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CN116829956A - 用于检测蛋白生物标志物组的抗体在制备诊断ad、mci和其它类型老年痴呆的试剂盒中的用途 - Google Patents

用于检测蛋白生物标志物组的抗体在制备诊断ad、mci和其它类型老年痴呆的试剂盒中的用途 Download PDF

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CN116829956A
CN116829956A CN202380009304.1A CN202380009304A CN116829956A CN 116829956 A CN116829956 A CN 116829956A CN 202380009304 A CN202380009304 A CN 202380009304A CN 116829956 A CN116829956 A CN 116829956A
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CN
China
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protein
amyloid precursor
urine
antibody
seq
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CN202380009304.1A
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戴正乾
顾柏俊
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Hunan Qiankang Technology Co ltd
Original Assignee
Hunan Qiankang Technology Co ltd
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Abstract

本发明公开了用于检测蛋白生物标志物组的抗体在制备诊断阿尔兹海默症(AD)、轻度认知障碍(MCI)和其它类型老年痴呆的试剂盒中的用途，所述所述蛋白生物标志物组包含多个作为蛋白生物标志物的淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein,APP)片段，所述淀粉样前体蛋白片段的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7所示。

Description

用于检测蛋白生物标志物组的抗体在制备诊断AD、MCI和其它 类型老年痴呆的试剂盒中的用途
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及用于检测蛋白生物标志物组的抗体在制备诊断AD、MCI和其它类型老年痴呆的试剂盒中的用途。
背景技术
由于全球范围内阿尔茨海默病病例数量的迅速增加，如今迫切需要找到能够在阿尔茨海默病早期阶段充分检测到的新型生物标志物来进行疾病的早期干预。Aβ聚集，是AD的标志特征，早于疾病临床表现之前多年出现。尽管其主要在大脑中合成，但研究人员发现外周系统在清除脑源性Aβ方面起着至关重要的作用。据估计，约60％的脑Aβ转运到外周被清除。脑源性Aβ通过以下一种或多种方式运输到外周:穿过血脑屏障和血-CSF屏障、间质液流动和CSF出口通路，包括蛛网膜绒毛和胶质淋巴通路。而在外周，Aβ被单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和肝细胞等通过吞噬或内吞作用清除，之后经尿液或胆汁排出，通过Aβ降解酶以及血液中的Aβ结合蛋白降解。由于尿液排泄被认为是人体清除废物和不需要的代谢物的最重要的方式，其可溶性Aβ1-40(Aβ40)和Aβ1-42(Aβ42)是尿液的正常成分并在阿尔茨海默病患者中发生改变也就不足为奇了。然而，关于尿液Aβ的研究仍处于长期被忽视的状态。
淀粉样前体蛋白(APP)是一种在脑内高水平表达的单一跨膜蛋白，可被多种蛋白酶快速代谢分解，包括α-、β-、γ-和η-分泌酶。分解产生大量的APP碎片产物，包括Aβ40和Aβ42。APP连续蛋白水解产生神经毒性Aβ肽，如Aβ42，是AD发生的关键步骤。在散发性AD患者尤其是在APOEε4阴性个体中我们发现APP的分解处理在增加。但除Aβ40、Aβ42外，尿中其他APP片段未见报道。
发明内容
本发明的目的在于，
提供用于检测蛋白生物标志物组的抗体在制备诊断AD、MCI和其它类型老年痴呆的试剂盒中的用途，所述蛋白生物标志物组包含多个作为蛋白生物标志物的淀粉样前体蛋白片段，所述淀粉样前体蛋白片段的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7所示。
优选地，所述诊断是从来源于人类的生物样本中检测所述蛋白生物标志物组，并且其中检测所述蛋白生物标志物组的步骤包括进行生物体外检测。
优选地，所述生物样本为尿液。
优选地，所述抗体是以淀粉样前体蛋白片段的其中一段序列为抗原的抗体。
更优选地，所述抗体包括Aβ抗体和抗Cystatin C抗体体。
更优选地，所述Aβ抗体包括针对鼠抗人Aβ单克隆抗体、针对淀粉样前体蛋白的N端单抗和针对淀粉样前体蛋白的C端的多克隆抗体；具体而言，所述抗Aβ抗体包括W0-2克隆抗体、aducanumab克隆抗体以及针对淀粉样前体蛋白(APP)N端单抗抗体(22C11克隆)、针对淀粉样前体蛋白(APP)C端的多克隆抗体(Ab369)。
优选地，所述蛋白生物标志物组通过蛋白免疫印迹法检测。
本发明的目的还在于，
提供一种用于诊断AD、MCI和其它类型老年痴呆的蛋白生物标志物组，所述蛋白生物标志物组包含多个作为蛋白生物标志物的淀粉样前体蛋白片段，所述淀粉样前体蛋白片段的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7所示。
优选地，所述诊断是从来源于人类的生物样本中检测所述蛋白生物标志物组，并且其中检测所述蛋白生物标志物组的步骤包括进行生物体外检测。
优选地，所述生物样本为尿液。
本发明的目的还在于，
提供一种诊断AD、MCI和其它类型老年痴呆的方法，所述方法是检测生物样本中的蛋白生物标志物组，所述蛋白生物标志物组包含多个作为蛋白生物标志物的淀粉样前体蛋白片段，所述淀粉样前体蛋白片段的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7所示。
优选地，所述生物样本是人类尿液。
优选地，所述方法是通过蛋白免疫印迹法，用不同抗体检测生物样本中的蛋白生物标志物组。
本发明通过检测尿液中的淀粉样前体蛋白的片段来早期筛查和辅助诊断AD、MIC和其它类型老年痴呆；所述片段包含多个作为蛋白生物标志物的淀粉样前体蛋白片段，所述淀粉样前体蛋白片段的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7所示。
在寻找基于尿液的AD生物标志物的过程中，本发明研究了尿液中Aβ和APP片段的存在，并确定APP片段具有很高的潜力使其可以作为早期诊断AD或其他类型痴呆的新型生物标志物。
总之，本发明运用蛋白免疫印迹法(Western blotting)，针对认知正常人群和痴呆患者(阿尔茨海默病(AD)或额颞叶痴呆患者(FTD))尿液中的β淀粉样蛋白，用不同抗体对其中淀粉样前体蛋白(APP)和Aβ进行检测。由此鉴定出多个APP片段，包括
～14KD、～28KD、～56KD和～68KD蛋白条带。与年龄匹配的认知正常对照组相比，
AD或FTD患者的尿液中发现明显升高的这些APP片段。后续的免疫沉淀和质谱法进一步分析证实了APP片段的存在。因此，定量或定性检测尿液APP片段可用于进行对AD或其他类型的痴呆患者的早期诊断。
附图说明
图1:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测Aβ。图的上部分：将合成Aβ42溶解在最小量的DMSO中，然后添加到从健康年轻供体收集的新鲜尿液中。样品采用TCA/Acton法进行浓缩。图的下部分：Aβ42溶于DMSO中，并用PBS稀释。用4-20％的Tricine凝胶分离Aβ42，转移到硝化纤维膜上。将免疫印迹煮沸5min，用抗Aβ42单抗(克隆W0-2,1μg/mL)和酶标抗小鼠IgG次级抗体(0.05μg/mL)检测。由此可发现Aβ42的单体、二聚体和四聚体。
图2:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测Aβ。将Aβ单体在F-12介质中超声溶解，在4℃中放置至少24小时形成聚集。用PBS或从健康年轻供体收集的尿液来稀释低聚物。样品用4-20％Tricine凝胶来进行分离，分离完成后转移到硝化纤维膜上。将免疫印迹煮沸5min，用抗Aβ42单抗(克隆W0-2,0.2μg/mL)和酶标抗小鼠IgG次级抗体(0.02μg/mL)检测。
图3:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测Aβ和APP。用4-20％Tricine凝胶分离合成Aβ40(8-250ng)和3个APP/PS1小鼠脑组织提取物(各50μg蛋白量，动物编号#L53,L29和L03)，分离完成后转移到硝化纤维膜上。将免疫印迹煮沸5min，用抗Aβ42单抗(克隆W0-2,1μg/mL)和酶标抗小鼠IgG次级抗体(0.02μg/mL)检测。
图4:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测尿液中APP片段。采用冷冻干燥法(上图)或TAC/Acton法(下图)浓缩以下供体：AβPET阴性的健康对照(HC)、AβPET阳性的阿尔茨海默病(AD)或额颞叶痴呆(FTD)患者人群的尿液进行冷冻和干燥。用4-20％Tricine凝胶分离样品(每个2μg蛋白量)，分离完成后转移到硝化纤维膜上。将免疫印迹煮沸5min，用抗Aβ42单抗(克隆W0-2,0.2μg/mL)和抗小鼠IgG次级抗体(0.02μg/mL)检测。
图5:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测尿液中APP片段。收集AβPET阴性的健康对照(HC)、AβPET阳性的老年痴呆症(AD)、额颞叶痴呆(FTD)患者等供体的尿液，采用冻干浓缩法(上图、10倍浓缩、30μL)或TAC/Acton法(下图、各2μg蛋白量)对尿液进行冷冻浓缩。样品用4-20％Tricine凝胶分离，分离完成后转移到硝化纤维膜上。将免疫印迹煮沸5min，用抗Aβ42单抗(Aducanumab,0.1μg/mL)和酶标抗人IgG次级抗体(0.02μg/mL)检测。
图6:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测尿液中APP片段。采用TAC/Acton法对AβPET阴性的健康对照(HC)、AβPET阳性的阿尔茨海默病(AD)和额颞叶痴呆(FTD)患者等供体的尿液进行冷冻浓缩。用4-20％Tricine凝胶分离样品(每个2μg蛋白量)，分离完成后转移到硝化纤维膜上。将免疫印迹煮沸5min，用抗Aβ42单抗(产自Bio-east,0.2μg/mL)反应，再用酶标抗小鼠IgG次级抗体(0.02μg/mL)引物检测。
图7:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测尿液中APP片段。采用TAC/Acton法对AβPET阴性的健康对照(HC)、AβPET阳性的阿尔茨海默病(AD)和额颞叶痴呆(FTD)患者等供体的尿液进行冷冻浓缩。用4-20％Tricine凝胶分离样品(每个2μg蛋白量)，分离完成后转移到硝化纤维膜上。将免疫印迹煮沸5min，用抗APP-C端多克隆抗体(Ab369,Sigma-Aldrich,0.1μg/mL)反应，再用酶标抗兔二级抗体(0.02μg/mL)引物检测。
图8:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测尿液中APP片段。采用TAC/Acton法对AβPET阴性的健康对照(HC)、AβPET阳性的阿尔茨海默病(AD)和额颞叶痴呆(FTD)患者等供体的尿液进行冷冻浓缩。用4-20％Tricine凝胶分离样品(每个2μg蛋白量)，分离完成后转移到硝化纤维膜上。将免疫印迹煮沸5min，用抗APP-N-端抗体(克隆22C11,Sigma-Aldrich,0.1μg/mL)反应，再用酶标抗小鼠IgG次级Ab(0.02μg/mL)引物检测。
图9:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测尿液中APP片段。将从患有或没有AD的老年人收集的冷冻人尿进行解冻，用4-20％的Tricine凝胶分离每个含有0.25μg蛋白质的样品，分离完成后转移到硝化纤维膜上。免疫印迹煮沸5min，用抗Aβ42单抗(克隆W0-2,0.2μg/mL)和酶标抗小鼠IgG次级抗体(0.02μg/mL)启动。以聚合的Aβ42寡聚物(5.7pg)、APP/PS1小鼠脑提取物(2μg)和合成Aβ42(0.5和1.0ng)互为对照。右侧显示了曝光时间较短的对照组的免疫蛋白印迹(Western blotting)图像。符号代表：○:CN；□:AD；△:MCI或记忆障碍者。开放:AβPET阴性；实心:AβPET阳性。
图10:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测尿液中APP片段。将从患有或没有AD的老年人收集的冷冻人尿进行解冻，用4-20％的Tricine凝胶分离每个含有0.25μg蛋白质的样品，分离完成后转移到硝化纤维膜上。免疫印迹煮沸5min，用抗Aβ42单抗(Aducanumab,40ng/mL)，再用酶标抗人IgG次级抗体(0.02μg/mL)检测。以合成的Aβ42(0.1和0.2μg)、APP/PS1小鼠脑提取物(2μg)和聚集的Aβ42低聚物5.7pg为对照。符号代表：○:CN；□:AD；△:MCI或记忆障碍者。开放:AβPET阴性；实心:AβPET阳性。
图11:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测尿液中APP片段。将从患有或没有AD的老年人收集的冷冻人尿进行解冻，用4-20％的Tricine凝胶分离每个含有0.25μg蛋白质的样品，分离完成后转移到硝化纤维膜上。免疫印迹煮沸5min，用抗APP N端单抗(22C11,0.1μg/mL)反应，再用酶标抗小鼠IgG次级抗体(0.02μg/mL)检测。以合成的Aβ42(0.1和0.2μg)、APP/PS1小鼠脑提取物(2μg)和聚集的Aβ42低聚物(5.7pg)为对照。符号代表：○:CN；□:AD；Δ:MCI或记忆障碍者。开放:AβPET阴性；实心:AβPET阳性。
图12:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测尿液中APP片段。将从患有或没有AD的老年人收集的冷冻人尿进行解冻，用4-20％的Tricine凝胶分离每个含有0.25μg蛋白质的样品，分离完成后转移到硝化纤维膜上。免疫印迹煮沸5min，用兔抗APP c端抗体(Ab369,0.1μg/mL)反应，再用酶标抗兔IgG次级抗体(0.02μg/mL)检测。以聚合的Aβ42寡聚物(5.7pg)、APP/PS1小鼠脑提取物(2μg)和合成的Aβ42(0.5和1.0ng)为对照。右侧显示了曝光时间较短的对照组的Western blotting图像。符号代表：○:CN；□:AD；△:MCI或记忆障碍者。开放:AβPET阴性；实相:AβPET阳性。
图13:蛋白免疫印迹(Western blotting)检测尿液中APP片段。将从患有或没有AD的老年人收集的冷冻人尿进行解冻，用4-20％的Tricine凝胶分离每个含有0.25μg蛋白质的样品，分离完成后转移到硝化纤维膜上。免疫印迹煮沸5min，用抗胱氨酸抑素C单抗(0.1μg/mL)和酶标抗小鼠IgG次级抗体(0.02μg/mL)检测。以合成的Aβ42(0.1和0.2μg)、APP/PS1小鼠脑提取物(50μg)和聚集的Aβ42低聚物(0.1μg)为对照。符号代表：○:CN；□:AD；△:MCI或记忆障碍者。开放:AβPET阴性；实相:AβPET阳性。
图14。HC健康人群和AD患者尿液经W0-2抗体免疫沉淀后的SDS-PAGE凝胶结果。W0-2内的6个跑带为重复跑带。凝胶用考马斯蓝R250染色，在脱色液中脱色后拍照。箭头表示切割凝胶跑带的大致位置。凝胶在跑带上水平切割。20μL样品中各取20μg蛋白装入每个通道。MlgG＝小鼠lgG对照，50μg；W0-2＝W0-2抗体20μg；Aβ42:合成Aβ42,20μg；IP＝免疫沉淀反应。
具体实施方式
在免疫印迹法Western blotting实验中，尿液样本采用冻干法浓缩至1/10体积处理，或采用三氯乙酸(TCA)沉淀法处理。即，在1mL尿液中加入100μL 0.15％脱氧胆酸盐，在室温(RT)中放置10min。加入TCA(100μL)，将混合物在4℃下放置1小时，然后在4℃下以16000g离心力离心40min。丢弃上清液，加入500μL冷藏丙酮。样品在16000g离心力下离心40min，将干燥物溶解于50μL 2×SDS缓冲液中，用SDS-page进行分析。
制备6-20％的Tris-Tricine梯度凝胶且堆叠，将样品与缓冲液混合，在96℃下加热5min。将约40μL的样品混合物以及SeeBlue Plus(赛默飞)预染色蛋白标准品加到凝胶中。蛋白质通过电泳分离，然后转移到硝化纤维膜上。在10mm磷酸盐缓冲盐水(PBS)中煮沸5min，用5％脱脂奶粉在Tris缓冲盐水加吐温-20(TBST)中封闭过夜，pH值(7.2)。用TBST清洗印迹几次，然后加含1:1000-1:25000(事先确认)稀释的一抗和5％脱脂奶粉的TBST，4℃过夜。清洗后，用含有1:10 000～1:30 000稀释HRP偶联二抗和5％脱脂奶粉的TBST培养1-2小时。清洗后，使用超灵敏ECL试剂，用Gel Doc设备捕获印迹图像。首先用免疫印迹Westernblotting检测有或没有进行TCA/丙酮处理的合成Aβ。结果表明，结果处理(TCA沉淀)的和对照的(尿液)，均不影响Aβ的检测(图1)。而且，随着Aβ承载量增加(>30ng)，Aβ二聚体(～8KD)逐渐可见。进一步增加Aβ承载超过250ng，可观察到四聚体存在(～16KD)(图1)。随后检测了溶解在PBS或尿液中的聚集Aβ，在低蛋白量(20ng或更少)下，PBS或尿液中均未观察到聚集Aβ的明显差异，表明尿液不太可能影响Aβ聚集自然形成(图2)。为了确保系统能够检测APP，制备了3只APP/PS1转基因小鼠的脑提取物，并使用免疫印迹Western blotting进行检测。观察到多个含APP片段或低聚物的蛋白条带，其中APP总长(～100KD)最为突出，其次是可能的C端片段(CTF)99条带(～14KD)(图3)。值得注意的是，尚未发现比四聚物更大的Aβ低聚物(图1-3)。
接下来，收集5例AβPET扫描阴性(centiloid评分<15)的认知正常健康对照，5例临床诊断为AD的样本，AβPET扫描centiloid评分>25,和2例额颞叶痴呆患者的尿液。尿液经冻干或TCA沉淀浓缩10次。用Aβ抗体进行Western blotting分析(克隆W0-2)。所有样本均有～28KD条带，但AD和FTD患者表现染色较强，而健康对照组染色较弱。另一条14-16KD带仅在部分AD和FTD患者中可见。不同的工艺，如冷冻干燥或TAC/丙酮沉淀，没有显著差异(图4)。
为了验证结果，本发明使用了一种不同的Aβ抗体，名为aducanumab。除了用W0-2抗体可发现的～28KD和14-16KD条带外，aducanumab还发现了另外两个高分子条带，一个在～56KD，另一个在～68KD(图5)。这两个条带在AD和FTD患者中很明显，但在HC样本中表现非常弱(图5)。同样，冻干尿或TCA沉淀尿蛋白的结果没有显著差异(图5)。
使用另一种Aβ抗体来进一步验证这一发现。对相同的样品进行免疫印迹Westernblotting检测，并使用从Bioeast Biotech(博岳生物，杭州，中国)购买的Aβ抗体以及我公司自行研发的QK-02进行检测。检测结果与W0-2结果相似(图6)。
使用兔抗APP蛋白C端多克隆抗体，我们在AD和FTD患者中发现了APP-C端片段(CTF)99，在两名FTD患者中发现了CTF83，其中一名患者显示了极强的染色(图7)。结果表明，之前由W0-2、aducanumab和Bioeast抗体识别的14-16KD条带更有可能是CTF99和CTF83条带，而不是Aβ低聚体。运用鼠抗APP蛋白N端单克隆抗体(克隆22C11)，在FTD、AD中发现～28KD和～56KD条带，HC样本中表现显色非常弱(图8)。在一个HC、一个AD和一个FTD中发现全长约～100KD的APP。部分AD患者也可见～68KD带(图8)。以上结果证实了APP在尿中存在，且AD和FTD患者的APP含量明显高于HC组结果。本发明进一步检测了42例认知正常对照组(CN,n＝19)、MCI患者(n＝15)和AD患者(n＝8)在未浓缩冷冻尿液样本中APP的存在。通过BCA检测试剂盒(PierceTM，赛默飞)测定每个尿样中的蛋白质浓度，用4-20％Tricine凝胶分离250ng蛋白，转移到硝化纤维膜上。用Aβ抗体W0-2(图9)和Aducanumab(图10)、APP N端抗22C11抗体(图11)、APP C端抗Ab369抗体(图12)检测印迹。同时以聚合Aβ、APP/PS1小鼠脑提取物和合成Aβ42作为对照。这些结果证实尿中存在可测量的APP及其碎片。为了平衡加样量，半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin C的抗体也被用于检测这些尿液样本(图13)。
为了进一步验证免疫印迹Western blotting的结果，使用了质谱分析仪鉴定尿液中的APP片段。简易步骤，将210mL双蒸馏水加热至沸腾，加入2mL 1％氯金酸。让混合物再煮沸2min，然后加入1.5mL 1％柠檬酸三钠。不断加热搅拌溶液，直到它变成清澈的红色。然后，继续搅拌5min。待溶液冷却至室温后，加入更多的水，使最终体积达到200毫升。通过400-700nm光谱法检测金溶液的质量。峰值波长为520nm，估计粒径为20nm。峰宽约1～2nm，峰外径大于1。
用0.1M K2CO3调节溶液pH至pH＝8.5。缓慢加入抗Aβ抗体(W0-2克隆)至终浓度为10μg/mL，慢速搅拌10min，加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP，平均MW 10,000,Sigma)使最终浓度为0.02％。最后，加入0.1％的聚乙二醇(PEG，平均MW 20,000,Sigma)溶液。混合物在14000G离心力下4℃离心40min。离心后，除去上清，重新悬浮于15mL水中。将5名认知正常对照组和5名AD患者的尿液样本混合，因此每组的最终体积为10mL。尿样在14000G离心力下4℃离心40min。取用上清液，用500mM硼酸钾缓冲液将pH调至7.6。尿样(1mL)与5mL包被W0-2抗体的胶体金混合。将混合液放在4℃的搅拌器上过夜。然后在14000G下，4℃下离心30min。丢弃上清液，用1mL PBS冲洗3次(14000G,4℃30min)。废弃上清液后，加入120μL 1×Tricine缓冲液，沉淀剂在95℃下煮沸5min。采用BCA蛋白法测定蛋白质浓度，将20μg蛋白质加入16.5％的预制备Tricine凝胶中。凝胶在70mA下运行45min。在不同的通道添加W-02抗体(20μg)和Aβ42单体作为对照。电泳完成后，凝胶用考马斯蓝R250溶液(0.1％考马斯蓝R-250,40％乙醇和10％乙酸)染色3小时，然后用去染色液(10％乙醇和7.5％乙酸)脱色。
结果显示，AD尿样中存在独特的条带(图14)。Aβ42单体的阳性对照为预期的4.5KD大小。然而，在HC样本和AD样本的凝胶上，于～7KD也观察到微弱的条带，这表明单体形成了少量的Aβ42二聚体。小鼠lgG道如预期显示出明确的非特异性结合，尤其是在AD尿样本凝胶中，证实了本实验中使用的IP是有效的，结果是有效的。
对这些AD样本尿液的独特条带(～4,7,14,28,56和68KD)进行切分，并通过质谱(MS)进行蛋白测序。使用该序列对UniProtKB和Swiss-Prot数据库进行Protein Blast检测，APP阳性率100％，E值为1×10-6。质谱(MS)鉴定的序列“LVFFAEDVGSNK”位于APP的残基号688～699，经处理后为Aβ40和Aβ42的一部分。
在～68kD蛋白条带中发现了与APP在WYFDVTEGK测试中不同的序列。使用WYFDVTEGK对UniProtKB和Swiss-Prot数据库进行Protein Blast检测，APP的阳性率为100％，E值为1×10-5。质谱鉴定的序列位于APP的残基号307～315，这些位置经过处理后是APP的可溶性部分。
包被抗Aβ抗体的金纳米颗粒免疫沉淀仅在AD患者尿液中可见蛋白条带，而在健康对照组尿液中未见蛋白条带，提示AD患者APP代谢物谱与健康人不同。这一观察结果与免疫印迹Western blotting结果一致，患者中APP片段数量较高。由此可得，APP片段具有很高的潜力使其可以作为AD或其他类型痴呆的早期诊断的新型生物标志物。

Claims (10)

1.用于检测蛋白生物标志物组的抗体在制备诊断AD、MCI和其它类型老年痴呆的试剂盒中的用途，所述蛋白生物标志物组包含多个作为蛋白生物标志物的淀粉样前体蛋白片段，所述淀粉样前体蛋白片段的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断是从来源于人类的生物样本中检测所述蛋白生物标志物组，并且其中检测所述蛋白生物标志物组的步骤包括进行生物体外检测；所述生物样本为尿液。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗体是以淀粉样前体蛋白的其中一段序列为抗原的抗体。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述抗体包括抗Aβ抗体，抗淀粉样前体蛋白抗体和抗Cystatin C抗体。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述Aβ抗体包括鼠抗人Aβ单克隆抗体、抗人Aβ自身免疫性抗体、针对淀粉样前体蛋白N端抗体和针对淀粉样前体蛋白C端的抗体。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白生物标志物组通过蛋白免疫印迹法检测。
7.一种用于诊断AD、MCI和其它类型老年痴呆的蛋白生物标志物组，其特征在于，所述蛋白生物标志物组包含多个作为蛋白生物标志物的淀粉样前体蛋白片段，所述淀粉样前体蛋白片段的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7所示。
8.如权利要求7所述的蛋白生物标志物组，其特征在于，所述诊断是从来源于人类的生物样本中检测所述蛋白生物标志物组，并且其中检测所述蛋白生物标志物组的步骤包括进行生物体外检测；所述生物样本为尿液。
9.一种诊断AD、MIC和其它类型老年痴呆的方法，其特征在于，所述方法是检测生物样本中的蛋白生物标志物组，所述蛋白生物标志物组包含多个作为蛋白生物标志物的淀粉样前体蛋白片段，所述淀粉样前体蛋白片段的序列如SEQ ID NO.1至SEQID NO.7所示。
10.通过检测尿液中的淀粉样前体蛋白的片段来早期筛查和辅助诊断AD、MIC和其它类型老年痴呆的应用；所述片段包含多个作为蛋白生物标志物的淀粉样前体蛋白片段，所述淀粉样前体蛋白片段的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7所示。
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