SK284529B6 - Deriváty rapamycínu, spôsob ich prípravy, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a súprava alebo balenie na použitie pri imunosupresii, zápale alebo infekciách - Google Patents

Abstract

Deriváty rapamycínu všeobecného vzorca (I), v ktorom substituent R2 je vybraný či už zo všeobecného vzorca (II), alebo zo všeobecného vzorca (III) a X znamená hydroxylovú skupinu alebo atóm vodíka; ako aj spôsoby ich prípravy a ich použitia ako liečiv a farmaceutické kompozície, ktoré ich obsahujú. Sú použiteľné ako účinné imunosupresívne a antiproliferačné látky a majú tiež protinádorovú aktivitu.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka derivátov rapamycínu, spôsobu ich výroby, ich použitia ako liečiv a farmaceutických kompozícií, ktoré ich obsahujú.

Doterajší stav techniky

Rapamycín je známe makrolidové antibiotikum, produkované mikroorganizmom Streptomyces hygroscopicus, ktoré má štruktúru znázornenú vzorcom (A)

Pozri napríklad J. B. McAlpine a kol., J. Antibiotics (1991) 44: 688; S. L. Schreiber a kol., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; USA patentový spis č. 3 929 992. (Vo vzorci rapamycínu sa navrhovali rôzne schémy číslovania. Aby sa predišlo zámene, keďže sa tu menujú špecifické deriváty rapamycínu, vyberali sa názvy s odkazom na schému číslovania rapamycínu vo vzorci (A)). Rapamycín je účinné imunosupresívum a preukázalo sa, že má protinádorovú a fungicídnu účinnosť. Jeho použiteľnosť ako liečiva je však obmedzená veľmi nízkou a premenlivou biologickou dostupnosťou. Rapamycín je navyše nerozpustný a nestály, čo sťažuje prípravu stabilných galenických kompozícií.

Je známych veľa derivátov rapamycínu. Niektoré 40-0-substituované rapamycíny sú opísané napríklad v USA patentovom spise č. 5 258 389 a v spise WO 94/09010 (O-alkylrapamycíny); v spise WO 92/05179 (estery karboxylových kyselín), v USA patentovanom spise č. 5 118 677 (amidestery), v USA patentovom spise č. 5 118 678 (karbamáty), v USA patentovom spise č. 5 100 883 (fluorované estery), v USA patentovom spise č. 5 151 413 (acetály) a v USA patentovom spise č. 5 120 842 (silylétery).

Podstata vynálezu

Najnovšie sa zistilo, že niektoré nové deriváty rapamycínu majú lepší farmakologický profil ako rapamycín a vykazujú vyššiu stabilitu.

Podľa vynálezu sa získava zlúčenina všeobecného vzorca (I)

v ktorom

R¹ je alkylová skupina, alkenylová skupina, alkinylová skupina, hydroxyalkylová skupina, hydroxyalkenylová skupina, hydroxyalkinylová skupina, benzylová skupina, alkoxybenzylová alebo chlórbenzylová skupina,

R² predstavuje buď všeobecný vzorec (II), alebo všeobecný vzorec (III) a⁵

(II) (III)

R³ je vybraný zo súboru, ktorý zahŕňa atóm vodíka, alkylovú skupinu, alkenylovú skupinu, alkinylovú skupinu, arylovú skupinu, tioalkylovú skupinu, arylalkylovú skupinu, hydroxyarylalkylovú skupinu, hydroxyarylovú skupinu, hydroxyalkylovú skupinu, dihydroxyalkylovú skupinu, hydroxyalkoxyalkylovú skupinu, hydroxyalkylarylalkylovú skupinu, dihydroxyalkylarylalkylovú skupinu, alkoxyalkylovú skupinu, alkylkarbonyloxyalkylovú skupinu, aminoalkylovú skupinu, alkylaminoalkylovú skupinu, alkoxykarbonylaminoalkylovú skupinu, alkylkarbonylaminoalkylovú skupinu, arylsulfonamidoalkylovú skupinu, allylovú skupinu, dihydroxyalkylalylovú skupinu, dioxolanylalylovú skupinu, karbalkoxyalkylovú skupinu a alkylsilylovú skupinu;

R⁴ znamená atóm vodíka, metylovú skupinu alebo s R³ tvoria alkylénový reťazec s 2 až 6 atómami uhlíka;

R⁵ znamená skupinu R⁶O-CH₂-, v ktorej R⁶ je vybraný zo súboru, ktorý zahŕňa atóm vodíka, alkylovú skupinu, alkenylovú skupinu, alkinylovú skupinu, arylovú skupinu, alkylkarbonylovú skupinu, arylkarbonylovú skupinu, heteroarylkarbonylovú skupinu, hydroxyalkylkarbonylovú skupinu, aminoalkylkarbonylovú skupinu, formylovú skupinu, tioalkylovú skupinu, arylalkylovú skupinu, hydroxyarylalkylovú skupinu, hydroxyarylovú skupinu, hydroxyalkylovú skupinu, dihydroxyalkylovú skupinu, hydroxyalkoxyalkylovú skupinu, hydroxyalkylarylalkylovú skupinu, dihydroxyalkylarylalkylovú skupinu, alkoxyalkylovú skupinu, alkylkarbonyloxyalkylovú skupinu, aminoalkylovú skupinu, alkylaminoalkylovú skupinu, alkoxykarbonylaminoalkylovú skupinu, alkylkarbonylaminoalkylovú skupinu, arylsulfonamidoalkylovú skupinu, alylovú skupinu, dihydroxyalkylalylovú skupinu, dioxolanylalylovú skupinu a karbalkoxyalkylovú skupinu; skupinu R⁷CO-, v ktorej R⁷ je vybraný zo súboru, ktorý zahŕňa atóm vodíka, alkylovú skupinu, hydroxylová skupinu, alkoxylovú skupinu, aryloxylovú skupinu, amínovú skupinu, alkylamínovú skupinu, zvyšok aminokyseliny alebo N,N-disubstituovanú aminoskupinu, v ktorej substituenty sú (a) vybrané zo súboru, ktorý zahŕňa alkylovú skupinu, arylovú skupinu alebo arylalkylovú skupinu, alebo (b) tvorí heterocyklickú štruktúru; skupinu R^SNCH-, v ktorej R⁸ je alkylová skupina, arylová skupina, amínová skupina, alkylamínovú skupina, arylamínová skupina, hydroxylová skupina, alkoxylová skupina alebo arylsulfonylamínová skupina; skupinu -O-CH-O-; alebo substituovanú dioxymetylynovú skupinu;

Y znamená atóm kyslíka, alebo (atóm vodíka a hydroxylovú skupinu) alebo (atóm vodíka a skupinu OR⁹), v ktorej R⁹ je vybraný zo súboru, ktorý' zahŕňa alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, alkylkarbonylovú skupinu, arylkarbonylovú skupinu, heteroarylkarbonylovú skupinu, hydroxy alkylkarbonylovú skupinu, aminoalkylkarbonylovú skupinu, formylovú skupinu alebo arylovú skupinu; a

X znamená hydroxylová skupinu alebo atóm vodíka; pričom „alk“ alebo „alkyl“ sa týka alifatického substituentu s 1 až 10 atómami uhlíka, prípadne prerušeného kyslíkovou väzbou; a „ar“ alebo „aryl“ sa týka monocyklického, prípadne heterocyklického, prípadne substituovaného aromatického substituentu so 4 až 14 atómami uhlíka, s tou podmienkou, že ak X je hydroxylová skupina, R¹ znamená alkylovú skupinu a R² je zvyšok všeobecného vzorca (II), potom R³ je iný ako atóm vodíka.

Súčasť „alk“ alebo „alkyl“, spomínaná skôr, môže byť rozvetvená, priama alebo cyklická; výhodne je to alifatický substituent s 1 až 6 atómami uhlíka, prípadne prerušený kyslíkovou väzbou, výhodnejšie neprerušený kyslíkovou väzbou.

Príklady súčastí „ar“ alebo „aryl“, spomenutých skôr a prípadne substituovaných, zahŕňajú napríklad fenylovú skupinu, benzylovú skupinu, tolylovú skupinu, pyridylovú skupinu a pod.

Ak je R¹ chlórbenzylová skupina alebo alkoxybenzylová skupina, je substituent výhodne v orto-polohe.

Ak skupina R⁷CO- znamená Ν,Ν-disubstituovanú karbamoylovú skupinu, môže to byť napríklad N-metyl-N-(2-pyridin-2-yl-etyl)-karbamoylová skupina, (4-metylpiperazin-l-yl)-karbonylová skupina alebo (morfolin-4-yl)-karbonylová skupina.

Ak je R⁵ substituovaná dioxymetylynová skupina, môže to byť napríklad 0,0-(alkylén)-dioxy-metylynová skupina, t. j. kde 2 atómy kyslíka sú viazané na alkylénovú skupinu.

V zlúčeninách všeobecného vzorca (I) sú nasledujúce významy preferované či už jednotlivo, alebo v akejkoľvek kombinácii alebo podkombinácii:

1. X je hydroxylová skupina a R¹ je alkinylová skupina s 3 až 10 atómami uhlíka alebo hydroxyalkinylová skupina s 3 až 10 atómami uhlíka, výhodne skupina alk-2-inylová s 3 až 10 atómami uhlíka alebo hydroxyalk-2-inylová skupina, výhodnejšie alk-2-inylová skupina s 3 až 6 atómami uhlíka;

2. X je atóm vodíka a R¹ je alkylová skupina s 1 až 10 atómami uhlíka, alk-2-enylová skupina s 3 až 10 atómami uhlíka, hydroxyalk-2-enylová skupina s 3 až 10 atómami uhlíka, alk-2-inylová skupina s 3 až 10 atómami uhlíka, hydroxyalk-2-inylová skupina s 3 až 10 atómami uhlíka alebo alkoxyalkylová skupina s 1 až 10 atómami uhlíka v alkoxylovej časti a s 1 až 10 atómami uhlíka v alkylovej časti, výhodne alkylová skupina s 1 až 6 atómami uhlíka alebo alk-2-inylová s 3 až 10 atómami uhlíka, výhodnejšie alkylová skupina s 1 až 4 atómy uhlíka, najvýhodnejšie metylová skupina;

3. R¹ ako alkinylová skupina s 3 až 6 atómami uhlíka je 2-propinylová skupina alebo pent-2-inylová skupina, výhodne pent-2-inylová skupina.

4. Y znamená atóm kyslíka alebo (atóm vodíka a hydroxylovú skupinu), alebo (atóm vodíka a alkoxylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka), výhodne atóm kyslíka.

5. R² je zvyšok všeobecného vzorca (II);

6. vo zvyšku všeobecného vzorca (II) je R³ atóm vodíka, hydroxyalkylová skupina s 1 až 6 atómami uhlíka, hydroxyalkoxyalkylová skupina s 1 až 6 atómami uhlíka v alkoxylovej časti a s 1 až 6 atómami uhlíka v alkylovej časti, (alkyl)-karbonyl-aminoalkylová skupina s 1 až 6 atómami uhlíka v obidvoch alkylových častiach, alkoxyalkoxylová skupina s 1 až 6 atómami uhlíka v obidvoch alkoxylových častiach alebo aminoalkylová skupina s 1 až 6 atómami uhlíka, výhodne atóm vodíka, hydroxyetylová skupina, hydroxypropylová skupina, hydroxyetoxyetylová skupina, metoxyetylová skupina alebo acetylaminoetylová skupina; osobitne je to atóm vodíka, keď X znamená atóm vodíka alebo keď X znamená hydroxylová skupinu a R¹ znamená alkinylovú skupinu;

7. vo zvyšku všeobecného vzorca (Π) je R⁴ metylová skupina;

8. R² je zvyšok všeobecného vzorca (III), kde R³ je zoskupenie R⁶OCH₂-, v ktorom R⁶ je vybraný zo súboru, ktorý zahŕňa atóm vodíka, alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alk-2-enylovú skupinu s 3 až 6 atómami uhlíka, alk-2-inylovú skupinu s 3 až 6 atómami uhlíka, arylovú skupinu, alkylkarbonylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, arylkarbonylovú skupinu, hydroxyalkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alkoxyalkylová skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka v alkoxylovej časti a s 1 až 6 atómami uhlíka v alkylovej časti alebo aminoalkylová skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka; ďalej skupinu R⁷CO-, v ktorom R⁷ je vybraný zo súboru, ktorý zahŕňa atóm vodíka, hydroxylová skupinu, alkoxylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, amínovú skupinu, alkylamínovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, zvyšok aminokyseliny alebo Ν,Ν-disubstituovanú amínovú skupinu, v ktorej substituenty sú buď (a) alkylové skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka, alebo arylové skupiny, alebo (b) tvoria heterocyklickú štruktúru; a napokon skupinu R^SNCH-, v ktorom R⁸ je alkylová skupina, arylová skupina, amínová skupina, alkylamínová skupina, arylamínová skupina, hydroxylová skupina, alkoxylovú skupina alebo arylsulfonylamínová skupina; skupinu -O-CH-O-; alebo substituovaná dioxymetylynová skupina.

Výhodnými zlúčeninami sú zlúčeniny všeobecného

v ktorom R¹, R² a Y majú význam definovaný skôr, prednostne majú niektorý z výhodných významov uvedených v bodoch 1. a 3. až 8.;

a zlúčeniny všeobecného vzorca (Ib)

’ (Ib), v ktorom R¹, R² a Y majú význam definovaný skôr, prednostne majú niektorý z výhodných významov uvedených v bodoch 2. až 8.

Zvlášť výhodné zlúčeniny zahŕňajú (i) 32-deoxo-rapamycín;

(ii) 16-0-pent-2-inyl-32-deoxo-rapamycín;

(iii) 16-0-pent-2-inyl-32-deoxo-40-0-(2-hydroxyetyl)-rapamycin;

(iv) 16-0-pent-2-inyl-32(S)-dihydro-rapamycín;

(v) 16-0-pent-2-inyl-3 2(S)-dihydro-40-0-(2-hydroxyetyl)-rapamycín;

(vi) 32(S)-dihydro-40-0-(2-metoxy)etyl-rapamycin;

(vii) 32(S)-dihydro-40-0-(2-hydroxyetyl)-rapamycín.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) môžu mať izomériu a jestvujú v nasledujúcich izomémych formách. Je očividné, že tento vynález zahŕňa zlúčeniny všeobecného vzorca (I), jednotlivé izoméry všeobecného vzorca (ľ)

v ktorom R¹, R², Y a X majú význam definovaný skôr, ako aj zmesi ich izomérov.

Jednotlivé izoméry sa môžu oddeľovať analogicky podľa známych metód.

Tento vynález sa tiež týka spôsobu prípravy zlúčenín všeobecného vzorca (I) a vyznačuje sa tým, že sa

a) pripravuje zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom X značí atóm vodíka, reduktívnou elimináciou karbonylovej skupiny v polohe 32 pri zlúčenine všeobecného vzorca (IVa)

v ktorom R¹, R² a Y majú význam definovaný skôr, v chránenej alebo nechránenej forme, a ak je to žiaduce, odstránením prítomných chrániacich skupín; alebo že sa

b) pripravuje zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom X značí hydroxylovú skupinu, stereoselektívnou redukciou karbonylovej skupiny v polohe 32 pri zlúčenine všeobecného vzorca (IVa) definovanej skôr, alebo že sa

c) konvertuje zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ znamená alkylovú skupinu, aby sa získala zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ je iný ako alkylová skupina.

Pri spôsobe je v stupni a) zlúčenina všeobecného vzorca (IVa) výhodne v chránenej forme, t. j. že obsahuje ochranné skupiny na funkčných skupinách, ktoré sa nezú častňujú reakcie, napríklad hydroxylové skupiny v polohe 28 a prípadne v polohe 40, keď R² znamená zvyšok všeobecného vzorca (II), alebo v polohe 39, keď R² znamená zvyšok všeobecného vzorca (III).

Redukcia v stupni a) na 32-deoxozlúčeninu všeobecného vzorca (I) sa zvyčajne môže uskutočňovať vo dvoch stupňoch:

i) reakciou zlúčeniny všeobecného vzorca (IVa), výhodne v chránenej forme, s hydridom, napríklad diizobutylalumíniumhydridom alebo výhodne lítium-tri-íere-butoxy-alumíniumhydridom, pri vzniku zodpovedajúcej 32-dihydrozlúčeniny. Ďalšie metódy a činidlá, pokiaľ sú známe k redukcii ketónov, sa môžu použiť na prípravu 32-dihydrozlúčeniny zo zodpovedajúceho ketónu. Zahŕňajú napríklad hydrogenáciu, redukciu kovmi, redukciu hydridmi kovov, ako je opísaná napríklad v publikácii Comprehensivc Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, str. 527 - 535, sekcia 7.1.1 - 7.1.4, a metódy asymetrickej redukcie ketónov, ako je napríklad uvedené v publikácii Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, str. 540 - 547, sekcia 7.1.15.

Za redukčným stupňom i/ potom nasleduje ii/ konverzia 32-dihydrozlúčeniny na zodpovedajúci 32-halogénderivát, napríklad 32-bróm- alebo výhodne 32-jódderivát, ktorý sa potom redukuje napríklad hydridom, na žiadaný 32-deoxoderivát, a ak je to žiaduce, odstráni sa zo získanej zlúčeniny ochrannej skupiny. Môžu sa použiť aj iné činidlá, ako tie, ktoré sa použili na redukciu halogénderivátov; sú to napríklad kovy s nízkym mocenstvom (napríklad lítium, sodík, horčík a zinok) a hydridy kovov (alumíniumhydridy, bórohydridy, silány, hydridy medi) (pozri Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, str. 18 - 20, sekcie

1.5.1. a 1.5.2.).

Alternatívne sa redukcia halogénderivátov dá dosiahnuť použitím vodíka alebo zdroja vodíka (napríklad kyseliny mravčej alebo jej soli) v prítomnosti vhodného kovového katalyzátora (napríklad Raney niklu, kovového paládia alebo komplexov paládia, komplexov rodia alebo ruténia) (pozri Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, str. 20 - 24, sekcia 1.5.3.). Ďalej sa môžu tiež použiť metódy, ktoré sú známe pre transformáciu alkoholu na zodpovedajúcu deoxyzlúčeninu. Tieto metódy zahŕňajú napríklad priamu redukciu alebo redukciu fosforečného medziproduktu, sulfonátu, tiokarbonátu, tiokarbamátu alebo xantátu, a sú opísané napríklad v Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, str. 27-31, sekcia 1.9.1.-1.9.4.

Skupiny vhodné na ochranu hydroxylových skupín, metódy tvorby ochranných skupín a ich odstraňovanie sú známe, pozri napríklad Protectiv Groups in Organic Synthesis, druhé vydanie, T. W. Greene, P. G. M. Wuts, John Wiley and Sons, New York, 1991, kapitola 2 a referencie tamtiež. Takýmito výhodnými skupinami na ochranu hydroxylových skupín sú napríklad triorganosilylové skupiny, ako je skupina trialkylsilylová s 1 až 6 atómami uhlíka (napríklad trimetylsilylová skupina alebo trietylsilylová skupina), triizopropylsilylová skupina, izopropyldimetylsilylová skupina, terc-butyldimctylsilylová skupina, triarylsilylová skupina (napríklad trifenylsilylová) alebo skupina triaralkylsilylová (napríklad tribenzylsilylová). Odstraňovanie ochranných skupín sa môže uskutočňovať v mierne kyslých podmienkach.

Redukčný stupeň i/ sa môže bežne realizovať pri nízkej teplote, napríklad od teploty -10 až do -80 °C.

V stupni ii/ sa 32-dihydrozlúčenina, prípadne v chránenej forme, výhodne 32(R)-diastereoizomér, prevádza na ester, výhodne sulfonát, napríklad mezylát, tozylát, nozylát alebo triflát, nasleduje zámena vhodným halogenidom, napríklad jodidom alebo bromidom sodným, tetrabutylamóniumjodidom alebo -bromidom, výhodne v prítomnosti zásady, napríklad amínu. Získaný 32(R)-diastereoizomér sa izoluje z reakčnej zmesi známou separačnou technikou, napríklad chromatografiou.

Hydridy, ktoré sú vhodné na redukciu 32-halogénzlúčenín, zahŕňajú napríklad radikálové hydridy, ako sú tributylcínhydrid alebo tris-(trimetylsilyl)-silán. Redukcia sa tiež dá uskutočniť v neprítomnosti alebo v prítomnosti radikálového iniciátora, napríklad 2,2'-azobisizobutyronitrilu alebo výhodnejšie trietylbóranu, zvyčajne pri teplote od 0 do 80 °C.

Po redukčnom stupni podľa bodu i/ alebo ii/, ak je to žiaduce, sa zvyčajne môže pridať oxidačné činidlo, ako je octan meďnatý, aby reoxidovalo na karbonylovú skupinu nežiaduci vedľajší produkt redukcie, ktorá môže nastať napríklad v polohe 9.

Alternatívne sa môže 32-dihydroderivát prevádzať priamo na halogénderivát známymi metódami, napríklad s použitím trifenylfosfínu v kombinácii s N-brómsukcínimidom alebo N-jódsukcinimidom, tetrabrómmetánom alebo tetrajódmetánom, 1,2-dibrómtetrachlóretánom, 2,4,5-tribrómimidazolom alebo 2,4,5-trijódimidazolom, jódom, 1,2-dijódetánom alebo s použitím tionylbromidu alebo metyltrifenoxyfosfóniumj odídu.

Redukcia karbonylovej skupiny v polohe 32 na 32-deoxoderivát sa môže tiež uskutočňovať tvorbou tozylhydrazónu, nasledovanou reakciou s bóranom, napríklad katecholbóranom, alebo tvorbou ditianu, nasledovanou vhodnou redukciou, napríklad Raney niklom alebo hydridom, napríklad tributylcínhydridom. Tiež sa môžu použiť ďalšie známe metódy prevádzania ketónu na zodpovedajúci alkán; tieto metódy zahŕňajú napríklad priamu redukciu (pozri Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, str. 35 - 37, sekcia

1.12.1.) alebo redukciu cez hydrazóny (pozri Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, str. 37 - 38, sekcia 1.12.2.) alebo cez deriváty síry a selénu (pozri Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, str. 34 - 35, sekcie 1.10. a 1.11.).

Redukčný stupeň b) na 32(S)-dihydrozlúčeninu všeobecného vzorca (I) sa uskutočňuje vo zvláštnych podmienkach. Prednostne sa používa také redukčné činidlo, ktoré signifikantne favorizuje redukciu na 32(S)-derivát, napríklad nátriumtrietylbórohydrid. Redukcia sa zvyčajne uskutočňuje pri nízkej teplote, napríklad od -50 až do -80 °C, v nezlúčivom rozpúšťadle, napríklad v tetrahydrofuráne, dietyléteri, glyme, diglyme alebo metyl-Zerc-butyléteri. Oddelenie 32(S)-dihydrozlúčeniny od malého množstva vzniknutej 32(R)-dihydrozlúčeniny sa môže realizovať známymi metódami, napríklad stĺpcovou chromatografiou alebo chromatografiou s reverznou fázou.

Ak je to žiaduce, môžu sa hydroxylové skupiny v polohe 28 a prípadne v polohe 40 chrániť pred uskutočnením redukcie a uvoľniť po nej, napríklad tak, ako je spomenuté skôr. Výhodne sa redukčný stupeň b) uskutočňuje bez ochrany hydroxylových skupín.

Konverzia v stupni c) sa môže uskutočňovať známymi metódami. Napríklad zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ znamená alkylovú skupinu, výhodne metylovú skupinu, môže reagovať so zlúčeninou R^X-OH, kde R^x je alkinylová skupina alebo hydroxyalkinylová skupina a vznikne zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ znamená alkinylovú skupinu alebo hydroxyalkinylovú skupinu. Reakcia sa zvyčajne uskutočňuje v aprotickom rozpúšťadle, napríklad v dichlórmetáne, toluéne, acetonitrile alebo tctrahydrofuráne, v kyslých podmienkach.

Redukcia v polohe 32, najmä redukčný stupeň b), sa výhodne uskutočňuje so zlúčeninou všeobecného vzorca (IVa), v ktorom R¹ má už žiadaný význam, napríklad R¹ je alkinylová skupina, čím sa zabráni neskoršej konverzii po redukcii. Zlúčenina všeobecného vzorca (IVa), v ktorom R¹ znamená alkinylovú skupinu alebo hydroxyaíkinylovú skupinu, ktorá je použitá ako východiskový materiál, sa môže pripraviť s použitím zlúčeniny R^X-OH, ako je uvedené.

Zlúčeniny, ktorc sa používajú ako východiskový materiál, sa môžu pripravovať analogicky podľa známych a realizovaných metód, ako sa uvádza napríklad v USA patentovom spise č.5 258 289, v spisoch WO 94/09010 a WO 95/16691 a v USA patentovom spise č. 5 120 842 a pod.

Nasledujúce príklady uskutočnenia spôsob podľa vynálezu bližšie ilustrujú. Uvedená skratka TES značí trietylsilylovú skupinu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 32-Deoxorapamycín (R¹ = metylová skupina; R² = zvyšok všeobecného vzorca (II), v ktorom R³ = atóm vodíka a R⁴ = = metylová skupina; X = atóm vodíka, Y = atóm kyslíka)

K miešanému a chladenému (-78 °C) roztoku 26,1 g (22,85 mmol) 28,40-bis-O-TES-rapamycínu v 260 ml tetrahydrofuránu sa pridá 50,3 ml (50,3 mmol) 1 M roztoku lítium-tri-rerc-butoxy-alumíniumhydridu v tetrahydrofuráne. Získaný roztok sa v priebehu 2 hodín nechá zohriať na -15 °C. Potom sa chladiaci kúpeľ nahradí ľadovým kúpeľom, ktorý zodvihne teplotu na 0 °C a v miešaní pri tejto teplote sa pokračuje 1 hodinu. Reakčná zmes sa naleje do deliacej nálevky, ktorá obsahuje 750 ml etylacetátu a 400 ml ľadovo studeného 2 N vodného roztoku kyseliny citrónovej a krátko sa pretrepe. Vodná vrstva sa oddelí a extrahuje 2x studeným ctylacetátom. Spojené organické roztoky sa premyjú ľadovo studeným 2 N vodným roztokom kyseliny citrónovej, vodou, nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a 2x nasýteným vodným roztokom chloridu sodného, potom sa vysušia nad bezvodným uhličitanom sodným, prefiltrujú sa a odparia pri zníženom tlaku. Odparok, ktorý pozostáva zo zmesi 32(R)-dihydro-28,40-bis-O-TES-rapamycínu a (32R)-9,32-bis-dihydro-28,40-bis-O-TES-rapamycínu, sa rozpustí bez ďalšieho čistenia v 260 ml metanolu. Tento roztok sa ochladí na 0 °C a nechá reagovať so 6,85 g (34,31 mmol) octanu meďnatého. Po 1 hodine miešania sa vzniknutá suspenzia zriedi metyl-íerc-butyléterom, premyje 2x vodou a 2x nasýteným vodným roztokom chloridu sodného. Vodná vrstva sa reextrahuje metyl-ŕerc-butyléterom. Spojené organické roztoky sa vysušia nad bezvodným síranom sodným, prefiltrujú a odparia pri zníženom tlaku. Odparok sa čistí chromatografiou na silikagéli (60 : 40, hexán - metyl-Zerc-butyléter) a poskytne čistý 32(R)-dihydro-28,40-bis-O-TES-rapamycín ako pevnú bielu látku.

’H NMR (CDC1₃) 4 : 1 zmes rotamérov, chemické posuny v zátvorkách sa týkajú minoritného rotaméru delta 0,72 (1H, dd, H-38ax), 1,63 (1,60) (3H, s, C17-CH₃), 1,66 (1,69) (3H, s, C29-CH₃), 1,77 a 1,81 (H-33), 2,46 (1H, m, H-31), 2,82 (2,91) (1H, m, H-25), 2,91 (1H, m, H-39), 3,13 (3H, s, C16-OCH₃), 3,26 (3H, s, C27-OCH₃), 3,41 (1H, m, H-40), 3,43 (3H, s, C39-OCH₃), 3,62 (1H, m, H-32), 3,75 (3,57) (1H, d, H-27), 4,10 (1H, d, H-28), 4,81 (1H, široké s, C10-OH), 5,05 (1H, d, H-34), 5,27 (1H, d, H-30), 5,36 (1H, d, H-2), 5,69 (1H, dd, H-22), 6,03 (5,96) (1H, d, H-18), 6,15 (1H, dd, H-21), 6,33 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19) MS (FAB, Lil matrice) m/z 1150 ([M + Li]⁺) (rel. intenzita 100)

K miešanému a chladenému (-15 °C) roztoku 20,69 (18,10 mmol) 32(R)-dihydro-28,40-bis-O-TES-rapamycínu a 7,55 ml (54,27 mmol) trietylamínu v 200 ml dichlórmetánu sa pridá 2,10 ml (27,02 mmol) metánsulfonylchloridu. Zmes sa mieša 20 minút, potom sa zriedi etylacetátom a pridá sa nasýtený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa extrahuje 3x etylacetátom. Spojené organické fázy sa premyjú nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a nasýteným vodným roztokom chloridu sodného, vysušia nad bezradným síranom sodným, prefiltrujú a zahustia pri zníženom tlaku. Odparok sa môže vyčistiť stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (80 : 20, hexán - etylacetát) a poskytne čistý 32(R)-dihydro-32-O-mezyl-28,40-bis-O-TES-rapamycín ako bielu pevnú látku, zvyčajne sa však surový produkt použije v nasledujúcom stupni bez ďalšieho čistenia.

'H NMR (CDCIj) delta 0,77 (1H, dd, H-38ax), 1,67 (3H, s, C17-CHj), 1,72 (3H, s, C29-CH₃), 2,77 (1H, m, H-25), 2,92 (1H, m, H-39), 3,03 (3H, s, C16-OCH₃), 3,17 (3H, s, C27-OCHj), 3,21 (3H, s, C39-OCH₃), 3,42 (1H, m, H-40), 3,45 (3H, s, CH₃SOj), 3,91 (1H, d, H-27), 4,10 (1H, d, H-28), 4,72 (1H, m, H-32), 4,94 (1H, s, C10-OH), 5,12 (1H, m, H-34), 5,25 (1H, d, H-30), 5,43 (1H, d, H-2), 5,88 (1H, dd, H-22), 6,03 (1H, d, H-18), 6,18 (1H, dd, H-21), 6,37 (1H, dd, H-20), 6,44 (lH,dd, H-19)

MS (FAB, Lil matrice) m/z 1228 ([M + Li]⁺) (rel. intenzita 68), 1132 ([(M - CHjSOjH) + Li]⁺) (rel. intenzita 100)

Zmes 22,35 g (18,30 mmol) 32(R)-dihydro-32-O-mezyl-28,-40-bis-O-TES rapamycínu, 27,50 g (183,33 mmol) jodidu sodného a 6,3 ml (36,68 mmol) diizopropyletylamínu v 400 ml tetrahydrofuránu sa varí pod spämým chladičom 6 hodín a nechá sa vychladnúť na izbovú teplotu. Získaná zmes sa zriedi etylacetátom a zmieša s 38,4 % vodným roztokom hydrogensiričitanu sodného. Vrstvy sa oddelia. Organická fáza sa premyje 3x nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a lx nasýteným vodným roztokom chloridu sodného, potom sa vysuší nad bezradným síranom sodným, prefiltruje a zahustí pri zníženom tlaku. Odparok sa čistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (83 : 17, hexán - etylacetát) a poskytne čistý 32(S)-deoxo-32-jód-28,40-bis-O-TES-rapamycín.

‘H NMR (CDCIj) 1,5 : 1 zmes rotamérov, chemické posuny v zátvorkách sa týkajú minoritného rotaméru delta 0,73 (1H, dd, H-38ax), 1,68 (1,66) (6H, s, C17-CH₃ a C29-CH₃), 2,72 (1H, m, H-25), 2,91 (2H, m, H-32 a H-39), 3,15 (3H, s, CI6-OCH5), 3,30 (3,31) (3H, s, C27-OCH₃), 3,43 (3,41) (3H, s, C39-OCH₃), 3,77 (3,91) (1H, d, H-27), 4,21 (4,25) (1H, d, H-28), 4,51 (1H, s, C10-OH), 5,45 (5,48) (1H, d, H-30), 5,60 (5,79) (1H, dd, H-22), 6,02 (5,85) (1H, d, H-18) MS (FAB, Lil matrice) m/z 1260 ([M + Li]⁺) (rel. intenzita 100)

K miešanému a chladenému (0 °C) roztoku 16,79 g (13,19 mmol) 32(S)-deoxo-32-jód-28,40-bis-O-TES-rapamycínu v 190 ml toluénu sa pridá 7 ml (26,38 mmol) tributylcínhydridu a potom 1,3 ml (1,30 mmol) 1 M roztoku trietylbóranu v hexáne. Zmes sa mieša 30 minút a zmieša sa s nasýteným vodným roztokom chloridu amónneho. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa extrahuje 2x etylacetátom. Spojené organické vrstvy sa premyjú vodou, nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vodou a 3x nasýteným vodným roztokom chloridu sodného, potom sa vysušia nad bezradným síranom sodným, prefiltrujú, zahustia pri zníženom tlaku a odparok sa čistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (75 : 25, hexán - mctyl-ŕerc-butyléter) a poskytne čistý 32(S)-deoxo-28,40-bis-Ó-TES-rapamycin ako bielu pevnú látku.

*H NMR (CDC1₃) 2,5 : 1 zmes rotamérov, chemické posuny v zátvorkách sa týkajú minoritného rotaméru delta 0,73 (1H, dd, H-38ax), 1,62 (1,57) (3H, s, C17-CH₃), 1,68 (1,72) (3H, s, C29-CH₃), 2,77 (2,91) (1H, m, H-25), 2,91 (1H, m, H-39), 3,15 (3H, s, C16-OCH₃), 3,27 (3,25) (3H, s, C27-OCH₃), 3,43 (3,45) (3H, s, C39-OCH₃), 3,70 (3,67) (1H, d, H-27), 4,11 (4,07) (1H, d, H-28), 4,57 (1H, široké s, C10-OH), 4,87 (4,67) (1H, d, H-34), 5,19 (5,08) (1H, d, H-30), 5,32 (1H, d, H-2), 5,60 (5,66) (1H, dd, H-22), 6,01 (5,92) (1H, d, H-18), 6,17 (1H, dd, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,40 (lH,dd, H-19)

MS (FAB, Lil matrice) m/z 1134 ([M + Li]⁺) (rel. intenzita 100)

K miešanému a chladenému (-15 °C) roztoku 10,73 g (9,52 mmol) 32-deoxo-28,40-bis-O-TES-rapamycínu v 85 ml metanolu sa prikvapkáva 9,5 ml 2 N vodnej kyseliny sírovej. Po skončení prikvapkávania sa reakčná zmes zohreje na 0 °C a mieša 1,5-hodiny, potom sa zriedi etylacetátom a zmieša s nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa extrahuje 3x etylacetátom. Spojené organické fázy sa premyjú 3x nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a nasýteným vodným roztokom chloridu sodného, potom sa vysušia nad bezradným síranom sodným, prefiltrujú a zahustia pri zníženom tlaku. Odparok sa rozpustí v dietyléteri a žiadaný 32-deoxo-rapamycín vykryštalizuje (bezfarebné kryštály).

¹II NMR (CDC1₃) 3 : 1 zmes rotamérov, chemické posuny v zátvorkách sa týkajú minoritného rotaméru delta 0,70 (1H, dd, H-38ax), 1,14 a 1,32 (H-32), 1,56 (H-33), 1,65 (1,62) (3H, s, C17-CH₃), 1,68 (1,70) (3H, s, C29-CH₃), 2,31 (2H, m, H-23 aH-31), 2,82 (2,95) (1H, m, H-25), 2,95 (1H, m, H-39), 3,14 (3H, s, C16-OCH₃), 3,32 (3H, s, C27-OCH₃), 3,38 (1H, m, H-40), 3,43 (3,41) (3H, s, C39-OCH₃), 3,61 (1H, d, H-27), 4,12 (1H, d, H-28), 4,80 (4,71) (1H, d, H-34), 5,22 (1H, d, H-30), 5,31 (1H, d, H-2), 5,56 (1H, dd, H-22), 5,95 (5,87) (1H, d, H-18), 6,16 (1H, dd, H-21), 6,36 (1H, dd, H-20), 6,41 (1H, dd, H-19)

MS (FAB, Lil matrice) m/z 906 ([M + Li]⁺) (rel. intenzita 100)

Príklad 2

16-Pent-2-inyloxy-32(S)-dihydrorapamycín (R¹ = pent-2-inylová skupina; R² = zvyšok všeobecného vzorca (II), v ktorom R³ = atóm vodíka a R⁴ = metylová skupina; X = = hydroxylová skupina, Y = atóm kyslíka)

K miešanému a chladenému (0 °C) roztoku 970 mg (1,06 mmol) 32(S)-dihydrorapamycínu a 1,39 ml (15,00 mmol) 2-pentin-l-olu v 20 ml dichlórmetánu sa pridá 0,50 ml (6,50 mmol) kyseliny trifluóroctovcj. Zmes sa mieša pri 0 °C 3 hodiny a potom sa pridá nasýtený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa extrahuje 3x etylacetátom. Spojené organické roztoky sa premyjú nasýteným vodným roztokom chloridu sodného, vysušia nad bezradným síranom sodným, prefiltrujú a zahustia pri zníženom tlaku. Surová zmes sa čistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (20 : 80, hexán - etylacetát), potom HPLC s reverznou fázou (RP 18, 81 : 19, metanol - voda) a poskytne titulnú zlúčeninu ako bielu amorfnú látku.

'H NMR (CDClj 2,5 : 1 zmes rotamérov, chemické posuny v zátvorkách sa týkajú minoritného rotaméru delta 0,71 (1H, dd, H-38ax), 1,13 (1,05) (3H, t, CH₃CH₂CCCH₂O), l, 67 (3H, s, 17-CHJ, 1,69 (3H, s, 29-CH₃), 2,21 (2H, qt, CH₃CH₂CCCH₂O), 2,96 (1H, m, H-39), 3,33 (3,37) (3H, s, 27-OCHJ, 3,41 (3,39) (3H, s, 39-OCH₃), 3,78 (1H, dt, CH₃CH₂CCCHHO), 4,0 (1H, dt, CH₃CH₂CCCHHO), 5,52 (5,71) (1H, dd, H-22), 5,98 (5,83) (1H, d, H-18), 6,15 (1H, m, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19) MS (FAB) m/z 974 ([M + Li]⁺)

Príklad 3

16-Pent-2-inyloxy-32(S)-dihydrorapamycín (alternatívna cesta)

Rapamycín reakciou s 2-pentin-l-olom analogickým postupom ako v príklade 2 poskytne 16-pent-2-inyloxyrapamycín. K miešanému a chladenému (-77 °C) roztoku

17,5 g (18,1 mmol) 16-demetoxy-16-pent-2-inyloxyrapamycínu v 180 ml tetrahydrofuránu sa pridá 21,7 ml (21,7 mmol) 1 M roztoku trietylbórohydridu sodného v tetrahydrofuráne. Po 1 hodine pri teplote -77 °C sa reakcia preruší a neutralizuje 10 % vodným roztokom kyseliny citrónovej. Reakčná zmes sa potom nechá zohriať na izbovú teplotu a väčšina tetrahydrofuránu sa odstráni odparením pri zníženom tlaku. Zvyšný roztok sa extrahuje 2x etylacetátom, organické fázy sa spoja a vysušia nad síranom sodným. Po odparení rozpúšťadla sa surový reakčný produkt chromatografuje na silikagéli a eluuje zmesou hexán - acetón (7 : 3). Konečné vyčistenie sa dosiahne preparatívnou HPLC (RP-18, 76 : 24, metanol - voda) a získa sa titulná zlúčenina ako amorfná biela látka.

Spektrálne dáta sú zhodné s dátami produktu, ktorý sa získal inou cestou.

Príklad 4 32(S)-Dihydro-40-O-(2-metoxy)ctylrapamycín (R¹ = metylová skupina; R² = zvyšok všeobecného vzorca (II), v ktorom R³ = 2-metoxyetylová skupina a R⁴ = metylová skupina; X = hydroxylová skupina, Y = atóm kyslíka)

K miešanému a chladenému (0 °C) roztoku 2,17 g (2,00 mmol) 40-O-(2-metoxy)etyl-28-O-TES-rapamycínu v 20 ml tetrahydrofuránu sa prikvapkajú 4,4 ml (4,4 mmol) 1 M roztoku L-Selectridu^R v tetrahydrofuráne. Vzniknutý žltý roztok sa mieša 3 hodiny pri 0 °C a prebytočné hydridové činidlo sa rozloží prídavkom 2 ml metanolu. Roztok sa zriedi metyl-íerc-butyléterom a pridá sa nasýtený vodný roztok Rochellovej soli. Zmes sa nechá zohriať na izbovú teplotu a v miešaní sa pokračuje 15 minút. Vrstvy sa oddelia a organický roztok sa premyje studenou 1 N kyselinou chlorovodíkovou, nasýteným vodným roztokom chloridu sodného, 1 N roztokom hydrogenuhličitanu sodného a opäť roztokom chloridu sodného. Vodné premývacie podiely sa ešte reextrahujú metyl-terc-butyléterom. Spojené organické vrstvy sa vysušia nad bezradným síranom sodným, prefiltrujú a zahustia pri zníženom tlaku, čím sa získa surová zmes 32S a 32R izomérov 32-dihydro-40-O-(2-metoxy)-etyl-28-O-TES-rapamycínu.

Získaný surový produkt sa rozpustí v 20 ml acetonitrilu a ochladí na 0 °C. K tomuto roztoku sa pridajú 2 ml komplexu fluorovodík - pyridín. V miešaní sa pokračuje 1 hodinu a pridá sa 1 N roztok hydrogenuhličitanu sodného. Zmes sa extrahuje 3x metyl-terc-butyléterom. Spojené organické roztoky sa premyjú 1 N roztokom hydrogenuhličitanu sodného a nasýteným vodným roztokom chloridu sodného, vysušia nad bezradným síranom sodným, prefiltrujú a zahustia pri zníženom tlaku. Čistenie sa urobí HPLC s reverznou fázou (RP-18, 5 pm, 50 : 50 až 100 : 0, acetonitril

- voda počas 60 minút) a získa sa 32(S)-dihydro-40-O-(2-metoxy)etylrapamycín a 32(R)-dihydro-40-O-(2-metoxy)etylrapamycín ako vedľajší produkt.

32(S)-Dihydro-40-O-(2-metoxy)etylrapamycín: *H NMR (CDCI3) 2 : 1 zmes rotamérov, chemické posuny v zátvorkách sa týkajú minoritného rotaméru delta 0,77 (1H, dd, H-38ax), 1,67 (6H, s, C17-CH₃ a C29-CH₃), 2,50 (1H, m, H-31), 3,01 (1H, m, H-25), 3,12 (2H, m, H-39 a H-40), 3,14 (3,15) (3H, s, OCHj), 3,28 (1H, m, H-32), 3,36 (3,34) (3H, s, OCHJ, 3,39 (3H, s, OCH₃), 3,48 (3,46) (3H, s, OCHJ, 3,55 a 3,75 (4H, 2m, OCH₂CH₂O), 3,84 (1H, m, H-14), 3,84 (1H, m, H-14), 4,12 (4,16) (1H, d, H-28), 4,73 (1H, s, C10-OH), 5,03 (1H, m, H-34) MS (FAB) m/z 980 ([M + Li] J

Príklad 5 (32S)-Dihydro-40-O-(2-hydroxy)etylrapamycín (R¹ = metylová skupina; R² = zvyšok všeobecného vzorca (II), v ktorom R³ = 2-hydroxyetylová skupina a R⁴ = metylová skupina; X = hydroxylová skupina, Y = atóm kyslíka)

Analogicky podľa postupu v príklade 4, ale s použitím vhodných východiskových látok, sa získa titulná zlúčenina.

(32S)-dihydro-40-O-(2-hydroxy)etylrapamycín:

’H NMR (CDClj 1,7 : 1 zmes rotamérov, chemické posuny v zátvorkách sa týkajú minoritného rotaméru delta 0,76 (1H, dd, H-38ax), 2,50 (ÍH, m, H-31), 3,10 (1H, m, H-39), 3,13 (3,14) (3H, s, C16-OCHJ, 3,20 (1H, m, H-40), 3,28 (1H, m, H-32), 3,36 (3,38) (3H, s, C27-OCHJ, 3,45 (3,43) (3,41) (3H, s, C39-OCHJ, 3,50 (1H, d, H-27), 3,58 a 3,70 (4H, m, OCH₂CH₂OH), 4,12 (4,16) (1H, d, H-28), 5,06 (1H, m, H-34), 5,60 (1H, dd, H-22), 5,99 (1H, d, H-18), 6,17 (1H, dd, H-21), 6,33 (1H, dd, H-20,6,42, dd, H-19) MS (FAB, Lil matrice) m/z 966 ([M + Li]⁺) (rel. intenzita 100)

Príklad 6

16-Pent-2-inyloxy-32-deoxorapamycín (R¹ = pent-2-inylová skupina; R² = zvyšok všeobecného vzorca (II), v ktorom R³ = atóm vodíka a R⁴ = metylová skupina; X = atóm vodíka, Y = atóm kyslíka)

Analogicky podľa postupov v príkladoch 1 a 2 alebo 3, ale s použitím vhodných východiskových látok, sa získa titulná zlúčenina.

'H NMR (CDClj) delta 0,70 (1H, dd, H-38ax), 1,23 (3H, t, CH₃CH₂CCCH₂O), 2,21 (2H, ddq, CH₃OLCCCH₂0), 2,78 (1H, m, H-25), 2,94 (1H, m, H-39), 3,31 (3H, s, C27-OCHJ, 3,42 (3H, s, C39-OCHJ, 3,62 (1H, d, H-27), 3,78 (1H, ddd, CH₃CH₂CCCH₂O), 4,02 (1H, ddd, CH₃CH₂CCCH₂O), 4,12 (1H, d, H-28), 4,79 (1H, m, H-34), 5,20 (1H, d, H-30), 5,28 (1H, široké d, H-2), 5,50 (1H, dd, H-22), 5,97 (1H, d, H-18), 6,14 (1H, dd, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,38 (1H, dd, H-19)

MS (FAB, Lil matrice) m/z 958 ([M + Li]⁴) (rel. intenzita 100)

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) majú farmaceutickú aktivitu a dajú sa preto upotrebiť ako liečivá.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) majú najmä imunosupresívnu a antiproliferatívnu účinnosť, ako je zrejmé z nasledujúcich testovacích metód in vitro a in vivo.

1. Zmiešaná reakcia lymfocytov (MLR)

Zmiešaná reakcia lymfocytov (Mixed Lymphocyte Reaction, MLR) sa pôvodne vyvinula v súvislosti s alloštepmi, aby sa zistila kompatibilita tkaniva medzi potenciálnymi darcami orgánu a príjemcami, a je to jeden z najlepšie zavedených modelov imunitnej reakcie in vitro. Myší mo del MLR, napríklad ako ho opísal T. Meo v „Immunological Methods“, L. Lefkovits a B. Pemis, Eds., Academic press, N. Y., sir. 227 - 239 (1979), sa použil na preukázanie imunosupresívneho efektu zlúčenín všeobecného vzorca (I). Bunky sleziny (2 x 10^{3 * 5} v jamke) z myší kmeňa Balb/c (samice, 8 až 10 týždňov staré) sa inkubujú na mikrotitračných platniach 5 dní so slezinnými bunkami z myší kmeňa CBA (samice, 8 až 10 týždňov staré) v množstve 0,5 x 10⁶, ožiarených (2000 rad) alebo preparovaných mytomycínom C. Ožiarené alogenetické bunky vyvolávajú proliferatívnu odpoveď v slezinných bunkách z myší Balb/c, čo sa dá merať inkorporáciou značeného prekurzoru do DNA. Po ožiarení (alebo po preparácii mytomycínom C) nereagujú bunky stimulátoru na bunky Balb/c proliferáciou, ale udržiavajú si svoju antigenitu. Antiproliferativny efekt zlúčenín všeobecného vzorca (I) na bunky Balb/c sa meria pri rôznych zriedeniach a vypočítava sa koncentrácia, ktorá vyvoláva 50 % inhibíciu proliferácie buniek (IC₃₀)· Inhibičná kapacita testovanej vzorky sa môže porovnať s rapamycínom a vyjadriť ako relatívna IC₅o (t. j. IC₅₀ skúšanej vzorky : IC₅₀ rapamycínu). Pri zlúčeninách z príkladov 1 a 2 sa zistilo, že majú v tomto teste relatívnu IC₅₀ od 0,3 až do 0,08.

2. Proliferácia prenášaná IL-6 (IL-6 PROL)

Kapacita interferencie zlúčenín všeobecného vzorca (I) s rastovým faktorom asociovaného signálneho pochodu, sa zisťuje použitím hybridnej línie myšacích buniek závislých od interleukínu 6 (IL-6). Test sa uskutočňuje na mikrotitračných platniach s 96 jamkami. Kultivuje sa 5000 buniek/jamka, v médiu bez séra (ako opísal M. H. Schreier a R. Tees v Immunological Methods, I. Lefkovits a B. Pemis, Eds., Academic Press 1981, zv. II, str. 263 - 275), doplnenom 1 ng rekombinantného IL-6/ml. Po 66 hodinách inkubácie v neprítomnosti alebo v prítomnosti skúšanej vzorky sa bunky ožiaria 1 pCi (3-H)-tymidínu/jamka, po ďalších 6 hodinách sa odložia a merajú kvapalinovou scintiláciou. Inkorporácia (3-H)-tymidínu do DNA zodpovedá vzrastu počtu buniek a je preto meradlom proliferácie buniek. Zrieďovacia séria skúšanej vzorky umožňuje výpočet koncentrácie, ktorého výsledkom je 50 % inhibícia proliferácie buniek (1C_5O). Inhibičná kapacita skúšanej vzorky sa môže porovnať s rapamycínom a vyjadriť ako relatívne IC₃₀ (t. j. skúšaná vzorka : IC₅₀ rapamycínu). Zistilo sa, že zlúčeniny z príkladu 1 a 2 majú v tomto teste relatívne IC₃₀ od 0,2 do 0,09.

3. Test väzby na makrofilín (MBA)

O rapamycíne a o štruktúrne blízkej imunosupresívnej látke FK-506 je známe, že sa in vivo viažu na makrofilín-12 (rovnako známy ako bielkovina viažuca FK-506 alebo FKBP-12), a o tejto väzbe sa predpokladá, že má vzťah k imunosupresívnej aktivite spomínaných zlúčenín. Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa tiež pevne viažu na makrofilín-12, ako to ukazuje test kompetitívnej väzby. V tomto teste sa používa FK-506, viazaný na BSA, na zakrytie mikrotitračných jamiek. Rekombinantný ľudský makrofilín-12 s biotínom (biot-MAP) sa nechá viazať v prítomnosti alebo neprítomnosti testovanej vzorky na imobolizovaný FK-506. Po premytí (aby sa odstránil nešpecifický viazaný makrofilín) sa naviazaný biot-MAP zisťuje inkubáciou s konjugátom streptavidínu s alkalickou fosfatázou, potom nasleduje premytie a ďalšia adícia p-nitrofenylfosfátu ako substrátu. OD sa odpočíta pri 405 nm. Výsledkom väzby skúšanej vzorky na biot-MAP je pokles množstva biot-MAP viazaného na FL-506 a tým i pokles OD 405. Zrieďovacia séria skúšanej vzorky umožňuje stanovenie koncentrácie, ktorá spôsobí 50 % inhibíciu väzby biot-MAP na imobilizovaný FK-506 (IC50). Inhibičná kapacita skúšanej vzorky sa porovná s IC50 voľného FK-506 ako štandardu a vyjadruje sa ako relatívne IC₅₀ (t. j. ako IC₅₀ skúšanej vzorky: IC₅₀ voľného FK-506). V tomto teste sa zistilo, že zlúčeniny z príkladov 1, 2 a 5 majú relatívne IC501, 2,8 a 2,5.

4. Lokalizovaná reakcia štepu proti príjemcovi (GvH)

Účinnosť zlúčenín všeobecného vzorca (I) in vivo sa preukazuje na vhodnom modelovom zvierati, ako napríklad opísal Ford a kol., IRANSPLANTATION 10 (1970) 258. Bunky sleziny (1 x 10⁷) zo 6 týždňov starých krysích samíc kmeňa Wistar/Furth (WF) sa podkožné injikujú v deň 0 do ľavej zadnej labky krysích samíc kmeňa F344 x WF/F_b s hmotnosťou asi 100 g. Injekcie sa zvieratám dávajú 4 dni po sebe a 7. deň sa odoberú popliteálne lymfatické uzliny a odvážia. Rozdiely v hmotnosti medzi obidvoma lymfatickými uzlinami slúžia ako parameter na vyhodnotenie reakcie.

5. Reakcia aloštepov obličiek pri kryse

Jedna oblička z darcovskej krysy kmeňa DA(RT1²) alebo Brown-Norway (BN) (RD”) sa transplantuje do renálnej cievy jednostranne (vľavo) nefrektomovanej krysy - príjemcu (Lewis RT1¹), s použitím anostomózy zošitím koncami k sebe. Anostomóza močovodu sa urobí rovnako. Medikácia začína dňom transplantácie a pokračuje počas 14 dní. Kontralaterálna nefrektómia sa uskutoční 7 dní po transplantácii, pričom príjemca je odkázaný na funkciu darcovej ľadviny. Prežitie príjemcu štepu slúži ako parameter na funkčný štep.

6. Experimentálne vyvolaná alergická encefalomyelitída (EAE) pri kryse

Účinnosť zlúčenín všeobecného vzorca (I) pri EAE sa meria napríklad postupom, ktorý opísali Levine a Wenk, AMER. J. PATH. 47 (1965) 61; McFarlin a kol., J. IMMUNOL. 113 (1974) 712; Borel, TRANSPLANT. and CL1N. IMMUNOL 13 (1981) 3. EAE je široko prijímaný model roztrúsenej sklerózy. Samce kmeňa Wistar dostávajú do zadných labiek injekcie zmesi miechy s kompletným Freundovým adjuvans. Symptómy ochorenia (paralýza chvostu a obidvoch zadných labiek) sa zvyčajne vyvinú v priebehu 16 dní. Počet chorých zvierat, ako i čas začiatku ochorenia, sa zaznačí.

Ί. Artritis s Freundovým adjuvans

Je opísaná účinnosť proti experimentálne vyvolanej artritíde s použitím postupu, ktorý napríklad opísali Winter a Nuss, ARDHRITIS and RHEUMATTSM 9 (1966) 394; Billingham a Davics, HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACOL (Vane and Ferreira EDS., Springer - Verlag, Berlín) 50/II (1979) 108 - 144. Krysy kmeňa Wistar a OFA (samce alebo samice, 150 g telesnej hmotnosti) dostávajú podkožné injekcie do začiatku chvostu alebo do zadnej labky, s 0,1 ml minerálneho oleja, ktorý obsahuje 0,6 mg lyofilizovaného, teplom usmrteného mikroorganizmu Mycobacterium smegmatis. Pri vývoji modelovej artritídy sa medikácia začne ihneď po injekcii adjuvans (dni 1 až 18); v preukázanom modele artritídy sa medikácia začne 14. deň, kedy je sekundárny zápal dobre vyvinutý (dni 14 až 20). Na konci pokusu sa edém kĺbov meria posuvným mikromeradlom. ED₅₀ je perorálna dávka v mg/kg, ktorá zmenší edém (primárny alebo sekundárny) na polovičnú hodnotu kontroly.

8. Protinádorová aktivita a aktivita MDR

Protinádorová aktivita zlúčenín všeobecného vzorca (I) a ich schopnosť zvýšiť účinnosť protinádorovo aktívnych látok znížením mnohopočetnej liekovej rezistencie je demonštrovaná napríklad podávaním protinádorovo aktívnej látky, napríklad kolchicínu alebo etoposidu, bunkám s mnohopočetnou liekovou rezistenciou, ako i bunkám citlivým na liečivá, in vitro alebo zvieratám, ktoré majú mnohopočetnú liekovú rezistenciu alebo citlivosť na liečivá pri svojich nádoroch alebo infekciách, so súčasným podávaním alebo bez súčasného podávania zlúčenín všeobecného vzorca (I), ktoré sa majú testovať a podávaním zlúčenín všeobecného vzorca (I) samotných.

Takéto testovanie in vitro sa uskutočňuje s použitím vhodnej rezistentnej bunkovej línie a kontrolnej (parenterálne) bunkovej línie, generovanej napríklad tak, ako opísali Líng a kol., J. Celí. Physiol. 83, 103 - 116 (1974) a Bech - Hansen a kol., J. Celí. Physiol. 88. 23 - 32 (1976). Určité vybrané klony sú mnohopočetné liekovo rezistentné (napríklad rezistentné proti kolchicínu) línia CHR (subklon C5S3.2) aparenterálna senzitívna línia AUX BI SI 1).

In vivo sa protinádorová a anti-MDR aktivita preukazuje napríklad pri myšiach, ktorým sa injikujú mnohopočetné liekové rezistencie a na lieky senzitívne rakovinové bunky. Sublínia Ehrlichovho ascitického karcinómu (EA), ktoré sú rezistentné proti substanciám DR, VC, AM, ET, TE alebo CC, sa vyvíjajú postupným prenášaním buniek EA následným generáciám hostiteľských myší kmeňa BALB/c, v súhlase s metódou, ktorú opísal Slater a kol., J. Clin. Invest. 70.1131 (1982).

Rovnocenné výsledky sa môžu získať pri použití zlúčenín všeobecného vzorca (I) v skúšobných modeloch porovnateľného vzoru, napríklad in vitro, prípadne s použitím skúšobných zvierat, infikovaných mnohopočetné liekovo rezistentnými a senzitívnymi kmeňmi vírusov, bakteriálnymi kmeňmi rezistentnými proti antibiotikám (napríklad penicilínu), antimykoticky rezistentnými a citlivými kmeňmi húb a tiež kmeňmi protozoí, ktoré sú rezistentné proti liekom, ako sú napríklad kmene Plasmodií, napríklad prírodné sa vyskytujúce podkmene Plasmodium falciparum, ktoré majú získanú rezistenciu proti chemoterapeutikám a antimalarikám.

9. Inhibícia Mip a faktorov podobných Mip

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) navyše viažu a blokujú rôzne druhy Mip (macrofage infectivity potentiator) a faktory podobné Mip, ktoré sa štruktúrne podobajú makrofilínu. Mip a faktory podobné Mip, sú virulentné faktory, ktoré sú produkované celým radom patogénov, vrátane rodov Chlamidia, napríklad Chlamidia trachomatis; Neisseria, napríklad Neisseria meningitidis; a Legionella, napríklad Legionella pneumophilia; a taktiež obvyklými parazitickými členmi radu Rickettsiales. Tieto faktory hrajú kritickú úlohu pri vytváraní intracelulámej infekcie. Účinnosť zlúčenín všeobecného vzorca (I) pri redukcii infekčnej aktivity patogénov, ktoré produkujú Mip alebo faktory podobné Mip, sa dá preukázať porovnávaním infekčnej aktivity patogénov v bunkovej kultúre v prítomnosti a neprítomnosti makrolidov, napríklad s použitím metód, ktoré opísal Lundemose akol., Mol. Microbiol. (1993) 7: 777.

10. Chronická rejekcia aloštepov

Oblička krysieho samca kmeňa DA (RT1²) sa ortotopicky transplantuje do príjemcu, krysieho samca kmeňa Lewis (RT1¹). Celkovo sa transplantuje do 24 zvierat. Všetkým zvieratám sa podáva cyklosporín A perorálne v dávke

7,5 mg/kg/deň, počas 14 dní, začínajúc dňom transplantá cie, aby sa predišlo akútnej celulámej.rejekcii. Kontralaterálna nefrektómia sa neuskutočňuje. Každá pokusná skupina, ktorej sa podávajú rôzne dávky zlúčenín všeobecného vzorca (I) alebo placebo, pozostáva zo 6 zvierat. Počínajúc dňom 53 - 64 po transplantácii dostávajú zvieratá - príjemcovia perorálne počas ďalších 69 - 72 dní zlúčeniny všeobecného vzorca (I) alebo placebo. Za 14 dní po transplantácii sa zvieratá podrobia hodnoteniu štepu pôsobením magnetickej rezonancie (MRI) s meraním perfúzie obličiek (s porovnaní štepovanej obličky a vlastnej kontralaterálnej obličky). To sa opakuje 53 - 64 dní po transplantácii a na konci pokusu. Zvieratá sa potom pitvajú. Parametre rejekcie, ako je skóre MRI, relatívna rýchlosť perfúzie štepovanej obličky a histologické skóre aloštepu obličky na celulámu rejekciu a zmeny ciev sa určia a štatisticky analyzujú. Podávanie zlúčeniny všeobecného vzorca (I), napríklad zlúčeniny podľa príkladu 1 alebo 2, v dávke od 0,5 do

2,5 mg/kg v tomto modeli aloštepu obličky vyvoláva zníženie vo všetkých spomenutých parametroch rejekcie.

11. Angioplastika

Uskutoční sa katetrizácia balónkom v deň 0, v podstate tak, ako opísal Powell a kol. (1989). Pri anestézii Izofluranom sa katéter Fogarty 2F zavedie do ľavej artéria carotis communis cez vonkajšiu karotídu a nafúkne (rozšírenie = = 10 μΐ vody). Nafúknutý balónik sa pretiahne tri razy po dĺžke carotis communis, naostatok dva razy s jemným otáčaním, aby sa rovnomerne odstránil endotel. Katéter sa potom vyberie, okolo karotídy sa upraví ligatúra, aby sa predišlo krvácaniu a zvieratá sa nechajú zotaviť.

Dve skupiny po 12 krysách kmeňa RoRo (hmotnosť 400 g, asi 24 týždňov staré) sa použijú na štúdiu: prvá kontrolná skupina a druhá skupina, ktorá dostáva skúšanú zlúčeninu. Krysy sa vyberajú náhodne v priebehu celej manipulácie, experimentálnych procedúr a analýz.

Skúšané zlúčeniny sa podávajú perorálne 3 dni pred poškodením balónkom (deň -3) až do konca štúdie, 14 dní po poškodení balónkom (deň -14). Krysy sú umiestené v samostatných kleciach s prístupom ku krmivu a vode ad libitum. Krysy sa anestézujú Izofluranom, perfuzny katéter sa zasunie cez ľavú komoru a zaistí v ľavom oblúku aorty a aspiračná kanyla sa zasunie do pravej komory. Zvieratá sa perfundujú perfuznym tlakom 150 mm Hg, najskôr počas 1 minúty 0,1 M roztokom chloridu sodného s fosfátovým pufrom (PBS, pH 7,4) a potom počas 15 minút 2,5 % glutaraldehydom vo fosfátovom pufre (pH 7,4). Perfúzny tlak je 150 mm Hg na hrote kanyly (asi 100 mm Hg v karotíde, ako sa zistilo v predchádzajúcom pokuse zavedením kanyly, spojenej s prevádzačom tlaku do vonkajšej karotídy). Karotidy sa potom vyrežú, oddelia od okolného tkaniva, vložia do 0,1 M kakodylového pufru (pH 7,4) s obsahom 7 % sacharózy a inkubujú cez noc pri 4 °C. Nasledujúci deň sa karotídy ponoria do 0,05 % roztoku manganistanu draselného v 0,1 M kakodylovom pufre a trepú 1 hodinu pri izbovej teplote, potom sa dehydratujú etanolom 2x 10 minút v 75 %, 2x 10 minút v 85 %, 3x 10 minút v 95 % a 3x 10 minút v 100 % etanole. Dehydratované karotídy sa potom uložia do Tcchnovitu 7100 podľa odporúčania výrobcu. Úložné médium sa nechá polymérovať cez noc v exsikátore v atmosfére argónu, pretože kyslík inhibuje správne tvrdenie blokov.

Rezy s hrúbkou 1 až 2 pm sa odkroja zo strednej časti každej karotídy tvrdým kovovým nožom na rotačnom mikrotome a zafarbia sa 2 minúty Giemsovým farbivom. Asi 5 rezov z každej karotídy sa takto preparuje a stredný areál médie, neointimy a lumen sa morfometricky hodnotí pomocou zobrazovacieho analytického systému (MCID, To ronto, Kanada). V tomto teste zlúčeniny všeobecného vzorca (I), napríklad zlúčenina z príkladu 1 alebo 2, inhibujú myointimálnu proliferáciu, keď sa podávajú perorálne v denných dávkach 0,5 do 2,5 mg/kg.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sú tiež upotrebiteľné v testoch pri hľadaní prítomnosti alebo množstva zlúčenín, ktoré viažu makrofílín, napríklad v kompetitívnych testoch na účely diagnózy alebo skríningu. V inej forme sa vynález týka použitia zlúčenín všeobecného vzorca (I) ako pomôcok pri skríningu zisťovania prítomnosti zlúčenín, ktoré sa viažu na makrofílín v skúšanom roztoku, napríklad v krvi, krvnom sére alebo v testovacej pôde. Výhodne je zlúčenina všeobecného vzorca imobilizovaná v mikrotitračných jamkách, aby sa mohla viazať v prítomnosti alebo neprítomnosti testovacieho roztoku na značený makrofílín-12 (FKBP-12). Alternatívne FKBP-12 imobilizovaný v titračných jamkách, aby sa mohol viazať v prítomnosti alebo neprítomnosti testovacieho roztoku na zlúčeninu všeobecného vzorca (I), ktorá sa značila, napríklad fluórom, enzymaticky alebo ožarovaním, napríklad na zlúčeninu všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ je značkovacia skupina. Platne sa umyjú a odmeria sa množstvo viazanej značenej zlúčeniny. Množstvo látky viažucej makrofílín v testovacom roztoku je zhruba nepriamo úmerné množstvu viazanej značenej zlúčeniny. Na kvantitatívnu analýzu sa zostrojí štandardná krivka s využitím známych koncentrácií zlúčeniny viažucej makrofílín.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sú teda upotrebiteľné za týchto podmienok:

a) Liečenie a prevencia akútnej alebo chronickej rejekcie transplantovaného orgánu alebo tkaniva, napríklad pri liečení príjemcov transplantátu, napríklad srdca, pľúc, kombinácie srdce - pľúca, pečene, obličiek, pankreasu, kože alebo rohovky. Sú tiež indikované pri prevencii choroby odmietnutia štepu príjemcom, aká nasleduje po transplantácii kostnej drene.

b) Liečenie a prevencia transplantačnej vaskulopatie, napríklad aterosklerózy.

c) Liečenie a prevencia proliferácie buniek hladkého svalstva a migrácie, vedúcej k vnútornému zosileniu ciev, obštrukcii ciev, obštrukčnej koronárnej ateroskleróze, restenóze.

d) Liečenie a prevencia autoimunitných ochorení alebo zápalových stavov, ktorých etiológia zahŕňa autoimunitnú zložku, ako je artritída (napríklad reumatoidná artritída, progresívna chronická artritída a arthritis deformans) a reumatické ochorenia. Špecifické autoimunitné ochorenia, proti ktorým sa zlúčeniny všeobecného vzorca (I) môžu používať, zahŕňajú autoimunitné hematologické poruchy (vrátane napríklad hemolytickej anémie, aplastickej anémie, čistej anémie červených krviniek a idiopatickej trombocytopénie), systémový lupus erythematosus, polychondritídu, sklerodermu, Wegenerovu granulamatózu, dermatomyozitídu, chronickú aktívnu hepatitídu, myasténiu gravis, psoriázu, Steven - Johnsonov syndróm, idiopatický maladsorpčný syndróm, autoimunitné zápalové ochorenia čriev (vrátane napríklad ulceratívnej kolitídy a Crohnovej choroby), endokrinnú ofialmopatiu, Gravesovu chorobu, sarkoidózu, mnohopočetnú sklerózu, primárnu cirhózu žlčníka, juvenilný diabetes, (diabetes mellitus typu I), uveitis (predný a zadný), keratokonjuktivitídu (suchú a vemálnu), intersticiálnu pľúcnu fibrózu, psoriatickú artritídu, glumerulonefŕitídu (s nefŕotickým syndrómom a bez neho, napríklad vrátane idiopatického nefntického syndrómu a bez neho, alebo nefropatiu s minimálnou zmenou) a juvcnilnej dermatomyositídy.

e) Liečenie a prevencia astmy.

f) Liečenie mnohopočetnej liekovej rezistencie (MDR). Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) potláčajú P-glykoproteíny (Pgp), čo sú prenosové molekuly membrán blízke MDR. MDR je predovšetkým problematická u pacientov s rakovinou a AIDS, ktorí nereagujú na bežnú chemoterapiu, pretože sa liečivo vyplavuje z buniek pomocou Pgp. Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sú preto upotrebiteľné na zvýšenie účinnosti ďalších chemoterapeutík pri liečení a kontrole podmienok mnohopočetnej liekovej rezistencie, ako je mnohopočetné liekovo rezistentná rakovina alebo AIDS.

g) Liečenie proliferatívnych porúch, napríklad nádorov, hyperproliferatívnych porúch pokožky a pod.

h) Liečenie fungálnych infekcií.

i) Liečenie a prevencia zápalov, najmä potenciáciou steroidov.

j) Liečenie a prevencia infekcií, najmä infekcií patogénmi, ktoré majú Mip alebo Mip podobné faktory.

Pre uvedené indikácie sa potrebné dávkovanie môže samozrejme meniť, napríklad v závislosti od stavu, ktorý sa má liečiť (napríklad od typu ochorenia a povahy rezistencie), od žiadúceho účinku a od spôsobu podávania. Všeobecne sa dajú dosiahnuť uspokojivé výsledky pri perorálnom podávaní dávok od 0,05 do 5 alebo až do 10 mg/kg/deň, napríklad od 0,1 do 2 alebo až do

7,5 mg/kg/deň, aplikovaných jednou alebo delenými dávkami, 2x až 4x denne, alebo pri parenterálnom podávaní, napríklad intravenózne, a to intravenóznou injekciou alebo infúziou, v dávkach od 0,01 do 2,5 až do 5 mg/kg/deň, napríklad od 0,05 alebo 0,1 až do 1,0 mg/kg/deň. Vhodné denné dávky pre pacientov sú teda zvyčajne 500 mg perorálne, napríklad v rozmedzí od 5 do 100 mg perorálne alebo v rozmedzí od 0,5 do 125 až do 250 mg intravenózne, napríklad v rozmedzí od 2,5 do 50 mg intravenózne.

Alternatívne a neraz výhodne je dávkovanie usporiadané špecificky pre pacienta, aby sa zistila najnižšia hladina v krvi, napríklad stanovením technikou RIA. Takto sa dá upraviť dávkovanie pre pacienta tak, aby sa dosiahla pravidelná neprerušovaná hladina v krvi, ako sa odmeralo pomocou RIA v rozmedzí od 50 alebo 150 do 500 alebo 1000 ng/ml, t. j. analogicky podľa metód dávkovania bežne používaných pri imunosupresívnej terapii cyklosporínom.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa môžu podávať ako jediná aktívna zložka alebo spolu s inými liečivami. Napríklad pri imunosupresívnej aplikácii, ako je prevencia a liečenie choroby odmietnutia štepu príjemcom, rejekcie transplantátu alebo autoimunitné ochorenie, by sa zlúčeniny všeobecného vzorca (I) mohli užívať v kombinácii s cyklosporínmi alebo askomycínmi, alebo s ich imunosupresívnymi analógmi, napríklad cyklosporínom A, cyklosporínom G, FK-506 a pod., ďalej sú možné kortikosteroidy, cyklofosfamid, azatioprín, metotrexat, brequinar, leflunomid, mizoribín, kyselina mykofenolová, mykofenolát mofetil, imunosupresívne monoklonálne protilátky, napríklad monoklonálne protilátky receptorov leukocytov, napríklad MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, CTLA4, B7, CD-45 alebo CD58 alebo ich ligandy, alebo ďalšie imunomodulačné zlúčeniny. Pri protizápalových aplikáciách sa môžu zlúčeniny všeobecného vzorca (I) užívať s protizápalovo účinnými látkami, napríklad kortikosteroidmi. Pri protiinfekčných aplikáciách sa zlúčeniny všeobecného vzorca (I) môžu podávať v kombinácii s inými protiinfekčne účinnými látkami napríklad protivírusovo účinnými liečivami alebo antibiotikami.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa podávajú akoukoľvek zvyčajnou cestou, najmä enterálne, napríklad perorálne, napríklad v podobe roztokov alebo nápojov, tabliet alebo toboliek, alebo parenterálne, napríklad v podobe injikovateľných roztokov alebo suspenzií. Vhodné jednotkové dávkovacie formy na perorálne podávanie obsahujú napríklad od 1 do 50 mg zlúčeniny všeobecného vzorca (I), zvyčajne 1 až 10 mg. Farmaceutické kompozície, ktoré obsahujú zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa dajú vyrábať bežným spôsobom, napríklad analogicky ako farmaceutické kompozície obsahujúce rapamycín, ako sa opísalo napríklad v spise EPA 0 041 795.

Farmaceutické kompozície výhodne obsahujú niektorú zlúčeninu všeobecného vzorca (I) a nosné prostredie, ktoré obsahuje hydrofilnú fázu, lipofilnú fázu a namáčadlo. Môžu byť vo forme emulzie alebo predkoncentrátu emulzie. Takéto emulzie alebo predkoncentráty emulzií sa uvádzajú napríklad v britskej patentovej prihláške č. 2 278 780 A. Lipofilná fáza obsahuje výhodne 10 až 85 % hmotn. nosného média, namáčadlo obsahuje 5 až 80 % nosného média, hydrofilná faza obsahuje 10 až 50 % hmotn. nosného média. Zlúčenina všeobecného vzorca (I) sa nachádza výhodne v množstve od 2 do 15 % hmotn.

Zvlášť výhodná farmaceutická kompozícia pozostáva z nosného média v podobe mikroemulzného predkoncentrátu, ktorý obsahuje:

i) reakčný produkt ricínového oleja s etylénoxidom, ii) produkt transesterifikácie rastlinného oleja glycerolom, ktorý obsahuje prevažne kyselinu linolovú alebo kyselinu olejovú, mono-, di- a triglyceridy alebo polyoxyalkylovaný rastlinný olej, iii) 1,2-propylénglykol a iv) etanol.

V súlade s predchádzajúcim sa tento vynález teda týka:

A. zlúčeniny všeobecného vzorca (I) ako liečiva, napríklad pri prevencii alebo liečení uvedených porúch;

B. farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (I) v kombinácii s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom;

C. metódy prevencie alebo liečenia porúch, ako sa uvádza skôr, pri subjekte, ktorý takéto opatrenie potrebuje, metóda, ktorá zahŕňa podávanie účinného množstva zlúčeniny všeobecného vzorca (I) spomínanému objektu;

D. výbavy alebo balenia na použitie pri imunosupresii, zápale alebo infekciách, ako sa uvádza skôr, obsahujúce farmaceutickú kompozíciu, ktorá obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (I) a farmaceutickú kompozíciu, pozostávajúcu či už z imunosupresívneho liečiva alebo z protizápalovo, alebo protiinfekčne účinnej látky.

Prekvapivo sa zistilo, že zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom X znamená hydroxylovú skupinu, t. j. 32(S)-dihydro-zlúčeniny majú vyššiu aktivitu, napríklad v uvedených testoch a sú omnoho stabilnejšie ako zodpovedajúce enantioméry, t. j. 32(R)-dihydrozlúčeniny, ak sa napríklad podrobia tomuto testu: testované zlúčeniny sa inkubujú v krysom sére a ich väzná afinita k FKBP12 sa meria testom MBA v rôznom čase inkubácie. Keď afinita klesá, nominálne IC₅o stúpa. Pokles afinity sa všeobecne prisudzuje nestabilite zlúčeniny v krysom sére.

Priemyselná využiteľnosť

Nové zlúčeniny všeobecného vzorca (I), ktoré sa môžu pripravovať spôsobom podľa tohto vynálezu, predstavujú významnú skupinu liečiv, vhodných na aplikáciu pri mnohých ochoreniach, resp. poruchách, ako sú napríklad rejekcíe transplantátov, proliferatívne poruchy, zápaly, infekčné choroby a mnoho iných.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Derivát rapamycínu všeobecného vzorca (I) v ktorom

   R¹ je alkylová skupina, alkenylová skupina, alkinylová skupina, hydroxyalkylová skupina, hydroxyalkenylová skupina, hydroxyalkinylová skupina, benzylová skupina, alkoxybenzylová alebo chlórbenzylová skupina,

   R² predstavuje buď všeobecný vzorec (II), alebo všeobecný vzorec (III) (III (III) kde

   R³ je vybraný zo súboru, ktorý zahŕňa atóm vodíka, alkylovú skupinu, alkenylovú skupinu, alkinylovú skupinu, arylovú skupinu, tioalkylovú skupinu, arylalkylovú skupinu, hydroxyarylalkylovú skupinu, hydroxyarylovú skupinu, hydroxyalkylovú skupinu, dihydroxyalkylovú skupinu, hydroxyalkoxyalkylovú skupinu, hydroxyalkylarylalkylovú skupinu, dihydroxyalkylarylalkylovú skupinu, alkoxyalkylovú skupinu, alkylkarbonyloxyalkylovú skupinu, aminoalkylovú skupinu, alkylaminoalkylovú skupinu, alkoxykarbonylaminoalkylovú skupinu, alkylkarbonylaminoalkylovú skupinu, arylsulfonamidoalkylovú skupinu, alylovú skupinu, dihydroxyalkylalylovú skupinu, dioxolanylalylovú skupinu, karbalkoxyalkylovú skupinu a alkylsilylovú skupinu;

   R⁴ znamená atóm vodíka, metylovú skupinu alebo s R³ tvoria alkylénový reťazec s 2 až 6 atómami uhlíka;

   R⁵ znamená skupinu R⁶O-CH₂-, v ktorej R⁶ je vybraný zo súboru, ktorý zahŕňa atóm vodíka, alkylovú skupinu, alkenylovú skupinu, alkinylovú skupinu, arylovú skupinu, alkylkarbonylovú skupinu, arylkarbonylovú skupinu, heteroarylkarbonylovú skupinu, hydroxyalkylkarbonylovú skupinu, aminoalkylkarbonylovú skupinu, formylovú skupinu, tioalkylovú skupinu, arylalkylovú skupinu, hydroxyarylalkylovú skupinu, hydroxyarylovú skupinu, hydroxyalkylovú skupinu, dihydroxyalkylovú skupinu, hydroxyalkoxyalkylovú skupinu, hydroxyalkylarylalkylovú skupinu, dihydroxyalkylarylalkylovú skupinu, alkoxyalkylovú skupinu, alkylkarbonyloxyalkylovú skupinu, aminoalkylovú skupinu, alkylaminoalkylovú skupinu, alkoxykarbonylaminoalkylovú skupinu, alkylkarbonylaminoalkylovú skupinu, arylsulfonamidoalkylovú skupinu, alylovú skupinu, dihydroxyal

   SK 284529 Β6 kylalylovú skupinu, dioxolanylalylovú skupinu a karbalkoxyalkylovú skupinu; skupinu R⁷CO-, v ktorej R⁷ je vybraný zo súboru, ktorý zahŕňa atóm vodíka, alkylovú skupinu, hydroxylová skupinu, alkoxylovú skupinu, aryloxylovú skupinu, amínovú skupinu, alkylamínovú skupinu, zvyšok aminokyseliny alebo Ν,Ν-disubstituovanú aminoskupinu, v ktorej substituenty sú (a) vybrané zo súboru, ktorý zahŕňa alkylovú skupinu, arylovú skupinu alebo arylalkylovú skupinu, alebo (b) tvorí heterocyklickú štruktúru; skupinu R⁸NCH-, v ktorej R⁸ je alkylovú skupina, arylová skupina, aminová skupina, alkylamínovú, skupina, arylamínová skupina, hydroxylová skupina, alkoxylovú skupina alebo arylsulfonylamínová skupina; skupinu -0-CH-0-; alebo substituovanú dioxymetylynovú skupinu;

   Y znamená atóm kyslíka, alebo (atóm vodíka a hydroxylovú skupinu) a (atóm vodíka a skupinu OR⁹), v ktorej R⁹ je vybraný zo súboru, ktorý zahŕňa alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, alkylkarbonylovú skupinu, arylkarbonylovú skupinu, heteroarylkarbonylovú skupinu, hydroxyalkylkarbonylovú skupinu, aminoalkylkarbonylovú skupinu, formylovú skupinu alebo arylovú skupinu;

   a

   X znamená hydroxylová skupinu alebo atóm vodíka; pričom „alk“ alebo „alkyl“ sa týka alifatického substituentu s 1 až 10 atómami uhlíka, prípadne prerušeného kyslíkovou väzbou; a „ar“ alebo „aryl“ sa týka monocyklického, prípadne heterocyklického, prípadne substituovaného aromatického substituentu so 4 až 14 atómami uhlíka, s tou podmienkou, že ak X je hydroxylová skupina, R¹ znamená alkylovú skupinu a R² je zvyšok všeobecného vzorca (II), potom R³ je iný ako atóm vodíka.
2. 2. Derivát rapamycínu všeobecného vzorca (la) v ktorom

   R¹ znamená alk-2-inylovú skupinu s 3 až 10 atómami uhlíka alebo hydroxyalk-2-inylovú skupinu s 3 až 10 atómami uhlíka,

   R² je zvyšok všeobecného vzorca (II) alebo (III), definovaný v nároku 1 a Y znamená atóm kyslíka.
3. 3. Derivát rapamycínu všeobecného vzorca (Ib) v ktorom

   R¹ znamená alkylovú skupinu s 1 až 10 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 3 až 10 atómami uhlíka, hydroxyalkenylovú skupinu s 3 až 10 atómami uhlíka, alk-2-inylovú skupinu s 3 až 10 atómami uhlíka, hydroxyalk-2-inylovú s 3 až 10 atómami uhlíka alebo alkoxyalkylovú skupinu s 1 až 10 atómami uhlíka v alkoxylovej časti a s 1 až 10 atómami uhlíka v alkylovej časti,

   R² je zvyšok všeobecného vzorca (II) alebo (III), definovaný v nároku 1 a Y znamená atóm kyslíka.
4. 4. Derivát rapamycínu, ktorým je 16-pent-2-inyloxy-32(S)-dihydrorapamycín alebo 16-pent-2-inyloxy-32(S)-dihydro-40-O-(2-hydroxyetyl)-rapamycín.
5. 5. Derivát rapamycínu, ktorým je 32-deoxorapamycín alebo 16-pent-2-inyloxy-32-deoxorapamycín.
6. 6. Spôsob prípravy derivátu rapamycínu všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa

   a) pripravuje zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom X značí atóm vodíka, redukčnou elimináciou karbonylovej skupiny v polohe 32 pri zlúčenine všeobecného vzorca (IVa) v ktorom R¹, R² a Y majú význam definovaný skôr, v chránenej alebo nechránenej forme, a ak je to žiaduce, odstránením prítomných ochranných skupín; alebo že sa

   b) pripravuje zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom X značí hydroxylová skupinu, stereoselektívnou redukciou karbonylovej skupiny v polohe 32 pri zlúčenine všeobecného vzorca (IVa) definovanej skôr, alebo že sa

   c) konvertuje zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ znamená alkylovú skupinu, tak, aby sa získala zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ je iný ako alkylová skupina.
7. 7. Derivát rapamycínu podľa niektorého z nárokov 1 až 5 na použitie ako liečivo.
8. 8. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje derivát rapamycínu podľa niektorého z nárokov 1 až 5, v kombinácii s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.
9. 9. Súprava alebo balenie na použitie pri imunosupresii, zápale alebo infekciách obsahujúce farmaceutickú kompozíciu, ktorá pozostáva z derivátu rapamycínu podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a farmaceutickú kompozíciu, ktorá pozostáva z imunosupresívneho alebo imunomodulačného liečiva alebo z protizápalovo, alebo protiinfekčne účinnej látky.