DE69018968T2

DE69018968T2 - BLUTGERINNUNGSFAKTOR BETA XIIa MONOKLONALE ANTIKÖRPER UND IMMUNANALYSE.

Info

Publication number: DE69018968T2
Application number: DE69018968T
Authority: DE
Inventors: Michael Peter Combe Oxfordshire Ox7 2Pf Esnouf
Original assignee: Coagen Ltd
Current assignee: Coagen Ltd
Priority date: 1989-01-27
Filing date: 1990-01-29
Publication date: 1995-08-24
Anticipated expiration: 2010-01-30
Also published as: JP2916252B2; JPH04503006A; IL93207A0; GB8901859D0; WO1990008835A1; ES2072423T3; NZ232273A; EP0455707A1; IL93207A; CA2045475A1; AU641912B2; AU5030590A; DE69018968D1; CA2045475C; EP0455707B1; ATE121788T1; DK0455707T3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Immunassay und Reagensien für einen solchen Assay. Sie bezieht sich insbesondere auf den Blutkoagulationsfaktor XII und seine aktivierten Formen sowie Faktor XIIa.
Faktor XII ist ein inaktives Zymogen, das in normalem Blut vorhanden ist. Faktor XII wird ohne weiteres in der Gegenwart von Kallikrein, einem Kininogen von hohem Molekulargewicht und einer negativ geladenen Oberfläche, in eine zweikettige Form umgewandelt, die enzymatisch aktiv ist. Diese 80-kD Serinprotease, die oft Faktor αXIIa genannt wird, hat eine 52- kD schwere Kette, die über eine Disulfidbindung mit einer 28- kD Leichtkette verbunden ist. Die Proteolyse dieses Faktors setzt ein 40-kD Peptid aus der schweren Kette frei und führt zu einem Produkt, einem Faktor βXIIa, der die Serinproteaseaktivität behält, aber in dem die 28-kD Kette des Faktors αXIIa mit einem kleinen Peptidfragment Disulfid verbunden ist, das aus der früheren 52-kD schweren Kette stammt. In vielen Fällen hat das kleine Peptidfragment ein Molekulargewicht von 2000-D, aber es sind Fragmente von unterschiedlicher Größe beobachtet worden, zum Beispiel 800-D und 3000-D Fragmente.
Der Ausdruck "Faktor XIIa", abgekürzt zu "XIIa" wird hierin verwendet, um jede Form des aktivierten Faktors XII zu bezeichnen, das heißt, daß jedes Derivat des Faktors XII Serinproteinaseaktivität hat. Dies schließt jede Form des XIIa, der vom Faktor XII in vitro gebildet wird und jede Form, die in vivo auftritt und aus natürlichen Quellen gewonnen wird, ein. Es schließt des weiteren jedes Analogon eines natürlich vorkommenden Proteins ein, das eine modifizierte Aminosäuresequenz hat, zum Beispiel eine oder mehrere sogenannte "konservative" Änderungen der Aminosäuresequenz, das heißt, Änderungen (Additionen, Eliminierungen oder Substitutionen), die nicht die Eigenschaften des Moleküls beeinflussen, insbesondere die immunogenischen und enzymatischen Eigenschaften. Der Ausdruck schließt jede synthetische Kopie und jedes synthetische Analogon des natürlich vorkommenden Faktors XIIa ein, entweder hergestellt mittels chemischer Synthese oder mittels DNS Rekombinationstechnik. Dies schließt jede Form von (αXIIa und jede Form von βXIIA ein. Die Ausdrücke "βXIIa" und "Faktor βXIIa" und "αXIIa" und "Faktor αXIIa" werden hierin analog verwendet, um jede Form eines derartigen Moleküls zu bezeichnen.
Die Aminosäuresequenz einer Form des Faktors βXIIa, die ein 2000-D Peptidfragment hat, ist beschrieben worden (K. Fujikawa & B.A. McMullen, J. Biol. Chem. 258, 10924-10933, 1983) und es sind Vermutungen über seine tertiäre Strukture angestellt worden (D.E. Cool et al, J. Biol. Chem. 260, 13666-13676, 1985). Die Schnittstellen dieser Form des βXIIa sind weiter von Cool et al (J. Biol. Chem. 262, 13662-13672, 1987) definiert worden: Für αXIIa wird angegeben, das er von XII mittels Schneidens zwischen Arg³&sup5;³-Val³&sup5;&sup4; hergestellt wird und βXIIa wird aus αXIIa mittels Schneidens zwischen Arg³³&sup4;- Asn³³&sup5;, Arg³&sup4;³-Leu³&sup4;&sup4; und Arg³&sup5;³-Val³&sup5;&sup4; hergestellt, was zu zwei Polypeptidketten mit 9 und beziehungsweise 243 Resten führt.
Obwohl die vorliegende Erfindung sich insbesondere mit Human- Faktor XIIa befaßt, ist sie nicht auf Humanprotein oder auf ein XIIa Protein, das eine spezifische Aminosäuresequenz hat, beschränkt (siehe Fujikawa & McMullen oben).
Es ist bekannt, daß erhöhte Blutpiegel an Cholesterin, Low Density Lipoproteinen (LDL) (Lipoproteine niedriger Dichte) und Apolipoprotein B auf lange Sicht mit einem Sterberisiko an ischämischer Herzkrankheit (IHD) und an akutem Myokardinfarkt (AMI) positiv korrelieren. Ähnliche positive Korrelationen bei niedrigen Blut spiegeln an High Density Lipoprotein (HDL) (Lipoproteine hoher Dichte) und Apolipoprotein A1 sind gefunden worden.
Keiner dieser Parameter ist jedoch brauchbar für die Vorhersage des AMI Risikos beim Einzelnen. Meade et al. vom Northwick Park Hospital (Meade et al Lancet (i) 1050-4; Meade. Haemostasis 1983, 13, 178-85; Meade et al Lancet 1986, (ii) 533-7) und Kannel, Wolf, Castelli & Agostino von der Franingham Study (Kannel et al J.A.M.A. 1987, 258 (9), 1183-6) haben gezeigt, daß, unter sorfältig kontrollierten Bedingungen, Messungen des Fibrinogens und der Faktor-VII- Koagulationsaktivität die Wahrscheinlichkeit eines AMI besser vorhersagen können als es verschiedene Lipidmessungen können. Faktor VII ist selbst ein einkettiges Protein, das eine niedrige Aktivität hat, aber es kann in eine zweikettige Form umgewandelt werden, den Faktor VIIa, der aktiver ist. Substanzen, die den Faktor VII zu VIIa aktivieren können, schließen Faktor Xa, Faktor IXa, Faktor XIIa und Thrombin ein.
Wie oben ausgeführt, ist gezeigt worden, daß die Faktor-VII- Aktivität unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen, brauchbar bei der Vorhersage der Wahrscheinlichkeit des AMI beim Einzelnen ist. Jedoch sind die zur Zeit verfügbaren Verfahren zum Messen der Faktor-VII-Aktivität großen Variationen unterworfen. Insbesondere die Venenpunktion, die Methode, die im allgemeinen benützt, wird um Blutproben zu erhalten, setzt variable Mengen des Gewebefaktors frei, der wie oben erwähnt, an einem Verfahren der Aktivierung des Faktors VII beteiligt ist. Folglich ist die Verwendung der Faktor-VII-Aktivität bei der Vorhersage von AMI nicht ausreichend zuverlässig für die allgemeine Verwendung.
Die vorliegende Erfindung basiert auf den Beobachtung, daß ein erhöhter Lipidspiegel in der Ernährung, die Faktor-VII- Aktivität erhöht, indem die Fließgleichgewichts-Konzentration des Faktor XIIa, zum Beispiel βXIIa erhöht wird. Das heißt, daß der Faktor XIIa, zum Beispiel βXIIa ein Bindeglied zwischen Hyperlipidämie und Faktor VII ist.
Folglich wird vorgeschlagen Messungen der Faktor-XIIa-Spiegel zu verwenden, zum Beispiel βXIIa, um im Plasma die Wahrscheinlichkeit einer Herzkrankheit vorherzusagen, insbesondere von ischämischer Herzkrankheit (IHD) und akutem Myokardinfarkt (AMI) beim Einzelnen, in Analogie zu der Verwendung der Faktor-VII-Aktivität, aber unter Vermeidung des Nachteils der Gewebsfaktoraktivierung, die geschieht, wenn Proben des Faktors VII gewonnen werden.
Vor der gegenwärtigen Erfindung gab es jedoch keinen Faktor- XIIa-Assay, der schnell, selektiv und ausreichend empfindlich war, um genau XIIa bei einem Spiegel von unter ungefähr 10 ng/ml nachzuweisen und der leicht für die Benutzung über einen breiten Maßstab automatisiert werden kann.
Das Verfahren, das früher benutzt wurde, um den Faktor XIIa zu bestimmen, ist ein Enzymassay, in dem ein chromogenes Substrat hydrolysiert wird. Nicht nur der oben erwähnte Mangel an Empfindlichkeit, sondern ein weiterer Nachteil dieses Assays ist, daß das chromogene Substrat von einer großen Anzahl von anderen Substanzen, die im Plasma vorkommen, hydrolysiert wird, einschließlich des Faktor Xa, Kallikrein und Thrombin. Es ist daher notwendig, diese Hydrolyse einzuschätzen und sie zu tolerieren, die unvermeidlich Ungenauigkeiten einführen wird, insbesondere bei niedrigen XIIa Spiegeln. Dieser Assay kann nicht als einer angesehen werden, der genaue Ergebnisse bei Spiegeln des XIIa unter ungefähr 10 ng/ml ergibt.
Versuche den Assay von XIIa und anderen Gerinnungsfaktoren zu verbessern haben ein Bedürfnis nach verbesserten chromogenen Substanzen geweckt, siehe zum Beispiel EP-B 78 764 und EP-A 285 000.
Andere nicht-chromogene Typen eines Assays sind für Blutgerinnungsfaktoren vorgeschlagen worden, zum Beispiel offenbart WO-A 8606489 die Verwendung von Oberflächen gebundem Fibrinogen und markiertem Fibrinogen. Immunassays sind auch vorgeschlagen worden, zum Beispiel EP-A 325723 beschreibt in allgemeinen Ausdrücken den Gebrauch eines Mikropartikelträgers, der mit einem monoklonalen Antikörper gegen einen Blutgerinnungsfaktor sensibilisiert worden ist. J-A 62065693 beschreibt einen monoklonalen Antihumanblut- Gerinnungsfaktor-XI-Antikörper. Von diesem Antikörper wird angenommen, daß er sowohl eine starke Affinität zu dem Faktor XI vom aktiven Typ als auch zum Blutgerinnungsfaktor XI selbst hat. Der monoklonale Antikörper kann zur Bestimmung des Humanblutgerinnungsfaktor XI und des aktiven Typs des Faktors XI bei verschiedenen Formen des Immunassays verwendet werden.
Es ist ein monoklonaler Antikörper beschrieben worden, der den Faktor XII und den Faktor αXIIa erkennen kann, der aber nicht den Faktor βXIIa erkennen kann (E.J. Small et al, Blood, 65, 202-210, 1985). Dies ist nicht überraschend, weil die Autoren fanden, daß der Antikörper auf das 40-kD Fragment gerichtet war, das vom Faktor αXII freigesetzt wird, wenn er in den Faktor βXIIa umgewandelt wird, das heißt, daß der Antikörper auf eine Antigendeterminate gerichtet war, die Teil der Faktor XII und der Faktor αXIIa Moleküle ist, die aber physisch nicht in dem βXIIa Molekül existiert.
Es ist auch ein monoklonaler Antikörper beschrieben worden, der speziell an eine Antigendeterminante in der beichtkettengegend des Faktors XII (WO 89/11865) bindet. Dieser Antikörper bindet an ein Faktor XII Zymogen und auch an seine Schneideprodukte, die die Leichtkette enthalten, daß heißt, an den Faktor αXIIa und an Faktor βXIIa. Nuijens et al. (Thrombosis and Haemostasis, 58(2), 778-785 (1987) beschreiben die Verwendung von einer mit Immunglobulin angereicherten Fraktion des Antifaktor-XII-Antiserums bei der quantitativen Bestimmung der aktivierten Hageman-Faktor-Ci-Inhibitor- und der Kallikrein-Ci-Inhibitor-Komplexe. Es wurde gezeigt, daß die Antifaktor-XII-Antikörper auch an αXIIa und βXIIa binden.
Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper zur Verfügung, der an den Faktor βXIIa und an den Faktor Faktor αXIIa bindet und der eine korrigierte Kreuzreaktivität mit Faktor XII von 0,1% oder weniger besitzt.
Es ist überraschend, daß im Gegensatz zu J-A 6206593 und WO 89/11856, Nuijens et al. und Saml et al., die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung in der Lage sind den aktivierten Faktor XII zu erkennen und zwischen dem aktivierten XII und dem Zymogen-Faktor XII selbst zu unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Ermitteln und/oder Bestimmen des Faktor XIIa in einer Probe zur Verfügung, bei dem man eine Probe einem qualitativen oder quantitativen Immunassay unterwirft, der die Wechselwirkung zwischen einem Anitgen und einem Antikörper und die Ermittlung und/oder die Bestimmung eines resultierenden Antikörper- Antigen Klomplex umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß der Anitkörper ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung ist. Faktor βXIIa wird im allgemeinen als Standard für einen derartigen Assay verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Ausführung eines Immunassays für ein Antigen in einer Fluidprobe zur Verfügung, wobei dieser Assay eine Wechselwirkung zwischen dem Antigen und dem Antikörper umfaßt, der daran bindet, und die Bestimmung der Menge an Antigen, das in der Probe vorhanden ist, mit Bezug auf die Ergebnisse, die erhalten worden sind, wenn vorherbestimmte Mengen an bekanntem Antigen verwendet werden, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein erfindungsgemäßer monklonaler Antikörper ist und das bekannte Anitgen der Faktor βXIIa ist.
Ein erfindungsgemäßer Immunassay stellt ein schnelles Bestimmungsverfahren zur Verfügung, das ohne weiteres in einer automatischen Ausführungsform in großem Umfang verwendet werden kann. Der Assay ist auch genau und empfindlich und kann benutzt werden, um die Spiegel von XIIa gut unterhalb der effektiv niedrigeren Grenze von 10 ng/ml für die früher verwendeten chromogenen Assays nachzuweisen.
Die erfindungsgemäßen Anikörper und Immunassays sind im allgemeinen nützlich für die Untersuchung des Faktor XIIa, insbesondere, wenn eine große Anzahl von Assays sowohl in einem Forschungslabor als auch in einem Kliniklabor ausgeführt werden. Ein erfindungsgemäßer Antikörper und ein erfindungsgemäßer Immunassay sind insbesondere geeignet für den Gebrauch bei epidemiologischen Studien, um Daten zur Verfügung zu stellen, die in Analogie zu den oben diskutierten Faktor-VII-Daten zur Beurteilung des Risikos von einer Herzkrankheit verwendet werden können, insbesondere bei ischämischer Herzkrankheit und/oder beim akutem Myokardinfarkt beim Einzelnen.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfaren zur Verfügung, worin ein erfindungsgemäßer Immunassay bei einer Plasmaprobe, die von einem Menschen gewonnen worden ist, durchgeführt wird und worin, um die Suszeptivität des Menschen für Herzkrankheiten festzustellen, das Ergebnis, das für den Antigenspiegel in der untersuchten Probe erhalten worden ist, mit den Ergebnissen, die in einer Untersuchung im großen Maßstab erhalten worden sind, verglichen werden, die diesen Antigenspiegel mit der Suszeptivität für eine Herzkrankheit korrelieren. Die einzelnen Assays und die Untersuchung im großen Maßstab werden vorzugsweise unter Verwendung desselben Antikörpers durchgeführt.
Erfindungsgemäße monoklonale Antikörper und erfindungsgemäße Immunassays können auch in Studien über das Gerinnungssystem und bei thrombotischen Störungen verwendet werden.
Die Bindung des Faktors αXIIa an einen besonderen monoklonalen Antikörper relativ zu der Bindung des Faktors βXIIa kann festgestellt werden. Dies kann gemacht werden, indem ein Immunassay auf den Antikörper unter Verwendung des Faktors αXIIa als Antigen durchgeführt wird. Der Immunassay kann qualitativ oder quantitativ sein, wie es gewünscht wird, aber es ist im allgemeinen bevorzugt eine Flüssigphase als einen Festphasenassay zu verwenden. Während es wünschenswert sein kann die relative Bindung des Faktors αXIIa und des Faktors βXIIa an einen erfindungsgemäßen Anti-Faktor-XIIa-Antikörper zu kalkulieren, ist in Betracht zu ziehen, daß es nicht wesentlich ist, die Spezifität gegenüber αXIIa zu bestimmen, da angenommen wird, daß befriedigende Ergebnisse erhalten werden können, vorausgesetzt, daß derselbe Antikörper bei allen Assays, die miteinander verglichen werden, verwendet wird. (Es sei bemerkt, daß im allgemeinen die Ergebnisse eines erfindungsgemäßen Assays realtiv zu βXIIa Standards bestimmt werden und so können sie in Betracht gezogen werden als repräsentative Messung von βXIIa und βXIIa-Äquivalenten).
Erfindungsgemäß kann ein Peptid verwendet werden, das ein Fragment von βXIIa ist, das ist oder das schließt zumindest eine Antigendeterminante ein, die in der Lage ist den Anti- Faktor-βXIIa zu erkennen. Ein Antigenfragment des βXIIa kann selbst immunogen sein oder kann zu klein sein, um immunogen zu sein, in diesem Fall kann es in ein Immunogen umgewandelt werden, zum Beispiel durch eine Konjugation mit einem anderen Peptid, zum Beispiel wie unten beschrieben. Der Ausdruck "Antigenfragment des βXIIa", wie er hier verwendet wird, schließt sowohl ein Peptid, wie oben definiert, als auch eine Immunogenform eines derartigen Peptides ein, wenn es nicht selbst immunogen ist.
Verfahren zur Herstellung von Immunogenen sind dem Fachmann bekannt. Jedes dieser Verfahren kann verwendet werden, um den Faktor βXIIa oder ein Antigenfragment davon immunogen zu machen oder die Immunogenität zu verbessern.
Im wesentlichen umfassen alle diese Verfahren das Verbinden eines Moleküls, das keine antigenen Eigenschaften oder ausreichende antigene Eigenschaften hat, an ein größeres Proteinmolekül, um eine Immunantwort oder eine verbesserte Immunantwort bei einer Immunisierung zu erhalten. Proteinmoleküle, die als Träger verwendet werden, sind, zum Beispiel "Schlüsseloch Napfschnecken Hämocyanin" (keyhole limpet haemocyanin), bovines Serumalbumin, bovines Thyreoglobulin und "gereinigtes Proteinderivat des Tuberculin" (purified protein derivative of tuberculin). Zum Beispiel kann das "Schlüsseloch Napfschnecken Hämocyanin" (keyhole lipet haemocyanin (KLH)) mit einem Cystein haltigen Peptid über eine Cysteinthiolgruppe des Peptids unter Verwendung eines bifunktionellen Vernetzters, zum Beispiel ein Maleimidreagens, zum Beispiel Sulfosuccinimidyl-N-maleimidomethyl-cyclohexan-1- carboxylat, (siehe E. Isikawa et al J. Immunassay 1983, 4, 209) verbunden werden. Das resultierende Konjugat kann mittels Gelfiltrationschromatographie gereinigt und lyophilisiert werden.
Ein Peptid, das keine innere Thiolgruppe hat, kann einen Cysteinrest, der am N-Ende oder am C-Ende eingeführt ist, haben. Ein Konjugat kann verwendet werden, um eine Festphase zu beschichten, zum Beispiel die Vertiefungen einer Kunststoff-Mikrotiterplatte.
Faktor βXIIa kann mittels eines Verfahrens hergestellt werden, das zuerst die Isolierung des Faktors XII aus frischen oder frisch gefrorenem Plasma umfaßt, zum Beispiel unter Verwendung einer Kombination aus einer Ammoniumsulfatausfällung und einer Anionenaustauschchromatographie, zum Beispiel gemäß dem Verfahren, das von K. Fujikawa und E.W. Davie beschrieben wurde (Methods in Enzymol, 1981, 80, 198-211). Verfahren zur Umwandlung von Faktor XII zu Faktor βXIIa und zur Isolierung von Faktor βXIIa aus der erhaltenen Mischung werden bei K. Fujikawa und B. A. McMullen (Journal of Biol. Chem., 1983, 258, 10924-10933) und B. A. McMullen und K. Fujidawa (Journal of Biol. Chem. 1985, 260, 5328) beschrieben. Um den Faktor βXIIa zu erhalten, wird der Faktor XII im allgemeinen einem begrenztem Schneiden unterworfen, zum Beispiel mittels chemischem oder enzymatischem Aufschluß, zum Beispiel unter Verwendung von Trypsin oder einem Trypsin ähnlichem Enzym, im allgemeinen in einer hoch verdünnten Form, zum Beispiel in einem molaren Verhältnis von Trypsin : Faktor XII von 1:500, zum Beispiel in einem Gewichtsverhältnis von Trypsin : Faktor XII von 1:75 und die Schneideprodukte werden im allgemeinen mittels Chromatographie getrennt.
Einige Zubereitungen vom Faktor XII enthalten eine beträchtliche Menge an αXIIa, wie nach einer Untersuchung einer reduzierten Probe an SDS-PAGE geschlossen wird, wenn drei Proteinbanden mit offensichtlichen Molekulargewichten von 80, 52 und 28-kD beobachtet werden. Derartige Faktor XII Zubereitungen zeigen auch amidolytische Aktivität. Gemäß Fujikawa & Davie können die Faktoren XII und αXIIa unter Verwendung einer Benzamidinagarosesäulen- Chromatographie getrennt werden. Bei der Eluation werden zwei Peaks beobachtet, beide von ihnen haben eine Gerinnungsaktivität. Jedoch hat nur der zweite Peak amidolytische Aktivität. Vorausgesetzt, daß das Material auf die Benzamidinagarosesäule aufgetragen wird, die kein βXIIa enthält, was über eine Analyse von nicht reduziertem SDS-PAGE Gel festgestellt wird, dann ist der zweite Peak αXIIa. Dies kann durch die Ausführung von reduzierten und nicht reduzierten Proben an SDS-PAGE bestätigt werden.
Ein Antigenfragment des βXIIa kann mittels des Abbaus von βXIIa mittels enzymatischen oder chemischen Mitteln hergestellt werden. Zum Beispiel können die Disulfid verbundenen Leichtkettenpeptide des βXIIa mittels Reduktion und Carboxymethylierung von βXIIa und Isolierung des Fragments mittels Chromatographie (K. Fujikawa und B. A. McMullen Journal of Biol. Chem. 1983, 258, 10924) gewonnen werden.
Alternativ kann ein Antigenfragment des βXIIa, wenn seine Aminosäuresequenz bekannt ist, synthetisch hergestellt werden, wie das βXIIa selbst. Jedes der vielen bekannten chemischen Verfahren zur Peptidsynthese kann verwendet werden, insbesondere solche, die automatische Apparate verwenden.
Ein Antigenfragment des βXIIa kann unter Verwendung der DNS Rekombinationstechnik, wie βXIIa selbst, hergestellt werden. (Cool et al, 1985 und 1987, loc.cit. haben einen Humanblutkoagulationsfaktor XII cDNS und Gen charakterisiert.) Dies kann, zum Beispiel durch die Bildung eines Gens erreicht werden, zum Beispiel mittels chemischer Synthese oder mittels reverser Transkription aus der korrespondierenden m-RNS, Einbau des Gens in einen geeigneten Vektor, zum Beispiel ein Plasmid, zum Beispiel pBR 322, Einbau des Vektors in einen Wirtsorganismus, zum Beispiel E. Coli, und einer Genexpression in dem Wirtsorganismus. Diese Verfahren sind heute Routine, insbesondere wie Vektoren, zum Beispiel PBR 322 ist ein Beispiele, PBR 322 sind käuflich erhältlich. Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 ist ein Standardwerk, das Einzelheiten dieser Techniken, die auf diesem Gebiet verwendet werden, beschreibt. Im allgemeinen ist die chemische Synthese für kleinere Peptide bevorzugt, jedoch wird die mit rekombinanter DNS finanziell attraktiver für große Peptide als die chemische Synthese.
Wenn nicht anders beschrieben, schließen die Ausdrücke "Faktor βXIIa" und "βXIIa", wie hierin benützt, Antigenfragmente des βXIIa Moleküls ein.
Faktor βXIIa kann verwendet werden, um monoklonale Antikörper oder polyklonale Antisera herzustellen und diese Antikörper und Anisera sind Teil der vorliegenden Erfindung. Wie oben angezeigt, ist ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper in der Lage an den Faktor βXIIa und an den Faktor αXIIa zu binden und keine signifikante Bindung an den Faktor XII zu zeigen, der in der Lage ist zwischen Faktor XIIa und Faktor XII zu unterscheiden.
Der Ausdruck "Antikörper", wie er hierin verwendet wird, schließt jedes Antikörperfragment, das in der Lage ist an ein Antigen zu binden, ein, zum Beispiel Fab und F(ab')&sub2; Fragmente.
Wie oben ausgeführt, zeigt ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper im wesentlichen keine Bindung an Faktor XII. Für die Verwendung in Immunassays für diagnostische Zwecke sollte die korrekte Kreuzreaktivität mit dem Faktor XII (siehe unten) im allgemeinen 0,1 % oder weniger betragen. Für andere Zwecke, zum Beispiel für den Gebrauch als Immunabsorbens, kann eine höhere Kreuzreaktivität annehmbar sein. Ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper hat vorzugsweise eine Affinität für den Faktor βXIIa von zumindest 10¹&sup0;M&supmin;¹.
Ein Faktor, der bei der Beurteilung der Kreuzreaktivität eines erfindungsgemäßen Antikörpers mit dem Faktor XII in Betracht zu ziehen ist, ist, daß selbst "reine" Faktor XII Zubereitungen fast unvermeidlich mit geringen Mengen an XIIa verunreinigt sind (Silverberg und Kaplan, Blood 60, 1982, 64- 70). Die geringen Mengen an XIIa, die anwesend sind, sind unter den meisten Umständen nicht signifikant, aber bei der Beurteilung der Kreuzreaktivität ist es notwendig so genau wie möglich die Menge an XIIa in einer Faktor XII Zubereitung zu bestimmen und dann diese in Betracht zu ziehen, um die korrekte Kreuzreaktion besser als die anfänglich gemessene, offensichtliche Kreuzreaktion zu bestimmen.
Es ist gefunden worden, zum Beispiel, daß Faktor XII Zubereitungen ungefähr von 0,5 % bis 0,8 % XIIa enthalten können. Bei in Betracht ziehen dieses Wertes, wird eine offensichtliche Kreuzreaktion mit dem Faktor XII von 0,5 % zu einer korrigierten Kreuzreaktion von weniger als 0,1 %. Wenn nicht anders festgelegt, wird der Ausdruck "Kreuzreaktion" hierin verwendet, um die korrigierte Kreuzreaktion zu bezeichnen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Hybridomzellinie zur Verfügung, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper bildet und auch Reklone von derartigen Hyridomen.
Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers zur Verfügung, das die Kultivierung einer Hybridomzellinie umfaßt, die in der Lage ist einen Antikörper in einem Wachstumsmedium zu bilden und den Antikörper aus dem Wachstumsmedium zu gewinnen.
Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren ein Verfahren zur Bildung einer Hybridomzellinie zur Verfügung, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper bildet, das die Verabreichung eines Antigens an ein Tier umfaßt, um Antikörper herstellende Zellen zu erhalten, sowie die Fusion der resultierenden Antikörper herstellenden Zellen mit Myelomzellen und des Screenings der resultierenden Hybridome für die Bildung des monoklonalen Antikörpers, worin das Antigen Faktor βXIIa oder sein Antigenfragment ist.
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind bekannt, siehe zum Beispiel Methods in Enzymology, H. Van Vunikis und J. J. Longone (Herausgeber) 1981, 72(B) und ibidem 1983 92 (E).
Monoklonalen Antikörper können hergestellt werden, zum Beispiel mittels einer Modifikation des Verfahrens von Kohler und Milstein (G. Kohler und C. Milstein, Nature, 1975, 256, 495): Weibliche Balb/C oder C57/B10 Mäuse werden mittels intraperitonealer Injektion von βXIIa oder einem Antigenfragment von βXIIa, zum Beispiel von 10 bis 30 ug, im allgemeinen 20 ug von βXIIa oder einer korrespondierenden Menge von dem anderen Antigen immunisiert. Das βXIIa oder ein anderes Antigen wird vorzugsweise zu einem anderen Proteinmolekul konjugiert, zum Beispiel zu einem bovinen Thyreoglobulin oder "gereinigtem Proteinderivat des Tuberculin" (purified protein derivative of tuberculin). Die Konjugation kann ausgeführt werden, zum Beispiel mittels eines Carbodiimidsverfahrens oder unter Verwendung eines heterobifunktionellen Reagens. Das Immunogen ist im allgemeinen in einem Adjuvans, vorzugsweise im vollständigen Freunds Adjuvans. Dieses Verfahren wird im allgemeinen in Intervallen wiederholt, im allgemeinen unter Verwendung desselben Immunogens in derselben Dosis, zum Beispiel werden in dreiwöchigen Intervallen die Mäuse mit 20 ug des konjugierten βXIIa im vollständigen Freunds Adjuvans aufgefrischt bis geeignete Antwortspiegel beobachtet werden. Eine Präfusions-Auffrischung wird vor der Tötung vorgenommen, zum Beispiel intravenös 3 Tage vor der Tötung. Die Antikörperantwort wird überwacht, zum Beispiel mittels RIA Antiserums-Kurven-Analyse unter Verwendung von ¹²&sup5;I-radioaktiv markiertem βXIIa oder einem anderen βXIIa-Antigen, das durch das Chloramin-T-Verfahren hergestellt wird (P.J. McConahey und F.J. Dixon, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1966, 29, 185). Reinheit ist sicherzustellen, zum Beispiel unter Verwendung von Autoradiographie, zum Beispiel von SDS-PAGE Gelen, die unter reduzierten Bedingungen laufen.
Immune Mausmilzzellen werden dann mit Myelomazellen fusioniert, zum Beispiel NSO Mausmyelomazellen, zum Beispiel in der Gegenwart von 40-50 % PEG 4000 oder 50 % PEG 1500. Die Zellen werden dann in Vertiefungen von Kulturplatten eingebracht und auf einem Selektivnährboden gezüchtet. Die Überstände werden auf Reaktivität gegen gereinigtes βXIIa oder ein anderes βXIIa Antigen getestet, zum Beispiel mittels eines Festphasen-Iummunassays, zum Beispiel unter Verwendung von Peroxidase markiertem IgG. Alle Vertiefungen, die eine Spezifität für βXIIa zeigen, werden im allgemeinen für ein weiteres zweites Screening genommen. Das zweite Screnning besteht, zum Beispiel aus einem Screening aller spezifischen Antikörper zum Binden in einer Lösung an βXIIa oder an ein βXIIa Antigenfragment, das radioaktiv markiert worden ist. Diese werden vorzugsweise titriert, um die Antikörperverdünnung zu bestimmen, die für 50 % B max erfoderlich ist. Die Dosisantwort geht gegen nicht aktives, das heißt nicht markiertes, βXIIa oder das korrespondierende nicht aktive Antigenfragment, und sie wird auch gegen den Faktor XII, Plasmin und Firbronectin vozugsweise gebildet. Der Grad der Kreuzreaktion kann gemäß der folgenden Formel I bestimmt werden:
Gewicht des aktivitätsfreien Standards βXIIa, um 50 % B max zu erhalten, dividiert durch das Gewicht des Kreuzreaktanten, um 50 % B max zu erhalten und diese Ergebnis multipliziert mit 100.
(Falls ein Antigenfragment anstelle von βXIIa verwendet worden ist, sollte dies in der obigen Formel ausgetauscht werden.)
Die Antikörper, die eine vorherbestimmte offensichtliche Kreuzreaktivität zum Faktor XII, vorzugsweise von 1,5 % oder weniger und bevorzugter von 1 % oder weniger zeigen, werden weiterverwendet. Eine Scatchard Analyse kann an den Dosisantwortdaten durchgeführt werden, um Werte für die Affinitätskonstanten für jeden Antikörper zu erhalten. Die Affinitätskonstanten von zumindest 10¹&sup0;M&supmin;¹ haben, werden im allgemeinen für das Klonieren weiterverwendet. Erfolgreiche Klone werden generell isotypisiert. Die Zellen werden dann vozugsweise mittels Grenzverdünnungen subkloniert und wieder gescreent, im allgemeinen unter Verwendung eines Enzymimmunassays, für die Herstellung von Antikörpern gegen βXIIa. Ein ausgewählter Subklon aus jeder Klonierung kann auch unter Verwendung eines Radioimmunassays, was die Spezifität und Dosisantwort anbelangt, beurteilt werden.
Ein weiteres Screeningverfahren, kann unter Verwendung eines αXIIa als Antigen, an einer geeigneten Stelle eingefügt werden, um die Bindungscharakteristika eines Antikörpers zu bestätigen, der von einem ausgewählten Klon hergestellt worden ist. Für ein derartiges Screening kann hier eine αXIIa Zubereitung verwendet werden, die gemäß dem Verfahren von Fujikawa & Davie (siehe oben) erhalten wird. Falls jedoch das αXIIa Screening nach dem βXIIa Screening durchgeführt wird, ist es nicht im allgemeinen notwendig eine αXIIa enthaltende Faktor XII Zubereitung der beschriebenen Benzamidinagarose- Chromatography zu unterwerfen. Es ist im allgemeinen ausreichend sicherzustellen, daß die Zubereitung frei von βXIIa ist. Wie oben aufgezeigt, ist es im allgemeinen vorzuziehen, einen Flüssigphasenassay zu verwenden als einen Festphasenassay, zum Beispiel einen Assay, der die Verdrängung von αXIIa durch radioaktiv markiertes βXIIa vom Antikörper einschließt.
Subklonierte Hybridomzellen können intraperitoneal in Balb/C Mäuse für die Bildung von aszitischer Flüssigkeit injiziert werden. Das Immunglobulin kann aus der aszitischen Flüssigkeit ausgefällt werden, zum Beispiel bei 4ºC unter Verwendung von gesättigter Ammoniumsulphatlösung (gleiches Volumen). Die Fällung wird vorzugsweise gereinigt, zum Beispiel kann sie zentrifugiert werden, gelöst werden, zum Beispiel in 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5 (gleiches Volumen wie das urspüngliche aszitische Volumen) und dann gegen den gleichen Puffer dialysiert werden. Die Immunglobulinfraktion kann dann weiter mittels Anionenaustausch-Chromatographie gereinigt werden, zum Beispiel kann die Proteinlösung auf eine Mono-Q Anionenaustauschsäule (Pharmacia) aufgebracht werden und unter Verwendung eines Salzgradienten in dem gleichen Puffer, gemäß den Empfehlungen des Herstellers, eluiert werden. Die Fraktionen, die Immunglobulin enthalten, werden im allgemeinen Vereinigt und bei -20ºC zur Lagerung eingefroren.
Alternativ können die Hybridomzellen in Kulturen für die Antikörperherstellung gezüchtet werden und der Antikörper wird im wesentlichen, wie oben beschrieben für die aszitische Flüssigkeit, isoliert.
Obwohl die hier beschriebenen Hybridome von Mausmilz-Zellen stammen, ist die Erfindung nicht auf Hybridome von Murin- oder Teilmurinursprung beschränkt. Beide Fusionspartner (Milzzellen und Myelome) können von geeigneten Tieren erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung kann auch die Verwendung von einem polyklonalen Antiserum betreffen, das an XIIa bindet.
Verfahren, die verwendet werden, um polyklonale Antikörper herzustellen, sind bekannt, siehe zum Beispiel "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijessen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, R. H. Burdon und P.H. Van Knippenberg (Herausgeber), Elsevier, 1985 und Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, T. Chard, ibiidem, 3. Auflage, 1987. Polyklonale Antisera können, zum Beispiel im Schaf oder Kanninchen unter Verwendung von Faktor βXIIa hergestellt werden, zum Beispiel konjugiert an ein anderes Protein oder einen Faktor XII als Antigen.
Wie oben ausgeführt, stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Ermitteln und/oder Bestimmen des Faktors XIIa in einer Probe zur Verfügung, das die Unterwerfung der Probe unter einen qualitativen oder quantitativen Immunassay umfaßt, der eine Wechselwirkung zwischen einem Antigen und einem Antikörper und die Ermittlung und/oder Bestimmung eines resultierenden Antikörper-Antigen-Komplexes umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikörper um einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper handelt.
Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren ein Verfahren zur Durchführung eines Immunassays für ein Antigen in einer Fluidprobe zur Verfügung, wobei der Assay eine Wechselwirkung zwischen dem Antigen und einem Antikörper, der an dieses bindet, umfaßt und auch die Bestimmung der Menge des in der Probe enthaltenen Antigens umfaßt, unter Bezugnahme auf Ergebnisse, die unter Verwendung einer vorbestimmten Mengen eines bekannten Antigens erhalten worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikörper um einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper handelt und das bekannte Antigen Faktor βXIIa ist.
Verfahren zur Durchführung von Immunassays sind bekannt, zum Beispiel Methods in Enzymology, H. Van Vunakis und J. J. Langone (Herausgeber), 1981, 72(B); Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P. Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, R. J. Burdon und P.H. Van Knippenberg (Herausgeber), Elsevier, 1985; Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, T. Chard, ibidem, 3. Auflage, 1987; und Methods in Enzymology, H. Van Vunakis und J. J. Langone (Herausgeber) 1981, 74(C).
Wie oben ausgeführt, sind Immunassaytechniken sowohl qualitative wie quantitative bekannt und schließen ELISA (enzyme linked immunosorbent assays), Western blotting, Flüssigphasen-Fällungsassays, beschichtete Partikelassays, Kompetitivassays, Sandwichassays, einschließlich Forward-, Reverse- und Simultansandwichassays sowie Festphasenradioimmunassays [(SPRIA) = solid phase radio immunoassay)] ein.
Von diesen können ELISA und SPIRA besonders in dem vorliegenden Fall geeignet sein. Dementsprechend können Proben eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers an einen Festphasenträger absorbiert sein, zum Beispiel einem Kunststoff oder anderem polymeren Material, zum Beispiel den Vertiefungen aus Kunststoff-Mikrotiterplatten, Plasmaproben, die untersucht werden oder eine Standardlösung werden in Kontakt mit der Antikörperreagens inkubiert und jeder resultierende gebundene Faktor XIIa, der unter Verwendung eines markierten Antikörpers ermittelt wird, ist in der Lage an den gebundenen Faktor oder den Standard zu binden, zum Beispiel an ein anderes Epitop des Moleküls zu binden. Der markierte Antikörper kann polyklonal oder monoklonal sein. Ein geeignetes Radioisotop kann als Markierung verwendet werden, zum Beispiel ein β-Strahler oder ein α-Strahler, Beispiele sind ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³H und ¹&sup4;C. Eine Enzymmarkierung ist, zum Beispiel alkalische Phosphatase, unter Verwendung von Phenolphthaleinmonophosphat als Substrat. Eine enzymatische Reaktion kann von der Verwendung eines elektrochemischen Verfahrens gefolgt sein. Als eine Alternative für die Verwendung eines markierten Anti-Antikörpers, können gebundene XIIa oder βXIIa direkt unter Verwendung eines chromogenen Substrats bestimmt werden.
Anstatt einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper auf einem Festträger zu adsorbieren, kann βXIIa selbst oder ein Antigenfragment davon zur Verwendung in einem Kompetitivassay gebunden werden. Eine weitere Alternative ist es markierte, zum Beispiel radioaktiv markierte βXIIa oder ein Antigenfragment davon in einem Kompetitivassay zu verwenden.
Ein Beispiel für einen Radioimmunassay zur erfindungsgemäßen Verwendung ist folgender: Eine Dosisantwortkurve unter Verwendung eines monoklonalen Antikörper ¹²&sup5;I-markierten βXIIa, βXIIa-Standardlösungen und Antimaus IgG, verbunden mit einem Festträger, zum Beispiel Sephacryl S-1000 kann gemäß des folgenden Verfahrens veranschaulicht werden. Monoklonale Antikörper enthaltende aszitische Flüssigkeit wird mit Assaypuffer verdünnt, zum Beispiel einem Puffer umfaßend 50 mM Tris-HCl pH 7,4, der 0,15 mM NaCl, 0,25% BSA, 10mM EDTA, 3mM NaN und 0,1% Triton. In Doppelassayröhrchen wird eine Probe von jeder monoklonalen Antikörperlösung hinzugefügt, eine ¹²&sup5;I-radioaktiv markierte βXIIa Lösung und eine gereinigte βXIIa Standardlösung in Assaypuffer. Die Standardlösungen werden aus einer βXIIa Vorratslösung hergestellt. Kontrollröhrchen, die die Gesamtzerfälle ergeben, werden unter Verwendung von Assaypuffer und einer Markierungslösung hergestellt. Alle Röhrchen werden gemischt und dann inkubiert. Danach wurde eine Probe einer Suspension, die eine optimale Menge an Antimaus IgG, das mit einem Festträger verbunden ist, zu jedem Röhrchen (ausgenommen die Gesamten) hinzugefügt und die Röhrchen werden dann unter Schütteln inkubiert. Nach diesem Schritt wird vorzugsweise Sucrosepuffer (Assaypuffer + 10% Gew./Gew. Sucrose) unter das Reaktionsgemisch in jedem Röhrchen (ausgenommen die Gesamten) geschichtet, zum Beispiel unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe. Dem an einen Festträger gebundene Antimaus IgG wird es erlaubt zu sedimentieren, nachdem die Flüssigkeit aus jedem Röhrchen entfernt worden ist. Alle Röhrchen, einschließlich der Gesamten werden dann gezählt. Die gebundenen % können berechnet werden, indem die Zerfälle, die für jeden βXIIa Standard erhalten weren, durch die Gesamtzerfälle dividiert werden. Die Gesamtzerfälle zusammengezählt betragen, zum Beispiel 10 000 cpm (pro Minute registrierte Zerfälle). In dem obigen Radioimmunassay kann ein Antigenfragment von βXIIa durch βXIIa ersetzt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren einen Kit für die Durchführung eines erfindungsgemäßen Immunassays zur Verfügung, wobei der Kit, jeweils in einem getrennten Container oder in anderen Weise getrennt, umfaßt:
Einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und Faktor βXIIa oder sein Antigenfragment. Der Kit kann weitere Komponenten zur Durchführung des Immunassays umfassen, zum Beispiel wie oben beschrieben. Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann nicht markiert oder markiert sein. Er kann auf einem Festträger immobilisiert sein.
Ein erfindungsgemäßer Kit kann, zum Beispiel umfassen,
a) (i) einen erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper oder
(ii) einen Faktor βXIIa oder ein Antigenfragment davon oder
(iii) einen Antikörper, der gegen einen erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet ist;
b) (i) einen markierter Antikörper, der in der Lage ist, direkt oder indirekt mit dem Faktor βXIIa zu reagieren oder
(ii) einen markierter Faktor βXIIa oder
(iii) ein chromogenes Substrat für Faktor βXIIa und
(c) ein Kontrollreagenz, das gereinigter Faktor βXIIa oder ein Antigenfragment davon ist.
Eine Komponente a) (i) , a) (ii) oder a) (iii) kann, wenn es gewünscht wird, an einen festen Träger gebunden werden.
Ein Kit kann auch weitere Komponenten umfassen, jede in einem getrennten Behälter, zum Beispiel, eine Waschreagenslösung und eine Substratlösung.
Polyklonales Antiserum oder insbesondere ein erfindungsgemäßer monklonaler Antikörper können in der Affinitätschromatographie als Immunsorbenz bei der Reinigung des Faktor βXIIa oder eines Antigenfragments davon verwendet werden und die vorliegende Erfindung stellt ein Immunsorbens zur Verfügung, das einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper umfaßt, der im allgemeinen auf einen festen Träger absorbiert wird oder in anderer Weise von einem festen Träger in einer üblichen Weise (siehe unten) getragen wird, und sich auf ein Verfahren zur Reinigung des Faktors βXIIa oder eines Antigenfragments davon, unter Verwendung eines getragenen Antikörpers (Immunsorbens), bezieht. Der gereinigte Faktor βXIIa oder ein Antigenfragment können als Kontrollreagens in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Bestimmen des Faktor βXIIa verwendet werden. Umgekehrt bezieht sich die Erfindung auch auf ein Immunsorbens, das den Faktor βXIIa oder sein Antigenfragment umfaßt, das im allgemeinen auf einem festen Träger absorbiert wird oder in anderer Weise von einem festen Träger in üblicher Weise getragen wird (siehe unten).
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Screening und/oder ein Verfahren zur Reinigung von Anti-Faktor βXIIa Antikörpern und Antiserum, unter Verwendung von einem getragenen Antigen zur Verfügung (Immunsorbens). Es ist vorteilhaft monoklonale Anitkörper auf Spezifität und/oder Affinität für βXIIa, unter Verwendung von einem Antigenfragment des βXIIa, vorzugsweise in der Form eines Immunsorbens, wie oben beschrieben, zu screenen. Falls gewünscht, kann ein weiteres Screening und/oder Reinigen unter Verwendung von Faktor αXIIa oder einem Antigenfragment davon, das auf einem festen Träger als ein Immunsorbens immobilisiert ist, durchgeführt werden.
Polyklonale Antikörper können gereinigt werden, insbesondere um den Gehalt an Anti-Faktor βXIIa Antikörpern zu erhöhen, zum Beispiel indem die polyklonalen Antikörper mit Faktor βXIIa oder einem Antigenfragment davon in Kontakt gebracht werden. Die polyklonalen Antikörper werden vorzugsweise mit einem Antigenfragment von βXIIa, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, in Kontakt gebracht, und die resultierenden gebundenen Antikörper werden freigesetzt. Die Spezifitäts- und Affinitätseigenschaften einer rohen polyklonalen Antikörperzubereitung können im wesentlichen durch ein derartiges Verfahren verbessert werden, so daß die resultierenden polyklonalen Antikörper geeigneter für die Verwendung in einem kommerziellen Assay gemacht werden.
Ein monoklonaler Maus-Antikörper, der an βXIIa bindet, kann kovalent mit CNBr-aktivierter Sepharose-4B (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers verbunden werden. Eine derartige Säule kann verwendet werden, um ein βXIIa Antigen, zum Beispiel um βXIIa aus Plasma oder βXIIa oder ein Antigenfragment davon aus einem Aufschluß des Faktors XII, wie es geeignet ist, zu isolieren. Gebundenes βXIIa Antigen kann aus einer Säule, zum Beispiel unter Verwendung von 4M Guanidin eluiert werden und das Antigen kann in dem Ablauf nachgewiesen werden, zum Beispiel kann βXIIa in den Ablauffraktionen mittels enzymatischer Aktivität unter Verwendung von S-2302 Peptidsubstrats (Kabi) oder unter Verwendung von ¹²&sup5;I markiertem βXIIa nachgewiesen werden.
Ein βXIIa Antigen, wie oben beschrieben, das heißt βXIIa selbst oder ein Antigenfragment davon kann, zum Beispiel mit einer mit Thiol aktivierten Sepharose (Pharmacia) über eine oder mehrere Thiolgruppen auf intrinsischen oder eingeführten Cysteinresten, gemäß den Anweisungen des Herstellers, verbunden werden. Faktor αXIIa oder ein Antigenfragment davon können analog verbunden werden.
Wie oben ausgeführt, scheint eine Enzym/Substratbeziehung zwischen Faktor XIIa, zum Beispiel Faktor βXIIa, Aktivität und Faktor VII Aktivität zu bestehen, was darauf hindeutet, daß Faktor XIIa, zum Beispiel Faktor βXIIa, Aktivität an Stelle von Faktor VII Aktivität als ein Indikator für das Herzerkrankungsrisiko, insbesondere ischämische Herzkrankheit (IHD) und akuter Myokardinfarkt (AMI) verwendet werden kann.
Die Ergebnisse der Untersuchungen beim Umsatz von ¹²&sup5;I markiertem Faktor XII, der an Kanninchen in normaler oder Cholesterin ergänzter Nahrung verfüttert wurde, deuten darauf hin, daß, obwohl es eine geringe Änderung in der Halbwertszeit und der Poolgröße des Faktors XII in den extravaskulären oder intravaskulären Kompartimenten gibt und obwohl es eine geringere Änderung in der fraktionalen katabolischen Rate gibt, die absolute katabolische Rate bei den Kanninchen, die mit einer Cholesterin ergänzten Nahrung gefüttert wurden, größer ist als bei den Kanninchen, die mit der Standardnahrung gefütter wurden. Kanninchen haben einen viel geringere Kallikreinspiegel als ein Mensch, so daß erwartet wird, daß ein Anstieg bei der katabolischen Rate des Faktors XII würde beim Menschen sogar unter korrespondierenden Umständen stärker zum Ausdruck gebracht werden. Die Bedeutung der erhöhten katabolischen Rate des Faktors XII ist die Wirkung, die sie auf die Faktor VII Aktivität haben wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß Faktor XIIa, zum Beispiel Faktor βXIIa als Indikator für das Risiko des AMI geeignet sind.
Demgemäß wird vorgeschlagen, daß die Daten, die aus einem erfindungsgemäßen Immunassay resultieren, an einer Plasmaprobe durchgeführt werden, die von einer Versuchsperson erhalten wurden, nützlich sein werden, das Risiko einer Herzerkrankung dieser Versuchsperson vorherzusagen, insbesondere ischämische Herzkrankheit und/oder akuter Myokardinfarkt. Eine Korrelation zwischen den Ergebnissen, die für einen Einzelnen erhalten werden und dem Risiko einer Herzerkrankung, zum Beispiel ischämische Herzkrankheit und insbesondere dem akuten Myokardinfarkt, für diesen Einzelnen können durch das Studium dieser Parameter an einer Anzahl von Individuen gemacht werden, vozugsweise einschließlich von Individuen, die auf der Basis von anderen Kriterien als gefährdet angesehen werden und von Individuen die als nicht gefährdet angesehen werden. Je größer die untersuchte Population, um so größer wird die Genauigkeit der Korrelation sein. Die Gestaltung und Durchführung derartiger epidemiologischer Untersuchungen ist bekannt, siehe zum Beispiel die Northwick Park Hospital und Framingham Studies, auf die oben Bezug genommen wird. Die Bewertung des Risikos einer Herzerkrankung des Einzelnen, zum Beispiel AMI, kann durch Vergleich der Daten, die für diesen Einzelnen bestimmt wurden, mit denen, die in epidemiologischen Studien bestimmt wurden, zum Beispiel wie oben beschrieben, gemacht werden.
Das Verfahren und andere erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind auch nützlich bei Untersuchungen der Mechanismen, die bei der Blutkoagualtion und bei der Untersuchung der thrombotischen Störung eine Rolle spielen.
Die folgenden Beispiele 2, 3, 5 bis 7 und 9 veranschaulichen die Erfindung, beabsichtigen aber nicht die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.

Beispiel 1

Isolierung und Reinigung der Faktoren XII und βXIIa.

Die Isolierung von Faktor XII aus frischem oder gefrorenem Humanplasma wurde unter Verwendung einer Kombination aus gefälltem Ammoniumsulfat und Anionenaustausch-Chromatographie, insbesondere wie bei K. Fujikawa und E. W. Davies, Methods Enzymol, 1981, 80, 198 beschrieben, durchgeführt. Aus 6,5 Liter an Plasma betrug die Ausbeute an Faktor XII 53 mg.
Die Zubereitung des Faktors βXIIa aus Faktor XII durch tryptischen Aufschluß wurde unter Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens von B. A. McMullen und K. Fujikawa JBC, 1985, 260, 5328 und nach K. Fujikawa und B. A. Mc Mullen JBC, 1983, 258, 10924) (JBC ist Journal of Biological Chemistry) durchgeführt.
Die 53 mg des Faktors XII wurden gegen 8 Liter an 50 mM Tris/75mM NaCl, pH 8,0 bei 4ºC über Nacht dialysiert. Die Proteinlösung wurde auf 37ºC erwärmt, 0,7 mg Trypsin wurden hinzugefügt und bei 37ºC 15 Minuten lang äquilibriert. 1,4 mg Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI) wurden hinzugefügt, um den Aufschluß zu stoppen und die Lösung wurde bei 37ºC weiter 15 Minuten gehalten. Der βXIIa wurde sofort von den anderen Komponenten unter Verwendung von DEAE Sephacel abgetrennt.
Die Säule wurde mit Tris/75 mM NaCl pH 8,0 gewaschen bis gewisses Protein heraus gewaschen war und dann wurde ein Gradient unter Verwendung von 50 mM Tris/75mM Nacl T 50mM Tris/500mM NaCI pH 8,0 gestartet. Zwei Proteinpeaks werden während des Gradienten eluiert. βXIIa hat im Gegensatz zu Faktor XII keine Gerinnungsaktivität. Die Aktivität des Produkts im Eluat wurde unter Verwendung des synthetischen Substrats S-2302 (Kabivitrum) und der Änderungsrate der Extinktion bei 405 nm gemessen. βXIIa erscheint im zweiten Peak. 14 mg an βXIIa wurden erhalten (70% des Faktors XII).
Figur 1 der anliegenden Zeichnungen ist eine graphische Darstellung der Extinktion bei 280 nm gegen die Zeit für das Eluat der DEAE-Sephacelsäule und zeigt βXIIa in dem zweiten Peak.
Die Reinheit wurde mittels SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen, gemäß dem Verfahren von Laemmli. (V.K. Laemmli, Nature, 1970, 227, 680), bestätigt. Die Acrylamidkonzentration betrug in dem Sammelgel (spacer gel) 3% und 10 % im Trenngel. Proteinbanden wurden mit Coomassie-Blaufärbung nachgewiesen. Die Figuren 2a und 2b der anliegenden Zeichnungen zeigen SDS-PAGE-Gele für XII, beziehungsweise βXIIa. E&sub2;&sub8;&sub0;1% = 1,42 in Figur 2a und E&sub2;&sub8;&sub0;1% = 1,52 in Figur 2b. Bahn 1 von beiden Gelen besteht aus Banden, die durch Molekulargewichtsstandards, wie folgt, gebildet werden: 20100; 24000; 29000; 36000; 45000 und 66000. Die Bahnen 1, 2 und 3 der Figur 2a zeigen die Banden, die aus drei Fraktionen aus dem Faktor XII Peak auf S-Sepharose- Chromatographie (die anstelle von der bei Fujikawa beschrieben CM-Zellulosechromatographie verwendet wurde) erhalten wurden. Die Bahnen 2 bis 7 in Figur 2b zeigen die Banden, die für die Fraktionen 32 bis 27, beziehungsweise das Eluat der DEAE- Sephacel-Chromatographie, erhalten wurden.

Beispiel 2

(a) Herstellung der Murin spezifischen monoklonalen Antikörper

Murine monoklonale Antikörper auf Human-βXIIa wurden durch Modifikation des Verfahrens von Kohler und Milstein (G. Kohler und C. Milstein, Nature, 1975, 256, 495) hergestellt.
Weibliche Balb/C Mäuse wurden mittels intraperitonealer Injektion von 20 ug an βXIIa, das an a) bovines Thyreoglobulin oder b) gereinigtem Proteinderivat des Tuberkulin (purified protein derivative of tuberculin) konjugiert ist, immunisiert. Die Konjugation wurde entweder mittels eines Carbodimidsverfahrens oder unter Verwendung von heterobifunktionellen Reagens durchgeführt. Das Immunogen war im vollständigen Freunds Adjuvans anwesend. In dreiwöchigen Intervallen wurden die Mäuse mit 20 ug des konjugierten βXIIa im vollständigen Freunds Adjuvans aufgefrischt. Eine Präfusionierungsauffrischung wurde intravenös 3 Tage vor ihrer Tötung gegeben.
Die Antikörperantwort wurde mittels RIA Antiserumkurvenanalyse unter Verwendung von ¹²&sup5;I-radioaktiv markiertem βXIIa, das über das Chloramin-T-Verfahren (P.J. McConahey und F.J. Dixon, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol, 1966, 29, 185) hergestellt wurde, überwacht. Die Reinheit wurde unter Verwendung von Autoradiography von SDS-PAGE-Gelen, die unter reduzierten Bedingungen liefen, bestätigt. Immunmaus-Milzzellen wurden mit NSO-Mausmyelomzellen in der Gegenwart von 40-50% PEG 4000 fusioniert. Die Zellen wurden dann in Vertiefungen von Kulturplatten eingebracht und auf einem selektiven Medium gezüchtet. Die Überstände wurden auf Reaktivität gegenüber gereinigtem βXIIa mittels eines Festphasenenzym-Immunassays, unter Verwendung von mit Peroxidase markiertem Anti-Maus IgG, getestet. Kurzum, die Vertiefungen einer 96 Vertiefungs- Mikrotiterplatte wurden mit gereinigtem βXIIa (100 ul einer 10 ug/l Lösung in Phosphat gepufferter Salzlösung, PBS) beschichtet und dann unter Verwendung von 2% BSA (bovines Serumalbumin) in PBS blockiert. Die Zellkulturüberstände wurden in die Vertiefungen hinzugefügt und nach einer Inkubation von 1 Stunde bei 37ºC wurden die Vertiefungen 3 Mal gewaschen und mit Peroxidase markiertes Anti-Maus IgG wurde zu einer optimalen Verdünnung hinzugefügt. Nach einer weiteren Inkubation bei 37ºC für 1 Stunde wurden die Vertiefungen wieder gewaschen und 100 ul einer Substratlösung (6 mM H&sub2;O&sub2; und 40 mM o-Phenylendiamin in 0,1 M Citrat pH 5,0) wurden hinzugefügt. Die Farbentwicklung wurde mit 100 ul 3M HCl gestoppt und die Extinktion wurde bei 492 nm gemessen.
Alle Vertiefungen, die eine Spezifität für βXIIa zeigen, wurden für ein zweites Screening genommen. Das zweite Screening bestand in einem Screening aller spezifischen Antikörper auf eine Bindung an radioaktiv markiertem βXIIa in Lösung. Diese wurden titriert, um die Antikörperverdünnung, die für die Erzeugung von 50% B max. notwendig sind, zu bestimmen. Dosisantwortkurven gegen nicht aktiven (nicht markierten) βXIIa, Faktor XII, Plasmin und Fibronectin wurden erzeugt. Das Ausmaß der Kreuzreaktion wurde nach folgender Formel bestimmt:
Gewicht des nicht aktiven Standard βXIIa um 50% B max. zu erhalten, dividiert durch das Gewicht des Kreuzreaktanten, um 50% B max. zu erreichen multipliziert mit 100.
Diese Antikörper, die eine offensichtliche Kreuzreaktivität zu Faktor XII von weniger als 1,5% zeigen, wurden weiterverwendet. Eine Scatchardanalyse der Dosisantwortdaten wurde durchgeführt, um Werte für die Affinitätskonstanten für die Antikörper zu erhalten. Die, die Affinitätskonstanten von zumindest 107 M&supmin;¹ und vorzugsweise von bis zu 10¹&sup0;M&supmin;¹ haben, werden für die Klonierung weiterverwendet. Erfolgreiche Klone werden isotypisiert. Die Zellen werden dann mittels Grenzverdünnung subkloniert und wieder unter Verwendung eines Enzymimmunassays für die Herstellung von Antikörpern gegen βXIIa gescreent. Ein ausgewählter Klon aus jeder Klonierung wurde auch unter Verwendung eines Radioimmunassays, was die Spezifität und die Dosisantwort betrifft, beurteilt. Subklonierte Hybridomzellen, die Antikörper gegen βXIIa aussondern, werden intraperitoneal in Balbc Mäuse für die Herstellung von aszitischer Flüssigkeit injiziert. Sechs klonierte Hybridome, die aszitische Flüssigkeit produzieren, die monoklonale Antikörper gegen βXIIa enthälten, wurden gewonnen.

b) Isolierung der Immunglobulinfraktion aus aszitischer Flüssigkeit

Die Immunglobulinfraktion wurde bei 4ºC aus der aszitischen Flüssigkeit, unter Verwendung von gesättigter Ammoniumsulfatlösung (gleiches Volumen) ausgefällt. Der Niederschlag wurde zentrifugiert, in 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5 (gleiches Volumen zum ursprünglichen aszitischen Volumen) gelöst und dann gegen denselben Puffer dialysiert. Die Proteinlösung wurde dann in eine Mono-Q -Anionenaustauschsäule (Pharmazia) eingebracht und unter Verwendung eines Salzgradienten in dem gleichen Puffer, gemäß den Empfehlungen des Herstellers, eluiert. Die Fraktionen, die Immunglobulin enthalten, wurden vereinigt und bei -210ºC zur Lagerung eingefroren. Die Ausbeute betrug im allgemeinen 1 bis 5 mg gereinigter Antikörper/ml der aszitischen Flüssigkeit.

c) Enzymmarkierung der Antikörper

Gereinigtes Immunglobulin aus aszitischer Flüssigkeit oder polyklonales Antiserum wurde mit alkalischer Phosphatase, unter Verwendung des Thiol-maleimid-Verfahrens (E. Ishikawa et al, J. Immunoassy, 1983, 4, 209), konjugiert. Die erhaltenen Konjugate wurden mittels Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephacryl S-300 (Pharmacia) gereinigt.

Beispiel 3

Herstellung des Affinitätsträgers

Monoklonaler Mausantikörper gegen βXIIa wurde kovalent an CNBr aktivierte Sepharose-4B (Pharmacia), gemäß den Anweisungen des Herstellers, gebunden. 5 bis 10 mg gereinigtes IgG wurde an 1 g nicht gequollenes Gel gebunden. Diese Säule wurde verwendet, um βXIIa aus Plasma aus tryptischen Aufschlüssen aus Faktor XII zu isolieren. 4M Guanidin wurde verwendet, um gebundenes βXIIa aus der Säule zu eluieren und βXIIa wurde in den Ablauffraktionen mittels enzymatischer Aktivität, unter Verwendung von S-2302 Peptidsubstrat (Kabi) oder unter Verwendung von ¹²&sup5;I-markiertem βXIIa, ermittelt.

Beispiel 4

Polykonales Antiserum gegen Faktor XII und βXIIa wurden in Schafen oder Kanninchen mittels Standardverfahren unter Verwendung von nativem Faktor XII und konjugiertem βXIIa gebildet, siehe Methods in Enzymology, H. Van Vunatis und J. J. Langone (Herausgeber) 1981, 72(B) und 1983 92(E).

Beispiel 5

Radioimmunassay für βXIIa

Eine Dosisantwortkurve, die einen monoklonalen Antikörper 202/2.6 verwendet, der gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben wird, wurde erhalten. ¹²&sup5;I-markiertes βXIIa, βXIIa-Standardlösungen und Schaf-Anti-Maus-IgG, das an Sephacryl S-1000 (SAM-Sephacryl) gebunden wurde, wurde gemäß dem folgenden Verfahren veranschaulicht: Monoklonale- Antikörper-202/2.6- aszitische-Flüssigkeit wurde mit Assaypuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, das 0,15 M NaCl, 0,25% BSA, 10 mM EDTA, 3 mM NaN&sub3; und 0,1% Triton enthält) 1:1000 verdünnt. In doppelte 4 ml Volumen Polystyrol-Assayröhrchen wurde hinzugefügt: 50 ul an monoklonaler Antikörperlösung, 50 ul an radioaktiv markierter βXIIa Lösung und 100 ul an reiner βXIIa Standardlösung im Assaypuffer. Die Standardlösungen wurden mittels Verdoppels von Lösungen einer βXIIa Vorratslösung hergestellt. Die Konzentration der Vorratslösung wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:
E¹280 = 15,2 (K.Fujikawa und B.A. McMullen JBC, 280, 1983, 258, 10924).
Kontrollröhrchen, um die Gesamtzerfälle zu erhalten, enthalten 150 ul des Assaypuffers und 50 ul der Markierungslösung. Alle Röhrchen wurden auf einem Vortex gemischt und dann bei 21±1ºC 19 Stunden lang inkubiert. Nach dieser Zeitdauer wurden 50 ul einer Suspension, die eine optimale Menge an SAM-Sephacryl enthält, zu jedem Röhrchen (ausgenommen die Gesamten) hinzugefügt und die Röhrchen wurden dann bei 21±1ºC unter Schütteln 1 Stunde lang inkubiert. Nach diesem Schritt wurden 1,5 ml des Sucrosepuffers (Assaypuffer + 10% Gew./Gew. Sucrose), unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe, unter das Reaktionsgemisch in jedem Röhrchen (ausgenommen die Gesamten) geschichtet. Dem SAM-Sephacryl wurde es ermöglicht bei 21±1ºC 30 Minuten lang zu sedimentiern, wonach die Flüssigkeit aus jedem Röhrchen, unter Zurücklassung von ungefähr 0,3 ml, entfernt wurde. Alle Röhrchen, einschließlich der Gesamten, wurden dann 60 Sekunden in einem Multiwell Gammazähler gemessen (counted). Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 und Figur 3 der anliegenden Zeichnungen dargestellt, die eine Dosisantwortkurve der βXIIa Konzentration gegen % gebundenes ¹²&sup5;I-βXIIa ist. Die gebundenen % wurden berechnet, indem die Zerfälle, die für jeden βXIIa-Standard erhalten wurde, durch die Gesamtzerfälle dividiert wird. Die zusammengezählten Gesamtzerfälle betrugen 10000 cpm (Zerfälle pro Minute). Tabelle 1 Konzentration von unmarkiert hinzugefügtem βXIIa (ug/ml) % gebunden Mittelwert% gebunden

Beispiel 6

Herstellung von βXIIa monoklonalen Antikörpern

Murine monoklonale Antikörper gegen Human-ßxlla wurden mittels des allgemeinen Verfahrens nach Kohler und Milstein (G. Kohler & C. milstein, nature, 1975, 256, 495) gebildet:

(i) Herstellung des Immunogen

Das Immunogen wurde mittels Konjugation von βXIIa an ein gereinigtes Proteinderivat des Tuberkulin (PPD), unter Verwendung des heterobifunktionellen Reagens Sulpho SMCC (P. J. Lachmann et al, Synthetic Peptides as Antigens, Ciba Foundation Symposium 119, 25-27, 1986) hergestellt:
N-Succinidimyl-3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP, 6 mg) wurden in Ethanol (5 ml) gelöst. Eine 5 mg/ml Lösung an PPD (für den Heaf-Test, Statens Serum Institut, Denmark) in 0,1 M PBS pH 7,4 wurde hergestellt. Ein Gemisch aus PPD-Lösung (1 ml) und SPDP-Lösung (5 ul) wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, danach wurde die Zubereitungen gegen 0,1 M PBS pH 7,4 dialysiert. Die freien Thiolgruppen wurden exponiert, indem das derivatisierte PPD mit Dithiothreitol (bei einer 50 mM Konzentration) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann gegen 0,1 M Natriumacetatpuf fer pH 4,5, der 100 mM Natriumchlorid enthält, dialysiert.
Gereinigtes βXIIa, das wie in Beispiel 1 oben beschrieben hergestellt wurde, wurde gegen 0,1 M Boratpuffer pH 8,0 dialysiert und die Endkonzentration wurde auf 5 mg/ ml eingestellt. Eine Lösung aus Sulfosuccinimidyl-4-(N- maleiimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) wurde in 0,1 M Boratpuffer pH 8,0 hergestellt. 100 ul dieser Lösung wurden zu der βXIIa-Lösung hinzugefügt, so daß das molare Verhältnis Sulfo-SMCC:βXIIa 100:1 betrug. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert und dann gegen 0,1 M PBS pH 7,4 dialysiert.
Gleiche Gewichte an aktiviertem βXIIa und aktiviertem PPD wurden 18 Stunden lang bei 4ºC inkubiert und dann wurde das Gemisch gegen 0,1 M PBS pH 7,4 dialysiert. Dieses Material wurde zur Immunisierung verwendet.

(ii) Herstellung von Milz-Lymphozyten

Weibliche C57/B10 oder Balb/C Mäuse wurden mit BCG geprimed und wurden einen Tag später mit 20 ug des βXIIa-PPD-Immunogen im vollständigen Freuds Adjuvans immunisiert. In zweiwöchigen Intervallen wurden die Mäuse mit 20 ug des Immunogen im vollständigen Freuds Adjuvans aufgefrischt. Zwei Wochen nach der zweiten Auffrischung wurde eine Präfusionierungs-Auffrischung intravenös verabreicht und drei Tage später wurden die Tiere getötet.
Die Immunantwort der Mäuse wurde mittels RIA unter Verwendung von ¹²&sup5;I-radioaktiv markiertem βXIIa, hergestellt unter Verwendung des Chloramin-T Verfahrens mit einer Aufnahme von ungefähr 50-75 uCi/mg, überwacht. Die Reinheit wurde unter Verwendung der Autoradiography der SDS-PAGE Gele, die unter reduzierten Bedingungen liefen, bestätigt.
Das RIA-Verfahren war wie folgt: Zu 100 ul des verdünnten markierten βXIIa (15000 cpm/Röhrchen) wurden 100 ul des Antiserums, das im Assaypuffer II (Phosphat gepufferte Salzlösung, die 0,5 % (Gew./V) Tween (Warenzeichen), 1 % (Gew./V) bovines Serumalbumin (BSA) und 0,01% (Gew./V) Natriumazid enthält) verdünnt wurde, hinzugefügt. Weitere 100 ul des Puffers wurden hinzugefügt und das Gemisch wurde bei 20ºC 20 Stunden lang inkubiert. Das gebundene markierte βXIIa wurde unter Verwendung eines zweiten Antikörpersystems (Dako Anti-Maus-Antikörper bei 1/100 im Assaypuffer II, der 6% (Gew./V) PEG und 50 ug an 1/100 normalen Mausserum enthält) abgetrennt. Nach dem Abdekantieren, wurde der Überstand in den Gammazähler eingelesen, 60s/Röhrchen.

(iii) Fusionsprotokoll

Milzzellen wurden von antwortenden Mäusen, die einen Antikörpertiter von größer als 1/5000 und vorzugsweise größer als 1/20000 haben, entfernt, schonend homogenisiert, dreimal gewaschen und dann in Dulbeccos modifiziertem Eagle s medium (DMEM) resuspendiert. Die verwendete Myelomzelllinie war NSO (unkloniert), die aus dem MRC Laboratory of Molekular Biology, Cambridge stammt. Die Myelomazellen in der log Wachstumsphase wurden in DMEM gewaschen.
Milzzellen (1x10&sup8;) wurden mit Myelomazellen (1x10&sup7;) gemischt, zentrifugiert, und dann wurde die Flüssigkeit entfernt. Das resultierende Zellpellet wurde in ein Gefäß in ein 37ºC Wasserbad eingebracht. Über einen Zeitraum von einer Minute wurden 1 ml einer 50% (Gew./V) Lösung von Polyethylenglykol (PEG) 1500 in eine Salzlösung Hepes pH 7,5 hinzugefügt und das Gemisch wurde schonend eineinhalb Minuten gerührt. Über einen Zeitraum von fünf Minuten wurden 50 ml von serumfreien DMEM hinzugefügt, sodann wurde das Gemisch zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 10 ml DMEM, das 18% fetales Kalbserum (FCS) enthält, resuspendiert. Ein 10 ul aliquoter Teil der resultierenden Zellsuspension wurde zu jeder der 480 Vertiefungen der Standard- Multivertiefungs-Gewebekulturplatten hinzugefügt. Jede Vertiefung enthielt 2 ml des Standard-HAT-Mediums (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) und eine Feederschicht aus Balb/C Zellen bei einer Konzentration von 5x10&sup4; Makrophagen/Vertiefung. Die Vertiefungen wurden bei 37ºC in 9% CO&sub2; Luft bei ungefähr 90% Feuchtigkeit gehalten. Die Vertiefungen wurden, wie unten beschrieben, auf monklonale Antikörperbildung analysiert. Aus den Vertiefungen, die Antikörper bildende Zellen bildeten, wurden die Zellen entfernt und mittels dem Standardgrenzverdünnungs-Klonierungsverfahren geklont.

(iv) Sreenen der Hvbridome unter Verwendung des Festphasen- Immunassay

Alle Vertiefungen, die Hybride aufweisen wurden, unter Verwendung eines Festphasen-Immunassys (EIA), wie folgt gescreent:
Die Vertiefungen einer 96 Vertiefungs-Mikrotiterplatte (Nunc Immunoplate, Polysorb Catalogue Nr. 4-75094) wurden über Nacht mit gereinigtem βXIIa, das, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen wurde, unter Verwendung von 100 ul aliquotem Teil einer 1 ug/ml Lösung in MES-Salzlösung (20 mM 2-(N-Morpholinoethansulfonsäure, 150 mM Natriumchlorid, pH 6,5) überschichtet und sodann unter Verwendung von 1% Milchprotein in MES-Salzlösung blockiert. Die Zellkultur- Überstände, die 1:1 in verstärkter MES-Salzlösung (MES- Salzlösung, die 0,05% (Gew./V) Tween, 1% (Gew./V) BSA und 0,05% (Gew./V) Thiomersal enthält) verdünnt wurden, wurden zu den Vertiefungen hinzugefügt und nach der Inkubation von 1 Stunde bei 37ºC wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS, das 0,05% (Gew./V) Tween und 0,05% (Gew./V) Thiomersal enthält, gewaschen, und es wurde Meerrettich Peroxidase markiertes Anti-maus IgG (Biorad, Anti-Schwerketten spezifisch, 1:2500 in verstärkter MES-Salzlösung hinzugefügt. Nach einer weiteren Inkubation von 37ºC für 1 Stunde wurden die Vertiefungen wieder gewaschen und 100 ul einer Substratlösung (6mM H&sub2;O&sub2; und 40 mM o-Phenylendiamin in 0,1 M Citrat, pH 5,0) wurden hinzugefügt. Die Farbentwicklung wurde mit 100 ul 3M HCl gestoppt und die Extinktion wurde bei 492 nm gemessen. Die Vertiefungen, die eine gute Diskriminierung zwischen der Bindung von βXIIa und Faktor XII zeigen, wurden in einer Antiserumkurvenanalyse gegen ¹²&sup5;I-markiertes XβIIa tiriert. Alle Vertiefungen, die eine Bindung des markierten βXIIa und Titer größer als 1 in 10 zeigten, wurden für Analysen der Dosisantwort und den Grad der Kreuzreaktion mit Faktor XII unter Verwendung der Formel I präsentiert:
Gewicht des nicht aktiven Standard βXIIa um 50% B max. zu erhalten, dividiert durch das Gewicht des Kreuzreaktanten, um 50% B max. zu erreichen, multipliziert mit 100.
Aus diesen vorbereitenden Daten wurden 6 Hybridome, die eine offensichtliche Kreuzreaktivität von 1,5% haben, für die Klonierung ausgewählt.
Ein repräsentativer Klon aus jeder Linie wurde weiter mittels RIA auf Kreuzreaktion mit Faktor XII (FXII), Plasmin und Fibronection analysiert. Tabelle 2 zeigt die Dosisantwortkurven für drei bevorzugte Klone, um die offensichtliche Kreuzreaktivität gegen Faktor XII zu bestimmen. Tabelle 2 RIA-Dosisantwort um offensichtliche Kreuzreaktivität von gewissen Klonen gegen Faktor XII zu bestimmen. Klonnummer gebunden Konzentration an βXIIa ng/ml % Konzentration an XII ng/ml
Eine Scatchardanalyse wurde an den Dosisantwortkurven durchgeführt, um Affinitätskonstanten-(Ka)-Werte zu erhalten. Die Daten für die drei bevorzugten Zelllinien sind in Tabelle 3 unten, zusammen mit einigen Daten, die sich auf einen weiteren Klon beziehen, der einen hohen Grad an Kreuzreaktivität mit Faktor XII hat, dargestellt: Tabelle 3 RIA-Dosisantwort und Offensichtlichkeits- Kreuzreaktivitätsstudie von gewissen Anti-βXIIa Antikörper38/1 Kreuzreaktivität Klon Nummer Titer Plasmin Fibronectin

(v) Festsetzung der korrekten Kreuzreaktivität mit Faktor XII

Ein Faktor, der bei der Beurteilung der Kreuzreaktivität eines Anti-βXIIa-Antikörpers mit Faktor XII in Betracht zu ziehen ist, ist, daß selbst "reiner" Faktor XII fast unvermeidlich mit geringen Mengen an XIIa verunreinigt ist (Silverberg und Kaplan, Blood 60, 1982, 64-70). Obwohl diese Verunreinigung für die meisten Zwecke unbedeutend ist, beeinflußt die Anwesenheit von selbst geringen Mengen an XIIa die Ergebnisse der Studien der Kreuzreaktivität der Anti-βXIIa-Antikörper mit Faktor XII. Demgemäß wurde es als notwendig erachtet eine Abschätzung des βXIIa-Spiegels in den Proben des Faktors XII zu erhalten, die für die Kreuzreaktiviäts-Bestimmung verwendet werden. Der chromogene Assay für XIIa, der eine Verunreinigung bei Spiegeln von > 10 ng/ml ermitteln kann, wurde verwendet.

Messung der XIIa Konzentration in einer Faktor XII Probe

Die amidolytische Aktivität von XIIa, das in dem "reinen" Faktor XII anwesend ist, wurde mittels Zugabe von 200 ul an 2 mM Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid (52303, Kabi) in 65 mM Tris, 135 mM Natriumchlorid, 0,01% BSA, pH 8 zu 50 111 βXIIa Standards oder Faktor XII Proben, bestimmt, die vorbestimmte Konzentrationen an XII haben (bestimmt mittels Messung des Extinktions-Koeffizienten, siehe Fujikawa & McMullen, a.a.O.).
Die Hydrolyse des Substrats wurde mittels Bestimmung der Extinktion bei 405 nm, nach einer Inkubation von 60 Minuten bei Raumtemperatur gemessen. Die amidolytische Aktivität der Proben wurde mit denen des βXIIa-Standards verglichen. Die erhaltenen Resultate werden in Tabelle 4 unten gezeigt. Tabelle 4 Amidolytische Aktivität der Faktoren βXIIa und XII Probe- oder Standardkonzentration Extinktion bei 405 nm Standards Faktor XII Proben
Der Prozentsatz an Verunreinigung des Faktors XII mit βXIIa wurde gemäß der folgenden Formel berechnet.
Konzentration an βXIIa in Faktor XII / Konzentration an Faktor XII x 100
Die erhaltenen Resultate geben zu erkennen, daß die Verunreinigung des Faktors XII mit XIIa innerhalb des Bereichs von 0,5 bis 0,8 % liegt.

Beurteilung der Kreuzreaktivität des Faktors XII mit dem monoklonalen Antikörper 2/215

Ein Immunassay für βXIIa wurde unter Verwendung monoklonaler Anikörperkonjugate 201/9 und 202/16.1.9, wie in Beispiel 7 unten beschrieben, ausgeführt. Die βXIIa-Standard- und die Faktor-XII-Probe-Konzentrationen wurden, wie oben für den chromogenen Test dargestellt, verwendet. Die Resultate werden in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Kreuzreaktivität von 2/215 unter Verwendung monoklonaler Antikörperkonjugate Konzentration von βXIIa Extinktion bei 550 nm
Die offensichtliche Kreuzreaktivität wurde auf einen Bereich von 0,5% berechnet, aber wenn die Verunreinigung des Faktors XII mit XIIa, wie oben beschrieben, in Betracht gezogen wurde, lag die korrekte Kreuzreaktivität bei weniger als 0,1%.

(vi) Bildung von Antikörpern

Subklonierte Hybridomzellen, die Antikörper gegen ßxlla bilden, wurden intraperitoneall in Balb/C Mäuse zur Bildung von aszitischer Flüssigkeit injiziert oder sie wurden in Kulturen gezüchtet.
Die Immunglobulinfraktion wurde aus aszitischer Flüssigkeit bei 4ºC unter Verwendung von einem gleichen Volumen an gesättigter Ammoniumsulfatlösung ausgefällt. Die Fällung wurde zentrifugiert, in einem Volumen von 20 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5 (Puffer A) gelöst, das gleich dem ursprünglichen Volumen der aszitischen Flüssigkeit ist, und dann gegen denselben Puffer dialysiert. Die Proteinlösung wurde dann auf einer Mono-Q (Warenzeichen) Anionenaustauschsäule (HR 10/10, Pharmacia), mittels einer Vorrichtung von einer FPLC (Warenzeichen) Einrichtung von Pharmacia, fraktioniert. Das Eluat wurde, unter Verwendung eines Gradienten, der mit Puffer A und Puffer B (Puffer A wurde mit 1M NaCl ergänzt) gemacht wurde, bei einer Fließrate von 2 ml pro Minute, durchgeführt. Das Eluat wurde bei 280 nm überwacht und 1 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen, die Immunglobulin enthielten, wurden vereinigt und bei -20ºC zur Lagerung eingefroren.
Im wesentlichen wurde das gleiche Verfahren zur Isolierung der Immunglobulinfraktion aus der Kulturflüssigkeit verwendet.

(vii) Hinterlegung der Hybridome

Hybridomzelllinien sind beim European Collection of Animal Cell Cultures, Division of Biologics, PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury SPA OJG, England hinterlegt worden, wie folgt
2/215 (BFx11a) hinterlegt am 16. Januar 1990, Hinterlegungsnummer 90011606;
201/9 (ESBT4 1.1) hinterlegt am 18. Januar 1990, Hinterlegungsnummer 90011893;
202/16.1.9 (ESBT 92.9) hinterlegt am 25 Januar 1990, Hinterlegungsnummer 90012512.

Beispiel 7

Assay, der den monklonalen Antikörper 2/215 verwendet

Die Vertiefungen einer 96 Vertiefungs-Mikrotiterplatten wurden über Nacht bei 20-25ºC mit Antikörper 2/215 unter Verwendung von 100 ul pro Vertiefung einer 5 ug/ml Zubereitung eines Antikörpers in einem Beschichtungspuffer (0,1 M Phosphatpuf fer, 0,15 M Natriumchlorid, das 0,1% Natriumazid enthält, 0,02% Gentamycinsulfat, pH 7,4) beschichtet. Aliquote Teile von 100 ul einer Probe von Humanplasma oder von βXIIa-Standards wurden in die Vertiefungen hinzugefügt und die Platten wurden bei 20-25ºC 1 Stunde inkubiert. Jede Vertiefung wurde dann mit Waschpuffer (10 mM Boratpuffer, 50 mM Natriumchlorid, 0,1% Triton-X-100, 0,05% Natriumazid, pH 7,4) vor der Zugabe eines Gemisches von Anti-βXIIa monoklonalen Antikörpern 201/9 und 202/16.1.9 (202/16.1.9 ist ein hoher Faktor-XII-Kreuzreaktions-Antikörper) gewaschen, diese Antikörper wurden vorher an eine alkalische Phosphatase unter Verwendung des Thiol-maleiimidverfahrens (E.Ishikawa et al, J. Immunoassy, 1983, 4, 209) konjugiert. Jedes Antikörperkonjugat wurde gegen βXIIa titriert, um die bestmögliche Verdünnung zu bestimmen. Die Konjugate wurden dann mit diesen Verdünnungen gemischt. Das Konjugat-Verdünnungsmittel ist 0,1 M Natriumchlorid, 1 mM Magnesiumch1oridhexahydrat, 0,1 M Tris, 0,1 mM Zinkchlorid, 0,1 % (Gew./V) Natriumazid, 0,1 % Triton- X-100 und 1% BSA. Nach der Inkubation von 1 Stunde bei 20-25ºC wurde jede Vertiefung wieder mit dem Waschpuffer gewaschen.
Die Platte wurde fest auf einem Saugkissen, vor der Zugabe von 100 ul Phenolphthaleinmonophosphat-Substratlösung (1,0 g/l Phenolphthaleinmonophosphat (PMP) in 0,5 M Diethanolamin, pH 8,6, enthaltend 0,02 % Bronidox), abgetupft. Die Platten wurden 15 Minuten bei 20-25ºC inkubiert, sodann wurde die Hydrolyse des Substrats mittels der Zugabe von 100 ul einer Stoplösung (0,4 M Natriumcarbonat, 0,1 M 3-(Cyclohexylamino)- 1-propansulfonsäure, 0,1 M Ethylendiamin-tetraessigsäuretetranatriumsalz, 0,4 M Natriumhydroxid) gestoppt. Die Extinktion wurde, nach Zugabe der Stoplösung, bei 550 nm gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 unten dargestellt. Tabelle 6 Extinktion bei 550 nm von βXIIa Standards und von Humanplasmaproben Extinktion bei 550 nm βXIIa Konzentration in ng/ml Standard Probe

Beispiel 8

Assay unter Verwendung von Antikörpern, die aus polyklonalem Antiserum gereinigt wurden

Der Assay wurde, wie in Beispiel 7 beschrieben, ausgeführt, mit der Ausnahme, daß die Antikörper, die aus einem polyklonalem Antiserum gegen Faktor XII hergestellt wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben, gewonnen wurden und daraufhin, wie in Beispiel 6, mit alkalischer Phosphatase konjugiert wurden, anstelle von den Antikörpern 201/9 und 202/16.1.9 verwendet wurden. Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 7 hervor. Tabelle 7 Extinktion bei 550 nm βXIIa Konzentration in ng/ml Extinktion bei 550 nm

Beispiel 9

Assay unter Verwendung eines chromogenen Substrats

100 ul aliquote Teile von βXIIa Standards wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte hinzugefügt, die mit dem monklonalen Antikörper 2/215, wie in Beispiel 7 beschrieben, beschichtet wurden. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei 20- 25ºC inkubiert. Jede Vertiefung wurde dann mit dem Waschpuffer (siehe Beispiel 7), vor der Zubgabe von 200 ul chromogener Substratlösung (2 mM 52302 (Kabi Diagnostica, Uxbridge), 65 mM Tris, 135 mM Natriumchlorid), gewaschen. Nach der Inkubation von 1 Stunde bei 37ºC, wurden 50 ul 1% Essigsäure zu jeder Vertiefung hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Die Extinktion wurde bei 405 nm unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesers gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8 Extinktion bei 405 nm βXIIa Konzentration in ng/ml Extinktion 405 nm
Achtung: Dieses Assayverfahren ist nicht genau bezüglich βXIIa Konzentrationen unter ungefähr 10 ng/ml, so daß es nicht genug empfindlich ist, um βXIIa in Plasmaproben zu bestimmen. Trotzdem ist es nützlich zur Untersuchung von βXIIa bei höheren Konzentrationen, zum Beispiel während der Isolierung und Reinigung und in den erhalten Herstellungsansätzen.

Claims

1. Monoclonaler Antikörper, der an Faktor βXIIa und an Faktor XIIa bindet und eine korrigierte Kreuzreaktivität mit Faktor XII von 0,1 % oder weniger besitzt.

2. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, der durch die Hybridomazellinie 2/215 mit der Hinterlegungsnummer ECACC 90011606 oder durch einen ihrer Reklone oder durch die Hybridomazellinie 201/9 mit der Hinterlegungsnummer ECACC 90011893 oder einen ihrer Reklone gebildet wird.

3. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, der mit einer nachweisbaren Markierung versehen ist.

4. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, der auf einem festen Träger immobilisiert ist.

5. Hybridomazellinie, die einen monoclonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 bildet, oder einen ihrer Reklone.

6. Hybridomazellinie nach Anspruch 5, bei der es sich um die Hybridomazellinie 2/215 mit der Hinterlegungsnummer ECACC 90011606 oder einen ihrer Reklone oder um die Hybridomazellinie 201/9 mit der Hinterlegungsnummer ECACC 90011893 oder einen ihrer Reklone handelt.

7. Verfahren zur Bildung eines monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem man eine Hybridomazellinie, die den Antikörper bilden kann, in einem Wachtumsmedium kultiviert und den Antikörper vom Wachstumsmedium gewinnt.

8. Verfahren zur Gewinnung einer Hybridomazellinie, die einen monoclonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 bildet, bei dem man ein Antigen einem Tier verabreicht, um antikörperbildende Zellen zu gewinnen, die resultierenden antikörperbildenden Zellen mit Myelomazellen fusioniert und die resultierenden Hybridomas zur Bildung des monoclonalen Antikörpers screent, wobei es sich bei dem Antigen um Faktor βXIIa oder eines seiner antigenen Fragmente handelt.

9. Verfahren zur Durchführung eines Immunassays für ein Antigen in einer Fluidprobe, wobei das Assay eine Wechselwirkung zwischen einem Antigen und einem Antikörper umfaßt, der daran bindet, und die Menge des Antigens in der Probe mit Bezug auf Ergebnisse bestimmt, die mit vorbestimmten Mengen eines bekannten Antigens erhalten worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikörper um einen monoclonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2 handelt und das bekannte Antigen Faktor βXIIa ist.

10. Verfahren zum Ermitteln und/oder Bestimmen von Faktor XIIa in einer Probe, bei dem man eine Probe einem qualitativen oder quantitiven Immunassay unterwirft, das eine Wechselwirkung zwischen einem Antigen und einem Antikörper und die Ermittlung und/oder Bestimmung eines resultierenden Antikörper/Antigen-Komplexes umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikörper um einen monoclonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2 handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei es sich bei der Fluidprobe um eine Plasmaprobe handelt, die von einem Menschen gewonnen wurde, und wobei man zur Bestimmung der Anfälligkeit des betreffenden Menschen gegen Herzerkrankungen das Ergebnis, das man für den Antigenspiegel in der untersuchten Probe gewonnen hat, mit den Ergebnissen vergleicht, die man bei einer Untersuchung in vergrößertem Maßstab erhalten hat, wobei man den Spiegel des untersuchten Antigens mit der Anfälligkeit gegen Herzerkrankungen in Beziehung setzt.

12. Kit zur Durchführung eines Immunassays gemäß einem der Ansprüche 9 bis 10, wobei der Kit (jeweils in einem separaten Behälter oder auf andere Weise getrennt) einen monoclonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und Faktor βXIIa oder eines seiner antigenen Fragmente umfaßt.

13. Kit zur Durchführung eines Immunassays gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der Kit (jeweils in einem getrennten Behälter oder auf andere Weise getrennt)

(A) eine Komponente aus der durch

(a) (i) einen monoclonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, gegebenenfalls immobilisiert auf einem festen Träger,

(a) (ii) Faktor ßXIIa oder eines seiner antigenen Fragmente und

(a) (iii) einen Antikörper, der mit einem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 reagieren kann, gegebenenfalls immobilisiert auf einem festen Träger, gebildeten Gruppe und

(B) eine Komponente aus der durch

(b) (i) einen markierten monoclonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einen markierten anderen Antikörper, der direkt oder indirekt mit Faktor βXIIa reagieren kann,

(b) (ii) den markierten Faktor βXIIa und

(b) (iii) ein chromogenes Substrat für Faktor βXIIa gebildeten Gruppe und

(C) eine Komponente als Kontrollreagenz umfasst, bei dem es sich um den gereinigten Faktor βXIIa oder eines seiner antigenen Fragmente handelt,

wobei die gewählte Komponente (A) oder die gewählte Komponente (B) einen monoclonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 umfassen.

14. Immunsorbenz, das einen monoclonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 immobilisiert auf einem festen Träger umfaßt.

15. Verwendung eines Immunsorbenzes gemäß Anspruch 14 bei der Reinigung von βXIIa oder eines seiner antigenen Fragmente.