CN103333244B - 利用GST 表达体系制备的hZimp10-N 端高效价抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及利用GST表达体系制备的hZimp10-N端高效价抗体及应用。利用基因工程技术，将hZimp10基因N端克隆到原核表达载体中，经酶切鉴定后,用重组质粒转化大肠杆菌，并IPTG诱导产生GST-hZimp10融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western？blot检测。该抗hZimp10多克隆抗体效价与特异性良好,可以应用于细胞中hZimp10蛋白的检测并能有效检出hZimp10蛋白在不同细胞中的差异表达，对于系统研究hZimp10蛋白功能及其在肿瘤细胞凋亡中的作用机制意义重大。

Description

利用GST 表达体系制备的hZimp10-N 端高效价抗体及应用

技术领域

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域,具体涉及利用GST原核表达体系制备GST-hZimp10融合蛋白的多克隆抗体及应用。 

背景技术

hZimp10蛋白（定义为人类10号染色体上包含锌指结构的Miz1的PIAS类似蛋白）有选择性的表达在人类的卵巢、睾丸和前列腺组织中。作为一种新的PIAS类似蛋白，hZimp10已经被证明对一些重要的蛋白的转录活性具有重要的调节作用。例如：AR、Smad3/Smad4复合物和P53等等。 

随着研究的深入我们对于hZimp10蛋白功能及作用机制产生了更多的思考，如它是否与生殖系统的发育及功能密切相关，它是否对肿瘤起抑制作用，它是否能够促进癌细胞凋亡等等。而研究一种新的蛋白质的功能,抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测和功能研究中广泛应用的免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗原-抗体相互作用发展起来的。因此我们制备的hZimp10蛋白高效价抗体对于系统研究hZimp10在肿瘤细胞增殖和凋亡中的作用机制意义重大。 

发明内容

本发明的目的是建立一种能够用于hZimp10蛋白的检测的模型，为从蛋白水平深入研究hZimp10蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。 

利用基因工程技术，将hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-hZimp10融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得多克隆抗体。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测。 

本发明的GST-hZimp10融合蛋白是将利用特殊序列(hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段)构建GST-hZimp10融合蛋白原核表达载体,转化BL21得到的高效表达特异性的GST-hZimp10融合蛋白，这段N端128个氨基酸序列为： 

Met Asn Ser Met Asp Arg His Ile Gln Gln Thr Asn Asp Arg Leu Gln Cys Ile Lys Gln 

1                5                  10                   15                 20 

His Leu Gln Asn Pro Ala Asn Phe His Asn Ala Ala Thr Glu Leu Leu Asp Trp Cys Gly 

                25                  30                   35                 40 

Asp Pro Arg Ala Phe Gln Arg Pro Phe Glu Gln Ser Leu Met Gly Cys Leu Thr Val Val 

                45                  50                   55                 60 

Ser Arg Val Ala Ala Gln Gln Gly Phe Asp Leu Asp Leu Gly Tyr Arg Leu Leu Ala Val 

                65                  70                   75                 80 

Cys Ala Ala Asn Arg Asp Lys Phe Thr Pro Lys Ser Ala Ala Leu Leu Ser Ser Trp Cys 

                85                  90                   95                 100 

Glu Glu Leu Gly Arg Leu Leu Leu Leu Arg His Gln Lys Ser Arg Gln Ser Asp Pro Pro 

                105                  110                 115                120 

Gly Lys Leu Pro Met Gln Pro Pro 

                125 

其对应核苷酸序列为： 

1    atgaattcta tggacaggca catccagcag accaatgacc gactgcagtg catcaagcag 

61   cacttacaga atcctgccaa cttccacaat gccgccacgg agctgctgga ctggtgcgga 

121  gacccacggg ccttccagcg gcccttcgag cagagcctga tgggctgttt gacggtggtc 

181  agtcgggtgg cagcccagca aggctttgac ctggacctcg gctacagact gctggctgtg 

241  tgtgctgcaa accgagacaa gttcaccccg aagtctgccg ccttgttgtc ctcctggtgc 

301  gaagagctcg gccgcctgct gctgctccga catcagaaga gccgccagag cgatccccct 

361  gggaaactcc ccatgcagcc ccct 

这种GST-hZimp10融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤：第一步，克隆载体的构建 

从人hZimp10基因全长上应用PCR技术以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,扩增得到的目的片段与PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后,酶切鉴定并测序。第二步，原核表达载体pG`EX-4T-1的构建 

将克隆质粒和质粒pGEX-4T-1双酶切后,利用回收试剂盒获得hZimp10基因该区片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体,并且测序进一步确定。 

第三步，GST-hZimp10融合蛋白的诱导表达和纯化 

重组质粒PGEX-4T-1/hZimp10转化大肠杆菌BL21,利用IPTG诱导,GST-hZimp10融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定,，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose4B柱纯化,SDS-PAGE鉴定纯化产物。 

第四步，兔抗hZimp10抗血清的制备及纯化 

以纯化的hZimp10融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500μg融合蛋白,与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清,作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫,500μg纯化的GST-hZimp10融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀,前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血,用ELISA法测定抗体的效价,当抗体效价达到1∶100000时,颈动脉放血,收集血清。用ProteinA/G纯化抗hZimp10血清，准备蛋白A sepharose CL-4B亲和柱，亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，将抗体洗脱，达到纯化目的，SDS-PAGE鉴定纯化产物，获得该发明的多克隆抗体。应用多种免疫学方法检测其效价及特异性，结果显示该抗体可特异性的与hZimp10蛋白结合。。 

利用hZimp10蛋白N端128个氨基酸基因序列成功地构建GST-hZimp10融合蛋白原核表达载体,转化BL21后可高效表达特异性的GST-hZimp10融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST-hZimp10融合蛋白的高效价抗体经多种免疫学方法检测抗体效价及特异性，结果表明抗体效价高达1:100000且特异性良好。抗体可应用于细胞中hZimp10蛋白的检测并能有效检出hZimp10蛋白在不同细胞株中的差异表达，对于进一步探究hZimp10蛋白在癌细胞中的表达强度与肿瘤恶性程度的相关性上很有帮助，对于系统研究hZimp10蛋白功能及其在肿瘤细胞增殖和凋亡中的作用机制意义重大。另外，hZimp10蛋白表达有不同的剪切体（isoform），包括全长和N-128缺失型等，我们制备的hZimp10-N-128aa抗体为检测不同疾病条件下不同hZimp10isoform表达并以此判定hZimp10蛋白表达与疾病的关系奠定了基础。为应用该抗体建立一种肿瘤恶性程度的检测模型提供了条件。 

附图说明：

图1为PCR扩增出的hZimp10基因N-128片段DNA琼脂糖凝胶电泳图； 

图2为双酶切质粒pGEX-4T-1和重组T载体琼脂糖凝胶电泳图； 

图3为pGEX-4T-1/hZimp10重组体酶切鉴定结果； 

图4为纯化后的GST及GST-hZimp10融合蛋白SDS-PAGE图； 

图5为ProteinA/G纯化后的hZimp10抗体和纯化前的抗hZimp10血清SDS-PAGE图； 

图6为间接ELISA法测定抗体的效价； 

图7为抗血清特异性的Western blot分析。 

具体实施方式：

实施例1:抗GST-hZimp10血清的在制备 

1.PCR-PMD18-T/hZimp10重组质粒的构建 

hZimp10基因全长从Genebank得到,基因序列号为AY235683。以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,上游引物为5’-GGATCC ATGAAT TCTATG GACAGG(含BamHI，EcoRI酶切位点)；下游引物为5’-CTCGAG AGGGGG CTGCAT GGGGAG(含XhoI酶切位点)。应用PCR成功扩增出了hZimp10基因N端128个氨基酸对应DNA序列长度384bp【图1】。扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中,在含Amp+琼脂平板上挑选克隆,以碱裂解法小提重组质粒后,以BamH I和Xhol I双酶切鉴定。 

2.原核表达载体pGEX-4T-1的构建 

将含有hZimp10基因N-128片段的pMD18-T质粒经BamH I和Xho1双酶切后（片段约0.4kbp),利用回收试剂盒获得hZimp10基因该区片段,同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1(约4.9kbp)【图2】。然后将回收的hZimp10基因N-128片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。酶切鉴定重组体,结果显示该hZimp10基因N-128片段正确【图3】。 

3.GST-hZimp10融合蛋白的诱导表达和纯化 

重组质粒PGEX-4T-1/hZimp10转化大肠杆菌BL21,挑取单菌落接入LB/Ampr培养基中,37℃振摇培养过夜。次日,将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中,继续在37℃摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0.5～0.6时,加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L,不加入IPTG者为阴性对照,置25℃继续培养4～5h。离心收集菌体,以SDS-PAGE进行鉴定GST-hZimp10融合蛋白的表达,并优化表达条件,进行大量扩增诱导。以5000r/min于4℃离心5min,收集菌体,用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀。用超声裂解细菌,再以9600rpm,于4℃离心15min,取上清,过Glutathione-Sepharose4B柱,先以等体积洗脱缓冲液1(含20mM谷胱甘肽、50mM Triscl,pH=8.0)洗脱,收集洗脱液,再以等体积洗脱缓冲液2(含100mM谷胱甘肽)洗两遍,收集洗脱液,SDS-PAGE鉴定纯化产物【图4】。 

4.兔抗hZimp10抗血清的制备 

以纯化的GST-hZimp10融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500μg融合蛋白,与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清, 作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫,500μg纯化的GST-hZimp10融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀,前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血,用ELISA法测定抗体的效价,当抗体效价达到1∶100000时,颈动脉放血,收集血清。 

5.ProteinA/G纯化抗hZimp10血清 

将ProteinA/G sepharose CL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定。染色结果显示纯化效果明显，纯化后的样品有清晰的轻、重链带【图5】。 

实施例2:GST-hZimp10抗体的分析及应用 

1.GST-hZimp10抗体效价的测定 

用GST-hZimp10融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照,将纯化后的GST-hZimp10抗体先稀释10倍再倍比稀释后,用间接ELISA测定抗体的效价。结果显示,免疫前的兔血清未测出抗融合蛋白GST-hZimp10的抗体,GST-hZimp10抗体的滴度高达1∶100000以上【图6】。 

2.GST-hZimp10抗体应用于细胞中hZimp10蛋白的检测 

收集培养的前列腺癌细胞LNCaP和PC3，裂解超声后用BCA蛋白定量试剂盒对其进行蛋白定量，之后将样品等蛋白量进行SDS-PAGE，再电转移至硝酸纤维素膜上。以5%脱脂奶粉封闭1h,依次滴加兔抗hZimp10抗体(室温2h、PBS洗3次)及山羊抗兔IgG2HRP(室温反应1h、PBS洗涤3次),最后加底物DAB显色,并拍照。结果显示【图7】，我们制备的hZimp10抗体与LNCaP和PC3细胞株中所表达的hZimp10蛋白都发生了抗原-抗体反应，在Marker指示的123KD处出现了一条特异的蛋白带，并且在不同的细胞株中特异蛋白带的表达强度有所不同，LNCaP细胞的特异蛋白带强度高，证明LNCaP细胞高表达hZimp10。 

Claims (2)

1.利用GST表达体系制备的hZimp10-N端高效价抗体,其特征在于利用GST表达体系以hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段作为特异序列制备的GST-hZimp10融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-hZimp10抗体的滴度高达1∶100 000，并经过Western blot鉴定该抗GST-hZimp10血清具有较好的特异性，其中，N端128个氨基酸序列为：

Met Asn Ser Met Asp Arg His Ile Gln Gln Thr Asn Asp Arg Leu Gln Cys Ile Lys Gln

1                5                  10                  15                  20

His Leu Gln Asn Pro Ala Asn Phe His Asn Ala Ala Thr Glu Leu Leu Asp Trp Cys Gly

                25                  30                   35                40

Asp Pro Arg Ala Phe Gln Arg Pro Phe Glu Gln Ser Leu Met Gly Cys Leu Thr Val Val

                45                  50                  55                  60

Ser Arg Val Ala Ala Gln Gln Gly Phe Asp Leu Asp Leu Gly Tyr Arg Leu Leu Ala Val

                65                  70                  75                  80

Cys Ala Ala Asn Arg Asp Lys Phe Thr Pro Lys Ser Ala Ala Leu Leu Ser Ser Trp Cys

                85                  90                   95                  100

Glu Glu Leu Gly Arg Leu Leu Leu Leu Arg His Gln Lys Ser Arg Gln Ser Asp Pro Pro

                105                 110                 115                 120

Gly Lys Leu Pro Met Gln Pro Pro

                125

其对应核苷酸序列为：

1   atgaattcta tggacaggca catccagcag accaatgacc gactgcagtg catcaagcag

61  cacttacaga atcctgccaa cttccacaat gccgccacgg agctgctgga ctggtgcgga

121 gacccacggg ccttccagcg gcccttcgag cagagcctga tgggctgttt gacggtggtc

181 agtcgggtgg cagcccagca aggctttgac ctggacctcg gctacagact gctggctgtg

241 tgtgctgcaa accgagacaa gttcaccccg aagtctgccg ccttgttgtc ctcctggtgc

301 gaagagctcg gccgcctgct gctgctccga catcagaaga gccgccagag cgatccccct

361 gggaaactcc ccatgcagcc ccct 。

2.如权利要求1所述的原核表达GST-hZimp10融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于利用GST表达系统获得GST-hZimp10融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-hZimp10抗血清，具体包括五步：

第一步，PCR-PMD18-T/hZimp10重组质粒的构建，hZimp10基因N-128片段从Genebank得到,基因序列号为AY235683，以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,上游引物为5’-GGATCC ATGAAT TCTATG GACAGG，包含BamHI和EcoRI酶切位点；下游引物为5’-CTAGAG AGGGGG CTGCAT GGGGAG，包含XhoI酶切位点，扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中,在含Amp+琼脂平板上挑选克隆,以碱裂解法小提重组质粒后,以EcoR I和BamHI，Xhol I单双酶切鉴定；

第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建，将含有hZimp10基因N-128片段的pMD18-T质粒经BamHI和Xho1双酶切后,利用回收试剂盒获得hZimp10基因N-128片段,同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1，然后将回收的hZimp10基因N-128片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，酶切鉴定重组体,并且测序进一步确定；

第三步，GST-hZimp10融合蛋白的诱导表达和纯化，重组质粒PGEX-4T-1/hZimp10转化大肠杆菌BL21,挑取单菌落接入LB/Ampr培养基中,37℃振摇培养过夜，次日,将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中,继续在37℃摇床培养至对数生长中期，在培养液的A600为0.5～0.6时,加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L,不加入IPTG者为阴性对照,置25℃继续培养4～5h，离心收集菌体,以SDS-PAGE进行鉴定GST-hZimp10融合蛋白的表达,并优化表达条件,进行大量扩增诱导，以5000r/min于4℃离心5min,收集菌体,用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀，用超声裂解细菌,再以9600rpm,于4℃离心15min,取上清,过Glutathione-Sepharose4B柱,先以等体积洗脱缓冲液1，含20mM谷胱甘肽、50mM Triscl,pH＝8.0，洗脱,收集洗脱液,再以等体积洗脱缓冲液2，含100mM谷胱甘肽，洗两遍,收集洗脱液,SDS-PAGE鉴定纯化产物；

第四步，兔抗hZimp10抗血清的制备及纯化

以纯化的hZimp10融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500μg融合蛋白,与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射，免疫前取耳静脉血分离血清,作为免疫前的血清对照，2wk后进行第1次加强免疫,500μg纯化的GST-hZimp10融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀,前后四脚掌肌肉注射，之后每隔2wk加强免疫1次，于末次免疫后1wk取耳血,用ELISA法测定抗体的效价,当抗体效价达到1∶100 000时,颈动脉放血,收集血清，将ProteinA/G sepharose CL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定；

第五步，hZimp10抗体的免疫学检测

用GST-hZimp10融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照,将纯化后的GST-hZimp10抗体先稀释10倍再倍比稀释后,采用间接ELISA方法测定抗体的效价，并采用Western blot方法分析抗hZimp10血清特异性，将纯化的融合蛋白GST-hZimp10样品,经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上，以5％脱脂奶粉封闭1h,依次滴加兔抗鼠hZimp10抗血清，室温2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室温反应1h、PBS洗涤3次,最后加底物DAB显色,并拍照。