CN101830983A - 特异序列基础的水通道蛋白4高效价抗体的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及特异序列基础的水通道蛋白4高效价抗体的制备及应用，利用基因工程技术，将小鼠AQP4基因近3′端亲水区克隆到原核表达载体中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导产生GST-AQP4融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清。抗血清的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测。构建融合蛋白原核表达载体，可高效表达特异性的融合蛋白，获得抗GST-AQP4融合蛋白的高效价抗血清。该抗AQP4多克隆抗体效价与特异性均较良好，适合对AQP4的检测应用。为从蛋白水平深入研究AQP4功能提供了必要的实验工具。

Description

特异序列基础的水通道蛋白4高效价抗体的制备及应用

技术领域

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异序列基础的原核表达GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗体及应用。

背景技术

水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一类广泛存在于原核和真核生物细胞膜上，选择性高效转运水分子的特异孔道，目前在哺乳类已发现至少12个成员。研究表明，AQP家族在多种组织的液体转运生理和病理中发挥重要作用。水通道AQP4在脑的星形细胞、眼睛、耳朵、骨骼肌、胃腔壁细胞以及肾的集合管等处高表达，并在渗透压驱动的跨内皮水转运中发挥重要作用。

自2003年美国两位科学家因在膜通道研究领域的一些开创性工作而获当年的诺贝尔化学奖以来，水通道蛋白结构与功能的研究已成为热点。对于一种新蛋白质说来，抗体是研究其功能最有力的工具之一。在抗原-抗体相互作用基础上发展起来的一系列技术，如免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等，在蛋白质的检测和功能研究中都有着广泛的应用。

水通道蛋白4作为一种跨膜的蛋白分子，其中的疏水片段是无法进行原核表达的，而膜外小的亲水区域无抗原性或抗原性较小。现世面出售的AQP4抗体是以人工合成短肽链作为抗原制备而成，其抗原蛋白的空间结构较AQP4蛋白的空间结构有很大差异。

发明内容

本发明的目的是建立一种能够用于AQP4的检测的模型，为从蛋白水平深入研究AQP4功能及相关疾病提供必要的实验工具。

利用基因工程技术，将小鼠AQP4基因近3′端亲水区克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-AQP4融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清。抗血清的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测。

本发明的GST-AQP4融合蛋白是将利用特殊序列(小鼠AQP4基因近3′端亲水区)构建GST-AQP4融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特异性的GST-AQP4融合蛋白，这段近3′端亲水区基因核苷酸序列为：

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所表达蛋白的氨基酸序列为：

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这种GST-AQP4融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤：

第一步，克隆载体的构建

从小鼠AQP4基因全长上应用PCR技术以p8p64为模板，扩增得到的目的片段与PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。

第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建

将克隆质粒和质粒pGEX-4T-1双酶切后，利用回收试剂盒获得AQP4基因该区片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。

第三步，GST-AQP4融合蛋白的诱导表达和纯化

重组质粒PGEX-4T-1/AQP1转化大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，GST-AQP4融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose 4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。

第四步，兔抗AQP4抗血清的制备，即获得该发明的多克隆抗体

以纯化的AQP4融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500μg纯化的GST-AQP4融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶100 000时，颈动脉放血，收集血清，应用多种免疫学方法检测其效价及特异性。

我们应用该进行免疫组化鉴定，即取野生型小鼠脑，以AQP4敲除鼠脑做对照，做免疫组化。将组织剪碎加适量RIPA裂解液[0.1％SDS，150Mm NaCl，10Mm Tris，(pH7.4)，1％Triton X-100，1％ sodium deoxycholate，1mM PMSF]，充分研磨后，离心收集上清。取等量的细胞总蛋白进行12％SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜。5％脱脂奶粉封闭1h；与自制的I级抗体室温反应1h，PBS洗3次；再与HRP标记的羊抗兔II级抗体(JacksonImmunoresearch Laboratories)室温反应1h，PBS洗3次，用ECL光化学试剂盒(AmershamPhamacia)检测信号，X光片曝光显影。结果显示该兔抗GST-AQP4血清可特异性的与AQP4蛋白结合，成功对AQP4进行了检测【图7】。

利用选取的3′端亲水区基因序列成功地构建GST-AQP4融合蛋白原核表达载体，转化BL21后可高效表达特异性的GST-AQP4融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST-AQP4融合蛋白的高效价抗血清且特异性良好，克服了现存的以人工合成肽制备的抗体时，其抗原空间结构与表达蛋白差异大的缺点，所得到的抗体的效价和特异性都有大幅提升。可应用于对AQP4的检测，推进从蛋白水平AQP4功能的深入研究。

附图说明：

图1为PCR扩增出的AQP4基因近3′端亲水区DNA琼脂糖凝胶电泳图；

图2为双酶切质粒pGEX-4T-1琼脂糖凝胶电泳图；

图3为pGEX-4T-1/AQP4重组体测序结果；

图4为纯化后的GST及GST-AQP4融合蛋白SDS-PAGE图，其中1、2.GST(26KD)；3、

4.GST-AQP4(30KD)；

图5为间接ELISA法测定抗体的效价；

图6为抗血清特异性的Western blot分析，其中1，2，4.野生型CD1小鼠脑组织；3.buffer对照；

图7为抗GST-AQP4血清免疫组化鉴定结果，其中左侧为野生鼠的脑组织，右侧为敲除鼠的脑组织。

具体实施方式：

实施例1：抗GST-AQP4血清的在制备

1.PCR-PMD18-T/AQP4重组质粒的构建

小鼠AQP4基因全长从Genebank得到，基因序列号为NM009700。以p8p64为模板，上游引物为5’-GAATTCGACAACCGGAGCCAAGTG(含EcoR1酶切位点)；下游引物为5’-CTCGAGTACGGAAGACAATACCTC(含XhoI酶切位点)。应用PCR成功扩增出了AQP4基因近3′端亲水区DNA序列，长度102bp，编码34个氨基酸【图1】。扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoR I和Xhol I双酶切鉴定。

2.原核表达载体pGEX-4T-1的构建

将含有AQP4基因近3′端亲水区片段的pMD18-T质粒经EcoR I和Xhol双酶切后，利用回收试剂盒获得AQP4基因该区片段，同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1【图2】。然后将回收的AQP4基因近3′端亲水区片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4 DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定【图3】，结果显示该AQP4片段正确。

3.GST-AQP4融合蛋白的诱导表达和纯化

重组质粒PGEX-4T-1/AQP1转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr培养基中，37℃振摇培养过夜。次日，将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继续在37℃摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25℃继续培养4～5h。离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-AQP4融合蛋白的表达，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。以5000r/min于4℃离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀。用超声裂解细菌，再以9600rpm，于4℃离心15min，取上清，过Glutathione-Sepharose 4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1(含20mM谷胱甘肽、50mMTriscl，pH＝8.0)洗脱，收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2(含100mM谷胱甘肽)洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定纯化产物【图4】。

1、兔抗AQP4抗血清的制备及分析

i.抗血清的制备

以纯化的AQP4融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500μg纯化的GST-AQP4融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶100 000时，颈动脉放血，收集血清。

ii.抗血清效价的测定

用GST-AQP4融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，取末次加强免疫后第7天的血清。血清先稀释10倍再倍比稀释后，用间接ELISA测定抗体的效价。结果显示，免疫前的兔血清未测出抗融合蛋白GST-AQP4的抗体，末次免疫后抗血清中抗GST-AQP4抗体的滴度高达1∶50 000以上【图5】。

iii 抗血清特异性的Western blot分析

以可溶性GST-AQP4融合蛋白作为免疫原制备的兔抗GST-AQP4血清进行Western blot，将纯化的融合蛋白GST2LZP3样品，经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上。以5％脱脂奶粉封闭1h，依次滴加兔抗鼠LZP3抗血清(室温2h、PBS洗3次)及山羊抗兔IgG2HRP(室温反应1h、PBS洗涤3次)，最后加底物DAB显色，并拍照。在Mr×103为30处出现1条特异的蛋白带，说明抗GST-AQP4血清具有较好的特异性【图6】。

实施例2：抗GST-AQP4血清的应用

应用该进行免疫组化鉴定，即取野生型小鼠脑，以AQP4敲除鼠脑做对照，做免疫组化。将组织剪碎加适量RIPA裂解液[0.1％ SDS，150Mm NaCl，10Mm Tris，(pH7.4)，1％Triton X-100，1％ sodium deoxycholate，1mM PMSF]，充分研磨后，离心收集上清。取等量的细胞总蛋白进行12％SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜。5％脱脂奶粉封闭1h；与自制的I级抗体室温反应1h，PBS洗3次；再与HRP标记的羊抗兔II级抗体(JacksonImmunoresearch Laboratories)室温反应1h，PBS洗3次，用ECL光化学试剂盒(AmershamPhamacia)检测信号，X光片曝光显影，结果显示该兔抗GST-AQP4血清可特异性的与AQP4蛋白结合，成功对AQP4进行了检测【图7】。

图1

图2

Claims (3)

1.特异序列基础的原核表达GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗体，其特征在于利用特异序列原核表达的GST-AQP4融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-AQP4抗体的滴度高达1∶50000，并经过Western blot和免疫组化鉴定抗GST-AQP4血清具有较好的特异性，其中，所述的特异序列是指AQP4基因近3′端亲水区的一段序列，其氨基酸序列为：

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核苷酸序列为：

781                                 tgtcctgatg tggagctcaa acgtcgcctt

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2.如权利要求1所述的原核表达GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于利用GST表达系统获得GST-AQP4融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-AQP4抗血清，具体包括四步：

第一步，PCR-PMD18-T/AQP4重组质粒的构建，小鼠AQP4基因全长从Genebank得到，基因序列号为NM009700，以p8p64为模板，上游引物为5’-GAATTCGACAACCGGAGCCAAGTG，含EcoR1酶切位点；下游引物为5’-CTCGAGTACGGAAGACAATACCTC，含XhoI酶切位点，扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoR I和Xhol I双酶切鉴定并测序；

第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建，将含有AQP4基因近3′端亲水区片段的pMD18-T质粒经EcoR I和Xho1双酶切后，利用回收试剂盒获得AQP4基因该区片段，同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1，然后将回收的AQP4基因近3′端亲水区片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4 DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定；

第三步，GST-AQP4融合蛋白的诱导表达和纯化，重组质粒PGEX-4T-1/AQP1转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr培养基中，37℃振摇培养过夜，次日，将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继续在37℃摇床培养至对数生长中期，在培养液的A600为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25℃继续培养4～5h，离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-AQP4融合蛋白的表达，并优化表达条件，进行大量扩增诱导，以5000r/min于4℃离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀，用超声裂解细菌，再以9600rpm，于4℃离心15min，取上清，过Glutathione-Sepharose 4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1，含20mM谷胱甘肽、50mM Triscl，pH＝8.0，洗脱，收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2，含100mM谷胱甘肽，洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定纯化产物；

第四步，兔抗AQP4抗血清的制备及免疫学检测，以纯化的AQP4融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射，免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照，2wk后进行第1次加强免疫，500μg纯化的GST-AQP4融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射，之后每隔2wk加强免疫1次，于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶100000时，颈动脉放血，收集血清，采用间接ELISA方法测定血清抗体的效价，并采用Western blot方法分析抗AQP4血清特异性，将纯化的融合蛋白GST2LZP3样品，经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上，以5％脱脂奶粉封闭1h，依次滴加兔抗鼠LZP3抗血清，室温2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室温反应1h、PBS洗涤3次，最后加底物DAB显色，并拍照。

3.如权利要求1所述的GST-AQP4融合蛋白的原核表达的多克隆抗体在检测水通道蛋白4(AQP4)和深入研究水通道蛋白4(AQP4)功能中的应用。

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