JP7208380B2 - リコンビナーゼ媒介性カセット交換を使用した多重特異性抗体スクリーニング法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞株作製の分野に関する。より正確には、本明細書では、標的化組込み中の発現カセットのランダム化によって、二重特異性抗体発現細胞のライブラリを作製するための方法が報告されている。これらの細胞は、生産用細胞株として使用できる。

発明の背景
抗体または抗体様タンパク質を、２つの異なる標的に結合するように操作することができる。軽鎖と重鎖の正しいアセンブリは、様々な方法で促進可能である（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、２０１７）。このようなタンパク質の１つのクラスは、２つの異なる標的に対して向けられた２つの異なるＦａｂ断片を持つＩｇＧ様の二重特異性抗体である。例えば、１つの共通の軽鎖と２つの異なる重鎖を持つＩｇＧ（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８）、または２つの異なる軽鎖と２つの異なる重鎖を含むＣｒｏｓｓＭａｂ（（Ｒｅｇｕｌａら、２０１８、Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０１１）である。分子工学を使用することにより、軽鎖と重鎖の正しいアセンブリが促進される。

二重特異性抗体を使用することにより、２つの可溶性因子を同時に中和することができる（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０１１）。さらに、タンパク質およびその活性化因子を近接かつ適切な方向に持ってくることによって、タンパク質基質の活性化などの複雑な作用機序を発揮する可能性がある（Ｋｉｔａｚａｗａら、２０１２、Ｓｈｉｍａら、２０１６）。所望の機能を発揮できるＦａｂの適切な組合せを見つけることは、多大な労力を要し得る（Ｓａｍｐｅｉら、２０１３）。

抗体などの分泌型およびグリコシル化型タンパク質は、通常、真核細胞において、安定または一過性の組換え発現によって作製される。一過性トランスフェクションを使用すると、多様に異なる二重特異性抗体を発現させるために、多数の個別トランスフェクションを実行する必要がある。プラスミドのクローン調製物を用いた各トランスフェクションは、上清に１種類の二重特異性抗体のみが含まれ、スクリーニングに適していることを保証する。ランダム組込みによる安定したトランスフェクションについても、同じことが当てはまる。一般に、プラスミドがランダムにトランスフェクトされる場合、いくつかのプラスミドが宿主ゲノムに組み込まれる。その結果、プラスミドの混合物でトランスフェクトされた場合、トランスフェクトされた細胞のほとんどは、複数種の二重特異性抗体を分泌する。これは、１つの二重特異性抗体をコードする遺伝子のすべてが、同じプラスミド上に配置されている場合でも発生する。レンチウイルスベクターは、ランダム組込みのこの制限を部分的に克服し、１つまたは少数の単一コピーの組込みだけを持つ組換え細胞株を作製するために使用されてきた。これは、レンチウイルスｓｃＦｖ－Ｆｃ融合ライブラリによる同時形質導入後、組換え細胞株のライブラリを作製およびスクリーニングするために使用されている（Ｚｈａｎｇら、２０１２）。一方で、Ｚｈａｎｇらは、トランスフェクトされた細胞株の多くが、複数のレンチウイルスでトランスフェクトされ、その結果、組換え産物の混合物が産生され、スクリーニング結果の解釈が複雑になることを観察した。それにもかかわらず、Ｚｈａｎｇらは意図せずに強力な二重特異性アゴニスト結合剤を同定することができたため、ｓｃＦｖ－Ｆｃのランダムな組合せは、彼らにとって、利点があると判明した。３つ以上のポリペプチドで構成されるｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質とは対照的に、抗体フォーマットでは、サブユニットのランダムな組合せの可能性と生成物混合物の複雑さはさらに高くなり、スクリーニングがほとんど不可能になる。

リコンビナーゼ媒介性カセット交換（ＲＭＣＥ）による標的化組込みは、外来ＤＮＡを真核生物の宿主ゲノムの事前定義された部位に特異的かつ効率的に向ける方法である（Ｔｕｒａｎら、２０１１）。

ＷＯ２００６／００７８５０は、抗アカゲザルＤ組換えポリクローナル抗体および製造方法を開示している。問題を回避するために、使用された発現システムでは、個々の宿主細胞のゲノムへの部位特異的な組込みを使用している。前記システムは、抗ＲｈＤ ｒｐＡｂをコードするバリアント核酸セグメントを含む部位特異的な組込みのために、抗ＲｈＤ抗体発現ベクターのライブラリを包含する。ライブラリからの個々の核酸セグメントは、事前定義された組換え認識部位での部位特異的な組込みによって、またはリコンビナーゼ媒介性カセット交換手順によって、事前に決められた同じ染色体位置で個々の細胞に挿入され、それによって細胞株を作製し、個々の細胞は、抗ＲｈＤ ｒｐＡｂの異なるメンバーを発現する。

ＷＯ２０１３／００６１４２は、真核細胞における迅速な遺伝子改変のための新規なプロセスおよび試薬を開示している。遺伝的に改変された真核細胞のほぼ均質な集団がさらに開示されており、該真核細胞のゲノムにはドナーカセットが安定して組み込まれており、該ドナーカセットは、標的核酸部位および選択可能マーカーのタンパク質コード配列を含む単離された核酸断片に作動可能に連結された強力なポリアデニル化部位を含み、該単離された核酸断片は、第１の組換え部位および同一でない第２の組換え部位に挟まれている。該文献では、フロックス化Ｐｕｒ遺伝子の前のプロモーターを、強力なポリアデニル化部位で置き換えることより、非特異的な組込みイベントを阻止し、ＲＭＣＥアクセプター遺伝子座との正しい組換えが起こる場合にのみ、ピューロマイシン耐性コロニーが生成するはずであると論じている。

Ｋａｗａｂｅ，Ｙ．ら（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４（２０１１）２６７－２７９）は、累積的な部位特異的遺伝子組込みシステムを使用した、ＣＨＯ細胞の事前に選択された染色体遺伝子座への抗体遺伝子の反復組込みを開示した。大腸菌細胞において二重特異性抗体を調製するための方法は、ＫＲ２０１１ ００６８８１４に開示されている。ＷＯ００／３１２４６は、核酸およびポリペプチドライブラリのインビボ組換えによる調製方法およびそれらの使用を開示した。転移を介した特異的結合または機能性タンパク質の同定は、ＥＰ２６９２８６５ Ｂ１に開示されている。

本発明の一態様は、ＣＨＯ細胞において、二重特異性抗体のコンビナトリアル発現ライブラリを作製するためのＲＭＣＥベースの方法であり、該細胞はそれぞれ、正確に１種類の二重特異性分子を発現する。

本発明の別の態様は、ベクターライブラリ、それ自体、特に小さいサイズのものである。

本発明のさらなる態様は、ライブラリ自体を作製するために有用なベクターである。

本発明の一態様は、多重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込みの宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１および第２の組換え認識配列を含み、第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、該組換え認識配列のすべてが異なる、提供すること、
ｂ）ａ）で提供される細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１および第３の組換え認識配列と一致する２つの組換え認識配列をそれぞれ含む第１のベクターのライブラリであり、ここで、該２つの組換え認識配列は、２つ以上の外因性ヌクレオチド配列、および少なくとも１つの第２の選択マーカー（の一部）に隣接している、ライブラリ、ならびに該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２および第３の組換え認識配列と一致する２つの組換え認識配列をそれぞれ含む第２のベクターのライブラリであり、ここで、該２つの組換え認識配列は、２つまたは（さらに）それ以上の外因性ヌクレオチド配列に隣接している、ライブラリを導入すること、
ｃ）ｉ）ｂ）の第１および第２のベクターライブラリと同時に、またはｉｉ）その後、順次、１つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該１つ以上のリコンビナーゼは、第１および第２のベクターの組換え認識配列を認識し、（場合によっては、該１つ以上のリコンビナーゼが、２つのリコンビナーゼ媒介性カセット交換を実行する）、導入すること、ならびに
ｄ）第２の選択マーカーを発現し、かつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択すること
を含み、それにより、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製する、方法である。

一実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

一実施形態では、２つ以上の外因性ヌクレオチド配列は、互いに独立して、２～６、または２～４、または３、または４、または５、または６つの外因性ヌクレオチド配列である。一実施形態では、２つ以上の外因性ヌクレオチド配列は、互いに独立して、２～３、または２～４である。一実施形態では、２つ以上の外因性ヌクレオチド配列は、２つの外因性ヌクレオチド配列である。

一実施形態では、第１のベクターおよび第２のベクターは、合計４つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該４つの外因性ヌクレオチド配列のうち、１つは二重特異性抗体の第１の軽鎖をコードし、１つは二重特異性抗体の第２の軽鎖をコードし、１つは二重特異性抗体の第１の重鎖をコードし、１つは二重特異性抗体の第２の重鎖をコードする。

一実施形態では、第１および第２のベクターのそれぞれは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、第１および第２のベクターのそれぞれは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および同族の抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、第１または第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置し、他方のベクターは、該抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する該抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、第１および第２のベクターのそれぞれは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、各ベクターにおいて、該抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する。

一実施形態では、第１および第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する。

一実施形態では、第１または第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有する。

一実施形態では、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有する。

１つの好ましい実施形態では、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖はドメインクロスオーバーを有し、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する。

１つの好ましい実施形態では、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖はドメインクロスオーバーを有し、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する。

一実施形態では、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖はドメインクロスオーバーを有し、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置し、第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該抗体重鎖コードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する、またはその逆。

１つの好ましい実施形態では、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖はドメインクロスオーバーを有し、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置し、第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する。

本発明の一態様は、ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込みの宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１および第２の組換え認識配列を含み、第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、該組換え認識配列のすべてが異なる、提供すること、
ｂ）ａ）で提供される細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１および第３の組換え認識配列と一致し、２つの外因性ヌクレオチド配列および少なくとも１つの第２の選択マーカーコード配列（の一部）に隣接する２つの組換え認識配列をそれぞれ含む第１のベクター、ならびに該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２および第３の組換え認識配列と一致し、少なくとも２つのさらなる外因性ヌクレオチド配列に隣接する２つの組換え認識配列をそれぞれ含む第２のベクターを導入することであり、ここで、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有し、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置し、該第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する、導入すること、
ｃ）ｉ）ｂ）の第１および第２のベクターと同時に、またはｉｉ）その後、順次、１つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該１つ以上のリコンビナーゼは、第１および第２のベクターの組換え認識配列を認識する（場合によっては、該１つ以上のリコンビナーゼが２つのリコンビナーゼ媒介性カセット交換を実行する）、導入すること、ならびに
ｄ）第２の選択マーカーを発現し、かつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択すること
を含み、それにより、ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製する、方法である。

一実施形態では、第１のベクターは、コドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、それにより、該プロモーター配列は、上流に該（２つの）外因性ヌクレオチド配列が隣接し（すなわち、該外因性ヌクレオチド配列の下流に配置され）、該ＡＴＧコドンは、下流に組換え認識配列が隣接し（すなわち、組換え認識配列の上流に配置され）、第２のベクターは、上流に組換え認識配列が隣接し、下流に該（２つの）外因性ヌクレオチド配列が隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。

本発明の一態様は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む組換え細胞であり、
該外因性ヌクレオチド配列は、以下の要素：第１、第２および第３の組換え認識配列、第１および第２の選択可能マーカー、ならびに第１から第４の発現カセットを含み、
該要素の５’から３’の配列は、
ＲＲＳ１－第１のＥＣ－第２のＥＣ－ＲＲＳ３－ＳＭ１－第３のＥＣ－第４のＥＣ－ＲＲＳ２－ＳＭ２であり、ここで、ＲＲＳは組換え認識配列、ＥＣは発現カセット、ＳＭは選択マーカーである。

一実施形態では、各発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、目的の遺伝子、およびポリＡ部位を含み、場合によっては、ターミネーター配列を含む。

一実施形態では、
ｉ）第１の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする核酸、およびポリＡ部位を含み（場合によっては、ターミネーター配列を含む）、
ｉｉ）第２の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする核酸、およびポリＡ部位を含み（場合によっては、ターミネーター配列を含む）、
ｉｉｉ）第３の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸（ドメインクロスオーバーなし）、およびポリＡ部位を含み（場合によっては、ターミネーター配列を含む）、
ｉｖ）第４の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、抗体重鎖をコードする核酸（ドメインクロスオーバーなし）、およびポリＡ部位を含む（場合によっては、ターミネーター配列を含む）。

一実施形態では、プロモーターは、イントロンＡを有するヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリＡ部位は、ＢＧＨポリＡ部位であり、ターミネーターは、ｈＧＴターミネーターである。

一実施形態では、ドメインクロスオーバーは、ＣＨ１－ＣＬクロスオーバー、またはＶＨ－ＶＬクロスオーバー、またはＶＨ／ＣＨ１－ＶＬ／ＣＬクロスオーバーである。

一実施形態では、ｉ）ドメインクロスオーバーを伴う軽鎖およびドメインクロスオーバーを伴う重鎖の可変ドメインは、第１の抗原に特異的に結合する結合部位を形成し、ｉｉ）ドメインクロスオーバーを伴わない軽鎖およびドメインクロスオーバーを伴わない重鎖の可変ドメインは、第２の抗原に特異的に結合する結合部位を形成する。一実施形態では、第１の抗原は、抗原上の第１のエピトープであり、第２の抗原は、第１のエピトープとは異なる、抗原上の第２のエピトープである。一実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は、異なる抗原（ポリペプチド）である。

本発明の一態様は、二重特異性抗体を産生する方法であり、該方法は、
ａ）本発明による、または本発明による方法で調製される組換え宿主細胞を提供することと、
ｂ）ａ）の組換え宿主細胞を培養し、細胞または培養培地から二重特異性抗体を回収することと
を含む。
[本発明1001]
二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製するための方法であって、
（ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込み宿主細胞を提供することであって、ここで、前記外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列のすべてが異なる、提供すること、
（ｂ）前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第1および第3の組換え認識配列と一致しかつ2つの外因性ヌクレオチド配列および少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第1のベクターのライブラリ、ならびに
前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第2および第3の組換え認識配列と一致しかつ少なくとも2つのさらなる外因性ヌクレオチド配列に隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第2のベクターのライブラリ
を、（ａ）で提供される細胞に導入することであって、ここで、前記4つの外因性ヌクレオチド配列のうち、1つは前記二重特異性抗体の第1の軽鎖、1つは前記二重特異性抗体の第2の軽鎖、1つは前記二重特異性抗体の第1の重鎖、および1つは前記二重特異性抗体の第2の重鎖をコードする、導入すること、
（ｃ）（ｉ）（ｂ）の第1および第2のベクターのライブラリと同時に、または（ｉｉ）その後順次に、1つ以上のリコンビナーゼを導入することであって、ここで、前記1つ以上のリコンビナーゼは、前記第1および第2のベクターの前記組換え認識配列を認識し、前記1つ以上のリコンビナーゼは、前記組換え認識配列を認識して、2つのリコンビナーゼ媒介性カセット交換を実行する、導入すること、ならびに
（ｄ）前記第2の選択マーカーを発現し、かつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択すること
を含み、それにより、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製する、方法。
[本発明1002]
前記第1および第2のベクターのそれぞれが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記第1および第2のベクターのそれぞれが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および同族の抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含む、本発明1001から1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
前記第1または第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置し、他方のベクターが、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置する前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列を含む、本発明1001から1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記第1および第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置する、本発明1001から1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記第1および第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置する、本発明1001から1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記第1および第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、一方のベクターでは、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置し、他方のベクターでは、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置する、本発明1001から1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記第1または第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有する、本発明1001から1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記第1のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有する、本発明1001から1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記第1のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置する、本発明1001から1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記第1のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置し、前記第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置する、本発明1001から1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製するための方法であって、
（ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込み宿主細胞を提供することであって、ここで、前記外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列のすべてが異なる、提供すること、
（ｂ）前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第1および第3の組換え認識配列と一致しかつ2つの外因性ヌクレオチド配列および少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第1のベクター、ならびに
前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第2および第3の組換え認識配列と一致しかつ少なくとも2つのさらなる外因性ヌクレオチド配列に隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第2のベクター
を、（ａ）で提供される細胞に導入することであって、ここで、前記第1のベクターは、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置し、前記第2のベクターは、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（5’）に位置する、導入すること、
（ｃ）（ｉ）（ｂ）の第1および第2のベクターと同時に、または（ｉｉ）その後順次に、1つ以上のリコンビナーゼを導入することであって、ここで、前記1つ以上のリコンビナーゼは、前記第1および第2のベクターの前記組換え認識配列を認識する、導入すること、ならびに
（ｄ）前記第2の選択マーカーを発現しかつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択すること
を含み、それにより、ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製する、方法。
[本発明1013]
前記第1のベクターが、コドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、それにより、前記プロモーター配列は、上流に前記（2つの）外因性ヌクレオチド配列が隣接し（すなわち、前記外因性ヌクレオチド配列の下流に配置され）、前記ＡＴＧコドンは、下流に組換え認識配列が隣接し（すなわち、組換え認識配列の上流に配置され）、前記第2のベクターは、上流に組換え認識配列が隣接しかつ下流に前記（2つの）外因性ヌクレオチド配列が隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む、本発明1001から1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
二重特異性抗体を産生する方法であって、
（ａ）本発明1001から1013のいずれかの方法で調製された組換え宿主細胞を提供することと、
（ｂ）（ａ）の組換え宿主細胞を培養し、前記細胞または培養培地から二重特異性抗体を回収することと
を含む、方法。

発明の態様の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、リコンビナーゼ媒介性カセット交換（ＲＭＣＥ）が、ＣＨＯ細胞における二重特異性抗体のコンビナトリアル発現ライブラリを作製するために使用でき、各細胞が正確に１種類の二重特異性分子を発現するという発見に基づく。

Ｉ．定義
抗体工学におけるノブ・イントゥー・ホール二量体化モジュールおよびそれらの使用は、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．、Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．Ｂ．、Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２巻、第１号、１９９６年２月、７３－７３（１）頁に記載されている。

抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変することができる。例えば、ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１、およびＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１に、いくつかの例を伴って詳細に記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変して、これら２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれを「ノブ」にすることができ、もう一方を「ホール」にすることができる。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１、Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）、収量を増やす。

（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｗは、「ノブ変異」または「変異ノブ」として表され、（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは、「ホール変異」または「変異ホール」として表される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った付番）。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）も、例えば、「ノブ変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ変異を導入（「ノブ－ｃｙｓ－変異」または「変異ノブ－ｃｙｓ」と表記）すること、および「ホール変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を導入（「ホール－ｃｙｓ－変異」または「変異ホール－ｃｙｓ」と表記）することにより、使用できる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った付番）。しかし、これは本発明の分子には存在しない。

ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に提供されている。

本明細書で使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）において説明されているＫａｂａｔ付番システムに従って付番され、本明細書では「Ｋａｂａｔに従った付番」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔ付番システム（６４７～６６０頁を参照）を、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス付番システム（６６１～７２３頁を参照）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、本明細書では、この場合には、「ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った付番」と称することによってさらに明確にしている）に使用する。

本発明を実施するための有用な方法および技法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第Ｉ～ＩＩＩ巻（１９９７）、Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ～ＩＩ巻（１９８５）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（編）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、第２版、ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ、Ｎ．Ｙ．、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。

組換えＤＮＡ技術の使用は、核酸の誘導体生成を可能にする。このような誘導体を、例えば、置換、改変、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的変異導入によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄを参照されたい）。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のこのような細胞および当業者に公知のその均等物などを含む。同様に、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」という用語を、本明細書では相互交換可能に使用することができる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語を、相互交換可能に使用することができることにも留意されたい。

「約」という用語は、その後に続く数値の±２０％の範囲を表す。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を表す。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を表す。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も包含する。

「完全長抗体」という用語は、天然型の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を表す。完全長抗体は、可変ドメインおよび定常ドメインをそれぞれ含む２つの完全長抗体軽鎖、および可変ドメイン、第１の定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の定常ドメインおよび第３の定常ドメインをそれぞれ含む２つの完全長抗体重鎖を含む。完全長抗体は、例えば、完全長抗体の１つ以上の鎖にコンジュゲートした追加のｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂなど、さらなるドメインを含み得るこれらのコンジュゲートはまた、完全長抗体という用語に含まれる。

用語「真核細胞」、「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互交換可能に使用され、１つ以上の外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞には、初代形質転換細胞、および継代の数にかかわらずそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、親細胞と完全には同一の核酸含量でなくてよく、変異を含んでもよい。形質転換された元々の細胞でスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体の子孫は、本明細書に含まれる。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基、およびヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。

「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、超可変的な配列（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）であり、および／または構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有するアミノ酸残基ストレッチを含む、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、重鎖可変ドメインＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、軽鎖可変ドメインＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。

ＨＶＲには、次のものが含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１－９１７）、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））、ならびに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、および９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組合せ。

別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従って付番されている。

「単離された」組成物は、自然環境の構成成分から分離されたものである。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動、ＣＥ－ＳＤＳ）またはクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、またはイオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって、９５％または９９％超の純度と決定されるまで精製される。例えば、抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。

「単離された」核酸は、自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞内に含まれる核酸分子であるが、該核酸分子は、染色体外に存在するか、または本来の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

「単離された」ポリヌクレオチドまたは抗体は、自然環境の構成成分から分離された、ポリペプチド分子または抗体分子を指す。

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体（すなわち、該集団を構成する個々の抗体は同一であり、および／または同一のエピトープを結合する）を指すが、例えば、自然発生の変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の製造の間に起こり得るバリアント抗体（このようなバリアントは概して、少量で存在する）は除く。異なる決定基（エピトープ）に対して指向した様々な抗体を通常含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するための、そのような方法および他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。

「単一特異性抗体」は、１つの抗原に対して単一の結合特異性を有する抗体を表す。単一特異性抗体を、完全長抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２）またはそれらの組合せ（例えば、完全長抗体と追加のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）として調製することができる。単一特異性抗体は、一価である必要はない。すなわち、単一特異性抗体は、１つの抗原に特異的に結合する２つ以上の結合部位を含んでもよい。例えば、天然型の抗体は、単一特異性であるが二価である。

「多重特異性抗体」は、同じ抗原または２つの異なる抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を表す。多重特異性抗体を、完全長抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二重特異性抗体）またはそれらの組合せ（例えば、完全長抗体と追加のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）として調製することができる。多重特異性抗体は、少なくとも二価である。すなわち、２つの抗原結合部位を含む。また、多重特異性抗体は、少なくとも二重特異性である。したがって、二価の二重特異性抗体は、多重特異性抗体の最も単純な形態である。２つ、３つ、またはそれ以上（例えば、４つ）の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体も報告されている（例えば、ＵＳ２００２／０００４５８７Ａ１を参照）。

「天然型の抗体」とは、様々な構造を持つ自然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型のＩｇＧ抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖がジスルフィド結合したものから構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向けて、各重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）とを有し、第１と第２の定常ドメインの間にヒンジ領域が位置する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向けて、各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、続いて定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）とを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）、ラムダ（λ）と呼ばれる２種類のいずれかに割り当てられ得る。

「組換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作成、または単離されるすべての（キメラ、ヒト化およびヒト）抗体を表す。これには、ＮＳ０、ＨＥＫ、ＢＨＫまたはＣＨＯ細胞などの宿主細胞（すなわち、該宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現プラスミドを使用して発現される抗体）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子もしくは抗体に対するトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体が含まれる。

「価数」という用語は、本出願で使用される場合、（抗体）分子中の具体的な結合部位数の存在を表す。したがって、「二価」、「四価」および「六価」という用語は、（抗体）分子中に、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、および６つの結合部位の存在を表す。本明細書で報告される本明細書で報告される二重特異性抗体は、１つの好ましい実施形態では、「二価」である。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体によって抗原の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む、類似の構造を有する（例えば、Ｋｉｎｄｔ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（２００７）、９１頁を参照されたい）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、該抗原に結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）８８０－８８７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２（１９９１）６２４－６２８を参照されたい）。

相互交換可能に使用することができる「ベクター」または「プラスミド」という用語は、本明細書で使用される場合、連結された別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。該用語は、自己複製核酸構造体としてのベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、動作可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。

「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片とその対応する同族の抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体Ｆａｂ（断片－抗原結合）において、少なくとも１つの重鎖ドメインが、対応する軽鎖ドメインによって置換されている、もしくはその逆、という点について、ドメイン配列が天然型の抗体の配列から逸脱していることを表す。ドメインクロスオーバーは、一般的に３種類あり、（ｉ）ＣＨ１およびＣＬドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列（またはＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する完全長抗体重鎖）がもたらされるもの、（ｉｉ）ＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされるもの、ならびに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）および完全なＶＨ－ＣＨ１重鎖断片のドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＬドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの（上述のすべてのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）がある。

本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、ならびに結果として生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨおよびＶＬが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、かつＶＨおよびＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８（２０１１）１１１８７－１１１９２において報告されている。このような抗体は、一般にＣｒｏｓｓＭａｂと呼ばれる。

本発明による方法で得られた細胞によって産生される多重特異性抗体はまた、一実施形態では、上記の項目（ｉ）で述べたＣＨ１およびＣＬドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目（ｉｉ）で述べたＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目（ｉｉｉ）で述べたＶＨ－ＣＨ１およびＶＬ－ＶＬドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも１つのＦａｂ断片を含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原に特異的に結合するＦａｂは、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う２つ以上のＦａｂが、多重特異性抗体に含まれる場合、Ｆａｂは、同じ抗原に特異的に結合する。

「結合する」という用語は、その標的への結合部位の結合を表す。例えば、それぞれの抗原への、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインを含む抗体結合部位の結合である。この結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定することができる。すなわち、「（抗原への）結合」という用語は、インビトロアッセイにおいて、抗原への抗体の結合を表す。一実施形態では、結合は、抗体を表面に結合させ、該抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、結合アッセイで測定される。結合は、例えば、１０^－８Ｍ以下の結合親和性（Ｋ_Ｄ）を意味し、いくつかの実施形態では、１０^－１３～１０^－８Ｍを意味し、いくつかの実施形態では、１０^－１３～１０^－９Ｍを意味する。「結合」という用語には、「特異的に結合する」という用語も含まれる。

例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイの１つの可能な実施形態では、抗原を表面に結合させ、抗体の結合、すなわちその結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。結合の親和性は、用語ｋ_ａ（会合定数：複合体を形成するための会合の速度定数）、ｋ_ｄ（解離定数、複合体の解離のための速度定数）、およびＫ_Ｄ（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）によって定義される。あるいは、ＳＰＲセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、参照の応答シグナルと直接比較することができる。

「結合部位」という用語は、標的への結合特異性を示す任意のタンパク質性エンティティを表す。これは、例えば、受容体、受容体リガンド、アンチカリン、アフィボディ、抗体などであり得る。したがって、本明細書で使用される場合、「結合部位」という用語は、第２のポリペプチドに特異的に結合することができるか、または特異的に結合されることができるポリペプチドを表す。一実施形態では、結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、抗体重鎖および抗体軽鎖可変ドメインのペア、受容体またはその機能的断片、受容体リガンドまたはその機能的断片、酵素またはその基質からなるポリペプチドの群から選択される。

抗体の場合、結合部位は、少なくとも３つのＨＶＲ（例えば、ＶＨＨの場合）または３～６つのＨＶＲ（例えば、天然に存在する、すなわち、ＶＨ／ＶＬペアを有する従来の抗体の場合）を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成している。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと同族の抗体軽鎖可変ドメインのペアに含まれる。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、領域ＦＲ１、ＨＶＲ１／ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２／ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＨＶＲ３／ＣＤＲ３、およびＦＲ４（免疫グロブリンフレームワーク）を含む。特に、重鎖可変ドメインのＨＶＲ３／ＣＤＲ３領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、標的への結合部位の結合を表し、一実施形態では、結合アッセイにおいてである。そのような結合アッセイは、結合イベントが検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。例えば、抗体を表面に結合させ、該抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、結合アッセイである。あるいは、ブリッジングＥＬＩＳＡを使用することができる。

抗体の「クラス」は、定常ドメインまたは定常領域、好ましくは重鎖が持つＦｃ領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２へとさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

「定常領域」という用語は、定常ドメイン、すなわち、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖の領域を表す。一実施形態では、ヒトＩｇＧ定常は、重鎖のＡｌａ１１８からカルボキシル末端に及ぶ。一方、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよく、または存在しなくてもよい。Ｆｃ領域は、２つの重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドで構成されており、ヒンジ領域のシステイン残基を介して互いに共有結合し、鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。

「Ｆｃ領域」という用語は、少なくともヒンジ領域の一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を表す。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ａｓｐ２２１またはＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。一方、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよく、または存在しなくてもよい。Ｆｃ領域は、２つの重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドで構成されており、ヒンジ領域のシステイン残基を介して互いに共有結合し、鎖間ジスルフィド結合を形成ことができる。

本明細書で報告される方法で産生される抗体は、Ｆｃ領域として、一実施形態では、ヒト起源に由来するＦｃ領域を含む。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒト定常領域のすべての部分を含む。抗体のＦｃ領域は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化、およびＦｃ受容体結合に直接関与している。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０、Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．およびＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８－３４４、Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４、Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１－１２１６８、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９－３２４、およびＥＰ０３０７４３４において記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った付番）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、およびＣ３活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑと結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて規定される。一実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、変異Ｓ２２８Ｐおよび／またはＬ２３５Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った付番）を含むヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一実施形態では、Ｆｃ領域は、変異Ｌ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａ、ならびに場合によっては、Ｐ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った付番）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。

本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の存在下で、ある遺伝子を保持する細胞が特異的に選択されるか、または特異的に排除されることを可能にする該遺伝子を表す。例えば、限定ではないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、それぞれの選択剤の存在下で積極的に選択されることを可能にすることができ（選択的培養条件）、形質転換されていない宿主細胞は、該選択的培養条件下で増殖または生存することができない。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞の選択を可能にすることができ、一方、ネガティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞を選択的に排除することを可能にすることができる。選択マーカーは、薬剤耐性を付与し、または宿主細胞の代謝的もしくは異化的欠陥を補うことができる。原核細胞では、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞の選択マーカーとして有用な耐性遺伝子には、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシンおよびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。さらなるマーカー遺伝子は、ＷＯ９２／０８７９６およびＷＯ９４／２８１４３に記載されている。

対応する選択剤の存在下での選択を容易にするだけでなく、選択マーカーは、通常は細胞中に存在しない分子、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅをコードする遺伝子を代わりに提供することもできる。そのような遺伝子を保有する細胞を、例えば、コードされたポリペプチドによって放射される蛍光の検出によって、この遺伝子を保有しない細胞と区別することができる。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の構成要素の並置を指し、該構成要素は、意図される様式で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーがコード配列の転写を調節するように作用する場合、該プロモーターおよび／またはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接し、隣接している。特定の実施形態では、例えば、分泌リーダーおよびポリペプチドなどの２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、該配列は、近接し、隣接し、そして同じリーディングフレーム内にある。特定の実施形態では、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置し、それに隣接し得る。特定の実施形態では、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの構成要素は、隣接していなくても、作動可能に連結され得る。エンハンサーが、コード配列の転写を増加させる場合、該エンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されエンハンサーは、コード配列の上流、その中、または下流に位置し得、またコード配列のプロモーターから相当な距離を置いて位置し得る。作動可能な連結は、当技術分野で公知の組換え法によって、例えば、ＰＣＲ法を使用して、および／または都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成することができる。都合の良い制限部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、慣行に従って使用することができる。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が、５’末端に非依存的な方法により内部位置でＯＲＦの翻訳を開始できる場合、該ＩＲＥＳは、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている。

本明細書での「抗体」という用語は、最も広義に使用され、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体－抗体断片－融合体を含む様々な抗体構造を包含するが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的な断片である。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「相同配列」という用語は、配列のアラインメントによって判定されたとき、有意に配列類似性を共有する配列を指す。例えば、２つの配列は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％相同であり得る。アラインメントは、以下に限定されないが、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＨＭＭＥを含むアルゴリズムおよびコンピュータプログラムによって実行され、配列を比較し、配列の長さ、配列の同一性および類似性、ならびに配列の不一致およびギャップの存在および長さなどの因子に基づいて、一致の統計的有意性を計算する。相同配列は、ＤＮＡ配列とタンパク質配列の両方を指し得る。相同性は、核酸配列またはタンパク質全体に存在する必要はないが、文脈で示されている場合は、その一部にのみに存在することもできる。

本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端のいずれか、または両端に位置することを指す。隣接するヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列に隣接するか、または第２のヌクレオチド配列から規定の距離にあり得る。隣接するヌクレオチド配列の長さに、具体的な制限はない。例えば、隣接配列は、数塩基対または数千塩基対であり得る。

本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来せず、従来のＤＮＡ送達方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質転換法によって宿主細胞に導入されるものを示す。「内因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来することを指す。「外因性」ヌクレオチド配列は、該「外因性」配列が、例えば、組換えＤＮＡ技術を介して宿主細胞に導入される場合、塩基組成が同一な「内因性」カウンターパートを持ち得る。

ＩＩ．組成物および方法
従来の細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的の配列（ＳＯＩ）を保持するプラスミドのランダム組込み（ＲＩ）に依存している。

抗体は通常、真核細胞において、安定または一過性の組換え発現によって産生される。一過性トランスフェクションを使用すると、多数の異なる二重特異性抗体を発現させるために、多数の個別トランスフェクションを実行する必要がある。このようなトランスフェクションのそれぞれは、プラスミドのクローン調製物を含み、後に続くスクリーニング工程への適合性を確保するために、上清に１種類の二重特異性抗体のみが含まれるように保証する。コードする核酸のランダム組込みのため、安定したトランスフェクションアプローチに従う場合も同様である。

一般に、プラスミドがランダムなアプローチでトランスフェクトされた場合、いくつかのプラスミドが宿主細胞ゲノムに組み込まれる。その結果、プラスミドの混合物でトランスフェクトされた場合、トランスフェクトされた細胞のほとんどは、複数種の二重特異性抗体を分泌する。これは、複数コピーの組込みのため、１つの二重特異性抗体をコードする遺伝子のすべてが、同じプラスミド上に配置されている場合でも発生する。

したがって、３つ以上のポリペプチドを含む抗体フォーマットでは、サブユニットのランダムな組合せの可能性と生成物混合物の複雑さが高く、スクリーニングがほぼ不可能になる。これは、ＣｒｏｓｓＭａｂなどの操作された抗体フォーマットにも当てはまる（図１を参照）。

したがって、ＲＩに基づくプロセスは予測不可能であり、さらに大きな労力が必要となる。そのため、高生産性のＲＩクローンを特定するには多大な労力が必要となる。

従来のＲＩ ＣＬＤとは異なり、標的化組込み（ＴＩ）ＣＬＤは、規定のコピー数（通常は１～２コピー）で、ＣＨＯゲノムの所定の「ホットスポット」に導入遺伝子を導入する。コピー数が少なく、かつ事前にテストされた組込み部位を考えると、ＴＩ細胞株はＲＩ株と比較して安定性が高いはずである。さらに、選択的マーカーは適切なＴＩを持つ細胞の選択にのみ使用され、高レベルの導入遺伝子発現を持つ細胞の選択には使用されないため、変異原性の低いマーカーを適用して、配列バリアント（ＳＶ）の可能性を最小限に抑えることができる。該ＳＶは、部分的に、メトトレキサート（ＭＴＸ）やメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）などの選択剤の変異原性によるものである。

本発明は、ＴＩ法を使用して、単一の二重特異性抗体を発現する、すなわち、第１の軽鎖、第２の軽鎖、第１の重鎖および第２の重鎖のそれぞれの１つの発現カセットのみを含む、組換え細胞株をスクリーニングおよび同定する。本発明は、２プラスミドリコンビナーゼ媒介性カセット交換（ＲＭＣＥ）を使用して、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え細胞を作製する、新規の方法を提供する。改善は、とりわけ、ＲＩ法と比較してライブラリの作製に必要な時間が短縮されること、およびライブラリの細胞が単一のＴＩ遺伝子座に、二重特異性抗体をコードする異なる配列を正確に単一のコピーで含むという事実にある。本発明による方法は、抗体軽鎖の１つとそれに対応する重鎖との間のドメイン交換を含む、二重特異性抗体に対して特に有用である。本発明の方法はまた、様々な組込みプラスミドのプールを使用した１回のトランスフェクションで、異なる発現カセットの様々な配列を生成することができるという点で特に有用である。これにより、提供される細胞のライブラリは、様々でランダムな発現カセットの組合せを有するが、各鎖に対しては１つだけである。その後、ライブラリの細胞を、最高の生成物収量と品質のためにスクリーニングできる。

本開示の主題は、組換え二重特異性抗体を発現する組換え細胞株をスクリーニングするための方法を提供するだけでなく、有利な副産物プロファイルを持ち二重特異性抗体の高い生産性を有する組換え細胞株も提供する。

２プラスミドＲＭＣＥ法の利点としては、生産性の向上、および同じＴＩ遺伝子座から複数のポリペプチドの様々な組合せを共発現する柔軟性が挙げられる。

本明細書で使用される２プラスミドＲＭＣＥ戦略は、同じＴＩ遺伝子座において、４つの配列（すなわち、２つの異なる抗体重鎖（ＨＣ）および２つの異なる抗体軽鎖（ＬＣ））のコンビナトリアル挿入を可能にする。本明細書で使用される２プラスミドＲＭＣＥ法を用いると、カセット交換中に異なる半抗体を組み合わせることが可能であり、それにより、異なる半抗体の組合せに基づく多様性のある、二重特異性抗体のライブラリを提供することが可能である。したがって、４つの配列を同時に標的とする能力により、２プラスミドＲＭＣＥは、ＨＣ／ＬＣペアの組合せの調節を可能にし、様々な二重特異性抗体を発現する細胞のライブラリを提供する。付随して、複数の鎖を持つ複雑な分子の発現の生産性が向上する。

ＩＩ．ａ リコンビナーゼ媒介性カセット交換
標的化組込みは、外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれることを可能にする。特定の実施形態では、標的化組込みは、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。

「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列であり、リコンビナーゼ媒介性組換えイベントに必要かつ十分である。ＲＲＳを使用して、ヌクレオチド配列内で組換えイベントが発生する位置を定義できる。

特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される。複数のＲＲＳを選択する必要がある場合、同一でないＲＲＳが選択されている限り、各配列の選択は他の配列に依存する。

特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。

特定の実施形態では、ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である場合、宿主細胞は、組換えを実行するためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。特定の実施形態では、ＲＲＳがＦＲＴ部位である場合、宿主細胞は、組換えを実行するためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。特定の実施形態では、ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰまたはＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である場合、宿主細胞は、組換えを実行するためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。特定の実施形態では、ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰまたはφＣ３１ ａｔｔＢ部位である場合、宿主細胞は、組換えを実施するためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。リコンビナーゼを、該酵素のコード配列を含む発現ベクターを使用して、宿主細胞に導入することができる。

Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系で広く使用されている。Ｃｒｅは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内および分子間組換えの両方を媒介できる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐの逆方向反復に挟まれた８ｂｐの非パリンドロームコア領域で構成されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのコア領域内の組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介性組換えは高効率で起こり、他の宿主因子を必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Ｃｒｅ媒介性組換えにより、２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列が共有結合で閉じた円として切り出される。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で逆方向の位置に配置されている場合、Ｃｒｅ媒介性組換えにより、２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の方向が反転する。ＬｏｘＰ配列を異なる染色体上に配置して、異なる染色体間の組換えを促進することもできる。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上にあり、１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅ媒介性組換えにより、環状ＤＮＡ配列の組込みをもたらす。

特定の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、変異型ＬｏｘＰ配列である。変異型ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ媒介性組込みまたは置換の効率を高めるために開発された。特定の実施形態では、変異型ＬｏｘＰ配列は、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、およびＬｏｘ６６配列からなる群から選択される。例えば、Ｌｏｘ７１配列では、左側の１３ｂｐの反復で５ｂｐが変異している。Ｌｏｘ６６配列では、右側の１３のｂｐ反復で５ｂｐが変異している。野生型と変異型の両方のＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ依存性組換えを媒介することができる。

「一致するＲＲＳ」という用語は、２つのＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態では、２つの一致するＲＲＳは同じである。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは変異型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは変異型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、２つの一致するＲＲＳは異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、第１の一致するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の一致するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列であり、第２の一致するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。

ＩＩ．ｂ 例示的な標的化組込み宿主細胞株
適切なＴＩ宿主細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の特定の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列、すなわち「ランディング部位」を含む。

本開示の主題は、外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みに適した宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞、すなわち、ＴＩ宿主細胞のゲノム上の組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む。

特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞である。特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である。特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。

特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、該外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。

特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、第１、第２および第３のＲＲＳ、ならびに第１および第２のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含み、第３のＲＲＳは、第１または第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、第２の選択マーカーをさらに含み、第１および第２の選択マーカーは異なる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、第３の選択マーカーおよび内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み得、該ＩＲＥＳは、第３の選択マーカーに作動可能に連結されている。第３の選択マーカーは、第１または第２の選択マーカーとは異なり得る。

選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシンおよびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。選択マーカーはまた、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー、合成ＧＦＰマーカー、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー、強化型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）マーカー、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）マーカー、ｍＰｌｕｍマーカー、ｍＣｈｅｒｒｙマーカー、ｔｄＴｏｍａｔｏマーカー、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙマーカー、Ｊ－ｒｅｄマーカー、ＤｓＲｅｄ－ｍｏｎｏｍｅｒマーカー、ｍＯｒａｎｇｅマーカー、ｍＫＯマーカー、ｍＣｉｔｒｉｎｅマーカー、Ｖｅｎｕｓマーカー、ＹＰｅｔマーカー、Ｅｍｅｒａｌｄ６マーカー、ＣｙＰｅｔマーカー、ｍＣＦＰｍマーカー、Ｃｅｒｕｌｅａｎマーカー、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択され得る。

特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、第１、第２、および第３のＲＲＳ、第１および第３のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む。

「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、宿主細胞ゲノム内の核酸配列を含む。特定の実施形態では、組込み部位は、宿主細胞ゲノム上の２つの隣接するヌクレオチドの間にある。特定の実施形態では、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施形態では、組込み部位は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置する。特定の実施形態では、組込み部位は、ＴＩ宿主細胞の内因性遺伝子の中にある。

外因性ヌクレオチド配列は、宿主細胞に由来しないが、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質転換法などの従来のＤＮＡ送達方法によって、宿主細胞に導入することができるヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞のゲノム中の１つ以上の組込み部位で組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の１つ以上の組込み部位で組み込まれる。

特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、該ＲＲＳは、リコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１および第２のＲＲＳは同じであり、第３のＲＲＳは、第１または第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、３つのＲＲＳすべてが異なる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、複数のＲＲＳを含む。特定の実施形態では、ＲＲＳの総数のサブセットは同じであり、ＲＲＳの総数のサブセットは異なる。特定の実施形態では、ＲＲＳ（複数可）は、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。

特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１、第２および第３のＲＲＳ、ならびに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接し、すなわち、第１のＲＲＳは、選択マーカーの５’上流に位置し、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’下流に位置する。特定の実施形態では、第１のＲＲＳは、選択マーカーの５’末端に隣接し、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端に隣接する。

特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接するＲＲＳは異なる。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態では、配列決定されたＬｏｘＰ Ｌ３は、選択マーカーの５’に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカーの３’に位置する。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、変異型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは同じ方向に配置される。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは両方とも順方向または逆方向にある。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは反対方向に配置される。

特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに挟まれた２つの選択マーカーを含み、第１の選択マーカーは、第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態では、２つの選択マーカーは両方とも、グルタミンシンテターゼ選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、およびピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカーおよびＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシンおよびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、グルタミンシンテターゼ選択マーカーであり、第２の選択マーカーは、ＧＦＰマーカーである。特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは異なる。

特定の実施形態では、選択マーカーは、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結されている。

特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１および第２のＲＲＳは同じであり、第３のＲＲＳは、第１または第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、３つのＲＲＳすべてが異なる。

ＩＩ．ｃ 本発明を実施するのに適した例示的なベクター
上で概説した「１ベクターＲＭＣＥ」のほかに、新しい「２ベクターＲＭＣＥ」を実行することにより、標的化組込みおよびランダム化を同時に行うことができる。

本発明による方法では、「２ベクターＲＭＣＥ」戦略を用いている。例えば、限定ではないが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在し、一方、第１のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１および第３のＲＲＳに一致する２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第３および第２のＲＲＳに一致する２つのＲＲＳを含むというアレンジの、３つのＲＲＳを含む。２ベクターＲＭＣＥ戦略の例を図２に示す。このような２ベクターＲＭＣＥ戦略では、ＲＲＳの各ペア間に適切な数のＳＯＩを組み込むことにより、４つのＳＯＩを導入できる。

２プラスミドＲＭＣＥ戦略では、３つのＲＲＳ部位を使用して、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行する（図２）。したがって、ＴＩ宿主のランディングパッドは、ＲＲＳ１部位またはＲＲＳ２部位とのクロスアクティビティがない第３のＲＲＳ部位（ＲＲＳ３）を含む。標的とされる２つの発現プラスミドは、効率的な標的化のために、同じ
隣接するＲＲＳ部位、ＲＲＳ１とＲＲＳ３に挟まれた一方の発現プラスミド（フロント）、および、ＲＲＳ３とＲＲＳ２による他方の発現プラスミド（バック）を必要とする。２プラスミドＲＭＣＥの効率は低いと予想されるため、まれなＲＭＣＥ固有のイベントを強化するには、厳密な選択スキームが必要になる。２プラスミドＲＭＣＥには、２つの選択マーカーが必要である。１つの選択マーカー発現カセットは、２つの部分に分割された。フロントプラスミドは、プロモーターと、それに続く開始コドンおよびＲＲＳ３配列を含む。バックプラスミドは、ＡＴＧ開始を差し引いた、選択マーカーのコード領域のＮ末端に融合したＲＲＳ３配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列の間に追加のヌクレオチドを挿入する必要があり得る。２つのプラスミドが正しく標的化された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、細胞が選択に対して耐性を示す状態になる。図２は、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を示す模式図である。

１ベクターＲＭＣＥと２ベクターＲＭＣＥはいずれも、１つ以上のドナーＤＮＡ分子を宿主細胞ゲノムの所定の部位に一方向に組み込み、ドナーＤＮＡ上に存在するＤＮＡカセットを、組込み部位が存在する宿主ゲノム上のＤＮＡカセットと正確に交換する。ＤＮＡカセットは、少なくとも１つの選択マーカー（ただし、特定の２ベクターＲＭＣＥの例では、本明細書で概説するように「分割選択マーカー」を使用できる）、および／または少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳによって特徴付けられる。ＲＭＣＥは、リコンビナーゼによって触媒される、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間の二重組換えクロスオーバーイベントを伴う。ＲＭＣＥは、ＳＯＩまたは選択マーカーのコピーを宿主細胞ゲノムの所定の遺伝子座に導入するように設計されている。たった１回のクロスオーバーイベントを伴う組換えとは異なり、ＲＭＣＥは、原核生物のベクター配列が宿主細胞のゲノムに導入されないように実行できるため、宿主の免疫または防御機構の望ましくないトリガーを低減および／または防止する。ＲＭＣＥの手順を、複数のＤＮＡカセットで繰り返すことができる。

特定の実施形態では、標的化組込みは、２つのＲＭＣＥによって達成され、少なくとも外因性ＳＯＩまたは２つの異種特異的ＲＲＳに挟まれた少なくとも１つの選択マーカーをそれぞれ含む、２つの異なるＤＮＡカセットの両方を、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込む。特定の実施形態では、標的化組込みは、複数のＲＭＣＥによって達成され、複数のベクターからのＤＮＡカセットは、それぞれが少なくとも外因性ＳＯＩまたは２つの異種特異的ＲＲＳに挟まれた少なくとも１つの選択マーカーを含み、該ＤＮＡカセットのすべてが宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、選択マーカーは、両方のＲＭＣＥの組込みが選択マーカーの発現を可能にするように、第１のベクター上で部分的にコードされ、第２のベクター上で部分的にコードされ得る。このようなシステムの例を図２に示す。

特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介性組換えを介した標的化組込みは、原核生物ベクターからの配列を含まない宿主細胞ゲノムの１つ以上の所定の組込み部位に組み込まれる、選択マーカーまたは１つ以上の外因性ＳＯＩをもたらす。

ＩＩ．ｄ 本発明による方法の実施形態
上記のような外因性核酸（「ランディング部位」）を含む任意の既知または将来のＴＩ宿主は、本発明を実施するのに適している。

以下において、本発明による方法は、ＣＨＯ細胞株を用いて概説される。これは、本発明を例示するためにのみ提示されており、いかなる方法であっても限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲で設定される。

１つの好ましい実施形態では、ＴＩ宿主細胞株は、ＣＨＯ細胞である。

本発明による方法での使用に適した例示的なＴＩ宿主は、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性ＤＮＡ組換えのための３つの異種特異的ｌｏｘＰ部位、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓおよびＬ２を有するランディングカセットを保有するＣＨＯ細胞株である（背景については、Ｗｏｎｇら、２００５を参照されたい）。この構成により、２つのプラスミド、Ｌ３およびＬｏｘＦａｓ部位を持つフロントプラスミド、ならびにＬｏｘＦａｓおよびＬ２部位を保有するバックプラスミドの同時組込みが可能になる。選択可能マーカー遺伝子の機能要素は、両方のプラスミドに分布している。プロモーターおよび開始コドンは、フロントプラスミドに位置し、一方、コード領域およびポリＡシグナルは、バックプラスミドに位置する。両方のプラスミドのＣｒｅ媒介性組込みのみが、選択可能マーカー３に対する耐性を確実に誘導する。外因性核酸はまた、バイシストロンな選択可能マーカー１－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ耐性遺伝子を含み、ポジティブ選択によってランディングカセットを安定させるだけでなく、トランスフェクションおよびＣｒｅ組換え後にカセットがないものを選択（ネガティブ選択）できる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、カセット交換のモニターに役立つ。

２つの抗原ＡおよびＢに対するＣｒｏｓｓＭＡｂの発現のために、交差軽鎖（ｘＬＣ）および交差重鎖（ｘＨＣｋｎｏｂ）をコードする遺伝子がフロントプラスミドに配置される。両方の鎖が一緒になって、抗原Ａに対するＦａｂ断片を形成する。抗原Ｂに対してＦａｂ断片を形成する非交差軽鎖（ＬＣ）および非交差重鎖（ＨＣｈｏｌｅ）をコードする遺伝子は、バックプラスミドに配置される。

組換えＣＨＯ細胞のライブラリを作製するために、１種類のＣｒｏｓｓＭＡｂを発現する各細胞、抗原Ａに対する抗体鎖をコードするフロントプラスミドのライブラリ、および抗原Ｂに対する抗体鎖をコードするバックプラスミドのライブラリを混合し、ＴＩ宿主にトランスフェクトする（図３）。Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介されるプラスミドＡとＢは、標的遺伝子座でランダムにペアになる。続いて、安定的にトランスフェクトされた細胞のプールが、選択可能マーカー２（ポジティブ選択）および３（ネガティブ選択）で選択される。

この得られたＣＨＯ細胞の発現ライブラリは、限界希釈、細胞ソーティング、または細胞プリンティングなどの方法による単一細胞クローニングに供される。得られた単一細胞またはそれらのクローン子孫を、組換え二重特異性抗体の所望の機能についてスクリーニングすることができる。

組み込まれたプラスミドの同一性を分析するために、ＬＣ、ｘＬＣ、ＨＣｈｏｌｅおよびｘＨＣｋｎｏｂの抗体コード領域を、プライマーＰ＿１およびＰ＿２（配列番号０１および０２）を使用するＰＣＲによって同時に増幅した。Ｐ＿１は、これらの遺伝子の５’非翻訳領域に結合するが、Ｐ＿２は、３’非翻訳領域に結合する。得られたＰＣＲ産物の混合物を、２つの遺伝子に特異的なプライマーを使用したサンガーシーケンシングによって分析した。プライマーＰ＿３（配列番号０３）は、ｘＨＣｋｎｏｂ遺伝子の定常部分に結合し、フロントプラスミドのＶＬ領域の配列決定を可能にする。プライマーＰ＿４（配列番号０４）は、ＬＣ遺伝子の定常部分に結合し、バックプラスミドのＶＬ領域の配列決定を可能にする。

配列決定された３９個のクローンのうち３７個には、１種類のフロントプラスミドおよび１種類のバックプラスミドが含まれた（以下の表を参照）。１つのクローン（Ｐ２Ｆ１０）には、両方のバックプラスミドが含まれていた。クローンＰ２Ａ０９では、フロントプラスミドが検出されなかった。２つの使用されたバックプラスミドＢ＿１とＢ＿２のハイブリッド配列を含むクローンＰ２Ｃ１０のバックプラスミドを除いて、すべての配列は、参照配列の１つと正確に一致した。分析されたクローンの数が少ないにしては、トランスフェクトされたすべてのプラスミド（図４）および予想されるフロントプラスミドとバックプラスミドのすべての組合せが同様の頻度で発生した（図５）。

＊Ｂ＿１とＢ＿２のハイブリッド

得られたクローンにおける異なる発現プラスミドの表現／発生が、発現されたタンパク質（抗体鎖）の配列とほぼ無関係であることは、非常に驚くべきことであり、明確に指摘しなければならない。半抗体の好ましい発現または偏った発現は、一つも検出できなかった。これは、スクリーニング用というライブラリの使用目的を考慮すると重要な結果である。例えば、１つの種がこれよりも頻繁に発生し、スクリーニング結果に悪影響を与える場合。

本開示は、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１および第２のＲＲＳ、ならびに第１と第２のＲＲＳの間に位置する第３のＲＲＳを含み、すべてのＲＲＳは異なる、提供すること、
ｂ）ａ）で提供される細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１および第３のＲＲＳに一致し、２つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳをそれぞれ含む、第１のベクターのライブラリ、ならびに該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２および第３のＲＲＳに一致し、少なくとも２つのさらなる外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳをそれぞれ含む、第２のベクターのライブラリを導入することであり、ここで、該４つのＳＯＩの１つは、二重特異性抗体の第１の軽鎖、第２の軽鎖、第１の重鎖、および第２の重鎖をコードする、導入すること、
ｃ）ｉ）ｂ）の第１および第２のベクターのライブラリと同時に、またはｉｉ）その後、順次、１つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該１つ以上のリコンビナーゼは、第１および第２のベクターのＲＲＳを認識し、該１つ以上のリコンビナーゼはＲＲＳを認識し、２つのＲＭＣＥを実行する、導入すること、ならびに
ｄ）第２の選択マーカーを発現し、二重特異性抗体を分泌するＴＩ細胞を選択すること
を含み、それにより、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製する、方法を提供する。

一実施形態では、第１および第２のベクターのそれぞれは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含む。

一実施形態では、第１および第２のベクターのそれぞれは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび同族の抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含む。

一実施形態では、第１または第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含み、該抗体軽鎖をコードするＳＯＩは、該抗体重鎖をコードするＳＯＩの上流（５’）に位置し、他方のベクターは、該抗体軽鎖をコードするＳＯＩの上流（５’）に位置する該抗体重鎖をコードするＳＯＩを含む。

一実施形態では、第１および第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含み、該抗体軽鎖をコードするＳＯＩは、該抗体重鎖をコードするＳＯＩの上流（５’）に位置する。

一実施形態では、第１および第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含み、該抗体軽鎖をコードするＳＯＩの上流（５’）に位置する該抗体重鎖をコードするＳＯＩ。

一実施形態では、第１または第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有する。

一実施形態では、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有する。

一実施形態では、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有し、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードするＳＯＩが、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードするＳＯＩの上流（５’）に位置する。

一実施形態では、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有し、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードするＳＯＩが、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードするＳＯＩの上流（５’）に位置し、第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含み、該抗体軽鎖をコードするＳＯＩが、該抗体重鎖をコードするＳＯＩの上流（５’）に位置する。

本開示は、ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１および第２のＲＲＳ、ならびに第１と第２のＲＲＳの間に位置する第３のＲＲＳを含み、すべてのＲＲＳは異なる、提供すること、
ｂ）ａ）で提供される細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１および第３のＲＲＳに一致し、２つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳをそれぞれ含む第１のベクター、ならびに該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２および第３のＲＲＳに一致し、少なくとも２つのさらなる外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳをそれぞれ含む第２のベクターを導入することであり、ここで、第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有し、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードするＳＯＩは、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードするＳＯＩの上流（５’）に位置し、第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つのＳＯＩおよび抗体重鎖をコードする１つのＳＯＩを含み、該抗体軽鎖をコードするＳＯＩは、該抗体重鎖をコードするＳＯＩの上流（５’）に位置する、導入すること、
ｃ）ｉ）ｂ）の第１および第２のベクターと同時に、またはｉｉ）その後、順次、１つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該１つ以上のリコンビナーゼは、第１および第２のベクターのＲＲＳを認識する、導入すること、ならびに
ｄ）第２の選択マーカーを発現し、二重特異性抗体を分泌するＴＩ細胞を選択すること
を含み、それにより、ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製する、方法を提供する。

一実施形態では、第１のベクターは、コドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、それにより、該プロモーター配列は、上流に該（２つの）外因性ヌクレオチド配列が隣接し（すなわち、該外因性ヌクレオチド配列の下流に配置され）、該ＡＴＧコドンは、下流に組換え認識配列が隣接し（すなわち、組換え認識配列の上流に配置され）、第２のベクターは、上流に組換え認識配列が隣接し、下流に該（２つの）外因性ヌクレオチド配列が隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。

本開示は、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１および第２のＲＲＳ、ならびに第１と第２のＲＲＳの間に位置する第３のＲＲＳを含む第１のＤＮＡカセットを含み、３つのＲＲＳはすべて異なる、提供すること、
ｂ）ａ）で提供される細胞に、第２のＤＮＡカセットをそれぞれ含む第１のベクターのライブラリであり、ここで、第２のＤＮＡカセットは、第１のＤＮＡカセットの第１および第３のＲＲＳに一致し、２つの外因性ＳＯＩに隣接する２つの（異種特異的）ＲＲＳおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーを含む、ライブラリ、および第３のＤＮＡカセットをそれぞれ含む第２のベクターのライブラリであり、ここで、第３のＤＮＡカセットは、第１のＤＮＡカセットの第２および第３のＲＲＳに一致し、少なくとも２つのさらなる外因性ＳＯＩに隣接する２つの（異種特異的）ＲＲＳを含み、該４つのＳＯＩの１つは、二重特異性抗体の第１の軽鎖、第２の軽鎖、第１の重鎖、または第２の重鎖をコードする、ライブラリを導入すること、
ｃ）ｉ）ｂ）の第１および第２のベクターのライブラリと同時に、またはｉｉ）その後、順次、１つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該１つ以上のリコンビナーゼは、ＲＲＳを認識し、２つのＲＭＣＥを実行する、導入すること、ならびに
ｄ）第２の選択マーカーを発現し、二重特異性抗体を分泌するＴＩ細胞を選択すること
を含み、それにより、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製する、方法を提供する。

一実施形態では、第１のベクターは、コドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、それにより、該プロモーター配列は、上流に該（２つの）外因性ヌクレオチド配列が隣接し（すなわち、該外因性ヌクレオチド配列の下流に配置され）、該ＡＴＧコドンは、下流に組換え認識配列が隣接し（すなわち、組換え認識配列の上流に配置され）、第２のベクターは、上流に組換え認識配列が隣接し、下流に該（２つの）外因性ヌクレオチド配列が隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。

本発明による方法で提供される組換え宿主細胞はまた、本発明の一態様である。本発明によるそのような組換え宿主細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、
該外因性ヌクレオチド配列は、以下の要素：
第１、第２および第３の組換え認識配列、
２つの選択可能マーカー、ならびに
第１～第４の発現カセットを含み、
該要素の５’から３’への配列は、
ＲＲＳ１－第１のＥＣ－第２のＥＣ－ＲＲＳ３－ＳＭ－第３のＥＣ－第４のＥＣ－ＲＲＳ２－ＳＭであり、
ここで、ＲＲＳは組換え認識配列、
ＥＣは発現カセット、
ＳＭは選択マーカーである。

ＲＲＳ３と第３のＥＣの間の選択可能マーカーは、ＳＭ３である。

一実施形態では、発現カセットのそれぞれは、５’から３’の方向に、プロモーター、目的の遺伝子、およびポリＡ部位、場合によっては、ターミネーター配列を含む。

本発明のすべての態様の一実施形態では、
ｉ）第１の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする核酸、およびポリＡ部位、場合によっては、ターミネーター配列を含み、
ｉｉ）第２の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする核酸、およびポリＡ部位、場合によっては、ターミネーター配列を含み、
ｉｉｉ）第３の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸（ドメインクロスオーバーなし）、およびポリＡ部位、場合によっては、ターミネーター配列を含み、
ｉｖ）第４の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、抗体重鎖をコードする核酸（ドメインクロスオーバーなし）、およびポリＡ部位、場合によっては、ターミネーター配列を含む。

本発明のすべての態様の一実施形態では、プロモーターは、イントロンＡを有するヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリＡ部位は、ＢＧＨポリＡ部位であり、ターミネーターは、ｈＧＴターミネーターである。

本発明のすべての態様の一実施形態では、ドメインクロスオーバーは、ＣＨ１－ＣＬクロスオーバーまたはＶＨ－ＶＬクロスオーバーまたはＶＨ／ＣＨ１－ＶＬ／ＣＬクロスオーバーである。

一実施形態では、ドメインクロスオーバーを伴う軽鎖およびドメインクロスオーバーを伴う重鎖の可変ドメインは、第１の抗原に特異的に結合する結合部位を形成し、ドメインクロスオーバーを伴わない軽鎖およびドメインクロスオーバーを伴わない重鎖の可変ドメインは、第２の抗原に特異的に結合する結合部位を形成する。一実施形態では、第１の抗原は、抗原上の第１のエピトープであり、第２の抗原は、第１のエピトープとは異なる、該抗原上の第２のエピトープである。一実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は、異なる抗原（ポリペプチド）である。

本開示の主題はまた、目的のポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）本発明による、または本明細書に記載の方法で調製される組換え（宿主）細胞を提供することと、
ｂ）ＳＯＩを発現し、細胞または培養培地から目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下で、ａ）の組換え（宿主）細胞を培養することとを含む、方法に関する。

一実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。すべてが上記で特定された７つの遺伝子座を含む場合、任意のＣＨＯ細胞を宿主として使用することができる。

得られた組換え（宿主）細胞は、二重特異性抗体の組換え体産生のための方法で使用することができ、それにより、目的の二重特異性抗体の発現が容易になる。

特定の実施形態では、本開示は、抗体軽鎖および抗体重鎖の第１および第２のペアを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、
ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１および第２のＲＲＳ、ならびに第１と第２のＲＲＳの間に位置する第３のＲＲＳを含み、すべてのＲＲＳは異なる、提供すること、
ｂ）ａ）で提供される細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１および第３のＲＲＳに一致し、抗体軽鎖および抗体重鎖の第１のペアをコードする外因性ＳＯＩに少なくとも隣接し、少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクターを導入すること、
ｃ）ａ）で提供されるか、ｂ）で得られる細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２および第３のＲＲＳに一致し、抗体軽鎖および抗体重鎖の第２のペアをコードする外因性ＳＯＩに少なくとも隣接する２つのＲＲＳを含む第２のベクターを導入すること、
ｄ）１つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該１つ以上のリコンビナーゼは、ｂ）またはｃ）で得られた細胞へのＲＲＳを認識する、導入すること、ならびに
ｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択して、それにより、目的の第１および第２のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離すること
を含む、方法を提供する。

上記は二重特異性抗体について提示されているが、目的の配列は、本明細書に列挙した実施例を含むが、これらに限定されず、任意の目的のポリペプチドをコードすることができる。ＳＯＩは、同じでもよく、異なってもよい。例えば、ＳＯＩには、抗体の両方の鎖のコード配列を含めることができる。

特定の実施形態では、作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、ランダムに組み込まれたＳＯＩと比較して、ＳＯＩの発現レベルを増加させる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ＳＯＩは、ランダムに組み込まれたＳＯＩよりも約２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、または１０倍高く発現される。

特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、および抗体軽鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１の抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、第２の抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、および抗体軽鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１の抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、第２の抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、第１の抗体軽鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、および第２の抗体軽鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩを含む。特定の実施形態では、重鎖および軽鎖配列をコードする個々のＳＯＩは、例えば、単一の組込み部位に存在する単一の外因性核酸配列、または単一の組込み部位に存在する複数の外因性核酸配列に組み込まれ得る。

特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳおよび４つの外因性ＳＯＩを含み、第３のＲＲＳは、第１と第２のＲＲＳの間に位置する。特定の実施形態では、第１および第２のＳＯＩは、第１と第３のＲＲＳの間に位置し、第３および第４のＳＯＩは、第３および第２のＲＲＳの間に位置する。特定の実施形態では、第１および第２のＳＯＩは異なる。特定の実施形態では、第１および第２のＲＲＳは同じであり、第３のＲＲＳは、第１または第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、３つのＲＲＳすべてが異なる。特定の実施形態では、第１のＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３部位であり、第２のＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ部位であり、第３のＲＲＳはＬｏｘＦａｓ部位である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、４つの外因性ＳＯＩ、および１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１および第２のＳＯＩならびに選択マーカーは、第１と第３のＲＲＳの間に位置し、第３および第４のＳＯＩは、第３および第２のＲＲＳの間に位置する。

本開示の組換え宿主細胞を、任意の目的の分子、特に二重特異性抗体の調節された発現のために使用することができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を、ポリペプチド、例えば哺乳動物のポリペプチドの発現のために使用することができる。このようなポリペプチドの非限定的な例としては、ホルモン、受容体、融合タンパク質、制御因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、および抗体が挙げられる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を、構成的にまたは調節して、目的の治療用タンパク質または分子を発現させながら、シャペロン、タンパク質修飾酵素、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡまたは他のタンパク質もしくはペプチド発現のために使用することができる。

特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、二重特異性、三重特異性、または多重特異性ポリペプチドであり、例えば、二重特異性抗体、特に１つの軽鎖－重鎖ペアでドメインクロスオーバーを伴う完全長の４鎖二重特異性抗体である。

本開示の組換え宿主細胞は、現在の細胞培養法で使用されている非ＴＩ細胞と比較して、より短い時間枠で、目的の分子、例えば、特にドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を、大量に産生するのに用いることができる。特定の実施形態では、本開示の組換え宿主細胞を、現在の細胞培養法で使用される非ＴＩ細胞と比較して、目的の分子の品質を改善するために用いることができる。

以下の実施例および図は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。

抗原Ａに対する２つの機能的なｘＬＣ－ｘＨＣｋｎｏｂペアＡ１とＡ２、および抗原Ｂに対する２つの機能的なＬＣ－ＨＣｈｏｌｅペアのサブユニットのランダムな会合から生じるＣｒｏｓｓＭａｂ。２つの機能的なＦａｂを持つ４つのＣｒｏｓｓＭａｂの他に、部分的にまたは完全に機能不全な１２のＣｒｏｓｓＭａｂが、軽鎖と重鎖のミスペアリングのために生成される。 ２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行するために、３つのＲＲＳ部位の使用を伴う２プラスミドＲＭＣＥ戦略のスキーム。 標的化組込みＣＨＯ宿主細胞株におけるコンビナトリアルＣｒｏｓｓＭａｂライブラリの作製。抗原Ａに対するｎ個の異なるフロントプラスミド、および抗原Ｂに対するｍ個の異なるバックプラスミドのライブラリを混合し、ＴＩ ＣＨＯ宿主細胞株にトランスフェクトする。得られた安定的にトランスフェクトされた細胞のプールは、ｎ ｘ ｍの異なるＣｒｏｓｓＭａｂを発現し、各細胞は１種類のみを発現する。 ４Ａ：抗体１のｘＨＣｋｎｏｂおよびｘＬＣをコードするフロントプラスミドＦ＿１のマップ。４Ｂ：抗体２のＨＣｈｏｌｅおよびＬＣをコードするバックプラスミドＢ＿１のマップ。ＢＧＨポリＡ：ウシ成長ホルモン遺伝子の３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナル、ＨＧＴ：ヒト成長ホルモン遺伝子の転写終結配列。 ５Ａ：３６個の力価陽性の単一細胞クローンにおけるフロントプラスミドおよびバックプラスミドの保有数。予期しない標的遺伝子構成を持つクローンＰ２Ａ０９、Ｐ２Ｃ１０、およびＰ２Ｆ１０は含まれていない。Ｂ：３６個の力価陽性の単一細胞クローンにおけるフロントプラスミドとバックプラスミドの組合せの保有数。予期しない標的遺伝子構成を持つクローンＰ２Ａ０９、Ｐ２Ｃ１０、およびＰ２Ｆ１０は含まれていない。 ＧＦＰ（ｘ軸）および抗体発現（ｙ軸）のサイトメトリー測定。選択を開始してから１０日後、サイトメトリーを行った。図６Ａ：ＣＨＯ親細胞。図６Ｂ：ＴＩ宿主細胞。図６Ｃ：２ ｘ ２ＣｒｏｓｓＭａｂライブラリを発現する安定したプール。

引用文献
Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．ＭＡｂｓ．９（２０１７）１８２－２１２。
Ｋｉｔａｚａｗａ，Ｔ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１８（２０１２）１５７０－１５７４。
Ｌａｎｚａ，Ａ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（２０１２）８９８－９０８。
Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１。
Ｒｅｇｕｌａ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１８）ｇｚｙ０２１、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｙ０２１
Ｓａｍｐｅｉ，Ｚ．ら、ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．８（２０１２）ｅ５７４７９。
Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０８（２０１１）１１１８７－１１１９２。
Ｓｈｉｍａ，Ｍ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７４（２０１６）２０４４－２０５３。
Ｔｕｒａｎ，Ｓ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０７（２０１１）１９３－２２１。
Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｔ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７。
Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０９（２０１２）１５７２８－１５７３３。

実施例１
一般的技術
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ、（１９８９）に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。

ＤＮＡおよびタンパク質配列解析および配列データ管理
ＥＭＢＯＳＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）ソフトウェアパッケージおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン１１．５を、配列の作成、マッピング、解析、注釈付け、および図解に使用した。

実施例２
コンビナトリアル２ｘ２ＣｒｏｓｓＭＡｂ発現ライブラリの作製と解析
ヒト抗原Ａに特異的に結合する２つの異なる抗体の交差抗体鎖をコードする２つのフロントプラスミドＦ＿１およびＦ＿２、ならびにヒト抗原Ｂに特異的に結合する２つの異なる抗体の非交差抗体鎖をコードする２つのバックプラスミドＢ＿１およびＢ＿２を、ＴＩ ＣＨＯ宿主細胞株に同時にトランスフェクトした（下の表を参照）。図４は、フロントプラスミドＦ＿１およびバックプラスミドＢ＿１のマップを示す。フロントプラスミドＦ＿１およびＦ＿２は、ＶＬおよびＶＨのアミノ酸配列において、互いに異なる。バックプラスミドＢ＿１およびＢ＿２についても、同じことが当てはまる。

ｘＨＣｋｎｏｂ：ドメインクロスオーバーおよびノブ変異を伴う重鎖
ｘＬＣ：ドメインクロスオーバーを伴う軽鎖
ＬＣ：ドメインクロスオーバーを伴わない軽鎖
ＨＣｈｏｌｅ：ドメインクロスオーバーおよびホール変異を伴わない重鎖

ＴＩ宿主を、１５０ｒｐｍの一定の撹拌速度、標準的な加湿条件下（９５％ｒＨ、３７℃、および５％ＣＯ_２）で、使い捨て１２５ｍｌベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。３～４日ごとに、細胞を、選択マーカー１および選択マーカー２を有効濃度で含む化学的に定義された培地に、３ｘ１０^５細胞／ｍｌの濃度で播種した。培養物の密度と生存率を、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞カウンタ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。安定したトランスフェクションのために、等モル量のプラスミドＦ＿１、Ｆ＿２、Ｂ＿１およびＢ＿２を混合した。１μｇのＣｒｅ発現プラスミドを、５μｇのプラスミド混合物に添加した。トランスフェクションの２日前に、ＴＩ宿主細胞を、４ｘ１０^５細胞／ｍｌの密度で、新鮮な培地に播種した。トランスフェクションは、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶ（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、製造元のプロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスで実施した。３ｘ１０^７の細胞を、３０μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、選択剤を含まない３０ｍｌの培地に播種した。播種後５日目に、細胞を遠心分離し、組換え細胞を選択するために、選択剤３および選択剤４を有効濃度で含む８０ｍＬ培地に、６ｘ１０^５細胞／ｍｌの濃度で移した。培養物の細胞密度および生存率を定期的にモニターした。培養物の生存率が再び増加し始めたとき、選択剤３および４の濃度を、以前に使用した量の約半分に減少させた。選択を開始してから１０日後、細胞内ＧＦＰおよび細胞表面に結合した細胞外ＣｒｏｓｓＭａｂの発現を測定するフローサイトメトリによって、Ｃｒｅ媒介性カセット交換の成功を確認した（図６）。ヒト抗体の軽鎖および重鎖に対するＡＰＣ抗体（アロフィコシアニン標識Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を、ＦＡＣＳ染色用にした。フローサイトメトリは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。試料あたり１０，０００イベントを測定した。生細胞を、側方散乱（ＳＳＣ）に対する前方散乱（ＦＳＣ）のプロットでゲートした。生細胞ゲートは、トランスフェクトされていないＴＩ宿主細胞で定義され、ＦｌｏｗＪｏ ７．６．５ ＥＮソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ｏｌｔｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、すべての試料に適用された。ＧＦＰの蛍光を、ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの検出）で定量化した。ＣｒｏｓｓＭａｂを、ＡＰＣチャネル（６４５ｎｍでの励起、６６０ｎｍでの検出）で測定した。ＣＨＯ親細胞、すなわちＴＩ宿主細胞の作製に使用された細胞を、ＧＦＰおよびＣｒｏｓｓＭａｂ発現に対するネガティブコントロールとして使用した。選択開始から１４日後、生存率は９０％を超え、選択は完了したと見なされた。

選択後、安定的にトランスフェクトされた細胞のプールを、限界希釈による単一細胞クローニングに供した。この目的のために、細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色し、３８４ウェルプレートに０．６細胞／ウェルで播種した。単一細胞クローニングおよびその後のすべての培養工程では、選択剤４を培地から除外した。１つの細胞のみを含むウェルを、明視野および蛍光ベースのプレートイメージングによって同定した。１つの細胞を含むウェルのみを、さらに検討した。プレーティング後約３週間で、コンフルエントなウェルからコロニーを採取し、９６ウェルプレートでさらに培養した。９６ウェルプレートで４日後、培養培地中の抗体力価を、抗ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。簡単に説明すると、抗体を、ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ（商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に結合した抗ヒトＦｃ抗体で細胞培養液から捕捉し、捕捉抗体とは異なるエピトープに結合する抗ヒトＦｃ ＰＯＤコンジュゲートで検出した。二次抗体を、ＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ基質（ＰＯＤ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた化学発光によって定量した。ウェルの９１％が、細胞増殖を示し、抗体陽性であった。Ａｌｌｐｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、抗体陽性コロニーを溶解し、ゲノムＤＮＡを抽出した。

組み込まれたプラスミドの同一性を分析するために、ＬＣ、ｘＬＣ、ＨＣｈｏｌｅ、およびｘＨＣｋｎｏｂの抗体コード領域を、プライマーＰ＿１およびＰ＿２を使用したＰＣＲによって同時に増幅した。Ｐ＿１は、これらの遺伝子の５’非翻訳領域に結合するが、Ｐ＿２は、３’非翻訳領域に結合する。得られたＰＣＲ産物の混合物を、２つの遺伝子に特異的なプライマーを使用したサンガーシーケンシングによって解析した。Ｐ＿３は、ｘＨＣｋｎｏｂ遺伝子の定常部分に結合し、フロントプラスミドのＶＬ領域の配列決定を可能にする。Ｐ＿４は、ＬＣ遺伝子の定常部分に結合し、バックプラスミドのＶＬ領域の配列決定を可能にする。

配列決定された３９個のクローンのうち３７個には、１種類のフロントプラスミドおよび１種類のバックプラスミドが含まれた（以下の表を参照）。１つのクローン（Ｐ２Ｆ１０）には、両方のバックプラスミドが含まれていた。クローンＰ２Ａ０９では、フロントプラスミドが検出されなかった。バックプラスミドＢ＿１とＢ＿２のハイブリッド配列を含むクローンＰ２Ｃ１０のバックプラスミドを除いて、すべての配列は、参照配列の１つと正確に一致した。分析されたクローンの数が少ないにしては、トランスフェクトされたすべてのプラスミド（図４）および予想されるフロントプラスミドとバックプラスミドのすべての組合せが同様の頻度で発生した（図５）。

＊Ｂ＿１とＢ＿２のハイブリッド

得られたクローンにおける異なる発現プラスミドの表現／発生が、発現されたタンパク質（抗体鎖）の配列とほぼ無関係であることは、非常に驚くべきことであり、明確に指摘しなければならない。半抗体の好ましい発現または偏った発現は、一つも検出できなかった。これは、スクリーニング用というライブラリの使用目的を考慮すると重要な結果である。例えば、１つの種がこれよりも頻繁に発生する場合、スクリーニング結果に悪影響を与える可能性がある。

Claims (13)

1. 二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製するための方法であって、
   （ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込み宿主細胞を提供する段階であって、ここで、前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１および第２の組換え認識配列、ならびに前記第１の組換え認識配列と前記第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列のすべてが異なる、前記段階、
   （ｂ）前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第１および第３の組換え認識配列と一致しかつ２つの外因性ヌクレオチド配列および少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第１のベクターのライブラリ、ならびに
   前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第２および第３の組換え認識配列と一致しかつ少なくとも２つのさらなる外因性ヌクレオチド配列に隣接する２つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第２のベクターのライブラリ
   を、（ａ）で提供される細胞に導入する段階であって、ここで、前記２つの外因性ヌクレオチド配列及び前記２つのさらなる外因性ヌクレオチド配列を合わせた４つの外因性ヌクレオチド配列のうち、１つは前記二重特異性抗体の第１の軽鎖、１つは前記二重特異性抗体の第２の軽鎖、１つは前記二重特異性抗体の第１の重鎖、および１つは前記二重特異性抗体の第２の重鎖をコードする、前記段階、
   （ｃ）（ｉ）（ｂ）の第１および第２のベクターのライブラリと同時に、または（ｉｉ）その後順次に、１つ以上のリコンビナーゼを導入する段階であって、ここで、前記１つ以上のリコンビナーゼは、前記第１および第２のベクターの前記組換え認識配列を認識し、２つのリコンビナーゼ媒介性カセット交換を実行する、前記段階、ならびに
   （ｄ）前記第２の選択マーカーを発現し、かつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択する段階
   を含み、それにより、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製する、方法。
2. 前記第１および第２のベクターのそれぞれが、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１および第２のベクターのそれぞれが、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および同族の抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記第１および第２のベクターが、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する、請求項１から3のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第１および第２のベクターが、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する、請求項１から3のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記第１および第２のベクターが、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、一方のベクターでは、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置し、他方のベクターでは、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する、請求項１から3のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第１または第２のベクターが、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有する、請求項１から6のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１のベクターが、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有する、請求項１から7のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記第１のベクターが、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する、請求項１から8のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第１のベクターが、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置し、前記第２のベクターが、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する、請求項１から9のいずれか一項に記載の方法。
11. ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製するための方法であって、
    （ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込み宿主細胞を提供する段階であって、ここで、前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１および第２の組換え認識配列、ならびに前記第１の組換え認識配列と前記第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列のすべてが異なる、前記段階、
    （ｂ）前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第１および第３の組換え認識配列と一致しかつ２つの外因性ヌクレオチド配列および少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第１のベクター、ならびに
    前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第２および第３の組換え認識配列と一致しかつ少なくとも２つのさらなる外因性ヌクレオチド配列に隣接する２つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第２のベクター
    を、（ａ）で提供される細胞に導入する段階であって、ここで、前記第１のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置し、前記第２のベクターは、抗体軽鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する、前記段階、
    （ｃ）（ｉ）（ｂ）の第１および第２のベクターと同時に、または（ｉｉ）その後順次に、１つ以上のリコンビナーゼを導入する段階であって、ここで、前記１つ以上のリコンビナーゼは、前記第１および第２のベクターの前記組換え認識配列を認識する、前記段階、ならびに
    （ｄ）前記第２の選択マーカーを発現しかつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択する段階
    を含み、それにより、ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製する、方法。
12. 前記第１のベクターが、コドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、それにより、前記プロモーター配列は、上流に前記（２つの）外因性ヌクレオチド配列が隣接し（すなわち、前記外因性ヌクレオチド配列の下流に配置され）、前記ＡＴＧコドンは、下流に組換え認識配列が隣接し（すなわち、組換え認識配列の上流に配置され）、前記第２のベクターは、上流に組換え認識配列が隣接しかつ下流に前記（２つの）外因性ヌクレオチド配列が隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む、請求項１から11のいずれか一項に記載の方法。
13. 二重特異性抗体を産生する方法であって、
    （ａ）請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法で調製された組換え宿主細胞を提供する段階と、
    （ｂ）（ａ）の組換え宿主細胞を培養し、前記細胞または培養培地から二重特異性抗体を回収する段階と
    を含む、方法。

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