CN118831181B - 一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本说明书实施例提供一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型的构建方法及其应用，该构建方法包括：（1）制备第一外源基因hAPP的转基因片段、第二外源基因hPSEN1的转基因片段和第三外源基因hMAPT的转基因片段；（2）将三种转基因片段插入小鼠受精卵的基因组；（3）将受精卵移植入假孕雌性小鼠体内，筛选获得三个外源基因鉴定均为阳性的F0代小鼠；（4）基于F0代小鼠，获得阿尔兹海默症小鼠模型3‑FAD纯合阳性小鼠。本说明书实施例提供的阿尔兹海默症小鼠模型的发病进程上与人类患者相符，先出现血液标志物，接着出现病理表征，最后才出现行为学特征，为阿尔兹海默症的研究以及给药治疗提供了一个更为精准、有效的途径。

Description

一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型的构建方法及其应用

技术领域

本说明书涉及基因工程技术领域，特别涉及一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术

阿尔茨海默病（AD）是常见于老年或老年前期的中枢神经系统退行性疾病，是痴呆症的主要类型，占比达60-70%。其典型表现为早期记忆丧失、认知障碍，随后出现焦虑、妄想等行为和精神症状。AD主要病理特征包括脑内淀粉样斑块、神经原纤维缠结（NFTs）以及海马和皮层的神经变性。β淀粉样蛋白（Aβ）由淀粉样前体蛋白（APP）经β和γ分泌酶裂解产生，Aβ42因高聚集性更具毒性，其积累形成的淀粉样斑块会通过多种机制致神经元损伤和死亡，加剧神经退行性变。Tau蛋白在AD中异常磷酸化，脱离微管并聚集形成NFTs，破坏神经元结构和功能，导致严重认知损害。

为研究AD病理机制和开发疗法，科学家构建了多种转基因小鼠模型，引入AD相关基因（如APP、PS1和Tau基因）突变来模拟病理特征。常见策略是突变人类APP基因模拟Aβ积累，携带人类APP和PS1基因突变的小鼠能较早出现淀粉样斑块和认知损伤。双转基因小鼠6个月时显示记忆和突触传输损伤，是研究早期病理的理想模型，但未能很好再现人类患者中Tau蛋白聚集。虽有模型针对三个突变基因编辑，小鼠6个月出现Aβ病理，12个月形成NFTs，但行为和病理变化与临床患者不完全一致，只能用于研究特定关系。此外，还有非转基因模型通过注射毒素或自然老化诱导AD样病理变化。然而至今，虽已构建多种AD相关小鼠模型，但无一种能匹配人类患者疾病病程变化。

因此，期望构建一种能够匹配人类阿尔茨海默病患者病程变化的小鼠模型。

发明内容

为了能够提供一种能够匹配人类阿尔茨海默病患者病程变化的小鼠模型，为阿尔兹海默症的研究以及给药治疗提供一个更为精准、有效的途径，本说明书一个或多个实施例提供一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型的构建方法，该构建方法包括：（1）制备第一外源基因hAPP的转基因片段、第二外源基因hPSEN1的转基因片段和第三外源基因hMAPT的转基因片段；（2）将三种转基因片段插入小鼠受精卵的基因组；（3）将受精卵移植入假孕雌性小鼠体内，筛选获得三个外源基因鉴定均为阳性的F0代小鼠；（4）基于F0代小鼠，获得阿尔兹海默症小鼠模型3-FAD纯合阳性小鼠；

其中，第一外源基因hAPP的转基因片段携带Swedish突变；第二外源基因hPSEN1的转基因片段携带hPSEN1 M146V突变；第三外源基因hMAPT的转基因片段携带hMAPT P243L突变。

本说明书一个或多个实施例提供一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型在研究阿尔茨海默症病理机制或筛选用于治疗阿尔茨海默症的药物中的应用，该小鼠模型的基因组包括第一外源基因hAPP的转基因片段、第二外源基因hPSEN1的转基因片段和第三外源基因hMAPT的转基因片段；其中，第一外源基因hAPP的转基因片段携带Swedish突变；第二外源基因hPSEN1的转基因片段携带hPSEN1 M146V突变；第三外源基因hMAPT的转基因片段携带hMAPT P243L突变。

本说明书实施例至少具有以下有益效果：提供一种可稳定遗传、发病进程与人类患者的完全一致的三突变阿尔兹海默症小鼠模型，该小鼠模型在阿尔兹海默症的病理进程或阶段的发展与临床病人的情况是相符的，具有用于研究阿尔兹海默症病理机制研究和用于筛选治疗阿尔兹海默症药物的前景。

附图说明

本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，在这些实施例中，相同的编号表示相同的结构，其中：

图1是根据本说明书一些实施例所示的阿尔兹海默临床早期血液检测指标在3-FAD小鼠血液中的检测结果图；

图2是根据本说明书一些实施例所示的在2月龄3-FAD小鼠脑区中Aβ沉积的检测结果图；

图3是根据本说明书一些实施例所示的在3-FAD小鼠脑区中Aβ沉积随着病程发展呈现聚集并斑块化的检测结果图；

图4是根据本说明书一些实施例所示的在1月龄3-FAD小鼠脑区中p-Tau181的检测结果图；

图5是根据本说明书一些实施例所示的在2月龄3-FAD小鼠脑区中p-Tau217的检测结果图；

图6是根据本说明书一些实施例所示的在2月龄3-FAD小鼠脑区中p-Tau(Thr231)的检测结果图；

图7是根据本说明书一些实施例所示的在3月龄3-FAD小鼠脑区中p-Tau(Ser202,Thr205)的检测结果图；

图8是根据本说明书一些实施例所示的在3月龄3-FAD小鼠脑区中p-Tau(Ser396)的检测结果图；

图9是根据本说明书一些实施例所示的在3-FAD小鼠脑区中p-Tau181随病程变化的检测结果图；

图10是根据本说明书一些实施例所示的在3-FAD小鼠脑区中p-Tau(Ser202,Thr205)随病程变化的检测结果图；

图11是根据本说明书一些实施例所示的对3月龄3-FAD小鼠进行Morris水迷宫实验的实验结果图；

图12是根据本说明书一些实施例所示的给药后的小鼠血液的检测结果图；

图13是根据本说明书一些实施例所示的给药后的小鼠脑区的检测结果图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。

如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。

本说明书一个或多个实施例提供一种三突变阿尔兹海默症（3-FAD）小鼠模型及构建方法与应用，通过基因编辑的方式，将三个外源基因的转基因片段（包含hPSEN1 M146V突变、hAPP Swedish突变和hMAPT P243L突变）随机插入小鼠基因组中，在启动子神经特异性元件的调控下，三个外源基因的转基因片段能够特异性地在小鼠的脑区域表达，从而获得一种可稳定遗传、发病进程与人类患者基本一致的三突变阿尔兹海默症（3-FAD）小鼠模型。

本说明书实施例提供一种三突变阿尔兹海默症（3-FAD）小鼠模型的构建方法，该构建方法包括下述步骤：

（1）制备第一外源基因hAPP的转基因片段、第二外源基因hPSEN1的转基因片段和第三外源基因hMAPT的转基因片段。

hAPP基因（human Amyloid Precursor Protein gene，即人类淀粉样前体蛋白基因）是编码淀粉样前体蛋白（APP）的基因，位于人类第21号染色体的长臂（21q21.3），在生物医学和神经科学领域具有重要意义，尤其与阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）相关。

在一些实施例中，第一外源基因hAPP的转基因片段携带Swedish突变。Swedish突变（瑞典突变）是hAPP基因的一个特定突变，被命名为“瑞典突变”是因为最初在瑞典的几个家族中发现，该突变与早发性家族性阿尔茨海默病（Familial Alzheimer's Disease，FAD）密切相关。瑞典突变涉及hAPP基因在编码区域的两个核苷酸改变，具体位置在编码淀粉样前体蛋白（APP）上的第670和671位氨基酸。

在一些实施例中，第一外源基因hAPP的转基因片段包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在一些实施例中，第一外源基因hAPP的转基因片段包括hAPP 5’UTR和突变型hAPPCDS序列，突变型hAPP CDS序列携带Swedish突变。

在一些实施例中，第一外源基因hAPP的转基因片段还包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

hPSEN1基因（human Presenilin-1 gene，即人类早老素1基因）是编码早老素1蛋白（Presenilin-1, PS1）的基因，早老素1（PSEN1）是构成γ-分泌酶的催化亚基，后者负责加工淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein，APP)生成Aβ。hPSEN1基因位于人类第14号染色体的长臂（14q24.3），PSEN1基因突变是早发性家族性阿尔茨海默病（FAD）的主要致病因素之一。

在一些实施例中，第二外源基因hPSEN1的转基因片段携带hPSEN1 M146V突变。

如本文所用，“hPSEN1 M146V突变”是指hPSEN1基因发生突变后转录翻译得到的hPSEN1蛋白中的146位甲硫氨酸M突变为缬氨酸V。其中，所述146位甲硫氨酸M是以hPSEN1蛋白序列（GI: 15079861）或其同源序列为基准得到的。

在一些实施例中，第二外源基因hPSEN1的转基因片段包括如SEQ ID NO:3所示的序列。

在一些实施例中，第二外源基因hPSEN1的转基因片段包括突变型hPSEN1 CDS序列，突变型hPSEN1 CDS序列携带hPSEN1 M146V突变。

MAPT基因编码微管相关蛋白Tau，Tau是一种微管结合蛋白，细胞内的Tau蛋白被过度磷酸化继而降低溶解度，过度磷酸化的Tau与微管蛋白竞争结合正常Tau及其它微管相关蛋白，从而失去促进微管组装的生物活性，导致微管解聚和轴突运输受损，从而导致神经元退化和神经元凋亡，最终导致AD的发生。微管相关蛋白Tau（MAPT）基因的突变是导致AD、皮质基综合征和进行性核上性麻痹(PSP)综合征等其他Tau蛋白病神经退行性疾病的主要因素。

在一些实施例中，第三外源基因hMAPT的转基因片段携带hMAPT P243L突变。

如本文所用，“hMAPT P243L突变”是指hMAPT基因发生突变转录翻译得到的人微管相关蛋白Tau（MAPT）中第243位脯氨酸P突变为亮氨酸L。其中，所述243位脯氨酸P是以hMAPT蛋白序列（GI: 8400711）或其同源序列为基准得到的。

在一些实施例中，第三外源基因hMAPT的转基因片段包括突变型hMAPT CDS序列，突变型hMAPT CDS序列携带hMAPT P243L突变。

在一些实施例中，第三外源基因hMAPT的转基因片段包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

在一些实施例中，第一外源基因hPSEN1的转基因片段、第二外源基因hAPP的转基因片段、和第三外源基因hMAPT的转基因片段各自包括Thy1启动子。

在一些实施例中，第一外源基因hAPP的转基因片段包括从5’到3’按以下顺序可操作地连接和排列的元件：Thy1启动子、hAPP 5’UTR、突变型hAPP CDS序列（携带Swedish突变）；第一外源基因hAPP的转基因片段还包括如SEQ ID NO:2所示的序列。

在一些实施例中，第二外源基因hPSEN1的转基因片段包括从5’到3’按以下顺序可操作地连接和排列的元件：Thy1启动子、突变型hPSEN1 CDS序列（携带hPSEN1 M146V突变）；第二外源基因hPSEN1的转基因片段还包括如SEQ ID NO:4所示的序列。

在一些实施例中，第三外源基因hMAPT的转基因片段，包括从5’到3’按以下顺序可操作地连接和排列的元件：Thy1启动子、突变型hMAPT CDS序列（携带hMAPT P243L突变）；第三外源基因hMAPT的转基因片段还包括如SEQ ID NO:6所示的序列。

外源基因的转基因片段可以通过多种方式获得。例如，可以通过人工体外合成直接获得转基因片段。在一些实施例中，转基因片段可以通过构建质粒进行PCR扩增方式获得。

在一些实施例中，制备转基因片段包括：

a. 获取Thy1启动子及第一外源基因hAPP、第二外源基因hPSEN1和第三外源基因hMAPT的PCR产物。

在一些实施例中，设计引物，通过PCR方式分别获得Thy1启动子、hAPP CDS、hPSEN1CDS、hMAPT CDS四个片段的PCR产物。

b. 将所述Thy1启动子分别与第一外源基因hAPP、第二外源基因hPSEN1和第三外源基因hMAPT的PCR产物以及骨架载体进行连接形成重组载体，并将重组载体转化到感受态细胞中。

在一些实施例中，可以将Thy1启动子与hAPP CDS、hPSEN1 CDS、hMAPT CDS三个片段分别形成的重组载体，通过热激方式转化到感受态细胞中，然后在37℃培养箱中过夜培养。

如本文所用，“重组载体”是指一种用于携带、复制和表达外源基因片段的工具。在一些实施例中，重组载体的载体包括但不限于质粒载体、真核细胞表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体或者腺相关病毒载体。

c. 转化后进行PCR鉴定和测序，选择测序正确的克隆作为转基因载体；

在一些实施例中，选取转化后的单克隆菌落进行PCR鉴定，鉴定为阳性的克隆转接至试管，提取质粒，酶切鉴定，将酶切正确的克隆送测，选择测序正确的克隆作为外源基因的转基因载体。

d. 基于转基因载体制备所述转基因片段。

在一些实施例中，将构建出的转基因载体通过酶切方式制备出外源基因的转基因片段

（2）将三种转基因片段插入小鼠受精卵的基因组。

将三种转基因片段插入小鼠受精卵的中的“插入”是指在小鼠基因组中添加整合和/或整合替换，插入的方式可以为随机插入或定点插入。

在一些实施例中，将转基因片段显微注射到小鼠的受精卵中，随机打靶插入小鼠基因组。

（3）将受精卵移植入假孕雌性小鼠体内，筛选获得外源基因鉴定为阳性的F0代小鼠。

在一些实施例中，鉴定由PCR反应完成，PCR反应使用的引物对分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示。其中，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9用于鉴定第一外源基因hAPP；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13用于鉴定第二外源基因hPSEN1；SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17用于鉴定第三外源基因hMAPT。

（4）基于F0代小鼠，获得阿尔兹海默症小鼠模型3-FAD纯合阳性小鼠。

在一些实施例中，用F0代小鼠与野生小鼠（wide type，WT）回交，直至获得F0N5代小鼠；由F0N5代小鼠自交获得阿尔兹海默症小鼠模型3-FAD纯合阳性小鼠。

本说明书实施例提供一种如上所述构建方法得到的三突变阿尔兹海默症小鼠模型在研究阿尔茨海默病病理机制中的应用。

本说明书实施例提供一种如上所述构建方法得到的三突变阿尔兹海默症小鼠模型在筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

本说明书实施例还提供一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型，其基因组包括来自第一外源基因hAPP的转基因片段、来自第二外源基因hPSEN1的转基因片段、和来自第三外源基因hMAPT的转基因片段。此处所述的“小鼠模型”对应的是纯合体阳性小鼠。

在一些实施例中，第一外源基因hAPP的转基因片段携带Swedish突变。

在一些实施例中，第一外源基因hAPP的转基因片段包括如SEQ ID NO:1所示的序列。

在一些实施例中，第二外源基因hPSEN1的转基因片段携带hPSEN1 M146V突变。

在一些实施例中，第二外源基因hPSEN1的转基因片段包括如SEQ ID NO:3所示的序列。

在一些实施例中，第三外源基因hMAPT的转基因片段携带hMAPT P243L突变。

在一些实施例中，第三外源基因hMAPT的转基因片段包括如SEQ ID NO:5所示的序列。

在一些实施例中，第一外源基因hAPP的转基因片段、第二外源基因hPSEN1的转基因片段和第三外源基因hMAPT的转基因片段各自包括Thy1启动子。

本说明书实施例提供一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型，在一些实施例中，该三突变阿尔兹海默症小鼠模型由前述构建方法制备得到。

本说明书实施例提供一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型，该模型可用于研究阿尔茨海默症病理机制或筛选治疗阿尔茨海默症的药物。

本说明书实施例还提供利用以上所述三突变阿尔兹海默症小鼠模型来研究阿尔茨海默症病理机制的方法，也提供了利用以上所述三突变阿尔兹海默症小鼠模型来筛选治疗阿尔茨海默症的药物的方法。

在一些实施例中，所述研究阿尔茨海默症病理机制的方法包括以下步骤：

（1）将三个外源基因的转基因片段随机插入小鼠基因组中来制备三突变阿尔兹海默症小鼠模型；

（2）在此基础上加入特异性标记或与其他小鼠杂交以进行疾病机制相关的研究，定期检测小鼠的生物学特征，当出现阿尔兹海默症生物学标志时，收集小鼠组织结构的组织块；

（3）评估步骤（2）收集的组织块中DNA、RNA或蛋白质的表达；

（4）鉴定所述组织块中与病变细胞的层级组织、病变过程或生物学特征变化相关的基因或蛋白质。

特异性标记可以为病毒或慢病毒，包括腺相关病毒（AAV）、慢病毒（lentivirus）等。

在一些实施例中，所述筛选治疗阿尔茨海默症的药物的方法包括以下步骤：

（1）将三个外源基因的转基因片段随机插入小鼠基因组中来制备三突变阿尔兹海默症小鼠模型；

（2）对小鼠模型施用待筛选药物；

（3）定期检测小鼠模型中与阿尔兹海默症相关的生物学特征，生物学特征包括但不限于血液、脑脊液、病理和行为指标，检测对象包括但不限于蛋白质、DNA或RNA等；

（4）筛选出抑制小鼠模型出现与阿尔兹海默症相关的生物学特征的药物。

本说明书实施例至少具有以下有益效果：将第一外源基因（含hAPP Swedish突变）、第二外源基因（含hPSEN1 M146V突变）和第三外源基因（含hMAPT P243L突变）的转基因片段通过基因编辑的方式随机插入小鼠基因组中，在Thy1启动子神经特异性元件的调控下，能够使得含有hPSEN1 M146V突变、hAPP Swedish突变和hMAPT P243L突变的转基因片段特异性地在小鼠的脑区域表达，从而获得一种可稳定遗传、发病进程与人类患者的完全一致的三突变阿尔兹海默症（3-FAD）小鼠模型，3-FAD小鼠在阿尔兹海默症的发病进程上与人类患者相符，其呈现的情况是先出现血液标志物，接着出现病理表征，最后才出现行为学特征，这为阿尔兹海默症的研究以及给药治疗提供了一个更为精准、有效的途径。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。这些实施例中的部分内容也可以与其他实施例中的相应内容替换或组合，从而形成新的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。应当理解，以下实施例是为了更好地解释本发明，并不旨在限制本发明。

实施例

实施例1 构建阿尔兹海默症小鼠（3-FAD小鼠）模型

3-FAD小鼠模型的构建包括以下步骤：

（1）制备第一外源基因hAPP的转基因片段、第二外源基因hPSEN1的转基因片段和第三外源基因hMAPT的转基因片段，具体包括：

a. 设计引物，通过PCR方式分别获得Thy1启动子、hAPP CDS、hPSEN1 CDS、hMAPTCDS四个片段的PCR产物；

b. 将Thy1启动子分别与hAPP CDS、hPSEN1 CDS、hMAPT CDS三个片段以及骨架载体进行体外连接，通过热激方式转化到感受态细胞中，在平板上过夜培养；

c. 挑取平板上的单克隆菌落进行PCR鉴定，鉴定阳性的克隆转接试管，提取质粒，酶切鉴定，将酶切正确的克隆送测，最后选择测序正确的克隆作为Thy1-APP、Thy1-PSEN1、Thy1-MAPT三个转基因终载体。

d.将构建出的转基因载体通过酶切方式制备出外源基因的转基因片段。

三个外源基因的具体信息如下：

第一外源基因包括Thy1启动子、hAPP 5’UTR、突变型hAPP CDS序列和突变型hAPPCDS序列携带Swedish突变；

第二外源基因包括Thy1启动子、突变型hPSEN1 CDS序列和突变型hPSEN1 CDS序列携带hPSEN1 M146V突变；

第三外源基因包括Thy1启动子、突变型hMAPT CDS序列和突变型hMAPT CDS序列携带hMAPT P243L突变；

为了使hAPP、hPSEN1和hMAPT的转录和翻译效率保持稳定，在三个基因的N端均添加Kozak (GCCGCCACC)序列。

其中，三个外源基因序列具体如下所示：

第一外源基因的转基因片段的突变型的hAPP CDS序列如SEQ ID NO:1所示（其中加粗字体为突变位点序列，方向为5’-3’）：atgctgcccggtttggcactgctcctgctggccgcctggacggctcgggcgctggaggtacccactgatggtaatgctggcctgctggctgaaccccagattgccatgttctgtggcagactgaacatgcacatgaatgtccagaatgggaagtgggattcagatccatcagggaccaaaacctgcattgataccaaggaaggcatcctgcagtattgccaagaagtctaccctgaactgcagatcaccaatgtggtagaagccaaccaaccagtgaccatccagaactggtgcaagcggggccgcaagcagtgcaagacccatccccactttgtgattccctaccgctgcttagttggtgagtttgtaagtgatgcccttctcgttcctgacaagtgcaaattcttacaccaggagaggatggatgtttgcgaaactcatcttcactggcacaccgtcgccaaagagacatgcagtgagaagagtaccaacttgcatgactacggcatgttgctgccctgcggaattgacaagttccgaggggtagagtttgtgtgttgcccactggctgaagaaagtgacaatgtggattctgctgatgcggaggaggatgactcggatgtctggtggggcggagcagacacagactatgcagatgggagtgaagacaaagtagtagaagtagcagaggaggaagaagtggctgaggtggaagaagaagaagccgatgatgacgaggacgatgaggatggtgatgaggtagaggaagaggctgaggaaccctacgaagaagccacagagagaaccaccagcattgccaccaccaccaccaccaccacagagtctgtggaagaggtggttcgagttcctacaacagcagccagtacccctgatgccgttgacaagtatctcgagacacctggggatgagaatgaacatgcccatttccagaaagccaaagagaggcttgaggccaagcaccgagagagaatgtcccaggtcatgagagaatgggaagaggcagaacgtcaagcaaagaacttgcctaaagctgataagaaggcagttatccagcatttccaggagaaagtggaatctttggaacaggaagcagccaacgagagacagcagctggtggagacacacatggccagagtggaagccatgctcaatgaccgccgccgcctggccctggagaactacatcaccgctctgcaggctgttcctcctcggcctcgtcacgtgttcaatatgctaaagaagtatgtccgcgcagaacagaaggacagacagcacaccctaaagcatttcgagcatgtgcgcatggtggatcccaagaaagccgctcagatccggtcccaggttatgacacacctccgtgtgatttatgagcgcatgaatcagtctctctccctgctctacaacgtgcctgcagtggccgaggagattcaggatgaagttgatgagctgcttcagaaagagcaaaactattcagatgacgtcttggccaacatgattagtgaaccaaggatcagttacggaaacgatgctctcatgccatctttgaccgaaacgaaaaccaccgtggagctccttcccgtgaatggagagttcagcctggacgatctccagccgtggcattcttttggggctgactctgtgccagccaacacagaaaacgaagttgagcctgttgatgcccgccctgctgccgaccgaggactgaccactcgaccaggttctgggttgacaaatatcaagacggaggagatctctgaagtgaatctggatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaacagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaactag（SEQID NO:1）。需要注意的是，此处的突变序列（加粗表示）的目的是使得转录翻译之后的蛋白出现对应位置的氨基酸突变；所以，可以用有同样转录翻译结果的序列（如aacctt，aacctc和aaccta）来代替此处的突变序列。

第一外源基因Thy1-hAPP转基因片段的序列如SEQ ID NO:2所示（斜体为Thy1启动子序列，下划线为Kozak序列，大写字母为5’UTR序列，加粗为带有突变的hAPP CDS序列，其中加粗并带有下划线为突变位点序列，方向为5’-3’）：aattcagagaccgggaaccaaactagcctt taaaaaacataagtacaggagccagcaagatggctcagtgggtaaaggtgcctaccagcaagcctgacagcctgag ttcagtccccacgaactacgtggtaggagaggaccaaccaactctggaaatctgttctgcaaacacatgctcacac acacacacacaaatagtataaacaattttaaatttcatttaaaaataatttgtaaacaaaatcattagcacaggtt ttagaaagagcctcttggtgacatcaagttgatgctgtagatggggtatcattcctgaggacccaaaaccgggtct cagcctttccccattctgagagttctctcttttctcagccactagctgaagagtagagtggctcagcactgggctc ttgagttcccaagtcctacaactggtcagcctgactactaaccagccatgaagaaacaaggagtggatgggctgag tctgctgggatgggagtggagttagtaagtggccatggatgtaatgaccccagcaatgctggctagaaggcatgcc tcctttccttgtctggagacggaacgggagggatcatcttgtactcacagaagggagaacattctagctggttggg ccaaaatgtgcaagttcacctggaggtggtggtgcatgcttttaactccagtactcaggaggcagggccaggtgga tctctgtgagttcaagaccagcctgcactatggagagagttttgggacagccagagttacacagaaaaatcctggt ggaaaatctgaaagaaagagagaaagaaagaaagaaagaaaggaagaaagaaagaaagagtggcaggcaggcaggc 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第二外源基因的转基因片段的突变型的hPSEN1 CDS序列如SEQ ID NO:3所示（其中加粗字体为突变位点序列，方向为5’-3’）：atgacagagttacctgcaccgttgtcctacttccagaatgcacagatgtctgaggacaaccacctgagcaatactgtacgtagccagaatgacaatagagaacggcaggagcacaacgacagacggagccttggccaccctgagccattatctaatggacgaccccagggtaactcccggcaggtggtggagcaagatgaggaagaagatgaggagctgacattgaaatatggcgccaagcatgtgatcatgctctttgtccctgtgactctctgcatggtggtggtcgtggctaccattaagtcagtcagcttttatacccggaaggatgggcagctaatctataccccattcacagaagataccgagactgtgggccagagagccctgcactcaattctgaatgctgccatcatgatcagtgtcattgttgtcgtgactatcctcctggtggttctgtataaatacaggtgctataaggtcatccatgcctggcttattatatcatctctattgttgctgttctttttttcattcatttacttgggggaagtgtttaaaacctataacgttgctgtggactacattactgttgcactcctgatctggaattttggtgtggtgggaatgatttccattcactggaaaggtccacttcgactccagcaggcatatctcattatgattagtgccctcatggccctggtgtttatcaagtacctccctgaatggactgcgtggctcatcttggctgtgatttcagtatatgatttagtggctgttttgtgtccgaaaggtccacttcgtatgctggttgaaacagctcaggagagaaatgaaacgctttttccagctctcatttactcctcaacaatggtgtggttggtgaatatggcagaaggagacccggaagctcaaaggagagtatccaaaaattccaagtataatgcagaaagcacagaaagggagtcacaagacactgttgcagagaatgatgatggcgggttcagtgaggaatgggaagcccagagggacagtcatctagggcctcatcgctctacacctgagtcacgagctgctgtccaggaactttccagcagtatcctcgctggtgaagacccagaggaaaggggagtaaaacttggattgggagatttcattttctacagtgttctggttggtaaagcctcagcaacagccagtggagactggaacacaaccatagcctgtttcgtagccatattaattggtttgtgccttacattattactccttgccattttcaagaaagcattgccagctcttccaatctccatcacctttgggcttgttttctactttgccacagattatcttgtacagccttttatggaccaattagcattccatcaattttatatctag（SEQ ID NO:3）。需要注意的是，此处的突变序列（加粗表示）的目的是使得转录翻译之后的蛋白出现对应位置的氨基酸突变；所以，可以用有同样转录翻译结果的序列（如gtt，gtc和gta）来代替此处的突变序列。

第二外源基因Thy1-hPSEN1转基因片段的序列如SEQ ID NO:4所示（斜体为Thy1启动子序列，下划线为Kozak序列，加粗为带有突变的hPSEN1 CDS序列，其中加粗并带有下划线为突变位点序列，方向为5’-3’）：aattcagagaccgggaaccaaactagcctttaaaaaacataagtac aggagccagcaagatggctcagtgggtaaaggtgcctaccagcaagcctgacagcctgagttcagtccccacgaac tacgtggtaggagaggaccaaccaactctggaaatctgttctgcaaacacatgctcacacacacacacacaaatag tataaacaattttaaatttcatttaaaaataatttgtaaacaaaatcattagcacaggttttagaaagagcctctt ggtgacatcaagttgatgctgtagatggggtatcattcctgaggacccaaaaccgggtctcagcctttccccattc tgagagttctctcttttctcagccactagctgaagagtagagtggctcagcactgggctcttgagttcccaagtcc tacaactggtcagcctgactactaaccagccatgaagaaacaaggagtggatgggctgagtctgctgggatgggag tggagttagtaagtggccatggatgtaatgaccccagcaatgctggctagaaggcatgcctcctttccttgtctgg agacggaacgggagggatcatcttgtactcacagaagggagaacattctagctggttgggccaaaatgtgcaagtt cacctggaggtggtggtgcatgcttttaactccagtactcaggaggcagggccaggtggatctctgtgagttcaag accagcctgcactatggagagagttttgggacagccagagttacacagaaaaatcctggtggaaaatctgaaagaa 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ctacaagtgtcatgccagaaaagtctctaagaaaaccttttcagggaaaagggggtgactcaacaccgggcaagtt tgggaagccccacccttcgagtgatggaagagcagataggaagcctcagaagagagacaccggcacccaggtaacg ttcctcatgtggtctctgtcacactaggtgctcttccctggacatctccgtgaccacactctcagttcttagggag atgcgggtgctctctgaggctatctcagagttgcagattctgaggcctagagtgactacagtcagcctaggaagcc acagaggactgtggaccaggagggcagaagaggagaagggaagaaaaaccatcagataggacttgcaatgaaacta acccaagacaatcataatgcagacaggaatgttaaaggcgttcagcagctggccatgacacccatctgtccctctg gccaagtcagcaagcctggaagacctgggactcctgcccatatgtcctaagctccccacccacccactcgttcact gtccttattctctctctaccttcagccacttagtttcctaccttaagtcctagaattgatcctggcgtaatagcga agaggcccgcaccgat（SEQ ID NO:4）。

第三外源基因转基因片段的突变型hMAPT CDS序列如SEQ ID NO:5所示（其中加粗字体为突变位点序列，方向为5’-3’）：atggctgagccccgccaggagttcgaagtgatggaagatcacgctgggacgtacgggttgggggacaggaaagatcaggggggctacaccatgcaccaagaccaagagggtgacacggacgctggcctgaaagctgaagaagcaggcattggagacacccccagcctggaagacgaagctgctggtcacgtgacccaagctcgcatggtcagtaaaagcaaagacgggactggaagcgatgacaaaaaagccaagggggctgatggtaaaacgaagatcgccacaccgcggggagcagcccctccaggccagaagggccaggccaacgccaccaggattccagcaaaaaccccgcccgctccaaagacaccacccagctctggtgaacctccaaaatcaggggatcgcagcggctacagcagccccggctccccaggcactcccggcagccgctcccgcaccccgtcccttccaaccccacccacccgggagcccaagaaggtggcagtggtccgtactccacccaagtcgccgtcttccgccaagagccgcctgcagacagcccccgtgcccatgccagacctgaagaatgtcaagtccaagatcggctccactgagaacctgaagcaccagccgggaggcgggaaggtgcagataattaataagaagctggatcttagcaacgtccagtccaagtgtggctcaaaggataatatcaaacacgtcctgggaggcggcagtgtgcaaatagtctacaaaccagttgacctgagcaaggtgacctccaagtgtggctcattaggcaacatccatcataaaccaggaggtggccaggtggaagtaaaatctgagaagcttgacttcaaggacagagtccagtcgaagattgggtccctggacaatatcacccacgtccctggcggaggaaataaaaagattgaaacccacaagctgaccttccgcgagaacgccaaagccaagacagaccacggggcggagatcgtgtacaagtcgccagtggtgtctggggacacgtctccacggcatctcagcaatgtctcctccaccggcagcatcgacatggtagactcgccccagctcgccacgctagctgacgaggtgtctgcctccctggccaagcagggtttgtga（SEQ ID NO:5）。需要注意的是，此处的突变序列（加粗表示）的目的是使得转录翻译之后的蛋白出现对应位置的氨基酸突变；所以，可以用有同样转录翻译结果的序列（如ctt，ctc和cta）来代替此处的突变序列。

第三外源基因Thy1-hMAPT转基因片段的序列如SEQ ID NO:6所示（斜体为Thy1启动子序列，下划线为Kozak序列，加粗为带有突变的hMAPT CDS序列，其中加粗并带有下划线为突变位点序列，方向为5’-3’）：aattcagagaccgggaaccaaactagcctttaaaaaacataagtacag gagccagcaagatggctcagtgggtaaaggtgcctaccagcaagcctgacagcctgagttcagtccccacgaacta cgtggtaggagaggaccaaccaactctggaaatctgttctgcaaacacatgctcacacacacacacacaaatagta taaacaattttaaatttcatttaaaaataatttgtaaacaaaatcattagcacaggttttagaaagagcctcttgg tgacatcaagttgatgctgtagatggggtatcattcctgaggacccaaaaccgggtctcagcctttccccattctg agagttctctcttttctcagccactagctgaagagtagagtggctcagcactgggctcttgagttcccaagtccta caactggtcagcctgactactaaccagccatgaagaaacaaggagtggatgggctgagtctgctgggatgggagtg gagttagtaagtggccatggatgtaatgaccccagcaatgctggctagaaggcatgcctcctttccttgtctggag acggaacgggagggatcatcttgtactcacagaagggagaacattctagctggttgggccaaaatgtgcaagttca cctggaggtggtggtgcatgcttttaactccagtactcaggaggcagggccaggtggatctctgtgagttcaagac cagcctgcactatggagagagttttgggacagccagagttacacagaaaaatcctggtggaaaatctgaaagaaag agagaaagaaagaaagaaagaaaggaagaaagaaagaaagagtggcaggcaggcaggcaggaggaaggaaggaagg aaggaaggaaggaaggaaggaaggaaggaaaataggtgcgacttcaagatccggagttacaagcagaatgcactgt ttccctaacagggccaagtgttttgagtaactgaaggtgggcatgatgcctgggaagcagaaacaagccaggcaga tgcaccccttgccttgcttccgaagggctgcagtagcatggaaaacatggaaaacaaccaatccattccctttgct gatataacaggctccaaagccaaaacctgtcactggaggctcaagagcagatctccagccaagaggcaaaggaatg ggggaagctggagggcctccctctggttatccaggcttctgaaggttcaagcaaagaaagggttacaaccttaaaa ggagagcgtcccggggtatgggtagaagactgctccaccccgacccccagggtccctaaccgtcttttccctgggc gagtcagcccaatcacaggactgagagtgcctctttagtagcagcaagccacttcggacacccaaatggaacacct ccagtcagccctcgccgaccaccccaccccctccatccttttccctcagcctccgattggctgaatctagagtccc tccctgctcccccctctctccccacccctggtgaaaactgcgggcttcagcgctgggtgcagcaactggaggcgtt ggcgcaccaggaggaggctgcagctaggggagtccaggtgagagcaggccgacgggagggacccgcacatgcaagg accgccgcagggcgaggatgcaagccttccccagctacagttttgggaaaggataccagggcgctcctatatgggg gcgcgggaactggggaaagaaggtgctcccaggtcgaggtgggagaggaaggcagtgcggggtcacgggctttctc cctgctaacggacgctttcgaagagtgggtgccggaggagaaccatgaggaaggacatcaaggacagcctttggtc cccaagctcaaatcgctttagtggtgcgaatagagggaggaggtgggtggcaaactggagggagtccccagcgggt gacctcgtggctggctgggtgcggggcaccgcaggtaagaaaaccgcaatgttgcgggaggggactgggtggcagg cgcgggggaggggaaagctagaaaggatgcgagggagcggaggggggagggagcgggagaatctcaactggtagag gaagattaaaatgaggaaatagcatcagggtggggttagccaagccgggcctcagggaaagggcgcaaagtttgtc tgggtgtgggcttaggtgggctgggtatgagattcggggcgccgaaaacactgctgcgcctctgccaaatcacgct acccctgtatctagttctgccaggcttctccagccccagccccaattcttttctctagtgttcccccttccctccc ctgaatctcaagcccacactccctcctccataacccactgttatcaaatctaagtcatttgccacccaacaaccat caggaggcggaagcagacgggaggagtttgagatcaacttgggctacatcacgagttccaggctcaccaaggcttc ttaaggagaccttgtctctaaaattaattaattaattaattaatagtcccctttctctgccacagaaccttgggat ctggctcctggtcgcagctccccccaccccaggctgacattcactgccatagcccatccggaaatcctagtctatt tccccatggatcttgaactgcagagagaatggcagagtggcccgccctgtgcaaaggatgttcctagcctaggtgg agctcgcgaactcgcagactgtgcctctcttgggcaaggacaggctagacagcctgccggtgtgttgagctagggc actgtggggaaggcagagaacctgtgcagggcagcaatgaacacaggaccagaaaactgcagccctaggaacactc aagagctggccatttgcaagcatctctggcctccgtgcttctcactcatgtcccatgtcttatacaggcctctgtg gcacctcgcttgcctgatctcatccctagccgttaagctttctgcatgacttatcacttggggcataatgctggat acctaccattttcttagaccccatcaaaatcctatttgagtgtacggttcggagaacctcatttatccggtaaatg tcttttactctgctctcagggagctgaggcaggacatcctgagatacattgggagaggagatacagtttcaataaa ataataggttgggtggaggtacatgcctataatgccaccactcaggaaatggtggcagcttcgtgagtttgaggcc aacccaagaaacatagtgaaaccctgtcagtaaataagtaagcaagtatttgagtatctactatatgctagggctg acctggacattaggggtcatcttctgaacaaactagtgcttgagggaggtatttggggtttttgtttgtttaatgg atctgaatgagttccagagactggctacacagcgatatgactgagcttaacacccctaaagcatacagtcagacca attagacaataaaaggtatgtatagcttaccaaataaaaaaattgtattttcaagagagtgtctgtctgtgtagcc ctggctgttcttgaactcactctgtagaccaggctggcctggaaatccatctgcctgcctctgcctctctgcctct ctgcctctctgcctctctctctgcctctctctgcctctctctgcccctctctgcccctctctgcccctctctgccg ccctctgccttttgccctctgccctctgttctctggcctctgccctctgccctctggcctctggcctctgcctctg cctcttgagtgctggaatcaaaggtgtgagctctgtaggtcttaagttccagaagaaagtaatgaagtcacccagc agggaggtgctcagggacagcacagacacacacccaggacataggctcccacttccttggctttctctgagtggca aaggaccttaggcagtgtcactccctaagagaaggggataaagagaggggctgaggtattcatcatgtgctccgtg gatctcaagccctcaaggtaaatggggacccacctgtcctaccagctggctgacctgtagctttccccaccacaga atccaagtcggaactcttggcacctagaggatc 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gaaagggacattctcaagacccaggcaccctgatcagcactgacttggagctacaagtgtcatgccagaaaagtct ctaagaaaaccttttcagggaaaagggggtgactcaacaccgggcaagtttgggaagccccacccttcgagtgatg gaagagcagataggaagcctcagaagagagacaccggcacccaggtaacgttcctcatgtggtctctgtcacacta ggtgctcttccctggacatctccgtgaccacactctcagttcttagggagatgcgggtgctctctgaggctatctc agagttgcagattctgaggcctagagtgactacagtcagcctaggaagccacagaggactgtggaccaggagggca gaagaggagaagggaagaaaaaccatcagataggacttgcaatgaaactaacccaagacaatcataatgcagacag gaatgttaaaggcgttcagcagctggccatgacacccatctgtccctctggccaagtcagcaagcctggaagacct gggactcctgcccatatgtcctaagctccccacccacccactcgttcactgtccttattctctctctaccttcagc cacttagtttcctaccttaagtcctagaattgatcctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgat（SEQ ID NO:6）。

（2）将上述三种转基因片段显微注射到小鼠的受精卵中，随机打靶插入小鼠基因组；

（3）将受精卵移植入假孕雌性小鼠体内，鉴定筛选获得三个外源基因鉴定均为阳性的F0代小鼠；

PCR鉴定使用的引物对序列如下：

鉴定第一外源基因hAPP引物对：引物对1：AAGTAATGAAGTCACCCAGCAGG（SEQ ID NO:7）和CGTTTCTCCCCATGTTCTGAGA（SEQ ID NO:8）；引物对2：GGGTTGACAAATATCAAGACGGAG（SEQID NO:9）和CGTTTCTCCCCATGTTCTGAGA（SEQ ID NO:8）；

鉴定第二外源基因hPSEN1的引物对：引物对1：AAGTAATGAAGTCACCCAGCAGG（SEQ IDNO:10）和CGTACAGTATTGCTCAGGTGGTTG（SEQ ID NO:11）；引物对2：AGGAACTTTCCAGCAGTATCCTC（SEQ ID NO:12）和CGTTTCTCCCCATGTTCTGAGA（SEQ ID NO:13）；

鉴定第三外源基因hMAPT的引物对：引物对1：AAGTAATGAAGTCACCCAGCAGG（SEQ IDNO:14）和TGCCTGCTTCTTCAGCTTTCAG（SEQ ID NO:15）；引物对2：CAAGTGTGGCTCATTAGGCAAC（SEQ ID NO:16）和CGTTTCTCCCCATGTTCTGAGA（SEQ ID NO:17）；

内参基因的引物对：GTGCTGCTCACGCTGACCTTTAG（SEQ ID NO:18）和CAGAGTGGAATACTGTTGCACC（SEQ ID NO:19）。

（4）用F0代小鼠与野生小鼠（wide type，WT）回交，直至获得F0N5代小鼠；由F0N5代小鼠自交获得所述阿尔兹海默症小鼠模型3-FAD纯合阳性小鼠。

实施例2 检测血液生物标志物

采用自动超灵敏的免疫测定-单分子阵列的检测方法对小鼠血浆中阿尔兹海默临床早期血液检测指标进行检测，所检测的对象包括3只1月龄的3-FAD（1M）小鼠、3只2月龄的3-FAD（2M）小鼠和3只6月龄的C57BL/6J对照鼠（WT）作为对照组，实验结果如图1所示。其中，图1中（a）、（b）、（c）分别表示Aβ42/40、p-Tau181和p-Tau217的血液（血浆）检测结果（单位：pg/mL）。

从图1可以看出，首先，在1M的3-FAD小鼠的血液中同时检测出了Aβ42/40、p-Tau181以及p-Tau217这三种生物标志物。而目前市面上并未发现有能够同时从血液中检测出这三种生物标志物的模型，更没有在1月龄时就能检测到的情况。

其次，Aβ42/40比率的上调，具体为相较于对照组中未检测到Aβ42，3-FAD小鼠在1月龄就出现了Aβ42，并且随着时间推移，2月龄中Aβ42/40比率有所上升，但并未随疾病进程的进展而呈现出显著上升的态势，这一表现与临床上阿尔兹海默症的疾病进程是符合的。

最后，p-Tau181，p-Tau217的浓度随着时间推移而逐渐上升，这一表现也与临床患者中的检测指标是一致的。

由此，可以得出结论：3-FAD小鼠可以在血浆中成功同时检测出Aβ42/40，p-Tau181，p-Tau217，并且所呈现出的病症指标与临床血液早期检测的标准一致。

实施例3 病理学脑区检测

阿尔兹海默标志性神经病理学改变是弥散性的神经炎性斑块，其标志是细胞外β-淀粉样物质沉积（Aβ沉积），还有神经原纤维缠结（由过度磷酸化的Tau蛋白在细胞内聚集所形成的）。其中，Aβ聚集会贯穿整个阿尔兹海默病的发展阶段。

检测步骤：取3-FAD小鼠6只，在2月龄时进行安乐死处理。接着进行灌流取脑并进行固定、包埋，通过免疫组化染色检测Aβ斑块的表达，得到免疫组织化学（IHC）结果。采用同样的方法处理对照组（WT）2月龄的C57BL/6J2小鼠以及4月龄、6月龄的3-FAD小鼠，得到IHC结果。

从结果可以看出：一方面，如图2所示，相较于对照组中的小鼠未出现Aβ沉积，在2月龄3-FAD小鼠的皮层(Cortex，Ctx)、海马下托（Subiculum，Sub）中，Aβ被检测出来，并呈现散斑状态。并且如图3所示，在1月龄的3-FAD小鼠中，Aβ的沉积并未显现，而在2月龄的3-FAD小鼠脑中，Aβ的沉积才得以表现出来，同时结合前述在血液中1月龄的3-FAD小鼠就能够检测到Aβ42，这种情况与实际的临床表现是相符的。另外，随着病程的进展，Aβ沉积在3-FAD小鼠皮层和海马下托呈现聚集并斑块化，直至6月龄出现Aβ斑块沉积；而同为6月龄的对照组并未出现Aβ沉积。说明3-FAD小鼠在Aβ斑块逐渐沉积表达这一病理表征上与阿尔兹海默症的临床表征一致。

另一方面，多种过度磷酸化的Tau蛋白在3-FAD小鼠不同鼠龄阶段被检测出来。如图4所示，在1月龄的3-FAD小鼠的皮层(Ctx)、海马（Hip）和小脑（Cere）中，p-Tau 181被检测出来；如图5所示，在2月龄3-FAD小鼠的皮层(Ctx)、海马（Hip）和小脑（Cere）中，p-Tau 217被检测出来；如图6所示，同样在2月龄3-FAD小鼠中，p-Tau (Thr231)被检测出来；如图7所示，在3月龄3-FAD（3M）小鼠的皮层(Ctx)、海马（Hip）和小脑（Cere）中，p-Tau (Ser202,Thr205)被检测出来；如图8所示，在3月龄3-FAD小鼠的皮层(Ctx)、海马（Hip）和小脑（Cere）中，p-Tau (Ser396)被检测出来。其中，如图9所示，p-Tau181随时间进程磷酸化而加剧，并逐渐形成缠结形态；如图10所示，p-Tau(Ser202, Thr205)出现在Aβ沉积被检出之后，并随疾病进程加剧。

由此，根据图2-图10，可以得出结论：在3-FAD小鼠脑区中，p-Tau181、p-Tau217、p-Tau (Thr231)、p-Tau(Ser202, Thr205)和p-Tau(Ser396)按时间顺序依次出现，并且在3-FAD小鼠脑中，p-Tau181出现在Aβ沉积之前，p-Tau(Ser202, Thr205)出现在Aβ沉积之后，且随病程进展而加剧。而这种病理进程或阶段的发展与临床病人的情况是相符的，具有用于研究阿尔兹海默症病理机制研究和用于筛选治疗阿尔兹海默症药物的前景。

实施例4 行为学验证

视空间记忆的丧失是阿尔兹海默症病程发展中典型的行为特征表现。Morris水迷宫实验是一种在神经科学领域被广泛应用的实验方法，其主要作用是对实验动物的空间学习、记忆能力和方向感进行评估。该实验是基于动物想要逃避水环境的本能反应，即通过对动物在水迷宫中寻找隐藏在水下的平台所需的时间和路径进行观察，以此来对其空间记忆能力予以评估。

对3月龄3-FAD小鼠进行Morris水迷宫实验，3月龄的C57BL/6J小鼠作为对照组（WT）。具体为在一个如图11中（a）所示圆形水池中，水池分为四个象限（Q1、Q2、Q3和Q4），水池的水温保持在23±1℃。第一天将一个隐形固定平台(直径10cm)放置于Q2高于水面1cm左右，进行2次可视化训练，第2~5天，将隐形固定平台放置于Q2浸入水面以下1cm，每天进行4次训练。在第6天将平台从迷宫中移除，让小鼠自由游泳60秒。监测并记录每只小鼠越过有效区域(平台)的时间和距离以及在目标象限(平台所在象限)中探索的时间和距离，以及进入的次数。

结果如图11中（b）和（c）所示，与对照组相比，3-FAD小鼠不论是在游泳距离（单位：m）还是游泳速度（单位：mm/s）上均无明显差异，说明3M的3-FAD小鼠在行动能力上与对照组一致，即运动功能(Normal locomotor function）并未受损。如图11中（d）和（e）所示，从进入平台所在的象限即第二象限的次数和停留时间上看，相较于对照组，3-FAD小鼠的停留时间明显缩短，并且进入次数明显减少，结合其运动功能未受损的情况，说明3-FAD小鼠未能记住平台的位置，即记忆能力下降。同时相较于对照组，3-FAD小鼠从放入水池至到达平台的时间明显比对照组长，如图11中（f）所示，且在平台附近穿梭的次数也明显比对照组少，如图11中（g）所示，结合其运动功能未受损的情况，同样说明3-FAD小鼠的记忆能力下降。

由此，可以得出结论3月龄的3-FAD小鼠的运动功能(Normal locomotorfunction）并未受到损害，但表现出与临床症状相符的空间记忆能力下降的表型。并且相较于2月龄开始出现Aβ沉积的病理表征，行为学表征为3月龄开始出现，符合临床上阿尔兹海默症的发病进程。

综上所述，3-FAD小鼠可切实有效模拟人类阿尔茨海默病患者从临床诊断标志物、病理直至行为变化的小鼠模型，这对于深入探究阿尔茨海默症的发病机制、发现新的治疗靶点以及推动药物研发都具有重要的意义。

实施例5 利用3-FAD小鼠模型进行药物筛选

使用药物Lecanemab对3-FAD小鼠进行治疗，具体为对4只1月龄的3-FAD小鼠进行腹腔注射给药，给药量为12 mpk/只每次，每周一次，连续给药4周，记为实验组（3-FAD+Lecanemab）。同时设置两个对照组，对照组一为未给药的6月龄C57BL/6J小鼠（WT）3只，对照组二为未给药的3-FAD小鼠4只（3-FAD）。检测4周后小鼠血液中p-Tau181、p-Tau217的含量，结果如图12所示，其中，（a）和（b）分别表示血液中p-Tau181、p-Tau217的含量检测结果。由图12可知，在同样未给药的情况下，3-FAD小鼠血液中的p-Tau181、p-Tau217的含量相较于C57BL/6J小鼠显著提高，但给药后的3-FAD小鼠（3-FAD+Lecanemab）中的p-Tau181、p-Tau217的含量相较于未给药的3-FAD小鼠（3-FAD），这两个血液标志物含量均出现下降，与临床AD患者的趋势一致；并且相较于p-Tau181，p-Tau217下降趋势更为明显，也与临床治疗患者经Lecanemab治疗检测结果一致。

本申请还检测了对照组与给药4周后的实验组的脑部切片，得到如图13所示的IHC结果，与C57BL/6J小鼠相比，未给药的3-FAD小鼠（3-FAD）中有明显的Aβ沉积，而用药后的3-FAD小鼠（3-FAD+Lecanemab）中Aβ沉积出现减缓，且斑块面积变小，与临床治疗患者经Lecanemab治疗检测结果一致，说明本申请的3-FAD小鼠可用于阿尔兹海默症的药物筛选。

上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。

同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。

同理，应当注意的是，为了简化本说明书披露的表述，从而帮助对一个或多个发明实施例的理解，前文对本说明书实施例的描述中，有时会将多种特征归并至一个实施例、附图或对其的描述中。但是，这种披露方法并不意味着本说明书对象所需要的特征比权利要求中提及的特征多。实际上，实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。

一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20%的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。

针对本说明书引用的每个专利、专利申请、专利申请公开物和其他材料，如文章、书籍、说明书、出版物、文档等，特此将其全部内容并入本说明书作为参考。与本说明书内容不一致或产生冲突的申请历史文件除外，对本说明书权利要求最广范围有限制的文件（当前或之后附加于本说明书中的）也除外。需要说明的是，如果本说明书附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本说明书所述内容有不一致或冲突的地方，以本说明书的描述、定义和/或术语的使用为准。

最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。

Claims (5)

1.一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型在研究阿尔茨海默症病理机制或筛选用于治疗阿尔茨海默症的药物中的应用，其特征在于，所述小鼠模型的基因组包括第一外源基因hAPP的转基因片段、第二外源基因hPSEN1的转基因片段和第三外源基因hMAPT的转基因片段；

其中，所述第一外源基因hAPP的转基因片段携带Swedish突变；所述第二外源基因hPSEN1的转基因片段携带hPSEN1 M146V突变；所述第三外源基因hMAPT的转基因片段携带hMAPT P243L突变；

所述第一外源基因hAPP的转基因片段的CDS序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二外源基因hPSEN1的转基因片段的CDS序列如SEQ ID NO:3所示，所述第三外源基因hMAPT的转基因片段的CDS序列如SEQ ID NO:5所示；

将所述第一外源基因hAPP的转基因片段、所述第二外源基因hPSEN1的转基因片段和所述第三外源基因hMAPT的转基因片段插入小鼠受精卵的基因组；将所述受精卵移植入假孕雌性小鼠体内，筛选获得三个外源基因鉴定均为阳性的F0代小鼠；用所述F0代小鼠与野生小鼠回交，直至获得F0N5代小鼠；由所述F0N5代小鼠自交获得所述阿尔兹海默症小鼠模型3-FAD纯合阳性小鼠。

2.一种三突变阿尔兹海默症小鼠模型的构建方法，所述构建方法包括：

（1）制备第一外源基因hAPP的转基因片段、第二外源基因hPSEN1的转基因片段和第三外源基因hMAPT的转基因片段；

（2）将所述三种转基因片段插入小鼠受精卵的基因组；

（3）将所述受精卵移植入假孕雌性小鼠体内，筛选获得三个外源基因鉴定均为阳性的F0代小鼠；

（4）基于所述F0代小鼠，获得阿尔兹海默症小鼠模型3-FAD纯合阳性小鼠；

其中，所述第一外源基因hAPP的转基因片段携带Swedish突变；所述第二外源基因hPSEN1的转基因片段携带hPSEN1 M146V突变；所述第三外源基因hMAPT的转基因片段携带hMAPT P243L突变；

所述第一外源基因hAPP的转基因片段的CDS序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二外源基因hPSEN1的转基因片段的CDS序列如SEQ ID NO:3所示，所述第三外源基因hMAPT的转基因片段的CDS序列如SEQ ID NO:5所示；

所述步骤（4）包括用所述F0代小鼠与野生小鼠回交，直至获得F0N5代小鼠；由所述F0N5代小鼠自交获得所述阿尔兹海默症小鼠模型3-FAD纯合阳性小鼠。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中制备所述转基因片段包括：

a. 获取Thy1启动子及所述第一外源基因hAPP、所述第二外源基因hPSEN1和所述第三外源基因hMAPT的PCR产物；

b. 将所述Thy1启动子分别与所述第一外源基因hAPP、所述第二外源基因hPSEN1和所述第三外源基因hMAPT的PCR产物以及骨架载体进行连接形成重组载体，并将所述重组载体转化到感受态细胞中；

c. 转化后进行PCR鉴定和测序，选择测序正确的克隆作为转基因载体；

d. 基于所述转基因载体制备所述转基因片段。

4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）包括：

将所述转基因片段显微注射到小鼠的受精卵中，随机打靶插入所述小鼠受精卵的基因组。

5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）所述鉴定由PCR反应完成，所述PCR反应使用的引物对分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示。