CN114480494B

CN114480494B - 蛋白探针以及其在检测bace1活性中的应用

Info

Publication number: CN114480494B
Application number: CN202210124739.8A
Authority: CN
Inventors: 仓春蕾; 李豪; 魏亚男
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2022-02-10
Filing date: 2022-02-10
Publication date: 2024-07-05
Anticipated expiration: 2042-02-10
Also published as: CN114480494A

Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及蛋白探针以及其在检测BACE1活性中的应用。本发明提供了表达载体，上述表达载体包括编码如下蛋白片段的基因，上述蛋白片段包括：mCherry‑N片段，mCherry‑C片段，VAMP7，BACE1识别多肽。本发明提供了一种直观，动态，简便，可操作性强，可在生理条件下实施，可用于检测活细胞中BACE1活性的荧光蛋白探针。

Description

蛋白探针以及其在检测BACE1活性中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及蛋白探针以及其在检测BACE1活性中的应用。

背景技术

β分泌酶(BACE1)是一种天冬氨酸蛋白酶，主要表达在内体上，在阿尔兹海默病(AD)的发病机制中起关键作用。Vassar等人发现BACE1通过介导淀粉样蛋白前体蛋白(APP)在β位点的酶切，促进生成了包含99个氨基酸残基的C末端片段(β-CTF)。随后，β-CTF经过γ分泌酶的进一步酶切形成并释放淀粉样蛋白β(Aβ)。Aβ易在脑组织中积聚，导致聚集物和不溶性纤维的产生，成为AD发生的重要原因。总的来说，BACE1是Aβ形成过程中的关键酶，与AD的发生发展有着密切的联系。因此，BACE1可以作为AD药物开发的重要靶点，而开发用于活细胞BACE1活性测定的高选择性和灵敏度的强大工具对于AD特异性药物的筛选是至关重要的。

目前对BACE1活性的检测大多数依赖化学合成的肽底物，比如Sigma-Aldrich公司在售BACE1活性检测试剂盒，但该试剂盒需要首先将细胞裂解，使用蛋白裂解液进行检测，无法还原真实的生理环境。在现有技术中，BACE1活性检测的探针合成复杂，数据处理繁琐，仪器要求高，可操作性低。

因此，提供蛋白探针以及其在检测BACE1活性中的应用具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了蛋白探针以及其在检测BACE1活性中的应用。本发明的目的是开发一种直观，动态，简便，可操作性强，可在生理条件下实施，可用于检测活细胞中BACE1活性的荧光探针。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了表达载体，上述表达载体包括编码如下蛋白片段的基因，上述蛋白片段包括：

mCherry-N片段；

mCherry-C片段；

VAMP7；

BACE1识别多肽。

在本发明的一些具体实施方案中，所述mCherry-N片段为mCherry氨基酸序列的1-132，所述mCherry-C片段为mCherry氨基酸序列的142-236。

在本发明的一些实施方案中，133-141，133-140，134-140代表不同长度的上述的所述BACE1识别多肽，依次包括如下氨基酸序列：EVNLDAEFR，EVNLDAEF，VNLDAEF。

在本发明的一些实施方案中，上述BACE1识别多肽包括：133-141EVNLDAEFR。

在本发明的一些实施方案中，编码上述133-141(EVNLDAEFR)识别多肽具有：

(16)、如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；或

(17)、与(16)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(16)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(18)、与(16)或(17)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(16)或(17)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，上述BACE1识别多肽包括：133-140EVNLDAEF。

在本发明的一些实施方案中，编码上述133-140(EVNLDAEF)识别多肽具有：

(19)、如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；或

(20)、与(19)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(19)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(21)、与(19)或(20)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(19)或(20)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，上述BACE1识别多肽包括：134-140VNLDAEF。

在本发明的一些实施方案中，编码上述134-140(VNLDAEF)识别多肽具有：

(22)、如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；或

(23)、与(22)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(22)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(24)、与(22)或(23)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(22)或(23)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中上述mCherry-N端即为mCherry氨基酸序列的1-132，mCherry-C端即为mCherry氨基酸序列的142-236。

在本发明的一些实施方案中，上述表达载体中编码上述mCherry-N片段的核酸具有：

(1)、如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；或

(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；和/或

编码上述mCherry-C片段的核酸具有：

(4)、如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；或

(5)、与(4)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(4)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(4)或(5)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；和/或

编码上述VAMP7的核酸具有：

(7)、如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；或

(8)、与(7)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(7)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(9)、与(7)或(8)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(7)或(8)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；和/或

上述BACE1识别多肽具有：

(10)、如SEQ ID NO:10、如SEQ ID NO:11和/或如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；或

(11)、如(10)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(10)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(12)、与(10)或(11)所示的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列；

编码所述BACE1识别多肽的核酸具有：

(13)、如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；或

(14)、与(13)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(13)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(13)或(14)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

本发明还提供了引物及其组合，以上述表达载体为扩增的目的片段。

在本发明的一些实施方案中，上述引物具有：

(25)如SEQ ID NO:1～9任意所示的核苷酸序列；

(26)与(25)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(25)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(27)与(25)或(26)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(25)或(26)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

本发明还提供了宿主细胞，转化和/或转染上述表达载体。

本发明还提供了蛋白探针，经上述表达载体和/或上述宿主细胞直接或间接制得。

在本发明的一些实施方案中，上述蛋白探针中使用VAMP7将探针定位至内体上，VAMP7是一种定位在内体膜上的蛋白。从cDNA文库中使用PCR技术扩增出VAMP7，将VAMP7克隆进入pcDNA3.1-mCherry-BACE1-sub中，并且放置于mCherry-BACE1-sub的前端，使其表达出VAMP7-mCherry-BACE1-sub融合蛋白。使该探针定位至内体，从而提高其对BACE1活性检测的敏感性。

在本发明的一些实施方案中，上述蛋白探针的构建首先因VAMP7的定位序列在其N端，故将其接入探针蛋白的N端，以达到将荧光蛋白定位至内体的目的，且VAMP7在胞质侧有187个氨基酸残基，而腔内侧仅有11个氨基酸残基，可以令mCherry-BACE1-sub与大量表达在内体膜上的BACE1有更多的空间结合机会，增大酶切效率。

在本发明的一些实施方案中，上述蛋白探针通过VAMP7定位在内体上，增加与BACE1结合的可能性。EVNLDAEF是APPswe(APPswe是APP的一种致病突变型，该突变可以更容易被BACE1酶切)中一段可以被BACE1识别并酶切的多肽，当BACE1识别到EVNLDAEF时，便可以发挥酶切作用，将mCherry剪成两段蛋白，从而失去荧光。通过光学系统，比如荧光显微镜，可以检测到这种荧光的变化，从而对BACE1活性进行评估。

在本发明的一些实施方案中，上述蛋白探针中如图3所示可以看到替换入的多肽在mCherry突出的位置，更加方便BACE1的识别酶切。

在本发明的一些实施方案中，也可以将上述蛋白探针构建至病毒载体之中，构建稳定表达探针的细胞系，此细胞系可以作为筛选BACE1特异性药物的工具细胞，用来建立大规模高通量药物筛选的方案。

本发明还提供了检测产品，包括上述蛋白探针以及可接受的助剂。

在本发明的一些实施方案中，上述检测产品不包括蛋白裂解液。

本发明还提供了上述表达载体、上述宿主细胞、上述蛋白探针和/或上述检测产品在制备检测BACE1活性的试剂盒中的应用。

本发明还提供了上述表达载体、上述宿主细胞、上述蛋白探针和/或上述检测产品在制备检测和/或诊断阿尔兹海默症的试剂盒中的应用。

本发明还提供了上述表达载体、上述宿主细胞、上述蛋白探针和/或上述检测产品在筛选预防和/或治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。

本发明提供了表达载体，上述表达载体包括编码如下蛋白片段的基因，上述蛋白片段包括：mCherry-N片段；mCherry-C片段；VAMP7；BACE1识别多肽。

本发明的有益效果包括：

(1)与已有的检测试剂相比，本发明中的探针不必使用蛋白裂解液，可以在活细胞中进行检测，更能真实的反应BACE1在细胞内的活性。

(2)与一些化合物探针相比，本发明中的蛋白探针可以固定表达在BACE1所在的内体上，可以更加直接准确的检测BACE1活性。

(3)化学小分子的光稳定性不佳，容易发生荧光淬灭；且由于化学小分子的pH稳定性不佳，一些小分子探针容易发生水解，从而产生非特异性信号，而本发明的蛋白探针本质上是一种蛋白，其稳定性更强，避免了非特异性信号的干扰。而mCherry的pKa<4.5，在内体的酸性环境(4.5<pH<6.5)中仍然具有稳定的荧光。

(4)由于本发明的蛋白探针是细胞表达的，有利于进行一些动态的持续性的实验研究。

(5)相比较于利用FRET荧光对的探针检测时需要FRET荧光显微镜而言，本发明的蛋白探针仅需mCherry的红色荧光通道，在普通荧光显微镜下即可实现检测，对检测设备要求低，操作简便直接，数据处理方便。

(6)本发明的蛋白探针可以用于构建稳定表达的细胞系，作为BACE1特异性药物筛选的工具细胞。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示VAMP7-mCherry-BACE1-sub蛋白探针的结构图；

图2示VAMP7-mCherry-BACE1-sub蛋白探针的原理图；

图3示BACE1识别多肽EVNLDAEF替换进入mCherry的位置示意图；

图4示VAMP7-mCherry-BACE1-sub蛋白探针的表达质粒结构图；

图5示HEK293T细胞中共转探针VAMP7-mCherry-BACE1-sub和Rab5a-Q79L的共定位confocal图；

图6示分别在HEK293T细胞中转染探针VAMP7-mCherry-BACE1-sub-(133-141)，VAMP7-mCherry-BACE1-sub-(133-140)，VAMP7-mCherry-BACE1-sub-(134-140)后加入BACE1抑制剂verubecestat的confocal成像和统计图；

其中：133-141，133-140，134-140代表不同长度的BACE1识别多肽：EV NLDAEFR,EVNLDAEF,VNLDAEF；

图7示不同代数的HEK293T细胞中表达探针的confocal成像与统计图；

图8示探针VAMP7-mCherry-BACE1-sub-(133-140)的稳转细胞系中加入verubecestat和过表达BACE1的激光共聚焦显微图和统计图；

图9示在HEK293T细胞中分别表达探针133-141，133-140，134-139，134-140，134-141与135-140后，加入verubecestat的激光共聚焦显微图、荧光强度图及灵敏度图。

具体实施方式

本发明公开了蛋白探针以及其在检测BACE1活性中的应用。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。

本发明荧光蛋白探针构建、多肽识别序列优化及活性检测试验中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1荧光蛋白探针构建至pcDNA3.1

本实施实例将荧光蛋白探针构建至pcDNA3.1中，并使构建得到的探针在HEK293T细胞中表达。

如图4所示是构建得到的质粒结构图，下面对操作步骤具体说明：

使用PCR方法从mCherry-C1的质粒中扩增得到mCherry-N和mCherry-C，使用引物：

mCherry-N-for:5’-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGAT-3’(BamHI)(如SEQ ID NO:1所示)；

mCherry-N-rev:5’-GGTGCCGCGCAGCTT-3’(如SEQ ID NO:2所示)；

mCherry-C-for:5’-AAGCTGCGCGGCACCGAAGTGAATCTGGATGCAGAATTCCGACAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAG-3’(如SEQ ID NO:3所示)；

mCherry-N-rev:5’-CCACACTGGACTAGTGGATCCCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGCC-3’(BamHI)(如SEQ ID NO:4所示)。

其中mCherry-C-for中包含BACE1可以识别并酶切的多肽所对应的碱基序列(5’-GAAGTGAATCTGGATGCAGAATTCCGA-3’)(如SEQ ID NO:5所示)。

随后使用PCR融合蛋白程序将mCherry-N和mCherry-C融合成mCherry-BACE1-sub，使用BamHI单酶切pcDNA3.1后通过同源重组方法将mCherry-BACE1-sub克隆进pcDNA3.1，构建pcDNA3.1-mCherry-BACE1-sub。

提取HEK293T细胞中的mRNA，反转录成cDNA，建立cDNA文库。使用PCR方法从cDNA文库中扩增VAMP7，使用引物：

VAMP7-for:5’-TTTAAACTTAAGCTTGGTACCATGGCGATTCTTTTTGCTGTTGTT-3’(KpnI)(如SEQ ID NO:6所示)；

VAMP7-rev:5’-CATGGATCCGAGCTCGGTACCTTTCTTCACACAGCTTGGCCATGT-3’(KpnI)(如SEQ ID NO:7所示)。

使用KpnI单酶切pcDNA3.1-mCherry-BACE1-sub后通过同源重组方法将VAMP7克隆进pcDNA3.1-mCherry-BACE1-sub，构建VAMP7-mCherry-BACE1-sub-133-141。133-141是指BACE1底物的九个氨基酸序列在mCherry的133a.a.-141a.a.的位置替换掉原始序列。

进一步地，可以通过点突变的方法构建VAMP7-mCherry-BACE1-sub-133-140，VAMP7-mCherry-BACE1-sub-134-140等不同BACE1底物长度的探针。

如图5所示是将质粒VAMP7-mCherry-BACE1-sub与Rab5a-Q79L共转染入HEK293T细胞中，可以明显的看到VAMP7-mCherry-BACE1-sub蛋白可以在HEK293T细胞中表达，并且与内体有着良好的共定位，为探针的高灵敏度提供了基础。

实施例2 BACE1识别的多肽序列优化筛选

在该探针构建的过程中，针对BACE1识别的多肽序列进行了优化筛选：

对最初的133-141：EVNLDAEFR进行缩短，构建了133-140：EVNLDAEF，134-139：VNLDAE，134-140：VNLDAEF，134-141：VNLDAEFR，135-140：NLDAEF。随后对共6种探针进行荧光强度和灵敏度检测：

结果如图9和表1所示，图9中左图为荧光强度的共聚焦图像，图9右上图为六种探针的基础荧光强度，图9右下图为六种探针的灵敏度。综合来看，133-140和134-140灵敏度有所提升，荧光强度也有提升，故而筛选出三种多肽序列。

表1

发现以下三种133-141:EVNLDAEFR,133-140:EVNLDAEF,134-140:VNLDAEF不同长度的多肽序列均可用于作为BACE1酶切的底物参与探针构建。

如图6和表2所示，使用10μM的BACE1抑制剂verubecestat对VAMP7-mCherry-BACE1-sub-(133-141)，VAMP7-mCherry-BACE1-sub-(133-140)和VAMP7-mCherry-BACE1-sub-(134-140)三种探针进行了检测，图6右侧分别统计了每个内体的平均荧光强度，每个细胞中内体的平均荧光强度，每个内体的总荧光强度以及每个细胞内所有内体的总荧光强度，当加入BACE1抑制剂verubecestat时，BACE1活性减弱，探针无法被切开，因此荧光强度增强。

这证明以VAMP7-mCherry-BACE1-sub为基础构建的三种探针在检测BACE1活性方面具有实用性，并且由于序列不同，可能有助于筛选不同结合位点的BACE1药物。

表2

使用ImageJ对激光共聚焦显微镜结果进行荧光强度分析，分别记录内体(图片中的点)的平均荧光强度和总荧光强度，以及每个细胞中内体的平均荧光强度和总荧光强度。数值报告为平均值(mean)+均值标准误差(SEM)。统计学显著性用学生t检验进行计算，p<0.05被认为具有统计学意义，以*按以下形式表示：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。图中标尺为10μm。

实施例3研究细胞衰老中BACE1活性的变换

阿尔兹海默病(AD)是一种神经退行性疾病，AD的发生发展与年龄的增长密切相关。而BACE1与Aβ的积累有着直接的关系，并且在AD的发生发展中发挥着重要的作用。本实例的目的是应用本发明的探针研究细胞衰老中BACE1活性的变换。

基于此目的，分别在19代和69代的HEK293T细胞中转染入mCherry-BACE1-sub，培养后进行confocal成像。结果如图7和表3所示，随着HEK293T代数的增加，探针荧光强度减弱，BACE1活性不断增强。因此，我们可以合理推测：BACE1活性增强，导致在脑组织中产生更多的Aβ积累，导致正常神经元的死亡，进而引发AD症状。这与前人在小鼠和人类脑组织中得到的结果是一致的，进一步证明了该探针的实用性。

表3

	mean	SEM
			P19	1	0.05306
P69	0.84174^*	0.03685

使用ImageJ对激光共聚焦显微镜结果进行荧光强度分析，统计每个细胞的平均荧光强度。数值报告为平均值(mean)+均值标准误差(SEM)。统计学显著性用学生t检验进行计算，p<0.05被认为具有统计学意义，以*按以下形式表示：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。图中标尺为10μm。

实施例4

将VAMP7-mCherry-BACE1-sub-(133-140)的基因序列通过同源重组的方式克隆进入pSin-EF2-EGFP-Pur慢病毒载体中，所用引物：

VAMP7-mCherry-BACE1-sub-133-140-Sin-for：5’-TTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCATGGCGATTCTTTTT-3’(EcoRI)(如SEQ ID NO:8所示)

VAMP7-mCherry-BACE1-sub-133-140-Sin-rev：5’-GAATTGGCCGCCCTAGATGCATGCGGATCCCTACTTGTACAGCTC-3’(BamHI)(如SEQ ID NO:9所示)，得到慢病毒骨架质粒。

随后将质粒pSin-EF2-VAMP7-mCherry-BACE1-sub-pur与包装质粒PAX2、PMD2.G按照2:2:1的质量比使用LentiFit转染入HEK293T细胞中以生产慢病毒。使用慢病毒对HEK293T细胞进行感染，并使用puromycin进行筛选，得到稳定表达VAMP7-mCherry-BACE1-sub-133-140探针的细胞系。

在该细胞系中加入verubecestat，另一方面使用瞬时转染的方法使该细胞系过表达BACE1，24h后进行激光共聚焦显微成像，并使用imageJ对荧光强度进行计算，结果见表4和图8。与图6相似，加入verubecestat后将导致该探针的荧光强度增加；而过表达BACE1之后，该细胞系中BACE1活性得到增强，使得探针被进一步酶切，导致荧光强度减弱。总之，图8中通过抑制和增强BACE1活性这两种方式验证了该细胞系对BACE1活性的灵敏性和实用性，为后续BACE1药物的筛选以及BACE1与AD进一步的相互关系的研究提供一个良好的工具。

表4

	mean	SEM
			DMSO	1	0.04614
verubecestat	2.45406^***	0.18026
			Control	1	0.07164
BACE1	0.73837^**	0.04053

使用ImageJ对激光共聚焦显微镜结果进行荧光强度分析，统计内体(图中的点)的总荧光强度。数值报告为平均值(mean)+均值标准误差(SEM)。统计学显著性用学生t检验进行计算，p<0.05被认为具有统计学意义，以*按以下形式表示：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。图中标尺为10μm。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学技术大学

<120> 蛋白探针以及其在检测BACE1活性中的应用

<130> MP21037680

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttggtaccg agctcggatc catggtgagc aagggcgagg aggat 45

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtgccgcgc agctt 15

<210> 3

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagctgcgcg gcaccgaagt gaatctggat gcagaattcc gacagaagaa gaccatgggc 60

tgggag 66

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccacactgga ctagtggatc cctacttgta cagctcgtcc atgccgcc 48

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagtgaatc tggatgcaga attccga 27

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttaaactta agcttggtac catggcgatt ctttttgctg ttgtt 45

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catggatccg agctcggtac ctttcttcac acagcttggc catgt 45

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcttccatt tcaggtgtcg tgaggaattc atggcgattc ttttt 45

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattggccg ccctagatgc atgcggatcc ctacttgtac agctc 45

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe

1 5

<210> 13

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcacc 396

<210> 14

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 60

ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag 120

gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac 180

atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc 240

gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaag 285

<210> 15

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggcgattc tttttgctgt tgttgccagg gggaccacta tccttgccaa acatgcttgg 60

tgtggaggaa acttcctgga ggtgacagag cagattctgg ctaagatacc ttctgaaaat 120

aacaaactaa cgtactcaca tggcaattat ttgtttcatt acatctgcca agacaggatt 180

gtatatcttt gtatcactga tgatgatttt gaacgttccc gagcctttaa ttttctgaat 240

gagataaaga agaggttcca gactacttac ggttcaagag cacagacagc acttccatat 300

gccatgaata gcgagttctc aagtgtctta gctgcacagc tgaagcatca ctctgagaat 360

aagggcctag acaaagtgat ggagactcaa gcccaagtgg atgaactgaa aggaatcatg 420

gtcagaaaca tagatctggt agctcagcga ggagaaagat tggaattatt gattgacaaa 480

acagaaaatc ttgtggattc ttctgtcacc ttcaaaacta ccagcagaaa tcttgctcga 540

gccatgtgta tgaagaacct caagctcact attatcatca tcatcgtatc aattgtgttc 600

atctatatca ttgtttcacc tctctgtggt ggatttacat ggccaagctg tgtgaagaaa 660

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaagtgaatc tggatgcaga attccga 27

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaagtgaatc tggatgcaga attc 24

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtgaatctgg atgcagaatt c 21

Claims

1.表达载体，其特征在于，

所述表达载体元件的顺序为VAMP7-mCherry-N片段-BACE1识别多肽-mCherry-C片段；

所述BACE1识别多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10、如SEQ ID NO:11或如SEQ ID NO:12所示；

编码所述mCherry-N片段的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

编码所述mCherry-C片段的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于：

编码所述VAMP7的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

编码所述BACE1识别多肽的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQID NO:18所示。

3.宿主细胞，其特征在于，转化和/或转染如权利要求1或如权利要求2所述的表达载体。

4.蛋白探针，其特征在于，经如权利要求1或如权利要求2所述的表达载体，或如权利要求3所述的宿主细胞直接或间接制得。

5.检测产品，其特征在于，包括如权利要求4所述的蛋白探针以及可接受的助剂。

6.如权利要求5所述的检测产品，其特征在于，所述检测产品不包括蛋白裂解液。

7.如权利要求1或如权利要求2所述的表达载体、如权利要求3所述的宿主细胞、如权利要求4所述的蛋白探针、如权利要求5或如权利要求6所述的检测产品在制备检测BACE1活性的试剂盒中的应用。

8.如权利要求1或如权利要求2所述的表达载体、如权利要求3所述的宿主细胞、如权利要求4所述的蛋白探针、如权利要求5或如权利要求6所述的检测产品在制备检测或诊断阿尔兹海默症的试剂盒中的应用。

9.如权利要求1或如权利要求2所述的表达载体、如权利要求3所述的宿主细胞、如权利要求4所述的蛋白探针、如权利要求5或如权利要求6所述的检测产品在筛选预防或治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。