TWI464262B

TWI464262B - 抗體固定區的變異

Info

Publication number: TWI464262B
Application number: TW097137137A
Authority: TW
Inventors: 井川智之; 白岩宙丈
Original assignee: 中外製藥股份有限公司
Priority date: 2007-09-26
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2014-12-11
Also published as: EP2194066A4; MY163473A; CN101874041A; JP2022101707A; US20100298542A1; RU2526512C2; AU2008304748C1; PH12018501459B1; KR20210156290A; EP2194066B1; EP3059246B1; KR20160135850A; ZA201002422B; KR20210024260A; ES2566957T3; CA3222170A1; PH12021552811A1; JP5484060B2; JP2014144956A; JP5868441B2

Description

抗體固定區的變異

本發明關於具有良好物理性質(安定性與同質性)、免疫性、安全性及/或血漿中停留時間之抗體固定區；以及包括該固定區之抗體。

由於在血漿(血液)中為高度安定且具有較少的不良作用(adverse effects)，抗體吸引作為醫藥的注意力。其等之中，IgG-型抗體醫藥品已為市售可得且目前有許多抗體醫藥品正開發中(Janice M Reichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden & Matthew C Dewitz. Monoclonal antibody successes in the clinic. Nature Biotechnology(2005)23,1073-1078;Pavlou AK,Belsey MJ. The therapeutic antibodies market to 2008. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2005 Apr;59(3)：389-96)。

已為市售可得之所有抗體醫藥品幾乎皆為IgG1亞型(subclass)。由於可結合至Fcγ受體且顯現ADCC活性，IgG1型抗體期待有用於作為抗癌抗體醫藥品。然而，對於例如ADCC之效應子功能(effector function)為重要者之Fc域與Fcγ受體的結合，可引起不需要的副作用，且因而較佳由預備用於中和生物活性之抗體醫藥品移除該結合活性(Reddy MP,Kinney CA,Chaikin MA,PayneA,Fishman-Lobell J,Tsui P,Dal Monte PR,Doyle ML,Brigham-Burke MR,Anderson D,Reff M,Newman R,Hanna N,SWeet RW,Truneh A. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J. Immunol. 2000 Feb 15;164(4)：1925-33)。再者，由於Fcγ受體表現於抗原呈現細胞(antigen-presenting cells)，結合至Fcγ受體之分子有存在作為抗原的傾向。已經報導免疫性(immunogenicity)係藉由蛋白質或肽對IgG1之Fcγ域的連結且可藉此增強(Guyre PM,Graziano RF,Goldstein J,Wallace PK,Morganelli PM,Wardwell K,Howell AL. Increased potency of Fc-receptor-targeted antigens. Cancer Immunol. Immunother. 1997 Nov-Dec;45(3-4)：146-8;US 20050261229A1)。抗體Fc域與Fcγ受體之間的交互作用被認為是TGN1412之臨床試驗第1期遭遇嚴重副作用的成因(Strand V,Kimberly R,Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology：lessons learned,future directions. Nat. Rev. Drug Discov. 2007 Jan;6(1)：75-92)。因此，由副作用與免疫性的觀點而言，對Fcγ受體的結合對於準備用於中和生物活性之抗體醫藥品被認為較不佳。

一種用於減弱對Fcγ受體結合的方法為改變IgG抗體之同型物，由IgG1轉換為IgG2或IgG4；然而，此方法無法完全地抑制該結合(Gessner JE,Heiken H,Tamm A,Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann. Hematol. 1998 Jun;76(6)：231-48)。經報導用於完全地抑制對Fcγ受體結合的方法之一為改變Fc域。例如抗-CD3抗體及抗-CD4抗體之效應子功能引起不良作用。因此，將不存在於野生型序列之胺基酸導入至Fc的Fcγ-受體-結合域(Reddy MP,Kinney CA,Chaikin MA,Payne A,Fishman-Lobell J,Tsui P,Dal Monte PR,Doyle ML,Brigham-Burke MR,Anderson D,Reff M,Newman R,Hanna N,Sweet RW,Truneh A. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J. Immunol. 2000 Feb 15;164(4)：1925-33;Cole MS,Anasetti C,Tso JY. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic toTcells. J. Immunol. 1997 Oct 1;159(7)：3613-21)，且正進行臨床試驗以評估不結合至Fcγ受體之抗-CD3抗體與具有變異之Fc域的抗-CD4抗體(Strand V,Kimberly R,Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology：lessons learned,future directions. Nat. Rev. Drug Discov. 2007 Jan;6(1)：75-92;Chau LA,Tso JY,Melrose J,Madrenas J. HuM291(Nuvion),a humanized Fc receptor-nonbinding antibody against CD3,anergizes peripheral blood T cells as partial agonist of the T cell receptor. Transplantation 2001 Apr 15;71(7)：941-50)。或者，Fcγ受體-非結合抗體可藉由將IgG1(於EU編號系統之位置233、234、235、236、327、330及331)之FcγR-結合域改變為IgG2或IgG4序列(Armour KL,Clark MR,Hadley AG,Williamson LM. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur. J. Immunol. 1999 Aug;29(8)：2613-24;WO 99/58572)而製備。然而，該等分子含有新穎非天然的9至12個胺基酸的肽序列，其可構成T-細胞抗原決定基肽(epitope peptide)且因而造成免疫性風險。無先前報導關於以克服該等問題之Fcγ受體-非結合抗體。

同時，抗體蛋白質之物理性質，特別是免疫性與安定性，於抗體醫藥品的開發上為非常重要。對於IgG2同型物，已有報導源自鉸鏈區之雙硫鍵的異質性(Chu GC,Chelius D,Xiao G,Khor HK,Coulibaly S,Bondarenko PV. Accumulation of Succinimide in a Recombinant Monoclonal Antibody in Mildly Acidic Buffers Under Elevated Temperatures. Pharm. Res. 2007 Mar 24;24(6)：1145-56;US 2006/0194280)。大規模製造抗體醫藥品而同時維持所期望物質的異質性以及製造間相關物質的恆定為困難的。因此，可能的話，期望開發作為醫藥品之抗體分子為單一物質。

IgG2與IgG4於酸性條件下不安定。於使用Protein A與病毒失活化處理之純化步驟中，IgG型抗體通常暴露於酸性條件。因此，於該等步驟中需要關注於IgG2與IgG4的安定性且較佳為開發作為醫藥品之抗體分子於酸性條件下亦為安定者。天然的IgG2與IgG4、以及衍生自IgG2或IgG4之Fcγ受體-非結合抗體(Gessner JE,Heiken H,Tamm A,Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann. Hematol. 1998 Jun;76(6)：231-48;Cole MS,Anasetti C,Tso JY. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells. J. Immunol. 1997 Oct 1;159(7)：3613-21;WO 99/58572)具有該等問題。當開發抗體為醫藥品時，期望解決該等問題。

IgG1-型抗體於酸性條件下為相對的安定，且於此型抗體中，源自鉸鏈區之雙硫鍵的異質性程度亦為較低。然而，已有報導當IgG1-型抗體儲存於溶液中作為製劑時，於鉸鏈區進行非酵素性肽鍵裂解，且結果產生為不純物之Fab片段(AJ Cordoba,BJ Shyong,D Breen,RJ Harris. Nonenzymatic hinge region fragmentation of antibodies in solution. J. Chromatogr. B. Anal. Technol. Biomed. Life Sci.(2005)818,115-121)。當開發抗體為醫藥品時，期望克服不純物的產生。

再者，有報導抗體C-終端序列之異質性，其為起因於C-終端胺基酸殘基Lys或兩個C-終端胺基酸殘基Glu與Lys的刪除之C-終端胺基的醯胺化結果(Johnson KA,Paisley-Flango K,Tangarone BS,Porter TJ,Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal. Biochem. 2007 Jan 1;360(1)：75-83)。當開發抗體為醫藥品時，較佳為去除該異質性。

用於中和抗原之抗體醫藥品之固定區，較佳具有克服上述問題之序列。然而尚未有報導符合所有要求之固定區。

於慢性自體免疫疾病等之抗體醫藥品投藥的較佳型式被認為是皮下製劑。可以較長間隔於皮下投藥之低劑量、便利的抗體醫藥製劑，可藉由增加抗體於血漿中之半衰期以延長其治療效果且因此降低蛋白質投藥量而提供，以及藉由賦予抗體具有高安定性而因此可製備高濃度製劑。

一般而言，皮下製劑需要為高濃度製劑。由安定性等觀點而言，IgG-型抗體製劑之濃度限制，一般認定為約100mg/ml(Shire SJ,Shahrokh Z,Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J. Pharm. Sci. 2044 Jun; 93(6)：1390-402)。因此，於高濃度確保安定性為一挑戰。然而，尚未有報導藉由於IgG固定區導入胺基酸取代物而改良IgG於高濃度之安定性。已報導用於延長抗體於血漿中之半衰期的方法且其取代固定區之胺基酸(Hinton PR,Xiong JM,Johlfs MG,Tang MT,Keller S,Tsurushita N. An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life. J. Immunol. 2006 Jan 1;176(1)：346-56;Ghetie V,Popov S,Borvak J,Radu C,Matesoi D,Medesan C,Ober RJ,ward ES. Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis. Nat. Biotechnol. 1997 Jul;15(7)：637-40)；然而，由免疫性風險的觀點而言，非天然序列對於固定區之導入為較不佳的。

如上所述，當抗體醫藥品之目的為中和抗原時，較佳為具有上述問題已被克服之固定區序列。然而，尚未有可克服上述缺點之固定區。因此，冀求已克服上述問題之抗體固定區。

有鑑於上述情況而完成本發明。本發明之目的係提供藉由胺基酸改變而具有經改良之物理性質(安定性與同質性)、免疫性、安全性及血漿中停留時間之抗體固定區。

本發明者們進行致力於研究以製造抗體固定區，該抗體固定區經由其胺基酸序列的改變而改良且具有經改良之物理性質(安定性與同質性)、免疫性、安全性及血漿中停留時間。其結果，本發明者們成功地改良抗體固定區以具有於酸性條件下之安定性增加、衍生自鉸鏈區雙硫鍵之異質性降低、衍生自H-鏈C-終端之異質性降低、以及於高濃度之安定性增加，以及發現具有降低的Fcγ受體結合活性之新穎固定區序列，而最小化新穎T-細胞抗原決定基肽的產生。

本發明關於抗體固定區，其藉由胺基酸改變之改良而由安全性、免疫性風險、物理性質(安定性與同質性)、以及血漿中之停留時間之觀點為優異的；包括該等抗體固定區之抗體；包括該等抗體知醫藥品；以及用於製造其等之方法。更具體而言，本發明提供：

[1]一種人類抗體固定區，其係下述任一者：

(a)包括於序列編號：1之胺基酸序列中於位置329(於EU編號系統之位置446，參照具有免疫學重要性之蛋白質序列，NIH出版號No.91-3242)的Gly及位置330(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者經刪除的人類抗體固定區；

(b)包括於序列編號：2之胺基酸序列中於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者經刪除的人類抗體固定區；以及

(c)包括於序列編號：3之胺基酸序列中於位置329(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置330(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者經刪除的人類抗體固定區；

[2]一種IgG2固定區，其於序列編號：2之胺基酸序列中於位置209(於EU編號系統之位置330)、210(於EU編號系統之位置331)及218(於EU編號系統之位置339)的胺基酸經其他胺基酸取代；

[3]一種IgG2固定區，其於序列編號：2之胺基酸序列中於位置276(於EU編號系統之位置397)的胺基酸經另一胺基酸取代；

[4]一種IgG2固定區，其於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(於EU編號系統之位置131)、102(於EU編號系統之位置219)及/或16(於EU編號系統之位置133)的胺基酸經以另一胺基酸取代；

[5]如[4]之IgG2固定區，其中，於序列編號：2之胺基酸序列之位置20(於EU編號系統之位置137)及21(於EU編號系統之位置138)的胺基酸經另一胺基酸取代；

[6]一種IgG2固定區，其於序列編號：2之胺基酸序列中於位置147(於EU編號系統之位置268)的His、於位置234(於EU編號系統之位置355)的Arg、及/或於位置298(於EU編號系統之位置419)的Gln經其他胺基酸取代；

[7]一種IgG2固定區，其於序列編號：2之胺基酸序列中於位置209(於EU編號系統之位置330)、210(於EU編號系統之位置331)、218(於EU編號系統之位置339)、276(於EU編號系統之位置397)、14(於EU編號系統之位置131)、16(於EU編號系統之位置133)、102(於EU編號系統之位置219)、20(於EU編號系統之位置137)、及21(於EU編號系統之位置138)的胺基酸經以其他胺基酸取代；

[8]如[7]之IgG2固定區，其進一步包括於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者經刪除；

[9]一種IgG2固定區，其於序列編號：2之胺基酸序列中於位置276(於EU編號系統之位置397)、14(於EU編號系統之位置131)、16(於EU編號系統之位置133)、102(於EU編號系統之位置219)、20(於EU編號系統之位置137)、及21(於EU編號系統之位置138)的胺基酸經其他胺基酸取代；

[10]如[9]之IgG2固定區，其進一步包括於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者刪除；

[11]一種IgG2固定區，其於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu、於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser、於位147(於EU編號系統之位置268)的His、於位置234(於EU編號系統之位置355)的Arg、及於位置298(於EU編號系統之位置419)的Gln經其他胺基酸取代；

[12]如[11]之IgG2固定區，其進一步包括於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者經刪除；

[13]一種IgG2固定區，其於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu、於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser、於位147(於EU編號系統之位置268)的His、於位置234(於EU編號系統之位置355)的Arg、於位置298(於EU編號系統之位置419)的Gln、及於位置313(於EU編號系統之位置434)的Asn經其他胺基酸取代；

[14]如[11]之IgG2固定區，其進一步包括於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者刪除；

[15]一種IgG4固定區，其於序列編號：3之胺基酸序列中於位置289(於EU編號系統之位置409)的胺基酸經以另一胺基酸取代；

[16]一種IgG4固定區，其於序列編號：3之胺基酸序列中於位置289(於EU編號系統之位置409)、位置14、16、20、21、97、100、102、103、104及105(於EU編號系統分別為位置131、133、137、138、214、217、219、220、221及222)、及位置113、114及115(於EU編號系統分別為位置233、234及235)的胺基酸經以其他胺基酸取代，以及於位置116(於EU編號系統之位置236)的胺基酸經刪除；

[17]如[16]之IgG4固定區，其進一步包括於位置326(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置327(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者刪除；

[18]一種IgG1固定區，其序列編號：1中於位置317(於EU編號系統之位置434)的Asn經另一胺基酸取代；

[19]如[18]之IgG1固定區，其進一步包括於位置329(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置330(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者經刪除；

[20]一種IgG2固定區，其於序列編號：2之胺基酸序列中於位置209(於EU編號系統之位置330)的Ala、於位置210(於EU編號系統之位置331)的Pro、於位置218(於EU編號系統之位置339)的Thr、於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu、及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser經其他胺基酸取代；

[21]如[20]之IgG2固定區，其進一步包括於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者經刪除；

[22]一種IgG2固定區，其於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu、及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser經其他胺基酸取代；

[23]如[22]之IgG2固定區，其進一步包括於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys之兩者經刪除；

[24]一種人類抗體固定區，包括序列編號：5之胺基酸序列；

[25]一種人類抗體固定區，包括序列編號：7之胺基酸序列；

[26]一種人類抗體固定區，包括序列編號：9之胺基酸序列；

[27]一種人類抗體固定區，包括序列編號：35之胺基酸序列；

[28]一種人類抗體固定區，包括序列編號：36之胺基酸序列；

[29]一種人類抗體固定區，包括序列編號：37之胺基酸序列；

[30]一種人類抗體固定區，包括序列編號：43之胺基酸序列；

[31]一種人類抗體固定區，包括序列編號：57之胺基酸序列(M40ΔGK)；

[32]一種人類抗體固定區，包括序列編號：55之胺基酸序列(M86ΔGK)；

[33]一種抗體，包括[1]至[32]中任一項之固定區；

[34]一種抗-IL-6-受體之抗體，包括[1]至[32]中任一項之固定區；[35]一種醫藥組合物，包括[1]至[32]中任一項之固定區。

本發明提供抗體固定區，藉由改變抗體固定區之胺基酸序列使該抗體之物理性質(安定性與同質性)、免疫性、安全性及/或血漿中停留已為改善；包括該固定區之抗體；包括該抗體之醫藥組合物；以及製造該等之方法。

本文中，固定區意指IgG1、IgG2或IgG4型之固定區。該抗體固定區較佳人類抗體固定區。人類IgG1、IgG2與IgG4固定區之胺基酸為已知(人類IgG1固定區，序列編號：1；人類IgG2固定區，序列編號：2；以及人類IgG4固定區，序列編號：3)。本發明之含有胺基酸取代之抗體固定區可包括其他胺基酸取代與修改，只要其包括本發明之胺基酸取代即可。因此，於包括序列編號：2之胺基酸序列之IgG2固定區中包括本發明之胺基酸取代的IgG2固定區，包含：於序列編號：2中包括一個或多個胺基酸取代/或修改且進一步包括本發明之胺基酸取代的IgG2固定區，以及包括本發明之胺基酸取代且進一步包括一個或多個胺基酸取代及/或修改的IgG2固定區。同樣應用於包括序列編號：1之胺基酸序列的IgG1固定區以及包括序列編號：3之胺基酸序列的IgG4固定區。人類IgG4固定區之序列已改變以改良鉸鏈區之安定性。(Mol. Immunol. 1993 Jan;30(1)：105-8)。再者，於EU編號系統中於位置297之糖鏈可為任何糖鏈結構，或可無任何糖鏈連接於此位置(例如可以大腸桿菌(E. coli )製造)。

<具有經改變之胺基酸的IgG2>

本發明提供於酸性條件下具有經改良之安定性的IgG2固定區。

更具體而言，本發明提供IgG2固定區，其中序列編號：2之胺基酸序列中於位置276(於EU編號系統之位置276)之Met經以另一胺基酸取代。取代後之胺基酸型態並無各別限制；然而，較佳取代為Val。於酸性條件下之抗體安定性可藉由以另一胺基酸取代序列編號：2之胺基酸序列中於位置276(於EU編號系統之位置276)之Met而改良。

本發明所提供之具有於酸性條件下經改良之安定性的IgG2固定區，亦可具有其他胺基酸之取代、刪除、增加及/或插入，只要其至少具有上述胺基酸取代即可。

本發明提供具有降低的鉸鏈區異質性的IgG2固定區。

更具體而言，本發明提供IgG2固定區，其中於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、及/或於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys經以其他胺基酸取代。取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳為於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、及於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys取代為Ser(IgG2-SKSC)。

該等取代可降低源自IgG2鉸鏈區之異質性。包括胺基酸取代之本發明的IgG2固定區，包含IgG2固定區(其包括上述三型態胺基酸取代之至少一者)；然而，IgG2固定區較佳地包括於位置14的Cys與於位置102的Cys以其他胺基酸取代或所有上述三型態胺基酸取代。

本發明所提供之具有降低的異質性之IgG2固定區，亦可具有其他胺基酸之取代、刪除、增加及/或插入，只要其至少具有上述胺基酸取代即可。

例如，於包括序列編號：2之IgG2固定區域變異於位置14的Cys與於位置16的Arg，可產生非天然、新穎的9至12個胺基酸肽序列，其可變成T-細胞抗原決定基肽，且因而產生免疫性風險。即使以上述之導入胺基酸取代，非天然T-細胞抗原決定基肽的產生可藉由以其他胺基酸取代於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu以及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser而避免。取代後之胺基酸型態並無各別限制；然而，較佳為於位置14的Glu取代為Gly及於位置21的Ser取代為Gly。

本發明亦提供具有低Fcγ受體-結合活性之IgG2固定區。

更具體而言，本發明亦提供IgG2固定區，其包括於序列編號：2之胺基酸序列中於位置209(EU330)的Ala、於位置210(EU331)的Pro、及/或於位置218(EU339)的Thr，分別以Ser、Ser及Ala取代之胺基酸序列。已有報導於位置209(EU303)的Ala取代及於位置210(EU331)的Pro取代能減弱Fcγ受體結合(Eur. J. Immunol. 1999 Aug；29(8)：2613-24)。由免疫性風險的觀點，因為造成可成為T-細胞抗原決定基之非人類衍生肽的產生而非較佳者。然而，IgG2之Fcγ受體結合可藉由同時將位置218(EU339)的Thr取代為Ala而降低，且可變成T-細胞抗原決定基之該9至12的胺基酸肽為僅衍生自人類。

本發明之包括胺基酸取代之IgG2固定區包括上述三型態胺基酸取代之至少一者；然而，該IgG2固定區較佳地包括所有上述三型態胺基酸取代。於較佳具體例中，包括胺基酸取代之本發明的IgG2固定區包含IgG2固定區，其包括於序列編號：2之胺基酸序列中於位置209(EU330)的Ala、於位置210(EU331)的Pro、及/或於位置218(EU339)的Thr，分別以Ser、Ser及Ala取代之胺基酸序列。

本發明所提供之具有低Fcγ受體結合活性之IgG2固定區，亦可具有其他胺基酸之取代、刪除、增加及/或插入，只要其至少具有上述胺基酸取代即可。

本發明亦提供具有低C-端異質性之IgG2固定區。

更具體而言，本發明亦提供IgG2固定區，其包括於序列編號：2之胺基酸序列中於位置325(EU編號系統之位置446)的Gly及於位置326(EU編號系統之位置447)的Lys經刪除之胺基酸序列。源自抗體H鏈之C終端的異質性僅可在該二胺基酸經刪除時降低。

本發明所提供之具有降低的C-終端異質性之IgG2固定區，亦可具有其他胺基酸之取代、刪除、增加及/或插入，只要其至少具有上述胺基酸取代即可。

本發明進一步地亦提供具有改良的血漿中停留時間之IgG2固定區。

具體而言，本發明亦提供IgG2固定區，其包括於序列編號：2之胺基酸序列中於位置147(EU編號系統之位置268)的His、於位置234(EU編號系統之位置355)的Arg及於位置298(EU編號系統之位置419)的Gln經以其他胺基酸取代之胺基酸序列。取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳為於位置147(於EU編號系統之位置268)的His取代為Gln、於位置234(於EU編號系統之位置355)的Arg取代為Gln、及於位置298(於EU編號系統之位置419)的Gln取代為Glu。本發明之包括胺基酸取代之IgG2固定區包含上述三型態胺基酸取代之至少一者；然而，該IgG2固定區較佳地包括所有上述三型態胺基酸取代。

下述為本發明IgG2之較佳具體例，其於酸性條件下具有經改良的安定性、於鉸鏈區具有降低的異質性及/或降低的Fcγ受體結合活性。

包括IgG2固定區之抗體，該IgG2固定區包括胺基酸序列其中於序列編號：2之胺基酸序列中於位置209的Ala、於位置210的Pro、於位置218的Thr、於位置276的Met、於位置14的Cys、於位置16的Arg、於位置102的Cys、於位置20的Glu及於位置21的Ser，經其他胺基酸取代。

取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳為於位置209(於EU編號系統之位置330)的Ala取代為Ser、於位置210(於EU編號系統之位置331)的Pro取代為Ser、於位置218(於EU編號系統之位置339)的Thr取代為Ala、於位置276(於EU編號系統之位置397)的Met取代為Val、於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys取代為Ser、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly。

該IgG2固定區包括，例如，包括序列編號：4(M14)之胺基酸序列。

於另一較佳具體例中，本發明之IgG2固定區包括上述IgG2固定區中刪除於位置325的Gly及於位置326的Lys以降低C-終端異質性所成之IgG2固定區。該等抗體包括，例如，包括序列編號：5(M14ΔGK)之胺基酸序列的固定區之IgG2固定區。

下述為本發明IgG2之較佳具體例，其於鉸鏈區具有降低的異質性及/或降低的Fcγ受體結合活性。

包括IgG2固定區之抗體，該IgG2固定區包括胺基酸序列其中於序列編號：2之胺基酸序列中於位置209的Ala、於位置210的Pro、於位置218的Thr、於位置14的Cys、於位置16的Arg、於位置102的Cys、於位置20的Glu及於位置21的Ser，經以其他胺基酸取代。

取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳為於位置209(於EU編號系統之位置330)的Ala取代為Ser、於位置210(於EU編號系統之位置331)的Pro取代為Ser、於位置218(於EU編號系統之位置339)的Thr取代為Ala、於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys取代為Ser、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly。

該IgG2固定區包括，例如，包括序列編號：54(M86)之胺基酸序列之IgG2固定區。

於另一較佳具體例中，本發明之IgG2固定區包括上述IgG2固定區中刪除於位置325的Gly及於位置326的Lys以降低C-終端異質性所成之IgG2固定區。該等抗體包括，例如，包括序列編號：55(M86ΔGK)之胺基酸序列的固定區之IgG2固定區。

下述為為本發明之IgG2固定區之另一較佳具體例，其於酸性條件下具有經改良的安定性及於鉸鏈區具有降低的異質性。

包括IgG2固定區之抗體，該IgG2固定區包括胺基酸序列其中於序列編號：2之胺基酸序列中於位置276的Met、於位置14的Cys、於位置16的Arg、於位置102的Cys、於位置20的Glu及於位置21的Ser，經以其他胺基酸取代。

取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳為於位置276(於EU編號系統之位置397)的Met取代為Val、於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys取代為Ser、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly。

該IgG2固定區包括，例如，包括序列編號：3(M31)之胺基酸序列之IgG2固定區。

於另一較佳具體例中，本發明之IgG2固定區包括上述IgG2固定區中刪除於位置325的Gly及於位置326的Lys以降低C-終端異質性所成之IgG2固定區。該等抗體包括，例如，包括序列編號：7(M31ΔGK)之胺基酸序列的固定區之IgG2固定區。

下述為本發明之IgG2固定區之另一較佳具體例，其於鉸鏈區具有降低的異質性。

包括IgG2固定區之抗體，該IgG2固定區包括胺基酸序列其中於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14的Cys、於位置16的Arg、於位置102的Cys、於位置20的Glu及於位置21的Ser，經以其他胺基酸取代。

取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳為於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys取代為Ser、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly。

該IgG2固定區包括，例如，包括序列編號：56(M40)之胺基酸序列之IgG2固定區。

於另一較佳具體例中，本發明之IgG2固定區進一步包括上述IgG2固定區中刪除於位置325的Gly及於位置326的Lys之IgG2固定區。該等抗體包括，例如，包括序列編號：57(M40ΔGK)之胺基酸序列的固定區之IgG2固定區。

本發明提供IgG2固定區，其包括下述胺基酸序列：於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu、於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser、於位置147(於EU編號系統之位置268)的His、於位置234(於EU編號系統之位置355)的Arg及於位置298(於EU編號系統之位置419)的Gln經以其他胺基酸取代，以及同時地於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及於位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys經刪除。

取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳為於位置14的Cys取代為Ser、於位置16的Arg取代為Lys、於位置102的Cys取代為Ser、於位置20的Glu取代為Gly、於位置21的Ser取代為Gly、於位置147的His取代為Gln、於位置234的Arg取代為Gln及於位置298的Gln取代為Glu。

具體而言，本發明提供包括序列編號：35(M58)之胺基酸序列之抗體固定區。

本發明提供IgG2固定區，其包括下述胺基酸序列：於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu、於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser、於位置147(於EU編號系統之位置268)的His、於位置234(於EU編號系統之位置355)的Arg、於位置298(於EU編號系統之位置419)的Gln及於位置313(於EU編號系統之位置434)的Asn經以其他胺基酸取代，以及同時地於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及於位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys經刪除。

取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳為於位置14的Cys取代為Ser、於位置16的Arg取代為Lys、於位置102的Cys取代為Ser、於位置20的Glu取代為Gly、於位置21的Ser取代為Gly、於位置147的His取代為Gln、於位置234的Arg取代為Gln、於位置298的Gln取代為Glu及於位置313的Asn取代為Ala。

具體而言，本發明提供包括序列編號：37(M73)之胺基酸序列之抗體固定區。

該等抗體固定區經最適化以具有相較於IgG1固定區為降低的Fcγ受體結合活性、降低的免疫性風險、改良的酸性條件下安定性、降低的異質性、改良的血漿中停留時間及/或製劑中較高的安定性。

<具有經改變之胺基酸的IgG4>

本發明提供於酸性條件下為安定的IgG4固定區。

更具體而言，本發明提供IgG4固定區，其包括於序列編號：3之胺基酸序列中於位置289(於EU編號系統之位置409)的Arg經以另一胺基酸取代之胺基酸序列。取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳取代為Lys。於酸性條件下之抗體安定性可藉由將序列編號：3之胺基酸序列中於位置277(於EU編號系統之位置409)的Arg經以另一胺基酸取代而改良。

本發明所提供之具有酸性條件下經改良之安定性的IgG4固定區，亦可具有其他胺基酸之取代、刪除、增加及/或插入，只要其至少具有上述胺基酸取代即可。

本發明提供具有降低的C-終端異質性之IgG4固定區。

本發明提供IgG4固定區，其中於包括序列編號：3之胺基酸序列之IgG4固定區中於位置326(EU編號系統之位置446)的Gly及於位置327(EU編號系統之位置447)的Lys經刪除。源自抗體H鏈之C終端的異質性僅可在該二胺基酸經刪除時降低。

本發明所提供之具有降低的C-終端異質性之IgG4固定區，亦可具有其他胺基酸之取代、刪除、增加及/或插入，只要其至少具有上述胺基酸取代即可。

IgG4固定區包括胺基酸序列其中於序列編號：3之胺基酸序列於位置14的Cys、於位置16的Arg、於位置20的Glu、於位置21的Ser、於位置97的Arg、於位置100的Ser、於位置102的Tyr、於位置103的Gly、於位置104的Pro、於位置105的Pro、於位置113的Glu、於位置114的Phe、於位置115的Leu及於位置289的Arg經以其他胺基酸取代，且同時地於位置116的Gly經刪除。

取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳為於位置14(EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、於位置20(EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly、於位置21(EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly、於位置97(EU編號系統之位置214)的Arg取代為Thr、於位置100(EU編號系統之位置217)的Ser取代為Arg、於位置102(EU編號系統之位置219)的Tyr取代為Ser、於位置103(EU編號系統之位置220)的Gly取代為Cys、於位置104(EU編號系統之位置221)的Pro取代為Val、於位置105(EU編號系統之位置222)的Pro取代為Glu、於位置113(EU編號系統之位置233)的Glu取代為Pro、於位置114(EU編號系統之位置234)的Phe取代為Val、於位置115(EU編號系統之位置255)的Leu取代為Ala及於位置289(EU編號系統之位置409)的Arg取代為Lys。

該IgG4固定區包括，例如，包括序列編號：8(M11)之胺基酸序列之IgG4固定區。

於另一較佳具體例中，本發明之IgG4固定區包含於上述IgG4固定區中進一步包括於位置325(EU編號系統之位置446)的Gly及於位置326(EU編號系統之位置447)的Lys經刪除之IgG4固定區。該等抗體包含，例如，包括序列編號：9(M11ΔGK)之胺基酸序列之IgG4固定區。

<具有經改變之胺基酸的IgG1>

本發明提供具有降低的C-終端異質性的IgG1固定區。

更具體而言，本發明提供具有於包括序列編號：1之胺基酸序列的IgG1固定區中於位置329(EU編號系統之位置446)的Gly及於位置330(EU編號系統之位置447)的Lys經刪除之IgG1固定區。源自抗體H-鏈C終端的異質性僅可在該二胺基酸經刪除時降低。

本發明提供具有良好血漿中停留時間之IgG1固定區。

本發明提供IgG1固定區，其包括於序列編號：1之胺基酸序列中於位置317(EU編號系統之位置434)的Asn經另一胺基酸取代之胺基酸序列。取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而，較佳取代為Ala。

本發明提供具有於序列編號：36之胺基酸序列中於位置329的Gly及於位置330的Lys經刪除之固定區。更具體而言，本發明提供包括序列編號：43(M83)之胺基酸序列的抗體固定區。

本發明所提供之具有降低的C-終端異質性的IgG1固定區，亦可具有其他胺基酸之取代、刪除、增加及/或插入，只要其至少具有上述胺基酸取代即可。

本發明亦提供包括上述任一抗體固定區的抗體。本發明之抗體的型態與啟源並無特別限制，只要其包括上述抗體固定區即可，且可為任何抗體。

本發明之抗體亦包含抗體(該抗體包括上述之任何胺基酸取代)之經修改產物。抗體的起源並無特別限制。抗體包含人類、小鼠、大鼠及兔子的抗體。本發明之抗體可為嵌合性抗體、人源化抗體、完全地人源化抗體等。於較佳具體例中，本發明之抗體可為人源化抗體。

或者，上述抗體固定區及/或包括上述抗體固定區之抗體分子，可經連接為Fc融合分子至類抗體結合分子(支架分子(scaffold molecules)、生物活性肽、結合肽等之形式。

本發明之抗體亦包含抗體(該抗體包括上述任一固定區)之修改產物。

該等抗體修改產物包含，例如，與例如聚乙二醇(PEG)及細胞毒素物質之多種分子連接的抗體。該等抗體修改產物可藉由化學性修改本發明抗體而獲得。用於修改抗體之方法已知於此項技術領域。

本發明之抗體亦可為雙特異抗體(bispecific antibody)。「雙特異抗體」意指具有辨識不同抗原定基之單一分子可變區的抗體。該等抗原決定基可存在於單一分子或不同分子。

上述抗體固定區可使用於對抗所欲抗原之抗體中作為固定區。該抗原並無特別限制。

本發明之抗體亦可藉由，例如下述方法獲得。於獲得本發明之抗體之一具體例中，於固定區中之一個或多個胺基酸殘基首先經刪除或以感興趣之胺基酸取代。以感興趣之胺基酸取代一個或多個胺基酸殘基的方法包含，例如，定點突變(site-directed mutagenesis)(Hashimoto-Gotoh,T.,Mizuno,T.,Ogasahara,Y.,and Nakagawa,M. An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene(1995)152,271-275;Zoller,M.J.,and Smith, M. Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. (1983)100,468-500;Kramer,w.,Drutsa,V.,Jansen,H. W.,Kramer,B.,Pflugfelder,M.,and Fritz,H. J. The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. (1984)12,9441-9456;Kramer W.,and Fritz H. J. Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. (1987)154,350-367;Kunkel,T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1985)82,488-492)。該等方法可使用以感興趣之胺基酸於抗體之固定區中取代目標胺基酸。

獲得抗體之另一具體例中，結合至感興趣之抗原的抗體首先以此項技術領域中具有通常知識者習知之技術製備。當所製備之抗體係衍生自非人類動物時，其可經人源化。抗體之結合活性可藉由習知方法測定。其次，抗體固定區中一個或多個胺基酸殘基可經刪除或以感興趣之胺基酸取代。

更具體而言，本發明關於用於製造抗體的方法，其包括下述步驟：

(a)　表現編碼於固定區之一個或多個胺基酸殘基經刪除或以感興趣之胺基酸取代之H鏈的DNA，及表現編碼L鏈的DNA；以及

(b)　收集步驟(a)之表現產物。

本發明製造方法之第一步驟為表現編碼於固定區之一個或多個胺基酸殘基經刪除或以感興趣之胺基酸取代之H鏈的DNA，及表現編碼L鏈的DNA。編碼於固定區之一個或多個胺基酸殘基經刪除或以感興趣之胺基酸取代之H鏈的DNA可藉由下述方法製備，例如，獲得編碼野生型H鏈固定區的DNA，且導入合適取代以使固定區中編碼特定胺基酸之密碼(code)編碼感興趣之胺基酸。

或者，編碼於固定區之一個或多個胺基酸殘基經刪除或以感興趣之胺基酸取代之H鏈的DNA，亦可藉由設計然後化學性合成編碼於野生型H鏈之固定區之一個或多個胺基酸殘基經刪除或以感興趣之胺基酸取代之蛋白質的DNA而製備。

胺基酸取代之型態包含本文中所述及之取代，但不限於該等。

或者，編碼於固定區之一個或多個胺基酸殘基經刪除或以感興趣之胺基酸取代之H鏈的DNA亦可製備為部分DNA之組合。該等部分DNA之組合包含，例如，編碼可變區的DNA與編碼固定區的DNA之組合，以及編碼Fab區的DNA與編碼Fc區的DNA之組合，但不限定於該等。編碼L鏈的DNA亦可製備為部分DNA之組合。

用於表現上述DNA之方法包含下文所述者。例如，藉由插入編碼H鏈可變區的DNA至具有編碼H鏈固定區的DNA之表現載體而構築的H鏈表現載體。同樣地，藉由插入編碼L鏈可變區的DNA至具有編碼L鏈固定區的DNA之表現載體而構築的L鏈表現載體。或者，該等H鏈基因及L鏈基因可插入至單一載體。表現載體包含，例如，SV40為基礎的載體，EB病毒為基礎的載體以及BPV(乳突病毒)為基礎的載體，但不限於該等。宿主細胞以藉由上述方法所構築的抗體表現載體共轉形(co-transform)。該等宿主細胞包含上述細胞如CHO(中國倉鼠卵巢)細胞以及如大腸桿菌(E. coli )、酵母菌及枯草桿菌之微生物，以及植物與動物(Nature Biotechnology(2007)25,563-565;Nature Biotechnology(1998)16,773-777;Biochemical and Biophysical Research Communications(1999)255,444-450;Nature Biotechnology(2005)23,1159-1169;Journal of Virology(2001)75,2803-2809;Biochemical and Biophysical Research Communications(2003)308,94-100)。該轉型較佳可使用電穿孔(electroporation)、陽離子脂質體(lipofectin)方法(R. W. Malone et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1989)86,6077;P. L. Felgner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1987)84,7413)、磷酸鈣方法(F. L. Graham & A. J. van der Eb,Virology(1973)52,456-467)、DEAE-Dextran方法等而達成。

抗體製造之下一步驟中，收集步驟(a)之表現產物。表現產物例如可藉由培養轉形株，然後將產物由轉形細胞或培養基分離而收集。抗體之分離與純化可藉由如離心、硫酸銨劃分、鹽析、超過濾、1q、FcRn、Protein A與Protein G之管柱、親和層析、離子交換層析與凝膠滲透層析之方法的合適組合而達成。

＜用於改良IgG2固定區於酸性條件之安定性的方法＞

本發明亦關於改良於酸性條件之抗體安定性的方法，其包括於序列編號：2(IgG2)之胺基酸序列中於位置276(EU編號系統之位置397)的Met經另一胺基酸取代的步驟。本發明用於改良於酸性條件之抗體安定性的方法可包括其他胺基酸取代步驟，只要其包括於序列編號：2(IgG2)之胺基酸序列中於位置276(EU編號系統之位置397)的Met經另一胺基酸取代即可。取代後胺基酸之型態雖無特別限制；然而，較佳取代為Val。用於胺基酸取代之方法並無特別限制。取代例如可藉由上述之定點突變或實施例中所述方法而達成。

<用於降低衍生自IgG2固定區之鉸鏈區的異質性的方法>

本發明亦關於用於降低抗體異質性的方法，其包括於序列編號：2(IgG2)之胺基酸序列中取代於位置14(EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(EU編號系統之位置133)的Arg及/或於位置102(EU編號系統之位置219)的Cys的步驟。取代後之胺基酸型態並無特別限制；然而較佳為於位置14的Cys取代為Ser，於位置16的Arg取代為Lys，於位置102的Cys取代為Ser。本發明之用於降低抗體異質性的方法可包括其他胺基酸取代步驟，只要其包括於序列編號：2(IgG2)之胺基酸序列中取代於位置14(EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(EU編號系統之位置133)的Arg及/或於位置102(EU編號系統之位置219)的Cys的步驟。取代方法並無特別限制。取代例如可藉由上述之定點突變或實施例中所述方法而達成。於胺基酸取代中，所有上述三個胺基酸可經取代或該等之一者或二者(例如位置14與102)可經取代。

<用於降低源自IgG2固定區中C-終端胺基酸刪除之異質性的方法>

本發明亦關於用於降低抗體異質性的方法，其包括於包括序列編號：2之胺基酸序列的IgG2固定區中刪除於位置325(EU編號系統之位置446)的Gly及於位置326(EU編號系統之位置447)的Lys的步驟。本發明之用於降低抗體異質性的方法可包括胺基酸取代的其他步驟，只要其包括於包括序列編號：2之胺基酸序列的IgG2固定區中刪除於位置325(EU編號系統之位置446)的Gly及於位置326(EU編號系統之位置447)的Lys的步驟即可。胺基酸取代的方法並無特別限制。取代例如可藉由上述之定點突變或實施例中所述方法而達成。

<藉由取代IgG2固定區之胺基酸以改良血漿中停留時間的方法>

本發明亦關於用於改良抗體之血漿中停留時間的方法，其包括於包括序列編號：2之胺基酸序列的IgG2固定區中取代於位置147(EU268)的His、於位置234(EU355)的Arg及/或於位置298(EU419)的Gln的步驟。本發明之用於改良抗體之血漿中停留時間的方法可包括胺基酸取代的其他步驟，只要其包括上述步驟即可。取代後胺基酸之型態並無特別限制；然而，較佳為於位置147(EU268)的His取代為Gln，於位置234(EU355)的Arg取代為Gln及於位置298(EU419)的Gln取代為Glu。

本發明亦關於用於改良抗體之血漿中停留時間的方法，其包括於包括序列編號：2或35(M58)之胺基酸序列的IgG2固定區中取代於位置313(EU434)的Asn的步驟。取代後胺基酸之型態並無特別限制；然而，較佳取代為Ala。本發明用於改良抗體之血漿中停留時間的方法可包括其他胺基酸取代步驟，只要其包括上述步驟即可。

<藉由取代IgG1固定區之胺基酸以改良血漿中停留時間的方法>

本發明亦關於用於改良抗體之血漿中停留時間的方法，其包括於包括序列編號：1之胺基酸序列的IgG1固定區中取代於位置317(EU434)的Asn的步驟。取代後胺基酸之型態並無特別限制；然而，較佳取代為Ala。本發明用於改良抗體之血漿中停留時間的方法可包括其他胺基酸取代步驟，只要其包括上述步驟即可。

本發明亦關於用於改良抗體之血漿中停留時間且降低衍生自刪除C-端胺基酸之異質性的方法，其包括於包括序列編號：1之胺基酸序列的IgG1固定區中取代於位置317(EU434)的Asn及刪除於位置329(EU446)的Gly的步驟。取代後胺基酸之型態並無特別限制；然而，較佳取代為Ala。本發明用於改良抗體之血漿中停留時間的方法可包括其他胺基酸取代步驟，只要其包括上述步驟即可。

<用於降低FcγR結合而維持IgG2固定區中人類序列的之方法>

本發明亦關於用於降低抗體之FcγR結合的方法，其包括於包括序列編號：2之胺基酸序列的IgG2固定區中於位置209(EU330)的Ala取代為Ser，於位置210(EU331)的Pro取代為Ser及於位置218(EU339)的Thr取代為Ala的步驟。本發明之用於降低抗體之FcγR結合的方法可包括其他胺基酸取代步驟，只要其包括於包括序列編號：2之胺基酸序列的IgG2固定區中於位置209(EU330)的Ala取代為Ser，於位置210(EU331)的Pro取代為Ser及於位置218(EU339)的Thr取代為Ala的步驟即可。取代例如可藉由上述之定點突變或實施例中所述方法而達成。

本發明亦關於用於降低源自IgG2鉸鏈區之異質性的方法，用於改良於酸性條件之抗體安定性的方法，用於降低源自C-終端之抗體異質性的方法，及/或用於降低抗體之FcγR結合的方法，所有該等包括於包括序列編號：2(M14ΔGK)之胺基酸序列之IgG2固定區中之下述步驟：

(a)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置209(EU編號系統之位置330)的Ala經以另一胺基酸取代；

(b)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置210(EU編號系統之位置331)的Pro經以另一胺基酸取代；

(c)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置218(EU編號系統之位置339)的Thr經以另一胺基酸取代；

(d)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置276(EU編號系統之位置397)的Met經以另一胺基酸取代；

(e)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(EU編號系統之位置131)的Cys經以另一胺基酸取代；

(f)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置16(EU編號系統之位置133)的Arg經以另一胺基酸取代；

(g)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置102(EU編號系統之位置219)的Cys經以另一胺基酸取代；

(h)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置20(EU編號系統之位置137)的Glu經以另一胺基酸取代；

(i)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置21(EU編號系統之位置138)的Ser經以另一胺基酸取代；

(j)刪除於序列編號：2之胺基酸序列中於位置325的Gly及於位置326的Lys(分別為EU編號系統之位置446及447)。

取代後胺基酸之型態並無特別限制；然而，較佳為於位置209(於EU編號系統之位置330)的Ala取代為Ser、於位置210(於EU編號系統之位置331)的Pro取代為Ser、於位置218(於EU編號系統之位置339)的Thr取代為Ala、於位置276(於EU編號系統之位置397)的Met取代為Val、於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys取代為Ser、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly。

本發明亦關於用於降低源自IgG2鉸鏈區之異質性的方法，用於降低源自C-終端之抗體異質性的方法，及/或用於降低抗體之FcγR結合的方法，所有該等包括於包括序列編號：2(M86ΔGK)之胺基酸序列之IgG2固定區中之下述步驟：

(d)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(EU編號系統之位置131)的Cys經以另一胺基酸取代；

(e)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置16(EU編號系統之位置133)的Arg經以另一胺基酸取代；

(f)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置102(EU編號系統之位置219)的Cys經以另一胺基酸取代；

(g)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置20(EU編號系統之位置137)的Glu經以另一胺基酸取代；

(h)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置21(EU編號系統之位置138)的Ser經以另一胺基酸取代；

(i)刪除於序列編號：2之胺基酸序列中於位置325的Gly及於位置326的Lys(分別為EU編號系統之位置446及447)。

取代後胺基酸之型態並無特別限制；然而，較佳為於位置209(於EU編號系統之位置330)的Ala取代為Ser、於位置210(於EU編號系統之位置331)的Pro取代為Ser、於位置218(於EU編號系統之位置339)的Thr取代為Ala、於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys取代為Ser、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly。

本發明之方法可包括如胺基酸取代及刪除之其他步驟，只要其包括上述步驟即可。用於胺基酸取代及刪除的方法並無特別限制。取代及刪除例如可藉由上述之定點突變或實施例中所述方法而達成。

本發明亦關於用於降低源自IgG2鉸鏈區之異質性的方法，用於改良於酸性條件之抗體安定性的方法，及/或用於降低源自C-終端之抗體異質性的方法，所有該等包括於包括序列編號：2(M31ΔGK)之胺基酸序列之IgG2固定區中之下述步驟：

(a)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置276(EU編號系統之位置397)的Met經以另一胺基酸取代；

(b)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(EU編號系統之位置131)的Cys經以另一胺基酸取代；

(c)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置16(EU編號系統之位置133)的Arg經以另一胺基酸取代；

(d)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置102(EU編號系統之位置219)的Cys經以另一胺基酸取代；

(e)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置20(EU編號系統之位置137)的Glu經以另一胺基酸取代；

(f)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置21(EU編號系統之位置138)的Ser經以另一胺基酸取代；

(g)刪除於序列編號：2之胺基酸序列中於位置325的Gly及於位置326的Lys(分別為EU編號系統之位置446及447)。

取代後胺基酸之型態並無特別限制；然而，較佳為於位置276(於EU編號系統之位置397)的Met取代為Val、於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys取代為Ser、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly。

本發明亦關於用於降低源自IgG2鉸鏈區之異質性的方法及/或用於降低源自C-終端之抗體異質性的方法，所有該等包括於包括序列編號：2(M40ΔGK)之胺基酸序列之IgG2固定區中之下述步驟：

(a)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(EU編號系統之位置131)的Cys經以另一胺基酸取代；

(b)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置16(EU編號系統之位置133)的Arg經以另一胺基酸取代；

(c)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置102(EU編號系統之位置219)的Cys經以另一胺基酸取代；

(d)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置20(EU編號系統之位置137)的Glu經以另一胺基酸取代；

(e)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置21(EU編號系統之位置138)的Ser經以另一胺基酸取代；

(f)刪除於序列編號：2之胺基酸序列中於位置325的Gly及於位置326的Lys(分別為EU編號系統之位置446及447)。

取代後胺基酸之型態並無特別限制；然而，較佳為於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys取代為Ser、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly。

本發明亦關於用於改良於酸性條件之抗體安定性的方法，用於改良抗體之血漿中停留時間的方法及/或用於降低源自C-終端之抗體異質性的方法，所有該等包括於包括序列編號：2(M58)之胺基酸序列之IgG2固定區中之下述步驟：

(a)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser；

(b)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置16(EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys；

(c)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置102(EU編號系統之位置219)的Cys取代為Ser；

(d)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置20(EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly；

(e)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置21(EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly；

(f)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置147(EU編號系統之位置268)的His取代為Gln；

(g)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置234(EU編號系統之位置355)的Arg取代為Gln；

(h)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置298(EU編號系統之位置419)的Gln取代為Glu；

本發明亦關於用於降低源自IgG2鉸鏈區之異質性的方法，用於改良抗體之血漿中停留時間的方法及/或用於降低源自C-終端之抗體異質性的方法，所有該等包括於包括序列編號：2(M73)之胺基酸序列之IgG2固定區中之下述步驟：

(i)於序列編號：2之胺基酸序列中於位置313(EU編號系統之位置434)的Asn取代為Ala；

<用於改良於酸性條件下IgG4固定區安定性的方法>

本發明亦關於用於改良於酸性條件下抗體安定性的方法，其包括於包括序列編號：3((Mol. Immunol. 1993 Jan;30(1)：105-8))之胺基酸序列之IgG4固定區中於位置289(EU編號系統之位置409)的Arg經以另一胺基酸取代的步驟。本發明之用於改良於酸性條件下抗體安定性的方法可包括其他胺基酸取代步驟，只要其包括於包括序列編號：3(人類IgG4固定區)之胺基酸序列中於位置289(EU編號系統之位置409)的Arg經以另一胺基酸取代的步驟即可。取代後胺基酸之型態並無特別限制；然而，較佳取代為Lys。取代例如可藉由上述之定點突變或實施例中所述方法而達成。

<用於降低源自IgG4固定區中C-端胺基酸刪除之異質性的方法>

本發明亦關於用於降低抗體異質性的方法，其包括於包括序列編號：3((Mol. Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8))之胺基酸序列之IgG4固定區中刪除於位置326(EU編號系統之位置446)的Gly及於位置327(EU編號系統之位置447)的Lys的步驟。本發明之用於降低抗體異質性的方法可包括其他胺基酸取代步驟，只要其包括於包括序列編號：3((Mol. Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8))之胺基酸序列之IgG4固定區中刪除於位置327(EU編號系統之位置447)的Lys及/或於位置326(EU編號系統之位置446)的Gly及的步驟即可。取代後胺基酸之型態並無特別限制。取代例如可藉由上述之定點突變或實施例中所述方法而達成。

本發明亦關於用於改良於酸性條件之抗體安定性的方法，用於降低源自C-終端之抗體異質性的方法，及/或用於降低抗體之FcγR結合的方法，所有該等包括於包括序列編號：3(M11ΔGK)之胺基酸序列之IgG4固定區中之下述步驟：

(a)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置14(EU編號系統之位置131)的Cys經以另一胺基酸取代；

(b)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置16(EU編號系統之位置133)的Arg經以另一胺基酸取代；

(c)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置20(EU編號系統之位置137)的Glu經以另一胺基酸取代；

(d)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置21(EU編號系統之位置138)的Ser經以另一胺基酸取代；

(e)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置97(EU編號系統之位置214)的Arg經以另一胺基酸取代；

(f)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置100(EU編號系統之位置217)的Ser經以另一胺基酸取代；

(g)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置102(EU編號系統之位置219)的Tyr經以另一胺基酸取代；

(h)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置103(EU編號系統之位置220)的Gly經以另一胺基酸取代；

(i)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置104(EU編號系統之位置221)的Pro經以另一胺基酸取代；

(j)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置105(EU編號系統之位置222)的Pro經以另一胺基酸取代；

(k)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置113(EU編號系統之位置233)的Glu經以另一胺基酸取代；

(1)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置114(EU編號系統之位置234)的Phe經以另一胺基酸取代；

(m)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置115(EU編號系統之位置235)的Leu經以另一胺基酸取代；

(n)刪除於序列編號：3之胺基酸序列中於位置116(EU編號系統之位置236)的Gly；

(o)於序列編號：3之胺基酸序列中於位置289(EU編號系統之位置409)的Arg經以另一胺基酸取代；

(p)刪除於序列編號：3之胺基酸序列中於位置236的Gly及於位置237的Lys(分別為EU編號系統之位置446及447)。

取代後胺基酸之型態並無特別限制；然而，較佳為於位置14(EU編號系統之位置131)的Cys取代為Ser、於位置16(EU編號系統之位置133)的Arg取代為Lys、於位置20(EU編號系統之位置137)的Glu取代為Gly、於位置21(EU編號系統之位置138)的Ser取代為Gly、於位置97(EU編號系統之位置214)的Arg取代為Thr、於位置100(EU編號系統之位置217)的Ser取代為Arg、於位置102(EU編號系統之位置219)的Tyr取代為Ser、於位置103(EU編號系統之位置220)的Gly取代為Cys、於位置104(EU編號系統之位置221)的Pro取代為Val、於位置105(EU編號系統之位置222)的Pro取代為Glu、於位置113(EU編號系統之位置233)的Glu取代為Pro、於位置114(EU編號系統之位置234)的Phe取代為Val、於位置115(EU編號系統之位置255)的Leu取代為Ala及於位置289(EU編號系統之位置409)的Arg取代為Lys。

<用於降低源自IgG1固定區之C-終端胺基酸刪除之異質性的方法>

本發明亦關於用於降低抗體異質性的方法，其包括於包括序列編號：1之胺基酸序列之IgG1固定區中刪除於位置329(EU編號系統之位置446)的Gly及於位置330(EU編號系統之位置447)的Lys的步驟。本發明之用於降低抗體異質性的方法可包括其他胺基酸取代步驟，只要其包括於包括序列編號：1之胺基酸序列之IgG1固定區中刪除於位置330(EU編號系統之位置447)的Lys及於位置329(EU編號系統之位置446)的Gly及的步驟即可。取代後胺基酸之型態並無特別限制。取代例如可藉由上述之定點突變或實施例中所述方法而達成。

上述抗體固定區並無特別限制，且可使用於任何抗體。使用本發明固定區之抗體之例包含：

(a)包括序列編號：48之胺基酸序列之重鏈(VH4-M73)；

(b)包括序列編號：46之胺基酸序列之重鏈(VH3-M73)；

(c)包括序列編號：44之胺基酸序列之重鏈(VH5-M83)；

(d)包括序列編號：49之胺基酸序列之輕鏈(VL1-κ)；

(e)包括序列編號：47之胺基酸序列之輕鏈(VL3-κ)；

(f)包括序列編號：45之胺基酸序列之輕鏈(VL5-κ)；

(g)包括(a)之重鏈及(d)之輕鏈的抗體(FV3-M73)；

(h)包括(b)之重鏈及(e)之輕鏈的抗體(FV4-M73)；以及

(i)包括(c)之重鏈及(f)之輕鏈的抗體(FV5-M83)。

<包括抗體之醫藥組合物>

本發明提供包括本發明抗體之醫藥組合物。

除了該抗體之外，本發明之醫藥組合物可藉由習知方法與醫藥可接受載劑一起配方。例如，當抗體使用水或任何醫藥可接受液體配方為注射用無菌溶液或懸浮物時，該組合物可非經腸使用。例如，組合物可藉由合適地組合抗體與醫藥可接受載劑或介質而配方，具體地為無菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、媒劑、防腐劑、結合劑等，以一般可接受之醫藥實施所需要之單位劑量及形式將其混合。於該配方物中之活性成分含量可經調整以獲得於所需範圍內之合適劑量。

注射用無菌組合物可根據標準協定，使用媒劑如無菌注射水而配方。

使用於注射之水溶液包含，例如生理鹽水與含有葡萄糖或如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇及氯化鈉之其他輔劑的等張溶液。該等可與合適的助溶劑結合，如具體地為乙醇之醇、如丙二醇與聚乙二醇之多元醇類、以及如Polysorbate 80^TM 及HCO-50之非離子性界面活性劑。

油包括芝麻油與大豆油，且可與如苯甲酸芐酯或芐醇之助溶劑組合。其等亦可與下述者配方：緩衝液，如磷酸鹽緩衝液或乙酸鈉緩衝液；鎮痛劑，如普卡因鹽酸鹽；安定化劑，如芐醇或酚；或抗氧化劑。所製備之注射物典型地分裝取樣至合適的安瓿。

投藥較佳地為非經腸地，且具體地包括注射、鼻內投藥、肺內投藥及經皮投藥。例如，注射可藉由靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射或皮下注射而全身性或局部性投藥。

再者，投藥方法可根據患者的年齡及症狀而合適地選擇。含有抗體或編碼抗體之多核苷酸的醫藥組合物之單一劑量，可例如由每公斤體重之0.0001至1,000mg的範圍選擇。或者，劑量可為每人0.001至100,000mg的範圍。然而，劑量並不限於該等值。投藥之劑量與方法根據患者的體重及症狀而變化，且可由此項技術領域中具有通常知識者合適地選擇。

如使用於本文，三-字母與一-字母密碼所代表之胺基酸係如下述：

丙胺酸：　Ala(A)

精胺酸：　Arg(R)

天門冬醯胺：　Asn(N)

天門冬胺酸：　Asp(D)

半胱胺酸：　Cys(C)

麩胺醯胺：　Gln(Q)

麩胺酸：　Glu(E)

甘胺酸：　Gly(G)

組胺酸：　His(H)

異白胺酸：　Ile(I)

白胺酸：　Leu(L)

離胺酸：　Lys(K)

甲硫胺酸：　Met(M)

苯丙胺酸：　Phe(F)

脯胺酸：　Pro(P)

絲胺酸：　Ser(S)

羥丁胺酸：Thr(T)

色胺酸：Trp(W)

酪胺酸：Tyr(Y)

纈胺酸：Val(V)

本發明提供合適於醫藥品之抗體固定區，其物理性質(安定性與同質性)、免疫性、安全性與血漿中停留時間皆由胺基酸改變而經改良。

本文所述及之所有先前技術文獻皆併入本文作為參考文獻。

實施例

後文中，參照實施例進一步地說明本發明，但其不意味限制於該等。

實施例1：於酸性條件下IgG2及IgG4安定性的改良IgG2-或IgG4-轉化人源化IL-6受體抗體之表現載體的構築與該抗體的表現

為了降低Fcγ受體-結合活性，人源化抗人類IL-6受體抗體之固定區，人源化PM-1抗體(Cancer Res. 1993 Feb 15；53(4)：851-6)，其為IgG1同型物(isotype)，係經IgG2或IgG4(Mol. Immunol. 1993 Jan;30(1)：105-8)取代以產生分子WT-IgG2(序列編號：13)及WT-IgG4(序列編號：14)。使用動物細胞表現載體表現IgG。構築表現載體，其中使用於參考例1之人源化PM-1抗體(IgG1)之固定區係經NheI/NotI分解後，藉由接合(ligation)以IgG2或IgG4固定區取代。各DNA片段之核苷酸序列使用BigDyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)根據所附之指導手冊，以DNA定序儀(ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer or ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems))測定。藉由下述方法使用WTL鏈(序列編號：15)表現WT-IgG1、WT-IgG2與WT-IgG4。人類胚胎腎癌-衍生之HEK293H細胞(Invitrogen)懸浮於補充有10%胎牛血清(Invitrogen)之DMEM(Invitrogen)。對於貼附性細胞，細胞(10-ml/plate；細胞密度：5至6 x 10⁵ cells/ml)平鋪於碟中(10cm直徑；CORNING)且培養於CO₂ 培養箱中(37℃，5%CO₂ )培養一整日夜。然後，藉由吸引移除培養基，且添加6.9之CHO-S-SFM-II培養基(Invitrogen)。所製備之質體DNA混合物(總和13.8μg)與20.7μ1之1μg/ml聚伸乙亞胺(Polysciences Inc.)及690μ1之CHO-S-SFMII培養基組合。使所得混合物於室溫靜置10分鐘，且之後將細胞添加至各碟。細胞於CO₂ 培養箱中(37℃於5%CO₂ )培養4至5小時。然後，6.9ml之CHO-S-SFM-II培養基(Invitrogen)添加至碟，且細胞於CO₂ 培養箱中培養3日。收集培養上清液且離心(約2000g，5分鐘，室溫)以移除細胞，且通過0.22μm過濾器MILLEX^(R) -GV(Millipore)無菌化。樣品儲存於4℃直至使用。

(1)人源化PM-1抗體(PM-1VH+IgG1)H鏈，序列編號：12(胺基酸序列)

(2)人源化PM-1VH+IgG2H鏈，序列編號：13(胺基酸序列)

(3)人源化PM-1 VH+IgG4 H鏈，序列編號：14(胺基酸序列)

使用鹽酸純化經Protein A溶洗之WT-IgG1、WT-IgG2與WT-IgG4

50μl之懸浮於TBS的rProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)添加至所得培養上清液，且合併之溶液藉由於4℃回轉4小時或更久而混合。將溶液移轉至Ultrafree^(R) -MC(Millipore)的0.22-μm過濾杯。以500μl之TBS清洗3次後，rProtein A Sepharose^TM 樹脂懸浮於100μl之10mM HCl/150mM NaCl(pH 2.0)且使混合物靜置兩分鐘以溶洗抗體(鹽酸溶洗液)。立即地，藉由添加6.7μl之1.5M Tris-HCl(pH 7.8)中和溶洗液。溶洗進行兩次，製得200μl之經純化抗體。

藉由鹽酸溶洗純化之WT-IgGl、WT-IgG2與WT-IgG4之凝膠過濾層析法分析

藉由鹽酸溶洗所獲得之經純化樣品的凝集物中的含量，係藉由凝膠過濾層析法分析。

凝集估算方法：

系統：Waters Alliance

管柱：G3000SWxI(TOSOH)

移動相 50mM磷酸鈉，300mM KCl，pH 7.0

流速，波長：0.5ml/min，220nm

結果示於第1圖。雖然純化後WT-IgG1中凝集物之含量為約2%，但純化後WT-IgG2與WT-IgG4之含量為約25%。此建議IgG1於鹽酸溶洗中對於酸為安定的，且相對地，IgG2與IgG4為不安定的且進行變性/凝集。因此，IgG2與IgG4於酸性條件顯現的安定性較低於IgG1的安定性。Protein A經常使用於純化IgG分子，且IgG分子於酸性條件下由Protein A溶洗。此外，於開發IgG分子作為醫藥品中所需要之病毒失活化，通常於酸性條件下實施。因而期望IgG分子於酸性條件下的安定性較高。然而，發現IgG2與IgG4分子於酸性條件下的安定性比IgG1更低，且首次建議於酸性條件下開發IgG2與IgG4分子作為醫藥品時有變性/凝集的問題。期望當開發其等作為醫藥品時，可克服此變性/凝集的問題。然而，截至今日，尚未有報導經由胺基酸取代用以解決此問題之方法。

具有經改變之CH3域的WT-IgG2與WT-IgG4的純化與估算

IgG2與IgG4分子於酸性條件下的安定性顯現比IgG1的安定性低。因此，測試IgG2與IgG4分子之經改變形式於酸性條件下的安定性。根據用於IgG2與IgG4分子之固定區的模式，咸認為於酸性條件下之去安定化(destabilizing)可能因子之一為CH3-CH3域界面之不安定性。IgG2中於EU編號系統之位置397的甲硫胺酸或IgG4中於EU編號系統之位置409的精胺酸，被認為使CH3/CH3界面去安定化。由於IgG1於EU編號系統中的位置397與409分別為纈胺酸與離胺酸，製備包括於EU編號系統中於位置397的甲硫胺酸取代為纈胺酸之經改變的IgG2(IgG2-M397V，序列編號：16(胺基酸序列))以及包括於EU編號系統中於位置397的精胺酸取代為離胺酸之經改變的IgG4(IgG4-R409K，序列編號：17(胺基酸序列))。

使用於感興趣抗體之構築表現載體的方法、以及表現與純化抗體的方法，與上述鹽酸溶洗所使用者相同。進行凝膠過濾分析以估算由Protein A鹽酸溶洗所獲得經純化樣品中凝集物的含量。

凝集物估算方法：

系統：Waters Alliance

管柱：G3000SWx1(TOSOH)

移動相：50mM磷酸鈉，300mM KCl，pH 7.0

流速，波長：0.5ml/min,220nm

結果示於第1圖。雖然純化後WT-IgG1中凝集物之含量為約2%，但純化後WT-IgG2與WT-IgG4之含量為約25%。相對地，於具有經改變CH3域之變異株中，IgG2-M397V與IgG4-R409K，凝集物的含量相當於(約2%)1gG1者。此發現顯示IgG2或IgG4抗體於酸性條件下的安定性，可藉由IgG2於EU編號系統中於位置397的甲硫胺酸取代為纈胺酸或IgG4於EU編號系統中於位置409的精胺酸取代為離胺酸而改良。經純化抗體對抗20mM乙酸鈉、150mMNaCl、pH 6.0(EasySEP,TOMY)之溶液而透析。DSC測定(中點溫度(midpoint temperature)與Tm值的測定)係於約0.1mg/ml的蛋白質濃度以1℃/min的加熱速率由40至100℃實施。再者，測定WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V與IgG4-R409K之熱變性(thermal denaturation)之中點溫度。結果顯示，對於經改變之CH3域的Tm值，分別相較於wT-IgG2與WT-IgG4，於IgG2-M397V與IgG4-R409K中較高。此結果建議，由熱安定性的觀點而言，分別相較於WT-IgG2與WT-IgG4，IgG2-M397V與IgG4-R409K亦較為優異。

於病毒失活步驟與使用Protein A的純化步驟中，IgG2與IgG4暴露於酸性條件。因此，於上述步驟之變性/凝集成為問題。然而，發現藉由使用IgG2-M397V與IgG4-R409K於IgG2與IgG4固定區的序列可解決該問題。因此，顯現該等改變非常有用於開發IgG2與IgG4抗體醫藥品。再者，IgG2-M397V與IgG4-R409K的有用性亦藉由其優異的熱安定性而顯現。

實施例2：衍生自IgG2雙硫鍵之異質性的改良由Protein A經鹽酸溶洗WT-IgG1、WT-IgG2與wT-IgG4的純化

50μ1之懸浮於TBS的rProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)添加至實施例1所得培養上清液，且合併之溶液藉由於4℃回轉4小時或更久而混合。將溶液移轉至Ultrafree^(R) -MC(Millipore)的0.22-μm過濾杯。以500μ1之TBS清洗3次後，rProteinA Sepharose^TM 樹脂懸浮於100μ1之50mM乙酸鈉(pH3.3)水溶液且使混合物靜置兩分鐘以溶洗抗體。立即地，藉由添加6.7μl之1.5M Tris-HCl(pH 7.8)中和溶洗液。進行兩次溶洗，製得200μl之經純化抗體。

藉由陽離子交換層析(IEC)之WT-IgG1、WT-IgG2與WT-IgG4之分析

經純化之WT-IgG1、WT-IgG2與WT-IgG4藉由陽離子交換層析法分析同質性。

使用IEC之估算方法：

系統：Waters Alliance

管柱：ProPac WCX-10(Dionex)

移動相A：25mM MES-Na0H,pH 6.1

B：25mM MES-NaOH,250mM Na-乙酸鹽，pH 6.1

流速，波長：0.5ml/min,280nm

梯度B：於WT-IgG1之分析中為50%至75%(75min)

B：於WT-IgG2與wT-IgG4之分析中為30%至55%(75min)

結果示於第2圖。WT-IgG2於離子交換分析中顯示超過一個波峰，而WT-IgG1與WT-IgG4顯現單一波峰。此建議，相較於IgG1與IgG4，IgG2分子為更異質性的。確實地，已報導IgG2同型物具有衍生自鉸鏈區之雙硫鍵的異質性(Chu GC et al.,Pharm. Res. 2007 Mar 24;24(6)：1145-56)。因此，顯示於第2圖之IgG2的雜峰(hetero-peaks)亦認定為期望物質/衍生自雙硫鍵之相關物質。大規模的製造抗體藥品而維持製造之間的期望物質/相關物質之異質性的差異為困難的，且因而開發作為醫藥品之抗體分子為期望盡可能有同質性(較低異質性)的分子。對於野生型IgG2，於開發抗體醫藥品中有重要的同質性問題。確實地，美國專利US20060194280(A1)已顯示天然IgG2於離子交換層析法分析中獲得雜峰(為雙硫鍵之結果)，且生物活性於雜峰間變化。美國專利US20060194280(A1)報導於純化步驟中之重新折疊作為組合雜峰為單一波峰之方法，但於製造中使用該步驟為成本高且複雜的。因此，用於組合該雜峰成為單一波峰之較佳方法係以胺基酸取代為主。雖然應克服源自鉸鏈區雙硫鍵之異質性以開發IgG2作為醫藥品，但截至目前仍無報導關於經由胺基酸取代解決此問題之方法。

經改變WT-IgG2 CH1域與鉸鏈區之製備與估算

如示於第3圖，對於IgG2分子有多可能的雙硫鍵型態。雙硫鍵與游離半胱胺酸之差異型態，為衍生自IgG2鉸鏈區之異質性的可能成因。IgG2具有兩個半胱胺酸(EU編號系統之位置219與220)於上鉸鏈區，且緊鄰該二上-鉸鏈半胱胺酸之半胱胺酸包含H鏈CH1域之EU編號系統中位置131的半胱胺酸與L鏈C-終端半胱胺酸，以及於二聚體H鏈之上鉸鏈的兩個相應的半胱胺酸。具體地，當抗體組合為H2L2形式時，於IgG2之上鉸鏈區的附近有總數為8的半胱胺酸。此可為起因於錯誤雙硫鍵與游離般光胺酸之各種異質性型態的理由。

IgG2之鉸鏈序列與CH1係經改變以降低源自IgG2鉸鏈區之異質性。進行測試以避免起因於雙硫鍵與游離半胱胺酸之差異型態的IgG2異質性。測試多種經改變抗體的結果建議，可不降低熱安定性而避免異質性，此係藉由於野生型IgG2固定區序列之H鏈CHl域中分別於EU編號系統之位置131與133之半胱胺酸與精胺酸取代為絲胺酸與離胺酸，以及於H鏈之上鉸鏈之EU編號系統之位置219的半胱胺酸取代為絲胺酸(後文稱為IgG2-SKSC，序列編號：18)。該等取代將使IgG2-SKSC於H與L鏈間形成同質性共價鍵，其為L鏈的C-終端半胱胺酸與EU編號系統之位置220的半胱胺酸之間的雙硫鍵(第4圖)。

使用揭示於參考例1之方法，構築IgG2-SKSC表現載體且表現與純化IgG2-SKSC。經純化之IgG2-SKSC與野生型IgG2(WT-IgG2)藉由離子交換層析法分析。

使用IEC之估算方法：

系統：Waters Alliance

管柱：ProPac wCX-10(Dionex)

移動相A：25mM MES-NaOH,pH5.6

B：25mM MES-NaOH,250mM Na-乙酸鹽,pH5.6

流速，波長：0.5ml/min,280nm

梯度B：50%至100%(75min)

結果示於第5圖。如上述所預期的，IgG2-SKSC顯示經溶洗為單一波峰而WT-IgG2獲得多波峰。此建議衍生於IgG2之鉸鏈區的異質性可使用例如用於產生IgG2-SKSC的改變而避免，該改變使L鏈之C-終端半胱胺酸與EU編號系統之位置220的半胱胺酸之間形成單一雙硫鍵。WT-IgG1、WT-IgG2與IgG2-SKSC之熱變性的中點溫度係藉由相同於實施例1揭示的方法而測定。結果顯示WT-IgG2獲得Fab域之波峰，該Fab域具有比WT-IgG1更低的Tm值，而IgG2-SKSC不獲得該波峰。此建議於熱安定性上，相較於WT-IgG2，IgG2-SKSC亦較優異。

雖然野生型IgG2被認為具有於開發抗體醫藥品為重要的同質性問題，但發現此問題可藉由使用IgG2-SKSC於IgG2的固定區而解決此問題。因此，IgG2-SKSC非常有用於開發IgG2抗體醫藥品。再者，IgG2-SKSC之有用性亦藉由發現其為熱安定性優異而顯現。

實施例3：IgG分子中C-終端異質性的改良白WT-IgG1之H鏈C-終端ΔGK抗體之表現載體的構築

有報導關於抗體C-終端序列之異質性，其為起因於兩個C-終端胺基酸之甘胺酸與離胺酸的刪除所致之C-終端胺基酸殘基的刪除與C-終端胺基之醯胺化的結果(Johnson KA et al., Anal. Biochem. 2007 Jan 1;360(1)：75-83)。當開抗體醫藥品時，較佳為缺乏該異質性。事實上，於人源化PM-1抗體TOCILIZUMAB中，主要成分為缺乏C-終端胺基酸離胺酸之序列，其為核苷酸序列所編碼但刪除後轉譯修飾(post-translational modification)，以及具有離胺酸之次要成分亦共存為異質性。因此，C-終端胺基酸序列係經改變以降低C-終端異質性。具體地，本發明者們改變野生型IgG1之核苷酸序列，以刪除源自IgG1之H鏈固定區之C-終端離胺酸與甘胺酸，且確定C-終端胺基之醯胺化是否能藉由刪除兩個C-終端胺基酸之甘胺酸與離胺酸而受到抑制。

使用於參考例1所獲得之編碼人源化PM-1抗體(WT)之pB-CH載體，將突變導入H鏈之C終端序列。編碼EU編號系統中於位置447的離胺酸及/或於位置446的甘胺酸，係使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，根據所附之操作指南所揭示之方法，導入突變而轉化為中止密碼(stop codon)。因此，構築經基因工程而缺乏C-終端胺基酸之離胺酸(EU編號系統之位置447)的抗體以及經基因工程而缺乏兩個C-終端胺基酸之甘胺酸與離胺酸(分別為EU編號系統之位置446與447)的抗體之表現載體。藉由表現該人源化PM-1抗體之經基因工程之H鏈與L鏈獲得H鏈C-終端　K與ΔGK抗體。抗體藉由參考例1揭示之方法表現與純化。

經純化之H鏈C-終端ΔGK抗體根據下述步驟，藉由陽離子交換層析法分析。C-終端刪除對於異質性的效果，藉由陽離子交換層析法，根據下述方法使用經純化之H鏈C-終端ΔGK抗體估算。陽離子交換層析法分析之條件係如下文所述。比較PM-1抗體、H鏈C-終端ΔK抗體與H鏈C-終端ΔGK抗體之層析圖。

管柱：ProPac WCX-10(Dionex)

移動相A：25mmol/l MES/NaOH,pH 6.1

B：25mmol/l MES/NaOH,250mmol/l NaCl,pH 6.1

流速：0.5ml/min

梯度：25% B(5min)->(105min)->67% B->(1min)->100% B(5min)

偵測：280nm

未改變之人源化PM-1抗體、H鏈C-終端ΔK抗體與H鏈C-終端ΔGK抗體之分析結果示於第6圖。根據Chu GC等人(Pharm. Res. 2007 Mar 24;24(6)：1145-56)，具有較主波峰(main peak)為更延長的滯留時間的基峰(basic peak)，含有H鏈C終端於位置449具有Lys以及H鏈C終端於位置447具有Pro。基峰的強度顯著地於H鏈C-終端ΔGK抗體中降低，而於H鏈C-終端ΔK抗體中未觀察到該顯著的降低。此建議H鏈之C-終端異質性僅可在兩個C-終端胺基酸由H鏈刪除時為之降低。

H鏈C-終端ΔGK抗體之熱變性溫度藉由DSC測定，確認於H鏈C-終端之兩的胺基酸的刪除，對於熱安定性的效果。為了DSC測定，抗體以150mM NaC之120mM乙酸緩衝液(pH 6.0)透析，轉換緩衝液。經脫氣後，人源化PM-1抗體與H鏈C終端ΔGK抗體溶液，以及參考溶液(外透析液)密封至熱量槽(calorimetric cell)，且均勻地於40℃熱平衡。然後，以速率約1K/min由40至100℃掃描樣品。註解所得變性峰(Rodolfo et al.,Immunology Letters,1999,p47-52)。結果顯示C-終端刪除對於CH3域之熱變性溫度沒有效果。

因此，源自C-終端胺基酸之異質性，可藉由於核苷酸層級，由H鏈固定區刪除C-終端離胺酸與甘胺酸而降低，且不影響抗體之熱安定性。由於所有人類抗體IgG1、IgG2與IgG4的固定區，皆於其C-終端序列中EU編號系統之位置446與447含有Gly與Lys，所以於此實施例與其他實施例所發現之降低C-終端胺基酸異質性的方法，亦期待應用於IgG2與IgG4固定區。

實施例4：具有新穎之最適化固定區序列之M14ΔGK的構築

當抗體醫藥品目標為中和抗原時，例如Fc域之ADCC的效應子功能為必需的且因而對Fcγ受體的結合為非必需的。由免疫性與不良作用的觀點，認定對Fcγ受體的結合為不佳的(Strand V et al.,Nat. Rev. Drug Discov. 2007 Jan;6(1)：75-92;Gessner JE et al.,Ann. Hematol. 1998 Jun;76(6)：231-48)。人源化抗-IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB不需要結合至Fcγ受體，因期僅需要特異地結合至IL-6受體以及中和其生物活性，以使用作為例如類風濕性關節炎之IL-6相關疾病的治療劑。

M14ΔGK、M11ΔGK與M17ΔGK，Fcγ受體-非結合、最適化固定區之構築與估算

一種減弱Fcγ受體結合的可能方法為將IgG抗體由IgG1同型物轉換為IgG2或IgG4同型物(Ann. Hematol. 1998 Jun;76(6)：231-48)。作為完全去除對Fcγ受體結合的方法，已報導將人工改變導入至Fc域的方法。例如，由於抗-CD3抗體與抗-CD4抗體的效應子功能引起不良作用，不存在於野生型序列之胺基酸突變已導入至Fc域之Fcγ受體-結合區(Cole MS et al.,J. Immunol. 1997 Oct 1;159(7)：3613-21;Reddy MP et al.,J. Immunol. 2000 Feb 15;164(4)：1925-33)，且所得之Fcγ受體-非結合抗-CD3及抗-CD4抗體正於臨床試驗中(Strand V et al.,Nat. Rev. Drug Discov. 2007 Jan;6(1)：75-92;Chau LA et al.,Transplantation 2001 Apr 15;71(7)：941-50)。根據另一報導(WO 99/58572)，Fcγ受體-非結合抗體可藉由將IgG1之FcγR-結合域(EU編號系統中於位置233、234、235、236、327、330及331)轉換為IgG2之序列(EU編號系統中於位置233、234、235與236)或IgG4之序列(EU編號系統中於位置327、330與33)而製備。然而，若上述所有突變皆導入IgG1，將產生有潛力作為非天然T-細胞抗原決定基肽之九個胺基酸之新穎肽序列，而此增加免疫性風險。。於開發抗體醫藥品中，免疫性應最小化。

為了克服上述問題，考慮於IgG2固定區之改變。於IgG固定區之FcγR-結合域，EU編號系統中於位置327、330與331的殘基，不同於IgG4之非結合序列，而EU編號系統中於位置233、234、235與236為非結合型之胺基酸EU編號系統中於位置327、330與331的胺基酸改變為IgG4之序列(G2Δa揭示於Eur. J. Immunol. 1999 Aug;29(8)：2613-24)。然而，由於EU編號系統中於位置339的胺基酸為丙胺酸，而於IgG2相對應之殘基為甲硫胺酸，EU編號系統中於位置327、330與331的胺基酸的簡單改變為IgG4之序列，不佳地產生9個胺基酸之新穎肽序列，有潛力作為非天然T-細胞抗原決定基肽，且因而增加免疫性風險。然後，本發明者們發現，除了上述改變之外，於IgG2中藉由導入EU編號系統中於位置339的甲硫胺酸取代為丙胺酸，可避免新穎肽序列之產生。

除了上述突變之外，導入其他突變，且其等為IgG2中EU編號系統中於位置397的甲硫胺酸取代為纈胺酸，其發現於實施例1以改良IgG2於酸性條件之安定性；以及EU編號系統中於位置131的半胱胺酸取代為絲胺酸、EU編號系統中於位置133的精胺酸取代為離胺酸以及EU編號系統中於位置219的半胱胺酸取代為絲胺酸，其發現於實施例2以改良源自鉸鏈區雙硫鍵之異質性。再者，由於於位置131與133之突變產生9個胺基酸之新穎肽序列，有潛力地作為非天然T-細胞抗原決定基肽，且因而增加免疫性風險，因此於位置131至139附近之肽序列，藉由導入EU編號系統中於位置137的麩胺酸取代為甘胺酸以及EU編號系統中於位置138之絲胺酸取代為甘胺酸，轉換為天然人類序列。再者，EU編號系統中於位置446與447的甘胺酸與離胺酸，由H鏈之C終端刪除以降低C-終端異質性。具有所有經導入突變之固定區序列命名為M14ΔGK(M14ΔGK，序列編號：5)。雖然M14ΔGK於位置219的半胱胺酸突變為絲胺酸為新穎9個胺基酸序列而有潛力作為T-細胞抗原決定基肽，但由於絲胺酸的性質類似於半胱胺酸的性質而任定免疫性風險非常低。藉由TEPITOPE之免疫性預測亦建議於免疫性無差異。

對於抗體H鏈之可變區為WT且固定區為M14ΔGK(M14ΔGK，序列編號：5;WT-M14ΔGK，序列編號：19)之表現載體系藉由參考例1揭示之方法構築。具有M14ΔGK作為H鏈及WT作為L鏈之抗體，藉由參考例1揭示之方法表現與純化。

再者，WT-M11ΔGK(M11ΔGK，序列編號：8;WT-M11ΔGK，序列編號：21)中，以相同方法將突變導入IgG4固定區於EU編號系統中於位置233、234、235與236(G4Δb揭示於Eur. J. Immunol. 1999 Aug;29(8)：2613-24；此改變新產生非人類序列且因而增加免疫性風險)以降低Fcγ受體結合。除了上述改變之外，為了降低免疫性風險，於EU編號系統中於位置131、133、137、138、214、217、219、220、221與222導入突變，以使鉸鏈區雙硫鍵之型態與M14ΔGK相同；於EU編號系統中於位置409導入突變(實施例1)以改良於酸性條件之安定性；以及於EU編號系統中於位置446與447的胺基酸刪除(實施例3)，以降低C-終端異質性。

再者，構築WT-M17ΔGK(M17ΔGK，序列編號：10;WT-M17ΔGK，序列編號：20)，藉由於IgG1固定區於EU編號系統中於位置233、234、235、236、327、330、331與339導入突變(G1Δab揭示於Eur. J. Immunol. 1999 Aug;29(8)：2613-24)，以減弱Fcγ受體結合且藉由刪除於EU編號系統中於位置446與447的胺基酸以降低C-終端異質性(實施例3)。

WT-M17ΔGK或WT-M11ΔGK使用作為H鏈，且WT使用作為L鏈。該等抗體藉由參考例1揭示之方法表現與純化。

WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK對於Fcγ受體結合活性之估算

FcγR結合活性藉由下述步驟估算。使用Biacore T100，人類衍生之Fcγ受體I(後文稱為FcγRI)經固定至感應晶片使其與作為分析物之IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK或M17ΔGK交互作用。比較結合抗體量。測量係使用Recombinant Human FcRIA/CD64(R&D systems)作為人類衍生之FcγRI，以及IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK與M1ΔGK作為樣品進行。FcγRI藉由胺偶合方法經固定至感應晶片CM5(BIACORE)。經固定FcγRI之最終量為13000RU。泳動緩衝液(running buffer)使用HBS-EP+，且流速為20μl/min。樣品濃度使用HBS-EP+調整為100μg/ml。分析包含下述兩步驟：兩分鐘締合相(association phase)，其中注射10μl抗體溶液；以及後續的四分鐘分離相(dissociation phase)，其中注射物換為HBS-EP+。分離相後，感應晶片藉由注射20μl之5mM氫氧化鈉與更新(regenerate)。締合、分離與更新構成一個循環。注射各種抗體溶液以獲得感應圖譜(sensorgram)。作為分析物，依次序注射IgG4、IgG2、IgG1、M11、M14與M17。此注射系列重複兩次。測定結合抗體量之數據比較結果示於第7圖。比較結果顯示結合抗體量依下述次序降低：IgG1＞IgG4＞＞IgG2=M11ΔGK=M14ΔGK=M17ΔGK。因此，其顯示野生型IgG2、M11ΔGK、M14ΔGK與M17ΔGK之FcγRI結合較野生型IgG1與IgG4弱。

FcγRIIa結合係藉由下述步驟估算。使用Using Biacore T100，人類衍生之Fcγ受體IIa(後文稱為FcγRIIa)經固定至感應晶片使其與作為分析物之IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK或M17ΔGK交互作用。測量係使用Recombinant Human FcRIIA/CD32a(R&D systems)作為人類衍生之FcγRIIa，以及IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK與M17ΔGK作為樣品進行。FcγRIIa藉由胺偶合方法經固定至感應晶片CM5(BIACORE)。經固定FcγRIIa之最終量為3300RU。泳動緩衝液(running buffer)使用HBS-EP+，且流速為20μl/min。然後，注射電泳緩衝液直到基線穩定為止。測量於基線穩定後進行。使經固定之FcγRIIa與作為分析物之各IgG同型物(IgG1、IgG2或IgG4)之抗體或導入突變之抗體(M11ΔGK、M14ΔGK或M17ΔGK)。觀察結合的抗體量。泳動緩衝液使用HBS-EP+，且流速為20μl/min。測量溫度為25℃。各IgG或其經改變型式之濃度調整為100μg/ml。注射20μl分析物且使其與固定之FcγRIIa交互作用。交互作用後，分析物由FcγRIIa分離且該感應晶片藉由注射200μ1泳動緩衝液而更新。作為分析物，依序注射IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK與M17ΔGK。此注射系列重複兩次。測定結合抗體量之數據比較結果示於第8圖。比較結果顯示結合抗體量依下述次序降低：IgG1>IgG2=IgG4>M11ΔGK=M14ΔGK=M17ΔGK。因此，其顯示M11ΔGK、M14ΔGK與M17ΔGK之FcγRIIa結合較野生型IgG1、IgG2與IgG4弱。

FcγRIIb結合係藉由下述步驟估算。使用Using Biacore T100，人類衍生之Fcγ受體IIb(後文稱為FcγRIIb)經固定至感應晶片使其與作為分析物之IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK或M17ΔGK交互作用。測量係使用Recombinant Human FcRIIB/C(R&D systems)作為人類衍生之FcγRIIb，以及IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK與M17ΔGK作為樣品進行。FcγRIIb藉由胺偶合方法經固定至感應晶片CM5(BIACORE)。經固定FcγRIIb之最終量為4300 RU。然後，注射泳動緩衝液直到基線穩定為止。測量於基線穩定後進行。使經固定之FcγRIIa與作為分析物之各IgG同型物(IgG1、IgG2或IgG4)之抗體或導入突變之抗體(M11ΔGK、M14ΔGK或M17ΔGK)。觀察結合的抗體量。泳動緩衝液(running buffer)使用HBS-EP+，且流速為20μ1/min。測量溫度為25℃。各IgG或其經改變型式之濃度調整為200μg/ml。注射20μ1分析物且使其與固定之FcγRIIb交互作用。交互作用後，分析物由FcγRIIb分離且該感應晶片藉由注射200μ1泳動緩衝液而更新。作為分析物，依序注射IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK與M17ΔGK。此注射系列重複兩次。測定結合抗體量之數據比較結果示於第9圖。比較結果顯示結合抗體量依下述次序降低：IgG4＞IgG1＞IgG2＞M11ΔGK=M14ΔGK=M17ΔGK。因此，其顯示M11ΔGK、M14ΔGK與M17ΔGK之FcγRIIb結合較野生型IgG1、IgG2與IgG4弱。

FcγRIIIa結合係藉由下述步驟估算。使用Using Biacore T100，人類衍生之Fcγ受體IIIa(後文稱為FcγRIIIa)經固定至感應晶片使其與作為分析物之IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK或M17ΔGK交互作用。測量係使用hFcγRIIIaV-His6(申請人的公司所製備之重組hFcγRIIIaV-His6)作為人類衍生之FcγRIIIa，以及IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK與M17ΔGK作為樣品進行。FcγRIIIa藉由胺偶合方法經固定至感應晶片CM5(BIACORE)。經固定hFcγRIIIaV-His6之最終量為8200RU。泳動緩衝液(running buffer)使用HBS-EP+，且流速為5μl/min。樣品濃度使用HBS-EP+調整為250μg/ml。分析包含下述兩步驟：兩分鐘締合相(association phase)，其中注射10μl抗體溶液；以及後續的四分鐘分離相(dissociation phase)，其中注射物換為HBS-EP+。分離相後，感應晶片藉由注射20μ1之5mM氫氧化鈉與更新(regenerate)。締合、分離與更新構成一個循環。注射各種抗體溶液以獲得感應圖譜(sensorgram)。作為分析物，依次序注射IgG4、IgG2、IgG1、M11ΔGK、M14ΔGK或M17ΔGK。測定結合抗體量之數據比較結果示於第10圖。比較結果顯示結合抗體量依下述次序降低：IgG1>>IgG4>IgG2>M17ΔGK>M11ΔGK=M14ΔGK。因此，其顯示M11ΔGK、M14ΔGK與M17ΔGK之FcγRIIIa結合較野生型IgG1、IgG2與IgG4弱。再者，M11ΔGK與M14ΔGK之FcγRIIIa結合發現比含有報導於Eur. J. Immunol. 1999 Aug；29(8)：2613-24之突變G1Δab的 M17ΔGK者為弱。

上述此發現顯示，WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK之Fcγ受體結合，相較於野生型IgG1，顯著地降低。由於Fcγ受體媒介之交互作用於APC之免疫性風險以及由例如ADCC之效應子作用所引起之不良作用，可藉由使用WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK或WT-M11ΔGK作為固定區而避免。因此，WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK有用於作為目標為中和抗原之抗體醫藥品的固定區。

WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK對於高濃度安定性之估算

估算WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK對於高濃度之安定性。WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK之經純化抗體，相對於20mM組胺酸氯、150mMNaCl，pH 6.5(EasySEP,TOMY)之溶液透析，然後藉由超過濾濃縮。測試抗體於高濃度之安定性。條件如下述。

抗體：WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK緩衝液：20mM組胺酸氯、150mM NaCl，pH 6.5

濃度：61mg/ml

儲存溫度與時間期間：40℃兩週，40℃一個月，40℃兩個月

凝集物估算方法：

系統：Waters Alliance

管柱：G3000SWx1(TOSOH)

移動相：50mM磷酸鈉，300mM KCl，pH 7.0

流速，波長：0.5ml/min，220nm

分析稀釋100倍之樣品

於起始配方物(製備後立即)中及於各種條件儲存後之配方物中之凝集物含量，係藉由上述之凝膠過濾層析法估算。相對起始配方戊之凝集物含量的差異(增加量)顯示於第11圖。結果顯示，相較於WT-IgG1，WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK之凝集物量些為增加且約為WT含量之一半。再者，如第12圖所示，增加的Fab片段量於WT-IgG1與WT-M17ΔGK之間為相當的，WT-M14ΔGK與WT-M11ΔGK中的增加量為約WT中的量的四分之一。IgG型抗體配方物之代謝途徑包含揭示於WO 2003/039485之凝集物的形成與Fab降解的產生。根據該二標準，凝集物與Fab片段產生，相較於WT-IgG1，WT-M14ΔGK與WT-M11ΔGK顯示配方物具有優異安定性。因此，即便具有為不佳安定性之IgG1固定區且無法以高濃度液體配方物製備為抗體醫藥品的抗體，使用WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK作為固定區，期望能產生更安定之高濃度液體配方物。

特別地，WT-M14ΔGK期望為非常有用於作為新穎固定區序列，其可(1)克服原始IgG2分子於酸性條件下之不安定性；(2)改良源自鉸鏈區雙硫鍵之性；(3)不結合至Fcγ受體；(4)具有最小數目之有潛力作為T-細胞抗原決定基肽之9個胺基酸之新穎肽序列；以及(5)於高濃度配方物具有較佳於IgG1之安定性。

實施例5：M31ΔGK之製備與估算

製備於實施例4之M14ΔGK係藉由取代IgG2序列於Eu編號系統中之位置330、331與339而構築M31ΔGK(M31ΔGK，序列編號：7)。藉由參考例1揭示之方法構築用於其可變區為WT且固定區序列為M31ΔGK(WT-M31ΔGK，序列編號：22)之抗體H鏈之序列的表現載體。使用WT-M31ΔGK作為H鏈與WT作為L鏈，藉由參考例1揭示之方法表現與純化WT-M31ΔGK。

除了同時表純化WT-M31ΔGK、WT-IgG2與WT-M14ΔGK之外，且藉由下述步驟之陽離子交換層析法分析。使用於陽離子交換層析法分析之條件係如下述。比較WT-IgG2、WT-M14ΔGK與WT-M31ΔGK之色譜圖。

管柱：ProPac WCX-10(Dionex)

移動相A：25mmol/l MES/NaOH,pH 6.1

B：25mmol/l MES/NaOH,250mmol/l NaCl,pH 6.1

流速：0.5ml/min

梯度：0% B(5min)-＞(65min)-＞100% B-＞(1min)

偵測：280nm

WT-IgG2、WT-M14ΔGK與WT-M31ΔGK之分析結果示於第13圖。如同WT-M14ΔGK，WT-M31ΔGK顯示經溶洗為單峰，而WT-IgG2獲得多波峰。此酯式衍生自IgG2鉸雙硫鍵之異質性亦可避免於WT-M31ΔGK。

實施例6：WT-M14之血漿停留時間之估算用於計算人類血漿中停留時間之方法

IgG分子於想將中之延長的停留時間(慢速廓清(slowelimination))已知起因於FcRn作用(FcRn已知為IgG分子之補救受體(salvage receptor))(Nat. Rev. Immunol. 2007 Sep;7(9)：715-25)。當經由吞飲作用(pinocytosis)併入內體(endosomes)時，於內體中之酸性條件下(約pH 6.0)，IgG分子結合製表現於內體之FcRn。雖然不結合至FcRn之IgG分子經轉移且降解於溶小體(lysosomes)，結合至FcRn者則轉位至細胞表面且然後由FcRn釋放回返至血漿而對抗血漿之中性條件(約pH 7.4)。

已知IgG-型抗體包含IgG1、IgG2、IgG3與IgG4同型物。人類中該等同型物之血漿半衰期已報導對於IgG1與IgG2為約36日；對於IgG3為約29日；以及對於IgG4為約16日(Nat. Biotechnol. 2007 Dec;25(12)：1369-72)。因此，IgG1與IgG2於血漿值停留時間相信為最長者。一般而言，使用於醫藥劑之抗體同型物為IgG1、IgG2與IgG4。用於進一步延長IgG抗體於血漿中之停留時間的方法包括用於改良上述對於人類FcRn之結合活性的方法，且此係藉由改變IgG固定區之序列而達成(J. Biol. Chem. 2007 Jan 19;282(3)：1709-17;J. Immunol. 2006 Jan 1;176(1)：346-56)。

於小鼠FcRn與人類FcRn之間有種特異性的差異(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Dec 5;103(49)：18709-14)。因此，為了預測經改變之人類固定區序列之IgG抗體的血漿停留時間，期望於人類FcRn基因轉殖鼠中估算對人類FcRn之結合與血漿中停留時間(Int. Immunol. 2006 Dec;18(12)：1759-69)。

對人類FcRn之結合的估算

FcRn為FcRn與β2-微球蛋白之複合物。根據已揭示之人類FcRn基因序列(J. Exp. Med. (1994)180(6),2377-2381)，製備寡-DNA引子。編碼全基因之DNA片段，使用人類cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA,Clontech)作為模板以及所製備之引子藉由PCR製備。使用所獲得之DNA片段作為模板，將含有信號區(Met1-Leu290)之細胞外域(extracellular domain)藉由PCR擴增，且插入動物細胞表現載體(人類FcRn之胺基酸序列如前述序列編號：24)。同樣地，根據已揭示之人類β2-微球蛋白基因序列(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(2002)99(26),16899-16903)，製備寡-DNA引子。編碼全基因之DNA片段，使用人類cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA,Clontech)作為模板以及所製備之引子藉由PCR製備。使用所獲得之DNA片段作為模板，含有信號區(Met1-Met119)之編碼全β2-微球蛋白之DNA片段藉由PCR擴增，且插入動物細胞表現載體(人類β2-微球蛋白之胺基酸序列如前述序列編號：25)。

可溶之人類FcRn藉由下述步驟表現。構築用於FcRn與β2-微球蛋白之質體，藉由微脂粒感染以10%胎牛血清(Invitrogen)，導入至人類胚胎腎癌衍生之細胞株HEK293H(Invitrogen)。收集所得培養上清液，且藉由揭示於J. Immunol. 2002 Nov 1;169(9)：5171-80之方法，使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)純化，接著使用HiTrap Q HP(GE Healthcare)進一步純化。

使用Biacore 3000估算對人類FcRn之結合。結合至Protein L或兔子抗-人類IgG Kappa鏈抗體之抗體，經固定於感應晶片，添加人類FcRn作為分析物與抗體交互作用，且由結合人類FcRn之量計算親和性(KD)。具體地，Protein L或兔子抗-人類IgG Kappa鏈抗體係藉由胺偶合方法，使用含有150mM NaCl之50mM Na-磷酸鹽緩衝液(pH 6.0)作為泳動緩衝液，固定於感應晶片CM5(BIACORE)。然後，抗體以含有0.02% Tween20之泳動緩衝液稀釋，且注射以結合至該晶片。然後注射人類FcRn且估算人類FcRn對抗體之結合活性。

使用BIAevaluation Software計算親和性。所獲得之感應圖譜用於計算最終人類FcRn注射前之立即的結合至抗體的hFcRn的量。抗體對於人類FcRn之親和性，藉由相當的恆定狀態親和性方法計算。

人類FcRn基因轉殖鼠中血漿停留時間的估算

人類FcRn基因轉殖鼠中之藥物動力學(活體內動力學)(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ mice;Jackson Laboratories)界下述步驟估算。抗體以劑量1mg/kg，靜脈內對老鼠投藥一次，且於合適時間點收集血液。所收集血液立即以15,000rpm於4℃離心15分鐘以獲得血漿。分離之血漿直至使用前儲存於-20℃或更低溫之冷凍櫃。血漿濃度藉由ELISA測定。

WT-M14於人類之血漿停留時間的預言性估算

WT-IgG1與WT-M14對結合至人類FcRN之活性，藉由BIAcore估算。如表1所示，結果顯示WT-M14之結合活性些略高於WT-IgG1之結合活性。

如示於第14圖，當使用人類FcRn基因轉殖鼠估算時，WT-IgG1與WT-M14之間的血漿停留時間為相當的。此發現建議人類M14固定區之血漿停留時間為相當於IgG1固定區之血漿停留時間。

實施例7：具有良好血漿中停留時間之WT-M44、WT-M58與WT-M73的製備 WT-M58分子之製備

如實施例6所揭示者，人類FcRn基因轉殖鼠中WT-M14之血漿停留時間為相當於WT-IgG1之血漿停留時間。用於改良血漿停留時間之已知方法包含該等用於降低抗體之等電點者以及增強對FcRn結合者。此處，導入下述修改以改良WT-M14之血漿停留時間。具體地，導入下述取代至WT-M31ΔGK，其係如實施例4所揭示，由WT-M14製備：於EU編號系統中，於位置397的纈胺酸取代為甲硫胺酸；於位置268的組胺酸取代麩胺醯胺；於位置355的精胺酸取代為麩胺醯胺；以及於位置419的麩胺醯胺取代為麩胺酸。此四個取代導入至WT-M31ΔGK以產生WT-M58(序列編號：26之胺基酸序列)。表現載體藉由實施例1所揭示之方法製備。WT-M58與L(WT)分別使用作為H鏈與L鏈。藉由實施例1所揭示之方法表現與純化WT-M58。

WT-M73分子之構築

另一方面，WT-M44(序列編號：27之胺基酸序列)，係藉由將EU編號系統中，於位置434的胺基酸取代為丙胺酸之取代導入至IgG1。WT-M83(序列編號：58之胺基酸序列)亦藉由刪除EU編號系統中於位置446的甘胺酸以及於位置447的離胺酸而產生，以降低H鏈C-終端異質性。再者，WT-M73(序列編號：28之胺基酸序列)意藉由將EU編號系統中，於位置434的胺基酸取代為丙胺酸之取代導入至WT-M83而產生。

上述抗體之表現載體係藉由實施例1揭示之方法構築。WT-M44、WT-M58或WT-M73使用作為H鏈，而L(WT)使用作為L鏈。WT-M44、WT-M58與WT-M73藉由實施例1揭示之方法表現與純化。

人類中WT-M44、WT-M58與WT-M73之血漿停留時間之預測性估算

WT-IgG1、WT-M44、WT-M58與WT-M73對人類FcRn之結合活性，藉由BIAcore估算。如表2所示，結果顯示WT-M44、WT-M58與WT-M73之結合活性較大於WT-IgG1，且分別為WT-IgG1之約、2.7倍、1.4倍與3.8倍。

作為人類FcRn基因轉殖鼠中，WT-IgG1、WT-M14與WT-M58之血漿停留時間之估算結果，如第24圖所示。相對於WT-IgG1與WT-M14，WT-M58確認具有增加的血漿停留時間。再者，估算WT-IgG1、WT-M44、WT-M58與WT-M73於人類基因轉殖鼠之血漿停留時間。如第15圖所示，相較於WT-IgG1，WT-M44、WT-M58與WT-M73皆確認具有改良的血漿中停留時間。血漿停留時間改良效果，相關於對於人類FcRn的結合活性。特別地，WT-M73於第28日之血漿濃度改良約為WT-IgG1的16倍。相較於具有IgG1固定區之抗體，具有M73固定區之抗體於人類之血漿停留時間，亦顯著地增加。

實施例8：新穎固定區M14與M58於各種抗體對於降低異質性的效果

如實施例4所示者，其顯示源自IgG2鉸鏈區之異質性，於人源化抗-IL-6受體PM1抗體(WT)中，可藉由將IgG2鉸鏈區轉換為M14而降低。亦測試人源化PM1抗體以外的IgG2型抗體，以估算異質性是否可藉由將其固定區轉換為M14或M58而降低。

人源化PM1抗體以外的抗體為：抗IL-6受體抗體F2H/L39(F2H/L39_VH與F2H/L39VL之胺基酸序列分別如前述序列編號：29與30)；抗-IL-31受體抗體H0L0H0L0_VH與H0L0_VL之胺基酸序列分別如前述序列編號：31與32)；以及抗-RANKL抗體DNS(DNS_VH與DNS_VL之胺基酸序列分別如前述序列編號：33與34)。對於該等抗體之各者，產生具有IgG1固定區(序列編號：1)、IgG2固定區(序列編號：2)或M14(序列編號：5)或M58(序列編號：35)之抗體。

所產生的抗體，使用充足的梯度與合適的流速，於ProPac WCX-10(Dionex)管注(移動相A：20mM乙酸鈉(pH 5.0)，移動相B：20mM乙酸鈉/1M NaCl(pH5.0))，藉由陽離子交換層析法估算異質性。由陽離子交換層析法(IEC)獲得之估算，結果如第16圖所示。

如第16圖所示，固定區由IgG1型轉換為IgG型顯示增加異質性不僅於人源化抗-IL-6受體PM1抗體(WT)，亦於抗-IL-6受體抗體F2H/L39、抗-IL-31受體抗體HOLO與抗-RANKL抗體DNS。相對地，可藉由將其固定區轉換為M14或M58而於所有該等抗體降低異質性。因此，其顯示，無論抗原的型態或抗體可變區序列，源自天然IgG2之異質性，可藉由將H-鏈CH1域之EU編號系統之位置131的半胱胺酸取代為絲胺酸，以及將H鏈之上鉸鏈之EU編號系統之位置219的半胱胺酸取代為絲胺酸而降低。

實施例9：新穎固定區M58於各種抗體中對於改良血漿停留時間的效果

如實施例7所示，其顯示於人源化抗-IL-6受體PM1抗體(WT)中，將固定區由IgG1轉換為M58，改良FcRn基因轉殖鼠中對FcRn的結合活性與血漿停留時間。因此，亦測試人源化PM1抗體以外的IgG1型抗體，以估算其血漿中停留時間是否可藉由將其固定區轉換為M58而改良。

人源化PM1抗體以外的抗體為抗-IL-31受體抗體HOLO(HOLO_VH與HOLO_VL之胺基酸序列分別如前述序列編號：31與32)以及抗-RANKL抗體DNS(DNS_VH與DNS_VL之胺基酸序列分別如前述序列編號：33與34)。對於該等抗體之各者，產生具有IgG1固定區(序列編號：1)或M58(序列編號：35)之抗體，且藉由實施例6揭示之方法估算其對於人類FcRn之結合活性。結果如表3所示。

如表3所示，其顯示固定於由IgG1型轉換為M58之結果，和抗-IL-6受體抗體WT相同，抗-IL-31受體抗體HOLO與抗-RANKL抗體DNS兩者對人類FcRn之結合活性改良。此建議，無論抗原的型態或抗體可變區序列，藉由將固定區由IgG1轉換為M58而改良血漿中停留時間之可能性。

實施例10：CH1域中半胱胺酸對於異質性與安定性之效果

如實施例2所示，將IgG2之鉸鏈區與CH1域之半胱胺酸予以取代以降低天然IgG2之異質性。各種經改變抗體之估算顯現，可藉由使用SKSC(序列編號：38)降低異質性而不減少安定性。SKSC(序列編號：38)為藉由於野生型IgG2固定區序列之H-鏈CH1域中，EU編號系統之位置131的半胱胺酸取代為絲胺酸以及位置133的精胺酸取代為離胺酸，以及H-鏈上鉸鏈中，EU編號系統之位置219的半胱胺酸取代為絲胺酸，所獲得之經改變固定區。

同時，用於降低異質性之另一可能方法為於H-鏈上鉸鏈中，EU編號系統之位置219的半胱胺酸取代為絲胺酸，或位置220的半胱胺酸取代為絲胺酸。藉由於IgG2中，EU編號系統之位置219的半胱胺酸取代為絲胺酸製備之經改變IgG2固定區SC(序列編號：39)，以及EU編號系統之位置220的半胱胺酸取代為絲胺酸製備之經改變IgG2固定區CS(序列編號：40)。由不同於WT之抗IL-6受體抗體之F2H/L39(分別如前述胺基酸序列：29與30之F2H/L39_VH與F2H/L39_VL)，分別製備具有SC與CS之WT-SC(序列編號：41)與WT-CS(序列編號：42)，且與WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SKSC與WT-M58比較異質性與熱安定性。再者，分別具有IgG1(序列編號：1)、IgG2(序列編號：2)、SC(序列編號：39)、CS(序列編號：40)、SKSC(序列編號：38)或M14(序列編號：5)之F2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC與F2H/L39-M14。抗體比較相關之異質性。

WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58、F2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC與F2H/L39-M14，使用充足的梯度與合適的流速，於ProPac WCX-10(Dionex)管柱(移動相A：20mM乙酸鈉(pH 5.0)，移動相B：20mM乙酸鈉/1M NaCl(pH 5.0))，藉由陽離子交換層析法，估算異質性。藉由陽離子交換層析法之估算，結果如第17圖所示。

如第17圖所示，固定區由IgG1型轉換為IgG2型，顯示於WT與F2H/L39兩者降低異質性。相對地，異質性藉由將固定區轉換為SKSC與M14或M58而顯著地降低。同時，如同於SKSC的情況，固定區轉換為SC，顯著地降低異質性。然而，轉換為CS未顯著地改良異質性。

除了低異質性，一般而言，當抗體醫藥品開發中製備安定的配方物時，亦期望高安定性。因此，為了估算安定性，藉由示差掃描熱量計(DSC)(VP-DSC; Microcal)測定熱變形之中點溫度(Tm值)。熱變形之中點溫度(Tm值)作為安定性指標。為了製備安定配方物作為醫藥劑，較高的熱變形之中點溫度(Tm值)為較佳(J. Pharm. Sci. 2008 Apr;97(4)：1414-26)。WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC與WT-M58，相對於20mM乙酸鈉、150mM NaCl，pH 6.0(EasySEP;TOMY)之溶液透析。DSC測量係以1℃/min之加熱速率於40至100℃的範圍，且於蛋白質濃度約0.1mg/ml進行。由DSC所獲得之變型曲線示於第18圖。Fab域之Tm值如表4所示。

wT-IgG1與WT-IgG2之Tm值約為相同(約94℃；IgG2之Tm約低1℃)。同時，WT-SC與WT-CS之Tm值約為86℃，其顯著低於WT-IgG1與WT-IgG2之Tm值。另一方面，WT-M58與WT-SKSC之Tm值約為94℃，與WT-IgG1與WT-IgG2之Tm值相當。相較於IgG2，WT-SC與WT-CS明顯地不安定，且因此兩者皆包括CH1域之半胱胺酸取代為絲胺酸之WT-SKSC與WT-M58，於抗體醫藥品開發中為較佳。相對於IgG2，顯著地降低WT-SC與WT-CS之Tm的理由，咸信為WT-SC或WT-CS與IgG2之間雙硫鍵型式的差異。

再者，DSC變性曲線之比較顯示，WT-IgG1、WT-SKSC與WT-M58對於Fab域，各具有尖銳且單一的變性峰。相對地，WT-SC與WT-CS對於Fab域，各獲得較寬廣的變性峰。WT-IgG2亦於Fab域變性峰之較低溫度測獲得肩峰。一般而言，認為單一組成分獲得尖銳DSC變性峰，而當有不同Tm值之兩個或更多個組成分時(亦即為異質性)存在時，變性峰變為較寬廣。具體而言，上述結果建議WT-IgG2、WT-SC與WT-CS之各者含有兩個或更多個組成份之可能性，且因此天然-IgG2異質性未顯著地於WT-SC與WT-CS中降低。此發現建議不僅是鉸鏈區的半胱胺酸，CH1域的半胱胺酸亦相關於野生型-IgG異質性，且不僅鉸鏈區的半胱胺酸需要改變，CH1域的半胱胺酸亦需要改變以降低DSC異質性。再者，如上所述，與野生型IgG2相當的安定性，僅當鉸鏈區與CH1域的半胱胺酸兩者皆被取代時始可為之降低。

由上述可發現，異質性與安定性的觀點，固定區僅將絲胺酸取代鉸鏈區的半胱胺酸之SC與CS，不足以作為降低源自IgG2鉸鏈區之異質性的固定區。因而發現異質性可顯著地降低而維持IgG2-相等的安定性，僅當除了鉸鏈區的半胱胺酸之外，CH1域中，EU編號系統之位置131的半胱胺酸取代為絲胺酸時。該等固定區包含上述之M14、M31、M58與M73。特別地，M58與M73為安定的且較少異質性，且顯現改良的血漿中停留時間，且因此期望非常有用於作為抗體醫藥品之固定區。

實施例11：具有改良的PK/KD之完全人源化抗-IL-6受體抗體之產生

為了產生具有改良的PK/KD之完全人源化抗-IL-6受體抗體，藉由改變TOCILIZUMAB(H鏈，WT-IgG1(序列編號：12);L鏈，WT(序列編號：15)創造下述分子。使用實施例7所製備之M73或M83作為固定區，製備下述完整地人源化IL-6受體抗體：Fv3-M73(H鏈，VH4-M73，序列編號：48；L鏈，VL1-kappa，序列編號：49)、Fv4-M73(H鏈，VH3-M73，序列編號：46；L鏈，VL3-kappa，序列編號：47)與Fv5-M83(H鏈，VH5-M83，序列編號：44；L鏈，VL5-kappa，序列編號：45)。

比較所製備之Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83抗IL-6受體之親和性與TOCILIZUMAB。測定該等抗-IL-6受體抗體之親和性，如表5所示(參照參考例之方法)。再者，其等之BaF/gp130-中和活性與TOCILIZUMAB及對照組(揭示於參考例之已知高親和性抗-IL-6受體抗體，以及揭示於US 2007/0280945之VQ8F11-21 hIgG1)相比較(參照參考例之方法)。使用BaF/gp130測定該等抗體之生物活性所獲得的結果顯示於第19圖(TOCILIZUMAB、對照組與具有最終IL-6濃度為300ng/ml之Fv5-M83)與第20圖(TOCILIZUMAB與具有最終IL-6濃度為30ng/ml之Fv3-M73與Fv4-M73)。如表5所示，Fv3-M73與Fv4-M73比TOCILIZUMAB具有約2至3倍較高的親和性，而Fv5-M83顯現比TOCILIZUMAB較高100倍之親和性(由於難以測量Fv5-M83之親和性，取代使用Fv5-IgG1測量親和性，Fv5-IgG1具有IgG1-型固定區；一般認為該固定區對於親和性無效果)。如第20圖所示，Fv3-M73與Fv4-M73較TOCILIZUMAB顯現較強活性。如第19圖所示，Fv5-M83具有非常強活性，由50%抑制濃度的觀點，其較TOCILIZUMAB為高100倍。由50%抑制濃度的觀點，相較於對照組(已知高親和性抗-IL-6受體抗體)，Fv5-M83亦顯示約10倍的較高中和活性。

TOCILIZUMAB、對照組、Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83之等電點，使用此項技術領域中已知方法藉由等電點沉澱法(isoelectric focusing)測定。結果顯示TOCILIZUMAB之等電點為約9.3；對照組為約8.4至8.5；Fv3-M73為約5.7至5.8；Fv4-M73為約5.6至5.7；且Fv5-M83為約5.4至5.5。因此，相較於TOCILIZUMAB與對照組，各抗體具有顯著較低的等電點。再者，可變區VH/VL的理論等電點由 GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算。結果顯示TOCILIZUMAB之理論等電點為9.20；對照組為7.79；Fv3-M73為5.49；Fv4-M73為5.01；以及Fv5-M83為4.27。因此，當相較於TOCILIZUMAB與對照組，各抗體具有顯著較低的等電點。因此，當相較於TOCILIZUMAB與對照組，認為Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83之血將停留時間有改良。

使用TEPITOPE(Methods. 2004 Dec;34(4)：468-75)，分析TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73或Fv5-M83之可變區序列中之T-細胞抗原決定基。其結果，推測TOCILIZUMAB具有T-細胞抗原決定基，其中多者可結合至HLA。相對地，推測結合至T-細胞抗原決定基之序列的數目，於Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83中顯著降低。此外，Fv3-M73、Fv4-M73或Fv5-M83之框架沒有老鼠序列且因而為完全人源化。相較於TOCILIZUMAB，Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83的免疫性風險顯著地降低。

實施例12：　完全人源化之抗-IL-6受體抗體於猴中之PK/PD測試

TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83各者，以1mg/kg之劑量，對食蟹猴靜脈內投藥一次以估算其血漿濃度之時間歷程(參照參考例之方法)。靜脈投藥後，TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83之血漿濃度時間歷程如第21圖所示。比較TOCILIZUMAB，Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83之各者於食蟹猴顯現顯著地經改良的血漿停留時間，其中，相較於TOCILIZUMAB，Fv3-M73與Fv4-M73顯現實質上經改良的血漿停留時間。

估算各抗體對中和膜結合食蟹猴IL-6受體之效用。於抗體投藥後第6日至第18日(第3日至第10日為TOCILIZUMAB)，以每日降低5μg/kg，皮下投藥食蟹猴IL-6受體，且於各動物中之CRP濃度於24小時後測定(參照參考例之方法)。各動物投藥後之CRP濃度的時間歷程示於第22圖。為了估算各動物對中和可溶食蟹猴IL-6受體之效用，測定食蟹猴中游離可溶食蟹猴IL-6受體的血漿濃度，以及計算可溶IL-6受體中和的百分比(參照參考例之方法)。各動物投藥後，可溶IL-6受體中和的百分比之時間歷程示於第23圖。

相較於TOCILIZUMAB與對照組(已知高親和性抗-IL-6受體抗體)，Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83之各者，中和膜結合食蟹猴IL-6受體為較持續的方式，且於長時期壓抑CRP的增加。再者，相較於TOCILIZUMAB與對照組，Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83中和膜結合食蟹猴IL-6受體為較持續的方式，且於長時期抑制游離可溶食蟹猴IL-6受體的增加。該等發現顯示，相較於TOCILIZUMAB與對照組，Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83皆為優異於膜結合與可溶IL-6受體之持續的中和。其中，Fv3-M73與Fv4-M73為顯著地優異於持續中和。同時，Fv5-M83比Fv3-M73與Fv4-M73，更強力地壓抑CRP與游離可溶食蟹猴IL-6受體。因此，Fv5-M83於中和膜結合與可溶IL-6受體，比Fv3-M73、Fv4-M73及對照組(已知高親和性抗-IL-6受體抗體)更強。考慮該等食蟹猴之活體結果，反映Fv5-M83對於IL-6受體之較強親和性以及Fv5-M83於BaF/gp130分析系統中，相對於對照組之較強的生物活性。

相較於TOCILIZUMAB與對照組，Fv3-M73與Fv4-M73為高度優異於持續其作為抗-IL-6受體中和抗體之活性，且因此能顯著地降低投藥的劑量與頻率。再者，由作為抗-IL-6受體-中和抗體而言，Fv5-M83顯示顯著的強力活性以及持續其活性。因此，Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83期望有用於作為醫藥之IL-6拮抗劑。

參考例可溶重組食蟹猴(cvnomolgus monkev)IL-6受體(cIL-6R)之製備

寡-DNA引子根據揭示於恆河猴(Rhesus monkeys)IL-6受體之基因序列而製備(Birney et al.,Ensembl 2006,Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34(Database issue)：D556-61)。編碼完整之食蟹猴IL-6受體的DNA片段，使用引子、以及由食蟹猴之胰臟所製備之cDNA作為模板，藉由PCR製備。所得DNA片段插入動物細胞表現載體，且使用載體製備穩定表現CHO細胞株(cyno. sIL-6R-產生CHO細胞株)。cyno. sIL-6R-產生CHO細胞株之培養基，使用HisTrap column(GE Healthcare Bioscience)純化後以Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)濃縮。經由Superdex200pg16/60凝膠過濾管柱(GE Healthcare Bioscience)之進一步純化，獲得可溶食蟹猴IL-6受體(後文稱為cIL-6R)之最終經純化樣品。

重組食蟹猴I1-6(cIL-6)之製備

食蟹猴IL-6藉由下述步驟製備。製備寄存於SWISSPROT存取編號P79341之編碼212個胺基酸之核苷酸且經純株化至動物表現載體。所得載體導入CHO細胞以製備穩定表現CHO細胞株(cyno. IL-6R-產生CHO細胞株)。cyno.sIL-6R-產生CH0細胞株之培養基，使用SP-Sepharose/FF管柱(GE Healthcare Bioscience)純化後以Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮。經由Superdex75pg26/60凝膠過濾管柱(GE Healthcare Bioscience)之進一步純化，且以Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮後，獲得可溶食蟹猴IL-6(後文稱為cIL-6)之最終經純化樣品。

已知高親和性抗-IL-6受體抗體之製備

構築表現VQ8F11-21 hIgG1(已知高親和性抗-IL-6受體抗體)之動物細胞表現載體。VQ8F11-21 hIgG1揭示於美國專利US 2007/0280945 A1(US 2007/0280945 A1；H鏈與L鏈之胺基酸序列分別如前述序列編號：19與27)。抗體可變區使用合成寡DNAs之組合藉由PCR構築(組裝PCR(assembly PCR)。IgG1使用作為固定區。抗體可變區與固定區藉由組裝PCR一起組合後，插入動物細胞表現載體以構築感興趣之H鏈與L鏈之表現載體。所得表現載體之核苷酸序列藉由此項技術領域具有通常知識者已知方法測定。高親和性抗-IL-6受體抗體(後文簡稱為「對照組」)，藉由實施例1揭示之方法使用所構築之表現載體表現與純化。

藉由人類gp130-表現BaF3細胞(BaF/gp130)估算生物活性

IL-6受體中和活性，係使用IL-6/IL-6受體-依賴方式增殖之BaF3/gp130估算。以補充有10%FBS之RPMI1640清洗三次後，BaF3/gp130細胞以5x10⁴ 細胞/ml懸浮於補充有600ng/ml或60ng/ml之人類介白素-6(TORAY)(分別為300ng/ml或30ng/ml之最終濃度)、合適量的重組可溶人類IL-6受體(SR344)與10%FBS之RPMI1640。細胞懸浮液分散於(50μl/孔)96-孔盤(CORNING)。然後，經純化之抗體以含有10%FBS之RPMI1640稀釋，且添加至各孔(50μl/孔)。細胞於37℃、5%C0₂ 培養3日。WST-8 Reagent(Cell Counting Kit-8；Dojindo Laboratories)以PBS稀釋兩倍。於20μ1之該試劑添加至各孔後，使用SUNRISE CLASSIC(TECAN)立即測定波長450nm(參考波長620nm)之吸收。培養2小時後，再次測定波長450nm(參考波長620nm)之吸收。使用兩小時間波長的變化作為指標，估算IL-6受體中和活性。

結合至IL-6受體之Biacore為基準之分析

抗原-抗體反應動力學使用Biacore T100(GE Healthcare)分析。SR344-抗體交互作用，係藉由將合適量之抗-IgG(γ-鏈專一性)F(ab’)₂ 以胺偶合法固定至感應晶片，感興趣之抗體於pH7.4結合至晶片，然後於晶片流入於pH7.4經調整為各種濃度之IL-6受體SR344作為分析物。所有測量於37℃進行。動力學參數、結合速率常數ka(1/Ms)及解離速率常數k_d (1/s)，由測量所獲得之感應圖譜計算。然後，根據速率常數決定K_D (M)。使用Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)決定各別參數。

於猴中決定抗體、CRP與游離可溶IL-6受體之血漿濃度之PK/PD測試

於食蟹猴中之血漿濃度，係使用此項技術領域中具有通常知識者習知之方法藉由ELISA測定。

CRP之濃度，使用Cias R CRP(KANTO CHEMICAL CO.,INC.)，以自動分析儀(TBA-120FR;Toshiba Medical Systems Co.)測定。

游離可溶食蟹猴IL-6受體於食蟹猴之血漿濃度係藉由下述步驟測定。血漿中所有IgG抗體(食蟹猴IgG、抗-人類IL-6受體抗體與抗-人類IL-6受體抗體-可溶食蟹猴IL-6受體複合物)，藉由上料30μl之食蟹猴血漿至合適量之經0.22-μm過濾杯(Millipore)乾燥之rProtein A Sepharose Fast Flow resin(GE Healthcare)，而吸附至Protein A。然後，杯中的溶液使用高速離心機旋轉以收集通過之溶液。通過之溶液不含有Protein A-結合之抗-人類IL-6受體抗體-可溶食蟹猴IL-6受體複合物。因此，游離可溶IL-6受體之濃度，可藉由測量通過Protien A之溶液中可溶食蟹猴IL-6受體之濃度而測定。可溶食蟹猴IL-6受體之濃度係使用此項技術領域中具有通常知識者習知之用於測量可溶人類IL-6受體之方法測定。如上述所製備之可溶食蟹猴IL-6受體(cIL-6R)係使用作為標準品。然後可溶IL-6受體中和之百分比係由下述公式計算。

<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

<120> Antibody constant region mutant

<130> C1-A0709P

<150> JP 2007-250147

<151> 2007-09-26

<160> 58

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

第1圖顯示使用凝膠過濾層析法分析經氫氯酸溶出液純化之WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V與IgG4-R409K中凝集物含量的結果圖。

第2圖顯示WT-IgG1、WT-IgG2與WT-IgG4之陽離子交換樹脂(IEC)的結果圖。

第3圖顯示WT-IgG2之鉸鏈區中雙硫鍵的預測圖。

第4圖顯示IgG2-SKSC之鉸鏈區中雙硫鍵的預測圖。

第5圖顯示WT-IgG2與IgG2-SKSC之陽離子交化樹脂(IEC)的結果圖。

第6圖顯示人源化PM-1抗體、H鏈C-終端ΔK抗體以及H鏈C-終端ΔGK抗體之陽離子交換樹脂(IEC)的結果圖。

第7圖顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK結合至FcγRI之量的比較圖。

第8圖顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK結合至FcγRIIa之量的比較圖。

第9圖顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK結合至FcγRIIb之量的比較圖。

第10圖顯示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK結合至FcγR IIIa(Va1)之量的比較圖。

第11圖顯示於高濃度對於WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK之安定性測試中凝集增加的結果圖。

第12圖顯示於高濃度對於WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK與WT-M11ΔGK之安定性測試中Fab片段增加的結果圖。

第13圖顯示於高濃度對於WT-IgG2、WT-M14ΔGK與WT-M31ΔGK之陽離子交換樹脂(IEC)的結果圖。

第14圖顯示對人類FcRn基因轉殖鼠靜脈投藥WT-IgG1與WT-M14後之血漿濃度時程圖。

第15圖顯示對人類FcRn基因轉殖鼠靜脈投藥WT-IgG1、WT-M44、WT-M58與WT-M73後之血漿濃度時程圖。

第16圖顯示藉由抗IL-6受體抗體WT與F2H/L39、抗-IL-31受體抗體H0L0以及抗RANKL抗體DNS之對於異質性之陽離子交換層析為主之效果評估圖。

第17圖顯示藉由抗IL-6受體抗體WT與F2H/L39之CH1域半胱胺酸對於異質性之陽離子交換層析為主之效果評估圖。

第18圖顯示藉由抗IL-6受體抗體WT之CH1域半胱胺酸對於變性峰(denaturation peak)之DSC為主之效果評估圖。

第19圖顯示TOCILIZUMAB、對照組與Fv5-M83中和BaF/g130之活性圖。

第20圖顯示TOCILIZUMAB、Fv3-M73與Fv4-M73中和BaF/gp130之活性圖。

第21圖顯示於食蟹猴靜脈投藥後TOCILIZUMAB、對照組、Fv3-M73、Fv4-M73與Fv5-M83之血漿濃度時程。

第22圖顯示於食蟹猴之TOCILIZUMAB、對照組、Fv3-M73、Fv4-M73或Fv5-M83之靜脈投藥後，CRP濃度的時程圖。

第23圖顯示食蟹猴之TOCILIZUMAB、對照組、Fv3-M73、Fv4-M73或Fv5-M83之靜脈投藥後，可溶IL-6受體中和百分比的時程圖。

第24圖顯示對人類FcRn基因轉殖鼠靜脈投藥WT-IgG1、WT-M44與WT-M58後之血漿濃度時程圖。

Claims

一種IgG2固定區，其中於序列編號：2之胺基酸序列之位置20(於EU編號系統之位置137)及21(於EU編號系統之位置138)的胺基酸分別經Gly及Gly取代。
一種IgG2固定區，其中序列編號：2之胺基酸序列中於位置209(於EU編號系統之位置330)、210(於EU編號系統之位置331)、218(於EU編號系統之位置339)、276(於EU編號系統之位置397)、14(於EU編號系統之位置131)、16(於EU編號系統之位置133)、102(於EU編號系統之位置219)、20(於EU編號系統之位置137)、及21(於EU編號系統之位置138)的胺基酸分別經Ser、Ser、Ala、Val、Ser、Lys、Ser、Gly、及Gly取代。
如申請專利範圍第2項之IgG2固定區，更包括刪除於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys兩者。
一種IgG2固定區，其中序列編號：2之胺基酸序列中於位置276(於EU編號系統之位置397)、14(於EU編號系統之位置131)、16(於EU編號系統之位置133)、102(於EU編號系統之位置219)、20(於EU編號系統之位置137)、及21(於EU編號系統之位置138)的胺基酸分別經Val、Ser、Lys、Ser、Gly、及Gly取代。
如申請專利範圍第4項之IgG2固定區，更包括刪除於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys兩者。
一種IgG2固定區，其中序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu、於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser、於位147(於EU編號系統之位置268)的His、於位置234(於EU編號系統之位置355)的Arg、及於位置298(於EU編號系統之位置419)的Gln分別經Ser、Lys、Ser、Gly、Gly、Gln、Gln、及Glu取代。
如申請專利範圍第6項之IgG2固定區，更包括刪除於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys兩者。
一種IgG2固定區，其中序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu、於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser、於位置147(於EU編號系統之位置268)的His、於位置234(於EU編號系統之位置355)的Arg、於位置298(於EU編號系統之位置419)的Gln、及於位置313(於EU編號系統之位置434)的Asn分別經Ser、Lys、Ser、Gly、Gly、Gln、Gln、Glu、及Ala取代。
如申請專利範圍第8項之IgG2固定區，更包括刪除於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置 326(於EU編號系統之位置447)的Lys兩者。
一種IgG2固定區，其中序列編號：2之胺基酸序列中於位置209(於EU編號系統之位置330)的Ala、於位置210(於EU編號系統之位置331)的Pro、於位置218(於EU編號系統之位置339)的Thr、於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu、及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser分別經Ser、Ser、Ala、Ser、Lys、Ser、Gly、及Gly取代。
如申請專利範圍第10項之IgG2固定區，更包括刪除於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys兩者。
一種IgG2固定區，其中序列編號：2之胺基酸序列中於位置14(於EU編號系統之位置131)的Cys、於位置16(於EU編號系統之位置133)的Arg、於位置102(於EU編號系統之位置219)的Cys、於位置20(於EU編號系統之位置137)的Glu、及於位置21(於EU編號系統之位置138)的Ser分別經Ser、Lys、Ser、Gly、及Gly取代。
如申請專利範圍第12項之IgG2固定區，更包括刪除於位置325(於EU編號系統之位置446)的Gly及位置326(於EU編號系統之位置447)的Lys兩者。
一種人類抗體固定區，包括序列編號：5之胺基酸序列。
一種人類抗體固定區，包括序列編號：7之胺基酸序列。
一種人類抗體固定區，包括序列編號：9之胺基酸序列。
一種人類抗體固定區，包括序列編號：35之胺基酸序列。
一種人類抗體固定區，包括序列編號：37之胺基酸序列。
一種人類抗體固定區，包括序列編號：57之胺基酸序列(M40△GK)。
一種人類抗體固定區，包括序列編號：55之胺基酸序列(M86)。
一種抗體，包括申請專利範為第1至20項中任一項之固定區。
一種抗-IL-6-受體之抗體，包括申請專利範為第1至20項中任一項之固定區。
一種醫藥組合物，包括申請專利範為第1至20項中任一項之固定區。