CN115894659B - 微管相关蛋白Tau抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微管相关蛋白Tau抗原及其制备方法和应用，其内部包扩四种优势线性表位多肽，其序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。将以上含有Tau蛋白线性表位多肽的序列通过柔性链氨基酸串联得到所述微管相关蛋白Tau抗原的氨基酸序列，如SEQ ID NO.5所示。本发明所述的重组Tau蛋白抗原是通过原核细胞Ecoli表达并纯化，表达的蛋白抗原纯度高。本发明提供的可溶性Tau蛋白抗原具有良好的免疫原性，用重组Tau蛋白抗原免疫动物能够产生特异性的多抗，并且可以识别的六种不同Tau蛋白亚型。故该抗原可作为一种高效的免疫原用于免疫和抗体制备和生产，从而用于对Tau蛋白的科研检测和认知功能障碍这类疾病标志物Tau的诊断。

Description

微管相关蛋白Tau抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种微管相关蛋白Tau抗原及其制备方法和应用。

背景技术

Tau蛋白和β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)是阿兹海默症(Alzheimer'sdisease，AD)的特征性病变，是决定神经退行性病变发生和发展的两种重要因素。Tau蛋白由位于17q21.31染色体的微管相关蛋白Tau(microtubule-associated protein Tau，MAPT)单基因编码产生。Tau蛋白有多种功能。正常情况下，其最重要的功能是聚合微管，包括连接、稳定和促进微管组装，其他还包括在轴突、树突中运输营养物质及调控神经细胞的生长发育等。大量微管位于神经轴突，少部分位于树突和神经元。

异常的翻译后修饰致使Tau蛋白成为无功能的实体，其中研究最多的是Tau蛋白的磷酸化。目前公认，Tau蛋白增多和修饰形成的Tau病变是神经毒性的来源。通常情况下，Tau病变有3个主要特点：Tau蛋白水平增高；涉及一种异常翻译后修饰，如过度磷酸化，有时和其他翻译后修饰(如截断或乙酰化)相关；异常Tau蛋白聚集。而一旦Tau蛋白出现沉积，则伴随神经功能失调的发生。Tau蛋白的水平和轻度认知功能障碍密切相关。

AD患者中的特征性脑脊液生物标记物变化为Aβ42下降，同时总Tau蛋白(totalTau，T-Tau)和磷酸化Tau蛋白(phosphorylated Tau，p-Tau)上升，这些标记物已经被确认可用于诊断痴呆、轻度认知功能损害。

在人类中，编码Tau蛋白的基因MAPT通过选择性mRNA剪接产生六种亚型(352-441个氨基酸)。根据人tau蛋白外显子2、3和10的剪切，分成6种不同的亚型，分别为tau352(0N3R)、tau381(1N3R)、tau383(0N4R)、tau410(2N3R)、tau412(1N4R)和tau441(2N4R)，其中外显子2和3编码两段29个氨基酸的N端插入序列(0N，1N，2N)外显子10会导致产生具有3个或4个C末端重复的三个同种型(3R或者4R)，通过不同的剪切模式，形成6种不同的剪切后亚型。以Tau(2N4R)最长亚型蛋白为例展示其结构区域，主要包括N末端投射功能区(aa1-151)，2N插入序列位于此段，中间脯氨酸富集区(aa152-244)、微管结合区(Microtubule-binding domain，MBD，aa245-368)，包含四个C末端重复序列4R和C末端功能区(C端，aa369-441)。

根据Meredith、Barthe′lemy、Sato、Cicognola、Chen在2013-1019年间的研究报道发现在人脑脊液或血浆中Tau蛋白因受蛋白酶切割作用，大量以N末端(aa1-151)和中间区域Tau剪切片段(aa152-244)存在，而C末端片段含量极低。因此如何设计并合成的免疫原，从而可以囊括同时识别血浆及脑脊液中不同Tau蛋白亚型的切割体形式抗体的表位，成为检测人组织或体液中总tau蛋白(t-Tau)的关键环节。脑脊液T-tau水平测定对区分AD和正常对照(T-tau：95％ CI为2.44～2.64，P＜0.0001)以及稳定型和进展型轻度认知障碍(mild cognitive impairment，MCI)都具有诊断性价值以及AD预测价值。

目前诊断和科研过程中均需要针对Tau蛋白建议快速的特异性检测方法。常规的Tau蛋白检测方法通常是免疫检测，即使用针对Tau抗体检测其水平，所以，合适的Tau抗原决定簇多肽表位的预测及发现也成为了研究重点。目前市面上尚未有针对Tau蛋白表位串联抗原的确切报道，随着医学检验领域的发展，诊断上需要一种兼具高特异性和抗原性的可溶性Tau蛋白抗原决定簇表位串联抗原，以适用于高特异性抗体的制备与生产。

因此，设计并得到一种可溶性Tau蛋白抗原，其产生的抗体识别tau蛋白全部的六种亚型蛋白具有良好的应用前景和现实意义。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述技术问题，本发明提供一种多表位串联的特异性Tau蛋白抗原及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，第一方面，本发明提供了一种微管相关蛋白Tau的4个优势线性表位多肽，所述优势线性表位多肽(1)、(2)、(3)、(4)的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

所述优势线性表位多肽(1)、(2)、(3)、(4)分别为Tau(2N4R)6-24、111-130、152-170和185-204，即Tau(2N4R)的6-24位于第6个氨基酸到第24个氨基酸，111-130位于第111个氨基酸到第130个氨基酸，152-170位于第152个氨基酸到第170个氨基酸，185-204位于第185个氨基酸到第204个氨基酸。

第二方面，本发明提供了一种微管相关蛋白Tau抗原，其氨基酸序列如Seq IDNO.5所示。

进一步的，所述微管相关蛋白Tau抗原是通过所述的优势线性表位多肽(1)、(2)、(3)、(4)依次通过柔性多肽链(linker)串联得到，所述柔性多肽链的氨基酸序列为GGGGS。

进一步，所述微管相关蛋白Tau抗原的编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.6所示。

第三方面，本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体由表达载体和如Seq ID No.6所示的微管相关蛋白Tau抗原的编码基因重组而成。

进一步的，所述表达载体为PET28a质粒。

第四方面，本发明还提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌是向宿主菌中转化如上所述的重组表达载体而成。

进一步的，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

第五方面，本发明还提供一种微管相关蛋白Tau抗原的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将Seq ID NO.6所示的Tau抗原的编码基因克隆到表达载体中，得到重组表达载体；

(2)将步骤(1)得到的重组表达载体转入宿主菌，得到重组工程菌；

(3)利用重组工程菌诱导表达Tau蛋白抗原；

(4)提取纯化步骤(3)的表达蛋白，制得重组Tau蛋白抗原。

进一步，所述步骤(1)的具体步骤优选为：将Seq ID NO.6所示的Tau抗原的编码基因构建到表达质粒PET28a的多克隆位点NcoI和XhoI之间，得到重组表达载体，命名为PET28a-Tau。

进一步，所述步骤(2)的具体步骤优选为：

(2-1)BL21(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入100ng PET28a-Tau质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置25分钟；

(2-2)42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟；

(2-3)向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟；

(2-4)5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并接种到50mL含10ug/mL卡那霉素的LB培养基里，37℃，150rpm过夜培养。

进一步，所述步骤(3)的具体步骤优选为：

按2％的接种量，取4mL步骤(2)的种子液转接至200ml含10ug/mL卡那霉素的LB培养基的摇瓶中，37℃，150rpm恒温摇床振荡2h，加IPTG，使其终浓度为1mmol/L，然后20℃高效诱导表达14h。

进一步，所述步骤(4)的具体步骤优选为：

将步骤(3)中的高效表达的重组工程菌发酵液，12000rpm，4℃离心10min，将沉淀的菌体重悬于50mL 0.2M、PH7.4的PBS缓冲液中，洗涤1次，然后12000rpm，4℃离心10min，将沉淀重悬于50mL0.2M、PH7.4的PBS缓冲液中，冰浴超声30min，然后12000rpm，4℃离心15min，收集上清；

上清经0.45um滤膜过滤后，过5mL镍柱纯化，按0.5ml/min的流速使上述蛋白样品缓慢流过镍柱。用50mL体积的Buffer A洗掉杂蛋白，Buffer A成分为pH7.4，0.2M PBS含300mM NaCl和30mM咪唑，流速为1ml/min，再按照1ml/min的流速，用洗脱剂Buffer B洗脱目的蛋白，Buffer B的成分为pH7.4，0.2M PBS含300mM NaCl和300mM咪唑。

所得洗脱液利用15mL，3kDa超滤管进行浓缩除盐，置换Buffer为pH7.4，0.2M PBS，离心条件为4000g,10min/次，浓缩制得重组Tau蛋白抗原。

第六方面，本发明还提供一种针对Tau抗原的多克隆抗体，所述的多克隆抗体是由氨基酸序列如Seq ID NO.5所示的重组Tau蛋白抗原制备成的多克隆抗体。所述重组Tau蛋白抗原可由上述方法制备得到。

具体的，可通过将所述重组Tau蛋白抗原免疫动物，获得血清，制备得到多克隆抗体。

更具体的，将重组Tau蛋白抗原乳化后，免疫新西兰大耳兔，免疫方式为背部多点免疫，进行四次免疫，收集、分离得到含有多克隆抗体的血清，纯化，制得多克隆抗体。

第七方面，本发明提供针对Tau抗原的多克隆抗体在制备Tau蛋白检测试剂盒中的应用。

第八方面，本发明还提供一种Tau蛋白检测试剂盒，所述Tau蛋白检测试剂盒包括所述的多克隆抗体。所述Tau蛋白检测试剂盒可检测识别Tau蛋白的全部六种亚型。

为解决上述技术问题，本发明的总体思路如下：

Tau蛋白是微管相关蛋白，其在人体中的常见形式有六种亚型，分别为tau352(0N3R)、tau381(1N3R)、tau383(0N4R)、tau410(2N3R)、tau412(1N4R)，Tau(2N4R)最长亚型蛋白为例展示其结构区域主要包括N末端投射功能区(aa1-151)，2N插入序列位于此段，中间脯氨酸富集区(aa152-244)、微管结合区(Microtubule-binding domain，MBD，aa245-368)，包含四个C末端重复序列4R和C末端功能区(C端，aa369-441)。

但是根据Meredith、Barthe′lemy、Sato、Cicognola、Chen在2013-1019年间的研究报道发现在人脑脊液或血浆中Tau蛋白因受蛋白酶切割作用，大量以N末端(aa1-151)和中间区域Tau剪切片段(aa152-244)存在，而C末端片段含量极低。

所以，本非发明利用生物软件分析氨基酸序列，优先选择Tau(2N4R)的抗原特异性比较强的序列，并且根据Tau蛋白的所有亚型序列，选择六个亚型共同的序列进行表位选择，即排除前面描述的2N插入序列并保留6个亚型共有的3R序列(带有4R序列的亚型比3R多一段重复序列)。选择评分高的表位并保证可以识别所有Tau亚型的表位序列。这样设计的Tau抗原通过免疫得到的针对Tau的特异性抗体才具备识别样本中不同形式Tau亚型蛋白或水解片段的价值。

因此，以Tau蛋白序列(2N4R)为基础，通过生物信息学软件对Tau(Uniprot序列号P10636-8)蛋白编码氨基酸的序列进行分析，将筛选得到的优势抗原表位按照一定顺序进行串联，构建并合成多表位融合抗原；同时，进行密码子优化后合成该蛋白的核酸序列，构建高效原核表达载体，纯化高纯度的重组蛋白。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

1、本发明研制了一种新的重组Tau蛋白抗原，并通过重组工程菌进行表达，表达制备的重组Tau蛋白抗原包含了四个线性表位多肽，且线性多肽互不重叠且均位于Tau蛋白的N端区域和中间脯氨酸富含区(天然情况下Tau蛋白中多以N端区域和中间区域剪切体形式存在)，在Tau的六种亚型中均存在所述四个线性表位多肽序列。

2、本发明通过柔性多肽链GGGGS串联四个线性表位多肽，相对于单个多肽，提高了免疫原性和抗原表位的丰富性，同时也省去了多肽偶联提高免疫原性的必要，利用串联后的多肽将优势线性表位集中在一条序列中，避免了将全长蛋白表达用作免疫原免疫后抗体表位的不确定性并避免了针对Tau的抗体不能识别所有Tau蛋白亚型的风险，有利于抗体应用于下游Tau蛋白相关诊断或者科研检测。

3、本发明提供的一种可溶性Tau蛋白抗原，其具有良好的免疫原性，可刺激抗原免疫动物发生免疫应答，其产生的多克隆抗体效价高特异性强，并且可以识别Tau蛋白的全部六种亚型。

附图说明

图1为Tau 6种蛋白亚型示意图tau352(0N3R)、tau381(1N3R)、tau383(0N4R)、tau410(2N3R)、tau412(1N4R)和tau441(2N4R)。

图2为Tau蛋白(2N4R亚型)线性表位利用Bepipred Linear Epitope Prediction2.0的分析结果。

图3为Tau抗原纯化SDS-PAGE图；其中，序号M为marker，序号R为纯化后还原状态的重组Tau蛋白抗原。

具体实施方式

下面以具体的实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

需要说明的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

菌种与质粒：宿主菌BL21(DE3)，购自上海唯地生物技术有限公司，质粒PET28a，购自苏州泓迅生物科技股份有限公司。

分子生物学试剂：卡那霉素(kan)、IPTG为上海生工的产品。其他试剂为进口或者国产分析纯试剂。

基因的合成：苏州泓迅生物科技股份有限公司。

基因合成方法：将Tau蛋白抗原核苷酸序列(氨基酸序列对应Seq ID No.5)克隆到表达载体PET28a中，由苏州泓迅生物科技股份有限公司直接合成；蛋白的SDS-PAGE分析等一般的分子克隆方法按常规方法进行。其他试剂盒按说明书进行。

Tau亚型蛋白：tau352(0N3R)、tau381(1N3R)、tau383(0N4R)、tau410(2N3R)、tau412(1N4R)，Tau(2N4R)均采购自北京达科为生物技术有限公司(BiLegend代理品牌)。

实施例1抗原表位的筛选

参考在NCBI上公布的Tau蛋白(2N4R)序列，利用ExPasy、UniProt等在线分析工具得到蛋白的二级结构和三级结构域，结合Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0分析结果及Tau蛋白六种亚型中所共有的序列，以及可以识别Tau蛋白在体内的水解后主要片段形式，并结合经验设计筛选出Tau蛋白四个的优势线性抗原。筛选出个优势线性抗原分别为Tau(2N4R)6-24、111-130、152-170和185-204，6-24位于第6个氨基酸到第24个氨基酸，111-130位于第111个氨基酸到第130个氨基酸，152-170位于第152个氨基酸到第170个氨基酸，185-204位于第185个氨基酸到第204个氨基酸。Tau六种亚型的结构分区,2N插入序列及R1-R4区域布局及亚型蛋白氨基酸长度见图1。

Tau蛋白(2N4R亚型)线性表位的Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0分析结果见图2。

实施例2特异性Tau蛋白抗原的基因获取

将编码优势抗原表位的基因按照一定的排列组合串联，具体顺序为6-24、111-130、152-170、185-204，串联抗原构建了含有4个多表位的融合抗原基因，抗原表位之间通过柔性链GGGGS串联并对应相应的基因。经过稀有密码子在线软件对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子核苷酸替换大肠杆菌的稀有密码子，使最终合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌的稀有密码子。

实施例3构建特异性Tau蛋白抗原的表达载体

由苏州泓迅生物科技股份有限公司直接合成特异性Tau融合蛋白抗原的核苷酸序列，并构建到商业化表达质粒PET28a多克隆位点NcoI和XhoI之间，命名为PET28a-Tau。

实施例4重组表达载体的转化和接种

1、BL21(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入100ng PET28a-Tau质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置25分钟；

2、42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟；

3、向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟；

4、5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并接种到50mL含卡那霉素(10ug/mL)的LB培养基里，37℃，150rpm过夜培养。

实施例5表达菌株高效诱导表达

按2％的接种量，取4mL种子液转接至200ml LB培养基(10ug/mL卡那霉素)的摇瓶中，37℃，150rpm恒温摇床振荡2h，加IPTG(终浓度为1mmol/l)，然后20℃高效诱导表达14h。

实施例6表达蛋白的纯化

将实施例5中的高效表达的重组工程菌发酵液，高速(12000rpm，4℃)离心10min，将沉淀的菌体重悬于50mL 0.2M PBS(PH7.4)中，洗涤1次，高速(12000rpm，4℃)离心10min，将沉淀重悬于50mL0.2M PBS(PH7.4)中，冰浴超声30min，然后12000rpm，4℃离心15min，收集上清。

上清经0.45um滤膜过滤后，过5mL镍柱纯化(Ni NTA Beads，常州天地人和生物科技有限公司)，按0.5ml/min的流速使上述蛋白样品缓慢流过镍柱。用50mL体积的Buffer A(pH7.4，0.2M PBS含300mM NaCl和30mM咪唑)洗掉杂蛋白，流速为1ml/min，再按照1ml/min的流速，用洗脱剂Buffer B(pH7.4，0.2M PBS含300mM NaCl和300mM咪唑)洗脱目的蛋白。

利用Millipore的15mL，3kDa超滤管进行浓缩除盐，置换Buffer为pH7.4，0.2MPBS，离心条件为4000g,10min/次。最终的蛋白经SDS—PAGE检测后，纯度>95％，产量6.5mg，见图3。

实施例7重组Tau蛋白的多抗血清的制备

将纯化的Tau蛋白抗原制备多抗血清，用抗原和佐剂联合免疫新西兰大耳白兔的方式，制备并纯化获得的兔抗血清，间接ELISA法检测抗Tau蛋白抗原抗体滴度。

1、主要试剂：完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为SIGMA公司产品。其他试剂为国产或进口分析纯试剂。

2、免疫程序

实施例6制备的纯化重组Tau蛋白作为免疫原，免疫4只新西兰大耳兔(编号K0001-K0004)，每只免疫200ug抗原，免疫方式为背部多点免疫。第一次免疫使用完全弗氏佐剂与纯化Tau蛋白混合乳化，两周后第二次免疫，用不完全弗氏佐剂和纯化Tau蛋白混合乳化，免疫方式为背部多点免疫。两周后第三次免疫，用不完全弗氏佐剂和纯化Tau蛋白混合乳化，免疫方式为背部多点免疫，两周后同样免疫程序免疫第四次。

3、间接ELISA测兔抗血清效价

第四次免疫后五天，兔耳缘静脉取血，4000rpm离心10min获得兔抗血清。取融合蛋白用碳酸盐缓冲液(50mM，PH9.6)稀释后100ul/孔、100ng/孔的重组Tau抗原蛋白量包被酶联板，4℃过夜。次日1％牛血清白蛋白封闭，37℃封闭2h，将兔抗血清四倍梯度稀释作为一抗(首孔1：750稀释，然后按倍比稀释，每浓度平行测两孔)，阴性对照采用1％BSA TBS溶液作为一抗，37℃水浴孵育1h后，加1:5000二抗羊抗兔，加显色液显色。检测酶联板OD450信号值，结果显示(见表一)效价高至1:768000以上，说明免疫原蛋白有很好的免疫原性和特异性。

表1间接酶联免疫法检测兔抗血清效价实验结果(A450值)

使用购买得到的6种不同亚型Tau蛋白100ng/孔的蛋白量包被酶联板，同时使用一种非相关蛋白(编号为NSP)作为阴性对照以证明其特异性，蛋白均以同样模式包被并4℃过夜。次日1％牛血清白带白封闭，37℃封闭2h，将兔抗血清1：20000稀释作为一抗，1％BSATBS作为血清阴性对照，37℃水浴孵育1h后，加1:5000二抗羊抗兔，加显色液显色。检测酶联板OD450信号值，结果如表二所示，结果显示兔抗血清可以特异性的识别不同亚型的Tau蛋白，说明免疫原产生抗体的表位位于六种亚型蛋白共有的序列中，证明了Tau重组蛋白良好的免疫原性和特异性，其产生的多抗可以识别不同亚型的Tau蛋白，在将来的诊断及检测应用上具备较高的价值和意义。

表2间接酶联免疫法检测兔抗血清识别Tau亚型蛋白实验结果(A450值)

Claims (8)

1.一种微管相关蛋白Tau抗原，其特征在于，所述的微管相关蛋白Tau抗原是通过使用优势线性表位多肽（1）、（2）、（3）、（4）依次通过柔性多肽链串联得到，且所述柔性多肽链的氨基酸序列为GGGGS；

其中，所述优势线性表位多肽（1）、（2）、（3）、（4）的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的微管相关蛋白Tau抗原，其特征在于，其氨基酸序列如Seq IDNO.5 所示。

3.如权利要求1或2所述的微管相关蛋白Tau抗原的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为Seq ID NO.6。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体由表达载体和如权利要求3所述的微管相关蛋白Tau抗原的编码基因重组而成。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为PET28a质粒。

6.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌是向宿主菌中转化如权利要求4或5所述的重组表达载体而成。

7.如权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21（DE3）。

8.如权利要求1或2所述的微管相关蛋白Tau抗原的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）将Seq ID NO .6所示的微管相关蛋白Tau抗原的编码基因克隆到表达载体中，得到重组表达载体；

（2）将步骤（1）得到的重组表达载体转入宿主菌，得到重组工程菌；

（3）利用重组工程菌诱导表达Tau蛋白抗原；

（4）提取纯化步骤（3）的表达蛋白，制得重组Tau蛋白抗原。