FI113051B - Rapamysiinijohdannaisia - Google Patents

Description

i 113051

RAPAMYSIINIJOHDANNAISIA

Keksintö koskee rapamysiinijohdannaisia, menetelmää niiden valmistamiseksi, niiden käyttöä valmistettaessa lääkeaineita ja niitä sisältäviä far-5 maseuttisia seoksia.

Rapamysiini on tunnettu Streptomyces hygros-copicuksen tuottama makrolidiantibiootti, jolla on kaavassa A kuvattu rakenne: 10 41 «"Λ· I « I 37 \ se •fVVtV <A) 15 ° ioJLoh ^ 11» O 0 24 " 7 I U 20 22 „/ 13 15 I 19 21 £ 20

Ks. esim.. McAlpine J.B. et ai., J. Antibiotics 44, 688, (1991), Screiber S.L. et ai., J. Am.

: Chem. Soc 113, 7433 (1991), patentti U.S. 3,929,992.

: 25 (Rapamysiinilie on ehdotettu lukuisia erilaisia nume- rointikaavioita. Sekaannuksen välttämiseksi, kun tiet-‘ _ tyjä rapamysiinijohdannaisia mainitaan tässä hakemuk- sessa, nimet ilmoitetaan viittaamalla rapamysiiniin käyttäen kaavan A numerointikaaviota.) Rapamysiini on 30 voimakas immunosupressiivinen aine ja sillä on osoi-tettu olevan kasvaimia ja sieniä ehkäisevä vaikutus. '*·' Sen käyttöä lääkeaineena rajoittaa kuitenkin sen hyvin alhainen ja vaihteleva määrä, jota keho voi käyttää • » hyväksi. Lisäksi rapamysiini on liukenematon ja siltä t;i 35 puuttuu stabiilius, mikä tekee vaikeaksi formuloida ’*’ ‘ stabiileja galeenisia seoksia.

...’ Tunnetaan useita rapamysiinin johdannaisia.

2 113051

Tiettyjä 40-O-substituoituja rapamysiineja on kuvattu esim. patenttijulkaisuissa U.S. 5,258,389 ja WO 94/09010 (O-alkyylirapamysiineja); WO 92/05179 (kar-boksyylihapon estereitä) , U.S. 5,118,677 (amidi-5 estereitä), U.S. 5,118,678 (karbamaatteja) , U.S. 5,100,883 (fluorattuja estereitä), U.S. 5,151,143 (asetaaleja) ja U.S. 5,120,842 (silyylieettereitä).

Nyt on yllättävästi keksitty, että tietyillä uusilla rapamysiinin johdannaisilla on parantunut far-10 makologinen profiili rapamysiiniin verrattuna ja ne omaavat suuremman stabiiliuden.

Keksinnön mukaisesti tuotetaan kaavan I yhdiste 2 0 ° o , °H j , : . 25 i » t !. ' jossa *ji(* Ri on Ci.10alkyyli, C3-i0alkynyyli tai hydroksi-C2-io~ ‘ alkynyyli, 30 R2 on radikaali, jolla on kaava II: ··/ /

O

35

:Kaava II

3 113051 joissa R3 valitaan ryhmästä: H, Ci-4-alkyyli, hydroksi-C2-6-alkyyli, hydroksi-Ci-6-alkoksi-C2-6-alkyyli tai Ci-6-alkoksi-C2_6-alkyyli; 5 R4 on metyyli; Y on O; X on OH tai H; edellyttäen, että X:n ollessa OH Ri on muu kuin Ci-io -alkyyli.

10 Kaavan I yhdisteissä seuraavat merkitykset ovat edullisia joko yksittäin tai missä tahansa yhdistelmässä tai alayhdistelmässä: 1. X on OH ja Rx on C3-i0alkynyyli tai C3-i0hydroksi-alkynyyli, edullisesti C3-i0alk-2-ynyyli tai C3-i0hyd- 15 roksialk-2-ynyyli, edullisemmin C3.6alk-2-ynyyli.

2. X on H ja Ri on Ci-i0alkyyli, C3-i0alk-2-ynyyli, tai C3-i0hydroksialk-2-ynyyli, edullisesti Ci-6alkyyli tai C3-6alk-2-ynyyli, edullisemmin Ci-4alkyyli, edullisimmin metyyli; 20 3. C3.6alkynyyli R!:nä on 2-propynyyli tai pent-2- ynyyli, edullisemmin pent-2-ynyyli; 4. Y on O; • 5 . R2 on kaavan II j äännös; , , 6. Kaavan II jäännöksessä R3 on H, hydroksi-Ci- * » , ·;1, 25 6alkoksi-C2-6alkyyli, tai Ci_6alkoksi-C2-6alkoksi, edul- h . lisesti H, hydroksietyyli, hydroksipropyyli, hydrok- j, '1 sietoksietyyli tai metoksietyyli; H erityisesti X:n : “ ollessa H tai X:n ollessa OH ja Ri:n ollessa alkynyy- • · li; 30 7. Kaavan II jäännöksessä R4 on metyyli; : ' : Edullisia yhdisteitä ovat kaavan Ia • 1 » · I » • I » 1 · • » · • · · I | » 4 113051 yhdisteet, jossa Ri = C3-i0-alk-2-ynyyli; R2. ,on edellä määritetyn kaavan II jäännös ja Y on O, saavat 15 edullisesti edellä kohdissa 1 ja 3-8 ilmoitetut edulliset merkitykset; j a kaavan Ib *. -

i Y

, 25 |T 2 « t · 30 yhdisteet, jossa Ri on C3-i0alk-2-ynyyli, R2 on edellä | määritetyn kaavan II jäännös ja Y on O, edullisesti saavat edellä kohdissa 2-8 ilmoitetut edulliset merki-. tykset.

' ; Erityisen edullisiin yhdisteisiin kuuluvat: 35 (i) 32-deoksorapamysiini, ; (ii) 16-0-pent-2-ynyyli-32-deoksorapamysiini, (iii) 16-O-pent-2-ynyyli-32-deokso-40-O-(2- 113051 hydroksietyyli)-rapamysiini, (iv) 16-0-pent-2-ynyyli-32(S)-dihydrorapamysiini, (v) 16-0-pent-2-ynyyli-32(S)-dihydro-40-O-(2-hydroksietyyli)-rapamysiini, 5 (vi) 32(S)-dihydro-40-O-(2-metoksi)etyyli- rapamysiini, (vii) 32(S)-dihydro-40-O-(2-hydroksietyyli)- rapamysiini.

Kaavan I yhdisteet voivat omata isomeriaa ja 10 näin ollen on olemassa isomeerisia lisämuotoja. On selvää, että keksintö pitää sisällään kaavan I yhdisteet, kaavan i' yksittäiset isomeerit, L O _ ohoA° ? j 2 0 9 9 R’ 25 joissa Ri, R2, Y ja X ovat kuten edellä määritettiin, sekä niiden isomeerien seokset.

/ Yksittäiset isomeerit voidaan erottaa alalla tunnettujen menetelmien mukaisesti.

: Keksintö tuottaa myös kaavan I yhdisteiden 30 valmistusmenetelmän, joka menetelmä käsittää a) kaavan I yhdisteen valmistuksen, jossa X on H, , ··, poistamalla pelkistäen kaavan IVa, > · • t · i » ‘ * » · > · f » · i » · 6 113051 j^, L JL jö 0 ΓΥ \ .

Οΐγ^0 0 ο'"·γ jossa Ri, R2 ja Y ovat kuten edellä määritettiin, yhdisteen asemassa 32 oleva karbonyyli, suojatussa tai 15 suojaamattomassa muodossa ja tarvittaessa mukana olevien suojaryhmien poistamisen; tai b) kaavan I yhdisteen, jossa X on OH, valmistuksen pelkistämällä stereoselektiivisesti edellä määritetyn 20 kaavan IVa yhdisteen asemassa 32 oleva karbonyyli; tai c) annetaan yhdisteen, jolla on kaava I, jossa Ri on alkyyli, reagoida Rx-OH-yhdisteen, jossa Rx on C3.10- : alkynyyli tai hydroksi-C3-i0-alkynyyli, kanssa yhdis- ; teen, jolla on kaava I, jossa Ri on C3-i0-alkynyyli tai 25 hydroksyyli-C3-io-alkynyyli, tuottamiseksi.

Prosessivaiheessa a) kaavan IVa yhdiste on edullisesti suojatussa muodossa, s.o. se voi sisältää » > · * ,, suojaryhmiä funktionaalisissa ryhmissä, jotka eivät osallistu reaktioon, esim. OH asemassa 28 ja valinnai-30 sesti asemassa 40 R2:n ollessa kaavan II jäännös tai » ? * ; ’.· asemassa 39 R2:n ollessa kaavan III jäännös.

Pelkistäminen a) kaavan I 32-deoksoyhdis-; teeksi voidaan suorittaa tarkoituksenmukaisesti kah- > i · _ ! dessa vaiheessa: , 35 i) antamalla kaavan IVa yhdisteen reagoida suoja- V : tussa muodossa hydridin, esim. di-isobutyyli- ' : aluminiinihydridin tai edullisesti litiumtri-tert- 7 113051 butoksialumiiniihydridin kanssa, vastaavan 32-dihydroyhdisteen valmistamiseksi. Muita menetelmiä ja alalla tunnettuja reagensseja voidaan käyttää ketonien pelkistämiseen 32-dihydroyhdisteen valmistamiseksi 5 vastaavasta ketonista. Niihin kuuluvat esim. hydraus, pelkistäminen metallien avulla, metallihydridipelkis-tys, kuten on kuvattu julkaisussa "Comprehensive Organic Transformations" (Orgaaniset yleistransformaati-ot) , R.C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, 10 ss. 527-535, kappaleet 7.1.1-7.1.4, ja ketonien asymmetriset pelkistysmenetelmät, esim. kuten on esitetty julkaisussa "Comprehensive Organic Transformations", R.C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, ss. 540-547, kappale 7.1.15. Pekistämisvaihe i) on siten 15 suoritettu.

ii) muuntamalla 32-dihydroyhdiste vastaavaksi 32-halojohdannaiseksi, esim. 32-bromi- tai (edullisesti) 32-jodijohdannaiseksi, joka sitten pelkistetään esim. hydridin avulla halutuksi 32-deoksojohdannaiseksi ja 20 tarvittaessa poistetaan saadun yhdisteen suojaus. Voidaan käyttää lisäreagensseja, kuten halogenidien pelkistämiseen käytettyjä, ja niihin kuuluvat esim. pie-: nivalenssiset metallit (s.o. litium, natrium, magnesi um ja sinkki) ja metallihydridit (alumiinihydridit, t » 25 boorihydridit, silaanit, kuparihydridit) (ks. "Compre-

|‘ hensive Organic Transformations", R.C. Larock, VCH

t t • * Publishers Inc., New York, 1989, ss. 18-20, kappaleet

f I

ί · 1.5.1 ja 1.5.2).

V, Vaihtoehtoisesti halogenidin pelkistäminen 30 voidaan saada aikaan käyttämällä vetyä tai vetylähdet-tä (s.o. muurahaishappoa tai sen suolaa) sopivan me-tallikatalyytin (Raney-nikkelin, metallisen palla-* f diumin tai palladiumkompleksien, rodium- tai ruteeni- '· : kompleksien) läsnäollessa (ks. "Comprehensive Organic ’ : 35 Transformations", R.C. Larock, VCH Publishers Inc., : New York, 1989, ss. 20-24, kappale 1.5.3). Lisäksi voidaan käyttää myös tunnettuja menetelmiä alkoholin 113051 δ muuttamiseksi vastaavaksi deoksiyhdisteeksi. Näihin menetelmiin kuuluvat esim. suora pelkistäminen tai välituotteena saadun fosforiyhdisteen, sulfonaatin, tio-karbonaatin, tiokarbamaatin tai ksantaatin pelkistämi-5 nen ja niitä on kuvattu esim. julkaisussa "Comprehensive Organic Transformations", R.C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, ss. 27-31, kappaleet 1.9.1-1.9.4.

Sopivia hydroksisuojaryhmiä ja menetelmiä 10 niiden muodostamiseksi ja poistamiseksi tunnetaan alalta, ks. esim. "Protective Groups in Organic Synthesis" (Suojaryhmät orgaanisissa synteeseissä), 2. painos, T.W. Greene ja P.G.M. Wuts, John Wiley & Sons, New York, 1991, kappale 2 ja siinä olevat viitteet. 15 Edullisia OH-suojaryhmiä ovat esim. triorganosilyyli-ryhmät, kuten tri (Ci-6) alkyylisilyyli (esim. trimetyy-lisilyyli, trietyylisilyyli), tri-isopropyylisilyyli, isopropyylidimetyylisilyyli, t-butyylidimetyylisi- lyyli, triaryylisilyyli (esim. trifenyylisilyyli) tai 20 triaralkyylisilyyli (esim. tribentsyylisilyyli). Suojauksen poisto voidaan suorittaa lievästi happamissa olosuhteissa.

Pelkistysvaihe i) voidaan suorittaa matalassa ' ' lämpötilassa, esim. -10 - -80°C:ssa.

« < · ·.* · 25 Vaiheessa ii) valinnaisesti suojatussa muo- * % * I/· I dossa oleva 32-dihydroyhdiste, edullisesti 32 (R)- diastereoisomeeri, muunnetaan esteriksi, edullisesti » · sulfonaatiksi, esim. mesylaatiksi, tosylaatiksi, nosy-laatiksi tai triflaatiksi, jota seuraa korvaaminen so- t » t 30 pivalla halogenidilla, esim. natriumjodidilla tai bromidilla, tetrabutyyliammoniumjodidilla tai bromidilla, edullisesti emäksen, esim. amiinin, läsnä- ollessa. 32 (R) -diastereomeeri voidaan erottaa seokses- » ·,: ta noudattaen tunnettuja erotusmenetelmiä, esim. kro- 35 matografiaa.

Sopiviin hydrideihin 32-haloyhdisteen pelkis- > » tämiseksi kuuluvat esim. radikaalihydridit, kuten tri- 9 113051 butyylitinahydridi tai tris-(trimetyylisilyyli)-silaani. Pelkistäminen voidaan suorittaa radikaali-initiaattorin, esim. 2,2'-atsobis-isobutyronitriilin tai edullisesti Et3B:n, puuttuessa tai läsnäollessa, 5 edullisesti lämpötilassa 0-80°C.

Hapettava aine, kuten kupari(2)asetaatti, voidaan tarvittaessa edullisesti lisätä i) tai ii) pelkistysvaiheen jälkeen ei-halutun sivupelkistymisen, joka voi tapahtua esim. asemassa 9, hapettamiseksi valo linnaisesti uudelleen karbonyyliksi.

Vaihtoehtoisesti 32-dihydrojohdannainen voidaan muuntaa suoraan halogenidiksi alalla tunnettujen menetelmien avulla, esim. käyttäen trifenyylifosfiinia yhdessä N-bromi- tai N-jodisukkiini-imidin, hiilitet-15 rabromidin tai tetrajodidin, 1,2-dibromitetra- kloorietaanin, 2,4,5-tribromi- tai trijodi-imidat-solin, jodin, 1,2-dijodietaanin kanssa, tai käyttäen tionyylibromidia tai metyylitrifenoksifosfoniumjodi-dia.

20 Asemassa 32 olevan karbonyylin pelkistäminen 32-deoksojohdannaiseksi voidaan suorittaa myös muodostamalla tosyylihydratsoni, jota seuraa käsittely boo-| rihydriinillä, esim. katekoliboorihydriinillä, tai muodostamalla ditiaani, jota seuraa sopiva pelkistämi-25 nen esim. Raney-nikkelillä tai hydridillä, esim. tri- I · .i , butyylitinahydridillä. Muita tunnettuja menetelmiä ·* voidaan käyttää ketonin muuntamiseen vastaavaksi al- ‘ " kaaniksi; näihin menetelmiin kuuluvat esim. suora pel- ’.* · kistäminen (ks. "Comprehensive Organic Transforma- 30 tions", R.C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, ' : 1989, ss. 35-37, kappale 1.12.1) tai pelkistäminen : hydratsonien kautta ("Comprehensive Organic Transfor- ‘. mations", R.C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, * · j 1989, ss. 37-38, kappale 1.12.2) ja rikki- ja se- » i t 35 leenijohdannaisten kautta ("Comprehensive Organic

Transformations", R.C. Larock, VCH Publishers Inc., New York, 1989, ss. 34-35, kappaleet 1.10 ja 1.11).

10 113051

Pelkistämisvaihe b) kaavan I 32(S)-dihydro-yhdisteeksi suoritetaan valikoiduissa olosuhteissa. Edullisesti käytetään pelkistintä, joka suosii merkittävästi pelkistymistä 32(S):ksi, esim. natriumtrietyy-5 liboorihydridiä. Pelkistäminen voidaan tarkoituksenmukaisesti toteuttaa matalassa lämpötilassa, esim. -50 --80°C:ssa, inertissä liuottimessa, esim. THF-dietyylieetteri, glyme, diglyme tai metyyli-t-butyylieetteri. 32(S)-dihydroyhdisteen erottaminen 10 tuotetuista pienistä 32 (R) -dihydroyhdistemääristä voidaan suorittaa alalla tunnettujen menetelmien, esim. kolonnikromatografiän, käänteisfaasikromatografiän, avulla.

Haluttaessa asemassa 28 ja valinnaisesti ase-15 massa 40 olevat hydroksiryhmät voidaan suojata ennen pelkistämistä ja suojaus poistaa jälkeenpäin, esim. kuten edellä on todettu. Pelkistämisvaihe b) suoritetaan edullisesti ilman OH-suojausta.

Muunnosvaihe c) voidaan toteuttaa alalla tun-20 nettujen menetelmien mukaisesti. Esim. kaavan I yhdisteen, jossa Rx on Ci-Ci0-alkyyli, edullisesti metyyli, voidaan antaa reagoida yhdisteen Rx-OH kanssa, jossa Rx on alkynyyli tai hydroksiaikynyyli kaavan I yhdisteen tuottamiseksi, jossa Rx on C3-i0-alkynyyli tai hydroksi-. 25 C3-io-alkynyyli. Reaktio voidaan toteuttaa sopivasti dissosioituvaa vetyä sisältämättömässä liuottimessa, esim. dikloorimetaani, tolueeni, asetonitriili tai ’ THF, happamissa olosuhteissa.

• Edullisesti pelkistäminen asemassa 32, eri- 30 tyisesti pelkistysvaihe b), toteutetaan kaavan IVa yh-disteellä, jossa Ri:llä jo on haluttu merkitys, esim. Ri on C3-io-alkynyyli, jolloin vältetään myöhempi muun- • I · , taminen pelkistämisen jälkeen. Lähtöaineena käytetty » * · • I kaavan IVa yhdiste, jossa Ri on alkynyyli tai hydrok- 35 si-C3-io-alkynyyli, voidaan valmistaa käyttäen yhdis- tettä Rx-OH, kuten edellä on todettu.

Lähtöaineina käytettyjä yhdisteitä voidaan • · · 11 113051 valmistaa alalla tunnettujen ja käytettyjen menetelmien mukaisesti, kuten on paljastettu patenttijulkaisuissa U.S. 5,258,389, WO 94/09010, WO 95/16691, U.S. 5,120,842 j.n.e.

5 Seuraavat esimerkit ovat keksintöä valaise via. Kaikki lämpötilat ovat C-asteita. Käytetään seu-raavia lyhenteitä: THF = tetrahydrofuraani TES = trietyylisilyyli 10 ESIMERKKI 1: 32-deoksorapamysiini (Ri = CH3; R2 = II, jossa R3 = H ja R4 = CH3; X = H; Y = O)

Sekoitettuun, jäähdytettyyn (-78°) 28,40-bis-O- TES-rapamysiinin 26,1 g (22,85 mmol) liuokseen 260 ml:ssa THF lisätään 50,3 ml (50,3 mmol) 1 M litium-15 tri-t-butoksialumiinihydridin liuosta THF:ssa. Saadun seoksen annetaan lämmitä -15°:een 2 tunnin kuluessa. Jäähdytyshaude korvataan jäähauteella, joka saattaa lämpötilan 0°:een, ja sekoitusta jatketaan 1 tunnin ajan tässä lämpötilassa. Reaktioseos kaadetaan erotus-20 suppiloon, joka sisältää 750 ml etyyliasetaattia ja 400 ml jääkylmää 2N sitruunahapon vesiliuosta ja ravistellaan vähän aikaa. Vesipitoinen kerros erotetaan .* ja uutetaan kahdesti kylmällä etyyliasetaatilla. Yh- ; distetty orgaaninen liuos pestään jääkylmällä 2N sit- . 25 ruunahapon vesiliuoksella, vedellä, kyllästetyllä nat- riumbikarbonaatin vesiliuoksella ja kahdesti kylläste- * » tyllä suolaliuoksella, kuivataan sitten vedettömällä > · natriumkarbonaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan alipaineessa. Jäännös, joka koostuu 32(R)-dihydro- 30 28,40-bis-O-TES-rapamysiinin ja 32(R)9,32-bis-dihydro- 28,40-bis-O-TES-rapamysiinin seoksesta liuotetaan il- ,: man lisäpuhdistusta 260 ml: aan etanolia. Tämä liuos : jäähdytetään 0°:een ja käsitellään 6,85 g:lla (34,31 · mmol) kupari (2) asetaattia. 1 tunnin sekoituksen jäl- 35 keen saatu suspensio laimennetaan metyyli-t-butyyli- • ' eetterillä ja pestään kahdesti vedellä ja kahdesti : kyllästetyllä suolaliuoksella. Vesipitoiset kerrokset 12 113051 vastauutetaan metyyli-t-butyylieetterillä. Yhdistetty orgaaninen liuos kuivataan vedettömällä natriumsulfaa-tilla, suodatetaan ja konsentroidaan alipaineessa. Jäännös puhdistetaan silikageelikromatografin (60:40 5 heksaani/metyyli-t-butyylieetteri) avulla puhtaan 32(R)-dihydro-28,40-bis-O-TES-rapamysiinin saamiseksi valkoisena kiinteänä aineena.

XH NMR (CDC13) 4:1 seos rotameereista, kemialliset siirrokset sulkujen sisällä viittaavat aiarotameeriin 10 δ 0,72 (1H, dd, H-38ax) , 1,63 (1,60) (3H, s, C17-CH3) , 1,66 (1,69) (3H, s, C2 9-CH3) , 1,77 ja 1,81 (H-33), 2,46 (1H, m, H-31) , 2,82 (2,91) (1H, m, H-25) , 2,91 (1H, m, H-39) , 3,13 (3H, s, C16-OCH3) , 3,26 (3H, s, C27-OCH3) , 3,41 (1H, m, H-40) , 3,43 (3H, s, C39-OCH3) , 15 3,62 (1H, m, H-32), 3,75 (3,57) (1H, d, H-27) , 4,10 (1H, d, H-28) , 4,81 (1H, laaja s, C10-OH) , 5,05 (1H, d, H-34) , 5,27 (1H, d, H-30) , 5,36 (1H, d, H-2) , 5,69 (1H, dd, H-22) , 6,03 (5,96) (1H, d, H-18), 6,15 (1H, dd, H-21) , 6,33 (1H, dd, H-20) , 6,40 (1H, dd, H-19) 20 MS (FAB, Lii matriisi) m/z 1150 ([M + Li]+) (suht. in tensiteetti 100)

Sekoitettuun, jäähdytettyyn (-15°) 32(R)- • dihydro-28,40-bis-O-TES-rapamysiinin 20,69 g (18,10 . , mmol) ja trietyyliamiinin 7,55 ml (54,27 mmol) liuok- 25 seen 200 ml:ssa metyleenikloridia lisätään 2,10 ml .! , (27,02 mmol) metaanisulfonyylikloridia. Seosta sekoi tetaan 20 minuuttia, laimennetaan sitten etyyliasetaa-; ‘ tiliä ja lisätään kyllästetty natriumbikarbonaatin ve siliuos. Kerrokset erotetaan ja vesipitoinen kerros 30 uutetaan kolme kertaa etyyliasetaatilla. Yhdistetty : orgaaninen faasi pestään kyllästetyllä natriumbikar bonaatin vesiliuoksella ja suolaliuoksella, kuivataan . vedettömällä natriumsulfaatilla, suodatetaan ja kon- » ; sentroidaan alipaineessa. Tämä jäännös puhdistetaan 35 kolonnikromatografin avulla silikageelillä (80:20 hek- saani/etyyliasetaatti) , joka antaa puhtaan 32(R)-. dihydro-32-0-mesyyli-28,40-bis-O-TES-rapamysiinin vai- , 113051 13 koisena kiinteänä aineena, mutta tavallisesti raaka-tuote käytetään myöhemmässä vaiheessa ilman lisäpuh-distusta.

XH NMR (CDC13) δ 0,77 (1H, dd, H-38ax) , 1,67 (3H, 5 s, CI7-CH3), 1,72 (3H, S, C29-CH3), 2,77 (1, M, H-25) , 2,92 (1H, m, H-39) , 3,03 (3H, s, CI6-OCH3) , 3,17 (3H, s, C27-OCH3) , 3,21 (3H, s, C39-OCH3) , 3,42 (1H, m, H- 40), 3,45 (3H, s, CH2SO3) , 3,91 (1H, d, H-27) , 4,10 (1H, d, H-28) , 4,72 (1H, m, H-32) , 4,94 (1H, S, C10- 10 OH), 5,12 (1H, m, H-34), 5,25 (1H, d, H-39), 5,43 (1H, d, H-2), 5,88 (1H, dd, H-22), 6,03 (1H, d, H-18), 6,18 (1H, dd, H-21) , 6,37 (1H, dd, H-20) , 6,44 (1H, dd, H- 19) MS (FAB, Lii matriisi) m/z 1228 ([M + Li]+) (suht. in- 15 tensiteetti 68), 1132 ([M - CH3SO3H) + Li]+) (suht. in tensiteetti 100) 32(R)-dihydro-32-0-mesyyli-28,40-bis-O-TES-rapamysiinin 22,35 g (18,30 mmol), natriumjodidin 27,50 g (183,33 mmol) ja di-isopropyylietyyliamiinin 20 6,3 ml (36,68 mmol) seosta 400 ml:ssa THF lämmitetään palautusjäähdytyksen alaisena 6 tuntia, annetaan sitten jäähtyä huoneenlämpötilaan. Saatu seos laimenne-; taan etyyliasetaatilla ja käsitellään 38,4 %:lla nat- riumbisulfaatin vesiliuoksella. Kerrokset erotetaan. 25 Orgaaninen faasi pestään kolme kertaa kyllästetyllä < » · [;* ' natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja kerran kylläs- : .· tetyllä suolaliuoksella, kuivataan sitten vedettömällä : *·· natriumsulfaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan ali- 1 « · : paineessa. Jäännös puhdistetaan kolonnikromatografin 30 avulla silikageelillä (83:17 heksaani/etyyliasetaatti) *.·.*. puhtaan 32 (S) -deokso-32-jodi-28,40-bis-O-TES-rapamy- • * ,···. siinin saamiseksi.

* · 1H NMR (CDCI3) 1,5:1 seos rotameereista, kemialli- • · set siirrokset sulkujen sisällä viittaavat alarotamee-35 riin δ 0,73 (1H, dd, H-38ax) , 1,68 (1,66) (6H, s, C17- .···. CH3 ja C29-CH3) , 2,72 (1H, m, H-25), 2,91 (2H, m, H-32 ja H-39), 3,15 (3H, s, CI6-OCH3) , 3,30 (3,31) (3H, s, 14 113051 C27-OCH3), 3,43 (3,41) (3H, s, C39-OCH3) , 3,77 (3,91) (1H, d, H-27) , 4,21 (4,25) (1H, d, H-28) , 4,51 (1H, s, CIO-OH), 5,45 (5,48)(1H, d, H-30), 5,60 (5,79)(1H, dd, H-22), 6,02 (5,85)(1H, d, H-18) 5 MS (FAB, Lii matriisi) m/z 1260 ([M + Li]+) (suht. intensiteetti 100)

Sekoitettuun, jäähdytettyyn (0°) 32(S) - deokso-32-jodi-28,40-bis-O-TES-rapamysiinin 16,79 g (13,19 mmol) liuokseen 190 ml:ssa tolueenia lisätään 7 10 ml (26,38 mmol) tributyylitinahydridia, jota seuraa 1,3 ml (1,30 mmol) 1 M trietyyliboorihydridin liuosta heksaanissa. Seosta sekoitetaan 30 minuuttia ja se sammutetaan kyllästetyllä ammoniumkloridin vesiliuoksella. Kerrokset erotetaan ja vesipitoinen kerros uu-15 tetaan kahdesti etyyliasetaatilla. Yhdistetyt or gaaniset kerrokset pestään vedellä, kyllästetyllä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella, vedellä ja kolme kertaa kyllästetyllä suolaliuoksella, kuivataan sitten vedettömällä natriumsulfaatilla, suodatetaan ja kon-20 sentroidaan alipaineessa. Jäännös puhdistetaan kolon-nikromatografin avulla silikageelillä (75:25 heksaa-ni/metyyli-t-butyylieetteri) puhtaan 32-deokso-28,40-. bis-O-TES-rapamysiinin saamiseksi valkoisena kiinteänä aineena.

» 25 1H NMR (CDC13) 2,5:1 seos rotameereista, kemialli- * set siirrokset sulkujen sisällä viittaavat alarotamee- riin δ 0,73 (1H, dd, H-38ax) , 1,62 (1,57) (3H, s, C17- CH3) , 1,68 (1,72) (3H, s, C29-CH3) , 2,77 (2,91) (1H, m, H-25) , 2,91 (1H, m, H-39) , 3,15 (3H, s, C16-OCH3) , 30 3,27 (3,25) (3H, s, C27-OCH3) , 3,43 (3,45) (3H, s, C39- OCH3), 3,70 (3,67) (1H, d, H-27) , 4,11 (4,07) (1H, d, H- 28), 4,57 (1H, laaja s, CIO-OH) , 4,87 (4,67) (1H, d, ’·;·* H-34) , 5,19 (5,08) (1H, d, H-30), 5,32 (1H, d, H-2) , :/.j 5,60 (5,66) (1H, dd, H-22), 6,01 (5,92) (1H, d, H-18), ·:··: 35 6,17 (1H, dd, H-21) , 6,30 (1H, dd, H-20) , 6,40 (1H, t.:.. dd, H-19) I.. MS (FAB, Lii matriisi) m/z 1134 ([M + Li]+) (suht. in- * % • · » * » 15 113051 tensiteetti 100)

Sekoitettuun, jäähdytettyyn (-15°) 32-deokso- 28,40-bis-0-TES-rapamysiinin 10,73 g (9,52 mmol) liuokseen 85 ml:ssa metanolia lisätään pisaroittain 9,5 5 ml 2N rikkihapon vesiliuosta. Lisäyksen päätyttyä re-aktioseos lämmitetään 0°:een ja sekoitetaan 1,5 tuntia, laimennetaan sitten etyyliasetaatilla ja pysäytetään kyllästetyllä natriumbikarbonaatilla. Kerrokset erotetaan ja vesipitoinen kerros uutetaan kolmella 10 erällä etyyliasetaattia. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestään kolme kertaa kyllästetyllä natriumbikarbonaatilla ja suolaliuoksella, kuivataan sitten vedettömällä natriumsulfaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan alipaineessa. Jäännös liuotetaan dietyylieette-15 riin, jolloin haluttu 32-deokso-rapamysiini kiteytyy (värittöminä kiteinä).

^ NMR (CDC13) 3:1 seos rotameereista, kemialliset siirrokset sulkujen sisällä viittaavat alarotameeriin δ 0,70 (1H, dd, H-38ax), 1,14 ja 1,32 (H-32), 1,56 (H-20 33), 1,65 (1,62) (3H, S, C17-CH3) , 1,68 (1,70) (3H, S, C29-CH3) , 2,31 (2H, m, H-23 ja H-31) , 2,82 (2,95) (1H, m, H-25) , 2,95 (1H, m, H-39) , 3,14 (3H, s, CI6-OCH3) , : 3,32 (3H, s, C27-OCH3), 3,38 (1H, m, H-40), 3,43 (3,41) (3H, s, C3 9-OCH3) , 3,61 (1H, d, H-27), 4,12 (1H, 25 d, H-28) , 4,80 (4,71) (1H, d, H-34), 5,22 (1H, d, H- * 30), 5,31 (1H, d, H-2) , 5,56 (1H, dd, H-22) , 5,95 (5,87) (1H, d, H-18) , 6,16 (1H, dd, H-21) , 6,36 (1H, : ’· dd, H-20) , 6,41 (1H, dd, H-19) , : MS (FAB, Lii matriisi) m/z 906 ([M + Li]+) (suht. in- 30 tensiteetti 100) ESIMERKKI 2: 16-pent-2-ynyylioksi-32 (S) -dihydrorapa- mysiini (Rx = pent-2-ynyyli; R2 = II, jossa R3 = H ja R4 = CH3; X = OH; Y = O) * t ·

Sekoitettuun, jäähdytettyyn (0°) 32 (S)- . 35 dihydrorapamysiinin 970 mg (1,06 mmol) ja 2-pentyn-l- v · olin 1,39 ml (15,00 mmol) liuokseen 20 ml:ssa metyyli- kloridia lisätään 0,50 ml (6,5 mmol) trifluorietikka- 16 113051 happoa. Seosta sekoitetaan 0°:ssa 3 tuntia ja se sammutetaan kyllästetyn natriumbikarbonaatin vesiliuoksella. Kerrokset erotetaan ja vesipitoinen kerros uutetaan kolmella erällä etyyliasetaattia. Yhdistetty 5 orgaaninen liuos pestään kyllästetyllä suolaliuoksel la, kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan alipaineessa. Raakaseos puhdistetaan kolonnikromatografin avulla silikageelillä (20:80 heksaani/etyyliasetaatti), sitten käänteisfaasi 10 HPLC:lla (RP18, 81:19 metanoli-vesi) otsikon tuotteen saamiseksi valkoisena amorfisena aineena.

^ NMR (CDCl3) 2,5:1 seos rotameereista, kemialliset siirrokset sulkujen sisällä viittaavat alarotamee-riin δ 0,71 (1H, dd, H-38ax), 1,13 (1,05) (3H, t, 15 CH3CH2CCCH20) , 1,67 (3H, s, I7-CH3) , 1,69 (3H, s, 29- CH3) , 2,21 (2H, qt, CH3CH2CCCH2O) , 2,96 (1H, m, H-39) , 3,33 (3,37) (3H, s, 27-OCH3) , 3,41 (3,39) (3H, s, 39-OCH3) , 3,78 (1H, dt, CH3CH2CCCHHO) , 4,0 (1H, dt, CH3CH2CCCHHO) , 5,52 (5,71) (1H, dd, H22) , 5,98 20 (5,83)(1H, d, H-18), 6,15 (1H, m, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19) MS (FAB) m/z 974 ([M + Li]+) : ESIMERKKI 3: 16-pent-2-ynyylioksi-32(S)-dihydrorapa- mysiini (vaihtoehtoinen reitti) • : ’· 25 Rapamysiinin annetaan reagoida 2-pentyn-l- ; olin kanssa esimerkin 2 menettelyä vastaavasti 16- • ♦ pent-2-ynyylioksi-rapamysiinin tuottamiseksi.

1 > · *... Sekoitettuun, jäähdytettyyn (-77°) 16- ' demetoksi-16-pent-2-ynyylioksi-rapamysiinin 17,5 g 30 (18,1 mmol) liuokseen 180 ml:ssa THF lisätään 21,7 ml

I I I

t ( « : .* (21,7 mmol) 1 M natriumtrietyyliboorihydridin liuosta THF:ssa. 1 tunnin jälkeen -77°:ssa reaktio sammutetaan : ja neutraloidaan 10 % sitruunahapon vesiliuoksella.

ii(i; Reaktioseoksen annetaan tulla huoneenlämpötilaan ja

• I

. 35 suurin osa THF:sta poistetaan haihduttamalla alipai- I I * V : neessa. Saatu liuos uutetaan kahdesti etyyliasetaatil- la, orgaaniset faasit yhdistetään ja kuivataan natri- 17 113051 umsulfaatilla. Liuottimen haihdutuksen jälkeen raaka reaktiotuote erotetaan kromatografisesti silikageelil-lä eluoimalla heksaani/asetonilla 7:3. Lopullinen puhdistus saadaan aikaan alustavan HPLC:n avulla (RP18, 5 76:24 metanoli:vesi) otsikon tuotteen saamiseksi val koisena amorfisena aineena.

Spektrin analyysitulokset ovat samat kuin toista reittiä saadun tuotteen tulokset.

ESIMERKKI 4 : 32(S)-dihydro-40-O-(2-metoksi)etyyli- 10 rapamysiini (Ri = CH3; R2 = II, jossa R3 = 2- metoksietyyli ja R4 = CH3; X = OH; Y = 0)

Sekoitettuun, jäähdytettyyn (0°) 40-0-(2- metoksi)etyyli-28-O-TES-rapamysiinin 2,17 g (2,00 mmol) liuokseen 20 mlrssa THF lisätään pisaroittain 15 4,4 ml (4,4 mmol) 1 M L-Selectride® liuosta THF:ssa.

Saatua keltaista liuosta sekoitetaan 3 tuntia 0°:ssa ja ylimääräinen hydridireagenssi sammutetaan lisäämällä 2 ml MeOH. Liuos laimennetaan metyyli-t-butyy-lieetterillä ja lisätään kyllästettyä Rochellen suolan 20 vesiliuosta. Tämän seoksen annetaan lämmitä huoneenlämpötilaan ja sekoitusta jatketaan 15 minuuttia. Kerrokset erotetaan ja orgaaninen liuos pestään kylmällä • · · IN HCl:lla, kyllästetyllä suolaliuoksella, IN natrium- . bikarbonaatilla ja uudelleen suolaliuoksella. Vesipi- , 25 toiset pesuliuokset vastauutetaan metyyli-t- _ butyylieetterillä. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset t · !. * kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla, suodatetaan ’ ’ ja konsentroidaan alipaineessa 32-dihydro-40-0-(2- metoksi)etyyli-28-O-TES-rapamysiinin 32S- ja 32R-iso-30 meerien raakaseoksen saamiseksi.

Edellä saatu raakatuote liuotetaan 20 ml:aan : asetonitriiliä ja jäähdytetään 0°:een. Saatuun liuok- ; seen lisätään 2 ml HF-pyridiinikompleksia. Sekoitusta ! jatketaan 1 tunnin ajan ja lisätään IN natriumbikarbo- , ’ 35 naatti. Tämä seos uutetaan kolme kertaa metyyli-t- : butyylieetterillä. Yhdistetty orgaaninen liuos pestään IN natriumbikarbonaatilla ja kyllästetyllä suolaliuok- 18 113051 sella, kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla, suodatetaan ja konsentroidaan alipaineessa. Puhdistus suoritetaan käänteisfaasi-HPLC:n (RP18, 5 pm, 50:50 - 100:0 asetonitriili-vesi, 60 minuuttia) avulla saaden 5 32(S)-dihydro-40-O-(2-metoksi)etyyli-rapamysiinia ja sivutuotteena 32(R)-dihydro-40-O-(2-metoksi)etyyli-ra-pamysiinia.

32(S)-dihydro-40-O-(2-metoksi)etyyli-rapamysiini: XH NMR (CDC13) 2:1 seos rotameereista, kemialliset 10 siirrokset sulkujen sisällä viittaavat alarotameeriin 6 0,77 (1H, dd, H-38ax), 1,67 (6H, s, C17-CH3 ja C29- CH3) , 2,50 (1H, m, H-31) , 3,01 (1H, m, H-25) , 3,12 (2H, m, H-39 ja H-40) , 3,14 (3,15) (3H, s, OCH3) , 3,28 (1H, m, H-32), 3,36 (3,34) (3H, s, OCH3) , 3,39 15 (3,38) (3H, s, OCH3) , 3,48 (3,46) (3H, s, OCH3) , 3,55 ja 3,75 (4H, 2m, 0CH2CH20) , 3,84 (1H, m, H-14) , 4,12 (4,16) (1H, d, H-28) , 4,73 (1H, s, C10-OH) , 5,03 (1H, m, H-34) MS (FAB) m/z 980 ([M + Li]+) 20 ESIMERKKI 5: 32(S)-dihydro-40-O-(2-hydroksi)etyyli- rapamysiini (Ri = CH3; R2 = II, jossa R3 = -CH2CH2OH ja R4 = CH3; X = OH; Y = O) • Noudattamalla esimerkin 4 menettelyä, mutta : käyttäen sopivaa lähtömateriaalia, saadaan aikaan ot- : 25 sikon yhdiste.

. 32 (S) -dihydro-40-0- (2-hydroksi) etyyli-rapamysiini : . .. ΧΗ NMR (CDC13) 1,7:1 seos rotameereista, kemialli- : set siirrokset sulkujen sisällä viittaavat alarotamee riin 5 0,76 (1H, dd, H-38ax), 2,5 (1H, m, H-31), 3,10 30 (1H, m, H-39), 3,13 (3,14) (3H, s, C16-OCH3) , 3,20 (1H, ‘ m, H-40), 3,28 (1H, m, H-32) 3,36 (3,38) (3H, s, C27- :*' OCH3) , 3,45 (3,43) (3,41) (3H, s, C39-OCH3) , 3,50 (1H, d, /•I H-27) , 3,58 ja 3,70 (4H, m, OCH2CH2OH) , 4,12 (4,16) (1H, 1 i d, H-28), 5,06 (1H, m, H-34), 5,60 (1H, dd, H-22) , 35 5,99 (1H, d, H-18) , 6,17 (1H, dd, H-21) , 6,33 (1H, dd, H-20) , 6,42 (1H, dd, H-19) > 19 113051 MS (FAB, Lii matriisi) m/z 966 ([M + Li]+) (suht. intensiteetti 100) ESIMERKKI 6 : 16-pent-2-ynyylioksi-32 -deokso-rapamy- siini (Ri = pent-2-ynyyli; R2 = II, jossa R3 = H ja R4 5 = CH3; X = H; Y = 0)

Noudattamalla esimerkkien 1 ja 2 tai 3 menettelyä, mutta käyttäen sopivia lähtömateriaaleja, saadaan aikaan otsikon yhdiste.

XH NMR (CDC13) δ 0,70 (1H, dd, H-38ax) , 1,23 (3H, 10 t, CH3CH2CCCH20) , 2,21 (2H, ddq, CH3CH2CCCH20) , 2,78 (1H, m, H-25) , 2,94 (1H, m, H-39) , 3,31 (3H, s, C27- 0CH3) , 3,62 (1H, d, H-27), 3,78 (1H, ddd, CH3CH2CCCH20) , 4,02 (1H, ddd, CH3CH2CCCH20) , 4,12 (1H, d, H-28) , 4,79 (1H, m, H-34) , 5,20 (1H, d, H-30) , 5,28 15 (1H, laaja d, H-2) , 5,50 (1H, dd, H-22) , 5,97 (1H, d, H-18) , 6,14 (1H, dd, H-21) , 6,30 (1H, dd, H-20) , 6,38 (1H, dd, H-19) MS (FAB, Lii matriisi) m/z 958 ([M + Li]+) (suht. in tensiteetti 100) 20 Kaavan I yhdisteet omaavat farmaseuttisen vaikutuksen ja ovat siten käyttökelpoisia lääkeaineina .

*: Erityisesti kaavan I yhdisteillä on immunosu- pressiivinen ja lisäkasvua ehkäisevä vaikutus, kuten 25 on osoitettu seuraavissa laboratorio- ja elävässä eli- » mistössä suoritetuissa koemenetelmissä: ’ 1. Seoslymfosyyttireaktio (MLR) < «

Seoslymfosyyttireaktio kehitettiin alun perin saman lajin siirrännäisten yhteydessä arvioitaessa mah- . 30 dollisten elimen luovuttajien ja vastaanottajien vä- » * · listä kudoksen yhteensopivuutta ja on eräs parhaista » · '·;·* immuunireaktion vahvistetuista laboratoriomalleista.

Hiirimallin MLR, esim. kuten T. Meo on kuvannut jul-·:·.ί kaisussa "Immunologisia menetelmiä", toimittajat L.

35 Lefkovits ja B. Pernis, Academic Press, N.Y., ss. 227- » · · *;'t‘ 239 (1979) , käytetään osoittamaan kaavan I yhdisteiden » 1 • t • H * 20 113051 immunosupressiivinen vaikutus. Pernasoluja (2x105/ allas) Balb/c hiiristä (naaras, 8-10 viikkoa) yhteisin-kuboidaan mikrotiitterilevyillä 5 päivän ajan säteily-tettyjen (2000 rad) tai mitomysiini C:llä käsiteltyjen 5 CBA hiiristä (naaras, 8-10 viikkoa) otettujen pernasolujen 0,5xl06 kanssa. Säteilytetyt allogeeniset solut aiheuttavat lisäkasvullisen reaktion Balb/c pernasoluissa, joka voidaan määrittää merkityn emänukli-din DNA:hän liittymisen avulla. Koska stimululoivia 10 soluja säteilytetään (tai mitomysiini C käsitellään) ne eivät reagoi Balb/c soluihin lisäkasvulla, vaan todella pitävät antigeenisyytensä. Kaavan I yhdisteiden lisäkasvua ehkäisevä vaikutus Balb/c soluilla määritetään erilaisilla laimennuksilla ja pitoisuus, joka 15 johtaa solujen lisäkasvun 50 %:seen ehkäisyyn (IC50) , lasketaan. Testattavan näytteen ehkäisykykyä voidaan verrata rapamysiiniin ja ilmaista suhteellisena IC50:nä (s.o. testattavan näytteen IC5o/rapamysiinin IC50) . Esimerkkien 1 ja 2 yhdisteiden on havaittu saavan täs-20 sä kokeessa vastaavasti suhteelliset IC50 arvot 0,3 ja 0,08.

2. IL-6 välitteinen lisäkasvu (IL-6 PROL) '· Kaavan I yhdisteiden kyky häiritä kasvutekijään , liittyviä signaalikanavia arvioidaan käyttäen inter- 25 leukin-6 (IL-6) riippuvaisen hiiren jatkuvaa hybrido- ma-solusukupolvea. Analysointi suoritetaan 96-altaisilla mikrotiitterilevyillä. 5000 solua/allas i · . viljellään seerumivapaassa väliaineessa (kuten M.H.

Schreier ja R. Tees ovat kuvanneet julkaisussa "Immu-30 nologisia menetelmiä" (Immunological Methods), toimit tajat I.Lefkovits ja B. Pernis, Academic Press 1981, ..· osa II, ss. 263-275), täydennettynä 1 ng:lla rekombi- . : naatio-IL-6/ml. 66 tunnin inkubaation jälkeen testat- tavan näytteen mukanaollessa ja sen puuttuessa soluja 35 sykäytetään 1 μΟΐ (3-H)-tymidiinillä/allas vielä 6 » * ,· · tunnin ajan, otetaan talteen ja lasketaan nestetuik- :...ϊ keen avulla. (3-H)-tymidiinin liittyminen DNA:han kor- 21 113051 reloi solujen lukumäärän kasvun kanssa ja on siten solujen lisäkasvun mitta. Testattavan näytteen laimen-nussarja mahdollistaa pitoisuuden laskemisen, joka johtaa solujen lisäkasvun 50 %: seen (IC50) estämiseen.

5 Testattavan näytteen estokykyä voidaan verrata rapamy-siiniin ja ilmaista suhteellisena IC50:nä (s.o. testattava näytteen/rapamysiinin IC50) . Esimerkkien 1 ja 2 yhdisteiden on havaittu saavan tässä kokeessa vastaavasti suhteelliset IC50 arvot 0,2 ja 0,09.

10 3 . Makrofiliini(macrophilin)sitoutumisen analysointi (MBA)

Rapamysiinin ja siihen rakenteellisesti liittyvän immunosupressiivisen aineen FK-506 tiedetään molempien sitoutuvan elimistössä makrofiliiniin-12 (joka tunne-15 taan myös FK-506 sidosproteiinina eli FKBP-12) ja tämän sitoutumisen ajatellaan liittyvän näiden yhdisteiden immunosupressiiviseen vaikutukseen. Kaavan I yhdisteet sitoutuvat myös voimakkaasti makrofiliiniin-12, kuten on osoitettu vertailevassa sitoutumisanalyy-20 sissä. Tässä kokeessa BSA:han liitettyä FK-506 käytetään mikrotiitterilevyjen päällystämiseen. Biotinatun ihmisen rekombinaatiomakrofiliinin-12 (biot-MAP) anne-'·* taan sitoutua testattavan näytteen läsnäollessa ja puuttuessa liikkumattomaksi tehtyyn FK-506:een. Pesun 25 jälkeen (ei-ominaisesti sitoutuneen makrof iliinin »·. poistamiseksi) sitoutunut biot-MAP arvioidaan inkuboi- malla streptavidin-alkaalinen fosfataasi-konjugaatin ,. kanssa, jota seuraa pesu ja myöhemmin p-nitrofenyy- lifosfaatin lisäys viljelysaineeksi. Tulos on OD aal-30 lonpituudella 405 nm. Testattavan näytteen sitoutumi-

: nen biot-MAP:hen johtaa FK-506 sitoutuneen biot-MAP

·,,,· määrän vähenemiseen ja siten OD405:n alenemiseen. Tes- .·. : tattavan näytteen laimennussarja mahdollistaa pitoi- >iti· suuden määrittämisen, joka antaa tulokseksi liikkumat- . 35 tomaksi tehtyyn FK-506 sitoutuvan biot-MAP 50 %:seen *. : (IC5o) estämiseen. Testattavan näytteen estokykyä ver- rataan vapaan FK-506:n IC50:een standardina ja ilmais- 22 113051 taan suhteellisena IC50:nä (s. o. IC50-testattava näy-te/ICso-vapaa FK-506). Tässä analyysissä esimerkkien 1, 2 ja 5 yhdisteiden on havaittu saavan vastaavasti suhteelliset IC5o arvot 1, 2,8 ja 2,5.

5 4. Paikallinen siirrännäinen-isäntä (QvH) reaktio

Elimistössä kaavan I yhdisteiden tehokkuus on osoitettu sopivassa eläinkoemallissa, kuten on kuvattu esim. Ford et al:n julkaisussa, TRANSPLANTATION, 10, 258 (1970). Pernasoluja (lxlO7) 6 viikon ikäisistä 10 Wistar/Furth (WF) naarasrotista ruiskutetaan ihonalaisesti 0-päivänä n. 100 g painavien naarasrottien (F344 x WF)Fi vasempaan takakäpälään. Eläimiä käsitellään 4 seuraavan päivän ajan ja polvitaipeen imusolmukkeet poistetaan ja punnitaan 7. päivänä. Kahden imusolmuk-15 keen välinen painoero otetaan parametriksi reaktiota arvioitaessa.

5. Munuaissiirrännäisreaktio rotassa

Toinen munuainen DA(RTla) tai Brown-Norway (BN)(RTla) luovuttajarotasta siirretään toispuoleises-20 ti (vasen puoli) munuaispoistetun (Lewis RT11) vas- taanottajarotan munuaissuoneen käyttäen päästä päähän yhdyshaaraa. Virtsajohdinyhdyshaara on myös päiden vä-, linen. Käsittely alkaa elimen siirtopäivänä ja sitä jatketaan 14 päivän ajan. Vastapuolen munuaisen poisto • 25 tehdään seitsemän päivää elinsiirron jälkeen, mikä jättää vastaanottajan luovutetun munuaisen toimintakyvyn varaan. Siirrännäisen vastaanottajan elossapysy-mistä pidetään toimivan siirrännäisen parametrina.

6. Kokeellisesti aiheutettu allerginen aivo-selkäydin- . 3 0 tulehdus (EAE) rotissa : Kaavan I yhdisteiden tehokkuus EAErssa määritetään / . esim. julkaisuissa Levine & Wenk, Amer. J. Path., 47, j 61 (1965); McFarlin et ai., J. Immunol., 113, 712 (1974); Borel, Transplant. & Clin. Immunol., 13, 3 35 (1981), kuvatun menettelyn avulla. EAE on laajalti hy- väksytty malli multippeli skleroosia ajatellen. Wis- 23 113051 tar-urosrottiin ruiskutetaan takakäpäliin naudan selkäytimen ja valmiin Freundin apuaineen seosta. Sairauden oireet (hännän ja molempien takajalkojen halvaus) kehittyvät tavallisesti 16 päivän kuluessa. Sairastu-5 neiden eläinten lukumäärä samoin kuin sairauden syntyaika merkitään muistiin.

7. Freundin apuaineniveltulehdus

Tehokkuus kokeellisesti aiheutettua niveltulehdusta vastaan osoitetaan käyttäen esim. julkaisuissa Win-10 ter & Nuss, Arthritis & Rheumatism, 9, 394 (1996);

Billingham & Davies, Handbook of Experimental Pharmacol. (toimittajat Vane & Ferreira, Springer-Verlag, Berlin), 50/11, ss. 108-144 (1979), kuvattua menette lyä. OFA ja Wistar rottiin (uros ja naaras, kehonpaino 15 150 g) ruiskutetaan ihon läpi hännän tyviosaan tai ta- kakäpälään 0,1 ml mineraaliöljyä, joka sisältää 0,6 mg lyofilisoitua kuumatapettua Mycobacterium smegmatis. Kehittyvässä niveltulehdusmallissa käsittely aloitetaan heti apuaineen ruiskutuksen jälkeen (päivät 1-20 18); todetussa niveltulehdusmallissa käsittely aloite taan 14. päivänä, kun sekundaarinen tulehdus on hyvin kehittynyt (päivät 14-20). Kokeen päättyessä nivelten : turpoaminen määritetään mikrometrin avulla. ED50 on an nos suun kautta mg/kg, joka vähentää (primaarista tai 25 sekundaarista) turpoamista puoleen vertailukohteiden turvotuksesta.

8. Kasvaimia ehkäisevä ja MDR-vaikutus

Kaavan I yhdisteiden kasvaimia ehkäisevä vaikutus ja niiden kyky parantaa kasvaimia ehkäisevien aineiden 30 toimintaa lievittämällä monivaikutteisen lääkkeen vastustuskykyä osoitetaan esim. antamalla syöpää ehkäise-.· vää ainetta, esim. kolkisiinia (colchicine) tai eto- : posidia (etoposide), monivaikutteiselle lääkkeelle vastustuskykyisiin soluihin ja lääkkeelle herkistyviin 35 soluihin laboratoriossa tai eläimille, joilla on monivaikutteiselle lääkkeelle vastustuskykyisiä tai lääk- 24 113051 keelle herkistyviä kasvaimia tai infektioita, antamalla niiden kanssa testattavia kaavan I yhdisteitä tai ilman näitä ja antamalla kaavan I yhdisteitä yksinään.

Tällainen laboratoriotestaus suoritetaan käyttäen 5 mitä tahansa sopivaa lääkkeelle vastustuskykyistä so-lusukupolvea ja (samasta polveutuvaa) vertai-lusolusukupolvea, jotka on luotu, kuten esim. Ling et ai., J. Cell. Physiol., 83, ss. 103-116 (1974) ja

Bech-Hansen et ai., J- Cell. Physiol., 88, ss. 23-32 10 (1976) ovat kuvanneet. Tietyt valitut kloonit ovat mo- nivaikutteiselle lääkkeelle (esim. kolkisiinille) vastustuskykyistä lajia CHR (aliklooni C5S3.2) ja samasta polveutuvaa herkistyvää sukupolvea AUX B1 (aliklooni ABI SH) .

15 Kasvaimia ja MDR:a ehkäisevä vaikutus elimistössä osoitetaan, esim. hiirissä, joihin on ruiskutettu mo-nivaikutteista lääkettä kestäviä ja lääkkeelle herkistyviä syöpäsoluja. Lääkeaineelle vastustuskykyiset Ehrlich-vesivatsasyövän (EA, Ehrlich ascites car-20 cinoma) alasukupolvet DR, VC, AM, ET, TE tai CC kehitetään EA-solujen sekvenssisiirron avulla Balb/c isän-tähiirten seuraaviin sukupolviin Slater et ai., J.

. Clin. Invest., 70, 1131 (1982), kuvaamien menetelmien mukaisesti.

25 Samanlaisia tuloksia voidaan saada aikaan käyttäen ' kaavan I yhdisteitä vastaavasti suunnitelluissa koe- malleissa esim. laboratoriossa tai käyttäen koe-eläimiä, joihin on tartutettu lääkkeelle vastustusky-kyisiä ja lääkkeelle herkistyviä virus-lajeja, antibi-30 ootille (esim. penisilliiniä) vastustuskykyisiä ja herkistyviä bakteerilajeja, sienten kasvun ehkäisylle ’t vastustuskykyisiä ja herkistyviä sienilajeja samoin kuin lääkeaineelle vastustuskykyisiä alkueläinlajeja, ,‘·· esim. Plasmodium-lajeja, esimerkiksi luonnossa esiin- "! 35 tyviä Plasmodium falciparum alalajeja, jotka omaavat hankitun kemoterapeuttisen, malarian vastaisen lääkkeen vastustuskyvyn.

25 113051 9. Mip ja Mip-tyyppisen tekijän ehkäisy

Lisäksi kaavan I yhdisteet sitoutuvat ja eristävät monenlaisia Mip (makrofagi infektiviteetin tehostin, macrophage infectivity potentiator) ja Mip-tyyppisiä 5 tekijöitä, jotka ovat rakenteellisesti makrofiliinin kaltaisia. Mip ja Mip-tyyppiset tekijät ovat virulent-titekijoitä, joita tuottavat monenlaiset taudin synnyttäjät, mukaanlukien Klamydia-suku, esim. Chlamidia trachomatis; Neisseria-suku, esim. Neisseria meningi-10 tidis; ja Legionella-suku, esim. Legionella pneumophi-lia; ja myös riketsioiden lahkon tietyt loisjäsenet. Näillä tekijöillä on tärkeää osa solujen sisäisen infektion muodostumisessa. Kaavan I yhdisteiden tehokkuus taudin synnyttäjien, jotka tuottavat Mip tai Mip-15 tyyppisiä tekijöitä, infektiivisyyden alentamisessa voidaan osoittaa vertaamalla soluviljelmissä olevien taudin synnyttäjien infektiivisyyttä makrolidien läsnäollessa ja puuttuessa, esim. käyttäen Lundemose et al:n artikkelissa, Mol. Microbiol., 7, 777 (1993), 20 kuvattuja menetelmiä.

10. Krooninen siirrännäisen hylkiminen DA (RTla) urosrotan munuainen siirretään suoraan * ulkonaisesti Lewis (RT11) urosvastaanottajaan. Yhteen- • sä 24 eläimelle tehdään elimensiirto. Kaikkia eläimiä ‘ 25 käsitellään syklosporiini A:11a annoksella 7,5 : mg/kg/päivä suun kautta 14 päivän ajan, alkaen siirto- päivästä, akuutin solujen välisen hylkimisen estämi-·. seksi. Vastapuolen munuaisen poistoa ei suoriteta. Ku kin kaavan I yhdisteen eri annoksella tai plasebolla : 30 käsitelty koeryhmä käsittää kuusi eläintä.

* » ; Alkaen päivästä 53-64 elinsiirron jälkeen vastaan- ottajaeläimiä käsitellään suun kautta vielä 69-72 päi-; vää kaavan I yhdisteellä tai ne saavat plaseboa. 14 , · päivää elinsiirron jälkeen eläimet altistetaan siir- 35 rännäisen arviointiin magneettiresonassikuvauksen (MRI) avulla määrittämällä munuaisten perfuusio (ver- » 26 113051 taamalla siirrettyä munuaista ja omaan vastapuolen munuaista) . Tämä toistetaan 53-64 päivää elinsiirron jälkeen ja kokeen lopussa. Sitten eläimille tehdään ruumiinavaus. Hylkimisparametrit, kuten MRI-tulos, 5 siirretyn munuaisen suhteellinen perfuusion määrä ja munuaissiirrännäisen histologinen arvio solujen välisen hylkimisen ja suonimuutosten osalta, määritetään ja analysoidaan tilastollisesti. Kaavan I yhdisteen, esim. esimerkin 1 tai 2 yhdisteen, antaminen annoksina 10 0,5-2,5 mg/kg tässä rotan munuaisen siirtomallissa tuottaa kaikkien edellä mainittujen hylkimisparametri-en alenemisen.

11. Verisuoniplastiikka

Pallokatetrointi suoritetaan 0-päivänä, pääosin 15 kuten Powell et ai. ovat kuvanneet (1989). Isofluo-raaninukutuksessa Fogarty 2F katetri viedään vasempaan yhteiseen päänvaltimoon pään ulkovaltimon kautta ja se laajennetaan (venytys » 10 μΐ H20). Laajennettu pallo vedetään takaisin pitkin yhteisen päänvaltimon pituut-20 ta kolme kertaa, viimeiset kaksi kertaa samalla varovasti kiertäen tasaisen suonen sisäkalvon poistamisen saamiseksi aikaan. Sitten katetri poistetaan, sidelan-: · ka asetetaan pään ulkovaltimon ympärille verenvuodon . estämiseksi ja eläinten annetaan toipua.

25 Kahta 12 RoRo rotan ryhmää (400 g, n. 24 viikon ikäisiä) käytetään tutkimukseen: yhtä vertailuryhmää » · ja yhtä testattavaa yhdistettä saavaa ryhmää. Rotat \ / satunnaistetaan täysin kaiken käsittelyn, koevaiheiden • ja erittelytutkimuksen aikana.

30 Testattavaa yhdistettä annetaan suun kautta (let- * / kuruokinta) alkaen 3 päivää ennen pallovammaa (-3 päi- ; : vää) tutkimuksen loppuun asti, 14 päivää pallovamman . jälkeen (+14 päivää) . Rottia pidetään yksittäishäkeis- ' ! sä ja niille annetaan ruokaa ja vettä halun mukaan.

, 35 Sitten rotat nukutetaan isofluoraanilla, perfuusioka- V · tetri asennetaan vasemman kammion kautta ja kiinnite- : : tään aorttakaareen ja hengityskanyyli asennetaan oike- 27 113051 aan kammioon. Eläimiä perfusoidaan 150 mmHg:n per-fuusiopaineella, aluksi 1 minuutin ajan 0,1 M fosfaat-tipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, pH 7,4) ja sitten 15 minuuttia fosfaattipuskurissa (pH 7,4) olevalla 5 2,5 % glutaarialdehydillä. Perfuusiopaine on 150 mmHg kanyylin kärjessä (« 100 mmHg päänvaltimossa, määritettynä alustavassa kokeessa viemällä paineanturiin kiinnitetty kanyyli pään ulkovaltimoon). Sitten pään-valtimot leikataan pois, erotetaan ympäröivästä kudok-10 sesta ja upotetaan 0,1 M kakodylaattipuskuriin (pH 7,4), joka sisältää 7 % sakkaroosia, ja inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa. Seuraavana päivänä päänvaltimot upotetaan 0,1 M kakodylaatissa olevaan 0,05 % KMn04:iin ja ravistellaan 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. 15 Sitten kudoksista poistetaan vesi porrastetussa etano-lisarjassa; 2 x 10 min 75 %:ssa, 2 x 10 85 %:ssa, 3 x 10 min 95 %: ssa ja 3 x 10 min 100 %:ssa etanolissa. Kuivatut päänvaltimot upotetaan sitten Technovit 7100:aan valmistajan suositusten mukaisesti. Upotusvä-20 liaine jätetään polymeroitumaan yön yli eksikaattoriin argon kaasun alaisena, koska hapen on havaittu estävän lohkojen sopivan kovettumisen.

. 1-2 μπι paksuja leikkeitä leikataan kunkin päänval- timon keskiosasta pyörivässä mikrotomissa olevalla ko-25 vametalliterällä ja niitä värjätään 2 minuutin ajan Giemse-väriaineessa. Siten valmistetaan n. 5 leikettä ,· kustakin päänvaltimosta ja väliaineen, suonen uudis- sisäkalvon ja ontelon poikkileikkauksen alue arvioi-: daan morfometrisesti kuva-analyysijärjestelmän avulla 30 (MCID, Toronto, Canada). Tässä analyysissä kaavan I . yhdisteet, esim. esimerkin 1 tai 2 yhdiste estävät li- haskalvon lisäkasvun, kun niitä annetaan suun kautta ' päivittäisenä 0,5-2,5 mg/kg:n annoksena.

·. i Kaavan I yhdisteet ovat myös käyttökelpoisia 35 analyyseihin makrof iliiniin sitoutuvien yhdisteiden läsnäolon tai määrän toteamiseksi, esim. vertailevissa » t · analyyseissa diagnostisiin tai seulontatarkoituksiin.

• » 28 113051

Kaavan I yhdisteitä voidaan käyttää seulontatyökaluna testattavassa liuoksessa, esim. veressä, veriseerumissa tai seulottavassa koenesteessä, olevien makrofilii-niin sitoutuvien yhdisteiden läsnäolon määrittämisek-5 si. Kaavan I yhdiste tehdään edullisesti liikkumattomaksi mikrotiitterialtaissa ja sen annetaan sitten sitoutua testattavan liuoksen mukanaollessa tai puuttuessa merkattuun makrofiliiniin-12 (FKBP-12). Vaihtoehtoisesti FKBP-12 tehdään liikkumattomaksi mikrotiitte-10 rialtaissa ja sen annetaan sitoutua testiliuoksen mukanaollessa tai puuttuessa kaavan I yhdisteeseen, joka on merkattu, esim. fluori-, entsymaattisesti- tai sä-teilymerkattu, esim. kaavan I yhdiste, jossa Ri sisältää merkkausryhmän. Levyt pestään ja sidotun merkatun 15 yhdisteen määrä mitataan. Testattavassa liuoksessa oleva makrofiliiniin sitoutuvan aineen määrä on karkeasti kääntäen verrannollinen sidotun merkatun yhdisteen määrään. Kvantitatiivista analyysiä varten tehdään standardisitoutumiskäyrä käyttäen tunnettuja mak-20 rofiliiniin sitoutuvan yhdisteen pitoisuuksia.

Kaavan I yhdisteet ovat siten käyttökelpoisia seuraavissa tiloissa: . a) Akuutin tai kroonisen elin- tai kudossiirrän- näisen hylkimisen hoitaminen ja estäminen, esim. vas- • * 25 taanottajan sydän-, keuhko-, yhdistetyn sydän-keuhko-, • ' maksa-, munuais-, haima-, iho- tai sarveiskalvosiir- : rännäisten hoitamiseksi. Ne on tarkoitettu myös siir- * '·· rännäinen-isäntä sairauden, kuten luuytimen siirtoa :T: seuraavan sairauden, estämiseen.

30 b) Siirrännäissuonisairauksien, esim. valtimonko- vetustaudin, hoitaminen ja estäminen.

» · ,·*·, c) Sileän lihaksen solujen uusikasvun ja migraati- • % on, joka johtaa suonen sisäkalvon paksunemiseen, ve- • · risuonen tukkeutumiseen, tukkeuttavaan sepelvaltimon *:**: 35 kovettumaan, uudelleenahtaumaan, hoitaminen ja estämi- • · · nen.

I I » * · * d) Autoimmuunisairauden ja tulehdustilojen hoita- » » • » 29 113051 minen ja estäminen, erityisesti taudin syitä koskevien tulehdustilojen, jotka sisältävät autoimmuunikomponen-tin, kuten niveltulehdus (esim. nivelreuma, kroonisesti etenevä niveltulehdus ja nivelkuluma) ja reumasai-5 raudet. Erikoisiin autoimmuunisairauksiin, joihin kaavan I yhdisteitä voidaan käyttää, kuuluvat hematologiset autoimmuunisairaudet (mukaanlukien esim. hemolyyt-tinen anemia, aplastinen anemia, puhdas punasoluanemia ja idiopaattinen trombosytopenia), systeeminen lupus 10 erythematosus, polychondritis, sclerodoma, Wegener granulamatosis, dermatomyositis, krooninen aktiivinen maksatulehdus, myastenia gravis, psoriasis, Steven-Johnson oireyhtymä, idiopaattinen sprue-tauti, autoimmuuni suolistotulehdussairaus (mukaanlukien esim. haa-15 vainen paksusuolen tulehdus ja Crohnin tauti), endokriininen silmäsairaus, Gravesin tauti, sarkoidoosi, multippeli skleroosi, primaarinen maksakirroosi, nuoruusiän diabetes (diabetes mellitus tyyppi I), uveiit-ti (etupuoleinen ja takapuoleinen), keratoconjunctuvis 20 sicca ja vernal keratoconjunctuvis, keuhkotibroosi, syyhyinen niveltulehdus, glomerulonephritis (nefroot-tisen oireyhtymän kanssa tai ilman sitä, esim. sisäl-täen idiopaattisen nefroottisen oireyhtymän tai lievän muutosnefropatian) ja nuoruusiän dermatomyosiitti.

25 e) Astman hoitaminen ja estäminen.

f) Monivaikutteisen lääkkeen (MDR) vastustuskyvyn käsittely. Kaavan I yhdisteet vaimentavat P-glykoproteiineja (Pgp), jotka ovat MDRtään liittyviä • kalvon siirtomolekyylejä. MDR on erityisen ongelmalli- 30 nen syöpäpotilailla ja AIDS potilailla, jotka eivät I reagoi tavanomaiseen kemoterapiaan, koska Pgp pumppaa j*”. lääkityksen ulos soluista. Kaavan I yhdisteet ovat si- , ten käyttökelpoisia muiden kemoterapeuttisten aineiden » » * '· : tehon parantamiseen monivaikutteisen lääkkeen vastus- ' * 35 tuskykyisten tilojen, kuten monivaikutteiselle lääk- keelle vastustuskykyisen syövän tai monivaikutteiselle lääkkeelle vastustuskykyisen AIDS:n, hoitamisessa ja 30 113051 hallinnassa.

g) Lisäkasvullisten sairauksien, esim. kasvaimien, liikalisäkasvullisen ihosairauden ja vastaavan, hoito.

h) Sieni-infektioiden hoito.

5 i) Tulehduksen hoito ja estäminen, varsinkin mah dollistettaessa steroidien toiminta.

j) Infektion hoito ja estäminen, erikoisesti patogeenien aiheuttaman infektion, jossa on Mip tai Mip-tyyppisiä tekijöitä.

10 Edellä oleviin taudin syihin tarvittava annos vaihtelee tietysti riippuen esim. hoidettavasta tilasta (esim. sairauden tyypistä tai vastustuskyvyn luonteesta) , halutusta vaikutuksesta ja antotavasta. Yleensä saadaan kuitenkin tyydyttäviä tuloksia annet-15 taessa suun kautta annoksia, jotka ovat luokkaa 0,05-5 tai jopa 10 mg/kg/päivä, esim. luokkaa 0,1-2 tai jopa 7,5 mg/kg/päivä, annettuna kerran päivässä tai jaettuina annoksina 2-4 kertaa päivässä, tai annettaessa ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti, esim. laskimon-20 sisäisesti, esim. laskimonsisäisellä tiputuksella tai ruiskeella, annoksina, jotka ovat luokkaa 0,01-2,5-jopa 5 mg/kg/päivä, esim. luokkaa 0,05 tai 0,1- jopa . 1,0 mg/kg/päivä. Sopivat annokset potilaille ovat si ten suun kautta luokkaa 500 mg, esim. luokkaa 5-100 mg 25 suun kautta, tai suonensisäisesti luokkaa 0,5-125- jo- » pa 250 mg, esim. luokkaa 2,5-50 mg suonensisäisesti.

Vaihtoehtoisesti ja myös edullisesti annoste-· lu järjestetään potilaalle ominaisella tavalla ennalta : määrättyjen minimiveritasojen tuottamiseksi, esim.

30 määritettynä RIA-tekniikan avulla. Täten potilaalle annostelu voidaan säätää säännöllisten jatkuvien RIA:n ,·**, avulla mitattujen minimi veritasoj en saavuttamiseksi, jotka ovat luokkaa 50 tai 150- jopa 500 tai 1000 t « :. ‘i ng/ml, s.o. annostelumenetelmiä vastaavasti, joita ny- 35 kyään käytetään immunosupressiivisessa syklosporiini- hoidossa (Ciclosporin) .

* < *

Kaavan I yhdisteitä voidaan antaa ainoana ak- • to 31 113051 tiivisena osana tai yhdessä muiden lääkeaineiden kanssa. Esimerkiksi immunosupressiivisissa käyttötarkoituksissa, kuten siirrännäisen-isännän välisen sairauden, siirrännäisen hylkimisen tai autoimmuunisairauden 5 estäminen ja hoito, kaavan I yhdisteitä voidaan käyttää yhdessä syklosporiinien tai askomysiinien tai im-munosupressiivisten analogien kanssa, esim. syklospo-rin A, syklosporin G, FK-506 j.n.e; kortikosteroidit; syklofosfamidi; atsatiopriini; metotreksaatti; bre-10 quinar; leflunomidi; mizoribiini; mykofenolihappo; my-kofenolaatti mofetil; immunosupressiiviset monokloona-tut vasta-aineet, esim. leukosyyttireseptoreiden mono-kloonatut vasta-aineet, esim. MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, CTLA4, B7, CD45, tai CD58 tai niiden li-15 gandit; tai muut immunomoduloitavat yhdisteet. Tulehdusta ehkäiseviin käyttötarkoituksiin kaavan I yhdisteitä voidaan käyttää yhdessä tulehtumista ehkäisevien aineiden, esim. kortikosteroidien, kanssa. Infektiota ehkäiseviin käyttötarkoituksiin kaavan I yhdisteitä 20 voidaan käyttää yhdessä muiden infektiota ehkäisevien aineiden, esim. virusten vastaisten lääkeaineiden tai antibioottien, kanssa.

; Kaavan I yhdisteitä annetaan kaikkien tavan- , omaisten reittien kautta, erityisesti suolen sisäises- 25 ti, esim. suun kautta, esim. liuosten muodossa juotavaksi, tablettien tai kapseleiden muodossa, tai ruoan-.* sulatuskanavan ulkopuolisesti, esim. ruiskutettavien ·· liuosten tai suspensioiden muodossa. Sopivat yksikkö- : annosmuodot annettavaksi suun kautta sisältävät esim.

30 1-50 mg kaavan I yhdistettä, tavallisesti 1-10 mg.

Farmaseuttisia seoksia, jotka sisältävät kaavan I yhdisteitä, voidaan valmistaa tavanomaiseen tapaan, » esim. rapamysiiniä sisältäviä farmaseuttisia seoksia i vastaavasti, kuten on kuvattu esim. patenttijulkaisus- ί 35 sa EPÄ 0 041 795.

Farmaseuttiset seokset sisältävät edullisesti kaavan I yhdisteen ja kantoaineen, joka väliaine si- 32 113051 sältää hydrofiilisen faasin, lipofiilisen faasin ja pinta-aktiivisen aineen. Ne voivat olla emulsio- tai mikroemulsioesikonsentraatin muodossa. Tällaisia emulsio- tai mikroemulsioesikonsentraatteja on esitetty 5 esim. patenttijulkaisussa UK 2 278 780 A. Edullisesti lipofiilinen faasi muodostaa 10-85 p% kantoaineesta; pinta-aktiivinen aine muodostaa 5-80 p% kantoaineesta; hydrofiilinen faasi muodostaa 10-50 p% kantoaineesta. Kaavan I yhdistettä on edullisesti mukana määrältään 10 2-15 p%. Erityisen edullinen farmaseuttinen seos kä sittää mikroemulsioesikonsentraattikantoaineen, joka sisältää i) risiiniöljyn ja etyleenioksidin reaktiotuotteen, 15 ii) kasviöljyn ja glyserolin transesteröintituot teen, joka sisältää pääosin linolihapon tai öljyhapon mono-, di- ja triglyseridejä tai polyoksialkyloitua kasviöljyä, iii) 1,2-propyleeniglykolia ja 20 iv) etanolia.

Edellä olevan mukaisesti keksintö tuottaa myös; A. Kaavan I yhdisteen käytettäväksi lääkeaineena, esim. edellä esitettyjen sairauksien estämiseen tai . 25 hoitamiseen.

B. Farmaseuttisen seoksen, joka sisältää kaavan I

·' yhdisteen yhdessä sitä varten farmaseuttisesti hyväk syttävän laimennus- tai kantoaineen kanssa.

Yllättäen on myös havaittu, että kaavan I yh-30 disteillä, joissa X on OH, s.o. 32(S)-dihydroyhdis-teillä on parantunut vaikutus, esim. edellä esitetyis-sä kokeissa, ja ne ovat stabiilimpia kuin vastaavat enantiomeerit, s.o. 32(R)-dihydroyhdisteet esim. al- ’· tistettaessa seuraavaan kokeeseen: ’ · 35 Testattavia yhdisteitä inkuboidaan rotan see- rumissa ja määritetään niiden sitoutumisaf f initeetti ·, FKBP-12:een MBA-analyysissa erilaisten inkubointiaiko- 1 k 33 113051 jen jälkeen. Affiniteetin vähentyessä nimellinen IC50 kasvaa. Affiniteetin vähennys liitetään yleensä yhdisteen epästabiiliuteen rotan seerumissa.

» » s » f * * ·

Claims (10)

113051

1. Rapamysiinijohdannainen, jolla on kaava I, f» = l^0H ? 10 .1 15 tunnettu siitä, että Ri on Ci-io-alkyyli, C3-i0-alkynyyli tai hydroksi-C3. io-alkynyyli, R2 on radikaali, jolla on kaava II: 20 d six 25 •' Kaava 11 1 : joissa R3 valitaan ryhmästä: H, Ci_4-alkyyli, hydroksi-C2-6- 30 alkyyli, hydroksi-Ci-6-alkoksi-C2.6-alkyyli tai Ci-6-*. alkoksi-C2.6-alkyyli ; R4 on metyyli; '· Ί Y on O; ja * ‘ X on OH tai H; edellyttäen, että X:n ollessa OH Ri 35 on muu kuin Ci-io-alkyyli.

2. R, = • · ^ ÖH 25 vs^J\OH 30 : tunnettu siitä, että Ri on C3.i0alk-2-ynyyli, .. R2 on patenttivaatimuksessa 1 määritetyn kaavan II * ! mukainen jäännös ja Y on O. I ·

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rapamysii-nijohdannainen, jolla on kaava Ia, 113051 f1 = V^° 0 ,a • OH j* tunnettu siitä, että Ri on C3-i0alk-2-ynyyli

15 R2 on patenttivaatimuksessa 1 määritetyn kaavan II mukainen jäännös ja Y on O.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rapamysii-nijohdannainen, jolla on kaavan Ib,

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rapamysii- .· * : ni johdannainen, tunnettu siitä, että se on 16- pent-2-ynyylioksi-32 (S) -dihydrorapamysiini tai 16-0- 113051 pent-2-ynyylioksi-32(S)-dihydro-40-O-(2-hydroksi-etyyli) -rapamysiini .

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rapamysiini johdannainen, tunnettu siitä, että se on 32- 5 deoksorapamysiini tai 16-0-pent-2-ynyyli-32-deokso-rapamysiini.

6. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen kaavan I yhdisteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 10 a) valmistetaan suojatussa tai suojaamattomassa muodossa kaavan I yhdiste, jossa X on H, poistamalla pelkistäen kaavan IVa, 1 Γ* Ξ I A^v

20. O o' y OH I ‘ jossa Ri ja Y ovat kuten patenttivaatimuksessa 1 on määritetty, yhdisteen asemassa 32 oleva karbonyyli, ja poistetaan tarvittaessa mukana olevat suojaryh- 30 mät; tai * ,·* b) valmistetaan kaavan I yhdiste, jossa X on OH, ; pelkistämällä stereoselektiivisesti edellä määritetyn . kaavan IVa yhdisteen asemassa 32 oleva karbonyyli; tai * i * ' \ c) annetaan yhdisteen, jolla on kaava I, jossa Ri 35 on alkyyli, reagoida Rx-OH-yhdisteen, jossa Rx on C3-i0- ! alkynyyli tai hydroksi-C3-10-alkynyyli, kanssa yhdis- teen, jolla on kaava I, jossa Ri on C3-i0-alkynyyli tai » i · 113051 hydroksyyli-C3-io-alkynyyli, tuottamiseksi.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen rapamysiinijohdannainen käytettäväksi lääkeaineena.

8. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu 5 siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1 - 5 mukaista yhdistettä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän laimennus- tai kantoaineen kanssa.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen farmaseuttinen koostumus käytettäväksi yhdessä farmaseuttisen 10 koostumuksen kanssa, joka käsittää toisen immunosu-pressiivisen, immunomoduloitavan lääkeaineen, tulehdusta ehkäisevän aineen tai infektion estävän aineen.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen yhdisteen käyttö valmistettaessa lääkettä akuutin 15 tai kroonisen elin- tai kudossiirrännäisen hylkimisen, siirrännäisverisuonisairauksien, restenoosin, autoimmuunisairauden, tulehdustilojen tai astman estämiseksi tai hoitamiseksi. » · « * « * t · * 1 · • · · • · * · I i » > 1 > » 1 1 113051 PATE1STTKRAV