JPH08508464A

JPH08508464A - カテプシンｄはアルツハイマー病におけるアミロイド生成プロテアーゼである

Info

Publication number: JPH08508464A
Application number: JP6514167A
Authority: JP
Inventors: ペリータンブリニ，ポール; ハンスハインツヘルベルトベンツ，ギュンター; ハービッヒ，ディーター; ノーマンドレイヤー，ロバート
Original assignee: ベイヤーコーポレイション
Priority date: 1992-12-16
Filing date: 1993-11-12
Publication date: 1996-09-10
Also published as: CA2151927A1; WO1994013319A1

Abstract

(57)【要約】アルツハイマー症のβ−アミロイドタンパク質の前駆物質に対して特異的なプロテアーゼのインヒビター、例えばアスパラギン酸プロテアーゼ、カテプシンＤおよびキモトリプシン様セリンプロテアーゼのインヒビターを用いて、β−アミロイドタンパク質の生成を調節する方法；前記アミロイド前駆タンパク質の減成を行うのに必要な特異性を有する分子のプロテアーゼ活性を生体外で検出する方法；前記アミロイド前駆タンパク質に対して特異的なプロテアーゼのインヒビターを同定する検定法；ならびに同定されたインヒビターおよびアルツハイマー症の治療に用いる治療薬としてのこれらインヒビターの用途を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】カテプシンＤはアルツハイマー病におけるアミロイド生成プロテアーゼである発明の背景本出願は、1992年５月11日提出の米国特許第07/880,914号の一部継続である19 92年12月16日提出の米国特許第07/995,660号の一部継続である。１）産業上の利用分野本発明は、アルツハイマー病（以後“AD”と記す）ベータアミロイドタンパク質に対する前駆体をプロセッシングする特異性を有するタンパク質分解酵素を同定するための方法；ベータアミロイドタンパク質に対する前駆体に特異的なプロテアーゼの阻害剤を同定するための方法；並びにベータアミロイドタンパク質に対する前駆体に特異的なプロテアーゼの阻害剤、例えばアスパラギン酸プロテアーゼ、カテプシンＤ、及びキモトリプシン様セリンプロテアーゼを用いてベータアミロイドタンパク質の生成を調節するための方法に関する。２）関連技術の説明本検定は、AD患者の脳におけるアミロイド性ペプチドの生成速度を制御するプロテアーゼの同定に有益である。このように、それらはこのようなタンパク質を単離するために用い得るし、並びにADの療法として用い得るプロテアーゼ阻害剤を同定するのにも用い得る。アスパラギン酸プロテアーゼ、即ちアミロイド前駆体タンパク質（以後“APP”と記す）をプロセッシングするための主なアミロイド原性プロテアーゼとしてのカテプシンＤを同定するための検定の適用を以下に説明する。APPホロタンパク質に対するアミロイド前駆体を生成し得る二次セリンプロテアーゼの部分的特性表示が提供される。 ADは、通常は前頭、頭頂及び後頭皮質における進行性萎縮を特徴とする脳の進行性変性疾患である。ADの臨床的発現としては、進行性記憶障害、言語及び視覚空間識別力の喪失、並びに行動欠損が挙げられる（McKhan et al.，1986，Neuro logy，34:939）。全体的認識障害は、大脳半球全体に見出されるニューロン細胞の変性によるものである（Price，1986，Annu．Rev．Neurosci．9:489）。病理学的には、AD患者の剖検脳の原発性の顕著な特徴は、（１）神経繊維のもつれの蓄積を含むニューロン神経細胞形質から成る病変；（２）脳血管性アミロイド沈着物；及び（３）神経炎斑である。脳血管性アミロイド（Wong et al.，1 985，PNAS，82:8729）及び神経炎斑（Masters et al.，1985，PNAS，82:4249）はともに、単に“Ａ４”又は“ベータアミロイド”と呼ばれる独特のペプチドを含有する。ベータアミロイドは、相対分子量4,500の不溶性の高度に凝集する小ポリペプチドであり、39〜42個のアミノ酸から成る。証拠のいくつかのラインは、AD病変の病因におけるベータアミロイドの役割を支持する。例えばベータアミロイド及び関連断片はPC−12細胞株に対して有毒であり（Yanker et al.，1989，Science ，245:417）、ニューロンの一次培養に対して有毒であり（Yanker et al.，1990 ，Science，250:279）、そして齧歯類の脳におけるニューロン変性及び齧歯類における対応する記憶喪失反応を引き起こす（Flood et ａl.，1991，PNAS，88:33 63；Kowall et al.，1991，PNAS，88:7247）ことが示されている。しかしながら最も強力な証拠は、ある種の形態の家族性アルツハイマー病（FAD）と同時分離するアミノ酸置換のホロアミロイド前駆体タンパク質（以後、“APP”と呼ぶ）内の部位から得られる。APP内のベータアミロイドペプチド配列に対してＮ末端（Mullant et al.，1 992，Nature Genetics，1:345）又はＣ末端（Goate et al.，1991，Nature，349 :704；Yoshioka et al.，1991，Biochem．Biophys．Res．Comm.，178:1141；nur rell et al.，1991，Science，254:97；及びChartier-Harlin et al.，1991，Na ture，353:844）に位置するこれらの点突然変異は、断片を含有するベータアミロイドの内部タンパク質分解性放出の速度を変えることによりFADを引き起こすことを示唆する（Mullan等及びChartier-Harline等。ともに上記）。 Kang等（1987，Nature，325:733）は、大型前駆体タンパク質から生じるとして並びにその一部としてベータアミロイドタンパク質を記載する。この前駆体を同定するために、公知のベータアミロイド配列から選定されたオリゴヌクレオチドを用いてそのタンパク質をコードする全長相補的DNAクローンを単離し、シーケンシングした。予測された前駆体は695この残基を含有したが、これは一般に “APP 695”（アミロイド前駆体タンパク質695）と呼ばれる。 APPタンパク質をコードする遺伝子を引き続きクローニングした結果、Ａ４領域が２つの隣接するエクソン上にコードされた（Lemaire et al.，1989，Nuclei c Acids Res.，17:517）が、これはＡ４蓄積が択一的にスプライシングされたmR NAの直接発現の結果である可能性を除外する。これは、Ａ４蓄積がAPP内のペプチド領域に対してＮ及びＣ末端の部位でのAPPの異常タンパク質分解性分解に起因しなければならないことを意味する。 APP 695はヒト脳中に見出されるAPPの最も多量にある形態であるが、しかし他に３つの形態、即ちAPP 714，APP 751及びAPP 770が存在する（Tanzi et al.，1 988，Nature，351:528；Ponte et al .，1988，Nature，331:525；及びKitaguchi et al.，1988，Nature，331:530）。異長同形態がヒト第21染色体上に位置する単一APPからの別のスプライシングから生じる（Goldgaber et al.，1987，Science，235:877；及びTanzi et al.， 1987，Science，235:880）。 APP 751及びAPP 770は56アミノ酸Kunitz阻害剤ドメインを含有し、これはウシ膵臓トリプシン阻害剤と40％の相同を共有する。これらの形態のAPPはともにプロテアーゼ阻害活性を有し（Kitaguchi et al.，1988，Nature，311:530；及びS mith et al.，1990，Science，248:1126）、これらの形態の少なくとも１つがおそらくは以前にプロテアーゼNexin 11として同定されたものである（Oltersdorf et al.，1989，Nature，341:144；Van Nostrand et al.，1989，Nature，341:5 46）。アミロイド前駆体タンパク質に関する生理学的役割は、未だ確証されていない。それは、細胞表面受容体（Kang et al.，1987，Nature，325:733）、付着分子（Schubert et al.，1989，Neuron，3:689）、成長又は栄養因子（Saitoh et al .，1989，Cell，58:615:Araki et al.，1991，Biochem．Biophys．Res．Comm.， 181:265；及びMilward et al.，1992，Neuron，9:129）、創傷治癒の調節体（Va n Nostrand et al.，1990，Science，248:745；及びSmith et al.，1990，Scien ce，248:1126）であるか、又は細胞骨格系においてある役割を演じる（Refolo e t al.，1991，J．Neuroscience，11:3888）と提唱されている。多数の研究が行なわれてADにおける変更APP発現の役割が調べられたが、しかし結果は相容れないものであった（例えば検討文献：Unterbeck et al.，1990， Review of Biological Research in Aging，Wiley-Liss，Inc.，4:139参照）。異形態のAPPの相対量の変化がアミロイド蓄積に依るものか否かを調べるための研究も行なわれた。このような研究の結果は、同じく紛らわしいものであったが、しかしAPPを含有するKunitzドメインの相対発現レベルがADでは上昇するという結論を支持した（Johnson et al.，1990，Science，248:854）。したがって上昇APP 751を発現するトランスジェニック動物は皮質及び海馬ベータアミロイド反応性沈着物を示すことが判明した（Quen et al.，1991，Natur e，352:239）。最新研究は、Ａ４のＮ末端から全長APPのＣ末端に伸びるAPP断片（約100個のアミノ酸から成るため、以後“Ｃ−100断片”と呼ぶ）も、in vitro（Dyrks et al.，1988，EMBO J.，7:949）及びトランスフェクト化細胞（Wolf et al.，1990 ，EMBO J.，9:2079；及びMaruyama et al.，1990，Nature，347;566）の両方での凝集が可能であることを示した。トランスフェクト化Ｐ19細胞におけるＣ−10 0断片の過剰発現は細胞毒性を引き起こすことが示された（Fuckuchi et al.，19 92，Biochem．Biophys．Res．Comm.，182:165）。さらに、ベータアミロイド及びＣ末端領域をともに含有するＣ末端断片はヒト脳中に存在することが示され（Estus et al.，1992，Science，255:726）、トランスフェクト化細胞株における研究はこれらの断片がエンドソーム−ライソソーム経路で産生され得ることを示唆する（Golde et al.，1992，Science，255:728 ）。全体として、上記の報告は、Ａ４領域のＮ末端でのAPPの単一タンパク質分解性切断がADに伴う病態生理学的症状を引き起こすに十分であることを示唆する。一次細胞及び細胞株（ADトランスフェクト体を含む）の培養が、ベータアミロイド（１〜４２アミノ酸）と同じＮ末端を有しおそらく全長ベータアミロイドを包含する３〜４kDaのペプチドを分泌することを最近の研究は示している（Haas et al.，1992，Nature，349:322；及びShoji et al.，1992，Science， 258:126）。このようなペプチドはさらに、AD及び非AD患者の脳脊髄液（以後“C SF”と記す）中に見出された（Scubert et al.，1992，Nature，359:325；及びS hoji et al.，1992、同上）。 APPは、APP細胞外ドメインの分泌のために生理学的経路中のＡ４領域内の部位でも切断される（Esch et al.，1990，Science，248:1122；及びWang et al.，1 991，J．Biol．Chem.，266:16960）。この経路はいくつかの細胞株で働き、必然的にＡ４、即ち前駆体のアミロイド領域の破壊を引き起こす。このような経路はヒト脳でも働いているという証拠が得られている（Palmert et al.，1989，Bioc hem．Biophys．Res．Comm.，165:182）。 APPの正常の非病理的プロセッシングに関与する酵素は、“セクレターゼ”と呼ばれている。セクレターゼ作用に起因するＣ末端断片はＣ−100断片（上記）より17アミノ酸だけ小さく、以後“生理学的Ｃ末端断片”と呼ぶ。Ａ４の正味の病理学的蓄積はAPP分解の病理学的及び生理学的経路の相対的活性により制御されると仮定されている。したがって、ADに苦しむ人々の脳中のベータアミロイドの蓄積を説明する下記のようないくつかの可能性が存在する：（１）アミロイド原性領域の破壊に伴うセクレターゼの活性又はレベルの不足；（２）病理学的経路のプロテアーゼに曝露されるようになり得るようなAPPの細胞分類の変更；（３）病理学的プロテアーゼのレベルの増大；（４）そうでなければ産生されるのと同様に速くアミロイドを分解する分解酵素のレベルの不足；又は（５）APPアミノ酸配列の突然変異により引き起こされる病理学的タンパク質分解性分解に対するAPPの感受性の増大。他と比べて、細胞中のAPP分類の調節についてはほとんど知られていない。クンパク質キナーゼＣ活性の変化による少なくとも一部のリン酸化の変化がAPP通行の変化を引き起こし、最後にAPPプロセッシングの変化を引き起こすという仮説が育ちつつある（Buxbaum et al.，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:6 003）。したがって、細胞リン酸化を変えることを意図した治療は、APPのＣ末端断片のパターンの定性的及び定量的変化の両方を引き起こした。アミロイド原性APPプロセッシングは最初はエンドソーム−ライソソーム事象であると示唆された（Golde et al.，1992，Science，255:728；及びC．Haas et al.，1992，Nature，357:500）が、しかしベータアミロイド生成における分泌経路内又は原形質膜でのプロテアーゼの参加と一致して、択一的にプロセッシングされた形態の分泌APP（Suebert et al.，1993，Nature，361:260）と一緒に培養細胞によりベータアミロイドが放出されるという最新の証拠がある（C．Haas et al.，1992，Nature，359:322；及びShoji et al.，1992，Science，258:126 ）。近年、スウェーデン型のFADに関連したAPP 695を発現するトランスフェクト化細胞株が野生型APPでトランスフェクトされた細胞より６〜８倍速くベータアミロイド様断片を放出することが示された（Citron et al.，1992，Nature，360 :672；並びにCai et al.，1993，Science，259:514；及び1992，Neuroscience L ett.，144:42）が、しかしロンドン（Ｖ〜Ｉ）突然変異の効果についての同様の研究はアミロイド放出に及ぼす作用を示さなかった（Cai等。同上参照）。いくつかの場合において、培養細胞によるアミロイド放出は、APP前駆体のバリン594 （参照１によるナンバリング）で始まるＮ末端を有する異常形態のベータアミロイドを含有する（C．Haas et al.，1992，Nature，359:322；Busciglio et al. ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90；2092）が、この意味は不明である。阻害剤の作用は、これらの系におけるベータアミロイド産生における酸性細胞区画の参加を圧倒的に支持する（Shoji et al.，1992，Science，2 58:126；Busciglio et al.，Pro．Natl．Acad．Sci．USA，90:2092；及びHaas e t al.，1993，J．Biol．Chem.，268:3021）が、これはある種のシステイン又はセリンの関与の欠如を示唆する（Shoji et al.，1992，Science，258:126；Busc iglio et al.，Pro．Natl．Acad．Sci．USA，90:2092；及びHaas et al.，1993 ，J．Biol．Chem.，268:3021）。近年、Nitsch等（1992，Science，258:304）は、ある種のアセチルコリン受容体型による細胞株のトランスフェクションとその後の受容体活性化が、タンパク質キナーゼ活性の変化により生じると結論される工程におけるAPPプロセッシング及び分泌の増大を引き起こすことを示した。リン酸化の変化に関する役割に関係がある上に、この後者の研究はADに特徴的なコリン作動性神経機能におけるプラーク病態と確立された心の動揺との間の連関を提示する。上記の観察にもかかわらず、細胞分類のあらゆる根元的変化に対する平衡を元に戻し得る選択的及び特異的治療薬の設計を可能にするにはAPP分類についての知識は不十分である。ベータアミロイドは（単数又は複数の）プロテアーゼの直接作用により生成されねばならない。Ｃ−100又はベータアミロイド生成に関与するいわゆる“病的 ”脳プロテアーゼ（単数又は複数）の同定は、アミロイド蓄積を遮断するよう意図された治療用プロテアーゼ阻害剤を開発するための努力における必須段階である。このような酵素の同定には、脳抽出物中に存在する他の脳タンパク質分解酵素の存在下でプロテアーゼの活性を特異的に測定させるこのようなプロテアーゼの活性に対する特異的検定の開発を要する。次いで、このような検定を用いてプロテアーゼ精製中にプロテアーゼを検出する。最後に、本検定を用いて、鉛治療化合物に対する薬学的スクリーニングに必要とされるような酵素の強力な阻害剤の作用を測定することができる。いくつかの研究がセクレターゼ及びうわさの病的プロテアーゼの両方の精製及び特性表示を試みた。初期の研究は、APP内の予期される切断部位を模倣しただけの合成ペプチド基質を特徴とする検定を用いた。このような検定は精製プロテアーゼのin vitro活性を測定するには有用であるが、それらはプロテアーゼ精製をモニタリングするのに必要とされるようなプロテアーゼの混合物中でのあるプロテアーゼの検出を可能にするのに十分な特異性をめったに有していない。したがって、これらのペプチダーゼ検定は必要なプロテアーゼ特異性を提供できず、このように定量化されたペプチダーゼ活性を用いても、ヒト脳組織から候補APP プロセッシング酵素活性の精製をうまく追跡できなかった。本開示に先立って、いずれの工程に関しても信用できる候補プロテアーゼ（単数又は複数）は出現していないし、種々の研究の結果は相容れないものであった。例えば、多数の有用な研究が、病的プロテアーゼは：ラインゾーム起源である（Cataldo et al.，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:3861；及びHaas et al.，1992，Nature，357:500）；カルシウム依存性カテプシンＧ様セリンプロテアーゼ又は金属依存性システインプロテアーゼ（Razzaboni et al.，1992，Br ain Res.，589:207；及びAbrahams et al.，1991，Ao．N.Y．Acad．Sci.，640:1 61）；カルパインＩ（Siman et al.，1990，J．Neuroscience，10:2400）；多触媒性プロテアーゼ（Ishiura et al.，1989，FEBS．Lett.，257:388）；セリンプロテアーゼ（Nelson et al.，1990，J．Biol．Chem.，265:3836）；トロンビン（Igarashi et al.，1992，Biochem．Biophys．Res．Comm.，185:1000）；あるいは亜鉛金属−ペプチダーゼ（WIPO出願WO92/07068(Athena Neurosciences，Inc.)）であると提案している。同様の不一致はセクレターゼの同定に際しても生じており、その主張を以下に示す：金属−ペプチダーゼ（McDcrmott et al.，1991，Biochem．Biophys．Res ．Comm.，179:1148）；アセチルコリネラーゼ関連プロテアーゼ（Small et al. ，1991，Biochemistry，30:10795）；カテプシンＢ（Tagawa et al.，Biochem． Biophys．Res．Comm.，177:377）；又は広範な亜部位特異性を有する原形質膜関連プロテアーゼ（Sisodia，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:6075；及び Maruyama et al.，1991，Biochem．Biophys．Res．Comm.，179:1670）。 APPプロセッシング酵素の性質を同定するための過去及び現在の尽力が一般に実を結ばないのは、使用した検定の特異性が不十分であったこと、並びに脳組織に関連したプロテアーゼの複雑な異種性が原因であった。本発明の要約本開示は、組換え体APPのタンパク質分解性分解を基礎にした特異的検定を反応生成物の免疫化学的検出と組み合わせて用いてAPPプロセッシング酵素のいくつかを同定する方法を記載する。本発明の検定は、APPからのベータアミロイドの生成にある役割を演じるための正確な特異性及び適切な局在性を有するヒト脳プロテアーゼを同定する。ここに開示した検定の書式は、同定プロテアーゼとともに、大量のサンプルを合理的に処理し、検出の免疫化学的方法により良好な感受性を生じる。さらに本検定の簡便性により、実験室の技術者が容易に常用し得るし、一貫した再現可能な結果が生じ得る。これらの並びにその他の改良を以下に記す。本発明の一目的は、AD患者を治療するために用い得る薬剤を見出すための方法を提供することである。前述のように、39〜42アミノ酸ペプチドベータアミロイドを産生するためのAPPのタンパク質分解性分解は、アミロイド斑形成の病態生理学的工程の第一段階である。証拠のいくつかのラインは、AD脳中に見出される神経変性特徴におけるベータアミロイド及びアミロイド斑の原因的役割を指し示す。これらを以下に示す：（ｉ）変性中のニューロンを伴う斑物質及び異栄養性神経突起の同時局在化（ Price et al.，1989，BioEssays，10:69で検討されている）；（ii）ベータアミロイドが培養中のニューロンに対して有毒であり得る証拠（ Yankner et al.，1990，Science，250:270）；（iii）ベータアミロイドがニューロン変性に関連し、ある種の動物モデルで試験した場合に記憶を変えたという証拠（Flood et al.，1991，PNAS，88:3363 ；及びKowall et al.，1991，PNAS，88:7247）；（iv）APPにおける点突然変異を有するある種の形態の遺伝性ADの同時分離（C oate et al.，1991，Nature，349:704；Yoshioka et al.，1991，Biochem．Biop hys．Res．Comm.，178:1141；Chartier-Harlin et al.，1991，Nature，353:844 ；Murrell et al.，1991，Science，254:97；及びMullan et al.，1992，Nature Genetics，1:345）。したがって、APPのベータアミロイドへのタンパク質分解性変換は、ADの病因における必須段階であり、例えば治療介在のための重要な標的であると思われる。関連したプロテアーゼ活性の同定、並びに適切なin vitroすに検定の開発は、したがってAD患者におけるアミロイド斑形成を遮断するための治療として用い得る治療用プロテアーゼ阻害剤の開発に必ず先要である。本発明は、タンパク質分解性ベータアミロイド生成の阻害剤を発明するのに用い得る２つの開発に関する：（１）ホロAPP基質、及びAPPを分解する高度精製プロテアーゼ又はAPPを分解し得る未同定プロテアーゼを含有する粗製生物抽出物のいずれかを包含するin v itro検定；並びに（２）上記（１）に記載のin vitro検定系とともに用いた場合にアミロイド性又は前アミロイド性APP C末端断片を精製し得るヒト脳からの特異的プロテアーゼの同定及び精製。本検定は、Ｃ末端APP断片を産生するためのin vitro APP分解活性の検出を可能にする。粗製生物抽出物とともに用いた場合、本検定を用いて検出活性に関与するプロテアーゼの精製をモニタリングし得るし、又はそのプロテアーゼを特性表示し得る。さらに、精製プロテアーゼ又は未同定APP分解酵素活性を含有する粗製生物抽出物とともに用いた場合、本検定を用いて検定混合物中で同時インキュベートされる化学又は生物化合物によるAPPプロセッシング活性の阻害を測定しうる。それにより同定される阻害化合物は、AD患者に特徴的なin vivoアミロイド斑形成の治療用阻害剤としての使用法を有する。上記（２）により同定されるプロテアーゼとしては、アスパラギン酸プロテアーゼ、カテプシンＤ、及びカテプシンＧとは異なり、Ｎ−［トシル−Ｌ−フェニルアラニン−クロロメチルケトン（“TPCK”）及びアルファー２アンチプラスミン、並びにジャガイモからのキモトリプシン阻害剤により阻害されるキモトリプシン様セリンプロテアーゼが挙げられる。カテプシンＤの同定は特に有意である。カテプシンＤは、それぞれ10.0kDa及び5.6kDaの大きさのＣ−100及びベータアミロイド様断片を生成し得ることを我々は明示する。この発見により、上記（１）に記載のin vitro検定又は本発明に記載されているようなより簡単な高スルーブットペプチダーゼ検定を用いてその活性の阻害剤を探究するためにあらゆる精製又は単離カテプシンＤが使用できる。さらに、カテプシンＤの特異性並びに特異的アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤の設計については多くが公知であるため、アミロイド原性プロテアーゼとしてのカテプシンＤの同定は、確立された方法を用いた特異的カテプシンＤ阻害剤の開発並びに確立されたカテプシンＤ阻害剤の利用をともに可能にする。さらに、カテプシンＤは意外にも、Glu（593）−Val（594）（ナンバリングは Kang等（上記）に依る）間のペプチド結合でAPPを加水分解することを下記に示す。カテプシンＤの好ましい特異性は、普通は、疎水性残基間に認められる。この情報は、カテプシンＤ阻害剤の設計にさらに用い得る。上記のように、それによって同定される阻害化合物は、AD患者に特徴的なin v ivoアミロイド斑形成の治療用阻害剤としての使用法を有する。本発明の使用により同定されたAPP分解酵素を精製し、使用して：（ｉ）プロテアーゼの同時局在化をAD脳病態とさらに相関させるのに必要な免疫化学試薬を開発し；そして（ii）対応するプロテアーゼを単離し得る。次にクローン化cDNAを用いてプロテアーゼ過剰発現の作用を査定し得るADのためのトランスジェニック動物モデルを構築する。本発明の使用により同定されるAPP分解酵素阻害剤はさらに、例えばアフィニティークロマトグラフィーによるAPP分解酵素の精製における配位子として有用である。カラムは一般に、必要な場合には炭化水素スペーサーアームを介して間接的に、酵素阻害剤が取り付けられた不活性マトリックス、例えばアガロースで包む。次に酵素を含有する組成物をカラムに適用し、他のすべてのタンパク質が通過し、廃棄される間に、阻害剤により止められる。次に酵素の特性を変え、もはや阻害剤と結合できないpHでの変形緩衝剤を用いて溶離することにより、又は阻害剤を置換する競争的対配位子の使用により、酵素をカラムから遊離させる。どちらの場合も、酵素はカラムを通過して収集され、ここに至っては他のタンパク質は存在しない。さらに詳しくは、例えばT．Palme r，Understanding Enzymes，1991，Ellis Horwood，New York，3rd Edition（この記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）を参照して頂きたい。合成ペプチド基質を組み込んだ検定は高度精製プロテアーゼ製剤のin vitro酵素学的研究に有用であるが、しかし一般的に過多のプロテアーゼを含有する粗製生物抽出物中の所望のプロテアーゼ活性の選択的検出を可能にするには不十分な特異性を有する。例えば、脳組織は広範なそして種々のペプチドプロセッシング及び分解酵素が豊富であるが、このことは、合成ペプチド基質を用いて特異的脳 APP分解プロテアーゼを単離する努力がなぜ首尾よく行かなかったかを説明し得る（上記背景の項を参照）。したがって下記の実施例３では、合成ペプチド検定により、特異化検定条件下でＣ末端断片を産生するためのAPPを分解できないいくつかのペプチダーゼの同定がなされ、APP分解プロテアーゼのパターンはいかなる点でも脳ペプチダーゼの対応するパターンに類似しないことが示される。この問題のさらに限定的なアプローチは、ホロAPPの基質としての使用、並びにプロテアーゼ含有分画を用いたインキュベーション後のその特異的分解を査定する方法である。このために、本発明は、脳プロテアーゼ分画による組換え体APPの酵素分解がAPPのＣ末端領域に対する抗体を用いたイムノプロットによりモニタリングされるような方法を記載する。我々の検定手順は、全長ベータアミロイドペプチドを含むのに十分なサイズの APPからのＣ末端断片の生成に焦点を合わせている（内部タンパク質分解を要する工程。Ａ４領域に対するＮ末端）。ヒト脳組織（非AD対照又はAD）を均質化し、次いで慣用的超遠心分離を用いて可溶性分画（以後“Ｓ”）、1,500ｇ後ペレット（以後“Ｐ−２”）及びミクロソーム分画（以後“Ｍ”）に亜分別する。膜性Ｍ及びＰ−２分画をTriton X-100 製剤で可溶化する。その結果生じるＭ及びＰ−２、並びにＳ分画からの可溶性分画を次に別々にMono−Ｑ強陰イオン交換カラム上でクロマトグラフィー処理すると、異なる脳プロテアーゼが分離する。ベータアミロイドのＮ末端周囲のアミノ酸配列をまねた合成ペプチドを用いて、Ｍ、可溶性及びＰ−２分画からの精製による個々のモノ−Ｑ分画のペプチダーゼ活性を査定する。ペプチダーゼ活性の別々のピークの回収に基づいてカラム分画の連続プールを作る。ペプチダーゼ活性のプールを用いて、トランスフェクト化CHO細胞株から精製された高度精製組換え体APPのタンパク質分解性分解の検出のための検定条件を確立する。APP C末端ドメイン又はベータアミロイド領域に向けられる抗体を用いてＣ末端APP断片を置くイムノプロット検定を開発する。本検定を用いて、全長ベータアミロイドを潜在的に含有するのに十分大きいサイズのAPP C末端断片を生成することができる６つの潜在的に異なるタンパク質分解活性を同定する。モノ−Ｑプール間のAPP分解活性の回収が段階２で確立されたペプチダーゼ活性プロフィールとよく相関することは見出されなかった。阻害剤研究により、APP分解活性にはセリン及びアスパラギン酸プロテアーゼ活性の両方が含まれることが明らかになった。酵素精製をモニタリングするためにペプチダーゼ検定を用いることは断念されている。組換え体APPのより大きな供給は、バキュロウイルス特定昆虫細胞系中での発現により得られ、タンパク質精製中のAPP分解活性をモニタリングするための主要な方法としてのAPP分解検定の使用を可能にする。主なアスパラギン酸プロテアーゼ活性は、Ｐ−２分画のモノ−Ｑ精製からの分画中で同定される。さらなる精製及び特性表示実験は、酵素がカテプシンＤである個とを立証する。カテプシンＤは、5.6kDaのベータアミロイド様断片を生成するホロAPPを加水分解することが示されている。アプロチニンセファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて、上記で同定されたアプロチニン感受性APP分解活性を単離しようとした。11，14及び1 8kDaの特異的Ｃ末端断片を生成するためにAPPを分解し得るキモトリプシン様セリンプロテアーゼ活性を一部精製するが、これは免疫化学的手段により全長ベータアミロイドを含有することが示された。この手順により、APPのアミロイド原性分解にある役割を演じる可能性が高いいくつかの脳プロテアーゼ活性をわれわれは同定した。本明細書に記載した同定又は非同定活性の各々を、APP分解検定とともに用いて、治療的価値を有する選択的プロテアーゼ阻害剤をスクリーニングした。本明細書中で用いる場合、“APP基質”という用語は、生物供給源からの単離又は精製により得られるかあるいはAPP又はその類似体、及びタンパク質又はその一部の消化により得られる断片、APPタンパク質の一部をコードする遣伝子の発現によりエンドソーム−ライソソームれる断片、及びAPPの一部に対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチドを含めたあらゆるこのようなタンパク質の断片をコードするクローン化遣伝子の発現により得られるか否かにかかわらず、全長APPを意味する。本発明の検定のためのAPP基質は、種々の形態で試験試薬として提供される。A PP 695に好ましくは由来するか、又はそのアミノ酸配列に少なくとも一部対応するけれども、他のAPP同型（上記）の誘導体又は類似体が、同様に本発明の方法に用いるために意図される。APP 695は、Schubert等（1989，Proc．Natl．Acad ．Scj．USA，86:2066）が記載しているように、天然供給源から生化学的分離又は精製により、あるいはタンパク質又はその機能性部分をコードする組換え体DN Aクローンの発現（knops et al.，1991，J．Biol．Chem.，266:7285；及びBhasi n et al.，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:10307）により得られる。 APPタンパク質の断片は、関連するタンパク質分解試験サンプル活性（上記）による認識及び切断に十分なアミノ酸の配列を包含する。生物物質からのAPPの単離は、通常、クロマトグラフィー、特にアフィニティークロマトグラフィーのような慣用的技術による精製を包含する。精製APP又はその断片を用いてモノクローナル又はポリクローナル抗体を調製し、次いでこれを慣用的手法によるアフィニティー精製に用い得る。その結果生じた精製APP物質をさらに処理し、例えば化学的又は酵素消化により断片化し得る。関連するタンパク質分解試験サンプル活性（上記）に対する所望の感受性に関してスクリーニングすることにより、有用な断片を同定する。前述のように、APP基質は、APP又はその一部をコードする組換え体DNAクローンの発現により調製し得る。クローン化APP遣伝子は、それ自体天然でも合成でもよく、天然遣伝子は、公知のアミノ酸配列を基礎にした変性プローブを用いてcDNA又はゲノムライブラリーから得られる（Kang e t al.，1987，Nature，325:733）。適切な組換え体DNAを得るための他の方法、並びにクローン化遣伝子を発現するための方法は、当業者には明らかである。試験サンプルの存在下でのAPP基質のタンパク質分解性切断の検出には、種々の便利な方法が適用できる。目下のより好ましい方法のいくつかを以下に示すが、しかしながらこれについての本発明の特徴から逸脱しない限りこの工程に多数の他の方法を用い得ることは当業者には認識される。概して、このためには、AP P基質のタンパク質分解性切断の発生を検出できるあらゆる方法を用い得る。このことは切断が単一産生種、例えば光学的反応性物質、例えば着色又は蛍光染料を生じるようにAPP基質の適切な設計によりもたらされる。別の主なアプローチとしては、イムノアッセイによるといったような、１つ又はそれ以上の切断生成物の感受性検出が含まれる。現在、このような切断生成物は好ましくはAPP基質のＣ末端断片デある；しかしながら、サンプルとのインキュベーション時に出現するあらゆる断片が検出の対象である。病的タンパク質分解活性の特徴である１つ又はそれ以上の切断生成物の検出は、多数の方法により達成し得る。下記の実施例でさらに実証されるこのような方法の１つは、ウエスターンブロットとして一般に公知の手順を包含する。典型的には、試験サンプルと一緒にAPPをインキュベーション後に、ゲル電気泳動を実施して成分を分離して反応混合物を生じる。次に分離タンパク質成分をニトロセルロース膜のような固体マトリックスに移す。 APP分解に特徴的な断片に特異的な抗体を次に膜に固定された成分と反応させ、二次酵素標識化抗体抱合体の付加により検出する。その結果生じた結合抱合体の位置選定を酵素標識のための色原性基質で発現させる。一般に有用な試験系を受けることが可能な種々のイムノアッセイ書式は、APP 断片の検出に適用できる。典型的には、APP基質を試験サンプルと一緒にインキュベートし、その結果生じた無傷APPを固定化させ（例えば固相上に捕獲することにより）、あるいは試験サンプルを固定化形態のAPP基質と一緒にインキュベートする。次に固定化APP基質をAPP基質の一部に対する抗体試薬と反応させることによりタンパク質分解性切断を検出して、APP基質から切断し、又は切断部位を限定する。抗体試薬は、全抗体又はFab又はFab′のような抗原結合部位を含む抗体断片を包含し得るし、モノクローナル型であっても又はポリクローナル型であってもよい。固定化相と結合した抗体試薬の検出は、特徴的タンパク質分解性切断の非存在示す。逆に、固定化相と結合している抗体がないことは、APP切断を示す。抗体試薬の結合の検出は、一般に標識化形態のこのような抗体試薬の使用、あるいは二次又は抗−抗体、即ち標識された抗体の使用を伴う。 APPの捕獲又は固定化は、多数の方法で達成し得る。抗体は、切断可能な断片上にないAPPのエピトープに特異的に産生される。このような抗体を固定化し、使用して無傷面APPを捕獲又は固定化し得る。あるいは、配位子又はハプテンをA PPに共有的に付着させて、対応する固定化受容体又は抗体を用いてAPPを捕獲又は固定化し得る。このために有用な典型的配位子：受容体対は、ビオチン：アビジンである。このために有用なハプテンの例は、フルオレセイン及びジギトキシゲニンである。 APP基質が固定化又は捕獲される固相は、微小滴定プレートウエル、試験管、ストリップ、ビーズ、粒子等を含めた種々の物質から成る。特に有用な固相は、磁性又は常磁性粒子である。このような粒子を誘導化して、簡単な化学反応により種々の化合物と結合し得る化学的に活性な基を含有させることができる。粒子を入れた容器に磁石を近づけて粒子を懸濁液から取り除く。かくしてやっかいな遠心分離又は濾過に依らずに粒子を繰り返し洗浄して、検定手順を十分に自動化するための基礎を提供する。一次又は二次抗体試薬のための標識は、当業界で十分公知のものから選択し得る。このような標識のいくつかは、蛍光又は化学発光性標識、放射性同位元素であり、そしてより好ましくはこのための酵素はアルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼである。これらの酵素は種々の条件下で安定であり、高触媒回転率を有し、簡単な色原性基質を用いて検出し得る。 APP基質のタンパク質分解性切断は、クロマトグラフィー法によっても検出され、APP断片が分離され、次いで検出される。高圧液体クロマトグラフィー（HPL C）はこの点で特に有用である。この方法を用いるに際しては、蛍光標識したAPP 基質を調製する。試験サンプルとともにインキュベーション後、反応混合物をクロマトグラフィーカラムにかけて、蛍光性断片対無傷APPの移動の示差速度を観察する。本発明はさらにAD罹患患者を治療するための方法であって、このような患者に単独の又は非毒性不活性の製薬上許容可能な賦形剤との混和物中のアスパラギン酸プロテアーゼのそのために有効な量の阻害剤を投与することを包含する方法に関する。本発明はさらに、非毒性不活性の製薬上許容可能な賦形剤との混和物中のアスパラギン酸プロテアーゼのこのような阻害剤を含有する製剤処方物に関する。本発明はさらに、用量単位でのこのような製剤処方物を包含する。これは、処方物が個別パーツ、例えば錠剤、糖衣錠、カプセル、カプレット、ピル、坐薬及びアンプルの形態で存在し、その阻害剤含量は分画又は多数回に分けた個々の投与量に対応することを意味する。用量単位は、例えば１，２，３又は４回分に分けた量、あるいは個々の用量の１／２、１／３又は１／４を含有し得る。個別用量は、好ましくは１回の投与で与えられる、そして通常は１日用量の全部、１／２、１／３又は１／４に対応する活性化合物の量を含有する。非毒性、不活性の製薬上許容可能な賦形剤により、固体、半固体又は液体希釈剤、充填剤及び全タイプの処方物補助剤が考えられる。言及し得る好ましい製剤処方物は、錠剤、糖衣錠、カプセル、カプレット、ピル、顆粒、坐薬、溶液、懸濁液及び乳濁液、ペースト、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、散粉及びスプレーである。錠剤、糖衣錠、カプセル、カプレット、ピル及び顆粒は、例えば（ａ）充填剤及び増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及びケイ酸、（ｂ）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルジネート、ゼラチン及びポリビニルピロリドン、（ｃ）湿潤剤、例えばグリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム及び炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液抑制剤、例えばパラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば第四アンモニウム化合物、（ｇ）浸潤剤、例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート、（ｈ）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイト、（ｉ）滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム及び固体ポリエチレングリコール、あるいは上記（ａ）〜（ｉ）に列挙した物質の混合物のような通例の賦形剤に加えて阻害剤を含有し得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、カプレット、ピル及び顆粒は、任意に乳白剤を含有する通例のコーティング及びシェルで提供し得るし、それらが阻害剤のみを又は好ましくは腸管のある部分に、任意に遅延方式で放出し得るような組成物であってもよい。用い得る包埋組成物の例は、高分子物質及びワックスである。阻害剤はさらに微小カプセル封入体形態で、適切な場合には１つ又はそれ以上の上記賦形剤とともに存在し得る。坐薬は、阻害剤の他に、通例の水溶性又は水不溶性賦形剤、例えばポリエチレングリコール、脂肪、例えばカカオ脂肪及び高級エステル（例えばＣ₁₀脂肪酸を有するＣ₁₄−アルコール）、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、阻害剤の他に、通例の賦形剤、例えば動物性及び植物性脂肪、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。散粉及びスプレーは、阻害剤の他に、通例の賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレーはさらに通例の推進剤、例えばクロロフルオロカーボンを含有し得る。溶液及び乳濁液は、阻害剤の他に、通例の賦形剤、例えば溶剤、可溶化剤及び乳化剤、例えば水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油、グリセロール、グリセロールホルマル、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。非経口投与のために、溶液及び乳濁液は血液と等張の滅菌形態であってもよい。懸濁液は、阻害剤の他に、通例の賦形剤、例えば液体希釈剤、例えば水、エチルアルコール又はプロピレングリコール、及び懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカントゴム、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。上記の処方形態は、着色剤、防腐剤、並びに香り−及び風味改良添加剤、例えばペパーミント油及びユーカリ油、並びに甘味剤、例えばサッカリン又はアスパルタムを含有し得る。阻害剤は総混合物の約0.1〜99.5重量％、好ましくは約0.5〜95重量％の濃度で上記の製剤処方物中に存在する必要がある。上記の製剤処方物は多数の阻害剤を含有し得るが、この場合、上記製剤処方物中の阻害剤の総量は、総混合物の約0.1〜99.5重量％、好ましくは約0.5〜95重量％である。本発明の処方物は、本発明の阻害剤に加えて他の活性成分を含有し得る。上記の製剤処方物は、公知の方法により、例えば単数又は複数の活性化合物を単数又は複数の賦形剤と混合することにより、通例の方法で調製し得る。上記の処方物は、経口的に、経直腸的に、経頬的に、非経口的に（静脈内、筋肉内又は皮下に）、槽内に、膣内に、腹腔内に又は局所的に（散粉、軟膏又は滴剤）投与し得る。適切な処方物は、注射液、経口治療様の溶液及び懸濁液、ゲル、ポアーオン処方物、乳濁液、軟膏又は滴剤である。眼科用及び皮膚科用処方物、銀塩及び他の塩、耳用滴剤、眼用軟膏、粉末又は溶液を局所治療に用い得る。さらに、ゲル、粉末、散粉、錠剤、持続性放出錠剤、プレミックス、濃縮物、顆粒、ペレット、カプセル、カプレット、エアゾール、スプレー及び吸入物を用いることができる。阻害剤はさらに、他のキャリヤー物質、例えばプラスチック（例えば局所治療用のプラスチックの鎖）、コラーゲン又は骨セメント中に組み込み得る。作用部位は脳であるため、阻害剤は血管脳関門を通過しなければならない。これには、いくつかの場合には、例えば親液性キャリヤーとの結合により、又は親液性置換基、例えば炭化水素、例えば長鎖アルキル基、アルケニル基、例えばビニル等の導入により、阻害剤の親液性が増大されることが必要である。親液性を増大するためのこのような修飾は、慣用的であって、当業者の技術の範囲内である。例えば、R.B．Silverman，“The Organic Chemistry of Drug Design and D rug Action”，1992，Academic Press，San Diego（この記載内容はすべて参照により本明細書中に含めるものとする）の特に361〜364ページを参照して頂きたい。親液性増大を達成するためのあらゆる慣用的方法が意図される。適切な親液性キャリヤーの例としては、N．Bodor等が創案し、Silverman（同上）が362ページで考察している可逆的酸化還元剤供給系がある。N．Bodor et al.，1983，Pha rmacol．Ther.，19:337；及びN．Bodor，1987，Ann．N.Y．Acad．Sci.，507:289 （これらの記載内容はすべて参照により本明細書中に含めるものとする）も参照のこと。概して、24時間毎に体重１kg当たり約0.5〜500mg／kg、好ましくは５〜100mg ／kgの総量で、適切な場合には何回かに分けて投与する形態で、阻害剤を投与して、所望の結果を達成するのが有益である。個々の用量は、好ましくは約１〜約80mg／kg、特に３〜30mg／kgの量で阻害剤を含有する。しかしながら、言及した用量から逸脱する、特に疾病の性質及び重症度の、処方物の性質の、医薬剤の投与の、並びに投与実施の期間又は間隔の関数としてそうする必要があるかもしれない。したがって、ある場合には、上記量以下の阻害剤で処理に十分であるかも知れないが、他の場合には専門的知識に基づいてあらゆる専門家が上記量の阻害剤を容易に確定し得る。定義本明細書中で用いるアミノ酸の３文字又は１文字での略語を下記に示す：図面の簡単な説明図１ａ〜１ｆは、ADヒト皮質亜分画と比較した場合の対照のペプチダーゼ活性の二次元等値線ブロットを示す。Ｐ−２，Ｓ及びＭ分画のイオン交換（モノ−Ｑ）分離により、実施例１にしたがって亜分画を調製した。Mono−Ｑ分画によるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val- Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）の酵素的切断を実施例３に記載されているように実施した。各ブロットは、同一インキュベーション条件下で各モノ−Ｑ分画（縦座標）のインキュベーションにより得られる各蛍光性物質（横座標）の相対量を示す。物質の量は、等値線により垂直に示す。等値線が多い程、特定の物質の量も多いことを示す。対照Ｓ（ａ）、AD Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、AD Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、AD Ｐ−２（ｆ）からのモノ−Ｑ分画に分析を施した。３つのADプロットの右手縦座標上のローマ数字は、実施例３に記載のプール領域の位置を示し、次に実施例８にしたがってこれを検定すると、有意APP分解活性を含有することが判明した。図２ａ〜２ｆは、AD皮質に由来するＭ，Ｓ、又はＰ−２分画のイオン交換分離からの選択モノ−Ｑに関連したAPP 695分解活性のイムノブロット分析を示す。プールは、実施例３に記載されているようなペプチダーゼ活性のそれらの含量を基礎にして作った。イムノブロット検定は、実施例８に記載されているように実施した。以下のプールに関する代表的検定を示す：図２ａ：Ｐ−２プールＶに関連した活性： APPは、レーン２〜６の各々に認められた。PMTI 73からのＣ−100（レーン１）、無Ｐ２−Ｖブランク（レーン２）、Ｐ２−Ｖ（レーン３）、Ｐ２−Ｖ＋EDTA（レーン４）、Ｐ２−Ｖ＋メタノール（レーン５）、及びＰ２−Ｖ＋メタノールに溶解したペプスタチンＡ（レーン６）。図２ｂ：ＭプールIIIに関連した活性：APPは、レーン２〜７に認められた。 PMTI 73からのＣ−100（レーン１）、Ｍ−III＋シスタチンＣ（レーン２）、Ｍ −III＋アプロチニン（レーン３）、Ｍ−III＋カプトプリル（レーン４）、Ｍ− III＋EGTA（レーン５）、Ｍ−III＋Ｎ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-As p-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）（レーン６）、阻害剤を伴わないＭ−III（レーン７）、及び予染分子量マーカー（レーン８）。図２ｃ：ＳプールＩに関連した活性： APPは、レーン２〜６の各々に認められた。Ｓ−Ｉ＋Ｎ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-net-Asp-Ala-Glu-Phe-Ar g-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）（レーン２）、Ｓ−Ｉ＋EGTA（レーン３）、Ｓ−Ｉ＋カプトプリル（レーン４）、Ｓ−Ｉ＋アプロチニン（レーン５）、Ｓ−Ｉ＋シスタチン（レーン６）、及びPMTI 73からのＣ−100（レーン７）。レーン１は予染分子量マーカーを含有する。図２ｄ： AD Ｐ−２の分離からの個々のモノ−Ｑ分画中で回収した活性：Ｐ−２プールVIIが他所で観察される伝導領域に対応するモノ−Ｑ分画38〜43を個別にAPP分解活性に関して調べた。各分画に関しては、組換え体APP 695の非存在下（−）又は存在下（＋）の両方でインキュベーションを実施した。分画番号は、図２上に記してある。使用したＣ−100基準は、PMTI 100からのものであった。Mrは分子サイズマーカーを示す。図２ｅ： PMTI 73又はPMTI 100により向けられるＣ−100生成物の移動位置の比較：PMTI 73（レーン１及び３）及びPMTI 100（レーン２及び４）のタンパク質生成物を分子マーカー（レーン５）と比較して示す。図２ｆ：生成物形成の典型的時間経過：APP＋Ｍ−IIIを、ｔ＝０時間（レーン１）、５時間（レーン２）、20.5時間（レーン３）、44.5時間（レーン４）及び55時間（レーン５）に分析した。分子量マーカー（レーン６）、Ｃ−100 PMTI 73（レーン７）及びＭ−IIIを伴わないAPP（レーン８）を示す。上記図２ａ〜２ｆの各々に関しては、移動は上から下までであった。２ｅ〜２ｄ及び２ｆでは、上実線矢印はホロAPPの移動位置を示し、下実線矢印はＣ−100 の移動位置を示す。図２ｄでは、二重線矢印は酵素により生じたＣ−100断片の推定上のオリゴマーの移動の位置を示す。全阻害剤の濃度は後述の表４に列挙する。図３ａ及び３ｂは、ゲル濾過によりＰ−２ VIIプールをさらに精製した結果を示す。図３ａ：モノ−Ｑ10/10クロマトグラフィーからのＰ２プールVII分画をプールし、0.25mlに濃縮して、150mM NaClを含有する10mM Tris-HCl緩衝液pH7.5中で平衡させた縦配列の２つのSuperose 6HR 10/30カラムに適用した。0.3ml／分の流速で溶離を実施し、カラム溶離液を280nmでモニタリングした。分画（0.24ml ）を収集し、イムノブロットを用いてペプチダーゼ活性及びAPP分解検定を施した。矢印は、APP分解活性が回収されたクロマトグラムの領域の位置を示す。Ｋ −Ｍ（黒丸）及びＭ−Ｄ（白丸）結合切断に関連したペプチダーゼ活性も示す。クロマトグラフィーは22℃で実施した。図３ｂ：公知の分子量を有する指示標準タンパク質に対するAPP分解活性の移動を用いて、実施例８に列挙したAPP分解プロテアーゼのMr見掛けを算出した。図４は、ベータアミロイドペプチドに対して生じたネズミ類モノクローナル抗体のペプチドエピトープマッピングを示す。微小滴定プレートを合成APP 695（5 97〜638）（ベータアミロイド１〜42）50ngで覆い、遮断して、次に予インキュベート（室温で６０分）した１00μｌのＣ286.8Ａ（80ngのIgG）とともに指示濃度の競争相手ペプチドの存在下又は非存在下でインキュベートした。ペプチド１〜７はペプチド配列番号：１と呼ばれることに留意。室温で60分インキュベーション後、プレートを洗浄し、結合抗体の量を、標準手法（Wunderlich et-al.，1 992，J．of Immumol．Methods，147:1）にしたがってホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗マウスポリクローナル抗体で展開することにより確定した。プレートに結合する抗体の％競合（％Ｃ）を、以下の等式を用いて450nmでの吸光率データから算出した：図５：ヒト脳Ｐ−２亜分画の精製からのイオン交換分画で回収されたAPP 69 5プロセッシング活性。123分画すべてをカラムから収集した。最初の32分画は負荷及び洗浄相に対応した。塩勾配は分画33で開始した。分画３〜18（パネルａ）、21〜32（パネルｂ）、33〜38（パネルｃ）及び39〜44（パネルｄ）のスクリーンを示す。各分画に関して、APP 695基質の非存在下（−）及び存在下（＋）でインキュベーションを実施した。０又は24時間に関するAPP 695のインキュベーションは、適切な場合には位置を示す。インキュベーションは以下のように実施した：バキュロ由来ホロAPP 695（80nm ）を、100mM Mes緩衝液pH6.5，0.008％（ｖ／ｖ）Triton X-100，160mn NaCl，6 .7mM Tris（APPストックから）を含有する総量15μｌ中の各カラム分画５μｌとともにインキュベートした。SDS-PAGEサンプル緩衝液を付加することにより24時間後に反応を終了させた。実施例８に記載されているように、実施例６のＣ末端ポリクローナル抗血清を用いてイムノブロットを展開させた。矢印は生成断片の位置を示す。分画45〜86も調べたが、しかし相対的に低い活性しか示さなかった（したがって図示していない）。ピークＡ及びＢは、主要活性の位置を示す。図６は、ゲル濾過におけるＰ−２由来APP分解活性の精製結果を示す：カテプシンＤの溶離との相関。パネル（ａ）Superose 6HRカラム上でのＰ−２ピークＢの精製に関する280nm溶離プロフィール。パネル（ｂ）及び（ｃ）実施例５に記載されているようにして必然的に確定される溶離分画49〜60における対応するAP P C末端プロセッシング活性。矢印は主要生成帯の位置を示す。パネル（ｄ）及び（ｅ）カテプシンＤ（１／300希釈液）に対するウサギポリクローナル抗体を用いた溶離分画のイムノブロット分析。矢印は免疫反応帯の移動位置を示す。ヒト肝臓カテプシンＤも比較のために分析した。図７は、Ｐ−２亜分画から単離されたプロテアーゼ活性のプロテアーゼ阻害剤特異性を示す。反応（32μｌ）はAPP付加により37℃で開始して、その後の初期成分条件を達成した：ゲル濾過の15〜25kDa領域からのＰ−２酵素（2.54μｇ／m l）分画（図６）；96mM Mes緩衝液pH6.5中のAPP（168nM）。15μｌの３ｘサンプル緩衝液を付加することにより26時間後に反応を終了させて、APP C末端に対するウサギポリクローナル抗血清の１／1000希釈液を用いてイムノブロット分析した。以後の阻害剤付加の効果を示す；阻害剤無含有（レーン７及び20）、１mM EDTA（レーン５）；エタノール中の400μＭ PMSF（レーン９）；エタノール単独（レーン11）；100μＭＥ−64（レーン13）；10μ ｇ／mlアプロチニン（レーン22）；DMSO中の100μＭペプタチンＡ（レーン26）；DMSOのみ（レーン24）。０時間（レーン２及び30）及び26時間（レーン３及び 28）のAPPインキュベーションの効果も示す。レーン４，８，12，19，23及び27 はＣ−100標準を含有した。予染分子量マーカーはレーン１及び29に存在する。1 8及び28kDaのＣ末端生成物断片の位置を矢印で示す。図８は、APP C末端ドメインに対する抗体を用いてモニタリングしたカテプシンＤ触媒APP切断の時間経過を示す。パネル（ａ）は、86μＭペプスタチンＡの非存在下（レーン10〜14）又は存在下（レーン４〜８）でのカテプシンＤによる APPタンパク質分解の時間経過を示す。APPは単独でも（レーン１〜３）インキュベーションした。数値は反応開始後の時間（時間）を示す。反応は、APPを付加することにより37℃で開始し、以下の初期成分濃度を達成した：MeS緩衝液pH6.5 中のAPP（82nM）、カテプシンＤ（9.2μｇ／ml）、ペプスタチンを含有しないサンプルには、同量の溶媒（1.3％ｖ／ｖメタノール）を入れた。ｔ＝０，43，84 ，140及び215分で、アリコート（15μｌ）を除去して7.5μｌのSDS-PAGEサンプル緩衝液と混合し、APP C末端ドメインに対するウサギ抗血清を用いてイムノブロット分析した。18及び28kDaの反応生成物の位置を矢印で示す。図９は、Ｐ−２由来酵素又はカテプシンＤによるAPP C末端プロセッシングのp H及びイオン強度依存性を示す。バネル（ａ）は、カテプシンＤ及びＰ−２酵素で観察されたpH依存性を示す（ピークＢ、図５、ゲル濾過クロマトグラフィー後、図６）。パネル（ｂ）は、pH6.5での両酵素に関するイオン強度依存性を示す。反応は、酵素付加により3 7℃で開始し、以下の初期成分濃度を達成した：カテプシンＤ（9.2μｇ／ml）又は図６からのＰ−２酵素（11.7μｇ／ml）、酢酸ナトリウム、MeS及びTris-HCl の各々中に100mM、及び精製APP（79nM）。ｔ＝０及び３時間で、アリコート（15 μｌ）を除去して7.5μｌの３ｘサンプル緩衝液と混合し、実施例８にしたがってＣ末端ポリクローナル抗血清を用いてイムノブロット分析した。28，18及び14 kDaの反応生成物の位置を矢印で示す。図10は、Superose 6HR上でさらに精製後のカテプシンＤ及びＰ−２酵素（ピークＢ、図５）によるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe- Arg-NH₂（配列番号：７）の切断を示す。反応を酵素／阻害剤付加により37℃で開始し、それにより以下のｔ＝０成分濃度を達成した：酢酸塩、MeS及びTris pH 5.0の各々中に130mMを包含するカクテル緩衝液中にカテプシンＤ（2.8μｇ／ml ）又は図６からのＰ−２酵素（17.5μｇ／ml）、Ｎ−ダンシル−ペプチド（58μ Ｍ）、カプトプリル（0.3mM）。サンプルはペプスタチンＡ（３％ｖ／ｖ最終メタノール中に213μＭ）又は最終的に等濃度のメタノールのみを含有した。０，２，４，８及び24時間で、12％（ｖ／ｖ）TFA（10μｌ）を付加して反応を終了させて、実施例２及び３にしたがってHPLC分析を施した。以下のものに関する代表的痕跡を示す：Ｐ−２酵素、ｔ＝０時間（パネルＡ）；Ｐ−２酵素、ｔ＝24時間（パネルＢ）；Ｐ−２酵素＋ペプスタチンＡ、ｔ＝24時間（パネルＣ）；カテプシンＤ、ｔ＝０時間（パネルＤ）；カテプシンＤ、ｔ＝24時間（パネルＥ）；及びカテプシンＤ＋ペプスタチンＡ、24時間（パネルＦ）。図11は、カテプシンＤ及びＰ−２酵素（ピークＢ）によるＮ−ダンシル−Ile- Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH₂（配列番号：７）切断のpH依存性を示す。反応条件は本質的に図10に記載されているとおりであったが、但しカクテル緩衝液は指示pH値に調整し、インキュベーション時間はＰ−２酵素に関しては23時間、カテプシンＤに関しては５時間であった。（ａ）カテプシンＤによる切断、及び（ｂ）Ｐ−２酵素による切断。-Glu-Val- （黒丸）及び-Met-Asp-（白丸）結合での切断率を各場合で示す。図12は、カテプシンＤによるAPPの予備的消化からの反応生成物のSDS-PAGE分析である。パネル（ａ）は帯切断前のコーマシーcoomassie染色したエレクトロブロットの写真であり、パネル（ｂ）は、帯切断後の対応するブロットであり、パネル（ｃ）はパネル（ａ）及び（ｂ）に示したものに対する一連の平行する反応の対応するイムノブロット分析（モノクローナル286.8Ａの１／100希釈液）である。（ａ）における反応は、基質付加により37℃で開始して、それにより以下の初期成分濃度を達成した：30mM NaClを含有する40mM酢酸ナトリウムpH5.0中に APP（15.6μＭ）、カテプシンＤ（0.17μＭ，7.145μｇ／ml）。ｔ＝16時間で、反応混合物を高速真空により15μｌに濃縮し、7.5μｌの３ｘサンプル緩衝液と混合し、SDS-PAGE処理した。（ｃ）における反応は、本質的に同一方法で実施したが、但しAPP濃度は3.2μＭに下げた。両実験（ａ及びｃにおける）に関しては、完全インキュベーション系を用いて（レーン３）、カテプシンＤの非存在下で（レーン４、同一緩衝液付加直後にカテプシンＤをあらためて加えた）実施した。各場合のレーン５は、カテプシンＤのみの対照を含有し、一方レーン６は移動基準として精製APPを含有した。予染分子量マーカーはレーン１に存在する。（ｃ）では、主要免疫反応生成物の位置を矢印で示す。図13は、ベータアミロイドのＮ末端に対するモノクローナル抗体を用いてモニタリングしたカテプシンＤ触媒APP分解の時間経過を示す。APP付加により37℃で反応を開始して、それにより以下の初期成分濃度を達成した：83mM酢酸ナトリウムpH5.0中にAPP（448μＭ）、カテプシンＤ（30μ Ｍ）、含有する場合にはペプスタチンＡ（97.2μＭ）。指示時点で、アリコート（20μｌ）を取り出して、10μｌの３ｘ SDS-PAGEサンプル緩衝液と混合し、モノクローナル抗体286.8Ａ（1／100）を用いてイムノブロット分析した。反応はペプスタチンＡ（メタノールに溶解して供給）の非存在下（−）で又は存在下（＋）で実施した。サンプルにはすべて2.7％（ｖ／ｖ）メタノールを入れた。レーン１及び12は予染Mrマーカーを含有した。レーン10及び18はＣ−100 Mrマーカーを含有した。レーン11及び13はカテプシンＤを含まずにそれぞれ０及び21時間インキュベートしたAPPを含有した。主要生成物断片を矢印で示す。図14は、カテプシンＤ及びＰ−２由来酵素（ピークＢ）による合成ペプスタチンの加水分解の時間経過におけるアミノ酸置換の効果を示す。反応を基質付加により37℃で開始して、以下の初期成分濃度を達成した：Tris，MeS及び酢酸塩緩衝液pH5.0の各々中の135mM緩衝液中にカテプシンＤ（2.5μｇ／ml）又はＰ−２ピークＢ酵素（7.5μｇ／ml）、Ｎ−ダンシル−ペプチド（58μＭ）、カプトプリル（0.3mM）で、ペプスタチンＡ（213μＭ）、塩化ナトリウム（75mM）を含有してもよい。種々の時点でアリコート（30μｌ）を取り出して、TFA中で12.5％に調整して、RP−HPLC分析した。その後の基質／プロテアーゼ組合せに関する加水分解の時間経過を示す：（ａ）カテプシンＤによるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala- Glu-Phe-Arg-NH₂（配列番号：７）；（ｂ）カテプシンＤによるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala- Glu-Phe-Arg-NH₂（配列番号：３）；（ｃ）Ｐ−２酵素（ピークＢ、図５、ゲル濾過後、図６）によるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH₂（配列番号：７）；（ｄ）Ｐ−２酵素（ピークＢ、図５）によるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val- Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH₂（配列番号：３）。Ｅ−Ｖ結合（矩形、パネルＡ及びＣ）、Ｍ−Ｄ結合（中黒菱形、Ａ及びＣ）での、又は保持時間4.4分で代謝生成物を生じるため（Ｂ及びＤ）の切断を示す。図15は、アプロチニンセファロース上での可溶化Ｐ−２分画の精製を示す。実施例１にしたがって実験を実施した。（ａ）は典型的Ａ280nm溶離プロフィールであり、そして（ｂ）は溶離分画におけるAPPプロセッシング活性に関するイムノブロット検定（APPのＣ末端ドメインに対するウサギ抗血清）である。矢印は主要APP分解生成物の移動を示す。酸性溶離からの分画８〜13における破壊生成物の出現に留意。図16は、モノ−Ｑ上のＰ−２由来アプロチニン結合プロテアーゼの精製を示す。（ａ）はＡ280nm溶離プロフィールであり、そして（ｂ）は検出のためにウサギ抗Ｃ末端APP抗血清（１／1000希釈液）を用いた溶離分画の活性を示し、そして（ｃ）はMab 286.8Ａ（1.61mg／ml精製IgGの／100希釈液）を用いた溶離分画の活性を示す。３つの矢印は、11，14及び18kDa Ｃ末端APP分解生成物の移動を示す。図17は、プールＹセリンプロテアーゼにより触媒されるAPP分解のpH及びイオン強度依存性を示す。パネル（ａ）は、pH依存性を示す。37℃で反応を開始して、以下のｔ＝０成分濃度を達成した：指示pHに調整した酢酸塩、nes及びTrisの各々中に32mMを包含するカクテル緩衝液中のプールＹプロテアーゼ（図16からの５μｌの分画16）、APP（38nM）。反応混合物（16μｌ）は、7.5μｌの３ｘサンプル緩衝液を付加することにより２時間後に反応を終結した。本質的には実施例８に記載の通りに、APP C末端ドメインに対するウサギポリクローナル抗血清を用いて、イムノブロットを展開させた。レーン１及び12は予染Mrマーカーを含有した。レーン９はＣ−100を含有し、レーン10及び11はプールＹを含まずにpH6.5 でそれぞれ０及び３時間インキュベートしたAPPを含有した。パネル（ｂ）は、イオン強度依存性を示す。反応は本質的に（ａ）と同様に実施したが、但し緩衝液は指示モル濃度の塩化ナトリウムを含有する95mM MeS pH6.5であった。プールＹの非存在下（レーン２〜７）又は存在下（レーン９〜14）でのAPP切断を、各濃度の塩化ナトリウムに関して示す。レーン１及び８はそれぞれMrマーカー及びＣ−100基準を含有した。矢印は11，14及び18kDaのAPP断片の移動を示す。図18は、プールＹプロテアーゼの阻害剤選択性を示す。酵素付加により37℃で反応を開始して、16μｌの容量中の以下の初期成分濃度を達成した：30mM Mes緩衝液pH6.5中のsuperdex 75カラム上での精製後のプールＹ＃３〜５（14μｇ／ ml）、APP（35nM）。7.5μｌの３ｘサンプル緩衝液を付加することにより反応を終結させた。実施例８にしたがって、APP C末端ドメインに対するウサギ抗血清を用いて、イムノブロットを展開させた。以下の阻害剤に関するデータを示す：パネル（ａ）メタノール中の860μＭ PMSF（レーン４）、メタノール中の400μ Ｍペプスタチン（レーン６）、５mMベンズアミジン（レーン８）、350μＭＥ −64（レーン９）、7.7mM EDTA（レーン10）、15μＭアプロチニン（レーン11）、及び0.1％（ｗ／ｖ）デオキシコレート（レーン15）。以下の対照も処理した：阻害剤無含有（レーン12）、エタノール（レーン３）、メタノール（レーン５）、プールＹのみ（レーン２）、０時点での（レーン13）及び４時間目（レーン 14）のAPPのみ。レーン１及び７はそれぞれ予染Mrマーカー及びＣ−100標準を示す。パネル（ｂ）1.8μＭアルファ−１−抗キモトリプシン（レーン２）、156μＭTLCK（レーン３）、46μＭキモトリプシン阻害剤Ｉ（レーン４）、119μＭキモトリプシン阻害剤II（レーン５）、４μＭアルファ−２−抗血清（レーン６）、51μＭアルファ−１−抗トリプシン（レーン７）、DMSO中に投与される98μＭキモスタチン（レーン10）、15 3μＭメタノール性TPCK（レーン12）。対照を以下に示す：阻害剤無含有（レーン８）、DMSO（レーン11）、及びメタノール（レーン13）。予染分子量マーカー及びＣ−100標準をレーン１及び９にそれぞれ適用した。矢印は11，14及び18kDa のAPP分解生成物を示す。図19は、１）DMSOもDMSO＋10μＭペプスタチンＡもHEK293細胞の成長に影響を及ぼさず（パネルＡ）、２）DMSO＋ペプスタチンＡで処理した後期対数相培養から収穫した条件付きの培地は、DMSOのみで処理した培養より有意に低いレベルの 15kDa APP C末端断片を示す（パネルＢ）。パネルＡ HEK293細胞（ATCC CRL 157 3、懸濁培養に適している）を、MoAb培地（JRH Bioscience，Lenexa，Kansas）＋0.2％ｖ／ｖウシ胎児血清400ml（中黒矩形）を含入するローラーボトル中に植えつけた。別のローラーは0.01％ｖ／ｖDMSO（中白矩形）又は0.01％DMSO＋10μ ＭペプスタチンＡ（中黒菱形）を含入した。細胞増殖は、５％ CO₂／95％大気中で37℃であった。トリパンブルー処理サンプル中の生育可能細胞数を血球計で定量し、時間により一定パーセンテージ（60％）であった。対数相の終了時（７日目に矢印で位置を示した）に条件付き培地を収穫して、BeckmanGs−６ベンチトップ遠心分離器中で1500RPMで遠心分離して、固定化抗ベータアミロイドモノクローナル抗体（C286.8A）のカラム上でクロマトグラフィー処理した。パネルＢウサギ抗APP C末端抗血清を用いたイムノブロット。レーン１予染分子量マーカー；レーン２〜７は、DMSO処理細胞からの培地の精製からの分画１〜６のそれぞれの分析である；レーン９〜14はDMSO／ペプスタチンＡ処理細胞からの培地の精製からの分画１〜６のそれぞれの分析である。レーン８はＣ−10 0標準を含有し（実施例５，PMTI 100から）、そしてレーン15は実施例７の方法２により精製した組換え体ホロAPP 695を含有した。DMSOのみ処理からの分画５及び６は、DMSO／ペプスタチンＡ処理における対応する分画からは存在しない15 kDa帯を含有した。さらに詳しくは実施例12の本文に記載されている。図20は、APPプロセッシング活性を有するアスパラギン酸プロテアーゼのヒト脳からの精製を要約する。ａ）モノ−Ｑ HR10／10カラム上での可溶化Ｐ−２分画（140mgタンパク質）の精製に関する溶離プロフィール。タンパク質濃度（白丸）、伝導（破線）及び10μＭペプスタチンＡの非存在下（黒丸）又は存在下（白三角）でのＮ−ダンシル−ISEVKMDAEFR−NH₂からのＮ−ダンシル−ISEを、各収集分画に関して示す。ｂ）MAb 286.8Ａを用いたAPP加水分解に関するイムノブロット検定：レーン１Ｃ−100標準；レーン２単独でインキュベートした１（ｂ）からのプール分画24〜45（４℃で2.0〜5.3mmho）；レーン３ APPとともにインキュベートしたプール分画；レーン４プール分画＋APP＋10μＭ最終ペプスタチンＡ。矢印は生成物断片を示す。ｃ）競合的EIAによるMAb 286.8 Ａのエピトープマッピング。ヒトAPP 695のアミノ酸645〜695を含有するペプチド、ベータアミロイドの他の指示セグメントのＮ−ダンシル−ISEVKMDAEFRHDDDD （１〜７）を、C286.8Aと免疫原との結合を遮断する能力に関して試験した。ベータアミロイド１〜42，１〜28，１〜16及びＮ−ダンシル−ISEVKMDAEFRHDDDD（１〜７を含有）はC286.8A結合用量を依存的に阻害し、一方12〜28，25〜35及び645〜69 5は阻害せず、したがってC286.8Aに関する反応性エピトープをＡ４領域のＮ末端７アミノ酸に局在化した（APP 597〜603）。ｄ）カテプシンＤに対するウサギポリクローナル抗体の１／300希釈液を用いた活性分画のイムノブロット分析。 APPプロセッシング：31μｇ／mlの均質ホロAPP 695（実施例７の方法２にしたがって調製）を酢酸塩、Mes及びTris pH4.0，0.002％（ｖ／ｖ）Triton X-100及び30mM外生NaClの各々中に40mMを含有する総量15μｌ中の５μｌの各カラム分画とともにインキュベートした。SDS-PAGEサンプル緩衝液を付加して最終的に１ｘとして反応を24時間後に終了させて、10〜20％アクリルアミド勾配トリクリンゲル（Novex）上で100Ｖに一定に保って電気泳動し、次いでProblott膜（Applied Biosystems）上で電気プロティング処理した。アルカリ性ホスファターゼと結合した適切な二次抗体を用いて標準サンドイッチ法により、ブロットをモノクローナル抗体C286.8Aを用いて最終50μｇ／mlで展開した。組換え体Ｃ−100を本方法に記載されているように調製した。ペプチダーゼ：カラム分画のアリコート（20μｌ）を10μｌの反応混合物に加えて以下の初期成分濃度を達成した：50mM酢酸ナトリウムpH５を包含するカクテル緩衝液中に合成Ｎ−ダンシル−ISEVKMDAEFR−NH₂（58μＭ）、カプトプリル（ 0.2mM）、メタノール（0.3ｖ／ｖ）、及び含まれている場合にはメタノールに溶解したペプスタチンＡ（10μＭ）。40μＭペプスタチンＡ 10μｌの付加により、24時間後に反応を停止させた。酵素的生成物を検出し、RP−HPLCにより定量した（実施例２）。図21は、ヒトカテプシンＤに対する固定化抗体が溶液からヒト脳APP分解活性を選択的に除去することを示す。ａ）対照（実線）及び抗カテプシンＤ（破線）カラムに関するＡ280nm溶離プロフィール。番号を振った矢頭は以下を示している：１付加の開始；２平衡緩衝液で洗浄；３ 100mMグリシンpH2.2で溶離；４ 50mM塩酸ジエタノールアミンpH11で溶離；５ 100mMグリシン，0.5％（ｖ／ｖ）Triton X-100で溶離。ｂ）APPプロセッシング活性を、抗CD（＋）又は対照（−）からの選択無効分画（１〜27）に関して、並びにアプリセート（Ｑプール）、精製カテプシンＤ（CD）又はAPP単独に関して示す。APP加水分解活性は、分画40より上では検出されなかった。ｃ）21倍に濃縮した又はカテプシンＤに対するポリクローナル抗体に向けてグリシン／トリトン溶離物（分画80〜89、８倍に濃縮）をプールした流動分画９のイムノブロット反応性。濃縮は10％（ｖ／ｖ）TCAを用いた沈殿により行なった。クロマトグラフィー：記載（T.T．Ngo et al.，1992，Chromatography，597:1 01）の通りに強ALクロマトグラフィーにより対照及び抗カテプシンＤウサギ抗血清を精製し、標準方法（R．Axen et a1.，1967，Nature，214:1302）によりCnBr 活性化セファロース４Ｂ（Pharmacia）と結合させた。APPプロセッシング活性を含有した図21ｂからの等量（44mlの100mM NaClを含有する110mM重炭酸ナトリウムpH8.1中に4.1mgタンパク質）のプール分画を固定化抗カテプシンＤ IgG又は固定化対照IgGの同サイズカラム（4.2ml樹脂）に平行して適用した。カラムを各々、500mlのNaClを含有する28mlの100mM NaHCO₃ pH8.3，28mlの100mMグリシンpH2. 5，40mlの50mM塩酸ジエタノールアミンpH11、及び最後に0.5％（ｖ／ｖ）Triton X-100を含有する30mlの100mMグリシンpH2.5で引き続き洗浄した。産又は塩基中に回収された分画をTrisで中和した。0.5ml／分の流速でクロマトグラフィーを実施して、２mlの分画を全体で収集した。全操作は４℃で行なった。 APPプロセッシング：均質ハロAPP 695（最終31μｇ／ml）を酢酸塩、Mes及びT ris pH4.0，0.002％（ｖ／ｖ）Triton X-100及び40mM外生NaClの各々中に40mMを含有する総量15μｌ中の５μｌの各カラム分画とともにインキュベートした。SD S-PAGEサンプル緩衝液を付加して反応を24時間後に終了させて、モノクローナル抗体286.8Ａで展開させたイムノブロットにより分析した。矢印は生成物断片を示す。高度精製ヒトカテプシンＤは、最終1.27μｇ／mlで酵素的インキュベーション中に存在した。図22は、カテプシンＤに対する固定化抗体がAPP類似ペプチドを分解するヒト脳ペプチダーゼを吸着する個とを示す。ａ）及びｂ）Ｎ−ダンシル−ISEVKMDA EFR−NH₂の分解における流動分画及びプール化グリシン／トリトン溶離物（分画 80〜89、図21ａ、21倍に濃縮）中のそれぞれのペプチダーゼ活性。ｃ）及びｄ）Ｎ−ダンシル−ISEVNLDAEFR−NH₂加水分解に関する対応するデータ。ａ）では、流動分画のＥ−Ｖ加水分解活性（丸）を示す。ｃ）では、Ｌ−Ｄ加水分解を示す。結合対照（中黒記号）又は抗カテプシンＤ IgG（中白記号）を含有するカラムから回収された分画からの活性を示す。三角形は、インキュベーション終了時に残存する議論の余地のない基質の量に及ぼす10μＭペプスタチンＡの効力を示す。ｂ）及びｄ）では、ペプスタチンＡの非存在下（中白棒グラフ）又は存在下（中黒棒グラフ）で活性を測定した。方法：カラム分画（20μｌ）の付加により37℃で反応を開始して、30μｌ中の以下の初期成分濃度を達成した：酢酸塩、Mes及びTris pH5.0の各々中に40mM を含有するカクテル緩衝液中のペプチド基質（58μＭ）、カプトプリル（0.28mM ）、メタノール（0.1％ｖ／ｖ）。含まれる場合、ペプスタチンは最終濃度10μ Ｍである。最終10μＭペプスタチンＡの付加により20時間後に反応を終了させて、実施例２にしたがってＣ−10，RP−HPLC分析を施した。図23は、初期割当が表５に報告されているために、なされたカテプシンＤによるAPP 695の加水分解から生成されたベータアミロイド断片の配列割り当ての更新された要約を示す。ａ）イムノブロット（図12Ｃから得たイムノブロットレーン：レーン１ βAPP 695のみ；レーン２ βAPP 695＋CD）上でのC286.8A免疫反応性に対するβAPP由来断片のＮ末端配列。矢印は、イムノブロット帯と、C 286.8Aエピトープを含有するに十分な配列及びサイズを有するシーケンシングブロットの対応するセグメントにおいて同定された断片とを結びつける。下部のケースの文字は、不定配列割当を意味する。APP 695アミノ酸ナンバリングは、kan g等（1987，Nature，325:733）に依る。ｂ）C286.8Aエピトープを含有する（斜線入り）又はしない（中白）全回収断片を含むベータAPP 695断片化パターン。各断片の長さは、断片当たりの残基の概算数に比例して描かれ、指示断片サイズ（SDS-PAGE）から算出され、平均残基質量は110であると思われた。いくつかの断片サイズに及ぼすグリコシル化の潜在的作用は、説明されない。成熟βAPP 695（影を付けたセグメント）中のβAPの位置も示す。ｂ）では、加水分解された結合は、βAPP 695残基に対応した：122〜123（Ｆ−Ｖ）；303〜304（Ｙ−Ｌ）；405〜406（Ｌ−Ｑ）；459〜460（Ｌ−Ｒ）；532〜533（Ｌ−Ｐ）；549〜550 （Ｆ−Ｇ）；593〜594（Ｅ−Ｖ）。方法：実施例12に記載されているように反応を実施した。完全インキュベーションに特異的な断片を含有する、又は平行イムノブロットにおけるCD−依存性免疫反応帯と同時移動するコーマシー染色した電気ブロットのセグメントを切り出し、次いで気相においてApplide Biosystems 477Ａ型タンパク質シーケンサー上でシーケンシングした。80％のβAPPをより小さな断片に加水分解した。12.7 pmolの検出可能なＮ末端配列を産生するのと平衡するβAPPの量をゲルに適用した。本発明の詳細な説明以下の実施例で本発明をさらに詳しく説明する。実施例１．ヒト脳プロテアーゼ単離プロテアーゼ単離のために、２つの一般的アプローチを取った。初期の研究では、下記の“方法１”に記載したようにして脳プロテアーゼ活性を単離した。その結果生じるイオン交換クロマトグラフィーから得られた酵素活性の特性表示を実施例３及び８に記載し、組換え体CHO細胞由来APPを分解できる（実施例８）がしかしペプチダーゼとして相対的に不活性である（実施例３）６つの異なる活性の同定がなされた。６つの活性の内の１つはその後カテプシンＤと同定され（実施例９）、ゲル濾過上でのそのクロマトグラフィーによりさらに特徴表示された。アフィニティー精製を試みるための代替アプローチにおいて、実施例８（表４）、“方法２”に記載のヒト脳セリンプロテアーゼのいくつかを実行した。この手法は、初期段階でアプロチニンセファロースを用いたセリンプロテアーゼのアフィニティー精製を基礎にし、APP C末端プロセッシングに関する能力を示すセリンプロテアーゼ（実施例10）の同定を成す。方法１：（ｉ）亜細胞（sub-cellulor）分別４名の別々の年齢に見合ったAD患者からのヒト前頭皮質極９領域の切片を凍結（−70℃）しながら計量し、４℃で0.32 Ｍのスクロース150mlに加えて、鋏で細切した。バッチ中で100ml Elvehjemガラステフロン陶器を用いて懸濁液を均質化した（10リターンストローク）。併合ホモジネートをSorval SS-34ローター中で遠心分離した。密でないペレットを取り出して、再均質化し、上記のように遠心分離した。各抽出のための上清を併合し、Sorval SS-34ローター中で15,000ｇで30分遠心分離した。その結果生じた“Ｐ−２”ペレットを攪拌しながら100mlの氷冷0.32Ｍスクロース中に再懸濁し、−70℃で保存した。最後の回転からの上清を15,000ｇで 60分遠心分離して上清又は可溶性分画（“Ｓ”）、及びミクロソーム分画（“Ｍ ”）を産生して、これを60mlの0.32Ｍスクロース中に再懸濁した。Ｓ及びＭはともに−70℃で保存した。（ii）可溶化膜性対照又はAD亜分画（Ｐ−２又はＭ）を以下の条件を調整して可溶化した：50mM Tris-HCl緩衝液pH7.5を含有する２％（ｖ／ｖ）Triton X -100。４℃で3.5時間攪拌後、懸濁液をBeckman 70 Tiローター中で105,000ｇで6 0分遠心分離した。以下の最終タンパク質濃度をＰ−２（3.9〜4.0mg／ml）；及びＭ（1.4〜1.6mg／ml）に関する可溶化に用いた。可溶化上清を後に使用するために−70℃で保存した。可溶性分画は洗剤では処理しなかったが、しかしストック１Ｍ緩衝液の付加によりTris-HCl pH7.5中に50mMに調整した。（iii）イオン交換クロマトグラフィー 50ml Rheodyneステンレス製ループインジェクター7125型を備え、モノQ HR10／10カラム（Pharmacia，Piscataway ，NJ）に接続したGilson勾配液体クロマトグラフ（305及び306型ポンプ）を用いてクロマトグラフィーを実施した。Pharmacia UV-M検出器及びKippen-zonenチャートレコーダーを用いて、280nmでカラム溶離液の吸光度をモニタリングした。Ｐ−２、ミクロソーム（Ｍ）又は可溶性（Ｓ）タンパク質分画をカラム上に載せ、２ml／分の流速で、50mM Tris-HCl pH7.5で平衡させた。次にカラムを、溶離液中のＡ280nmがゼロに低減し、その時点でカラム流速が４ml／分に増大するまで平衡緩衝液で洗浄した。タンパク質を以下のように溶離した：溶媒：Ａ＝50mM Tris-HCl pH7.5 Ｂ＝50mM Tris-HCl pH7.5（１Ｍ NaCl含有）計画：０〜50％Ｂ 70分間 50％Ｂを10分間保持 50〜100％Ｂ 10分間 100％Ｂを10分間保持再平衡４ml分画をクロマトグラフィー全体で収集した。以下のタンパク質付加を１回のカラム処理当たり適用した：Ｐ−２ 97mg（対照）及び95mg（AD）；Ｓ 50mg （対照）及び68mg（AD）；並びにＭ 36mg（対照）及び31mg（AD）。初期研究では、Ａ280nm、総タンパク質（Bradford検定）及びペプチダーゼ活性に関して溶離分画をモニタリングした（実施例２及び３に記載されているように）。ペプチダーゼ活性を基礎にして作ったプールを次に調製し（実施例３）、 CHO細胞由来APP C末端的に処理するそれらの能力に関して試験した（実施例８に記載）。しかしながら、さらなる試験のすべてにおいて、バキュロウイルス特定発現により得られる組換え体APPのＣ末端プロセッシングに関するそれらの能力に関して、溶離分画を別々に試験した（実施例９）。（iv）ゲル濾過クロマトグラフィーゲル濾過の典型的例を図３に示す。さらに一般的には、以下のようにクロマトグラフィーを実施する。Ｐ−２の精製さらの、APP C末端プロセッシング活性を含有するモノ−Ｑ分画をプールし、0.25m l未満に濃縮して、10mM Tris-HCl緩衝液pH7.5で平衡させ、150mM NaClを含有する縦配列の２つのSepharose 6HRカラムに適用した。終始0.3ml／分の流速を用いた。Ａ280nm、総タンパク質（Bradford検定）、ペプチダーゼ活性、及び組換え体APPのＣ末端プロセッシングに関する活性に関して溶離分画をモニタリングした。方法２：（ｉ）亜細胞分別上記の方法１に記載されているようにしてこれを実施した。（ii）可溶化本質的に上記の方法１に記載されているのと同様に実施した。（iii）アプロチニン−Sepharoseクロマトグラフィー上記の可溶性（230m g）、Ｐ−２（216mg）又はミクロソーム（47mg）分画を、予め20mM Tris-HCl緩衝液pH7.0で平衡させたアプロチニンSepharose（Sigma、カタログ番号42268，1- 5×10cm）のカラムに適用した。一旦カラムを負荷し、平衡緩衝液（100ml）で洗浄して、次に500mM塩化ナトリウムを含有する60mlの50mM酢酸ナトリウム緩衝液p H5.0で溶離した。流速は終始1.0mL／分であった。溶離分画（４ml）を280nmでモニタリングし、Bradford検定を用いて分析し、バキュロウイルス系中での発現により得られる組換え体APPを用いて、実施例８に記載されているようにAPP C末端プロセッシング活性に関して調べた。活性分画は、抗APP C末端抗体を用いてイムノブロット上で検出可能な11，14及び18kDa（およそ）断片を形成し得る（抗体産生の方法に関しては実施例６参照）。（iv）イオン交換クロマトグラフィーアプロチニン−Sepharose上のＰ− ２分画の精製からの活性分画をプールし、50mM Tris-HCl pH7.5に対して透析して、透析緩衝液で予め平衡させたモノ−Ｑカラム（HR５／５）に適用した。いったん負荷し、上記の方法１と本質的に同様に、カラムを溶離した。活性分画（２ ml）をＡ280nm、総タンパク質（Bradford検定）に関して、並びにバキュロウイルス由来APP C末端プロセッシングに関するそれらの能力に関して、モニタリングした。APP分解活性の広範なピークが観察され、これはAPP C末端抗体並びにベータアミロイドペプチドのＮ末端に向けられるモノクローナル抗体の両方と反応する11，14及び18kDa APPC末端断片を形成し得る（抗体産生の方法に関しては実施例６参照）。活性分画を含有する領域と交わるＡ280nmプロフィールに基づいて、活性の３つのプールを明白なＡ280nmピークと各々重ねて調製した。プールは以下の伝導範囲を包含した：プールＸ（12.2〜14.4mmho）、プールＹ（14.9〜18.9mmho）及びプールＺ（20.2〜22.9mmho）。（ｖ）ゲル濾過クロマトグラフィープールＸ，Ｙ及びＺを各々２ml（プールＸ及びＹ）又は3.6ml（プールＺ）に濃縮し、150mM塩化ナトリウムを含有する 50mM Tris-HCl pH7.5で予め平衡させたSuperdex 75カラム（Pharmacia，Piscata way，NJ）に別々に適用した。いったん負荷し、平衡緩衝液でカラムを溶離した。終始1.0 ml／分の流速でクロマトグラフィーを実施した。Ａ280nm、総タンパク質（Bradf ord検定）に関して、及びバキュロ発現APPのＣ末端プロセッシングに関して分画（１ml）をモニタリングした。各々のいかの標準タンパク質のクロマトグラフィーによりゲル濾過を測定した：チログロブリン（570kDa）、ウシガンマグロブリン（158kDa）、オバルブミン（44kDa）、ミオグロビン（17.5kDa）及びビタミンＢ₁₂（1.35kDa）。実施例２．ペプチダーゼ検定開発 “細胞外”ドメイン（単数又は複数）とベータアミロイドペプチド領域のＮ末端との間の接合部でのAPP加水分解に適した特異性を有するヒト脳組織中のエンドプロテアーゼの高スループット検出を可能にするようにペプチダーゼ検定を開発した。選択した技術は、RP-HPLC分離による蛍光性ペプチド生成物質のその後の検出、及び後カラム蛍光検出とともに、ダンシル化ペプチド基質を用いた。ペプチド基質配列の進化：ヒトAPPのベータアミロイドペプチド配列のＮ末端領域周囲に観察されたのと同様のアミノ酸配列を含有する蛍光的標識化ドデカペプチド基質を、固相ペプチド合成により調製した。ペプチドは、Fmoc／NMP-Ho BL化学物質を用いてApplied Biosystems 430A型ペプチド合成機上に合成した（F ields et al.，1990，Int．J．Pepeide Protein Res-，35：161；Knorr et al. ，1989，Totrahedron Letters，30：1927）。通常は、ペプチドを切断し、90％トリフルオロ酢酸、４％チオアニソール、２％エタンジチオール、及び４％液化フェノール中で室温で２時間脱保護化した。しかしながら、ペプチドＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Gl u-Phe-Arg-His（配列番号：２）は、粗製組織分画とともにインキュベートした場合、望ましくないカルボキシペプチダーゼ消化を受けることが判明した。カルボキシペプチダーゼ消化を弱めるために、以下の修飾基質を設計した：Ｎ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala- Glu-Phe-Arg-NH₂（配列番号：７）及びＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met -Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）。この後者のペプチドは、粗製組織分画の存在下でさえカルボキシペプチダーゼ消化に対して相対的に不感受性であり、実施例３のペプチダーゼプロファイリング研究に用いた。さらに精製した酵素分画を用いて、Ｃ末端アルファアミド基質（配列番号：７）を実施例９のペプチダーゼ試験に用いた。下記の実施例３のHP LCプロトコールを用いて、いずれかのペプチドの分解をモニタリングした。実施例３．正常対照及びAD脳の亜分画におけるペプチダーゼ活性の測定（ｉ）インキュベーション実施例１に記載されたカラム分画のアリコート（20μｌ）を10μｌの反応混合物と一緒にインキュベートして、以下の成分濃度を達成した：Mes，Tris-HCl及び酢酸塩pH6.5の各々中に100mMを含むカクテル緩衝液中にＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-As p-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）（50μＭ）、カプトプリル（300μＭ）。イオン交換分画を用いたインキュベーションを37℃で24時間実施し、その後TF A中に最終濃度３％（ｖ／ｖ）に調整することにより反応を終わらせた。（ii）タンパク質分解性生成物のHPLC定量二液溶媒供給、加熱カラムコンパートメント及びオートインジェクターで完全なものになるHewlet-Packard HP 1090を用いてHPLC分析を実施した。イン−ラインGilson 121型フィルター蛍光計（310〜410nmで励起、480〜520nmで放射）をHPLC chem-station（DOSシリーズ）及びデータ分析に適したソフトウエアとともに用いて、蛍光検出（カラム後）を実施した。上記の酸性化インキュベーション混合物のアリコート（通常10μｌ）をガードＣ18 ５μＭガード（20×4.6mm）を取り付けたHypersil ５μＭＣ18カラム（100×4.6nm）上に射出した。27％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有する100mM 酢酸ナトリウム緩衝液pH6.5を用いて平等な分離を達成した。合成ペプチド生成物の移動による同定及び比較、その構造をPTC−アミノ酸分析及びFAB−MSにより確証した（下記の表２参照）。さらに、上記の表２に列挙したある代謝物質の保持時間は、HPLC作動時に変わりやすいため、Ｎ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg- His（配列番号：２）の切断に閏して実施例２に引用したものとは異なる。例えば表２に列挙したデータを反映する試験は、HPLCカラムと一列にガードカラムを用いてクロマトグラフィーを実施したため、相対的に長い保持時間を有する。全実験において、実験サンプルと平衡して合成生成物標準の分析により酵素的生成物の保持時間の日々の変化に対してHPLCカラムを度盛りした。 HP CHEMステーションデータ獲得ソフトウエアを用いて、個々のイオン交換分画のタンパク質分解性代謝物質プロフィールに関するデータを収集した。６つの切断生成物の各々に関する曲線下の面積及びそれらの保持時間をピーク表ファイルに保存する。全ピーク表をつき合わせてEXCEL（プログラム言語Ｃで書いたカスタムユーティリティーを使用）で（６xn）エリア配列に移す（ここで、ｎ＝モノ−Ｑ分画の数）。配列の各列はモノＱ分画からの単一ペプチダーゼ分析を示す。ゼロをデータの各カラム間に挿入して人工的に列方向の値の勾配を確立する。 SpyGlassはこの配列をとり、生成した物質に関するモノＱ分画数、切断Ｖ及び面積％が３軸である３次元面に変換する。手動でSpyGlassプログラム内に設定される以下の判定基準にしたがって等値線を限定する：一次等値線は、特定物質への1.5％基質変換が観察されたブロットの連続領域と接続する。同様に、連続等値線は５％，10％，20％，30％，40％及び50％の領域と接続し、基質変換も示された。その結果生じた等値線プロットは、分画数が縦座標にかかり、ペプチド結合切断Ｖが横座標上にあり、生成物質の量が等値線により示される脳ペプチダーゼ地図を示す。対照及びAD脳亜分画のペプチダーゼプロファイリングの結果：図１は、イオン交換クロマトグラフィーによりさらに亜分別を施した対照並びにAD P-2，Ｓ及びＭ分画によりＮ−ダンシルペプチド基質の切断に関して得られたペプチダーゼプロフィールの比較を示す。分析により、対照及びAD脳の亜分画全体の洗剤的に異なる多数のペプチダーゼ活性が同定できる。各分析（図１のａ〜ｆ）に関して、各ペプチド結合での切断に関する活性の量はシリーズを通じて低減した：Ｖ−Ｋ＞Ｋ−Ｍ＞Ｍ−Ｄ＞Ｓ−Ｅ＞Ｅ−Ｖ。しかしながらＫ−Ｍ及びＭ−Ｄ切断は、Ｃ−100生成を引き起こすAPP加水分解の部位を示しているという見込みが大きいために、最も興味深い。1.6分で回収された代謝物質は、おそらく過酸化水素による基質の処理が同一保持時間（rt）を有する物質を生じるので、基質中のスルホキシドへのメチオニン酸化によるものと思われる。1.0及び1.3及び3.3分のrtで生成される代謝物質は、現在のところ同定されていない。Ｋ−Ｍ切断に関しては、対照及びADに関する酵素のスペクトル及びピーク活性についての活性の全レベルはシリーズを通して低下した：Ｐ−２＞Ｓ＝Ｍ。これは、ADにおけるＭ−Ｄ切断に関しても真実であるが、一方対照分画に関してはその順序はＳ＞Ｐ−２＝Ｍであった。 ADにおいて認められた最も豊冨なペプチダーゼピーク（１つより多い等値線により境されるもののみ）に関しては、以下の数の明白に決定されたペプチダーゼピークを区別し得る：Ｐ−２３つのＫ−Ｍピーク及び１つのＭ−Ｄピーク；Ｍ３つのＫ−Ｍピーク及び２つのＭ−Ｄピーク；ＳＫ−Ｍピークなし、１つのＭ−Ｄピーク。対応する対照及びAD間のより多くのピークのレベル間の定性的比較により、１つの顕著な差異のみが明らかにされた。差異はミクロソーム分画で観察され、個の場合対照Ｍプロフィールは単−Ｍ−Ｄ生成物を分画75周囲に含有し、一方ADプロフィールでは、同一領域は明らかにダブレットを含有した。正常及び疾病状態集団におけるペプチダーゼ間の考え得る変異のために、対照及びAD間のペプチダーゼレベルの定量的差異を際立たせる点はほとんどない。要するに、少ペプチダーゼ形態のレベルにおける対照及びAD分画間の定性的又は有意に定量的な差異が存在し得るということを無視することはできないけれども、全体的プロフィールは、１つだけの明白な差異がペプチダーゼ活性のより多くのピークにはあきらかである。（iii）別個のプール中へのペプチダーゼ活性の統合Ｎ−ダンシル−Ile-S er-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）基質を用いて得られたペプチダーゼ活性プロフィールを基礎にして、Ｐ−２，Ｓ及びＭ分画のイオン交換分離からのカラム分画を隣接するプール中に統合した（Ｍに関しては12プール、Ｐ−２に関しては13プール、Ｓに関しては14プール）。各場合にAD及び対照分画に関するクロマトグラフィープロフィールの同一領域をプールするよう注意し、YSI35型伝導計を用いて各プールの電導度をモニタリングすることにより工程の精度を検査した。プール中は分画を４℃に維持し、−70℃で保存した。Amicon Centriprep-10膜を用いて各ペプチダーゼを濃縮した。濃縮前に、各Centriprep膜を50mM Tris-HC l，pH7.5中で洗浄した。５ml以上の容量を含有するペプチダーゼプールに関しては、15ml Centriprepを用いた。これらのプールをDu Pont Sorval卓上遠心分離機上で2700rpmで約40分間濃縮した。４ml未満を含有するプールは、２ml Centri prepを用いて、Du Pont Sorval RC遠心分離機（SS34ローター）上で5000rpmで約 40分間濃縮した。遠心分離後、各濃縮プールを等量の50mM Tris-HCl，pH7.5で洗浄した。遠心分離工程中はプールを４℃に維持し、−70℃で保存した。プールを、電導度（cond uctance）及び最終濃縮容量とともに下記の表３に列挙する。実施例４．組換え体APP 695の発現本実施例は、ホロAPP 695を発現し、次いで実施例７に記載のように精製し、次いで実施例８〜10に記載されているようにAPP分解検定のための組換え体基質として用いる方法を記載する。２つのアプローチを用いた。最初にCHO細胞発現系を用いてAPP 695を生成した。基質としてAPPのこの供給源を用いた実験には、ヒト脳Ｐ−２，Ｓ及びＭ分画の精製からのモノ−Ｑ分画の連続プールで検出可能な６つの異なるプロテアーゼ活性を同定させる初期活性測定が含まれた。これらの試験は実施例８に記載する。次いで、バキュロウイルス特定系を用いた発現により、組換え体APP 695を得た。それにより生じたより多量のAPP 695により、実施例９及び10に略記したより詳細な試験の実施が可能になり、ある種のAPP分解酵素の同定が成された。発現の両方法を以下に示す：方法１：ホロAPP 695を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株の開発（ｉ）ベクター構築 FC−４（Kang等、上記）からのAPP 695cDNAの公知の2 .36kb NruI／Spel断片を大腸菌E.coli DNAポリメラーゼＩの大型断片により充填して、pMTI−５（Ｔ３プロモーター下でのAPP 695）を生じるKS Bluescript M13 ＋（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA）のSmalクローニング部位中に盲端挿入した。次に新規の最適KozakコンセンサスDNA配列を、オリゴ： 5′-CTCTAGAACTAGTGGGTCGACACGATGCTGCCCGGTTTG-3′（配列番号：８）によりPMT I−39を作るために、特定部位の突然変異誘発を用いて作った（Kunkel et．al. ，1987，Methods in Enzymology，154：367）。次にこのプラスミドを特定部位の突然変異誘発（Kunkel等、同上）より変更して、位置614のバリンをグルタメードに変えた（開放読み枠はKang等（同上）にしたがってナンバリングした）。最適Kozakコンセンサス配列及びValのGluへの突然変異を含有する全長APP cDN Aを次に、NotI及びHindIII部分消化によりPMTI−39から切り出す。次いで2.36kb APP 695断片をゲル精製して、NotI／HindIII切断pcNAINeo（Invitrogen Corp. ，San Diego，CA）に結紮して、PMTI90を作り、このなかでAPP 695発現がCM部位プロモーターの制御下で起きる。ValのGluへの突然変異は確証済配列であり、ベクターを用いてCHO細胞を安定的に形質転換する。（ii）APP 695 matenesを発現する安定CHO細胞株の生成。 APP 695構築物によるトランスフェクションのためにチャイニーズハムスター卵巣Ｋ−１細胞（ATCC CCL61）を用いた。APP 695及びネオマイシン薬剤耐性マーカーを含有する20μｇの発現プラスミドを0.5mlのPBS中の１×10⁷CHO細胞中に、 Bio-Rad Gene Apparatus（Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA）を用いて電気穿孔によりトランスフェクトした。25μｆキャパシタンスで1200Ｖの単一パルスを細胞に施した。電気穿孔後、細胞を氷中で10分間インキュベートし、遠心分離により収集した。細胞ペレットをAlpha MEn，10％ウシ胎児血清中に５×10⁴細胞／mlの密度で再懸濁し、１mlアリコートを24ウエル組織培養クラスタープレートの各ウエル中に分布させた。48時間インキュベーション後、１mg／mlのGeneticin（GIBCO-BRL， Grand Island，NY）を含有する培地１mlを付加してネオマイシン薬剤耐性マーカーを含有する細胞を選択して、インキュベーションを続け、薬剤含有倍地を１週間に２回変えた。ウエスタンブロットにより、薬剤耐性細胞をAPP 695発現に関して試験した。A PP 695発現に対して陽性な細胞を限定希釈によりクローニングし、個々のクローンを単離して、APP 695発現に関して調べた。APP 695発現に対して陽性なクローンを亜培養し、APP 695発現細胞の大規模産生とその後の組換え体タンパク質の単離のためにローラーボトルに広げた。方法２：バキュロウイルス感染昆虫細胞を用いた組換え体ホロAPP 695の発現（ｉ）組換え体ベクターの構築バキュロウイルスベクターpVL1392（Invit rogen）をXba I（ポリリンカー中）で切断し、pMTI−39からのグル単離2.36kb X ba I断片と結紮した（Bluescript M13 SmaI部位へのAPP 695 NruI／SpcI，Ｔ３配向、Smal／NruIプラント融合部位に新規のKozak及びXbaI部位を用いる）。これによりpMTI 103が生じる：これをDH５α中に形質転換し、Amp上で選択して、プラスミドDNAのリチウムprepをトランスフェクション用に作った。（ii）細胞及びウイルス American Type Culture Collection（ATCC）から購入したSpodoptera frugiperda（Sf9）を懸濁培養として28℃で、10％ウシ胎児血清を含有するTNMFH培地（Summers，M.D.，and Smith，G.E.，1987，A Manual of Methods for Baculovi rus Vectors and Insect Cell Procedures，Bulletin no．1555，Texas Agriｃ．Exp．Stn．and Texas A & M Univ.，University Station，TX）中で増殖させた。野生型AcMNPV DNAは、Invitrogen，SanDiego，CAから購入した。（iii）DNA トランスフェクション及びプラーク検定リン酸カルシウム法（Summers et al.，1987，同上）を用いてSf９細胞中に精製プラスミドDNA（４ μｇ）及び直鎖ウイルスDNA（１μｇ）を同時トランスフェクションすることによる相同組換えにより、外来DNAをポリヘドリン遺伝子座のAcMNPVのゲノム中に挿入した。トランスフェクト化細胞により放出されたウイルスを２ラウンドのプラーク検定（Summer et al.，1987,同上）により精製し、組換え体ウイルスをポリヘドリン陰性プラークに関する肉眼的スクリーニングにより同定した。次に精製組換え体ウイルス培養をウエスタンブロットにより昆虫細胞中にAPPを産生するそれらの能力に関してスクリーニングした。（iv）組換え体タンパク質産生 10％ウシ胎児血清を含有するTMNFH培地中で懸濁培養として１×10⁶細胞／mlで増殖させたSf９細胞の５リットルバッチを、１のM.O.I.で組換え体ウイルスで感染させた。感染24時間後に細胞を収穫し、細胞溶解物を組換え体タンパク質の精製のために調製した。実施例５．哺乳類細胞の一過性感染による組換え体Ｃ−100標準の産生のための発現ベクターの開発Ｃ−100ペプチド断片は、Ａ４ペブチドのＮ末端から全長APPのＣ末端に及ぶAP PのＣ末端部分を含有する（上記背景の項参照）。Ｃ−100断片は、Ａ４ペプチドの最終的形成を引き起こす初期分解生成物を意味する。本発明の一態様において、組換え体Ｃ−100を発現するHela S3 細胞（ATCC CCL 2.2）からの細胞溶解物を、脳分画でインキュベートしていた組換え体APPサンプルと平衡してイムノブロット検定で分析し、モノ−Ｑクロマトグラフィーにより亜分画化した（実施例３参照）。Ｃ−100断片の移動及び検出は、概してＣ末端APP断片の免疫検出のために病的プロテアーゼ並びに陽性対照により生成される物質の発生に関するサイズマーカーとして役立つ。酵素的に生成した物質のサイズとＣ−100断片のサイズの比較は、酵素的に生成した断片がＡ４ペプチドのＮ末端近くの、あるいはセクレターゼにより触媒されるようにＡ４セグメント内での切断から得られるか否かについての見識を提供し得る。（ｉ）プラスミド構築２つの方法を用いてＣ−100発現のためのプラスミドを作製した。各プラスミドはPMTI73又はPMTI100として別々に同定される。 PMTI73構築：市販のプラスミドPUC−19をEcoRIで消化してそのポリリンカーを制限した。市販PWE16を次に消化済PUC19中に挿入して、PMTI2300を作った。PM TI2301は、オリゴヌクレオチドアダプターを用いてBamHI／HindIII消化後にPMTI 2300から得た。APPのEcoRIプロモーター断片を、盲端結紮によりPMTI2301のHind III部位に挿入して、PMTI2307を生成した。 PC−４（Kang等。上記）からのBamHI断片をPMTI2307のBamHI部位に結紮してPM TI2311を生成した。FC−４からのXhoI断片をPnTI2311のXhoI部分に挿入して、PM TI2312を生成した。マウス金属チオニン−１遺伝子のEcoRIゲノムクローンからの2.2kb BglII／EcoRI断片をPMTI2312のClaI部位中に挿入することにより、PMTI 2323を作った。微小遺伝子PMTI2337を生成するために、PMTI2323のKpnI及びBglI I部位間の配列を欠失させて、合成オリゴヌクレオチドアダプター sp−スペーサー−４を用いてクローンを結紮した。 PMTI2337をBamHI／SpcIで切断し、断片をBluescript KS（1）（Stratagene）のBamHI／XbaI制限部位中に結紮して、PMTI2371を生成した。PMTI2371をHindIII ／NotIで切断して、APP695の末端100アミノ酸をコードする0.7kb断片を放出させた。この挿入物をpcDNAINEO（Invitrogen Corp.）のHindIII／NotI部位に結紮して、プラスミドPMTI73を作った。 PMTI 100構築： PMTI90（実施例４、方法１参照）をXbaI／HindIIIで切断してこれもAPP695の末端100アミノ酸をコードする0.6kb断片を放出させ、これをpc DNAINEOのXbaI／HindIII部位に結紮して、PMTI100を作った。各場合、ベクター、挿入物及びプラスミドを当業者に公知の方法で精製した。（ii）Ｃ−100断片のトランスフェクション及び発現６ウエルコースタークラスター（直径3.5cm）を各ウエル中に５×10⁵細胞のHela Sl細胞を使用の24 時間前に植えつけることにより、Ｃ−100標準の小規模発現のための調製を開始した。十分量のワクシニアウイルスVTE７−３をトリプシン処理して多数の20プラーク形成単位／細胞を感染させ、等量の粗製憂いするストック及び0.25mg／mlトリプシンを混合し、次いで激しく攪拌した。トリプシン処理ウイルスを10分間隔で攪拌しながら、37℃で30分インキュベートした。凝集塊が残存した場合、インキュベーション混合物を０℃に冷却して、音波処理水浴中で30秒間音波処理した。冷却音波処理を凝集塊が検出されなくなるまで繰り返した。 Hela S1細胞を入れた各ウエルが0.5mlのウイルスを有するに十分な血清無含有 DMEMでトリプシン処理ウイルスを希釈した。培地を吸い出して、次いで細胞をウイルスに30分間感染させて、10分間隔で揺すってウイルスをかき混ぜた。感染終了の約５分前に、新鮮なトランスフェクション混合物を以下のように調製した：各ウエルに対して、0.015mlのリポフェクチン試薬（Bethe sda Research Labs，Gaithersburg，MD）をポリスチレン試験管中のOPTIMUM（Be thesda Research Labs，Gaithersburg，MD）に加え、静かに混合した。攪拌はしなかった。ついで３μｇのCsCl精製DNAを加えて、静かに混合した。ウイルス混合物を細胞から吸い出して、次にトランスフェクション溶液を導入した。その結果生じた混合物を37℃で３時間インキュベートした。次に各ウエルを１mlのOPTIMUMで覆って、CO₂インキュベーター中で37℃で一夜インキュベートした。遠心分離によりトランスフェクション後20時間に細胞を収穫し、１％Triton X -100，10μｇ／ml BPTI，10μｇ／mlロイペプチン、200mM NaCl，10mM HEPES，１mM CaCl₂，１mM MgCl₂，１mM EDTAを含有し、pH7.5に調整した溶解緩衝液0.2m lを加えて、氷上で溶解物を調製した。光学顕微鏡で完全溶解をモニタリングし、直ちに収穫した。溶解は１分未満で完全に起きて、この段階での遅延はゼラチン状塊を生じる核の溶解を引き起こした。組換え体溶解物を後に使用するために−20℃で保存した。好ましくは、組換え体溶解物は、凍結前に、２−メルカプトエタノールを欠いた（３ｘ）SDS−PAGE サンプル緩衝液中で１：50に希釈すべきである。 APP C末端抗体によるSDS−PAGE／イムノブロットを用いたPMTI73又はPMTI100 による発現によって産生されたタンパク質のサイズの比較を実施した（図２ｃ）。試験は、PMTI100が単一免疫反応帯の発現に向けられ、一方PMTI73は小分子サイズの２つの主要帯の発現に向けられることを示した。中間サイズの弱い帯も、多量でゲルに適用した場合に（図２ａ〜２ｄ）、PMTI73中に明らかであった。 PMTI100タンパク質を多量にSDS−PAGEゲルに適用すると、一連のぼんやりした帯（例えば図２ｄ）が現れる。明白なMr11.7kDaのＣ−100モノマーの強い帯の他に、Mr25.5kDa，35kDa及び45kDaでぼんやりした帯が観察され、これはそれぞれＣ−100モノマーの二量体、三量体及び四量体凝集物に寄与する。Mr18.9kDaの別のかすかな帯も観察される。同様の現象は、文献でも同様の解釈で報告されている（Dyrks et al.，1988，EMBO J.，７；949）。 PMTI73により生成される最大の３つの帯は、PMTI100に関して観察される単一帯よりわずかに大きかった。PMTI73発現からの最大帯は、単一ペプチド配列が初期翻訳物質から切断されて、Ｎ末端で５つの余分のアミノ酸を含有するＣ−100 断片を産生した。実施例６．免疫化学試薬の生成３つの異なる免疫化学試薬を本発明の試験に用いた。（ｉ）APPのＣ末端を認識するウサギポリクローナル抗血清を得て、実施例８に記載の検定条件にしたがってタンパク質分解的プロセッシングにより生成したＣ末端APP断片のイムノブロット検出のために用いた。（ii）APPのＣ末端を認識するアフィニティー精製抗体を調製して、バキュロウイルス特定系で発現されるAPPのアフィニティー精製のためのイムノアフィニティーカラムを合成するために用いた（実施例７参照）。（iii）ベータアミロイドペプチドのＮ末端を認識するマウスモノクローナル抗体を生成し、ホロAPP695のタンパク質分解性消化により生成されるＣ末端APP 断片が全長ベータアミロイドペプチドを含有するか否かを測定するためにイムノブロット検定に用いた（特定の適用に関しては実施例９及び10参照）。３つの免疫化学物質の各々の生成方法を以下に示す：（ｉ）APPのＣ末端に対するウサギポリクローナル抗血清抗血清をヒトAPP695のＣ末端ドメインに引き出して、Buxbaum等（1990，Proc ．Natl．Acad．Sci.，87：6003）の方法にしたがって調製した。APP695のCOOH末端領域に対応する合成ペプチド（以後“β APP 645−694”と呼ぶ）をYale Univ ersity，Protein and Nucleic Acid Chemistry Facility，New Haven，CTから得た。 β APP 645−694を用いてウサギを免疫化して、ポリクローナル抗体を引き出した。ヒトAPP695のアミノ酸19〜695を含有する融合タンパク質を発現する大腸菌E.coliの溶解物のイムノブロット分析により、血清をスクリーニングした。組換え体融合タンパク質に対して免疫反応性である血清を、連続的in vitro転写（ Stratagene，La Jolla，CAから購入したキット）及び翻訳（Promega Corp.，Mad ison，WIから購入した網状赤血球溶解キット）によりβ APP 645−694 cDNAから産生した〔³⁶Ｓ〕メチオニン標識化APP695に対する免疫沈降活性に関してさらにスクリーニングした。（ii）ホロAPPの精製のためのポリクローナル抗体アフィニティーカラム合成APP C末端ペプチド免疫原の精製：Ｎ末端にシステイン残基を有するAPP （649−695）のＣ末端に及ぶ粗製合成ペプチド（Ｐ−142）80〜90mgを、HPLCにより精製した（収率42％；34mg）。アミノ酸分析、Ｎ末端配列分析及び飛行質量分光測定のレーザー着脱時間Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrome tryは、精製ペプチドが全長及びＮ末端で剪頭されたペプチドの混合物（１／２全長／剪頭）であることを示した。精製Ｐ−142免疫原によるウサギの免疫化： HPLC精製ペプチドAPP（649−695 ）を用いてウサギを免疫化した。２羽のウサギは各々、完全フロイントアジュバント中の125μｇのペプチドで、その後不完全フロイントアジュバント中の同量のペプチドの増強により、３週間間隔で初期試験を施した。９か月間に14の採血標本を収集し、16〜32週目の採血に関してAbの最適産生を観察した（ワクシニアＣ−100及びCHO APPを用いたウエスタン分析で示された）。この期間の採血を90〜100mlの抗血清のおよその量に対してプールした。抗血清の精製のための免疫化APP649−695アフィニティーマトリックスの調製： BSAによるPierce Imject活性化免疫原抱合キットを用いて、9.7mgの精製ペプチドAPP（649−695）をマレイミド活性化BSAと結合させた。Ellman試薬で測定すると、約40％のペプチド（3.88mg）がBSAと結合した。BSA結合ペプチドを、ゲル濾過により非結合ペプチドから分離した（キットからの精製緩衝液＝83mM NaH₂ PO₄ pH7.2；900mM NaCl）。ゲル濾過カラムからのプール化無効容量（2.9mg Ｐ −142がBSAと抱合／12.5ml）を１ｇ（3.5ml）のCNBr活性化セファロースと結合させた（＞90％のペプチド抱合体が標準Pharmaciaプロトコールにより結合）。残りの部位をエタノールアミンで遮断した。セファロースアフィニティーマトリックスを1.0×3.5cmガラスカラム中に包装した。 APP（649−695）アフィニティーカラムを用いたウサギポリクローナル抗体の精製：最適Ab産生の採血からの併合ウサギ抗血清をプールし（100ml／3.9ｇタンパク質）、洗浄緩衝液（100mM NaHCO₃ pH8.3；750mn NaCl）で１：１（ｖ／ｖ）希釈して、ペプチドアフィニティーカラム上に1.0ml／分で４℃で負荷した。負荷（200ml）後、Ａ280が０に戻るまで洗浄緩衝液（75ml）でカラムを洗浄下。 IgGを100mMグリシンpH2.5（40ml）で溶離した。１分分画を、100μｌの1.0Ｍ Tr is-HCl pH8.0を入れた試験管中に収集した。中和低pHIgG溶離物をプールし（34m l；14.7mg）、1.0リットルの100mM NaHCO₃ pH8.3；500mM NaClに対して４℃で透析した。イムノアフィニティーカラムの調製：精製ウサギIgGとセファロースSepharo seとの結合 5.0ｇのCnBr Sepharoseを50mlの結合緩衝液（100mM NaHCO₃ pH8.3 ；500mM NaCl）で活性化し、オルビトロン上で４℃で21時間、透析済IgGプールと混合した。結合後、樹脂を浸漬ガラスフィルターを通して結合緩衝液で１回、その後100mlの遮断緩衝液（100mM NaHCO₃ pH8.3：500mM NaCl；1.0Ｍエタノールアミン）で３回洗浄した。結合緩衝液（100ml）、次いで低pH緩衝液（100mM NaO Ac pH4.0；500mM NaCl）による２つの連続した中間洗浄工程、並びに結合緩衝液（100ml）による最終洗浄により樹脂調製は完了する。結合は、総量17.5mlの樹脂の87％に認められた（0.727mg IgG／ml樹脂）。（iii）ベータアミロイドペプチドに対するモノクローナル抗体の生成及びエピトープマッピングハイブリドーマ法以下の２つの合成ペプチドの混合物を多数回注射することにより、Balb／ｃマウスを免疫化した：１）ベータアミロイドを含有するホロAPP695のアミノ酸597〜638（ナンバリングはKang等、同上による）、及び２）Ｃ末端ドメインを含有するAPP295アミノ酸645−695。標準手法（Herzenberg et al.，1978,：D.M.Weir（Ed_-），Handbook of Experimental Immunology，pp 25. 1-25.7，Blackwell Scientific Publicatins，Oxford，UK）を用いて、固定化動物からのSplenoytesをＸ63／Ag8.653マウス骨髄腫細胞と融合させた。その結果生じたハイブリッドからの上清を、ベータアミロイドペプチド免疫原を微小滴定プレートと結合させるEIAを用いて抗ペプチド特異的抗体の存在に関してハイブリッドを試験した。免疫原として用いた合成ペプチドと反応する抗体を分泌する培養を、限定希釈により２回クローニングし、それらのアイソタイプを記載（Wu nderlin et al_，1992，J_ of Immunol．Method s，147：1）通りに確定した。分泌IgGを、使いつくした培養液のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによりクローン化ハイブリドーマ細胞の血清無含有発酵プロスから精製した。エピトープマッピング抗ペプチドモノクローナル抗体の１つであるC286.8 Aと呼ばれるIgG 2bは、EIA並びにイムノブロット検定により、合成ベータアミロイドペプチドとの良好な反応性を示した。モノクローナルのエピトープ反応性を、競合EIAを用いて測定した。ヒトAPP695のアミノ酸597−612，597−624，597− 638，608−624，621−631及び645−695（ナンバリングはKang等による）を含有する合成ペプチド、並びにＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Gl u-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）を、C286.8AのAPP597−638との結合を遮断する能力に関して試験した。抗体により認識されるペプチドは、溶液中の抗体で予備インキュベートした場合には、微小滴定プレートと結合するベータアミロイドとのその後の反応に有用な抗体の溶液濃度を低下させる。このような実験の結果は、図４に示し、本明細書で後述する。ペプチドAPP597−612，597−624，597−638及びＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-V al-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）のみが、用量依存様式でのC286.8A結合を阻害し得た。これらのペプチドは、それぞれベータアミロイド配列のアミノ酸１−16，１−28，１−42及び１−７を含有する（Ｎ末端アスパラギン酸残基からナンバリング）。あらゆるベータアミロイド配列、例えばAPP649−695を欠く、又はベータアミロイドペプチド配列12−28又は2 5−35（それぞれAPP608−624及びAPP621−631）を含有するペプチドは、モノクローナル抗体の相同抗原との結合を阻害しなかった。これらの結果は、このモノクローナル抗体に関する反応性エピトープが、少なくとも一部、ヒトAPPのＡ４領域、即ちAPP597−601の最初の７個のアミノ酸中に存在することを示す。実施例７．組換えホロ−APP695の精製 APP C末端プロセシングの最初の試験は、上記実施例４に述べたようにしてCHO 細胞で発現された組換えAPP695を用いて行い、次いで下記の方法１のようにして精製した。この基質を用いる特性決定の試験は後記実施例８で説明し、この試験によって、Ｃ末端のプロセシングを行うことができる可能性のある六つの異なる APP減成酵素が同定された。次にバキュロウイルスの発現系を成長させ（実施例４参照）、CHO発現系が達成可能なレベルより高いレベルのAPPを得た。バキュロウイルス系由来のホロ−A PP695の精製は下記の方法２で述べる。バキュロウイルス由来の精製したホロ−A PP695は、下記実施例９と10で述べるプロテアーゼ特性決定試験を行うのに使用した。特にことわらない限り、ステップはすべて０〜４℃で行った。ホロ−APP695の検出は、特に下記実施例８に記載されているように、抗ヒトAPP695C末端抗体を用い免疫ブロット分析法によって行った。方法１．安定にトランスフェクトされたCHO細胞由来のホロ−APP695の精製（ａ）形質膜の単離。ローラーボトル内でのCHO細胞の連続培養で得た全細胞ペレット（179ｇ）（実施例４参照）を遠心分離（1500ｇ×５分間）で収集し、塩化ナトリウム（30mM）、塩化マグネシウム（１mM）、EDTA（10mM）、PMSF（200 μｇ／ml）、Ｅ−64（42μｇ／ml）およびペプスタチン（3.8μｇ／ml）を含有する50mMトリス−HCl緩衝液（pH8.0）中に再懸濁させて全容積を600mlにした。この細胞を、テフロンポッター（10回の戻り工程）を用いてホモジナイズし、次いで41％スクロースを含有しプロテアーゼインヒビターのEDTA，PMSF，Ｅ− 64およびペプスタチンを含有していないホモジナイゼーション緩衝液10ml中で層分離させた（25ml／遠心分離管）。Beckman SW−28ローター内で遠心分離（26,8 00RPM×60分間）を行ってから、中間層を注意深く取り出し（合計量約150ml）、同容積のホモジナイゼーション緩衝液（プロテアーゼインヒビターを除く）で希釈し、テフロンポッター（３回の戻りストローク）を用いて再懸濁させ、次いで上記のようにして再び遠心分離して、しっかり固まったペレットを得た。上澄み液をデカントし、次いでペレットを５mMトリスHCl pH8.0に再懸濁させ全容積100 mlにした（テフロンポッター、３回戻りストローク）。再び遠心分離（Beckman 70 Tiローター中50,000RPM×60分間）に付し、ペレットを50mMトリスHCl，pH8.0 中に再懸濁させて全容積を57mlにした。（ｂ）形質膜の可溶化。上記の再懸濁させたCHO形質膜標品の37mlづつを、プロテアーゼインヒビターと原液の20％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−100の混合物に順次添加して、上記のホモジナイゼーション緩衝液中（全可溶化容積45ml）、次の成分濃度：EDTA（１mM）、Ｅ−64（24μｇ／ml）、PMSF（53μｇ／ml）、ペプスタチンＡ（11μｇ／ml）およびトリトンＸ−100（最終的に2.2％ｖ／ｖ）にした。この混合物を４℃て30分間ゆるやかに振盪させ、次いで非可溶化物質を遠心分離（Beckman 70 Tiローター中50,000RPM×40分間）で除いた。可溶化されたホロ− APPを含有する上澄み液を、0.45μＭのディスクフィルターで濾過した。（ｃ）強力なアニオン交換クロマトグラフィによる、可溶化APP695の精製。ホロ −APP695を含有する上記上澄み液を同容積の蒸留水で希釈し、0.1％トリトンＸ −100を含有する20mMトリス−HCl緩衝液pH8.0で予め平衡化したMono-Q HR 10／1 0カラムに加えた。負荷してから、全容積210mlの平衡緩衝液に０〜１ＭのNaClを含有する直線勾配液でカラムを溶離した。流量は終止３ml／minに維持した。17〜22mmho（４℃）の伝導率の範囲内で溶離するタンパク質は、大部分の免疫反応性APP695を含有しており、これを合して0.025％のトリトンＸ−100を含有する５mMトリス−HCl pH8.0 の２ｌに対しし４時間透析し、次いで遠心分離（Beckman SW 28ローター中26,80 0RPM×60分間）によってわずかの濁りを除いて清澄にした。（ｄ）ヘパリンアガロースクロマトグラフィ。上記の清澄試料を、透析緩衝液で予め平衡化したヘパリンアガロースのカラム（15×1.6cm）に加えた。負荷中は、カラムの頂部１／３内に淡褐色のバンドが生成した。負荷してから５分間づつ画分を集めた（流量は終止１ml／minにした）。カラムは、塩化ナトリウムの最終濃度を連続的に０，150，300，600および2000mMに調節した平衡緩衝液85mlで段階的に溶離した。免疫で検出可能な（immunodetectable）ホロ−APPの大部分は600mM NaClで溶出し、次の定量的画分は300mMで回収された。300mMと600mMのN aClで回収されたAPPは別々に集めて、−80℃で別々に貯蔵した。以下の試験で使用したAPPはその300mM NaClによる画分由来のAPPである。300mMヘパリンアガロース溶出液由来の部分的に純品のAPPの収量は、湿潤CHO細胞ペレット１ｇ当り5. 5μｇであった（ブラドフォード検定法）。この標品中のAPPは、SDS PAGEによる分析に基づいて純度が約25％であると判定した。方法２．組換えバキュロウイルスでインフェクトされた昆虫細胞由来のホロ−AP P695の精製（ａ）細胞ペレットの可溶化。二つの５Ｌづつの発酵実験から収穫した細胞ペレットを含し（全重量8.9ｇの検出可能なタンパク質）、下記のインヒビター：ペプスタチンＡ（25μｇ／ml）；ロイペプチン（25μｇ／ml）キモスタチン（25μｇ／ml）；アンチパイン（25μｇ／ml）；アプロチニン（25μｇ／ml）；ベンズアミジン（４mg／ml）；PMSF（0.87mg／ ml）およびEDTA（25mM）を含有する0.32Ｍスクロース160mlに添加し、次いでテフロンポッター（10回戻りストローク）によってホモジナイズした。そのホモジネートを遠心分離（Beckman 70 Tiローター中、105,000ｇで１時間）に付し、得られたペレットを、0.5Ｍ NaClおよび先に述べたのと同じインヒビターを同じ濃度で含有する10mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）160ml中に、テフロンポッター（1 0回戻りストローク）を使用して再懸濁させた。軽く音波処理を行った後（Brans on Sonifier Cell，２分間、パワーレベル４）、トリトンＸ−100を最終濃度５％（ｖ／ｖ）まで添加し、次にその懸濁液を４℃で20分間ゆっくり撹拌した。その混合物を遠心分離（Beckman Ti 70ローター中、50,000RPM，60分間）に付し、そしてヘパリンアガロースクロマトグラフィにかける第一上澄み液（574mgのタンパク質）を注意深く取り出した。ペレットを、0.5Ｍ NaClおよび上記の各インヒビターを上記の濃度で含有する10mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）160mlに、テフロンポッター（20回戻りストローク）を使って再懸濁させた。上記のように、５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−100で可溶化し次いで遠心分離して第二の可溶化上澄み液（683mgのタンパク質）を得た。（ｂ）ヘパリン−アガロースの放射状フロークロマトグラフィー。上記（ａ）で得た上澄み液の両方を、以下のようにしてヘパリンアガロースで別個に精製した。これら上澄み液に精製水と１ＭトリスpH9.5を加えて希釈し、容積を3.5Ｌにし、コンダクタンスを1.8mmhoにおよびpHを8.0にし、パックされた樹脂250mlが入っていてかつ0.1％トリトンＸ−100を含有する５mMトリス−HCl緩衝液pH8.0で予め平衡化されたSuperflow250カラム（Sepragen社）に注入した。負荷してから、上記カラムを平衡緩衝液３Ｌで洗浄し、次いで600mM NaCl を含有する平衡緩衝液で溶離した。30ml／minの流量を全体にわたって使用した。45mlづつの画分を、Ａ280nmで全タンパク質について監視し（ブラドフォード検定法）、免疫反応性APPのレベルを、実施例６ｉ）の抗APP C末端抗血清に対する免疫ブロット法で検出した。有意なAPPを含有する画分を合して、抗体アフィニティークロマトグラフィーに付した。（ｃ）抗体アフィニティークロマトグラフィー。第一上澄み液（276mgのタンパク質を含有している）と第二上澄み液（113mgのタンパク質を含有）をヘパリンアガロースで精製して600mM NaClで溶離したプールを合して、pHを8.3に調節し、次いで実施例６ii）に記載されているようにセファロースに結合されたアフィニティー精製Ｃ末端抗体が入っていて、500mM NaCl，0.1％トリトンＸ−100を含有する100mM重炭酸ナトリウム緩衝液pH8.3で予め平衡化された抗体アフィニティーカラム（10.5×1.5cm）に加えた。クロマトグラフィーは全体にわたって１ml ／分の流量で実施した。負荷してからカラムを70mlの平衡緩衝液で洗浄し、次いで0.1％のトリトンＸ−100を含有する100mMグリシンpH2.4の50mlで溶離した。５ mlつづの画分を収集して各々１Ｍトリス−HCl（pH8.0）0.5ml中に入れ、Ａ250nm で全タンパク質を監視し（ブラドフォード検定法）、前記ののようにして免疫で検出可能なAPPを検出した。有意なAPPを含有する画分を合した。この合したヘパリンアガロース溶出液を、合計５回アフィニティ精製法に付した。連続精製の各工程から回収したAPPのプールを合してAPPの合計量は９mgになった。（ｄ）強い陰イオン交換クロマトグラフィ。抗体アフィニティクロマトグラフィからの組合せ分画（タンパク質9.0mg）を、0.025％（体積／体積）のトリトンＸ −100及び150mMのNaClを含むpH8.0 の20mMのトリス−HCl緩衝液で予め平衡化されたモノ−QHR５／５カラムに適用した。ひとたび装荷した後、カラムを合計70mlの中で線形0.15〜１ＭのNaCl勾配で溶出させた。全体にわたり0.5ml／分の流速を使用した。有意で免疫検出可能なA PPを含む溶出された分画を組合せ、使用するまで−80℃でアリュート中に保存した。APPの最終調製物は、クーマシーブリリアントブルーで現像されたSDS−PAGE に基づいて95％以上の純度を有しており、理論上の組成と86％の一致の範囲内にあるアミノ酸組成を示し、成熟タンパク質について以下のＮ末端配列を示した： Leu-Glu-Val-Pro-Thr-Asp-Gly-Asn-Gly-Leu-、２回の５Ｌ発酵ランからのペレットから5.6mgの精製タンパク質が得られた。アミノ酸分析は、基本的に他の文献中で記述されている通りに行なった（Dupo nt，D.R.，Keim，P.S.，Chui，A.H.，Bello，R．Bozzini，M．及びWilson，K.J. ，「アミノ酸分析に対する広範なアプローチ」、Techniques in Protein Chemis try内、編集：Tony E．Hugli，Academic Press，284〜294(1989)）。２時間160 ℃で2.0％のフェノールと共に６Ｎの塩酸を用いて蒸気相内のアルゴンの下で試料を加水分解した。オンライン式130Ａ型分離システム及びネルソン分析用2600 型クロマトグラフィソフトウェアを用いて、Applied Biosystemsの420Ａ型デリヴィタイザー（Derivitizer）上でフェニルチオカルバモイル−アミノ酸分析を行なった。例８．ヒト脳プロテアーゼ下位分画を触媒としたAPP695の分解の検出のためのイムノブロット検定（ａ）基質APPを用いたインキュベーション（ｉ）所要量の２Ｍの保存緩衝液を付加することによりpH6.5のMES緩衝液中の最終的な140mMにまで調整された組換え型ヒトAPP695（10.75μｌ）を用いて、37℃ で24時間、（例１に記述されているとおりの段階から得られたイオン交換分画又は濃縮された分画プール（例３）の５ μｌアリュートをインキュベートする。インキュベーション中の最終的緩衝液濃度は95mM，pH6.5であった。インキュベーション時間中、APP695のいくつかのタンパク質分解による劣化が起こり、より低いMrフラグメントを生み出す。（ii）36％（体積／体積）のグリセロール及び12％（体積／体積）のSDS，10％（体積／体積）の２−メルカプトエタノール及び微量のブロモフェノールブルートラッキング用染料を含む1.5ＭのトリスHCl，pH8.45といった３ｘのLaemlie SD S−PAGE試料緩衝液を7.5μｌ付加することによって、タンパク質分解反応を終結させた。試料を加熱し（100℃×87分）、次に冷却させた。（ｂ）SDSPAGE分析： 10〜20％のアクリルアミド勾配トリシンゲルのウエルに対して、反応混合物（ 15μｌ）を適用した（日常的には、厚み1.0mmの15ウエルNovexプレキャストゲル、Novex Experimental Technology，San Diego，CA）。ゲルを恒常電圧条件下で、そして50Ｖにて、試料がゲルの中に入るまで走行させ、入った時点で電圧を10 0Ｖにまで上昇させた。トラッキング用染料がゲル底面から0.5cm以内のところに達した時点で、電気泳動を中断させた。Mrが３〜195kDaの範囲内にある予め染色されたMr標識を用いて（Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD）、ゲルを較正した。高分子量と低分子量の標識を含むキットを各々10マイクロリットルずつ10μｌの３ｘ試料緩衝液と混合し、（ａ）（ii）項に記載されているとおりに処理した。予め染色された標識としてはキット内に以下の分子量標識タンパク質が存在していた：ミオシンＨ鎖（196kDa）；ホスホリラーゼＢ（106kDa ）；ウシ血清アルブミン（71kDa）；オバルブミン（45.3kDa）；炭酸脱水酵素（ 29.1kDa）；ベーターラクトグロブリン（ 18.1kDa）；リゾチーム（14.4kDa）；ウシトリプシン阻害物質（5.8kDa）；及びインシュリンＡ及びＢ鎖（３KDa）。（ｃ）イムノブロット法、（ｉ）その後ゲルを小型トランスブロット電気泳動セル（Biorad labs，Richmon d，CA）に移した。150mMのグリシン及び20％（ｖ／ｖ）のメタノールを含むpH8. 5の20mMのトリスHCl緩衝液といった４℃に維持したトランスファ緩衝液を用いて、100Ｖ（恒常）で１時間ProBlott（TM）膜（Applied Biosystems．Foster City ，CA）上でタンパク質を電気ブロットに付した。（ii）ProBlott膜をとり出し、150mMのNaClを含むpH8.0の10mMのトリスHCl緩衝液中の５％（重量／体積）の脱脂粉乳という組成の15mlの遮断用緩衝液内に１時間室温で放置した。（ｄ）APP及びＣ末端分解産物の免疫検出：合成ヒトAPP695C−末端ペプチド免疫原に対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清の１：1000希釈液を含む15mlの遮断用緩衝液に膜を移し、一晩４℃でインキュベートした。５分間穏やかに振とうさせながら連続三回の15mlの体積の遮断用緩衝液で、膜を洗い流した。次に、アルカリ性ホフファターゼでカップリングされたヤギ抗ウサギIgGの１：1000希釈液（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）を含む15mlの遮断用緩衝液に膜を移し、90分間室温でインキュベートした。その後、10分間穏やかに振とうさせながら、連続三回の15mlの体積の遮断用緩衝液を用いて、膜を洗い流した。次に、100mMのNaCl及び５mMのMgCl₂を含むpH9.5の100mMのトリスHClを含むアルカリ性ホスファターゼ緩衝液を各々15mlの体積で５分間、連続三回用いて、膜を洗浄した。次に100mMのNaCl，５mMのMgCl₂及び50μｌのBCIP基質（50mg／ml， Promega，Madison， WI）そして99μｌのNBT基質（50mg／ml，Promega）を含むpH9.5の100mMのトリス HCl 15mlを用いて、暗所でゲルをインキュベートした。低いMrの免疫反応性バンドが見かけ上さらに強まることが全くなくなるまでインキュベーションを続行した（標準的には室温で３時間）。次にゲルを脱イオン水で洗い流し、乾燥させた。 APP695を酵素的に分解してＣ−末端断片を生ずる細分画ヒトAD皮質のモノ−Ｑプールの能力の分析実施例３に記載するＰ−２，Ｓおよびｍプールの各々を前述のイムノブロットアッセイにかけた。真性のAPP基質分子の使用と組み合わせた、免疫原検出法の特異性は、高度に精製された酵素調製物を使用する必要性を回避する、比較的粗製の生物学的抽出物中のAPP分解性酵素の活性を検出する選択的方法を提供する。こうして、部分的に精製したプールのあるものは、時間依存的態様でＣ−末端 APP断片を形成できるタンパク質分解活性を有した。ヒトAD脳のイムノブロット分析の代表例は、Ｐ−２Ｖ（パネルａ）、Ｍ III（パネルｂ）およびＳＩ（パネルｃ）について、ならびにＰ−２VIIプール（パネルｄ）のプール前の個々の画分については第１図に示されている。プールＭ IIIについて、例えば、第２ｆ図に描写されているような、時間過程の実験は、これらの断片が時間０に基質または酵素画分の中に存在しないことを示した。さらに、基質単独のインキュベーションはそれらを形成しなかった（例えば、第２ａ図、レーン２、第２ｄ図、レーン２、第２ｆ図、レーン８を参照のこと）。バンドの大きさの範囲は、酵素画分に依存して、Mrがほぼ11.5kDa〜25k Daの間で変化したが、反応において形成した異なる生成物の数は驚くほど少なかった。pH6.5において、合計39のADプールのうちの８つはこのような活性を有することが発見された。プールはｉ）脳の細分画、ii）カラムの溶離のイオン強度、およびiii）定性的APP切断パターンに基づいて互いに区別することができた。６つの選択したプール（「Ｍ−III，Ｍ−VIII，Ｓ−Ｉ，Ｓ−III，Ｐ−２Ｖ、およびＰ−２VII」と表示する）は有意なAPP分解活性を有することが発見された。対応する対照脳プールはまた、多少の上記の活性を含有したが、活性のレベルが対照プールとADプールとの間で異なるか否かを決定することは不可能であった。上記の６プールの各々は11kDaのAPPのＣ−末端断片を形成できる酵素活性を有した。 MRが11.5kDaのタンパク質分解生成物はとくに興味あるものであった。なぜなら、それは、それ以上の研究において、通常主要な免疫検出可能なＣ−末端生成物であり、そしてベータ−アミロイドペプチドのｎ−末端アスパルテートで開始しそして全長の分子（Ｃ−100断片）のＣ−末端に延長するオープンリーディングフレームからなるAPPの組換えＣ−末端断片と共移動することが発見されたからである。この共移動は第２ｄ図に例示されている。この意味は、11.5kDaのバンドがＡ４領域のＮ−末端またはその付近のAPPの内部タンパク質分解生成物であること、およびこの断片を形成できる前述のプロテアーゼ活性は、アミロイド発生ペプチドの発生において生体内である役割を演ずることができることにある。第２ｄ図は、少なくともＰ２プールVIIの場合において、APPタンパク質分解の 11.5kDaのＣ−末端の酵素生成物は凝集することができることを示す。PMTI100推進Ｃ−100標準と共移動するMr11.5kDa、および18kDaの断片におけるペプチドのバンドの出現に加えて、Mr24.3，27.4および35.5kDaに他のバンドが出現する。2 4.3および35.5kDaのバンドは、Ｃ−100断片の、それぞれ、二量体および三量体について期待されるMrをもち、そして凝集のためであるＣ −100における対応するかすかなバンドとほぼ共移動する（詳細については実施例５を参照のこと）。第２ａ図〜第２ｃ図は、また、古典的プロテアーゼインヒビターの作用を検査するためにこのアッセイを使用できることを示す助けをする。例えば、第２ａ図から明らかなように、Ｐ−２Ｖはメタノールにより部分的に阻害されそしてメタノール性ペプスタチンＡにより完全に阻害されるが、Ｍ−III（第２ｂ図）およびＳ−Ｉ（第２ｃ図）の両方はアプロチニンおよびシステインにより完全に阻害される。こうして、このアッセイは、１つの態様において、APP分解酵素の新規な生体外インヒビターについて探索に適用される。これにより同定される効力のある化合物を、適当に動物モデル、例えば、APPまたはそのベータ−アミロイド含有断片を過度に発現するようにデザインされたトランスジェニック動物を使用して生体内の効能について試験する。下表４は、ペプチド生成物の大きさ、生成物の形成についての見掛けのpH依存性、および商業的に入手可能なプロテアーゼインヒビターの作用を包含する、モノ−Ｑ画分から回収されるAPP分解活性の６つの主要なプールの性質のいくつかを要約する。活性のいくつかはアルカリ性の範囲の最適なpHを有し、そしてリソソームのカテプシンの作用のためであるように思われなかった。この観察は意味がある。なぜなら、いく人かの研究者らは、病理学的APPのプロセシングはエンドソーム− リソソームの経路内でプロテアーゼにより実施されると報告したからである（Ca taldoら、1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87：3861；Benowitzら、1989，E xperimental Neurology，106：37；Coleら、1989，Neurochem．Res．14：933）。この経路内の酵素は活性pH最適値を示すことが期待されるであろう。入手可能なデータに基づいて、Ｍ−IIIおよびＳ−Ｉはすべての列挙した基準により高度に類似し、そして多分ＳおよびＭ画分の各々の同一の酵素の交差汚染を表す。したがって、ヒト能がAPPを分解して11.5kDaのＣ−100様生成物断片を生ずることができる最小５つの異なるプロテアーゼ活性を含有する可能性がある。表４が示すように、活性のいくつかは試験したインヒビターのいずれかによる阻害に対して不感受性であり、そしてこれらの酵素は異常なグループの構成員を表すことができる。Ｍ−IIIおよびＳＩにおける11.5kDaのＣ−100断片の形成に関係する活性はセリンまたはシステイン型であるか、あるいは異常なグループの構成員を表す。あるいは、これらの画分はセリンおよびシステインの両方のプロテアーゼを含有することができ、両方の酵素はＣ−100の生産において絶対的（順次の）役割を演ずる。P2Vはアスパラギン酸プロテアーゼ活性およびセリンプロテアーゼ活性の両方を含有するP2VIIはPMSFに向かうその感受性に基づくセリンプロテアーゼ活性を含有する。しかしながら、引き続く研究において、ペプスタチン阻害可能な活性が認められ、表４におけるセリンプロテアーゼ活性と一緒にアスパラギン酸プロテアーゼのＰ２中の共局在化を示した。Ｓ IIIまたはＭ VIIIにおける酵素活性のいずれも試験したインヒビターのいずれに対しても感受性ではなかった。いずれの場合においても、実施例３において使用したＮ−ダンシルペプチド基質を使用する酵素プールの共インキュベーションによるAPP分解の阻止を証明することができなかった。 APP活性（実施例８）とモノ−Ｑプールのペプチダーゼ活性（実施例３および第１図）の回収を比較すると、２つの活性の間に相関関係がほとんど存在しないことが明瞭に示される。こうして、APP分解活性は比較的ペプチダーゼ活性をほとんど示さないプールの中に大部分含有された。これが示唆するように、APP分解活性は劣ったペプチダーゼであり、そして活性のために無傷の折りたたまれた APP基質を必要とすることがあるか、あるいは選択したペプチドは病理学的APPプロセシングの誤った位置を表す（しかしその可能性は少ない）。それにもかかわらず、この発見は他の研究者らがペプチド基質に基づくアッセイを使用して普通のAPP分解酵素の同定に成功しなかった理由を説明する。上の考察から、本発明のアッセイはヒト脳からの特定のAPP分解酵素の単離を可能とするために十分な特異性を有すると結論される。それ以上の研究において、Ｐ−２VII関連APPアーゼの回収を追跡するためにイムノブロットアッセイをわれわれは使用した。研究はこのプールに集中された。なぜなら、それは６つの特徴づけられた活性の最大の発生量を表し、かつアミロイド的であると思われるＣ−末端断片を発生したからである。それはＰ−２細分画のイオン交換分離から回収可能な主要な活性を表し、そしてペプチダーゼ活性の主ピークと一致しない勾配中の一点において溶離される。 APPアーゼを表示するＰ−２VII画分をプールし、そして２つの直列のスパロース（Superose）12カラム（ファーマシア）の大きさ排除クロマトグラフィーにかけた。溶離された画分中のペプチダーゼおよびAPPアーゼを分析した（第３ａ図）。Ｋ−Ｍ切断活性は一部分オーバーラップすると思われたが、Ｍ−Ｄ活性のピークは再びまたAPPアーゼのピークと一致しなかった。既知の分子量のマーカーに対するクロマトグラフィーの目盛り定めは、Ｐ−２VII画分のAPPアーゼ活性について±6.5kDaの不確実さをもつ31.6KDaの見掛けのメジアンMrを生じた（第３ｂ図）。実施例９ APPC−末端のプロセシング酵素としてのカテプシンＤの同定実施例４、方法２、に記載するバキュロウイルスの発現系、および実施例７、方法２、の精製系を使用することによって、より大きい量のホロ−APP695が得られたので、ペプチダーゼ活性に基づいて作った画分のプール中のAPP分解酵素の含量を評価する（実施例８において実施したように）よりむしろ、ヒト脳酵素の精製からの個々のカラムの画分中のAPP分解酵素の回収を追跡することができるようになった。実施例１の方法に従う可溶化Ｐ−２画分の精製からの個々のモノ−Ｑ画分について、APP分解酵素活性の含量を第５図に示す。モノ−Ｑクロマトグラフィーにかけた可溶性およびミクロソームの画分の同様な分析と比較したとき、酵素のＣ −末端APP断片についての相対的染色強度はモノ−ＱからのＰ−２細分画において首尾一貫して最大であった。Ｐ−２におけるAPP分解活性は、２つの明確な移動ピークとしてモノ−Ｑから回収された（ＡおよびＢ、第５図）。ピークＡは、われわれの初期の研究において見られるように、負荷および低いイオン強度の洗浄において、すなわち、Ｐ−２Ｖの回収にほぼ相当する領域において溶離される（表４）が、ピークＢはＰ−２VII活性が前に観察されたプールした領域とオーバーラップし（表４）、そしてセリンおよびアスパラギン酸プロテアーゼ活性の両方からなることが示された。同様な大きさの分解生成物はMrほぼ28，18および14および＜11kDaにおいてピークＡおよびＢの両方の活性をもつことが観察されたが、18kDaバンドの相対的染色強度はピークＡよりピークＢにおいて非常に大きかった。ピークＢをプールし、そして実施例１、方法１に記載するようにスパロース（Superose）６HRで精製した。溶離された画分は２つの定性的に明確な型の活性を含有し、これらはそれらの溶離のプロフィルがオーバーラップした。もとのピークＢの画分で観察されたものに最も密接に類似するAPP 破壊パターンを生成する活性（第５図）が、ゲル濾過からの画分51〜56において回収され（第６ｂ図および第６ｃ図）、15〜25kDaの見掛けのMrと一致した。この溶離のピークの前に、主として18kDaの破壊生成物を形成する活性の溶離が存在し、そしてこれは多分より大きい見掛けのMrのプロテアーゼにより触媒される。この後者の活性は、実施例８、表４におけるＰ−２VIIプール中の前述のセリンプロテアーゼ活性に多分相当する。ピークＢ（および15〜25kDaのMr領域内の）のゲル濾過精製からの活性画分は古典的プロテアーゼインヒビターによる阻害について試験した（第７図）。これらの研究により、ピークＢ活性はペプスタチンＡにより定量的阻害により決定してアスパラギン酸プロテアーゼにより大きく触媒されることが確証された。比較的わずかのヒトアスパラギン酸プロテアーゼが知られている。同定されたものは、カテプシンＤおよびＥ、およびペプシンを包含する。観察された活性がこれらの酵素のいくつかに相当することができる可能性を試験するために、バキュロ誘導ホロ−APPを酵素的に分解するそれらの能力について、ヒトレニンの商業的調製物（カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州サンディエゴ、カタログNo.553864）、およびヒトカテプシンＤ、およびヒトカテプシンＤ（ヒト肝臓、カルビオケム（Calbiochem）、サンディエゴ、カタログNo.219401）を検査した。ヒトカテプシンＤ（カタログNo.219401、カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州サンディエゴ）は、銀染色で展開したSDS−PAGE上で電気泳動的に均質であり、カテプシンＤの理論的組成とのすぐれた（93％の）一致を示すアミノ酸組成を示した。すべてのＮ−末端はカテプシンＤに相当し、主要な配列は成熟プロテアーゼの軽鎖（GPIPEVLKNY）および重鎖（GGVKVERQVF）に相当する当量モル量で存在する。レニンは不活性であった（示されていない）が、カテプシンＤはAPPを選択的に切断して、モノ−Ｑからの前述のＰ−２ピークＢ（第５図）で観察されたものと同様なＣ−末端分解生成物のパターンを生成する。こうして、商業的カテプシンＤ調製物は時間依存的方式でホロ−APPを分解して近似Mr18および28kDaの主要なＣ−末端生成物を生成した。ペプスタチンＡによる活性の阻害はこの反応におけるカテプシンＤの関与を確証した（第８図）。ヒトカテプシンＤに対する商標的ポリクローナル抗体を入手し（ダコ・コーポレーション（Dako Corp.）、カリフォルニア州カーピンテリア、カタログNo．A5 61）、そしてイムノブロット上のヒトカテプシンＤに対して反応性であり、Mr27 〜28kDaの免疫反応性バンドを発生することが発見された。この抗体をイムノブロットアッセイにおいて使用して、Ｐ−２、可能性またはミクロソームの画分のモノ−Ｑ精製からのクロマトグラフィーの画分が免疫反応性カテプシンＤを含有するかどうかを検査した。抗体はイムノブロット上のヒトレニンと交差反応しなかった。有意な量のカテプシンＤがＰ−２のモノ−Ｑ画分（第20ｄ図）およびAPP分解活性を有する可溶性画分（データは示されていない）において観察された。興味あることには、Ｐ−２のモノ−Ｑ画分の分析においてカテプシンＤの反応性の２つのクロマトグラフィー的に明確なピークが観察され、それらの各々はピークＡおよびＢと一致した（示されていない）。ピークＡ活性に関連する免疫反応性アスパラギン酸プロテアーゼ、カテプシンＤは、実施例８のＰ２Ｖが前に同定された領域と一致した。これが示唆するように、ピークＡおよびＢはカテプシンＤの多数の形態のためであることができる。カテプシンＤの多数の形態はどこかに記載し、そして単一の遺伝子生成物の翻訳後の修飾の差に帰属された。Ｐ−２のピークＢ（第５図）のそれ以上の精製からのゲル濾過カラムの画分のイムノブロットアッセイは、カテプシンＤの免疫反応性の存在がAPP分解活性のピークと正確に一致することを示した（第６ｂ図）。カテプシンＤの免疫反応性との共移動性およびカテプシンＤに対する分解性AP Pの類似性に加えて、ゲル濾過によりさらに精製したピークＢのプロテアーゼは、Ｃ−末端のAPP分解存在の形成についてのカテプシンＤと同一のpH最適値（pH ４〜５）およびイオン強度の依存性を示した（第９図）。最後に、Ｐ−２画分において観察された免疫反応性バンドは、バイオラド・ミニフォル（Biorad ninip hor）クロマトグラフィー系の分離用IEFにかけたとき、カテプシンＤについて報告したのもに類似するpI（４〜６）を示した（示されていない）。集合的に、ヒト脳Ｐ−２のモノ−Ｑ画分後に観察されるペプスタチン感受性APPプロテアーゼ活性はカテプシンＤの作用のためであるという事実を、これらのデータが強く支持する。次いで、ピークＢプロテアーゼ（ゲル濾過により精製した）およびカテプシンＤのペプチダーゼ活性を、基質として合成ペプチドＮ−ダンシル-Ile-Ser-Glu-V al-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH₂（配列識別番号：７）を使用して比較した。両方の酵素はこのペプチドを時間依存性方式で非常に遅い速度にかかわらず加水分解した。両方の酵素について、主要な切断は-Glu-Val-結合において観察され、そしてより少ない程度に-Met-Asp-結合において観察された（第10図）。第1 0図において、Met-Asp切断生成物の大部分をさらに描写した24時間の時点までに Glu-Val生成物に変換されたことに注意すべきである。期待されるように、カテプシンＤおよびＰ−２酵素調製物により触媒されるペプチダーゼ反応の両方はペプスタチンＡにより阻害された。両方の酵素はGlu-Val-結合における加水分解のための酸性最適値をpH４に示した（第１図）。-Met-Asp-における加水分解は、また、カテプシンＤで酸性最適値（＜pH3.0）を示したが、Ｐ−２酵素では、２つの最適値が観察され（pH3.0およびpH7.0において）、これは多分中性のpH最適値での反応における追加の汚染性Ｐ−２プロテアーゼの沈澱のためであった（第11図）。カテプシンＤは通常疎水性残基の間で加水分解する。しかしながら、酸性pHにおいて、AspおよびGlu側鎖のプロトン化（中性の）形態はプロテアーゼのサブサイト結合の要件を満足するために十分な疎水性であるように思われる。Asp側鎖のpKaはGlu残基よりいっそう酸性であり、そして第11図において検査したpH範囲を通じてGlu残基より少ない程度にプロトン化されるであろう。これはカテプシンＤでは-Met-Asp-結合においてより低い切断速度、および-Glu-Val-結合と比較したとき、この部位における切断についてより低いpH最適値におけるヒント（hint）を説明することができる。イムノブロットアッセイにおけるモノクローナル抗体C286.8Aを使用する他の研究により、Ｐ−２酵素活性がカテプシンＤのためであることが確証された。われわれのいっそう最近の研究において、この活性は可溶化Ｐ−２画分のイオン交換クロマトグラフィーからの塩の勾配で初期のかなり狭い数の画分にわたって溶離された単一のピークとして回収された（第20ａ図）。APP695を生体外で加水分解して15〜38kDaの大きさの範囲の断片を形成し（第20ｂ図）、それらのすべてはベータ−アミロイドの最初の７つのＮ−末端残基を認識するネズミモノクローナル抗体（C286.8A）に対して反応した（第20ｃ図）。プールした画分の活性は1 0μＭのペプスタチンＡ、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビターにより完全に阻害された（第20ｂ図）が、他のプロテアーゼの阻害、例えば、EDTA（１mM）、PMSF（0.4mM）、Ｅ−64（0.1mM）、およびアプロチニン（10μｇ／ml）により影響を受けなかった（示されていない）。APP分解活性は、APP模倣Ｎ−ダンシル −ISEVKMDAEFR−NH₂を−Ｅ−Ｖ−結合において加水分解するペプスタチン感受性プロテアーゼの溶離と一致した（第20ａ図）。カテプシンＤは、20kDaのカテプシンＤ軽鎖のイムノブロット分析により判定して、ホロ−APPおよびペプチド分解活性と共溶離した（第20ｄ図）。高度に純粋なカテプシンＤはホロ−APPを分解して、Ｐ−２アスパラギン酸プロテアーゼ活性を使用して観察されたものと区別できないC286.8A免疫反応性生成物（第21ｂ図）のパターンを生成した（第21ｂ図）。免疫吸着実験を実施して、Ｐ−２アスパラギン酸プロテアーゼとカテプシンＤとの間の可能な免疫学的同一性を検査した。それらのAPP分解活性に基づいてプールしたイオン交換画分（第20ａ図）を、カテプシンＤに対するイムノアフィニティー精製した抗体のカラムか、あるいは精製した対照を含有する対照カラムに等しい量で適用した。２つのカラムのためのＡ280の溶離のプロフィルを重ねることができた（第21ａ図）。対照カラムからの貫流画分は、最初の空隙後に適用したプールと同一レベルのAPP分解活性を含有した（すなわち、画分５以降、第21ｂ図）。対照的に、APP分解活性は抗カテプシンＤカラムからの貫流から画分９（追加の5.7空隙体積）まで本質的に存在せず、そして画分27（31空隙体積）までの適用したプールの中に存在するレベルに等しいレベルに到達しなかった。抗カテプシンＤカラムからの貫流中のAP P分解活性のこの損失は、固定化されたのと同一の抗カテプシンＤ抗体で検出された免疫反応性カテプシンＤの軽鎖（20kDa）および重鎖（27kDa）の消耗と一致した（第21ｃ図）。カテプシンＤの免疫反応性は抗カテプシンＤカラムから回収されたが、0.5％のトリトンＸ−100を含めたとき100mMのグリシンpH2.5を使用する溶離により対照カラムから回収されなかった。免疫反応性カテプシンＤに相当するバンド以外のタンパク質バンドはこの溶離において検出されなかったことに注意すべきである（第21ｃ図）。これにより、吸着されたAPP分解活性がカテプシンＤそれ自体以外の免疫学的に交差反応性のプロテアーゼから生ずる可能性はありそうに思われない。不都合なことには、微量のみのAPP分解酵素活性が抗カテプシンＤカラムから回収された（示されていない）。これは多分この活性が中和された溶離緩衝液により阻害されたためである：溶離緩衝液の組成物は、また、精製されたカテプシンＤによるホロ−APPの分解を定量的に阻害した（示されていない）。ヒトカテプシンＤに対する固定化されたポリクローナル抗体は、また、イオン交換プールの中に存在するAPPペプチド加水分解活性を免疫吸着した（第22図）。部分的加水分解の条件下に、イオン交換プールはダンシル−ISEV KMDAEFR-NH₂をＭ−ＤおよびＥ−Ｖの両方の結合において切断した（第20図におけるように延長したインキュベーションの条件下に、Ｍ−Ｄ切断からの生成物は二次タンパク質分解によりＥ−Ｖ生成物に究極的に変換された）。APP分解活性を使用するときのように、Ｅ−Ｖ（第22ａ図）およびＭ−Ｄ（示されていない）結合の切断の蛍光生成物を生ずるペプチダーゼ活性は、最初に、対照IgGカラムからの貫流の画分５の中に現れたが、画分12〜13まで抗カテプシンＤカラムから本質的に見られなかった（第22ａ図）。低いレベルのＭ−ＤおよびＥ−Ｖペプチダーゼ活性は引き続いて抗カテプシンＤカラムから回収されたが、グリシン／トリトンpH2.5を使用する溶離により対照IgGカラムから回収されたなかった（第22 ｂ図）。貫流の中に、あるいは酸性溶離により回収されたペプチダーゼ活性の各々はペプスタチンＡにより完全に阻害された。いわゆるスウェーデンのFADにおいて観察されたAPP位置の対応するペプチド模倣（Ｎ−ダンシル−ISEVNLDAEFR-N H₂）を使用する並行実験において、同様な結果が得られた（第22ｃ図および第22 ｄ図）。しかしながら、この後者のペプチドでは、蓄積する主要な蛍光生成物がＬ−Ｄ結合の切断から生じた。このペプチドの蓄積速度は非常に速かったので、この反応に利用可能な基質のすべてはインキュベーション時間内によく消耗され、第22ｃ図の貫流画分の中に異なる活性の低い評価に導いた。再び、貫流の中に、あるいは溶離により回収されたペプチダーゼ活性はペプスタチンＡにより阻害された。ペプチダーゼは、野性型APP模倣基質におけるＭ−Ｄ結合の切断について観察された速度より速い見掛け速度でスウェーデンのペプチド模倣の中に存在するＬ−Ｄ結合を加水分解した。期待されるように、他の基質のカテプシンＤの加水分解について報告されたものとおおよそ一致した切断に相当するいくつかの生成物が観察された（Moriyama ら、1980，J．Biochem．88：619）。報告されたカテプシンＤを除外して、カテプシンＤ特異性はバンド３の主要な生成物、およびバンド５の小さい生成物を形成する-Glu-Val-切断、バンド１および２の-Leu-Arg-切断生成物を含んだ（表５）。 APP593-594における-Glu-Val結合の切断は、ペプスタチン阻害性反応においてペプチド基質（前述したような）中の対応する結合を切断するカテプシンＤの観察された能力と一致した。カテプシンＤは通常ある種の疎水性残基の対の間を加水分解する。Glu-Val結合における切断は、予期されなかったが、グルタメート残基の側鎖のプロトン化（pKa＝4.25）のために酸性（pH５）条件下に多分起こり、それを中性とする。事実、-Glu-側鎖の18％はpH5.0においてプロトン化されるであろうと結論することができる。このような酸性条件はリソゾームまたは分泌顆粒中で起こるか、あるいは組織の損傷のときに、か、あるいはヒポキシアまたは虚血後に誘発されることがある。最も有意には、カテプシンＤは、普通の形態のベータ−アミロイドのＮ−末端と称される-Asp-残基に対してＮ−末端の３アミノ酸残基を-Glu-Val-結合において異形加水分解により、5.6kDaの生成物（バンド３、表５）を発生した。この断片はカテプシンＤを使用しないインキュベーションから取ったブロットの同等の区画の中に存在しなかった。さらに、この断片は全長のベータ−アミロイドペプチドを含有する正しい大きさ（5.6kDa）を有し、そしてその発生はカテプシンＤが、また、ベータ−アミロイドペプチドのＣ−末端領域に密接する第２部位においてAPPを切断しなくてはならないことを示唆する。事実、このようなＣ−末端の切断のための前駆体基質は、また、バンド５において同定され、これはMr（10.0kDa）を示した。この断片の配列が示唆するように、それはＣ−末端ドメインのすべてでないにしても、大部分を含有し、そしてそれはAPP593−594における単一の-Glu-Val-切断により発生した。 APP695は、カテプシンＤ切断のための理想的な基質であったと思われ、しかもカテプシンＤにより切断されなかった多数の他のペプチド結合を含有する。それらが加水分解されなかったという事実は、折りたたまれたAPP構造内のカテプシンＤに対するアクセスから離れた、これらの部位の高度の隔離を反映する：疎水性対の大部分は疎水性APPタンパク質コアに位置することが期待されるであろう。同一の考察は、カテプシンＤにより加水分解されることが示された部位（表５）が最適なカテプシンＤ認識モチーフを常に含有しなかった理由を説明する。タンパク質表面上に位置するためには、このような部位はカテプシンＤが触媒する切断のために理想的であるより大きい程度の極性または電荷を含有しなくてはならないであろう。これに関して、５つの内部の切断部位のうちの３つは２つのプロリン残基を含有し、それらの各々は切断容易な結合の８残基内に存在したことは注目に値する。このような残基はしばしば二次構造中の破壊に関連するか、あるいはタンパク質表面にしばしば見出される屈曲（turns）に関連する。平行のイムノブロット（第12ｃ図）において、生成物のペプチドのいくつか（矢印の位置）はベータ−アミロイドのＮ−末端残基に対するモノクローナル抗体 C286.8A）と反応した。これらは第12ａ図（表５）中のバンド３と同一の位置において移動するMr5.6におけるバンド、第12ａ図（表５）中のバンド５と共移動するMr９〜10kDaの間のタブレット、およびMr14kDaにおけるタブレット、および第12ａ図中のバンド６と共移動する16〜18kDaにおけるタブレット、Mr40kDaにおけるバンドを含んだ。配列決定したバンド（表５）のうちで、バンド３，５および６のみが第12ｃ図により検出されたバンドと共移動した。これに一致して、表５中のこれらの同一の３バンドのみは適当なＮ−末端配列をもち、そしてベータ−アミロイドのエピトープを含有する大きさであった。第12図に記載するベータ−アミロイドの免疫反応性分解生成物の時間的順序の形成を、わずかに異なるモル比のカテプシンＤおよびAPP（第13図）下に、ペプチダーゼ活性の不存在または存在の両方において実施した。インヒビターの不存在下に、低分子量断片の時間依存性蓄積が観察され、これは、それぞれ、Mrほぼ 16〜18および28kDaにおけるバンドの形成で最初に開始された。２時間において、Mrほぼ40kDaにおけるバンドが観察された。16〜18および40kDaのバンドは２時間を越えてさらに増強されたが、28kDaのバンドの強度は時点を越えて一定に止まった。16〜18および40kDaの強度は８時間を越えてさらに増加した。８時間と2 1時間との間に、Mrほぼ14，10および5.6kDaにおいて検出可能なバンドの強度の実質的な増加が存在した。これらの後者の３つのバンドは16〜18または40kDaと平行に増強しなかったので、14，10および5.6kDaのバンドは16〜18または40kDa のバンドのいずれかまたはすべての二次的分解から誘導された可能性が存在する。第13図に記載する16〜18または40kDaのバンドは、表５中に列挙しかつ第12ｃ図に示す同一のMrバンドに相当した。第13図において観察されるバンドのすべてはペプチダーゼ活性により阻害され、それらがカテプシンＤの作用により発生したことを確証した。第23図は、表５が作成されて以来同定されたものを包含するように、カテプシンＤにより形成されたAPP断片の配列の更新を提供する。それは、また、第12ｃ図において観察される特定のC286.8A免疫反応性バンドに配列を関係づける。各C 286.8A免疫反応性バンドについて、配列決定ブロットの対応するセグメントは、C286.8Aエピトープを含有しかつこうしてイムノブロットのバンドを説明するために十分な大きさおよび配列の１または２以上の断片を生じた（第23ａ図）。成熟βAPPのＮ−末端の外に、CDを使用する消化は７つの異なる切断から生ずるβAPPのＮ−末端を生じ（第23ｂ図）、これらはカテプシンＤの報告された特異性とおおよそ一致した（A ．Moriyamaら、1990，J．Biochem．88：619；J．van Noortら、1989，J．Biol． Chem．264：14159；およびM．Tanjiら、1991，Biochem．Biophys．Res．Comm．1 76：798）。断片化パターン（第23ｂ図）が示唆するように、5.5kDaの断片はより大きい前駆体、例えば、38kDaのペプチド、あるいは第13図のさらに特徴づけられない一時的28kDaの断片の漸進的Ｎ−末端およびＣ−末端の減少により起こる。5.5kDaの免疫反応性断片は同一配列をもつ10〜12kDaの断片から直接誘導することができるであろう。これらの断片およびMr15〜16の断片の両方は、βAPの全長のコピーを含有するために十分な大きさを有するように思われる。明らかなように、他の生成物、例えば、10〜12kDaの免疫反応性断片のそれ以上のプロセシングから生ずる生成物は、多分それ以上の分解、あるいはエレクトロブロッティングの間の損失のために、検出されないままであることがある。アルツハイマー病のアミロイド−シスにおける主要なプロテアーゼとしてカテプシンＤの関係は、ここで、アルツハイマー病に関してなされた他の観察を説明する。第１に、APPがリゾチームの中に蓄積しそしてそこでプロセシングされてアミロイドを有する断片を生ずるという増大すう証拠が存在する（Haasら、1992 ，Nature，357：500）。アミロイドの沈積はリソソームの酸性pHにおいて好適である（Burdickら、1992，J．Biol．Chem．267：546）。第２に、カテプシンＤはリソソームのプロテアーゼであるが、また、アルツハイマーの脳におけるアミロイドの沈積に関連する有意なレベルで存在することが組織化学的に示された（Cataldoら、1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：3861 ）。第３に、培養において細胞により解放されるベータ−アミロイドは残基Val594 で開始する小さいＮ−末端配列からなり（Haasら、1992，Nature，359：322）この配列はベータ−アミロイド１−42において普通に見られるAsp597で開始するより豊富な配列に対してＮ−末端の３アミノ酸である。小さい配列は、多分、位置 593−594、すなわち、カテプシンＤにより特定のタンパク質分解を行うことが現在示されたのと同一部位、における-Glu-Val-結合の直接的内部タンパク質分解により発生する。ここで、カテプシンＤは-Glu-Val-および-Met-Asp-の両方の結合を加水分解するので、それはHaasらにより配列決定されたベータ−アミロイド断片の両方を形成するために必要な特異性を有することが強調される。第４に、システインプロテアーゼのインヒビターＥ−64およびロイベプチンは LC−99細胞によるベータ−アミロイドの解放に影響を及ぼさないが、一般的リソソームのインヒビターはこの解放をブロックし（Shojiら、1992，Science，258 ：126）、これらの細胞によるベータ−アミロイドの形成はシステインプロテアーゼ以外のリソソームの酵素により触媒されることを示した。このような反応のための残りの候補のプロテアーゼは、それらの研究において使用したシステインプロテアーゼインヒビターにより阻害されない。さらに、APPはベータ−アミロイドのＣ−末端と膜アンカー配列との間の疎水性残基のストレッチを含有する。この領域におけるペプチド結合のあるものはカテプシンＤにより加水分解されることができるであろう。事実、位置645−646における-Leu-Val-結合は、PEPTIDESORTコンピュータープログラムにより、可能なカテプシンＤ認識部位であるとして強調される。この部位は、家族性アルツハイマー病（ FAD）のある形態と共分離することが示された３つの点突然変異の位置に密接する。この領域内の切断ならびに位置593−594における-Glu-Val-結合は、表５におけるバンド３の大きさを説明することができるであろう。この部位におけるFA D突然変異は、この領域内のカテプシンＤによるAPP切断速度を増強することができるであろう。最後に、位置595〜596における-Lys-Met-から-Asn-Leu-への二重突然変異は、また、FADと共分離する。この突然変異は、特定のアミロイド発生プロテアーゼが-Lys-Met-結合付近の切断のための特異性をもって存在する可能性をなくするように思われる。なぜなら、その突然変異はこのような酵素による切断を増強するよりむしろ妨害することが期待されるであろうからである。むしろ、ベータ− アミロイドを生ずる一次的内部タンパク質分解がこのジペプチドに隣接して、好ましいそれに対してＮ−末端で起こる可能性を増加する。Glu-Val-結合は、Ｓ１およびＳ１′位置において影響を受けないで残った、最も近いＮ−末端部位を表す。考えられるところでは、-Glu-Val-の切断容易な結合へのＳ２′およびＳ３′ 部位における-Asn-Leu-の突然変異はカテプシンＤによる切断を増強することができるであろう。これが真実であるかどうか試験するために、基質Ｎ−ダンシル -Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH₂（配列識別番号：７）、およびＫ−Ｍ対がNLで置換され、これにより前述のFAD突然変異を模擬する、同様なペプチドを加水分解するカテプシンＤおよびＰ−２酵素の能力をわれわれは比較した。両方の酵素はより長い時間のフレームでＭ−ＤおよびＥ−Ｖ結合において野生型ペプチドを切断したが、第14図に示す短いインキュベーション時間で非常にわずかの切断が観察された。対照的に、両方の酵素による突然変異ペブチドの切断は、野生型ペプチドを使用して観察されたより30〜50倍速い開始速度で起こった。すべき発生した単一の代謝物質は4.4分の保持時間を示し、そして野生型ペプチドを使用して前に見られなかった。この生成物を引き続いて精製し、そして質量スペクトル〔Ｍ− Ｈ〕⁺＝907およびアミノ酸組成の分析の組み合わせにより、Ｎ−ダンシル−ISEV NL（配列識別番号：９）と同定された。したがって、生成物は基質のＬ−Ｄ結合の間の加水分解から生じなくてはならない。カテプシンＤによるこの切断は、また、ベータ−アミロイドの主要な形態において見出されるものと同一であるＮ− 末端をもつペプチドを遊離し、そしてアミロイド発生プロテアーゼカテプシンＤによりいっそう急速に切断される部位を提供することによって、この特定の初期の発現FADにおいて観察される−NL−突然変異がベータ−アミロイド形成速度を増大するメカニズムを提供する。生じうるベータ−アミロイド蓄積速度の増加は、このAPP突然変異に連鎖したアルツハイマー病の初期の発現形態を誘発することができるであろう。アルツハイマー病の重大な候補としてのカテプシンＤの同定は、この病気のための治療的インヒビターの開発の努力を有意に促進する。例えば、特定のカテプシンＤインヒビターはベータ−アミロイドの毒性の蓄積を阻止することによって治療的利益を提供することができるであろう。ここにおいて提供する新しい情報は、他のアスパラギン酸プロテアーゼ、例えば、レニンおよびHIV−プロテアーゼの新規なインヒビターのデザインのために達成されたように、堅固に結合性のインヒビターを合理的にデザインするために、それを比較的に簡単とする。あるいは、カテプシンＤは次に生体外ペプチダーゼアッセイを使用して高い処理量のスクリーンにおける使用に適合させて、化学的ライブラリーのランダムまたは半ランダム探索により治療的インヒビターを同定することができる。このような目的のために適当なアッセイは、本発明の実施例２および３に記載するＮ−ダンシル−ペプチドのアッセイを包含することができる。実施例10 Ｃ−末端のAPPのプロセシングに対する特異性をもつセリンプロテアーゼの同定第４図は、ヒト脳が組換えAPPのＣ−末端をプロセシングすることができるセリンプロテアーゼを含有すること、およびある場合においてこれらのセリンプロテアーゼがアプロチニンで阻害可能であったことを示す。このようなプロテアーゼのいっそう円滑な単離を試みるために、初期の工程としてアプロチニン−セファローズによるアフィニティー精製組み込んだ別の単離の計画を提出した（実施例１、方法２）。Ｐ−２画分のそれ以上の精製のためのこの手順の適用は、APP分解活性の単離において有望であった（第１５図）。酸性溶離によりアプロチニン−セファローズのカラムから回収された活性画分をモノ−Ｑカラムでさらに精製した（第１６図）。活性画分（第16ａ図）は、APPのＣ−末端に対するモノクローナル抗体を使用するイムノブロットにより分析したとき（第16ｂ図）、11kDa，14kDaおよび 18kDaのAPPのＣ−末端を形成する能力を示した。最小の生成物は組換えＣ−100 標準と共移動した。抗ベータ−アミロイドモノクローナル抗体を使用する活性画分中のAPP分解の再アッセイは、同一の３つの生成物のバンドの検出に導いた（第16ｂ図）。抗体C286.8Aは、実施例６（iii）におけるように、ベータ−アミロイドのペプチドの最初の７アミノ酸残基を認識するので、この実験はすべての３つの生成物が全長のベータ−アミロイドを含有したことを示す。これらの生成物のペプチドの１または２以上はアミロイドであるか、あるいはベータ−アミロイド領域に対してＣ−末端のこれらのペプチドをさらにプロセシングすることによってベータ−アミロイドを生ずることができるであろう。したがって、これらの存在の形成に関係するセリンプロテアーゼはアミロイド−シスにおいてある役割を演ずることができるであろう。前述の11，14および18kDaの生成物のバンドを形成した酵素活性はモノ−Ｑから広いピークとして溶離し、そして多分２以上のプロテアーゼの作用から生じたであろう。モノ−ＱカラムからのA280nm吸収性成分の回収に基づいて、プールＸ，ＹおよびＺと呼ぶタンパク質分解活性の３つの異なるプローブをモノ−Ｑカラムから調製した（方法２、実施例１）。スーパーデックス75上の各プールのクロマトグラフィーの間に空隙体積から、見掛けMr＞75kDaと一致する、酵素活性回が収された（データは示されていない）が、クロマトグラフィーの間の可能なタンパク質凝集を除外することができない。プールＹはSDS−PAGEで分析したとき最も純粋なプールを表し、そしてほぼ1 00kDaのMrに主要な染色されたバンドを示した。プールＹをそれ以上の特性決定のために選択した。プールＹによるAPPの加水分解のためのpH依存性はpH７〜９の最適値を示し（第17ａ図）、そして酵素活性は塩化ナトリウム濃度を42mMを越えて増加することによって徐々に阻害された（第17ｂ図）。酵素のインヒビターの感受性の研究（第18ａ図）により、それがセリンプロテアーゼであり、PMSFおよびアプロチニンにより阻害されるが、ペプスタチンＡ，Ｅ−64またはEDTAにより影響を受けないことが確証された（第18ａ図）。セリンプロテアーゼインヒビターのベンズアミジンは酵素に対する作用をもたず、それがトリプシン様エンドプロテアーゼでありえないことを示唆した。この酵素は、Ｓ１サブサイトに中性の疎水性残基を含有する基質の切断に対する特異性をもつキモトリプシンの族である可能性が強い。したがって、それ以上のインヒビターの研究（第18ｂ図）は、プールＹの活性がキモトリプシンインヒビターII、アルファー２−抗プラスミンおよびTPCKにより強く阻害されることを示した。弱い阻害は、また、キモスタチンおよびアルファ−１−抗キモトリプシンで観察されたが、TLCKはまったく阻害しなかった。カテプシンＧは他の研究者らによりAPPのプロセシングにおいてある役割を演ずることが示唆されたが、カテプシンＧに対するポリクローナル抗体を使用するプールＹプロテアーゼ画分のイムノブロット分析はこのセリンプロテアーゼを検出することができなかった。11，14および18kDaのＮ−末端の配列決定は切断部位を同定し、そして既に進行している。実施例11 治療的カテプシンＤインヒビターのデザインこの実施例はSchechterら、1967，Biochem．Biophys．Res．Comm．27：157の名称を利用してペプチドの特異性を記載し、ここで切断容易な結合をフランキングする基質中のアミノ酸を酵素により切断されるペプチド結合に関するそれらの位置に従い番号をつける。切断容易な結合に対してＮ−末端のペプチド基質のアミノ酸側鎖は切断容易な結合から増加する距離で連続的にＰ１〜Ｐｎと番号をつける。切断容易な結合に対してＣ−末端のペプチド基質のアミノ酸側鎖は連続的にＰ１′〜Ｐｎ′と番号をつける。Ｐ１およびＰ１′アミノ酸側鎖は切断すべきペプチド結合の形成に関係するアミノ酸に相当する。側鎖Ｐ１〜ＰｎおよびＰ１ ′〜Ｐｎ′は、それぞれ、酵素のサブサイトＳ１〜ＳｎおよびＳ１′〜Ｓｎ′の対応する部位との特異的相互作用を形成することをもくろむ。Ｐ側鎖と対応するＳサブサイトとの間の相互作用はプロテアーゼ−基質複合体の安定化のための結合エネルギーに寄与し、こうして相互作用に対する特異性を付与する。ペプチド模倣インヒビターの開発のために取ったアプローチは、実施例２および３のｎ−ダンシルペプチド基質のアッセイ、あるいは実施例８に記載するホロ −APP分解のアッセイを利用して、精製たカテプシンＤと組み合わせて、酵素学的測定を行うことができる。生体外のカテプシンＤによりタンパク質分解切断のために最適なペプチド長さおよび配列の定量。配列Dns-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH₂ （配列識別番号：７）のドデカペプチドを使用して出発して、酵素加水分解のための見掛けの反応速度論的パラメーターへのＮ−末端またはＣ−末端からのペプチドの短縮の効果を酸性のpHおよび最適なイオン強度で決定する。最適な長さのペプチド中の各位置におけるアミノ酸の変動の加水分解のKmおよびVmaxへの効果を決定する。インヒビターの合成。最適な切断に必要な必須アミノ酸配列（上の１ａ，ｂから）、および適当なスペーサーを含有するペプチド模倣化合物を合成する。これらのペプチド中のアミノ酸配列はAPP基質中の切断部位付近に観察されるもの、例えば、Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp（配列識別番号：４）およびTrp-His-S er-Phe-Gly-Ala-Asp-Ser（配列識別番号：５）と同一であるか、あるいはカテプシンＤの生体外の阻害についてのそれらの効能の研究に基づいてカテプシンＤに対する最適な結合を付与することが発見されたものから選択することができるであろう。Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp（配列識別番号：４）およびTrp-His -Ser-Phe-Gly-Ala-Asp-Ser（配列識別番号：５）の場合において、Ｐ１およびＰ１′は、それぞれ、Ｅ−ＶおよびＦ−Ｇである。上の配列または最適なカテプシンＤ阻害を示す配列（Ｎ−および／またはＣ− 置換を含有する、より短い変異型を包含する）を含有するペプチドインヒビターを合成し、ここでＰ１およびＰ１′の間のペプチド結合のCO−NH−原子は次の標準のスペーサーの群により置換されておりそして適当な合成ルートを使用してそれらの任意の可能な立体化学的立体配置を得る；還元されたアミド、ヒドロキシ同配体、ケトン同配体、ジヒドロキシ同配体、スタチン類似体、ホスホネートまたはホスホンアミド、逆アミド。これらのインヒビターの大部分はトランジション状態の類似体として機能するであろう。本発明の生体外アッセイ（Ｎ−ダンシル−ペプチドアッセイまたはホロ−APP 分解アッセイ）のいずれかを使用して決定されたこれらの第１世代の化合物の効能は、次のいずれかまたはすべてにより最適化することができるであろう：（ｉ）フランキングアミノ酸残基の付加または欠失；（ii）インヒビター中の各位置におけるアミノ酸側鎖の型（ＤまたはＬ）の変更；（iii）ブロッキング基、例えば、Bocまたはアセチル（Ｎ−末端）、またはＯ −Me、Ｏ−ベンジル、Ｎ−ベンジル（Ｃ−末端）を使用するＮ−またはＣ−末端の置換。上の方法に従い合理的に開発されたインヒビターの外に、他の既知のカテプシンＤインヒビターの全体または一部分をアルツハイマー病のための治療的インヒビターとして、あるいはインヒビターの効能の最適化およびアルツハイマー病の治療のために新しい誘導体の開発のための出発点として使用できるであろう。このようなインヒビターは次のものを包含する：１−デオキシノジリミシン（Lema nskyら、1984，J．Biol．Chem．259：10129）；ジアゾアセチル−ノルロイシンメチルエステル（Keilovaら、1970，Febs Lett．９：348）；Gly-Glu -Gly-Phe-Leu-Gly-Asp-Phe-Leu（配列識別番号：６）（Gubenseckら、1976，Feb s Lett．71：42）：カイチュウ属（Ascaris）からのペプシンインヒビター（Kei lovaら、1972，Biochim．Biophys．Acta．284：461）；ペプスタチン（Yamamoto ら、1978，European Journal of Biochemistry，92：499）。実施例12 培養において維持されたヒト胎児の腎（HEK）293細胞によるAPPC−末端の断片の形成へのペプスタチンＡ、カテプシンＤのインヒビターの作用次の実施例は、生体外のカテプシンＤによりAPP695から形成されることが示されたもの（実施例９）と同一の大きさ（15kDa）のAPPのＣ−末端断片を形成しそして組織培養培地の中に解放するHEK293細胞の能力を、ペプスタチンＡ、カテプシンＤ活性が生体外で阻害することを示す。HEK細胞はトランスフェクションされたAPP695からベータ−アミロイドを解放することが知られており、それゆえアミロイド発生APPプロセシングに必要なプロテアーゼを含有する〔C．Haassら、1 992，Nature，359：322〕。したがって、これらの細胞はベータ−アミロイド形成の研究のための許容された細胞モデルを提供する。これらの細胞の中に存在するAPP751/770の内因性レベルは下に概説する研究のための基質として働いた。われわれは400mlの懸濁培養においてHEK293細胞を成長させた。いくつかの培養物は、DMSO溶媒単独（0.01％ｖ／ｖ最終）を含有したか、あるいはDMSO＋10μＭ最終のペプスタチンＡを含有した。第19ａ図から明らかなように、DMSOまたはDMSO ＋ペプスタチンのいずれも、使用したこれらの物質の濃度においてHEK293細胞の成長速度に悪影響を及ぼさなかった。DMSOまたはDMSO＋ペプスタチンＡで処理した細胞から後期対数期に取った培地のアリコート（185ml）を、推奨される手順〔Axen R．ら、1967，Nature，214：1302〕によりCNBr活性化セファローズ４Ｂ（ファーマシア）を使用してセファローズ４Ｂ上に固定化したモノクローナルC2 86.8A（実施例６）の同一大きさのカラム（1.5×５cm）の上に通した。負荷の前に、カラムを500mMのNaClを含有する100mMの重炭酸ナトリウム緩衝液pH8.3で平衡化した。HEK293細胞により組織培養培地の中に解放されたAPP断片を含有するベータ−アミロイドは固定化モノクローナル抗体に結合し、そして引き続いて0. 025％ｖ／ｖのトリトンＸ−100を含有する100mMのグリシンpH2.4で洗浄することによって１ml／分でカラムから溶離された。溶離された画分（４ml）を実施例８のイムノブロット手順にかけて、カラムに結合しそして引き続いてカラムから溶離されたAPP断片を検出した。イムノブロット検出は実施例６方法ｉ）の抗Ｃ− 末端抗体を使用して実施した。この手順により検出された画分はベータ−アミロイドのＮ−末端のペプタペプチド配列（固定化C286.8Aへの結合を説明するために）ならびにＣ−末端ドメインまたはその一部分（抗Ｃ−末端抗体との反応性を説明するために）を含有しなくてはならないであろう。第19ｂ図は、DMSOのみまたはDMSO＋ペプスタチンＡの存在下に成長させた細胞からの培地を負荷した固定化C286.8Aのカラムからの溶離画分の中に回収されたＣ−末端断片の量を比較する。クロマトグラフィーを平行に同一条件下に実施した。理解できるように、ペプスタチンＡを使用する処理はイムノブロットにより検出できる溶離された15〜16kDaのAPP誘導断片の量を有意に減少した。この断片はＮ−末端配列Ｇ−Ａ−Ｄ−Ｓ−ＶＰ−Ａ−（表５および第23図）をもつカテプシンＤにより生体外で形成された断片と同一大きさであり、そしてベータ−アミロイドのある形態に相当するＮ−末端をもつ同様な5.6kDaの断片の細胞の形成における中間体を表すことができるであろう。生体外でカテプシンＤにより形成される他のAPP断片はこの実験において検出されなかった。検出されなかった断片は、検出限界より下に存在したか、あるいは他のプロテアーゼにより細胞中でさらに分解した可能性がある。この実験が示すように、HEK293細胞。すなわち、細胞のアミロイド形成の特徴を示す許容される細胞系は、カテプシンＤにより生体外で形成されたAPP695 断片に類似する少なくとも１つのAPP断片を作りかつ解放し、そしてこの断片の形成は無毒の投与量のカテプシンＤインヒビターにより阻害される。こうして、カテプシンＤのペプチドに基づくインヒビターは細胞のAPPのプロセシングを変更するとき実用性を有する。実施例13：阻害の研究カテプシンＤによるＮ−ダンシル−ISEVKMDAEFR−NH₂の生体外加水分解を使用して、レニンおよびHIV−プロテアーゼインヒビターのプログラムから選択された250のペプチド化合物を、ヒトカテプシンＤを阻害するそれらの能力についてスクリーニングした。これらのうちで、下表６において同定された化合物は効力のあるカテプシンＤ阻害の効能を示した。表６に記載する番号に対応するインヒビターの構造を下表７に表す：ここにおけるすべての式において、略号BOCはｔ−ブトキシカルボニルを表す。以上のインヒビターは次のようにして製造することができる：インヒビター１，２，３，４，５，10および20はドイツ国特許出願（DE）第4,215,874号、1992 年５月14日出願（これは米国特許出願第08 /059,488号、1993年５月10日出願に相当する）に記載されている。これらの出願の両方をここに引用によって加える。インヒビターは抗ウイルス剤、ことにHIV プロテアーゼインヒビターであると開示されている。インヒビター１は次のようにして製造した：第１工程：10mlの無水ジクロロメタン中の614mg（2.20mmol）の（２Ｒ）−Ｎ −（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−アミノ−２−〔２−（１，３−ジチオラン −２−イル）〕酢酸（欧州特許（EP）第412 350号）および337mg（2.20mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）の撹拌した０℃に冷却した溶液を43 4mg（2.10mmol）のジシクロヘキシルカーボジイミド（DDC）で処理し、そしてこの混合物を５分間撹拌する。次いで、10mlのジクロロメタン中の1.10ｇ（2.20mm ol）の１−｛（２Ｒ，Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−〔５−アミノ−６−シクロヘキシル４ヒドロキシ−２−（１−メチル）エチル−ヘキサノイル〕｝−Ｓ−イソロイシニル−２−ピリジルメチルアミド二塩酸塩（欧州特許（EP）第437 729号）および0.88ml（8.0mmol）のＮ−メチルモルホリンの溶液を滴々添加する。冷却浴を除去し、そして反応混合物を室温において２時間撹拌する。反応の終わりを薄層クロマトグラフィーにより決定する。生ずる尿素を濾過により除去し、濾液を真空濃縮し、そして粗組成物を90ｇのシリカゲル（ジクロロメタン：メタン95：５）のクロマトグラフィーにより精製する。1.29ｇ（理論値の88％）の化合物：が淡い粉末として得られる。第２工程：17mlの無水ジオキサン中の塩化水素ガスの４Ｎ溶液中の2.41ｇ（3. 28mmol）の上の化合物21の溶液を０℃において30分間する。次いで15mlのトルエンを添加し、そしてこの混合物を真空濃縮する。この方法をさらに２回反復し、次いで残留物をエーテルで粉砕し、吸引濾過し、そして高真空下に水酸化カリウム（KOII）の存在下に乾燥すると、2.29ｇ（理論値の98％）の化合物：が無色の粉末として得られる。第３工程：20mlの無水ジクロロメタン中の0.80ｇ（2.40mmol）の（２Ｓ）−３ −ｔ−ブトキシカルボニル−２−（１−ナフチルメチル）−プロピオン酸（H．B uhlmayerら、1988，J．Med．Chem．31：1839に従い製造した）および0.40ｇ（2. 64ｇ（2.64mmol）のHOBTの撹拌し、０℃に冷却した溶液を0.52ｇ（2.52mmol）の DCCで処理し、そして５分間撹拌する。次いで30mlのジクロロメタン中の1.55ｇ（2.19mmol）の上の化合物22および0.96ml（8.74mmol）のＮ−メチルモルホリンの溶液を滴々添加し、そして反応混合物を室温において２時間撹拌する。生ずる尿素を濾過により除去し、濾液を真空濃縮し、そして粗生成物を、必要に応じて、360ｇのシリカゲル（ジクロロメタン：メタノール95：５）のクロマトグラフィーにより精製すると、586mg（理論値の28％）の非極性（２Ｒ）異性体が無色の粉末としておよび690mg（33％）の極性（２Ｓ）一異性体がまた無色の粉末として得られる。インヒビター２，３，４，10および20は同様に適当な酸を適当なアミン塩酸塩（これらは既知であるか、あるいは普通の手段により製造することができる）とカップリングすることによって製造することができる。インヒビター３および20 の集合において、式：を有する化合物から出発することが必要であろう。化合物23の製造は化合物21のそれに類似するが、249mg（0.89mmol）の（２Ｒ）−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−アミノ−２−〔２−（１，３−ジチオラン−２−イル）〕酢酸（欧州特許（EP）第412 350号）および440mg（0.81mmol）の１−｛（２Ｒ，Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−〔５−アミノ−６−シクロヘキシル−４−ヒドロキシ−２−（２−プロペニル）−ヘキサノイル〕｝−Ｓ−イソロイシニル−２−ピリジルメチルアミド二塩酸塩（欧州特許（EP）第437 729号）から出発し、そして粗生成物を24ｇのシリカゲル（ジクロロメタン：メタノール９：１）のクロマトグラフィーにより、553mg（93％）の化合物23が淡い粉末として得られる。次いでアミン塩酸塩の製造は化合物22に類似するが、560mg（0.91mmol）の化合物23から出発する。452mg（91％）のアミン塩酸塩が無色の粉末として得られる。インヒビター10は式：の出発物質を必要とするであろう。化合物24の製造は化合物21のそれに類似するが、258mg（0.92mmol）の（２Ｒ）−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−アミノ−２−〔２−（１，３−ジチオラン−２−イル）〕酢酸（欧州特許（EP）第 412 350号）および500mg（0.84mmol）の１−｛（２Ｒ，Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−〔５ −アミノ−６−シクロヘキシル−４−ビドロキシ−２−（２−フェニル）−ヘキサノイル〕｝−Ｓ−イソロイシニル−２−ピリジルメチルアミド二塩酸塩（欧州特許（EP）第437 729号）から出発し、そして粗生成物を20ｇのシリカゲル（ジクロロメタン：メタノール９：１）のクロマトグラフィーにより、593mg（90％）の化合物24が非晶質粉末として得られる。次いでアミン塩酸塩の製造は化合物 22に類似するが、589mg（0.75mmol）の化合物23から出発する。484mgのアミン塩酸塩が無色の粉末として得られる。インヒビター７は公開された欧州特許出願（EP）第0 472 077号（これは1992 年２月26日に公開され、そしてその内容全体をここに引用によって加える）から知られている。このインヒビターはその中にHIVプロテアーゼ活性をもつインヒビターとして開示されている。インヒビター８は公開された欧州特許出願（EP）第0 441 912号（これは1991 年８月14日に公開され、そしてその内容全体をここに引用によって加える）から知られている。このインヒビターはそのレニンのインヒビターとして開示されている。インヒビター９，15，16および19は公開された欧州特許出願（EP）第0 472 07 8号（これは1992年２月26日に公開され、そして1992年９月15日に発行された米国特許第5,147,865号に等しい）から知られている。両方の刊行物の内容全体をここに引用によって加える。これらのインヒビターはその中にHIVプロテアーゼ活性をもつインヒビターとして開示されている。インヒビター11および12はドイツ国特許出願（DE）第41 26 485号（これは199 1年８月10日に出願され、そして1992年７月24日に出願された米国特許出願第07/ 920,216号に対応する）に記載されている。３件の刊行物の開示全体をここに引用によって加える。これらのインヒビターはその中にHIVプロテアーゼ活性をもつインヒビターとして開示されている。これらのインヒビターの両方は次のようにして製造することができる：第一ステップ無水ジオキサンに気体塩化水素を溶解した４Ｎ溶液100mlに、5 .00ｇ（20.21mmol）の（Ｓ）−２−（tert−ブトキシカルボニルアミノ−１−フェニルブテ−３−エン〔J．R．Lulyら、J．Org．Chem．52巻、1487頁、1987年〕を溶解した溶液を、室温で30分間撹拌する。次にトルエン15mlを添加し、得られた混合物を減圧で濃縮する。この工程をさらに２回繰返し、次いで残留物を少量のエーテルと共に研和（trituate）し、吸引して濾別し、高真空下KOHで乾燥して、下記化合物3.69ｇ（理論量の99％）を無色の結晶として得る。第二ステップ無水ジクロロメタン40mlに、Ｎ−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−バリン4.81ｇ（22.13 mmol）とHOBT3.29ｇ（24.35mmol）を溶解し攪拌して得た溶液を０℃まで冷却し、次いでDDC5.29ｇ（25.65mmol）で処理し５分間撹拌する。次に、ジクロロエタン30mlに、3.70ｇ（20.12mmol）の化合物25と8.8 5ｇ（80.48mmol）のＮ−メチルモルホリンを溶解して得た溶液を滴下して加える。冷却浴を外し反応混合物を室温で２時間撹拌する。反応が終了したことは薄層クロマトグラフィーで測定した。生成した尿素を濾過して除き、濾液を減圧で濃縮し、次いでその粗生成物をシリカゲル450ｇ（ジクロロメタン：メタノール95 ：５）によって精製して下記化合物6.07ｇ（理論量の87％）を無色泡状物として得る。第三ステップ無水ジオキサンに気体塩化水素を溶解した４Ｎ溶液100mlに、6 .08ｇ（17.53mmol）の化合物26を溶解して得た溶液を室温で30分間撹拌する。次にトルエン15mlを添加し、得られた混合物を減圧で濃縮する。この工程をさらに２回繰返し、次いで残留物を少量のエーテルで研和し、吸引して濾別し、高真空下KOHで乾燥して、下記化合物4.90ｇ（理論量の99％）を無色粉末として得る。第四ステップ 1.50ｇ（4.47mmol）の（２Ｓ）−３−tert−ブチルスルホニル −２−（１−ナフチルメチル）−プロピオン酸〔H．B って製造した〕と0.66ｇ（4.92mmol）のHOBTを、15mlの無水ジクロロメタンに溶解し撹拌して得た溶液を０℃まで冷却し、次いでDCC0.97ｇ（4.69mmol）で処理し５分間撹拌する。次に、1.15ｇ（4.07mmol）の化合物27と1.80ml（16.27mmol ）のＮ−メチルモルホリンをジクロロメタン10mlに溶解した溶液を滴下して加え、反応混合物を室温で１時間撹拌する。生成した尿素を濾過して除き、濾液を減圧で濃縮し、次いでその粗生成物を、シリカゲル270ｇのクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール95：５）で精製して下記の化合物2.01ｇ（理論量の 88％）を無色泡状物として得る。第五ステップジクロロメタン中に化合物28を加え撹拌して得た懸濁液を０℃ まで冷却し、次いで２当量のｍ−クロロ過安息香酸（MCPBA）（80％濃度）で処理し、上記温度で２時間撹拌する。さらに１当量のMCPBAを添加し次いでその混合物をさらに１時間室温で撹拌する。次に酢酸エチルを添加しその反応混合物を 10％Na₂SO₃溶液のに加えて撹拌する。有機層を分取し、NaHCO₃溶液で３回洗浄し次いでMgSO₄で乾燥する。溶媒を減圧蒸発させた後、残留物を少量のエーテル／ペンタンと共に研和（trituate）して下記の化合物を無色の粉末として得る。第六ステップ化合物29、および（２Ｓ）−２−（トリフルオロメチル）−ピロリジン〔G．V．Shustovら、Isvest．Akad．Nauk． SSSR，1422，1987年（英文）参照〕（インヒビター11を製造する場合）または（２Ｓ）−２−（トリフルオロメチル）−ピペリジン（インヒビター13を製造する場合）をｎ−プロパノールに溶解した溶液を、高温下圧力容器内で撹拌する。反応混合物を冷却した後、減圧で濃縮し次にシリカゲルのクロマトグラフィーにかける。ｎ−ペンテンと共に研和したした後インヒビターを得る。インヒビター５と６は前掲のヨーロッパ特許第0441912号の一般教示事項に入っており、この特許に教示されている製造図式にしたがって製造することができる。したがってインヒビター５は下記のようにして製造することができる。第一ステップＬ−フェニルアラニン300ｇ（1.91mol）を、ジオキサン360ml および水360mlの混合物中に懸濁させる。ジ−tertブチルジカーボネート432.9ｇ（1.98mol）を撹拌しながらpH9.8で添加する。このpHは約975mlの４Ｎ NaOHで一定に維持する。16時間後、反応混合物をエーテルで抽出し、その水性層を、クエン酸を用いてpHを３〜４に調節し、次いでエーテルで２回および酢酸エチルで２回洗浄する。有機相を合し次に水で３回洗浄する。ロータリーエバポレーターで濃縮し次いでジエチルエーテル／ヘキサンから結晶化させて下記の化合物291.6 ｇ（60.7％収率）を得る。第二ステップ 265ｇ（1.0mol）の化合物30を２Ｌのメタノールに溶解し、20 ｇの５％Rh／Ｃで40気圧下５時間水素化する。触媒を吸引しながらセライトで濾別し、メタノールで洗浄し、得られた溶液を濃縮する。下記の化合物271ｇ（100％収率）が得られる。第三ステップ 163.0ｇ（0.601mol）の化合物31と40.3ｇ（0.661mol）のＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンを２Ｌの塩化メチレン室温で溶解する。０℃で、303.5ｇ（3.005mol）のトリエチルアミンを滴下して加える（pHは約８）。塩化メチレンにnPPaを溶解した50％濃度の溶液390.65ml（0.601mol）を最高−10℃ で滴下して加える。得られた混合物を一夜25℃まで昇温させ、16時間撹拌する。その反応混合物を濃縮し、残留物に飽和重炭酸塩溶液500mlを加え、次いでその混合物を25℃で20分間撹拌する。酢酸エチルで３回抽出した後、有機相をNa₂SO₄ で乾燥し次いで濃縮する〔粗収量：178ｇ（94.6％）〕。この粗物質をシリカゲルのクロマトグラフィ（移動相系CH₂Cl₂：CH₃OH 98：２）に付して下記の化合物 36.6ｇを得る。第四ステップ窒素雰囲気下、炎をあてて乾燥した装置内で、63 .7ｇ（0.21mol）の化合物32をアルミナで処理したエーテル1.5Ｌに溶解し、０℃ でLiAlH4 10ｇ（0.263mol）を少しづつ添加し、次にその混合物を０℃で20分間撹拌する。次に50ｇ（0.367mol）のKHSO₄の水（１Ｌ）溶液を０℃で注意深く滴下して加える。相分離が起こり、水性相をジエチルエーテル300mlづつで３回抽出し、次いで合した有機相を、３Ｎ HClで３回、NaHCO₃溶液で３回次にNaCl溶液で２回洗浄する。有機相をNa₂SO₄で乾燥し濃縮する。下記の化合物45ｇ（84.1 ％収率）を回収した。この化合物33は直ちに処理するかまたは１〜２時間−24℃で貯蔵する。第五ステップ 14.6ｇ（35mmol）の“インスタントイリド（instant ylide） ”（Fluka 69500）を、90mlの無水テトラヒドロフラン中に懸濁させる。氷中で冷却しながら20℃〜25℃の反応温度で、無テトラヒドロフラン45mlに9.0ｇ（35m mol）の化合物33を溶解した溶液を滴下して加える。その反応混合物を15分間撹拌し、氷250ml中に注入し、酢酸エチル／ｎ−ヘキサン３：１ 150mlづつを用いて２回抽出する。Na₂SO₄で乾燥し濃縮した後、残留物をシリカゲルのクロマトグラフィー（移動相エーテル：ヘキサン７：３）に付して下記の化合物3.2ｇ（40. 0％収率）が得られる。第六ステップ 202.4ｇ（0.8mol）の化合物34を1000mlのメシチレンに溶解し、水トラップを用いて140℃まで加熱する。この温度で、197ｇ（1.6mol）のＮ− ベンジルヒドロキシルアミンと1.6molのアセトアルデヒドのメシチレン800ml中混合物を２時間かけて滴下して加える。４時間と８時間の反応時間が経過した後、メシチレン中、同じ量のＮ−ベンジルヒドロキシルアミンとエチルアルデヒドを滴下する。全反応時間の16時間が経過した後、混合物を濃縮し、残留物にジエーテルを添加し、得られた混合物を１ＭのKHSO₄溶液で洗浄する。Na₂SO₄で乾燥し濃縮した後、残留物をシリカゲルのクロマトグラフィー（移動相エーテル：ヘキサン３：７）にかける。下記の化合物が得られる。第七ステップ 18.1ｇ（45mmol）の化合物35（ジアステレオマーＣ）をメタノール300mlに溶解する。14.2ｇ（225mmol）のギ酸アンモニウムを添加した後、装置をN₂で充分にフラッシュし次いで3.6ｇのパラジウム／炭（10％）を添加する。得られた混合物を還流しながら３時間撹拌する。冷却し、続いて濾過によって触媒を除き、溶液を濃縮し、酢酸エチルに溶解し、次いで飽和重炭酸塩溶液で２回洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、次いで高真空度下で乾燥する。下記の化合物11.36ｇが得られる。第八ステップ 6.6ｇ（21mmol）の化合物36を塩化メチレン500mlに溶解する。水分を遮断して（CaCl₂管）、無水ペンタン酸〔塩化メチレン50ml中の、2.16ｇ（21mmol）のペンタン酸と2.16ｇ（10.5mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミドとで製造し濾過して得られる〕を塩化メチレンに溶解した溶液を室温で添加する。３時間後、濃縮を行い続いて酢酸エチル中に投入し、飽和重炭酸塩溶液で洗浄し次いで硫酸ナトリウムで乾燥する。濾過し濃縮し、次いで高真空下で乾燥する。8.0ｇ（理論量の95.2％）の下記の化合物が得られる。第九ステップ 7.57ｇ（19mmol）の化合物37を、４Ｎ塩酸／ジオキサン70ml中で、水分を遮断して30分間撹拌する。得られた溶液を濃縮しジエチルエーテルと混合し次いで蒸発乾固する。高真空下で乾燥した後、生成した塩酸塩5.54ｇ（16 .5mmol）、HOBT 4.46ｇ（33mmol）およびBoc-Val-OH 16.5mmolを塩化メチレン50 0mlに溶解する。０℃まで冷却した後、Ｎ−メチルモルホリンを用いてpHを8.5に調節し、次いで3.57ｇ（17.3mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加する。20℃で16時間経過後、尿素を濾別し、溶液を濃縮し、酢酸エチルに投入し、次いで飽和重炭酸塩溶液で洗浄する。酢酸ナトリウムで乾燥し、続いて濃縮し高真空度下で乾燥する。下記の化合物が得られる。第十ステップ 1.8mmolの化合物38を11mlの４Ｎ塩酸／ジオキサン中で30分間撹拌する。得られた溶液を濃縮し、ジエチルエーテルと混合し次いで蒸発乾固する。高真空度下で乾燥した後、生成した塩酸塩1.8mmo lを塩化メチレン50mlに溶解し、０℃まで冷却する。BOC−フェニルアラニン1.8m molを添加した後、トリエチルアミンでpHを約８に調節し、次に875.2mg（1.98mm ol）のベンゾトリアゾリルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを添加する。室温で16時間反応させ、続いて濃縮し、酢酸エチル中に投入し次に飽和重炭酸塩溶液で３回洗浄する。インヒビター５が粗製形態で得られ次いでシリカゲルのクロマトグラフィーにかける。インヒビター６は、第八ステップにおいて、無水３−メチルペンタン酸〔塩化メチレン50ml中、21mmolの３−メチルペンタン酸と2.16ｇ（10.5mmo1）のジシクロヘキシルカルボジイミドとで製造し濾過して得られる〕を塩化メチレンに溶解した溶液を使用することを除いて、インヒビター５と類似の方法で得られる。インヒビター17は前掲のヨーロッパ特許第0472077号の一般教示事項に入っており、この特許に教示されている製造図式にしたがって製造することができる。したがってインヒビター17は下記のようにして製造できる。第一ステップ無水ジオキサンに気体塩化水素を溶解した４Ｎ溶液100mlに、5 .07ｇ（20.00mmol）の（Ｓ）−２−（tert−ブトキシカルボニルアミノ−１−シクロヘキシルブテ−３−エン〔J．R．Lulyら、J．Org．Chem.,52巻、1487頁、19 87年〕を溶解して得た溶液を室温で30分間撹拌する。次にトルエン15mlを添加し、得られた混合物を減圧で濃縮する。この工程をさらに２回繰返し、次いで残留物を少量のエーテルで研和し、吸引濾別し、次いで高真空度下KOHで乾燥する。下記の化合物3.76ｇ（理論量の99％）が無色の結晶として得られる。第二ステップ 4.63ｇ（21.3mol）のＮ−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ −バリンと3.29ｇ（24.35mmol）のHOBTとを40mlの無水ジクロロメタンに溶解した溶液を攪拌し０℃まで冷却し、次いで5.29ｇ（25.65mmol）のDDCで処理し、次いでその混合物を５分間撹拌する。3.60ｇ（19.00mmol）の化合物39および8.85m l（80.48mmol）のＮ−メチルモルホリンをジクロロメタン30mlに溶解した溶液を滴下して加える。冷却浴を外し、反応混合物を室温で２時間撹拌する。反応の完了は薄層クロマトグラフィーで測定する。生成した尿素を濾過して除き、濾液を減圧で濃縮し、次いで粗生成物を450ｇのシリカゲル（ジクロロメタン／メタノール95：５）のクロマトグラフィーで精製する。4.33ｇ（理論量の65％）の下記化合物が無色の結晶として得られる。第三ステップ無水ジオキサンに気体塩化水素を溶解した４Ｎ溶液100mlに、4 .32ｇ（12.30mmol）の化合物40を溶解した溶液を室温で30分間撹拌する。次にトルエン15mlを添加し、得られた混合物を減圧で濃縮する。この工程をさらに２回繰返し、次に残留物を少量のエーテルで研和し、吸引濾別を行い高真空度下KOHで乾燥する。3.37ｇ（理論の95％）の下記の化合物が無色の粉末として得られる。第四ステップ 4.47mmolのBoc−Ｌ−シクロヘキシルアラニン〔M．C．Khosla ら、J．Med．Chem.,15巻、792頁、1972年〕と0.66ｇ（4.92mmol）のHOBTとを無水ジクロロメタン15mlに懸濁させて撹拌し０℃に冷却し、次いで0.97ｇ（4.69mm ol）のDCCで処理し得られた混合物を５分間撹拌する。次に、4.07mmolの化合物4 1と1.80ml（16.27mmol）のＮ−メチルモルホリンをジクロロメタン10mlに溶解した溶液を滴下して加え、次いでその反応混合物を室温で１時間撹拌する。生成した尿素を濾過して除き、濾液を減圧で濃縮し、次にその粗生成物を270ｇのシリカゲル（ジクロロメタン：メタノール95：５）のクロマトグラフィーにかける。下記化合物が得られる。第五ステップ 0.60mmolの化合物42をジクロロメタン３mlに入れ撹拌して調製し０℃まで冷却した懸濁液を、２当量のｍ−クロロ過安息香酸（80％濃度）で少しづつ処理し、得られた混合物を上記温度で２時間撹拌する。次いで、さらに１当量のｍ−クロロ過安息香酸を添加し、続いてその混合物を室温で１時間撹拌する。酢酸エチル10mlを添加し、その反応混合物を20mlの10％濃度のNa₂SO₃の溶液に入れて撹拌する。有機相を分取し、NaHCO₃溶液10mlで３回洗浄し次いでMgSO₄ で乾燥する。溶媒を減圧で蒸発させた後、残留物を少量のエーテル／ペンタンで研和し、インヒビター17が得られる。インヒビター14は、1991年７月24日に公開されかつ米国特許第5,145,951号（1 992年９月８日に発行された）に対応するヨーロッパ特許願公開第0437729号によって公知である。これら両刊行物の全内容は本願に援用するものである。このインヒビター14はこれら刊行物に、HIVプロテアーゼ活性のインヒビターとして開示されている。インヒビター18は、1990年12月27日に公開され、かつ1992年４月28に出願され現在係属中の米国特許願第07/876,697号（1990年５月16日に出願されすでに放棄された米国特許願第07/524,779号の継続出願である）に対応するヨーロッパ特許願公開第0403828号によって公知である。これらの三つの出願の全開示事項は本願に援用するものである。このインヒビター18はこれら出願に、HIVプロテアーゼ活性のインビターとして開示されている。本願の明細書と特許請求の範囲は例示のために記載されているので本発明を限定せず、そして本発明の思想と範囲を逸脱することなく各種の改変と変更を行うことができることは分かるであろう。具体的に述べると、上記出願に開示されている他のインヒビターも本願で述べているように有用である。本願の特許請求の範囲にはこれらの他の実施態様も含まれる。配列表一般情報出願人：タンブリーニ，ポールピー；ベンツ，ギュンター；ヘビッヒ，ディエター発明の名称：カテプシンＤはアルツハイマー症でアミロイドを生成するプロテアーゼである配列の数：９通知送付先受取人：Miles Inc．住所：モーガン・レーン・400 都市名：ウェストヘーブン州名：コネティカット国名：米国郵便番号(ZIP)：06516 コンピュータの読出し可能なフォーム媒体の種類：ディスケット、3.50インチ、800Kb記憶コンピュータ：Sharp PC 4600 オペレーティングシステム：MS−DOS ソフトウェア：Word Perfect 5.1 本件出願のデータ出願番号：割り当てられていない出願日：分類：割り当てられていない。原出願のデータ出願番号：07/995,660 出願日：1992年12月16日原出願のデータ出願番号：07/880,914 出願日：1992年５月11日弁護士／弁理士の情報氏名：パメラエイシモントン登録番号：31,060 名簿番号：MTI 224.2 通信の情報電話番号：(203)937−2340 ファクシミリ番号：(203)937−2975 配列番号：１配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列配列番号：２配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列配列番号：３配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列配列番号：４配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列配列番号：５配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列配列番号：６配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列配列番号：７配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列配列番号：８配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 刊行物の情報著者：カングら雑誌名：Nature 巻数：325 頁数：733 発行時：1987年配列配列番号：９配列の長さ：６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 45/00 ＡＥＤ 9450−4ＨＣ０７Ｆ 9/572 ＺＣ０７Ｆ 9/572 9152−4ＢＣ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 6807−4ＢＣ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 8310−2Ｊ 33/561 33/561 9159−4ＣＣ０７Ｄ 207/08 // Ｃ０７Ｄ 207/08 9284−4Ｃ 211/60 211/60 7329−4Ｃ 303/36 303/36 9455−4Ｃ 339/06 339/06 7602−4Ｃ 409/12 ２１１ 409/12 ２１１ 7602−4Ｃ２１３２１３ 7602−4Ｃ 409/14 ２１３ 409/14 ２１３ 8517−4ＨＣ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 8517−4Ｈ 7/08 7/08 8517−4Ｈ 14/81 14/81 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＤ (72)発明者ベンツ，ギュンターハンスハインツヘルベルトアメリカ合衆国，コネチカット 06437, ギルフォード，シルバンヒルズロード 81 (72)発明者ハービッヒ，ディータードイツ連邦共和国，デー―42115 ブッペルタル，クルマヘールシュトラーセ 82 (72)発明者ドレイヤー，ロバートノーマンアメリカ合衆国，コネチカット 06492, ウォーリングフォード，イーストセンターストリート 838

Claims

【特許請求の範囲】１．アルツハイマー症のβ−アミロイドタンパク質の前駆物質に対して特異的な少なくとも一つのプロテアーゼのインヒビターによってβ−アミロイドタンパク質の生成を調節する方法。２．前記インヒビターが、アスパラギン酸プロテアーゼ類およびセリンプロテアーゼ類に対して特異的なインヒビターからなるインヒビター群から選択される請求の範囲１記載の方法。３．アスパラギン酸プロテアーゼ類の前記インヒビターがカテプシンＤを特異的に阻害する請求項２記載の方法。４．セリンプロテアーゼ類の前記インヒビターが、α−２−アンチプラスミン、キモトリプシンインヒビターIIまたはTPCKで阻害され、かつｐ７〜９において、11，14および18kDaのAPPのＣ末端フラグメントを形成するセリンプロテアーゼを特異的に阻害する請求の範囲２記載の方法。５．前記インヒビターが、１−デオキシノジリマイシン、ジアゾアセチル−ノルロイシンメチルエステル、Gly-Glu-Gly-Phe-Leu-Gly-Asp-Phe-Leu（配列番号：６）、回虫ペプシンインヒビターおよびペプスタチンからなる群から選択される請求の範囲３記載の方法。６．前記インヒビターが、下記化合物からなる群から選択される請求の範囲１記載の方法。７．カテプシンＤのインヒビターの治療量を投与することを含んでなる、アルツハイマー症のアミロイドプラークの生成を防止する方法。８．前記インヒビターが、還元型（reduced）アミド類、ヒドロキシアイソスター（isoster）、ケトンアイソスター、ジヒドロキシアイソスター類、スタチン類似体類、ホスホネート類、ホスホンアミド類および逆性（reversed）アミド類からなる群から選択される反応性スペーサーを含有する遷移状態類似体である請求の範囲７記載の方法。９．前記インヒビターが下記化合物：からなる群から選択される請求の範囲７記載の方法。 10．（ａ）カテプシンＤが触媒として活性である条件下で、カテプシンＤを、カテプシンＤが切断できるペプチド基質とともにインキュベートして第一インキュベート試料を生成させ；（ｂ）インヒビターになる可能性がある物質の存在下で、カテプシンＤを、カテプシンＤが切断できるペプチド基質とともにインキュベートして第二インキュベート試料を生成させ；（ｃ）所定の期間に生成するペプチド生成物の量を分析して、前記第一インキュベート試料と前記第二インキュベート試料の生成物の生成速度を計算し；（ｄ）インヒビターになる可能性がある物質の存在下で観察される減少した酵素活性を計算することを含んでなり、その減少が阻害活性を示す；カテプシンＤのインヒビターの同定方法。 11．前記カテプシンＤがヒトカテプシンＤである請求の範囲10記載の方法。 12．前記ペプチド基質がＮ−ダンシル化されている請求の範囲10記載の方法。 13．アミロイド前駆タンパク質を分解できる分子のタンパク質分解活性の測定方法であって；（ａ）ヒトから生理学的試料を入手し；（ｂ）上記試料中の、アミロイド前駆タンパク質を分解するプロテアーゼが触媒として活性である条件下、アミロイド前駆タンパク質基質の存在下で上記試料をインキュベートし；（ｃ）ステップ（ｂ）のインキュベートを終った混合物の一部分を用いてゲルを形成し；（ｄ）ステップ（ｃ）のゲルを電気泳動に付して、別個のポリペプチド成分を示す電気泳動移動パターンを得て；（ｅ）ステップ（ｄ）の前記成分を膜にブロットし；（ｆ）ステップ（ｅ）で得た前記ブロットされた膜を、抗アミロイド前駆タンパク質抗体と接触させ；（ｇ）前記抗アミロイド前駆タンパク質抗体を認識しかつ検出可能なリガンドに結合されている第二抗体と、前記ブロットされた膜を反応させ；次いで（ｈ）β−アミロイドペプチド配列を含有するのに充分な大きさのフラグメントに対応する領域におけるブロットの染色強度を検査する；ことを含んでなる測定方法。 14．前記生理学的試料が、脳の組織および脳脊髄液からなる群から選択される請求の範囲13記載の方法。 15．前記生理学的試料がカテプシンＤを含有している請求の範囲14記載の方法。 16．さらに、前記の生理学的試料を処理して、粗製ホモジネート、可溶性画分、または界面活性剤で可溶化された膜の画分を得ることを含んでいる請求の範囲 13記載の方法。 17．前記アミロイド前駆タンパク質基質が、点変異を含有する遺伝子配列から翻訳される請求の範囲13記載の方法。 18．前記アミロイド前駆タンパク質基質が、アミロイド前駆タンパク質のＣ末端部分に対応する請求の範囲13記載の方法。 19．前記抗アミロイド前駆タンパク質抗体が、β−アミロイドペプチドおよびアミロイド前駆タンパク質のＣ末端フラグメントからなる群から選択されるペプチドを認識する請求の範囲13記載の方法。 20．前記Ｃ末端フラグメントが、組換えＣ−100もしくはβ−アミロイドのサイズマーカーと同時移動することによって検出されるようなＣ−100もしくはβ −アミロイドのペプチドフラグメントを含有している請求項19記載の方法。 21．アミロイド前駆タンパク質に対して特異的なプロテアーゼのインヒビターを同定する方法であって；（ａ）生理学的試料をヒトから得て；（ｂ）上記試料の一部および選択されたアミロイド前駆タンパク質基質で第一インキュベート試料を形成し、次いで前記試料の第二の部分、前記の選択されたアミロイド前駆タンパク質基質および被験インヒビターで第二インキュベート試料を形成し；（ｃ）予め決められた期間が経過した後、ステップ（ｂ）のインキュベーションを停止し；（ｄ）ステップ（ｃ）のインキュベーションを停止された反応混合物の一部を用いてゲルを形成し；（ｅ）ステップ（ｄ）のゲルを電気泳動に付して、別個のポリペプチド成分を示す電気泳動移動パターンを得て；（ｆ）ステップ（ｅ）の前記成分を膜にブロットし；（ｇ）ステップ（ｆ）で得た前記膜を、抗アミロイド前駆タンパク質抗体と接触させ；（ｈ）前記抗アミロイド前駆タンパク質抗体を認識しかつ検出可能なマーカーに結合されている第二抗体と、前記ブロットされた膜を反応させ；（ｉ）β−アミロイドの配列を含有するのに充分な大きさのフラグメントに対応する領域におけるブロットの染色強度を検査し；次いで（ｊ）前記の第一と第二のインキュベート試料から観察される同じサイズのバンドの染色強度を比較する；ことを含んでなる方法。 22．アミロイド前駆タンパク質に対して特異的な前記プロテアーゼがカテプシンＤである請求の範囲21記載の方法。