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TW202245844A - 抗dll3抗體-藥物結合物 - Google Patents

抗dll3抗體-藥物結合物 Download PDF

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TW202245844A
TW202245844A TW111101468A TW111101468A TW202245844A TW 202245844 A TW202245844 A TW 202245844A TW 111101468 A TW111101468 A TW 111101468A TW 111101468 A TW111101468 A TW 111101468A TW 202245844 A TW202245844 A TW 202245844A
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約翰Ｔ 波瑞爾
查爾斯 魯丁
傑森 路易斯
阿布杜 康
大衛 安徳魯
信磊 陳
艾佛 羅倫茲
松永大典
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紀念斯隆凱特琳癌症中心
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Abstract

本發明之目的為提供一種結合至DLL3之抗體與具有抗腫瘤活性之藥物的抗體-藥物結合物、一種包含該抗體-藥物結合物並對腫瘤具有治療作用的醫藥組成物、一種使用該抗體-藥物結合物或該醫藥組成物治療腫瘤的方法等。本發明提供一種結合至DLL3之抗體與具有抗腫瘤活性之藥物的抗體-藥物結合物、一種包含該抗體或該抗體-藥物結合物的醫藥組成物，及一種治療腫瘤的方法。

Description

抗DLL3抗體-藥物結合物
[相關申請案的交叉參考]
本申請案主張於2021年1月13日申請之美國臨時申請號63/136,938的優先權，其揭示內容藉由引用整體併入本文。 [序列表]
本申請包含已以ASCII格式電子申請之序列表，並在此藉由引用整體併入。該ASCII副本創建於2022年1月12日，命名為098065-0301_SL.txt，且大小為150,762位元組。
本技術一般係關於製備特異性結合δ樣(delta-like)蛋白3(DLL3)之免疫球蛋白相關組成物(例如，抗體或其抗原結合片段)及其用途，以及用於生產抗DLL3抗體、包含抗DLL3抗體之抗體-藥物結合物(ADC)、包含抗體-藥物結合物之抗腫瘤劑等之方法。本揭示進一步提供治療之用途和方法，其包含對有需要的受試者投予揭示之抗DLL3抗體、ADC及抗腫瘤劑。
提供以下對本技術背景的敘述僅僅是為了幫助理解本技術，並非承認描述或構成本技術之先前技術。
癌症是排名前幾位的死亡原因。儘管預計癌症患者的數量會隨著人口老齡化而增加，但治療需求尚未得到充分滿足。習知的化療劑存在的問題是：由於選擇性低，這些化療劑不僅對腫瘤細胞有毒性，而且對正常細胞也有毒性，從而產生不良反應；且化療劑不能以足夠的量投予，因此不能充分發揮它們的作用。因此，近年來，開發了選擇性更高的分子標靶藥物或抗體藥物，其靶向在癌細胞中呈現突變或高表現特徵的分子，或參與細胞惡性轉化的特定分子。
抗體在血液中高度穩定，並且特異性地結合其標靶抗原。由於這些原因，人們期望減少不良反應，並且已經開發大量針對在癌細胞表面上高度表現的分子的抗體藥物。依賴抗體之抗原特異性結合能力的技術之一是使用抗體-藥物結合物(ADC)。ADC是一種結合物，其中與癌細胞表面表現的抗原結合並可通過該結合將抗原內化至細胞中的抗體被結合至具有細胞毒性活性的藥物。ADC可有效地將藥物遞送至癌細胞，因此可預期藉由在癌細胞中蓄積藥物來殺傷癌細胞(Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016; WO2014/057687; US2016/0297890)。關於ADC，例如，包含與單甲基奧瑞他汀E(auristatin E)結合之抗CD30單株抗體的Adcetris(TM) (本妥昔單抗(brentuximab) vedotin)已被批准作為霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)和間變性大細胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma)的治療藥物。此外，包含與恩他新(emtansine)結合之抗HER2單株抗體的Kadcyla(TM)(曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine))用於治療HER2陽性進行性或複發性乳癌。
適於作為抗腫瘤藥物之ADC的標靶抗原的特徵為：該抗原在癌細胞表面特異性高表現，但在正常細胞中表現低或不表現；抗原可內化至細胞中；抗原不從細胞表面分泌等等。抗體之內化能力取決於標靶抗原及抗體二者的性質。難以從標靶的分子結構預測適於內化的抗原結合位點，或難以從抗體的結合強度、物理性質等預測具有高內化能力的抗體。因此，開發具有高效之ADC的一個重要挑戰是獲得對標靶抗原具有高內化能力的抗體(Peters C, et al., Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015)。
DLL3(即δ樣配體3或δ樣蛋白3)是ADC的已知標靶抗原之一。DLL3是一種單通道I型跨膜蛋白，且是Notch配體之一(參見 Owen et al.J Hematol Oncol 12, 61 (2019))。DLL3在包括SCLC和LCNEC之高級別肺神經內分泌腫瘤中選擇性地表現。在SCLC和LCNEC患者來源的異種移植腫瘤中觀察到DLL3的表現增加，且在原發性腫瘤中亦被證實。參見Saunders et al., Sci Translational Medicine 7(302):302ra136 (2015)。在包括前列腺神經內分泌癌在內的肺外神經內分泌癌中亦觀察到DLL3的表現增加(Puca et al., Sci Transl Med 11(484)：pii：eaav0891 (2019)。雖然DLL3在此類腫瘤細胞的表面表現，但它在成人正常組織中的表現是有限的。
已報導包含與吡咯并苯并二氮呯(PBD)結合之抗DLL3單株抗體的ADC(參見WO2013/126746及 Saunders et al., Sci Translational Medicine 7(302) ： 302ra136 (2015 ))。此外，含有抗DLL3抗體作為活性成分的各種醫藥組成物是已知的。參見 Giffin et al., Clin Cancer Res 2021;27:1526–37及WO2011/093097。但到目前為止，還沒有針對DLL3的藥物被批准用作藥劑。
本領域需要高效且有效的靶向治療劑，例如ADC，用於治療各種類型的癌症。本申請滿足了此種需求。
本發明的一目的為提供包含此類抗δ樣配體3(即，「δ樣蛋白3」或「DLL3」)抗體且具有抗腫瘤活性的抗體-藥物結合物(ADC)、包含該抗體-藥物結合物且對腫瘤有治療作用的醫藥化合物、使用該抗體-藥物結合物或醫藥化合物治療腫瘤之方法，等等。
本發明人等已進行旨在實現上述目的的深入研究，並且令人驚訝地發現，所揭示之包含抗DLL3抗體的ADC具有出乎意料的高抗腫瘤活性，特別是在小細胞肺癌中。
本發明包括以下本發明的方面和具體實施例：
[1]在一方面，本揭示提供一種抗體-藥物結合物，其包含與DLL-3特異性結合之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段經由連接子與藥物結合，其中該抗體或抗體之功能性片段能結合至DLL3且包含重鏈免疫球蛋白可變域(V H)及輕鏈免疫球蛋白可變域(V L)，其中 (a)   V H包含選自由以下所組成之群組的V H-CDR1序列、V H-CDR2序列及V H-CDR3序列： (i)分別為SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5； (ii)分別為SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15； (iii)分別為SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25；及 (iv)分別為SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35；及/或 (b)   V L包含選自由以下所組成之群組的V L-CDR1序列、V L-CDR2序列及V L-CDR3序列： (i)分別為SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10； (ii)分別為SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20； (iii)分別為SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30；及 (iv)分別為SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40。
[2]在[1]的一些具體實施例中，抗體包含重鏈免疫球蛋白可變域(V H)及輕鏈免疫球蛋白可變域(V L)，其中(a)包含V H-CDR1序列、V H-CDR2序列及V H-CDR3序列之V H與(b)包含V L-CDR1序列、V L-CDR2序列及V L-CDR3序列之V L的組合選自由以下所組成之群組： (i)分別為(a) SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5及(b) SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10； (ii)分別為(a) SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15及(b) SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20； (iii)分別為(a) SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25及(b) SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30；及 (iv)分別為(a) SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35及(b) SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40。
[3]在[1]或[2]的一些具體實施例中，抗體包含重鏈免疫球蛋白可變域(V H)及輕鏈免疫球蛋白可變域(V L)，其中： (a)V H包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：32；及/或 (b)V L包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：37。
[4]在[1]-[3]中任一項的一些具體實施例中，抗DLL3抗體包含重鏈免疫球蛋白可變域(V H)及輕鏈免疫球蛋白可變域(V L)，其中：(a)V H包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：32，且(b)V L包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：37。
[5]在[1]-[4]中任一項的一些具體實施例中，V H胺基酸序列及V L胺基酸序列選自由以下所組成之群組： 分別為SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：7(7-I1-B)； 分別為SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：17(2-C8-A)； 分別為SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：27(10-O18-A)；及 分別為SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：37(6-G23-F)，或 抗DLL3抗體包含選自由以下所組成之群組的重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列： 分別為SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：62(H2-C8-A)； 分別為SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62(H2-C8-A-2)； 分別為SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62(H2-C8-A-3)； 分別為SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：70(H10-O18-A)； 分別為SEQ ID NO：68及SEQ ID NO：70(H10-O18-A-2)； 分別為SEQ ID NO：69及SEQ ID NO：70(H10-O18-A-3)； 分別為SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：66(H6-G23-F)； 分別為SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：66(H6-G23-F-2)；及 分別為SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：66(H6-G23-F-3)。
[6]在[1]-[5]中任一項的一些具體實施例中，抗體包含： (a)輕鏈免疫球蛋白可變域序列，其與SEQ ID NOs：7、17、27或37中任一者之輕鏈免疫球蛋白可變域序列至少95%相同；或輕鏈序列，其與SEQ ID NOs：62、66或70中任一者之序列至少95%相同；及/或 (b)重鏈免疫球蛋白可變域序列，其與存在於SEQ ID NOs：2、12、22或32中任一者之重鏈免疫球蛋白可變域序列至少95%相同；或重鏈序列，其與SEQ ID NOs：59、60、61、63、64、65、67、68或69中任一者之序列至少95%相同。
[7]在[1]-[8]中任一項的一些具體實施例中，進一步包含選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD及IgE所組成之群組的同型之Fc域。
[8]在[1]-[7]中任一項的一些具體實施例中，抗DLL3包含SEQ ID NO：42、57或58之重鏈恆定區。
[9]在[1]-[8]中任一項的一些具體實施例中，抗原結合片段選自由Fab、F(ab’) 2、Fab’、scF v及F v所組成之群組。
[10]在[1]-[9]中任一項的一些具體實施例中，抗體為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體或雙特異性抗體。
[11]在[1]-[10]中任一項的一些具體實施例中，抗體包含： (a)重鏈包含SEQ ID NOs：59至61中任一者的胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NOs：62中任一者的胺基酸序列； (b)重鏈包含SEQ ID NOs：63至65中任一者的胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NOs：66中任一者的胺基酸序列；及/或 (c)重鏈包含SEQ ID NOs：67至69中任一者的胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NOs：70中任一者的胺基酸序列。
[12]在[1]-[11]中任一項的一些具體實施例中，抗體包含： (a)重鏈包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列； (b)重鏈包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列；或 (c)重鏈包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列。
[13]在另一方面，本揭示提供一種抗體-藥物結合物，其包含特異性結合至DLL-3的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段經由連接子與藥物結合，其中該抗DLL-3抗體與根據[1]-[12]中任一項的抗體競爭結合DLL-3。
[14]在[1]-[13]中任一項的一些具體實施例中，抗體與哺乳動物DLL3多肽中存在的表位結合。
[15]在[14]的一些具體實施例中，表位是構形表位或非構形表位。
[16]在[14]或[15]的一些具體實施例中，哺乳動物DLL3多肽具有包含SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51的胺基酸殘基27-492的胺基酸序列。
[17]在[1]-[16]中任一項的一些具體實施例中，重鏈或輕鏈具有選自由以下所組成之群組的一個或二個或多個胺基酸殘基之修飾或集合：N-連接糖苷化、O-連接糖苷化、N-末端加工、C-末端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、對N-末端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、在重鏈(LALA)的位置234及235(根據EU索引)處將兩個白胺酸(L)殘基取代成丙胺酸(A)、重鏈位置356處的一組胺基酸殘基Glu(E)和位置358處的Met(M)(根據EU索引)、重鏈位置356處的Asp(D)和位置358處的白胺酸(L)(根據EU索引)或其任意組合、N-末端麩醯胺或N-末端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基末端刪除一個或兩個胺基酸。
[18]在[17]的一些具體實施例中，從其重鏈的羧基末端刪除一個或兩個胺基酸。
[19]在[18]的一些具體實施例中，從其兩條重鏈的每個羧基末端刪除一個胺基酸。
[20]在[17]-[19]中任一項的一些具體實施例中，其重鏈之羧基末端的脯胺酸殘基進一步被醯胺化。
[21]在[1]-[20]中任一項的一些具體實施例中，抗體包含糖鏈修飾，其被調節以增強抗體依賴性細胞毒性活性。
[22]在[1]-[21]中任一項的一些具體實施例中，藥物為由下式表示之抗腫瘤化合物： [式1]
Figure 02_image001
。
[23]在[1]-[22]中任一項的一些具體實施例中，抗體經由連接子與藥物結合，該連接子具有選自由下式(a)至(f)所組成之群組的任何結構： (a)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， (b)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， (c)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， (d)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， (e)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 (f)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-(「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， 其中該抗體連接至-(琥珀醯亞胺-3-基-N)之末端，該抗腫瘤化合物連接至(a)、(b)、(e)或(f)之-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-部分、(c)之CH 2-O-CH 2-C(=O)-部分或(d)之CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)-部分的羰基，以位置1處的胺基之氮原子作為連接位置，GGFG (SEQ ID NO：85)表示由通過肽鍵連接之甘胺酸-甘胺酸-苯基丙胺酸-甘胺酸(SEQ ID NO：85) 所組成的胺基酸序列，且 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-具有下式表示之結構： [式2]
Figure 02_image003
其在其位置3處與抗體連接，並在位置1處的氮原子上與含有此結構的連接子結構中的亞甲基連接。
[24]在[1]-[23]中任一項的一些具體實施例中，連接子由選自由下式(c)、(d)及(e)所組成之群組中的任何式表示： (c)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， (d)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)、及 (e)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
[25]在[1]-[24]中任一項的一些具體實施例中，連接子由下式(c)或(e)表示： (c)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 (e)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
[26]在[1]-[25]中任一項的一些具體實施例中，ADC具有下式表示之結構： [式3]
Figure 02_image005
其中AB表示抗體，n表示每個抗體與抗體結合之藥物-連接子結構的平均單元數，且抗體經由衍生自抗體的硫氫基連接至連接子。
[27]在[1]-[25]中任一項的一些具體實施例中，ADC具有下式表示之結構： [式4]
Figure 02_image007
其中AB表示抗體，n表示每個抗體與抗體結合之藥物-連接子結構的平均單元數，且抗體經由衍生自抗體的硫氫基連接至連接子。
[28]在[1]-[27]中任一項的一些具體實施例中，抗體為包含含有SEQ ID NO：17之可變域序列的輕鏈及含有SEQ ID NO：12之可變域序列的重鏈的抗體。
[29]在[1]-[27]中任一項的一些具體實施例中，抗體為包含含有SEQ ID NO：27之可變域序列的輕鏈及含有SEQ ID NO：22之可變域序列的重鏈的抗體。
[30]在[1]-[27]中任一項的一些具體實施例中，抗體為包含含有SEQ ID NO：37之可變域序列的輕鏈及含有SEQ ID NO：32之可變域序列的重鏈的抗體。
[31]在[1]-[27]中任一項的一些具體實施例中，抗體為包含含有SEQ ID NO：7之可變域序列的輕鏈及含有SEQ ID NO：2之可變域序列的重鏈的抗體。
[32]在[1]-[31]中任一項的一些具體實施例中，每個抗體結合的選擇藥物-連接子結構的平均單元數在1到10個之範圍內。
[33]在[1]-[32]中任一項的一些具體實施例中，每個抗體結合的選擇藥物-連接子結構的平均單元數在2到8個之範圍內。
[34]在[1]-[33]中任一項的一些具體實施例中，每個抗體結合的選擇藥物-連接子結構的平均單元數在5到8個之範圍內。
[35]在[1]-[34]中任一項的一些具體實施例中，每個抗體結合的選擇藥物-連接子結構的平均單元數在7到8個之範圍內。
[36]在另一方面，本揭示提供一種醫藥組成物，其包含根據[1]-[35]中任一項的抗體-藥物結合物、其鹽、或該結合物或該鹽的水合物。
[37]在[36]的一些具體實施例中，其為抗腫瘤藥物。
[38]在一些具體實施例中，[36]或[37]的醫藥組成物用於治療腫瘤，其中該腫瘤是表現DLL3之腫瘤。
[39]在[38]的一些具體實施例中，腫瘤為小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、各種組織的神經內分泌腫瘤、神經膠質瘤或假性神經內分泌腫瘤(pNET)，該組織包括腎臟、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內膜)、胃腸道(胃、結腸)、甲狀腺(甲狀腺髓質癌)、胰臟及肺臟。
[40]在另一方面，本揭示提供一種治療腫瘤之方法，其包含對具有腫瘤之個體投予根據[1]-[35]中任一項的抗體-藥物結合物、其鹽、以及該結合物或該鹽的水合物。
[41]在另一方面，本揭示提供一種治療腫瘤的方法，其包含對具有腫瘤之個體同時地、分開地或連續地投予一種醫藥組成物及至少一種抗腫瘤藥物，該醫藥組成物包含根據[1]-[35]中任一項的抗體-藥物結合物、其鹽、以及該結合物或該鹽的水合物。
[42]在[40]或[41]的一些具體實施例中，腫瘤為表現DLL3之腫瘤。
[43]在[40]至[42]中任一項的一些具體實施例中，腫瘤為小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、各種組織的神經內分泌腫瘤、神經膠質瘤或假性神經內分泌腫瘤(pNET)，該組織包括腎臟、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內膜)、胃腸道(胃、結腸)、甲狀腺(甲狀腺髓質癌)、胰臟及肺臟。
[44]在另一方面，本揭示提供一種生產抗DLL3抗體-藥物結合物之方法，其包含使抗DLL3抗體或該抗體之功能性片段與藥物-連接子中間體化合物反應的步驟，其中該抗體或該抗體之功能性片段能結合至DLL3且包含重鏈免疫球蛋白可變域(V H)及輕鏈免疫球蛋白可變域(V L)，其中 (a)V H包含選自由以下所組成之群組的V H-CDR1序列、V H-CDR2序列及V H-CDR3序列 (i)分別為SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5； (ii)分別為SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15； (iii)分別為SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25；及 (iv)分別為SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35；及/或 (b)V L包含選自由以下所組成之群組的V L-CDR1序列、V L-CDR2序列及V L-CDR3序列 (i)分別為SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10； (ii)分別為SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20； (iii)分別為SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30；及 (iv)分別為SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40。
發明之有益效果：包含經由具有特定結構之連接子而與在細胞中發揮毒性之藥物連接的本發明抗-DLL3抗體之抗DLL3抗體-藥物結合物，其特徵可藉由對具有表現DLL3之癌細胞的患者投予而期待達到優異的抗腫瘤效果和安全性。具體而言，本發明的抗DLL3抗體-藥物結合物可用作抗腫瘤劑。
前述一般描述和以下詳細描述是例示性和解釋性的，並旨在提供對所主張之揭示內容的進一步解釋。通過以下對圖式的簡單描述和對本揭示的詳細描述，其他目的、優點和新穎的特徵對於本領域技術人員來說將是顯而易見的。
應理解，本技術的某些方面、模式、具體實施例、變化及特徵在下文中以各種詳細程度進行敘述，以便提供對本技術的實質上地理解。
在實施本技術時，使用了分子生物學、蛋白質生物化學、細胞生物學、免疫學、微生物學和重組DNA中的許多習知技術。參見例如，Sambrook and Russell eds.(2001) Molecular Cloning ： A Laboratory Manual, 3rd edition；the series Ausubel et al. eds.(2007) Current Protocols in Molecular Biology；the series Methods in Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson et al.(1991) PCR 1 ： A Practical Approach(IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al.(1995) PCR 2 ： A Practical Approach；Harlow and Lane eds.(1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells ： A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；美國專利號4,683,195; Hames and Higgins eds.(1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds.(1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds.(1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds.(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press, London)；及Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology。檢測和測量多肽基因表現產物水平(即基因轉譯水平)的方法是本技術領域所熟知的，且包括使用多肽檢測方法，例如抗體檢測和定量技術。(亦參見，Strachan & Read, Human Molecular Genetics, Second Edition.(John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999))。
在下文中，將參照附圖描述用於進行本發明的較佳具體實施例。應當注意，以下描述的具體實施例僅說明本發明的代表性具體實施例，本發明的範圍不應因這些實例而狹義地解釋。 I. 定義
在本說明書中，術語「癌」與術語「腫瘤」係以相同意義使用。
在本說明書中，使用術語「基因」不僅包含DNA，亦包含mRNA及cDNA及其cRNA。
在本說明書中，使用術語「多核苷酸」或「核苷酸」具有與核酸的意義相同的意義，且亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸及引子。在本說明書中，除非另有說明，否則術語「多核苷酸」和「核苷酸」可彼此互換使用。
在本說明書中，術語「多肽」和「蛋白質」可相互交換使用。
在本說明書中，術語「細胞」包括個體動物中的細胞和培養的細胞。
在本說明書中，術語「DLL3」可用於具有與DLL3蛋白的含義相同的含義。在本說明書中，人類DLL3亦稱為「hDLL3」。
在本說明書中，術語「細胞毒性活性」用於意指以任何給定方法引起細胞病理性的變化。該術語不僅意指直接的外傷，而且亦指引起各種的細胞結構或機能上的損傷，諸如DNA的切斷、鹼基二聚體的形成、染色體的切斷、細胞分裂胞器的損傷、及各種酵素活性的降低。
在本說明書中，使用短語「在細胞中發揮毒性」意指以任何給定方式在細胞中呈現出毒性。該術語不僅意指直接的外傷，而且亦指引起各種的細胞結構、機能、代謝上的影響，諸如DNA的切斷、鹼基二聚體的形成、染色體的切斷、細胞分裂胞器的損傷、各種酵素活性的降低、及抑制細胞生長因子的作用。
在本說明書中，術語「抗體之功能性片段」，亦稱為「抗體之抗原結合片段」，用於意指具有針對抗原之結合活性的抗體之部分片段，且包含Fab、F(ab’)2、scFv、雙功能抗體(diabody)、由抗體片段所形成的線性抗體及多特異性抗體等。Fab'是藉由在還原條件下處理F(ab')2所獲得之抗體可變區的單價片段，其亦包括在抗體的抗原結合片段中。然而，只要抗原結合片段具有抗原結合能力，則抗體之抗原結合片段不受限於此等分子。此等抗原結合片段不僅包括將抗體蛋白質之全長分子以適當的酵素進行處理所獲得的那些，亦包括使用經基因工程化之抗體基因而於適當的宿主細胞中所產生的蛋白質。
在本說明書中，術語「表位」用於意指特定抗DLL3抗體結合之DLL3的部分肽或部分三維結構。此類表位，即上述DLL3的部分肽，可藉由本領域技術人員熟知的方法來確定，例如免疫測定法。首先，產生抗原的各種部分結構。關於此類部分結構的產生，可應用已知的寡肽合成技術。例如，藉由本領域技術人員熟知的基因重組技術產生一系列多肽，其中DLL3已從其C-末端或N-末端以適當長度連續截短。此後，研究抗體對此類多肽的反應性，並粗略確定識別位點。此後，進一步合成較短的肽，然後可研究其對這些肽的反應性，以確定表位。當與具有多個胞外域之膜蛋白結合的抗體指向作為表位之由多個域構成的三維結構時，可藉由修飾特定胞外域之胺基酸序列，且從而修飾三維結構，來確定抗體結合的域。亦可藉由X射線結構分析指定與抗體相鄰的抗原的胺基酸殘基來確定為與特定抗體結合的抗原的部分三維結構之表位。
在本說明書中，「人源化抗體」係指包含至少一個鏈的抗體，該鏈包含來自人類抗體鏈的可變區框架殘基和至少一個來自非人類抗體(例如，小鼠)的互補決定區(CDR)。
如本文所使用，術語「人類抗體」旨在包括具有源自人免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。然而，如本文所使用，術語「人類抗體」並非意圖包括其中源自另一種哺乳動物物種(例如小鼠)的CDR序列已被移植至人類框架序列上的抗體。
在本說明書中，「與相同表位結合的抗體」用於意指與共同表位結合的抗體。若第二抗體與第一抗體所結合的部分肽或部分三維結構結合，則可確定第一抗體和第二抗體結合相同的表位。或者，即使表位的特定序列或結構尚未確定，藉由確認第二抗體與第一抗體競爭第一抗體結合的抗原(即第二抗體干擾第一抗體與抗原的結合)，可確定第一抗體和第二抗體結合相同的表位。在本說明書中，短語「與相同表位結合」係指藉由這些確定方法中的任何一種或兩種確定第一抗體和第二抗體與相同表位結合的情況。當第一抗體和第二抗體結合相同的表位，且進一步地第一抗體具有特殊效果，例如抗腫瘤活性或內化活性時，可預期第二抗體具有與第一抗體相同的活性。
在本說明書中，術語「CDR」用於意指互補決定區。已知抗體分子之重鏈及輕鏈各具有3個CDR。此類CDR亦稱為高度變異區，且位於抗體重鏈及輕鏈的可變區。這些區域具有特定高度可變的一級結構，並在各個重鏈及輕鏈中的多肽鏈一級結構上被分成三個位點。在本說明書中，關於抗體的CDR，重鏈的CDR從重鏈胺基酸序列的胺基末端側起分別稱為CDRH1、CDRH2及CDRH3，反之，輕鏈的CDR從輕鏈胺基酸序列的胺基末端側起分別稱為CDRL1、CDRL2及CDRL3。這些位點在三維結構上彼此靠近，並決定了對於抗體結合之抗原的抗體特異性。
如本文所使用，術語「CDR-移植抗體」意指其中「接受者(acceptor)」抗體的至少一個CDR被來自具有所需抗原特異性之「供體」抗體的CDR「移植物」置換的抗體。
在本發明中，短語「在嚴格條件下雜交」用於指稱在市售雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution (manufactured by Clontech Laboratories, Inc.)中，於68℃下進行雜交，或在68℃、0.7至1.0 M NaCl存在下使用DNA固定濾器進行雜交的條件下進行雜交，然後將所得物在68℃以0.1-2倍濃度的SSC溶液(其中1倍濃度的SSC由150 mM NaCl和15 mM檸檬酸鈉組成)洗滌以用於鑑定，或與其相當的條件。
如本文所使用，術語「個體」、「患者」或「受試者」可為個別的有機體、脊椎動物、哺乳動物或人類。在一些具體實施例中，該個體、患者或受試者為人類。
如本文所使用，術語「醫藥上可接受的載劑」旨在包括與醫藥投予相容的任何和所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌及抗真菌化合物、等張及吸收延遲化合物等。醫藥上可接受的載劑及其製劑是本領域技術人員已知的，且例如敘述於Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.)。
如本文所使用的「處理」或「治療」涵蓋在例如人類之受試者中治療本文所述的疾病或病症，且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其發展；(ii)緩解疾病或病症，即導致病症消退；(iii)減緩疾病的進展；及/或(iv)抑制、緩解或減緩疾病或病症的一種或多種症狀的進展。在一些具體實施例中，治療意指與疾病相關的症狀例如得到緩解、減輕、治愈或處於緩解狀態。
如本文所使用，「特異性結合」係指識別並結合另一分子(例如抗原)但實質上不識別和結合其他分子的分子(例如抗體或其抗原結合片段)。如本文所使用，術語「特異性結合」特定分子(例如，多肽或多肽上的表位)、與特定分子「特異性結合」或對特定分子「具有特異性」例如可藉由對於其結合的分子具有約10 −4M、10 −5M、10 −6M、10 −7M、10 −8M、10 −9M、10 −10M、10 −11M或10 −12M之KD的分子來呈現。術語「特異性結合」亦可指分子(例如抗體或其抗原結合片段)結合特定多肽(例如DLL3多肽)或特定多肽上的表位而實質上不結合任何其他多肽或多肽表位。
在本說明書中，術語「一至多數」用於表示1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1或2。 II.δ 樣 (Delta-Like) 配體 (DLL3)
DLL3 (即，δ樣配體3或δ樣蛋白3)在包括SCLC和LCNEC的高級別肺神經內分泌腫瘤中選擇性表現。在 SCLC和LCNEC患者來源的異種移植腫瘤中觀察到DLL3的表現增加，且在原發性腫瘤中亦被證實。參見，Saunders et al., Sci Translational Medicine7(302)：302ra136 (2015)。在包括前列腺神經內分泌癌在內的肺外神經內分泌癌中亦觀察到DLL3的表現增加(Puca et al., Sci Transl Med11(484)：pii：eaav0891 (2019))。雖然DLL3在此類腫瘤細胞的表面表現，但其不在正常組織中表現。本揭示提供免疫球蛋白相關組成物(例如，抗體或其抗原結合片段)，其在與腫瘤細胞上的DLL3結合時內化，因此可用於將毒性有效載荷遞送至這些腫瘤細胞。本技術的免疫球蛋白相關組成物可用於在有需要的受試者中檢測或治療DLL3相關癌症的方法。因此，本方法的各個方面係關於抗DLL3抗體的製備、表徵和操作。本技術的免疫球蛋白相關組成物可單獨使用或與用於治療癌症的其他治療劑組合使用。在一些具體實施例中，免疫球蛋白相關組成物為人源化抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。
在果蠅( Drosophila)中，Notch信號主要由Notch受體介導。δ是Notch的果蠅配體之一，可活化相鄰細胞中的訊號傳導。人類具有四種已知的Notch受體(NOTCH1至NOTCH4)和三種δ同源物，稱為δ樣配體：DLL1、DLL3及DLL4。已報導，與DLL1和 DLL4 不同，DLL3是抑制而非活化Notch信號。
DLL3(亦被稱為δ樣3或SCDO1)為Notch DSL配體的δ樣家族成員。代表性的DLL3蛋白異種同源物包括，但不限於： 人類(登錄號NP_058637：
Figure 02_image009
及NP_982353：
Figure 02_image011
黑猩猩(登錄號XP_003316395：
Figure 02_image013
小鼠(登錄號NP_031892：
Figure 02_image015
Figure 02_image017
及大鼠(登錄號NP_446118：
Figure 02_image019
Figure 02_image021
在人類中，DLL3基因由8個外顯子組成，跨越9.5 kBp，位於染色體19q13上。最後一個外顯子內的交替剪接產生2389 bp轉錄本(登錄號 NM_016941 (SEQ ID NO：55))及2052 bp轉錄本(登錄號 NM_203486 (SEQ ID NO：56))。前者轉錄本編碼一種長度為618個胺基酸的蛋白質(登錄號NP_058637 (SEQ ID NO：50))，而後者編碼一種長度為587個胺基酸的蛋白質(登錄號 NP_982353 (SEQ ID NO：51))。參見圖4A-4B。DLL3的這兩種蛋白質同功型在其等胞外域和跨膜域之間具有100%的總體同一性，不同之處僅在於較長的同功型包含延伸的細胞質尾部，該尾部在蛋白質的羧基末端含有32個額外的殘基。
兩種同功型都可在腫瘤細胞中檢測到。事實上，異常的DLL3表現(基因型及/或表型)與各種致瘤細胞亞群有關，例如癌症幹細胞及腫瘤起始細胞。因此，本揭示提供可特別用於靶向此類細胞的DLL3抗體(例如，癌症幹細胞、腫瘤起始細胞、和癌症，例如，小細胞肺癌、大細胞神經內分泌癌、肺神經內分泌癌、肺外神經內分泌癌和黑色素瘤)，從而促進腫瘤性病症的治療、管理或預防。
本發明中使用的DLL3蛋白可直接從人或非人類哺乳動物(例如，大鼠、小鼠或猴)的DLL3表現細胞中純化，然後可被使用，或可製備上述細胞的細胞膜流分並用作DLL3蛋白。或者，DLL3亦可藉由活體外合成或藉由基因操作使宿主細胞產生DLL3來獲得。根據這樣的基因操作，DLL3蛋白可藉由將DLL3 cDNA整合至能夠表現DLL3 cDNA的載體中，然後在含有轉錄及轉譯所必需的酶、基質及能量材料的溶液中合成DLL3來獲得，或藉由轉化其他原核生物或真核生物的宿主細胞，使其表現DLL3來獲得。此外，基於上述基因操作的DLL3表現細胞或可使用表現DLL3的細胞株呈現DLL3蛋白。或者，可將已插入DLL3 cDNA的表現載體直接投予欲免疫之動物，因此可在該免疫動物體內表現DLL3。
再者，由在上述DLL3之胺基酸序列中包含1個或多個胺基酸的取代、缺失及/或添加的胺基酸序列構成的蛋白質，且具有與所述DLL3蛋白質的生物學活性同等的生物學活性，亦包括在該術語「DLL3」中。 III. 抗 DLL3 抗體
本技術敘述用於產生和使用抗DLL3免疫球蛋白相關組成物(例如，抗DLL3抗體或其抗原結合片段)的方法和組成物。本揭示之抗DLL3免疫球蛋白相關組成物可用於診斷或治療DLL3相關癌症(例如，小細胞肺癌、大細胞神經內分泌癌、肺神經內分泌癌、肺外神經內分泌癌和黑色素瘤)。本技術範圍內的抗DLL3免疫球蛋白相關組成物包括例如，但不限於特異性結合靶多肽、其同源物、衍生物或片段的單株、嵌合、人源化、雙特異性、人類抗體和雙功能抗體。本揭示亦提供本文所揭示之任何抗DLL3抗體的抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自由Fab、F(ab)'2、Fab'、scFv及Fv所組成之群組。
本技術揭示可促進DLL3-抗體複合物內化並因此可用於將毒性有效載荷遞送至腫瘤細胞的抗DLL3抗體。
圖5-8提供VH和VL的核苷酸和胺基酸序列，以及該等抗體的CDR序列揭示於本文中(SEQ ID NOs：1-40)。下表亦提供V H及V L之胺基酸序列，以及該等抗體的CDR序列揭示於本文中。
SEQ ID NO: 描述 序列
SEQ ID NO：2 7-I1-B之V H的胺基酸序列 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNTWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKSDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTQYYWNSFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：3 7-I1-B之V HCDR1的胺基酸序列 GFTFSNTW
SEQ ID NO：4 7-I1-B之V HCDR2的胺基酸序列 IKSKSDGGTT
SEQ ID NO：5 7-I1-B之V HCDR3的胺基酸序列 TQYYWNSFDY
SEQ ID NO：7 7-I1-B之V L的胺基酸序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：8 7-I1-B之V LCDR1的胺基酸序列 QASQDISNYLN
SEQ ID NO：9 7-I1-B之V LCDR2的胺基酸序列 DASNLET
SEQ ID NO：10 7-I1-B之V LCDR3的胺基酸序列 QQYDNLPLT
SEQ ID NO：12 2-C8-A之V H的胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：13 2-C8-A之V HCDR1的胺基酸序列 GFTFSSY
SEQ ID NO：14 2-C8-A之V HCDR2的胺基酸序列 KEDGSE
SEQ ID NO：15 2-C8-A之V HCDR3的胺基酸序列 DPGWAPFDY
SEQ ID NO：17 2-C8-A之V L的胺基酸序列 DIQMSQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLAISSLQPEDFATYYCQQYNSFPYTFGQGTTLEIK
SEQ ID NO：18 2-C8-A之V LCDR1的胺基酸序列 RASQGISNYLA
SEQ ID NO：19 2-C8-A之V LCDR2的胺基酸序列 AASSLQS
SEQ ID NO：20 2-C8-A之V LCDR3的胺基酸序列 QQYNSFPYT
SEQ ID NO：59 H2-C8-A之V H的胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：60 H2-C8-A-2之V H的胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：61 H2-C8-A-3之V H的胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：62 H2-C8-A、H2-C8-A-2及 H2-C8-A-3之V L的胺基酸序列 DIQMSQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLAISSLQPEDFATYYCQQYNSFPYTFGQGTTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：22 10-O18-A之V H的胺基酸序列 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：23 10-O18-A之V HCDR1的胺基酸序列 GGSINSY
SEQ ID NO：24 10-O18-A之V HCDR2的胺基酸序列 FYSGI
SEQ ID NO：25 10-O18-A之V HCDR3的胺基酸序列 IGVAGFYFDY
SEQ ID NO：27 10-O18-A之V L的胺基酸序列 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGTSPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：28 10-O18-A之V LCDR1的胺基酸序列 RASQSVSSSYLA
SEQ ID NO：29 10-O18-A之V LCDR2的胺基酸序列 GASSRAT
SEQ ID NO：30 10-O18-A之V LCDR3的胺基酸序列 QQYGTSPLT
SEQ ID NO：67 H10-O18-A之V H的胺基酸序列 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：68 H10-O18-A-2之V H的胺基酸序列 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：69 H10-O18-A-3之V H的胺基酸序列 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：70 H10-O18-A、H10-O18-A-2及 H10O18-A-3之V L的胺基酸序列 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGTSPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：32 6-G23-F之V H的胺基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：33 6-G23-F之V HCDR1的胺基酸序列 GYTFTSY
SEQ ID NO：34 6-G23-F之V HCDR2的胺基酸序列 DPSDGS
SEQ ID NO：35 6-G23-F之V HCDR3的胺基酸序列 DREYNYYGLDV
SEQ ID NO：37 6-G23-F之V L的胺基酸序列 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYRDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFRGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：38 6-G23-F之V LCDR1的胺基酸序列 RSSQSLVYRDGNTYLN
SEQ ID NO：39 6-G23-F之V LCDR2的胺基酸序列 KVSNRDS
SEQ ID NO：40 6-G23-F之V LCDR3的胺基酸序列 MQGTHWPPT
SEQ ID NO：63 H6-G23-A之V H的胺基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：64 H6-G23-A-2之V H的胺基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：65 H6-G23-A-3之V H的胺基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：66 H6-G23-A、H6-G23-A-2及 H6-G23-A-3之V L的胺基酸序列 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYRDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFRGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一個方面，本揭示提供包含重鏈免疫球蛋白可變域(VH)及輕鏈免疫球蛋白可變域(VL)之抗體或其抗原結合片段，其中(a) 該VH包含選自由以下所組成之群組的VH-CDR1序列、VH-CDR2序列及VH-CDR3序列：(i)分別為SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5；(ii)分別為SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15；(iii)分別為SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25；及(iv)分別為SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35；及/或(b) 該VL包含選自由以下所組成之群組的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列及VL-CDR3序列：(i)分別為SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10；(ii)分別為SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20；(iii)分別為SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30；及(iv)分別為SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40。在一些具體實施例中，本揭示提供包含重鏈免疫球蛋白可變域(VH)及輕鏈免疫球蛋白可變域(VL)之抗體或其抗原結合片段，其中(a)包含V H-CDR1序列、V H-CDR2序列及V H-CDR3序列之V H與(b)包含V L-CDR1序列、V L-CDR2序列及V L-CDR3序列之V L的組合係選自由以下所組成之群組：(i)分別為(a) SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5及(b) SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10；(ii)分別為(a) SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15及(b) SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、及SEQ ID NO：20；(iii)分別為(a) SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、及SEQ ID NO：25及(b) SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30；及(iv)分別為(a) SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35及(b) SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40。在一些具體實施例中，該抗體進一步包含任何同型的Fc域，例如，但不限於IgG (包括IgG1及變異體(SEQ ID NO：42、57及58)、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA (包括IgA1及IgA2)、IgD、IgE或IgM及IgY。在一些具體實施例中，抗體包含SEQ ID NO：42、57或58之重鏈恆定區，較佳為SEQ ID NO：57或58，更佳為SEQ ID NO：58。恆定區序列的非限制性例子包括： 人類IgD恆定區，Uniprot：P01880 (SEQ ID NO：41)
Figure 02_image023
人類IgG1恆定區，Uniprot：P01857 (SEQ ID NO：42)
Figure 02_image025
人類IgG1變異體恆定區(SEQ ID NO：57)
Figure 02_image027
人類IgG1變異體恆定區(SEQ ID NO：58)
Figure 02_image029
人類IgG2恆定區，Uniprot：P01859 (SEQ ID NO：43)
Figure 02_image031
人類IgG3恆定區，Uniprot：P01860 (SEQ ID NO：44)
Figure 02_image033
人類IgM恆定區，Uniprot：P01871 (SEQ ID NO：45)
Figure 02_image035
Figure 02_image037
人類IgG4恆定區，Uniprot：P01861 (SEQ ID NO：46)
Figure 02_image039
人類IgA1恆定區，Uniprot：P01876 (SEQ ID NO：47)
Figure 02_image041
Figure 02_image043
人類IgA2恆定區，Uniprot：P01877 (SEQ ID NO：48)
Figure 02_image045
人類Ig κ恆定區，Uniprot：P01834 (SEQ ID NO：49)
Figure 02_image047
在一些具體實施例中，本技術的免疫球蛋白相關組成物包含與SEQ ID NOS:41-48、57、58至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%相同的重鏈恆定區。另外或可選擇地，在一些具體實施例中，本技術的免疫球蛋白相關組成物包含與SEQ ID NO：49至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%相同的輕鏈恆定區。在一些具體實施例中，本技術的免疫球蛋白相關組成物與DLL3的胞外域結合。在一些具體實施例中，表位為構形表位。
在另一方面，本揭示提供分離的免疫球蛋白相關組成物(例如，抗體或其抗原結合片段)，其包含含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32或其等具有一個或多個保留胺基酸取代之變異體的重鏈免疫球蛋白可變域(VH)胺基酸序列，或含SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69或其等具有一個或多個保留胺基酸取代之變異體的重鏈胺基酸序列。
另外或可選擇地，在一些具體實施例中，本技術之免疫球蛋白相關組成物包含含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37或其等具有一個或多個保留胺基酸取代之變異體的輕鏈免疫球蛋白可變域(VL)胺基酸序列，或含SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：70或其等具有一個或多個保留胺基酸取代之變異體的輕鏈胺基酸序列。
在一些具體實施例中，本技術之免疫球蛋白相關組成物包含選自由以下組成群組之重鏈免疫球蛋白可變域(VH)或重鏈胺基酸序列及輕鏈免疫球蛋白可變域(VL)或輕鏈胺基酸序列：分別為SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：7 (7-I1-B)；分別為SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：17 (2-C8-A)；分別為SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：62 (H2-C8-A)；分別為SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62 (H2-C8-A-2)；分別為SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62 (H2-C8-A-3)；分別為SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：27 (10-O18-A)；分別為SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：70 (H10-O18-A)；分別為SEQ ID NO：68及SEQ ID NO：70 (H10-O18-A-2)；分別為SEQ ID NO：69及SEQ ID NO：70 (H10-O18-A-3)；分別為SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：37 (6-G23-F)；分別為SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：66 (H6-G23-F)；分別為SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：66 (H6-G23-F-2)；及分別為SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：66 (H6-G23-F-3)。
在免疫球蛋白相關組成物的任何上述具體實施例中，HC和LC免疫球蛋白可變域序列形成結合DLL3胞外域的抗原結合位。在免疫球蛋白相關組成物的任何上述具體實施例中，HC及LC免疫球蛋白可變域序列形成結合DLL3的抗原結合位並促進免疫球蛋白相關組成物的內化。在一些具體實施例中，表位為構形表位。
在一些具體實施例中，HC及LC免疫球蛋白可變域序列為相同多肽鏈的組成部分。在其他具體實施例中，HC及LC免疫球蛋白可變域序列為不同多肽鏈的組成部分。在某些具體實施例中，抗體為全長抗體。
在一些具體實施例中，本技術之免疫球蛋白相關組成物與至少一種DLL3多肽特異性結合。在一些具體實施例中，本技術之免疫球蛋白相關組成物以約10 -3M、10 -4M、10 -5M、10 -6M、10 -7M、10 -8M、10 -9M、10 -10M、10 -11M或10 -12M之解離常數(KD)結合至少一種DLL3多肽。在某些具體實施例中，免疫球蛋白相關組成物為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體或雙特異性抗體。在一些具體實施例中，抗體包含人類抗體框架區。
在某些具體實施例中，免疫球蛋白相關組成物包括一種或多種下述特徵：(a)輕鏈免疫球蛋白可變域序列，其與存在於SEQ ID NOs：7、17、27、37、62、66或70中任一者的輕鏈免疫球蛋白可變域序列或輕鏈序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同；及/或(b)重鏈免疫球蛋白可變域序列，其與存在於SEQ ID NOs：2、12、22、32、59、60、61、63、64、65、67、68或69中任一者的重鏈免疫球蛋白可變域序列或重鏈序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同。在另一方面，本文提供的免疫球蛋白相關組成物中的一個或多個胺基酸殘基被另一胺基酸取代。該取代可以是如本文所定義之「保留取代」。
在某些具體實施例中，免疫球蛋白相關組成物包含IgG1恆定區，該IgG1恆定區包含一個或多個選自由N297A和K322A所組成之群組的胺基酸取代或胺基酸殘基組、在重鏈(LALA)位置234及235處(根據EU索引)的兩個白胺酸(L)殘基的兩個胺基酸取代為丙胺酸(A)、重鏈位置356處的Glu (E)及位置358處的Met (M)(根據EU索引)的一組胺基酸殘基、或一組重鏈位置356處的Asp (D)及位置358處的白胺酸(L)(根據EU索引)或其等之任意組合。另外或可選擇地，在一些具體實施例中，免疫球蛋白相關組成物包含IgG4恆定區包含S228P突變。包含上述LALA取代的工程化抗體顯示出抗腫瘤作用，而沒有任何不良的毒性作用、PK輪廓和由Fc介導的效應免疫功能引起的穩定性受損(Pharmacol Ther.2019; 200：110-125)。
在一些方面，本文所述之抗DLL3免疫球蛋白相關組成物包含結構修飾以促進快速結合和細胞攝取及/或緩慢釋放。在一些方面，本技術的抗DLL3免疫球蛋白相關組成物(例如抗體)可在CH2恆定重鏈區中包含缺失以促進快速結合和細胞攝取及/或緩慢釋放。在一些方面，Fab片段用於促進快速結合和細胞攝取及/或緩慢釋放。在一些方面，F(ab)'2用於促進快速結合和細胞攝取及/或緩慢釋放。
考量本文所述之抗DLL3抗體的胺基酸序列修飾。例如，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。藉由將適當的核苷酸變化導入抗體核酸或藉由肽合成來製備抗DLL3抗體的胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如，抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。只要獲得的抗體具有所需的特性，就可進行缺失、插入和取代的任何組合以獲得感興趣之抗體。修飾亦包括蛋白質醣基化模式的改變。取代誘變最感興趣的位點包括高度變異區，但也考慮FR改變。「保留取代」如下表所示。
胺基酸取代
原始殘基 例示性取代 保留取代
Ala (A) val；leu；ile val
Arg (R) lys；gln；asn lys
Asn (N) gln；his；asp；lys；arg gln
Asp (D) glu；asn glu
Cys (C) ser；ala ser
Gln (Q) asn；glu asn
Glu (E) asp；gln asp
Gly (G) ala ala
His (H) asn；gln；lys；arg arg
Ile (I) leu；val；met；ala；phe；正白胺酸 leu
Leu (L) 正白胺酸；ile；val；met；ala；phe ile
Lys (K) arg；gln；asn arg
Met (M) leu；phe；ile leu
Phe (F) leu；val；ile；ala；tyr tyr
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr；phe tyr
Tyr (Y) trp；phe；thr；ser phe
Val (V) ile；leu；met；phe；ala；正白胺酸 leu
一種類型的取代變異體涉及取代親代抗體的一個或多個高度變異區殘基。產生此類取代變異體的一種方便方法涉及使用噬菌體顯示的親和力成熟。具體而言，將幾個高度變異區位點(例如，6-7個位點)突變以在每個位點處產生所有可能的胺基酸取代。因此所生成之抗體變異體以單價方式從絲狀噬菌體(filamentous phage)顆粒中顯示，作為與包裝在各個顆粒內的M13基因III產物的融合體。然後如本文所述，篩選噬菌體顯示的變異體的生物活性(例如，結合親和力)。為了鑑定用於修飾的候選高度變異區位點，可進行丙胺酸掃描誘變以鑑定對於抗原結合有顯著貢獻的高度變異區殘基。或者或另外地，分析抗原-抗體複合物的晶體結構以鑑定抗體和抗原之間的接觸點可能是有益的。此類接觸殘基和相鄰殘基是根據本文闡述的技術進行取代的候選者。一旦產生此類變異體，就如本文所述對一組變異體進行篩選，並可選擇在一種或多種相關測定中具有相似或優越特性的抗體用於進一步研發。
在一方面，本技術提供編碼本文所述之任何免疫球蛋白相關組成物的核酸序列。本文亦揭示編碼本文所述任何抗體的重組核酸序列。在一些具體實施例中，核酸序列選自由SEQ ID NOs：1、6、11、16、21、26、31及36所組成之群組。
在另一方面，本技術提供宿主細胞或表現載體，其表現編碼本文所述之任何免疫球蛋白相關組成物的任何核酸序列。
本技術的免疫球蛋白相關組成物(例如抗DLL3抗體)可為單特異性的、雙特異性的、三特異性的或具有更多的多特異性。多特異性抗體可對於一種或多種DLL3多肽的不同表位具有特異性，或可對於DLL3多肽以及異源組成物(例如異源多肽或固體支持材料)皆具有特異性。參見，例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt et al., J. Immunol.147：60-69 (1991)；美國專利號5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648；6,106,835；Kostelny et al., J. Immunol.148：1547-1553 (1992)。在一些具體實施例中，免疫球蛋白相關組成物為嵌合的。在某些具體實施例中，免疫球蛋白相關組成物為人源化的。
本技術的免疫球蛋白相關組成物可進一步在N‑或C‑處重組地融合至異源多肽或化學結合(包括共價和非共價結合)至多肽或其他組成物。例如，本技術的免疫球蛋白相關組成物可重組地融合或結合至在檢測測定中用作標記的分子和效應分子，例如異源多肽、藥物或毒素。參見，例如WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美國專利號5,314,995；及EP 0 396 387。
在本技術的免疫球蛋白相關組成物的任何上述具體實施例中，抗體或抗原結合片段可選擇地結合至選自由同位素、染料、色原、對比劑、藥物、毒素、細胞因子、酶、酶抑制劑、激素、激素拮抗劑、生長因子、放射性核種、金屬的試劑、脂質體、奈米顆粒、RNA、DNA或其任何組合所組成之群組。在一些具體實施例中，本技術的抗體或抗原結合片段可與醫藥上可接受的載劑組合。對於化學鍵或物理鍵，免疫球蛋白相關組成物上的官能基通常與藥劑上的官能基締合。或者，藥劑上的官能基與免疫球蛋白相關組成物上的官能基締合。
藥劑和免疫球蛋白相關組成物上的官能基可直接締合。例如，藥劑上的官能團(例如，硫氫基)可與免疫球蛋白相關組成物上的官能基(例如，硫氫基)締合以形成二硫化物。或者，官能基可通過交聯劑(即接合劑)締合。以下描述一些交聯劑的實例。交聯劑可連接至藥劑或免疫球蛋白相關組成物。結合物中的藥劑或免疫球蛋白相關組成物的數量亦受限於另一者所存在的官能基數量。例如，與結合物相關的藥劑的最大數量取決於免疫球蛋白相關組成物上所存在的官能基數量。或者，與藥劑相關的免疫球蛋白相關組成物的最大數量取決於藥劑上所存在的官能基數量。
在又另一具體實施例中，結合物包含與一種藥劑締合的一種免疫球蛋白相關組成物。在一個具體實施例中，結合物包含至少一種化學鍵結(例如，結合)至至少一種免疫球蛋白相關組成物的藥劑。該試劑可藉由本領域技術人員已知的任何方法與免疫球蛋白相關組成物化學鍵結。例如，藥劑上的官能基可直接連接至免疫球蛋白相關組成物上的官能基。合適的官能基的一些例子包括例如胺基、羧基、硫氫基、馬來醯亞胺、異氰酸酯、異硫氰酸酯和羥基。
藥劑亦可藉由交聯劑，諸如二醛、碳二亞胺、二馬來醯亞胺等，與免疫球蛋白相關組成物化學鍵結。例如，交聯劑可從Pierce Biotechnology, Inc.(Rockford，Ill)獲得。Pierce Biotechnology, Inc.網站可提供幫助。額外的交聯劑包括美國專利號5,580,990；5,985,566；及6,133,038 (Kreatech Biotechnology, B.V., Amsterdam, The Netherlands)中所述之鉑交聯劑。
或者，在藥劑及免疫球蛋白相關組成物上的官能基可相同。同雙功能交聯劑通常用於交聯相同的官能基。同雙功能交聯劑之實例包括EGS (即，乙二醇雙[琥珀醯亞胺基琥珀酸酯])、DSS (即，二琥珀醯亞胺辛二酸酯)、DMA (即，己二醯亞胺二甲酯.2HCl)、DTSSP (即，3,3'-二硫代雙[磺酸基琥珀醯亞胺基丙酸酯])、DPPDB (即，1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙醯胺基]丁烷)及BMH (即，雙馬來醯亞胺己烷)。此類同雙功能交聯劑亦可自Pierce Biotechnology, Inc.獲得。
在其他情況下，從免疫球蛋白相關組成物中切割藥劑可能是有益的。上述 Pierce Biotechnology, Inc.的網站亦可協助本領域技術人員選擇合適的交聯劑，這些交聯劑可被例如細胞中的酶切割。因此，該藥劑可與免疫球蛋白相關組成物分離。可切割的連接子之例子包括SMPT (即，4-琥珀醯亞胺氧基羰基-甲基-a-[2-吡啶基二硫基]甲苯)、磺酸基-LC-SPDP (即，磺酸基琥珀醯亞胺基6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基)己酸酯)、LC-SPDP (即，琥珀醯亞胺基6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基)己酸酯)、磺酸基-LC-SPDP (即，磺酸基琥珀醯亞胺基6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基)己酸酯)、SPDP (即，N-琥珀醯亞胺基3-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基己酸酯)及AEDP (即，3-[(2-胺基乙基)二硫基]丙酸HCl)。
在另一具體實施例中，結合物包含與至少一種免疫球蛋白相關組成物物理性鍵結的至少一種藥劑。可使用本領域技術人員已知的任何方法將試劑與免疫球蛋白相關組成物物理性鍵結。例如，可藉由本領域技術人員已知的任何方法將免疫球蛋白相關組成物和藥劑混合在一起。混合的順序並不重要。例如，可藉由本領域技術人員已知的任何方法將藥劑與免疫球蛋白相關組成物物理性混合。例如，可以將免疫球蛋白相關組成物和藥劑放置在容器中並攪拌，例如藉由搖動容器，以混合免疫球蛋白相關組成物和藥劑。
可藉由本領域技術人員已知的任何方法來修飾免疫球蛋白相關組成物。例如，免疫球蛋白相關組成物可藉由如上所述的交聯劑或官能基進行修飾。
本發明的抗體亦包括抗體的修飾。修飾用於意指經化學或生物修飾本發明的抗體。此類化學修飾之實例包括化學部分與胺基酸骨架的結合，及N-連接或O-連接之碳水化合物鏈的化學修飾。此類生物修飾之實例包括經轉譯後修飾之抗體(例如，N-連接或O-連接糖基化、N-末端或C-末端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、及N-末端麩醯胺或N-末端麩胺酸轉化為焦麩胺酸)及其N末端添加甲硫胺酸殘基而造成允許使用原核宿主細胞表達的抗體。此外，此類修飾亦意指包括能夠檢測或分離本發明之抗體或抗原的標記抗體，例如酶標記抗體、螢光標記抗體和親和性標記抗體。本發明之抗體的此類修飾可用於改善抗體在血液中的穩定性和保留；抗原性降低；抗體或抗原之檢測或分離等。
此外，藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾(糖基化、去岩藻糖基化等)，可增強抗體依賴性細胞毒性的活性。作為調節抗體糖鏈修飾的技術是已知的，如敘述於國際專利公開號WO1999/54342、WO2000/61739、及WO2002/31140、WO2007/133855等中的技術，但該技術不限於此。本發明的抗體亦包括已對上述糖鏈修飾進行調節的抗體。
一旦分離出抗體基因，可使用宿主和表現載體的適當組合將該基因導入適當的宿主以產生抗體。抗體基因的具體實例可為編碼本敘述中所述之抗體的重鏈序列的基因和編碼其中所述之抗體的輕鏈序列的基因的組合。在轉化宿主細胞時，可將此類重鏈序列基因和輕鏈序列基因插入到單個表現載體中，或者這些基因可替代地分別插入至不同表現載體中。
當使用真核細胞作為宿主時，可使用動物細胞、植物細胞或真核微生物。特別是，動物細胞的實例可包括哺乳動物細胞，諸如猴細胞的COS細胞(Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)、中國倉鼠卵巢細胞的二氫葉酸還原酶缺陷細胞株(CHO細胞, ATCC CCL-61) (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980) 77, p. 4126-4220)及FreeStyle 293F細胞(Invitrogen Corp.)。
當使用原核細胞作為宿主時，可例如使用大腸桿菌(Escherichia coli)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
將感興趣的抗體基因導入這些細胞進行轉化，然後將轉化的細胞進行活體外培養以獲得抗體。在上述培養中，依據抗體的序列而有產量不同的情況，因此，可使用產量為指標，從具有同等結合活性的抗體中選擇容易作為藥物製造的抗體。因此，本發明的抗體亦包括藉由上述製備抗體的方法獲得的抗體，該方法包含培養轉化之宿主細胞的步驟和從上述步驟中獲得的培養物中收集感興趣抗體或抗體之功能性片段的步驟。
已知在培養的哺乳動物細胞中產生的抗體重鏈羧基末端的離胺酸殘基被刪除(Journal of Chromatography A, 705：129-134 (1995))，而且，已知重鏈羧基末端的兩個胺基酸殘基甘胺酸和離胺酸被刪除，而新定位在羧基末端的脯胺酸殘基被醯胺化 (Analytical Biochemistry, 360：75-83 (2007))。然而，這些重鏈序列的此類缺失和修飾不會影響抗體的抗原結合活性和效應子功能(補體的活化、抗體依賴性細胞毒性等)。因此，本發明之抗體亦包括進行上述修飾的抗體和該抗體的功能性片段，此類抗體的具體實例包括在重鏈羧基末端處包含1或2個胺基酸缺失的缺失突變體，及藉由醯胺化上述缺失突變體而形成的缺失突變體(例如，其中羧基末端位點的脯胺酸殘基被醯胺化的重鏈)。然而，涉及本發明抗體重鏈羧基末端缺失的缺失突變體不限於上述缺失突變體，只要它們保留抗原結合活性和效應子功能即可。構成本發明之抗體的兩條重鏈可為選自由全長抗體和上述缺失突變體組成之群組中的任一種重鏈，或可為選自上述群組中的任意兩種類型的組合。個別缺失突變體的比例會受到產生根據本發明之抗體的培養的哺乳動物細胞之類型和培養條件的影響。根據本發明之抗體的主要成分的實例可包括在兩條重鏈的各羧基末端處刪除一個胺基酸殘基的抗體。
抗體的生物學活性的實例通常可包括抗原結合活性、藉由與抗原結合而被內化到表現抗原的細胞中的活性、中和抗原活性的活性、增強抗原活性的活性、抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)活性、補體依賴性細胞毒性(CDC)活性及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。根據本發明之抗體的功能是針對DLL3的結合活性，且較佳為藉由與DLL3結合而被內化至表現DLL3之細胞中的活性。此外，本發明之抗體可具有ADCC活性、CDC活性及/或ADCP活性，以及細胞內化活性。 IV. 抗 DLL3 抗體的生產
本發明之抗DLL3抗體可源自於任何物種。該物種的較佳實例可包括人類、猴、大鼠、小鼠和兔。當本發明之抗DLL3抗體源自於人類以外的物種時，較佳藉由熟知的技術來嵌合或人源化抗DLL3抗體。本發明之抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體，較佳為單株抗體。
本發明之抗DLL3抗體為可靶向腫瘤細胞的抗體。具體而言，本發明之抗DLL3抗體具有能夠識別腫瘤細胞的特性、能夠與腫瘤細胞結合的特性、及/或藉由細胞攝取被內化到腫瘤細胞中的特性，等等。因此，本發明的抗DLL3抗體可經由連接子與具有抗腫瘤活性的化合物結合以製備抗體-藥物結合物。
抗體對腫瘤細胞的結合活性可藉由流式細胞分析技術確認。抗體攝取至腫瘤細胞中可藉由以下來確認：(1)使用與抗體結合的二級抗體(螢光標記)在螢光顯微鏡下觀察細胞攝取的抗體的測定法(Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 751-761)、(2)使用與抗體結合的二級抗體(螢光標記)測量細胞攝取的螢光量的測定法(Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, 2004年12月)、或(3)使用與抗體結合的免疫毒素的Mab-ZAP測定，其中毒素在細胞攝取時釋放，從而抑制細胞生長(Bio Techniques 28：162-165, 2000年1月)。白喉毒素之催化區的重組結合蛋白和蛋白G可用作免疫毒素。
在本說明書中，術語「高內化能力」用於表示，已投予上述抗體和皂草素(saporin)標記的抗大鼠IgG抗體之DLL3表現細胞的存活率(其以相對於定義為100%的未添加抗體的細胞存活率的比率表示)較佳為70%或更低，更佳為60%或更少。
本發明之抗腫瘤抗體-藥物結合物包含發揮抗腫瘤作用的結合化合物。因此，較佳的，但非必須的，抗體本身應具有抗腫瘤作用。為了在腫瘤細胞中特異性及/或選擇性地發揮抗腫瘤化合物的細胞毒性之目的，重要且較佳為該抗體應具有被內化並轉移至腫瘤細胞中的特性。
抗DLL3抗體可藉由本領域常用的方法用以多肽作為抗原免疫對動物，然後收集並純化在其活體中產生的抗體來獲得。較佳使用保留三維結構的DLL3作為抗原。此類方法之實例可包括DNA免疫方法。
抗原的來源並不限於人類，因此亦可用來源於非人類之動物(諸如小鼠或大鼠)的抗原對動物進行免疫。在此情況下，可藉由檢查所獲得的結合至異源抗原的抗體與人類抗原的交叉反應性來選擇適用於人類疾病的抗體。
此外，產生針對該抗原之抗體的抗體產生細胞可根據已知的方法與骨髓瘤細胞融合(例如，Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497；及Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980))，以建立融合瘤，從而獲得單株抗體。
在下文中，將具體描述獲得針對DLL3的抗體的方法。
總體概述。最初，選擇可以產生本技術的抗體的靶多肽。例如，可針對全長DLL3蛋白或針對DLL3蛋白的胞外域的一部分產生抗體。產生針對此類標靶多肽之抗體的技術為本領域技術人員所熟知。此類技術之實例包括，例如，但不限於，那些涉及顯示庫(display library)、異體或人類小鼠、融合瘤等的技術。本技術範圍內的標靶多肽包括任何源自DLL3蛋白的多肽，其含有能夠引發免疫反應的胞外域。
應理解，針對DLL3蛋白及其片段的重組工程化抗體和抗體片段，例如抗體相關多肽，是適於根據本揭示使用。
可用於本文所述技術之抗DLL3抗體包括單株和多株抗體，以及抗體片段，諸如Fab、Fab'、F(ab′) 2、Fd、scFv、雙功能抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或抗體片段。已經描述了可用於高產量生產含有抗體Fv的多肽，例如Fab'和F(ab′) 2抗體片段的方法。參見美國專利號5,648,237。
一般而言，抗體是從原始物種中獲得的。更特別是，獲得對標靶多肽抗原具有特異性的起源物種抗體的輕鏈、重鏈或兩者之可變部分的核酸或胺基酸序列。起源物種是可用於產生本技術的抗體或抗體庫之任何物種，例如大鼠、小鼠、兔、雞、猴、人類等。
噬菌體或噬菌粒顯示技術對於衍生本技術之抗體是有用的技術。產生和選殖單株抗體的技術為本領域技術人員所熟知。編碼本技術之抗體的序列的表現可在大腸桿菌( E. coli)中進行。
由於核酸編碼序列的簡併性(degeneracy)，編碼與天然存在之蛋白質實質上相同的胺基酸序列的其他序列可用於實施本技術中。這些包括，但不限於包括編碼上述多肽之全部或部分核酸序列的核酸序列，其藉由置換編碼序列內功能等同之胺基酸殘基的不同密碼子而改變，從而產生緘默變化。應理解，根據本技術的免疫球蛋白的核苷酸序列容許藉由標準方法計算之高達25%的序列同源性變異(“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.)，只要此類變異體形成識別DLL3蛋白的有效抗體。例如，多肽序列中的一個或多個胺基酸殘基可被另一種具有相似極性的胺基酸取代，該胺基酸作為功能等效物，導致緘默改變。序列內胺基酸的取代物可選自該胺基酸所屬類別的其他成員。例如，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸。極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸和麩醯胺。帶正電荷(鹼性)之胺基酸包括精胺酸、離胺酸和組胺酸。帶負電荷(酸性)之胺基酸包括天冬胺酸和麩胺酸。亦包括在本技術範圍內的是蛋白質或其片段或衍生物，其在轉譯期間或之後被差異修飾，例如，藉由醣基化、蛋白水解切割、與抗體分子或其他細胞配體的連接等。此外，免疫球蛋白編碼核酸序列可在活體外或活體內突變以產生及/或破壞轉譯、起始及/或終止序列，或在編碼區產生變異及/或形成新的限制性內切酶位點或將前-現有的破壞，以促進進一步的體外修飾。可以使用本領域已知的任何突變誘發技術包括，但不限於活體外定突變誘發， J. Biol.Chem.253:6551、使用Tab連接子(Pharmacia)等等。
多株抗血清及免疫原的製備。產生本技術的抗體或抗體片段的方法通常包括以純化的DLL3蛋白或其片段或以表現DLL3蛋白或其片段的細胞免疫受試者(通常為非人類受試者，例如小鼠或兔)。適當的免疫原性製劑可包含例如重組表現的DLL3蛋白或化學合成的DLL3肽。DLL3蛋白或其部分或片段的胞外域可用作免疫原，在使用用於製備多株和單株抗體的標準技術來產生與DLL3蛋白或其部分或片段結合的抗DLL3抗體。
全長DLL3蛋白或其片段可用作免疫原的片段。在一些具體實施例中，DLL3片段包含DLL3的胞外域，因此針對該肽產生的抗體與DLL3蛋白形成特異性免疫複合物。
DLL3的胞外域長度為466個胺基酸，橫跨全長DLL3蛋白的27-492個胺基酸。在一些具體實施例中，抗原性DLL3肽包含至少5、8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸殘基。依據用途和根據本領域技術人員熟知的方法，有時需要較長的抗原肽而不是較短的抗原肽。給定之表位的多聚體(multimers)有時比單體更有效。
如果需要，DLL3蛋白(或其片段)的免疫原性可藉由與載體蛋白(諸如，鑰孔蟲戚血蘭素(KLH)或卵白蛋白(OVA))融合或結合來增加。許多此類載體蛋白為本領域已知的。亦可將DLL3蛋白與習知佐劑(諸如，弗氏(Freund)完全或不完全佐劑)結合，以增強受試者對多肽的免疫反應。用於增加免疫反應的各種佐劑包括，但不限於弗氏佐劑(完全及不完全)、礦物凝膠(例如，氫氧化鋁)、表面活性物質(例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子、肽、油乳劑、二硝基酚等)、人類佐劑(諸如卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)及小棒狀桿菌( Corynebacterium parvum))或類似的免疫刺激化合物。這些技術在本領域中是標準的。
在描述本技術時，免疫反應可被描述為「初級」或「次級」免疫反應。初級免疫反應，亦被敘述為「保護性」免疫反應，係指個體由於某些初始暴露(例如，初始「免疫」)而對特定抗原(例如，DLL3蛋白)產生的免疫反應。在一些具體實施例中，免疫可藉由給個體接種含有抗原的疫苗而發生。例如，該疫苗可為包含一種或多種DLL3蛋白衍生之抗原的DLL3疫苗。初級免疫反應會隨著時間的推移而弱化或減弱，甚至會消失或至少減弱到無法檢測到。因此，本技術亦關於「次級」免疫反應，其在本文中也被敘述為「記憶免疫反應」。術語次級免疫反應係指在已經產生初級免疫反應之後在個體中引發的免疫反應。
因此，可引發次級免疫反應，例如，以增強已經弱化或減弱的現有免疫反應，或重建已消失或無法再檢測到的先前免疫反應。次級或記憶免疫反應可為體液(抗體)反應或細胞反應。在抗原第一次呈遞時產生的記憶B細胞受到刺激時，會發生次級或記憶體液反應。延遲型過敏(DTH)反應是一種由CD4 +T細胞介導之細胞次級或記憶免疫反應。第一次接觸抗原會引發免疫系統，而另外的曝露接觸會導致DTH。
適當免疫後，可從受試者的血清中製備抗DLL3抗體。如果需要，針對DLL3蛋白的抗體分子可從哺乳動物中分離(例如，從血液中)，並藉由熟知的技術進一步純化，諸如多肽A層析以獲得IgG流分。
單株抗體。在本技術的一個具體實施例中，該抗體是抗DLL3單株抗體。例如，在一些具體實施例中，抗DLL3單株抗體可為人類或小鼠抗DLL3單株抗體。為了製備針對DLL3蛋白或其衍生物、片段、類似物或同源物的單株抗體，可利用提供任何藉由連續細胞株培養來產生抗體分子的技術。此類技術包括，但不限於融合瘤技術(參見，例如Kohler & Milstein, 1975. Nature256：495-497)；融合瘤技術(Trioma technique)；人類B細胞融合瘤技術(參見，例如Kozbor, et al., 1983. Immunol.Today4：72)及EBV融合瘤技術，以生產人類單株抗體(參見，例如Cole, et al., 1985.In：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)。人類單株抗體可用於實施本技術並可藉由使用人類融合瘤來生產(參見，例如Cote, et al., 1983. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030)或藉由在活體外以艾司坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus)轉化人類B細胞(參見，例如Cole, et al., 1985.In：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)。例如，可分離編碼抗體區域的核酸族群。將利用源自編碼抗體保守區之序列的引子的PCR用於從群體中擴增編碼抗體之一部分的序列，然後從擴增的序列重建編碼抗體或其片段(例如可變域)的DNA。此類擴增序列亦可與編碼其他蛋白質(例如噬菌體外殼或細菌細胞表面蛋白)的DNA融合，用於在噬菌體或細菌上表現及顯示融合多肽。然後可表現擴增的序列，並例如基於表現的抗體或其片段對存在於DLL3蛋白上的抗原或表位的親和力來進一步選擇或分離。或者，表現抗DLL3單株抗體的融合瘤可藉由免疫受試者，然後使用常規方法從受試者的脾臟中分離融合瘤來製備。參見，例如Milstein et al.,(Galfre and Milstein, Methods Enzymol(1981) 73：3-46)。使用標準方法篩選融合瘤將產生不同特異性(即，針對不同表位)和親和力的單株抗體。可使用具有所需特性(例如DLL3結合)的選定單株抗體，如藉由融合瘤表現，其可與諸如聚乙二醇(PEG)的分子結合以改變其特性，或可分離編碼它的cDNA，以各種方式定序和操作。可將合成的樹枝狀聚合物樹添加至反應性胺基酸側鏈，例如離胺酸，以增強DLL3蛋白的免疫原特性。此外，CPG-二核苷酸技術可用於增強DLL3蛋白的免疫原特性。其他操作包括取代或刪除導致抗體在儲存期間或投予受試者後不穩定的特定胺基醯基殘基，以及提高DLL3蛋白之抗體親和力的親和力成熟技術。
融合瘤技術。在一些具體實施例中，本技術的抗體為融合瘤所產生的抗DLL3單株抗體，該融合瘤包括從轉基因非人動物(例如，轉基因小鼠)獲得的B細胞，該轉基因動物的基因組包含與永生化細胞融合的人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因。融合瘤技術包括本領域已知的技術的那些，並被教示於Harlow et al., Antibodies ： A Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988)；Hammerling et al., Monoclonal And T-Cell Hybridomas,563-681 (1981)。其他產生融合瘤和單株抗體的方法是本領域技術人員所熟知的。
噬菌體顯示技術。如上所述，本技術的抗體可藉由重組DNA和噬菌體顯示技術的應用產生。例如，可使用本領域已知的各種噬菌體展示方法製備抗DLL3抗體。在噬菌體展示方法中，功能性抗體域顯示在攜帶編碼它們的多核苷酸序列之噬菌體顆粒的表面上。藉由直接選擇抗原，通常是結合或捕獲到固體表面或珠子的抗原，從全部或組合抗體庫(例如，人類或鼠類)中選擇具有所需結合特性的噬菌體。這些方法中使用的噬菌體通常是絲狀噬菌體，包括fd和M13，具有重組融合至噬菌體基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或雙硫穩定化Fv抗體域。此外，方法可適用於構建Fab表現庫(參見，例如Huse, et al., Science246：1275-1281, 1989)以允許快速有效地鑑定對DLL3多肽具有所需特異性的單株Fab片段，例如多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物。可用於製備本技術之抗體的噬菌體顯示方法的其他實例包括敘述於以下中的那些：Huston et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A., 85：5879-5883, 1988；Chaudhary et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,87：1066-1070, 1990；Brinkman et al., J. Immunol.Methods182：41-50, 1995；Ames et al., J. Immunol.Methods184：177-186, 1995；Kettleborough et al., Eur.J . Immunol.24：952-958, 1994；Persic et al., Gene187：9-18, 1997；Burton et al., Advances in Immunology57：191-280, 1994；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 96/06213；WO 92/01047 (Medical Research Council et al.)；WO 97/08320 (Morphosys)；WO 92/01047 (CAT/MRC)；WO 91/17271 (Affymax)；及美國專利號5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727及5,733,743。用於經雙硫鍵連接多肽在噬菌體顆粒表面以顯示多肽的方法已敘述於Lohning，美國專利號6,753,136。如上述參考文獻中所述，在噬菌體選擇之後，來自噬菌體的抗體編碼區可被分離並用於產生完整的抗體，包括人類抗體，或任何其他所需的抗原結合片段，並在包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母菌和細菌的任何所需的宿主中表現。例如，亦可使用本領域已知的方法使用重組產生Fab、Fab’及F(ab′) 2片段的技術，諸如敘述於以下中的技術：WO 92/22324；Mullinax et al., BioTechniques12：864-869, 1992；及Sawai et al., AJRI34：26-34, 1995；及Better et al., Science240：1041-1043, 1988。
一般而言，可針對合適的抗原選擇選殖到顯示載體中的雜合抗體或雜合抗體片段，以鑑定保持良好結合活性的變異體，因為抗體或抗體片段將存在於噬菌體或噬菌粒顆粒的表面上。參見，例如Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)。然而，其他載體形式可用於此方法，諸如將抗體片段庫選殖至裂解的噬菌體載體(修飾的T7或Lambda Zap系統)中以進行選擇及/或篩選。
重組抗 DLL3 抗體之表現。如上所述，本技術的抗體可藉由重組DNA技術的應用產生。編碼本技術的抗DLL3抗體的重組多核苷酸構建體通常包括與抗DLL3抗體鏈的編碼序列有效連接的表現控制序列，包括天然相關的或異源的啟動子區。因此，本技術的另一方面包括含有一個或多個編碼本技術之抗DLL3抗體的核酸序列的載體。對於本技術的一種或多種多肽的重組表現，藉由本領域熟知及如下文詳述的重組DNA技術，將包含編碼抗DLL3抗體的全部或部分核苷酸序列的核酸插入適當的選殖載體或表現載體中(即，包含用於轉錄和轉譯插入之多肽編碼序列的必要元件的載體)。產生載體之多樣族群的方法已經描述於Lerner et al.，美國專利號6,291,160及6,680,192。
一般而言，可用於重組DNA技術的表現載體通常是質體的形式。在本揭示中，「質體」和「載體」可互換使用，因為質體是最常用的載體形式。然而，本技術旨在包括此類其他形式的表現載體，其等在技術上不是質體，諸如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)，它們具有等同的功能。此類病毒載體允許感染受試者並在該受試者中表現構建體。在一些具體實施例中，表現控制序列為在能夠轉化或轉染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統。一旦將載體併入合適的宿主中，將宿主維持在適於編碼抗DLL3抗體的核苷酸序列的高水平表現的條件下，並收集和純化抗DLL3抗體，例如交叉反應的抗DLL3抗體。一般參見U.S. 2002/0199213。這些表現載體通常可作為游離基因體或作為宿主染色體DNA的組成部分在宿主生物體中複製。通常，表現載體包含選擇標記，例如安比西林抗性或潮黴素(hygromycin)抗性，以允許檢測那些用所需DNA序列轉化的細胞。載體亦可編碼訊號肽，例如果膠酸裂解酶(pectate lyase)，可用於指導胞外抗體片段的分泌。參見美國專利號5,576,195。
本技術的重組表現載體包含編碼具有DLL3結合特性之蛋白質的核酸，其形式適合於在宿主細胞中表現該核酸，其意指重組表現載體包括一種或多種調節序列，其基於要用於表現的宿主細胞而選擇，其與要表現的核酸序列可操作地連接。在重組表現載體中，「可操作地連接」意指將感興趣的核苷酸序列以允許核苷酸序列表現的方式連接至調節序列(例如，在活體外轉錄/轉譯系統中或當載體被導入宿主細胞時在宿主細胞中)。術語「調控序列」旨在包括啟動子、增強子和其他表現控制元件(例如，聚腺苷酸化訊號)。此類調控序列敘述於，例如，Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。調節序列包括指導核苷酸序列在許多類型的宿主細胞中持續型表現的那些序列及指導核苷酸序列僅在某些宿主細胞中表現的那些序列(例如，組織特異性調節序列)。本領域技術人員將理解，表現載體的設計可取決於諸如要轉化之宿主細胞的選擇、所需多肽的表現水平等因素。可用作重組多肽表現之啟動子(例如抗DLL3抗體)的典型調控序列包括例如，但不限於3-磷酸甘油酸激酶和其他醣解酶的啟動子。誘導型酵母菌啟動子，除其他外，包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。在一個具體實施例中，編碼本技術的抗DLL3抗體的多核苷酸可操作地連接至 ara B啟動子，並可在宿主細胞中表現。參見美國專利號5,028,530。可將本技術的表現載體導入宿主細胞，從而產生由本文所述之核酸編碼的多肽或肽，包括融合多肽(例如，抗DLL3抗體等)。
本技術的另一方面關於抗DLL3抗體表現宿主細胞，其含有編碼一種或多種抗DLL3抗體的核酸。本技術的重組表現載體可被設計用於在原核或真核細胞中表現抗DLL3抗體。例如，抗DLL3抗體可在細菌細胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表現載體)、真菌細胞(如酵母菌、酵母細胞)或哺乳動物細胞中表現。合適的宿主細胞進一步敘述於Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。或者，重組表現載體可在活體外轉錄及轉譯，例如使用T7啟動子調控序列和T7聚合酶。先前已經描述用於經由隨機產生的多核苷酸序列的表現來製備和篩選具有預定特性的多肽(例如抗DLL3抗體)的方法。參見美國專利號5,763,192；5,723,323；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862；6,492,107；6,569,641。
在原核生物中多肽的表現最常以含有指導融合或非融合多肽表現的組成型或誘導型啟動子之載體在大腸桿菌中進行。融合載體將許多胺基酸添加至其中編碼的多肽中，通常添加至重組多肽的胺基末端。此類融合載體通常有三個目的：(i)增加重組多肽的表現；(ii) 增加重組多肽的溶解度；及(iii)藉由在親和性純化中充當配體來幫助純化重組多肽。通常，在融合表現載體中，在融合部分和重組多肽的連接處導入蛋白水解切割位點，以在融合多肽純化後能夠將重組多肽與融合部分分離。此類酶及其同族識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表現載體包括pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene67：31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.)及pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.)，其等分別融合麩胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合多肽或多肽A至標靶重組多肽上。
合適的誘導型非融合大腸桿菌表現載體的實例包括pTrc (Amrann et al., (1988) Gene69：301-315)及pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)。經由多肽融合靶向組裝不同的活性肽或蛋白質域以產生多功能多肽的方法已經描述於Pack et al.，美國專利號6,294,353；6,692,935。在大腸桿菌中最大化重組多肽(例如抗DLL3抗體)表現的一種策略是在宿主細菌中表現多肽，而該宿主細菌的蛋白水解切割重組多肽的能力受損。參見，例如Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128。另一種策略是改變要插入表現載體之核酸的核酸序列，以使每個胺基酸的個別密碼子為表現宿主(例如，大腸桿菌)中優先使用的密碼子(參見，例如Wada, et al., 1992. Nucl.Acids Res.20：2111-2118)。本技術之核酸序列的此類改變可藉由標準DNA合成技術進行。
在另一具體實施例中，抗DLL3抗體表現載體為酵母表現載體。用於在酵母菌釀酒酵母菌( Saccharomyces cerevisiae)中表現的載體實例包括pYepSec1 (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6：229-234)、pMFa (Kurjan and Herskowitz, Cell30：933-943, 1982)、pJRY88 (Schultz et al., Gene54：113-123, 1987)、pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)及picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.)。或者，可使用桿狀病毒表現載體在昆蟲細胞中表現抗DLL3抗體。可用於在經培養之昆蟲細胞(例如SF9細胞)中表現多肽(例如抗DLL3抗體)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith, et al., Mol.Cell.Biol.3：2156-2165, 1983)及pVL系列(Lucklow and Summers, 1989. Virology170：31-39)。
在又一具體實施例中，編碼本技術之抗DLL3抗體的核酸係使用哺乳動物表現載體在哺乳動物細胞中表現。哺乳動物表現載體之實例包括，例如但不限於pCDM8(Seed, Nature329：840, 1987)及pMT2PC (Kaufman, et al., EMBO J.6：187-195, 1987)。當用於哺乳動物細胞時，表現載體的控制功能通常由病毒調節元件提供。例如，常用的啟動子源自於多瘤病毒(polyoma virus)、腺病毒2、巨細胞病毒(cytomegalovirus)和猿猴病毒40。對於可用於表現本技術之抗DLL3抗體的其他適合的原核和真核細胞表現系統，參見，例如Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL.2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989中的第16及17章。
在另一具體實施例中，重組哺乳動物表現載體能夠指導核酸在特定細胞類型(例如，組織特異性調節元件)中的表現。組織特異性調節元件是本領域已知的。合適的組織特異性啟動子的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝臟特異性；Pinkert, et al., Genes Dev.1：268-277, 1987)、淋巴特異性啟動子(Calame and Eaton, Adv.Immunol.43：235-275, 1988)、T細胞受體啟動子(Winoto and Baltimore, EMBO J. 8：729-733, 1989)及免疫球蛋白啟動子(Banerji, et al., 1983. Cell33：729-740; Queen and Baltimore, Cell33：741-748, 1983.)、神經元特異性啟動子(例如，神經元絲啟動子；Byrne and Ruddle, Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5473-5477, 1989)、胰特異性啟動子(Edlund, et al., 1985.Science 230：912-916)、及乳腺特異性啟動子(例如，乳清啟動子；美國專利號4,873,316及歐洲申請公開號264,166)。亦包括發育調節的啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel and Gruss, Science249：374-379, 1990)及α-胎蛋白啟動子(Campes and Tilghman, Genes Dev.3：537-546, 1989)。
本方法的另一方面涉及其中已導入本技術的重組表現載體的宿主細胞。術語「宿主細胞」和「重組宿主細胞」在本文中可互換使用。應理解，此類術語不僅指特定的受試細胞，而且亦指此類細胞的子代或潛在子代。因為某些修飾可能由於突變或環境影響而在後代中發生，所以此類子代實際上可能與親代細胞不同，但仍包括在本文所使用術語的範圍內。
宿主細胞可為任何原核或真核細胞。例如，抗DLL3抗體可在細菌細胞，諸如大腸桿菌、昆蟲細胞、酵母菌或哺乳動物細胞中表現。哺乳動物細胞是用於表現編碼免疫球蛋白或其片段之核苷酸片段的合適宿主。參見Winnacker, From Genes To Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)。本領域已經開發許多能夠分泌完整異源蛋白的合適宿主細胞株，包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株、各種COS細胞株、HeLa細胞、L細胞和骨髓瘤細胞株。在一些具體實施例中，細胞為非人類的。這些細胞的表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子、增強子和必要的加工訊息位點，諸如核醣體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點及轉錄終止子序列。Queen et al., Immunol.Rev .89：49, 1986。說明性的表現控制序列係源自內源基因、巨細胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳突病毒等的啟動子。Co et al., J Immunol.148：1149, 1992。其他合適的宿主細胞為本領域技術人員已知的。
可經由習知轉化或轉染技術將載體DNA導入原核或真核細胞。如本文所使用，術語「轉化」和「轉染」旨在意指多種本領域公認的用於將外源核酸(例如，DNA)導入宿主細胞的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱、DEAE-葡聚醣介導的轉染、脂質轉染、電穿孔、基因槍法或基於病毒的轉染。用於轉化哺乳動物細胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生質體融合、微脂體、電穿孔和顯微注射(一般參見，Sambrook et al., Molecular Cloning)。轉化或轉染宿主細胞的合適方法可見於Sambrook, et al.(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL.2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)及其他實驗室手冊。依據細胞宿主的類型，可藉由熟知的方法將含有感興趣的DNA片段的載體轉移至宿主細胞中。
對於哺乳動物細胞的穩定轉染，已知依據所使用的表現載體和轉染技術，只有一小部分細胞可將外源DNA整合至它們的基因體中。為了識別和選擇這些整合物，通常將編碼選擇標記(例如，對抗生素的抗性)的基因與感興趣的基因一起導入宿主細胞。各種可選擇的標記包括那些賦予藥物抗性的標記，例如G418、潮黴素和胺甲喋呤(methotrexate)。編碼選擇標記之核酸可在與編碼抗DLL3抗體之核酸的相同載體上導入宿主細胞，或可在單獨的載體上導入。以導入的核酸穩定轉染的細胞可藉由藥物選擇來鑑定(例如，已併入選擇標記基因的細胞將存活，而其他細胞則會死亡)。
包含本技術的抗DLL3抗體的宿主細胞，諸如培養中的原核或真核宿主細胞，可用於產生(即，表現)重組抗DLL3抗體。在一個具體實施例中，該方法包含在合適的培養基中培養宿主細胞(其中已經導入編碼抗DLL3抗體的重組表現載體)，以產生抗DLL3抗體。在另一具體實施例中，該方法進一步包含從培養基或宿主細胞中分離抗DLL3抗體的步驟。一旦表現，就從培養基和宿主細胞中純化抗DLL3抗體的採集物，例如抗DLL3抗體或抗DLL3抗體相關多肽。抗DLL3抗體可根據本領域的標準程序進行純化，包括HPLC純化、管柱層析、凝膠電泳等。在一個具體實施例中，在宿主生物體中產生抗DLL3抗體係藉由Boss等人之方法(美國專利號4,816,397)。通常，抗DLL3抗體鏈與訊號序列一起表現並因而釋放至培養基中。然而，如果抗DLL3抗體鏈不是由宿主細胞自然分泌的，則可藉由以溫和的清潔劑處理來釋放抗DLL3抗體鏈。重組多肽的純化在本領域是熟知的並包括硫酸銨沉澱、親和性層析純化技術、管柱層析、離子交換純化技術、凝膠電泳等(一般參見Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)。
編碼抗DLL3抗體的多核苷酸，例如抗DLL3抗體編碼序列，可併入轉基因中以導入轉基因動物的基因體中並隨後在轉基因動物的乳汁中表現。參見，例如美國專利號5,741,957、5,304,489及5,849,992。合適的轉基因包括與乳腺特異性基因如酪蛋白或β‑乳球蛋白的啟動子和增強子有效連接的輕鏈及/或重鏈的編碼序列。為了生產轉基因動物，可將轉基因顯微注射至受精的卵母細胞中，或可將轉基因併入胚胎幹細胞的基因體中，然後將這些細胞的細胞核轉移至無核的卵母細胞中。
單鏈抗體。在一個具體實施例中，本技術之抗DLL3抗體為單鏈抗DLL3抗體。根據本技術，技術可適用於生產對DLL3蛋白特異的單鏈抗體(參見，例如美國專利號4,946,778)。可用於產生本技術之單鏈Fvs及抗體的技術的實例包括敘述於以下中的那些技術：美國專利號4,946,778及5,258,498；Huston et al., Methods in Enzymology, 203：46-88, 1991；Shu, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,90：7995-7999, 1993；及Skerra et al., Science240：1038-1040, 1988。
嵌合及人源化抗體。在一個具體實施例中，本發明的抗DLL3抗體為嵌合抗DLL3抗體。在一個具體實施例中，本發明的抗DLL3抗體為人源化抗DLL3抗體。在本技術之一個具體實施例中，供體和接受體抗體是來自不同物種的單株抗體。例如，接受體抗體為人類抗體(以盡量減少其在人體內的抗原性)，在這種情況下，產生的CDR移植抗體被稱為「人源化」抗體。
包含人類和非人類部分的重組抗DLL3抗體，例如嵌合和人源化單株抗體，可使用標準重組DNA技術製備，並在本技術的範圍內。對於一些用途，包括本技術的抗DLL3抗體在活體內的用途以及這些藥劑在活體外檢測測定中的用途，可使用嵌合或人源化的抗DLL3抗體。此類嵌合和人源化單株抗體可藉由本領域已知的重組DNA技術產生。此類有用之方法包括例如，但不限於以下所述之方法：國際申請號PCT/US86/02269；美國專利號5,225,539；歐洲專利號184187；歐洲專利號171496；歐洲專利號173494；PCT國際公開號WO86/01533；美國專利號4,816,567；5,225,539；歐洲專利號125023；Better, et al., 1988. Science240：1041-1043；Liu, et al., 1987. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu, et al., 1987. J. Immunol.139：3521-3526；Sun, et al., 1987. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura, et al., 1987. Cancer Res.47：999-1005；Wood, et al., 1985. Nature314：446-449；Shaw, et al., 1988. J. Natl.Cancer Inst.80：1553-1559；Morrison (1985) Science229：1202-1207；Oi, et al.(1986) BioTechniques4：214；Jones, et al., 1986. Nature321：552-525；Verhoeyan, et al., 1988. Science239：1534；Morrison, Science229：1202, 1985；Oi et al., BioTechniques4：214, 1986；Gillies et al., J. Immunol.Methods,125：191-202, 1989；美國專利號5,807,715；及Beidler, et al., 1988. J. Immunol.141：4053-4060。例如，將抗體人源化可使用各種技術，包括CDR移植(EP 0 239 400；WO 91/09967；美國專利號5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,248,516；EP460167)、鑲飾(veneering)或重塑(resurfacing) (EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E. A., Molecular Immunology, 28：489-498, 1991；Studnicka et al., Protein Engineering7：805-814, 1994；Roguska et al., PNAS91：969-973, 1994)及鏈式混排(chain shuffling) (美國專利號5,565,332)。在一個具體實施例中，以特異性選擇的限制酶消化編碼鼠類抗DLL3單株抗體的cDNA以去除編碼Fc恆定區的序列，並取代編碼人類Fc恆定區的cDNA的等效部分(參見Robinson et al.，PCT/US86/02269；Akira et al., 歐洲專利申請號184,187；Taniguchi，歐洲專利申請號171,496；Morrison et al.，歐洲專利申請號173,494；Neuberger et al.，WO 86/01533；Cabilly et al.美國專利號4,816,567；Cabilly et al.，歐洲專利申請號125,023；Better et al.(1988) Science240：1041-1043；Liu et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu et al.(1987) J Immunol139：3521-3526；Sun et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：214-218；Nishimura et al.(1987) Cancer Res47：999-1005；Wood et al.(1985) Nature314：446-449；及Shaw et al.(1988) J. Natl.Cancer Inst.80：1553-1559；美國專利號6,180,370；美國專利號6,300,064；6,696,248；6,706,484；6,828,422。
在一個具體實施例中，本技術提供人源化抗DLL3抗體的構建，該抗體不太可能誘導人類抗小鼠抗體(以下稱為「HAMA」)反應，同時仍具有有效的抗體效應功能。如本文所使用，與抗體相關的術語「人類的」和「人源化的」涉及預期在人類受試者中引發治療上可耐受的弱免疫原性反應的任何抗體。在一個具體實施例中，本技術提供人源化抗DLL3抗體、重鏈和輕鏈免疫球蛋白。
CDR 移植抗體。在一些具體實施例中，本技術之抗DLL3抗體為抗DLL3 CDR移植抗體。一般而言，用於產生抗DLL3 CDR抗體的供體和接受體抗體是來自不同物種的單株抗體；通常，接受體抗體為人類抗體(以最小化其在人體內的抗原性)，在這種情況下，所產生之CDR移植抗體被稱為「人源化」抗體。具體而言，「人源化抗體」係指包含至少一個鏈的抗體，該鏈包含來自人類抗體鏈的可變區框架殘基和至少一個來自非人類抗體(例如，小鼠)的互補決定區(CDR)。如本文所使用，術語「人類抗體」旨在包括具有源自人免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。然而，如本文所使用，術語「人類抗體」並非意圖包括其中源自另一種哺乳動物物種(例如小鼠)的CDR序列已被移植至人類框架序列上的抗體。移植物可為接受體抗體的單個V H或V L內的單個CDR(或甚至單個CDR的一部分)，或可為V H及V L之一者或兩者內的多個CDR(或其部分)。通常，接受體抗體的所有可變域中的所有三個CDR都將被對應的供體CDR置換，儘管只需置換所需的數量，以使所得的CDR移植抗體與DLL3蛋白充分結合。產生CDR移植和人源化抗體的方法被教示於Queen et al.美國專利號5,585,089；美國專利號5,693,761；美國專利號5,693,762；及Winter U.S. 5,225,539；及EP 0682040。用於製備V H和V L多肽的方法被教示於Winter et al.，美國專利號4,816,397；6,291,158；6,291,159；6,291,161；6,545,142；EP 0368684；EP0451216；及EP0120694。
在從同一家族及/或同一家族成員中選擇合適的框架區候選物後，藉由將來自原始物種的CDR移植到雜合框架區中來產生重和輕鏈可變區之一或兩者。關於上述任一方面的雜合抗體或具有雜合可變鏈區的雜合抗體片段的組裝，可使用本領域技術人員已知的習知方法來完成。例如，可藉由寡核苷酸合成及/或PCR來產生編碼本文所述之雜合可變域的DNA序列(即，基於目標物種的框架和來自起源物種的CDR)。編碼CDR區的核酸亦可使用合適的限制酶從起源物種抗體中分離出來，並藉由與合適的連接酶連接而連接到標靶物種框架中。或者，可藉由定點突變誘發改變起源物種抗體之可變鏈的框架區。
由於雜合體是從對應於各框架區的多個候選者中的選擇所構建的，因此存在許多適合根據本文所述原理構建的序列組合。因此，雜合物庫可組裝成具有各個框架區不同組合的成員。此類庫可為序列的電子資料集合或雜合物之物質集合。
此過程通常不會改變側接移植之CDR的接受體抗體的FR。然而，本領域技術人員有時可藉由置換給定FR的某些殘基以使FR更類似於供體抗體的對應FR來提高增進所產生之抗DLL3 CDR-移植之抗體的抗原結合親和力。取代的合適位置包括與CDR相鄰或能夠與CDR相互作用的胺基酸殘基(參見，例如US 5,585,089，尤其是第12-16欄)。或者，本領域技術人員可從供體FR開始，並將其修改為更類似於接受體FR或人類共通的FR。進行這些修飾的技術是本領域已知的。特別是，如果產生的FR與該位置的人類共通的FR相符，或與這種共通的FR至少90%或更多相同，與具有完全人類FR的相同抗體相比，這樣做可能不會顯著增加所產生之修飾的抗DLL3 CDR-移植之抗體的抗原性。
雙特異性抗體 (BsAbs) 。雙特異性抗體為一種可同時結合兩個具有不同結構之標靶的抗體，例如，兩個不同的標靶抗原、同一標靶抗原上的兩個不同表位。例如，可藉由合併識別相同或不同抗原的不同表位的重鏈及/或輕鏈來製備BsAbs。在一些具體實施例中，藉由分子功能，雙特異性結合劑在其兩個結合臂之一(一個VH/VL對)上結合一個抗原(或表位)，並在其第二個臂(一個不同的VH/VL對)上結合不同的抗原(或表位)。根據此定義，雙特異性結合劑具有兩個不同的抗原結合臂(在特異性和CDR序列二者中)，並對於它所結合的各抗原都是單價的。
本技術的雙特異性抗體(BsAb)和雙特異性抗體片段(BsFab)具有至少一個與例如DLL3特異性結合的臂和至少一個與第二標靶抗原特異性結合的其他臂。在某些具體實施例中，能夠與在細胞表面表現DLL3抗原的腫瘤細胞結合。
使用分子工程可生產多種雙特異性融合蛋白。例如，已構建了利用完整免疫球蛋白框架(例如，IgG)、單鏈可變片段(scFv)或其組合的BsAbs。在一些具體實施例中，該雙特異性融合蛋白是二價的，包含例如具有針對一種抗原之單個結合位點的scFv及具有針對第二種抗原的單個結合位點的Fab片段。在一些具體實施例中，該雙特異性融合蛋白是二價的，包含例如具有針對一種抗原之單個結合位點的scFv及具有針對第二種抗原的單個結合位點的scFv片段。在其他具體實施例中，該雙特異性融合蛋白是四價的，包含例如，具有針對一種抗原之二個結合位點及針對第二種抗原之二個相同scFv的免疫球蛋白(例如，IgG)。由兩個串聯的scFv單元構成的BsAbs已顯示是臨床上成功的雙特異性抗體形式。在一些具體實施例中，已設計BsAbs包含兩個串聯的單鏈可變片段(scFv)，使得結合腫瘤抗原(例如，DLL3)的scFv 與結合不同標靶抗原的scFv連接。
最近生產BsAbs的方法包括工程化的重組單株抗體，其具有額外的半胱胺酸殘基，因此它們的交聯比更常見的免疫球蛋白同型物更為強烈。參見，例如FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1221-1225 (1997)。另一種方法是工程化重組融合蛋白，將所需的雙重特異性將兩個或多個不同的單鏈抗體或抗體片段片段連接起來。參見，例如Coloma et al., Nature Biotech.15:159-163 (1997)。使用分子工程可生產多種雙特異性融合蛋白。
以相似方式產生連接兩個或多個不同單鏈抗體或抗體片段的雙特異性融合蛋白。重組方法可用於生產多種融合蛋白。在一些特定具體實施例中，根據本技術的BsAb包含免疫球蛋白和scFv，該免疫球蛋白包含重鏈和輕鏈。在一些特定具體實施例中，scFv與本文揭示之任何DLL3免疫球蛋白的重鏈的C末端相連。在一些特定具體實施例中，scFv與本文揭示之任何DLL3免疫球蛋白的輕鏈的C末端相連。在各種具體實施例中，scFv經由連接子序列與重鏈或輕鏈連接。通過PCR反應，將重鏈Fd與scFv框架內連接所需的適當連接子序列導入V L及V κ域。然後將編碼scFv的DNA片段連接至包含編碼CH1域之DNA序列的分期載體(staging vector)中。將所產生之scFv-CH1構建體切除並連接至含有編碼DLL3抗體之V H區的DNA序列的載體中。所得載體可用於轉染合適的宿主細胞，例如哺乳動物細胞，以表現雙特異性融合蛋白。
在一些具體實施例中，連接子為長度至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個或更多個胺基酸。在一些具體實施例中，連接子的特徵在於它傾向於不採用剛性的三維結構，而是為多肽(例如，第一及/或第二抗原結合位點)提供柔韌性。在一些具體實施例中，基於賦予BsAb的特定性質，例如穩定性的增加，在本文所述的BsAb中使用連接子。在一些具體實施例中，本技術之BsAb包含AG 4S連接子(SEQ ID NO：82)。在一些特定具體實施例中，本技術之BsAb包含(G 4S) n連接子，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大(SEQ ID NO：83)。
Fc 修飾。在一些具體實施例中，本技術的抗DLL3抗體包含變異體Fc區，其中該變異體Fc區包含相對於野生型Fc區(或親代Fc區)的至少一個胺基酸修飾，使得該分子對Fc受體(例如，FcγR)具有改變的親和力，前提是該變異體Fc區在基於Fc-Fc受體相互作用的晶體學和結構分析上，與Fc受體直接接觸的位置不具有取代，諸如揭示於Sondermann et al., Nature, 406:267-273 (2000)中的那些。Fc區內與諸如FcγR的Fc受體直接接觸的位置的實例包括胺基酸234-239 (鉸鏈區)、胺基酸265-269 (B/C環)、胺基酸297-299 (C7E環)和胺基酸327-332 (F/G)環。
在一些具體實施例中，本技術之抗DLL3抗體對於活化及/或抑制受體具有改變的親和力，具有含一個或多個胺基酸修飾之變異體Fc區，其中該一個或多個胺基酸修飾為以丙胺酸進行的N297取代，或以丙胺酸進行的K322取代。
醣基化修飾。在一些具體實施例中，本技術之抗DLL3抗體具有與親代Fc區相比具有變異體醣基化的Fc區。在一些具體實施例中，變異體醣基化包括不存在岩藻糖；在一些具體實施例中，變異體醣基化是由在GnT1缺陷型CHO細胞中的表現所引起的。
在一些具體實施例中，本技術的抗體相對於結合感興趣之抗原(例如DLL3)的合適參考抗體可具有修飾的醣基化位點，而不改變抗體的功能性，例如，與抗原的結合活性。如本文所使用，「醣基化位點」包括抗體中的任何特定胺基酸序列，寡糖(即，含有連接在一起的兩個或更多個單醣的碳水化合物)將特異性地且共價地連接至該序列。
寡糖側鏈通常經由N-或O-鍵結連接至抗體的骨架上。N-連接的醣基化係指寡糖部分連接至天冬醯胺酸殘基的側鏈。O-連接的醣基化係指寡糖部分與羥基胺基酸(例如，絲胺酸、蘇胺酸)的連接。例如，缺乏某些寡糖(包括岩藻糖和末端N-乙醯葡萄糖胺)的Fc-糖型(hDLL3-IgGln)可在特殊的CHO細胞中產生並呈現出增強的ADCC效應功能。
在一些具體實施例中，本文揭示的免疫球蛋白相關組成物的碳水化合物含量藉由添加或刪除醣基化位點進行修飾。用於修飾抗體之碳水化合物含量的方法為本領域所熟知的並包括於本技術中，參見，例如美國專利號6,218,149；EP 0359096B1；美國專利公開號US 2002/0028486；國際專利申請公開號WO 03/035835；美國專利公開號2003/0115614；美國專利號6,218,149；美國專利號6,472,511；其等全部皆藉由引用全文方式併入本文中。在一些具體實施例中，藉由刪除抗體的一個或多個內源性碳水化合物部分來修飾抗體(或其相關部分或組分)的碳水化合物含量。在一些特定具體實施例中，本技術包括藉由將位置297從天冬醯胺酸修飾成丙胺酸來刪除抗體Fc區的醣基化位點。
工程化糖型可用於多種目的，包括但不限於增強或降低效應功能。工程化糖型可藉由本領域技術人員已知的任何方法產生，例如藉由使用工程化或變異體表現菌株、藉由與一種或多種酶共表現，例如N-乙醯葡萄糖胺轉移酶III (GnTIII)、藉由在各種生物體或來自各種生物體的細胞株中表現包含Fc區的分子、或藉由在包含Fc區的分子已表現後修飾碳水化合物。產生工程化糖型的方法為本領域已知的，包括但不限於以下中所描述的那些方法：Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol.17：176-180；Davies et al., 2001, Biotechnol.Bioeng.74:288-294；Shields et al., 2002, J. Biol.Chem.277:26733-26740；Shinkawa et al., 2003, J. Biol.Chem.278:3466-3473；美國專利號6,602,684；美國專利申請號10/277,370；美國專利申請號10/113,929；國際專利申請號WO 00/61739A1；WO 01/292246A1；WO 02/311140A1；WO 02/30954A1；POTILLEGENT™技術(Biowa, Inc. Princeton, N.J.)；GLYCOMAB™醣基化工程技術(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)；其等各藉由引用全文方式併入本文中。參見，例如國際專利申請公開號WO 00/061739；美國專利申請公開號2003/0115614；Okazaki et al., 2004, JMB, 336：1239-49。
融合蛋白。在一個具體實施例中，本技術之抗DLL3抗體為融合蛋白。本技術之抗DLL3抗體當與第二種蛋白質融合時可用作抗原標籤。可與多肽融合的結構域的實例不僅包括異源訊號序列，還包括其他異源功能區。融合不一定需要是直接的，但可通過連接子序列發生。此外，本技術的融合蛋白亦可被工程化以改善抗DLL3抗體的特性。例如，可在抗DLL3抗體的N‑末端添加一個額外的胺基酸區，特別是帶電荷的胺基酸，以增進從宿主細胞純化期間或隨後的處理和儲存中的穩定性和持久性。此外，可將肽部分添加至抗DLL3抗體中以促進純化。可在最終製備抗DLL3抗體之前去除此種區域。添加肽部分以促進多肽的處理是本領域熟悉的常規技術。本技術之抗DLL3抗體可與標記序列融合，諸如促進融合多肽純化的肽。在選擇的具體實施例中，標記胺基酸序列是六-組胺酸肽(SEQ ID NO：84)，諸如以pQE載體提供之tag (QIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif)，其中許多是可商購的。如Gentz et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824, 1989，例如，六-組胺酸(SEQ ID NO：84)提供方便地純化融合蛋白。另一種可用於純化的肽標籤，「HA」標籤，對應於衍生自流感血球凝集素蛋白的表位。Wilson et al., Cell37：767, 1984。
因此，任何這些上述融合蛋白都可使用本技術的多核苷酸或多肽進行工程化。此外，在一些具體實施例中，本文所述之融合蛋白顯示增加的活體內半衰期。
與單獨的單體分泌蛋白或蛋白片段相比，具有雙硫鍵連接的二聚體結構(由於IgG)的融合蛋白可更有效地結合和中和其他分子。Fountoulakis et al., J. Biochem.270：3958-3964, 1995。
相似地，EP-A-O 464 533 (加拿大對應案2045869)揭示包含免疫球蛋白分子恆定區的不同部分及另一人類蛋白或其片段的融合蛋白。在許多情況下，融合蛋白中的Fc部分有利於治療和診斷，因此可導致例如藥物代動力學特性的改善。參見EP-A 0232 262。或者，在融合蛋白表現、檢測和純化後刪除或修飾Fc部分可能是需要的。例如，如果融合蛋白用作免疫抗原，則Fc部分會阻礙治療和診斷。在藥物發現中，諸如hIL‑5等人類蛋白質已與Fc部分融合，用於高通量篩選測定以鑑定hIL‑5的拮抗劑。Bennett et al., J. Molecular Recognition8：52-58, 1995；Johanson et al., J. Biol.Chem., 270：9459-9471, 1995。
抗原的製備：DLL3抗原可根據遺傳操作藉由使宿主細胞產生編碼抗原蛋白的基因來獲得。具體而言，可製作能夠表現抗原基因的載體，並將該載體導入宿主細胞，使該基因在其中表現，然後純化所表現的抗原。亦可藉由基於上述基因操作的抗原表現細胞或表現抗原的細胞株對動物進行免疫的方法獲得抗體。
或者，不使用抗原蛋白，抗體的獲得亦可藉由將抗原蛋白的cDNA併入表現載體中，然後將表現載體投予被免疫動物，並在該免疫動物體內表現抗原蛋白，從而在其中產生針對抗原蛋白的抗體。
在本發明中使用的抗DLL3抗體沒有特別限制。例如，可適當地使用由本案序列表中所示的胺基酸序列指定的抗體。本發明中使用的抗DLL3抗體較佳為具有以下特性的抗體： (1)具有以下特性的抗體： (a)   特異性結合DLL3，及 (b)   具有藉由與DLL3結合而被內化到表現DLL3的細胞中的活性；或 (2)根據上述(1)的抗體，其中該DLL3為人類DLL3。
獲得本發明之針對DLL3的抗體的方法並沒有特別限制，只要可獲得抗DLL3抗體即可。較佳為使用保留其構形的DLL3作為抗原。
獲得抗體的方法的一個實例可包括DNA免疫方法。DNA免疫法是一種涉及以抗原表現質體轉染動物(例如小鼠或大鼠)個體，然後在該個體中表現抗原以誘導針對抗原的免疫的方法。轉染方法包括將質體直接注射到肌肉的方法、將轉染試劑(諸如微脂體或聚乙烯亞胺)注射入靜脈的方法、使用病毒載體的方法、使用基因槍注射附著在質體上之金顆粒的方法、將大量質體溶液快速注射靜脈的流體動力學方法等。關於將表現質體注射到肌肉的轉染方法，一種稱為活體內電穿孔的技術，該技術涉及將電穿孔應用於質體的肌肉注射部位，已知是一種用於提高表現程度的方法(Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol.1998 Sep; 16 (9)：867-70或Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13; 96 (8)：4262-7)。此方法藉由在肌內注射質體之前以玻尿酸酶處理肌肉來進一步提高表現程度(McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ., Gene Ther.2001 Aug; 8 (16)：1264-70)。另外，雜交瘤製造可藉由已知的方法進行，亦可使用例如Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences, Inc.)進行。
獲得單株抗體的具體實例可包括以下程序： (a)  可藉由將DLL3 cDNA併入表現載體中來誘導免疫反應(例如，pcDNA3.1；Thermo Fisher Scientific Inc.)，並藉由電穿孔或基因槍等方法將載體直接投予待免疫動物(例如大鼠或小鼠)，以便在該動物體內表現DLL3。如果需要增強抗體力價，藉由電穿孔等方式投予載體可進行一次或多次，較佳為多次； (b)  從上述動物中收集含有抗體產生細胞的組織(例如淋巴結)，其中免疫反應已被誘導； (c)  骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)(例如小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞)的製備； (d)  產生抗體的細胞和骨髓瘤之間的細胞融合； (e)  選擇產生感興趣之抗體的雜交瘤組； (f)  分裂成單細胞殖株(選殖)； (g)  可選擇地，用於大量生產單株抗體之雜交瘤的培養，或接種雜交瘤的動物的繁殖；及/或 (h)  研究由此產生之單株抗體的生理活性(內化活性)和結合特異性，或檢查抗體作為標記試劑的特性。
本文使用的用於測量抗體力價的方法的實例可包括但不限於流式細胞分析技術和Cell-ELISA。
本發明之抗體亦包括為了降低對人類的異源抗原性而進行人工修飾的基因重組抗體，諸如嵌合抗體、人源化抗體及人類抗體，以及上述針對DLL3的單株抗體。這些抗體可藉由已知方法產生。
嵌合抗體的實例可包括可變區和恆定區彼此異源的抗體，諸如藉由將源自小鼠或大鼠的抗體的可變區與源自人類的恆定區結合而形成的嵌合抗體(參見Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 81, 6851-6855, (1984))。
人源化抗體之實力可包括藉由僅將互補決定區(CDR)併入人類來源之抗體所形成的抗體(參見Nature (1986) 321, p. 522-525)、根據CDR移植方法將來自某些框架的胺基酸殘基以及CDR序列併入人類抗體所形成的抗體(國際公開號WO90/07861)、及藉由修飾一些CDR的胺基酸序列同時保持抗原結合能力所形成的抗體。
本發明的抗體的其他實例可包括與DLL3結合的人類抗體。抗DLL3人抗體意指僅具有源自人類染色體之抗體的基因序列的人類抗體。抗DLL3人類抗體可藉由使用產生人類抗體之小鼠的方法獲得，該小鼠具有包含人類抗體的重鏈和輕鏈基因的人類染色體片段(參見Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143；Kuroiwa, Y. et al., Nucl.Acids Res.(1998) 26, p. 3447-3448；Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999；Tomizuka, K. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2000) 97, p. 722-727；等等)。
此類產生人類抗體的小鼠可藉由使用基改動物特異性產生，其中內源性免疫球蛋白重鏈和輕鏈的基因座被破壞，然後使用酵母人工染色體(YAC)載體等導入人類免疫球蛋白重鏈和輕鏈的基因座被破壞，然後從此類基改動物中生產出剔除動物和轉基因動物，然後將這些動物相互繁殖。
另外，抗DLL3人抗體亦可藉由以編碼此類人類抗體的各重鏈和輕鏈的cDNA，或者較佳以包含該cDNA的載體，根據基因重組技術轉化真核細胞，然後培養產生基改的人類單株抗體的轉化細胞，從而從培養上清液中獲得抗體。
在此上下文，真核細胞，且較佳為哺乳動物細胞，例如CHO細胞、淋巴細胞或骨髓瘤，可例如用作宿主。
此外，亦已知一種獲得噬菌體顯示衍生的人類抗體的方法，該抗體選自人類抗體庫(參見Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002) 43 (7), p. 2301-2308；Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203；Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431；等)。
例如，可應用噬菌體顯示方法，該方法包括使人類抗體的可變區作為單鏈抗體(scFv)在噬菌體表面上表現，然後選擇與抗原結合的噬菌體(Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116)。
藉由分析因其與抗原的結合能力而選擇的噬菌體基因，可確定編碼與抗原結合的人抗體可變區的DNA序列。
一旦確定與抗原結合的scFv的DNA序列，就製備具有上述序列的表現載體，然後將製備的表現載體導入合適的宿主並使其在其中表現，從而獲得人類抗體(國際公開號WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438及WO95/15388、Annu.Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455、Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116)。
本說明書中的胺基酸取代較佳為保留胺基酸取代。保留胺基酸取代是發生在與某些胺基酸側鏈相關的胺基酸基團內的取代。較佳的胺基酸基團如下：酸性基團=天冬胺酸及麩胺酸；鹼性基團=離胺酸、精胺酸和組胺酸；非極性基團=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、及色胺酸；及不帶電的極性家族=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸。其他較佳胺基酸基團如下：脂肪族羥基=絲胺酸及蘇胺酸；含醯胺基團=天冬醯胺酸及麩醯胺；脂族基團=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；及芳族基團=苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。此類胺基酸取代較佳在不損害具有原始胺基酸序列的物質之性質的情況下進行。 V. 抗 DLL3 抗體的鑑定和表徵
用於鑑定及/或篩選本技術的之抗DLL3抗體的方法。用於針對DLL3多肽的抗體鑑定和篩選具有對DLL3蛋白所需特異性的那些抗體(例如，與DLL3胞外域結合的那些)的方法包括本領域已知的任何免疫介導技術可藉由本技術領域中具有通常知識者熟知的各種方法在活體外檢測免疫反應的成分。例如，(1)細胞毒性T淋巴細胞可與放射性標記的標靶細胞一起陪育，並藉由釋放放射性來檢測這些標靶細胞的裂解；(2)輔助T淋巴細胞可與抗原和抗原呈遞細胞一起陪育，並藉由標準方法測量細胞因子的合成和分泌(Windhagen A et al., Immunity, 2：373-80, 1995)；(3)抗原呈遞細胞可與全蛋白抗原一起陪育，然後藉由T淋巴細胞活化測定或生物物理方法檢測該抗原在MHC上的呈遞(Harding et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 86：4230-4, 1989)；(4)肥大細胞可與交聯其Fc-ε受體的試劑和藉由酶免疫測定法測量的組織胺釋放的試劑一起孵育(Siraganian et al., TIPS, 4：432-437, 1983)；及(5)酵素免疫吸附法 (ELISA)。
類似地，模型生物體(例如小鼠)或人類受試者中的免疫反應產物亦可藉由本技術領域中具有通常知識者熟知的各種方法檢測。例如，(1)藉由目前在臨床實驗室中使用的標準方法，例如 ELISA，可很容易地檢測反應疫苗接種產生的抗體；(2)可藉由刮擦皮膚表面並放置無菌容器以捕獲刮擦部位上的遷移細胞來檢測免疫細胞向炎症部位的遷移(Peters et al., Blood, 72：1310-5, 1988)；(3)可使用3H-胸苷測量周邊血液單核細胞(PBMC)反應有絲分裂促進劑或混合的淋巴細胞反應的增殖；(4)PBMC中顆粒性白血球、巨噬細胞和其他吞噬細胞的吞噬能力可藉由將PBMC與標記顆粒一起放入孔中測量(Peters et al., Blood, 72：1310-5, 1988)；及(5)免疫系統細胞的分化可藉由以針對CD分子(諸如CD4和CD8)的抗體標記PBMC，並測量表現這些標誌物的PBMC的流分來測量。
在一個具體實施例中，在可複製基因封裝(genetic package)表面上顯示DLL3肽來選擇本技術之抗DLL3抗體。參見，例如美國專利號5,514,548；5,837,500；5,871,907；5,885,793；5,969,108；6,225,447；6,291,650；6,492,160；EP 585 287；EP 605522；EP 616640；EP 1024191；EP 589 877；EP 774 511；EP 844 306。已描述用於產生/選擇含有噬菌粒基因體的絲狀噬菌體顆粒的方法，該噬菌粒基因組編碼具有所需特異性的結合分子。參見，例如EP 774 511；US 5871907；US 5969108；US 6225447；US 6291650；US 6492160。
在一些具體實施例中，使用在酵母宿主細胞表面上顯示DLL3肽來選擇本技術之抗DLL3抗體。有用於藉由酵母表面顯示的scFv多肽之分離的方法已描述於Kieke et al., Protein Eng. 1997 Nov; 10(11)：1303-10。
在一些具體實施例中，使用核醣體顯示選擇本技術之抗DLL3抗體。使用核醣體顯示來鑑定肽庫中之配體的方法已描述於Mattheakis et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9022-26, 1994；及Hanes et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4937-42, 1997。
在某些具體實施例中，在使用DLL3肽的tRNA顯示來選擇本技術的抗DLL3抗體。使用tRNA顯示於活體外配體選擇的方法已敘述於Merryman et al., Chem.Biol., 9：741-46, 2002。
在一個具體實施例中，本技術之抗DLL3抗體係使用RNA顯示來選擇的。使用RNA顯示庫於選擇肽和蛋白質的方法已敘述於Roberts et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94：12297-302, 1997；及Nemoto et al., FEBS Lett., 414：405-8, 1997。使用非天然RNA顯示庫於選擇肽和蛋白質的方法已敘述於Frankel et al., Curr.Opin.Struct.Biol., 13：506-12, 2003。
在一些具體實施例中，本技術之抗DLL3抗體在革蘭氏陰性菌的周質中表現並與標記的DLL3蛋白混合。參見WO 02/34886。在表現對DLL3蛋白具有親和力的重組多肽的殖株中，與抗DLL3抗體結合的標記DLL3蛋白之濃度增加，並允許將細胞從庫的其餘部分中分離出來，例如敘述於Harvey et al., Proc.Natl.Acad.Sci.22：9193-98 2004及美國專利公開號2004/0058403。
選擇所需的抗DLL3抗體後，預期可藉由本領域技術人員已知的任何技術，例如原核或真核細胞表現等，來大量生產該抗體。可藉由使用習知技術構建編碼抗體重鏈的表現載體來產生抗DLL3抗體，例如但不限於抗DLL3雜合抗體或片段，其中需要保留原始物種抗體結合特異性(如根據本文所述之技術工程化)的CDR和可變區框架的最小部分衍生自原始物種抗體，並且抗體的其餘部分是源自可如本文所述進行操作的目標物種免疫球蛋白，從而產生用於表現雜合抗體重鏈的載體。
DLL3結合的測量。在一些具體實施例中，DLL3結合測定係指其中DLL3蛋白和抗DLL3抗體在適於DLL3蛋白和抗DLL3抗體之間結合的條件下混合並評估DLL3蛋白和抗DLL3抗體之間的結合量的測定形式。將結合量與合適的對照進行比較，該對照可以是不存在DLL3蛋白時的結合量、存在非特異性免疫球蛋白組成物時的結合量或兩者。可藉由任何合適的方法評估結合量。結合測定方法包括例如ELISA、放射免疫測定法、閃爍接近測定法、螢光能量轉移測定法、液相層析法、膜過濾測定法等。用於直接測量DLL3蛋白與抗DLL3抗體結合的生物物理測定法為，例如，核磁共振、螢光、螢光偏振、表面等離子共振(BIACORE晶片)、生物層干涉法等。特異性結合藉由本領域已知的標準測定法來確定，例如放射性配體結合測定法、ELISA、FRET、免疫沉澱、SPR、NMR (2D-NMR)、質譜等。若候選抗DLL3抗體的特異性結合比在不存在候選抗DLL3抗體時觀察到的結合大至少1%，則該候選抗DLL3抗體可用作本技術之抗DLL3抗體。
藉由組合與上述重鏈胺基酸序列和輕鏈胺基酸序列顯示高同一性的序列，可選擇具有與上述各抗體同等的生物學活性的抗體。此類同一性通常為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，最佳為99%以上的同一性。此外，亦可藉由組合重鏈和輕鏈的胺基酸序列，其中該重鏈及輕鏈的胺基酸序列包含一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加，可選擇與上述各抗體具有同等生物活性的抗體。
可藉由使用Clustal W第2版的系統內定參數比對序列來確定兩種類型的胺基酸序列之間的同一性(Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ and Higgins DG (2007),"Clustal W and Clustal X version 2.0", Bioinformatics.23 (21)：2947-2948)。
若新產生的人類抗體與本說明書中描述的任何一種大鼠抗人類DLL3抗體、嵌合抗人類DLL3抗體或人源化抗人類DLL3抗體所結合的部分肽或部分三維結構結合，則可確定人類抗體與大鼠抗人類DLL3抗體、嵌合抗人類DLL3抗體或人源化抗人類DLL3抗體結合的表位相同。或者，藉由確認人類抗體與本說明書中所述的大鼠抗人類DLL3抗體、嵌合抗人類DLL3抗體或人源化抗人類DLL3抗體與DLL3的結合競爭，可確定人類抗體與本說明書中描述的大鼠抗人類DLL3抗體、嵌合抗人類DLL3抗體或人源化抗人類DLL3抗體所結合的表位相同，即使特定序列或表位的結構尚未被確定。在本說明書中，當藉由這些測定方法中的至少一種確定人類抗體「結合相同的表位」時，得出的結論是，新製備的人類抗體與本說明書中描述的大鼠抗人類DLL3抗體、嵌合抗人類DLL3抗體或人源化抗人類DLL3抗體「結合相同的表位」。當確認人類抗體結合相同表位時，預期人類抗體應具有與大鼠抗人類DLL3抗體、嵌合抗人類DLL3抗體或人源化抗人類抗體相當的生物活性。
藉由將上述方法獲得之嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體根據已知的方法等評估與抗原的結合活性，可選擇較佳的抗體。
用於比較抗體特性的另一指標的一個實例可包括抗體的穩定性。示差掃描熱析儀(DSC)是一種能夠快速準確地測量熱變性中點(Tm)的儀器，該熱變性中點(Tm)是蛋白質相對結構穩定性的良好指標。藉由使用DSC測量Tm值並對獲得的值進行比較，可比較熱穩定性的差異。已知抗體的保存穩定性與抗體的熱穩定性有一定的相關性(Lori Burton, et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273)，因此，可使用熱穩定性作為指標來選擇較佳的抗體。用於選擇抗體的指示劑的其他實例可包括在合適的宿主細胞中的高產率和在水溶液中的低凝集性。例如，因為產量最高的抗體並不總是表現出最高的熱穩定性，故需要根據上述指標綜合判斷，選擇最適合對人投予的抗體。
獲得的抗體可純化為均質狀態。對於抗體的分離和純化，可使用用於普通蛋白質的分離和純化方法。例如，將管柱層析、過濾、超濾、鹽析、透析、製備型聚丙烯醯胺凝膠電泳及等電聚焦適當選擇並相互結合，從而可分離純化抗體(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)；及Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))，然而分離和純化方法的例子不限於此。
層析的實例可包括親和力層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、逆相層析和吸收層析。
這些層析技術可使用液相層析進行，諸如HPLC或FPLC。
親和力層析中使用的管柱實例可包括Protein A管柱和Protein G管柱。涉及使用Protein A之管柱的實例可包括Hyper D、POROS及Sepharose F. F. (Pharmacia)。
另外，使用經抗原固定的載體，可藉由利用抗體與抗原的結合活性來純化抗體。 VI. 抗 DLL3 抗體 - 藥物結合物 (ADC)A. 藥物
本文所述之抗DLL3抗體(例如，2-C8-A、6-G23-F及10-O18-A或人類抗體：H2-C8-A、H2-C8-A-2、H2-C8-A-3、H6-G23-F、H6-G23-F-2、H6-G23-F-3、H10-O18-A、H10-O18-A-2及H10-O18-A-3)可藉由連接子結構部分與藥物結合以製備抗DLL3抗體-藥物結合物(ADC)。藥物並無特別限制，只要其具有可與連接子結構連接的取代基或部分結構即可。抗DLL3抗體-藥物結合物(ADC)可根據結合的藥物用於各種目的。此類藥物的實例可包括具有抗腫瘤活性的物質、對血液疾病有效的物質、對自體免疫疾病有效的物質、抗炎物質、抗菌物質、抗真菌物質、抗寄生蟲物質、抗病毒物質和抗麻醉物質。 i . 抗腫瘤化合物
以下將描述在本發明的抗DLL3抗體-藥物結合物中使用抗腫瘤化合物作為待結合的化合物之實例。抗腫瘤化合物並未特別限制，只要該化合物具有抗腫瘤作用且具有取代基或可連接到連接子結構的部分結構的化合物即可。當部分或全部的連接子在腫瘤細胞中被切割時，抗腫瘤化合物部分被釋放，從而該抗腫瘤化合物呈現出抗腫瘤作用。當在與藥物的連接位置處切割連接子時，抗腫瘤化合物以其原始結構釋放，以發揮其固有的抗腫瘤效果。
本文揭示之抗DLL3抗體(例如2-C8-A、6-G23-F和10-O18-A或人類抗體：H2-C8-A、H2-C8-A-2、H2-C8-A-3、H6-G23-F、H6-G23-F-2、H6-G23-F-3、H10-O18-A、H10-O18-A-2及H10-O18-A-3)，諸如章節IV所述獲得的那些。「抗DLL3抗體的產生」可經由連接子結構部分與抗腫瘤化合物結合以製備抗DLL3抗體-藥物結合物。
作為使用於本發明之抗腫瘤化合物之一個實例，較佳可使用依喜替康(exatecan)，一種喜樹鹼(camptothecin)衍生物(由下式表示之(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲
Figure 111101468-001
并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)。 [式5]
Figure 02_image049
該化合物可藉由例如美國專利公開號US2016/0297890中描述的方法或其他已知方法獲得，且位於位置1之胺基可較佳被使用作為連接連接子結構的位置。又，依喜替康可在部分連接子仍附著於其上的同時在腫瘤細胞中釋放。然而，即使在這樣的狀態下，該化合物也發揮優異的抗腫瘤作用。
因為依喜替康具有喜樹鹼結構，所以已知在酸性水性介質(例如pH 3的級別)中平衡偏向具有形成內酯環(封閉環)的結構，但在鹼性水性介質(例如，pH 10的級別)下，其平衡偏向為具有開放內酯環(開放環)的結構。亦預期導入具有對應於此類閉環結構和開環結構的依喜替康殘基的藥物結合物具有相同的抗腫瘤作用，且必然地，任何這樣的藥物結合物皆包括在本發明的範圍內。
抗腫瘤化合物的其他實例可包括文獻中描述的抗腫瘤化合物(Pharmacological Reviews, 68, p. 3-19, 2016)。其特定實例可包括多柔比星(doxorubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)、尾海兔素10(dolastatin 10)、奥里斯他汀(auristatin)(諸如單甲基奥里斯他汀E (MMAE)及單甲基奥里斯他汀F (MMAF))、美登醇類(maytansinoids)(諸如DM1及DM4)、吡咯并苯并二氮呯二聚物SG2000 (SJG-136)、喜樹鹼衍生物SN-38、杜卡黴素(duocarmycins)(諸如CC-1065)、蠅蕈素(amanitin)、道諾黴素(daunorubicin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、環胞苷(Cyclocytidine)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、胺甲喋呤、鉑系抗腫瘤劑(順鉑或其衍生物)、紫杉醇(Taxol)或其衍生物。
在抗體-藥物結合物中，每抗體之結合的藥物分子的數量為影響其有效性及安全性的關鍵因子。抗體-藥物結合物之生產藉由定義反應條件而進行，諸如用於反應之起始原料和試劑的量，從而獲得恆定數量的結合藥物分子。與低分子量化合物的化學反應不同，通常獲得包含不同數目的結合的藥物分子的混合物。定義每抗體分子的結合的藥物分子數量並表示為平均值，即結合的藥物分子的平均數。除非另有說明，即，除了代表具有特定數目的結合的藥物分子的抗體-藥物結合物的情況，該抗體-藥物結合物包含在具有不同數目的結合藥物分子的抗體-藥物結合物混合物中，本發明之結合的藥物分子數通常亦指平均值。依喜替康分子結合至抗體分子的數目為可控制的，且就每抗體之結合的藥物分子的平均數而言，可連結約1至10個依喜替康分子(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。依喜替康分子的數目較佳為2至8、3至8、4至8、5至8、6至8、7至8，更佳為5至8，進一步較佳為7至8，更進一步較佳為8。需要注意的是，基於本案實施例之描述，所屬技術領域中具通常知識者可設計對抗體分子結合所需數目之藥物分子的反應，且可獲得具有經控制數目的結合的依喜替康分子之抗體-藥物結合物。 B. 連接子結構
將描述在本發明之抗DLL3抗體-藥物結合物中將藥物結合至抗DLL3抗體的連接子結構。
在本案之抗體-藥物結合物中，將抗DLL3抗體與藥物結合的連接子結構並未特別限制，只要可使用所產生之抗體-藥物結合物即可。可根據使用目的適當選擇和使用連接子結構。連接子結構的一個實例可包括已知文獻中所述之連接子(Pharmacol Rev 68：3-19, 2016年1月, Protein Cell DOI 10.1007/s13238-016-0323-0, etc.)。其進一步的特定實例可包括VC(纈胺酸-瓜胺酸)、MC(馬來醯亞胺基己醯基)、SMCC(琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯)、SPP(N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯、SS (二硫化物)、SPDB (N-琥珀醯亞胺基 4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯、SS/腙、腙及碳酸鹽。
另一實例可包括美國專利公開號US2016/0297890中描述的連接子結構(作為一個實例，在其段落[0260]至[0289]中描述的那些)。較佳可使用以下給出的任何連接子結構。需注意的是，該結構的左端是與抗體的連接位置，其右端是與藥物的連接位置。再者，以下提供之連接子結構中的GGFG (SEQ ID NO：85)表示由通過肽鍵連接的甘胺酸-甘胺酸-苯基丙胺酸-甘胺酸(GGFG; SEQ ID NO：85)所組成的胺基酸序列。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
更佳的如下： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。 [1]更佳的如下： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
抗體被連接至‑(琥珀醯亞胺-3-基-N) 末端(例如，與「-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)-」中-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-連接的末端對側的末端(左側末端))，且抗腫瘤化合物連接於與抗體連接-(琥珀醯亞胺-3-基-N)之末端對側的末端(上述實例中右側末端處CH 2-O-CH 2-C(=O)-的羰基。「-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-」具有下式表示之結構： [式6]
Figure 02_image051
此部分結構的位置3是與抗DLL3抗體的連接位置。此種在位置3處與抗體連接的特徵在於形成硫醚鍵。此結構部分位置1處的氮原子與存在於包括於該結構中之連接子內的亞甲基之碳原子相連。
在本發明的以依喜替康為藥物的抗體-藥物結合物中，較佳具有以下給定之任何結構的藥物-連接子結構部分用於抗體。對於這些藥物-連接子結構部分，每個抗體結合的平均數可為1至10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，且較佳為2至8，更佳為5至8，進一步較佳為7至8，更進一步較佳為8。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
更佳的如下： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
更佳的如下： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-(NH-DX) (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。 [2]-(NH-DX)具有下式表示之結構： [式7]
Figure 02_image053
且其表示藉由從依喜替康之位置1處的胺基上除去一個氫原子而衍生的基團。 C. 生產抗體 - 藥物結合物之方法
可用於本發明之抗體-藥物結合物的抗體並未特別限制，只要其為具有內化活性的抗DLL3抗體或該抗體的功能性片段即可，如上述章節IV.「抗DLL3抗體之生產」及實施例中所述。在一些具體實施例中，抗DLL3抗體為2-C8-A、6-G23-F、10-O18-A、H2-C8-A、H2-C8-A-2、H2-C8-A-3、H6-G23-F、H6-G23-F-2、H6-G23-F-3、H10-O18-A、H10-O18-A-2或H10-O18-A-3。
其次，將描述生產本發明之抗體-藥物結合物的典型方法。需注意的是，在以下描述中，顯示於各反應流程中的「化合物編號」用於表示化合物。具體而言，將各化合物稱為「式(1)化合物」、「化合物(1)」等。其他化合物編號亦為如此。 D. 生產方法 1
由下述給出的式(1)表示之抗體-藥物結合物(其中抗-DLL3抗體經由硫醚與連接子結構連接)可藉由使具有藉由抗DLL3抗體的還原而從雙硫鍵轉化之巰基的抗體與化合物(2)反應來生產，該化合物(2)可通過已知方法獲得(例如，可藉由專利公開文獻US2016/297890中所述方法獲得(例如，段落[0336]至[0374])中所述之方法)。例如，此抗體-藥物結合物可藉由以下方法生產。 [表示式1]
Figure 02_image055
其中AB表示具有硫氫基之抗體，其中 L 1具有由-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-表示之結構，且 L 1'表示由下式表示之馬來醯亞胺基。 [式8]
Figure 02_image057
-L 1-L X具有由下式中任一者表示之結構： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
其中，更佳的結構如下： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
進一步更佳的結構如下： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
在上述反應流程中，抗體-藥物結合物(1)可理解為，具有從藥物至連接子末端的一個結構部分與一個抗體連接的結構。然而，此描述是為了方便而提供的，實際上有很多個上述結構部分連接至一個抗體分子的情況。下述製造方法的說明亦為如此。
具體而言，抗體-藥物結合物(1)可藉由使經已知方法(例如，可藉由專利公開文獻US2016/297890中所述方法獲得(例如，可藉由段落[0336]至[0374]所述方法獲得))獲得的化合物(2)與具有硫氫基的抗體(3a)反應來生產。
具有硫氫基的抗體(3a)可藉由本領域技術人員熟知的方法獲得(Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996))。該方法的實例可包括，但不限於：將Traut氏試劑與抗體之胺基反應；N-琥珀醯亞胺基S-乙醯基硫烷酸酯類與抗體之胺基反應後，與羥基胺反應；N-琥珀醯亞胺基3-(吡啶二硫基)丙酸酯與抗體反應後，與還原劑反應；抗體與還原劑諸如二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇、及參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)反應，以還原抗體中的鍵間雙硫鍵，從而形成氫硫基。
具體而言，抗體中每個鏈間雙硫鍵使用0.3至3莫耳當量之TCEP作為還原劑，並於含螯合劑的緩衝液中將還原劑與抗體反應，可獲得具有部分或完全還原的鏈間雙硫鍵的抗體。螯合劑之實例可包括乙二胺四乙酸(EDTA)及二乙三胺五乙酸(DTPA)。螯合劑可以1 mM至20 mM之濃度使用。磷酸鈉、硼酸鈉或乙酸鈉等之溶液可用作緩衝液。作為具體實例，藉由將抗體與TCEP於4℃至37℃反應1至4小時，可獲得具有部分或完全還原之硫氫基的抗體(3a)。
應注意的是，藉由進行硫氫基與藥物-連接子部分的加成反應，藥物-連接子部分可藉由硫醚鍵結合。
然後，每個具有硫氫基的抗體(3a)使用2至20莫耳當量的化合物(2)，可生產抗體-藥物結合物(1)，其中每抗體結合2至8個藥物分子。具體而言，可將含有溶解於其中的化合物(2)的溶液添加至含有具有硫氫基之抗體(3a)的緩衝液中進行反應。在此上下文，乙酸鈉溶液、磷酸鈉、硼酸鈉等可用作緩衝液。用於反應之pH為5至9，且更佳為反應於接近pH 7進行。有機溶劑，諸如二甲亞碸 (DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、及N-甲基-2-吡啶酮(NMP)，可用作溶解化合物(2)之溶劑。可藉由將含有溶於有機溶劑之化合物(2)的溶液以1至20% v/v添加至含有具有硫氫基之抗體(3a)的緩衝溶液中進行反應。反應溫度為0至37℃，更佳為10至25℃，且反應時間為0.5至2小時。可藉由使未反應的化合物(2)與含硫醇基之試劑反應性失活而終止反應。含硫醇基之試劑例如為半胱胺酸或N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)。更具體而言，可藉由添加1至20莫耳當量之NAC至使用的化合物(2)，並於室溫培育所獲得之混合物10至30分鐘，而終止反應。
抗體-藥物結合物之鑑定：依據下述共通程序，可將所生產的抗體-藥物結合物(1)歷經濃縮、緩衝液交換、純化、及抗體濃度及每抗體分子之結合藥物分子的平均數之測量，以鑑定抗體-藥物結合物(1)。 i . 共通程序 A ：抗體或抗體 - 藥物結合物水溶液之濃度
於Amicon Ultra (50,000 MWCO，Millipore Corporation)容器中，添加抗體或抗體-藥物結合物之溶液，並使用離心機(Allegra X-15R，Beckman Coulter, Inc.)，藉由離心而濃縮抗體或抗體-藥物結合物之溶液(於2000 G至4000 G離心5至20分鐘)。 ii. 共通程序 B ：抗體濃度的測量
使用UV偵測器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific Inc.)，依據製造商定義的方法，進行抗體濃度之測量。於此方面，使用各抗體不同的280 nm吸光係數(1.3 mLmg -1cm -1至1.8 mLmg -1cm -1)。 iii. 共通程序 C ：抗體的緩衝液交換
將PBS6.0/EDTA添加至根據共通程序A濃縮的抗體水溶液，此操作進行數次，然後使用共通程序B測量抗體濃度，並以PBS6.0/EDTA調整至5-20 mg/mL。 iv. 共通程序 D ：抗體 - 藥物結合物之純化
將NAP-25管柱(GE Healthcare)以市售可取得的緩衝溶液平衡，諸如以含山梨糖醇(5%)的乙酸緩衝液(10 mM，pH 5.5；其於說明書中稱為ABS)平衡。將抗體-藥物結合物之水性反應溶液(約2.5 mL)施加至NAP-25管柱，然後以製造商定義的量以緩衝溶液洗析，從而收集抗體流份。將其中收集的流份再次施用於NAP-25管柱並以緩衝溶液進行洗析的凝膠過濾純化過程總共重複2或3次，以獲得抗體-藥物結合物，其不含未結合的藥物連接子和低分子量化合物(參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)及二甲亞碸)。 v. 共通程序 E ：抗體 - 藥物結合物中抗體濃度及每抗體分子結合的藥物分子之平均數之測量
抗體-藥物結合物中結合的藥物濃度可藉由測量抗體-藥物結合物之水溶液的280 nm及370 nm之二種波長中的UV吸光度後，進行下示之計算而算出。
任何給定波長的總吸光度等於系統中存在的所有吸光化學物質的吸光度之和[吸光度的加成性]。因此，基於抗體和藥物的莫耳吸光係數在抗體和藥物結合前後不變的假設，抗體-藥物結合物中的抗體濃度和藥物濃度由以下方程式表示。 A 280= A D,280+ A A,280= ε D,280C D+ ε A,280C A方程式(1) A 370= A D,370+ A A,370= ε D,370C D+ ε A,370C A方程式(2)
在此上下文，A 280代表於280 nm的抗體-藥物結合物水溶液的吸光度，A 370代表於370 nm的抗體-藥物結合物水溶液的吸光度，A A,280代表於280 nm的抗體吸光度，A A,370代表於370 nm的抗體吸光度，A D,280代表於280 nm的結合物前驅物的吸光度，A D,370代表於370 nm的結合物前驅物的吸光度，ε A,280代表於280 nm的抗體之莫耳吸光係數，ε A,370代表於370 nm的抗體之莫耳吸光係數，ε D,280代表於280 nm的結合物前驅物之莫耳吸光係數，ε D,370代表於370 nm的結合物前驅物之莫耳吸光係數，C A代表抗體-藥物結合物中的抗體濃度，及C D代表抗體-藥物結合物中的藥物濃度。
在此上下文，關於ε A,280、ε A,370、ε D,280及ε D,370，使用預先準備的值(基於計算的估計值或藉由化合物的UV測量獲得的測量值)。例如，ε A,280可藉由已知的計算方法由抗體的胺基酸序列估計(Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423)。ε A,370通常為零。可藉由測量溶液之吸光度(其中以一定莫耳濃度溶解所使用之結合物前驅物)，基於朗伯-比爾定律(Lambert-Beer law)(吸光度=莫耳濃度×莫耳吸光係數×光析管(cell)光徑長)而獲得ε D,280及ε D,370。藉由測量抗體-藥物結合物之水溶液之A 280及A 370，然後使用該值代入式(1)及(2)而解出聯立方程式，可獲得C A及C D。又，藉由將C D除以C A，可測定每抗體結合的藥物分子之平均數。 vi. 共通程序 F ：抗體 - 藥物結合物中每抗體分子結合的藥物分子之平均數之測量 -(2)
除了上述小節v「共同程序E」外，抗體-藥物結合物中每抗體分子結合的藥物分子的平均數亦可使用以下方法藉由高效液相層析(HPLC)測定來確定。在下文中，將描述當抗體藉由雙硫鍵與藥物連接子結合時，藉由HPLC測量結合的藥物分子之平均數的方法。參照此方法，本領域技術人員可藉由HPLC適當測量結合的藥物分子之平均數，取決於抗體與藥物結合物之間的連接方式。
製備用於 HPLC 分析的樣品 ( 抗體 - 藥物結合物的還原 )
將抗體-藥物結合物溶液(約1 mg/mL，60 μL)與二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(100 mM，15 μL)混合。藉由將混合物在37℃培育30分鐘，抗體-藥物結合物的輕鏈和重鏈之間的雙硫鍵被裂解。所產生之樣品用於HPLC分析。
HPLC 分析
於下列測量條件下進行HPLC分析。 HPLC系統：Agilent 1290 HPLC系統 (Agilent Technologies, Inc.) 檢測器：紫外線吸收光譜儀(測量波長：280 nm) 管柱：ACQUITY UPLC BEH Phenyl (2.1 × 50 mm，1.7 μm，130 angstroms；Waters Corp., P/N 186002884) 管柱溫度：75℃ 移動相A：含0.10%三氟乙酸(TFA)及15% 2-丙醇之水溶液 移動相B：含0.075% TFA及15% 2-丙醇之乙腈溶液 梯度程序1：14%-36% (0分鐘-15分鐘)、36%-80% (15分鐘-17分鐘)、80%-14% (17分鐘-17.01分鐘)及14% (17.01分鐘-25分鐘) 梯度程序2：14%-80% (0分鐘-15分鐘)、80% (15分鐘-17分鐘)、80%-14% (17分鐘-17.01分鐘)及14% (17.01分鐘-25分鐘) 樣品注射：10 μL
資料分析
與未結合的抗體輕鏈(L0)和重鏈(H0)相比，與藥物分子結合的輕鏈(與i個藥物分子結合的輕鏈：L i)及與藥物分子結合的重鏈(與i個藥物分子結合的重鏈：H i)與結合的藥物分子的數量成比例地呈現出更高的疏水性，因此具有更長的滯留時間。因此這些鏈以例如L0和L1或H0、H1、H2和H3的順序被洗析。藉由將滯留時間與L0和H0進行比較，可將檢測峰分配給 L0、L1、H0、H1、H2和H3中的任何一個。結合的藥物分子的數量可由本領域技術人員定義，但較佳為L0、L1、H0、H1、H2和H3。
由於藥物連接子具有UV吸收，根據下表示式，使用輕鏈或重鏈和藥物連接子的莫耳吸收係數，將峰面積值因應結合的藥物連接子分子的數量進行校正。 [表示式2]
Figure 02_image059
[表示式3]
Figure 02_image061
在此上下文，藉由已知的計算方法從每個抗體的輕鏈或重鏈胺基酸序列估計的值(Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423)可用作抗體輕鏈或重鏈的莫耳吸光係數(280 nm)。在H2-C8-A的情況下，根據抗體的胺基酸序列，將26123的莫耳吸光係數和84150的莫耳吸光係數分別用作輕鏈和重鏈的估計值。在H6-G23-F的情況下，根據抗體的胺基酸序列，將30105的莫耳吸光係數和77423的莫耳吸光係數分別用作輕鏈和重鏈的估計值。在H10-O18-A的情況下，根據抗體的胺基酸序列，將26166的莫耳吸光係數和81340的莫耳吸光係數分別用作輕鏈和重鏈的估計值。將藉由將每個藥物連接子與巰乙醇或N-乙醯半胱胺酸反應使順丁二醯亞胺基轉化為琥珀醯亞胺硫醚的化合物之實際測量莫耳吸光係數(280 nm)用作該化合物的莫耳吸光係數(280 nm)。吸光度測定的波長可由本領域技術人員適當設定，較佳為能夠測量抗體的峰的波長，更佳為280 nm。在H2-C8-A-2的情況下，根據抗體的胺基酸序列，將26212的莫耳吸光係數和83998的莫耳吸光係數分別用作輕鏈和重鏈的估計值。在H10-O18-A-2的情況下，根據抗體的胺基酸序列，將26212的莫耳吸光係數和81478的莫耳吸光係數分別用作輕鏈和重鏈的估計值。
根據以下表示式，對於峰面積的校正值的總和，計算每個鏈的峰面積比率(%)。 [表示式4]
Figure 02_image063
根據使用以下表示式計算抗體-藥物結合物中每個抗體分子的結合的藥物分子之平均數。
結合的藥物分子之平均數=(L 0峰面積比率×0+L 0峰面積比率×1+H 0峰面積比率×0+H 1峰面積比率×1+H 2峰面積比率×2+H 3峰面積比率×3)/100×2
需注意的是，為了確保抗體-藥物結合物的量，可將在相似條件下所生產之具有幾乎相同平均結合的藥物分子數量(例如，±1個數量級)的多個抗體-藥物結合物混合，以製備新的批次。在這種情況下，新批次的平均藥物分子數介於混合前的平均藥物分子數之間。
本發明之抗體-藥物結合物的一個具體實例可包括抗體-藥物結合物，其具有下式表示之結構： [式9]
Figure 02_image065
或具有下式表示之結構： [式10]
Figure 02_image067
在此上下文，AB表示本說明書所揭示之抗DLL3抗體，且該抗體經由源自該抗體的硫氫基與藥物連接子結合。在此上下文，n與所謂的DAR(drug-to-antibody Ratio，藥物與抗體比)含義相同，表示每個抗體的藥物-抗體比。具體而言，n表示每抗體分子之結合的藥物分子數量，其為被定義及表示為平均值的數值，即結合的藥物分子的平均數。在本發明以[式9]或[式10]表示之抗體-藥物結合物的情況，藉由上述小節vi中的共通程序F進行測量，n可為2至8，較佳為5至8，更佳為7至8，更佳為8。
本發明之抗體-藥物結合物的一個實例可包括具有由上述式[式9]或[式10]表示之結構的抗體-藥物結合物，其中由AB表示之抗體包括選自由以下抗體(a)至(e)所組成之群組的任一種抗體，或抗體的功能性片段，或抗體-藥物結合物的醫藥上可接受的鹽： (a)包含SEQ ID NO：7之可變域序列的輕鏈及包含SEQ ID NO：2之可變域序列的重鏈； (b)包含SEQ ID NO：17之可變域序列的輕鏈及包含SEQ ID NO：12之可變域序列的重鏈； (c)包含SEQ ID NO：27之可變域序列的輕鏈及包含SEQ ID NO：22之可變域序列的重鏈； (d)包含SEQ ID NO：37之可變域序列的輕鏈及包含SEQ ID NO：32之可變域序列的重鏈；及 (e)選自由抗體(a)至(f)所組成之群組中的任何一種抗體，其中重鏈或輕鏈包含一種或兩種或多種選自由以下組成之群組為代表的轉譯後修飾：N-連接糖基化、O-連接糖基化、N-末端加工、C-末端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N末端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸醯胺化，及N末端麩醯胺或N末端麩胺酸轉化為焦麩胺酸，以及羧基末端的一個或兩個胺基酸的缺失。 VII. 藥物
由於本文所揭示及上述章節IV「抗DLL3抗體的生產」和實施例中描述的本發明之抗DLL3抗體或抗體的功能性片段(例如，2-C8-A、6-G23-F、10-O18-A、H2-C8-A、H2-C8-A-2、H2-C8-A-3、H6-G23-F、H6-G23-F-2、H6-G23-F-3、H10-O18-A、H10-O18-A-2或H10-O18-A-3)結合至腫瘤細胞表面的DLL3並具有內化活性，其可用作藥物，特別是用作下述癌症的治療劑：諸如小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、各種組織(包括腎臟、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內膜)、胃腸道(胃、結腸)、甲狀腺(甲狀腺髓質癌)、胰臟癌和肺癌)的神經內分泌腫瘤、神經膠質瘤或假性神經內分泌腫瘤(pNET)等，可單獨使用或與其他藥物組合使用。
此外，本發明之抗DLL3抗體或該抗體之功能性片段可用於檢測表現DLL3的細胞。
再者，由於本發明之抗DLL3抗體或該抗體之功能性片段具有內化活性，其可用作抗體-藥物結合物中的抗體。
當使用具有抗腫瘤活性(諸如細胞毒性活性)之藥物作為藥物時，上述章節VI「抗DLL3抗體-藥物結合物」和實施例中描述的本發明之抗DLL3抗體-藥物結合物為抗DLL3抗體及/或具有內化活性的抗體的功能性片段及具有抗腫瘤活性(諸如細胞毒性活性)的藥物的結合物。由於此抗DLL3抗體-藥物結合物對表現DLL3之癌細胞呈現出抗腫瘤活性，因此其可用作藥物，特別是用作癌症的治療劑及/或預防劑。
本發明之抗DLL3抗體-藥物結合物可吸收水分或具有吸附水，例如，當其放置在空氣中或進行再結晶或純化過程時轉變成水合物。此類含水化合物或醫藥上可接受的鹽亦包括於本發明中。
當本發明的抗DLL3抗體-藥物結合物具有鹼性基團(諸如胺基)時，如果需要，可形成醫藥上可接受的酸加成鹽。此類酸加成鹽的實例可包括：氫鹵化物，諸如氫氟酸鹽、鹽酸鹽和氫碘酸鹽，無機酸鹽，例如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽；低級烷磺酸鹽，諸如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽和乙磺酸鹽；芳基磺酸鹽，諸如苯磺酸鹽和對甲苯磺酸鹽；有機酸鹽，諸如甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽和馬來酸鹽；及胺基酸鹽，諸如鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽和天冬胺酸鹽。
當本發明的抗DLL3抗體-藥物結合物具有酸性基團(諸如羧基)時，如果需要，可形成醫藥上可接受的鹼加成鹽。此類鹼加成鹽的實例可以包括：鹼金屬鹽，諸如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等；鹼土金屬鹽，諸如鈣鹽和鎂鹽；無機鹽，諸如銨鹽；以及有機胺鹽，諸如二芐胺鹽、
Figure 111101468-002
啉鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖酸鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、環己胺鹽、二環己胺鹽、N,N'-二芐基乙二胺鹽、二乙醇胺鹽、N-芐基-N-(2-苯基乙氧基)胺鹽、哌𠯤鹽、四甲基銨鹽和三(羥甲基)胺基甲烷鹽。
本發明亦可包括抗DLL3抗體-藥物結合物，其中構成抗體-藥物結合物的一個或多個原子被原子的同位素置換。存在兩種同位素：放射性同位素和穩定同位素。同位素之實例可包括氫同位素(2H和3H)、碳同位素(11C、13C和14C)、氮同位素(13N和15N)、氧同位素(15O、17O和18O)和氟同位素(18F)。包含以此類同位素標記的抗體-藥物結合物的組成物可用作例如治療劑、預防劑、研究試劑、測定試劑、診斷劑和活體內診斷成像劑。本發明包括以同位素標記的各種及每種抗體-藥物結合物，以及以任何給定比例之同位素標記的抗體-藥物結合物的混合物。可根據本領域已知的方法製造同位素標記抗體-藥物結合物，例如藉由使用使用同位素標記的起始原料來代替後述的本發明生產方法的起始原料。
例如，可基於抑制細胞增殖反應的活性來測量活體外細胞毒性。例如，培養過表現DLL3的癌細胞株，並在培養系統中加入不同濃度的抗DLL3抗體-藥物結合物。此後，可測量其對細胞生長、病灶形成、群落形成和球狀體生長的抑制活性。在此上下文，例如，藉由使用源自小細胞肺癌或大細胞神經內分泌癌的癌細胞株，可檢測針對小細胞肺癌或大細胞神經內分泌癌的細胞生長抑制活性。
可測量在實驗動物活體內對癌症的治療效果，例如，將抗DLL3抗體-藥物結合物投予至已接種高度表現DLL3之腫瘤細胞株的裸鼠，然後測量癌細胞的變化。在此上下文，例如，藉由使用藉由接種小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、各種組織(包括腎臟、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內膜)、胃腸道(胃、結腸)、甲狀腺(甲狀腺髓質癌)、胰臟及肺臟)的神經內分泌腫瘤、神經膠質瘤或假性神經內分泌腫瘤(pNET)之免疫缺陷小鼠衍生的動物模型，可測量對於小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、各種組織(包括腎臟、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內膜)、胃腸道(胃、結腸)、甲狀腺(甲狀腺髓質癌)、胰臟及肺臟)的神經內分泌腫瘤、神經膠質瘤或假性神經內分泌腫瘤(pNET)的治療效果。
應用本發明的抗DLL3抗體-藥物結合物的癌症的類型沒有特別限制，只要該癌症在待治療的癌細胞中表現DLL3即可。其實例可以包括小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、各種組織的神經內分泌腫瘤，該組織包括腎臟、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內膜)、胃腸道(胃、結腸)、甲狀腺(甲狀腺髓質癌)、胰臟及肺臟。其等之其他實例可包括神經膠質瘤和假神經內分泌腫瘤(pNET)。然而，癌症不限於此，只要癌症表現DLL3即可。癌症的更佳實例可包括小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)及各種組織的神經內分泌腫瘤。
本發明之抗DLL3抗體-藥物結合物較佳可投予至哺乳動物，且更佳為投予至人類。
包含本發明之抗DLL3抗體-藥物結合物的醫藥組成物中使用的物質可從本領域通常使用的藥物添加劑等中根據施用劑量或施用濃度適當選擇，然後使用。
本發明抗DLL3抗體-藥物結合物可以作為含有一種或多種醫藥相容成分之醫藥組成物而被投予。例如，醫藥組成物通常包含一種或多種藥物載體(例如，無菌液體(例如水和油(包括石油和動物來源、植物來源或合成來源的油(例如花生油、大豆油、礦物油和芝麻油)))。當靜脈內投予醫藥組成物，水是更典型的載體。食鹽水溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液亦可用作液體載體，特別是用於注射溶液。合適的藥物載體是本領域已知的，如果需要，上述組成物亦可包含痕量的保濕劑、乳化劑或pH緩衝劑。合適的醫藥載劑之實例揭示於E. W. Martin的「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。處方對應於投予模式。
各種遞送系統是已知的且它們可用於投予本發明之抗DLL3抗體-藥物結合物。投予途徑的實例可以包括，但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內和皮下途徑。例如，可藉由注射或推注注射進行投予。根據較佳具體實施例，上述抗體-藥物結合物的投予是藉由注射進行的。腸胃外投予是較佳的投予途徑。
根據代表性之具體實施例，醫藥組成物根據習知程序被規定為適合於靜脈內投予至人類的醫藥組成物。用於靜脈內投予的組成物通常為無菌和等張水性緩衝溶液中的溶液。如有必要，藥物亦可含有助溶劑和局部麻醉劑，以減輕注射區域的疼痛(例如，利多卡因(lignocaine))。一般而言，上述成分以單位劑型的混合物形式單獨或一起以冷凍乾燥粉末或無水濃縮物的形式提供於容器中，該容器藉由密封於例如標明活性劑的量安瓿或囊袋中獲得。當藥物藉由注射投予時，可使用例如裝有無菌藥用級的水或食鹽水的注射瓶來投予。當藥物藉由注射投予時，可提供注射用無菌水或食鹽水安瓿瓶，使得上述成分在投予前相互混合。
本發明之醫藥組成物可為僅包含本案抗DLL3抗體-藥物結合物的醫藥組成物，或可為包含抗-DLL3抗體-藥物結合物和至少一種其他癌症治療劑的醫藥組成物。本發明之抗DLL3抗體-藥物結合物亦可與另外的癌症治療劑一起投予，從而可增強抗癌效果。用於此目的之另外的抗癌劑可一起與抗體-藥物結合物同時、單獨或連續地投予個體。否則，另外的抗癌劑和抗DLL3抗體-藥物結合物可以各自不同的投予間隔投予受試者。此類癌症治療劑的實例可包括細胞毒性化療劑，包括卡鉑定(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、洛鉑(lobaplatin)、依托泊苷(etoposide)、伊立替康(irinotecan)、拓撲替康(topotecan)和氨柔比星(amrubicin)；RNA轉錄抑制劑，包括魯比萘丁(lurbinectedin)；免疫檢查點抑制劑，包括阿特珠單抗(atezolizumab)、度伐鲁單抗(durvalumab)、納武利尤單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)及伊匹單抗(ipilimumab)，及酪胺酸激酶抑制劑，包括安羅替尼(anlotinib)，然癌症治療劑並不限於此，只要該藥物具有抗腫瘤活性即可。
此類醫藥組成物可製備成凍乾調配物或液體調配物形式的具有選定組成和必要純度的調配物。製備成凍乾調配物的醫藥組成物可為含有本領域使用的適當醫藥添加劑的調配物。
同樣地，可製備液體調配物以使液體調配物包含本領域中使用的各種醫藥添加劑。
醫藥組成物的組成物及濃度亦依據投予方法而變化。關於包含於本發明之醫藥組成物中的抗DLL3抗體-藥物結合物對抗原的親和力，即，抗DLL3抗體-藥物結合物與抗原的解離常數(Kd值)，隨著親和力的增加(即Kd值低)，醫藥組成物可發揮藥效，即使其施用劑量減少。
因此，抗體-藥物結合物的施用劑量亦可藉由基於抗體-藥物結合物對抗原的親和力狀態設定施用劑量來確定。當將本發明之抗體-藥物結合物投予人類時，可以例如約0.001至100 mg/kg的劑量一次或以1至180天的間隔多次投予。較佳地以0.1至50 mg/kg的劑量投予，且更佳為1至50 mg/kg、1至30 mg/kg、1至20 mg/kg、1至15 mg/kg、2至50 mg/kg、2至30 mg/kg、2至20 mg/kg或2至15 mg/kg，以1至4週之間隔，較佳為2至3週多次投予。
總之，所揭示之免疫球蛋白相關組成物(例如，抗體或其抗原結合片段，諸如2-C8-A、6-G23-F、10-O18-A及其人源化型式)及其抗體-藥物結合物可用於治療DLL3相關的癌症。此類治療可用於被鑑定為具有病理性高水平DLL3的患者(例如，藉由本文所述方法診斷的患者)或被診斷患有已知與此類病理水平相關的疾病的患者。在一方面，本揭示提供一種在有需要的受試者中治療DLL3相關癌症的方法，包含對該受試者投予有效量的本技術的抗體(或其抗原結合片段)。可藉由本技術之抗體治療的癌症的實例包括，但不限於：小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、各種組織(包括腎臟、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內膜)、胃腸道(胃、結腸)、甲狀腺(甲狀腺髓質癌)、胰臟及肺臟)的神經內分泌腫瘤、神經膠質瘤或假性神經內分泌腫瘤(pNET)。本技術的組成物可選擇地作為單次推注投予有需要的受試者。或者，給藥方案可包含在腫瘤出現後的不同時間進行的多次投予。投予可藉由任何合適的途徑進行，包括口服、鼻內、腸胃外(靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下)、直腸、顱內、腫瘤內、鞘內或局部。投予包括自我投予和他人投予。亦應理解，所述醫學病症的各種治療模式旨在表示「實質性」，其包括全部治療但也少於全部治療，且其中達到一些生物學或醫學相關結果。 實施例
本技術藉由以下實施例進一步說明，其不應解釋為以任何方式進行限制。以下實施例證實本技術的說明性抗DLL3抗體和抗體-藥物結合物(ADC)的製備、表徵和用途。然而，這些實施例並非旨在限制本發明的範圍。此外，不應藉由任何手段以限制方式解釋這些實例。需要說明的是，以下實施例中，除非另有說明，有關基因操作的個別操作均根據「Molecular Cloning」中描述的方法進行(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989)，或根據本領域技術人員使用的實驗手冊中描述的其他方法，或使用市售試劑或套組時，均按照市售產品中包含的說明進行實施。在本說明書中，除非另有說明，否則試劑、溶劑及起始材料均可從商業渠道獲得。 實施例 1- 單株抗體的產生
DLL3 (GenBank 登錄號 Q9NY J7-1)的胞外域(ECD)對應於在穩定表現全長DLL3的HEK293T細胞中產生的具有C末端6×His標籤(SEQ ID NO：84)的胺基酸Ala27-Ala479用作免疫原。根據標準免疫技術，以可溶性DLL3-ECD或穩定細胞對攜帶人類免疫球蛋白庫的Ablexis AlivaMAb Kappa小鼠(Ablexis, San Diego, CA)進行為期3週的免疫。收穫來自具有對DLL3特異性的高血清力價之小鼠的脾細胞和引流淋巴結細胞，並使用電融合與小鼠骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤。然後篩選這些雜交瘤以藉由ELISA鑑定特異性結合可溶性DLL3-ECD的抗體的存在，以及藉由流式細胞分析技術鑑定與親代293細胞比較之穩定表現293細胞的全長DLL3蛋白。藉由在流式細胞分析技術中對293 DLL3 轉染細胞株(transfectant)的染色強度以及如下所述的4℃/37℃染色進行排序，選擇雜交瘤用於進一步研究。 實施例 2- 使用單株抗體 6-G23-F 、 2-C8-A 、 7-I1-B 和 10-O18-A 進行 4/37 內化測定
藉由比較4℃和37℃的染色，比較四種單株抗體(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A)內化DLL3的能力。參考單株抗體SC16，已知為經由DLL3內化並具有ADC活性，並於先前在文獻中報導，其用作內化的陽性對照。以胰蛋白酶/EDTA收穫指數生長的NCI-H82細胞，在含有10%胎牛血清(FCS)的RPMI中洗滌一次，並以2×10 7個細胞/ml重新懸浮在補充有10% FCS的DMEM中。將100 µl (2×10 6個細胞)添加至U型底96孔盤。將測試的單株抗體(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B或10-O18-A)或參考單株抗體添加至不同的孔中，使複製盤中最終濃度為10 µg/ml。兩個盤在4℃下保持30分鐘，然後以補充有10% FCS的冷RPMI洗滌兩個盤2次，並再懸浮於補充有10% FCS的RPMI中。一個盤保持在4℃ (對照盤)，另一個盤則在CO 2培養箱(實驗盤)中在37℃下培養。實驗盤在37℃下於CO 2培養箱中以及對照盤在4℃下培育4小時後，將細胞在4℃下以冷洗滌緩衝液(含有0.5% BSA的PBS)洗滌3次。然後將樣品重新懸浮於冷洗滌緩衝液+R-藻紅蛋白-AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG (Jackson 115-116-071)中，洗滌緩衝液中的最終濃度為7 µg/ml。在4℃培育30分鐘後，將細胞在冷洗滌緩衝液中洗滌3次，然後固定在0.5%多聚甲醛PBS中，並在48小時內藉由流式細胞分析技術進行分析。藉由將從對照盤(在4℃下與抗體一起孵育)獲得的MFI除以從實驗盤(在37℃下與抗體一起孵育)獲得的對應MFI計算的平均螢光強度(MFI)比率作為內化的相對量度。高數值表示較大的內化。如下表所示，所有單株抗體(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A)都能內化結合DLL3，但不能達到參考單株抗體的程度。
殖株 MFI 比率
6-G23-F 1.67
2-C8-A 1.76
7-I1-B 1.68
10-O18-A 1.56
參考單株抗體 2.66
小鼠IgG1 1.28
這些結果證實本技術的免疫球蛋白相關組成物經由與DLL3結合而經歷內化。因此，本文揭示之免疫球蛋白相關組成物可用於將治療劑遞送至DLL3陽性癌細胞。 實施例 3- 單株抗體 6-G23-F 、 2-C8-A 、 7-I1-B 和 10-O18-A 的淬滅內化測定
為了對單株抗體的內化進行排序，使用淬滅內化分析。此方法反映了內化和進入胞內體/溶酶體途徑。將山羊抗小鼠IgG1 F(ab) (Jackson Immunoresearch 115-007-185)以Dy light Dy650 NHS酯(Thermofisher 02206)及LICOR IRDye QC1 NHS酯(LICOR 929-7030)雙重標記(雙標記抗體在本文中稱為「F(ab) Dy650-QC1」)。此測定之原理如下：F(ab) Dy650-QC1並無螢光，因為Dy light Dy650螢光被IRDye QC1淬滅。然而，內化後，F(ab) Dy650-QC1經由胞內體/溶酶體途徑降解，且該IRDye QC1的最終釋放使得可觀察到Dy light Dy650螢光。因此，將Dy light Dy650螢光信號作為經由溶酶體內化的量度。簡而言之，以胰蛋白酶/EDTA收穫指數生長的NCI-H82細胞，在補充有10% FCS的生長培養基RPMI中洗滌一次，然後再懸浮於生長培養基中，每孔加入1.25 x10 6個細胞(80 µl)。將濃度為200 µg/ml的單株DLL3抗體與200 µg/ml的山羊抗小鼠IgG1 Dy650 QC1在室溫下混合20分鐘，然後將20 µl混合物加入細胞中。在4℃培育30分鐘後，以生長培養基洗滌細胞兩次，再懸浮於生長培養基中並在CO 2培養箱中轉移至37℃ 4小時以允許內化。然後將細胞用含有0.5% BSA的冰冷PBS洗滌2次，並藉由流式細胞分析技術進行分析，並測定平均螢光強度。將對照參考單株的平均螢光強度設置為100%內化。如下表所示，所有四種單株抗體均表現出內化和進入胞內體/溶酶體途徑。
殖株 Dy light Dy658 螢光 ( 對照參考單株抗體的百分比 )
6-G23-F (10µg/ml) 76.5
7-I1-B  (10µg/ml) 70.1
2-C8-A (10µg/ml) 62.9
10-O18-A (10µg/ml) 62.2
同型對照 20
這些結果證實本技術的免疫球蛋白相關組成物經由與DLL3結合進行內化，並進入細胞的吞噬體/溶酶體腔室。因此，本文揭示之免疫球蛋白相關組成物可用於將治療劑遞送至DLL3陽性癌細胞。 實施例 4- 用於抗 DLL3 單株抗體之 Fab ZAP 測定
Fab ZAP 測定被用作測量內化的另一種方法。Fab ZAP測定經由抗DLL3單株抗體的內化來測量毒素向細胞的遞送。Fab ZAP測定使用皂草素毒素結合的F(ab)抗小鼠重鏈和輕鏈來標記帶有毒素的單株抗體。使用來自Advanced Targeting Systems的套組，並遵循Fab ZAP測定方案來表徵抗DLL3單株抗體組(panel)。簡而言之，以胰蛋白酶/EDTA收穫指數生長的NCI-H82細胞，在補充有10% FCS的RMPI中洗滌一次，並以5000個細胞/孔接種於補充有10% FCS之100 μl RPMI的96孔白色固體盤中。第二天，加入25 µl純化的單株抗體(G23-F、2-C8-A、7-I1-B或10-O18-A)或參考單株抗體，起始濃度為10 µg /ml，並進行連續三倍稀釋。加入25 µl皂苷(saponin)結合的F(ab)抗小鼠Ig HL (Fab ZAP)，最終濃度為4.4 nM。3-4天後，將等體積的Cell Titre Glow (Promega G7571)加入盤中，在定軌振盪器上搖動2分鐘，在室溫下再經10分鐘後，使用讀盤器讀取螢光。為了消除前區(prozone)效應，所有的單株抗體都被測試為全滴定。如圖9及下表所示，所有單株抗體皆表現出細胞毒性活性，與參考單株抗體相當。在使用這些單株抗體的其他實驗中，小鼠IgG1對照單株抗體並無表現出細胞毒性活性。因此，這些結果表明細胞毒性活性是通過識別DLL3而不是通過FcR介導的。
FAB ZAP % SC16 最大殺傷
6-G23-F (10 µg/ml) 94.0
7-I1-B (10 µg/ml) 97.0
10-O18-A (10 µg/ml) 88.0
2-C8-A (10 µg/ml) 89.0
這些結果證實本技術的免疫球蛋白相關組成物可將治療劑遞送至在其細胞表面表現DLL3的腫瘤。因此，本文揭示之免疫球蛋白相關組成物可用於將治療劑遞送至DLL3陽性癌細胞。 實施例 5- 抗 DLL3 抗體的表位結合
純化的抗DLL3單株抗體組和參考單株抗體在Carterra®陣列表面等離子共振(SPR)測定平台上進行成對表位組合(Carterra ®Inc., Salt Lake City UT)，其中測試各單株抗體對組胺酸標記的DLL3抗原(DLL3-His)的捕獲，以及與組中的所有其他抗體競爭與DLL3-His的結合。藉由印刷陣列測定法(print array method)，通過標準胺偶合技術將抗體固定在HC200M晶片(配體)上。然後在每個循環中，將抗原注入整個陣列，之後注入單一抗體(分析物)。在每個循環結束時，將表面再生以在新循環開始之前去除抗原和分析物。如下表所示，組(panel)測定了三個不同的倉(bin)，其中7-I1-B和2-C8-A對映至倉2，而6-G23-F在倉3中，10-O18-A在倉1中。
單株抗體 表位倉
10-O18-A 1
7-I1-B 2
2-C8-A 2
6-G23-F 3
這些結果證實本技術的免疫球蛋白相關組成物與DLL3蛋白中存在的三個不同表位結合。因此，本文揭示的免疫球蛋白相關組成物可彼此組合用於將多種治療劑遞送至表現DLL3的腫瘤細胞。 實施例 6- 親和力測量
使用Octet HTX儀器，在25℃下使用PBS 0.1% BSA 0.02% Tween 20作為結合緩衝液，10 mM甘胺酸pH 1.7作為再生緩衝液，藉由生物層干涉法(biolayer interferometry，BLI)測定四種單株抗體(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B及10-O18-A)的結合親和力。將四種純化的單株抗體(各5 µg/mL)加載至抗小鼠Fc感測器上。將加載的感測器浸入重組人類DLL3蛋白(胺基酸Ala27-Ala479，cat #9749-DL，R&D Systems)的系列稀釋液中，起始濃度為200 nM，使用7次系列1:3稀釋。如圖10A-10D所示，結合是濃度依賴性的。使用單價(1:1)結合模型計算解離常數(KD)。如圖10E中所示，所有單株抗體的親和力都在次奈莫耳(sub-nanomolar)範圍內。圖11顯示6-G23-F、10-O18-A及2-C8-A單株抗體(mAbs)選擇性地結合DLL3，但不結合DLL1或DLL4。7-I1-B mAb結合DLL3及DLL4，但不結合DLL1。
這些結果證實本技術的免疫球蛋白相關組成物以高親和力特異性結合 DLL3。因此，本技術的免疫球蛋白相關組成物可用於檢測生物樣品中之DLL3蛋白的方法中。 實施例 7- 單株抗體與轉染細胞和初代細胞的結合
藉由流式細胞分析技術測試四種單株抗體(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A)與小鼠和食蟹猴DLL3以及內源性人類DLL3結合的能力。為此目的，以編碼全長人類、小鼠或食蟹猴DLL3的質體DNA轉染HEK293細胞並用於實驗。簡而言之，將106個轉染的HEK293細胞或NCI-H82初代細胞在FACS緩衝液PBS 0.5% BSA中添加至96孔U型底盤的孔中，並將純化的單株抗體添加至10 µg/ml。在4℃培育30分鐘後，將細胞在FACS緩衝液中洗滌3次，並與PE標記的F(ab)2抗小鼠IgG H和L第二階段培育。在4℃培育另30分鐘後，將細胞在FACS緩衝液中洗滌3次，在流式細胞儀上分析。資料以單株的平均螢光強度除以第二階段的背景染色的比率呈現。如下表所示，所有單株抗體都與食蟹猴DLL3發生交叉反應，並在NCI H82細胞上檢測到內源性DLL3，但只有6-G23-F和7-I1-B與小鼠DLL3結合。
單株抗體 293 hDLL3 293 cyno DLL3 293 mDLL3 293 ( 陰性對照 ) NCI-H82
6-G23-F 6.33 13.06 3.97 1.32 11.10
7-I1-B 9.74 18.67 4.70 1.46 19.21
10-O18-A 4.74 9.85 0.99 0.60 9.40
2-C8-A 7.71 15.03 1.50 0.59 11.89
這些結果證實本技術的免疫球蛋白相關組成物可用於檢測生物樣品中之DLL3蛋白的方法中。 實施例 8- 定序
藉由RACE (cDNA末端的快速擴增)，從7-I1-B、6-G23-F、2-C8-A和10-O18-A的對應雜交瘤中分離四種單株抗體的可變重鏈和可變輕鏈。以RNAEasy套組(Qiagen)從裂解的雜交瘤中分離RNA。分離mRNA用於cDNA合成，並使用RACE套組生成PCR產物。然後將PCR產物選殖至TOPO載體中，進行PCR擴增，隨後凝膠分離用於測序。重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)的核苷酸和胺基酸序列顯示於下表及圖5A-5B (7-I1-B)，圖6A-6B (2-C8-A)，圖7A-7B (10-O18-A)、及圖8A-8B (6-G23-F)。
SEQ ID NO: 敘述 序列
SEQ ID NO：1 7-I1-B之V H的核苷酸序列 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGGGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACACCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGCAAATCTGATGGTGGGACAACAGACTACGCTGCACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAAAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACCCAGTATTATTGGAACTCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：2 7-I1-B之V H的胺基酸序列 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNTWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKSDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTQYYWNSFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：3 7-I1-B之V HCDR1的胺基酸序列 GFTFSNTW
SEQ ID NO：4 7-I1-B之V HCDR2的胺基酸序列 IKSKSDGGTT
SEQ ID NO：5 7-I1-B之V HCDR3的胺基酸序列 TQYYWNSFDY
SEQ ID NO：6 7-I1-B之V L的核苷酸序列 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATAATCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID NO：7 7-I1-B之V L的胺基酸序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：8 7-I1-B之V LCDR1的胺基酸序列 QASQDISNYLN
SEQ ID NO：9 7-I1-B之V LCDR2的胺基酸序列 DASNLET
SEQ ID NO：10 7-I1-B之V LCDR3的胺基酸序列 QQYDNLPLT
SEQ ID NO：11 2-C8-A之V H的核苷酸序列 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCAGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGGAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGGGCTGGGCTCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：12 2-C8-A之V H的胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：13 2-C8-A之V HCDR1的胺基酸序列 GFTFSSY
SEQ ID NO：14 2-C8-A之V HCDR2的胺基酸序列 KEDGSE
SEQ ID NO：15 2-C8-A之V HCDR3的胺基酸序列 DPGWAPFDY
SEQ ID NO：16 2-C8-A之V L的核苷酸序列 GACATCCAGATGTCCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAAGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCGCCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTTCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCACGCTGGAGATCAAA
SEQ ID NO：17 2-C8-A之V L的胺基酸序列 DIQMSQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLAISSLQPEDFATYYCQQYNSFPYTFGQGTTLEIK
SEQ ID NO：18 2-C8-A之V LCDR1的胺基酸序列 RASQGISNYLA
SEQ ID NO：19 2-C8-A之V LCDR2的胺基酸序列 AASSLQS
SEQ ID NO：20 2-C8-A之V LCDR3的胺基酸序列 QQYNSFPYT
SEQ ID NO：21 10-O18-A之V H的核苷酸序列 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAATAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTTTTACAGTGGGATCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCATTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATCGGCGTGGCTGGTTTTTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：22 10-O18-A之V H的胺基酸序列 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：23 10-O18-A之V HCDR1的胺基酸序列 GGSINSY
SEQ ID NO：24 10-O18-A之V HCDR2的胺基酸序列 FYSGI
SEQ ID NO：25 10-O18-A之V HCDR3的胺基酸序列 IGVAGFYFDY
SEQ ID NO：26 10-O18-A之V L的核苷酸序列 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTACCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID NO：27 10-O18-A之V L的胺基酸序列 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGTSPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：28 10-O18-A之V LCDR1的胺基酸序列 RASQSVSSSYLA
SEQ ID NO：29 10-O18-A之V LCDR2的胺基酸序列 GASSRAT
SEQ ID NO：30 10-O18-A之V LCDR3的胺基酸序列 QQYGTSPLT
SEQ ID NO：31 6-G23-F之V H的核苷酸序列 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCGACCCAAGTGATGGTAGCACAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGGGAATATAACTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：32 6-G23-F之V H的胺基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：33 6-G23-F之V HCDR1的胺基酸序列 GYTFTSY
SEQ ID NO：34 6-G23-F之V HCDR2的胺基酸序列 DPSDGS
SEQ ID NO：35 6-G23-F之V HCDR3的胺基酸序列 DREYNYYGLDV
SEQ ID NO：36 6-G23-F之V L的核苷酸序列 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTATACCGTGATGGAAACACCTACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACCGGGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCCGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCCGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTACACACTGGCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
SEQ ID NO：37 6-G23-F之V L的胺基酸序列 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYRDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFRGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：38 6-G23-F之V LCDR1的胺基酸序列 RSSQSLVYRDGNTYLN
SEQ ID NO：39 6-G23-F之V LCDR2的胺基酸序列 KVSNRDS
SEQ ID NO：40 6-G23-F之V LCDR3的胺基酸序列 MQGTHWPPT
在以下關於「重組抗DLL3抗體的生產」的實施例8-1至8-3中，根據IMGT ID J00241，將精胺酸殘基插入輕鏈恆定區的第一個胺基酸位置 實施例 8-1 重組抗 DLL3 抗體 H2-C8-A 、 H2-C8-A-2 及 H2-C8-A-3 之生產
重鏈的構建：藉由連接實施例8中獲得的可變區(SEQ ID NO:12)與人類IgG1的γ鏈恆定區(SEQ ID NO:42)，構建抗DLL3抗體H2-C8-A的重鏈(SEQ ID NO:59)。抗DLL3抗體H2-C8-A-2 (SEQ ID NO：60)和H2-C8-A-3 (SEQ ID NO：61)的重鏈也藉由連接實施例8中獲得的可變區(SEQ ID NO：12)與IgG1或變異體之人類γ鏈恆定區(SEQ ID NOs：57及58)來構建。
Figure 02_image069
Figure 02_image071
Figure 02_image073
輕鏈的構建：構建了抗DLL3抗體H2-C8-A的輕鏈，且藉由將實施例8中獲得的可變區與IgG1的人類κ鏈恆定區(SEQ ID NOs：17及49)連接來構建抗DLL3抗體H2-C8-A-2及H2-C8-A-3的輕鏈(SEQ ID NO：62)。
Figure 02_image075
表現載體pCMA-G1之構建：包含人類重鏈訊號序列和編碼人類γ鏈恆定區之DNA序列的表現載體pCMA-G1的構建體敘述於專利申請號WO2017/051888。
表現載體pCMA-LK之構建：包含人類輕鏈訊號序列和編碼人類γ鏈恆定區之DNA序列的表現載體pCMA-LK構建體敘述於專利申請號WO2017/051888。
表現載體pCMA-G1-1之構建：合成DNA片段(SEQ ID No：75) (Eurofins Genomics，人工基因合成服務)。DNA片段用XbaI和PmeI的限制酶消化。藉由瓊脂糖凝膠電泳分離得到的1.1 kb片段，並以Wizard SV Gel 和 PCR Clean-Up System (Promega) 進行純化。pCMA-G1的表現載體亦以XbaI和PmeI的限制酶消化，以藉由瓊脂糖凝膠電泳移除人類重鏈訊號序列和編碼人類γ鏈恆定區的DNA序列。得到的3.4 kb pCMA-G1 XbaI/PmeI片段亦以Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System純化。將純化的1.1 kb和3.4 kb XbaI/PmeI片段與Ligation High (Toyobo)連接以構建表現載體pCMA-G1-1。
Figure 02_image077
Figure 02_image079
Figure 02_image081
抗DLL3抗體H2-C8-A-2重鏈之表現載體的構建：合成由核苷酸位置58至405處的核苷酸(在SEQ ID NO:76中)與在5'位點處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC；SEQ ID NO：76之核苷酸36-57)及3'位點處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(AGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC；SEQ ID NO:76之核苷酸406-428)所組成的DNA片段(GENEART，人工基因合成服務)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Takara Bio USA)，將合成的DNA片段插入pCMA-G1-1已被限制性酶BIpI切割的位點，從而構建抗-DLL3抗體H2-C8-A-2重鏈的表現載體。
Figure 02_image083
Figure 02_image085
Figure 02_image087
抗DLL3抗體H2-C8-A-3重鏈表現載體的構建：合成由核苷酸位置1至1401處的核苷酸(在SEQ ID NO:77中)與在SEQ ID NO：77之5'位點外側處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(CCAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACC；SEQ ID NO：86)及SEQ ID NO：77之3'位點外側處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(TGAGTTTAAACGGGGGAGGCTAACT；SEQ ID NO：87)所組成的DNA片段(GENEART，人工基因合成服務)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組，將擴增的DNA片段插入pCMA-LK已被限制性酶XbaI/PmeI切割的位點，從而構建抗-DLL3抗體H2-C8-A-3重鏈的表現載體。
Figure 02_image089
Figure 02_image091
Figure 02_image093
抗DLL3抗體H2-C8-A-2及H2-C8-A-3輕鏈表現載體的構建：合成由核苷酸位置61至381處的核苷酸(在SEQ ID NO：80中)與在5'位點處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC；SEQ ID NO：80之核苷酸37-60)及3'位點處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(CGTACGGTGGCCGCCCCCTCC；SEQ ID NO：80之核苷酸382-402)所組成的DNA片段(GENEART，人工基因合成服務)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Takara Bio USA)，將合成的DNA片段插入pCMA-LK已被限制性酶BsiWI切割的位點，從而構建抗-DLL3抗體H2-C8-A-2及H2-C8-A-3輕鏈的表現載體。
Figure 02_image095
Figure 02_image097
表現及純化：構建編碼H2-C8-A的重鏈和輕鏈對應之DNA序列的表現載體(轉染級質體，Genscript)，並轉染至HEK293細胞(HD 293F，Genscript)。在培養和收穫之後，藉由蛋白A親和性層析從獲得的上清液中純化抗體。
或者，關於H2-C8-A-3，按照手冊，培養和繼代FreeStyle 293F細胞(Thermo Fisher Scientific)。將處於對數生長期的FreeStyle 293F細胞接種在3-L Erlenmeyer Flask (CORNING)上，並以FreeStyle293表現培養基(Thermo Fisher Scientific)，以2.0 - 2.4×10 6個細胞/mL稀釋至總體積為580 mL。同時，將300 µg H2-C8-A-3的重鏈表現載體、300 µg H2-C8-A-3 的輕鏈表現載體和1.8 mg聚乙亞胺(Polyscience)添加至20 mL Opti -Pro SFM培養基(Thermo Fisher Scientific)，輕輕攪拌所獲得之混合物。培育5分鐘後，將混合物添加至 FreeStyle 293F細胞中。將細胞在培養箱(37℃，8% CO 2)中以95 rpm振盪培育4小時，然後將包括4 mM GlutaMAX Supplement I (Thermo Fisher Scientific)的480 mL BalanCD(R) HEK293 (FUJIFILM Irvine Scientific)及包括4 mM GlutaMAX Supplement I的120 mL BalanCD(R) HEK293 Feed (FUJIFILM Irvine Scientific)添加到培養物中。將細胞進一步在培養箱(37℃，8% CO 2)中以95 rpm振盪培養6天。收集培養上清液並以500-mL Filter System (Thermo Fisher Scientific)過濾。
另一方面，關於H2-C8-A-2，按照手冊，FreeStyle 293F細胞在37℃、8% CO 2下在具有Middle Scale Bioreactor BCP (Biott)的旋轉瓶中培養和繼代。使用WAVE BIOREACTOR (GE Healthcare)進行FreeStyle 293F細胞的轉染和培養。將處於對數生長期的2.5 L FreeStyle 293F細胞以2.0 - 2.4×10 6個細胞/mL接種在WAVE CELLBAG10L (Cytiva)上。同時，將1.25 mg H2-C8-A-2的重鏈表現載體、1.25 mg H2-C8-A-2的輕鏈表現載體和7.5 mg聚乙亞胺(Polyscience)添加至160 mL Opti -Pro SFM培養基(Thermo Fisher Scientific)，輕輕攪拌所得混合物。培育5分鐘後，將混合物添加到WAVE CELLBAG10L中的FreeStyle 293F細胞中。細胞在WAVE CELLBAG10L (37℃，8% CO 2)中搖動培養4小時，然後將包括4 mM GlutaMAX Supplement I的1.92 L BalanCD(R) HEK293及包括4 mM GlutaMAX Supplement I的480 mL BalanCD(R) HEK293 Feed添加至培養物中。細胞在WAVE CELLBAG10L (37℃，8% CO 2)中進一步搖動培養6天。收集培養上清液，離心並以CAPSULE CARTRIDGE FILTER (孔徑：0.45　m，ADVANTEC)過濾。
抗DLL3抗體之純化：過濾後的培養上清液藉由rProtein A親和層析和陶瓷羥磷灰石兩步法純化。純化方法的細節敘述於專利申請號WO2020/013170。 實施例 8-2 重組抗 DLL3 抗體 H6-G23-F 、 H6-G23-F-2 及 H6-G23-F-3 之生產
重鏈的構建：藉由連接實施例8中獲得的可變區(SEQ ID NO:32)與人類IgG1之γ鏈恆定區(SEQ ID NO:42)來構建抗DLL3抗體H6-G23-F的重鏈(SEQ ID NO：63)。抗DLL3抗體H6-G23-F-2及H6-G23-F-3之重鏈(分別為SEQ ID NOs：64及65)亦藉由連接實施例8所獲得之可變區(SEQ ID NO：32)與人類IgG1變異體之γ鏈恆定區(SEQ ID NOs：57及58)來構建。
Figure 02_image099
Figure 02_image101
輕鏈的構建：構建了抗DLL3抗體H6-G23-F的輕鏈，且藉由將實施例8中獲得的可變區與人類IgG1的κ鏈恆定區(SEQ ID NOs：37及49)連接，可構建抗DLL3抗體H6-G23-F-2及H6-G23-F-3的輕鏈(SEQ ID NO：66)。
Figure 02_image103
表現及純化：製備編碼上述H6-G23-F的重鏈和輕鏈對應之DNA序列的表現載體(轉染級質體，Genscript)，並轉染至HEK293細胞(HD 293F，Genscript)。在培養和收穫之後，藉由蛋白A親和性層析從獲得的上清液中純化抗體。 實施例 8-3 重組抗 DLL3 抗體 H10-O18-A 、 H10-O18-A-2 及 H10-O18-A-3 之生產
重鏈的構建：抗DLL3抗體H10-O18-A的重鏈(SEQ ID NO：67)藉由連接實施例8中獲得的可變區(SEQ ID NO：22)與人類IgG1之γ鏈恆定區(SEQ ID NO：42)來構建。抗DLL3抗體H10-O18-A-2及H10-O18-A-3的重鏈(分別為SEQ ID NOs:68及69)可藉由連接實施例8獲得之可變區 (SEQ ID NO：22)與人類IgG1變異體之γ鏈恆定區(SEQ ID NOs：57及58)來構建。
Figure 02_image105
Figure 02_image107
Figure 02_image109
Figure 02_image111
輕鏈的構建：構建了抗DLL3抗體H10-O18-A的輕鏈，且抗DLL3抗體H10-O18-A-2及H10-O18-A-3的輕鏈(SEQ ID NO：70)可藉由連接實施例8中獲得的可變區與人類IgG1的κ鏈恆定區(SEQ ID NO：27及49)來構建。
Figure 02_image113
抗DLL3抗體H10-O18-A-2重鏈之表現載體的構建：合成DNA片段，其由核苷酸位置58至405處的核苷酸(在SEQ ID NO：78中)與在5'位點處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC；SEQ ID NO：78之核苷酸36-57)及3'位點處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(AGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC；SEQ ID NO：78之核苷酸406-428)所組成(GENEART，人工基因合成服務)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Takara Bio USA)，將合成的DNA片段插入pCMA-G1-1已被限制性酶BIpI切割的位點，從而構建抗-DLL3抗體H10-O18-A-2重鏈的表現載體。
Figure 02_image115
Figure 02_image117
Figure 02_image119
抗DLL3抗體H10-O18-A-3重鏈之表現載體的構建：合成DNA片段，其由核苷酸位置1至1401處的核苷酸(在SEQ ID NO：79中)與在SEQ ID NO：79之5'位點外側處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(CCAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACC；SEQ ID NO：86)及SEQ ID NO：79之3'位點外側處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(TGAGTTTAAACGGGGGAGGCTAACT；SEQ ID NO：87)所組成(GENEART，人工基因合成服務)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組，將擴增的DNA片段插入pCMA-LK已被限制性酶PmeI/XbaI切割的位點，從而構建抗-DLL3抗體H10-O18-A-3重鏈的表現載體。
Figure 02_image121
Figure 02_image123
抗DLL3抗體H10-O18-A-2及H10-O18-A-3輕鏈表現載體之構建：合成DNA片段，其由核苷酸位置61至384處的核苷酸(在SEQ ID NO：81中)與在5'位點處用於In-Fusion反應的側翼重組位點(CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC；SEQ ID NO：81之核苷酸37-60)及3'位點處(CGTACGGTGGCCGCCCCCTCC；SEQID NO：81之核苷酸385-405)所組成(GENEART，人工基因合成服務)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Takara Bio USA)，將合成的DNA片段插入pCMA-LK已被限制性酶BsiWI切割的位點，從而構建抗-DLL3抗體H10-O18-A-2及H10-O18-A-3輕鏈的表現載體。
Figure 02_image125
Figure 02_image127
表現及純化：構建編碼H10-O18-A的重鏈和輕鏈對應之DNA序列的表現載體(轉染級質體，Genscript)，並轉染至HEK293細胞(HD 293F，Genscript)。在培養和收穫之後，藉由蛋白A親和性層析從獲得的上清液中純化抗體。
或者，關於H10-O18-A-3，按照手冊，培養和繼代FreeStyle 293F細胞(Thermo Fisher Scientific)。將處於對數生長期的FreeStyle 293F細胞接種在3-L Erlenmeyer Flask (CORNING)上，並以FreeStyle293表現培養基(Thermo Fisher Scientific)，以2.0 - 2.4×10 6個細胞/mL稀釋至總體積為580 mL。同時，將300 µg H10-O18-A-3的重鏈表現載體、300 µg H10-O18-A-3的輕鏈表現載體和1.8 mg聚乙亞胺(Polyscience)添加至20 mL Opti -Pro SFM培養基(Thermo Fisher Scientific)，輕輕攪拌所獲得之混合物。培育5分鐘後，將混合物添加至FreeStyle 293F細胞中。將細胞在培養箱(37℃，8% CO 2)中以95 rpm振盪培育4小時，然後將包括4 mM GlutaMAX Supplement I (Thermo Fisher Scientific)的480 mL BalanCD(R) HEK293 (FUJIFILM Irvine Scientific)及包括4 mM GlutaMAX Supplement I的120 mL BalanCD(R) HEK293 Feed (FUJIFILM Irvine Scientific)添加到培養物中。將細胞進一步在培養箱(37℃，8% CO 2)中以95 rpm振盪培養6天。收集培養上清液並以500mL Filter System (Thermo Fisher Scientific)過濾。 另一方面，關於H10-O18-A-2，按照手冊，FreeStyle 293F細胞在37℃、8% CO 2下在具有Middle Scale Bioreactor BCP (Biott)的旋轉瓶中培養和繼代。使用WAVE BIOREACTOR (GE Healthcare)進行FreeStyle 293F細胞的轉染和培養。將處於對數生長期的2.5 L FreeStyle 293F細胞以2.0 - 2.4×10 6個細胞/mL接種在WAVE CELLBAG10L (Cytiva)上。同時，將1.25 mg H10-O18-A-2的重鏈表現載體、1.25 mg H10-O18-A-2的輕鏈表現載體和7.5 mg聚乙亞胺(Polyscience)添加至160 mL Opti-Pro SFM培養基(Thermo Fisher Scientific)，輕輕攪拌所得混合物。培育5分鐘後，將混合物添加到WAVE CELLBAG10L中的FreeStyle 293F細胞中。細胞在WAVE CELLBAG10L (37℃，8% CO 2)中搖動培養4小時，然後將包括4 mM GlutaMAX Supplement I的1.92 L BalanCD(R) HEK293及包括4 mM GlutaMAX Supplement I的480 mL BalanCD(R) HEK293 Feed添加至培養物中。細胞在WAVE CELLBAG10L (37℃，8% CO 2)中進一步搖動培養6天。收集培養上清液，離心並以CAPSULE CARTRIDGE FILTER (孔徑：0.45 μm，ADVANTEC)
抗DLL3抗體之純化：過濾後的培養上清液藉由rProtein A親和層析和陶瓷羥磷灰石兩步法純化。純化方法的細節敘述於專利申請號WO2020/013170。 實施例 9- 抗 DLL3 抗體 hSC16.56 之生產
參照國際公開號WO 2017/031458中所載之hSC16.56的下述SEQ ID NOs：71和72的重鏈全長和輕鏈全長胺基酸序列(其對應於國際公開號WO 2017/031458中的SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)來製備抗DLL3抗體hSC16.56：
Figure 02_image129
實施例 10-H2-C8-A- 結合物之生產
步驟1：抗體-藥物結合物(1) [式11]
Figure 02_image131
抗體之還原：藉由使用生產方法1所述之共通程序B(使用1.52 mLmg -1cm -1作為280 nm吸光係數)及C，將實施例8-1中生產之H2-C8-A以PBS6.0/EDTA調整至10.5 mg/mL。在此溶液(2.0 mL)中，添加10 mM TCEP(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)水溶液(0.0868 mL；每抗體分子6.0當量)及1 M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque,Inc.；0.0300mL)。在確認溶液具有pH 7.0後，藉由將溶液在37℃培育2小時來還原抗體中的鏈間雙硫鍵。
抗體和藥物連接子之間的結合：向其中加入10 mM N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-lH-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-lH,12H­苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲
Figure 111101468-001
并[l,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧乙氧基)甲基]甘胺醯胺(「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)(US2016/0297890中實施例14之方法8)之二甲亞碸(0.145 mL；每抗體分子10當量)溶液，並將所獲得之混合物在15℃培育1小時來結合藥物連接子與抗體。隨後，向其中加入100 mM NAC(Sigma-Aldrich Co. LLC)水溶液(0.0145 mL；每抗體分子10當量)，並將所獲得之混合物在室溫下進一步攪拌20分鐘以終止藥物連接子之反應。
純化：藉由生產方法1所述之共通程序D純化上述溶液，獲得9.0mL含有標題抗體-藥物結合物「H2-C8-A-結合物」之溶液。
表徵：使用生產方法1所述之共通程序E(使用ε A,280= 220378及ε A,370= 0，ε D,280= 5440及ε D,370= 21800)，獲得以下特徵值。抗體濃度：1.96 mg/mL，抗體產率：17.6 mg (84%)，藉由共通程序E測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：5.0，且藉由共通程序F(梯度程序1)測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：7.5。 實施例 11-H6-G23-F- 結合物之生產
使用H6-G23-F溶液(10.1 mg/mL於PBS6.0/EDTA中，4.0 mL)進行與實施例10相同的操作(使用1.46 mLmg -1cm -1作為280 nm吸收係數)。結果獲得H6-G23-F-結合物溶液(18 mL)。
表徵：使用生產方法1所述之共通程序E(使用ε A,280= 215353及ε A,370= 0，ε D,280= 5440及ε D,370= 21800)，獲得以下特徵值。抗體濃度：1.74 mg/mL，抗體產率：31.4 mg (78%)，藉由共通程序E測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：5.3，且藉由共通程序F(梯度程序1)測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：7.7。 實施例 12-H10-O18-A- 結合物之生產
使用H10-O18A溶液(10.5 mg/mL於PBS6.0/EDTA中，3.8 mL)進行與實施例10相同的操作(使用1.49 mLmg -1cm -1作為280 nm吸收係數)。結果獲得H10-O18-A結合物溶液(18 mL)。
表徵：使用生產方法1所述之共通程序E(使用ε A,280= 215424及ε A,370= 0，ε D,280= 5440及ε D,370= 21800)，獲得以下特徵值。抗體濃度：1.80 mg/mL，抗體產率：32.5 mg (81%)，藉由共通程序E測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：5.1，且藉由共通程序F(梯度程序2)測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：7.8。 實施例 13- 抗 DLL3 ADC, SC16LD6.5 之生產
藉由以下步驟製備抗DLL3 ADC，SC16LD6.5；參考WO 2017/031458 A2產生抗DLL3抗體hSC16.56。hSC16.56的輕鏈和重鏈的胺基酸序列分別以SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：72表示。根據先前報導的程序(Med.Chem.Lett.2016, 7, 983−987)合成藥物連接子SG3249。根據WO 2014/130879 A2中所述程序，結合hSC16.56與SG3249，以提供SC16LD6.5。 實施例 14- 抗 LPS 抗體 - 結合物之生產
抗LPS抗體結合物是由識別與DLL3無關之抗原的人類IgG所產生的抗體藥物結合物，並用作陰性對照。
參照國際公開號WO 2015/046505中所述之h#1G5-H1L1的下述SEQ ID NOs：73和74所示的重鏈全長和輕鏈全長胺基酸序列(其對應於國際公開號WO 2015/046505中的SEQ ID NOs：57和67)來生產抗LPS抗體。
在實施例10之相似方法中，使用抗LPS抗體及N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-lH-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-lH,12H­苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲
Figure 111101468-001
并[l,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧乙氧基)甲基]甘胺醯胺(「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)製備抗LPS抗體-結合物。
表徵：抗體濃度：10.74 mg/mL，藉由共通程序E測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：5.8，且藉由共通程序F(梯度程序1)測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：7.9
Figure 02_image133
Figure 02_image135
實施例 15 - 抗體 - 藥物結合物之活體內抗腫瘤作用
使用源自免疫缺陷小鼠的動物模型，藉由接種DLL3陽性人類腫瘤細胞株細胞來評估抗體-藥物結合物的抗腫瘤作用。將4至5週齡的BALB/c裸鼠(CAnN.Cg-Foxnl [nu]/ CrlCrlj [Foxnlnu/Foxnlnu]，Charles River Laboratories Japan inc.)在SPF條件下適應3天或更長時間，然後用於本實驗。給小鼠餵食無菌固體飼料(FR-2，Funabashi Farms Co., Ltd)，並給予無菌自來水(藉由向自來水中添加5至15 ppm次氯酸鈉溶液製備)。使用電子數顯卡尺(CD-15CX，Mitutoyo Corp.)，每週兩次測量接種腫瘤的長徑和短徑，然後根據以下表示式計算腫瘤的體積。腫瘤體積(mm 3= 1 / 2 x長徑(mm) x [短徑(mm)] 2以ABS緩衝液(10 mM乙酸鹽緩衝液，5%山梨糖醇，pH 5.5)(Nacalai Tesque,Inc.)稀釋各抗體-藥物結合物，並以各實施例中顯示的劑量將稀釋液靜脈內投予至各小鼠的尾部。以與上述相同的方式將ABS緩衝液投予對照組(媒劑組)。實驗中每組使用六隻小鼠。
15)-1 抗腫瘤作用 - (1)
將DLL3陽性人類小細胞肺癌細胞株NCI-H209 (ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.)中，並將細胞懸浮液以4 x 10 6個細胞的劑量皮下接種至每隻雌性裸鼠的右脅區域(第0天)。在第11天，將小鼠隨機分組。在分組當天，3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物)或抗LPS抗體-結合物中的每一種以3 mg/kg之劑量靜脈內投予至各小鼠的尾部。結果顯示於圖1。橫坐標描繪了接種後的天數，縱坐標描繪了估計的腫瘤體積。誤差範圍描述為SE值。箭頭表示投予日期。
抗LPS抗體結合物在該腫瘤模型中並未表現出有意義的抗腫瘤作用。所有3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物)在投予後均減小了腫瘤體積，發揮顯著的腫瘤消退作用，且腫瘤消退作用持續至投予後28天(圖1)。此外，經各抗體-藥物結合物處理的小鼠並未顯示出明顯的體重減輕跡象，這表明3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物)是低毒性且安全的。當各組中至少一隻小鼠的估計腫瘤體積超過3000 mm 3時，將媒劑組和抗-LPS抗體-結合物組進行安樂死。
15)-2 抗腫瘤作用 - (2)
將DLL3陽性人類小細胞肺癌細胞株NCI-H524 (ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.)中，並將細胞懸浮液以2.5 x 10 6個細胞的劑量皮下接種至每隻雌性裸鼠的右脅區域(第0天)。在第13天，將小鼠隨機分組。在分組當天，3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物)或抗LPS抗體-結合物中的每一種以3 mg/kg之劑量靜脈內投予至各小鼠的尾部。結果顯示於圖2。橫坐標描繪了接種後的天數，縱坐標描繪了估計的腫瘤體積。誤差範圍描述為SE值。箭頭表示投予日期。
抗LPS抗體結合物在該腫瘤模型中並未表現出有意義的抗腫瘤作用。所有3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物)在投予後均減小了腫瘤體積，發揮顯著的腫瘤消退作用，且腫瘤消退作用持續至投予後29天(圖2)。此外，經各抗體-藥物結合物處理的小鼠並未顯示出明顯的體重減輕跡象，這表明3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物)是低毒性且安全的。當組別中至少一隻小鼠的估計腫瘤體積超過3000mm 3時，對媒劑組和抗-LPS抗體-結合物組進行安樂死。
15)-3 抗腫瘤作用 - (3)
將DLL3陽性人類小細胞肺癌細胞株NCI-H510A (ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.)中，並將細胞懸浮液以2.5 x 10 6個細胞的劑量皮下接種至每隻雌性裸鼠的右脅區域(第0天)。在第15天，將小鼠隨機分組。在分組當天，3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物)、抗LPS抗體-結合物中的每一種以3 mg/kg之劑量靜脈內投予至各小鼠的尾部。參考抗DLL3-抗體-藥物結合物 (SC16LD6.5)以0.2 mg/kg之劑量靜脈內投予與至個小鼠之尾部。結果顯示於圖3。橫坐標描繪接種後的天數，縱坐標描繪估計的腫瘤體積。誤差範圍描述為SE值。箭頭表示投予日期。
抗LPS抗體結合物3 mg/kg在該腫瘤模型中並未表現出有意義的抗腫瘤作用。參考抗DLL3-藥物結合物(SC16LD6.5) 0.2 mg/kg在該腫瘤模型中呈現出一些腫瘤生長抑制作用，而沒有腫瘤消退作用。另一方面，所有3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物) 3 mg/kg在投予後均減小了腫瘤體積，發揮顯著的腫瘤消退作用，且腫瘤消退作用持續至投予後27天。所有3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物)皆比SC16LD6.5進一步減小了腫瘤體積。因此，與SC16LD6.5相比，本發明3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物) 3 mg/kg作為用作抗腫瘤劑的抗體-藥物結合物具有優越性。(圖3)。此外，經各抗體-藥物結合物處理的小鼠並未顯示出明顯的體重減輕跡象，這表明3種抗體-藥物結合物(殖株名稱：H2-C8-A-結合物、H6-G23-F-結合物、H10-O18-A-結合物)是低毒性且安全的。 實施例 16-H2-C8-A-2 結合物之生產
使用H2-C8-A-2溶液(10.1 mg/mL於PBS6.0/EDTA中，18.0 mL)進行與實施例10相同的操作(使用1.53 mLmg -1cm -1作為280 nm吸收係數)。結果獲得H2-C8-A-2結合物溶液(59.5 mL)。
表徵：使用生產方法1所述之共通程序E(使用ε A,280= 220420及ε A,370= 0，ε D,280= 5440及ε D,370= 21800)，獲得以下特徵值。抗體濃度：2.80 mg/mL，抗體產率：166 mg (92%)，藉由共通程序E測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：6.1，且藉由共通程序F(梯度程序1)測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：7.8。 實施例 17-H10-O18-A-2- 結合物之生產
使用H10-O18-A-2溶液(10.3 mg/mL於PBS6.0/EDTA中，18.3 mL)進行與實施例10相同的操作(使用1.49 mLmg -1cm -1作為280 nm吸收係數)。結果獲得H10-O18-A-2結合物溶液(59.5 mL)。
表徵：使用生產方法1所述之共通程序E(使用ε A,280= 215380及ε A,370= 0，ε D,280= 544及ε D,370= 21800)，獲得以下特徵值。抗體濃度：2.85 mg/mL，抗體產率：169.8 mg (90%)，藉由共通程序E測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：6.0，且藉由共通程序F(梯度程序2)測量之每抗體分子的平均結合藥物分子數(n)：7.9。 實施例 18- 抗體 - 藥物結合物之活體內抗腫瘤作用
18)-1 抗腫瘤作用 - (4)
將DLL3陽性人類小細胞肺癌細胞株NCI-H510A (ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.)中，並將細胞懸浮液以2.3 x 10 6個細胞的劑量皮下接種至每隻雌性裸鼠的右脅區域。腫瘤建立後，將小鼠隨機分組(每組6隻)。在分組當天，將2種抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物、H10-O18-A-2-結合物)或抗LPS抗體-結合物中的每一種以3 mg/kg的劑量靜脈內投予至各小鼠尾部。參考抗DLL3-抗體-結合物 (SC16LD6.5)以0.2 mg/kg之劑量靜脈內投予與至個小鼠之尾部。結果顯示於圖12。橫坐標描繪投予後的天數，縱坐標描繪估計的腫瘤體積。誤差範圍描述為SE值。
抗LPS抗體結合物3 mg/kg在該腫瘤模型中並未表現出有意義的抗腫瘤作用。0.2 mg/kg的參考抗DLL3-藥物結合物(SC16LD6.5) 在該腫瘤模型中呈現出一些腫瘤生長抑制作用，而沒有腫瘤消退作用。另一方面，3 mg/kg的兩種抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物、H10-O18-A-2-結合物)均減少了腫瘤體積，且在這些組別中，所有腫瘤在投予後28天時都比它們的初始體積小。H2-C8-A-2-結合物及H10-O18-A-2-結合物比SC16LD6.5進一步減少腫瘤體積。因此，相較於SC16LD6.5抗體藥物結合物，本發明二種抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物、H10-O18-A-2-結合物)作為用作抗腫瘤劑的抗體-藥物結合物具有優越性(圖12)。此外，經各抗體-藥物結合物處理的小鼠顯示無體重減輕或顯示可忽略的體重減輕，表明這些抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物、H10-O18-A-2-結合物)毒性低且安全。當媒劑組中至少一隻小鼠的腫瘤長徑超過20 mm時，對該組實施安樂死。
18)-2 抗腫瘤作用 - (5)
將DLL3陽性人類小細胞肺癌細胞株NCI-H209 (ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.)中，並將細胞懸浮液以4 x 10 6個細胞的劑量皮下接種至每隻雌性裸鼠的右脅區域。腫瘤建立後，將小鼠隨機分組(每組5隻)。在分組當天，將2種抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物、H10-O18-A-2-結合物)中的每一種以3 mg/kg 的劑量靜脈內投予至各小鼠尾部。結果顯示於圖13。橫坐標描繪投予後的天數，縱坐標描繪估計的腫瘤體積。誤差範圍描述為SE值。
兩種抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物、H10-O18-A-2-結合物)均減少了腫瘤體積，且在這些組別中，所有腫瘤在投予後28天時都比它們的初始體積小。此外，經各抗體-藥物結合物處理的小鼠並未顯示出有意義的體重減輕跡象，這表明2種抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物、H10-O18-A-2-結合物)皆為低毒性且安全的。 實施例 19-ICR 小鼠中抗體 - 藥物結合物之毒性或可耐受性劑量
19)-1 ICR小鼠的耐受劑量-(1)
將5週齡的Cr1：CD1 (ICR)雄性小鼠(Charles River Laboratories Japan, Inc.)隨機分組(每組5隻小鼠)。在分組當天，將2種抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物或H10-O18-A-2-結合物)中的每一種以45或90 mg/kg的劑量靜脈內投予至各小鼠尾部。每週多次觀察小鼠的死亡率，並在投予後41天測量體重。
在此實驗期間，以H2-C8-A-2-結合物處理的小鼠全部存活。在此實驗期間，以H2-C8-A-2-結合物處理的小鼠在任何測試劑量(45、90 mg/kg)下都顯示可忽略的體重減輕或沒有體重減輕。在此實驗期間，以H10-O18-A-2-結合物處理的小鼠全部存活。在此實驗期間，以H10-O18-A-2-結合物處理的小鼠在任何測試劑量(45、90 mg/kg)下都顯示可忽略的體重減輕或沒有體重減輕。
19)-2 ICR小鼠的耐受劑量-(2)
將5週齡的Cr1：CD1 (ICR)雌性小鼠(Charles River Laboratories Japan, Inc.)隨機分組(每組5隻小鼠)。在分組當天，將2種抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物或H10-O18-A-2-結合物)中的每一種以45或90 mg/kg的劑量靜脈內投予至各小鼠尾部。每週多次觀察小鼠的死亡率，並在投予後41天測量體重。
在此實驗期間，以H2-C8-A-2-結合物處理的小鼠全部存活。在此實驗期間，以H2-C8-A-2-結合物處理的小鼠在任何測試劑量(45、90 mg/kg)下都顯示可忽略的體重減輕或沒有體重減輕。在此實驗期間，以H10-O18-A-2-結合物處理的小鼠全部存活。在此實驗期間，以H10-O18-A-2-結合物處理的小鼠在任何測試劑量(45、90 mg/kg)下都顯示可忽略的體重減輕或沒有體重減輕。 [產業利用性]
本發明提供具有內化活性的抗DLL3抗體及包含該抗體的抗體-藥物結合物。抗體-藥物結合物可用作癌症等的治療藥物。實際上，前述實施例及揭示內容證實本技術的ADC組成物可用於治療患有DLL3相關癌症的受試者的方法(例如，小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、各種組織(包括腎臟、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內膜)、胃腸道(胃、結腸)、甲狀腺(甲狀腺髓質癌)、胰臟及肺臟)的神經內分泌腫瘤、神經膠質瘤或假性神經內分泌腫瘤(pNET))。
無
圖1(Fig. 1)顯示三種人類抗DLL3抗體-藥物結合物(H2−C8−A−結合物、H6−G23−F−結合物、H10−O18−A−結合物)或抗LPS抗體-結合物之活體內抗腫瘤作用。使用動物模型進行評估，其中將DLL3陽性人類小細胞肺癌細胞株NCI-H209接種至免疫缺陷小鼠中。橫坐標描繪接種後的天數，縱坐標描繪估計的腫瘤體積。誤差範圍描述標準誤差(SE)值。箭頭表示投予日期。
圖2(Fig. 2)顯示三種人類抗DLL3抗體-藥物結合物(H2−C8−A−結合物、H6−G23−F−結合物、H10−O18−A−結合物)或抗LPS抗體-結合物之活體內抗腫瘤作用。使用動物模型進行評估，其中將DLL3陽性人類小細胞肺癌細胞株NCI-H524接種至免疫缺陷小鼠中。橫坐標描繪接種後的天數，縱坐標描繪估計的腫瘤體積。誤差範圍描述標準誤差(SE)值。箭頭表示投予日期。
圖3(Fig. 3)顯示三種人類抗DLL3抗體-藥物結合物(H2−C8−A−結合物、H6−G23−F−結合物、H10−O18−A−結合物)或抗LPS抗體-結合物或抗DLL3抗體-結合物(SC16LD6.5)之活體內抗腫瘤作用。使用動物模型進行評估，其中將DLL3陽性人類小細胞肺癌細胞株NCI-H510A接種至免疫缺陷小鼠中。橫坐標描繪接種後的天數，縱坐標描繪估計的腫瘤體積。誤差範圍描述標準誤差(SE)值。箭頭表示投予日期。
圖4(Fig. 4)：圖4A顯示智人δ樣典型Notch配體3 (DLL3)同功型1的核苷酸序列和胺基酸序列，分別表示為SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：50。圖4B顯示智人δ樣典型Notch配體3 (DLL3)同功型2的核苷酸序列和胺基酸序列，分別表示為SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：51。
圖5(Fig. 5)：圖5A顯示抗體7-I1-B的V H域的核苷酸序列和胺基酸序列，分別表示為SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2。V HCDR1 (SEQ ID NO：3)以粗體字體顯示，V HCDR2 (SEQ ID NO：4)以底線顯示，且V HCDR3 (SEQ ID NO：5)以斜體、下底線字體指示。圖5B顯示抗體7-I1-B的V L域的核苷酸序列和胺基酸序列，分別表示為SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7。V LCDR1 (SEQ ID NO：8)以粗體字體顯示，V LCDR2 (SEQ ID NO：9)以底線顯示，且V LCDR3 (SEQ ID NO：10)以斜體、下底線字體指示。
圖6(Fig. 6)：圖6A顯示抗體2-C8-A的V H域的核苷酸序列和胺基酸序列，分別表示為SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12。V HCDR1 (SEQ ID NO：13)以粗體字體顯示，V HCDR2 (SEQ ID NO：14)以底線顯示，且V HCDR3 (SEQ ID NO：15)以斜體、下底線字體指示。圖6B顯示抗體2-C8-A的V L域的核苷酸序列和胺基酸序列，分別表示為SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17。V LCDR1 (SEQ ID NO：18)以粗體字體顯示，V LCDR2 (SEQ ID NO：19)以底線顯示，且V LCDR3 (SEQ ID NO：20)以斜體、下底線字體指示。
圖7(Fig. 7)：圖7A顯示抗體10-O18-A的V H域的核苷酸序列和胺基酸序列，分別表示為SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22。V HCDR1 (SEQ ID NO：23)以粗體字體顯示，V HCDR2 (SEQ ID NO：24)以底線顯示，且V HCDR3 (SEQ ID NO：25)以斜體、下底線字體指示。圖7B顯示抗體10-O18-A的V L域的核苷酸序列和胺基酸序列，分別表示為SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27。V LCDR1 (SEQ ID NO：28)以粗體字體顯示，V LCDR2 (SEQ ID NO：29)以底線顯示，且V LCDR3 (SEQ ID NO：30)以斜體、下底線字體指示。
圖8(Fig. 8)：圖8A顯示抗體6-G23-F的V H域的核苷酸序列和胺基酸序列，分別表示為SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32。V HCDR1 (SEQ ID NO：33)以粗體字體顯示，V HCDR2 (SEQ ID NO：34)以底線顯示，且V HCDR3 (SEQ ID NO：35)以斜體、下底線字體指示。圖8B顯示抗體6-G23-F的V L域的核苷酸序列和胺基酸序列，分別表示為SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37。V LCDR1 (SEQ ID NO：38)以粗體字體顯示，V LCDR2 (SEQ ID NO：39)以底線顯示，且V LCDR3 (SEQ ID NO：40)以斜體、下底線字體指示。
圖9 (Fig. 9)顯示Fab ZAP測定的結果，其為一種基於細胞毒性的內化測定，用於測定指定的抗體對DLL3的內化。參考DLL3單株抗體SC16用作陽性對照。參見WO2015127407。所有測試的抗DLL3抗體皆表現出與參考單株抗體相當的殺傷活性。在較高濃度的抗DLL3抗體下觀察到鉤狀效應(hook effect)，因為游離的抗DLL3與細胞結合的抗DLL3競爭Fab ZAP。
圖10(Fig. 10)：圖10A-10D顯示抗體7-I1-B (圖10A)、6-G23-F (圖10B)、10-O18-A (圖10C)和2-C8-A (圖10D)的結合曲線，經由Octet HTX在25℃下使用PBS 0.1% BSA 0.02% Tween 20 作為結合緩衝液及10 mM 甘胺酸 pH 1.7作為再生緩衝液來測量。將單株抗體(每種 5 µg/mL)加載至抗小鼠Fc感測器上，並將加載的感測器浸入在 200 nM 起始濃度下的重組人類DLL3蛋白(胺基酸Ala27-Ala479，Cat #9749-DL，R&D Systems)，以7次連續1:3稀釋。對於每個DLL3稀釋，顯示了實際測量值和曲線擬合。圖10E顯示本文所述的四種單株抗體(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A)的解離常數(K D)值，其使用圖10A-10D中所示之結合曲線計算，並應用單價(1:1)結合模型。
圖11(Fig. 11)顯示6-G23-F、10-O18-A和2-C8-A單株抗體(mAb)選擇性地結合DLL3，但不結合DLL1或DLL4。7-I1-B mAb結合DLL3和DLL4，但不結合DLL1。
圖12(Fig. 12)顯示二種人類抗DLL3抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物、H10-O18-A-2-結合物)、抗DLL3抗體結合物或抗DLL3抗體-藥物結合物(SC16LD6.5)的活體內抗腫瘤作用。使用動物模型進行評估，其中將DLL3陽性人類小細胞肺癌細胞株NCI-H510A接種至免疫缺陷小鼠中。橫坐標描繪投予後的天數，縱坐標描繪估計的腫瘤體積。誤差範圍描述標準誤差(SE)值。
圖13 (Fig. 13)顯示二種人類抗DLL3抗體-藥物結合物(H2-C8-A-2-結合物、H10-O18-A-2-結合物)的活體內抗腫瘤作用。使用動物模型進行評估，其中將DLL3陽性人類小細胞肺癌細胞株NCI-H209接種至免疫缺陷小鼠中。橫坐標描繪投予後的天數，縱坐標描繪估計的腫瘤體積。誤差範圍描述標準誤差(SE)值。
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無。

Claims (44)

  1. 一種抗體-藥物結合物，其包含與DLL-3特異性結合之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段經由連接子與藥物結合，其中該抗體或該抗體之功能性片段能結合至DLL3且包含重鏈免疫球蛋白可變域(V H)及輕鏈免疫球蛋白可變域(V L)，其中 (a)   該V H包含選自由以下所組成之群組的V H-CDR1序列、V H-CDR2序列及V H-CDR3序列： (i)    分別為SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5； (ii)   分別為SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15； (iii)  分別為SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25；及 (iv)  分別為SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35；及/或 (b)   該V L包含選自由以下所組成之群組的V L-CDR1序列、V L-CDR2序列及V L-CDR3序列： (i)    分別為SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10； (ii)   分別為SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20； (iii)  分別為SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30；及 (iv)  分別為SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40。
  2. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該抗體包含重鏈免疫球蛋白可變域(V H)及輕鏈免疫球蛋白可變域(V L)，其中(a)包含V H-CDR1序列、V H-CDR2序列及V H-CDR3序列之該V H與(b)包含V L-CDR1序列、V L-CDR2序列及V L-CDR3序列之該V L的組合選自由以下所組成之群組： (i)   分別為(a) SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5及(b) SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10； (ii)  分別為(a) SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15及(b) SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20； (iii) 分別為(a) SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25及(b) SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30；及 (iv)  分別為(a) SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35及(b) SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40。
  3. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該抗體包含重鏈免疫球蛋白可變域(V H)及輕鏈免疫球蛋白可變域(V L)，其中： (a)  該V H包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：32；及/或 (b)  該V L包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：37。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗DLL3抗體包含重鏈免疫球蛋白可變域(V H)及輕鏈免疫球蛋白可變域(V L)，其中：(a)該V H包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：32，且(b)該V L包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：37。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物結合物，其中該V H胺基酸序列及該V L胺基酸序列選自由以下所組成之群組： 分別為SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：7(7-I1-B)； 分別為SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：17(2-C8-A)； 分別為SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：27(10-O18-A)；及 分別為SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：37(6-G23-F)；或 其中抗DLL3抗體包含選自由以下所組成之群組的重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列： 分別為SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：62(H2-C8-A)； 分別為SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62(H2-C8-A-2)； 分別為SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62(H2-C8-A-3)； 分別為SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：70(H10-O18-A)； 分別為SEQ ID NO：68及SEQ ID NO：70(H10-O18-A-2)； 分別為SEQ ID NO：69及SEQ ID NO：70(H10-O18-A-3)； 分別為SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：66(H6-G23-F)； 分別為SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：66(H6-G23-F-2)；及 分別為SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：66 (H6-G23-F-3)。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體包含： (a)  輕鏈免疫球蛋白可變域序列，其與SEQ ID NOs：7、17、27或37中任一者之輕鏈免疫球蛋白可變域序列至少95%相同；或輕鏈序列，其與SEQ ID NOs：62、66或70中任一者之序列至少95%相同；及/或 (b)  重鏈免疫球蛋白可變域序列，其與存在於SEQ ID NOs：2、12、22或32中任一者之重鏈免疫球蛋白可變域序列至少95%相同；或重鏈序列，其與SEQ ID NOs：59、60、61、63、64、65、67、68或69中任一者之序列至少95%相同。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體-藥物結合物，其進一步包含選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD及IgE所組成之群組的同型的Fc域。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗DLL3包含SEQ ID NO：42、57或58之重鏈恆定區。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗原結合片段選自由Fab、F(ab’) 2、Fab’、scF v及F v所組成之群組。
  10. 如請求項1至8中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體或雙特異性抗體。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體包含： (a)  重鏈包含SEQ ID NOs：59至61中任一者之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NOs：62中任一者之胺基酸序列； (b)  重鏈包含SEQ ID NOs：63至65中任一者之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NOs：66中任一者之胺基酸序列；及/或 (c)  重鏈包含SEQ ID NOs：67至69中任一者之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NOs：70中任一者之胺基酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體包含： (a)  重鏈包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列； (b)  重鏈包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列；或 (c)  重鏈包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列。
  13. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中抗DLL-3抗體與如請求項1至12中任一項之抗體競爭結合DLL-3。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體與哺乳動物DLL3多肽中存在的表位結合。
  15. 如請求項14之抗體-藥物結合物，其中該表位是構形表位或非構形表位。
  16. 如請求項14或15之抗體-藥物結合物，其中該哺乳動物DLL3多肽具有包含SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51之胺基酸殘基27-492的胺基酸序列。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗體-藥物結合物，其中該重鏈或該輕鏈具有選自由以下所組成之群組的一個或二個或多個胺基酸殘基之修飾或集合：N-連接糖苷化、O-連接糖苷化、N-末端加工、C-末端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、對N-末端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、在重鏈(LALA)的位置234及235(EU編號)處將兩個白胺酸(L)殘基取代成丙胺酸(A)、重鏈位置356處的一組胺基酸殘基Glu(E)和位置358處的Met(M)(EU編號)、重鏈位置356處的Asp(D)和位置358處的白胺酸(L)(EU編號)或其任意組合、N-末端麩醯胺或N-末端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基末端刪除一個或兩個胺基酸。
  18. 如請求項17之抗體-藥物結合物，其中從其重鏈的羧基末端刪除一個或兩個胺基酸。
  19. 如請求項18之抗體-藥物結合物，其中從其兩條重鏈的每個羧基末端刪除一個胺基酸。
  20. 如請求項17至19中任一項之抗體-藥物結合物，其中其重鏈之羧基末端的脯胺酸殘基進一步被醯胺化。
  21. 如請求項1至20中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗體包含糖鏈修飾，其被調節以增強抗體依賴性細胞毒性活性。
  22. 如請求項1至21中任一項之抗體-藥物結合物，其中該藥物為由下式表示之抗腫瘤化合物： [式1]
    Figure 03_image137
    。
  23. 如請求項1至22中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體經由連接子與該藥物結合，該連接子具有選自由下式(a)至(f)所組成之群組的任何結構： (a)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， (b)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， (c)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， (d)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， (e)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 (f)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， 其中該抗體連接至-(琥珀醯亞胺-3-基-N)之末端，該抗腫瘤化合物連接至(a)、(b)、(e)或(f)之-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-部分、(c)之CH 2-O-CH 2-C(=O)-部分或(d)之CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)-部分的羰基，以位置1處的胺基之氮原子作為連接位置，GGFG(SEQ ID NO：84)表示由通過肽鍵連接之甘胺酸-甘胺酸-苯基丙胺酸-甘胺酸(SEQ ID NO： 85)所組成之胺基酸序列，且 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-具有下式表示之結構： [式2]
    Figure 03_image139
    其在其位置3處與抗體連接，並在位置1處的氮原子上與含有此結構的連接子結構中的亞甲基連接。
  24. 如請求項1至23中任一項之抗體-藥物結合物，其中該連接子由選自由下式(c)、(d)及(e)所組成之群組中的任何式表示： (c)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)， (d)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 (e)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
  25. 如請求項1至24中任一項之抗體-藥物結合物，其中該連接子由下式(c)或(e)表示： (c)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2-O-CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)，及 (e)  -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH 2CH 2-C(=O)-NH-CH 2CH 2O-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-C(=O)-GGFG-NH-CH 2CH 2CH 2-C(=O)- (「GGFG」揭示為SEQ ID NO：85)。
  26. 如請求項1至25中任一項之抗體-藥物結合物，其具有下式表示之結構： [式3]
    Figure 03_image141
    其中AB表示抗體，n表示每抗體中與該抗體結合之藥物-連接子結構的平均單元數，且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連接至該連接子。
  27. 如請求項1至25中任一項之抗體-藥物結合物，其具有下式表示之結構： [式4]
    Figure 03_image143
    其中AB表示抗體，n表示每抗體中與該抗體結合之藥物-連接子結構的平均單元數，且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連接至該連接子。
  28. 如請求項1至27中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體為包含含有SEQ ID NO：17之可變域序列的輕鏈及含有SEQ ID NO：12之可變域序列的重鏈的抗體。
  29. 如請求項1至27中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體為包含含有SEQ ID NO：27之可變域序列的輕鏈及含有SEQ ID NO：22之可變域序列的重鏈的抗體。
  30. 如請求項1至27中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體為包含含有SEQ ID NO：37之可變域序列的輕鏈及含有SEQ ID NO：32之可變域序列的重鏈的抗體。
  31. 如請求項1至27中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體為包含含有SEQ ID NO：7之可變域序列的輕鏈及含有SEQ ID NO：2之可變域序列的重鏈的抗體。
  32. 如請求項1至31中任一項之抗體-藥物結合物，其中每抗體中結合的選擇的藥物-連接子結構的平均單元數在1至10個之範圍內。
  33. 如請求項1至32中任一項之抗體-藥物結合物，其中每抗體中結合的選擇的藥物-連接子結構的平均單元數在2至8個之範圍內。
  34. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中每抗體中結合的選擇的藥物-連接子結構的平均單元數在5至8個之範圍內。
  35. 如請求項1至34中任一項之抗體-藥物結合物，其中每抗體中結合的選擇的藥物-連接子結構的平均單元數在7至8個之範圍內。
  36. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至35中任一項之抗體-藥物結合物、其鹽、或該結合物或該鹽的水合物。
  37. 如請求項36之醫藥組成物，其為抗腫瘤藥物。
  38. 如請求項36或37之醫藥組成物，其用於治療腫瘤，其中該腫瘤為表現DLL3之腫瘤。
  39. 如請求項38之醫藥組成物，其中該腫瘤為小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、各種組織的神經內分泌腫瘤、神經膠質瘤或假性神經內分泌腫瘤(pNET)，該組織包括腎臟、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內膜)、胃腸道(胃、結腸)、甲狀腺(甲狀腺髓質癌)、胰臟及肺臟。
  40. 一種治療腫瘤之方法，其包含對具有腫瘤之個體投予如請求項1至35中任一項之抗體-藥物結合物、其鹽、以及該結合物或該鹽的水合物。
  41. 一種治療腫瘤之方法，其包含對具有腫瘤之個體同時地、分開地或連續地投予醫藥組成物及至少一種抗腫瘤藥物，該醫藥組成物包含如請求項1至35中任一項之抗體-藥物結合物、其鹽、以及該結合物或該鹽的水合物。
  42. 如請求項40或41之治療方法，其中該腫瘤為表現DLL3之腫瘤。
  43. 如請求項40至42中任一項之治療方法，其中該腫瘤為小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、各種組織的神經內分泌腫瘤、神經膠質瘤或假性神經內分泌腫瘤(pNET)，該組織包括腎臟、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內膜)、胃腸道(胃、結腸)、甲狀腺(甲狀腺髓質癌)、胰臟及肺臟。
  44. 一種生產抗DLL3抗體-藥物結合物之方法，其包含使抗DLL3抗體或該抗體之功能性片段與藥物-連接子中間體化合物反應的步驟，其中該抗體或該抗體之功能性片段能結合至DLL3且包含重鏈免疫球蛋白可變域(V H)及輕鏈免疫球蛋白可變域(V L)，其中 (a)   該V H包含選自由以下所組成之群組的V H-CDR1序列、V H-CDR2序列及V H-CDR3序列： (i)   分別為SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5； (ii)  分別為SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15； (iii) 分別為SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25；及 (iv)  分別為SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35；及/或 (b)   該V L包含選自由以下所組成之群組的V L-CDR1序列、V L-CDR2序列及V L-CDR3序列 (i)   分別為SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、及SEQ ID NO：10； (ii)  分別為SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20； (iii) 分別為SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30；及 (iv)  分別為SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40。
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