DE68928427T2

DE68928427T2 - Antikörper mit modifiziertem Kohlenhydratgehalt und Verfahren zur Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE68928427T2
Application number: DE68928427T
Authority: DE
Inventors: Paul R Hinton; Sherie L Morrison; Vernon T Oi
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1988-09-15
Filing date: 1989-09-05
Publication date: 1998-06-04
Anticipated expiration: 2009-09-06
Also published as: EP0359096A1; JPH02231097A; US6218149B1; US20020028486A1; ATE159982T1; EP0359096B1; DE68928427D1

Description

Die hierin beschriebene Erfindung wurde teilweise im Lauf der Arbeit unter den Fördernummern AI 19042, CA 16858, CA 22736 und CA 13696 des National Institute for Health, U.S. Department of Health and Human Services, gemacht. Die US-Regierung hat gewisse Rechte an dieser Erfindung.

Hintergrund der Erfindung

Überall in dieser Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen durch arabische Zahlen verwiesen. Vollständige Zitate für diese Verweisungen sind am Ende der Beschreibung direkt vor den Ansprüchen zu finden. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen in ihrer Gesamtheit werden hiermit durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, den diese Erfindung betrifft, vollständiger zu beschreiben.
Die immunochemische Charakterisierung von Antikörpern gegen alpha (1T6)-Dextran ergab Einblicke in die Größe und Form der Antikörper- Bindungsstelle und das Wesen der Wechselwirkung zwischen Antikörpern und Antigen. In dieser Hinsicht wäre es nützlich, die immunochemischen Eigenschaften der anti-Dextran-Antikörper mit ihrer Primärstruktur zu korrelieren. Im Laufe diese Studien wurden cDNAs aus drei monoklonalen Anti-alpha (1T6)-Dextran-Hybridomzellllnien, 14.6b.1, 5.54.4.24.1 und 19.22.1 kloniert (1) und die Nucleotidsequenzen der variablen Bereiche der schweren Kette (Vfl) und der leichten Kette (V&sub1;) bestimmt (2) (siehe Tabelle 1 auf Seite 22 dieser Anmeldung). Alle synthetisieren eine identische leichte Kappa-Kette, wobei das Vkappa-OX1- Keimbahngen (3) auf das Jkappa2-Segment umgelagert ist, und die schweren Ketten unterscheiden sich nur durch eine oder zwei Aminosäuren in ihren Komplementarität bestimmenden Bereichen (complementarity-deterrnining regions, CDRs). Im Vergleich zu 14.6b.1 haben 5.54.4.24.1 und 19.22.1 eine identische Aminosäure-Veränderung Thr T Asn an Position 60 im variablen Bereich der schweren Kette (VH); 5.54.4.24.1 hat einen zusätzlichen Austausch (Ser T Gly) an Position 31 in dem Komplementarität bestimmenden Bereich 1 (CDR1). Die Veränderungen in der Sequenz der schweren Kette führen dazu, daß 5.54.4.24.1 und 19.22.1 im Vergleich zu 14.6b.1 eine Verringerung ihrer Bindungskonstante sowohl für polymeres Dextran als auch für Isomaltoheptaose (IM7) um das zehnfache oder mehr aufweisen (Tabelle I).
Der Austausch Thr T Asn in 5.54.4.24 und 19.22.1 führt zum Verlust einer potentiellen N-verknüpften Glykosylierungsstelle (Asn 58 - Tyr 59 - Thr 60), die in 14.6b.1 vorhanden ist. Einer der Zwecke dieser Studie und der vorliegenden Erfindung war, zu bestimmen, ob diese potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstelle glykosyliert wird, und falls, ob die Hinzufügung von Kohlehydrat zu dem Komplementarität bestimmenden Bereich 2 (CDR2) die Bindungskonstante für Dextran beeinträchtigt. Es ist schwierig, die Glykosylierung von VH direkt zu zeigen, da sowohl der Immunglobulin A (IgA)-Isotyp als auch der Immunglobulin M (IgM)-Isotyp innerhalb der CH1-Domäne glykosyliert wird, und in Fd vorhandenes Kohlehydrat entweder an VH oder den konstanten Bereich der schweren Kette (CH) gebunden sein könnte. Fd ist das Produkt, das sich bei der chemischen oder enzymatischen Spaltung des Antikörpers ergibt, und enthält die schwere Kette des variablen Bereichs und die schwere Kette des konstanten Bereichs des Antikörpers. Daher wurden die drei VM-Bereiche auf den konstanten Bereich von menschlichem IgG&sub4;, das in seiner CH1-Domäne frei von Kohlehydrat ist, übertragen. Bei dieser Erfmdung wird gezeigt, daß Kohlehydrat innerhalb des VH von 14.6b.1 vorhanden ist. Der Vergleich der Assoziationskonstanten für aglykosylierte, mit Tunicamycin behandelte und unbehandelte Antikörper zeigt, daß die Anwesenheit von Kohlehydrat die scheinbare (manifeste) Assoziationskonstante (apparent association constant, aKa) von 14.6b.1 für Dextran erhöht. Die Auswirkung auf die Bindung ist singulär für das in VH vorhandene Kohlehydrat, da das Fehlen von Kohlehydrat aus CH2 die aKa für Dextran nicht verändert.
Durch Einführen einer Kohlehydrat-Erkennungsstelle für die Anfügung eines Kohlehydrats in einen Antikörper kann die Reinigung des Antikörpers gefördert werden, weil das Kohlehydrat an der Außenseite des Antikörpers angefügt ist und daher der Bindung durch Lectin (Reinigung) leichter zugänglich ist.
In dieser Erfindung kann der Kohlehydrat-Gehalt eines Antikörpers verändert werden durch Hinzufügen oder Entfernen von Kohlehydrat- Erkennungsstellen in dem konstanten Bereich des Antikörpers. Dadurch werden Effektor-Funktionen des Antikörpers verändert. Kohlehydrat- Erkennungsstellen in dem konstanten Bereich können auch als Stellen für eine Markierung, z.B. Radionuklide wie ¹²&sup5;I, dienen.
WO 88/07089, das als ein Dokument des Stands der Technik gemäß Art. 54(3) und (4) EPÜ betrachtet werden muß, offenbart einen Antikörper mit geänderter Effektor-Funktion, z.B. geänderter Affinität für einen Effektor-Liganden wie einen Fc-Rezeptor (FcR) an einer Zelle oder den Cl-Bestandteil des Komplements, der hergestellt wird durch Ersetzen mindestens eines Aminosäure-Rests in dem konstanten Bereich des Antikörpers gegen einen anderen Rest.
25 Akolkar et al., J. Immunol. Vol. 138, p. 4472-4479, June 1987 beschreiben einen nicht natürlich vorkommenden monoklonalen Mäuse- Antikörper, der in dem CDR2-Teil seines variablen Bereichs der schweren Kette die Glykosylierung-Stelle Asn-Tyr-Thr besitzt, die eine bekannte Kohlehydrat-Erkennungsstelle ist.
Morrison et al., Clin. Chem., Vol 34/9, p. 1668-1675 offenbaren die Herstellung und Charakterisierung von gentechnologisch veränderten Antikörper-Molekülen, bei denen eine CH2-Domäne, in der das Kohlehydrat-Anfügungssignal entfernt wurde, enthaltende Fragmente in Myelom- und Hybridom-Zellen Moniert wurden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung schafft ein Verfahren zur Modifizierung des Kohlehydratgehalts eines Antikörpers, welches ein Anfügen einer Kohlehydrat-Erkennungsstelle an einen konstanten Bereich des Antikörpers aufweist, wobei die Kohlehydrat-Erkennungsstelle in einem derartigen Bereich eines solchen Antikörpers nicht in der Natur vorkommt.
Außerdem schafft diese Erfindung einen menschlichen Antikörper, der nicht in der Natur vorkommt und der gekennzeichnet ist durch die Anwesenheit einer Kohlehydrat-Erkennungsstelle in einem konstanten Bereich des Antikörpers, der in der Natur nicht eine solche Kohlehydrat- Erkennungsstelle in einem derartigen konstanten Bereich enthält.
Schließlich schafft diese Erfindung therapeutische Mittel, die abgeleitet sind von und DNA-kodierend für die Antikörper der Erfindung sind, sowie empfindliche Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von Substanzen in einer Probe, Verfahren zur Rückgewinnung einer Substanz aus einer die Substanz enthaltenden Probe und zur Reinigung einer solchen Substanz, und Ausrüstungen für diagnostische Tests.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1. Substituieren der genomischen VH-Region mit V H-cDNA und Isotypen-Austausch. Ein genomisches EcoRI-Fragment, das den MPC11 H-Ketten-Promotor, eine Leader-Sequenz, eine umgeordnete V-Region und einen Ig-Enhancer (22) enthielt, wurde in die EcoRI-Stelle eines bBR322-Abkömmlings mit Deletion von Nucleotid 2065 bis 29 ein- Moniert. Unter Verwendung von cDNA, die von den Anti-alpha (1T6)- Dextran-Hybridomen (2) hergestellt worden war, wurde die V-Region von MPC11 durch die Anti-Dextran V-Region ersetzt durch Inserieren des PvuII-PstI cDNA-Fragments in durch PvuII-PstI gespaltenes MPC 11. Die ersten vier VH-Aminosäuren stammen aus MPC11, sind aber identisch mit denjenigen, die man in den drei cDNAs (22) findet. Das die VH von Dextran enthaltende EcoRI-Fragment wurde an einen konstanten Bereich innerhalb des pSV2-gpt-Expressionsvektors (23, 4) eines menschlichen IgG&sub4; gebunden. Die codierenden Sequenzen der MPC11- und cDNA-Gene sind als durchgehende bzw. schraffierte Linien gezeigt. Die gepunkteten Kästchen stellen die codierenden Sequenzen des konstanten Bereichs von menschlichem IgG&sub4; dar. Die Karten sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet.
Fig. 2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse von nach Papain-Verdau von mit A) [³&sup5;S]-Met oder B) [¹&sup4;C]- Glukosamin markiertem sezerniertem oder abgesondertem Ig erhaltenen Immunpräzipitaten. Absonderungen von Zellen, die in Anwesenheit von 15 µ Ci/ml [³&sup5;S]-Met oder 100 µ Ci/ml [¹&sup4;C]-D-Glukosamin-Hydrochlorid (24) markiert worden waren, wurden vier Stunden lang bei 37ºC mit Papain (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei einem Verhältnis von Enzym:Protein von 1:100 verdaut. Die Reaktion wurde durch Hinzufügung von 0,03 M Iodacetamid beendet. Die Fc-Fraktion und unverdautes Antikörper-Protein wurden durch Inkubieren mit IgG Sorb (Enzyme Center, Malden, MA) abgeschieden. Das Antigen bindende Fragment (Fab) wurde unter Verwendung von Kaninchen-anti-Mensch- Fab oder durch unlöslich gemachtes Dextran (Sephadex G75) aus dem Überstand abgeschieden. Die Proben wurden mit beta-Mercaptoethanol (0,15 M) reduziert und unter Verwendung von 5% SDS-PAGE (16) analysiert. Die von den Transfektions-Zelllüiien erzeugten schweren Ketten sind wie folgt: THV8, VH 19.22.1; TJC8 .5, VH 5.54.4.24.1; TKC3.2, VH 14.6b. 1; alle Transfektanten synthetisieren die alpha (1T6)- Dextran-spezifische leichte Kette. Mit [³&sup5;S]-Met markierte und reduzierte Igs wurden als Marker verwendet. In Figur 2A wurden die TKC3.2 (Fab)- und die TKC3.2-Probe auf getrennten SDS-PAGE-Gelen analysiert.
Fig. 3. 12.5% Tris-Glycin SDS-PAGE-Analyse von [³&sup5;S]-Met-markierten Transfektomkultur-Überständen, die nach Concanavalin A (Con A)- Adsorption (wie angegeben) und/oder Tunicamycin-Behandlung mit Kaninchenantiserum gegen das Fragment des konstanten Bereichs (Fe) von menschlichem Ig der Immunpräzipitation unterzogen wurden. Tunicamycin mit einer Konzentration von 8 µg/ml (Boehringer Mannheim, Westdeutschland) wurde zur Hemmung von N-verknüpfter Glykosyherung verwendet. Die Zellen wurden drei Stunden lang mit [³&sup5;S]-Met in Anwesenheit von Tunicamycin biosynthetisch markiert, das sezernierte Ig in dem Kulturüberstand verworfen, die Zellen mit Ipco Modified Dulbecco's Medium (IMDM)-Medium zweimal gewaschen; frisches Tunicamycin und [³&sup5;S]-Met wurden hinzugefügt; und die Behandlung ging über Nacht bei 37ºC weiter. Vor der SDS-PAGE wurden die Proben mit 0,15 M beta-Mercaptoethanol reduziert. Die Positionen der H- und L-Kette sind angegeben.
3A. Con A-Sepharose-Adsorption von sezerniertem Transfektom-Ig. Spuren 1 und 6, unbehandeltes TKC3.2 (VH 14.6b.1) bzw. sezerniertes Immunglobolin THV8.3 (VH 19.22.1). Spuren 2 und 4, ungebundenes TKC3.2, und gebundenes und aus Con A Sepharose eluiertes TK3.2, Spuren 3 und 5, ungebundenes THV8.2, und gebundenes und aus Con A Sepharose eluiertes THV8.2.
3B. Tunicamycin-behandelte Zellüberstände ohne oder mit Con A - Sepharose-Adsorption. Spuren 1 und 2, TKC3.2 (VH 14.6b.1) vor und nach Tunicamycin-Behandlung; Spuren 3 und 4, THV8.3 (VH 19.22.1) vor und nach Tunicamycin-Behandlung; Spuren 5 und 6, Tunicamycinbehandelter TKC3.2 Con A-Überstand bzw. -Eluat; Spuren 7 und 8, Tunicamycin-behandelter THV8.3 Con A-Überstand bzw. -Eluat.
Fig. 4. Hemmung der Antikörper-Bindung an mit Dextran beschichtete ELISA-Platten durch lösliches Dextran. Der Prozentsatz der Antikörper- Bindung (Ordinate) ist gegen die Dextran-Hemmstoff-Konzentration (Abszisse) aufgetragen. Die Platten wurden mit 20 µg/ml Dextran beschichtet. Unveränderte Antikörper und durch Tunicamycin-Behandlung aglykosylierte (glucosefrei gemachte) Antikörper wurden verwendet; Spurenmengen an glykosyliertem Ig, die in Tunicamycin-behandeltem TKC3.2 anwesend waren, wurden durch Adsorption an Con A Sepharose entfernt.
Scheinbare Assoziationskonstanten wurden unter Verwendung des Verfahrens von Nieto et. al. (25) bestimmt. In Kürze, die Assoziationskonstante für einen Antikörper ist definiert als die reziproke freie Ligandenkonzentration, die zum Besetzen der Hälfte der Antikörper-Bindungsstellen notwendig ist. Wenn eine festgesetzte Menge an Antikörper Ab auf einer mit Festphasen-Antigen beschichteten Platte mit zunehmenden Mengen an freiem Ligand zur Reaktion gebracht wird, ist das Reziproke der freien Ligandenkonzentration, die 50% Hemmung der Bindung an die Platte verursacht, eine Funktion der intrinsischen Ka, d.h. der scheinbaren Affinitätskonstante (aKa). Die Berechnung der Konstante wird durchgeführt durch Interpolieren der Hemmungskurve unter der Annahme von Linearität nahe dem Punkt mit 50% Bindung. Die folgenden experimentellen Bedingungen wurden zur Messung der aka-Werte verwendet. Corning Mikrotiterplatten wurden mit 0,5 µg/ml oder 20 µg/ml Dextran B512 (Versuchbedingungen bei hoher Affinität bzw. geringer Affinität) beschichtet. Gebundenes Immunglobulin Ig wurde unter Verwendung von mit Meerrettich-Peroxidase markiertem Anti- Mensch-IgG quantitativ bestimmt.
Fig. 5. Allgemeines Schema für zwei gezielte Primer-Mutagenesen. Das Sal I-Bam HI-Fragment, das das Exon des konstanten Bereichs von IgG enthält, wird an der Polylinker-Stelle in den M13-Phagen M13mp19 einkloniert. Die Plus-Strang DNA-Matrize des rekombinaten Phagen wird durch das Standard-Polyethylenglykol-Verfahren hergestellt. Zur Erzeugung der Mutation werden zwei Primer verwendet, wobei einer der M13 Sequenzierungsprimer ist, der andere ein am 5'-Ende phosphorylierter mutagener Primer mit einer Nucleotid-Fehlpaarung in der Konsensus-Glykosylierungs-Sequenz. Beide Primer werden gleichzeitig mit der Matrize gepaart. Nach Primer-Extension und -Ligation wird der Mutanten/Wildtyp-Lücken-Heteroduplex zur Transformation von E. coli- Wirt JM109 verwendet.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung schafft ein Verfahren zum Modifizieren des Kohlehydratgehalts eines Antikörpers, wobei das Verfahren ein Anfügen einer Kohlehydraterkennungsstelle oder von Kohlehydraterkennungsstellen an einen konstanten Bereich des Antikörpers aufweist, wobei die Kohlehydraterkennungsstelle(n) in einem solchen konstanten Bereich eines solchen Antikörpers nicht natürlich vorkommt (vorkommen). Dieses Verfahren schafft auch einen so hergestellten modifizierten Antikörper. Es gibt zahlreiche Verfahren zur Einführung der Kohlehydrater kennungsstelle in den Antikörper, und diese sind Fachleuten auf dem Gebiet dieser Erfindung gut bekannt. Die Anfügung der Kohlehydraterkennungsstelle an den Antikörper kann bewirkt werden durch zielgerichtete Mutagenese von DNA, die einen derartigen konstanten Bereich des Antikörpers kodiert.
Der Begriff "Antikörper", wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, umfaßt alle Arten von Antikörpern einschließlich sowohl menschlicher, nicht-menschlicher Antikörper, als auch chimärer Antikörper, sowohl monoklonaler als auch polykionaler Antikörper, und alle Antikörper-Isotypen einschließlich der Hauptklassen humoraler Immunglobuline beim Menschen, IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Bei einer Ausführungsform dieser Erfmdung ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper; bei einer anderen ist der Antikörper ein menschlicher Antikörper.
Diese Erfmdung betrifft auch einen menschlichen Antikörper, z.B. einen menschlichen monoklonalen Antikörper, der in der Natur nicht vorkommt und der gekennzeichnet ist durch die Anwesenheit einer Kohlehydraterkennungsstelle in einer konstanten Region des Antikörpers, der in der Natur keine derartige Kohlehydraterkennungsstelle in einer derartigen konstanten Region enthält. Die Erfindung stellt außerdem DNA, die einen derartigen Antikörper kodiert, zur Verfügung.
Die Kohlehydraterkennungsstelle, wie hierin verwendet, umfaßt irgendeine spezifische Aminosäuresequenz in einem Antikörper, an der ein Kohlehydrat spezifisch an den Antikörper binden wird. Die zur Zeit am besten bekannte derartige Kohlehydraterkennungsstelle, die gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, ist die Aminosäuresequenz:
Asn - X - Thr/Ser
in der X irgendeine Aminosäure sein kann und Thr/Ser ein Threonin oder ein Serin bedeutet. Eine solche Stelle oder Stellen kann (können) in die konstante Region des Antikörpers eingeführt werden unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet, auf das sich diese Erfindung bezieht, gut bekannt sind. Siehe beispielsweise "In Vitro Mutagenese", Recombinant DNA: A Short Course, J.D. Watson et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116. Eine insbesondere brauchbare Forrn der in vitro Mutagenese, Fachleuten ebenfalls gut bekannt, ist die zielgerichtete Mutagenese, die beschrieben ist in Recombinant DNA: A Short Course, und die in dem Abschnitt mit experimentellen Einzelheiten, welcher folgt, beispielhaft dargelegt ist.
So kann die Kohlehydraterkennungsstelle in den Antikörper eingeführt werden durch Modifizieren oder Mutieren einer Aminosäuresequenz dergestalt, daß die gewünschte Asn -- X -- Thr/Ser-Sequenz erhalten wird. Wenn die Sequenz ein Asparagin oder ein Threonin oder Serin besitzt, dann an der nächsten Position zwei Aminosäuren fehlen, können ein korrespondierendes Threonin oder Serin; bzw. ein Asparagin eingeführt werden, um die gewünschte Asn -- X -- Thr/Ser-Sequenz zu erhalten, so daß der Antikörper dann Kohlehydrat an den Antikörper binden wird.
Diese Erfindung betrifft auch einen Antikörper, der erfindungsgemaß mit einem nachweisbaren Marker markiert ist. Beispielsweise kann der Antikörper einen nachweisbaren Marker besitzen, der an eine oder mehrere der Aminosäuren oder Kohlehydrate, die seine Struktur ausmachen, angefügt oder in sie inkorporiert ist. Ein solcher Marker kann irgendein Molekül oder Reagenz sein, das nachgewiesen werden kann, wie ein Chromophor, ein Fluorophor oder eine radioaktive Einheit, z.B. ¹²&sup5;I. Zusätzlich kann der nachweisbare Marker ein Enzym sein, das eine Reaktion, welche ein nachweisbares Produkt erzeugt, katalysiert, ein Chemilumineszenz-Katalysator, Biotin, oder ein durch kernmagnetische Resonanz nachweisbares Metallion sein. Zu anderen geeigneten nachweisbaren Markern gehören Liganden, die in der Lage sind, an spezielle Proteine, die mit einem Enzym, z.B. Meerrettich-Peroxidase, markiert wurden, zu binden. Ein Beispiel für einen geeigneten Liganden ist Biotin, das an Avidin oder Streptavidin binden wird. Ein anderer geeigneter Ligand ist ein Hämin-Molekül, das an den Apoenzym-Bereich von Katalase binden wird. Fachleute werden gut vertraut sein mit Verfahren zum Anfügen oder Einführen derartiger nachweisbarer Marker bei Antikörpern und zum Verwenden von Antikörpern, die so markiert sind.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt diese Erfindung einen festen Träger zur Verfügung, an den ein Antikörper gemaß der Erfindung gebunden ist. Der feste Träger kann in der Form einer Säule für chromatographische Trennungen sein oder kann ein Bett oder eine Platte oder dergleichen für diagnostische Anwendung sein. Der feste Träger kann beispielsweise Silikat-, Zellulose-, Kunststoff-Material, Glas mit geregelten Poren, Sepharose, Bromcyan- oder DBM-aktiviertes Papier oder Nitrozellulose umfassen.
Die vorliegende Erfindung schafft außerdem ein Verfahren zur Modifizierung der biologischen Effektorfunktion eines Antikörpers, wobei das Verfahren das Modifizieren des Kohlehydratgehalts des Antikörpers unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, bei dem der Kohlehydratgehalt des Antikörpers durch Anfügen einer Kohlehydraterkennungsstelle oder von Kohlehydraterkennungsstellen an einen konstanten Bereich des Antikörpers modifiziert wird, umfaßt. Biologische Effektortünktionen von Antikörpern, die auf diese Weise modifiziert werden können, umfassen solche Funktionen wie die Fähigkeit, Fc- Rezeptoren zu binden, und die Fähigkeit zur Komplementaktivierung.
Wo erfindungsgemaß eine Kohlehydraterkennungsstelle in einen speziellen Bereich des Antikörpers, z.B. eine konstante Region, eingeführt werden soll, wird die geänderte oder gentechnologisch veränderte DNA verwendet, um ein vollständiges Antikörpergen aufzubauen. Das Gen, d.h. die DNA-Sequenz, wiederum wird in einen Expressionsvektor eingeführt und nachfolgend in einer geeigneten Zellumgebung exprimiert. Für Kohlehydrat enthaltende Antikörpermoleküle ist eine eukaryotische Zelle bevorzugt. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung werden ohne weiteres die gut bekannten Techniken bewußt sein, mittels derer solche DNA-Sequenzen oder Gene aufgebaut werden, die Art der Einführung in Expressionsvektoren, die Arten von Vektoren, die von Nutzen sind, und die Bedingungen und Art und Weise der Expression in einer geeigneten Zellumgebung.
Der menschliche Antikörper, z.B. menschliche monoklonale Antikörper, kann ein Kohlehydrat an eine derartige Kohlehydraterkennungsstelle angefügt besitzen, und kann bei einer Ausführungsform dieser Erfindung als ein therapeutisches Mittel verwendet werden, wenn ein therapeutischer Ligand wie ein Arzneimittel gegen Krebs wie eine Rizin-A-Kette, Radionuklide, z.B. ¹²&sup5;I oder ein anderes therapeutisches Mittel an ein derartiges Kohlehydrat, das an einen derartigen Antikörper angefügt ist, gebunden ist. Derartige therapeutische Mittel können beispielsweise zur Behandlung von Anomalien des Immunsystems oder anderen Krankheitszuständen verwendet werden. In noch weiteren Ausführungsformen ist dieser menschliche Antikörper gekennzeichnet oder markiert, d.h. eine Kennzeichnung wie ein nachweisbarer Marker ist an ein derartiges Kohlehydrat, das an den Antikörper angefügt ist, gebunden.
Diese Erfmdung schafft auch ein empfindlicheres Verfahren zur Ermittlung der Anwesenheit einer Substanz oder einer zu analysierenden Substanz in einer Probe wie einer Probe einer menschlichen biologischen Flüssigkeit, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen der Probe mit einem gegen die Substanz gerichteten Antikörper umfaßt. Der Antikörper kann mit einem nachweisbaren Marker, z.B. einem Chromophor, einem Fluorophor oder einer radioaktiven Einheit, gekennzeichnet sein. Ein derartiger Antikörper, wie er hierin vorstehend beschrieben ist, ist einer, der nicht in der Natur vorkommt und der eine gentechnob gisch in eine konstante Region des Antikörpers hineinmanipulierte Kohlehydraterkennungsstelle aufweist, wobei er in einer derartigen konstanten Region natürlicherweise keine Kohlehydraterkennungsstelle enthält. Bei diesem Verfahren wird das in Kontakt bringen unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß irgendeine Substanz oder zu analysierende Substanz (Analyt), die in der Probe vorhanden ist, mit dem Antikörper einen nachweisbaren Komplex ausbildet, und dann wird die Anwesenheit eines solchen Komplexes und daher die Anwesenheit der Substanz ermittelt oder nachgewiesen. Bei einer Ausführungsform wird der so eingesetzte Antikörper an einen festen Träger des hierin vorstehend beschriebenen Typs gebunden.
Die Menge oder Konzentration der Substanz oder des Analyten in der Probe kann auch näher bestimmt werden durch Bestimmung der Menge des gebildeten Komplexes und daher der Menge oder Konzentration der Substanz oder des Analyten, beispielsweise durch Vergleich mit einer bekannten Menge der Substanz oder des Analyten. Die quantitative Bestimmung der Menge oder des durch die Substanz gebildeten Komplexes und des gegen die Substanz gerichteten Antikörpers in einer Probe kann durchgeführt werden unter Verwendung von Verfahren, die von der Identität der nachweisbaren Einheit abhängen, die aber dennoch in der Technik gut bekannt sind. So kann, wenn die nachweisbare Einheit radioaktiv ist, ein Flüssigkeits-Szintillationszähler verwendet werden. Wenn die Einheit ein Enzym ist, wie Meerrettich-Peroxidase bei einer Standardanalyse, kann ein Spektrophotometer verwendet werden. Wenn die Einheit fluoreszierend ist, kann ein Fluorometer verwendet werden. Ein besonders brauchbarer Weg beinhaltet das Sortieren fluoreszierender aktivierter Zellen, mittels dessen das Verfahren günstig, schnell und genau ausgeführt werden kann.
Darüber hinaus schafft diese Erfindung noch ein Verfahren zur Rückgewinnung einer Substanz aus einer die Substanz enthaltenden Probe, welches das in Kontakt bringen der Probe mit gegen die Substanz gerichtetem Antikörper aufweist. Der Antikörper wurde hierin vorstehend beschrieben als einer, der in der Natur nicht vorkommt und der eine in eine konstante Region des Antikörpers gentechnologisch hineinmanipulierte Kohlehydraterkennungsstelle besitzt, wobei der Antikörper in einer derartigen konstanten Region natürlicherweise keine Kohlehydraterkennungsstelle besitzt. Das in Kontakt bringen wird unter geeigneten Bedingungen dergestalt ausgeführt, daß die Substanz in der Probe einen Komplex mit dem Antikörper ausbildet. Die Substanz wird dann aus dem sich ergebenden Komplex zurückgewonnen. Gemaß einem weiteren Aspekt ist ein solches Verfahren ein chromatographisches Verfahren, bei dem der Antikörper an einen festen Träger, der in eine Säule gepackt ist, gebunden wird.
Diese Erfindung betrachtet auch ein Reinigungsverfahren für eine Substanz, welches ein Rückgewinnen der Substanz aus einer die Substanz enthaltenden Probe unter Verwendung des vorstehend eben beschriebenen Verfahrens umfaßt unter derartigen Bedingungen, daß die Substanz in gereinigter Forrn rückgewonnen wird.
Diese Erfindung betrifft außerdem noch eine diagnostische Ausrüstung, die den vorstehend beschriebenen Antikörper enthält, der nicht in der Natur vorkommt und der eine gentechnologisch in einen konstanten Bereich des Antikörpers hineinmanipulierte Kohlehydraterkennungsstelle aufweist, wobei der Antikörper in einem derartigen konstanten Bereich natürlicherweise keine Kohlehydraterkennungsstelle enthält. Außerdem schafft diese Erfindung eine diagnostische Ausrüstung, die einen solchen Antikörper aufweist, der mit einem nachweisbaren Marker wie einem Chromophor, Fluorophor oder einer radioaktiven Einheit gekennzeichnet ist. Die verschiedenen Verfahren zur Errnittlung oder zum Nachweis der Anwesenheit einer Substanz in einer Probe und zur Rückgewinnung einer Substanz aus einer die Substanz enthaltenden Probe basieren auf den neuen Antikörpern dieser Erfindung und den einen Komplex bildenden Substanzen, und werden hierin genauer beschrieben.
Die Arten von Tests, die bei den von der vorliegenden Erfmdung geschaffenen Verfahren brauchbar sind, sind Fachleuten auf dem Gebiet, auf das sich diese Erfindung bezieht, gut bekannt. Unter solchen Verfahren sind Flüssigphasen-Tests wie Radioimmuntests, und Festphasen- Tests wie ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays, enzymverknüpfte Immunosorbent-Tests) und der Sandwich- oder IRMA (Immuno Radio-Metric Assay, Immunoradiometrischer Test)-Test. Was den letzteren Test betrifft, ist ein besonders brauchbarer immunometrischer Test die immunometrische "zweiseitige" oder "Sandwich" Testtechnik, die von David et al. U.S. 4 376 110, deren Inhalt hierrnit durch Bezugnahme in die Offenbarung aufgenommen wird, offenbart wird. Die Versuchbedingungen wie Versuchsdauer, pH, Temperatur, Ionenstärke des Versuchs sind Fachleuten ebenfalls bekannt. Eine allgemeine Beschreibung solcher weithin bekannter Tests und Bedingungen sind beschrieben in Laboratory Techniques in Biochemistrv and Molecular Biologv, vol. 13, Monodonal Antibody Technologv, A.M. Campbell, Elsevier, New York, 1986, chapter 2, "Assay Techniques", pp. 33-65.
Diese Erfindung wird in dem folgenden Abschnitt der Diskussion experimenteller Details veranschaulicht. Diese Abschnitte werden dargelegt, um beim Verstehen der Erfindung zu helfen, sind aber nicht dazu gedacht, und sollten nicht so ausgelegt werden, daß sie die Erfmdung, wie sie in den danach folgenden Ansprüchen dargelegt ist, in irgendeiner Weise beschränken.

Experimentelle Einzelheiten

Erste Reihe von Experimenten

Materialien und Verfahren

Klonieren und Expression von chimären schweren Ketten mit variablen Bereichen die von Anti-Dextran Hybridomen abstammen

Die exprimierten VH-Regionen aus den drei Hybridom-Antikörpern gegen alpha (1T6)-Dextran wurden an das Gen der konstanten Region des menschlichen IgG&sub4; gekoppelt (Fig. 1), und nach Transfektion von D3 lenkte eine nur die hybridomeigene leichte Kette erzeugende Zelllinie (4, 5) die Expression einer H-Kette, die sich mit der endogenen leichten Kette zusammenfügte und sezerniert wurde (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Nucleotidsequenzen der variablen Region der schweren Kette (VH) und der leichten Kette (VL) wurden bestimmt (2) (Tabelle I). Tabelle I Immunochemische Eigenschaften von für Dextran B512 spezifischen Hybidom-Antikörpern
a Nach Sharon et al. (1)
b Nach Newman et al. (20)
c Macimale Anzahl von alpha (1T6)-verknüpften Glukoseresten, die an der Antigenbindungstelle des Antikörpers sitzen
d Bestimmt durch Affinitäts-Gelelektrophorese nach dem von Takeo unf Kabat (21) beschriebenen Verfahren
e Assoziationskonstanten von anti-Dextran-Bindungsstellen mit Isomalthoheptaose (IM7)
f Gemäß Alkolkar et al. (2)
Zur Bestimmung, ob der chimäre Antikörper 14.6b. 1 Kohlehydrat in der VH enthielt, wurde das Molekül durch Papain-Spaltung in Fab und Fe fraktioniert, dann wurden die Moleküle mit beta-Mercaptoethanol reduziert und auf 5 % SDS-PAGE-Gelen analysiert. Die Proteine wurden mit [³&sup5;S]-Met markiert und das Fab unter Verwendung von spezifischem Anti-Fab-Antiserum ausgefällt (Fig. 2A). Transfektom-Antikörper, deren VH von 5.54.4.24.1 und 19.22.1-cDNA-Klonen (TJC8 bzw. THV8) stammt, zeigen Co-Migration ihrer leichten Fd- und Kappa-Kette. Im Gegensatz dazu wandert bei Transfektom-Antikörpem, deren variabler Bereich der H-Kette von 14.6b. 1 (TKC3.2) stammt, der Fd-Bereich langsamer als die L-Kette. Die verringerte Beweglichkeit des 14.6b.1- Fd-Fragments ist vereinbar mit der Glykosylierung seiner VH.
Zur Bestätigung der Anwesenheit von Kohlehydrat in dem VH von 14.6b.1 wurde das sezernierte Immunglobulin mit [¹&sup4;C]-Glukosamin markiert, Fab- und Fc-Fraktionen hergestellt, und die Produkte mittels SDS-PAGE analysiert (Fig. 2B). Erwartungsgemäß enthalten die leichten Kappa-Ketten kein Kohlehydrat, und Banden fehlen. [¹&sup4;C]-Glukosamin- Markierung des Fc-Fragments von menschlichem IgG wurde gefunden, welches N-verknüpftes Kohlehydrat innerhalb seiner CH2-Domäne enthält (6). Jedoch zeigt nur TKC3.2 (Fab), dessen Fd von dem 14.6b. 1 VH erhalten wurde, Glukosamin-Markierung. Die verringerte Intensität der Fd-Banden relativ zu Fc liegt wahrscheinlich eher an der schlechten Rückgewinnung des Fab-Fragments als an unvollständiger Glykosylie rung (7). In SDS-PAGE-Gelen, in denen H-Ketten, die keine, eine oder zwei Kohlehydrat-Einheiten enthielten, aufgelöst werden konnten (Fig. 3A), wurde für TKC3.2 nur eine Bande der schweren Kette gefunden.

Rolle des Kohlehydrats bei der Antigen-Antikörper-Wechselwirkung

Zur Untersuchung der Rolle von Kohlehydrat bei der Antigen-Bindung wurden die Assoziationskonstanten für Tunicamycin-behandelte aglykosylierte und für unbehandelte unveränderte Anti-Dextran Transfektom- Antikörper bestimmt. Obwohl Tunicamycin ein wirksamer Hemmstoff N-verknüpfter Glykosylierung ist (8), ist es schwierig, Proteine zu erzeugen, die völlig frei von glykosylierten Spezies sind. Aus Rekonstruktions-Experimenten wurde deutlich, daß selbst eine Spur von Verunreinigung an Antikörper hoher Affinität die scheinbare Bindungskonstante für Dextran des Antikörpers geringer Affmität dramatisch erhöhen konnte (Daten nicht gezeigt). Um dies zu vermeiden wurde Con A verwendet, das Oligosaccharide hohen Mannosegehalts und zweiantennige (biantennary) komplexe Oligosaccharide bindet (9), um nicht-glykosyliertes von glykosyliertem Immunglobulin zu trennen. Adsorptionsexperimente zeigten, daß das Kohlehydrat in THV8.3-Antikörper (VH 14.6b.1) an Con A-Sepharose nicht absorbiert wurde (Fig. 3A, Spuren 2 und 4). Der restliche TKC3.2-Antikörper, der in dem Con A-Überstand (Spur 2) zu sehen ist, kann die Unfahigkeit, die Con A-Aufschlämmung vollständig von der Kulturflüssigkeit zu trennen, wiederspiegeln.
Tunicamycin-Behandlung sowohl von TKC3.2- als auch von THV8.3- Antikörpern führte zu einer elektrophoretischen Mobilitätsveränderung, die mit dem Verlust von Kohlehydrat der H-Kette vereinbar ist (Fig. 3B, Spuren 1 bis 4). H-Ketten, die zwei, eine und null N-verknüpfte Kohlehydrat-Einheiten enthalten (Spuren 1, 3 bzw. 2 oder 4), können aufgelöst werden. Die H-Ketten-Banden der unbehandelten Proben (Spuren 1 und 3) erscheinen homogen, was nahelegt, daß alle H-Ketten gleichförmig glykosyliert sind. Aus dem Fehlen von sichtbaren Banden glykosilierter H-Ketten in den Spuren 2, 4 und 6 wurde geschätzt, daß die Tunicamycin-Behandlung zu einer Deglykosylierung des Immunglobulins von mehr als 97% führt. Die Spuren 5 bis 8 zeigen die bei Con A-Adsorption von mit Tunicamycin behandeltem Immunglobulin erhaltenen Ergebnisse. Weder der aglykosylierte TKC3.2 (VH 14.6b.1)-Antikörper noch der aglykosylierte THV8.3 (VH 19.22.1)-Antikörper wurde von Con A gebunden (Spuren 5 und 7).
Nach der Feststellung, daß Con A-Adsorption glykosylierte Verunreinigungen aus Tunicamycin-behandelten TKC3.2-Präparaten entfernen konnte, wurde als nächstes an Con A absorbiertes Material für Studien zur Dextranbindung verwendet. Die Ergebnisse aus einem typischen Experiment sind in Fig. 4 graphisch dargestellt. Für den unveränderten TKC3.2-Antikörper (VH 14.6b.1) wurde eine 50%-ige Hemmung der Bindung an mit 0,5 µg/ml oder 20 µg/ml Dextran beschichtete ELISA- Platten erhalten, wenn 1,2 µg/ml Dextran-Hemmstoff hinzugefügt wurden. An Kohlehydrat verarmter TKC3.2-Antikörper (VH 14.6b.1) konnte nicht an mit 0,5 µg/ml Dextran beschichtete Platten binden (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung von Bedingungen von Bindung mit geringer Affinität (Mikrotitermulden, beschichtet mit 20 µg/ml Dextran) zeigten die aglykosylierten TKC3.2 (VH 14.6b.1)-Antikörper und der unveränderte THV8.3-Antikörper 50% der maximalen Bindung, wenn 18 bis 24 µg/ml Dextran B512-Hemmstoff (Inhibitor) hinzugefügt wurden.
Die scheinbaren Assoziationskonstanten für Tunicamycin-behandelte aglykosylierte und für unbehandelte unveränderte Anti-Dextran-Antikörper sind in Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle II Scheinbare Bindungskonstanten für Dextran B512
a Berechnet aus der reziproken Konzentration von Dextran B512, die notwendig ist, um 50% der maximalen Bindung von Antikörper an Dextran-beschichtete Platten zu verhindern. Die I/[Dex]&sub1;&sub5;&sub0;-Konzentration wurde mit dem Faktor 2 multipliziert, um den endgültigen aka-Wert zu ergeben, weil Dextran-Inhibitor und Antikörper in einem Molverhältnis von 1:1 zu Mikrotitermulden zugegeben wurden.
b nicht bestimmt
c Der aKa-Wert stellt einen Durchschnitt dar, der aus der Anzahl der in der Klammer angegebenen Experimente erhalten wurde. Der Fehler für die Summe aller dieser Werte wird dargestellt durch die erste Standardabweichung.
d Bestimmt unter Verwendung des Affinitäts-Gelelektrophorese-Verfahrens.
e,f Die Antikörper-Konzentrationen waren 0,8 µg/ml bzw. 0,3 µg/ml.
g Kultur-Überstände waren nicht aus Tunicamycin-Experimenten. Die Anti körper-Konzentration war 1 µg/ml.
Zur Bestimmung von Antikörper-Konzentrationen wurden in BBS (0,02M Borat-gepufferte, 0,75 %-ige Kochsalzlösung, pH 8,3) verdünnte Kultur-Überstände drei Stunden lang bei 37ºC an Polystyrol-Mikrotitermulden (Corning, N.Y.) gebunden. Nach Blockieren irgendwelcher nicht reagierten Stellen mit 1 % Rinderserumalbumin/0,05 % Tween 20PBS (PBS T S) eine Stunde lang bei Raumtemperatur, wurden die ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Platten dreimal mit PBS/0,5 % Tween, einmal mit PBS gewaschen, und dann wurde gebundenes Ig quantitativ bestimmt durch Reaktion mit einem mit Meerrettich-Peroxi dase markierten Anti-Mensch-IgG-Antikörper und Vergleich mit einem menschlichen IGG-Standard bekannter Konzentration. Die Testergebnisse wurden mindestens dreimal reproduziert.
Die Bindungskonstante des an Kohlehydrat verarmten TKC3.2-Antikörpers (VH 14.6b.1) war 14-15-fach geringer als die des unveränderten Antikörpers. Im Gegensatz dazu beeinträchtigte die Entfernung von Kohlehydrat aus dem Fc von THV8.3 (VH 19.22.1) nicht die Fähigkeit der Antikörper zur Bindung von Antigen. Alle Experimente mit Ausnähme der bezeichneten wurden unter Verwendung einer Antikörper- Konzentration von 1 µg/ml durchgeführt. Eine leichte Auswirkung der Antikörper-Konzentration auf scheinbare aKa-Werte wurde beobachtet. Die unter Verwendung des Inhibierungs-ELISA bestimmten aKa-Werte waren im allgemeinen 3-5-fach höher als diejenigen, die mittels Affinitäts-Gelelektrophorese erhalten wurden, aber die Unterschiede in der Bindungsstärke zwischen den Antikörpern waren ähnlich bei Verwendung der beiden Tests. Es wurde ein 32-facher Unterschied in der Bindungsaffinität zwischen dem TKC3.2 (VH 14.6b.1)- und dem THV8.3 (VH 19.22.1)-Antikörper gefunden gegenüber dem 50-fachen Unterschied zwischen 14.6b.1 und 19.22.1, der früher berichtet wurde (10). Zusammenfassend ist klar, daß die Anwesenheit von Kohlehydrat innerhalb des Anti-Dextran VH-Bereichs seine Affinität für Antigen beträchtlich beeinträchtigt, ein zusätzlicher Beitrag der geänderten Aminosäuren zu den Unterschieden in der Bindung kann jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Struktur der Kohlehydrat-Einheiten auf der schweren Kette. Schließlich wurde Endo H-Glykohydrolase zur Untersuchung der Struktur des VH- Oligosaccharids verwendet. Die Di-N-Acetylchitobiose-Verknüpfung von Kernoligosacchariden mit hohem Mannosegehalt, die an neu synthetisierten IgG H-Ketten gefunden wurde, ist empfänglich für Endo H-Spaltung (11), wahrend behandelte komplexe Kohlehydrate gegen Endo H-Spaltung beständig sind. Aus Zellzytoplasma erhaltene H-Ketten wurden durch Endo H hydrolysiert (Werte nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu wurden schwere Ketten aus den Absonderungen sowohl von THV8.3 als auch von TKC3.2 durch Endo H-Behandlung nicht verändert.
Potentielle Bedeutung von Kohlehydrat bei der Antikörper-Wirkung. Antikörper sind Glykoproteine, bei denen alle schweren Ketten mindestens einen und häufig mehrere N-verknüpfte Kohlehydrat-Reste enthalten (12). Die Rolle, die man für an den konstanten Bereichen der schweren Ketten gefundenes Kohlehydrat postulierte, umfaßt Solubilisierung der 11-Kette, Erleichterung des subzellulären Transports und der Absonderung, Montageförderung und Aufrechterhaltung von Immunglobolin-Konformationsmerkmalen, die zu Effektorfunktionen beiträgt (13). Kohlehydrat kann man auch innerhalb des V-Bereichs eines Antikörper- Moleküls finden. 15 % der leichten Ketten von menschlichen Myelomen besitzen Kohlehydrat innerhalb ihrer variablen Bereiche (14). In einer Studie an 76 Myelom-Proteinen von menschlichem IGG wurde von näherungsweise 25 % gezeigt, daß sie eine Kohlehydrat-Einheit an dem Fab-Fragment enthalten (15). Das Kohlehydrat war entweder an die leichten Ketten oder die Fd-Fragmente und in eimgen Fällen an beide gebunden.

Versuchsdiskussion

Bei der vorliegenden Erfmdung wurde unmittelbar gezeigt, daß die Anwesenheit von Kohlehydrat in CDR2 von VH kritisch ist für die Bindung mit hoher Affinität eines für polymeres alpha (1T6)-Dextran spezifischen monoklonalen Antikörpers, und daraus kann geschlossen werden, daß das Kohlehydrat auch zu der erhöhten Affinität für IM7 beiträgt. So können nicht nur die spezifische Aminosäuresequenz des variablen Bereichs, sondern auch seine Kohlehydrat-Einheiten die Spezifität und Stärke der Antigen-Antikörper-Wechselwirkung bestimmen.
In einer früheren Studie isolierten und charakterisierten Matsuuchi et al. (16) eine spontan auftretende Mutante des Myeloms J558 (IgA, lambda, anti-alpha (1T3)-Dextran) mit verringerter Reaktivität gegenüber polymerem Dextran. Die Mutante unterschied sich von dem Wildtyp insofern, als sie erhöhte Mengen an Sialinsäure an dem Kohlehydrat in ihrem Fab-Bereich besaß. Weil der variable Bereich von J558 nicht die kanonische Kohlehydrat-Zusatzsequenz enthält, befindet sich das geänderte Kohlehydrat wahrscheinlich innerhalb der CH&sub1;-Domäne. Die Veränderung des Kohlehydratgehalts war die Folge der veränderten Verfügbarkeit von zellulären Enzymen, die an der Glykosylierung beteiligt sind.
Labeta et al. berichteten, daß die Affmität eines Anti-DNP-Antikörpers für Hapten-DNP-GABA-BSA nach Endo 11-Spaltung des Fab-Kohlehydrats beträchtlich erhöht war (17). Im Gegensatz dazu und in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verringerte das Fehlen von Kohlehydrat bei dem Antigen-bindenden Fragment (Fab) eines Antikörpers gegen alpha (1T6)-Dextran die Affinität des Antikörpers für Antigen.
Von großem Interesse ist der Mechanismus, durch den die Anwesenheit eines an Aminosäuren an der Bindungsstelle des Antikörpers 14.6b.1 angefügten Oligosaccharids zu einer erhöhten Ka sowohl für polymeres Dextran als auch für IM7 führt. Sowohl der Vergleich mit röntgenkristallographischen Studien nicht verwandter Antikörper, die voraus sagen, daß Reste, an die das Kohlehydrat in VH angefügt ist, an den hypervariablen Schleifen exponiert sein sollten, als auch die Con A- Adsorptionsexperimente dieser Erfmdung legen nahe, daß das VH-Oligosaccharid relativ exponiert ist und an der Oberfläche des Ig angeordnet ist. Obwohl Zucker-Zucker-Kontakte zwischen den zwei Oligosacchariden in CH&sub2; des konstanten Bereichs dokumentiert wurden (18), ist es schwierig einzusehen, wie direkte Wechselwirkungen sowohl mit polymerem Dextran als auch einem ortsfüllenden Oligosaccharid IM7 auftreten könnten.
Eine wahrscheinlichere Erklärung für die Wirkung der Glykosylierung ist, daß das an die Aminosäure 58 gebundene Kohlehydrat die Konformation der Verbindungsstelle ändert. Derartige Veränderungen könnten die Zugänglichkeit des Threonin-Rests an Position 60 in dem 14.6b.1 VH-Bereich erhöhen, so daß er mit dem Antikörper enger in Berührung kommen kann. Tatsächlich haben Feldman und Mitarbeiter aus dem hypothetischen Raummodell des V-Bereichs des Galaktan bindenden Myeloms Ig J539 vorhergesagt, daß der Thr-Rest 56 der H-Kette Galaktan berühren kann (19). Die röntgenkristallographische Struktur des 14.6b.1 Fab würde helfen zu verstehen, wie die Anwesenheit von Kohlehydrat die Topologie der Verbindungsstelle beeinflußt.

Zweite Reihe von Experimenten

Herstellung von Antikörpern mit verändertem Kohlehydrat im konstanten Bereich. Alle vier Unterklassen von menschlichem IgG enthalten eine Konsensus-Glykosylierungssequenz Asn-X-Thr/Ser (X - irgendeine Aminosäure) in der CH2-Domäne. Mehrere Berichte zeigten, daß diese Kohlehydrat-Seitenkette wichtig ist für die Effektorfunktionen von Immunglobulinen, einschließlich Fc-Rezeptorbindung und Komplementaktivierung (22, 23). Zur Entfernung dieses Signals für Kohlehydrat- Anfügung aus der CH2-Domäne wurde zielgerichtete Mutagenese verwendet, so daß Moleküle mit Kohlehydratmangel zur Verwendung beim Prüfen der Rolle von Kohlehydrat bei biologischen Funktionen herge stellt werden konnten. Bis heute verwendeten Forscher für diesen Zweck Immunglobuline, die von Zellen hergestellt wurden, die in Anwesenheit von Tunicamycin, einem Inhibitor für N-verknüpfte Glykosylierung, wuchsen. Unter Verwendung dieses Weges konnten jedoch nur kleine Mengen an Protein hergestellt werden, und es war schwierig sicherzustellen, daß die sich ergebenden Proteine völlig frei von Kohlehydrat waren.
Es gibt viele unterschiedliche Wege für zielgerichtete Mutagenese; ein bei der vorliegenden Erfmdung verwendeter Weg ist in Fig. 5 veranschaulicht (24). Das Sal I-Bam HI-Fragment, das das Exon des konstanten Bereichs von IgG enthält, wird an der Polylinker-Stelle in den M13-Phagen M13mp19 einkloniert. Die Plus-Strang-DNA-Matrize des rekombinanten Phagen wird nach dem Standard-Polyethylenglykol-Verfahren hergestellt. Zur Erzeugung der Mutation werden zwei Primer verwendet, wobei einer der M13-Sequenzierungsprimer ist, der andere ein am 5'-Ende phosphorylierter mutagener Primer mit einem fehlgepaarten Nucleotid in der Konsensus-Glykosylierungs-Sequenz. Beide Primer werden gleichzeitig an die Matrize reassozuert. Nach der Primer- Extension und -Ligation wird der Mutanten/Wildtyp-Lücken-Heteroduplex zur Transformation des E. coli-Wirts JM109 verwendet. Zur Unterscheidung von Mutanten von Phagenklonen vom Wildtyp wird Koloniehybridisierung verwendet. Unter wenig harten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren sowohl der mutierte Phage als auch der Phage vom Wildtyp mit dem mutagenen Oligomer. Wenn die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen erhöht wird, z.B. durch Erhöhen der Temperatur, bei der die hybridisierten Phagen-Plaques gewaschen werden, bleibt das markierte mutagene Oligomer mit der Mutanten-Phagen-DNA hybridisiert, dissoziiert aber von der nicht-mutierten Phagen-DNA. Schließlich muß die genaue Nucleotid-Veränderung, die in die schwere Immunglobulin-Kette eingeführt wurde, durch DNA-Sequenzierung bestätigt werden; das Dideoxy-Verfahren der Sequenzierung wird verwendet (25, 26). Das mutagenisierte Gen wird dann in einen Expressionsvektor transferiert, wo es zur Lenkung der Synthese eines geänderten Proteins verwendet werden kann. Dieser allgemeine Weg kann verwendet werden zur Einführung von Veränderungen irgendwo in dem Antikörpermolekul, und kann besonders angewendet werden für die Herstellung von Antikörpermolekulen mit geänderten Idiotypen.
Unter Verwendung des in diesem Schnitt beschriebenen Verfahrens wurden Antikörper ohne Kohlehydrat im konstanten Bereich hergestellt. Diese zeigen geänderte Effektorfunktionen: verringerte Fähigkeit zur Bindung von Fc-Rezeptoren und zur Komplement-Aktivierung. Einer (γ3) zeigt eine verringerte Serum-Halbwertszeit bei Mäusen, während die Halbwertszeit des zweiten (γ1) unverändert erscheint.
Dieser Weg könnte auch dazu verwendet werden, zusätzliche Kohlehydrat-Molekule in den konstanten Bereich zu bringen. Dies könnte nützlich sein, wenn Liganden über deren Kohlehydrate an Antikörper angefügt werden.

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Claims

1. Ein Verfahren zum Modifizieren des Kohlenhydratgehalts eines Antikörpers, wobei das Verfahren ein Hinzufügen einer Kohlenhydraterkennungsstelle zu einem konstanten Bereich des Antikörpers aufweist, wobei diese Kohlenhydraterkennungsstelle nicht natürlicherweise in einem derartigen konstanten Bereich eines derartigen Antikörpers vorkommt.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Hinzufügung der Kohlenhydraterkennungsstelle zu dem Antikörper durch eine stellengerichtete Mutagenese von DNA bewirkt wird, welche einen derartigen konstanten Bereich des Antikörpers kodiert.

3. Ein menschlicher Antikörper, der nicht in Natur vorkommt und der gekennzeichnet ist durch das Vorhandensein einer Kohlenhydraterkennungsstelle in einem konstanten Bereich des Antikörpers, welcher nicht in natürlicher Weise eine derartige Kohlenhydraterkennungsstelle in einem derartigen konstanten Bereich aufweist.

4. Ein menschlicher monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3.

5. Ein menschlicher Antikörper nach Anspruch 3, mit Kohlenhydrat, welches an einer derartigen Kohlenhydraterkennungsstelle angebracht ist.

6. Ein gekennzeichneter Antikörper nach Anspruch 5, bei welchem die Kennzeichnung an ein derartiges Kohlenhydrat gebunden ist.

7. Ein therapeutisches Mittel, welches den Antikörper nach Anspruch 5 und einen therapeutischen Ligand aufweist, wobei der Ligand an ein derartiges Kohlenhydrat gebunden ist, das an einem derartigen Antikörper angebracht ist.

8. Ein modifizierter Antikörper, der durch das Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt ist.

9. DNA, den Antikörper nach Anspruch 3 kodierend.