CN106084057A - Bace1剪切型高效价抗体的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用GST表达体系制备的BACE1剪切型高效价抗体及应用。利用基因工程技术将BACE1剪切型基因克隆到原核表达载体中，酶切鉴定后用重组质粒转化大肠杆菌，IPTG诱导产生GST‑BACE1146‑189aa和GST‑BACE1190‑214aa融合蛋白，以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。这两种抗BACE1剪切型多克隆抗体效价与特异性良好，可以应用于细胞中BACE1不同剪切型52KD、49KD的检测以及四种剪切型的区分，并能有效检出BACE1剪切型在不同细胞中的差异表达，对于系统研究BACE1功能及其在AD中的作用机制意义重大。
Description
技术领域
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及利用GST原核表达体系制备GST-BACE1融合蛋白的多克隆抗体及应用。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)，俗称老年痴呆症，是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的致死性中枢神经退行性疾病，AD主要病理特征之一是在神经细胞外由β淀粉样蛋白(Aβ)形成的淀粉样斑块(amyloid plaque)，Aβ是由APP(AmyloidPrecursor Protein)在β剪切酶(BACE1)和γ剪切酶复合物的相继作用下产生。
BACE1蛋白又称β位点APP裂解酶1，是一种膜结合的天冬氨酸蛋白酶，是裂解APP产生Aβ的关键酶，它在多种组织中都有表达，在脑和胰腺中表达最高。在神经元中的BACE1活性较高，而胰腺中高表达的BACE1是缺失了外显子3的无活性片段，这种缺失了部分外显子的表达方式被称为选择性剪切。根据现有的文献报道，BACE1的选择性剪切存在A、B、C、D四种长型，分别为55KD、52KD、49KD和47KD。迄今为止，关于这几种剪切型的功能以及与Aβ的作用机制和与AD的关系，还没有更多的报道和研究，但由于四种剪切型的大小接近，为其研究造成很大困难，所以急需可以分别这几种剪切型的技术手段。
对于一种新的蛋白质的功能的研究，抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测和功能研究中广泛应用的免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗原-抗体相互作用发展起来的。因此我们制备的BACE1蛋白高效价抗体用于检测49KD和52KD两种剪切型，可以有效地分辨这两种剪切型，对于系统研究BACE1作用机制意义重大，为开发治疗AD的药物提供了依据和线索。
发明内容
本发明的目的是建立一种能够用于BACE1蛋白49KD和52KD两种剪切型的检测的模型，为从蛋白水平深入研究BACE1剪切型的蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。
用于区分BACE1四种剪切型55KD、52KD、49KD和47KD的2个抗体片段分别为：BACE1146-189aa(insert1)，BACE1190—214aa(insert2)【图1】。BACE1146-189aa可用于识别BACE1剪切型55KD和52KD，BACE1190—214aa可用于识别BACE1剪切型55KD和49KD。
BACE1剪切型55KD可同时被BACE1146-189aa和BACE1190—214aa识别；BACE1剪切型52KD只可被BACE1146-189aa识别；BACE1剪切型49KD只可被BACE1190—214aa识别；BACE1剪切型47KD既不能被BACE1146-189aa识别，又不能被BACE1190—214aa识别。
| BACE1剪切型 | BACE1146-189aa(insert1) | BACE1190—214aa(insert2) |
| BACE1—55KD | √ | √ |
| BACE1—52KD | √ | × |
| BACE1—49KD | × | √ |
| BACE1—47KD | × | × |
注：表中“√”表示包含该片段且能被该片段识别，“×”表示不包含该片段且不能被该片段识别；
根据此原理，我们从Genebank中获取这两个片段的序列，制备用于检测BACE1——49KD和BACE1——52KD两种剪切型的蛋白高效价抗体。利用基因工程技术，将BACE1蛋白N端第190个氨基酸至214个氨基酸(insert 2)、第146至189个氨基酸(insert 1)对应的DNA片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得2个多克隆抗体，分别能够检测BACE1的49KD和52KD两种剪切型，并且采用ELISA和Western blot检测证明这两个抗体的效价及特异性均很高。
本发明的GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白是将利用特殊序列构建GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特异性的GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白，这两段氨基酸序列以及对应的核苷酸序列分别为：
190--214AA(75bp)
氨基酸序列：
碱基序列：
146--189AA(132bp)
氨基酸序列：
碱基序列:
这种GST-BACE1190-214aa，GST-BACE1146-189aa融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤：
第一步，克隆载体的构建
从人BACE1基因全长上应用PCR技术以pCDNA3.1-Flag-BACE1为模板，扩增得到的目的片段与PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。
第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建
将克隆质粒和质粒pGEX-4T-1双酶切后，利用回收试剂盒获得BACE1190-214aa和BACE1146-189aa基因片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。
第三步，GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白的诱导表达和纯化
重组质粒PGEX-4T-1/BACE1190-214aa和PGEX-4T-1/BACE1146-189aa转化大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose 4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。
第四步，兔抗BACE1190-214aa和BACE1146-189aa抗血清的制备及纯化
以纯化的BACE1190-214aa和BACE1146-189aa融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500μg纯化的GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶100000时，颈动脉放血，收集血清。用ProteinA/G纯化抗BACE1血清，准备蛋白A sepharose CL-4B亲和柱，亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，将抗体洗脱，达到纯化目的，SDS-PAGE鉴定纯化产物，获得该发明的多克隆抗体。应用多种免疫学方法检测其效价及特异性，结果显示这两种抗体可特异性的与BACE1剪切型蛋白结合。
利用BACE1190-214aa和BACE1146-189aa蛋白片段氨基酸基因序列成功地构建GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白原核表达载体，转化BL21后可高效表达特异性的GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白的高效价抗体经多种免疫学方法检测抗体效价及特异性，结果表明抗体效价高达1:100000且特异性良好。
抗体可应用于细胞中BACE1剪切型蛋白的检测并能有效检出BACE1剪切型蛋白在不同组织及细胞株中的差异表达，对于进一步探究BACE1选择性剪切的功能以及与Aβ产生机制的相关性上很有帮助，对于系统研究BACE1剪切型蛋白功能及其在阿尔兹海默症中作用机制意义重大，同时我们制备的抗体为检测不同疾病条件下不同BACE1的剪切型表达并以此判定BACE1蛋白表达与疾病的关系奠定了基础。
附图说明：
图1为抗体设计模式图
图2为PCR扩增出的BACE1基因片段DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图3为重组GST载体琼脂糖凝胶电泳图；
图4为GST及GST-BACE1融合蛋白SDS-PAGE图；
图5为ProteinA/G纯化后的BACE1抗体SDS-PAGE图；
图6为间接ELISA法测定抗体的效价；
图7为抗血清特异性的Westernblot分析。
图8为细胞中过表达不同剪切型的突变质粒，抗体Westernblot分析
具体实施方式：
实施例1:抗GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa剪切型血清的在制备
1、PCR-PMD18-T/BACE1190-214aa和BACE1146-189a重组质粒的构建
BACE1基因全长从Genebank得到，基因序列号为NM 001207048。以pCDNA3.1-Flag-BACE1为模板，190-214aa上游引物为GGA TCC ATG CCT GAC GAC TCC CTG GAG CCT TTCTTT GAC TCT CTG GTAAAG(含Bamh1酶切位点)；下游引物为5’-CTC GAG CTA CTG CAG GGAGGA GAG GTT GGGAAC GTG GGT CTG CTT TAC CAG(含XhoI酶切位点)。146-189aa上游引物为5’-GGATCC ATG GTA AGC ATC CCC CAT GGC(含Bamh1酶切位点)；下游引物为5’-CTC GAGCTA CCT GGC AAT CTC AGC ATA(含XhoI酶切位点)。应用PCR成功扩增出了BACE1基因上25个和44个氨基酸对应75bp和132bp的DNA序列【图2】。扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以BamH I和Xhol I双酶切鉴定。
2、原核表达载体pGEX-4T-1的构建
将含有BACE1基因片段的pMD18-T质粒经BamHI和Xho1双酶切后，利用回收试剂盒获得BACE1190-214aa和BACE1146-189a基因片段，同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1。然后将回收的BACE1190-214aa和BACE1146-189a基因片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。酶切鉴定重组体，结果显示该BACE1基因两个片段均正确【图3】。
3、GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a融合蛋白的诱导表达和纯化
重组质粒PGEX-4T-1/BACE1剪切型转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr培养基中，37℃振摇培养过夜。次日，将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继续在37℃摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25℃继续培养4～5h。离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a融合蛋白的表达【图4】，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。以5000r/min于4℃离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀。用超声裂解细菌，再以9600rpm，于4℃离心15min，取上清，过Glutathione-Sepharose 4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1(含20mM谷胱甘肽、50mM TrisCl，pH＝8.0)洗脱，收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2(含100mM谷胱甘肽)洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定纯化产物【图5】。
4、兔抗BACE1190-214aa和BACE1146-189a抗血清的制备
以纯化的GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500μg纯化的GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶100000时，颈动脉放血，收集血清。
5、ProteinA/G纯化抗BACE1190-214aa和BACE1146-189a血清
将ProteinA/G sepharose CL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的收集管混合，用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定。染色结果显示纯化效果明显，纯化后的样品有清晰的轻、重链带。
实施例2:GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a抗体的分析及应用
1、GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a抗体效价的测定
用GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，将纯化后的GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a抗体先稀释10倍再倍比稀释后，用间接ELISA测定抗体的效价。结果显示，免疫前的兔血清未测出抗融合蛋白GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a的抗体，GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a抗体的滴度高达1∶100000以上【图6】。
2、GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a抗体应用于细胞中BACE1剪切型蛋白的检测
以可溶性GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a两段融合蛋白作免疫原而制备的兔抗鼠GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a两种高效价血清进行Westernblot,结果发现在30KD处出现特异性的蛋白条带,结果提示抗GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189a两种血清高特异性【图7】。
收集培养的前列腺HK293T，过表达BACE1剪切型55KD、52KD、49KD和47KD的突变质粒，裂解超声后用BCA蛋白定量试剂盒对其进行蛋白定量，之后将样品等蛋白量进行SDS-PAGE，再电转移至硝酸纤维素膜上。以5％脱脂奶粉封闭1h，依次滴加兔抗BACE1抗体(室温2h、PBS洗3次)及山羊抗兔IgG2HRP(室温反应1h、PBS洗涤3次)，最后加底物DAB显色，并拍照【图8】。结果显示，我们制备的BACE1190-214aa和BACE1146-189a抗体与293T细胞株中所表达的BACE1剪切型蛋白都发生了抗原-抗体反应，在Marker指示下的，我们的抗体1可以特异性识别BACE1—49KD，抗体2可以特异性识别BACE1—52KD。
190--214AA(75bp)
146--189AA(132bp)
190--214AA(75bp)
氨基酸序列：
146--189AA(132bp)
氨基酸序列：
Claims (5)
1.发明保护两种抗体共同用于BACE1四种剪切型55KD、52KD、49KD和47KD的区分，以及这两种抗体用于BACE1剪切型中52KD和49KD的鉴定；
用于区分BACE1四种剪切型55KD、52KD、49KD和47KD的2个抗体片段分别为：BACE1146-189aa(insert1)，BACE1190—214aa(insert2)；
注：表中“√”表示包含该片段且能被该抗体识别，“×”表示不包含该片段且不能被该抗体识别；
抗体BACE1146-189aa可用于识别BACE1剪切型55KD和52KD，抗体BACE1190—214aa可用于识别BACE1剪切型55KD和49KD；
BACE1剪切型55KD可同时被抗体BACE1146-189aa和抗体BACE1190—214aa识别；BACE1剪切型52KD只可被抗体BACE1146-189aa识别；BACE1剪切型49KD只可被抗体BACE1190—214aa识别；BACE1剪切型47KD既不能被抗体BACE1146-189aa识别，又不能被抗体BACE1190—214aa识别；
因此这两种抗体可以用于四种剪切型55KD、52KD、49KD和47KD的区分。
2.发明保护用于识别BACE1剪切型55KD、52KD抗体BACE1146-189aa(insert1)的氨基酸序列和对应的核苷酸序列；
其特征是利用GST表达体系以BACE1蛋白N端第146至189个氨基酸作为特异序列制备的GST-BACE1146-189aa融合蛋白。
146--189氨基酸序列：
146--189AA(132bp)碱基序列：
3.发明保护用于识别BACE1剪切型55KD、49KD抗体BACE1190—214aa(insert2)的氨基酸序列和对应的核苷酸序列；
其特征是利用GST表达体系以BACE1蛋白N端第190至214个氨基酸作为特异序列制备的GST-BACE1190—214aa融合蛋白。
190--214AA氨基酸序列：
190--214AA(75bp)碱基序列：
4.发明保护这种抗体制备方法；
如权利要求2、3所述的原核表达GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于利用GST表达系统获得GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-BACE1190-214aa和GST-BACE1146-189aa抗血清。
5.发明保护根据权利1、2、3、4所述的两种抗体在阿尔兹海默症等疾病中BACE1剪切的鉴别、检测、治疗及应用。
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