RS65573B1 - Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije - Google Patents

Description

OPIS

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se generalno odnosi na bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T ćelije.

Osnova

Selektivno uništenje pojedinačne ćelije ili specifičnog tipa ćelija je često poželjno u različitim kliničkim postavkama. Na primer, primarni cilj terapije karcinoma je da ciljano uništi tumorske ćelije, a ostavi zdrave ćelije i tkiva netaknute i neoštećene.

Zanimljiv način da se to postigne je putem indukcije imunog odgovora protiv tumora da bi imunske efektorske ćelije, kao što su ćelije prirodne ubice (NK) ili citotoksični T limfociti (CTL), napale i uništile tumorske ćelije. CTL ćelije predstavljaju najsnažnije efektorske ćelije imunskog sistema, ali se ne mogu aktivirati efektorskim mehanizmom posredovanim Fc domenom konvencionalnih terapijskih antitela.

U tom smislu, bispecifična antitela dizajnirana da se vežu jednim „krakom“ za površinski antigen na ciljnim ćelijama, i drugim „krakom“ za aktivirajuću, nepromenljivu komponentu kompleksa T ćelijskih receptora (TCR), postala su interesantna poslednjih godina. Istovremeno vezivanje takvog antitela za oba cilja će izazvati privremenu interakciju između ciljne ćelije i T ćelije, i uzrokovati aktivaciju bilo koje citotoksične T ćelije, a nakon toga i lizu ciljne ćelije. Tako se imunski odgovor preusmerava na ciljne ćelije i ne zavisi od prezentacije peptidnog antigena od strane ciljne ćelije ili specifičnosti T ćelije, kao što je relevantno za normalnu MHC-ograničenu aktivaciju CTL. U ovom kontekstu, ključno je da se CTL aktiviraju samo kada ciljna ćelija predstavlja bispecifično antitelo za njih, tj. imitira se imunološka sinapsa. Naročito poželjna su bispecifična antitela koja ne zahtevaju pretkondicioniranje limfocita ili kostimulaciju kako bi se izazvala efikasna liza ciljnih ćelija.

Razvijeno je nekoliko formata bispecifičnih antitela, i ispitana je njihova prikladnost za imunoterapiju posredovanu T ćelijama. Od njih, takozvani BiTE (bispecifični T ćelijski angažer) molekuli su veoma dobro okarakterisani, i već su se pokazali obećavajuće na kliničkim ispitivanjima (revijalni rad Nagorsen i Bäuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)). BiTE-ovi su tandemski molekuli scFv u kojima su dva molekula scFv spojena fleksibilnim linkerom. Dalji bispecifični formati koji se procenjuju za uključivanje T ćelija uključuju dijatela (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) i njihove derivate, kao što su tandemska dijatela (Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66(1999)). Noviji razvoj predstavljaju takozvani DART (dvostruki afinitet za ponovno ciljanje) molekuli, koji se baziraju na formatu dijatela, ali imaju C-terminalni disulfidni most za dodatnu stabilizaciju (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)). Takozvani triomabovi, koji su kompletni hibridni mišji/pacovski molekuli IgG, i koji se trenutno procenjuju u kliničkim ispitivanjima, predstavljaju format veće veličine (čiji pregled je dat u Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). Različiti formati koji se razvijaju pokazuju veliki potencijal koji se pripisuje preusmeravanju T ćelija i aktivaciji u imunoterapiji. Zadatak generisanja bispecifičnih antitela koja su za to pogodna, međutim, nipošto nije trivijalan, i uključuje niz izazova koji se moraju ispuniti u vezi sa efikasnošću, toksičnošću, primenljivošću i produktivnošću antitela.

Mali konstrukti kao što su, na primer, molekuli BiTE - mada su u stanju da efikasno unakrsno povezuju efektorske i ciljne ćelije - imaju veoma kratak poluživot u serumu, što zahteva da se daju pacijentima putem kontinualne infuzije. Formati slični IgG-u, sa druge strane, iako imaju značajnu korist od dugog poluživota, imaju manu što su toksični vezano za nativne efektorske funkcije svojstvene molekulima IgG. Njihov imunogeni potencijal predstavlja još jednu nepovoljnu karakteristiku za uspešan terapijski razvoj bispecifičnih antitela nalik na IgG, posebno kod nehumanih formata. Konačno, glavni izazov u opštem razvoju bispecifičnih antitela je proizvodnja konstrukata bispecifičnih antitela u klinički dovoljnoj količini i čistoći, zbog pogrešnog sparivanja teških i lakih lanaca antitela različitih specifičnosti posle koekspresije, što smanjuje prinos ispravno sastavljenog konstrukta i dovodi do brojnih nefunkcionalnih sporednih proizvoda, od kojih može biti teško razdvojiti željeno bispecifično antitelo.

Različiti pristupi su uzeti za prevazilaženje problema vezivanja lanca u bispecifičnim antitelima (vidi npr. Klein et al., mAbs 6, 653-663 (2012)). Na primer, strategija "dugme u rupici" ima za cilj prinudno sparivanje dva različita teška lanca antitela uvođenjem mutacija u CH3 domene radi modifikacije kontaktne međupovršine. Na jednom lancu, glomazne aminokiseline se zamenjuju aminokiselinama sa kratkim bočnim lancima, da bi se stvorila "rupica". Nasuprot tome, aminokiseline sa velikim bočnim lancima se uvode u drugi CH3 domen, da bi se stvorilo "dugme". Koekspresijom ova dva teška lanca (i dva identična laka lanca, koji moraju biti prikladni za oba teška lanca), primećeni su visoki prinosi heterodimera ("dugme-rupica") u odnosu na homodimer ("rupica-rupica" ili "dugme-dugme") (Ridgway, JB, et al., Protein Eng.9 (1996) 617-621; i WO 96/027011). Procenat heterodimera mogao bi se dodatno povećati remodelovanjem interakcijskih površina dva CH3 domena, koristeći pristup displeja faga i uvođenje disulfidnog mosta radi stabilizacije heterodimera (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech.16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol.270 (1997) 26-35). Novi pristupi za tehnologiju dugmeta u rupici opisani su npr. u EP 1870459 A1.

Međutim, strategija ''dugme u rupici'' ne rešava problem pogrešnog sparivanja teški lanac - laki lanac, koji se javlja u bispecifičnim antitelima koja sadrže različite lake lance za vezivanje za različite ciljne antigene.

Strategija za sprečavanje pogrešnog sparivanja teški lanac - laki lanac je razmena domena između teških i lakih lanaca jednog od vezujućih krakova bispecifičnog antitela (vidi WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 i Schaefer, W. et al., PNAS, 108 (2011) 11187-11191, koji se odnose na bispecifična antitela IgG sa unakrsno izmenjenim domenom).

Razmena varijabilnih domena teškog i lakog lanca VH i VL u jednom od vezujućih krakova bispecifičnog antitela (WO2009/080252, vidi takođe Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191) jasno smanjuje sporedne proizvode uzrokovane pogrešnim sparivanjem lakog lanca protiv prvog antigena sa pogrešnim teškim lancem protiv drugog antigena (u poređenju sa pristupom bez takve razmene domena). Ipak, ovi preparati antitela nisu potpuno bez sporednih proizvoda. Glavni sporedni proizvod zasnovan je na interakciji tipa Bens Džons (Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191; na slici S1I dodatka). Dalje smanjenje takvih sporednih proizvoda je poželjno da bi se poboljšao npr. prinos takvih bispecifičnih antitela.

Imajući u vidu teškoće i nedostatke povezane sa trenutno dostupnim bispecifičnim antitelima za imunoterapiju posredovanu T ćelijama, ostaje potreba za novim, poboljšanim formatima takvih molekula. Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifične antigen vezujuće molekule za aktiviranje i preusmeravanje T ćelija, koji kombinuju dobru efikasnost i produktivnost sa niskom toksičnošću i povoljnim farmakokinetičkim svojstvima.

Rezime pronalaska

Pronalazak je kao što je definisano u zahtevu 1. Prema ovim pronalaskom, odnos željenog bispecifičnog antitela u poređenju sa neželjenim sporednim proizvodima, posebno sporednim proizvodima tipa Bens Džons koji se javljaju u bispecifičnim antitelima sa VH/VL domenom u jednom od vezujućih krakova, može se poboljšati uvođenjem naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjem na specifičnim položajima aminokiselina u CH1 i CL domenima.

Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, kao što je definisano u zahtevu 1, koji obuhvata

(a) prvi molekul Fab koji se specifično vezuje za CD20;

(b) drugi molekul Fab koji se specifično vezuje za CD3 epsilon, i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH lakog lanca Fab i teškog lanca Fab zamenjeni jedan drugim; (c) c) treći molekul Fab koji se specifično vezuje za CD20; i

; i

pri čemu

u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c), aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu, u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c), aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 je zamenjena glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu);

Prema pronalasku, drugi molekul Fab je unakrsno izmenjeni molekul Fab u kome su razmenjeni varijabilni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab, prvi i treći molekul Fab su konvencionalni molekuli Fab, i najviše jedan molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za aktivirajući antigen T ćelije je prisutan u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T ćelije (tj. bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije obezbeđuje jednovalentno vezivanje za aktivirajući antigen T ćelije).

U konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c), aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu), i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana argininom (R) (numeracija prema Kabatu), i u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c), aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži treći molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen.

Treći molekul Fab je identičan prvom molekulu Fab. Treći molekul Fab tako sadrži iste aminokiselinske supstitucije kao i prvi molekul Fab. Kao i prvi molekul Fab, treći molekul Fab je posebno konvencionalni molekul Fab.

Prvi i treći molekul Fab se specifično vezuju za CD20, a drugi molekul Fab se specifično vezuje za CD3, konkretnije CD3 epsilon.

Prvi molekul Fab pod a) i drugi molekul Fab pod b) su spojeni jedan sa drugim, preko peptidnog linkera.

Prema predmetnom pronalasku, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U aspektima otkrića gde je bilo (i) drugi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab ili (ii) prvi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, dodatno laki lanac Fab molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab mogu biti spojeni jedan sa drugim, opciono preko peptidnog linkera. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema ovom pronalasku dodatno sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje.

Drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve podjedinice Fc domena. Prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab.

Prema pronalasku, treći molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve podjedinice Fc domena. Drugi kao i treći molekul Fab su spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena, a prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u suštini sadrži molekul imunoglobulina, pri čemu su varijabilni regioni VH i VL teškog i lakog lanca u jednom od krakova Fab razmenjeni/zamenjeni jedan drugim, i pri čemu je dodatni (konvencionalni) molekul Fab spojen N-krajem sa pomenutim krakom Fab.

U bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, ovde opisane aminokiselinske supstitucije su u CH1 i CL domenima prvog i trećeg molekula Fab. U skladu sa konceptom predmetnog pronalaska, aminokiselinske supstitucije, kao što su ovde opisane, načinjene su u prvom i trećem molekulu Fab, a takve aminokiselinske supstitucije nisu načinjene u drugom molekulu Fab.

Aminokiselinske supstitucije, kao što su ovde opisane, načinjene su u prvom i trećem molekulu Fab i konstantni domen CL prvog i trećeg molekula Fab je kapa izotipa. Konstantni domen CL prvog (i trećeg) molekula Fab i konstantni domen CL drugog molekula Fab su kapa izotipa.

Molekul imunoglobulina koji se nalazi u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku je imunoglobulin potklase IgG1. U jednom aspektu otkrića, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG4.

Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, i taj molekul obuhvata

a) prvi molekul Fab koji se specifično vezuje za CD20;

b) drugi molekul Fab koji se specifično vezuje za CD3 epsilon, i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH lakog lanca Fab i teškog lanca Fab zamenjeni jedan drugim; c) treći molekul Fab koji se specifično vezuje za CD20; i

d) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju; pri čemu, treći molekul Fab pod c) je identičan prvom molekulu Fab pod a);

pri čemu, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c), aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu), i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana argininom (R) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu, u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c), aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu); i

pri čemu, prvi molekul Fab pod a) je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab pod b), a drugi molekul Fab pod b) i treći molekul Fab pod c) su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena pod d).

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, Fc domen je Fc domen IgG1. U jednom aspektu otkrića, Fc domen je Fc domen IgG4. U još konkretnijem aspektu otkrića, Fc domen je FC domen IgG4koji sadrži aminokiselinsku supstituciju S228P (Kabatova numeracija). Fc domen je humani Fc domen.

Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše asocijaciju prve i druge podjedinice Fc domena. Aminokiselinski ostatak u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena zamenjen je aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se generiše izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, i aminokiselinski ostatak u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice unutar koje izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice može da se pozicionira.

Fc domen pokazuje smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1. Fc domen je konstruisan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili redukovanu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. Jedna ili više aminokiselinskih supstitucija u Fc domenu koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju je u jednom ili više položaja izabranih iz grupe koju čine L234, L235 i P329 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Svaka podjedinica Fc domena sadrži tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, pri čemu su navedene aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Fc domen je Fc domen IgG1, konkretno Fc domen humanog IgG1. U drugim aspektima otkrića, svaka podjedinica Fc domena sadrži dve aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, pri čemu su pomenute aminokiselinske supstitucije L235E i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom takvom aspektu otkrića, Fc domen je Fc domen IgG4, konkretno Fc domen humanog IgG4. U jednom aspektu, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije je FC domen IgG4, a sadrži aminokiselinske supstitucije L235E i S228P (SPLE) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Fc receptor je Fcγ receptor. Fc receptor je humani Fc receptor i Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. Fc receptor je humani FcγRIIa, FcγRI i/ili FcγRIIIa. Efektorska funkcija je ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC).

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži molekul Fab koji se specifično vezuje za CD3, tačnije CD3 epsilon, sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 iz SEQ ID NO: 4, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 5, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 8, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 9 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 10. U jednom aspektu otkrića, molekul Fab koji se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen, konkretno CD3, konkretnije CD3 epsilon, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 7. Drugi molekul Fab sadržan u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku specifično se vezuje za CD3, konkretnije CD3 epsilon, i sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 4, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 5, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 8, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 9 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 10. Drugi molekul Fab sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži dva molekula Fab koji se specifično vezuju za antigen ciljne ćelije CD20, koji sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 46, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 47, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 49, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 50 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 51. U jednom aspektu otkrića, molekul Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije, konkretno CD20, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 30 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 31. Prvi i treći molekul Fab sadržani u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, specifično se vezuju za CD20 i sadrže region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 46, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 47, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 49, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 50 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 51. Prvi i treći molekul Fab sadrže varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, i taj molekul obuhvata

a) prvi molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen;

b) drugi molekul Fab koji se specifično vezuje za drugi antigen, i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH lakog lanca Fab i teškog lanca Fab zamenjeni jedan drugim; c) treći molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen; i

d) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju; pri čemu

(i) prvi antigen je CD20, i drugi antigen je CD3, konkretno CD3 epsilon;

(ii) prvi molekul Fab pod a) i treći molekul Fab pod c) svaki sadrže region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 46, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 47, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 49, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 50 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 51, a drugi molekul Fab pod b) sadrži CDR 1 teškog lanca SEQ ID NO: 4, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 5, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 8, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 9 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 10;

(iii) u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana lizinom (K) ili argininom (R), posebno argininom (R) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu); i

(iv) prvi molekul Fab pod a) je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab pod b), a drugi molekul Fab pod b) i treći molekul Fab pod c) su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena pod d).

Prema drugom aspektu otkrića, obezbeđen je jedan ili više izolovanih polinukleotida koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz pronalaska. Otkriće dalje obezbeđuje jedan ili više ekspresionih vektora koji sadrže izolovani(e) polinukleotid(e) iz pronalaska, i ćeliju domaćina koja sadrži izolovani(e) polinukleotid(e) ili ekspresione vektor(e) iz otkrića. U nekim aspektima pronalaska, ćelija domaćina je eukariotska ćelija, posebno ćelija sisara.

U drugom aspektu, obezbeđen je postupak za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema otkriću, koji obuhvata korake a) uzgajanja ćelije domaćina iz ovog otkrića pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije i b) izolovanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije. Otkriće takođe uključuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i koji je proizveden pomoću postupka iz ovog pronalaska.

Ovo otkriće dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Otkriće obuhvata i postupke korišćenja bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska. U jednom aspektu, otkriće obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ili farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska koji bi se koristili kao lek. U jednom aspektu je obezbeđen bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ili farmaceutska kompozicija prema otkriću, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinaca kojima je to potrebno. U specifičnom aspektu otkrića, bolest je kancer.

Takođe je otkrivena upotreba bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema pronalasku za proizvodnju leka za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno; koja se sastoji od davanja navedenom pojedincu terapeutski delotvorne količine kompozicije koja sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku u farmaceutski prihvatljivom obliku. U jednom aspektu otkrića, bolest je kancer. U bilo kom od gore navedenih aspekata, pojedinac je poželjno sisar, naročito čovek.

Kratak opis slika

SLIKA 1. Primeri za konfiguracije bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije (TCB) iz pronalaska (Slika 1 B) i otkrića (Slike A, D-Z). (A, D) Ilustracija molekula "1 1 CrossMab". (B, E) Ilustracija molekula "2 1 IgG CrossFab" sa alternativnim redosledom CrossFab i Fab komponenata ("invertovani"). (C, F) Ilustracija molekula "2 1 IgG CrossFab". (G, K) Ilustracija molekula "1 1 IgG CrossFab" sa alternativnim redosledom Crossfab i Fab komponenata ("invertovani"). (H, L) Ilustracija molekula "1 1 IgG CrossFab". (I, M) Ilustracija molekula "2 1 IgG CrossFab" sa dva CrossFab-a. (J, N) Ilustracija molekula "2 1 IgG CrossFab" sa dva CrossFab-a i alternativnim redosledom Crossfab i Fab komponenata ("invertovani"). (O, S) Ilustracija molekula "Fab-Crossfab". (P, T) Ilustracija molekula “Crossfab-Fab”. (Q, U) Ilustracija molekula “(Fab)2-Crossfab”. (R, V) Ilustracija molekula “CrossFab-(Fab)2”. (W, Y) Ilustracija molekula “Fab-(CrossFab)2”. (X, Z) Ilustracija molekula “(CrossFab)2-Fab”. Crna tačka: opciona modifikacija u Fc domenu koja promoviše heterodimerizaciju. +, --: aminokiseline suprotnih naelektrisanja uvedene u CH i CL domene.

SLIKA 2. Ilustracija TCB-a pripremljenih u Primeru 1. (A) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” bez izmena naelektrisanja (CH1/CL razmena u CD3 vezivaču), (B) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (C) "2 1 IgG CrossFab" sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (D) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” bez izmena naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču), (E) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” bez izmena naelektrisanja (VH-CH1/VL-CL razmena u CD3 vezivaču), (F) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD20 vezivačima, izmena naelektrisanja u CD3 vezivaču, EE = 147E, 213E; KK = 123K, 124K), (G) "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa izmenama naelektrisanja i DDKK mutacijom u Fc regionu (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (H) "1 1 CrossMab ”sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivaču, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (I) "1 1 CrossMab" sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivaču, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K, različit vezivač za CD20), (J) "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa izmenama naelektrisanja 213E, 123R (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivaču, E = 213E; R = 123R), (K) “2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena i izmena naelektrisanja u CD3 vezivaču).

SLIKA 3. (A-I, N, O) CE-SDS analiza TCB-ova pripremljenih u Primeru 1 (finalni prečišćeni preparati). (A) Elektroferogram molekula “A”, prikazan na slici 2A, (B) elektroferogram molekula ”B”, prikazan na slici 2B, (C) elektroferogram molekula ”C”, prikazan na slici 2C, (D) elektroferogram molekula ”D”, prikazan na slici 2D, (E) elektroferogram molekula ”E”, prikazan na slici 2E, (F) elektroferogram molekula ”F”, prikazan na slici 2F, (G) elektroferogram molekula ”G”, prikazan na slici 2G, (H) elektroferogram molekula ”H”, prikazan na slici 2H, (I) elektroferogram molekula ”I”, prikazan na slici 21, (N) elektroferogram molekula ”J”, prikazan na slici 2J, (O) elektroferogram molekula ”K”, prikazan na slici 2K. Traka A = neredukovana, traka B = redukovana. (J-L, P, Q) SDS-PAGE analiza TCB-ova pripremljenih u Primeru 1 nakon prvog koraka prečišćavanja (afinitetna hromatografija sa proteinom A). (J) 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE, neredukovan; traka 1 = marker (Mark 12, neobojeni standard, Invitrogen); traka 2-11 = frakcije iz afinitetne hromatografije sa proteinom A molekula B, (K) 3-8% Tris-Acetat SDS-PAGE, neredukovan; traka 1 = marker (HiMark, Invitrogen); traka 2-12 = frakcije iz afinitetne hormatografije sa proteinom A molekula C, (L) 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE, neredukovan; traka 1 = marker (Mark 12, neobojeni standard, Invitrogen); traka 2-14 = frakcije iz afinitetne hromatografije sa proteinom A molekula D, (P) 4-12% Bis/Tris SDS PAGE, neredukovan; traka 1 = marker (Mark 12, Invitrogen); traka 2 -10 = frakcije iz afinitetne hromatografije sa proteinom A molekula J, (Q) 4-12% Bis/Tris SDS PAGE, neredukovan; traka 1 = marker (Mark 12, Invitrogen); traka 2-12 = frakcije iz afinitetne hromatografije sa proteinom A molekula K. (M) Preparativna hromatografija na molekulskim sitima (SEC; prvi korak prečišćavanja) TCB-ova pripremljenih u Primeru 1 (molekul A (prvi korak SEC), B i D, kako je naznačeno).

SLIKA 4. CD3 i CD20 vezivanje anti-CD3/anti-CD20 T-ćelijskih bispecifičnih (TCB) antitela (“CD20 TCB”) sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (“naelektrisani ostaci”) (vidi Primer 1).

SLIKA 5. Liza tumorskih ćelija indukovana anti-CD3/anti-CD20 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelima (“CD20 TCB”) sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (“naelektrisani ostaci”) nakon 22 h inkubacije sa humanim PBMC (vidi Primer 1).

SLIKA 6. Aktivacija CD8<+>T-ćelija (A) ili CD4<+>T-ćelija (B) nakon ubijanja CD20-eksprimirajućih tumorskih ciljnih ćelija posredstvom T-ćelija (Nalm-6) indukovana anti-CD3/anti-CD20 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelima ("CD20 TCB") sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja ("naelektrisani ostaci") (vidi Primer 1).

SLIKA 7. Aktivacija CD8<+>T-ćelija (A) ili CD4<+>T-ćelija (B) nakon ubijanja CD20-eksprimirajućih tumorskih ciljnih ćelija posredstvom T-ćelija (Z-138) izazvanog antiCD3/anti-CD20 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelima ("CD20 TCB") sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja ("naelektrisani ostaci") (vidi Primer 1).

SLIKA 8. Iscrpljivanje B ćelija u punoj krvi zdravog čoveka nakon inkubacije sa anti-CD3/anti-CD20 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelima (“CD20 TCB”) sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (“naelektrisani ostaci”); test od 22 h (vidi Primer 1).

SLIKA 9. Aktivacija CD8<+>T-ćelija (A) ili CD4<+>T-ćelija (B) nakon ubijanja CD20-eksprimirajućih B ćelija posredstvom T-ćelija u punoj krvi zdravog čoveka indukovanog anti-CD3/anti-CD20 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelima (“CD20 TCB”) sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (“naelektrisani ostaci”) (vidi Primer 1).

SLIKA 10. Vezivanje anti-CD20/anti-CD3 TCB (molekul "B" prikazan na slici 2B) za humane CD20-(A) i CD3-eksprimirajuće (B) ciljne ćelije.

SLIKA 11. Vezivanje anti-CD20/anti-CD3 TCB (molekul "B" prikazan na slici 2B) za CD20- i CD3-eksprimirajuće ciljne ćelije ljudi i majmuna cinomolgus. (A) B-ćelije, (B) CD4 T-ćelije, (C) CD8 T-ćelije.

SLIKA 12. Liza tumorskih ćelija posredovana različitim formatima anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela.

SLIKA 13. Liza tumorskih ćelija i naknadna aktivacija T-ćelija posredovana različitim formatima anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela. (AC) Liza Z138 ciljnih ćelija tumora pomoću PBMC efektorskih ćelija tri različita humana donora. (D) Liza panela DLBCL tumorskih ćelijskih linija kao što je naznačeno.

SLIKA 14. Iscrpljivanje B ćelija u ljudskoj punoj krvi posredovano različitim formatima anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela.

SLIKA 15. Aktivacija T-ćelija različitim formatima anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela, procenjena kvantifikacijom intenziteta CD3 nishodne signalizacije pomoću Jurkat-NFAT reporter testa.

SLIKA 16. Farmakokinetički parametri davanja i.v. bolusa od 0,5 mg/kg anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela (molekul "B" prikazan na slici 2B) iz retkih podataka iz uzoraka NOG miševa.

SLIKA 17. Šematski prikaz dizajna studije za procenu aktivnosti iscrpljivanja B ćelija anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela (molekul "B" prikazan na slici 2B) u potpuno humanizovanim NOG miševima.

SLIKA 18. Kinetika frekvencije B-ćelija i T-ćelija u krvi potpuno humanizovanih NOG miševa tretiranih (B) anti-CD20/anti-CD3 TCB antitelom (molekul "B" prikazan na Slici 2B) ili (A) kontrolom nosača. D0, D7: dani terapijske injekcije.

SLIKA 19. Analiza ekspresije različitih površinskih markera na perifernim T-ćelijama tri dana (D3) i deset dana (DIO) nakon primene nosača (crne trake) ili injekcije anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela (molekul "B" prikazan na slici 2B) (bele trake) u potpuno humanizovanim miševima.

SLIKA 20. Analiza frekvencije B-ćelija (A), frekvencije T-ćelija (B) i ekspresije površinskih markera na T-ćelijama (C) u slezini potpuno humanizovanih miševa tretiranih nosačem (crne trake) ili anti-CD20/anti-CD3 TCB antitelom (molekul "B" prikazan na slici 2B) (bele trake) na kraju studije (D10 nakon prve terapeutske injekcije).

SLIKA 21. Anti-tumorska aktivnost anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela (molekul "B" prikazan na slici 2B) (0,5 mg/kg, jednom nedeljno) na WSU-DLCL2 modelu kod NOG miševa sa prenosom huPBMC.

SLIKA 22. Ilustracija "2 1 IgG CrossFab, invertovanih" molekula pripremljenih u Primeru 2. (1) Molekul bez modifikacija naelektrisanja, (2) molekul sa modifikacijama naelektrisanja u CH1 i CL domenima molekula Fab koji se specifično vezuju za BCMA (EE = 147E, 213E; KK = 123K, 124K).

SLIKA 23. CE-SDS analiza (traka A = neredukovana, traka B = redukovana, tabela pika za traku A) "2 1 IgG CrossFab, invertovanih" molekula korišćenih u Primeru 2. Za molekul bez modifikacije naelektrisanja (83A10-TCB) i molekul sa modifikacijama naelektrisanja (83A10-TCBcv) primenjene su različiti postupci prečišćavanja (afinitetna hromatografija sa proteinom A (PA), gel hromatografija (SEC), hromatografija izmene katjona (cIEX) i finalni korak gel hromatografije (re-SEC)).

SLIKA 24. Koraci prečišćavanja CE-SDS analiza (traka A = neredukovana, traka B = redukovana, tabela pika za traku A) "2 1 IgG CrossFab, invertovanih" molekula korišćenih u Primeru 2, u direktnom (H2H) poređenju nakon afinitetne hromatografije sa proteinom A (PA) i gel hromatografije (SEC).

SLIKA 25. Analiza protočne citometrije vezivanja anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za BCMA pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma. (A) 83A10-TCB na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama, (B) 83A10-TCBcv na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama, (C) poređenje 83A10-TCB i 83A10-TCBcv na H929 ćelijama.

SLIKA 26. Ubijanje BCMA-pozitivnih H929 ćelija mijeloma pomoću anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ((A) 83A10-TCB, (B) 83A10-TCBcv) mereno oslobađanjem LDH.

SLIKA 27. Ilustracija TCB-a pripremljenih u Primeru 3. (A) "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u Her2 vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (B) "2+1 IgG CrossFab" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u Her3 vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K).

SLIKA 28. CE-SDS analiza TCB-a pripremljenih u Primeru 3 (finalni prečišćeni preparat). (A) Elektroferogram Her2 TCB, prikazan na slici 27A, (B) elektroferogram Her3 TCB, prikazan na slici 27B. Traka A = neredukovana, traka B = redukovana.

SLIKA 29. Vezivanje Her2 TCB (A) i Her3 TCB (B) za ćelije, kako je određeno pomoću FACS. Medijana intenziteta fluorescencije za vezivanje Her2 TCB molekula za humani CD3 na Jurkatovim ćelijama (levo) ili za humani Her2 (A) ili Her3 (B) na KPL-4 ćelijama (desno), mereno protočnom citometrijom. Prikazane su srednje vrednosti fluorescencije, zasnovane na triplikatima, uključujući SD.

SLIKA 30. Aktivacija T-ćelija pomoću Her3 TCB. Nakon zajedničke inkubacije humanih PBMC efektorskih ćelija, KPL-4 ciljnih ćelija i porasta koncentracija Her3 TCB, procenat CD69 pozitivnih CDS T-ćelija je izmeren pomoću FACS nakon 48 h. Prikazani su triplikati sa SD.

SLIKA 31. Aktivacija Jurkatovih ćelija preko CD3 nakon 5h, kao što je određeno luminescencijom. Nakon inkubacije KPL4 tumorskih ćelija sa Jurkat-NFAT reporterskim ćelijama (E:T 5:1 (A) ili 2,5:1 (B)) i porasta koncentracija Her2 TCB (A) ili Her3 TCB (B), aktivacija Jurkata je određena relativnim luminiscentnim signalima (RLUS) nakon 5h. Vrednosti EC50 su izračunate pomoću softvera Graph Pad Prism (34,4 pM (A) i 22 pM (B)). Prikazane su prosečne vrednosti triplikata, trake sa greškama označavaju SD.

SLIKA 32. (A, B) Liza tumorskih ćelija, merena oslobađanjem LDH, nakon inkubacije Her2-pozitivnih KPL4, N87, T47D ili MDA-MB-231 ciljnih ćelija sa humanim PBMC efektorskim ćelijama (E:T 10:1) i povećanjem koncentracije Her 2 TCB molekula tokom 25 h (A) ili 46 h (B). Prikazane su prosečne vrednosti triplikata, trake sa greškama označavaju SD. Vrednosti EC50 izračunate su pomoću softvera Graph Pad Prism: 7,5 pM (KPL4 ćelije), 25,6 pM (N87 ćelije), 30,6 pM (T47D ćelije) i 59,9 pM (MDA-MB-231 ćelije). (C) Liza tumorskih ćelija, kao što je izmerena otpuštanjem LDH, nakon inkubacije Her3-pozitivnih KPL4 ciljnih ćelija sa humanim PBMC efektorskim ćelijama (E:T 10:1) i povećanjem koncentracija molekula Her 3 TCB tokom 24 h ili 48 h, kao što je naznačeno. Prikazane su prosečne vrednosti triplikata, trake sa greškama označavaju SD. Vrednosti EC50 izračunate su pomoću softvera Graph Pad Prism: 2,54 pM (24 h) i 0,53 pM (48 h).

SLIKA 33. Liza tumorskih ćelija, indukovana pomoću Her3 TCB, određena aktivnošću kaspaze 3/7 (luminescencija). Prikazan je relativni luminescentni signal, koji je izmeren kao posledica aktivnosti kaspaze 3/7 u KPL-4-kaspaza-3/7 GloSensor ciljnim ćelijama nakon 6,5 h zajedničke inkubacije sa PBMC (E:T = 10:1) i različitih koncentracija Her3 TCB, kao što je naznačeno. Prikazani su triplikati sa SD. Vrednosti EC50 izračunate su pomoću softvera Graph Pad Prism: 0,7 pM.

SLIKA 34. Ilustracija TCB-a pripremljenih u Primeru 4. (A) " (Fab)2-CrossFab" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u MCSP vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (B) “(Fab)2-CrossFab ”bez modifikacija naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču).

SLIKA 35. CE-SDS analiza TCB-a sa modifikacijama naelektrisanja pripremljenih u Primeru 4 (finalni prečišćeni preparat): Elektroferogram (Fab)2-XFab-LC007cv, prikazan na slici 34A. Traka A = neredukovana, traka B = redukovana.

SLIKA 36. Medijana intenziteta fluorescencije za vezivanje TCB molekula za humani MCSP na MV-3 ćelijama (levo) ili za humani CD3 na Jurkatovim ćelijama (desno), izmerena protočnom citometrijom. Prikazane su srednje vrednosti fluorescencije, zasnovane na triplikatima, uključujući SD.

SLIKA 37. Liza tumorskih ćelija, merena oslobađanjem LDH, nakon inkubacije humanih MCSP-pozitivnih MV-3 ćelija sa humanim PBMC efektorskim ćelijama (E:T 10:1) i povećanjem koncentracije TCB molekula tokom 24 h (levo) ili 48 h (desno). Prikazane su prosečne vrednosti triplikata, trake sa greškama označavaju SD.

Detaljan opis pronalaska

Pronalazak je kao što je definisan u zahtevu.

Definicije

Termini se ovde koriste kao što se tipično koriste u struci, osim ako nije drugačije definisano u nastavku.

Kako se ovde koristi, izraz „antigen vezujući molekul” se u najširem smislu odnosi na molekul koji specifično vezuje antigensku determinantu. Primeri antigen vezujućih molekula su imunoglobulini i njihovi derivati, npr. fragmenti.

Termin „bispecifični“ znači da je antigen vezujući molekul sposoban da se specifično veže za najmanje dve različite antigenske determinante. Tipično, bispecifični antigen vezujući molekul sadrži dva mesta vezivanja antigena, od kojih je svako specifično za različitu antigensku determinantu. Bispecifični antigen vezujući molekul je sposoban da istovremeno vezuje dve antigenske determinante, naročito dve antigenske determinante eksprimirane na dve različite ćelije.

Termin „valentno“ kako se ovde koristi označava prisustvo određenog broja mesta vezivanja antigena u antigen vezujućem molekulu. Kao takav, termin „jednovalentno vezivanje za antigen“ označava prisustvo jednog (i ne više od jednog) mesta vezivanja antigena specifičnog za antigen u antigen vezujućem molekulu.

„Mesto vezivanja antigena“ se odnosi na mesto, tj. jedan ili više aminokiselinskih ostataka, antigen vezujućeg molekula koji osigurava interakciju sa antigenom. Na primer, antigen-vezujući deo antitela sadrži aminokiselinske ostatke iz regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Prirodni molekul imunoglobulina obično ima dva mesta vezivanja antigena, molekul Fab obično ima jedno mesto vezivanja antigena.

Kako se ovde koristi, termin „antigen vezujući ostatak” se odnosi na molekul polipeptida koji se specifično vezuje za antigensku determinantu. Antigen vezujući ostatak je u stanju da usmeri entitet za koji je vezan (npr. drugi antigen vezujući ostatak) na ciljno mesto, na primer na specifičan tip tumorskih ćelija ili stromu tumora koja nosi antigensku determinantu. Antigen vezujući ostatak je u stanju da aktivira signalizaciju kroz svoj ciljni antigen, na primer antigen kompleksa receptora T ćelija. Antigen vezujući ostaci uključuju antitela i njihove fragmente, kao što je ovde definisano. Konkretni antigen vezujući ostaci uključuju antigen-vezujući domen antitela, koji obuhvata varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. U određenim aspektima, antigen vezujući ostaci mogu obuhvatati konstantne regione antitela, kao što je ovde definisano i poznato u struci. Korisni konstantni regioni teškog lanca uključuju bilo koji od pet izotipova: α, δ, ε, γ ili μ. Korisni konstantni regioni lakog lanca uključuju bilo koji od dva izotipa:<K>i λ.

Kako se ovde koristi, termin „antigenska determinanta” je sinonim za „antigen” i

„epitop”, i odnosi se na mesto (npr. susedni deo aminokiselina ili konformaciona konfiguracija sastavljena od različitih regiona nesusednih aminokiselina) na polipeptidnom makromolekulu za koji se vezuje antigen vezujući deo, formirajući antigen vezujući kompleks ostatak-antigen. Korisne antigenske determinante mogu se naći, na primer, na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih virusom, na površinama drugih obolelih ćelija, na površini imunih ćelija, slobodne u serumu u krvi i/ili u ekstracelularnoj matrici (ECM). Proteini koji se ovde navode kao antigeni (npr. CD3) mogu biti svi nativni oblici proteina koji potiču od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naznačeno. U konkretnom otelotvorenju, antigen je humani protein. Kada se ovde pominje specifični protein, termin obuhvata neprerađeni protein „pune dužine“, kao i bilo koji oblik proteina koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante proteina, npr. splajsovane ili alelne varijante. Primer humanog proteina korisnog kao antigen je CD3, posebno epsilon podjedinica CD3 (vidi UniProt br. P07766 (verzija 130), NCBI RefSeq br. NP_000724.1, ID.BR.SEKV: 1 za humanu sekvencu; ili UniProt br. Q95LI5 (verzija 49), NCBI GenBank br. BAB71849.1, ID.BR.SEKV: 2 za sekvencu cinomolgusa [Macaca fascicularis]). Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz ovog pronalaska vezuje se za epitop CD3 ili antigen ciljne ćelije koji je sačuvan među antigenom CD3 ili antigenom ciljne ćelije različitih vrsta.

Pod „specifičnim vezivanjem” podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen i može se razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost antigen vezujućeg ostatka da se veže za specifičnu antigensku determinantu može se meriti bilo putem testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili putem drugih tehnika poznatih stručnim licima, npr. tehnikama površinske plazmonske rezonance (SPR) (analizirana na BIAcore instrumentu) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). U jednom aspektu, stepen vezivanja antigen vezujućeg ostatka za nevezani protein je manji od oko 10% vezivanja antigen vezujućeg ostatka za antigen, kao što je mereno, npr. pomoću SPR. U nekim aspektima, antigen vezujući ostatak koji se vezuje za antigen, ili antigen vezujući molekul koji sadrži taj antigen vezujući ostatak, ima konstantu disocijacije (KD) od ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, < 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).

„Afinitet“ se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. receptora) i njegovog partnera u vezivanju (npr. liganda). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antigen vezujući ostatak i antigen, ili receptor i njegov ligand). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može se generalno predstaviti preko konstante disocijacije (KD), koja predstavlja odnos konstanti stope disocijacije i stope asocijacije (koffodnosno kon). Tako ekvivalentni afiniteti mogu da uključe različite konstante brzine, dokle god odnos konstanti brzine ostaje isti. Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koji su ovde opisani. Poseban postupak za merenje afiniteta je površinska plazmonska rezonanca (SPR).

„Smanjeno vezivanje“, na primer smanjeno vezivanje za Fc receptor, odnosi se na smanjenje afiniteta za odgovarajuću interakciju, kao što je mereno na primer SPR-om. Radi jasnoće, ovaj termin uključuje i smanjenje afiniteta na nulu (ili ispod granice detekcije analitičkog postupka), odnosno potpuno ukidanje interakcije. Nasuprot tome, „povećano vezivanje“ se odnosi na povećanje afiniteta vezivanja za odgovarajuću interakciju.

„Aktivirajući T ćelijski antigen“, kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja je eksprimirana na površini T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, koja je sposobna da indukuje aktivaciju T ćelija nakon interakcije sa antigen vezujućim molekulom. Specifično, interakcija antigen vezujućeg molekula sa aktivirajućim T ćelijskim antigenom može indukovati aktivaciju T ćelija aktiviranjem signalne kaskade kompleksa receptora T ćelija. Aktivirajući T-ćelijski antigen je CD3, posebno epsilon podjedinica CD3 (vidi UniProt br. P07766 (verzija 130), NCBIRefSeq br. NP_000724.1, SEQ ID NO: 1 za humanu sekvencu; ili UniProt br. Q95LI5 (verzija 49), NCBI GenBank br. BAB71849.1, SEQ ID NO: 2 za sekvencu cinomolgusa [Macaca fascicularis]).

„Aktivacija T ćelija“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više ćelijskih odgovora T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, odabranih od: proliferacije, diferencijacije, sekrecije citokina, otpuštanja citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksične aktivnosti i ekspresije aktivacionih markera. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije iz ovog pronalaska su sposobni da indukuju aktivaciju T ćelija. Odgovarajući testovi za merenje aktivacije T ćelija su poznati u struci koja je ovde opisana.

„Antigen ciljne ćelije“, kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja je predstavljena na površini ciljne ćelije, na primer, ćelija u tumoru, kao što je ćelija kancera ili ćelija tumorske strome. Antigen ciljnih ćelija je CD20, naročito humani CD20 (vidi UniProt br. P11836).

Kako se ovde koriste, termini „prvi”, „drugi” ili „treći” u odnosu na molekule Fab, itd., koriste se radi pravljenja razlike kada postoji više od jednog ostatka svake vrste. Upotreba ovih pojmova nije namenjena da dodeli određeni redosled ili orijentaciju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, osim ako se to eksplicitno ne tvrdi.

„Molekul Fab“ se odnosi na protein koji se sastoji od VH i CH1 domena teškog lanca („teški lanac Fab“) i VL i CL domena lakog lanca („laki lanac Fab“) imunoglobulina.

Pod „spojenim“ se podrazumeva da su komponente (npr. molekul Fab i podjedinica Fc domena) povezane peptidnim vezama, bilo direktno ili preko jednog ili više peptidnih veznika.

Termin „jednolančani”, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul koji sadrži aminokiselinske monomere linearno vezane peptidnim vezama. U određenim aspektima otkrića, jedan od antigen vezujućih ostataka je jednolančani molekul Fab, tj. molekul Fab gde su laki lanac Fab i teški lanac Fab povezani peptidnim veznikom da bi formirali jedan peptidni lanac. U posebnom aspektu, C-kraj lakog lanca Fab povezan je sa N-krajem teškog lanca Fab u jednolančanom molekulu Fab.

Pod „unakrsno izmenjenim“ molekulom Fab (koji se takođe naziva „Crossfab“) podrazumeva se molekul Fab u kome su varijabilni domeni teškog i lakog lanca Fab razmenjeni (tj. zamenjeni jedan drugim), tj. unakrsno izmenjeni molekul Fab sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog domena lakog lanca VL i konstantnog domena teškog lanca 1 CH1 (VL-CH1, u smeru od N- do C-kraja) i peptidnog lanca sastavljenog od varijabilnog domena teškog lanca VH i konstantnog domena lakog lanca CL (VH-CL, u smeru od N- do C-kraja). Radi jasnoće, u unakrsno izmenjenom molekulu Fab gde su varijabilni domeni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab razmenjeni, peptidni lanac koji sadrži konstantni domen teškog lanca 1 CH1 ovde se naziva „teški lanac“ unakrsno izmenjenog molekula Fab.

Nasuprot tome, „konvencionalnim“ molekulom Fab se smatra molekul Fab u svom prirodnom formatu, tj. koji sadrži teški lanac sastavljen od varijabilnih i konstantnih domena teškog lanca (VH-CH1, u smeru od N- do C-kraja) i laki lanac sastavljen od varijabilnih i konstantnih domena lakog lanca (VL-CL, u smeru od N-do C-kraja).

Termin „molekul imunoglobulina“ se odnosi na protein koji ima strukturu prirodnog antitela. Na primer, imunoglobulini klase IgG su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-kraja do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni domen (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni region teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe zovu konstantni regioni teškog lanca. Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni domen (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni region lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen, koji se takođe zove konstantni region lakog lanca. Teški lanac imunoglobulina može biti dodeljen jednom od pet tipova, koji se zovu α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), ili μ (IgM), od kojih se neki mogu dalje podeliti na podtipove, npr. γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) i α2(IgA2). Laki lanac imunoglobulina se može svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (k) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena. Imunoglobulin se u suštini sastoji od dva molekula Fab i Fc domena, povezana preko regiona šarke imunoglobulina.

Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu, i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, poliklonska antitela i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen-vezujuću aktivnost.

„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, dijatela, linearna antitela, jednolančane molekule antitela (npr. scFv) i antitela sa jednim domenom.

Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite npr. u Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore izd., Springer-Verlag, New York, str. 269-315 (1994); pogledajte takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br.5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.5,869,046. Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledajte, npr, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U određenim aspektima otkrića, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,248,516 B1). Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.

Termin „antigen vezujući domen” se odnosi na deo antitela koji sadrži oblast koja se specifično vezuje za deo antigena ili ceo antigen, i komplementaran je sa delom antigena ili celim antigenom. Antigen vezujući domen se može dobiti, na primer, pomoću jednog ili više varijabilnih domena antitela (koja se još zovu i varijabilni regioni antitela). Posebno, antigenvezujući domen sadrži varijabilni domen lakog lanca antitela (VL) i varijabilni domen teškog lanca antitela (VH).

Izrazi „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnose se na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji učestvuje u vezivanju antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana regiona okvira (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). Videti, npr., Kindt et al., Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman and Co., strana 91 (2007). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti.

Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“ kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“). Generalno, nativna četvorolančana antitela sadrže šest regiona HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). HVR generalno sadrže ostatke aminokiselina iz hipervarijabilnih petlji i/ili regiona koji određuju komplementarnost (CDR), gde ovi drugi imaju najveću varijabilnost sekvenci i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. Hipervarijabilni regioni (HVR) se takođe pominju kao "regioni koji određuju komplementarnost" (CDR), i ti termini se ovde koriste naizmenično da ukažu na delove varijabilnog regiona koji formiraju antigen vezujuće regione. Ovaj konkretni region opisali su Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) i Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kada se uporede jedni sa drugima. I pored toga, namera je da primena bilo koje od ove dve definicije koje ukazuju na CDR antitela ili njihove varijante bude obuhvaćena terminom na način kako se on ovde definiše i koristi. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR-ove kao što su definisani svakom od gore navedenih referenci dati su dole u Tabeli 1 radi poređenja. Tačni brojevi ostataka koji sadrže konkretni CDR će varirati u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručna lica iz ove oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci sadrže konkretni CDR kada je data aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona datog antitela. Ovde navedene sekvence CDR su generalno prema Kabatovoj definiciji.

TABELA 1. Definicije CDR<1>

Kabat et al. su takođe definisali sistem numeracije sekvenci varijabilnih regiona koji je primenljiv na bilo koje antitelo. Lice standardne stručnosti iz ove oblasti može nedvosmisleno da primeni ovaj sistem „Kabatove numeracije” na svaku sekvencu varijabilnog regiona, ne oslanjajući se ni na kakve eksperimentalne podatke osim na same sekvence. Kako se ovde koristi u vezi sa sekvencama varijabilnih regiona "Kabatova numeracija" se odnosi na sistem numeracije koji su izradili Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Ako nije drugačije naglašeno, reference na numeraciju specifičnih položaja aminokiselinskih ostataka u varijabilnom regionu antitela su prema Kabatovom sistemu numeracije.

Kako se ovde koriste, aminokiselinski položaji svih konstantnih regiona i domena teškog i lakog lanca su numerisani u skladu sa Kabatovim sistemom za numeraciju koji je opisan u Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), i ovde se naziva "numeracija prema Kabatu" ili "Kabatova numeracija". Konkretno, Kabatov sistem numeracije (vidi stranice 647-660 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) se koristi za konstantni domen lakog lanca CL kapa i lambda izotipa, i sistem numeracije prema Kabatovom EU indeksu (vidi strane 661-723) se koristi za konstantne domene teškog lanca (CH1, šarka, CH2 i CH3), što je ovde dalje objašnjeno pozivajući se na "numeraciju prema Kabatovom EU indeksu “u ovom slučaju.

Polipeptidne sekvence na listi sekvenci nisu numerisane prema Kabatovom sistemu numerisanja. Međutim, osoba sa standardnom stručnošću u ovoj oblasti može da konvertuje numerisanje sekvenci iz redosleda sekvenci na Kabatovu numeraciju.

„Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

„Klasa“ antitela ili imunoglobulina ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.

Izraz „Fc domen“ ili „Fc region“ se ovde koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona IgG teškog lanca mogu malo da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG tipično se po uobičajenoj definiciji proteže od Cys226 ili Pro230 do karboksi terminusa teškog lanca.

Međutim, antitela koja proizvode ćelije domaćini mogu biti podvrgnuta posttranslacionom cepanju jedne ili više, posebno jedne ili dve aminokiseline sa C-kraja teškog lanca. Shodno tome, antitelo proizvedeno od strane ćelije domaćina ekspresijom specifičnog molekula nukleinske kiseline koji kodira teški lanac pune dužine može uključivati teški lanac pune dužine, ili može uključivati cepanu varijantu teškog lanca pune dužine (takođe se u ovom tekstu naziva „cepana varijanta teškog lanca“). Ovo može biti slučaj kada su poslednje dve aminokiseline C-kraja teškog lanca glicin (G446) i lizin (K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Shodno tome, C-terminalni lizin (Lys447), ili C-terminalni glicin (Gly446) i lizin (K447), Fc regiona mogu, ili ne moraju biti prisutni. Aminokiselinske sekvence teških lanaca, uključujući Fc domene (ili podjedinicu Fc domena, kao što je ovde definisana), ovde su označene bez C-terminalnog dipeptida glicin-lizin, ako nije drugačije naznačeno. U jednom aspektu otkrića, teški lanac koji uključuje podjedinicu Fc domena kao što je ovde naznačeno, sadržan u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, sadrži dodatni C-terminalni dipeptid glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom aspektu otkrića, teški lanac koji uključuje podjedinicu Fc domena, kao što je ovde naznačeno, sadržan u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, sadrži dodatni C-terminalni ostatak glicina (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Kompozicije iz otkrića, kao što su farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane, obuhvataju populaciju bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska. Populacija bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije može sadržati molekule koji imaju teški lanac pune dužine i molekule koji imaju cepanu varijantu teškog lanca. Populacija bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije može se sastojati od smeše molekula koji imaju teški lanac pune dužine i molekula koji imaju cepanu varijantu teškog lanca, pri čemu najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije ima cepanu varijantu teškog lanca. U jednom aspektu otkrića, kompozicija koja sadrži populaciju bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži teški lanac uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde navedeno, sa dodatnim C-terminalnim dipeptidom glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom aspektu otkrića, kompozicija koja sadrži populaciju bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži teški lanac uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde navedeno, sa dodatnim C-terminalnim ostatkom glicina (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom aspektu otkrića, takva kompozicija sadrži populaciju bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije sastavljenih od molekula koji sadrže teški lanac, uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde navedeno; molekule koji sadrže teški lanac, uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde navedeno, sa dodatnim C-terminalnim ostatkom glicina (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu); i molekule koji sadrže teški lanac, uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde navedeno, sa dodatnim C-terminalnim dipeptidom glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Ako ovde nije drugačije naznačeno, označavanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (vidi takođe i prethodno navedeno). „Podjedinica“ Fc domena kako se ovde koristi, odnosi se na jedan od dva polipeptida koji formiraju dimerni Fc domen, tj. polipeptid koji sadrži C-terminalne konstantne regione teškog lanca imunoglobulina, sposobne za stabilno samopovezivanje. Na primer, podjedinica Fc domena IgG sadrži konstantni domen IgG CH2 i IgG CH3.

„Modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena“ je manipulacija peptidnim skeletom ili posttranslaciona modifikacija podjedinice Fc domena koja smanjuje ili sprečava povezivanje polipeptida koji sadrži podjedinicu Fc domena sa identičnim polipeptidom da formiraju homodimer. Modifikacija koja promoviše povezivanje, kako se ovde koristi, posebno podrazumeva odvojene modifikacije napravljene za svaku od dve podjedinice Fc domena koje treba da se povežu (tj. prva i druga podjedinica Fc domena), pri čemu su modifikacije komplementarne jedna drugoj kako bi se promovisalo povezivanje dve podjedinice Fc domena. Na primer, modifikacija koja promoviše povezivanje može promeniti strukturu ili naelektrisanje jedne ili obe podjedinice Fc domena, kako bi njihovo povezivanje bilo sterno odnosno elektrostatički povoljno. Tako se (hetero)dimerizacija javlja između polipeptida koji sadrži prvu podjedinicu Fc domena i polipeptida koji sadrži drugu podjedinicu Fc domena, koja može biti neidentična u smislu da dodatne komponente spojene na svaku od podjedinica (npr. antigen vezujući delovi) nisu iste. Modifikacija koja podstiče povezivanje uključuje aminokiselinsku mutaciju u Fc domenu, posebno aminokiselinsku supstituciju. Modifikacija koja promoviše povezivanje sadrži odvojenu aminokiselinsku mutaciju, konkretno aminokiselinsku supstituciju, u svakoj od dve podjedinice Fc domena.

Termin „efektorske funkcije" ukazuje na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri za efektorske funkcije antitela uključuju: vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekreciju citokina, preuzimanje antigena posredstvom imunskog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjenje regulacije površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.

Kako se ovde koriste, pojmovi „konstruisati, konstruisano, inženjering“ uključuju bilo kakvu manipulaciju peptidne osnove ili posttranslacionih modifikacija prirodnog ili rekombinantnog polipeptida ili njegovog fragmenta. Inženjering obuhvata modifikacije aminokiselinske sekvence, glikozilacionog obrasca ili grupe bočnih lanaca pojedinačnih aminokiselina, kao i kombinacije ovih pristupa.

Izraz „mutacija aminokiselina“, kako se ovde koristi, obuhvata supstitucije, brisanje, umetanje i modifikacije aminokiselina. Svaka kombinacija supstitucije, brisanja, umetanja i modifikacije može se načiniti tako da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. smanjeno vezivanje za Fc receptor, ili povećano povezivanje sa drugim peptidom. Brisanja i umetanja aminokiselinske sekvence uključuju brisanja i umetanja aminokiselina na amino i/ili karboksi terminusu. Konkretne aminokiselinske mutacije su aminokiselinske supstitucije. U cilju izmene npr. karakteristika vezivanja Fc regiona, naročito su poželjne nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, tj. zamena jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima različita strukturna i/ili hemijska svojstva. Aminokiselinske supstitucije podrazumevaju zamenu aminokiselinama koje ne nastaju prirodno, ili derivatima prirodnih aminokiselina, dvadeset standardnih aminokiselina (npr. 4-hidroksiprolin, 3-metilhistidin, ornitin, homoserin, 5-hidroksilizin). Aminokiselinske mutacije se mogu generisati pomoću genetičkih ili hemijskih postupaka koji su dobro poznati u struci. Genetski postupci mogu obuhvatati mutagenezu usmerenu na mesto, PCR, sintezu gena, i slično. Smatra se da su takođe korisni postupci izmene grupe bočnih lanaca aminokiseline drugim postupcima osim genetskog inženjeringa, kao što je hemijska modifikacija. Ovde se mogu koristiti različite oznake kako bi se ukazalo na istu mutaciju aminokiselina. Na primer, supstitucija iz prolina u položaju 329 Fc domena u glicin se može označiti kao 329G, G329, G329, P329G ili Pro329Gly.

Kako se ovde koristi, pojam „polipeptid” se odnosi na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) koji su linearno povezani amidnim vezama (poznatim i kao peptidne veze). Pojam „polipeptid” se odnosi na bilo koji lanac dve ili više aminokiseline, i ne se odnosi na određenu dužinu proizvoda. Tako su peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein”, „aminokiselinski lanac” ili bilo koji drugi izraz koji se koristi da se ukaže na lanac dve ili više aminokiselina, uključeni u definiciju „polipeptida” i izraz „polipeptid” se može koristiti umesto ili kao sinonim bilo kog od ovih izraza. Termin „polipeptid” se takođe odnosi na proizvode post-ekspresione modifikacije polipeptida, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilovanje, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičko cepanje ili modifikaciju sa neprirodno nastalim aminokiselinama. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može se generisati na bilo koji način, uključujući i hemijsku sintezu. Polipeptid iz otkrića može biti veličine od oko 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 500 ili više, 1000 ili više, ili 2000 ili više aminokiselina. Polipeptidi mogu imati definisanu trodimenzionalnu strukturu, iako ne moraju nužno imati takvu strukturu. Polipeptidi sa definisanom trodimenzionalnom strukturom se nazivaju presavijeni, a polipeptidi koji nemaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, već mogu usvojiti veliki broj različitih konformacija se nazivaju odmotani.

„Izolovanim” polipeptidom ili varijantom ili njegovim derivatom smatra se polipeptid koji nije u svom prirodnom miljeu. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid se može ukloniti iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini izraženi u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim u svrhu otkrivanja, kao što su nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni odgovarajućom tehnikom.

„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence” u poređenju sa sekvencom referentnog polipeptida definisan je kao procenat onih aminokiselinskih ostataka u sekvencikandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, pri tom ne uzimajući u obzir bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali. U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:

100 puta količnik X/Y

gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.

Termin „polinukleotid” se odnosi na izolovani molekul ili konstrukt nukleinske kiseline, npr. informacionu RNK (mRNK), viralno dobijenu RNK ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može sadržati konvencionalnu vezu fosfodiestra ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što je pronađeno u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK). Termin „molekul nukleinske kiseline” se odnosi na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmente DNK ili RNK, prisutne u polinukleotidu.

„Izolovanim” molekulom nukleinske kiseline ili polinukleotidom smatra se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog izvornog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid sadržan u vektoru smatra se izolovanim u svrhe predmetnog otkrića. Dalji primeri za izolovani polinukleotid uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterolognim ćelijama domaćina ili prečišćene (delimično ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. Izolovani polinukleotid uključuje molekul polinukleotida koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul polinukleotida, ali je molekul polinukleotida prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro transkripte RNK iz predmetnog otkrića, kao i pozitivne i negativne lančane oblike i dvolančane oblike. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom otkriću dalje uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu da budu ili mogu da uključuju regulatorni element kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma ili terminator transkripcije.

Za nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu, na primer, najmanje 95% „identičnu“ referentnoj nukleotidnoj sekvenci iz predmetnog otkrića, predviđeno je da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci, osim što polinukleotidna sekvenca može uključivati do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom najmanje 95% identičnom referentnoj sekvenci nukleotida, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti uklonjeno ili supstituisano drugim nukleotidom, ili broj nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačen u referentnu sekvencu. Te izmene referentne sekvence mogu se desiti na 5' ili 3' terminalnim mestima referentne sekvence nukleotida ili bilo gde između tih terminalnih mesta, pojedinačno razbacane između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa u referentnoj sekvenci. U praktičnom smislu, pomoću poznatih kompjuterskih programa (npr. ALIGN-2), kao što su oni gorenavedeni za polipeptide, može na konvencionalan način da se odredi da li je neka konkretna polinukleotidna sekvenca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci iz predmetnog otkrića.

Termin „ekspresiona kaseta” se odnosi na polinukleotid generisan rekombinantno ili sintetički, sa nizom specifičnih elemenata nukleinske kiseline koji omogućavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljanu ćeliju. Rekombinantna ekspresiona kaseta može se inkorporirati u plazmid, hromozom, mitohondrijsku DNK, plastidnu DNK, virus ili fragment nukleinske kiseline. Tipično, deo rekombinantne ekspresione kasete ekspresionog vektora sadrži, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koja se transkribuje i promoter. U određenim aspektima otkrića, ekspresiona kaseta sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule iz pronalaska ili njihove fragmente.

Termin „vektor” ili „ekspresioni vektor” je sinonim za „ekspresioni konstrukt” i se odnosi na molekul DNK koji se koristi za uvođenje i usmeravanje ekspresije specifičnog gena na koji je operativno povezan u ciljanu ćeliju. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Ekspresioni vektor iz predmetnog otkrića sadrži ekspresionu kasetu. Ekspresioni vektori omogućavaju transkripciju velikih količina stabilne mRNK. Kada se ekspresioni vektor nađe unutar ciljne ćelije, molekul ribonukleinske kiseline ili protein koji je kodiran tim genom proizvodi se pomoću mehanizma ćelijske transkripcije i/ili translacije. U jednom aspektu otkrića, ekspresioni vektor sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule iz pronalaska ili njihove fragmente. Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelija domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, u koje spadaju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji. Ćelija domaćin je bilo koja vrsta ćelijskog sistema koji se može koristiti za dobijanje bispecifičnih antigen vezujućih molekula iz ovog pronalaska. Ćelije domaćini uključuju uzgajane ćelije, npr. uzgajane ćelije sisara, kao što su CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mišjeg mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, ćelije kvasaca, ćelije insekata i biljne ćelije, da navedemo samo nekoliko, ali i ćelije koje se nalaze u transgenoj životinji, transgenoj biljci ili uzgajenom biljnom ili životinjskom tkivu.

„Aktivirajući Fc receptor“ je Fc receptor koji nakon angažovanja Fc domena antitela izaziva signalizirajuće događaje koji stimulišu receptorsku noseću ćeliju da izvede efektorske funkcije. Humani aktivirajući Fc receptori uključuju FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) i FcαRI (CD89).

Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC) je imunološki mehanizam koji dovodi do lize ciljanih ćelija obloženih antitelima pomoću imunoloških efektorskih ćelija. Ciljne ćelije su ćelije za koje se antitela ili njihovi derivati koji sadrže Fc region specifično vezuju, najčešće preko proteinskog dela koji je N-kraj Fc regiona. Kao što se ovde koristi, termin „smanjen ADCC“ je definisan ili kao smanjenje broja ciljnih ćelija koje su lizirane u datom vremenu, pri datoj koncentraciji antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, putem mehanizma ADCC definisanog iznad, i/ili povećanje koncentracije antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, potrebno da se postigne liza datog broja ciljnih ćelija u datom vremenu, putem mehanizma ADCC. Smanjenje ADCC je u odnosu na ADCC posredovanu istim antitelom koje proizvodi isti tip ćelija domaćina, korišćenjem istih standardnih postupaka stvaranja, prečišćavanja, formulisanja i čuvanja (koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti), ali koje nije konstruisano. Na primer, smanjenje ADCC posredovane antitelom koje sadrži u svom Fc domenu aminokiselinsku supstituciju koja smanjuje ADCC, je u odnosu na ADCC posredovanu istim antitelom bez ove aminokiselinske supstitucije u Fc domenu. Odgovarajući testovi za merenje ADCC su dobro poznati u struci (vidi npr. PCT publikaciju br. WO2006/082515 ili PCT publikaciju br. WO2012/130831).

„Efikasna količina” agensa se odnosi na količinu koja je neophodna da bi se dovelo do fiziološke promene u ćeliji ili tkivu na koji se primenjuje.

„Terapeutski efikasna količina” agensa, npr. farmaceutski preparat, se odnosi na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Terapeutski efikasna količina agensa, na primer, eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizuje ili sprečava štetne efekte bolesti.

„Pojedinac“ ili „ispitanik“ je sisar. Sisari uključuju, ali se ne ograničavaju na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i ne-humane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). Konkretno, pojedinac ili ispitanik je čovek.

Termin „farmaceutski preparat” se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.

„Farmaceutski prihvatljiv nosač“ upućuje na sastojak farmaceutske kompozicije koji nije aktivni sastojak i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

Kao što je ovde upotrebljeno, „lečenje“ (i gramatičke varijacije, kao što je „lečiti“) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje brzine napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim aspektima otkrića, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska koriste se da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.

Termin „uputstvo za upotrebu“ koristi se da se ukaže na uputstvo koje se tipično nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.

Detaljan opis pronalaska i otkrića

Pronalazak je kao što je definisan u zahtevu.

Ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sa povoljnim svojstvima za terapeutsku primenu, naročito sa poboljšanom produktivnošću (npr. u pogledu čistoće, prinosa). Aminokiselinske supstitucije u molekulima Fab koje se sastoje od bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije ovog pronalaska su naročito efikasne u smanjenju pogrešnog sparivanja lakih lanaca sa nepodudarajućim teškim lancima (sporedni proizvodi tipa Bens-Džons), koji se mogu pojaviti u proizvodnji bi-/multispecifičnih antigen vezujućih molekula na bazi Fab koji imaju VH / VL razmenu u jednom (ili više, u slučaju molekula koji sadrže više od dva antigen vezujuća molekula Fab) od njihovih vezujućih krakova (vidi takođe WO2015/150447, naročito primere tu prikazane).

Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul za aktiviranje T ćelija, kao što je definisano u patentnom zahtevu, koji obuhvata

(a) prvi molekul Fab koji se specifično vezuje za CD20

(b) drugi molekul Fab koji se specifično vezuje za CD3epsilon, i gde su varijabilni domeni VL i VH lakog lanca Fab i teškog lanca Fab zamenjeni jedan drugim,

(c) treći molekul Fab koji se specifično vezuje za CD20; i

pri čemu

(c) u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab, aminokiselina u položaju 124 je supstituisana pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (numeracija prema Kabatu), i pri čemu, u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c), aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 je supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom aspektu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema otkriću, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom aspektu nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U daljem aspektu, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu), i u konstantnom domenu CH1 prvog Fab molekula pod a) aminokiselina u položaju 147 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U određenom aspektu, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom aspektu nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)) i aminokiselina u položaju 123 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom aspektu nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U konkretnijem aspektu, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana lizinom (K) ili argininom (R) (numeracija prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana argininom (R) (numeracija prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Konstantni domen CL prvog molekula Fab pod a) je kapa izotipa.

Alternativno, supstitucije aminokiselina prema jednom aspektu otkrića mogu se napraviti u konstantnom domenu CL i konstantnom domenu CH1 drugog molekula Fab pod b) umesto u konstantnom domenu CL i konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a). U takvim konkretnim aspektima, konstantni domen CL drugog molekula Fab pod b) je kapa izotipa.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku dalje sadrži treći molekul Fab koji se specifično vezuje za CD20. Pomenuti treći molekul Fab je identičan prvom molekulu Fab pod a). Aminokiselinske supstitucije su u konstantnom domenu CL i konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab i trećeg molekula Fab. Alternativno, supstitucije aminokiselina prema aspektima otkrića mogu se napraviti u konstantnom domenu CL i konstantnom domenu CH1 drugog molekula Fab pod b), ali ne u konstantnom domenu CL i konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab i trećeg molekula Fab.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema ovom pronalasku dalje sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje.

Formati bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije

Komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije iz otkrića mogu biti međusobno spojene u različitim konfiguracijama. Primeri konfiguracija su prikazani na Slici 1.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje.

Drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve podjedinice Fc domena.

U jednom takvom aspektu otkrića, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U takvom specifičnom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u suštini se sastoji od prvog i drugog molekula Fab, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slikama 1G i 1K. Opciono, laki lanac Fab prvog molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.

U drugom takvom aspektu, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U takvom specifičnom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije se u osnovi sastoji od prvog i drugog molekula Fab, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu su prvi i drugi molekul Fab spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slikama 1A i 1D. Prvi i drugi molekul Fab mogu biti spojeni sa Fc domenom direktno ili preko peptidnog veznika. U konkretnom aspektu, i prvi i drugi molekul Fab su spojeni sa Fc domenom preko imunoglobulinskog regiona šarke. U određenom aspektu, imunoglobulinski region šarke je region šarke humanog IgG1, posebno kada je Fc domen, FC domen IgG1.

U drugim aspektima opisa, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena.

U jednom takvom aspektu, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. U takvom specifičnom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u osnovi se sastoji od prvog i drugog molekula Fab, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je drugi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab, a prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. Takva konfiguracija je šematski prikazana na slikama 1H i 1L. Opciono, laki lanac Fab prvog molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.

Fab molekuli mogu biti spojeni sa Fc domenom ili međusobno direktno ili preko peptidnog veznika, koji sadrži jednu ili više aminokiselina, tipično oko 2-20 aminokiselina. Peptidni linkeri su poznati u struci i ovde opisani. Odgovarajući neimunogeni peptidni linkeri obuhvataju, na primer, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)nili G4(SG4)npeptidne linkere. „n“ je generalno ceo broj od 1 do 10, obično od 2 do 4. U jednom aspektu, navedeni peptidni veznik ima dužinu od najmanje 5 aminokiselina, u jednom aspektu dužinu od 5 do 100, u daljem aspektu od 10 do 50 aminokiselina. U jednom aspektu, navedeni peptidni veznik je (GxS)nili (GxS)nGm, gde G=glicin, S=serin, i (x=3, n= 3, 4, 5 ili 6, i m=0, 1, 2 ili 3) ili (x=4, n=2, 3, 4 ili 5 i m= 0, 1, 2 ili 3), u jednom aspektu x=4 i n=2 ili 3, a u daljem aspektu x=4 i n=2. U jednom aspektu, navedeni peptidni veznik je (G4S)2.Posebno pogodan peptidni veznik za međusobno spajanje lakih lanaca Fab prvog i drugog molekula Fab je (G4S)2.Primer peptidnog veznika pogodnog za povezivanje teških lanaca Fab prvog i drugog fragmenta Fab obuhvata sekvence (D)-(G4S)2(SEQ ID NO: 11 i 12). Dodatno, linkeri mogu sadržati imunoglobulinski region šarke (ili njegov deo). Posebno, gde je molekul Fab spojen sa N-krajem podjedinice Fc domena, može se spojiti preko imunoglobulinskog regiona šarke ili njegovog dela, sa dodatnim peptidnim veznikom ili bez njega. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sa jednim ostatkom koji vezuje antigen (kao što je molekul Fab) koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije (na primer, kao što je prikazano na Slici 1A, D, G, H, K, L) je koristan, naročito u slučajevima kada se očekuje internalizacija antigena ciljnih ćelija nakon vezivanja ostatka koja se vezuje za antigen sa visokim afinitetom. U takvim slučajevima, prisustvo više od jednog antigen-vezujućeg ostatka specifičnog za antigen ciljnih ćelija može pojačati internalizaciju antigena ciljnih ćelija, čime se smanjuje njegova dostupnost.

Međutim, u mnogim drugim slučajevima bi bilo korisno da bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži dva ili više antigen vezujućih ostataka (kao što su molekuli Fab) specifičnih za antigen ciljnih ćelija (videti primere prikazane na slici 1B, 1C, 1E, 1F, 1I, 1J. 1M ili 1N), na primer za optimizaciju ciljanja na ciljno mesto, ili za omogućavanje unakrsnog povezivanja antigena ciljnih ćelija.

Prema tome, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska dalje sadrži treći molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen. Prvi antigen je antigen ciljnih ćelija. U jednom aspektu, treći molekul Fab je konvencionalni molekul Fab. Treći molekul Fab je identičan prvom molekulu Fab (tj. prvi i treći molekul Fab sadrže iste aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca, i imaju isti raspored domena (tj. konvencionalni). Drugi molekul Fab se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen CD3, a prvi i treći molekul Fab se specifično vezuju za CD20.

U alternativnim aspektima otkrića, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz ovog pronalaska dalje sadrži treći molekul Fab koji se specifično vezuje za drugi antigen. U ovim aspektima, drugi antigen je poželjno antigen ciljne ćelije. U jednom takvom aspektu, treći molekul Fab je molekul Fab sa unakrsnom izmenom (molekul Fab gde su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab razmenjeni / zamenjeni jedan drugim). U jednom takvom aspektu, treći molekul Fab je identičan drugom molekulu Fab (tj. drugi i treći molekul Fab sadrže iste aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca, i imaju isti raspored domena (tj. konvencionalni ili unakrsni)). U jednom takvom aspektu, prvi molekul Fab se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen, naročito CD3, a drugi i treći molekul Fab se specifično vezuju za antigen ciljnih ćelija.

Treći molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve podjedinice Fc domena.

Drugi kao i treći molekul Fab su spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena, a prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u osnovi se sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, Fc domena koji se sastoji od prve i druge podjedinice, i jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve podjedinice Fc domena, i pri čemu, treći molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem druge podjedinice Fc domena. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1B i 1E (treći molekul Fab je uobičajeni molekul Fab i identičan je prvom molekulu Fab), i Slici 1I i 1M (alternativni aspekti, gde je treći molekul Fab unakrsno izmenjeni molekul Fab i poželjno je identičan drugom molekulu Fab). U jednom aspektu, drugi i treći molekul Fab mogu biti spojeni sa Fc domenom direktno ili preko peptidnog linkera. Prema pronalasku, drugi kao i treći molekul Fab su spojeni sa Fc domenom preko imunoglobulinskog regiona šarke. Prema pronalasku, imunoglobulinski region šarke je region šarke humanog IgG1a Fc domen je Fc domen IgG1. U opcionom aspektu otkrića, laki lanac Fab prvog molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab mogu dodatno međusobno biti spojeni.

U drugim aspektima otkrića, prvi kao i treći molekul Fab su spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena, a drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. U takvom specifičnom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u suštini se sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab, a prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve podjedinice Fc domena, i pri čemu, treći molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem druge podjedinice Fc domena. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1C i 1F (određeni aspekti, pri čemu je treći molekul Fab uobičajeni molekul Fab i poželjno je identičan prvom molekulu Fab) i na Slikama 1J i 1N (alternativni aspekti otkrića, pri čemu je treći molekul Fab unakrsno izmenjeni molekul Fab i poželjno je identičan drugom molekulu Fab). Prvi i treći molekul Fab mogu biti spojeni sa Fc domenom direktno ili preko peptidnog veznika. U konkretnom aspektu, prvi kao i treći molekul Fab su spojeni sa Fc domenom preko imunoglobulinskog regiona šarke. U jednom aspektu, imunoglobulinski region šarke je region šarke humanog IgG1, posebno kada je Fc domen, Fc domen IgG1. U alternativnom aspektu otkrića, laki lanac Fab prvog molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.

U aspektima otkrića sa konfiguracijama bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, gde je molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem svake od podjedinica Fc domena preko imunoglobulinskih regiona šarke, dva molekula Fab, region šarke i Fc domen suštinski formiraju molekul imunoglobulina. U konkretnom aspektu, molekul imunoglobulina je imunoglobulin klase IgG. U jednom konkretnijem aspektu, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG1. U jednom drugom aspektu, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG4. U još jednom konkretnom aspektu, imunoglobulin je humani imunoglobulin. U drugim aspektima, imunoglobulin je himerni imunoglobulin ili humanizovani imunoglobulin.

U nekom od opisanih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije, laki lanac Fab prvog molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab su spojeni jedan sa drugim, opciono preko peptidnog veznika. U zavisnosti od konfiguracije prvog i drugog molekula Fab, laki lanac Fab prvog molekula Fab može se spojiti na svom C-kraju sa N-krajem lakog lanca Fab drugog molekula Fab, ili laki lanac Fab drugog molekula Fab može biti spojen na svom C-kraju sa N-krajem lakog lanca Fab prvog molekula Fab. Spajanje lakih lanaca Fab prvog i drugog molekula Fab dalje smanjuje pogrešno sparivanje neusklađenih teških i lakih lanaca Fab, a takođe smanjuje i broj plazmida potrebnih za ekspresiju nekih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz otkrića.

U određenim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni region lakog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)), i polipeptid u kome teški lanac Fab prvog molekula Fab deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). U nekim aspektima opisa, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni regijon teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)), i polipeptid lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)).

U određenim otelotvorenjima, polipeptidi su kovalentno vezani, npr. disulfidnom vezom.

U nekim aspektima otkrića, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni region lakog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab prvog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). Prema otkriću, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid, pri čemu teški lanac Fab prvog molekula Fab deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji pak deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)).

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid lakog lanca unakrsno izmenjenog Fab drugog molekula Fab, pri čemu varijabilni region teškog lanca drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)), i polipeptid lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U drugim aspektima opisa, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni region lakog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)), ili polipeptid u kome polipeptid lakog lanca Fab prvog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)), prema potrebi.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku dalje sadrži polipeptid u kome teški lanac Fab trećeg molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) i polipeptid lakog lanca Fab trećeg molekula Fab (VL(3)-CL(3)). U određenim otelotvorenjima, polipeptidi su kovalentno vezani, npr. disulfidnom vezom.

U nekim aspektima opisa, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U određenim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ne sadrži Fc domen. U određenim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u osnovi se sastoji od prvog i drugog molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na slikama 1O i 1S.

U drugim aspektima opisa, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem Fab teškog lanca prvog molekula Fab. U određenim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ne sadrži Fc domen. U određenim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u suštini se sastoji od prvog i drugog molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu se drugi molekul Fab spaja na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem Fab teškog lanca prvog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slikama 1P i 1T.

U nekim aspektima opisa, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dalje sadrži treći molekul Fab, pri čemu je navedeni treći molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. U konkretnim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je konvencionalni molekul Fab. U drugim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je unakrsno izmenjeni molekul Fab kako je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab razmenjeni / zamenjeni jedan drugim. U određenim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u osnovi se sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a treći molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1Q i 1U (određeni aspekti, gde je treći molekul Fab konvencionalni molekul Fab i poželjno identičam prvom molekulu Fab).

U nekim aspektima, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži treći molekul Fab, pri čemu je navedeni treći molekul Fab spojen na N-kraju teškog lanca Fab sa C-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U konkretnim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je unakrsno izmenjeni molekul Fab kako je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab razmenjeni / zamenjeni jedan drugim. U drugim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je konvencionalni molekul Fab. U nekim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije se u osnovi sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a treći molekul Fab je spojen na N-kraju teškog lanca Fab sa C-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1W i 1Y (određeni aspekti, pri čemu je treći molekul Fab unakrsno izmenjeni molekul Fab, i poželjno identičan drugom molekulu Fab).

U nekim aspektima, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab na N-kraju teškog lanca Fab prvog molekula Fab, i bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži treći molekul Fab, pri čemu je navedeni treći molekul Fab spojen na N-kraju teškog lanca Fab sa C-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. U konkretnim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je konvencionalni molekul Fab. U drugim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je unakrsno izmenjeni molekul Fab kako je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab razmenjeni / zamenjeni jedan drugim. U određenim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u osnovi se sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je drugi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab, a treći molekul Fab je spojen na N-kraju teškog lanca Fab sa C-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1R i 1V (određeni aspekti, pri čemu je treći molekul Fab konvencionalni molekul Fab i poželjno identičan prvom molekulu Fab).

U nekim aspektima, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab, a bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži treći molekul Fab, pri čemu je navedeni treća molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U konkretnim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je unakrsno izmenjeni molekul Fab kako je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab razmenjeni / zamenjeni jedan drugim. U drugim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je konvencionalni molekul Fab. U određenim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u suštini se sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu je drugi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab, a treći molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1X i 1Z (određeni aspekti, pri čemu je treći molekul Fab unakrsno izmenjeni molekul Fab i poželjno identičan prvom molekulu Fab).

U određenim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži polipeptid u kome teški lanac Fab prvog molekula Fab ima karboksiterminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab, koji pak deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, u kome je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)).

U određenim aspektima otkrića, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira Tćelije prema pronalasku sadrži polipeptid u kome varijabilni region lakog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab u kome je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab prvog molekula Fab (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)).

U određenim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži polipeptid u kome teški lanac Fab trećeg molekula Fab deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab prvog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab u kome je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca) (VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid lakog lanca Fab trećeg molekula Fab (VL(3)-CL(3)). U određenim aspektima opisa, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži polipeptid u kome varijabilni region lakog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab prvog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab trećeg molekula Fab (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid lakog lanca Fab trećeg molekula Fab (VL(3)-CL(3)).

U određenim aspektima otkrića, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid u kome teški lanac Fab prvog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab trećeg molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab trećeg molekula Fab (tj. treći molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab trećeg molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab trećeg molekula Fab (VH(3)-CL(3)).

U određenim aspektima otkrića, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid u kome varijabilni region lakog lanca Fab trećeg molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab trećeg molekula Fab (tj. treći molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab prvog molekula Fab (VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab trećeg molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab trećeg molekula Fab (VH(3)-CL(3)).

Prema bilo kom aspektu otkrića, komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije (npr. molekuli Fab, Fc domen) mogu biti spojene direktno ili preko različitih linkera, posebno peptidnih linkera koji sadrže jednu ili više aminokiselina, tipično oko 2-20 aminokiselina, koji su ovde opisani ili su poznati u struci. Poželjno, neimunogeni peptidni veznici uključuju, na primer, peptidne veznike (G4S)n, (SG4)n, (G4S)nor G4(SG4)n, pri čemu je n obično ceo broj od 1 do 10, obično od 2 do 4.

Fc domen

Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sastoji se od para polipeptidnih lanaca koji sadrže domene teškog lanca molekula imunoglobulina. Na primer, Fc domen molekula imunoglobulina G (IgG) je dimer, čija svaka podjedinica sadrži konstantne domene IgG teškog lanca CH2 i CH3. Dve podjedinice Fc domena su sposobne za stabilno povezivanje jedne sa drugom. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz ovog pronalaska sadrži najviše jedan Fc domena.

Prema pronalasku, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije je Fc domen IgG. Fc domen je Fc domen IgG1. U drugom aspektu otkrića, Fc domen je Fc domen IgG4. U konkretnijem aspektu, Fc domen je Fc domen IgG4koji sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju S228 (Kabatova numeracija), konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. Ova aminokiselinska supstitucija umanjuje in vivo razmenu Fab kraka IgG4antitela (vidi Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). Fc domen je humani. Primer sekvence Fc regiona humanog IgG1je dat u SQ ID NO: 13.

Modifikacije Fc domena koje podstiču heterodimerizaciju

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije prema pronalasku i otkriću sadrže različite molekule Fab, spojene sa jednom ili drugom podjedinicom Fc domena, tako da su dve podjedinice Fc domena tipično sadržane u dva neidentična polipeptidna lanca. Rekombinantna koekspresija ovih polipeptida i naknadna dimerizacija dovode do nekoliko mogućih kombinacija dva polipeptida. Da bi se poboljšali prinos i čistoća bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije u rekombinantnoj proizvodnji, biće korisno da se u Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije uvede modifikacija koja unapređuje povezivanje željenih polipeptida.

Shodno tome, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema pronalasku sadrži modifikaciju koja podstiče povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena. Mesto najveće proteinsko-proteinske interakcije između dve podjedinice Fc domena humanog IgG nalazi se u CH3 domenu Fc domena. Tako, navedena modifikacija je u CH3 domenu Fc domena.

Postoji nekoliko pristupa za modifikacije u CH3 domenu Fc domena kako bi se sprovela heterodimerizacija, koji su dobro opisani npr. u WO96/27011, WO98/050431, EP1870459, WO2007/110205, WO2007/147901, WO2009/089004, WO2010/129304, WO2011/90754, WO2011/143545, WO2012058768, WO2013157954, WO2013096291. Tipično, u svim takvim pristupima, i CH3 domen prve podjedinice Fc domena i CH3 domen druge podjedinice Fc domena su konstruisani na komplementaran način, tako da svaki CH3 domen (ili teški lanac koji ga sadrži) više ne može da se homodimerizuje sam sa sobom, već je primoran da se heterodimerizuje sa komplementarno projektovanim drugim CH3 domenom (tako da se prvi i drugi CH3 domen heterodimerizuju, i nema homodimera između prva dva ili druga dva CH3 domena). Ovi različiti pristupi za poboljšanje heterodimerizacije teškog lanca se razmatraju kao različite alternative u kombinaciji sa modifikacijama teškog-lakog lanca (VH i VL razmena / zamena u jednom vezujućem kraku, i uvođenje supstitucija naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjem u CH1/CL interfejs) u bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju T-ćelije prema otkriću, što smanjuje pogrešno povezivanje lakog lanca i sporedne proizvode tipa Bens Džons.

Prema pronalasku, pomenuta modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena je takozvana modifikacija „dugme u rupici“, koja sadrži modifikaciju

„dugmeta“ u jednoj od dve podjedinice Fc domena i modifikaciju „rupice“ u drugoj od dve podjedinice Fc domena.

Tehnologija „dugme u rupici” je opisana npr. u US 5.731.168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Po pravilu, ova metoda podrazumeva uvođenje izbočine („dugme“) na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine („rupice“) na interfejsu drugog polipetida, tako da se izbočina može uklopiti u šupljinu da bi se podstaklo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su napravljene zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Odgovarajuće šupljine, iste ili slične veličine kao izbočine, stvaraju se na interfejsu drugog polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alaninom ili treoninom).

U skladu s ovim, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se uklopi u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice u koju može da se uklopi izbočina u CH3 domenu prve podjedinice.

U jednom aspektu, navedeni aminokiselinski ostatak koji ima veći volumen bočnog lanca je izabran iz grupe koja se sastoji od arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (Y) i triptofana (W).

U jednom aspektu, navedeni aminokiselinski ostatak koji ima manji volumen bočnog lanca je izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), serina (S), treonina (T) i valina (V).

Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju, ili sintezom peptida.

U CH3 domenu prve podjedinice Fc domene (podjedinica „dugmeta“) treoninski ostatak u položaju 366 zamenjen je triptofanskim ostatkom (T366W), a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena (podjedinica „rupice“) tirozinski ostatak u položaju 407 zamenjen je ostatkom valina (Y407V). U jednom aspektu otkrića, u drugoj podjedinici Fc domena dodatno je treoninski ostatak u položaju 366 zamenjen serinskim ostatkom (T366S) i leucinski ostatak u položaju 368 zamenjen je alaninskim ostatkom (L368A) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U prvoj podjedinici Fc domena dodatno je serinski ostatak u položaju 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), ili je ostatak glutaminske kiseline u položaju 356 zamenjen cisteinskim ostatkom (E356C), a u drugoj podjedinici Fc domena dodatno je tirozinski ostatak u položaju 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Uvođenje ova dva ostatka cisteina dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc domena, što dodatno stabilizuje dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

Prema otkriću, prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije S354C i T366W, a druga podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U posebnom aspektu, molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen je spojen (opciono preko molekula Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije) sa prvom podjedinicom Fc domena (koja sadrži modifikaciju "dugme"). Bez želje da se ograničimo teorijom, spajanje molekula Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen sa podjedinicom Fc domena koja sadrži dugme će (dodatno) minimizovati generisanje antigen vezujućih molekula koji sadrže dva molekula Fab koji se vezuju za aktivirajući T-ćelijski antigen (sterni sukob dva polipeptida koji sadrže dugme).

Ostale tehnike CH3-modifikacije za sprovođenje heterodimerizacije su razmatrane kao alternative prema otkriću, i opisane su npr. u WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

U jednom aspektu, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u EP 1870459 A1. Ovaj pristup se zasniva na uvođenju naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjima na specifičnim aminokiselinskim položajima u interfejs CH3/CH3 domena između dve podjedinice Fc domena.

Jedan poželjan aspekt za bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije su aminokiselinske mutacije R409D; K370E u jednom od dva CH3 domena (Fc domena) i aminokiselinske mutacije D399K; E357K u drugom CH3 domenu Fc domena (numerisanje prema Kabatovom EU indeksu).

U drugom aspektu opisa, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži aminokiselinsku mutaciju T366W u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije T366S, L368A, Y407V u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, i dodatno aminokiselinske mutacije R409D; K370E u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije D399K; E357K u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U još jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži aminokiselinske mutacije S354C, T366W u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije Y349C, T366S, L368A, Y407V u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, ili pomenuti bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži aminokiselinske mutacije Y349C, T366W u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije S354C, T366S, L368A, Y407V u CH3 domenima druge podjedinice Fc domena, i dodatne aminokiselinske mutacije R409D; K370E u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije D399K; E357K u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena (sve numeracije prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom aspektu otkrića, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2013/157953. U jednom aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju T366K, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju L351D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U daljem aspektu, prvi CH3 domen sadrži još jednu aminokiselinsku mutaciju L351K. U daljem aspektu, drugi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinsku mutaciju izabranu od Y349E, Y349D i L368E (poželjno L368E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom aspektu, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2012/058768. U jednom aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije L351Y, Y407A, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366A, K409F. U daljem aspektu, drugi CH3 domen sadrži dodatnu aminokiselinsku mutaciju na položaju T411, D399, S400, F405, N390, ili K392, npr. odabranu od a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ili T411W, b) D399R, D399W, D399Y ili D399K, c) S400E, S400D, S400R, ili S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V ili F405W, e) N390R, N390K ili N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ili K392E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U daljem aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije L351Y, Y407A, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366V, K409F. U daljem aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju Y407A, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366A, K409F. U daljem aspektu, drugi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinske mutacije K392E, T411E, D399R i S400R (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom aspektu, heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2011/143545 koristi se alternativno, npr. sa aminokiselinskom modifikacijom u položaju izabranom iz grupe koja se sastoji od 368 i 409 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom aspektu, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2011/090762, koji takođe koristi gore opisanu tehnologiju dugmeta u rupici. U jednom aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju T366W, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju Y407A. U jednom aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju T366Y, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju Y407T (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ili njegov Fc domen je IgG2potklase, i alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2010/129304. U alternativnom otelotvorenju, modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena sadrži modifikaciju koja posreduje elektrostatičke efekte upravljanja, na primer, kao što je opisano u publikaciji PCT WO 2009/089004. Po pravilu, ovaj postupak podrazumeva zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka na interfejsu dve podjedinice Fc domena naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da formiranje homodimera postaje elektrostatički nepovoljno, a heterodimerizacija elektrostatički povoljna. U jednom takvom aspektu, prvi CH3 domen uključuje aminokiselinsku supstituciju K392 ili N392 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D), poželjno K392D ili N392D), i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku supstituciju D399, E356, D356 ili E357 sa pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (npr. lizin (K) ili arginin (R), poželjno D399K, E356K, D356K, ili E357K, i još poželjnije D399K i E356K). U daljem aspektu, prvi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju K409 ili R409 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D), poželjno K409D ili R409D). U daljem aspektu, prvi CH3 domen dodatno ili alternativno sadrži aminokiselinsku supstituciju K439 i/ili K370 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D)) (sve numeracije prema Kabatovom EU indeksu).

U još jednom aspektu, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2007/147901. U jednom aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije K253E, D282K i K322D, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije D239K, E240K i K292D (numeracije prema Kabatovom EU indeksu).

U još jednom aspektu, heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2007/110205 može se koristiti alternativno.

U jednom aspektu, prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije K392D i K409D, a druga podjedinica Fc domena uključuje aminokiselinske supstitucije D356K i D399K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Modifikacije Fc domena koje smanjuju vezivanje Fc receptora i/ili efektorsku funkciju Fc domen daje bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T ćelije povoljne farmakokinetičke osobine, uključujući i dug poluživot u serumu, koji doprinosi dobroj akumulaciji u ciljnom tkivu i povoljnom stepenu raspodele između tkiva i krvi. Istovremeno, on može dovesti do nepoželjnog ciljanja bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore, a ne na željene ćelije koje nose antigene. Štaviše, koaktivacija signalnih puteva Fc receptora može dovesti do otpuštanja citokina, što u kombinaciji sa svojstvima aktiviranja T ćelija i dugim poluživotom antigen vezujućeg molekula dovodi do prekomerne aktivacije receptora citokina i teških neželjenih efekata kod sistemske primene. Aktivacija imunskih ćelija (koje nose Fc receptore), osim T ćelija, može čak i smanjiti efikasnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije zbog potencijalne destrukcije T ćelija, npr. NK ćelijama.

U skladu sa ovim, Fc domen bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije prema pronalasku ispoljava smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1. U jednom takvom aspektu, Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži pomenuti Fc domen) pokazuje manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% afiniteta vezivanja prema Fc receptoru, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1), i/ili manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% efektorske funkcije, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1). Prema otkriću, domen Fc domena (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži pomenuti Fc domen) ne vezuje se značajno za Fc receptor i/ili ne indukuje efektorsku funkciju. Fc receptor je Fcγ receptor. Fc receptor je humani Fc receptor. Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. Prema pronalasku, Fc receptor je aktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa receptor. Efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupe koja se sastoji od CDC, ADCC, ADCP i sekrecije citokina. U konkretnom otelotvorenju, efektorska funkcija je ADCC.

U jednom aspektu, domen Fc domena pokazuje suštinski sličan afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) u poređenju sa domenom Fc domena nativnog IgG1. Suštinski slično vezivanje za FcRn postiže se kada Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži navedeni Fc domen) pokazuje afinitet vezivanja za FcRn veći od oko 70%, konkretno veći od oko 80%, konkretnije veći od oko 90% Fc domena nativnog IgG1(ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1).

Fc domen je konstruisan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili redukovanu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje smanjuju afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. Najčešće su jedna ili više aminokiselinskih mutacija prisutne u svakoj od dve podjedinice Fc domena. Aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor. U jednom aspektu, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor najmanje 2 puta, najmanje 5 puta ili najmanje 10 puta. U aspektima gde postoji više od jedne aminokiselinske mutacije koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor najmanje 10 puta, najmanje 20 puta ili čak najmanje 50 puta. U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži konstruisani Fc domen pokazuje manje od 20%, konkretno manje od 10%, konkretnije manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor u poređenju sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži nekonstruisani Fc domen. U posebnom aspektu, Fc receptor je Fcγ receptor. Fc receptor je humani Fc receptor. Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. Fc receptor je aktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. Poželjno je da vezivanje za svaki od ovih receptora bude smanjeno. Afinitet vezivanja za komponentu komplementa, posebno afinitet vezivanja za C1q, takođe je smanjen. Afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) nije smanjen. Suštinski slično vezivanje za FcRn, tj. očuvanje afiniteta vezivanja Fc domena za navedeni receptor, postiže se kada Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži navedeni Fc domen) ima više od oko 70% afiniteta vezivanja za FcRn nekonstruisanog oblika Fc domena (ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži pomenuti nekonstruisani oblik Fc domena). Fc domen, ili bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije iz ovog otkrića koji sadrže navedeni Fc domen, mogu pokazivati više od oko 80%, a čak i više od oko 90% takvog afiniteta. Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije je konstruisan da ima smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. Smanjena efektorska funkcija može da obuhvata, ali nije ograničena na, jednu ili više od sledećih stvari: smanjenu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), smanjenu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), smanjenu ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), smanjenu sekreciju citokina, smanjeno preuzimanje antigena posredstvom imunog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjeno vezivanje za NK ćelije, smanjeno vezivanje za makrofage, smanjeno vezivanje za monocite, smanjeno vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, smanjenu direktnu signalizaciju koja indukuje apoptozu, smanjeno unakrsno povezivanje antitela vezanih za cilj, smanjenu zrelost dendritskih ćelija, ili smanjen prajming T ćelija. U jednom aspektu, smanjena efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupe u kojoj se nalazi smanjena CDC, smanjena ADCC, smanjena ADCP i smanjena sekrecija citokina. Prema pronalasku, smanjena efektorska funkcija je smanjena ADCC. U jednom aspektu, smanjena ADCC je manja od 20% ADCC indukovane nekonstruisanim Fc domenom (ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži nekonstruisani Fc domen).

U jednom aspektu, aminokiselinska mutacija koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju je aminokiselinska supstitucija. U jednom aspektu, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju izabranom iz grupe od E233, L234, L235, N297, P331 i P329 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju izabranom iz grupe L234, L235 i P329 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije L234A i L235A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom takvom aspektu, Fc domen je Fc domen IgG1, konkretno Fc domen humanog IgG1. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju P329. U konkretnijem aspektu, aminokiselinska supstitucija je P329A ili P329G, naročito P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom aspektu, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju P329 i drugu aminokiselinsku supstituciju u položaju izabranom od E233, L234, L235, N297 i P331 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U još konkretnijem aspektu, dodatna aminokiselinska supstitucija je E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. Prema pronalasku, Fc domen obuhvata aminokiselinske supstitucije u položajima P329, L234 i L235 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Fc domen obuhvata aminokiselinske mutacije L234A, L235A i P329G („P329G LALA“). Fc domen je Fc domen IgG1, konkretno Fc domen humanog IgG1. „P329G LALA“ kombinacija aminokiselinskih supstitucija skoro potpuno ukida vezivanje Feγ receptora (kao i komplementa) za Fc domen humanog IgG1, kako je opisano u publikaciji PCT br. WO 2012/130831. WO2012/130831 takođe opisuje postupke za pripremu takvih mutantnih Fc domena i postupke za određivanje njihovih svojstava, kao što su vezivanje za Fc receptore ili efektorske funkcije.

IgG4antitela pokazuju smanjen afinitet vezivanja za Fc receptore i smanjene efektorske funkcije u poređenju sa IgG1antitelima. Zato, u nekim aspektima otkrića, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije je Fc domen IgG4, konkretno Fc domen humanog IgG4. U jednom aspektu, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije u položaju S228, konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Da bi se dodatno smanjio afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili njegova efektorska funkcija, u jednom otelotvorenju Fc domen IgG4sadrži supstituciju aminokiselina u položaju L235, konkretno supstituciju aminokiseline L235E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju P329, konkretno supstituciju aminokiseline P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U konkretnom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije u položajima S228, L235 i P329, posebno aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Takvi mutanti Fc domena IgG4i njihova svojstva vezivanja Fcy receptora opisani su u publikaciji PCT br. WO 2012/130831.

Fc domen koji pokazuje smanjen afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1je humani Fc domen IgG1koji sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (numeracije prema Kabatovom EU indeksu). U određenim aspektima, N-glikozilacija Fc domena je eliminisana. U jednom takvom aspektu, Fc domen sadrži aminokiselinsku mutaciju u položaju N297, posebno aminokiselinsku supstituciju koja zamenjuje asparagin alaninom (N297A) ili asparaginskom kiselinom (N297D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Pored Fc domena opisanih gore i u publikaciji PCT br. WO2012/130831, Fc domeni sa smanjenim vezivanjem Fc receptora i/ili efektorskom funkcijom prema otkriću takođe uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc domena 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US patent br.6,737,056) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).

Mutantni Fc domeni se mogu pripremiti uklanjanjem, supstitucijom, umetanjem ili modifikacijom aminokiselina, uz upotrebu genetičkih ili hemijskih metoda dobro poznatih u struci. Genetički postupci mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR, sintezu gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi, na primer, sekvenciranjem.

Vezivanje za Fc receptore se može lako odrediti npr. testom ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) upotrebom standardnih instrumentata kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), a takvi Fc receptori se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Ovde je opisan takav pogodan test vezivanja. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju ćelije koji sadrže Fc domen za Fc receptore može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su NK ćelije koje eksprimiraju Fcγllla receptor.

Efektorska funkcija Fc domena ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen, može se izmeriti postupcima poznatim u struci. Ovde je opisan pogodan test za merenje ADCC. Drugi primeri in vitro analiza za procenu aktivnosti ADCC molekula od interesa opisani su u US patentu broj 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) i Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. patentu br.5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativno, mogu se koristiti neradioaktivni postupci analiza (videti, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula se može odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je objavljeno u Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

Vezivanje Fc domena za komponentu komplementa, posebno za C1q, je smanjeno. U skladu sa tim, kada je Fc domen konstruisan da ima smanjenu efektorsku funkciju, pomenuta smanjena efektorska funkcija uključuje smanjeni CDC. Testiranje vezivanja C1q se može obaviti radi utvrđivanja da li je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sposoban da vezuje C1q i da li stoga ima CDC aktivnost. Videti, npr. ELISA test C1q i C3c vezivanja u WO2006/029879 i WO2005/100402. Da bi se ocenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al, J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al, Blood 101, 1045-1052 (2003); i Cragg i Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

Antigen vezujući ostaci

Antigen vezujući molekul prema pronalasku je bispecifičan, tj. sadrži najmanje dva antigen vezujuća ostatka sposobna za specifično vezivanje za dve različite antigenske determinante. Prema pronalasku, ostaci koji vezuju antigen su molekuli Fab (tj. antigen vezujući domeni sastavljeni od teškog i lakog lanca, od kojih svaki sadrži varijabilni i konstantni domen). U jednom aspektu, ovi Fab molekuli su humani. Prema pronalasku, navedeni molekuli Fab su humanizovani. Navedeni molekuli Fab sadrže humane konstantne domene teškog i lakog lanca.

Najmanje jedan antigen vezujući ostatak je unakrsno izmenjeni molekul Fab. Takva modifikacija smanjuje pogrešno sparivanje teških i lakih lanaca iz različitih molekula Fab, čime se poboljšava prinos i čistoća bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz pronalaska u rekombinantnoj proizvodnji. U određenom unakrsno izmenjenom molekulu Fab koji je koristan za bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ovog pronalaska, varijabilni domeni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab (VL, odnosno VH) se razmenjuju. Međutim, čak i sa ovom razmenom domena, preparat bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije može sadržati određene sporedne proizvode zbog takozvane interakcije tipa Bens Džons između pogrešno uparenih teških i lakih lanaca (vidi Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191). Da bi se dodatno smanjilo pogrešno sparivanje teških i lakih lanaca iz različitih molekula Fab, i time povećala čistoća i prinos željenog bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, prema ovom pronalasku, na određene položaje aminokiselina uvedene su naelektrisane aminokiseline sa suprotnim naelektrisanjem u CH1 i CL domene bilo kog molekula Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljnih ćelija, ili molekula Fab koji se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen. Modifikacije naelektrisanja prema pronalasku se vrše u konvencionalnim molekulima Fab koji su sadržani u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije (kao što je prikazano npr. na Slikama 1 A-C, G-J), prikazane su dalje modifikacije naelektrisanja u unakrsno izmenjenim molekulima Fab koji su sadržani u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije (kao što je prikazano npr. na Slici 1 D-F, K-N) (ali ne u oba). Modifikacije naelektrisanja su načinjene u konvencionalnim molekulima Fab koji su sadržani u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije (koji se posebno vezuju za antigen ciljne ćelije).

Prema pronalasku, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije je sposoban da se istovremeno vezuje za antigen ciljnih ćelija, posebno antigen ćelija tumora, i aktivirajući T-ćelijski antigen, posebno CD3. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije je sposoban za unakrsno vezivanje T ćelije i ciljne ćelije istovremenim vezivanjem za antigen ciljne ćelije i aktivirajući T-ćelijski antigen. Takvo simultano vezivanje dovodi do lize ciljne ćelije, posebno tumorske ćelije. Takvo simultano vezivanje dovodi do aktivacije T ćelije. Takvo simultano vezivanje dovodi do ćelijskog odgovora T limfocita, konkretno citotoksičnog T limfocita, izabranog iz sledeće grupe: proliferacija, diferencijacija, sekrecija citokina, otpuštanje citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksična aktivnost i ekspresija aktivacionih markera. Vezivanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije za aktivirajući T-ćelijski antigen, posebno CD3, bez istovremenog vezivanja za antigen ciljnih ćelija, ne dovodi do aktivacije T ćelija.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije je sposoban da preusmeri citotoksičnu aktivnost T ćelije na ciljnu ćeliju. Pomenuto preusmeravanje je nezavisno od prezentacije peptidnog antigena posredstvom MHC od strane ciljne ćelije i/ili specifičnosti T ćelije.

Posebno, T ćelija prema pronalasku je citotoksična T ćelija. T ćelija je CD4<+>ili CD8<+>T ćelija, posebno CD8<+>T ćelija.

Aktivirajući molekul Fab koji vezuje T-ćelijski antigen

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska sadrži jedan molekul Fab koji se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen (takođe se ovde označava kao „aktivirajući molekul Fab koji vezuje T-ćelijski antigen“). Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži najviše jedan molekul Fab (ili drugi molekul Fab) sposoban za specifično vezivanje za aktivirajući T-ćelijski antigen. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije obezbeđuje jednovalentno vezivanje za aktivirajući T-ćelijski antigen.

Molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen je unakrsno izmenjeni molekul Fab kao što je ovde opisan, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teškog i lakog lanca Fab međusobno razmenjeni/zamenjeni. Molekuli Fab koji specifično vezuju antigen ciljne ćelije su konvencionalni molekuli Fab. Molekul Fab koji se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen je unakrsno izmenjeni molekul Fab i molekuli Fab koji se specifično vezuju za antigen ciljne ćelije su konvencionalni molekuli Fab.

U alternativnim aspektima opisa, molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen je konvencionalni molekul Fab. U takvim aspektima, molekul Fab koji specifično vezuje antigen ciljne ćelije je unakrsno izmenjeni molekul Fab kao što je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab međusobno razmenjeni/zamenjeni.

Aktivirajući T-ćelijski antigen je CD3, konkretno humani CD3 (SEQ ID NO: 1) ili CD3 cinomolgusa (SEQ ID NO: 2), najkonkretnije humani CD3. Molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen je unakrsno reaktivan za (tj. specifično se vezuje za) humani i cinomolgusov CD3. Aktivirajući T-ćelijski antigen je epsilon podjedinica CD3 (CD3 epsilon).

Molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen specifično se vezuje za CD3, posebno CD3 epsilon, i sadrži najmanje jedan region za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR) odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6, i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.

CD3 vezujući molekul Fab sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 5, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 9, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 10.

U drugom aspektu, CD3 vezujući molekul Fab sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 67, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 68, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 9, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 10.

U jednom aspektu, CD3 vezujući molekul Fab sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 3, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 7.

CD3 vezujući molekul Fab sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7.

CD3 vezujući molekul Fab sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 3 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 7.

Fab molekul koji vezuje antigen ciljne ćelije

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema pronalasku sadrži dva molekula Fab koji se specifično vezuju za CD20 (koji se ovde takođe naziva „molekul Fab koji vezuje antigen ciljne ćelije“). Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije se sastoji od dva molekula Fab koji se specifično vezuju za antigen ciljne ćelije. Svaki od ovih molekula Fab specifično se vezuje za istu antigensku determinantu. Svi ovi molekuli Fab su identični, tj. sadrže iste aminokiselinske sekvence, uključujući iste aminokiselinske supstitucije u CH1 i CL domenu, kao što je ovde opisano. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži molekul imunoglobulina koji se specifično vezuje za antigen ciljnih ćelija. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži najviše dva molekula Fab koji se specifično vezuju za antigen ciljnih ćelija.

Molekuli Fab koji se specifično vezuju za antigen ciljne ćelije su konvencionalni molekul Fab. Molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen je unakrsno izmenjeni molekul Fab kao što je ovde opisan, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teškog i lakog lanca Fab međusobno razmenjeni/zamenjeni.

U alternativnim aspektima opisa, molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući antigen ciljne ćelije je unakrsno izmenjeni molekul Fab, kao što je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab međusobno razmenjeni/zamenjeni. U takvim aspektima, molekuli Fab koji specifično vezuju aktivirajući T-ćelijski antigen su konvencionalni molekul Fab.

Fab molekul koji vezuje antigen ciljne ćelije vezuje se za specifičnu antigensku determinantu, i sposoban je da usmeri bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije na ciljno mesto, na primer, na određeni tip tumorske ćelije koja nosi antigensku determinantu.

U određenim aspektima, molekul Fab koji vezuje antigen ciljne ćelije specifično se vezuje za površinski ćelijski antigen.

U određenim aspektima, molekul Fab koji vezuje antigen ciljne ćelije je usmeren na antigen koji je povezan sa patološkim stanjem, kao što je antigen prezentovan na tumorskoj ćeliji ili na ćeliji inficiranoj virusom. Odgovarajući antigeni ciljnih ćelija su površinski ćelijski antigeni, na primer, ali nisu ograničeni na receptore na površini ćelija. U konkretnim aspektima, antigen ciljne ćelije je humani antigen. Primeri antigena ciljnih ćelija uključuju CD20, Her2, Her3, MCSP (hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom, takođe poznat kao hondroitin sulfat proteoglikan 4), ili BCMA (ciljna ćelija za sazrevanje humanih B ćelija, takođe poznata kao član superfamilije receptora faktora nekroze tumora 17 (UniProt Q02223)).

Antigen ciljne ćelije je CD20, naročito humani CD20. Antigen ciljne ćelije je CD20, i molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži region za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 46, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 47, i CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 48, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 49, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 50 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 51. U daljem aspektu otkrića, antigen ciljne ćelije je CD20, i molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 30, i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 31. Antigen ciljne ćelije je CD20, i molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 30 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 31. U jednom aspektu otkrića, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 18, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 19, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 20 i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 21. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 18, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 19, dve polipeptidne sekvence SEQ ID NO: 20 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21. U drugom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 32, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 19, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 20, i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 21. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 32, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 19, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 20 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21. U još jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 36, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 37, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 38 i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 39. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 37, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 38 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 39. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 40, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 41, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 20, i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 21. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 40, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 41, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 20 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21.

U drugim aspektima opisa, ciljni antigen je Her2, posebno humani Her2. U jednom aspektu, antigen ciljne ćelije je Her2, ai molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 61, i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 62. U daljem aspektu, antigen ciljnih ćelija je Her2, a molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljnih ćelija sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 61 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 62. U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 21, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 52, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 53 i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 54. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 52, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 53 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 54.

U drugim aspektima, ciljni antigen je Her3, posebno humani Her3. U jednom aspektu, antigen ciljne ćelije je Her3, ai molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 63, i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 64. U daljem aspektu, antigen ciljnih ćelija je Her3, a molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljnih ćelija sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 63 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 64. U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 21, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 55, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 56 i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 57. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 55, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 56 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 57.

U drugim aspektima opisa, ciljni antigen je hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP), posebno humani MCSP. U jednom aspektu, antigen ciljne ćelije je MCSP, a molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 65, i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 66. U daljem aspektu, antigen ciljnih ćelija je Her2, i molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 65 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 66.

U nekim aspektima, ciljni antigen je BCMA. U drugim aspektima, antigen ciljnih ćelija nije BCMA.

Polinukleotidi

Ovo otkriće dalje obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, kao što je ovde opisano, ili njegov fragment. U nekim aspektima, pomenuti fragment je antigen vezujući fragment.

Polinukleotidi koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska mogu se eksprimirati kao jedan polinukleotid koji kodira ceo bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, ili kao višestruki (npr. dva ili više) polinukleotidi koji su koeksprimirani. Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su koeksprimirani mogu se povezati putem, na primer, disulfidnih veza ili drugih sredstava, dajući funkcionalan bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije. Na primer, deo lakog lanca molekula Fab može biti kodiran odvojenim polinukleotidom iz dela bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji sadrži deo teškog lanca molekula Fab, podjedinicu Fc domena i opciono drugi molekul Fab (deo). Kad su koeksprimirani, polipeptidi teškog lanca će se povezati sa polipeptidima lakog lanca kako bi formirali molekul Fab. U drugom primeru, deo bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji sadrži jednu od dve podjedinice Fc domena i opciono jedan ili više molekula Fab (deo) može biti kodiran odvojenim polinukleotidom iz dela bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji sadrži drugu od dve podjedinice Fc domena i opciono molekul Fab (deo). Kada su koeksprimirane, podjedinice Fc domena će se udružiti da formiraju Fc domen.

U nekim aspektima, izolovani polinukleotid kodira celi bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema pronalasku, kao što je ovde opisano. U drugim aspektima, izolovani polinukleotid kodira polipeptide sadržane u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T ćelije prema pronalasku, kao što je ovde opisano.

U određenim primerima otelotvorenja, polinukleotid ili nukleinska kiselina je DNK. U drugim aspektima, polinukleotid iz predmetnog otkrića je RNK, na primer, u obliku informacione RNK (mRNK). RNK iz predmetnog otkrića može biti jednolančana ili dvolančana.

Rekombinantni postupci

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska mogu se dobiti, na primer, sintezom peptida u čvrstom stanju (npr. Merifildova sinteza u čvrstoj fazi) ili rekombinantnom proizvodnjom. Za rekombinantnu proizvodnju, jedan ili više polinukleotida koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije (fragment), npr. kao što je gore opisano, izoluju se i ubacuju u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takav polinukleotid može biti lako izolovan i sekvenciran pomoću konvencionalnih procedura. U jednom aspektu otkrića, obezbeđen je vektor, poželjno ekspresioni vektor, koji obuhvata jedan ili više polinukleotida kao što je ovde navedeno. Postupci koji su dobro poznati stričnim licima iz ove oblasti mogu se primeniti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije (fragment), uz odgovarajuće signale transkripcione/translacione kontrole. Ti postupci uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetsku rekombinaciju. Videti, na primer, tehnike koje su opisali Maniatis et al., M<OLECULAR>C<LONING>: A L<ABORATORY>M<ANUAL>, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); i Ausubel et al., C<URRENT>P<ROTOCOLS IN>M<OLECULAR>B<IOLOGY>, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Ekspresioni vektor može biti deo plazmida, virusa, ili može biti fragment nukleinske kiseline. Ekspresioni vektor uključuje ekspresionu kasetu u koju je kloniran polinukleotid koji klonira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije (fragment) (tj. kodirajući region) u operabilnoj asocijaciji sa promoterom i/ili drugim elementima kontrole transkripcije ili translacije. U smislu ovog dokumenta, „kodirajući region” je deo nukleinske kiseline koja se sastoji od kodona translatovanih u aminokiseline. Iako „stop kodon” (TAG, TGA ili TAA) nije translatovan u aminokiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ako je prisutan, ali sve ostale granične sekvence, kao što su promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni, 5' i 3' netranslatovane regije i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva ili više kodirajućih regiona mogu da se nalaze u jednom konstruktu polinukleotida, npr. u jednom vektoru ili u odvojenim konstruktima polinukleotida, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Štaviše, svaki vektor može da sadrži jedan kodirajući region ili može da obuhvata dva kodirajuća ili više kodirajućih regiona, npr. ovde opisani vektor može da kodira jedan ili više polipeptida, koji su posttranslaciono ili kotranslaciono razdvojeni u krajnje proteine putem proteolitičkog cepanja. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina kao što je ovde opisano mogu da kodiraju heterologe kodirajuće regione, spojene ili nespojene sa polinukleotidom koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije (fragment) iz predmetnog pronalaska, njegovu varijantu ili derivat. Heterologni kodirajući regioni obuhvataju, bez ograničenja, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen. Operabilna asocijacija se dešava kada se kodirajući region genskog proizvoda, npr. polipeptida, poveže sa jednom regulatornom sekvencom ili više regulatornih sekvenci, tako da postavi ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence (ili sekvenci). Dva DNK fragmenta (kao što je kodirajući region polipeptida i asocirani promoter) su „funkcionalno povezani” ukoliko indukcija promoterske funkcije izaziva transkripciju mRNK koja kodira željeni genski proizvod i ako priroda veze između dva DNK fragmenta ne ometa sposobnost ekspresije regulatornih sekvenci da usmeravaju ekspresiju genskog proizvoda ili utiču na sposobnost transkripcije DNK obrasca. Stoga bi region promotera bio operabilno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid da je promoter sposoban za vršenje transkripcije te nukleinske kiseline. Promoter može da bude ćelijski specifičan promoter koji usmerava značajnu transkripciju DNK samo u predodređenim ćelijama. Drugi elementi koji kontrolišu transkripciju, pored promotera, na primer pojačivači, operatori, represori i signali okončanja transkripcije, mogu operabilno da se povežu sa polinukleotidom radi usmeravanja transkripcije specifične za određene ćelije. Ovde su opisani odgovarajući promoteri i drugi regioni koje kontrolišu transkripciju. Veliki broj regiona koji kontrolišu transkripciju poznat je stručnim licima iz ove oblasti. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, regione koji kontrolišu transkripciju, i koji funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti za promociju i pojačavanje iz citomegalovirusa (npr. momentalni rani promoter u konjukciji sa intronom-A), virusa SV40 (npr. rani promoter) i retrovirusa (takav je, npr. Rausov sarkoma virus). Drugi regioni koji kontrolišu transkripciju obuhvataju one dobijene iz gena kičmenjaka, kao što su aktin, protein toplotnog stresa, goveđi hormon rasta i â-globin zeca, kao i druge sekvence sposobne za kontrolu ekspresije gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni odgovarajući regioni koji kontrolišu transkripciju uključuju promotere specifične za tkivo i pojačivače, kao i inducibilne promotere (npr. inducibilni promoteri tetraciklina). Slično tome, veliki broj elemenata koji kontrolišu translaciju poznat je stručnim licima iz ove oblasti. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, mesta vezivanja ribozoma, kodone početka i kraja translacije i elemente dobijene iz viralnih sistema (naročito unutrašnje ribozomalno ulazno mesto ili IRES, poznato i kao CITE sekvenca). Transporter ekspresije može da sadrži i druge karakteristike kao što je mesto početka replikacije i/ili elemente integracije hromozoma, kao što su duga terminalna ponavljanja retrovirusa (LTR) ili invertovana terminalna ponavljanja (ITR) adenoasociranih virusa (AAV).

Kodirajući regioni polinukleotida i nukleinske kiseline iz predmetnog otkrića mogu biti asocirani sa dodatnim kodirajućim regionima koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide, koji usmeravaju sekreciju polipeptida kodiranih od strane polinukleotida iz predmetnog otkrića. Na primer, ako je poželjna sekrecija bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, DNK koja kodira signalnu sekvencu može biti postavljena ushodno od nukleinske kiseline koja kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz otkrića ili njegov fragment. U skladu sa hipotezom signala, proteini koji se luče putem ćelija sisara imaju signalni peptid ili sekretornu vodeću sekvencu koja je isečena iz zrelog proteina nakon što je započet izvoz rastućeg lanca proteina širom endoplazmatičnog retikuluma. Lica standardne stručnosti iz ove oblasti su upoznata s tim da polipeptidi izlučeni iz ćelija kičmenjaka po pravilu imaju signalni peptid spojen za N-terminalni kraj polipeptida, koji je isečen iz translatovanog polipeptida radi stvaranja sekretornog ili „zrelog” oblika peptida. U određenim aspektima opisa, nativni signalni peptid, npr. koristi se teški lanac imunoglobulina ili laki lanac signalnog peptida, ili funkcionalni derivat te sekvence koja zadržava sposobnost usmeravanja izlučivanja sekrecije polipeptida sa kojim je funkcionalno povezana. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, vodeća sekvenca divljeg tipa se može supstituisati vodećom sekvencom aktivatora plazminogena u ljudskom tkivu (TPA) ili β-glukuronidaze miša. DNK koja kodira kratku sekvencu proteina koja bi se mogla koristiti za olakšavanje kasnijeg prečišćavanja (npr. histidinski rep) ili kao pomoć u obeležavanju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, može biti uključena unutar, ili na krajevima bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije (fragmenta) koji kodira polinukleotid.

U daljem aspektu otkrića, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan takav ovde opisan polinukleotid ili više njih. U određenim aspektima, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan takav ovde opisan vektor ili više njih. Polinukleotidi i vektori mogu da sadrže bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je ovde opisano u vezi sa polinukleotidima odnosno vektorima. U jednom takvom aspektu otkrića, ćelija domaćin sadrži (npr. prethodno je transformisana ili transficirana njime) vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska (ili njegov deo). Kao što je korišćen ovde, termin „ćelija domaćin” odnosi se na bilo koji ćelijski sistem koji može biti projektovan da proizvodi bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska ili njihove fragmente. Ćelije domaćini koje imaju sposobnost replikacije i podržavanja ekspresije bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije dobro su poznate u struci. Takve ćelije mogu da budu transficirane ili transdukovane u skladu sa određenim ekspresionim vektorom, a velike količine ćelija koje sadrže vektor mogu se uzgajati za zasejavanje velikih fermentora za dobijanje dovoljnih količina bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije za kliničku primenu. Odgovarajuće ćelije domaćini sadrže prokariotske mikroorganizme, kao što je E. coli ili različite eukariotske ćelije, kao što su jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelije insekata i slično. Na primer, polipeptidi se mogu proizvesti u bakterijama, naročito kada nije neophodna glikozilacija. Nakon ekspresije, polipeptid može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, a može i dalje da se prečišćava. Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju polipeptid, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije

„humanizovani“, što dovodi do stvaranja polipeptida sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), i Li et al, Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju (glikozilovanih) polipeptida se takođe izvode iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Videti npr. US Patent br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (gde se opisuje PLANTIBODIES™ tehnologija za proizvodnju antitela u transgenim biljkama). Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere korisnih ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); humana embrionska linija bubrega (ćelije 293 ili 293T, kao što opisuju npr. Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), Sertolijeve ćelije miša (TM4 ćelije kao što opisuje npr. Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije (kao što opisuju npr. Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)); MRC5 ćelije i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara predstavljaju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući dhfr<->CHO ćelije (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su: YO, NS0, P3X63 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju proteina, videti, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str.255-268 (2003). Ćelije domaćini obuhvataju gajene ćelije, između ostalog, gajene ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, bakterijske ćelije i biljne ćelije, ali i ćelije sadržane u transgenim životinjama, transgenim biljkama ili gajenom biljnom ili životinjskom tkivu. U jednom primeru otelotvorenja, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara, kao što je jajna ćelija kineskog hrčka (CHO), humana embrionska ćelija bubrega (HEK) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija).

U struci su poznate standardne tehnologije za ekspresiju stranih gena u ovim sistemima. Ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži teški ili laki lanac antigen vezujućeg domena, kao što je antitelo, mogu se konstruisati tako da takođe eksprimiraju i drugi lanac antitela, tako da je eksprimirani proizvod antitelo koje ima teški i laki lanac.

U jednom aspektu otkrića, obezbeđen je postupak za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, pri čemu ovaj postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, kako je ovde predviđeno, pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, i izolovanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).

Komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije genetski su spojene jedna sa drugom. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije može biti projektovan tako da se njegove komponente spoje direktno jedna sa drugom, ili indirektno putem sekvence linkera. Kompozicija i dužina linkera se može odrediti u skladu sa postupcima dobro poznatim u struci, i njihova efikasnost se može ispitati. Primeri za sekvence linkera između različitih komponenata bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije nalaze se u ovde navedenim sekvencama. Dodatne sekvence mogu takođe biti uključene da pripoje mesto cepanja da bi se razdvojile pojedine komponente fuzije ako je potrebno, na primer sekvenca prepoznavanja endopeptidaze.

U određenim aspektima, jedan ili više antigen vezujućih ostataka bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije obuhvataju najmanje jedan varijabilni region antitela sposoban za vezivanje antigenske determinante. Varijabilni regioni mogu da formiraju deo, ili da budu derivati antitela koja se nalaze ili ne nalaze u prirodi, i njihovi fragmenti. Postupci stvaranja poliklonskih antitela i monoklonskih antitela dobro su poznati u struci (videti, npr. Harlow and Lane, „Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Antitela koja se ne nalaze u prirodi mogu se konstruisati pomoću sinteze peptida na čvrstoj podlozi, mogu se proizvesti rekombinacijom (npr. kao što je opisano u U.S. patentu br.

4,186,567) ili se mogu dobiti, na primer, skriningom kombinatornih biblioteka koje sadrže varijabilne teške i lake lance (videti, npr. U.S. Patent. br.5,969,108 McCafferty).

Antitelo, fragment antitela, antigen vezujući domen ili varijabilni region antitela bilo koje životinjske vrste može se koristiti u bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju T ćelije iz ovog pronalaska. Neograničavajući primeri za antitela, fragmente antitela, antigen vezujuće domene ili varijabilne regione korisne u ovom otkriću mogu biti mišjeg, primatskog ili humanog porekla. Ako je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije namenjen za humanu upotrebu, himerni oblik antitela može da se koristi ako konstantni regioni antitela potiču od čoveka. Humanizovani ili potpuno humani oblik antitela takođe se može dobiti u skladu sa metodama poznatim u struci (videti, npr. U.S. Patent br. 5,565,332, Winter). Humanizacija se može postići različitim metodama, uključujući, bez ograničenja, (a) graftovanje nehumanih (npr. donorskih antitela) CDR u humani (npr. antitelo primalac) okvir i konstantne regione sa zadržavanjem ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr. onih koji su važni za održavanje dobrog afiniteta za vezivanje antigena ili funkciju antitela), (b) graftovanje samo nehumanih regiona koji određuju specifičnost (SDR ili α-CDR; ostaci ključni za interakciju antitelo-antigen) na humani okvir i konstantne regione, ili (c) transplantacija čitavih nehumanih varijabilnih domena, koji se „prekrivaju” sekcijom nalik na humanu tako što se zamenjuju površinski ostaci. Humanizovana antitela i postupci njihovog dobijanja razmotreni su u npr. Almagro i Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), a dodatno su opisani npr. u Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US Patent br. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison i Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (opis SDR (a-CDR)graftovanja); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (opis

„vraćanja na površinu”); Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (opis „FR mešanja”); i Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) i Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (opis pristupa „usmerene selekcije” FR mešanju). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela načelno su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) i Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humani varijabilni regioni mogu da formiraju deo ili da budu izvedeni iz humanih monoklonskih antitela dobijenih metodom hibridoma (videti npr. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51–63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Humana antitela i humani varijabilni regioni se mogu dobiti i primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov (videti, npr. Lonberg, Nat Biotech 23, 1117–1125 (2005). Humana antitela i humani varijabilni regioni se takođe mogu generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog regiona Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla (videti npr., Hoogenboom et al Methods in Molecular Biology 178, 1–37 (O’Brien et al, izdav., Human Press, Totowa, NJ, 2001); i McCafferty et al, Nature 348, 552–554; Clackson et al, Nature 352, 624–628 (1991)). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti.

U određenim aspektima, antigen vezujući ostaci korisni u ovom otkriću mogu biti projektovani tako da imaju poboljšan afinitet vezivanja prema, na primer, postupcima objavljenim u US Pat. Appl. Publ. br. 2004/0132066. Sposobnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije iz pronalaska da se veže za specifičnu antigensku determinantu može se meriti pomoću testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili drugih tehnika poznatih u struci, npr. tehnikom površinske plazmonske rezonance (koja se vrši na sistemu BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Kompetitivni testovi se mogu koristiti za identifikovanje antitela, fragmenta antitela, antigen vezujućeg domena ili varijabilnog domena koji se takmiči sa referentnim antitelom u pogledu vezivanja za određeni antigen, npr. antitelo koje se takmiči sa antitelom V9 u vezivanju za CD3. U određenim aspektima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo referentno antitelo. Detaljne primere metoda za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo daje Morris (1996) „Epitope Mapping Protocols“, u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primeru kompetitivnog testa, imobilisani antigen (npr. CD3) se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za antigen (npr. antitelo V9, opisano u US 6,054,297) i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za antigen, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen u test-uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual pogl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije pripremljeni u skladu sa ovde navedenim uputstvom mogu se prečistiti tehnikama poznatim u struci, kao što su tečna hromatografija visokih performansi, jonska hromatografija, gel elektroforeza, afinitetna hromatografija, gel hromatografija, i slično. Stvarni uslovi korišćeni za prečišćavanje određenog proteina delimično će zavisiti od faktora kao što su ukupno naelektrisanje, hidrofobnost, hidrofilnost itd. i biće jasni stručnim licima iz ove oblasti. Za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom se može koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen za koji se vezuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije. Na primer, za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska koristi se matrica sa proteinom A ili proteinom G. Afinitetna hromatografija pomoću sekvencijalnog proteina A ili G i gel hromatografija se mogu koristiti za izolovanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije suštinski kao što je opisano u Primerima. Čistoća bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije može se utvrditi različitim analitičkim metodama poznatim u struci, uključujući gel elektroforezu, tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom, i slično. Na primer, dokazano je da je teški lanac fuzionog proteina eksprimiran prema opisu u Primerima netaknut i pravilno povezan, kao što je pokazala redukovana SDS PAGE (videti npr. Sliku 3). Tri trake su razložene na približno Mr 25.000, Mr 50.000 i Mr 75.000, što odgovara predviđenim molekulskim masama lakog lanca, teškog lanca i fuzionog proteina teškog lanca/lakog lanca bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije.

Testovi

Ovde navedeni bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.

Testovi za merenje afiniteta

Afinitet bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije prema Fc receptoru ili ciljnom antigenu se može odrediti prema postupcima koji su navedeni u primerima pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR), koristeći standardne instrumente kao što je

„BIAcore” instrument (GE Healthcare), i receptore ili ciljne proteine, kakve je moguće dobiti rekombinantnom ekspresijom. Alternativno, vezivanje bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije za različite receptore ili ciljne antigene može se proceniti korišćenjem ćelijskih linija koje eksprimiraju određeni receptor ili ciljni antigen, na primer, putem protočne citometrije (FACS). Specifično ilustrativan i primeren aspekt otelotvorenja za merenje afiniteta vezivanja nalazi se u daljem tekstu i u Primerima.

Prema jednom aspektu, KDse meri površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE® T100 (GE Healthcare) na 25 °C.

Da bi se analizirala interakcija između Fc dela i Fc receptora, His-označeni rekombinantni Fc receptor je uhvaćen anti-Penta His antitelom (Qiagen) imobilisanim na CM5 čipovima, i bispecifični konstrukti se koriste kao analiti. Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, GE Healthcare) aktiviraju se pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Penta-His antitelo je razblaženo 10 mM natrijum acetatom, pH 5,0, do 40 μg/ml pre injektovanja pri protoku od 5 μl/minut, da se dobije oko 6500 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja liganda, 1 M etanolamin se injektuje da bi blokirao neizreagovale grupe. Nakon toga se Fc receptor hvata tokom 60 s pri 4 ili 10 nM. Za kinetička merenja, četvorostruka serijska razblaženja bispecifičnog konstrukta (raspon između 500 nM i 4000 nM) se injektuju u HBS-EP (GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% surfaktant P20, pH 7,4) na 25 °C pri protoku od oko 30 μl/min tokom 120 s.

Da bi se odredio afinitet prema ciljnom antigenu, bispecifični konstrukti su uhvaćeni anti-humanim Fab specifičnim antitelom (GE Healthcare) koje je imobilisano na aktiviranoj površini CM5-senzorskog čipa, kako je opisano za anti Penta-His antitelo. Konačna količina vezanog proteina je oko 12.000 RU. Bispecifični konstrukti se hvataju tokom 90 s na 300 nM. Ciljni antigeni se propuštaju kroz protočne ćelije tokom 180 s u rasponu koncentracija od 250 do 1000 nM, uz protok od 30 µl/min. Disocijacija se prati tokom 180 s.

Ukupne razlike indeksa prelamanja su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji. Odgovor stacionarnog stanja korišćen je da bi se dobila konstanta disocijacije KDnelinearnim uklapanjem krive Lengmirove izoterme vezivanja. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) su izračunate pomoću jednostavnog jedanna-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® T100 Evaluation Software verzija 1.1.1) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al. J. Mol. Biol.293:865-881 (1999).

Testovi za merenje aktivnosti

Biološka aktivnost bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska može se meriti različitim testovima, kao što je opisano u Primerima. Biološka aktivnost može, na primer, uključivati indukciju proliferacije T ćelija, indukciju signalizacije u T ćelijama, indukciju ekspresije aktivacionih markera u T ćelijama, indukciju sekrecije citokina pomoću T ćelija, indukciju lize ciljnih ćelija kao što su tumorske ćelije, i indukciju regresije tumora i/ili poboljšanje preživljavanja.

Kompozicije, formulacije i načini primene

U daljem aspektu, otkriće daje farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koji od ovde datih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije, npr. za upotrebu u bilo kom od donjih terapeutskih postupaka. U jednom aspektu, farmaceutski preparat uključuje bilo koji od ovde datih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom aspektu, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koji od ovde datih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.

Dalje, u otkriću je opisan postupak za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska u obliku pogodnom za primenu in vivo, pri čemu postupak obuhvata (a) dobijanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, i b) formulisanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, pri čemu je preparat bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije formulisan za primenu in vivo.

Farmaceutske kompozicije iz predmetnog otkrića sadrže terapeutski delotvornu količinu jednog ili više bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije rastvorenih ili dispergovanih u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Fraze „farmaceutski ili farmakološki prihvatljivo” odnose se na molekulske entitete i kompozicije koje su uglavnom netoksične za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, tj. ne dovode do neželjenih, alergijskih i drugih nepovoljnih reakcija kada se primene na životinjama, kao što je, na primer, čovek, po potrebi. Priprema farmaceutske kompozicije koja sadrži barem jedan bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i, opciono, dodatni aktivni sastojak, biće poznata stručnjacima u ovoj oblasti u smislu predmetnog pronalaska, kao što je objašnjeno u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd. Mack Printing Company, 1990. Pored toga, za primenu na životinjama (npr. ljudima), podrazumevaće se da preparati treba da ispune standarde sterilnosti, pirogenosti, opšte bezbednosti i čistoće u skladu sa zahtevima FDA Kancelarije za biološke standarde ili odgovarajućeg autoriteta u drugim zemljama. Poželjne kompozicije su liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori. U smislu ovog dokumenta, termin

„farmaceutski prihvatljivi nosač” podrazumeva sve rastvarače, pufere, disperzione medije, premaze, surfaktante, antioksidante, konzervanse (npr. antibakterijske agense, antifungicidne agense), izotonične agense, agense za odlaganje apsorpcije, soli, konzervanse, antioksidanse, proteine, lekove, stabilizatore lekova, polimere, gelove, veziva, ekscipijente, dezintegratore, lubrikante, zaslađivače, arome, boje, slične materijale i njihove kombinacije, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, str. 1289-1329. Osim ako se ne ukaže da je neki od konvencionalnih nosača nekompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova upotreba u terapeutskim ili farmaceutskim kompozicijama je razmotrena.

Ova kompozicija može da sadrži različite vrste nosača u zavisnosti od toga da li treba da se primeni u čvrstom, tečnom ili u obliku aerosola i da li je potrebno da budu sterilni za takvu vrstu primene u obliku injekcije. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska (i sva dodatna lekovita sredstva) mogu se primenjivati intravenski, intradermalno, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatički, intraslezinski, intrarenalno, intrapleuralno, intratrahealno, intranazalno, intravitrealno, intravaginalno, intrarektalno, intratumoralno, intramuskularno, intraperitonealno, supkutano, supkonjuktivalno, intravezikularno, mukozalno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, oralno, topički, lokalno, inhalacijom (npr. inhalacija aerosola), injekcijama, infuzijom, koninualnom infuzijom, lokalizovanom perfuzijom ciljanih ćelija direktno putem katetera, ispiranja, u kremama, lipidnim kompozicijama (npr. lipozomima) ili drugim postupkom ili kombinacijom prethodno navedenog, kao što je poznato stručnjacima iz ove oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990). Parenteralna primena, posebno intravenska injekcija, najčešće se koristi za primenu molekula polipeptida, kao što su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska.

Parenteralni preparati obuhvataju one namenjene primeni putem injekcija, npr. supkutano, intradermalno, intraleziono, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, intratekalno ili intraperitonealno ubrizgavanje. U pogledu injekcija, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz pronalaska mogu biti formulisani kao vodeni rastvori, poželjno fiziološki kompatibilni puferi, kao što je Henksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slani pufer. Rastvor može da sadrži agense za formulisanje, kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Umesto toga, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu da budu u obliku praha za mešanje sa odgovarajućim nosačem, npr. sterilnom nepirogenom vodom, pre upotrebe. Sterilni rastvori za ubrizgavanje pripremljeni su mešanjem bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvoru sa različitim drugim dolenavedenim sastojcima, po potrebi. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Uglavnom, disperzije se pripremaju mešanjem različitih sterilnih aktivnih sastojaka u sterilnom nosaču koji sadrži osnovni disperzioni medijum i/ili druge sastojke. U slučaju sterilnog praha za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, suspenzija ili emulzija, poželjni postupak pripreme je vakuum sušenje ili liofilizacija, kojima se dobija prah aktivnog sastojka, kao i ostalih poželjnih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog tečnog medijuma. Tečni medijum treba da bude odgovarajuće puferovan, ako je potrebno, a tečni diluent izotoničan pre ubrizgavanja sa odgovarajućom količinom soli ili glukoze. Kompozicija treba da bude stabilna u uslovima stvaranja i čuvanja, izolovana od kontaminirajućeg uticaja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Poželjno je da kontaminacija endotoksinom bude svedena na minimalni bezbedni nivo, na primer, manje od 0,5 ng/mg proteina. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil alkohol ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil paraben ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinil pirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Suspenzije za vodene injekcije mogu da sadrže jedinjenja koja povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, dekstran, i slično. Po potrebi, suspenzija može da sadrži i odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja i omogućavaju pripremu visoko koncentrovanih rastvora. Takođe, suspenzije aktivnih sastojaka mogu se pripremiti u obliku odgovarajućih injekcija uljane suspenzije. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili vehikulumi obuhvataju masna ulja, kao što je susamovo ulje, ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil oleati ili trigliceridi ili lipozomi.

Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences (18. izd. Mack Printing Company, 1990). Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem obuhvataju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže polipeptid, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule. U posebnom aspektu, prolongirana apsorpcija kompozicije za ubrizgavanje može se izazvati upotrebom u kompozicijama agenasa za odlaganje apsorpcije, kao što su, na primer, aluminijum monostearat, želatin, ili njihove kombinacije.

Pored prethodno opisanih kompozicija, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu se formulisati i kao depo preparat. Takve dugo delujuće formulacije mogu se primeniti implantacijom (na primer, supkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Stoga, na primer, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije se mogu formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u odgovarajućem ulju), jonoizmenjivačkim smolama ili slabo rastvorljivim derivatima, na primer, kao slabo rastvorljiva so.

Farmaceutske kompozicije koje sadrže bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska mogu se proizvesti pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja, emulgovanja, inkapsuliranja ili liofilizacije. Farmaceutski preparati mogu biti formulisani na konvencionalni način pomoću jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata, ekscipijenasa ili dodatnih sredstava koja olakšavaju obradu proteina u preparate koji se mogu koristiti u farmaceutske svrhe. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina primene.

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu se formulisati u kompoziciju u obliku slobodne kiseline ili baze, u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje zadržavaju značajnu biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. U njih spadaju kisele adicione soli, npr. one formirane sa slobodnim amino grupama proteinske kompozicije ili one formirane sa neorganskom kiselinom kao što je, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama poput sirćetne, oksalne, vinske ili bademove kiseline. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se dobiti iz neorganskih baza, kao što su: natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksid, ili organskih baza, kao što je izopropilamin, trimetilamin, histidin ili prokain. Farmaceutske soli su uglavnom rastvorljivije u vodi i drugim protičnim rastvaračima od odgovarajućih oblika slobodnih baza.

Postupci lečenja i preparati

Bilo koji od bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije koji su ovde obezbeđeni može se koristiti u terapeutskim metodama. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz otkrića mogu se koristiti kao imunoterapijska sredstva, na primer, u lečenju kancera.

Za upotrebu u metodama za lečenje bolesti, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz pronalaska formulišu se, doziraju i primenjuju u skladu sa dobrom medicinskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima.

U jednom aspektu otkrića, obezbeđeni su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije namenjeni za upotrebu kao lek. U daljim aspektima otkrića, obezbeđeni su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije za upotrebu u lečenju bolesti. U jednom aspektu, otkriće obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U određenim aspektima otkrića, ovo otkriće obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije za upotrebu u lečenju pojedinca koji ima bolest, koje se sastoji od primene na pojedincu terapeutski delotvorne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije. U određenim aspektima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U posebnom aspektu otkrića, bolest je kancer. U određenim aspektima otkrića, upotreba se dalje sastoji od primene na pojedincu terapeutski delotvorne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest kancer. U daljim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, kako je ovde opisano, za upotrebu u indukciji lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora. U određenim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije za upotrebu u indukciji lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora kod pojedinca, koja se sastoji od davanja pojedincu efektivne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, da izazove lizu ciljne ćelije. Prema svim gorenavedenim aspektima „pojedinac“ je sisar, poželjno čovek.

U daljem aspektu, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku u proizvodnji ili pripremi medikamenta. U jednom aspektu, medikament je za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U daljem aspektu, lek je za upotrebu u postupku lečenja bolesti koji uključuje davanje pojedincu koji ima bolest terapeutski efektivne količine leka. U određenim aspektima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U posebnom aspektu otkrića, bolest je kancer. U jednom otelotvorenju, postupak se dalje sastoji od davanja pojedincu terapeutski efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikanceroznog agensa, ako je lečena bolest karcinom. U daljem otelotvorenju, lek služi za indukciju lize ciljnih ćelija, posebno ćelija tumora. U daljem otelotvorenju, lek služi za indukciju lize ciljnih ćelija, posebno ćelija tumora, kod pojedinca uključujući davanje pojedincu efektivne količine leka za indukovanje lize ciljnih ćelija. Prema svim gorenavedenim spektima, „pojedinac“ može da bude sisar, poželjno čovek.

U određenim aspektima otkrića, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj, posebno kancer. Neograničavajući primeri kancera uključuju kancer bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, materice, grlića materice, endometrijalni kancer, kancer jednjaka, debelog creva, kolorektalni kancer, rektalni kancer, kancer želuca, kancer prostate, krvi, kože, karcinom skvamoznih ćelija, kancer kostiju i kancer bubrega. Ostali poremećaji proliferacije ćelija koji se mogu lečiti pomoću bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska uključuju, bez ograničenja, neoplazme locirane u: stomaku, kostima, dojkama, digestivnom sistemu, jetri, pankreasu, peritoneumu, endokrinim žlezdama (adrenalinskoj, paratiroidnoj, hipofizi, testisima, jajnicima, grudnoj, tiroidnoj žlezdi), očima, glavi i vratu, nervnom sistemu (centralnom i perifernom), limfnom sistemu, karlici, koži, mekom tkivu, slezini, grudnom košu i urogenitalnom sistemu. Obuhvaćena su i pretkancerozna stanja ili lezije i metastaze kancera. U određenim aspektima, kancer se bira iz grupe koja obuhvata karcinom renalnih ćelija, karcinom kože, pluća, kolorektalni karcinom, karcinom dojke, mozga, glave i vrata. Stručno lice zna da u mnogim slučajevima bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije možda neće obezbediti lek, već samo delimično olakšanje. U nekim aspektima, fiziološka promena koja ima određene koristi takođe se smatra terapeutski korisnom. Stoga, u nekim aspektima, količina bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji obezbeđuje fiziološku promenu smatra se „efektivnom količinom” ili „terapeutski efektivnom količinom”. Ispitanik, pacijent ili pojedinac kome treba lečenje tipično je sisar, konkretnije čovek.

U nekim aspektima, efektivna količina bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska se daje ćeliji. U drugim aspektima, terapeutski efektivna količina bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska se primenjuje na pojedinca radi lečenja bolesti.

Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska (kada se koristi sam ili u kombinaciji sa jednim terapeutskim agensom, ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, načina primene, telesne težine pacijenta, vrste bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, težine i toka bolesti, bilo da se bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne ili istovremene terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, i odluke nadležnog lekara. Lekar zadužen za primenu, u svakom slučaju, određuje koncentraciju aktivnog sastojka (sastojaka) u kompoziciji i odgovarajuću dozu za svakog ispitanika. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Jedan primer doze bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije bio bi u opsegu od oko 0,005 mg/kg do oko 10 mg/kg. U drugim primerima bez ograničenja, doza može da obuhvati od približno 1 mikrogram/kg telesne težine, približno 5 mikrograma/kg telesne težine, približno 10 mikrograma/kg telesne težine, približno 50 mikrograma/kg telesne težine, približno 100 mikrograma/kg telesne težine, približno 200 mikrograma/kg telesne težine, približno 350 mikrograma/kg telesne težine, približno 500 mikrograma/kg telesne težine, približno 1 milligram/kg telesne težine, približno 5 milligrama/kg telesne težine, približno 10 milligrama/kg telesne težine, približno 50 milligrama/kg telesne težine, približno 100 milligrama/kg telesne težine, približno 200 milligrama/kg telesne težine, približno 350 milligrama/kg telesne težine, približno 500 milligrama/kg telesne težine, do približno 1000 mg/kg telesne težine ili više po primeni, i svaki opseg koji se dobija iz toga. U primerima bez ograničenja raspona dobijenog iz ovde navedenih brojeva, može se primenjivati, na osnovu gore opisanih brojeva, raspon od približno 5 mg/kg telesne težine do približno 100 mg/kg telesne težine, približno 5 mikrograma/kg telesne težine do približno 500 miligrama/kg telesne težine, itd. Stoga se jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može dati pacijentu. Takve doze mogu da se primenjuju povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od približno dve do približno dvadeset ili npr. približno šest doza bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska će se generalno koristiti u količini efektivnoj za postizanje željene svrhe. Za lečenje ili prevenciju bolesti, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz pronalaska ili njihove farmaceutske kompozicije, daju se ili primenjuju u terapeutski efektivnim količinama. Određivanje terapeutski delotvorne količine poznato je stručnim licima iz ove oblasti, naročito u smislu ovog detaljnog obrazloženja.

U pogledu sistemske primene, terapeutski efikasna doza se može inicijalno proceniti putem in vitro testova, kao što su testovi kulture ćelija. Zatim doza može biti formulisana prema životinjskom modelu kako bi se dostigao raspon koncentracija u krvotoku koji uključuje IC50, kao što je utvrđeno kulturom ćelija. Takve informacije mogu da se koriste za preciznije utvrđivanje korisnih doza za ljude.

Inicijalne doze takođe mogu da se procene na osnovu in vivo podataka, npr. životinjskih modela, koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci. Lice standardne stručnosti iz ove oblasti može brzo da optimizuje davanje leka ljudima na osnovu podataka o životinjama.

Doza i interval primene mogu se pojedinačno podesiti kako bi se obezbedili nivoi bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije u plazmi koji su dovoljni za održavanje terapeutskog dejstva. Uobičajena doza primene za pacijente putem injekcija ima raspon od oko 0,1 mg/kg/dan do 50 mg/kg/dan, tipično od oko 0,5 mg/kg/dan do 1 mg/kg/dan. Terapeutski delotvorni nivoi u plazmi se mogu dostići primenom višestrukih doza svakog dana. Nivoi u plazmi se mogu meriti, na primer, HPLC hromatografijom.

U slučajevima lokalne primene ili selektivnog unosa, efikasna lokalna koncentracija bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije ne mora da bude u vezi sa koncentracijom u plazmi. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da optimizuju terapeutski efikasnu lokalnu dozu bez nepotrebnog eksperimentisanja.

Terapeutski efikasna doza ovde opisanih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije uglavnom obezbeđuje terapeutske koristi bez izazivanja značajne toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskoj kulturi ili na eksperimentalnim životinjama. Testovi u kulturi ćelija i studije na životinjama mogu se koristiti za utvrđivanje LD50(doza koja je smrtonosna za 50% populacije) i ED50(doza terapeutski delotvorna za 50% populacije). Odnos toksičnih i terapeutskih dejstava doze predstavlja terapeutski indeks, koji se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjni su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije koji pokazuju velike terapeutske indekse. U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u skladu sa ovim pronalaskom pokazuje visok terapeutski indeks. Podaci dobijeni iz testova kulture ćelija i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje raspona doza pogodnih za ljudsku upotrebu. Poželjno je da se doza nalazi u rasponu koncentracija u krvotoku koji uključuje ED50sa malom količinom ili bez toksičnosti. Doza može da varira u okviru raspona u zavisnosti od različitih faktora, npr. primenjeni oblik doze, način primene, stanje ispitanika, i slično. Tačnu formulaciju, način primene i dozu može izabrati lekar nakon uvida u stanje pacijenta (videti, npr., Fingl et al., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, gl. 1, str. 1).

Lekar zadužen za pacijente koji se leče ovde opisanim bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju T-ćelije zna kada i kako treba da okonča, prekine ili podesi primenu zbog toksičnosti, nepravilnog rada organa i slično. Sa druge strane, lekar zna i da podesi lečenje na viši nivo, ako klinički odgovor nije adekvatan (isključujući toksičnost). Jačina primenjene doze radi kontrole bolesti menjaće se u skladu sa ozbiljnošću stanja koje se leči, načina primene, i slično. Ozbiljnost bolesti može se, na primer, oceniti standardnim postupcima prognostičke evaluacije. Takođe, doza i možda učestalost doze takođe će se menjati u zavisnosti od godina, telesne težine i odgovora pojedinačnih pacijenata.

Ostali agensi i tretmani

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednim agensom ili više agenasa tokom terapije. Na primer, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska može biti primenjen uz barem jedan dodatni terapeutski agens. Termin „terapeutski agens” obuhvata sve agense za lečenje simptoma ili bolesti pojedinca kome treba lečenje. Takvi dodatni terapeutski agensi takođe mogu da sadrže bilo koji aktivni sastojak pogodan za određene indikacije koje se leče, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U određenim aspektima, dodatni terapeutski agens je imunomodulatorni agens, citostatički agens, inhibitor ćelijske adhezije, citotoksični agens, aktivator ćelijske apoptoze ili agens koji povećava senzitivnost ćelija na induktore apoptoze. U posebnom aspektu, dodatni terapeutski agens je antikancerogeni agens, na primer, uništitelj mikrotubula, antimetabolit, inhibitor topoizomeraze, DNK interkalator, alkilujući agens, hormonska terapija, inhibitor kinaze, antagonist receptora, aktivator apoptoze tumorske ćelije ili antiangiogeni agens.

Takvi drugi agensi su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji se koristi, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1% do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.

Takve kombinovane terapije koje su pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključeni u istu kompoziciju ili u različite kompozicije) i odvojenu primenu, što znači da primena bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog izuma mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa zračenjem.

Proizvodi

U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u kompoziciji je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ovog pronalaska. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, naznačeno time što kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom primeru aspekta otkrića može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Primeri

U nastavku su dati primeri za postupke i preparate iz pronalaska i otkrića. Podrazumeva se da mogu biti primenjena razna druga otelotvorenja, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.

Opšti postupci

Tehnike rekombinantne DNK

Za manipulaciju DNK korišćeni su standardni postupci kao što je opisano u radu Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača. Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., NIH Publication br.91-3242.

Sekvenciranje DNK

Sekvence DNK su određene pomoću sekvenciranja dvostrukog lanca.

Genska sinteza

Željeni segmenti gena, po potrebi su dobijeni putem PCR pomoću odgovarajućih obrazaca, ili su sintetisani pomoću uređaja Geneart AG (Regensburg, Nemačka) iz sintetičkih oligonukleotida i PCR proizvoda pomoću automatizovane genske sinteze. U slučajevima kada nije bila dostupna tačna sekvenca gena, prajmeri oligonukleotida su dizajnirani na osnovu sekvenci najbližih homologa i geni su izolovani pomoću RT-PCR iz RNK koja potiče iz odgovarajućeg tkiva. Segmenti gena okruženi mestima cepanja jedinstvenom restrikcionom endonukleazom klonirani su u standardne klonirajuće/sekvencione vektore. DNK plazmida je prečišćena iz transformisane bakterije i koncentracija je određena UV spektroskopijom. DNK sekvenca subkloniranog genskog fragmenta je potvrđena sekvenciranjem DNK. Segmenti gena su dizajnirani sa pogodnim restrikcionim mestima da bi se omogućilo subkloniranje u odgovarajuće ekspresione vektore. Svi konstrukti su dizajnirani sa DNK sekvencom na 5' kraju koja kodira vodeći peptid koji cilja proteine za izlučivanje u eukariotskim ćelijama.

Primer 1

Priprema T-ćelijskih bispecifičnih (TCB) antitela sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (anti-CD20 / anti-CD3)

U ovom primeru pripremljeni su sledeći molekuli, šematski prikazani na slici 2:

A. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" bez modifikacija naelektrisanja (CH1/CL razmena u CD3 vezivaču) (Slika 2A, SEQ ID NO: 14-17)

B. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivačima) (Slika 2B, SEQ ID NO: 18-21)

C. "2 1 IgG CrossFab" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivačima) (Slika 2C, SEQ ID NO: 32, 19-21) D. “2 1 IgG CrossFab, invertovan” bez modifikacija naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču) (Slika 2D, SEQ ID NO: 33, 15, 17, 21)

E. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" bez modifikacija naelektrisanja (VH-CH1/VL-CL razmena u CD3 vezivaču) (Slika 2E, SEQ ID NO: 34, 15, 17, 35)

F. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD20 vezivačima, modifikacija naelektrisanja u CD3 vezivaču) (Slika 2F, SEQ ID NO: 36-39)

G. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja i DDKK mutacijom u Fc regionu (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivačima) (Slika 2G, SEQ ID NO: 40, 41, 20, 21)

H. “1 1 CrossMab” sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivaču) (Slika 2H, SEQ ID NO: 42, 43, 20, 21)

I.“1 1 CrossMab” sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivaču, različiti vezivači CD20) (Slika 2I, SEQ ID NO: 43-45, 21)

J. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja 213E, 123R (VH/VL razmena u CD3 vezivaču modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivaču) (Slika 2J, SEQ ID NO:69-71, 21)

K. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena i modifikacija naelektrisanja u CD3 vezivaču) (Slika 2K, SEQ ID NO: 15, 17, 72, 73).

Sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca DNK su supklonirane u okvir bez konstantnog teškog lanca ili konstantnog lakog lanca, prethodno ubačen u odgovarajući ekspresioni vektor sisara koji je primalac. Ekspresiju proteina pokreće promoter MPSV, i sintetska poliA signalna sekvenca je prisutna na 3' kraju CDS. Pored toga, svaki vektor sadrži EBV OriP sekvencu.

Molekuli su proizvedeni kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija uzgajanih u suspenziji sa ekspresionim vektorima sisara, koristeći polietilenimin (PEI). Ćelije su transficirane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1:1 (A: „vektorski teški lanac (VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3)“: "vektorski laki lanac (VL-CL)": „vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)“: "vektorski laki lanac (VL-CH1)"; B, D, G, J, K: „vektorski teški lanac (VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)“: "vektorski laki lanac (VL-CL)": „vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)“: "vektorski laki lanac (VH-CL)"; C: „vektorski teški lanac (VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)“: "vektorski laki lanac (VL-CL)": „vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)“: "vektorski laki lanac (VH-CL)"; E: „vektorski teški lanac (VH-CH1-VL-CL-CH2-CH3)“: "vektorski laki lanac (VL-CL)": „vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)“: „vektorski lanac (VH-CH1)”; F: „vektorski teški lanac (VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)“: "vektorski laki lanac (VH-CL)": „vektorski teški lanac (VL-CH1-CH2-CH3)“: "vektorski laki lanac (VH-CH1)"), ili u odnosu 1:1:1:1 (H, I: „vektorski teški lanac (VL-CH1-CH2-CH3)“: "vektorski laki lanac (VL-CL)": „vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)“: “vektorski laki lanac (VH-CL)”).

Za transfekciju, HEK293 EBNA ćelije su uzgajane u suspenziji bez seruma u Excell medijumu za uzgajanje sa 6 mM L-glutaminom i 250 mg/l G418. Za proizvodnju u tubespin bocama od 600 ml (maksimalna radna zapremina 400 ml), 600 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, a supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 400 µg DNK. Nakon dodavanja 1080 µl rastvora PEI (2,7 µg/ml), smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u tubespin bocu od 600 ml i inkubirane 3 sata na 37°C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 360 ml Excell 6 mM L-glutamina 5 g/l Pepsoy 1,0 mM VPA medijuma, i ćelije su uzgajane 24 sata. Dan nakon transfekcije dodato je 7% Feed 1 (Lonza). Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 20-30 minuta na 3600 x g (Sigma 8K centrifuga), rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 mm) i dodat je natrijum azid u finalnoj koncentraciji od 0,01% m/V. Rastvor je čuvan na 4°C.

Koncentracija konstrukata u medijumu za uzgajanje određena je pomoću ProteinA-HPLC. Osnova za separaciju je vezivanje molekula koji sadrže Fc za Protein A pri pH 8,0, i gradijentno eluiranje od pH 2,5. Postojale su dve mobilne faze. To su bili puferi Tris (10 mM) - glicin (50 mM) - NaCl (100 mM), identični, osim što su podešeni na različite pH vrednosti (8 i 2,5). Telo kolone je bila pretkolona Upchurch 2x20 mm sa unutrašnjom zapreminom od ~ 63 µl, pakovana sa POROS 20A. 100 µl svakog uzorka je injektovano na ekvilibrisani materijal sa protokom od 0,5 ml/min. Nakon 0,67 minuta, uzorak je eluiran sa pH gradijentom do pH 2,5. Kvantifikacija je izvršena određivanjem apsorbance na 280 nm i izračunavanjem pomoću standardne krive sa rasponom koncentracija humanog IgGl od 16 do 166 mg/l.

Izlučeni protein je prečišćen iz supernatanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, upotrebom afinitetne hromatografije sa proteinom A, zatim hromatografskim korakom gel filtracije.

Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu HiTrap ProteinA HP (CV = 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 25 ml 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, pH 7,5, nakon čega je usledila dodatna faza ispiranja sa 6 zapremina kolone 10 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, pH 5,45. Kolona je zatim isprana sa 20 ml 10 mM MES, 100 mM natrijum hlorida, pH 5,0, i ciljni protein je eluiran u 6 zapremina kolone 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina, pH 3,0. Proteinski rastvor je neutralisan dodavanjem 1/10 0,5 M natrijum fosfata, pH 8,0. Ciljni protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu sa 20 mM histidinom, 140 mM natrijum hloridom, 0,01% Tween-20, pH 6,0. Molekul A je morao biti prečišćen dodatnom preparativnom gel hromatografijom (SEC) za postizanje konačnog sadržaja monomera od 100%. Stoga, frakcije sa visokim sadržajem monomera iz prvog koraka gel hromatografije su objedinjene, koncentrovane i ponovo nanete na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare). Ovaj dodatni korak prečišćavanja nije bio potreban za druge molekule (u zavisnosti od profila sporednog proizvoda, međutim, objedinjavanje frakcija i stoga povraćaj nakon prve gel hromatografije je bio različit za te molekule).

Čistoća i molekulska masa molekula analizirane su nakon prvog koraka prečišćavanja (afinitetna hromatografija sa proteinom A) pomoću SDS-PAGE u odsustvu redukcionog sredstva i bojenja bojom Coomassie (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen). Gel sistem NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, SAD) korišćen je prema uputstvu proizvođača (4-12% Trisacetatni gelovi ili 4-12% Bis-Tris).

Koncentracija proteina u prečišćenim proteinskim uzorcima određena je merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence.

Čistoća i molekulska masa molekula nakon završnog koraka prečišćavanja analizirani su CE-SDS analizama u prisustvu i odsustvu redukcionog sredstva. Caliper LabChip GXII sistem (Caliper lifescience) korišćen je prema uputstvu proizvođača. Za analizu je korišćen uzorak od 2 µg.

Ukupni sadržaj antitela u uzorcima je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) u radnom puferu 25 mM K2HPO4,125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25°C.

Svi molekuli su proizvedeni i prečišćeni po istom postupku (osim molekula A, koji je bio podvrgnut dodatnom koraku SEC, kao što je gore navedeno).

Molekul A je pokazao visok sadržaj agregata nakon prve preparativne gel hromatografije. Sadržaj agregata nakon ovog koraka prečišćavanja nije mogao biti određen, jer nije bilo početne separacije nečistoća velike molekulske mase i monomerne frakcije. Da bi se dobio 100% monomerni materijal, bio je potreban dodatni korak preparativne gel hromatografije. Molekul B je 100% monomerni nakon jedne preparativne gel hromatografije.

Koncentracija u supernatantu bila je veća za molekul A, ali je konačni prinos (zbog visokog sadržaja agregata) 2,3 puta manji nego za molekul B (Tabela 2).

Konačna čistoća pokazana CE-SDS analizom bila je veća za molekul B nego za molekul A (Tabela 3, Slika 3A i B). Slike 3M i 3N prikazuju hromatograme koraka SEC prečišćavanja (preparativni SEC), pri čemu molekul A ima široki pik u odnosu na molekul B, što ukazuje da preparat molekula A nanetog na SEC nije homogen, dok je preparat molekula B u velikoj meri monomerni.

Molekul C se može proizvesti sa visokim titrom, ali u poređenju sa molekulom B, konačni povraćaj je manji zbog visokog sadržaja sporednih proizvoda koji se ne mogu potpuno ukloniti primenjenim hromatografskim metodama (Tabela 2; Tabela 3; Slika 3B i J, i Slika 3C i K). Kao što je prikazano na slici 3B i 3K, SDS-PAGE analiza nakon prečišćavanja sa proteinom A nije pokazala nikakav sporedni proizvod za molekul B, dok preparat molekula C sadrži neke sporedne proizvode koji se pojavljuju na prividnoj molekulskoj masi od 100 kDa.

Molekul D se razlikuje od molekula B samo po odsustvu naelektrisanih ostataka u anti-CD20 Fab. Ovaj molekul se takođe može proizvesti prolazno sa visokim titrom, ali kao što je već opisano za molekul C, konačni kvalitet prikazan na analitičkoj SEC (98% monomera za molekul D, prema 100% monomera za molekul B) i povraćaj je bio manji nego za molekul B zbog visokog sadržaja sporednih proizvoda (Tabela 2; Tabela 3; Slika 3B i J i Slika 3D i L). Kao što je prikazano na slici 3J i 3L, analiza SDS-PAGE nakon koraka prečišćavanja sa proteinom A nije pokazala nikakav sporedni proizvod za molekul B, dok preparat molekula D sadrži neke sporedne proizvode koji se pojavljuju na prividnoj molekulskoj težini od 66 kDa i 40 kDa. Na slici 3N i 3O prikazani su hromatogrami koraka SEC prečišćavanja (preparativni SEC), gde molekul D ima široki pik u odnosu na molekul B, što ukazuje da preparat molekula D nanet na SEC nije homogen, dok je preparat molekula B u velikoj meri monomerni.

I titar proizvodnje molekula E bio je visok, ali konačni proizvod je još uvek sadržao nečistoće male molekulske mase, kao što je pokazano analitičkom SEC i kapilarnom elektroforezom (Tabela 2; Tabela 3; Slika 3E).

Za razliku od molekula B, molekul F ima VH-VL razmenu na Fab tumorskog ciljnog vezujućeg ostatka, dok su modifikacije naelektrisanja uvedene u anti-CD3 Fab. Ovaj molekul bi mogao biti proizveden i sa visokim titrima, ali je konačni povraćaj bio mali zbog sporednih proizvoda. Za anti-CD20 / anti-CD3 TCB, format sa modifikacijama naelektrisanja u anti-CD20 Fab je poželjniji, s obzirom na proizvodnju i prečišćavanje.

Molekul G je molekul sa modifikacijama naelektrisanja u Fc regionu ("DD" = K392D; K409D u jednoj od podjedinica Fc domena, "KK" = D356K; D399K u drugoj od podjedinica Fc domena (EU numeracija), zamenjuje mutaciju "dugme u rupici". Stvaranje bispecifičnih molekula podstiče se uvođenjem dva ostatka asparaginske kiseline u jedan teški lanac, i dva ostatka lizina u drugi teški lanac (slika 2G). Ovaj molekul može biti proizveden sa visokim titrom, ali finalni proizvod ima još neke nečistoće velike i male molekulske mase koje su pokazane analitičkom SEC i kapilarnom elektroforezom (Tabela 2; Tabela 3) dok se sporedni proizvodi mogu potpuno ukloniti za isti molekul koji nosi mutaciju „dugme u rupici“ (molekul B).

Molekul I, koji se razlikuje od molekula H prema CD20 vezivaču, pokazao je veći sadržaj agregata nakon konačne preparativne gel hromatografije u odnosu na molekulu H. Krajnja čistoća prikazana CE-SDS analizom bila je veća za molekul H nego za molekul I (Tabela 3, slika 3H i I). Isto tako, povraćaj za molekul H bio je 40% veći nego za molekul I (Tabela 2). Ovaj rezultat pokazuje da kvalitet molekula zavisi i od antitela koje se koristi u bispecifičnom formatu T ćelija.

Proizvodnja molekula J i molekula K imala je dobar početni titar, što je dovelo do dobrog prinosa. Međutim, konačni povraćaj od oko 20% za oba molekula bio je znatno ispod 48% postignutog sa molekulom B (Tabela 2). Oba molekula su po konačnom kvalitetu slična, sa> 99% sadržaja monomera (Tabela 2). Čistoća u neredukovanom CE-SDS je bolja za molekul J (kome nedostaju modifikacije naelektrisanja na poziciji 124 CL domena i poziciji 147 CH1 domena) sa skoro 99% u odnosu na molekul K (sa modifikacijama naelektrisanja i VL-VH razmenom u CD3 vezivaču) sa 90% (Tabela 3, Slika 3N i 3O). Molekul J je pokazao izvesno taloženje tokom faze koncentrovanja nakon afinitetne hromatografije. Molekul K ima modifikacije naelektrisanja u CD3 vezujućem CrossFab, a ne u CD20 vezujućem Fab. Ovo ima uticaja na konačni kvalitet, kao što pokazuje CE-SDS (Tabela 3, Slika 3O). Razlika u kvalitetu je uglavnom vidljiva nakon prvog koraka prečišćavanja na SDS-page (Slika 3P, 3Q). Molekul K sadrži više sporednih proizvoda na 150 kDa i 70 kDa (polovini molekula i konstrukata verovatno nedostaju laki lanci) od molekula J. Oba molekula imaju istu termičku stabilnost koja je slična molekulu B (Tabela 4).

Za anti-CD20 / anti-CD3 TCB, "invertovana" verzija sa modifikacijama naelektrisanja na anti CD20 Fab (molekul B) je format koji se može proizvesti sa najvećim povraćajem i krajnjim kvalitetom.

TABELA 2. Sažetak proizvodnje i prečišćavanja anti-CD20 / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja.

TABELA 3. CE-SDS analize (neredukovane) anti-CD20 / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja.

Potvrda molekulske mase pomoću LC-MS analiza

Deglikozilacija

Da bi se potvrdila homogena priprema molekula, krajnji proteinski rastvor je analiziran LC-MS analizom. Da bi se uklonila heterogenost uvedena ugljenim hidratima, konstrukti su tretirani pomoću PNGaze F. U tu svrhu, pH proteinskog rastvora je podešen na pH 7,0 dodavanjem 2 µl 2 M Tris do 20 µg proteina, u koncentraciji od 0,5 mg/ml. Doda se 0,8 µg PNGaze F i inkubira 12 h na 37°C.

LC-MS analiza - onlajn detekcija

Postupak LC-MS je izveden na aparatu Agilent HPLC 1200 spojenom na maseni spektrometar TOF 6441 (Agilent). Hromatografsko razdvajanje je izvršeno na koloni Macherey Nagel Polysterene; RP1000-8 (veličina čestica 8 µm, 4,6 × 250 mm; kat. br.719510). Eluent A je bio 5% acetonitril i 0,05% (V/V) mravlja kiselina u vodi, eluent B je bio 95% acetonitril, 5% vode i 0,05% mravlja kiselina. Protok je bio 1 ml/min, razdvajanje je izvršeno na 40°C i sa 6 µg (15 µl) uzorka proteina dobijenog prethodno opisanim postupkom.

Tokom prva četiri minuta, eluat je bio usmeren u otpad, kako bi se sprečila kontaminacija masenog spektrometra solima. ESI-izvor je radio sa protokom gasa za sušenje od 12 l/min, temperaturom od 350°C i pritiskom raspršivača od 60 psi. MS spektri su dobijeni korišćenjem napona fragmentatora od 380 V i raspona mase od 700 do 3200 m/z u pozitivnom jonskom režimu. MS podaci se dobijaju pomoću softvera instrumenta od 4 do 17 minuta.

Preparat molekula A je imao oko 10-15% molekula sa pogrešno sparenim lakim lancima i tragovima slobodnih ili povezanih lakih lanaca. Preparat molekula B je imao tragove molekula koji sadrže dva laka lanca CD3. Nečistoće, kao što su slobodni laki lanci ili povezani laki lanci, nisu mogle biti detektovane (Tabela 2).

Termička stabilnost putem statičkog rasejavanja svetlosti

Termička stabilnost je praćena pomoću statičkog rasejavanja svetlosti (SLS) i merenjem svojstvene proteinske fluorescencije kao odgovora na primenjeni temperaturni stres.

30 µg filtriranog uzorka proteina sa koncentracijom proteina od 1 mg/ml je naneto u duplikatu na Optim 2 (Avacta Analytical Ltd; GB). Temperatura je povećana sa 25 na 85°C pri 0,1°C/min, pri čemu su prikupljeni podaci o poluprečniku i ukupnom intenzitetu rasejavanja. Za određivanje svojstvene fluorescencije proteina, uzorak je pobuđen na 295 nm, a emisija je sakupljena između 266 i 473 nm.

Za sve molekule je određena termička stabilnost, i rezultati su prikazani u tabeli 4. Temperatura agregacije (TAgg) određena pomoću dinamičkog rasejavanja svetlosti i temperature topljenja (TM), merena putem fluorescencije proteina, nakon primene temperaturnog gradijenta bila je uporediva za sve molekule sa TAggu rasponu od 54-58°C i TMu rasponu od 56-60°C (Tabela 4).

TABELA 4. Termička stabilnost anti-CD20 / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja.

Vezivanje anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela za CD3 i CD20

Vezivanje T-ćelijskih bispecifičnih (TCB) antitela sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (molekuli "A" i "B" iznad) za CD3 anti-CD3 / anti-CD20 je mereno pomoću Jurkatovih humanih ćelija koje eksprimiraju CD3. Vezivanje za CD20 je određeno korišćenjem humanih Z-138 ćelija koje eksprimiraju CD20. Ćelije iz suspenzije su sakupljene, isprane jednom pomoću PBS, a vijabilnost i gustina ćelija su određene koristeći Vicell. Ćelije iz suspenzije su ponovo suspendovane u koncentraciji 2 x 10<6>ćelija/ml u FACS puferu.100 µl suspenzije ćelija je zasejano na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Svaki korak je izveden na 4°C. Ploče su centrifugirane na 360 x g tokom 5 min, i supernatant je uklonjen. Razblaženja antitela su pripremljena u PBS/0,1% BSA. 30 µl razblaženih anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela ili FACS pufera je dodato u bunarčiće, i ćelije su inkubirane 30 min na 4°C. Nakon inkubacije, po bunarčiću je dodato 120 µl FACS pufera, ploča je centrifugirana 5 minuta na 350 x g, i supernatant je uklonjen. Korak pranja je jednom ponovljen. Dodato je 30 µl prethodno razblaženog sekundarnog antitela po bunarčiću, kao što je naznačeno u rasporedu ploča. Ploče su inkubirane još 30 min na 4°C. Nakon inkubacije, po bunarčiću je dodato 120 µl FACS pufera, ploče su centrifugirane 5 minuta na 350 x g, i supernatant je uklonjen. Korak ispiranja je jednom ponovljen za sve ploče osim ploča sa Jurkatovim ćelijama, koje su fiksirane neposredno nakon ovog jednog koraka pranja. Ćelije su fiksirane pomoću 100 µl BD pufera za fiksiranje po bunarčiću (BD Biosciences, br. 554655) na 4°C tokom 20-30 min. Ćelije su ponovo suspendovane u 80 µl/bunarčiću FACS pufera za merenje FACS korišćenjem BD FACS CantoII.

Rezultat ovog eksperimenta je prikazan na slici 4.

Liza tumorskih ćelija i aktivacija CD4<+>i CD8+ T ćelija nakon ubijanja CD20-eksprimirajućih tumorskih ciljnih ćelija posredovanog T ćelijama indukovanog anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitelima

T-ćelijski posredovano ubijanje ciljnih ćelija i aktiviranje T ćelija indukovano anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitelima sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (molekuli "A" i "B" iznad) procenjeno je na tumorskim ćelijama Z-138 i Nalm-6. Humani PBMC su korišćeni kao efektori i za ubijanje, kao i za aktivaciju T ćelija detektovanu 22 h nakon inkubacije sa bispecifičnim antitelom. Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene, oprane i nanete na ploču sa gustinom od 30.000 ćelija / bunarčiću na ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene diferencijalnim centrifugiranjem sveže krvi od zdravih ljudskih donora sa rastvorom Histopaque. Sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, sobna temperatura), plazma iznad interfaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i PBMC pelet je dva puta ispran sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja 350 x g, 10 minuta). Dobijena PBMC populacija je prebrojavana automatski (ViCell) i držana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) u ćelijskom inkubatoru (37°C, 5% CO2) do dalje upotrebe (ne duže od 24 h). Za test ubijanja, antitela su dodavana u naznačenim koncentracijama (opseg od 1000 pM - 0,1 pM u triplikatu). PBMC su dodavane u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 6:1. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane na 420 x g tokom 4 min, i 50 µl/bunarčiću je preneto na sveže ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, radi detekcije LDH. Detekcija LDH je izvršena koristeći kit za otkrivanje citotoksičnosti (Roche br. 11644793001) prema uputstvu proizvođača. Preostale ćelije su isprane pomoću PBS koji sadrži 0,1% BSA. Površinsko bojenje za CD8 (APCCy7 anti-humani CD8, Biolegend br. 301016), CD4 (FITC anti-humani CD4, Biolegend br.

300506), CD69 (BV421 anti-humani CD69 Biolegend br. 310930) i CD25 (PECy7 antihumani CD25 Biolegend br. 302612) izvršeno je prema navodima dobavljača. Nakon 30 minuta na 4°C, ćelije su isprane dva puta sa 150 µl/bunarčiću PBS koji sadrži 0,1% BSA, i fiksirane koristeći 100 µl/bunarčiću 2% PFA. Merenje je izvedeno pomoću BD FACS CantoII. Rezultat ovog eksperimenta je prikazan na Slici 5, 6 i 7. Oba molekula pokazuju sličnu aktivnost u smislu lize tumorskih ćelija i aktivacije T ćelija.

Iscrpljivanje B ćelija i aktivacija CD4<+>i CD8+ T ćelija nakon ubijanja zdravih humanih B ćelija posredovanog T ćelijama indukovanim anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitelima u punoj ljudskoj krvi

Ljudska puna krv od zdravog donora inkubirana je sa anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitelima sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (molekuli "A" i "B" iznad) u naznačenim koncentracijama (raspon od 50.000 pM - 1 pM u triplikatu). Nakon 22 h, krv je izmešana, i sakupljeno je 35 µl za bojenje sa 20 µl FACS smeše antitela koja sadrži CD8 (APCCy7 anti-humani CD8, Biolegend br.301016), CD4 (FITC anti-humani CD4, Biolegend br. 300506), CD69 (BV421 anti-humani CD69 Biolegend br. 310930) i CD25 (PECy7 antihumani CD25, Biolegend br.302612), CD22 (APC anti-humani CD22, Biolegend br.302510) i CD45 (PerCPCy5.5 anti-humani CD45, Biolegend br.304028). Nakon 15 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, krv je fiksirana pomoću FACS rastvora za lizu (BD, br. 349202), i analizirana protočnom citometrijom. Iscrpljivanje B ćelija je izračunato na osnovu odnosa broja B ćelija i broja CD4<+>T ćelija, postavljajući netretirane uzorke na 0% iscrpljivanja B ćelija.

Rezultat ovog eksperimenta je prikazan na slici 8 i 9. Oba molekula pokazuju sličnu aktivnost u smislu iscrpljivanja B ćelija u punoj krvi i aktivacije T ćelija.

Vezivanje anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela za humane CD20- i CD3-eksprimirajuće ciljne ćelije

Vezivanje anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela prikazanog kao molekul "B" iznad testirano je na humanoj CD20-eksprimirajućoj ćelijskoj liniji difuznog B-krupnoćelijskog limfoma (DLBCL) (WSU DLCL2, 0,5-1 x 10<6>CD20 mesta vezivanja) i CD3-eksprimirajućoj imortalizovanoj liniji T limfocita (Jurkat). Ukratko, ćelije su sakupljene, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i ponovo su suspendovane pri 1,5 x 10<6>ćelija/ml u FACS puferu (PBS 0,1% BSA). 100 μl ćelijske suspenzije (koja sadrži 0,15 x 10<6>ćelija) inkubirano je na ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom tokom 30 minuta na 4°C sa rastućim koncentracijama CD20 TCB (50 pM - 200 nm), dva puta isprano hladnim PBS 0,1% BSA, ponovo inkubirano još 30 min na 4°C sa razblaženim PE-konjugovanim AffiniPure F(ab’)2 fragmentom kozjeg anti-humanog IgG Fcg fragment specifičnog sekundarnog antitela (Jackson Immuno Research Lab PE br.

109-116-170), isprani dva puta hladnim PBS sa 0,1% BSA, fiksirani dodatkom 2% PFA i analizirani pomoću FACS, koristeći FACS CantoII (softver FACS Diva), isključujući mrtve ćelije iz analize pomoću FSC/SSC gejtinga.

Rezultati su prikazani na slici 10A (vezivanje za WSU DLCL2 ćelije) i na slici 10B (vezivanje za Jurkatove ćelije). Krive vezivanja i vrednosti EC50 koje se odnose na vezivanje izračunate su pomoću softvera GraphPadPrism5. Vrednosti EC50 su bile 0,98 nM (dvovalentno vezivanje za WSU DLCL2 ćelije koje eksprimiraju CD20) i približno 12,5 nM (jednovalentno vezivanje za Jurkatove ćelije koje eksprimiraju CD3).

Vezivanje anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela za ciljne ćelije koje eksprimiraju humani i cinomolgus CD20 i CD3

Unakrsna reaktivnost anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela prikazanog kao molekul „B“ iznad određena je preko vezivanja za B ćelije koje eksprimiraju humani i cinomolgus CD20, i CD3-eksprimirajuće CD4 i CD8 T ćelije. Ukratko, heparinizovana ljudska krv i krv majmuna cinomolgus iz zdravih donora korišćena je za izolaciju PBMC centrifugiranjem sa gradijentom gustine. Izolovani PBMC su prebrojani, proverena im je vijabilnost, i ponovo su suspendovani pri 4 x 10<6>ćelija/ml u FACS puferu (100 μl PBS 0,1% BSA).100 μl ćelijske suspenzije (koja sadrži 0,4 x 10<6>ćelija) je naneto na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i centrifugirano (420 x g, 4 min). Nakon uklanjanja supernatanta, PBMC su inkubirani 30 min na 4°C sa rastućim koncentracijama CD20 TCB-AlexaFlour488 (200 pM - 200 nM), dva puta isprani hladnim PBS sa 0,1% BSA, ponovo inkubirani još 30 min na 4°C sa humanim/cinomolgus unakrsno reaktivnim antitelima: anti-CD19 (interno, klon 8B8)-AlexaFluor647, anti-CD4 (BD, br. 552838, klon L200)-PerCPCy5.5 i anti-CD8 (BD, br. 555367, klon RPA-T8)-PE. Nakon 30 min, PBMC su dva puta isprani hladnim PBS sa 0,1% BSA i tretirani FACS rastvorom za lizu (BD, br.349202), praćeno FACS analizom, koristeći FACS CantoII (softver FACS Diva). Krive vezivanja su dobijene pomoću softvera GraphPadPrism5.

Rezultati su prikazani na slici 11A (vezivanje za humane B ćelije i B ćelije cinomolgus majmuna), Slici 11B (vezivanje za CD4 T ćelije čoveka i majmuna cinomolgus) i Slici 11C (vezivanje za CD8 T ćelije čoveka i majmuna cinomolgus). Vrednosti EC50 koje se odnose na vezivanje za B-ćelije koje eksprimiraju CD20, izračunate pomoću softvera GraphPadPrism5, bile su 4,8 nM (humane B ćelije) i 3,3 nM (B ćelije cinomolgusa).

Liza tumora posredovana različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitijela

Liza tumorskih ćelija posredovana različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela (molekuli "B", "A", "C" i "H" prikazani gore) je procenjena na Z138 ćelijama (limfom pokrovnih ćelija, 0,06-0,23 x 10<6>CD20 vezujućih mesta). Humani PBMC su korišćeni kao efektori, i liza tumora je detektovana nakon 21-24 h inkubacije sa različitim formatima bispecifičnih antitela. Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene, isprane i nanete u gustini od 50.000 ćelija/bunarčiću, koristeći ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene diferencijalnim centrifugiranjem Histopaque zdrave ljudske krvi. Sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, sobna temperatura, bez kočnica), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC-ovi su preneti u novu falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS. Smeša je centrifugirana (350 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen, i PBMC pelet ispran sterilnim PBS-om (300 x g, 10 minuta). Dobijena PBMC populacija je prebrojavana automatski (ViCell) i čuvana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe (ne duže od 24 h). Za test lize tumora, antitela su dodata u naznačenim koncentracijama (opseg od 0,1 pM - 1 nM u triplikatu). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 6:1. Liza ćelija tumora je procenjivana nakon 21-24 h inkubacije na 37°C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih / nekrotičnih ćelija (LDH komplet za detekciju, Roche Applied Science, br. 11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-100. Minimalna liza (= 0%) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog konstrukta.

Slika 12 pokazuje da različiti formati CD20 TCB antitela indukuju jaku i ciljno specifičnu lizu CD20<+>ciljnih ćelija. Panel A prikazuje da “CD20 TCB_2 1_ sa naelektrisanjem, invertovan” (molekul “B” prikazan gore) pokazuje sličnu aktivnost kao

“CD20 TCB_2 1_bez naelektrisanja, invertovan” (molekul “A” prikazan gore), i da su oba potentnija od formata "CD20 TCB_1 1_ sa naelektrisanjem" (molekul "H" prikazan gore). Panel B prikazuje da je "CD20 TCB_2 1_sa naelektrisanjem, invertovan" (molekul "B" prikazan gore) potentniji od formata "CD20 TCB_2 1_sa naelektrisanjem, klasični" (molekul "C" prikazan gore). Vrednosti EC50 koje se odnose na testove ubijanja, izračunate pomoću softvera GraphPadPrism5, date su u Tabeli 5.

TABELA 5. Vrednosti EC50 (pM) lize tumorskih ćelija posredovane različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela procenjene upotrebom Z138 ciljnih tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD20.

Liza tumorskih ćelija i naknadna aktivacija T ćelija posredovana različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela

Liza tumorskih ćelija posredovana različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela (molekuli "B" i "H" prikazani gore) dalje je procenjivana na Z138 ćelijama (limfom pokrovnih ćelija) upotrebom humanih PBMC dobijenih od tri različita zdrava donora, kao i na širem panelu DLBCL linija, uključujući ćelijske linije OCI Ly-18 (0,06-0,2 x 10<6>mesta vezivanja CD20), Ramos (0,1-0,4 x 10<6>mesta vezivanja CD20), SU-DHL-5 (0,13-0,21 x 10<6>CD20 mesta vezivanja CD20), SU-DHL-8 (mesta vezivanja CD20 ispod granice detekcije testa), Toledo (0,02 x 10<6>mesta vezivanja CD20) i U2932 (0,09-0,4 x 10<6>mesta vezivanja CD20). Sakupljanje ćelija tumora, izolacija PBMC i uslovi analize bili su identični onima opisanim u prethodnom primeru. Odnos E:T za testove prikazane na slikama 13 A-C bio je 6:1, za test prikazan na slici 13D bio je 3:1. Liza ćelija tumora je procenjena nakon 21 h inkubacije na 37°C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11644 793 001). Za procenu aktivacije T ćelija koja se dešava nakon lize tumorskih ćelija, PBMC su prebačeni na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, centrifugirani na 400 x g tokom 5 min i isprani dva puta pomoću PBS koji sadrži 0,1% BSA. Površinsko bojenje za CD8 (APCCy7 anti-humani CD8 Biolegend, br. 301016), CD4 (FITC anti-humani CD4, Biolegend br.

300506) i CD25 (PECy7 anti-humani CD25 Biolegend br. 302612) izvedeno je prema naznakama dobavljača. Ćelije su isprane dva puta sa 150 µl/bunarčiću PBS koji sadrži 0,1% BSA i fiksirane korišćenjem 2% PFA ili FACS rastvora za lizu (BD, br. 349202). Uzorci su analizirani na BD FACS CantoII.

Slika 13 pokazuje da je format antitela "CD20 TCB_2 1_sa naelektrisanjem, invertovan" (molekul "B" prikazan gore) potentniji od formata antitela "CD20 TCB_1 1" (molekul "H" prikazan gore), kako je procenjeno detekcijom lize obe tumorske ćelije (paneli A, D) i aktivacijom T ćelija (Panel B, C) korišćenjem PBMC različitih donora. Vrednosti EC50 koje se odnose na lizu tumora i aktivaciju T ćelija Z138 ćelija date su u Tabeli 6a. Vrednosti EC50 koje se odnose na testove lize tumora na panelu ćelijskih linija DLBCL date su u Tabeli 6b. Vrednosti EC50 su izračunate pomoću softvera GraphPadPrism5.

TABELA 6a. Vrednosti EC50 (pM) lize tumorskih ćelija i aktivacije T ćelija posredovane anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitelima koristeći tumorske ćelije Z138 koje eksprimiraju

CD20.

TABELA 6b. Vrednosti EC50 (pM) lize tumora na panelu DLBCL tumorskih ćelijskih linija posredovane anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitelima.

Iscrpljivanje B ćelija u ljudskoj punoj krvi posredovano različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela

Normalno iscrpljivanje B ćelija posredovano različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela (molekuli "B" i "H" prikazani gore) i obinutuzumabom je dalje procenjivano koristeći svežu ljudsku krv zdravih volontera. Ukratko, sveža krv je sakupljena u špricevima koji sadrže heparin. Alikvoti krvi (180 µl/bunarčiću) naneti su na ploče sa 96 dubokih bunarčića, dopunjeni pomoću TCB ili razblaženjima antitela (10 µl/bunarčiću 10 µl/bunarčiću PBS), i inkubirani 24 h na 37°C u 5% CO2u ovlaženom ćelijskom inkubatoru. Posle inkubacije, krv je pomešana pipetiranjem gore-dole, pre nego što je 35 µl krvnih alikvota prebačeno na ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i inkubirano sa fluorescentnim anti-CD45 (APC, Biolegend, br. 304037), anti-CD4 (PerCPCy5.5, BD, br. 552838), anti-CD8 (APCCy7, Biolegend, br. 301016), anti-CD19 (PE, Biolegend, br. 302208), anti-CD25 (PECy7, Biolegend, br. 302612) i anti-CD69 (BV421, Biolegend, br. 310930), ukupno 55 µl zapremine za protočnu citometriju. Posle 15 min inkubacije na sobnoj temperaturi (u mraku) dodato je 180 µl/bunariću FACS rastvora za lizu (BD Biosciences) da bi se iscrpeli eritrociti i fiksirale ćelije pre protočne citometrije.

Slika 14 pokazuje da je „CD20 TCB_2 1_ sa naelektrisanjem, invertovan“ (molekul

„B“ gore) potentniji u iscrpljivanju normalnih B ćelija nego obinutuzumab (Gazyva) i „CD20 TCB_1 1“ sa naelektrisanjem (molekul „H“ iznad).

TABELA 7. Vrednosti EC50 (pM) iscrpljivanja B ćelija u normalnoj ljudskoj punoj krvi posredovanog različitim antitelima koja ciljaju CD20.

Aktivacija T ćelija određena putem kvantifikacije intenziteta CD3 nishodne signalizacije pomoću Jurkat-NFAT reporter testa

Kapacitet različitih formata anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela za indukciju unakrsnog vezivanja T ćelija i naknadnu aktivaciju T-ćelija je određen korišćenjem zajedničkih kultura CD20-eksprimirajućih tumorskih ciljnih ćelija i Jurkat-NFAT reporter ćelija (CD3eksprimirajuća ćelijska linija reportera za humanu akutnu limfatičku leukemiju sa NFAT promoterom, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega br. CS176501). Nakon istovremenog vezivanja anti-CD20 / anti-CD3 TCB za CD20 antigen (eksprimiran na tumorskim ćelijama) i CD3 antigen (eksprimiran na Jurkat-NFAT reporter ćelijama), NFAT promoter je aktiviran, i dovodi do ekspresije aktivne luciferaze svica. Intenzitet signala luminescencije (dobijen nakon dodavanja supstrata luciferaze) proporcionalan je intenzitetu aktivacije i signalizacije CD3. Jurkat-NFAT reporterske ćelije rastu u suspenziji, i uzgajane su u RPMI1640, sa 2g/l glukoze, 2 g/l NaHCO3, 10% FCS, 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 1 x NEAA, 1 x natrijum piruvat pri 0,1 - 0,5 miliona ćelija po ml, 200 µg po ml higromicina. Za test, tumorske ciljne ćelije (Z138) su sakupljene, i vijabilnost određena pomoću ViCell.50 µl/bunarčiću razblaženih antitela ili medijuma (za kontrole) je dodato ciljnim ćelijama. 20.000 ćelija/bunarčiću je stavljeno na ploču sa ravnim dnom, sa 96 bunarčića belih zidova (br.

655098, Greiner bio-one). Nakon toga, sakupljene su Jurkat-NFAT reporter ćelije i procenjena vijabilnost pomoću ViCell-a. Ćelije su ponovo suspendovane na 2 miliona ćelija/ml u ćelijskom medijumu bez higromicina B, i dodate u tumorske ćelije na 0,1 x 10<6>ćelija/bunarčiću (50 μl/bunarčiću) da se dobije krajnji E:T od 5:1, i krajnja zapremina od 100 µl/bunarčiću. Ćelije su inkubirane 6 h na 37°C u vlažnom inkubatoru. Na kraju vremena inkubacije, 100 µl/bunarčiću ONE-Glo rastvora (1:1 ONE-Glo i zapremina test medijuma po bunarčiću) je dodato u bunarčiće i inkubirano 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Luminescencija je detektovana pomoću WALLAC Victor3 ELISA čitača (PerkinElmer2030), detekciono vreme 5 sekundi/bunarčiću. Slika 15 prikazuje da „CD20 TCB_2 1_ sa naelektrisanjem, invertovani“ (molekul „B“ gore) dovodi do jače aktivacije T ćelija i signalizacije nishodno od CD3 nego „CD20 TCB_1 1“ (molekul „H“ gore).

TABELA 8. Vrednosti EC50 (pM) aktivacije CD3 detektovane pomoću Jurkat-NFAT reporter ćelija.

FK pojedinačne doze anti-CD20 / anti-CD3 TCB kod zdravih NOG miševa Izvedena je farmakokinetička studija pojedinačne doze (SDPK) da bi se procenila izloženost anti-CD20 / anti-CD3 TCB molekula "B" (u daljem tekstu "CD20 TCB") tokom studija efikasnosti (Slika 16). Davanje i.v. bolusa od 0,5 mg/kg primenjeno je na NOG miševima, i uzorci krvi su uzeti u odabranim vremenskim intervalima za farmakokinetičku procenu. Za merenje ukupnih koncentracija CD20 TCB korišćen je generički imunotest. Raspon kalibracije standardne krive za CD20 TCB bio je 0,78 do 50 ng/ml, gde je 15 ng/ml donja granica kvantifikacije (LLOQ).

Bifazni pad je primećen sa beta poluživotom od 10 dana (nekompartmentalna analiza) i klirensom od 8 ml/d/kg (2-kompartmentalni model). Poluživot i klirens su očekivani u odnosu na normalni neciljani IgG (Tabela 9).

Phoenix v6.2 kompanije Pharsight Ltd je korišćen za FK analizu, modeliranje i simulaciju.

TABELA 9. Farmakokinetički parametri kod davanja i.v. bolusa od 0,5 mg/kg CD20 TCB kod NOG miševa.

Aktivnost anti-CD20 / anti-CD3 TCB u iscrpljivanju B-ćelija in vivo Iscrpljivanje aktivnosti perifernih B-ćelija CD20 TCB je testirano na kompletno humanizovanim NOD/Shi-scid/IL-2Rγ<null>(NOG) miševima.

Potpuno humanizovani NOG miševi stari 14 nedelja, koji su nosili fiziološke nivoe cirkulišućih humanih B- i T-ćelija (Hayakawa J. et al. (2009), Stem Cells 27 (1), 175-182), tretirani su ili nosačem (n = 7) ili sa CD20 TCB (n = 6) u dozi od 0,5 mg/kg intravenski (i.v.) jednom nedeljno. Kao što je prikazano na dizajnu studije na slici 17, miševima je uzeta krv za analizu B ćelija i T-ćelija jedan i tri dana nakon prve terapeutske injekcije (D1, D3), i tri dana nakon druge (D10), i u tom terminu je studija prekinuta. U kasnijem terminu, slezine su takođe sakupljene za analizu B-ćelija i T-ćelija. Miševi su pregledani 4 dana pre terapeutske injekcije (D-4) kao početna referenca za brojanje B- i T-ćelija u cirkulaciji. Slika 18 prikazuje broj B- i T-ćelija analiziran ex vivo protočnom citometrijom u krvi miševa tretiranih nosačem (levi panel) i pomoću CD20 TCB (desni panel) u različitim vremenskim intervalima. Rezultati pokazuju da su cirkulišuće B-ćelije veoma efikasno iscrpljene već jedan dan nakon injekcije CD20 TCB, i njihov broj nije mogao biti detektovan tokom čitavog trajanja ispitivanja. Nasuprot tome, broj T-ćelija u cirkulaciji je samo prolazno snižen u terminu D1 nakon terapeutske injekcije, vratio se na početne nivoe u terminu D3 i ostao stabilan tokom čitavog trajanja ispitivanja. Status aktivacije T-ćelija je takođe analiziran u krvi tretiranih miševa u terminu D3 i D10 nakon prve terapeutske injekcije, pomoću ex vivo protočne citometrije, koristeći različite T-ćelijske površine i marker proliferacije Ki67 (Slika 19). T-ćelije iz CD20 TCB tretiranih miševa pokazale su aktivirani fenotip u terminu D3 nakon terapeutske injekcije (gornji panel), uz povećanje aktivacionih markera CD25, 4-1BB, PD-1 i granzyme-B (GZB) u CD4 i CD8 T-ćelijske pregradama, u poređenju sa T-ćelijama iz kontrole-nosača. T-ćelije iz tretiranih miševa takođe su eksprimirale više nivoe markera za proliferaciju Ki67. U terminu D10 nakon prve terapeutske injekcije, većina markera aktivacije T-ćelija vratila se na početne nivoe, sa izuzetkom GZB i PD-1, koji su još uvek bili eksprimirani na višim nivoima u odnosu na kontrolu-nosač.

Na slici 20 prikazani su rezultati analize B-ćelija i T-ćelija na slezinama miševa tretiranih nosačem i pomoću CD20 TCB na završetku studije (D10). Tretman CD20 TCB posredovao je u vrlo efikasnom iscrpljivanju B ćelija i u ovom sekundarnom limfoidnom organu (Slika 20A), dok je broj T-ćelija pokazao nivoe koji se mogu uporediti sa kontrolomnosačem (Slika 20B). Status aktivacije T ćelija (Slika 20C) bio je sličan onom koji je primećen u krvi, sa većom ekspresijom GZB i PD-1 u T ćelijama slezine tretiranih miševa u odnosu na kontrolu-nosač.

Sveukupno, ovi rezultati pokazuju da tretman sa CD20 TCB može posredovati u veoma efikasnom iscrpljivanju perifernih B-ćelija već jedan dan nakon injekcije terapije, dok B-ćelije ostaju nedetektovane do završetka studije (tri dana nakon druge terapeutske injekcije). B-ćelije su takođe efikasno iscrpljene u slezini tretiranih miševa. Aktivnost iscrpljivanja B-ćelija je paralelna sa prolaznom aktivacijom T-ćelija u krvi tretiranih životinja, koja se vraća na osnovne nivoe tri dana nakon terapeutske injekcije, sa izuzetkom GZB i PD-1 aktivacionih markera, koji ostaju eksprimirani na višem nivou u odnosu na netretirane kontrole.

Anti-tumorska aktivnost anti-CD20 / anti-CD3 TCB u modelu WSU-DLCL2 Antitumorska aktivnost CD20 TCB testirana je na NOG miševima koji nose humanu ćelijsku liniju difuznog velikog B-ćelijskog limfoma WSU-DLCL2, i preneti su sa humanim perifernim mononuklearnim ćelijama (PBMC). Ukratko, ženkama NOG miševa je supkutano (sc) injektovano 1,5 x 10<6>WSU-DLCL2 ćelija (originalno dobijene iz Evropske zbirke ćelijskih kultura). Kada je prosečan volumen tumora dostigao 200 mm<3>, miševi su dobili intraperitonealnu injekciju ljudskih PBMC (10 x 10<6>ćelija po mišu) kao izvor humanih T-ćelija. Dva dana kasnije, miševi su dobili i.v. CD20 TCB terapiju u dozi od 0,5 mg/kg primenjenu jednom nedeljno. Kao što je prikazano na Slici 21, CD20 TCB pokazuje snažnu anti-tumorsku aktivnost, sa gotovo potpunom regresijom tumora koja je uočena kod završetka studije (dan 34).

Primer 2

Primer 2 nije u skladu sa pronalaskom i prisutan je samo u svrhu ilustracije.

Priprema "2 1 IgG CrossFab, invertovanog" T-ćelijskog bispecifičnog antitela sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (anti-BCMA / anti-CD3)

Šematski prikaz molekula pripremljenih u ovom primeru prikazan je na slici 22. Anti-BCMA / anti-CD3 “2 1 IgG CrossFab, invertovani” molekul bez modifikacije naelektrisanja (koji se u ovom primeru naziva “83A10-TCB”) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 22-25, anti-BCMA/anti-CD3 “2 1 IgG CrossFab, invertovani” molekul sa modifikacijama naelektrisanja (u ovom primeru označen kao “83A10-TCBcv”) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 26-29.

Za generisanje vektora BCMAxCD3 bispecifičnog antitela, bispecifični molekuli izvedeni iz IgG1 se sastoje najmanje od dva antigen vezujuća ostatka sposobna da se specifično vežu za dve različite antigenske determinante CD3 i BCMA. Antigen vezujući ostaci su Fab fragmenti sastavljeni od teškog i lakog lanca, od kojih svaki sadrži varijabilni i konstantni region. Najmanje jedan od Fab fragmenata je "Crossfab" fragment, gde su razmenjeni VH i VL. Razmena VH i VL unutar Fab fragmenta osigurava da Fab fragmenti različite specifičnosti nemaju identičan raspored domena. Dizajn bispecifičnog molekula bio je jednovalentan za CD3 i dvovalentan za BCMA, gde je jedan Fab fragment spojen sa N-krajem unutrašnjeg CrossFab (2 1). Bispecifični molekul je sadržao Fc deo, kako bi molekul imao duži poluživot. Molekuli su proizvedeni kotransficiranjem HEK293 EBNA ćelija uzgajanih u suspenziji sa ekspresionim vektorima sisara, koristeći polietilenimin (PEI). Za pripremu 2 1 CrossFab-IgG konstrukata, ćelije su transficirane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1:1 ("vektor Fc (dugme)": "vektorski laki lanac": "vektorski laki lanac CrossFab": “vektorski teški lanac-CrossFab”).

Za bispecifična antitela, uvođenje zamene/razmene u jednom vezujućem kraku "CrossFab" jasno smanjuje sporedne proizvode, ali preparat nije potpuno oslobođen nusprodukata (detaljno opisano u WO2009/080252 i Schafer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191). Prema tome, da bi se dalje smanjili nusprodukti uzrokovani neskladom lakog lanca protiv prvog antigena sa pogrešnim teškim lancem protiv drugog antigena, i da bi se poboljšao prinos bispecifičnog antitela, dodat je pristup molekulu uvođenjem supstitucija naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjem na specifičnim aminokiselinskim položajima u CH1 i CL domenima u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju nezavisno lizinom (K), argininom (R)), i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatu); ili ii) u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju nezavisno lizinom (K), argininom (R)), i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b) aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatu).

Za proizvodnju bispecifičnih antitela, bispecifična antitela su eksprimirana prolaznom kotransfekcijom odgovarajućih ekspresionih vektora sisara u ćelijama HEK293-EBNA, koje su uzgajane u suspenziji, koristeći polietilenimin (PEI). Dan pre transficiranja, HEK293-EBNA ćelije su zasejane pri 1,5 miliona živih ćelija/ml u Ex-Cell medijumu sa dodatkom 6 mM L-glutamina. Za svaki ml finalne proizvodne zapremine centrifugirano je 2,0 miliona živih ćelija (5 minuta na 210 x g). Supernatant je usisan, i ćelije su ponovo suspendovane u 100 µl CD CHO medijuma. DNK za svaki ml finalne proizvodne zapremine pripremljena je mešanjem 1 µg DNK (odnos teški lanac: modifikovani teški lanac: laki lanac: modifikovani laki lanac = 1:1:2:1) u 100 µl CD CHO medijuma. Nakon dodavanja 0,27 µl rastvora PEI (1 mg/ml), smeša je mešana na vorteksu 15 sekundi, i ostavljena na sobnoj temperaturi 10 minuta. Nakon 10 minuta, ponovo suspendovane ćelije i smeša DNK/PEI su spojeni, a zatim prebačeni u odgovarajuću posudu koja je stavljena u šejker (37°C, 5% CO2). Nakon 3 sata inkubacije, dodato je 800 µl Ex-Cell medijuma, dopunjenog 6 mM L-glutaminom, 1,25 mM valproinskom kiselinom i 12,5% Pepsoy (50 g/l), za svaki ml finalne proizvodne zapremine. Nakon 24 sata, dodat je Feed (SF40, Lonza), 70 µl za svaki ml finalne proizvodne zapremine. Nakon 7 dana, ili kada je vijabilnost ćelija bila jednaka ili manja od 70%, ćelije su odvojene od supernatanta centrifugiranjem i sterilnom filtracijom. Antitela su prečišćena afinitetnim korakom, i sa jednim ili dva koraka poliranja, a to je hromatografija katjonske izmene i gel hromatografija. Po potrebi, korišćen je dodatni korak poliranja.

Za afinitetni korak, supernatant je nanet na kolonu sa proteinom A (HiTrap Protein A FF, 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 6 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, pH 7,5. Nakon koraka ispiranja sa istim puferom, antitelo je eluirano sa kolone elucionim korakom pomoću 20 mM natrijum fosfata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina, pH 3,0. Frakcije sa željenim antitelom su odmah neutralisane 0,5 M natrijum fosfatom, pH 8,0 (1:10), sakupljene i koncentrovane centrifugiranjem. Koncentrat je sterilno filtriran i dalje obrađivan hromatografijom katjonske izmene i/ili gel hromatografijom.

Za korak hromatografije katjonske izmene, koncentrovani protein je razblažen 1:10 elucionim puferom koji je korišćen za afinitetni korak, i nanet na kolonu za katjonsku izmenu (Poros 50 HS, Applied Biosystems). Nakon dva koraka ispiranja ekvilibracionim puferom i puferom za ispiranje, odnosno 20 mM natrijum fosfatom, 20 mM natrijum citratom, 20 mM TRIS, pH 5,0 i 20 mM natrijum fosfatom, 20 mM natrijum citratom, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum hloridom pH 5,0, protein je eluiran gradijentom, koristeći 20 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum hlorid pH 8,5. Frakcije koje sadrže željeno antitelo su spojene, koncentrovane centrifugiranjem, sterilno filtrirane i dalje obrađene korakom gel hromatografije.

Za korak gel hromatografije, koncentrovani protein je injektovan na kolonu XK16/60 HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) i 20 mM histidin, 140 mM natrijum hlorid, pH 6,0 sa ili bez Tween20 kao pufer za formulaciju. Frakcije koje sadrže monomere su sakupljene, koncentrovane centrifugiranjem i sterilno filtrirane u sterilnu bočicu.

Određivanje koncentracije antitela vršeno je merenjem apsorbance na 280 nm, koristeći teorijsku vrednost apsorbance 0,1% rastvora antitela. Ova vrednost je zasnovana na aminokiselinskoj sekvenci, i izračunata pomoću GPMAW softvera (Lighthouse data).

Čistoća i sadržaj monomera u finalnom preparatu proteina određeni su na CE-SDS (Caliper LabChip GXII sistem (Caliper Life Sciences)) odn. HPLC (TSKgel G3000 SW XL analitička kolona za gel hromatografiju (Tosoh)) u 25 mM kalijum fosfatu, 125 mM natrijum hloridu, 200 mM L-arginin monohidrohloridu, 0,02% (m/V) natrijum azidu, pufer pH 6,7.

Da bi se verifikovala molekulska masa finalnih proteinskih preparata i potvrdila homogena priprema molekula finalnog proteinskog rastvora, upotrebljena je tečna hromatografija-masena spektrometrija (LC-MS). Prvi korak je bio deglikozilacija. Da bi se uklonila heterogenost uvedena ugljenim hidratima, konstrukti su tretirani PNGazom F (ProZyme). Stoga je pH rastvora proteina podešen na pH 7,0 dodavanjem 2 µl 2 M Tris do 20 µg proteina sa koncentracijom od 0,5 mg/ml. Dodato je 0,8 µg PNGaze F, i inkubirano 12 h na 37°C. Zatim je izvršena LC-MS onlajn detekcija. LC-MS metoda je izvedena na aparatu Agilent HPLC 1200 spojenom na maseni spektrometar TOF 6441 (Agilent). Hromatografsko razdvajanje je izvršeno na koloni Macherey Nagel Polysterene; RP1000-8 (veličina čestica 8 µm, 4,6 x 250 mm; kat. br. 719510). Eluent A je bio 5% acetonitril i 0,05% (V/V) mravlja kiselina u vodi, eluent B je bio 95% acetonitril, 5% vode i 0,05% mravlja kiselina. Protok je bio 1 ml/min, razdvajanje je izvršeno na 40°C i 6 µg (15 µl) uzorka proteina dobijenog tretmanom kao što je opisano gore.

Tokom prvih 4 minuta, eluat je bio usmeren u otpad, kako bi se maseni spektrometar zaštitio od kontaminacije solju. ESI-izvor je radio sa protokom gasa za sušenje od 12 l/min, temperaturom od 350°C i pritiskom raspršivača od 60 psi. MS spektri su dobijeni korišćenjem napona fragmentora od 380 V i raspona mase od 700 do 3200 m/z u režimu pozitivnog jona. MS podaci su dobijeni pomoću softvera za instrumente od 4 do 17 minuta.

Slika 23 prikazuje CE-SDS (neredukovane) grafikone finalnih proteinskih preparata nakon različitih metoda prečišćavanja za 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela. Afinitetna hromatografija sa proteinom A (PA) i koraci prečišćavanja gel hromatografijom (SEC) primenjeni na 83A10-TCB antitelo dali su čistoću <30% i 82,8% sadržaja monomera (A). Kada su primenjeni dodatni koraci prečišćavanja, uključujući korake hromatografije katjonske izmene (cIEX) i finalne gel hromatografije (re-SEC) na finalnim proteinskim preparatima u (A), čistoća je povećana na 93,4%, ali je sadržaj monomera ostao isti, a prinos je značajno smanjen na 0,42 mg/l. Međutim, kada su specifične modifikacije naelektrisanja primenjene na antitelo 83A10 anti-BCMA Fab CL-CH1, odnosno 83A10-TCBcv, bolji profil proizvodnje / prečišćavanja TCB molekula, kao što je pokazano čistoćom od 95,3%, sadržajem monomera 100% i prinosom do 3,3 mg/l, već se mogao primetiti čak i kada su primenjeni koraci prečišćavanja PA cIEX SEC (C) u odnosu na (B), sa profilom proizvodnje / prečišćavanja koji pokazuje 7,9 puta manji prinos i za 17,2% niži sadržaj monomera, uprkos uključivanju dodatnog koraka prečišćavanja re-SEC.

Zatim je sproveden uporedni postupak proizvodnje, da bi se uporedio profil proizvodnje / prečišćavanja 83A10-TCB naspram 83A10-TCBcv antitela, kako bi se dalje procenile prednosti modifikacija naelektrisanja CL-CH1 koje se primenjuju na antitela. Kao što je prikazano na Slici 24, svojstva antitela 83A10-TCB i 83A10-TCBcv merena su paralelno, i upoređivana nakon svakog koraka prečišćavanja 1) samo PA afinitetnom hromatografijom (A, B), 2) PA afinitetnom hromatografijom, zatim SEC (C, D) i 3) PA afinitetnom hromatografijom, zatim SEC, a zatim cIEX i re-SEC (E, F). Grafikoni CE-SDS (neredukovani) finalnih proteinskih rastvora nakon odgovarajućih metoda prečišćavanja za 83 A10-TCB i 83 A10-TCBcv antitela prikazani su na slici 24. Kao što je prikazano na slikama 24A i 24B, poboljšanja sa primenom varijanti naelektrisanja na TCB antitela su već uočena samo nakon prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom. U ovoj uporednoj studiji, korak prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom primenjen na 83A10-TCB antitelo dao je čistoću od 61,3%, prinos od 26,2 mg/l i 63,7% sadržaja monomera (24A). Kao poređenje, kada je 83A10-TCBcv antitelo prečišćeno PA afinitetnom hromatografijom, sva svojstva su poboljšana sa boljom čistoćom od 81,0%, boljim prinosom od 51,5 mg/l i sadržajem monomera 68,2% (24B). Kada je primenjen dodatni korak prečišćavanja SEC na finalne proteinske preparate, kako se vidi na slikama 24A i 24B, 83A10-TCB je imao čistoću od 69,5%, prinos od 14,1 mg/l i sadržaj monomera 74,7% u odnosu na 83A10-TCBcv sa poboljšanom čistoćom i sadržajem monomera do 91,0%, odnosno 83,9%, i prinosom od 10,3 mg/l. Iako je prinos bio nešto manji (tj. 27% manji) za 83A10-TCBcv nego za 83A10-TCB u ovom konkretnom eksperimentu, procenat korektnog molekula bio je mnogo bolji za 83A10-TCBcv nego za 83A10-TCB, odnosno 90% prema 40-60%, mereno pomoću LC-MS. U trećem uporednom pregledu, finalni proteinski preparati 83A10-TCB i 83A10-TCBcv sa slika 24C i 24D su sakupljeni sa približno 1 l (ekvivalentna zapremina) odgovarajućih finalnih proteinskih preparata iz druge serije prečišćavanja (ista proizvodnja) nakon prečišćavanja samo PA afinitetnom hromatografijom. Prikupljeni proteinski preparati su zatim dalje prečišćavani cIEX i SEC metodama prečišćavanja. Kao što je prikazano na slikama 24E i 24F, poboljšanje profila proizvodnje / prečišćavanja TCB antitela sa varijantama naelektrisanja konzistentno je primećivano kada se uporedi sa TCB antitelom bez varijante naelektrisanja. Pošto je nekoliko koraka metoda prečišćavanja (tj. PA /- SEC cIEX SEC) korišćeno za prečišćavanje antitela 83A10-TCB, postignuta je čistoća od samo 43,1% i sadržaj monomera 98,3%, ali na štetu prinosa, koji je smanjen na 0,43 mg/l. Procenat korektnog molekula izmeren pomoću LC-MS još uvek je bio mali, i iznosio je 60-70%. Na kraju, kvalitet finalnog preparata proteina nije bio prihvatljiv za in vitro upotrebu. Nasuprot tome, kada su isti višestruki koraci prečišćavanja po istom redosledu primenjeni na antitelo 83A10-TCBcv, postignuta je čistoća 96,2% i sadržaj monomera 98,9%, kao i 95% korektnog molekula, mereno pomoću LC-MS. Međutim, prinos je takođe znatno smanjen na 0,64 mg/l nakon koraka prečišćavanja cIEX. Rezultati pokazuju da se bolja čistoća, veći sadržaj monomera, veći procenat korektnog molekula i bolji prinos mogu postići sa antitelom 83A10-TCBcv samo nakon dva standardna koraka prečišćavanja, tj. PA afinitetne hromatografije i SEC (Slika 24D), dok se takva svojstva ne mogu postići sa 83A10-TCB, čak ni kada su primenjeni dodatni koraci prečišćavanja (Slika 24E). Tabela 10 rezimira svojstva 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv nakon koraka PA prečišćavanja. Tabela 11 rezimira svojstva 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv nakon PA i SEC koraka prečišćavanja. Tabela 12 rezimira svojstva 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv nakon koraka prečišćavanja PA i SEC plus samo PA, zatim cIEX i re-SEC. U tabelama 10 do 12, vrednosti označene podebljanim slovima označavaju bolju osobinu, poredeći 83A10-TCB i 83A10-TCVcv. Sa jednim izuzetkom koji možda nije reprezentativan, svi parametri proizvodnje / prečišćavanja koji su rezultat 3 eksperimenta upoređivanja bili su bolji za 83A10-TCBcv u poređenju sa 83A10-TCB. Sveukupni rezultati jasno pokazuju da se prednosti u proizvodnji / prečišćavanju mogu postići primenom modifikacija naelektrisanja CL-CH1 na TCB antitela, i da su samo dva koraka prečišćavanja (tj. PA afinitetna hromatografija i SEC) potrebna za postizanje visokokvalitetnih proteinskih preparata sa vrlo dobrim razvojnim svojstvima.

TABELA 10. Profil proizvodnje / prečišćavanja anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela nakon koraka prečišćavanja afinitetnom hromatografijom sa proteinom

A.

TABELA 11. Profil proizvodnje / prečišćavanja anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela nakon koraka prečišćavanja afinitetnom hromatografijom sa proteinom A i gel hromatografijom.

TABELA 12. Profil proizvodnje / prečišćavanja anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela nakon koraka prečišćavanja 1.a) afinitetne hromatografije sa proteinom A i gel hromatografije i 1.b) afinitetne hromatografije sa proteinom A samo objedinjena, zatim 2) katjonske izmenjivačke hromatografije i 3) finalne gel hromatografije.

Vezivanje anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za BCMA-pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma (protočna citometrija)

Anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela (83A10-TCB, 13A4-TCBcv) su analizirana protočnom citometrijom da bi se odredilo vezivanje za humani BCMA na BCMA-eksprimirajućim ćelijama NCI-H929 (ATCC® CRL-9068™). MKN45 (humana ćelijska linija adenokarcinoma želuca koja ne eksprimira BCMA) korišćena je kao negativna kontrola. Ukratko, uzgajane ćelije su sakupljene, prebrojane, i vijabilnost ćelija je procenjena pomoću ViCell-a. Vijabilne ćelije su zatim podešene na 2 x 10<6>ćelija po ml u FACS puferu za bojenje koji sadrži BSA (BD Biosciences). Zatim je alikvot od 100 µl ove ćelijske suspenzije dodat u svaki bunarčić na ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i inkubiran sa 30 µl anti-BCMA antitela ili odgovarajućom IgG kontrolom tokom 30 minuta na 4°C. Sva anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela (i TCB kontrole) su titrisana i analizirana u konačnom rasponu koncentracija između 1 - 300 nM. Ćelije su zatim centrifugirane (5 min, 350 x g), isprane sa 120 µl/bunarčiću FACS pufera za bojenje (BD Biosciences), ponovo suspendovane i inkubirane dodatnih 30 min na 4°C sa fluorhrom-konjugovanim PE-konjugovanim AffiniPure F(ab’)2 fragmentom kozjeg anti-humanog IgG Fc fragment specifičnim (Jackson Immuno Research Lab; 109-116-170). Ćelije su zatim isprane dva puta puferom za bojenje (BD Biosciences), fiksirane upotrebom 100 ul BD pufera za fiksiranje po bunarčiću (BD Biosciences, br. 554655) na 4°C tokom 20 min, ponovo suspendovane u 120 µl FACS pufera, i analizirane pomoću BD FACS CantoII. Kao što je prikazano na Slici 25, srednji intenzitet fluorescencije anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela je prikazan u funkciji koncentracija antitela; (A) 83A10-TCB na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama, (B) 83A10-TCBcv na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama. Kada je primenljivo, EC50 je izračunat korišćenjem Prism GraphPad (LaJolla, CA, SAD) i EC50 vrednosti koje označavaju koncentraciju antitela koja je potrebna da bi se dostiglo 50% maksimalnog vezivanja za ćelije 83A10-TCB i 83A10-TCBcv do H929 sumirane su u tabeli 13. Slika 25C pokazuje da se 83A10-TCB i 83A10-TCBcv vezuju za H929 ćelije na način koji zavisi od koncentracije, i sa sličnom potencijom. Takvi rezultati su očekivani, jer molekuli 83A10-TCB i 83A10-TCBcv dele identične CDR sekvence na odgovarajućim varijabilnim domenima VL i VH. DP47-TCB kontrolno antitelo se nije vezalo za BCMA-pozitivne H929 ćelije mijeloma, mereno nedostatkom povećanja medijane intenziteta fluorescencije. U drugom uporednom eksperimentu, 83 A10-TCB i 83 A10-TCBcv su ispitivani u pogledu vezivanja za BCMA-pozitivne H929 ćelije i nedostatka vezivanja za BCMA / CD3-negativne MKN45 ćelije. Kao što je prikazano na Slici 25D, 83A10-TCB i 83A10-TCBcv se vezuju za BCMA-pozitivne H929 ćelije na način koji zavisi od koncentracije, i sa sličnom potencijom. EC50 vrednosti za vezivanje 83A10-TCB i 83A10-TCBcv za H929 ćelije za ovaj drugi eksperiment su rezimirane u tabeli 14.

TABELA 13. EC50 vrednosti za vezivanje anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela za H929 ćelije (Eksperiment 1).

TABELA 14. EC50 vrednosti za vezivanje anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela za H929 ćelije (Eksperiment 2).

Preusmerena T-ćelijska citotoksičnost H929 ćelija mijeloma sa velikom ekspresijom BCMA, indukovana anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (test oslobađanja LDH)

Anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela su takođe analizirana u pogledu potencijala da indukuju apoptozu posredovanu T ćelijama u ćelijama mijeloma koje imaju veliku ekspresiju BCMA nakon unakrsnog povezivanja konstrukta preko vezivanja antigen vezujućih ostataka za BCMA na ćelijama. Ukratko, humane BCMA eksprimirajuće ciljne ćelije H929 multiplog mijeloma su sakupljene puferom za disocijaciju ćelija, isprane i ponovo suspendovane u RPMI uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen). Približno 30.000 ćelija po bunarčiću je stavljeno na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i dodato je odgovarajuće razblaženje konstrukta antitela za željenu konačnu koncentraciju (u triplikatu); konačne koncentracije su bile u rasponu od 0,1 pM do 10 nM. Radi odgovarajućeg poređenja, svi TCB konstrukti i kontrole su podešeni na istu molarnost. Humane ukupne T ćelije (efektor) su dodate u bunarčiće da bi se dobio konačni odnos efektor:cilj (E:T) od 5:1. Kada su humani PBMC korišćeni kao efektorske ćelije, korišćen je konačni odnos E:T od 10:1. Negativne kontrolne grupe predstavljene su samo efektorskim ili ciljnim ćelijama. Kao pozitivna kontrola za aktivaciju humanih pan T ćelija, korišćen je 1 µg/ml PHA-M (Sigma br. L8902). Za normalizaciju, maksimalna liza H929 MM ciljnih ćelija (= 100%) je određena inkubacijom ciljnih ćelija sa konačnom koncentracijom od 1% Triton X-100, indukovanjem ćelijske smrti. Minimalna liza (= 0%) predstavljena je ciljnim ćelijama koinkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez bispecifičnog antitela T ćelija. Nakon 20-24 h inkubacije na 37°C, 5% CO2, oslobađanje LDH iz apoptotičnih / nekrotičnih ciljnih ćelija mijeloma u supernatantu je zatim mereno pomoću kompleta za detekciju LDH (Roche Applied Science), u skladu sa uputstvom proizvođača. Procenat oslobađanja LDH je predstavljen u odnosu na koncentracije anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela na krivama koncentracija-odgovor. Kada je primenljivo, vrednosti EC50 su merene korišćenjem Prism softvera (GraphPad), i određene kao koncentracija TCB antitela koja dovodi do 50% od maksimalnog oslobađanja LDH. Kao što je prikazano na Slici 26, anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela ((A,B) 83A10-TCB, (C,D) 83A10-TCBcv) indukovala su koncentraciono zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 ćelija mijeloma, mereno putem otpuštanja LDH. Ubijanje H929 ćelija je bilo specifično, jer DP47-TCB kontrolno antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije nije izazvalo oslobađanje LDH, čak ni pri najvišoj koncentraciji od 1 nM (A). Iako vrednosti EC50 nisu merljive korišćenjem statističkog softvera Prism (GraphPad) za 83A10-TCB (A, B) i 83A10-TCBcv (C, Eksperiment 1), veličina vrednosti EC50 mogla bi se približno proceniti na nizak pikomolarni raspon potencije za nenaelektrisane i naelektrisane TCB molekule. U drugom eksperimentu, efekat 83A10-TCBcv je procenjen u testu preusmeravanja ubijanja T-ćelija, i vrednost EC50 se može meriti na 1,5 pM. Autori ne mogu isključiti da bi nešto niža vrednost EC50 (nešto bolja potencija) mogla biti posledica varijabilnosti davaoca krvi. Međutim, veličina potencije za ubijanje ćelija H929 definitivno je u niskom pikomolarnom opsegu. Ukupni rezultati ukazuju na to da 83A10-TCB (bez varijante naelektrisanja) nasuprot 83A10-TCBcv (sa varijantom naelektrisanja) pokazuje slična biološka svojstva u testovima baziranim na ćelijama.

TABELA 15. EC50 vrednosti i procene za preusmereno T-ćelijsko ubijanje H929 ćelija indukovano antitelima anti-BCMA / anti-CD3 TCB.

Primer 3

Primer 3 nije u skladu sa pronalaskom i prisutan je samo u svrhu ilustracije.

Priprema „2 1 IgG CrossFab, invertovanog“ T-ćelijskog bispecifičnog antitela sa modifikacijama naelektrisanja (anti-Her2 / anti-CD3) i „2 1 IgG CrossFab“ T-ćelijskog bispecifičnog antitela sa modifikacijama naelektrisanja (anti-Her3 / anti -CD3) Šematski prikaz molekula pripremljenih u ovom primeru prikazan je na Slici 27. Anti-Her2 / anti-CD3 "2 1 IgG CrossFab, invertovani" molekul sa modifikacijama naelektrisanja (koji se u ovom primeru naziva "Her2 TCB") sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21, 52, 53 i 54. Anti-Her3 / anti-CD3 “2 1 IgG CrossFab” molekul sa modifikacijama naelektrisanja (koji se u ovom primeru naziva “Her3 TCB”) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21, 55, 56 i 57.

Molekuli su pripremljeni, prečišćeni i analizirani kako je opisano u Primeru 1 gore (sa jednim korakom preparativne SEC).

Oba molekula se mogu prečistiti sa velikim finalnim kvalitetom, što pokazuje analitička gel hromatografija i CE-SDS (Tabela 16, 17). Iako je povraćaj Her2 TCB u ovom preparatu bio niži u odnosu na Her3 TCB, protein je bio gotovo čist nakon dva koraka prečišćavanja (Protein A i SEC). CE-SDS analiza pokazuje samo 1,18% nečistoće male molekulske mase na oko 164 kDa (Tabela 17). Vrste detektovane na 187,28 kDa odgovaraju ciljnom molekulu bez N-povezane glikozilacije na Fc domenu (ova vrsta se obično detektuje pomoću CE-SDS za humani IgG1 nakon proizvodnje u eukariotskim ćelijama).

Her3 TCB se može prečistiti sa dobrim povraćajem. Konačni kvalitet je bio bolji od Her2 TCB poredeći konačni sadržaj monomera. Takođe, CE-SDS pokazuje 100% ciljni protein, pod pretpostavkom da pik detektovan na 192,05 kDa odgovara neglikozilovanoj Fcvrsti.

Kod oba preparata nisu detektovane nečistoće male molekulske mase povezane sa proizvodom, kao što su slobodni laki lanci (očekivana molekulska masa na 25 kDa), dimerizovani laki lanci, kao što se može desiti uvođenjem samo CH1-CL razmene na jednom lakom lancu (očekivana molekulska masa na 50 kDa) ili molekuli sa nedostaljućim ili nekovalentno vezanim lakim lancima (očekivana molekulska masa na 125 kDa, 150 kDa ili 175 kDa), putem CE-SDS ili analitičke gel hromatografije.

TABELA 16. Rezime proizvodnje i prečišćavanja anti-Her2 / anti-CD3 i anti-Her3 / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijama naelektrisanja.

TABELA 17. CE-SDS analize (neredukovane) anti-Her2 / anti-CD3 i anti-Her3 / anti-CD3

TCB molekula sa modifikacijama naelektrisanja.

Vezivanje Her2 TCB i Her3 TCB za ćelije

Jurkatove ćelije iz suspenzije su sakupljene, jednom isprane FACS puferom (PBS 0,1% BSA), i vijabilnost je određena pomoću ViCell-a.

Prianjajuće KPL-4 tumorske ćelije (koje je obezbedio J. Kurebajaši, Kawasaki Medical School, Japan) su sakupljene sa puferom za disocijaciju ćelija (Gibco Invitrogen) i jednom isprane FACS puferom, pre nego što je vijabilnost određena pomoću ViCell-a.

0,2 miliona ćelija je stavljeno po bunarčiću na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i ploče su centrifugirane 4 min na 400 g. Zatim je ćelijama dodato 25 µl po bunarčiću razblaženjaTCB u FACS puferu. Ćelije su inkubirane 30 minuta u frižideru. Nakon toga, ćelije su dva puta isprane sa 150 µl FACS pufera po bunarčiću.

25 µl odgovarajuće razblaženog sekundarnog antitela (FITC konjugovani AffiniPure F(ab')2fragment, kozji anti-humani IgG, F(ab')2fragment specifični, Jackson ImmunoResearch) je dodato po bunarčiću, i ploče su bojene još 30 min na 4°C u mraku. Ploče su dva puta isprane sa 150 µl FACS pufera po bunarčiću, i ponovo suspendovane u 150 µl FACS pufera. Analiza je izvršena pomoću BD FACS CantoII, opremljenog softverom FACS Diva. Srednje vrednosti fluorescencije (MFI) prikazane su u odnosu na koncentraciju TCB molekula.

Kao što je prikazano na Slici 29, oba TCB-a pokazuju koncentraciono zavisno dobro vezivanje za svoje ciljne antigene na ćelijama.

Aktivacija humanih CD8<+>T efektorskih ćelija, nakon lize humanih tumorskih ćelija posredstvom T-ćelija, indukovane pomoću Her3 TCB

CD8<+>T efektorske ćelije iz klasičnog eksperimenta lize tumorskih ćelija (kao što je opisano u nastavku) sa Her3 TCB koristeći odnos efektor-cilj (E:T) od 10:1 i vreme inkubacije od 48 sati procenjeni su u pogledu procenta CD69-pozitivnih ćelija.

Ukratko, nakon inkubacije, PBMC su prebačeni na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, centrifugirani na 350 x g tokom 5 min, i dva puta isprani sa PBS koji sadrži 0,1% BSA. Površinsko bojenje za CD8 (Biolegend br.300908) i CD69 (BioLegend br.310904) izvedeno je prema navodima dobavljača. Ćelije su dva puta isprane sa 150 µl/bunarčiću PBS-a koji sadrži 0,1% BSA i fiksirane 20 min na 4 °C pomoću 100 µl/bunarčiću 1% PF A. Nakon centrifugiranja, uzorci su ponovo suspendovani u 200 µl/bunarčiću PBS-a 0,1% BSA i analizirani na FACS CantoII (softver FACS Diva).

Kao što je prikazano na slici 30, Her3 TCB indukuje unakrsno povezivanje T ćelija i tumorskih ćelija (KPL-4) preko svojih ciljnih ostataka, i indukuje aktivaciju T ćelija na način koji je zavisan od koncentracije.

Jurkat-NFAT test aktivacije

Kapacitet Her2 TCB i Her3 TCB za indukovanje unakrsnog povezivanja T-ćelija i kasnije T-ćelijsku aktivaciju, procenjen je korišćenjem kokultura ciljnih ćelija pozitivnih na tumorski antigen (KPL-4) i Jurkat-NFAT reporter ćelija (ćelijska linija reportera humane akutne limfatične leukemije koja eksprimira CD3 sa NFAT promoterom, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega br. CS176501). Nakon istovremenog vezivanja TCB molekula za humani Her2, odnosno humani Her3, antigen (eksprimiran na tumorskim ćelijama) i CD3 antigen (eksprimiran na Jurkat-NFAT reporter ćelijama), NFAT promoter se aktivira, i dovodi do ekspresije aktivne luciferaze svica. Intenzitet signala luminescencije (dobijen nakon dodavanja supstrata luciferaze) proporcionalan je intenzitetu aktivacije i signalizacije CD3.

Za test, KPL-4 humane tumorske ćelije su sakupljene sa puferom za disocijaciju ćelija (Gibco Invitrogen), i vijabilnost je određena pomoću ViCell-a. 20.000 ćelija/bunarčiću je stavljeno na ploču sa ravnim dnom sa 96 bunarčića (Greiner bio-one), i dodat je razblaženi TCB ili medijum (za kontrole). Nakon toga, sakupljene su Jurkat-NFAT reporter ćelije i procenjena vijabilnost pomoću ViCell-a. Ćelije su ponovo suspendovane u medijumu za uzgajanje ćelija, i dodate tumorskim ćelijama da bi se dobio konačni E:T od 2,5:1 (za Her2 TCB) ili 5:1 (za Her3 TCB) kao što je naznačeno, i konačna zapremina od 100 µl po bunarčiću. Ćelije su inkubirane 5 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Na kraju vremena inkubacije, 100 µl/bunarčiću ONE-Glo rastvora (Promega, br. E6120) (1:1 ONE-Glo i zapremina medijuma za analizu po bunarčiću) je dodato u bunarčiće, i inkubirani su 10 min na sobnoj temperaturi u mraku. Luminescencija je detektovana pomoću WALLAC Victor3 ELISA čitača (PerkinElmer2030), detekciono vreme 5 sekundi/bunarčiću.

Kao što je prikazano na slici 31, oba TCB molekula indukuju unakrsno povezivanje T ćelija preko CD3, i kasnije T ćelijsku aktivaciju. Her3 TCB je malo potentniji na KPL-4 ćelijama, što se može objasniti višim nivoom Her3 u odnosu na Her2 na ovim ciljnim ćelijama.

Liza tumorskih ćelija indukovana od strane Her2 TCB i Her3 TCB

Liza tumorskih ćelija Her2- ili Her3-eksprimirajućih ciljnih ćelija tumora indukovana odgovarajućim TCB molekulima je procenjena koristeći mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) kao efektore, pri E:T od 10:1. Liza tumorskih ćelija određena je merenjem oslobođenog LDH u supernatantu nakon 24 h i 48 h posle inkubacije sa TCB, kao što je naznačeno.

Humani PBMC su izolovani iz sveže krvi, ili iz leukocitno-trombocitnog sloja. Ukratko, krv je razblažena 2:1 (sveža krv) ili 3:1 (leukocitno-trombocitni sloj) pomoću PBS. Oko 30 ml smeše krvi / PBS je raslojeno na 15 ml Histopaque (Sigma), i centrifugirano 30 minuta na 450 x g bez kočnice, na sobnoj temperaturi. Limfociti su sakupljeni pomoću pipete od 10 ml u epruvete od 50 ml koje sadrže PBS. Epruvete su napunjene do 50 ml PBS-om i centrifugirane 10 min na 350 g. Supernatant je odbačen, pelet je ponovo suspendovan u 50 ml PBS i centrifugiran 10 minuta na 300 x g. Korak ispiranja je jednom ponovljen. Ćelije su ponovo suspendovane u RPMI koji sadrži 10% FCS i 1% GlutaMax (Life Technologies) i čuvane na 37°C, 5% CO2u inkubatoru do početka testa (ne duže od 24h). Ciljne ćelije su sakupljene pomoću tripsin / EDTA, isprane i nanete pri gustini od 30.000 ćelija/bunarčiću na ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom. Ćelije su ostavljene da se učvrste preko noći u ovlaženom inkubatoru. Na dan testa, pločice za testiranje su centrifugirane na 350 x g tokom 5 min, i medijum je usisan. Dodato je 100 µl ispitivanog medijuma po bunarčiću.

TCB su dodati u naznačenim koncentracijama (raspon od 0,001 pM - 1 nM za Her3 TCB, i 0,01 pM - 100 nM za Her2 TCB, u triplikatu). PBMC su dodavane u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjivano nakon 24 h i 48 h inkubacije, kvantifikacijom LDH (laktat dehidrogenaze) oslobođene u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (LDH komplet za detekciju, Roche Applied Science, br.

11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-100. Minimalna liza (= 0%) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog antitela. Vrednosti EC50 su izračunate pomoću softvera GraphPadPrism5.

U drugom eksperimentu, liza tumorskih ćelija je određena aktivnošću kaspaze 3/7 nakon 6,5 h, merenjem luminescencije u čitaču mikroploča (5 s vreme očitavanja po bunarčiću).

Za određivanje aktivnosti kaspaze 3/7, KPL-4-kaspaza-3/7 GloSensor ciljne ćelije (KPL-4 ćelije koje su stabilno transficirane plazmidom GloSensor) su sakupljene kako je gore opisano. Nakon jednog ispiranja sa PBS, koncentracija je podešena na 0,3 x 10<6>ćelija/ml u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1% Glutamax) i pomešana sa 2% V/V reagensa GloSensor cAMP (Promega). 100 µl (= 30.000 ćelija) ove suspenzije ciljnih ćelija je prebačeno u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom sa belim zidovima.

Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od zdravih humanih donora, kako je gore opisano. Test lize tumorskih ćelija je izveden uglavnom kao što je gore opisano.

Rezultati prikazani na Slici 32C i na Slici 33 ilustruju da molekul Her3 TCB indukuje snažnu apoptozu i lizu KPL-4 tumorskih ćelija koja zavisi od koncentracije.

Isto važi i za Her2 TCB koji je prikazan na Slici 32A i B, i pokazuje značajnu lizu tumorskih ćelija zavisnu od koncentracije tokom vremena. Prema tome, izgleda da EC50 ubijanja zavisi od nivoa ekspresije Her2 na odgovarajućoj ciljnoj ćeliji. Što je nivo ekspresije viši, bolje je ubijanje tumorske ćelije od strane Her2 TCB.

Primer 4

Primer 4 nije u skladu sa pronalaskom i prisutan je samo u svrhu ilustracije.

Priprema "(Fab)2-CrossFab" bispecifičnih antitela T-ćelija sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (anti-MCSP / anti-CD3)

Šematski prikaz molekula pripremljenih u ovom primeru prikazan je na Slici 34. Molekul anti-MCSP / anti-CD3 “(Fab)2-CrossFab” sa modifikacijama naelektrisanja na MCSP vezivačima (u daljem tekstu “(Fab) 2-XFab-LC007cv” u ovom primeru) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 58, 59 i 60. Molekul anti-MCSP / anti-CD3 “(Fab)2CrossFab” bez modifikacija naelektrisanja (koji se naziva “(Fab) 2-XFab” u ovom primeru) sadrži odgovarajuće aminokiselinske sekvence bez modifikacija naelektrisanja.

Molekuli su pripremljeni, prečišćeni i analizirani u suštini kao što je opisano u Primeru 1 gore, sa sledećim adaptacijama.

Za proizvodnju ovih molekula, HEK293-EBNA ćelije su transficirane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1 ("vektorski teški lanac": “vektorski laki lanac anti-MSCP Fab”: “vektorski laki lanac anti-CD3 Fab”).

Koncentracija konstrukata u medijumu za uzgajanje određena je pomoću ProteinA-HPLC, na osnovu vezivanja delova CH1 domena za ProteinA na pH 8,0 i postupnog eluiranja od pH 2,5 kao što je opisano u Primeru 1.

Izlučeni proteini su prečišćeni iz supernatanta ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, koristeći afinitetnu hromatografiju vezivanjem za CH1, nakon čega sledi korak gel hromatografije. Za afinitetnu hromatografiju, supernatant je nanet na kolonu HiTrap KappaSelect (CV = 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 5 ml 50 mM Tris, 100 mM glicina, 150 mM NaCl pH 8,0. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 50 mM Tris, 100 mM glicina, 150 mM NaCl pH 8,0. Ciljni protein je eluiran u 10 zapremina kolone gradijentom do 50 mM Tris, 100 mM glicina, 150 mM NaCl pH 2,0. Proteinski rastvor je neutralisan dodavanjem 1/40 2 M Tris pH 8,0. Ciljni protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) koja je ekvilibrisana sa 20 mM histidinom, 140 mM natrijum hloridom, 0,01% Tween-20, pH 6,0.

Oba molekula su proizvedena i prečišćena istom metodom. U poređenju sa molekulom bez modifikacija naelektrisanja (“(Fab)2-XFab”), titar molekula sa naelektrisanjem je bio 10 puta manji. Ipak, konačni povraćaj je bio približno dva puta veći za molekul sa modifikacijama naelektrisanja u dva anti-MCSP Fab (“(Fab) 2-XFab-LC007cv”) (Tabela 18). Molekul (Fab)2-XFab-LC007cv mogao bi se prečistiti do konačnog sadržaja monomera od 95,8%, kao što prikazuje gel hromatografija, i konačne čistoće od 94,33% dokazane CE-SDS analizom. TABELA 18. Sažetak proizvodnje i prečišćavanja anti-MCSP / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja.

TABELA 19. CE-SDS analize (neredukovane) anti-MCSP / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijama naelektrisanja.

Vezivanje ćelija „(Fab)2-CrossFab“ T-ćelijskih bispecifičnih antitela sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (anti-MCSP / anti-CD3)

Jurkat-NFAT suspendovane ćelije su sakupljene, jednom isprane FACS puferom (PBS 0,1% BSA), i vijabilnost im je određena pomoću ViCell-a.

Prianjajuće MV-3 tumorske ćelije su sakupljene puferom za disocijaciju ćelija (Gibco Invitrogen) i jednom isprane FACS puferom, pre nego što im je vijabilnost određena pomoću ViCell-a.

0,2 miliona ćelija je naneto po bunarčiću ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i ploče su centrifugirane 4 min na 400 x g. Zatim je u ćelije dodato 25 µl po bunarčiću primarnih razblaženja antitela u FACS puferu. Ćelije su inkubirane 30 minuta u frižideru. Nakon toga, ćelije su dva puta isprane sa 150 µl FACS pufera po bunarčiću.

25 µl razblaženog sekundarnog antitela (FITC konjugovani AffiniPure F(ab')2 fragment, kozji anti-humani IgG, F(ab')2 fragment specifični, Jackson ImmunoResearch) je dodato po bunarčiću, i ploče su bojene još 30 min na 4 °C u mraku.

Ploče su dva puta isprane sa 150 µl FACS pufera po bunarčiću, i ponovo suspendovane u 150 µl FACS pufera. Analiza je izvršena pomoću BD FACS CantoII, opremljenog softverom FACS Diva. Medijane fluorescencije (MFI) su predstavljene u odnosu na koncentraciju MCSP TCB molekula.

Kao što je prikazano na Slici 36, molekul (Fab)2-XFAb-LC007cv pokazuje vezivanje za humani MCSP na MV-3 i za humani CD3 na Jurkatovim ćelijama, zavisno od koncentracije. Molekul (Fab)2-XFab bez modifikacija naelektrisanja pokazuje uporedivo vezivanje za humani MCSP kao (Fab)2-XFAb-LC007cv (EC50 vezivanja od 2,3 nM za (Fab)2-XFAb-LC007cv u odnosu na EC 50 od 1,5 nM za (Fab)2-XFab).

Liza tumorskih ćelija posredovana "(Fab)2-CrossFab" T-ćelijskim bispecifičnim antitelima sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (anti-MCSP / anti-CD3) Liza tumorskih ćelija MSP-eksprimirajućih MV-3 ciljnih ćelija tumora indukovana od strane MCSP TCB molekula je koristila humane PBMC kao efektore, pri E:T od 10:1. Liza ćelija tumora je određena merenjem oslobođenog LDH u supernatantima nakon 24 h i 48 h posle inkubacije sa TCB.

Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene pomoću tripsina/EDTA, isprane i nanete u gustini od 25.000 ćelija/bunarčiću koristeći ploče sa 96 bunarčića ravnog dna. Ćelije su ostavljene da se učvrste preko noći u ovlaženom inkubatoru. Na dan testa, pločice za testiranje su centrifugirane na 350 x g tokom 5 min, i medijum je usisan. Dodato je 100 µl ispitivanog medijuma po bunarčiću.

Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz sveže krvi. Ukratko, krv je razblažena u odnosu 2:1 dodatkom PBS. Oko 30 ml smeše krvi / PBS je raslojeno na 15 ml Histopaque (Sigma), i centrifugirano 30 minuta na 450 x g bez kočnice. Limfociti su sakupljeni pomoću pipete od 10 ml u epruvete od 50 ml koje sadrže PBS. Epruvete su napunjene do 50 ml dodatkom PBS i centrifugirane 10 min na 350 x g. Supernatant je odbačen, pelet je ponovo suspendovan u 50 ml PBS i centrifugiran 10 minuta na 300 x g. Korak ispiranja je jednom ponovljen. Ćelije su ponovo suspendovane u RPMI koji sadrži 10% FCS i 1% GlutaMax (Life Technologies) i čuvane na 37 °C, 5% CO2u inkubatoru do početka testa (ne duže od 24 h).

Za test ubijanja, molekuli TCB su dodati u naznačenim koncentracijama (raspon od 0,04 pM - 10 nM u triplikatu). PBMC su dodavane u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjivano nakon 24 h i 48 h inkubacije, kvantifikacijom LDH (laktat dehidrogenaze) oslobođene u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (LDH komplet za detekciju, Roche Applied Science, br.11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-100. Minimalna liza (= 0%) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog antitela. Vrednosti EC50 su izračunate pomoću softvera GraphPadPrism5.

Kao što je prikazano na Slici 37, oba molekula pokazuju lizu ciljnih ćelija koje eksprimiraju hMCSP zavisnu od koncentracije. Potencija molekula (Fab)2-XFAb-LC007cv (EC50 2,8 pM nakon 24 h, i 8,6 pM nakon 48 h) je uporediva sa potencijom molekula (Fab)2-XFab bez modifikacija naelektrisanja (EC505,9 pM nakon 24 h, i 4,8 pM nakon 48 h).

LISTA SEKVENCI

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

<120> Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije

<130> P32209

<150> EP 14179764.7

<151> 04.08.2014.

<150> EP 15170866.6

<151> 05.06.2015.

<160> 68

<170> Verzija PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 207

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis <400> 2

<211> 125

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VH

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<223> CD3 HCDR1

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 HCDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 HCDR3

<400> 6

<211> 109

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VL

<400> 7

<210> 8

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 LCDR1

<400> 8

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 LCDR2

<400> 9

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 LCDR3

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> linker

<400> 11

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> linker

<400> 12

<210> 13

<211> 225

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 13

<211> 690

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CH1-CD3 VH-CL-Fc (dugme, P329G LALA)

<400> 14

<211> 447

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CH1-Fc (rupica, P329G LALA)

<400> 15

<211> 214

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VL-CH1

<400> 16

<211> 219

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VL-CL

<400> 17

<211> 672

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (dugme, P329G LALA)

<400> 18

<211> 447

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CH1(EE)-Fc (rupica, P329G LALA)

<400> 19

<211> 219

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VL-CL(RK)

<400> 20

<211> 232

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VH-CL

<400> 21

<211> 687

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> BCMA VH-CH1-CD3 VH-CL-Fc (dugme, P329G LALA)

<400> 22

<211> 444

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> BCMA VH-CH1-Fc (rupica, P329G LALA)

<400> 23

<211> 214

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VL-CH1

<400> 24

<211> 216

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> BCMA VL-CL

<400> 25

<211> 669

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> BCMA VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (dugme, P329G LALA)

<400> 26

<211> 444

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> BCMA VH-CH1(EE)-Fc (rupica, P329G LALA)

<400> 27

<211> 232

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VH-CL

<400> 28

<211> 216

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> BCMA VL-CL(RK)

<400> 29

<211> 119

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH

<400> 30

<210> 31

<211> 115

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VL

<400> 31

<210> 32

<211> 672

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VL-CH1-CD20 VH-CH1(EE)-Fc(dugme, P329G LALA)

<400> 32

<211> 672

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CH1-CD3 VL-CH1-Fc(dugme, P329G LALA)

<400> 33

<211> 676

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CH1 CD3 VL-CL-Fc(dugme, P329G LALA)

<400> 34

<211> 228

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VH-CH1

<400> 35

<211> 681

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VL-CH1-CD3 VH-CH1(EE)-Fc(dugme, P329G LALA)

<400> 36

<211> 442

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VL-CH1-Fc(rupica, P329G LALA)

<400> 37

<211> 215

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VL-CL(KK)

<400> 38

<211> 226

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CL

<400> 39

<211> 672

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc(DD, P329G LALA)

<400> 40

<211> 447

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CH1(EE)-Fc(KK, P329G LALA)

<400> 41

<211> 447

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CH1(EE)-Fc(rupica, N297G)

<400> 42

<211> 439

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VL-CH1-Fc(dugme, N297G)

<400> 43

<211> 450

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VH-CH1(EE)-Fc(rupica, N297G)

<400> 44

<211> 213

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 VL-CL(RK)

<400> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 HCDR1

<400> 46

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 HCDR2

<400> 47

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<223> CD20 HCDR3

<400> 48

<210> 49

<211> 16

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 LCDR1

<400> 49

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 LCDR2

<400> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD20 LCDR3

<400> 51

<210> 52

<211> 673

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Her2 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc(dugme, P329G LALA)

<400> 52

<211> 448

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Her2 VH-CH1(EE)-Fc(rupica, P329G LALA)

<400> 53

<211> 214

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Her2 VL-CL(RK)

<400> 54

<211> 673

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VL-CH1-Her3 VH-CH1(EE)- Fc(dugme, P329G LALA)

<400> 55

<211> 448

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Her3 VH-CH1(EE)-Fc(rupica, P329G LALA)

<400> 56

<211> 220

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Her3 VL-CL

<400> 57

<211> 664

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> MCSP VH-CH1(EE)-MCSP VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1

<400> 58

<211> 229

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 VH-CL

<400> 59

<211> 214

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> MCSP VL-CL(RK)

<400> 60

<211> 120

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Her2 VH

<400> 61

<210> 62

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Her2 VL

<400> 62

<210> 63

<211> 120

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Her3 VH

<400> 63

<211> 113

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Her3 VL

<400> 64

<211> 112

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> MCSP VH

<400> 65

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> MCSP VL

<400> 66

<211> 19

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 HCDR2

<400> 67

<211> 14

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> CD3 LCDR1

<400> 68

Claims (1)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, pri čemu molekul sadrži teški lanac SEQ ID NO: 18, teški lanac SEQ ID NO: 19, dva laka lanca SEQ ID NO: 20 i laki lanac SEQ ID NO: 21; i pri čemu, teški i laki lanac su sastavljeni da formiraju prvi molekul Fab koji se specifično vezuje za CD20, drugi molekul Fab koji se specifično vezuje za CD3 i treći molekul Fab koji se specifično vezuje za CD20, i Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju.