SK3902001A3 - Alzheimer's disease secretase - Google Patents

Description

Vynález sa týka Alzheimerovej choroby, amyloidného beta peptidu (APP) a ľudských aspartylproteáz rovnako ako spôsobov identifikácie látok modulujúcich aktivitu týchto polypeptidov.

Doterajší stav techniky

Alzheimerova choroba (AD) spôsobuje progresívnu demenciu spojenú s tvorbou amyloidných plakov, neurofibrilámych spletí, glióz a stratu neurónov. Nemoc sa vyskytuje tak v geneticky podmienenej, ako aj sporadickej forme, ktorej klinický priebeh a patologické znaky sú dosť podobné. V súčasnosti sú známe tri gény, ktorých mutácia spôsobuje autosomálne dominantnú formu Alzheimerovej choroby. Tieto gény kódujú prekurzor amyloidného proteínu (APP) a dva súvisiace proteíny, presenilín-1 (PS 1) a presenilín-2 (PS 2), ktoré, ako naznačujú ich mená, sú si štruktúrne aj funkčne blízke. Mutácia ktoréhokoľvek z týchto troch proteínov zvyšuje proteolytickú úpravu APP cez intracelulámu dráhu, ktorá produkuje beta amyloidný_peptid alebo Αβ peptid (tu niekedy uvedený ako Abeta), 40-42 aminokyselín dlhý peptid, ktorý je primárny komponentou amyloidných plakov pri AD. Porucha regulácie intracelulámych dráh pre proteolytickú úpravu môže byť podstatou patofyziológie AD. V prípade tvorby plakov mutácie APP, PSI alebo PS2 ovplyvňujú proteolytickú úpravu APP, takže sa zvyšuje tvorba Αβ 1-42, formy Αβ peptidu, ktorý sa zdá byť zvlášť amyloidogénny a teda veľmi dôležitý pre AD. Rôzne formy APP sa odlišujú veľkosťou v rozmedzí 695-770 aminokyselín, lokalizujú sa na povrchu buniek a majú jednu C-koncovú transmembránovú doménu. A beta peptid je odvodený od regiónu APP priľahlému a obsahuje časť transmembránovej domény. Pri úprave obvykle dochádza APP k štiepeniu na α-sekretázovom štiepiacom mieste v oblasti Αβ sekvencie priľahlej k membráne, t.j. rozpustnej extracelulámej domény APP, ktorá je tak uvoľnená z povrchu bunky. Táto asekretázová APP úprava vedie k rozpustnému APP-α a považuje sa za normálnu a myslíme si, že nespôsobuje AD.

Patologická úprava APP na β- a γ-sekretázových miestach vedie k veľmi rozdielnym produktom v porovnaní s úpravou v α-mieste. Postupná úprava na β- a γ-sekretázovom mieste uvoľňuje Αβ peptid, peptid veľmi dôležitý v patogenéze AD. Úprava na β- a γ- sekretázových miestach sa môže uskutočňovať na endoplazmatickom retikule (v neurónoch) a v rámci endozomálne/lyzozomálnej dráhy po reinternalizácii bunkového povrchu obsahujúceho APP (vo ··· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · ··· · · ···· · · •••t ···· ·· · ·· ·· ·· ·· ·· ···

-2všetkých typoch buniek). Cez intenzívnu snahu, v priebehu viac než desať rokov, identifikovať enzýmy zodpovedné za úpravu APP na β a γ miestach a produkujúcich Αβ peptid, zostali tieto proteázy až doteraz neznáme. Tu je po prvý krát predložená identifikácia a charakterizácia β-sekretázového enzýmu. Sú tu uvedené niektoré známe a niektoré nové ľudské aspartylproteázy, ktoré môžu fungovať ako β-sekretázové proteázy a po prvý krát sa tiež vysvetľuje úloha týchto proteáz pri AD. Ďalej sú popísané oblasti v proteázach kritické pre ich unikátnu funkciu a po prvý krát sa charakterizuje ich substrát. Ide o prvý opis exprimovaného izolovaného purifíkovaného aktívneho proteínu tohto typu, stanovenia, ktoré využívajú tento proteín, to všetko navyše k identifikácii a vytvorení vhodných bunkových línií a inhibítorov.

Podstata vynálezu

Je opísaných mnoho variantov asp2 génu a peptidú.

Akákoľvek izolovaná alebo purifíkovaná nukleová kyselina, ktorá kóduje proteázu schopnú štiepiť beta (β) sekretázové štiepne miesto APP, ktorá obsahuje dve alebo viac sad špeciálnych nukleových kyselín, kde sú tieto špeciálne nukleové kyseliny oddelené nukleovými kyselinami, ktoré kódujú asi od 100 do 300 aminokyselinových pozícií, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné, kde sa prvá sada týchto špeciálnych nukleových kyselín skladá z nukleových kyselín, ktoré kódujú peptid DSG alebo DTG, kde posledná nukleová kyselina druhej sady nukleových kyselín je poslednou touto špeciálne nukleovú kyselinou, s výnimkou, že nie sú zahrnuté nukleové kyseliny uvedené ako SEQ č.l a SEQ č. 5. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, kde tieto dve sady nukleových kyselín sú oddelené nukleovými kyselinami, ktoré kódujú asi od 125-222 aminokyselinových pozícií, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, ktoré kódujú asi od 150-172 aminokyselinových pozícií, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, ktoré kódujú 125 až 222 aminokyselinových pozícií, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, ktoré kódujú asi 172 aminokyselinových pozícií, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, kde ich nukleotidy sú opísané v SEQ č. 3. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, kde tieto dve sady nukleových kyselín sú oddelené nukleovými kyselinami, ktoré kódujú asi od 150-196 aminokyselinových pozícií. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, kde tieto dve sady nukleových kyselín sú oddelené nukleovými kyselinami, ktoré kódujú asi 196 aminokyselinových pozícií. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, kde tieto dve sady nukleových kyselín sú oddelené nukleovými kyselinami, ktoré majú rovnaké ···· ·· ·· ·· e· ··· ···· ··· • · · · · ·· ·· • · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· ·· · sekvencie, ktoré vymedzujú rovnakú sadu špeciálnych nukleových kyselín podľa SEQ č. 5. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, kde tieto dve sady nukleových kyselín sú oddelené nukleovými kyselinami, ktoré kódujú asi od 150-190 aminokyselinových pozícií. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, kde tieto dve sady nukleových kyselín sú oddelené nukleovými kyselinami, ktoré kódujú asi 190 aminokyselinových pozícií. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, kde tieto dve sady nukleových kyselín sú oddelené nukleovými kyselinami, ktoré majú rovnaké sekvencie, ktoré vymedzujú rovnakú sadu špeciálnych nukleových kyselín podľa SEQ č. 1. Polynukleotid podľa vynálezu, kde prvá nukleová kyselina prvej špeciálnej sady aminokyselín, ktorá je prvá touto špeciálnou nukleovú kyselinou, je funkčne pripojená k akémukoľvek kodónu, kde nukleová kyselina tohto kodónu kóduje akýkoľvek peptid obsahujúci od 1 do 10 000 aminokyselín (pozícií). Polynukleotid podľa vynálezu, kde prvá nukleová kyselina prvej špeciálnej sady aminokyselín, ktorá je prvá touto špeciálnou nukleovú kyselinou, je funkčne pripojený k akémukoľvek kodónu, kde nukleová kyselina tohto kodónu kóduje akýkoľvek peptid vybraný zo skupiny obsahujúcej: akékoľvek reportérove proteíny, alebo proteíny, ktoré uľahčujú purifikáciu. Polynukleotid podľa vynálezu, kde prvá nukleová kyselina prvej špeciálnej sady aminokyselín, ktorá je prvá touto špeciálnou nukleovú kyselinou, je funkčne pripojený k akémukoľvek kodónu, kde nukleová kyselina od tohto kodónu kóduje akýkoľvek peptid vybraný zo skupiny obsahujúcej: ťažký reťazec imunoglobulínu, maltózu viažucu proteín, glutatión S transferázu, zelený fluorescentný proteín a ubichitín. Polynukleotid podľa vynálezu, kde posledná nukleová kyselina druhej špeciálnej sady aminokyselín, ktorá je prvá touto špeciálnou nukleovú kyselinou, je funkčne pripojený k polynukleotidu, ktorý kóduje akýkoľvek peptid obsahujúci od 1 do 10 000 aminokyselín (pozícií). Polynukleotid podľa vynálezu, kde posledná špeciálne nukleová kyselina je funkčne pripojená k akémukoľvek kodónu pripojenému k polynukleotidu, ktorý kóduje akýkoľvek peptid vybraný zo skupiny obsahujúcej: akékoľvek reportérove proteíny, alebo proteíny, ktoré uľahčujú purifikáciu. Polynukleotid podľa vynálezu, kde prvá nukleová kyselina je funkčne pripojená k polynukleotidu, ktoiý kóduje akýkoľvek peptid vybraný zo skupiny obsahujúcej ťažký reťazec imunoglobulínu, maltózu vážiacu proteín, glutatión S-transferázu, zelený fluorescentný proteín a ubichitín.

Akákoľvek izolovaná alebo purifíkovaná nukleová kyselina, ktorá kóduje proteázu schopnú štiepiť beta (β) sekretázové štiepné miesto APP, ktorá obsahuje dve alebo viac sad špeciálne nukleových kyselín, kde tieto špeciálne nukleové kyseliny sú oddelené nukleovými kyselinami, ktoré kódujú asi od 100 do 300 aminokyselinových pozícii, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné, kde sa prvá sada týchto špeciálnych nukleových kyselín ···· ·· • · • · ·· ·· ·· • ···· · · · • · · ·· · · • · · · ···· · · ·· ·· ·· ·· ·· ·

-4skladá z nukleových kyselín, ktoré kódujú peptid DTG, kde prvá nukleová kyselina prvej špeciálnej sady nukleových kyselín je prvou touto špeciálnou nukleovú kyselinou, a kde druhá sada nukleových kyselín kóduje DSG alebo DTG, kde posledná nukleová kyselina druhej sady špeciálnych nukleových kyselín je poslednou špeciálnou nukleovú kyselinou, kde prvá špeciálne nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovým kyselinám, ktoré kódujú akýkoľvek počet aminokyselín od nuly do 81 aminokyselín, a kde každý z týchto kodónov môže kódovať akúkoľvek aminokyselinu. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde prvá- špeciálne nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovej kyseline, ktorá kóduje od 64 do 77 aminokyselín, kde každý kodón môže kódovať akúkoľvek aminokyselinu. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde prvá špeciálne nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovej kyseline, ktorá kóduje 71 aminokyselín. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde prvá špeciálne nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovej kyseline, ktorá kóduje 71 aminokyselín, kde prvá z týchto 71 aminokyselín je aminokyselina T. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde tento polynukleotid obsahuje sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická s SEQ č. (príklad 11). Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde celý polynukleotid obsahuje sekvenciu SEQ č. (príklad 11). Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde prvá špeciálne nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovej kyseline, ktorá kóduje od 40 do 54 aminokyselín, kde každý kodón môže kódovať akúkoľvek aminokyselinu. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde prvá špeciálne nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovej kyseline, ktorá kóduje 47 aminokyselín. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde prvá špeciálne nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovej kyseline, ktorá kóduje 47 aminokyselín, kde prvá z týchto 47 aminokyselín je aminokyselina E. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde tento polynukleotid obsahuje sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická s SEQ č. (príklad 10). Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde celý polynukleotid obsahuje sekvenciu SEQ č. (príklad 10).

Akákoľvek izolovaná alebo purifikovaná nukleová kyselina, ktorá kóduje proteázu schopnú štiepiť beta (β) sekretázové štiepne miesto APP, ktorá obsahuje dve alebo viac sad špeciálne nukleových kyselín, kde tieto špeciálne nukleové kyseliny sú oddelené nukleovými kyselinami, ktoré kódujú asi od 100 do asi 300 aminokyselinových pozícií, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné, kde sa prvá sada týchto špeciálnych nukleových kyselín skladá z nukleových kyselín, ktoré kódujú peptid DTG, kde prvá nukleová kyselina prvej špeciálnej sady nukleových kyselín je prvou touto špeciálnou nukleovú kyselinou, a kde druhá sada nukleových kyselín kóduje DSG alebo DTG, kde posledná nukleová kyselina druhej sady špeciálnych nukleových kyselín je poslednou špeciálnou nukleovú kyselinou a je funkčne ···· ·· ·· ·· 4· ··· · · · · ··· • · · ···· · · ···· ···· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·

-5pripojená k nukleovým kyselinám, ktoré kódujú od 50 do 170 kodónov. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde posledná špeciálne nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovej kyseline, ktorá kóduje od 100 do 170 kodónov. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde posledná špeciálna nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovej kyseline, ktorá kóduje od 142 do 163 kodónov. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde posledná špeciálna nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovej kyseline, ktorá kóduje 142 kodónov. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde tento polynukleotid obsahuje sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická s SEQ č. (príklad 9 alebo 10). Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde celý polynukleotid obsahuje sekvenciu SEQ č. (príklad 9 alebo 10). Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde posledná špeciálna nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovým kyselinám, ktoré kódujú asi 163 kodónov. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde tento polynukleotid obsahuje sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická s SEQ č. (príklad 9 alebo 10). Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde celý polynukleotid obsahuje sekvenciu SEQ č. (príklad 9 alebo 10). Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde posledná špeciálna nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovej kyseline, ktorá kóduje asi 170 kodónov. Druhá sada špeciálnych nukleových kyselín podľa vynálezu kóduje polypeptid DSG a prípadne prvá sada nukleových kyselín je funkčne pripojená k peptidovému purifikačnému prívesku. Nukleová kyselina podľa vynálezu je funkčne pripojená k peptidovému purifikačnému prívesku, ktorým je 6 histidínov. Prvá sada špeciálnych nukleových kyselín podľa vynálezu tvorí jeden polynukleotid a druhá sada špeciálnych nukleových kyselín tvorí druhý polynukleotid, kde prvý aj druhý polynukleotid má aspoň 50 kodónov. Prvá sada špeciálnych nukleových kyselín podľa vynálezu tvorí jeden polynukleotid a druhá sada špeciálnych nukleových kyselín tvorí druhý polynukleotid, kde prvý aj druhý polynukleotid má aspoň 50 kodónov, kde sú uvedené polynukleotidy v rovnakom roztoku. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa vynálezu. Bunka alebo bunková línia, ktorá obsahuje polynukleotid podľa vynálezu.

Akýkoľvek izolovaný alebo purífikovaný peptid alebo proteín obsahujúci proteázu schopnú štiepiť beta (β) sekretázové štiepné miesto APP, ktorý obsahuje dve alebo viac sad špeciálne aminokyselín, kde tieto aminokyseliny sú oddelené asi od 100 do 300 aminokyselinových pozícií, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné, kde prvá sada týchto špeciálnych aminokyselín tvorí peptid DTG, aminokyselina prvej špeciálnej sady aminokyselín je touto prvou aminokyselinou, a kde druhá sada aminokyselín tvorí DSG alebo DTG, kde posledná aminokyselina druhej sady špeciálnych aminokyselín je poslednou špeciálnou aminokyselinou, s výhradou proteáz uvedených ako SEQ č. 2 a SEQ č. 6. Polypeptid podľa vynálezu, kde tieto dve sady aminokyseliny sú oddelené asi od 125 do 222 aminokyselinových

-6···· ·· ·· ·· ·· • · · ···· «·· • · · ···· · · • ·· · ···· ·· · ·· ·· ·· ·· ·· ··· pozícií, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné aminokyseliny. Polypeptid podľa vynálezu, kde tieto dve sady aminokyseliny sú oddelené asi od 150 do 172 aminokyselinami. Polypeptid podľa vynálezu, kde tieto dve sady aminokyseliny sú oddelené asi 172 aminokyselinami. Polypeptid podľa vynálezu, kde táto proteáza je opísaná v SEQ č. 4. Polypeptid podľa vynálezu, kde tieto dve sady aminokyseliny sú oddelené asi od 150 do 196 aminokyselinami. Polypeptid podľa vynálezu, kde tieto dve sady aminokyseliny sú oddelené asi 196 aminokyselinami. Polypeptid podľa vynálezu, kde tieto dve sady aminokyseliny sú oddelené rovnakými aminokyselinovými sekvenciami, ktoré oddeľujú rovnakú sadu špeciálnych aminokyselín v SEQ č. 6. Polypeptid podľa vynálezu, kde tieto dve sady aminokyseliny sú oddelené asi od 150 do 190 aminokyselinami. Polypeptid podľa vynálezu, kde tieto dve sady aminokyseliny sú oddelené asi 190 aminokyselinami. Polypeptid podľa vynálezu, kde tieto dve sady aminokyseliny sú oddelené rovnakými aminokyselinovými sekvenciami, ktoré oddeľujú rovnakú sadu špeciálnych aminokyselín v SEQ č. 2. Prvá aminokyselina prvej špeciálnej sady aminokyselín podľa vynálezu, ktorá je prvou špeciálnou aminokyselinou, je funkčne pripojená k akémukoľvek polypeptidu obsahujúcemu od 1 do 10000 aminokyselín. Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k akémukoľvek polypeptidu vybranému zo skupiny obsahujúcej: akékoľvek reportérove proteíny uľahčujúce purifikáciu. Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k akémukoľvek polypeptidu vybranému zo skupiny obsahujúcej: ťažký imunoglobulinový reťazec, proteín vážiaci maltózu, glutatión S-transferázu, zelený fluorescenčný proteín a ubichitín. Posledná aminokyselina druhej špeciálnej sady aminokyselín podľa vynálezu, ktorá je poslednou špeciálnou aminokyselinou, je funkčne pripojená k akémukoľvek polypeptidu obsahujúcemu od 1 do 10 000 aminokyselín. Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k akémukoľvek polypeptidu vybranému zo skupiny obsahujúcej: akékoľvek reportérove proteíny uľahčujúce purifikáciu. Polypeptid podľa vynálezu, kde posledná špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k akémukoľvek polypeptidu vybranému zo skupiny obsahujúcej: ťažký imunoglobulinový reťazec, proteín vážiaci maltózu, glutatión S-transferázu, zelený fluorescenčný proteín a ubichitín.

Akýkoľvek izolovaný alebo purifikovaný polypeptid, ktorý tvorí proteázu schopnú štiepiť beta (β) sekretázové štiepné miesto APP, ktorá obsahuje dve alebo viac sad špeciálnych aminokyselín, kde tieto špeciálne aminokyseliny sú oddelené asi od 100 do 300 aminokyselín, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné, kde sa prvá sada týchto špeciálnych aminokyselín skladá z aminokyselín DTG, kde prvá aminokyselina prvej špeciálnej sady ·· • · · ···· ·· • · • · • e • · · • · ·· • ·

-7• · « ·· ·· aminokyselín je prvou touto špeciálnou aminokyselinou a je to D, a kde druhá sada aminokyselín je DSG alebo DTG, kde posledná špeciálna aminokyselina druhej sady špeciálnych aminokyselín je poslednou špeciálnou aminokyselinou a je to G, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k aminokyselinám, ktoré kódujú akýkoľvek počet aminokyselín od nuly do 81 aminokyselín, a kde každá môže byť akákoľvek aminokyselina. Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k peptidu od 64 do 77 aminokyseliny, kde každá aminokyselina môže byť akoukoľvek aminokyselinou. Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k peptidu o 71 aminokyseline. Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k 71 aminokyselinám, kde prvá z týchto 71 aminokyselín je aminokyselina T. Polypeptid podľa vynálezu, kde tento polypeptid obsahuje sekvenciu, ktorá je ale z 95 % identická s SEQ č. (príklad 11). Polypeptid podľa vynálezu, kde celý polynukleotid obsahuje sekvenciu SEQ č. (príklad 11). Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k akémukoľvek počtu od 40 do 54 aminokyselín, kde každá aminokyselina môže byť akoukoľvek aminokyselinou. Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k 47 aminokyselinám. Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k 47 aminokyselinovému peptidu, kde prvá z týchto 47 aminokyselín je aminokyselina E. Polypeptid podľa vynálezu, kde tento polypeptid obsahuje sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická s SEQ č. (príklad 10). Polypeptid, kde celý polypeptid obsahuje sekvenciu SEQ č. (príklad 10).

Akýkoľvek izolovaný alebo purifikovaný polypeptid, ktorý tvorí proteázu schopnú štiepiť beta (β) sekretázové štiepné miesto APP, ktorý obsahuje dve alebo viac sad špeciálnych aminokyselín, kde tieto špeciálne aminokyseliny sú oddelené asi od 100 do 300 aminokyselinami, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné, kde prvá sada týchto špeciálnych aminokyselín tvorí peptid DTG, kde prvá aminokyselina prvej špeciálnej sady aminokyselín je prvou touto špeciálnou aminokyselinou, a kde druhá sada aminokyselín tvorí DSG alebo DTG, kde posledná aminokyselina druhej sady špeciálnych aminokyselín je poslednou špeciálnou aminokyselinou a je funkčne pripojená k od 50 do 170 aminokyselín, ktoré môžu byť akýmikoľvek aminokyselinami. Polypeptid podľa vynálezu, kde posledná špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k peptidu tvorenému od 100 do 170 aminokyselín. Polypeptid podľa vynálezu, kde posledná špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k peptidu tvorenému od 142 do 163 aminokyselín. Polypeptid podľa vynálezu, kde posledná špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k peptidu tvorenému 142 aminokyselinami. Polypeptid podľa vynálezu, kde tento polypeptid obsahuje sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická s SEQ č. (príklad 9 alebo • · ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· • · • · ·

-8• · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· • · ·· ·

10). Polypeptid podľa vynálezu, kde posledná špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k peptidu tvorenému asi 163 aminokyselinami. Polypeptid podľa vynálezu, kde tento polypeptid obsahuje sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická s SEQ č. (príklad 9 alebo 10). Polypeptid podľa vynálezu, kde celý polypeptid obsahuje sekvenciu SEQ č. (príklad 9 alebo 10). Polypeptid podľa vynálezu, kde posledná špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k peptidu tvorenému asi 170 aminokyselinami. Polypeptidy podľa vynálezu tvorí sekvencia DSG. Polypeptid podľa vynálezu, ktorý je funkčne pripojený k peptidovému purifikačnému prívesky. Polypeptid podľa vynálezu je funkčne pripojený k peptidovému purifikačnému prívesku, ktorým je 6 histidínov. Prvá sada špeciálnych aminokyselín podľa vynálezu tvorí jeden polypeptid a druhá sada špeciálnych aminokyselín tvorí druhý polypeptid, kde prvý aj druhý polypeptid má aspoň 50 aminokyselín, kde uvedené polypeptidy sú v rovnakej nádobke. Vektor obsahujúci polypeptid podľa vynálezu. Bunka alebo bunková línia, ktorá obsahuje polynukleotid podľa vynálezu. Spôsob prípravy ktoréhokoľvek z polynukleotidov, vektorov, alebo buniek podľa vynálezu. Akékoľvek polynukleotidy, polypeptidy, vektory, bunky, alebo bunkové línie podľa vynálezu pripravené spôsobmi podľa vynálezu.

Akýkoľvek izolovaný, alebo purifikovaný polypeptid, ktorý tvorí proteázu schopnú štiepiť beta (β) sekretázové štiepné miesto APP, ktorý obsahuje dve alebo viac sad špeciálnych aminokyselín, kde tieto špeciálne aminokyseliny sú oddelené asi od 100 do 300 aminokyselinami, kde aminokyseliny na týchto pozíciách môžu byť ľubovoľné, kde prvá sada týchto špeciálnych aminokyselín tvorí peptid DTG, kde prvá aminokyselina prvej špeciálnej sady aminokyselín je prvou touto špeciálnou aminokyselinou a to je D, a kde druhá sada aminokyselín tvorí DSG alebo DTG, kde posledná aminokyselina druhej sady špeciálnych aminokyselín je poslednou špeciálnou aminokyselinou a to je G, kde prvá špeciálna aminokyselina k ľubovoľnému počtu od nuly do aminokyselín, ktoré môžu byť akýmikoľvek aminokyselinami.

Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k peptidu tvorenému od 30 do 77 aminokyselín, ktoré môžu byť akýmikoľvek aminokyselinami. Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k peptidu tvorenému 35,47, 71, alebo 77 aminokyselinami.

Polypeptid podľa vynálezu, kde prvá špeciálna aminokyselina je funkčne pripojená k rovnakému zodpovedajúcemu polypeptidu SEQ č. 3, ktorý je dlhý 35, 47, 71, alebo 77 aminokyselín, začínajúc s počítaním od prvej aminokyseliny prvej špeciálnej sekvencie, DTG, smerom k N-koncu SEQ č. 3.

···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· • ·

-9·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· • 9 9 •

• · ·· ·

Polypeptid podľa vynálezu, kde tento polypeptid obsahuje sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická s SEQ č. 4, ktorá je identická s časťou sekvencie SEQ č. 4, vrátane všetkých sekvencií z prvej a/alebo druhej špeciálnej sady nukleových kyselín, smerom k N-koncu, vrátane 71, 47, 35 aminokyselín pred prvou špeciálnou aminokyselinou (príklady 10 a 11).

Polypeptid podľa vynálezu, kde celý polypeptid obsahuje 71 aminokyselín, kde prvá aminokyselina je T a druhá je Q. Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde táto nukleová kyselina obsahuje sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická so zodpovedajúcou aminokyselinovú sekvenciou SEQ č. 3, vrátane sekvenciou z prvej a/alebo druhej špeciálnej sady nukleových kyselín, smerom k N-koncu, vrátane 71 aminokyselín, pozri príklad 10, začínajúc DTG miestom a vrátane nukleotidov, ktoré kódujú 71 aminokyselín.

Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde táto nukleová kyselina obsahuje sekvenciu, ktorá je identická so zodpovedajúcou aminokyselinovú sekvenciou SEQ č. 3, ktorá je identická so sekvenciou v SEQ č. 3, vrátane sekvenciou z prvej a/alebo druhej špeciálnej sady nukleových kyselín, smerom k N-koncu, vrátane 71, pozri príklad 10, začínajúc DTG miestom a vrátane nukleotidov, ktoré kódujú 71 aminokyselín.

Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde prvá špeciálna nukleová kyselina je funkčne pripojená k nukleovým kyselinám, ktoré kódujú akýkoľvek počet od asi 30 do 54 aminokyselín, kde každý kodón môže kódovať akúkoľvek aminokyselinu.

Nukleová kyselina podľa vynálezu, kde prvá špeciálna nukleová kyselina je funkčne pripojená k 47 kodónom, kde prvou aminokyselinou z týchto 35 alebo 47 aminokyselín je aminokyselina E alebo G.

Polynukleotid podľa vynálezu, kde tento polynukleotid obsahuje sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická čo do zodpovedajúcich aminokyselín so sekvenciou SEQ č. 3, ktorá je identická s časťou sekvencie SEQ č. 3 zahŕňajúcou sekvencie prvých a/alebo druhých špeciálnych nukleových kyselín, smerom k N-koncu, vrátane 35 alebo 47 aminokyselín, v prípade 47 pozri príklad 11, začínajúc od DGT miesta a vrátane nukleotidov, ktoré kódujú 35 alebo 47 aminokyselín pred DTG miestom. Nukleové kyseliny podľa vynálezu, kde tento polynukleotid je identický čo do zodpovedajúcich aminokyselín so sekvenciou SEQ č. 3, ktorá je identická so sekvenciou v SEQ č. 3 zahŕňajúcu sekvencie prvých a/alebo druhých špeciálnych nukleových kyselín, smerom k N-koncu, vrátane 35 alebo 47 aminokyselín, v prípade 47 pozri príklad 11, začínajúc od DGT miesta a vrátane nukleotidov, ktoré kódujú 35 alebo 47 aminokyselín pred DTG miestom.

···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· • · • · • · · ·· • · · • · • · · · • · · ·· • · ·· ·· ··

- 10Izolovaná molekula nukleovej kyseliny obsahujúca polynukleotid, kde tento polynukleotid kóduje Hu-Asp polypeptid a má nukleotidovú sekvenciu aspoň z 95 % identickú so sekvenciou zvolenou zo skupiny obsahujúcej:

a) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu Hu-Asp polypeptid zvolený zo skupiny obsahujúcej Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b), kde uvedené Hu-Asp 1, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) polypeptidy majú kompletnú aminokyselinovú sekvenciu SEQ č. 2, SEQ č. 4, respektíve SEQ č. 6; a

b) nukleotidovú sekvenciu komplementárnu k nukleotidovej sekvencie v bode (a).

Molekula nukleovej kyseliny podľa vynálezu, kde tento Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp 1 a uvedená polynukleotidová molekula podľa l(a) obsahuje nukleotidovú sekvenciu SEQ č. 1. Molekula nukleovej kyseliny podľa vynálezu, kde tento Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(a) a uvedená polynukleotidová molekula podľa l(a) obsahuje nukleotidovú sekvenciu SEQ č. 4. Molekula nukleovej kyseliny podľa vynálezu, kde tento Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(b) a uvedená polynukleotidová molekula podľa l(a) obsahuje nukleotidovú sekvenciu SEQ č. 5. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny obsahujúcej polynukleotid, ktorý hybridizuje za prísnych podmienok s polynukleotidom majúcim polynukleotidovú sekvenciu podľa bodu (a) alebo (b). Vektor obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa vynálezu. Vektor podľa vynálezu, kde táto molekula nukleovej kyseliny je funkčne pripojená k promotoru pre expresiu Hu-Asp polypeptidu. Vektor podľa vynálezu, kde uvedený Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp 1. Vektor podľa vynálezu, kde uvedený Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(a). Vektor podľa vynálezu, kde uvedený Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(b). Hostiteľská bunka obsahujúca vektor podľa vynálezu. Spôsob získania Hu-Asp polypeptidu zahŕňajúci kultiváciu hostiteľských buniek podľa vynálezu a izoláciu uvedeného Hu-Asp polypeptidu. Izolovaný Hu-Asp 1 polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu aspoň z 95 % identickú so sekvenciou obsahujúcou aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ č. 2. Izolovaný Hu-Asp2(a) polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu aspoň z 95 % identickú so sekvenciou obsahujúcou aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ č. 4. Izolovaný Hu-Asp2(b) polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu aspoň z 95 % identickú so sekvenciou obsahujúcou aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ č. 8. Izolovaná protilátka, ktorá sa viaže špecificky k Hu-Asp polypeptidu podľa vynálezu.

Uvádzame väčší počet metód stanovenia enzýmu

Spôsob na identifikáciu buniek, ktoré sa môžu použiť na screening inhibítorov β sekretázovej aktivity, zahŕňa:

···· ·· • · • ·

- 11 • · · • · · · ·· ·· ·· ·· • · · • · ·· • · · · · · i • · · e ·· · ·· • · ·· identifikovanie buniek, ktoré exprimujú proteázu schopnú štiepiť APP v β sekretázovom mieste, čo zahŕňa:

i) odobratie buniek alebo supernatantu z buniek, ktoré sa majú identifikovať ii) meranie produkcie kritického peptidu, kde kritický peptid je zvolený zo skupiny obsahujúcej buď APP C-koncový peptid, alebo rozpustný APP, iii) selekcia buniek, ktoré produkujú kritický peptid.

Spôsob podľa vynálezu, kde sú odobraté bunky a kritickým peptidom je APP C-koncový peptid vzniknutý ako dôsledok β sekretázového štiepenia. Spôsob podľa vynálezu, kde sa odoberie supernatant a kritickým peptidom je rozpustný APP, kde rozpustný APP má C-koniec vzniknutý ako dôsledok β sekretázového štiepenia. Spôsob podľa vynálezu, kde bunky obsahujú niektorú z nukleových kyselín alebo polypeptidov podľa vynálezu a kde je ukázané, že bunky štiepi β sekretázové miesto niektorého z peptidov majúcich nasledujúcu peptidovú štruktúru, P2, PI, PI', P2', kde P2 je K alebo N, kde PI je M alebo L, kde Pľ je D, kde P2' je A. Spôsob podľa nároku 111, kde P2 je K a PI je M. Spôsob podľa nároku 112, kde P2 je N a PI je L.

Akákoľvek bakteriálna bunka obsahujúca akékoľvek nukleové kyseliny alebo peptidy podľa vynálezu. Bakteriálna bunka podľa vynálezu, kde táto baktéria je E coli. Akákoľvek eukariotická bunka obsahujúca ktorékoľvek nukleové kyseliny alebo polypeptidy podľa vynálezu. Akákoľvek bunka hmyzu obsahujúca akékoľvek nukleové kyseliny alebo polypeptidy podľa vynálezu. Bunka hmyzu podľa vynálezu, kde týmto hmyzom je s©, alebo High5. Bunka hmyzu podľa vynálezu, kde týmto hmyzom je High5. Akákoľvek cicavčia bunka obsahujúca akékoľvek nukleové kyseliny alebo polypeptidy vynálezu. Cicavčia bunka podľa vynálezu, kde cicavčia bunka je vybraná zo skupiny obsahujúcej bunky ľudské, hlodavcov, zajacovitých a primátov. Cicavčia bunka vynálezu, kde cicavčia bunka je vybraná zo skupiny obsahujúcej bunky ľudské. Cicavčia bunka podľa vynálezu, kde ľudská bunka je vybraná zo skupiny obsahujúcej HEK293 a IMR-32. Cicavčia bunka podľa vynálezu, kde táto bunka je bunka primáta. Bunka primáta podľa vynálezu, kde bunka primáta je COS-7 bunka. Cicavčia bunka podľa vynálezu, kde cicavčia bunka je vybraná zo skupiny obsahujúcej bunky hlodavcov. Bunka hlodavca podľa vynálezu vybraná zo skupiny obsahujúcej CH0-K1, Neuro-2A, 3T3 bunky. Bunky kvasiniek podľa vynálezu. Vtáčie bunky podľa vynálezu.

Akákoľvek izoforma APP, kde posledné dva karboxy terminálnej aminokyseliny tejto izoformy sú obidve lyzínové zvyšky. V opise je izoforma APP definovaná ako akýkolvek APP polypeptid, vrátane variantu APP (vrátane mutantných) a fragmenty APP, ktoré existujú u ľudí ako sú tie popísané v USA 5,766,846, oddiel 7, riadok 45 až 67, na ktoré sa tu odkazuje.

9999 99 99 99 99 · · · · · · ···

- 12• · ··· ·· ··· · · ···· ···· · · · ·· ·· ·· ·· ·· ···

Izoforma APP podľa nároku 114 obsahujúca izoformu známu ako APP695 modifikovanú tak, že poslednými dvoma karboxy terminálnymi kyselinami sú dva lyzínové zvyšky. Izoforma podľa vynálezu obsahujúca SEQ č. 16. Izoformný variant podľa vynálezu obsahujúci SEQ č. 18 a 20. Akákoľvek eukariotická bunková línia, obsahujúca nukleové kyseliny alebo polypeptidy podľa vynálezu. Akákoľvek bunková línia podľa vynálezu, ktorá je cicavčou bunkovou líniou (HEK293, Neuro2a, sú výhodné - plus iné). Spôsob na identifikáciu inhibítorov enzýmu, ktorý štiepi beta sekretázové štiepne miesto APP, ktorý zahŕňa:

a) kultiváciu buniek v kultivačnom médiu za podmienok, keď enzým spôsobuje spracovanie (Processing) APP a uvoľňuje amyloidný beta-peptid do média a spôsobuje akumuláciu CTF99 fragmentov APP v bunkovom lyzáte,

b) vystavenie kultivovaných buniek pôsobeniu testovanej zlúčeniny; a zvlášť stanovenie, či testovaná zlúčenina inhibuje funkciu enzýmu meraním množstva uvoľneného amyloidného beta-peptidu v médiu a/alebo množstva CTF99 fragmentov APP v bunkových lyzátoch;

c) identifikácia testovaných zlúčenín znižujúcich množstvo rozpustného amyloidného betapeptidu prítomného v kultivačnom médiu a úbytok CTF99 fragmentov APP v bunkových lyzátoch ako Asp2 inhibítorov.

Spôsob podľa vynálezu, kde kultivovanými bunkami sú bunky ľudské alebo hmyzu. Spôsob podľa vynálezu, kde ľudské alebo bunkové línie hlodavcov vykazujú β sekretázovú aktivitu spôsobujúcu APP spracovanie s uvoľňovaním amyloidného beta-peptidu do kultivačného média a akumuláciu CTF99 v bunkovom lyzáte. Spôsob podľa vynálezu, kde sa na ľudské alebo hlodavčie bunky pôsobí pozitívnymi oligomérmi proti enzýmu, ktorý vykazuje β sekretázovú aktivitu, čím sa zníži množstvo rozpustného amyloidného beta-peptidu sekretázovú v kultivačnom médiu a úbytok CTF99 fragmentov APP v bunkových lyzátoch. Spôsob na identifikáciu látok, ktoré znižujú aktivitu Hu-Asp polypeptidu vybraného zo skupiny obsahujúcej Hu-Aspl, HuAsp2(a) a Hu-Asp2(b), spôsob zahŕňa:

a) stanovenie aktivity uvedeného Hu-Asp polypeptidu v prítomnosti testovanej látky a v neprítomnosti testovanej látky; a

b) porovnanie aktivity uvedeného Hu-Asp polypeptidu stanoveného v prítomnosti uvedenej testovanej látky s aktivitou uvedeného Hu-Asp polypeptidu stanoveného v neprítomnosti uvedenej testovanej látky;

kde nižšia hladina aktivity v prítomnosti uvedenej testovanej látky než v jej neprítomnosti indikuje, že táto látka znižuje aktivitu Hu-Asp polypeptidu. Nukleové kyseliny, peptidy, proteíny, vektory, bunky a bunkové línie a stanovenia tu opísané.

·· ·· ·· • · · · · · ···· ·· • · • · ···· ···· ··

- 13 - ·· ·· ·· ·· ·· *

Vynález prináša izolované nukleové kyseliny obsahujúce polynukleotidy, ktoré kódujú polypeptid vybraný zo skupiny obsahujúcej ľudské aspartylproteázy. Zvlášť ľudská aspartylproteáza 1 (Hu-Aspl) a dva alternatívne spájacie varianty ľudskej aspartylproteázy 2 (HuAsp2) označované tu ako Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b). Označením „Hu-Asp“ sa tu myslí Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) i Hu-Asp2(b). Označením „Hu-Asp2“ sa tu myslí Hu-Asp2(a) i Hu-Asp2(b). HuAspl sa exprimuje najviac v pankrease a prostatickom tkanive, zatiaľ čo Hu-Asp2(a) a HuAsp2(b) sa exprimujú najviac v pankrease a mozgovom tkanive. Vynález tiež prináša izolované polypeptidy Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b), rovnako ako ich fragmenty, ktoré vykazujú aspartylproteázovú aktivitu.

Vo výhodnom vyhotovení obsahuje molekula nukleovej kyseliny polynukleotid o sekvencii zvolenej zo skupiny obsahujúcej zvyšky 1-1554 z SEQ č. 1; kódujúcu Hu-Aspl, zvyšky 1-1503 zo SEQ č. 3 kódujúcu Hu-Asp(a), a zvyšky 1-1428 zo SEQ č. 5 kódujúcu Hu-Asp(b). V ďalšom aspekte vynález prináša izolované nukleové kyseliny obsahujúce polynukleotid, ktorý hybridizuje za prísnych podmienok s polynukleotidom kódujúcim Hu-Aspl, Hu-Asp2(a), Hu-Asp2(b), alebo ich fragmenty. Európska patentová prihláška EP 0 848 062 uvádza polypeptid označovaný ako Aspl, ktorý sa vyznačuje značnou homológiou s Hu-Aspl, zatiaľ čo medzinárodná prihláška WO 98/22597 uvádza polypeptid označený ako „Asp2“, ktorý sa vyznačuje významnou homológiou s Hu-Asp2(a).

Vynález tiež prináša vektory obsahujúce izolované nukleové kyseliny podľa vynálezu, hostiteľské bunky, do ktorých sú také vektory vložené a rekombinantné metódy získavania HuAspl, Hu-Asp2(a), alebo Hu-Asp2(b) polypeptidov kultivovaním vyššie opísaných hostiteľských buniek a izolácie relevantných polypeptidov.

Ďalším aspektom vynálezu sú izolované Aspl, Hu-Asp2(a), a Hu-Asp2(b) polypeptidy, rovnako ako ich fragmenty. Vo výhodnom vyhotovení majú Aspl, Hu-Asp2(a), a Hu-Asp2(b) polypeptidy aminokyselinová sekveneiu podľa SEQ č. 2, SEQ č. 4, alebo respektíve SEQ č. 6. Vynález tiež popisuje aktívne formy Hu-Asp2, spôsoby pre prípravu týchto aktívnych foriem, spôsoby pre prípravu rozpustných foriem, spôsoby na meranie Hu-Asp2 aktivity a substráty pre Hu-Asp2 štiepenie. Vynález rovnako opisuje pozitívne oligoméry proti Aspl, Hu-Asp2(a), a HuAsp2(b) mRNA transkryptom a ich použitie ako antizmyslový prostriedok na vyradenie takej mRNA a následnú produkciu zodpovedajúcu polypeptidu. Izolované protilátky, polyklonálne aj monoklonálne, ktoré sa viažu špecificky k Aspl, Hu-Asp2(a), alebo Hu-Asp2(b) polypeptidom sú rovnako zahrnuté.

···· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ···

- 14·· · · · ·· e·· · · ···· ···· · · · ·· ·· ·· ·· ·· ···

Vynález rovnako prináša spôsoby na identifikáciu látok, ktoré modulujú aktivitu ktoréhokoľvek z Aspl, Hu-Asp2(a), a Hu-Asp2(b). Vynález popisuje spôsoby na testovanie takých látok v bezbunkových stanoveniach, kde sa pridáva Hu-Asp2, rovnako ako spôsoby na testovanie týchto látok na ľudských alebo iných cicavčích bunkách, v ktorých je Hu-Asp2 prítomný.

Stručný popis zoznamu sekvencií

Sekvencia č. 1-Ľudská Aspl, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 2-Ľudská Aspl, predpovedaná aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 3-Ľudská Asp2(a), nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 4-Ľudská Asp2(a), predpovedaná aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 5-Ľudská Asp2(b), nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 6-Ľudská Asp2(b), predpovedaná aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 7-Myšacia Asp2(a), nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 8-Myšacia Asp2(a), predpovedaná aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 9-Ľudská APP695, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 10-Ľudská APP695, predpovedaná aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 11-Ľudská APP695-Sw, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 12-Ľudská APP695-Sw, predpovedaná aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 13-Ľudská APP695-VF, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 14-Ľudská APP695-VF, predpovedaná aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 15-Ľudská APP695-KK, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 16-Ľudská APP695-KK, predpovedaná aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 17-Ľudská APP695-Sw-KK, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 18-Ľudská APP695-Sw-KK, predpovedaná aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 19-Ľudská APP695-VF-KK, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 20-Ľudská APP695-VF-KK, predpovedaná aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 21-T7-Human-pro-Asp-2(a)ÄTM, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 22-T7-Human-pro-Asp-2(a)ATM, aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 23-T7-Caspase-Human-pro-Asp-2(a)ÁTM, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 24-T7-Caspase-Human-pro-Asp-2(a)ATM, aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 25-Human-pro-Asp-2(a)ATM (nízke GC), nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 26-Human-pro-Asp-2(a)ÁTM (nízke GC), aminokyselinová sekvencia ···· ·· · ·· ·· ··· · · · · ···

-15«· ·· ·· ·· ·· ···

Sekvencia č. 27-T7-Caspase- Caspase 8 štiepenie Human-pro-Asp-2(a)ATM, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 28-T7-Caspase- Caspase 8 štiepenie Human-pro-Asp-2(a)ÁTM, aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 29-Human-pro-Asp-2(a)ÁTM, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 30-Human-pro-Asp-2(a)ÁTM, aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 31-Human-pro-Asp-2(a)ÁTM(His)₆, nukleotidová sekvencia

Sekvencia č. 32-Human-pro-Asp-2(a)ATM(His)₆, aminokyselinová sekvencia

Sekvencia č. 33-46 sú opísané ďalej v detailnom opise vynálezu.

Nasleduje niekoľko definícií používaných v tomto vynáleze, väčšinu používaných definícií bežne používajú odborníci v obore.

β amyloidný peptid znamená akýkoľvek peptid vznikajúci beta sekretázovým štiepením APP. Zahŕňa to peptidy o dĺžke 39, 40, 41, 42, a 43 aminokyselín, začínajúc od β sekretázového štiepiaceho miesta až po 39, 40, 41, 42, a 43 aminokyselinu od tohto miesta, β amyloidný peptid tiež znamená sekvencia 1-6, SEQ č. 1-6 podľa USA 5,750,349, vydaný 12. mája 1998 (zahrnuté do tohto dokumentu odkazom), β sekretázový štiepný fragment tu uvedený sa nazýva CTF-99, a zaujíma miesto od β sekretázového štiepného miesta až po karboxy koniec APP.

Izoformy APP znamená akýkoľvek APP polypeptid, vrátane APP variant (vrátane mutácii) a APP fragmenty, ktoré existujú u ľudí tak, ako sú opísané v USA 5 766 846, oddiel 6, riadky 4567, zahrnuté do tohto dokumentu odkazom a pozri nižšie.

Termín „β-amyloidný prekurzorový proteín“ (APP) tak, ako sa tu používa, sa definuje ako polypeptid, ktorý sa kóduje genóm rovnakého mena nachádzajúcim sa u človeka na dlhom ramene chromozómu 21 , a ktorý obsahuje ,,βΑΡ“ tu „β-amyloidný proteín“ pozri vyššie, vo svojej karboxy tretine. APP je glykozylovaný, jeden transmembránový segment obsahujúci proteín exprimovaný v širokom spektre buniek v mnohých cicavčích tkanivách. Príklady špecifických izotypov APP, ktoré sú v súčasnosti známe u ľudí, sú 695-aminokyselinový polypeptid popísaný v Kang et al. (1987) Náture 325:733-736, ktorý sa označuje ako „normálny“ APP; 751aminokyselinový polypeptid popísaný v Ponte et al. (1988) Náture 331:525-527 (1988) a Tanzi et al. (1988) Náture 331:528-530; a 770-aminokyselinový polypeptid popísaný v Kitaguchi et al. (1988) Náture 331:530-532. Príklady špecifických variantov APP zahŕňajú bodové mutácie, ktoré sa môžu odlišovať pozíciami i fenotypom (na preskúmanie známych mutantných variantov pozri Hardy (1992) Náture Genet. 1:233-234). Všetky citované odkazy sú tu zahrnuté svojím odkazom.

····	• e			··		··	• a
•	•	•	•		•	•	•	t	•	··
•	•	•	•		•	··	•	•
• ·	•	•	•		•	•	é	•	•
··	··			··		··	··		• a

Termín „APP fragment“, ak sa tu používa, znamená fragment APP iný než tie, ktoré obsahujú výlučne βΑΡ, alebo βΑΡ fragmenty. Takže APP fragmenty zahŕňajú aminokyselinové sekvencie APP navyše k tým, ktoré tvoria intaktný 3AP, alebo βΑΡ fragment.

Termín „akákoľvek aminokyselina“, ako sa tu používa, znamená aminokyselinu zvolenú z nasledujúcej skupiny, troj písmenovú a jedno písmenovú skratku, ktoré sa môžu tiež použiť: Alanin, Ala, A; Arginín, Arg, R; Asparagín, Asn, N; Asparágová kyselina, Asp, D; Cysteín, Cys, C; Glutamín, Gin, Q; Glutámová kyselina, Glu, E; Glycín, Gly, G; Histidín, His, H; Izoleucín, íle, I; Leucín, Leu, L; Lyzín, Lys, K; Metionín, Met, M; Fenylalanín, Phe, F; Prolín, Pro, P; Serín, Ser, S; Treonín, Thr, T; Tryptofán, Trp, W; Tyrozín, Tyr, Y; Valín, Val, V; Asparágová kyselina, alebo Asparagín, Asx, B; Glutámová kyselina alebo Glutamín, Glx, Z; akákoľvek aminokyselina, Xaa, X.

Vynález prináša spôsoby na vyhľadávanie v génových databázach jednoduchého motívu aktívneho miesta charakteristického pre. aspartylproteázy. Eukaryotické aspartylproteázy, ako je pepsín, alebo renín sa tvoria dvoma charakteristickými doménami, ktoré privádza do blízkosti v aktívnom mieste dva aspartylové zvyšky. Tie zabudované v krátkom tripeptidovom motíve DTG, alebo zriedka DSG. Väčšina aspartylproteáz vzniká ako proenzýmy ich N-koniec sa musí pre aktiváciu odštiepiť. DTG, alebo DSG motívy aktívneho miesta sa vyskytujú asi na pozíciách 6570 proenzýmu (prorenín, pepsinogén), ale asi na pozíciách 25-30 v aktívnom enzýme po odštiepení N-koncovej prodomény. Obmedzená dĺžka motívu aktívneho miesta sťažuje nájsť súbor krátkych expresných sekvenčných značiek (tags) (EST) nových aspartylproteáz. EST sekvencie majú obvykle asi 250 nukleotidov, alebo menej a teda kódujú 80-90 aminokyselinových zvyškov, alebo menej. Mala by to byť tak krátka sekvencia, že nemôže obsahovať dva motívy aktívneho miesta. Výhodnou metódou je skúmať databázu na hypotetickú, alebo zostavenú proteín kódujúcu sekvenciu. Vynález popisuje počítačovú metódu na identifikáciu kandidátov aspartylproteáz v databáze proteínových sekvencii. Spôsob sa použil na identifikáciu sedem kandidátov aspartylproteázových sekvencií v genóme Caenorhabditis elegans. Tieto sekvencie sa potom použili na identifikáciu Hu-Asp 1 a dvoch alternatívnych spájacích variantov Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) pomocou hľadania homológie.

Hlavným aspektom vynálezu je poskytnutie nových informácii o spracovaní (processingu)

APP. Patogénne spracovanie amyloidného prekurzorového proteínu (APP) cez Αβ dráhu vyžaduje sekvenčné pôsobenie dvoch proteáz označovaných ako β-sekratáza a γ-sekratáza.

Štiepenie APP β-sekretázou a γ-sekretázou uvoľňuje N-koniec respektíve C-koniec Αβ peptidu.

Vďaka nadprodukciu Αβ peptidu, sa zvlášť Αβ_Μ2 považuje za príčinu iniciácie Alzheimerovej

-17···· ···· ·· · ·· ·· ·· ·· ·· ··· choroby, inhibítory buď β-sekretázy, a/alebo γ-sekretázy sú potencionálnymi liekmi na Alzheimerovu chorobu. Cez význam β-sekretázy a γ-sekretázy v patogénnom spracovaní APP sa tieto enzýmy až dodnes molekulárne identifikovali. Nebolo teda známe, ktoré enzýmy sú zodpovedné za štiepenie v β-sekretázovom alebo γ-sekretázovom štiepnom mieste. Tie miesta samotné boli známe, pretože bol známy APP a rovnako bol známy Αβι.*2 pozri USA 5 766846 a USA 5 837672 (tu uvedené ako odkaz, s výnimkou odkazu na „rozpustné“ peptidy). Nebolo však známe, ktoré enzýmy sa podieľajú na produkciu Αβι^₂ peptidu.

Vynález obsahuje molekulárnu definíciu niekoľkých nových ľudských aspartylproteáz a jedna z nich označovaná ako Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) bola charakterizovaná detailne. Predchádzajúce formy aspl a asp2 už boli uverejnené, pozri EP 0848062A2 a EP 085444A2 autorov Dávid Powel a kol. Smith Kline Beecham Corp. (zahrnuté odkazom). Tu sú uvedené skôr známe a nové formy Hu-Asp2. Po prvý krát sa podarilo ich exprimovať v aktívnej forme, sú uvedené ich substráty a ich špecifická. Predtým bolo treba na štiepenie β-sekretázového miesta bunky alebo bunkový extrakt, teraz sa môže na stanovenie použiť purifikovaný proteín, čo je tu tiež uvedené. Na základe výsledkov (1) antisens knock out experimentov, (2) experimentov s prechodným vyradením pomocou transfekcie, a (3) biochemických experimentov s využitím purifikovaného rekombinantného Hu-Asp2 sa ukázalo, že Hu-Asp2 je β-sekratáza hrajúca úlohu v spracovaní APP. Hoc už bola známa nukleotidové a predpovedaná aminokyselinová sekvencia Hu-Asp2(a), pozri vyššie, pozri EP 0848062A2 a EP 0855444A2, doteraz sa neuverejnila žiadna charakterizácia tohto enzýmu. Teraz sa tu charakterizuje Hu-Asp2 enzým a je vysvetlené, prečo ide o zásadný a nevyhnutný enzým potrebný pre vznik Αβι^₂ peptidu možná tiež rozhodujúci krok pri vývoji AD.

V inom vyhotovení podľa vynálezu je popísaný nový zostrihový variant Hu-Asp2 označený ako Hu-Asp2(b), ktorý nebol doteraz známy.

V ďalšom vyhotovení podľa vynálezu sú poskytnuté izolované molekuly nukleových kyselín obsahujúce nukleotidové sekvencie kódujúce polypeptid vybraný zo skupiny obsahujúcej ľudskú aspartyl proteázu 1 (Hu-Aspl) a dva alternatívne spájacie varianty ľudskej aspartylproteázy 2 (Hu-Asp2), označené tu ako Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b). Pokiaľ sa tu uvádza nejaký odkaz na Hu-Asp2, myslia sa tým obidva varianty Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b). Hu-Aspl sa exprimuje najviac v pankrease a prostatickom tkanive, zatiaľ čo Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) sa exprimujú najviac v pankrease a mozgovom tkanive. Vynález tiež prináša izolované Hu-Aspl, Hu-Asp2(a), a Hu-Asp2(b) polypeptidy, rovnako ako ich fragmenty, ktoré vykazujú aspartyiproteázovú aktivitu.

-18···· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ··· ··· ···· ··

Predpovedané aminokyselinové sekvencie Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) majú významnú homológii so skôr identifikovanými cicavčími aspartylproteázami, ako je pepsinogén A, pepsínogén B, katepsín D, katepsín E a renín. P.B. Szecs, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 52:(210 522 (1992)). Tieto enzýmy sú charakterizované prítomnosťou duplikovaného DTG/DSG sekvenčného motívu. Hu-Aspl a Hu-Asp2 polypeptidy tu zverejnené tiež vykazujú extrémne vysokú homológiu s ProSite konsenzuálnym motívom aspartylproteáz získanú z SwissProt databázy.

Nukleotidové sekvencia určená ako zvyšky 1-1554 SEQ č. 1 zodpovedá nukleotidovej sekvencii kódujúcej Hu-Aspl, nukleotidovú sekvencia určená ako zvyšky 1-1503 SEQ č. 3 zodpovedá nukleotidovej sekvencii kódujúcej Hu-Asp2(a) a nukleotidovú sekvencia určená ako zvyšky 1-1428 SEQ č. 5 zodpovedá nukleotidovej sekvencii kódujúcej Hu-Asp2(b). Izolácia a sekvencovanie DNA kódujúce Hu~Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b) je opísané ďalej v príkladoch 1 a 2.

Ako je opísané v príkladoch 1 a 2 použili sa na sekvencovanie automatizované sekvenčné metódy za získania sekvenciou Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp2(b). Hu-Asp nukleotidovú sekvencia podľa vynálezu sa získala pre obidva reťazce DNA a veríme, že je 100 % presná. Ako je však známe z literatúry, môže nukleotidovú sekvencia získaná takýmito automatizovanými metódami obsahovať nejaké chyby. Nukleotidovú sekvencia získaná automatickým sekvencovaním je obvykle aspoň z 90 %, obvyklejšie aspoň z 95 % až 99,9 % identická so skutočnou nukleotidovou sekvenciou danej molekuly nukleovej kyseliny. Sekvencia sa môže presnejšie zistiť pomocou manuálnych sekvenčných metód, ktoré sú z literatúry dobre známe. Chyba v sekvencii, ktorá vedie k inzercii alebo delécii jedného alebo viac nukleotidov môže viesť k posunu čítacieho rámca pri translácii, takže predpovedaná aminokyselinovú sekvencia sa bude odlišovať od tej, ktorá by sa stanovila pomocou skutočnej nukleotidovej sekvencii, začínajúc bodom mutácie. Hu-Asp DNA podľa vynálezu zahŕňa cDNA, chemicky syntetizovanú DNA, DNA izolovanú pomocou PCR, genómovú DNA a ich kombinácie. Genómová Hu-Asp DNA sa môže získať prehľadávaním genetickej knihovne pomocou Hu-Asp2 cDNA tu popísanej, pomocou metód dobre známych z literatúry alebo pomocou oligonukleotidov zvolených z HuAsp2 sekvencii, ktoré sa môžu použiť ako priméry pre polymerázovú reťazovú reakciu (PCR). RNA prepísaná z Hu-Asp DNA je tiež zahrnutá v rozsahu vynálezu.

Kvôli degenerácii genetického kódu môžu dve odlišné DNA kódovať rovnakú aminokyselinovú sekvenciu. Vynález preto prináša izolované molekuly nukleových kyselín majúce polynukleotidovú sekvenciu kódujúcu akýkoľvek Hu-Asp polypeptid podľa vynálezu, kde táto ···· ·· • · • · ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · polynukleotidová sekvencia kóduje Hu-Asp polypeptid majúci kompletnú aminokyselinovú sekvenciu SEQ č. 2, SEQ č. 4, SEQ č. 6, alebo ich fragmenty.

Vynález zahŕňa tiež purifikované Hu-Asp polypeptidy, ako rekombinantné, tak aj nerekombinantné. Predovšetkým sú tu uvedené spôsoby pre produkciu Hu-Asp2 polypeptidov v aktívnej forme. To zahŕňa produkciu Hu-Asp2 polypeptidov a ich variant v bakteriálnych bunkách, bunkách hmyzu a cicavčích bunkách, tiež vo formách, ktoré umožňujú sekréciu HuAsp2 polypeptidu z bakteriálnej bunky, bunky hmyzu, alebo ľudskej bunky do kultivačného média, ďalej spôsoby pre produkciu variantu Hu-Asp2 polypeptidu obsahujúceho aminokyselinové prívesky, ktoré uľahčujú purifíkáciu. Vo výhodnom vyhotovení podľa vynálezu je Hu-Asp2 polypeptid prevedený do proteolyticky aktívnej formy buď v transformovaných bunkách, alebo po purifikácii a štiepení ďalšou proteázou v „cell-fŕee“ systéme, teda systéme prostého buniek, takej aktívnej formy Hu-Asp2 polypeptidu začínajúceho N-koncovou sekvenciou TQHGIR alebo ETDEEP. Varianty a deriváty, vrátane fragmentov Hu-Asp proteínov majúcich natívnu aminokyselinovú sekvenciu danú v SEQ č. 2, 4, a 6, ktoré si uchovávajú nejakú biologickú aktivitu Hu-Asp sú tiež v rozsahu vynálezu. Odborník v obore je samozrejme schopný odlišovať, či variant, derivát, alebo fragment Hu-Asp proteínu vykazuje Hu-Asp aktivitu stanovením aspartylproteázovej aktivity tohto variantu derivátu, alebo fragmentu. Fragmenty HuAsp patriace do rozsahu vynálezu zahŕňajú tie, ktoré obsahujú doménu aktívneho miesta obsahujúcu DTG aminokyselinovú sekvenciu, fragmenty, ktoré obsahujú doménu aktívneho miesta obsahujúcu DSG aminokyselinovú sekvenciu, fragmenty obsahujúce DTG aminokyselinovú sekvenciu i DSG aminokyselinovú sekvenciu, fragmenty, v ktorých sa predĺžilo oddelenie DTG a DSG aktívnych miest, fragmenty, v ktorých toto oddelenie sa skrátilo. V rozsahu vynálezu sú tiež fragmenty Hu-Asp, v ktorých sa odstránila transmembránová doména a tak umožnila produkcia Hu-Asp2 v rozpustnej forme. V ďalšom vyhotovení podľa vynálezu môžu byť dve poloviny Hu-Asp2, každá obsahujúca jedno aktívne miesto DTG alebo DSG sekvenciu produkovane oddelene ako rekombinantné polypeptidy a potom spojené v roztoku, kde dôjde k rekonštitúcii aktívnej proteázy.

Hu-Asp varianty môžu byť napríklad získané mutáciou natívnej Hu-Asp kódujúcej nukleotidové sekvencie. Hu-Asp variant tak, ako sa tu tento pojem používa, je polypeptid významne homologický s natívnym Hu-Asp polypeptidom, ktorý má ale aminokyselinovú sekvenciu odlišnú od natívneho Hu-Asp polypeptidu vďaka jednej alebo viac deliacim, inzerciám alebo substitúciám v aminokyselinovej sekvencii. Variantná aminokyselinová alebo nukleotidová sekvencia je s výhodou aspoň asi z 80 % identická, výhodnejšie z 90 % identická a najlepšie aspoň

-20···· ·· ·· ·· ·· • · · ···· · · · ··· ···· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ··· asi z 95 % identická s natívnou Hu-Asp sekvenciou. Tak teda variant nukleotidovej sekvencie, ktorý obsahuje, napríklad 5 bodových mutácií na každých sto nukleotidov, v porovnaní s natívnym Hu-Asp genóm, bude z 95 % identický s natívnym proteínom. Percentuálna identita sekvencie, tiež nazývaná homológia, medzi natívnou a variantnou Hu-Asp sekvenciou sa môže tiež stanoviť, napríklad porovnaním obidvoch sekvencii pomocou niektorého z počítačových programov obvykle na tento účel používaných, ako je program Gap (Viskonsin Sequence Analýzis Package, verzia 8 pre Unix, Genetic Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin), ktorý využíva algoritmus Smith a Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)).

Zmeny natívnej aminokyselinovej sekvencie sa môžu uskutočniť mnohými známymi technikami. Napríklad sa môžu na určených pozíciách vložiť mutácie postupmi dobre z literatúry známymi, ako je oligonukleotidom riadená mutagenéza, opísaná Walderem a kol. (Gene 42: 133 (1986)); Bauer a kol. (Gene 37: 73 (1985)); Craik (BioTechniques, Január 1985, str. 12-19); Smith a kol. (Genetic Engineering: Prínciples and Methods, Plénum Press (1981)); a U.S.A. patent č. 4518584 a 4737462.

Hu-Asp varianty patriace do rozsahu vynálezu môžu obsahovať konzervatívne substituované sekvencie, čo znamená, že je jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov nahradených iným zvyškom, pričom sa nezmení sekundárna a/alebo terciáma štruktúra Hu-Asp polypeptidu. Také substitúcie môžu zahŕňať nahradenie aminokyselinového zvyšku zvyškom iným majúcim podobné fyzikálno-chemické vlastnosti, ako je nahradenie jedného alifatického zvyšku (íle, Val, Leu,, alebo Ala) iným, alebo substitúcia medzi bázickými zvyškami Lys a Arg, kyslými zvyškami Glu a Asp, amidickými zvyškami Gin a Asn, hydroxylovými zvyškami Ser a Tyr, alebo aromatickými zvyškami Phe a Tyr. Ďalšie informácie týkajúce sa prípravy fenotypicky neutrálnych aminokyselinových zámien môžeme nájsť v Bowie a kol. Science 247: 1306-1310 (1990). Ďalšie Hu-Asp, ktoré si uchovávajú významne vysokú biologickú aktivitu Hu-Asp sú tie, kde sú aminokyselinové substitúcie vykonané v oblastiach mimo funkčného regiónu proteínu.

Ďalším aspektom vynálezu je poskytnutie izolovaných molekúl nukleových kyselín obsahujúcich polynukleotidy, ktoré hybridizujú za prísnych podmienok s časťou molekúl nukleových kyselín popísaných vyššie, napríklad aspoň s asi 15 nukleotidmi, výhodnejšie aspoň s asi 20 nukleotidmi a najlepšie aspoň s asi 30 nukleotidmi a celkom najlepšie aspoň s asi 30 až aspoň s asi 100 nukleotidmi vyššie opísaných molekúl nukleových kyselín. Také časti nukleových kyselín majú popísanou dĺžku zodpovedajúcu napríklad aspoň 15 nukleotidom referenčnej molekuly nukleovej kyseliny.

···· ·· • · • · ·· ·· ·· • ···· ··· • · · ·· · · • · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·

-21Prísnymi hybridizačnými podmienkami sa mysli inkubácia cez noc pri asi 42 °C po asi 2,5 hodiny v 6 x SSC/0,1% SDS, nasledovaná premytím filtrov v 1,0 x SSC pri 65 °C, 0,1% SDS.

Fragmenty Hu-Asp kódujúcich molekúl nukleových kyselín tu popísaných, rovnako ako polynukleotidy schopné hybridizácie s týmito molekulami nukleových kyselín sa môžu použiť ako sondy alebo priméry v polymerázovej reťazovej reakcii (PCR). Také sondy sa môžu použiť napríklad na detekciu prítomnosti Hu-Asp nukleových kyselín v in vitro stanoveniach, rovnako ako pri Southern a Nothem blottingu. Typy buniek exprimujúcich Hu-Asp sa môžu tiež identifikovať pomocou týchto sond. Tieto postupy sú odborníkovi v obore dobre známe a je schopný zvoliť sondu vhodnej dĺžky pre konkrétnu aplikáciu. V PCR sú využité 5 a 3' priméry zodpovedajúce koncom žiadanej Hu-Asp molekuly nukleovej kyseliny na izoláciu a amplifikáciu tejto sekvencie konvenčnými technikami.

Ďalšími výhodnými fragmentmi Hu-Asp molekúl nukleových kyselín sú pozitívne alebo negatívne oligonukleotidy obsahujúce jednoreťazcovú nukleovú kyselinu sekvencie schopnej sa viazať na cieľové Hu-Asp mRNA (pomocou negatívneho reťazca), alebo Hu-Asp DNA (pomocou pozitívneho reťazca) sekvencie. Vo výhodnom vyhotovení podľa vynálezu tieto HuAsp pozitívne oligonukleotidy redukujú množstvo Hu-Asp mRNA a následne produkciu Hu-Asp polynukleotidov.

V ďalšom aspekte vynález zahŕňa Hu-Asp polypeptidy s alebo bez natívne sa vyskytujúcej glykozylácie. Ako Hu-Asp 1, tak aj Hu-Asp2 majú kanonické akceptorové miesta pre Asn pripojené cukry, kde Hu-Asp 1 má dve také miesta a Hu-Asp2 má štyri. Hu-Asp exprimované v kvasinkách alebo cicavčích (diskutovaných ďalej) môžu byť podobné alebo významne rozdielne od natívneho Hu-Asp polypeptidu v molekulárnej hmotnosti a spôsobu glykozylácie. Exprese HuAsp v bakteriálnych expresných systémoch poskytuje neglykozylované Hu-Asp.

Polypeptidy podľa vynálezu sú s výhodou v izolovanej forme, s výhodou sú do značnej miery purifikované. Hu-Asp polypeptidy sa môžu získať a purifikovať z tkanív, bunkových kultúr alebo rekombinantných bunkových kultúr známymi metódami, vrátane precipitácie síranom amónnym alebo etanolom, chromatografiou na katexoch alebo anexoch, chromatografiou na fosfocelulóze, hydrofóbnou chromatografiou, afinitnou chromatografiou, chromatografiou na hydroxyapatite, lektínovou chromatografiou, vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC). Vo výhodnom vyhotovení vynálezu sa k Hu-Asp polypeptidu, technikami génového inžinierstva, pridáva aminokyselinový prívesok, ktorý je veľmi dobre známy, a ktorý obsahuje šesť histidínových aminokyselinových zvyškov, a ktorý umožňuje purifikáciu väzbou na imobilizovaný nikel na vhodnom nosiči, epitopy na polyklonálne alebo monoklonálne protilátky vrátane, ale

···· ·· • · · • · ·	·· ·· • · · · • · ··	·· · • · ·· • · ·
·· ··	·· ··	·· ···

nielen T7 epitopov, myc epitopov a V5a epitopov a fúzií Hu-Asp2 k vhodným proteínovým partnerom vrátane, ale nielen glutatión-S-transferázu alebo proteín vážiaci maltózu. Vo výhodnom vyhotovení podľa vynálezu sú tieto prídavné aminokyseliny umiestené na C-koniec Hu-Asp, ale sa môžu pridať na N-koniec alebo priamo do sekvencie Hu-Asp2 polypeptidu.

Vynález sa tiež týka vektorov obsahujúcich polynukleotidové molekuly podľa vynálezu, rovnako ako hostiteľských buniek transformovaných týmito vektormi. Ktorákoľvek polynukleotidová molekula podľa vynálezu sa môže vniesť do vektoru, ktorý obvykle obsahuje selekčný markér a začiatok replikácie, na pomnoženie v hostiteľovi. Pretože vynález rovnako zahŕňa Hu-Asp polypeptidy exprimované z polynukleotidových molekúl popísaných vyššie, existujú vektory výhodné pre expresiu Hu-Asp. Tieto vektory zahŕňajú DNA kódujúcu niektorý z Hu-Asp polypeptidov opísaných vyššie alebo nižšie, funkčne pripojených k vhodným transkripčným alebo translačným regulačným sekvenciám, kde tieto sekvencie sú odvodené od cicavčích, mikrobiálnych, vírových alebo hmyzích génov. Príklady takých regulačných sekvencii zahŕňajú transkripčné promótory, operátory alebo zosilňovače transkripcie, mRNA ribozomálne väzbové miesta a vhodné sekvencie, ktoré riadia transkripciu a transláciu. Nukleotidové sekvencie sú funkčne spojené vtedy, keď funkčná sekvencia má funkčný vzťah k DNA kódujúcu. Promótorova nukleotidová sekvencia je teda funkčne pripojená k Hu-Asp DNA sekvencii, ak riadi promótorovu nukleotidovú sekvenciu transkripcia Hu-Asp sekvencia.

Výber vhodných vektorov použiteľných na klonovanie polynukleotidových molekúl kódujúcich Hu-Asp alebo na expresiu Hu-Asp polypeptidov samozrejme závisí na hostiteľskej bunke, do ktorej sa vektor transformuje a prípadne, ktorá bude Hu-Asp polypeptid exprimovať. Vhodné hostiteľské bunky pre expresiu Hu-Asp polypeptidov zahŕňajú prokaryot, kvasinky a vyššie eukaryotické bunky, čo je diskutované ďalej.

Hu-Asp polypeptidy, ktoré sa majú exprimovať v takých hostiteľských bunkách, môžu byť tiež fúzne proteíny, ktoré obsahujú oblasti z heterológných proteínov. Také oblasti sa môžu zahrnúť aby umožňovali napríklad sekréciu, zvyšovali stabilitu alebo uľahčovali purifikáciu polypeptidu. Napríklad sa môže do expresného vektora vložiť sekvencia kódujúca vhodný signálny peptid. DNA sekvencia signálneho peptidu (sekrečný signál) sa môže pripojiť za zachovania čítacieho rámca k Hu-Asp sekvencii, takže Hu-Asp sa prekladá ako fúzny proteín obsahujúci signálny peptid. Signálny peptid, ktorý je funkčný v danej hostiteľskej bunke iniciuje extracelulámu sekréciu Hu-Asp polypeptidu. S výhodou sa signálna sekvencia po sekrécii Hu-Asp z bunky od Hu-Asp polypeptidu odštiepi. Nelimitujúce príklady signálnych sekvencii, ktoré sa

-23···· ·· ·· ·· • · · · · · · • · 9 9 9 99

9 9

9

99 99 99

999 môžu použiť podľa vynálezu, zahŕňajú kvasničný I-faktor a včelí melatín vedúcej sekvencie v sf9 bunkách hmyzu.

Vo výhodnom vyhotovení podľa vynálezu je Hu-Asp polypeptid ťuznym proteínom, ktorý obsahuje heterológnu oblasť, ktorá uľahčuje purífíkáciu polypeptidu. Mnoho dostupných peptidov používaných na tento účel umožňuje selektívnu väzbu fuzneho proteínu na väzného partnera. Napríklad Hu-Asp protein sa môže napríklad modifikovať, za vzniku fuzneho proteínu tak, že obsahuje peptid, ktorý sa špecificky viaže k väznému partnerovi alebo peptidový prívesok. Neobmedzujúce príklady takých peptidových príveskov zahŕňajú 6-His prívesok, tioredoxínový prívesok, hemaglutinínový prívesok, GST prívesok a OmpA signálnu sekvenciu. Ako je iste odborníkom v obore dobre známe, väzný partner, ktorý rozozná a viaže peptid, môže byť niektorá z molekúl alebo zlúčenín zahŕňajúca ióny kovov (napríklad afinitná kolóna s imobilizovanými iónmi kovov), protilátkami alebo ich fragmentmi a akýkoľvek protein alebo peptid, ktorý viaže daný peptid ako je FLAG prívesok.

Vhodné hostiteľské bunky pre expresiu Hu-Asp polypeptidov zahŕňajú prokaryoty, kvasinky a vyššie eukaryotické bunky. Vhodné prokaryotické hostiteľské bunky použiteľné pre expresiu Hu-Asp zahŕňajú baktérie rodov Escherichia, Bacillus a Salmonella, rovnako ako zástupcov rodov Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus. Pre expresiu napríklad v E.coli môže Hu-Asp polypeptid obsahovať N-terminálny metionínový zvyšok na uľahčenie expresie rekombinantného polypeptidu v prokaryotickom hostiteľovi. N-terminálny Met sa môže prípadne potom z exprímovaného Hu-Asp polypeptidu odštiepiť. Na uľahčenie expresie v Escherichia coli sa môžu nakoniec pridať ďalšie aminokyseliny vrátane, ale nielen, T7 vedúca sekvencia, T7caspasa 8 vedúca sekvencia rovnako ako iné vedúce sekvencie vrátane príveskov na purífíkáciu takých, ako je 6-His prívesok (príklad 9). Hu-Asp polypeptidy exprímované v E.coli sa môžu získať buď v rozpustnej forme, alebo v nerozpustnej forme, keď môže alebo nemusí byť prítomný vo forme inkluzných teliesok. Nerozpustné polypeptidy sa môžu previesť na rozpustné pomocou guanidín hydrochloridu, močoviny alebo ďalších látok, znovu zbaliť do rozpustnej formy pred alebo po purifikácii dialýzou proti vhodnému vodnému roztoku pufru. Pokiaľ sa rekombinantnými metódami získa aktívna Hu-Asp protoforma, môže sa na aktívnu previesť odštiepením prosegmentu vhodnou ďalšou proteázou, napríklad proteázou vírusu ľudskej imunodeficiencie.

Expresné vektory použiteľné v prokaryotických hostiteľoch obvykle obsahujú jeden alebo viac génov fenotypových selekčných markérov. Také gény obvykle kódujú napríklad proteíny, ktoré zabezpečujú rezistenciu k antibiotikám, alebo ktoré zabezpečujú požiadavky auxotrofíiych jedincov. Z komerčných zdrojov je pohotovo k dispozícii široká škála takých vektorov. Príklady ···· ·· • · ·· ·· • · · ···· · · · ··· · · ·· · · zahŕňajú pSPORT vektory, pGEM vektory (Promega), pPROEX vektory (LTI, Bethesda, MD), Bluescript vektory (Stratagene), pET vektory (Novagen) a pQE vektory (Qiagen).

Hu-Asp sa môžu tiež exprimovať v kvasinkových hostiteľských bunkách rodov Saccharomyces, Pichia, a Kluveromyces. Výhodné kvasinkové bunky sú 5. cerevisiae a P. pastoris. Kvasinkové vektory často obsahujú začiatok replikácie z2T kvasinkového plazmidu, autonómne replikujúce sa sekvencie (ARS), oblasť promótora, sekvencie pre polyadenyláciu, sekvencie pre ukončenie transkripcie a gén selekčného markeru. Vektory replikujúce sa v kvasinkách i v E.coli (označované ako „shuttle“ - člnky) sa môžu rovnako použiť. Navyše k vyššie zmieneným znakom kvasinkových vektorov obsahujú člnkové vektory sekvencie pre replikáciu a selekciu v E.coli. Priama sekrécia Hu-Asp polypeptidov exprimovaných v kvasinkových hostiteľoch sa môže zabezpečiť vložením nukleotidovej sekvencie kódujúcej kvasničný I-faktor vedúcou sekvenciou na 5 '-konci Hu-Asp kódujúcou nukleotidovou sekvenciou.

Pre expresiu Hu-Asp polypeptidov sa môžu rovnako použiť systémy založené na kultúrach buniek hmyzu. Vo výhodnom vyhotovení podľa vynálezu sa Hu-Asp polypeptidy podľa vynálezu exprimujú pomocou expresných systémov založených na bunkách hmyzu (pozri príklad 10). Ďalej sa môžu pre expresiu v bunkách hmyzu použiť expresné systémy založené na baculovíruse opísané v Luckow a Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

V ďalšom výhodnom vyhotovení podľa vynálezu sa Hu-Asp polypeptid exprimuje v cicavčích bunkách. Neobmedzujúce príklady vhodných cicavčích buniek zahŕňajú COS-7 línie opičích ľadvinových buniek (Gluzman a kol., Celí 23:175 (1981)), línie ľudských embryonálnych ľadvinových buniek 293 a ovariálne bunky čínskeho škrečka. S výhodou sú pre expresiu Hu-Asp proteínov použité ovariálne bunky čínskeho škrečka (príklad 11).

Voľba vhodného expresného vektora na expresiu Hu-Asp polypeptidov podľa vynálezu bude samozrejme závisieť na konkrétnych použitých cicavčích bunkách v rámci známej technológie. Príklady vhodných expresných vektorov zahŕňajú pcDNA3 (Invitrogén) a pSVL(Pharmacia Biotech). Výhodný vektor pre expresiu Hu-Asp polypeptidu je pcDNA3.1Hygro (Invitrogén). Expresné vektory použiteľné v cicavčích bunkách môžu obsahovať transkripčné a translačné riadiace sekvencie odvozené od genómov vírusov. Obvykle používané promótorove sekvencie a sekvencie zosilňovačov transkripcie, ktoré sa môžu použiť vo vynálezu zahŕňajú, bez obmedzenia menované, tie, ktoré sú odvodené od ľudského cytomegalovirusu (CMV), Adenovírusu 2, Polyoma vírusu a Simian vírusu 40 (SV40). Metódy pre konštrukciu cicavčieho expresného vektora sú uvedené napríklad v Okayama a Berg (Mol. Celí. Biol 3:280 ···· ·· ·· ·· ·· (1983)); Cosman a kol. (Mol. Immunol. 23:935 (1986)); Cosman a kol. (Náture 312:768 (1984)); EP-A-0367566; a WO 91/18982.

Polypeptidy podľa vynálezu sa môžu tiež použiť na prípravu polyklonálnych a monoklonálnych protilátok, ktoré sú vhodné na diagnostické stanovenie na detekciu expresie HuAsp polypeptidov. Tieto protilátky sa môžu pripraviť konvenčnými technikami. Pozri napríklad. Antibodies: A laboratoratory manual, Harlow a Land (eds.), Cold Spríng Harbor Laboratory Press, Cold Spríng Harbor, N.Y., (1988); Monoklonal antibodies, Hybrídomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plénum Press, New York (1980). Syntetické peptidy obsahujúce časti Hu-Asp zahŕňajúce 5 až 20 aminokyselín sa môžu tiež použiť pre produkciu polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok, a to po pripojení k vhodnému proteínovému nosiču napríklad okrem iného k hemakyanínu prílepky (KLH), kuraciemu ovalbumínu, alebo hovädziemu sérovému albumínu pomocou rôznych sieťovacích činidiel vrátane karbodiimidov, glutaraldehydu alebo ak'peptid obsahuje cysteín, N-metylmaleínimid. Výhodným peptidom na imunizáciu je KLH konjugovaný s C-koncom Hu-Aspl, alebo Hu-Asp2 t.j. QRRPRDPEWNDESSLVRHRWK, respektíve LRQQHDDFADDISLLK.

Hu-Asp molekuly nukleových kyselín podľa vynálezu sú vhodné rovnako pre identifikáciu chromozómov, pretože sa môžu hybridizovať so špecifickými miestami na ľudských chromozómoch. Hu—spi sa lokalizoval na chromozóme 21, zatiaľ čo Hu-Asp2 sa lokalizoval na chromozóme llq23.3-24.1. V súčasnosti je treba identifikovať konkrétne miesta na chromozómoch vzhľadom na to, že sú k dispozícii sondy založené na aktuálnych sekvenčných dátach (repetičný polymorfizmus). Sotva budú sekvencie presne lokalizované na chromozómoch, môže sa fyzická pozícia na chromozóme porovnať s genetickou mapou. Môže sa potom stanoviť vzťah medzi chorobami a génmi, ktoré na mape prislúchajú na rovnaké miesto. Či daný gén má vzťah ku konkrétnej chorobe, je teda jej príčinou, môže sa stanoviť porovnaním sekvenciou nukleových kyselín medzi zasiahnutými a nezasiahnutými osobami.

V ďalšom vyhotovení sa vynález týka spôsobov stanovenia funkcie Hu-Asp, zvlášť funkcie Hu-Asp2, ktorý zahŕňa inkubáciu roztoku Hu-Asp polypeptidu s vhodným substrátom, ktorým môže byť okrem iného syntetický peptid obsahujúci β-sekretázové štiepne miesto APP, s výhodou obsahujúci mutáciu nájdenú u Švédov zasiahnutých AD, kde je KM zamenené za NL, taký peptid obsahujúci sekvenciu SEVNLDAEFR v kyslom tlmivom roztoku, s výhodou v kyslom tlmivom roztoku s pH 5,5 (pozri príklad 12), využívajúci štiepenie tohto peptidu sledovaného pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie ako miery Hu-Asp proteolytickej aktivity. Výhodné stanovenie proteolytickej aktivity využíva substráty umožňujúce stanovenie pomocou vnútorného ···· ·· • · • ·· • · • ·

-26·· • · · ·· ·· ·· ··

napríklad okrem iného kumarinu a dinitrofenolu, takže rozštiepenie peptidu účinkom Hu-Asp vedie k zvýšeniu fluorescencie vďaka fyzikálnej separácii fluorofóru a zhášadla. Výhodné kolorímetrícké stanovenie Hu-Asp proteolytickej aktivity využíva iné substráty, ktoré obsahujú PI a P2 aminokyseliny zahŕňajúce miesto štiepenia pripojené amidickou väzbou k o-nitrofenolu, takéto štiepenie Hu-Asp vedie k zvýšeniu absorbancie po zmene pH pufru na alkalické.

V ďalšom vyhotovení sa vynález týka spôsobov pre identifikáciu látcrk, ktoré zvyšujú aktivitu Hu-Asp polypeptidov zo skupiny obsahujúcej Hu-Asp 1, Hu-Asp2(a), a Hu-Asp2(b), spôsob zhŕňa:

a) stanovenie aktivity daného Hu-Asp polypeptidu v prítomnosti testovanej látky a v neprítomnosti testovanej látky; a

b) porovnanie aktivity uvedeného Hu-Asp polypeptidu stanovenej v prítomnosti testovanej látky s aktivitou daného Hu-Asp polypeptidu stanovenej v neprítomnosti testované látky;

vyššia aktivita v prítomnosti testovanej látky v porovnaní s aktivitou v neprítomnosti testovanej látky indikuje, že testovaná látka zvyšuje aktivitu uvedeného Hu-Asp polypeptidu. Také testy sa môžu uskutočňovať s Hu-Asp polypeptidami v bezbunkovom systéme a s kultivovanými bunkami, ktoré exprimujú Hu-Asp, alebo ich varianty a izoformy.

V ďalšom vyhotovení sa vynález týka spôsobov pre identifikáciu látok, ktoré znižujú aktivitu Hu-Asp polypeptidu zvoleného zo skupiny obsahujúcej Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a HuAsp2(b), spôsob zahŕňa:

a) stanovenie aktivity daného Hu-Asp polypeptidu v prítomnosti testovanej látky a v neprítomnosti testovanej látky; a

b) porovnanie aktivity uvedeného Hu-Asp polypeptidu stanovenej v prítomnosti testovanej látky s aktivitou daného Hu-Asp polypeptidu stanovenej v neprítomnosti testovanej látky;

nižšia aktivita v prítomnosti testovanej látky v porovnaní s aktivitou v neprítomnosti testovanej látky indikuje, že testovaná látka znižuje aktivitu uvedeného Hu-Asp polypeptidu. Také testy sa môžu uskutočniť s Hu-Asp polypeptidmi v bezbunkovom systéme a s kultivovanými bunkami, ktoré exprimujú Hu-Asp, alebo ich variantmi a izoformami.

V ďalšom vyhotovení sa vynález týka nových bunkových línií (HEK125.3 buniek) na stanovenie spracovania amyloidného β-peptidu (Αβ) zamyloidného proteínového prekurzora (APP). Tieto bunky sú stabilnými transformantmi ľudských embryonálnych ľadvinových buniek 293 (HEK293) s bicistronickým vektorom odvodným od pIRES-EGFP (Clontoh) obsahujúceho modifikovanú ľudskú APP cDNA, väzné miesto pre ríbozóm a cDNA zosileného zeleného ···· ·· fluorescenčného proteínu v druhom cistróne. APP cDNA sa modifikovala pridaním dvoch kodónov pre lyzín na karboxy koniec sekvencie kódujúcej APP. Táto úprava zvýši spracovanie (Processing) na Αβ peptid asi 2 až 4 krát. Táto hladina spracovania Αβ peptidu je 60 krát vyššia než môžeme pozorovať pre netransformované HEK293 bunky. HEK 125.3 bunky budú vhodné pre posúdenie zlúčenín, ktoré inhibujú spracovanie Αβ peptidu. Tento vynález rovnako zahŕňa pridanie dvoch lyzínových zvyškov na C-koniec ďalších izoforiem APP vrátane 751 a 770 aminokyselinových izoforiem, k izoformám APP majúcim mutácie nájdené v_ ľudskej AD vrátane Švédskej KM-»NL a V717-»F mutácie, na C koniec APP obsahujúci β-sekretázové štiepné miesto, ktoré je funkčne pripojené k N-terminálnemu signálnemu peptidu pre inzerciu do membrány a sekréciu a reportérovu sekvenciu obsahujúcu napríklad okrem iného zelený fluorescenčný proteín alebo alkalickú fosfatázu, takže Štiepenie v β-sekretázovom štiepnom mieste uvoľňuje reportérový proteín z povrchu bunky exprímujúcej polypeptid.

Týmto sme všeobecne opísali vynález.

Pre lepšiu zrozumiteľnosť uvádzame nasledujúce príklady vyhotovenia vynálezu, ich účelom je vynález ilustrovať a nielen vymedzovať jeho rozsah.

-28···· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · ··· ··· · * ·· 9 · ·· ·· ·· ·· ·· ·

Stručný popis obrázkov

Obr. l:Obr. 1 ukazuje nukleotidovú (SEQ č. 1) a predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ č. 2) ľudského Aspl.

Obr. 2: Obr. 2 ukazuje nukleotidovú (SEQ č. 3) a predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ č. 4) ľudského Asp2(a).

Obr. 3: Obr. 3 ukazuje nukleotidovú (SEQ č. 5) a predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ č. 6) ľudského Asp2(b). Predpovedaná transmembránová doména Hu-Asp2(b) je uzatvorená v zátvorkách.

Obr. 4: Obr. 4 ukazuje nukleotidovú (SEQ č. 7) a predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ č. 8) myšacieho Asp2(a).

Obr. 5: Obr. 5 ukazuje najlepšie priloženie a porovnanie predpovedanej aminokyselinovej sekvencie Hu-Asp2(a) a myšacieho Asp2(a).

Obr. 6: Obr. 6 ukazuje nukleotidovú (SEQ č. 21) a predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ č. 22) T7-Human-pre-Asp-2(a)ATM.

Obr. 7: Obr. 7 ukazuje nukleotidovú (SEQ č. 23) a predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ č. 24) T7-caspase-Human-pre-Asp-2(a)ATM.

Obr. 8: Obr. 8 ukazuje nukleotidovú (SEQ č. 25) a predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ č. 26) Human-pre-Asp-2(a)ATM (nízke GC).

Obr. 9: Western blot ukazujúci zníženie CTF99 produkcie HEK125.3 bunkami transfekovanými pozitívne oligoméry proti Hu-Asp2 mRNA.

Obr. 10: Western blot ukazujúce zvýšenie CTF99 produkcie v myšacích Neuro-2a bunkách kotransfekovaných s APP-KK a s a bez Hu-Asp2 iba v tých bunkách kotransfekovaných s HuAsp2. Ďalšie zvýšenie produkcie CTF99 je zrejmé v bunkách kotransfekovaných s APP-Sw-KK s a bez Hu-Asp2 iba v tých bunkách kotransfekovaných Hu-Asp2.

Obr. 11: Obr. 11 ukazuje predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ č. 30) Human-Asp2(a)ATM.

Obr. 12: Obr. 12 ukazuje predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ č. 30) Human-Asp2(a)ATM(His)₆.

-29···· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ··· ··· ···· ·· ···· ···· ·· · ·· ·· ·· ·· ·· ···

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Vývoj skúmaného algoritmu vhodného pre identifikáciu aspartylproteázy a identifikáciu C. elegans aspartylproteázových génov v Wormpepl2:

Materiál a metódy

Klasické aspartylproteázy, napríklad pepsín a renin majú dvojdoménovú štruktúru, ktorá je zbalená tak, že sa dva aspartylové zvyšky dostávajú do blízkosti v aktívnom centre. Sú vložené v krátkom trípeptidovom motíve DTG, alebo menej často DSG. DTG alebo DSG motívy aktívneho miesta sa nachádzajú na zvyškoch 25-30 tohto enzýmu, a asi 65-70 proenzýmu (prorenín, pepsínogén). Znova sa tento motív objavuje ďalej medzi zvyškami 150-200. Proenzým sa aktivuje odštiepením N-terminálnej prodomény..Toto usporiadanie v dvojdoménovej štruktúre svedčí o tom, že dnešné aspartylproteázy vznikli génovou duplikáciou a divergenciou. Teda:

NH₂---------X---------D²⁵TG---------Y---------D^y+2STG-------------C, kde X znamená začiatok enzýmu, nasledujúci po N-koncovej prodoméne a Y znamená centrum molekuly, kde začína repetícia génu.

V prípade retrovírusových enzýmov ako je HIV proteáza, ide iba o polovinu dvojdoménovej štruktúry dobre známych enzýmov, ako je pepsín, katepsín D, renin, atď. Nemajú žiadny prosegment, sú vyštiepené z polypeptidového prekurzora obsahujúceho gag a pol proteíny vírusu. Môžu sa znázorniť:

NH₂---------D^TG---------Cioo

Tento „monomér“ má iba asi 100 aminokyselín, je teda extrémne úsporný v porovnaní s inými „dimémymi“ aspartylproteázami, ktoré majú tak asi 330 aminokyselín, nepočítajúc N-terminálnu prodoménu.

t

Limitovaná dĺžka aktívneho miesta eukaryotických aspartylproteáz sťažuje vyhľadávanie týchto sekvencií. EST sekvencie typicky zahŕňajú 250 nukleotidov, v tomto prípade je nepravdepodobné preklenúť obidve aspartylproteázové aktívne miesta. Preto sme sa zamerali na génom C.elegans. Genóm C.elegans obsahuje asi 13000 génov. Asi 12000 z nich bolo sekvencovaných a boli v nich vyznačené hypotetické otvorené čítajúce rámce (ORF) a uložené v databáze Wormpepl2. Táto databáza sa použila ako základ na vyhľadávanie nových eukaryotických aspartylproteáz, pomocou algoritmu, ktorý sa vyvinul špeciálne na tento účel. Na vyhľadávanie proteínov obsahujúcich dva DTG alebo DSG motívy sa použil nasledujúci AWK ···« ·· • · • ·

-30·· · • · · · · • · · ·· ·· • · · • · ·· ·· ·· ·· skríptum, ktorý sa štyri krát opakoval, aby sa odhalili všetky párové kombinácie aspartylového motívu.

BEGIN {RS= „>“} /*definuje, >„ ako separátor záznamov pre FASTA formát/ {

pos = index($0, „DTG“) /*nájde „DTG“ v zázname ♦/ if (pos>0) { rest = substr($0,pos+3) /*načíta zvyšok záznamu za prvým DTG*/ pos2 = index(rest, „DTG“) /*nájde druhý DTG záznam/ if (pos2>0) printf(„%s%s\n“ “>,„$0)} /* zaznamená zásah/ }

}

Vyššie uvedený AWK skript sa. použil na prehľadanie Wormpepl2, ktorý sa stiahol z ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/wormpep, a nájdenie sekvencii obsahujúcich aspoň dva DTG alebo DSG motívy. Použitie AWK obmedzilo každý záznam na 3000 znakov alebo menej. Z tohto dôvodu sa 35 väčších záznamov eliminovalo ručne, hoci bolo nepravdepodobné, že by kódovali aspartylproteázy.

Výsledky a diskusie

Databáza Wormpepl2 obsahuje 12178 vstupov, hoci niektoré z nich (<10%) predstavuje alternatívne zostrihy transkriptov rovnakého génu. Ak sa berie do úvahy počet génov kódovaných genómom C. elegans, ktorý je v asi 13000, pokrýva Wormpepl2 viac než 90 % genómov C. elegans.

Eukaryotické aspartylproteázy majú dvojdoménovú štruktúru, pravdepodobne vzniknutú duplikáciou pôvodného génu. Každá z domén obsahuje motív aktívneho miesta D(S/T)G umiestený medzi zvyškami 20-25 každej z domén. Retrovírusové (napríklad HIV proteáza) alebo retrotranspozómové proteázy sú homodiméry podjednotiek, ktoré sú homológne s jednou eukaryotickou doménou aspartylproteázy. Na prehľadanie databázy Wormpepl2 sa použil AWK skript na nájdenie proteínov, ktoré obsahujú aspoň dva D(S/T)G motívy. Takto sa identifikovalo viac než 60 proteínov s dvoma DTG alebo DSG motívmi. Tieto proteíny sa vizuálne posúdili a určilo sa, či nenaznačujú, že by mohli mať dvojdoménovú štruktúru opísanú vyššie.

Ďalej sa na prehľadanie Wormpepl2 použil profil eukaryotického a vírusového aktívneho miesta aspartylproteázy PS00141 z databázy PROSÍTE. (Bairoch A., Bucher P., Hofmann K., ·· ·· ·· • · • ·

-31 ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· • · · • · • · · • · · ·· ·· • · • · • · • ·

The PROSÍTE: stav v roku 1997, Nucleic Acid Res. 24:217-221(1997)). Takto sa získali prekrývajúce sa sady sekvencií z Wormpepl2. Z týchto sekvencií 7 obsahovalo dva DTG, alebo DSG motívy a PROSÍTE profil aktívneho miesta aspartylproteázy. Z týchto sedem tri sa našli na rovnakom cosmidovom klone (F21F8.3, F21F8.4, a F21F8.7) čo naznačuje, že ide o rodinu proteínov, ktoré vznikli duplikáciou pôvodného génu. Ďalšie dva ORF s vysokou homológiou k F21F8.3, F21F8.4 a F21F8.7 boli prítomné v rovnakom génovom zhluku F21F8.2 a F21F8.6), ale obsahovali iba jeden DTG motív. Dôkladné hľadanie týchto sekvenciL programom BLAST v databáze Wormpepl2 nenašlo žiadneho ďalšieho kandidáta aspartylproteázy v genóme C. elegans obsahujúceho dve opakovania DTG alebo DSG motívov.

Porovnávanie každej s C.elegans sekvenciou BLASTX so sekvenciami v SWISS-PROT, GenPeP a TREMBL databázami ukázalo, že najbližší červový homológ so známou cicavčou aspartylproteázou je R12H7.2 a že ak vzdialenejší príbuzný je T18H9.2 zatiaľ čo CEAZP1, F21F8.3, F21F8.4 a F21F8.7 tvorí subkluster s najmenšou homológiou s cicavčími sekvenciami. Diskusia:

APP, presenilín, a p35, aktivátor cdk5, prechádzajú obidva intracelulámym proteolytickým spracovaním v miestach, ktoré zodpovedajú substrátovej špecificite HIV proteázy. Deregulácia bunkovej aspartylproteázy s rovnakou substrátovou špecificitou môže teda poskytnúť zjednocujúci mechanizmus príčiny vzniku plakových a spleťových patológií v AD. Preto sa snažíme identifikovať nové ľudské aspartylproteázy. Snímanie celého genómu C.elegans poskytlo identifikáciu sedem otvorených čítacích rámcov, ktoré vyhovujú profilu aspartylproteázy, ako bol identifikovaný. Týchto sedem aspartylproteáz pravdepodobne zahŕňa kompletnú sadu týchto proteáz v jednoduchom mnohobunkovom eukaryotickom organizme. Táto sada zahŕňa štyri blízke príbuzné aspartylproteázy špecifické pre C.elegans, ktoré pravdepodobne vznikli duplikáciou pôvodného génu. Ďalší traja kandidáti aspartylproteáz (T18H9.2, R12H7.2 a Cl 1D2.2) vykazujú homológiu s cicavčími génovými sekvenciami.

Príklad 2

Identifikácia nových ľudských aspartylproteáz pomocou prehľadávania databázy prepojením genómov

Materiál a metódy

Počítačová analýza EST databáz, cDNA a predpovedanej polypeptidovej sekvencie:

···· ·· • · · • · ·

-32e· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · ·· ·· ·· ···

Pátranie v EST databáze po homológii s CESZP1, F21F8.3, F21F8.4 a F21F8.7 sekvenciami neprinieslo výsledok v nájdení nejakého nového cicavčieho homológu. TBLASTN prehľadávania pomocou sekvencie R12H7.2 našlo homológiu s katepsínom D, katepsínom E, pepsinogénom A, pepsinogénom C a renínom, zvlášť v okolí DTG motívu vnútri aktívneho miesta, ale rovnako schybila v identifikácii nejakej novej cicavčej aspartylproteázy. To naznačuje, že genóm C.elegcms pravdepodobne obsahuje iba jednu lyzozomálnu aspartylproteázu, ktorá sa u cicavcov ·· reprezentuje génovou rodinou, ktorá vznikla duplikáciou a následnou modifikáciou pôvodného génu.

TBLASTN prehľadávania pomocou ďalšej C.elelgans sekvencie T18H9.2 identifikovalo niekoľko EST, ktoré ukázali na úsek kódujúci novú ľudskú aspartylproteázu (Hu-Aspl). Ako sme už uviedli vyššie v príklade 1, BLASTX prehľadávania pomocou Hu-Aspl úseku v SWISSPROT preukázalo, že motív aktívneho miesta v tejto sekvencii je homologický s aktívnymi miestami ďalších aspartylproteáz. Opakované BLASTN prehľadávania LifeSeq, LifeSeqFL a verejných EST kolekcií identifikovalo 102 sekvenciu z cDNA knihovni, ktoré sa zostavili do jedného súboru. 51 Sekvenciou v tomto súbore nájdených vo verejných EST kolekcií sa rovnako zostavilo do jedného súboru (THC213329) Inštitútom pre výskum genómu (TIGR). TIGR anotácie indikuje, že v databáze sa nenašla žiadna dostatočná zhoda s týmto súborom. Poznamenávame, že TIGR súbor je reverzným komplementom LifeSeq kontige, ktorý sa zostavil. BLASTN hľadania HuASPl v krysích a myšacích EST sekvenciách in ZooSeq našlo jeden homologický EST v každej databáze (Incyte kloň 700311523 a IMAGE kloň 313341, GenBank č. W1O53O respektíve).

TBLASTN hľadanie zostavené DNA sekvenciou pre Hu-Aspl v LifeSeqFL a verejných EST databázach identifikovalo ďalšiu príbuznou ľudskú sekvenciu (Hu-Asp2) reprezentovanú jedným EST (2696295). Translácia tejto cDNA sekvencie ukázala jeden DTG motív, ktorý bol homologický s motívom aktívneho miesta hovädzej aspartylproteázy, NM1.

BLAST prehľadávania, zostavenie súborov a mnohopočetné porovnávanie sekvenciou sa vykonalo pomocou bioinformatických nástrojov poskytovaných LifeSeq, LifeSeqFL a LifeSeq zostavenej databázy od Incyte. Predpovedané motívy proteínov sa identifikovali buď pomocou ProSite (motívy v GCG 9), alebo databázou Pfam.

Klonovanie celej dĺžky Hu-Aspl do cDNA

Otvorený čítací rámec C.elegcms génu T18H9.2CE sa použil na prehľadávanie LifeSeq a LifeSeq-FL databáz a tak sa detekoval úsek označený ako 1863920CE1. cDNA na samom ···· ·· ·· ·· t* ··· · · · ··· • · · ···· ··

-i·» ·········· “ JJ · ·· ·· ·· ·· ·· g

5'konci tohto kontigu, 1863920, získal sa od Incyte a kompletne sekvencioval na obidvoch reťazcoch. Translácia otvoreného čítacieho rámca obsiahnutého vnútri klonu 1863920 ukázala prítomnosť duplikovanej aspartylproteázy s motívom aktívneho miesta (DTG/DSG), ale 5' koniec bol neúplný. Zvyšok Hu-Asp 1 sekvencie sa stanovil 5'Marathon Rače analýzou pomocou ľudského placentámeho Marathon predpripraveného cDNA templátu (Clonetech). 3'-pozitívne oligonukleotidový prímér špecifický pre 5'koniec klonu 1863920 sa použil spolu s 5' negatívne prímérom špecifickým pre Marathon predpripravený cDNA syntetický- adaptér pri PCR. Špecifické PCR produkty sa priamo sekvencovali cyklickým sekvencovanim a výsledná sekvencia sa zostavila zo sekvencie klonu 1863920 za získania kompletnej sekvencie kódujúcej Hu-Asp 1 (SEQIDč.l).

Primárna aminokyselinová sekvencia Hu-Asp 1 obsahuje niekoľko zaujímavých rysov (obr.

1, SEQ č. 2). Sekvencia obsahuje signálny peptid (zvyšky 1-20 v SEQ ID č.2), a pro-segment a katalytickú doménu obsahujúcu dve kópie motívu aktívneho miesta aspartylproteázy (DTG/DSG). Priestor medzi prvým a druhým motívom aktívneho miesta je asi 200 zvyškov, čo by malo zodpovedať očakávanej veľkosti jednej domény eukaryotickej aspartylproteázy. Zaujímavejšie je, že sekvencia obsahuje predpovedanú transmembránovú doménu (zvyšky 469492 v SEQ č. 2) blízko svojho C-konca, čo naznačuje, že proteáza je zakotvená v membráne. Tento znak sa nenašiel v žiadnej inej aspartylproteáze.

Klonovanie plnej dĺžky Hu-Asp-2 cDNA

Ako je popísané vyššie v príklade 1, poskytlo široké preskúmavanie genómu Caenorhabditis elegcms v databáze Wormpepl2 a hľadanie prípadnej aspartylproteázy a následné prehľadávanie ľudskej EST databázy ľudský protiklad C.elegans génu T18H9.2, ktorý sa označil ako Hu-Aspl. Zostavený úsek Hu-Asp 1 sa použil na hľadanie príbuzných sekvencií pomocou nástroja BLAST v ľudských EST databázach a našla sa jedna sekvencia (269625CE1) s približne 60 % identitou v LifeFL databáze. Podobné kľúče v gbl05PubEST alebo ľudských databáz dostupných od TIGR neidentifikovalo podobný EST kloň. cDNA kloň 2696295 identifikovaný jednoduchou sekvenčnou analýzou z ľudskej maternicovej cDNA knihovne, sa získal od Incyte, obidva jeho reťazce sa kompletne sekvencovali. Tento kloň obsahoval neúplný 1266bp otvorený čítací rámec, ktorý kóduje 422 aminokyselinový polypeptid, ale chýba mu iniciačný ATG na 5'konci. Skúmanie predpovedanej sekvencie ukázalo prítomnosť duplikovaných miest aspartylproteázy DTG/DSG oddelených 194 aminokyselinami. Následné vyhľadávanie zmienenej sekvencie poskytlo v LifeSeq EST databáze ďalšie EST sekvencie z cDNA knihovne ľudských ···· ·· • · • ·

-34·· ·· ·· • ···· ··· • · · ·· · · astrocytov (4386993), kde sa našli ďalšie 5 sekvencie príbuzné klonu 2696295. Kloň 4386993 sa získal od Incyte a oba jeho reťazce sa kompletne sekvencovali. Porovnanie klonu 4386993 a klonu 2696295 potvrdilo, že kloň 4386993 presahuje otvorený čítací rámec 31 aminokyselinami vrátane dvoch in-frame translačných iniciačných kodónov. Cez prítomnosť dvoch in-frame ATG sa nenašiel žiadny in-frame stop kodón uprostred od ATG, čo by indikovalo, že 4386993 nemá plnú dĺžku. Ďalej porovnanie sekvenciou klonov 2696295 a 4386993 ukázalo inzerciu 25 aminokyselinových zvyškov v 2696295. Zostávajúca Hu-Asp2 kódujúca sekvencia sa určila 5' Marathon RAČE analýzou pomocou ľudského hypokampového Marathon predpripraveného cDNA templátu (Clontech). 3' Pozitívne oligonukleotidový primér špecifický pre spoločný 5 úsek klonov 2696295 a 4386993 sa použil spolu s 5'negatívnym primérom špecifickým pre Marathon predpripravený cDNA syntetický adaptér pre PCR. Špecifické PCR produkty sa priamo sekvencovali cyklickým sekvencovaním a výsledná sekvencia sa zostavila so sekvenciami klonov 2696295 a 4386993 za získania kompletnej kódujúcej sekvencie Hu-Asp2(a) (obr. 2 a SEQ č.3) a Hu-Asp2(b) (obr. 3, SEQ č. 6). Obidve sekvencie obsahujú signálny peptid (zvyšky 1-21 v SEQ č. 4 a SEQ a SEQ č. 6), pro-segment a katalytickú doménu obsahujúcu dve kópie motívu aktívneho miesta katalytickej domény aspartylproteázy (DTG/DSG). Prvý a druhý motív aktívneho miesta je oddelený úsekom rôzne dlhým pre 25 aminokyselinovú deléciu v Hu-Asp2(b), ktorý obsahuje 168, alebo 194 aminokyselinových zvyškov pre Hu-Asp2(b) respektíve HuAsp2(a). Zaujímavejšie je, že obidve sekvencie obsahujú predpovedanú transmembránovú doménu (zvyšky 455-477 v SEQ č. 4 a 430-452 v SEQ č. 6) blízko svojho C-konca, čo naznačuje, že proteáza je zakotvená v membráne. Tento znak sa nenašiel v žiadnej inej aspartylproteáze okrem Hu-Aspl.

Príklad 3

Molekulárne klonovanie myšacej ASP2 cDNA a genómovej DNA

Klonovanie a charakterizácia myšacej ASP2 cDNA

Myšací ortológ Hu-Asp2 sa klonoval pomocou kombinácie snímania (screeningu) cDNA knihovne, PCR a genómového klonovania. Prehľadalo sa približne 500 000 nezávislých klonov z cDNA knihovne myšacieho mozgu pomocou ³²P značenej sekvenčnej sondy pripravenej z HuAsp2. Pozitívne klony sa podrobili sekvenčnej analýze a najdlhší cDNA obsahoval kompletný 3' neprekladaný región a 47 aminokyselín z kódujúcej oblasti. PCR amplifikácia rovnakej myšacej mozgovej cDNA knihovne s pozitívnym oligonukleotidovým primérom špecifickým pre 5'

-35·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · • · ·· ··· · • · · · · · ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· najťažšiu oblasť cDNA sekvenciou stanovenou vyššie a negatívny primér špecifický pre 5' región ľudskej Asp2 sekvencie nasledovanej DNA sekvenčnou analýzou poskytla ďalších 980 pb kódujúcich sekvencií. Zostávajúca 5'sekvencia myšacej Asp2 sa odvodila z genómickej sekvencie (pozri nižšie).

Izolácia a sekvenčná analýza myšacieho Asp2 génu

Myšacia EST sekvencia kódujúca časť myšacej Asp2 cDNA sa identifikovala v GenBank

EST databáze pomocou prehľadávacieho nástroja BLAST s Hu-Asp2 kódujúcou sekvenciou ako kľúčom. Kloň g3160898 vykazoval 88 % homológiu s ľudskou sekvenciou v rozsahu 352 pb.

Potom sa syntetizoval pár oligonukleotidových primérov špecifických pre tento región myšacej Asp2 a použil sa na amplifikáciu regiónov myšacieho génu. Myšacia genómová DNA odvodená od kmeňa 129/SvJ sa amplifikovala v PCR (25 cyklov) pomocou rôznych sad primérov špecifických pre myšacie Asp2 a produkty sa analyzovali elektroforézou na agarózovom géli. Set primérov Zoo-1 a Zoo—4 amplifikoval 750 bp fragment obsahujúci približne 600 bp sekvencií intronu zisteného na základe porovnania so známou cDNA sekvenciou. Táto sada primérov sa potom použila na prehľadanie myšacej BAC knihovne pomocou PCR, izoloval sa jediný genómický kloň a zistilo sa, pomocou DNA sekvenčnej analýzy, že obsahuje myšací Asp2 gén. DNA sekvencovanie tohto Asp2 genómického klonu a porovnanie s cDNA sekvenciami obidvoch Hu-Asp2 a častí myšacej cDNA sekvenciou poskytlo plnú dĺžku sekvencie myšacej Asp2 (SEQ č. 7). Predpovedaná aminokyselinová sekvencia myšacej Asp2 (SEQ č. 8) vykazuje 96,4 % identitu (GCG BestFit algoritmus) s 15/501 aminokyselinovými substitúciami v porovnaní s ľudskou sekvenciou (obr. 4).

Príklad 4

Distribúcia expresie Hu-Asp2 transkriptov v tkanivách

Materiál a metódy

Distribúcia expresie Hu-Asp2 transkriptov v tkanivách sa stanovila pomocou mnohonásobných Nothem blotov získaných od Clonetech (Palo Alto, CA). Kloň Incyte 2696295 vo vektore pINCY sa štiepil EcoRI/NotI a 1.8 kb cDNA inzert sa purifikoval pomocou preparatívnej elektroforézy v agarózovom géli. Tento fragment sa rádioaktívne označil na špecifickú aktivitu > 1 x 10⁹ dpm/pg náhodným predĺžením v prítomnosti [a³²P-dATP] (>3000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) a Klenowova fragmentu DNA polymerázy I.

···· ·· • · · · • · · · • · · · · • · · · · ·· ·· · • ·

-36Nylonové filtre obsahujúce denaturovanú, podľa veľkosti rozdelenej pohni A*RNA izolované z rôznych ľudských tkanív sa hybridizovali s 2 x 10⁶ dpm/ml sondou v ExpressHyb pufre (ClonTech, Palo Alto, CA) po 1 hodinu pri 68 °C a premyli podľa odporúčania výrobcu. Hybridizačné signály sa vizualizovali autorádiografiou pomocou BioMax XR filmu (Kodak, Rochester, NY) pri -80 °C.

Výsledky a diskusie

Získali sa iba obmedzené informácie o distribúcii expresie Hu-Asp2 transkriptov v tkanivách z dôvodov relatívne malého počtu EST detekovaných pomocou metód popísaných vyššie (<5). V snahe získať ďalšie informácie o expresii Hu-Asp2 génu sa použila Nothem analýza na stanovenie veľkosti a zastúpenie Hu-Asp2 transkriptov. PolyA*RNA sa izolovali zo série periférnych tkanív a oblastí mozgu a potom sa po separácii za denaturačných podmienok na pevnom nosiči vizualizovali Hu-Asp2 transkripty pomocou hybridizácie z rádioaktívne značeným inzertom klonu 2696259 za prísnych podmienok. 2696295 cDNA sonda ukázala transkripty pohybujúce sa zdanlivými veľkosťami 3,0 kb, 4,4 kb a 8,0 kb, kde posledné dva transkripty boli najvýraznejšie.

V skúmaných tkanivách boli Hu-Asp2 transkripty najhojnejšie v pankrease a mozgu s nižšími, ale detekovateľnými hladinami vo všetkých ďalších tkanivách okrem týmusu a PBL tkanív. Po zistení relatívnej hojnosti Hu-Asp2 transkriptov v mozgu sa stanovila tiež expresia v jednotlivých oblastiach mozgu. Podobná konštalácia veľkostí transkriptov sa detekovala vo všetkých skúmaných oblastiach mozgu (cerebellum, mozgová kôra, okcipitálny pól, čelný lalok, spánkový lalok a putamen) s najvyššou prítomnosťou v dreni a predĺženej mieche.

Príklad 5

Detekcia Hu-Asp 1 a Hu-Asp2 transkriptov pomocou Nothem blotu u ľudí

Bunková línia

Rôzne ľudské bunkové línie sa testovali na schopnosť produkcie Hu-Asp 1 a Hu-Asp2 mRNA. Z ATCC sa získali ľudské embryonálne ľadvinové bunky (HEK-293), bunky africkej zelenej opice (Cos-7), ovariálne bunky čínskeho škrečka (CHO), Hela bunky a línie neuroblastomových buniek IMR-32. Bunky sa kultivovali v DME obsahujúcom 10 % FCS, okrem CHO buniek, ktoré sa udržiavali v a-MEM/10 % FCS pri 37 °C v 5 % CO₂ pokiaľ takmer nezrástli. Premyté monovrstvy buniek (3 x 10⁷) sa zlizovali na miskách a polyA*RNA sa ···· ·· • · • ·

-37·· • · ·

99 • · 9 9 • 9 · ·· ·· extrahovala pomocou Qiagén Oligotes Direct mRNA kitu. Vzorky obsahujúce 2 pg poly A⁺RNA z každej bunkovej línie sa frakcionovali za denaturačných podmienok (glyoxal), preniesli sa na pevný podklad z nylonovej membrány pomocou kapilárnych síl a transkripty sa vizualizovali hybridizáciou so značenou (³²P) kódujúcou sekvenčnou sondou odvodenou buď z Hu-Asp 1, alebo Hu-Asp2. Rádioaktívne signály sa detekovali pomocou rôntgenového filmu a analýzy obrazu v Phosphorlmagere.

Hu-Aspl cDNA sonda vizualizovala podobnú zostavu transkriptov “(2,6 kb a 3,5 kb), ktoré sa skôr detekovali v ľudských tkanivách. Relatívne zastúpenie stanovené kvantifikáciou rádioaktívneho signálu bolo Cos-7>HEK 292 = HELA > IMR32.

Hu-Asp2 cDNA sonda tiež zobrazila podobnú zostavu transkriptov v porovnám s tkanivami (3,0 kb, 4,4 kb a 8,0 kb) s nasledujúcim relatívnym zastúpením HEK 293 > Cos 7 > IMR 32 > HELA.

Príklad 6

Modifikácia APP vedúca k zvýšeniu Αβ spracovania peo in vitro screening

Ľudské bunkové línie, ktoré vyštiepajú Αβ peptid z APP poskytujú nástroj na stanovenie a vyhľadávanie inhibítorov β- a γ- sekretáz. Produkcia a uvoľnenie Αβ peptidu do supematantu kultúry sa monitoruje enzýmovým imuno stanovením (EIA). Hoci sa expresia APP objavuje v širokom spektre buniek a spracovanie a uvoľňovanie Αβ peptidu sa uskutočňuje jak v neurálnych, tak aj v bunkových líniách, ktoré neuronálnymi nie sú, sú endogénne hladiny APP spracovania nízke a je ťažké ich detekovať pomocou EIA. Αβ spracovanie sa môže zvýšiť exprimovaním APP v mutantných bunkových líniách, čo zvyšuje Αβ spracovanie. Zistili sme, že pridanie dvoch lyzinových zvyškov na karboxykoniec APP695 zvýši Αβ spracovanie. Umožnilo nám to vytvoriť transformovanú bunkovú líniu, ktorá uvoľňuje Αβ peptid do kultivačného média v pozoruhodnom množstve 20 000 pg/ml.

Materiál a metódy

Materiál

Ľudské embryonálne ľadvinové bunky línie 293 (HEK293 bunky) sa získali z interných zdrojov. Vektor pIRES-EGFP sa zabezpečil od ClonTech. Oligonukleotidy pre mutáciu pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) sa zabezpečili od Genosys. Plazmid obsahujúci ľudský

APP695 (SEQ č. 9 [nukleotidy] a SEQ č. 10 [aminokyseliny]) sa získal od Northwestern ·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· • · ·· ···· ·· • · · • · · · · ·

- 38 - · · · · ·· ··

Univerzity Medical School. Klonoval sa do pSK (Stratagéne) do Notl miesta za vzniku plazmidu pAPP695.

Postup mutagenézy

Švédska mutácia (K670N, M671L) sa vložila do pAPP695 pomocou Stratagene Quick Change Mutagénesis Kit za vzniku plazmidu pAPP695NL (SEQ č. 11 [nukleotidy] a SEQ č. 12 [aminokyseliny]). Na vloženie di-lyzínového motívu na C-koniec APP695 sa použil pôvodný primér č.276 5' GACTGACCACTCGACCAGGTTC (SEQ č. 47) spolu s „opravovacím“ primérom č.274 5' CGAATTAAATTCCAGCACACTGGCTACTTCTTGTTCTGCATCTCAAAGAAC (SEQ č. 48) a hraničným primérom č. 275 CGAATTAAATTCCAGCACTGGCTA (SEQ č. 49), čím došlo k modifikácii 3' konca APP695 cDNA (SEQ č. 15 [nukleotidy] a SEQ č. 16 [aminokyseliny]). Tak sa zároveň pridalo BstXl reštrikčné miesto, ktoré bude kompaktibilné s BstXl miestom v mnohonásobnom klonovacom mieste pIRES-EGFP. PCR amplifikácia sa uskutočnila pomocou ClonTech HF Advantage cDNA PCR súpravy pomocou polymerázového mixu a pufrov dodaných výrobcom. Pre „opravovací“ PCR sa opravovací primér použil v koncentrácii 1/20 molámej koncentrácie ohraničujúcich prímerov. PCR amplifikačné produkty sa purifikovali pomocou QIAquick PCR purifikačnej súpravy (Qiagén). Po štiepení reštrikčnými enzýmami sa produkty separovali v 0,8 % agarózovom géli a potom sa vyštiepili DNA fragmenty purifikované pomocou QIAquick gél extrakčnej súpravy (Qiagén).

Pre znovu zostavenie modifikovanej APP695-SW cDNA sa získal Notl-Bgl2 fragment APP695-Sw cDNA a pomocou PCR 3'Bgl2-BstXl APP695 cDNA fragment a tieto sa spájali do pIRES-EGFP plazmidovej DNA otvorenej v Notl a BsXl miestach. Spojenia sa vykonávali 5 minút pri izbovej teplote pomocou sady Rapid DNA Ligation (Boehringer Mannheim) a transformovali do Library Efficiency DH5a kompetentných buniek (GibcoBRL-Life Technologies). Bakteriálne kolónie sa testovali na prítomnosť inzertu pomocou PCR amplifikácie s primérmi č.276 a č.275. Plazmidová DNA sa purifikovala na trasfekciu cicavčích buniek pomocou sady QIAprep Spin Miniprep (Qiagén). Získaná konštrukcia sa označila pMG125.3 (APPSW-KK, SEQ č. 17 [nukleotidová] a SEQ č. 18 [aminokyselinová]).

Transfekcie cicavčích buniek

HEK293 bunky pre transfekciu sa napestovali do 80 % zrastú v Dulbecco modifikovanom Eagle médiu (DMEM) s 10 % fetálnym hovädzím sérom. Kotransfekcie sa vykonali pomocou LipofectAmine (Gibco-BRL) s 3 gg pMG125.3 DNA a 9 gg pcDNA3.1 DNA na 10 x 10⁶ ···· ·· · • · · · • · · · • · · · · • · · · · ·· ·· ·

-39·· ·· • · · · · · • ·· · · • · · · · · • · · · · buniek. Tri dni po transfekcii sa bunky preniesli do média obsahujúceho G418 v koncentrácii 400 pg/ml. Po troch dňoch rastu v selektívnom médiu sa bunky rozdelili podľa ich fluorescencie.

Klonálna selekcia 125.3 buniek pomocou FACS

Vzorky buniek sa analyzovali na EPICS Elite ESP prietokovom cytometri (Coulter,

Hialeah, FL) vybaveným vzduchom chladeným argónovým laserom s 488 nm excitačnou líniou. EGFP emisia sa merala za 525 nm filtrom a intenzita fluorescencie sa zobrazovala na cez 4 rady idúcej logaritmickej stupnice po oddelení živých buniek stanovených priamym a pravouhlým rozptylom. Jednotlivé zelené bunky sa rozdelili do každej z 96 jamôk doštičky obsahujúce rastové médium s G418. Po štyroch dňoch sa G418 pridalo do média na konečnú koncentráciu 400 pg/ml. Po selekcii obsahovalo 32 % jamôk expandujúce klony. Jamky s klonmi sa z 96 jamkovej doštičky preniesli na 24 jamkovú doštičku a potom najrýchlejšie rastúce kolónie na 6 jamkovú doštičku. Konečná vybraná bunková línia bola tá najiýchlejšia rastúca z 6 klonov. Tento kloň označený 125.3 sa udržiaval v G418 o koncentrácii 400 pg/ml a každé 4 dni prenášal do čerstvého média. Nepozorovala sa žiadna strata Αβ produkcie podľa EGFP fluorescencie behom 23 prepasážovania.

Αβ EIA analýza (sendvičová ELISA s dvojitou protilátkou pre ΙιΑβ 1-40/42)

Supematanty odobraté 48 hodín po transfekcii sa analyzovali v štandardnej Αβ EIA, ako je popísané ďalej. Ľudský Αβ 1-40, alebo 1-42 sa stanovil pomocou monoklonálnej protilátky (mAb) 6E10 (Senetek, St. Louis, MO) a biotinované králičím antisérom 162, alebo 164 (New York State inštitúte for Basic Research, Staten Island, NY) v ELISA s dvojitou protilátkou. Väzná protilátka 6E10 je špecifická k epitopov prítomným na N-koncových aminokyselinách 1-16 ΙιΑβ. Konjugované detekčné protilátky 162 a 164 sú špecifické pre ΙιΑβ 1-40 respektíve 1-42. V stručnosti, Nunc Maxisorp 96 jamková imunodoštička sa pokryla ΙΟΟμΙ/jamku mAb 6E10 (5 pg/ml) zriedenou v 0,1 M uhličitanovom pufri, pH 9,6 a inkubovala sa pri 4 °C cez noc. Po premytí doštičky 3 podiely 0,01 M DPBS (Modifikovaný Dubelcco PBS (0,008 M fosforečnan sodný, 0,002 M fosforečnan draselný, 0,14 M chlorid sodný, 0,01 M chlorid draselný, pH 7,4) od Pierce, Rockford, II) obsahujúceho 0,05 % Tween-20 (DPBST), sa miska blokovala 60 min. 200 μΐ 10 % normálneho ovčieho séra (Sigma) v 0,01 DPBS, aby sa vylúčila nešpecifická väzba. Ľudský Αβ 1-40, alebo 1-42 ako štandardy ΙΟΟμΙ/jamka (Bachem, Torrance, CA) zriedené zo zásobného roztoku v DMSO v kultivačnom médiu sa pridali po premytí doštičky, rovnako ako 100 μΙ/jamku vzorku, napríklad upravené médium transfekovaných buniek. Doštička sa ·· • · • ·

-40···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· ·· • · · • · ·· • · · • · · · ·· ·· ·· inkubovala 2 hodiny pri izbovej teplote a pri 4 °C cez noc. Ďalší deň, po premytí doštičky, sa pridalo 100 μΙ/jamku biotinylovaného králičieho antiséra zriedeného 162 1:400, alebo 164 1:50 v DPBST + 0,5 % BSA a inkubovalo sa pri izbovej teplote 1 hodinu 15 minút. Nasledovalo premytie 100 μΙ/jamku neutravidín-chrenová peroxidáza (Pierce, Rockford, Π) zriedený 1:10000 v DPBST s inkubáciou 1 hodinu pri izbovej teplote. Po poslednom premytí sa pridal ako substrát 100 μΙ/jamku o-fenyléndiaminu dihydrochloridu (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), v 50 mM kyseline citrónovej a 100 mM sodnom fosfátovom pufri (Sigma Chemicals,-St. Louis, MO), pH 5,0 mM vytvorené sfarbenie sa monitorovalo pri 450 nm na kinetickej čítačke mikrodoštičiek 20 minút pomocou Soft max Pro Software. Všetky Štandardy a vzorky sa vykonali trikrát vedľa seba. Vzorky, ktorých absorbancia spadala do rozsahu kalibračnej krivky, sa vyhodnotili pomocou Soft max Pro Software a vyjadrili pg/ml v kultivačnom médiu.

Výsledky

Pridanie dvoch lyzínov na karboxy-koniec APP695 veľmi zvýšilo Αβ spracovanie v HEK293 bunkách (tabuľka 1). Pridanie di-lyzínového motívu do APP695 zvyšuje Αβ spracovanie na hladinu pozorovanú pri APP695 obsahujúcim švédsku mutáciu. Kombinácia dilyzínového motívu so švédskou mutáciou ďalej zvyšuje spracovanie asi 2,8 krát.

Kotransformácia HEK293 buniek pomocou pMG125.3 a pcDNA3.1 umožnila dvojitú selekciu transformovaných buniek na rezistencii k G418 a vysokú hladinu expresie EGFP. Po selekcii klonov pomocou FACS produkovala získaná bunková línia pozoruhodných 20 000 pg Αβ peptidú na ml kultivačného média po 36 hodinovom raste na 24 jamkových doštičkách. Produkcia Αβ peptidú za rôznych podmienok je zhrnutá v tabuľke 2.

Tabuľka 1

Uvoľnenie Αβ peptidú do kultivačného média 48 hodín po prechodnej transfekcii HEK293 buniek pomocou uvedeného vektoru obsahujúceho divoký, alebo modifikovaný APP. Hodnoty sú priemety + SD a P-hodnoty pre párové porovnanie pomocou Študentova t-testu, kde sa berie do úvahy nezhodná variabilita.

·· ·· • · • · • · ·

-41 ···· • · • · • · ·· ·· ·· ·· • · · • · ·· • · · • · · · ·· ·· ··

APP konštrukt	Αβ 1-40 peptid (pg/ml)	Násobok zvýšenia	P-hodnota
pIRES-EGFP vektor	147+28	1,0
wt APP695 (142.3)	194+15	1,3	0,051
wt APP695-KK (124.1)	424+34	2,8	3 x 10-5
APP695-Sw (143.3)	457+65	3,1	2 x 10-3
APP695-SwKK (125.3)	1308+98	8,9	3x10-4

Tabuľka 2

Uvoľnenie Αβ peptidu z HEK125.3 buniek za rôznych rastových podmienok.

Typ kultivačné doštičky	Objem média	Trvanie kultivácie	Ab 1-40 (pg/ml)	Ab 1-42 (pg/ml)
24 jamková	400 μΐ	36 hodín	28,036	1,439

Príklad 7

Pozitívny oligomér inhibície Abeta spracovanie v HEK125.3 bunkách

Sekvencie Hu-Asp 1 a Hu-Asp2 sa poskytli Sequitur, Inc (Natick, MA) na selekciu cielených sekvencii a design druhej generácie chimérických pozitívnych oligomérov pomocou chránenej technológie (Sequitur Ver.D Pat pending č.3002). Pozitívne oligoméry Lotč. S644, S645, S646 a S647 cielili proti Aspl. Pozitívne oligoméry Lotč. S648, S649, S650 a S651 cielili proti Asp2. Kontrolné pozitívne oligoméry Lotč. S652, S653, S654 a S655 cielili proti irelevantnému génu a pozitívne oligoméry Lotč. S648, S649, S650 a S651 cielili proti druhému irelevantnému génu.

Pre transfekciu s pozitívnymi oligomérmi sa HEK125.3 bunky napestovali asi do 50 % zrastú na 6 jamkových doštičkách v minimálnom esenciálnom médiu (MEM) obohatenom 10 % fetálnym teľacím sérom. Zásobný roztok oligofektínu G (Sequitur Inc., Natick, MA) o koncentrácii 2 mg/ml sa zriedil na 50 μg/ml v MEM bez séra. Oddelene sa nariedilo 100 μΜ zásobný roztok pozitívnych oligomérov, a to na 800 nM v Opti-MEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY). Zriedené zásobné roztoky oligofektínu G a pozitívneho oligoméru sa potom zmiešali v pomere 1:1 ainkubovali sa za izbovej teploty. Po 15 minútach inkubácie sa činidlá zriedili 10 ·· • 42···· ·· ·· • · · · · · e • · · · · ·· • · · · · ·· · • · · · · · t · ·· ·· ·· «· ·· krát v MEM obsahujúceho 10 % fetálneho teľacieho séra a 2 ml tohto roztoku sa pridalo do každej jamky 6 jamkovej doštičky, odkiaľ sa predtým odstránilo staré médium. Po transfekcii sa bunky kultivovali za stálej prítomnosti oligofektínu G/pozitívneho oligoméru. Pre sledovanie uvoľňovania Ab peptidu sa z upraveného média periodicky odoberali podiely 400 μΐ a nahradzovali čerstvým médiom, to všetko začínajúc 24 hodinami po transfekcii. Uvádzané dáta pochádzajú zo supematantov kultúr odobratých 48 hodín po transfekcii.

·*

Výsledky

Šestnásť rôznych oligomérov získaných z Sequirur Inc sa transfekovalo oddelene do HEK125.3, aby sá mohol stanoviť ich účinok na Αβ spracovanie peptidov. Iba pozitívne oligoméry cielené proti Aspl a Asp2 znižovali Abeta spracovanie v HEK125.3 bunkách, pričom tie, ktoré sú zamerané proti Asp2, majú väčší inhibičný účinok. Ako Αβ ¢1-40) a Αβ ¢1-42) sa inhibovali s rovnakou intenzitou. V tabuľke 3 sú vypočítané percenta inhibície v porovnaní s netransfekovanými bunkami. Pozitívne oligoméme reagenty vykazujúce väčšiu než 50 % inhibíciu sú označené hviezdičkou. Z testovaných reagentov, 3 zo 4 pozitívnych oligomérov cielených proti ASP1 vykazovalo priemerne 52 % inhibíciu Αβ 1-40 spracovanie a 47 % inhibíciu Αβ 1-42 spracovanie. Pre ASP2, 4 zo 4 pozitívnych oligomérov cielených proti ASP1 vykazovalo väčšiu než 50 % inhibíciu s priemernou inhibíciou 62 % pre Αβ 1-40 spracovanie a 60 % inhibíciu pre Αβ 1-42 spracovanie.

Tabuľka 3

Inhibícia uvoľňovania Αβ peptidu z HEK125.3 buniek, na ktoré sa pôsobí pozitívnymi oligomérmi.

Cieľový gén	pozitívny oligomér	Abeta (1-40)	Abeta (1-42)
Aspl-1	S644	62%*	56%
Asp 1-2	S645	41%*	38%
Asp 1-3	S646	52%*	46%
Aspl-4	S647	6%	25%
Asp2-1	S648	71%*	67%
Asp2-2	S649	83%*	76%
Asp2-3	S650	46%*	50%
Asp2-4	S651	47%*	46%

• · · • · · • · · · • · · · ·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · «· ··

-43····

Conl-1	S652	13%	18%
Conl-2	S653	35%	30%
Conl-3	S655	9%	18%
Conl-4	S674	29%	18%
Con2-1	S656	12%	18%
Con2-2	S657	16%	19%
Con2-3	S658	8%	35%
Con2-4	S659	3%	18%

Príklad 8

Demonštrácia Hu-Asp2 β-sekretázovej aktivity v kultivovaných bunkách

Ukázalo sa, že niekoľko mutácií APP asociovaných s časným nástupom Alzheimerovej choroby ovplyvňuje Αβ spracovanie. Ten sa týka N- a C- terminálnych štiepných miest, ktoré uvoľňujú Αβ APP. Tieto štiepne miesta sa označujú ako β sekretázové, respektíve γ sekretázové. Štiepenie APP v β sekretázovom štiepnom mieste vedie k vytvoreniu C-koncového fragmentu APP obsahujúceho 99 aminokyselín s molekulovou hmotnosťou 11 145 daltonov. Tzv. Švédska KM-»NL mutácia ihneď uprostred β sekretázového štiepneho miesta spôsobuje významné zvýšenie tvorby ako 1-40, tak aj 1-42 aminokyselinovej formy Αβ peptidu. Tzv. Londýnska VF mutácia (V717-»F v izoforme APP770) má malý vplyv na celkovú tvorbu Αβ peptidu, ale zvyšuje percentuálne zastúpenie ďalšieho 1-42 aminokyselinovej formy Αβ peptidu ovplyvnením výberu γsekretázového štiepného miesta použitého behom APP spracovania. Stanovilo sa, či tieto mutácie ovplyvňujú množstvo a typ produkovaného Αβ peptidu produkovaného kultivovanými bunkami kotransfekovanými konštrukciami riadiacimi expresiu Hu-Asp2.

Vykonali sa experimenty, ktoré demonštrovali Hu-Asp2 β-sekretázovú aktivitu kultivovaných buniek. V prvom experimente sa ukázalo, že pôsobením pozitívnych oligomérov proti Hu-Asp2 transkryptom na HEK125.3 bunky, ako je to popísané v príklade 7, dochádza k poklesu množstva C-terminálneho fragmentu APP tvoreného β-sekretázovom štiepením (CTF99) (Obr. 9). To ukazuje, že Hu-Asp2 pôsobí priamo alebo nepriamo na uskutočnenie β sekretázového štiepenia. V druhom experimente sa ukázalo, že zvýšená expresia Hu-Asp2 v transfekovaných myšacích Neuro2A bunkách zvyšuje akumuláciu CTF99 β-sekretázového ···· ·· • · ·· ·· ·· • ···· · · · • · · ·· · · štiepneho fragmentu (Obr. 10). Toto zvýšenie je najlepšie zrejmé, ak sa pre transfekciu použije mutantný APP-KK kloň obsahujúci C-terminálny di-lyzínový motív. Ďalšie zvýšenie je pozorované, ak sa Hu-Asp2 kotransfekuje s APP-Sw-KK obsahujúcim Švédsku mutáciu KM-NL. Švédska mutácia zvyšuje štiepenie APP β-sekretázu.

Druhá sada experimentov ukázala, že Hu-Asp2 sprostredkuje γ sekretázovú aktivitu v experimentoch s kotransfekovanými embryonálnymi ľadvinovými HEK293 bunkami. Kotransfekcia Hu-Asp2 s APP-KK klonom výrazne zvyšuje produkciu a uvoľňovanie rozpustných Αβ1-40 a Αβί—42 peptidov z HEK293 buniek. Je tu zrejmé proporcionálne väčšie zvýšenie uvoľňovania Αβί-42. Ďalšie zvýšenie produkcie Αβί-42 sa pozoruje, ak sa Hu-Asp 1 kotransfekuje s APP-VF (SEQ ID č. 13 [nukleotidová] a SEQ ID č. 14 [aminokyselinová]) alebo s APP-VF-KK (SEQ ID č. 19 [nukleotidová] a SEQ ID č. 20 [aminokyselinová]) klonom nesúcim Londýnsku mutáciu V717-»F. Je známe, že V717-»F mutácia ovplyvňuje špecifické γ sekretázové štiepenie APP, takže je zvýšené štiepenie na Αβ42 štiepnom mieste. Asp2 teda pôsobí priamo alebo nepriamo na uľahčenie γ-sekretázového spracovania APP na β42 štiepnom mieste.

Materiál

Protilátky 6E10 a 4G8 sa získali od Senetek (St. Louis, MO). Protilátka 369 sa získala z laboratória Paula Greengarda na Rockefellerovej Univerzite. Protilátka C8 sa získala z laboratória Dennise Selkoe na Harvard Medical School a Brigham a Ženskej nemocnici.

Použité APP konštrukty

APP konštrukty použité pre transfekčné experimenty zahŕňali:

APP divoký typ APP695 (SEQ ID č. 9 a č. 10)

APP-Sw

APP-VF

APP-KK

APP-Sw-KK

APP-VF-KK

APP695 obsahujúci Švédsku KM—>NL mutáciu (SEQ ID č. 11 a č. 12), APP695 obsahujúci Londýnsku V->F mutáciu (SEQ ID č. 13 a č. 14), APP695 obsahujúci C-terminálny KK motív (SEQ ID č. 15 a č. 16), APP695-Sw obsahujúci C-terminálny KK motív (SEQ ID č. 17 a č. 18), APP695-VF obsahujúci C-terminálny KK motív (SEQ ID č. 19 a č. 20),

Tieto konštrukty sa vložili do vektora pIRES-EGFP (Clontech, Palo Alto C A) medzi Notl a BstXl miesta pomocou vhodnej sekvencie spojovníka vloženej pomocou PCR

-45···· ·· ·· ·· ·· · ··· · · · · ···· ··· ···· ·· · ·· ··· · · · · · · · ···· ···· · · · ·· ·· ·· ·· ·· ···

Transfekcie pozitívnych oligomérových alebo plazmidových DNA konštruktov v HEK293 bunkách, HEK125.3 bunkách a Neuro-2A bunkách.

Ľudské embryonálne ľadvinové HEK293 bunky a myšacie Neuro-2a bunky sa transfekovali expresnými konštruktmi pomocou Lipofectamine Plus reagentu od Gibco/BRL. Bunky sa vysiali na 24 jamkovú doštičku pre tkanivové kultúry na hustotu 70 až 80 % zrastú. Štyri jamky na doštičku sa transfekovali 2 μβ DNA (3:1, APPľkotransfektant), 8 μΐ Plus reagentu a 4 μΐ Lipofektaminu v OptiMEM. OptiMEM sa pridalo na konečný objem 1 ml, rozdelilo do jamôk, 200 μΐ na jamku, a inkubovalo 3 hodiny. Kládol sa dôraz na dodržanie konštantného pomeru dvoch plázmidov použitých pre kotransfekciu a celkového množstva DNA použitej pre kotransfekciu. Transfekčné médium sa nahradilo DMEM, 10 % FBS, Na-pyruvátom s antibiotikami/antimykotikami a bunky sa inkubovali za normálnych podmienok (37 °C, 5% CO₂) po 48 hodín. Upravené médium sa prenieslo do polypropylénových skúmaviek a uchovávalo pri 80 °C až do stanovenia obsahu Αβ1-40 a Αβ1-42 pomocou EIA, ako je popísané v predchádzajúcich príkladoch. Transfekcia pozitívnych oligomérov do HEK125.3 buniek sa vykonala, ako je popísané v príklade 7.

Príprava bunkových extraktov, Western blot protokol

Bunky sa odobrali asi 60 hodín po transfekcii plazmidovou DNA. Najprv sa bunky preniesli z doštičiek do 15-ml kónických skúmaviek a centrifugovali pri 1 500 otáčkach za minútu po dobu 5 minút, aby sa odstránilo médium. Palety buniek sa raz premyli PBS. Potom sme lyžovali bunky lyžujúcim pufrom (10 mM HEPES, pH 7,9, 150 mM NaCl, 10 % glycerol, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0,1 mM vanadičnan sodný a 1 % NP-40). Zmesi lyzovaných buniek sa centrifugovali pri 5000 otáčkach za minútu a supernatant sa skladoval pri -20 °C ako bunkové extrakty. Rovnaké množstvá extraktov HEK125.3 buniek transfekovaných s Asp2 pozitívnymi oligomérmi a kontrolami sa precipitovali protilátkou 369, ktorá rozoznáva C-koniec APP a potom sa CTF99 detekoval v imunoprecipitáte pomocou protilátky 6E10. Experiment sa opakoval pomocou C8, druhej precipitačnej protilátky, ktorá tiež rozoznáva C-koniec APP. Na získanie Western blotu extraktov z myšacích Neuro-2a buniek kotransfekovaných s Hu-Asp2 a APP—KK, APP-Sw-KK, APP-VF-KK, alebo APP-VF sa rovnaké množstvo bunkových extraktov elektroforézuje v 4-10 %, alebo 10-20 % Trícine gradientovom géie (NOVEX, San Diego, CA). Plná dĺžka APP a CTF99 β-sekretázových produktov sa detekovala pomocou protilátky 6E10.

-46···· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ··· ··· ···· ·· ···· ···· ·· ·* ·· ·· · ·· ·

Výsledky

Transfekcia HEK125.3 buniek s Asp2-1 alebo Asp2-2 pozitívnymi oligomérmi redukovala produkciu CTF β-sekretázového produktu v porovnaní s bunkami podobne transfekovanými kontrolnými oligomérmi majúcimi reverznú sekvenciu (Asp2-1 reverzná a Asp2-2 reverzná). V experimente s kotransfekciou Hu-Asp2 do myšacích Neuro-2a buniek APP-KK konštruktom zvyšoval tvorbu CTF99. Tá sa ďalej zvýšila, ak sa Hu-Asp2 koexprimoval s APP-Sw-KK mutantnou formou APP nesúcou Švédsku mutáciu KM->NL, ktorá zvyšuje β-sekretázové spracovanie.

Kotransfekcia Hu-Asp2 s APP mala menší účinok na produkciu Αβ40, ale zvýšila produkciu Αβ42 nad úroveň pozadia (tabuľka 4). Prídavok di-lyzínového motívu na C-koniec APP zvyšuje Αβ peptidové spracovanie asi dvakrát, hoc produkcia Αβ40 a Αβ42 zostáva pomerne nízka (352 pg/ml respektíve 21 pg/ml). Kotransfekcia Asp2 s APP-KK ďalej zvyšuje produkciu Αβ40 i Αβ42. Stimulácie Αβ40 produkcie prítomnosti HuAsp2 je viac než trojnásobnej, zatiaľ čo produkcia Αβ42 je zvýšená viac než desaťkrát. Kotransfekcia Hu-Asp2 a APP-KK konštruktov teda prednostne zvyšuje produkciu Αβ42.

APP V717->F mutácia spôsobuje zvýšenie γ sekretázového spracovania v Αβ42 štiepnom mieste. Kotransfekcia Hu-Asp2 s APP-VF, alebo APP-VF-KK konštrukty zvyšuje Αβ42 produkciu (dvojnásobné zvýšenie s APP-VF a štvornásobné zvýšenie s APP-VF-KK, tabuľka 4), ale malo zmesový účinok na produkciu Αβ40 (mierne zníženie s APP-VF a dvojnásobné zvýšenie s APPVFKK v porovnaní s pcDNA kotransfekčnou kontrolou). Účinok Asp2 na Αβ42 produkciu bol teda proporcionálne väčší a viedol ku zvýšeniu pomeru Αβ42 ku celkovému Αβ. Pomer Αβ42 ku celkovému Αβ tak dosiahol veľmi vysokú hodnotu 42 % v HEK293 bunkách kotransfekovaných s Hu-Asp2 a APP-VF-KK.

Western blot ukazujúci zníženie produkcie CTF99 HEK125.3 bunkami transfekovanými pozitívnymi oligomérmi cielenými proti Hu-Asp2 mRNA. (vpravo) Western blot ukazujúci zvýšenie produkcie CTF99 v myšiach Neuro-2a bunkách kotransfekovaných s Hu-Asp2 a APPKK. Ďalšie zvýšenie produkcie CTF99 sa pozoruje v bunkách kotransfekovaných sHu-Asp2 a APP-Sw-KK.

···· ·· • · · • · · • · · · ·· ·· ·· • · · · • · ··

-47·· ·· • · · • · • · · · ·· ·· • · ·· ·

Tabuľka 4

Výsledky kotransfekcie Hu-Asp2, alebo pcDNA plazmidových DNA s rôznymi APP konštruktmi obsahujúcimi V717-+F mutáciu, ktorá modifikuje γ-sekretázové spracovanie. Kotransfekcia Asp2 zvyšuje pomer Αβ42 ku celkovému Αβ. Tabelované hodnoty sú množstvá Αβ peptidu pg/ml.

		pcDNA kotransfekcia		Asp2 kotransfekcia
	Αβ40	Αβ42	Αβ42/οβΗωνγ	Αβ40	Αβ42	A342/celkový
APP	192+18	<4	<2%	188+40	8±10	3,9%
APP-VF	118±15	15+19	11,5%	85+7	24±12	22,4%
APP-KK	352+24	5,5±216	5,5%	1062±101	226±49	17,5%
APP-VF-KK	230±31	88±24	27,7%	491±35	355±36	42%

Príklad 9

Bakteriálna expresia ľudskej Asp2L

Expresia rekombinantného Hu-Asp2L v E.coli

Hu-Asp2L sa môže exprimovať v E.coli po prídavku N-terminálnej sekvencie ako je T7 tag (SEQ ID č. 21 a č. 22) alebo T7 tágu nasledovaného vedúcou sekvenciou kaspasy 8 (SEQ ID č. 23 a č. 24). Alternatívne sa môže na zvýšenie výťažku Hu-Asp2 použiť cielená mutagenéza 5 konca na zníženie obsahu GC (SEQ ID č. 27 a č. 26). Navyše sa môže upraviť proteolytické štiepné miesto Asp2 (SEQ ID č. 27 a č. 28). Na získanie rozpustného proteínu po expresii a refoldingu je výhodná delécia transmembránovej domény a cytoplazmatického úseku, alebo delécia úseku za membránou, transmembránovej domény a cytoplazmatického úseku.

Metódy

Použili sa PCR priméry obsahujúce vhodné sekvencie spojovníkov, aby sa mohli zostaviť fúzie Asp2 kódujúcich sekvencií s N-koncovými modifikáciami vrátane T7 tágu (SEQ ID č. 21 a 22), alebo T7-kaspasia vedúca sekvencie (SEQ ID č. 23 a 24). Tieto konštrukty sa klonovali do ···· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · ··· ··· ···· ··

-48···· ···· ·· · ·· ·· ·· ·· ·· ··· expresného vektora pet23a(+)[Novagen], kde T7 promótor riadi expresia T7 tágu predchádzajúcu sekvencii mnohonásobného klonovacieho miesta. Na klonovanie Hu-Asp za T7 vedúcej sekvencie pet23a sa na amplifikáciu zvolili Hu-Asp2 sekvencie a použili nasledujúce oligonukleotidy:

č.553=GTGGATCCACCCAGCACGGCAATCCGGCTG (SEQ ID č. 35),

č.554=GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG (SEQ ID č. 36), ktoré vytvárajú v 5' respektíve 3' voľných koncoch BamHI respektíve Hindm presahy. Asp2 sekvencia sa amplifikovala z plnej dĺžky Asp2(b) cDNA klonované do pcDNA3.1 pomocou Advanced-GC cDNA PCR (Clontech) podľa inštrukcií výrobcu so spevnením a predlžovaním pri 68 °C v dvoj krokovom PCR cylde v 25 cykloch. Inzert a vektor sa štiepili BamHI a HindlII, purifikovali elektroforézou v agarózovom géle a potom sa spojili pomocou sady Rapid DNA Ligation (Boerhinger Mannheim). Spájacia reakčná zmes sa použila na transformáciu kmeňa E.coli JM109 (Promega) a získali sa kolónie na purifikáciu plazmidú (Qiagen, Qiaprep minispin) a DNA sekvenčnú analýzu. Pre indukovateľnú expresiu pomocou indukcie s izopropyl-P-Dtiogalaktopyranozidom (IPTG), sa expresný vektor transfekoval do kmeňa E.coli BL21 (Statagene). Bakteriálne kultúry sa pestovali v LB médiu v prítomnosti ampicilínu (100 gg/ml) a indukovali v log fáze rastu pri OD600 0,6-1,0 pomocou 1 mM IPTG 4 hodiny pri 37 °C. Peleta buniek sa získala centrifugáciou.

Na klonovanie Hu-Asp2 sekvencie za T7 tag a kaspasovej vedúcej sekvencie (SEQ ID č. 23 a 24) sa vyššie uvedený konštrukt obsahujúci T7-Hu-Asp2 sekvencie (SEQ ID č. 21 a 22) otvoril v BamHI mieste, potom sa podrobil teplotnej hybridizácii a spojil do vektorovej DNA kaspasie 8 vedúcej sekvencie oligonukleotidy

Č559=GATCGATGACTATATCTGACTCTCCGCGTGAACAG-GACG (SEQ ID č. 37), č.560=GATCCGTCCTGTTCACGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC (SEQ ID č. 38). 5' presah každej sady oligonukleotidov sa navrhol tak, aby umožňoval spojenie do BamHI miesta, ale nie následné štiepenie BamHI. Reakčná zmes po ligácii sa použila na transformáciu do JM109, rovnako ako je uvedené vyššie na analýzu expresie proteínu po transfere do E.coli BL21.

Na zníženie obsahu GC v 5' koncu asp2 sa páry antiparalelných oligonukleotidov navrhli tak, aby sa zmenili na báze degenerovaných kodónov na 15 aminokyselinových pozíciách z G/C na A/T (SEQ ID č. 25 a 26). Nové nukleotidové sekvencie na 5'koncu asp2 nezmenili kódované nukleotidy a zmenili sa na optimalizáciu expresie v E.coli.

···· • •	• · • · • ·	·· • · • ·	·· • · ··	·· • · • ·	• ·· • •
··	• ·	»·	··	··	···

Sekvencia negatívneho spojovníka je:

CGGCATCCGGCTGCCCCTGCGTAGCGGTCTGGGTGGTGCTCCACTGGGTCTGCGTC TGCCCCGGGAGACCGACGAA3' (SEQ ID č. 39).

Sekvencia pozitívneho spojovníka je:

5'CTTCGTCGGTCTCCCGGGGCAGACGCAGACCCAGTGGAGCACCACCCAGACCGCTA CGCAGGGGCAGCCGGATGCCG3' (SEQ ID č. 40).

Po vzájomnej teplotnej hybridizácii fosforylovaných spojovníkov v 0,1 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4 sa tieto ligovali do unikátneho Cla I a Srna I miesta Hu-Asp2 vo vektore pTAC. Pre indukovateľnú expresiu pomocou indukcie s izopropyl-P-D-tiogalaktopyranozidom (IPTG) sa bakteriálne kultúry pestovali v LB médiu v prítomnosti ampicilínu (100 pg/ml) a indukovali v log fáze rastu pri OD600 0,6-1,0 pomocou 1 mM IPTG 4 hodiny pri 37 °C. Pelet buniek sa získal centrifugáciou.

Pre vytvorenie vektora, kde vedúca sekvencia sa môže odstrániť obmedzenou proteolýzou pomocou kaspasy 8, takže je uvoľnený Hu-Asp2 polypeptid začínajúci N-terminálnou sekvenciou GSFV (SEQ ID č. 27 a 28), sa sledoval nasledujúci postup. Dva fosforylované oligonukleotidy obsahujúce kaspasy 8 štiepne miesto IETD,

č.571=5'GATCGATGACTATGTCTGACTCTCCGCTGGACTCTGGTATCGAAACCGACG (SEQ ID č. 41) a

Č.572=GATCCGTCGGTTTCGATACCAGAGTCCAGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC (SEQ ID č. 42) sa podrobili teplotnej hybridizácii a ligovali do pET23a+, ktorý sa otvoril BamHI. Po transformácii do JM109 sa získala purifikovaná vektorová DNA, orientácia inzertu sa potvrdila DNA sekvenčnou analýzou a pre amplifikáciu zvolenej Hu-Asp2 sekvencie sa použili nasledujúce oligonukleotidy:

č.573=5'AAGGATCCTTTGTGGAGATGGTGGACAACCTG (SEQ ID č. 43)

č.554=GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG (SEQ ID č. 44), ktoré umiestnili BamHI respektíve HindlII miesta na voľné 5' respektíve 3' konce inzertu. Asp2 sekvencia sa ampliíikovala z plnej dĺžky Asp2 cDNA klonovanej do pcDNA3.1 pomocou Advanced-GC cDNA PCR (Clontech) podľa inštrukcií výrobcu s aneláciou a predlžovaním pri 68 °C v dvoj krokovom PCR cykle v 25 cykloch. Inzert a vektor sa štiepili BamHI a HindlII, purifikovali elektroforézou v agarózovom géle a potom sa ligovali pomocou sady Rapid DNA Ligation (Boerhinger Mannheim). Spojená reakčná zmes sa použila na transformáciu kmeňa E. coli JM109 (Promega) a získali sa kolónie pre purifikáciu piazmidu (Qiagen, Qiaprep minispin)

···· • •	··	··	·· • · ··	·· • •	• •	··
• •	• •	• •	• •
• ·	•	•	•	•	• ·	•	•
··		··		«·	··	··		• t

a DNA sekvenčnú analýzu. Pre indukovateľnú expresiu pomocou indukcie s izopropyl-P-Dtiogalaktopyranozidom (IPTG), sa expresný vektor transfékoval do kmeňa E.coli BL21 (Statagene). Bakteriálne kultúry sa pestovali v LB médiu v prítomnosti ampicilínu (100 pg/ml) a indukovali v log fáze rastu pri OD600 0,6-1,0 pomocou 1 mM IPTG 4 hodiny pri 37 °C. Peleta buniek sa získala centrífugáciou.

Na uľahčenie purifikácie sa vložil do všetkých vyššie zmienených konštruktov 6-His tag, a to za T7 vedúcej sekvencie otvorením konštruktu v BamHI mieste a ligáciou fosforylovaných oligonukleotidov podrobených teplotnej hybridizácii, obsahujúcej 6 histidínovú sekvenciu č.565=GATCGCATCATCACCATCATTACG (SEQ ID č. 45),

č.566=GATCCATGGTGATGGTGATGATGATGC (SEQ ID č. 46). 5' Presah každej sady oligonukleotidov sa navrhol tak, aby umožňoval ligáciu do BamHI miesta, ale nie následné štiepenie s BamHI.

Príprava pelety buniek

Pelety bakteriálnych buniek (36,34 g) reprezentujúce 10,8 litrov kultúry sa suspendovali do objemu 200 ml pomocou 20 mm tkanivového homogenizátora pri 3000 až 5000 otáčkach za minútu v 2 M KC1, 0,1 M Trisu, 0,05 M EDTA, 1 mM DTT. Vodivosť sa nastavila na asi 193 mMhos pomocou vody.

Po dispergácii pelety sa pridalo ďalšie množstvo roztoku KC1, a to na celkový objem 500 ml. Táto suspenzia sa ďalej homogenizovala asi 3 minúty pri 5000 otáčkach za minútu pomocou rovnakého zariadenia. Zmes sa potom pretlačila cez Rannie vysokotlakový homogenizátor pri tlaku 69 MPa.

Vo všetkých prípadoch sa ďalej použila peleta, zatiaľ čo supernatant sa vylial. Vzniknutý roztok sa centrífugoval v GSA rotore 1 hodinu pri 12 500 otáčkach za minútu. Peleta sa resuspendovala v rovnakom roztoku (bez DTT) pomocou rovnakého tkanivového homogenizátora pri 2000 otáčkach za minútu. Po homogenizácii 5 minút pri 3000 otáčkach za minútu sa objem upravil na 5000 ml rovnakým roztokom a ten sa stočil 1 hodinu pri 12 500 otáčkach za minútu. Peleta sa potom resuspendovala ako prv, ale tento krát sa celkový objem upravil na 1,5 1 rovnakým roztokom pred 5 minútovou homogenizáciou. Po centrifugácii rovnakou rýchlosťou po 30 minút sa táto procedúra zopakovala. Peleta sa potom resuspendovala v asi 150 ml studenej vody, spojili sa pelety zo šiestich centrifugačných skúmaviek pre GSA rotor. Peleta sa homogenizovala 5 minút pri 3000 otáčkach za minútu, objem sa upravil na 250 ml studenou vodou a stočil v priebehu 30 minút. Hmotnosť výslednej pelety bola 17,75 g.

····	··	··	··	··
•	• ·	• ·	•	•	•	•	··
•	•	•	•	•	··	•	•
• ·	•	•	•	•	•	i	•	•
··	··	··	··	··		··

Lýzia pelety baktérií v roztoku KC1 nasledovaná centrífugáciou v GSA rotore sa najprv použila na prípravu pelety. Rovnaký roztok sa potom trikrát použil na resuspendáciu a homogenizáciu. Konečné premytie vodou/homogenizácia sa vykonalo na odstránenie nadbytku KClaEDTA.

Solubilizácia rHuAsp2L

Na solubilizáciu HuAsp2L z pelety sa použil pomer 9-10ml/g peletu. Roztavilo sa 17,75 g pelety a pridalo 150 ml 8 M guanidínu HCl, 5 mM βΜΕ, 0,1% DEA. Na úpravu pH na 8,6 sa použil 3 M Tris. Peleta sa najprv resuspendovala v roztoku guanidínu pomocou 20 mm tkanivového homogenizátora pri 1000 .otáčkach za minútu. Zmes sa potom miešala pri 4 °C 1 hodinu a scentrífugovala 1 hodinu pri 12 500 otáčkach za minútu v GSA rotore. Výsledný supernatant sa potom centrífugoval 30 minút pri 40 000 g v SS-34 rotore. Výsledný supernatant sa potom skladoval pri -20 °C, okrem 50 ml podielu.

Afinitná chromatografia s imobilizovaným niklom solubilizovaného rHuAsp2L

Použili sa nasledujúce roztoky:

A) 6 M guanidín HCl, 0,1 M NaP, pH 8,0,0,01 M Tris, 5 mM βΜΕ, 0,5 mM imidazol

A ) 6 M močovina, 20 mM NaP, pH 6,80, 50 mM NaCI

B ) 6 M močovina, 20 mM NaP, pH 6,20, 50 mM NaCI, 12 mM imidazol

C') 6 M močovina, 20 mM NaP, pH 6,80, 50 mM NaCI, 300 mM imidazol.

Poznámka: Pufry A' a C' sa miešali vo vhodnom pomere na dosiahnutie príslušnej koncentrácie imidazolu.

ml solubilizovaného materiálu sa spojilo s 50 ml pufru A a nanieslo na 100 až 125 ml Qiagen Ni-NTA SuperFlow (preekvilibrovanou pufrom A) v 5x10 cm Biorad econo kolóne. Takto sa kolóna jemne trepala cez noc pri 4 °C.

Kroky pri chromatografii

1) Odtečenie zvyšku z kolóny.

2) Premytie 50 ml pufru A (spojilo s pretieknutou trakciou)

3) Premytie 250 ml pufru A (premytie 1)

-52···· ·· φφ ·· φφ ··· φ φ φ φ ··· φ φ · φ φ φφ · φ

Φ·ΦΦ φ··· ·· φ φφ φφ φφ φφ φφ ·ΦΦ

4) Premytie 250 ml pufru A (premytie 2)

5) Premytie 250 ml pufru A'

6) Premytie 250 ml pufru B'

7) Premytie 250 ml pufru A'

8) Elúcia 250ml 75mM imidazolu

9) Elúcia 250ml 150mM imidazolu (150-1)

10) Elúcia 250ml 150mM imidazolu (150-2)

11) Elúcia 250ml 300mM imidazolu (300-1)

12) Elúcia 250ml 300mM imidazolu (300-2)

13) Elúcia 250ml 300mM imidazolu ¢300-3)

Výsledky chromatografie rHuAsp sa eluovalo pri 75 mM imidazole až 300mM imidazole. Frakcia (75 mM) rovnako ako prvá 150mM imidazolová (150-1) frakcia obsahovala kontaminujúce proteíny, ako je vidno na géloch farbených Coomassie Blue. Preto sa pre refolding experiment použila frakcia 150-2 a 300-1, pretože obsahovala najväčšie množstvo (pozri Coomassie Blue farbené gély).

Refolding experimenty s rHuAsp2L

Experiment 1

Do 40 ml 150-2 sa pridal IM DTT, 3M Tris, pH 7,4 a DEA na konečné koncentrácie 6 mM, 50 mM, respektíve 0,1 %. Roztok sa náhle (za miešania) zriedil 200 ml 4 °C studeného 20 mM NaP, pH 6,8, 150 mM NaCl. Toto zriedenie ustavilo konečnú koncentráciu močoviny na 1 M. Roztok zostal číry, dokonca aj keď sa ponechal, aby v otvorenej nádobke na RT, alebo pri 4°C.

Po státí na vzduchu po 4-5 hodin pri 4 °C sa roztok dialyzoval cez noc proti 20 mM NaP, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20% glycerol. Táto metóda účinne odstráni močovinu bez precipitácie proteínu.

Experiment 2

Niektoré z 150-2 eluátov sa 2x koncentrovali na Amicon Centríprep, 10 000 MWCO, a potom sa s nimi nakladalo rovnako ako v experimente 1. Tento materiál tiež zostal v roztoku bez viditeľnej precipitácie.

-53···· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · · · · ··· ···· ·· ···· ···· · · · • t ·· ·· ·· ·· ···

Experiment 3

Do 89 ml 150-2 sa pridal IM DTT, 3M Tris, pH 7,4 a DEA na konečné koncentrácie 6 mM, 50 mM, respektíve 0,1%. Roztok sa náhle (za miešania) zriedil 445 ml 4°C studeného 20 mM NaP, pH 6,8, 150 mM NaCl. Roztok zostal čistý bez zjavnej precipitácie. Roztok sa oddelil do RT miešaný 10 minút a potom pridal MEA na konečnú koncentráciu 0,1 mM. Roztok sa pomaly miešal 1 hodinu. Potom sa pridal cystamin a Q1SO4 na konečnú koncentráciu 1 mM respektíve 10 μΜ. Roztok sa pomaly miešal na RT 10 minút a potom umiestnil do chladenej miestnosti (4 °C) a mierne trepal cez noc za prístupu vzduchu.

Nasledujúci deň sa roztok (stále číry a bez precipitácie) centrifúgoval pri 100 000 x g 1 hodinu. Supernatanty z viacej podielov sa spojili a dialyzovali proti 20 mM NaP, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20% glycerol. Po dialýze sa materiál skladoval pri -20 °C.

Malý podiel (asi 10 ml) roztoku proteínu (stále v 1M močovine) sa oddelil na biochemické analýzy a zmrazil pri -20 °C.

Príklad 10

Expresia Hu-Asp2 a jeho derivátov v bunkách hmyzu

Expresia pomocou baculovírusovej infekcie

Kódujúca sekvencia Hu-Asp2 a niekoľko derivátov sa upravilo pre expresiu v bunkách hmyzu pomocou PCR. 5' Negatívny oligonukleotidový primér, ktorý modifikuje miesto iniciácie translácie tak, aby súhlasilo s Kozák konsenzuálnou sekvenciou sa pároval s 3' pozitívnym primérom, ktorý obsahuje prirodzený translačný terminačný kodón v Hu-Asp2 sekvencii. PCR amplifikácia pcDNA3.1 (hygro)/Hu-Asp2 templátu pozri príklad 12. Pomocou PCR sa tiež upravili dva deriváty Hu-Asp2 s deletovanou C terminálnou transmembránovou doménou (SEQ ID č. 29 a č. 30), alebo deletovanou C terminálnou transmembránovou doménou a vložilým hexahistidínovým zakončením na C-koncu. (SEQ ID č. 31 a 32). Pároval sa rovnaký 5 negatívny oligonukleotidový primér ako je opísaný vyššie s buď 3'pozitívnym primérom, ktorý (1) vkladá translačný terminačný kodón po kodóne 453 (SEQ ID č. 3), alebo (2) vkladá hexahistidínový tag za translačný terminačný kodón pomocou PCR. s pcDNA3.1(hygro)/Hu-Asp2L ako templátu. Vo všetkých prípadoch sa PCR vykonávala v 15 cykloch pomocou Pwol DNA polymerázy (Boehringer-Mannheim) podľa inštrukcií výrobcu. Reakčné produkty sa štiepili BamHI a Nôti a ligovali do BamHI a Nôti štiepeného baculovírusového transferového vektora pVL1393

-54···· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ··· ·«· · · ·· ·· ···· · · · · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ··· (Invitrogen). Časť reakčnej zmesi po ligácii sa použila pre transformáciu kompetentných buniek E.coli a potom sa vykonala antibiotická selekcia transformantov na LB-Amp. Plazmidová DNA sa získala štandardnou alkalickou lyziou a zaostrením v CsCl za získania baculovírusového transferového vektora pVL1393/Asp2, pVL1393/Asp2ATM, pVL1393/Asp2ATM(His)6. Vytvorenie rekombinantných baculovirusov a infekcia sfé buniek hmyzu sa vykonala pomocou štandardných metód.

Expresia transfekcií - Prechodná a stabilná expresia pVĽ1393/Asp2ATM a pVL1393/Asp2ATM(His)₆ v High 5 bunkách hmyzu sa uskutočnila pomocou hmyzieho expresného vektora pIZ/V5-His. DNA inzerty z expresného plazmidového vektora pVL1393/Asp2, pVL1393/Asp2ATM, pVL1393/Asp2ATM(His)6 sa vyštiepili pomocou BamHI a Nôti a subklonovali do BamHI a Nôti štiepeného pIZ/V5-His pomocou štandardných metód. Výsledné expresné plazmidy označené pIZ/VL1393/Asp2, pIZ/VL1393/Asp2ATM, pIZ/VL1393/Asp2ATM(His)6, sa pripravili, ako je opísané vyššie.

Pre transfekciu sa High 5 bunky hmyzu kultivovali v High Five free médiu doplnenom o 10 pg/ml gentamycín pri 27 °C v utesnených fľašiach. Transfekcie sa vykonali za použitia High five buniek, High five média bez séra doplnenom o 10 pg/ml gentamycín a InsectinPlus lipozómy (Invitrogen, Carlsbad, CA) pomocou štandardných metód.

Pre prechodnú transfekciu vo veľkom meradle sa 1,2 x 10⁷ High five buniek vysialo na 150 mm misky pre tkanivové kultúry a ponechali 15-30 minút pri izbovej teplote, aby sa pripojili. Behom času pripojovania sa pripravila DNA/lipozomová zmes zmiešaním 6 ml média bez séra, 60 pg AspATM/pIZ(+/-His) DNA a 120 μΐ Insectin Plus a inkubovala pri izbovej teplote 15 minút. Vysievacie médium sa z misiek z bunkami odstránilo a nahradilo DNA/lipozomovou zmesou, a to na 4 hodiny pri izbovej teplote pri konštantnom kývaní 2 otáčky za minútu. Ďalej sa na misky pridalo 6 ml média a inkubovali sa 4 dni pri 27 °C vo vlhkom inkubátore. Štyri dni po transfekcii sa médium získalo prečistenou centrífugáciou 500 x g, stanovila sa expresia Asp2 Western blotingom. Pre stabilnú expresiu sa na bunky pôsobilo 50 pg/ml Zeocinom a bunky, ktoré prežili, sa spojili a použili ako klonálne bunky obmedzeným zriedením a následne analýzou hladiny expresie, ako je uvedené vyššie.

Purifikácia Asp2ATM a Asp2ATM(His)ô

Odstránenie transmembránového segmentu Hu-Asp2 vedie k sekrécii polypeptidu do kultivačného média. Po produkcii proteínu buď baculovírusovou infekciou, alebo transfekciou je kondiciované médium získané, prečistené centrífugáciou a dialyzované proti Tris-HCl (pH 8,0).

···· ·· • · • ·

-55·· ·· • · · a • I ··

Tento materiál sa potom purifíkoval chromatografiou na anexe (Tris-HCI, pH 8,0) a potom katexe (acetátový pufr, pH 4,5) s použitím gradientov NaCl. Elučný profil sa monitoroval (1) Western blotom (2) stanovením aktivity pomocou peptidového substrátu opísaného v príklade 12. V prípade Asp2ÁTM(His)e sa upravené médium dialyzovalo proti Tris pufru (pH 8,0) a purifikovaná chromatografia na náplni IMAC a následne na anexe.

Sekvenčná analýza purifikovaného Hu-Asp2ATM(His)e ukázala, že sa odštiepil signálny peptid [TQHGIRLPLR].

Príklad 11

Expresia Hu-Asp2 v CHO bunkách

Heterológna expresia Hu-Asp2 v CHO-K1 bunkách

Kódujúca sekvencia Hu-Asp2- sa klonovala do cicavčieho expresného vektora pcDNA3.1(+)Hygro (Invitrogen, Carlsbad, C A), ktorý obsahuje CMV okamžitý časný promótor a bGH polyadenilačný signál, aby sa zabezpečila expresia. Expresný plazmid pcDNA3.1(+)Hygro/ Hu-Asp2 sa pripravil alkalickou lyziou a izoláciou v CsCl a kompletná sekvencia obidvoch reťazcov potvrdila integritu kódujúcej sekvencie.

Ovariálne bunky čínskeho škrečka divokého typu (CHO-K1) sa získali z ATCC. Bunky sa udržiavali v mnohovrstvových kultúrach v α-MEM obsahujúcom 10 % FCS pri 37 °C v 5 % CO₂. Dve 100 mm misky CHO-K1 buniek (60 % zrast) sa transfekovali pcDNA3.1(+)Hygro samotnom (kontrola), alebo pcDNA3.1(+)Hygro/ Hu-Asp2 pomocou katiónových lipozómov DOTAP podľa odporúčania výrobcu. K bunkám sa pridali zmesi DNA/lipozómy, inkubovali sa 15 hodín a potom sa médium nahradilo rastovým médiom obsahujúcim 500 jednotiek/ml hygromycínu B. V prípade pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2 transfekovaných buniek sa individuálne hygromycín rezistentné bunky klonovali obmedzeným zriedením. Po expanzii klonov individuálnych bunkových línií sa expresia Hu-Asp2 proteínu potvrdila Western blotom pri použití polyklonálneho králičieho antiséra proti rekombinantnému Hu-Asp2 pripravenému expresiou v E.coli. Misky s bunkami každej línie blízko zrastú sa získali zoškrabnutím do PBS a bunky sa získali centrifugáciou. Pelety buniek sa resuspendovali v chladnom lyžujúcom pufri (25 mM Tris-HC1 (8,0)/5 mM EDTA) obsahujúce inhibítory proteáz a bunky sa lyžovali sonifikáciou. Rozpustná a membránová frakcia sa oddelili centrifugáciou (105 000 x g, 60 min) a normalizované množstvo proteinov z každej frakcie sa separovalo na SDS-PAGE. Po elektrotransfére separovaných polypeptidov na PVDF membrány sa Hu-Asp2L proteín detekoval

-56pomocou králičieho anti-Hu-Asp2 antiséra (1/1000 zriedenie) komplexy protilátka/antigén sa vizualizovali pomocou s alkalickou fosfatázou konjugovanej ovčej protilátky proti králičej protilátke (1/2500). Špecifický imunoreaktívny proteín so zdanlivou Mr 65 kDa sa detekoval v pcDNA3.1(+)Hygro/ Hu-Asp2 transfekovaných buniek a nie pri kontrole. Hu-Asp2 polypeptid sa detekoval iba v membránovej frakcii, čo je v súlade s prítomnosťou signálnej sekvencie jednej transmembránovej domény v predpovedanej sekvencii. Na základe tejto analýzy mal najväčšiu hladinu expresie Hu-Asp2 kloň č. 5 a táto bunková línia sa namnožila ako materiál pre purifikáciu.

Purifikácie rekombinantného Hu-Asp2L z CHO-Kl/Hu-Asp2 klonu č. 5

Pri typickej purifikácii sa ako materiál použili pelety buniek klonu č.5 zo 20 150 mm misiek so zrastenými bunkami. Pelety buniek sa resuspendovali v 50 ml studeného lyžujúceho pufru ako je opísaný vyššie. Bunky sa lyžovali polytrón homogenizáciou (2 x 20 sec) a lyzát sa centrifúgoval pri 338 000 x g 20 minút. Pelet membrán sa potom resuspendoval v 20 ml studeného lyžujúceho pufru obsahujúceho 50 mM β-oktylglukozid a jemne miešal pri 4 °C 1 hodinu. Detergentový extrakt sa prečistil centrifugáciou pri 338 000 x g po 20 minút a supematant sa uschoval na ďalšiu analýzu.

β-Oktylglukozidový extrakt sa aplikoval na kolónu s MonoQ anexom, ktorá sa skôr ekvilibrovala 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)/50 mM β-oktylglukozid. Po aplikácii vzorku sa kolóna eluovala lineárnym gradientom zvyšujúcim sa koncentráciou NaCl (0-1,0 M v priebehu 30 minút) a jednotlivé frakcie sa analyzovali pomocou Western blotu a stanovila sa v nich β-sekretázová aktivita (pozri, nižšie). Frakcie obsahujúce jak Hu-Asp2L imunoreaktivitu a β-sekretázovú aktivitu sa spojili a dialyzovali proti 25 mM NaOAc (pH 4,5)/50 mM β-oktylglukozid. Po dialýze sa precipitovaný materiál odstránil centrifugáciou a rozpustný materiál na kolóne s MonoS katexom, ktorá sa skôr ekvilibrovala roztokom obsahujúcim 25 mM NaOAc (pH 4,5)/50 mM βoktylglukozid. Kolóna sa ekvilibrovala lineárnym gradientom zvyšujúcou sa koncentráciou NaCl (0-1,0 M v priebehu 30 minút) blotu a stanovovala sa v nich β-sekretázová aktivita. Frakcie obsahujúce jak Hu-Asp2L imunoreaktivitu a β-sekretázovú aktivitu sa spojili a zistilo sa, že sú z viac než 90 % čisté pomocou SDS-PAGE s farbením pomocou Coomassie Blue.

Príklad 12

Stanovenie Hu-Asp2 β-sekretázové aktivity pomocou peptidových substrátov

Stanovenie β-sekretázy

-57···· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · ··· ··· · · ·· ·· • · · · ···· ·· · ·· ·· ·· ·· ·· ··· β-Sekretázová aktivita sa merala stanovením hydrolýzy syntetického peptidu obsahujúceho APP Švédsku mutáciu pomocou RP-HPLC s UV detekciou. Každá reakčná zmes obsahovala 50 mM NaMES (pH 5,5), 1 % β-oktylglukozid, peptidový substrát (SEVNLDAEFR, 70 μΜ) a enzým (1-5 gg proteínu). Zmesi sa inkubovali pri 37 °C rôznou dobou a reakčné produkty sa stanovili na RP-HPLC pomocou lineárneho gradientu 0-70 B v priebehu 30 minút (A = 0,1% TFA vo vode, B = 1% TFA/10% voda/90 AcCN). Elučný profil sa monitoroval pomocou absoŕbancie pri 214 nm. V predbežných experimentoch sa dva piky produktov eluovali pred intaktným peptidovým substrátom, potvrdili sme, že majú sekvenciu DAEFR a SEVNL, a to pomocou Edmanového odbúravania a MALDI-TOF hmotnostného spektrometra. Percento hydrolýzy peptidového substrátu sa spočítalo porovnaním integrovaných plôch píkov pre dva produktové peptidy a začiatočný materiál získaných meraním pri 214 nm. Špecificita proteázovej štiepnej reakcie sa stanovila uskutočnením β-sekretázového stanovenia v prítomnosti zmesi proteázových inhibítorov (8 μΜ pepstatín A, 10 μΜ leupeptín, 10 μΜ E64 a 5 mM EDTA).

Alternatívne stanovenie β-sekretázovej aktivity využíva substráty s vnútorne zhášanou fluorescenciou na monitorovanie enzýmovej aktivity pomocou fluorescenčnej spektroskopie v jednom vzorku, alebo na mikrodostičke. Každá reakčná zmes obsahovala 50 mM Na-MES (pH 5,5), peptidový substrát MCA-EVKMDAEFJK-DNP] (bioSource International) (50 μΜ) a purífikovaný Hu-Asp2 enzým. Tieto komponenty sa ekvilibrovali na 37 °C a reakcia sa začala prídavkom substrátu. Excitácia sa vykonávala pri 330 nm a reakčná kinetika sa monitorovala meraním fluorescencie pri 390 nm. Pre detekciu zlúčenín, ktoré ovplyvňujú Hu-Asp2 aktivitu, sa testované zlúčeniny pridali behom preinkubačnej fáze reakcie a potom sa reakcia monitorovala rovnako ako bolo opísané vyššie. Ako aktivátory sú označené zlúčeniny, ktoré zvyšujú rýchlosť nástupu fluorescencie, zatiaľ čo inhibítory znižujú rýchlosť nástupu fluorescencie.

Je zrejmé, že vynález sa môže uskutočňovať aj inak, ako je práve opísané vo vyššie uvedených príkladoch.

Je mnoho možných modifikácií a variácií vynálezu a tieto sú rovnako zahrnuté v rozsahu vynálezu.

Všetky publikácie vyššie citované sú tu zahrnuté svojimi odkazmi.

Claims (128)

1. Purifíkovaný polypeptid obsahujúci cicavčí Asp2 polypeptid, ktorý štiepi cicavčí β-amyloidný prekurzorový proteín, alebo fragment, analóg alebo derivát cicavčieho Asp2 polypeptidu, ktorý si zachováva aktivitu štiepenia β-amyloidného prekurzorového proteínu.

2. Purifíkovaný polypeptid podľa nároku 1, vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

a) polypeptidu obsahujúceho purifikovanú, ľudskú Asp2(a) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 4 alebo jeho fragment, ktoiý štiepi β-amyloidný prekurzorový proteín;

b) polypeptidu obsahujúceho purifikovanú, ľudskú Asp2(b) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 6 alebo jeho fragment, ktorý štiepi β-amyloidný prekurzorový proteín;

c) polypeptidu obsahujúceho myšaciu Asp2(b) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 8 alebo jeho fragment, ktorý štiepi β-amyloidný prekurzorový proteín;

d) polypeptidu obsahujúceho purifíkovaný polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická s a), b) alebo c).

3. Purifíkovaný polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci purifikovanú ľudskú Asp2(a) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO:

4 alebo jeho fragment, ktorý štiepi β-amyloidný prekurzorový proteín.

5. Purifíkovaný polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci časť ľudskej Asp2(a) aminokyselinove] sekvencie ukázanej v SEQ ID NO: 4, pričom táto časť obsahuje aminokyseliny 22 až 501 v SEQ ID NO: 4 a nemá aminokyseliny 1 až 21.

6. Purifíkovaný polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci časť ľudskej Asp2(a) aminokyselinovej sekvencie ukázanej v SEQ ID NO: 4 schopné štiepiť β-amyloidný prekurzorový proteín, pričom polypeptid nemá aminokyselinové zvyšky 455 až 477 transmembránovej domény z SEQ ID NO: 4.

···· ·· • · ·· ·· ·· • · · · · ···

Ί. Polypeptid podľa nároku 5, kde polypeptid nemá aminokyselinové zvyšky 454 až 501 z SEQ ID NO: 4.

8. Purifikovaný polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci purifikovanú ľudskú Asp2(b) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 6 alebo jeho fragment, ktoiý štiepi β-amyloidný prekurzorový proteín.

9. Purifikovaný polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci časť ľudskej Asp2(b) aminokyselinovej sekvencie ukázanej v SEQ ID NO: 6, pričom táto časť obsahuje aminokyseliny 22 až 476 v SEQ ID NO: 6 a nemá aminokyseliny 1 až 21.

10. Purifikovaný polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci časť ľudskej Asp2(b) aminokyselinovej sekvencie ukázanej v SEQ ID NO:- 6, schopnej štiepiť β-amyloidný prekurzorový proteín, pričom táto časť nemá aminokyselinové zvyšky 430 až 452 transmembránovej domény z SEQ IDNO. 6.

11. Purifikovaný polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci myšaciu Asp2 aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 8 alebo jeho fragment, ktorý štiepi β-amyloidný prekurzorový proteín.

12. Purifikovaný polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci fragment cicavčieho Asp2 polypeptidu, kde purifikovaný polypeptid nemá transmembránovú doménu cicavčieho Asp2 polypeptidu.

13. Fúzny proteín obsahujúci polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, a ktorý obsahuje heterolognú cieľovú aminokyselinovú sekvenciu.

14. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde polypeptid štiepi ľudský βamyloidný prekurzorový proteín alebo ľudský β-amyloidný prekurzorový proteín-Sw v βsekretázovom štiepnom mieste.

15. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, 5 až 7 alebo 9 až 13, kde polypeptid nemá ktorúkoľvek z cicavčej Asp2 pro-peptidovej sekvencie.

···· • · • · • · • · · • · • · • ·

-60·· ·· ·· • · · • ·· • · · · • · · ·· ·· • e · • · • · • · ·· ·

16. Polypeptid podľa nároku 14, ktorého začiatočná N-koncová sekvencia je ETDEEP.

17. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, 5 až 7 alebo 9 alebo 11 až 15, vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

a) polypeptidu obsahujúceho časť aminokyselinovej sekvencie ukázanej v SEQ ID NO: 4 schopné štiepiť β-amyloidný prekurzorový proteín, kde polypeptid nemá aminokyseliny 1 až 45 z SEQ ID NO: 4; a

b) polypeptidu obsahujúceho časť aminokyselinovej sekvencie ukázanej v SEQ ID NO: 6 schopné štiepiť β-amyloidný prekurzorový proteín, kde polypeptid nemá aminokyseliny 1 až 45 z SEQ ID NO: 6.

18. Purifikovaný polynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až'16.

19. Polynukleotid podľa nároku 17, vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

a) polynukleotidu obsahujúceho nukleotidovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO. 3;

b) polynukleotidu obsahujúceho nukleotidovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 5;

c) polynukleotidu obsahujúceho nukleotidovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 7;

d) polynukleotidu obsahujúceho nukleotidovú sekvenciu, ktorá je aspoň z 95 % identická so sekvenciou z bodu a), b) alebo c), a ktorá kóduje polypeptid, ktorý štiepi β-amyloidný prekurzorový proteín; a

e) fragmentu odvodeného zo sekvencie z bodu a), b), c) alebo d), ktorá kóduje polypeptid, ktorý štiepi β-amyloidný prekurzorový protein.

20. Polynukleotid podľa nároku 17, obsahujúci nukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúcej z SEQ ID NO: 21, 23,25,27,29 a 31.

21. Purifikovaný polynukleotid podľa nároku 17, vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

a) purifíkovaného polynukleotidu, ktorý obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje aminokyseliny 22 až 501 zo SEQ ID NO: 4 a nemá priľahlú nukleotidovú sekvenciu kódujúcu aminokyseliny 1 až 21 zo SEQ ID NO: 4;

···· ·· ·· ·· ·· • · · ···· ·· ··· · · ·· , ·

-61 ·· ·· ·· ·· ·· ·

b) purifikovaného polynukleotidu, ktorý obsahuje nukleotidová sekvenciu, ktorá kóduje aminokyseliny 22 až 476 zo SEQ 1D NO: 6 a nemá priľahlú nukleotidová sekvenciu kódujúcu aminokyseliny 1 až 21 zo SEQ ID NO: 6.

22. Purifíkovaný polynukleotid podľa nároku 17, vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

a) purifikovaného polynukleotidu obsahujúceho nukleotidová sekvenciu kódujúcu časť ľudskej Asp2(a) aminokyselinovej sekvencie ukázanej v SEQ ID NO: 4, ktorá štiepi βamyloidný prekurzorový proteín a kde polynukleotid nemá priľahlú nukleotidová sekvenciu kódujúcu aminokyselinové zvyšky 455 až 477 transmembránovej domény zo SEQIDNO:4;a

b) purifikovaného polynukleotidu obsahujúceho nukleotidová sekvenciu kódujúcu časť ľudskej Asp2(a) aminokyselinovej sekvencie ukázanej v SEQ ID NO: 6, ktorá štiepi βamyloidný prekurzorový proteín a kde polynukleotid nemá priľahlú nukleotidovú sekvenciu kódujúcu aminokyselinové zvyšky 430 až 452 transmembránovej domény zo SEQIDNOó.

23. Purifíkovaný polynukleotid podľa nároku 21, pričom polynukleotid nemá nukleotidovú sekvenciu kódujúcu aminokyseliny 454 až 501 zo SEQ ID NO:4.

24. Purifíkovaný polynukleotid podľa nároku 17, obsahujúci fragment cicavčieho Asp2 polynukleotidu, kde fragment nemá nukleotidovú sekvenciu kódujúcu transmembránovú doménu cicavčieho Asp2 polynukleotidu.

25. Purifíkovaný polynukleotid podľa nároku 17, kde polynukleotid nemá nukleotidovú sekvenciu kódujúcu cicavčiu Asp2 pro-peptidovú sekvenciu.

26. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 24.

27. Vektor podľa nároku 25, ktorý je expresným vektorom, kde je polynukleotid funkčne pripojený k sekvencii kontroly expresie.

28. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfektovaná polynukleotidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 24.

···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ··

-62·· ·· • · · · • · ·· • · · · e · • · · · ·· ··

29. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfektovaná vektorom podľa nárokov 25 až 26.

30. Hostiteľská bunka podľa nároku 28, ktorou je cicavčia bunka.

31. Hostiteľská bunka podľa nároku 28 alebo 29, kde expresia polypeptidu prebieha na jej ·* povrchu.

32. Hostiteľská bunka podľa nároku 28 alebo 29, ktorá vylučuje polypeptid kódovaný polynukleotidom, pričom vylúčený polypeptid nemá transmembránovú doménu.

33. Hostiteľská bunka podľa akéhokoľvek z nárokov 27 až 31, kde sa hostiteľská bunka transfektuje nukleovou kyselinou obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje βamyloidný prekurzorový proteín alebo jeho fragment, ktorý obsahuje miesto rozpoznania proteázy, rozpoznané polynukleotidom.

34. Hostiteľská bunka podľa nároku 32, kde sa hostiteľská bunka transfektuje nukleovou kyselinou obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje β-amyloidný prekurzorový proteín.

35. Hostiteľská bunka podľa nároku 33, kde sa hostiteľská bunka transfektuje nukleotidovou kyselinou obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje β-amyloidný prekurzorový proteín, ktorý obsahuje dva zvyšky karboxy-terminálneho lyzínu.

36. Hostiteľská bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 32 až 34, kde β-amyloidný prekurzorový proteín alebo jeho fragment obsahuje Švédsku mutáciu KM->NL amyloidného prekurzorového proteínu ihneď uprostred β-sekretázového štiepneho miesta.

37. Hostiteľská bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 32 až 35, kde expresia polypeptidu a β-amyloidného prekurzorového proteínu alebo fragmentu β-amyloidného prekurzorového proteínu prebieha na jej povrchu.

··

38. Spôsob prípravy polypeptidu, ktorý štiepi β-amyloidný prekurzorový proteín, vyznačujúci sa tým, že sa hostiteľské bunky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 36 kultivujú v kultivačnom médiu za podmienok, pri ktorých bunky produkujú polypeptid, ktorý sa kóduje polynukleotidom.

39. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že sa ďalej polypeptid z buniek alebo kultivačného média purífikuje.

40. Spôsob na identifikáciu látok, ktoré inhibujú aktivitu ľudskej Asp2 aspartylproteázy, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nasledujúce kroky:

a) kontaktovanie β-amyloidného prekurzorového proteínu s polypeptidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16 v prítomnosti a neprítomnosti testovanej látky;

b) stanovenie aktivity spracovania β-amyloidného prekurzorového proteínu v prítomnosti a neprítomnosti testovanej látky; a

c) porovnanie aktivity spracovania β-amyloidného prekurzorového proteínu v prítomnosti testovanej látky s aktivitou v neprítomnosti testovanej látky, aby sa stanovila látka, ktorá inhibuje aktivitu spracovania β-amyloidného prekurzorového proteínu, pričom znížená aktivita v prítomnosti testovanej látky určuje látku, ktorá inhibuje Hu-Asp2 aktivitu.

41. Spôsob podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že sa polypeptid, ktorý je rekombinantným polypeptidom, purífikuje a izoluje z buniek transformovaných alebo transfektovaných polynukleotidom obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu, ktorá polypeptid kóduje.

42. Spôsob podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že sa polypeptid exprimuje v bunkách transformovaných alebo transfektovaných polynukleotidom obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid, pričom kontaktovanie obsahuje kultiváciu buniek v prítomnosti alebo neprítomnosti testovanej látky a krok stanovenia obsahuje meranie aktivity spracovania β-amyloidného prekurzorového proteínu buniek.

43. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že krok stanovenia obsahuje meranie produkcie beta amyloidného peptidu bunkami v prítomnosti alebo neprítomnosti testovanej látky.

·· • · • ·

-64···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· «β • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· • · ·· ·

44. Spôsob podľa nároku 41 alebo 42, vyznačujúci sa tým, že bunka je bunkou ľudskej embryonálnej bunkovej línie 293 ľadvín.

45. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 40 až 43, vyznačujúci sa tým, že nukleotidová sekvencia je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z:

a) nukleotidovej sekvencie kódujúcej Hu-Asp2(a) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 4;

b) nukleotidovej sekvencie kódujúcej Hu-Asp2(b) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 6;

c) nukleotidovej sekvencie kódujúcej fragment Hu-Asp2(a) (SEQ ID NO: 4) alebo HuAsp2(b) (SEQ ID NO: 6), kde fragment vykazuje charakteristiky aspartylproteázovej aktivity Hu-Asp2(a) alebo Hu-Asp2(b); a

d) nukleotidová sekvencia polynukleotidu, ktorá sa hybridizuje v prísnych hybridizačných podmienkach k Hu-Asp2 kódujúcemu polynukleotidu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5.

46. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 40 až 43, vyznačujúci sa tým, že Hu-Asp2 obsahuje Hu-Asp2(a) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 4.

47. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 40 až 43, vyznačujúci sa tým, že Hu-Asp2 obsahuje Hu-Asp2(b) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 6.

48. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 40 až 43, vyznačujúci sa tým, že Hu-Asp2 obsahuje fragment Hu-Asp2(a) (SEQ ID NO: 4) alebo Hu-Asp2(b) (SEQ ID NO: 6), kde fragment vykazuje charakteristiky aspartylproteázovej aktivity Hu-Asp2(a) alebo HuAsp2(b).

49. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 40 až 47, vyznačujúci sa tým, že bunka obsahuje vektor, ktorý obsahuje polynukleotid.

50. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 39 až 48, vyznačujúci sa tým, že β-amyloidný prekurzorový protein obsahuje Švédsku mutáciu K-»N, M-»L priliehajúcu k miestu β-sekretázového spracovania.

···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ··

-65·· ·· ·· ·· ·· ·· • · · • ·

51. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 39 až 49, vyznačujúci sa tým, že β-amyloidný prekurzorový proteín ďalej obsahuje karboxy-terminálny dilyzín.

52. Spôsob pre identifikáciu látok, ktoré modulujú aktivitu ľudskej Asp2 aspartylproteázy, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nasledujúce kroky:

a) kontaktovanie purífikovaného alebo izolovaného polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16 a β-amyloidného prekurzorového proteínu v prítomnosti a neprítomnosti testovanej látky; kde Asp2 aspartylproteáza sa kóduje molekulou nukleovej kyseliny, ktorá sa hybridizuje za prísnych hybridizačných podmienok k Hu-Asp2kódujúcemu polynukleotidu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 6;

b) stanovenie aktivity polypeptidu pre spracovanie β-amyloidného prekurzorového proteínu v prítomnosti a neprítomnosti testovanej látky; a

c) porovnanie aktivity polypeptidu pre spracovanie β-amyloidného prekurzorového proteínu v prítomnosti testovanej látky s aktivitou v neprítomnosti testovanej látky, aby sa stanovili látky, ktoré modulujú aktivitu spracovania amyloidného prekurzorového proteínu, pričom modulátorom je Asp2 inhibítor, ktorý spomaľuje spracovanie β-amyloidného prekurzorového proteínu a modulátor, ktorým je Asp2 agonista, ktorý zvyšuje toto spracovanie.

53. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 39 až 51, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje krok liečby Alzheimerovej nemoci látkou stanovenou ako inhibítor Hu-Asp2 podľa krokov a) až c).

54. Použitie látky stanovenej ako inhibítor Hu-Asp2 podľa ktoréhokoľvek z nárokov 39 až 41 na výrobu lieku na liečbu Alzheimerovej nemoci.

55. Spôsob na stanovenie modulátorov β-sekterazovej aktivity, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nasledujúce kroky:

a) kontaktovanie prvej kompozície s druhou kompozíciou, obidve v prítomnosti a neprítomnosti zlúčeniny predpokladaného modulátora, kde prvá kompozícia obsahuje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16 a kde druhá kompozícia obsahuje

-66·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · » · · · · • · · · · · ·· ·· ·· a ···· ·· • · · • · · • · · * • · · · ·· ·· polypeptid, ako substrát, majúci aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu miesto βsekretázového štiepenia;

b) meranie štiepenia polypeptidu, ako substrátu, v prítomnosti a v neprítomnosti zlúčeniny predpokladaného modulátora; a

c) stanovenie modulátorov β-sekretázovej aktivity z rozdiele v štiepení v prítomnosti proti štiepení v neprítomnosti zlúčeniny predpokladaného modulátora, kde modulátor, ktorým je antagonista β-sekretázy spomaľuje toto štiepenie a modulátor, ktorým je agonista βsekretázy zvyšuje toto štiepenie.

55. Spôsob podľa nároku 54, vyznačujúci sa tým, že polypeptid prvej kompozície obsahuje polypeptid purífikovaný alebo izolovaný z buniek transformovaných alebo transfektovaných polynukleotidom obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje tento polypeptid.

56. Spôsob podľa nároku 54, vyznačujúci sa tým, že sa polypeptid prvej kompozície exprimuje v bunke transformovanej alebo transfektovanej polynukleotidom obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje tento polypeptid a kde krok merania obsahuje meranie aktivity spracovania β-amyloidného prekurzorového proteínu bunky.

57. Spôsob podľa nároku 54, vyznačujúci sa tým, že prvá kompozícia obsahuje purífikovaný ľudský Asp2 polypeptid.

58. Spôsob podľa nároku 54, vyznačujúci sa tým, že prvá kompozícia obsahuje rozpustný fragment ľudského Asp2 polypeptidu, ktorý zachováva aktivitu Asp2 β-sekretázy.

59. Spôsob podľa nároku 58, vyznačujúci sa tým, že rozpustný fragment je fragment, ktorý nemá Asp2 transmembránovú doménu.

60. Spôsob podľa nároku 58, vyznačujúci sa tým, že polypeptid, ako substrát, z druhej kompozície obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEVNLDAEFR.

61. Spôsob podľa nároku 58, vyznačujúci sa tým, že polypeptid, ako substrát, z druhej kompozície obsahuje aminokyselinovú sekvenciu EVKMDAEF.

···· · • · • · ·

-67·· ·· ·· • · · · · · · í? ·.: .: :

• · · · · · ·· ·· ·· ·

62. Spôsob podľa nároku 58, vyznačujúci sa tým, že druhá kompozícia obsahuje polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu ľudského β-amyloidného prekurzorového proteínu.

63. Spôsob podľa nároku 62, vyznačujúci sa tým, že ľudský β-amyloidný prekurzorový proteín sa vyberie zo skupiny pozostávajúcej z APP695, APP751 a APP770.

64. Spôsob podľa nároku 63, vyznačujúci sa tým, že ľudský β-amyloidný prekurzorový proteín obsahuje aspoň jednu mutáciu vybranú z KM—>NL Švédskej mutácie a V—>F Londýnskej mutácie.

65. Spôsob podľa nároku 62, vyznačujúci sa tým, že polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu ľudského β-amyloidného prekurzorového proteínu ďalej obsahuje aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu marker sekvenciu pripojenú koncom k aminokyselinový sekvencii ľudského β-amyloidného prekurzorového proteínu.

66. Spôsob podľa nároku 62, vyznačujúci sa tým, že polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu ľudského β-amyloidného prekurzorového proteínu ďalej obsahuje dva zvyšky lyzínu pripojené ku karboxylovému koncu aminokyselinovej sekvencie ľudského βamyloidného prekurzorového proteínu.

67. Spôsob podľa nároku 54, vyznačujúci sa tým, že druhá kompozícia obsahuje eukaryotickú bunku, ktorá exprimuje β-amyloidný prekurzorový proteín alebo jeho fragment obsahujúce miesto štiepenia β-sekretázy.

68. Spôsob podľa nároku 67, vyznačujúci sa tým, že β-amyloidný prekurzorový proteín exprimovaný hostiteľskou bunkou je variantom β-amyloidného prekurzorového proteínu, ktorá obsahuje dva karboxyl-terminálne zvyšky lyzínu.

69. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 54 až 68, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje krok liečby Alzheimerovej nemoci látkou stanovenou ako inhibítor Hu-Asp2 podľa krokov a) až c).

·· ♦· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· • ·

-68···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ·

70. Použitie látky stanovenej ako inhibítor Hu-Asp2 podľa ktoréhokoľvek z nárokov 54 až 68 na výrobu lieku na liečbu Alzheimerovej nemoci.

71. Spôsob stanovenia látky, ktorá inhibuje aktivitu ľudskej Asp2 aspartylproteázy, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nasledujúce kroky:

a) pestovanie bunky v prítomnosti a neprítomnosti testovanej látky, kde bunka exprimuje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16 a exprimuje β-amyloidný prekurzorový polypeptid, ktorý obsahuje karboxy-terminálny dilyzín;

b) určenie aktivity spracovania β-amyloidného prekurzorového polypeptidu bunky v prítomnosti a neprítomnosti testovanej látky; a

c) porovnanie aktivity spracovania β-amyloidného prekurzorového polypeptidu v prítomnosti testovanej látky s aktivitou v neprítomnosti testovanej látky, aby sa stanovila látka, ktorá inhibuje aktivitu Hu-Asp2, kde redukovaná aktivita v prítomnosti testovanej látky svedčí o látke, ktorá inhibuje Hu-Asp2.

72. Spôsob podľa nároku 71, vyznačujúci sa tým, že β-amyloidný prekurzorový polypeptid ďalej obsahuje Švédsku mutáciu K->N, M—>L priľahlú k miestu spracovania β-sekretázy.

73. Spôsob podľa z nárokov 71 alebo 72, vyznačujúci sa tým, že sa hostiteľská bunka transformuje alebo transfektuje polynukleotidom obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje Hu--Asp2, kde nukleotidová sekvencia sa vyberie zo skupiny pozostávajúcej z:

a) nukleotidovej sekvencie kódujúcej Hu-Asp2(a) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 4;

b) nukleotidovej sekvencie kódujúcej Hu-Asp2(b) aminokyselinovú sekvenciu ukázanú v SEQ ID NO: 6;

c) nukleotidovej sekvencie kódujúcej fragment Hu-Asp2(a) (SEQ ID NO: 4) alebo HuAsp2(b) (SEQ ID NO: 6), kde fragment vykazuje charakteristiky aspartylproteázovej aktivity Hu-Asp2(a) alebo Hu-Asp2(b); a

d) nukleotidovej sekvencie polynukleotidu, ktorá sa hybrídizuje v prísnych hybridizačných podmienkach k Hu-Asp2-kódujúcemu polynukleotidu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5.

-69···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· ·· • · · • · ·· • · · • · · · ·· ··

74. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 71 až 73, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje krok liečby Alzheimerovej nemoci látkou stanovenou ako inhibítor Hu-Asp2 podľa krokov a) až c).

75. Použitie látky stanovenej ako inhibítor Hu-Asp2 podľa ktoréhokoľvek z nárokov 71 až 73 na výrobu lieku na liečbu Alzheimerovej nemoci.

76. Spôsob zníženia bunkovej produkcie β-amyloidu z β amyloidného prekurzorového proteínu, obsahujúceho krok transformácie alebo transfekcia buniek pozitívnym reagentom schopným znížiť produkciu Asp2 polypeptidu znížením transkripcie alebo translácie Asp2 v bunkách, kde znížená produkcia Asp2 polypeptidu v bunkách koreluje so znížením spracovania βamyloidného prekurzorového polypeptidu na β-amyloid.

77. Spôsob zníženia bunkovej produkcie β-amyloidu z β-amyloidného prekurzorového proteínu, vyznačujúci sa tím, že obsahuje nasledujúce kroky:

a) stanovenie cicavčích buniek, ktoré produkujú β-amyloid; a b) transformáciu alebo transfekciu buniek pozitívnym reagentom schopným znížiť produkciu

Asp2 polypeptidu znížením transkripcie alebo translácie Asp2 v bunkách, kde znížená produkcia Asp2 polypeptidu v bunkách koreluje so znížením spracovania β-amyloidného prekurzorového polypeptidu na β-amyloid.

78. Spôsob podľa nároku 77, vyznačujúci sa tým, že krok stanovenie obsahuje diagnostikovanie Alzheimerovej nemoci, Alzheimerova nemoc koreluje s prítomnosťou buniek, ktoré produkujú β-amyloid, ktorý tvorí amyloidné plaky v mozgu.

79. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 76 až 78, vyznačujúci sa tým, že bunka je nervovou bunkou.

80. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 76 až 79, vyznačujúci sa tým, že pozitívny reagent obsahuje oligonukleotid obsahujúci jednoreťazovú sekvenciu nukleovej kyseliny schopnej viazať Hu-Asp mRNA.

-7081. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 76 až 80, vyznačujúci sa tým, že pozitívny reagent oiigonukleotid obsahuje jednoreťazovú sekvenciu nukleovej kyseliny schopnú viazať Hu-Asp DNA.

82. Polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu cicavčieho β-amyloidného prekurzorového proteínu alebo jeho fragmentu obsahujúci miesto štiepenia β-amyloidného prekurzorového proteínu rozpoznateľné cicavčou β-sekretázou a ďalej obsahujúci dva lyzinové zvyšky na karboxylovom koncu aminokyselinovej sekvencie cicavčieho β-amyloidného prekurzorového proteínu alebo fragmentu β-amyloidného prekurzorového proteínu.

83. Polypeptid podľa nároku 82 obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu cicavčieho β-amyloidného prekurzorového proteínu a ďalej obsahuje dva lyzinové zvyšky na karboxylovom koncu aminokyselinovej sekvencie cicavčieho β-amyloidného prekurzorového proteínu.

84. Polypeptid podľa nároku 82 alebo 83, kde cicavčia β-amyloidný prekurzorový proteín je ľudský β-amyloidný prekurzorový proteín.

85. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 82 až 84, kde je ľudský β-amyloidný prekurzorový proteín obsahuje aspoň jednu variantu vybranú zo skupiny pozostávajúcej z Švédskej mutácie KM-»NL a Londýnskej mutácie V717->F.

86. Popynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 82 až 85.

87. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa nároku 86.

88. Vektor podľa nároku 87, kde polynukleotid je funkčne spojený s promótorom na podporu expresie polypeptidu kódujúceho polynukleotid v hostiteľskej bunke.

89. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfektovaná polynukleotidom podľa nároku 86 alebo vektorom podľa nároku 87 alebo 88.

90. Hostiteľská bunka podľa nároku 89, ktorá je cicavčou bunkou.

···· ·· • · • · • · • · · ·· ·· • · • ·

-71·· ·· • · · • · ·· • · · • · · • · ·· ·· ··

91. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu aspoň z 95 % identickú so sekvenciou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z:

a) nukleotidovej sekvencie kódujúcej Hu-Asp polypeptid vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Hu-Aspl, Hu-Asp(a) a Hu-Asp(b), kde Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp(b) polypeptidy majú úplnú aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO: 6; a

b) nukleotidovej sekvencie komplementárnej k nukleotidovej sekvencii aj.

92. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 91, kde Hu-Asp polypeptid je Hu-Aspl.

93. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 91, kde Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(a).

94. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 91, kde Hu-Asp polypeptid je Hu-Asp2(b).

95. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny obsahujúcej polynukleotid, ktorý hybrídizuje za prísnych podmienok hybridizácie k polynukleotidu obsahujúcemu nukleotidovú sekvenciu vybranú z:

a) nukleotidovej sekvencie kódujúcej Hu-Asp polypeptid vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Hu-Aspl, Hu-Asp(a) a Hu-Asp(b), kde Hu-Aspl, Hu-Asp2(a) a Hu-Asp(b) polypeptidov, ktoré majú úplnú aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:6; a

b) nukleotidovej sekvencie komplementárnej k nukleotidovej sekvencii a).

96. Vektor obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 91 až 95.

97. Vektor podľa nároku 96, kde molekula nukleovej kyseliny je funkčne spojená s promótorom na expresiu Hu-Asp peptidu.

98. Hostiteľská bunka obsahujúca vektor podľa nároku 96 alebo 97.

99. Spôsob získania Hu-Asp polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje hostiteľská bunka podľa nároku 98 a izoluje sa Hu-Asp polypeptid.

···· ·· • · · t · · • · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · · • · · • · • ·

-72·· ·· ·· ·· ·

100.

101.

102.

103.

104.

105.

106.

107.

108.

109.

110.

111.

112.

Izolovaný Hu-Aspl polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekveneiu aspoň z 95 % identickú so sekvenciou obsahujúcou aminokyselinovú sekveneiu SEQ ID NO.2.

Izolovaný Hu-Asp2(a) polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekveneiu aspoň z 95 % identickú so sekvenciou obsahujúcou aminokyselinovú sekveneiu SEQ ID NO:4.

Izolovaný Hu-Asp2(a) polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekveneiu aspoň z 95 % identickú so sekvenciou obsahujúcou aminokyselinovú sekveneiu SEQ ID NO:8.

Izolovaná protilátka, ktorá sa špecificky viaže k Hu-Asp polypeptidu podľa ktoréhokoľvek nároku 100 až 102.

Bunka podľa nároku 98, ktorá je* bakteriálne bunkou.

Bakteriálna bunka podľa nároku 104, kde baktéria je E. coli.

Bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 36 alebo 98, kde bunka je eukaryotická.

Bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 36 alebo 98, kde bunka je bunkou hmyzu.

Bunka hmyzu podľa nároku 107, kde hmyzia je sf9 alebo High 5.

Bunka hmyzu podľa nároku 107, kde hmyzou bunkou je High 5.

Bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 36 alebo 98, kde bunka je bunkou cicavčou.

Cicavčia bunka podľa nároku 110, vybraná zo skupiny pozostávajúcej z ľudských buniek, buniek hlodavcov, zajacovitých a primátov.

Cicavčia bunka podľa nároku 111, kde cicavčia bunka je bunkou ľudskou.

113. Cicavčia bunka podľa nároku 112, vybraná zo skupiny pozostávajúcej z HEK293 a IMR··

-73···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • ·· • · · • · · ··

114.

115.

116.

117.

118.

119.

120.

121.

122.

123.

124.

125.

126.

32 buniek.

Cicavčia bunka podľa nároku 111, kde bunka je bunka primáta.

Bunka primáta podľa nároku 114, bunka primáta je COS-7 bunka.

Cicavčia bunka podľa nároku 111, kde cicavčia bunka je bunka hlodavca.

Hlodavčia bunka podľa nároku 116 vybraná zo skupiny obsahujúcej CHO-K1, Neuro-2A, 3T3 bunky.

Bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 36 alebo 98, kde bunkou je bunka kvasiniek.

Bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 36 alebo 98, kde bunkou je vtáčia bunka.

Izoforma β-amyloidného prekurzorového proteínu modifikovaná tak, že aspoň dva karboxy terminálnej aminokyseliny izoformy sú lyzíny.

Izoforma β-amyloidného prekurzorového proteínu podľa nároku 120 obsahujúceho izoformu známu ako APP695 modifikovanú tak, že poslednými dvoma karboxmi terminálnymi aminokyselinami sú dva lyzínové zvyšky.

Izoforma podľa nároku 111 obsahujúceho SEQ ID NO: 16.

Izoformný variant podľa nároku 121 obsahujúceho SEQ ID NO: 18 alebo 20.

Nukleová kyselina kódujúca polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 120 až 123.

Eukaryotická bunka obsahujúca nukleové kyseliny podľa nároku 124.

Eukaryotická bunka obsahujúca polypeptid podľa nárokov 120 až 123.

127. Eukaryotická bunka podľa nároku 125 alebo 126, kde bunkou je cicavčia bunka.

• · ·· • · · • ·· • · · · * · a • ·

-74···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · • · ·· ·

128. Cicavčia bunka podľa nároku 127, vybraná zo skupiny pozostávajúcej zHEK293 a Neuro2a.

129. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 39,41 až 50, 54, 56 a 71 až 73, vyznačujúci sa tým, že krok stanovenia a meranie obsahuje meranie množstvo amyloidného β-peptidu uvoľneného do bunkového rastového média a/alebo množstva CTF99 fragmentov βamyloidného prekurzorového proteínu v bunkových lyzátoch.

130. Spôsob podľa nároku 129, vyznačujúci sa tým, že bunka je z ľudskej, hlodavčej alebo hmyzej bunkovej línie.