[go: up one dir, main page]

RS54802B1 - Mutant interleukin-2 polipeptidi - Google Patents

Mutant interleukin-2 polipeptidi

Info

Publication number
RS54802B1
RS54802B1 RS20160397A RSP20160397A RS54802B1 RS 54802 B1 RS54802 B1 RS 54802B1 RS 20160397 A RS20160397 A RS 20160397A RS P20160397 A RSP20160397 A RS P20160397A RS 54802 B1 RS54802 B1 RS 54802B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
polypeptide
mutant
amino acid
immunoconjugate
Prior art date
Application number
RS20160397A
Other languages
English (en)
Inventor
Oliver Ast
Peter Bruenker
Anne Freimoser-Grundschober
Sylvia Herter
Thomas U Hofer
Ralf Hosse
Christian Klein
Ekkehard Moessner
Valeria G Nicolini
Pablo Umana
Original Assignee
Roche Glycart Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Glycart Ag filed Critical Roche Glycart Ag
Publication of RS54802B1 publication Critical patent/RS54802B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Mutant interieukin-2 (IL-2) polipeptid, koji sadrži tri aminokiselinske mutacije koje ukidaju ili smanjuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor visokog afiniteta i zadržavaju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u pređenju sa IL-2 polipeptidom divljeg tipa, pri čemu su navedene tri aminokiselinske mutacije na položajima koji odgovaraju ostacima 42, 45 i 72 humanog IL-2 (SEQ ID NO: 1). Prijava sadrži još 22 patentna zahteva.

Description

MUTANT INTERLEUKIN-2
POLIPEPTIDI
Oblast tehnike
Ovaj pronalazak se, uopšteno, odnosi na mutant interleukin-2 polipeptide. Određenije, pronalazak se odnosi na mutant IL-2 polipeptide, koji ispoljavaju poboljšane karakteristike za korišćenje u vidu imunoterapeutskih sredstava. Pored toga, pronalazak se odnosi na imunokonjugate, koji sadrže navedene mutant IL-2 polipeptide, polinukleotidne molekule koji kodiraju mutant IL-2 polipeptide ili imunokonjugate, i vektore i ćelije domaćina koje sadrže takve polinukleotidne molekule. Pronalazak se, dalje, odnosi na postupke za proizvodnju mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, farmaceutske smeše koji iste sadrže, i na njihova korišćenja.
Stanje
lnterieukin-2 (IL-2), poznat takođe kao T-ćelijski faktor rasta (TCGF), jeste globularni glikoprotein od 15.5 kDa, koji igra centralnu ulogu u proizvodnji, preživljavanju i homeostazi limfocita. On ima dužinu od 133 aminokiseline i sastavljen je od četiri antiparalelna, amfipatska a-heliksa, koji obrazuju kvaternarnu strukturu, neophodnu za njegovu funkciju (Smith, Science 240, 1169-76 (1988); Bazan, Science 257, 410-413 (1992)). Sekvence IL-2 obrazuju različite vrste, a nalaze se pod NCBI RefSeq Brojevima NP000577 (humani), NP032392 (mišji), NP446288 (pacovski) ili NP517425 (šimpanze).
Posredovanje u dejstvu IL-2 ostvaruje se putem vezivanja za receptore IL-2 (IL-2R), koji su sastavljeni od ukupno do tri pojedinačne podjedinice, čije različito povezivanje može proizvesti različite oblike receptora koji se razlikuju prema njihovom afinitetu za IL-2. Udruživanje a (CD25), p (CD122) i v (Yc-CD 132) podjedinica proizvodi trimerni receptor visokog afiniteta za IL-2. Dime mi receptor IL-2, koji je sastavljen od p i y podjedinica, je označen kao IL-2R srednjeg afiniteta, a podjedinica obrazuje monomerni IL-2 receptor slabog afiniteta. Premda se dimerni IL-2 receptor srednjeg afiniteta vezuje sa IL-2 sa približno 100-puta manjim afinitetom nego sa trimernim receptorom visokog afiniteta, obe varijante i dimerna i trimerna, IL-2 receptora, u stanju su da prenose signal nakon vezivanja IL-2 (Minami et al., Annu Rev Immunol 11, 245-268 (1993)). Sledstveno tome, a-podjedinica, CD25, nije od suštinskog značaja za signalizaciju IL-2. Ona prenosi vezivanje visokog afiniteta na svoj receptor, dok su 3 podjedinica, CD122, i v-podjedinica ključne za transdukciju signala (Krieg et al., Proc Natl Acad Sci 107, 11906-11 (2010)). Trimerni receptori IL-2, koji uključuju CD25, ekspresuju se posredstvom ćelija (u mirovanju) CD4 + P3 račvaste kutije (FoxP3) + regulatornih T (Treg) ćelija. Oni se, takođe, tranzitorno indukuju na T ćelijama, aktiviranim na konvencionalni način, dok ove ćelije u stanju mirovanja ekspresuju samo dimerne IL-2 receptore. Tre9ćelije dosledno ekspresuju najviši stepen CD25 in vivo (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005)). IL-2 se sintetiše, uglavnom posredstvom aktiviranih T-ćelija, posebno CD4<+>helper T ćelija. On stimuliše proliferaciju i diferencijaciju T ćelija, indukuje proizvodnju citotoksičnih T limfocita (CTL-i) i diferencijaciju limfocita periferne krvi u citotoksične ćelije i tzv. "kiler ćelije" aktivirane posredstvom limfokina (LAK), potiče citokine i ekspresiju citolitičnih molekula posredstvom T ćelija, olakšava proliferaciju i diferencijaciju B-ćelija i sintezu imunoglobulina od strane B-ćelija, i stimuliše proizvodnju, proliferaciju i aktivaciju tzv. "natural kiler" (NK) ćelija (prikazano npr., u VValdmann, Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2009); Olejniczak i Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-89 (2008); Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-79 (2008)).
Sposobnost IL-2 da proširi populacije limfocita in vivo i da poveća efektorske funkcije ovih ćelija, pruža antitumorska svojstva IL-2, čineći imunoterapiju sa IL-2 atraktivnom opcijom tretmana za određene metastatske maligne bolesti. Sledstveno tome, lečenje sa visokom dozom IL-2 dobilo je odobrenje za korišćenje kod pacijenata sa metastatskim karcinomom renalnih ćelija i malignim melanomom.
Međutim, IL-2 ima dvostruku funkciju u imunom odgovoru zbog toga što ne samo što posreduje u ekspanziji i aktivnosti efektorskih ćelija, već je, isto tako, suštinski uključen u održavanje periferne imune tolerancije.
Glavni mehanizam, na kome se temelji periferna samo-tolerancija jeste ćelijska smrt indukovana aktivacijom IL-2 (AICD) u T ćelijama. AICD jeste proces putem koga se potpuno aktivirane T ćelije podvrgavaju programiranoj ćelijskoj smrti posredstvom zaposedanja receptora smrti, ekspresovanih na ćelijskoj površini, kao što su CD95 (poznat, takođe, kao Fas) ili TNF receptor. Kada se antigenom aktivirane T ćelije, koje ekspresuju IL-2 receptor visokog afiniteta (nakon prethodne izloženosti IL-2) tokom proliferacije re-stimulišu sa antigenom posredstvom T-ćelijskog receptorskog kompleksa (TCR)/CD3, indukuje se ekspresija Fas liganda (FasL) i/ili tumor nekrozis faktora (TNF), čime se ćelije učine osetljivim na Fas-posredovanu apoptozu. Ovaj proces zavisi od IL-2 (Lenardo, Nature 353, 858-61 (1991)) i posredovan je sa STAT5. Procesom AICD u T limfocitima, ne uspostavlja se samo tolerancija na sopstvene antigene, već, isto tako, na perzistentne antigene, koji, razumljivo, ne čine deo sastava domaćina, kao što su tumorski antigeni.
Pored toga, IL-2 je, takođe, uključen u održanje perifernih CD4<+>CD25<+>regulatornih T (Treg) ćelija (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005); D'Cruz i Klein, Nature Immunol 6, 1152-59 (2005); Maloy i Powrie, Nature Immunol 6, 1171-72 (2005), koje su, isto tako, poznate kao supresorske T ćelije. One suprimiraju efektorske T ćelije, proistekle iz razaranja njihovih (sopstvenih) meta, ili posredstvom ćelija-ćelija kontakta, putem inhibicije T-ćelijske ispomoći i aktivacije, ili posredstvom oslobađanja imunosupresivnih citokina, kao što su IL-10 ili TGF-B. Prikazano je kako pražnjenje Treg ćelija pojačava IL-2 indukovanu anti-tumorsku imunost (Imai et al., Cancer Sci 98, 416-23 (2007)).
Sledstveno tome, IL-2 nije optimalan za inhibiciju tumorskog rasta, budući da bi u prisustvu IL-2 proizvedeni CTL-i mogli tumor prepoznati kao sopstveni, uz podvrgavanje AlCD-u ili bi imuni odgovor mogao biti inhibiran od strane IL-2 zavisnih Treg ćelija.
Dalja nedoumica u vezi sa imunoterapijom IL-2, su sporedni efekti koje proizvodi tretman rekombinantnim humanim IL-2. Pacijenti, koji se često podvrgavaju tretmanu sa visokim dozama IL-2, ispoljavaju ozbiljne kardiovaskularne, pulmonalne, bubrežne, jetrene, gastrointestinalne, neurološke, kožne, hematološke i sistemske štetne efekte, koji zahtevaju intenzivno praćenje i "in-patient" rukovođenje. Najveći broj ovih sporednih efekata može se objasniti razvojem takozvanog vaskulamog (ili kapilarnog) sindroma curenja (VLS), patološkog povećavanja vaskularne permeabilnosti, što dovodi do izlivanja tečnosti u više organa (što uzrokuje npr., plućni i kožni edem i razaranje jetrenih ćelija) i iscrpljivanja intravaskularne tečnosti (što izaziva pad krvnog pritiska i kompenzatorno povećanje brzine rada srca). Ne postoji drugi način lečenja VLS-a osim izbacivanja IL-2. Režimi sa niskim dozama IL-2 ispitivani su na pacijentima, da bi se izbegao sindrom VLS, međutim, po cenu dobijanja suboptimalnih terapeutskih rezultata. Verovalo se da je VLS izazavan oslobađanjem proinflamatornih citokina, kao što je tumor nekrozis faktor (TNF)-a, iz IL-2-aktiviranih NK ćelija, međutim nedavno se pokazalo da je IL-2-indukovani plućni edem, proistekao iz direktnog vezivanja IL-2 za ćelije plućnog endotela, uz ekspresovanje niskih do srednjih nivoa funkcionalnih a8v IL-2 receptora (Krieg et al., Proc Nat Acad Sci USA 107, 11906-11 (2010)).
Primenjeno je nekoliko pristupa, radi prevazilaženja ovih problema, povezanih sa imunoterapijom sa IL-2. Na primer, utvrđeno je da kombinacija IL-2 sa određenim anti-IL-2 monoklonskim antitelima pojačava efekte tretmana sa IL-2 in vivo (Kamimura et al., J Immunol 177, 306-14 (2006); Bovman et al., Science 311, 1924-27 (2006)). U alternativnom pristupu, IL-2 je mutiran na različite načine, da bi se smanjila njegova toksičnost i/ili povećala njegova efikasnost. Hu i saradnici (Blood 101, 4853-4861 (2003), US Pat. Publ. No. 2003/0124678) su supstituisali argininski ostatak na položaju 38 IL-2 sa triptofanom, da bi se eliminisalo vazopermeabilno dejsto IL-2. Shanafelt i saradnici (Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)) su izvršili mutaciju asparagina 88 sa argininom, da bi se povećala selektivnost za T ćelije u odnosu na NK ćelije. Heaton i saradnici (Cancer Res 53, 2597-602 (1993); US Pat. No. 5,229,109) su indukovali dve mutacije, Arg38Ala i Phe42Lys, da bi se smanjila sekrecija proinflamatornih citokina iz NK ćelija. Gillies i saradnici (US Pat. Publ. No. 2007/0036752) su supstituisali tri ostatka IL-2 (Asp20Thr, Asn88Arg i Gln126Asp), koji doprinose afinitetu za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, da bi se smanjio VLS. Gillies i saradnici (WO 2008/0034473) su, takođe, izvršili mutaciju veze IL-2 sa CD25, posredstvom supstitucije aminokiselina Arg38Trp i Phe42Lys, da bi se smanjila interakcija sa CD25 i aktivacija Treg ćelija zbog pojačavanja efikasnosti. S istim ciljem, VVittrup i saradnici (WO 2009/061853) su proizveli mutante IL-2 koji pokazuju povećani afinitet za CD25, ali ne aktiviraju receptor, tako da deluju kao antagonisti. Uvedene mutacije predstavljale su ispomoć u razaranju interakcije sa (3- i/ili y-podjedinicom receptora.
Međutim, ni za jedan od poznatih IL-2 mutanata nije se pokazalo da dovodi do prevazi laže nja svih prethodno pomenutih problema, povezanih sa imunoterapijom sa IL-2, to jest toksičnosti izazvane indukcijom VLS, tumorske tolerancije, koja je uzrokovana indukcijom AICD i imunosupresije, koja je posledica aktivacije Treg ćelija. Sledstveno tome, u ovoj oblasti ostaje potreba za daljim povećanjem terapeutske upotrebljivosti proteina IL-2.
Izlaganje suštine pronalaska
Ovaj pronalazak je, delom, zasnovan na spoznaji da je interakcija IL-2 sa a-podjedinicom trimernog IL-2 receptora visokog afiniteta odgovorna za probleme, povezane sa imunoterapijom sa IL-2.
Pronalazak se odnosi na sledeće mutant interleukin-2 (IL-2) polipeptide, imunokonjugate, polinukleotide, ćelije domaćina, postupke proizvodnje mutant IL-2 polipeptida i farmaceutske smeše:
[1] Mutant interleukin-2 polipeptid (IL-2), koji sadrži tri aminokiselinske mutacije, koje poništavaju ili smanjuju afinitete mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor visokog afiniteta i zaštićuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa, pri čemu su navedene tri aminokiselinske mutacije na položajima koji odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2 (SEQ ID NO: 1).
[2] Mutant interleukin-2 polipeptid pod [1], pri čemu su navedene tri aminokiselinske mutacije aminokiselinske supstitucije odabrane iz grupe koju čine: F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K.
[3] Mutant interleukin-2 polipeptid pod [1] ili [2], pri čemu je navedena aminokiselinska mutacija na položaju koji odgovara ostatku 72 humanog IL-2, aminokiselinska supstitucija L72G.
[4] Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od [1] do [3], pri čemu je navedena aminokiselinska mutacija na položaju koji odgovara ostatku 42 humanog IL-2, aminokiselinska supstitucija F42A.
[5] Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od [1] do [4], pri čemu je navedena aminokiselinska mutacija na položaju koji odgovara ostatku 45 humanog IL-2, aminokiselinska supstitucija Y45A.
[6] Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od [1] do [5], pri čemu su navedene tri aminokiselinske mutacije supstitucije aminokiselina F42A, Y45A i L72G.
[7] Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od [1] do [6], koji dalje sadrži aminokiselinsku mutaciju koja odstranjuje O-glikozilacijski položaj iz IL-2 na položaju koji odgovara ostatku 3 humanog IL-2.
[8] Mutant interleukin-2 polipeptid pod [7], pri čemu je navedena aminokiselinska mutacija kojom se odstranjuje O-glikozilacijski položaj iz IL-2 na položaju koji odgovara ostatku 3 humanog IL-2, aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju čine: T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K i T3P.
[9] Mutant interleukin-2 polipeptid pod [7] ili [8], pri čemu je navedena aminokiselinska mutacija kojom se odstranjuje O-glikozilacijski položaj iz IL-2 na položaju koji odgovara ostatku 3 humanog IL-2, aminokiselinska supstitucija T3A.
[10] Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od [1] do [9], pri čemu je navedeni mutant IL-2 polipeptid molekul humanog IL-2.
[11] Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od [1] do [10], pri čemu navedeni mutant IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 19.
[12] Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od [1] do [11], pri čemu je navedeni mutant IL-2 polipeptid vezan za deo koji nije IL-2 .
[13] Imunokonjugat koji sadrži mutant IL-2 polipeptid prema bilo kom od [1] do [12] i antigen-vezujući deo.
[14] Imunokonjugat pod [13], pri čemu je navedeni antigen-vezujući deo antitelo ili fragment antitela.
[15] Imunokonjugat pod [13], pri čemu je navedeni antigen-vezujući deo odabran od Fab molekula i scFv molekula.
[16] Imunokonjugat pod [13], pri čemu je navedeni antigen-vezujući deo imunoglobulinski molekul, posebno molekul IgG.
[17] Imunokonjugat iz bilo kog od [13] do [16], pri čemu je navedeni antigen-vezujući deo usmeren ka antigenu, koji se nalazi na tumorskoj ćeliji ili u okruženju tumorske ćelije.
[18] Izolovani polinukleotid koji kodira mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat iz bilo kog od [1] do [17].
[19] Ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid pod [18].
[20] Postupak proizvodnje mutant IL-2 polipeptida koji sadrži tri aminokiselinske mutacije, koje ukidaju ili redukuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor visokog afiniteta i zaštićuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa, pri čemu su navedene tri aminokiselinske mutacije na položajima koji odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2 (SEQ ID NO: 1), ili njegovog imunokonjugata, koji uključuje kultivaciju ćelije domaćina pod [19] pod uslovima, koji su pogodni za ekspresiju mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata.
[21] Farmaceutska smeša koja sadrži mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat iz bilo kog od [1] do [17] i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[22] Mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat iz bilo kog od [1] do [17] za korišćenje u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno.
[23] Mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat pod [22] za korišćenje u lečenju bolesti, pri čemu je navedena bolest rak.
Tekuće izlaganje obezbeđuje mutant interleukin-2 (IL-2) polipeptid koji sadrži prvu aminokiselinsku mutaciju, koja ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor visokog afiniteta i zaštićuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa. U jednom ostvarenju, navedena prva aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 72 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedena prva aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju čine: L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U još specifičnijem ostvarenju, navedena prva aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija L72G. U određenim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptid sadrži drugu aminokiselinsku mutaciju, koja ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor visokog afiniteta i zaštićuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa. U jednom ostvarenju, navedena druga aminokiselinska mutacija je na položaju, koji je odabran od položaja koji odgovaraju ostatku 35, 38, 42, 43 i 45 humanog IL-2. U specifičnom ostvarenju, navedena druga aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 42 humanog IL-2. U još specifičnijem ostvarenju, navedena druga aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju čine: F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R i F42K. U jednom još specifičnijem ostvarenju, navedena druga aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija F42A. U određenim ostvarenjima, mutant interleukin-2 polipeptid sadrži treću aminokiselinsku mutaciju, koja ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor visokog afiniteta i zaštićuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa. U posebnom ostvarenju, mutant interleukin-2 polipeptid sadrži tri aminokiselinske mutacije koje ukidaju ili smanjuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor visokog afiniteta i zaštićuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa, pri čemu su navedene tri aminokiselinske mutacije na položajima koji odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedene tri aminokiselinske mutacije su aminokiselinske supstitucije, odabrane iz grupe koju čine: F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U specifičnom ostvarenju, navedene tri aminokiselinske mutacije su aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G. U određenim ostvarenjima mutant interleukin-2 polipeptid dalje sadrži mutaciju aminokiseline kojom se eliminiše O-glikozilacijski položaj IL-2 na položaju koji odgovara ostatku 3 humanog IL-2. U jednom ostvarenju navedena aminokiselinska mutacija kojom se odstranjuje O-glikozilacijski položaj IL-2 na položaju koji odgovara ostatku 3 humanog IL-2 jeste aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju čine: T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K i T3P. U specifičnom ostvarenju aminokiselinska mutacija kojom se odstranjuje O-glikozilacijski položaj IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2, jeste T3A. U određenim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptid je u suštini molekul IL-2 pune dužine, posebno humani molekul IL-2 pune dužine.
Izlaganje dalje obezbeđuje mutant interleukin-2 polipeptid, koji je vezan za deo koji nije IL-2. U određenim ostvarenjima, navedeni deo koji nije IL-2 jeste ciljani deo. U određenim ostvarenjima, navedeni deo koji nije IL-2 jeste antigen-vezujući deo. U jednom ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo jeste antitelo. U drugom ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je fragment antitela. U još specifičnijem ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je odabran od Fab molekula i scFv molekula. U određenom ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je Fab molekul. U drugom ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je scFv molekul. U pojedinim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptid je vezan za prvi i drugi deo koji nije IL-2. U jednom takvom ostvarenju, mutant interleukin-2 polipeptid deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa navedenim prvim delom koji nije IL-2 i amino-terminalnu peptidnu vezu sa navedenim drugim delom koji nije IL-2. U jednom ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je imunoglobulinski molekul. U još specifičnijem ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je imunoglobulinski molekul IgG klase, posebno lgG1 podklase. U određenim ostvarenjima, navedeni antigen-vezujući deo je usmeren ka antigenu, prisutnom na tumorskoj ćeliji ili u okruženju tumorske ćelije, posebno ka antigenu, odabranom iz grupe koju čine: protein aktivacije fibroblasta (FAP), A1 domen tenascina-C (TNC A1), A2 domen tenascina-C (TNC A2), ekstra domen B fibronektina (EDB), karcinoembrijski antigen (CEA) i hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP).
Takođe je, ovim izlaganjem obezbeđen imunokonjugat koji sadrži mutant IL-2 polipeptid, kao što je ovde opisan, i antigen-vezujući deo. U jednom ostvarenju, ovde opisanog, imunokonjugata, mutant IL-2 polipeptid deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa navedenim antigen-vezujućim delom. U pojedinim ostvarenjima, imunokonjugat sadrži kao prvi i drugi antigen-vezujući deo. U jednom takvom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid, koji je sadržan u, ovde opisanom, imunokonjugatu, deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim antigen-vezujućim delom, a drugi antigen-vezujući deo deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa i) mutant IL-2 polipeptiđom ili ii) navedenim prvim antigen-vezujućim delom. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući deo, sadržan u ovde opisanom, imunokonjugatu, je antitelo, u drugom ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je fragment antitela. U specifičnom ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je odabran od Fab molekula i scFv molekula. U određenom ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je Fab molekul. U određenom drugom ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je imunoglobulinski molekul. U još specifičnijem ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je imunoglobulinski molekul IgG klase, posebno podklase lgG1. U određenim ostvarenjima, navedeni antigen-vezujući deo je usmeren ka antigenu, prisutnom na tumorskoj ćeliji ili u okruženju tumorske ćelije, posebno ka antigenu, odabranom iz grupe koju čine: protein aktivacije fibroblasta (FAP), A1 domen tenascina-C (TNC A1), A2 domen tenascina-C (TNC A2), ekstra domen B fibronektina (EDB), karcinoembrijski antigen (CEA) i hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom
(MCSP).
Izlaganje, dalje, obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, kao što je ovde opisan, ekspresione vektore koji sadrže navedene polinukleotide, i ćelije domaćina koje sadrže polinukleotide ili ekspresione vektore.
Takođe je obezbeđen postupak proizvodnje mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugat, kao što je ovde opisan, farmaceutska smeša koja sadrži mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, kao što je ovde opisan, i farmaceutski prihvatljiv nosač, i postupci korišćenja mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, kao stoje ovde opisan.
Određenije, izlaganje se odnosi na mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, kao što je ovde opisan, za korišćenje u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U određenom ostvarenju, navedena bolest je maligna bolest. U određenom ostvarenju, pojedinac je čovek.
Izlaganje se, isto tako, odnosi na korišćenje mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, kao što je ovde opisan, za proizvodnju leka za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno.
Dalje se izlaganje odnosi na lečenje kolesti kod pojedinca, koje obuhvata primenu navedenom pojedincu terapeutski efektivne količine smeše koja sadrži mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, kao što je ovde opisan. Navedena bolest je poželjno rak.
Izlaganje se, isto tako, odnosi na stimulaciju imunog sistema ispitanika, koja uključuje primenu navedenom ispitaniku efektivne količine smeše koja sadrži mutant IL-2 polipeptid ili imunkonjugat, kao što je ovde opisan, u farmaceutski prihvatljivom obliku.
Detaljni opis pronalaska
Definicije
Ovde su korišćeni nazivi kao što se u struci uopšteno koriste, ukoliko nije u nastavku drugačije definisano.
Naziv "interleukin-2" ili "IL-2", kako je ovde korišćen, odnosi se bilo koji nativni IL-2, koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr., ljudi) i glodan (npr., miševi i pacovi), ukoliko nije drugačije naznačeno. Naziv obuhvata neprerađeni IL-2, kao i bilo koji oblik IL-2, koji proistiće iz procesa u ćeliji. Naziv, takođe, obuhvata varijante IL-2 koje postoje u prirodi, npr., sastavljene varijante ili alelske varijante. Aminokiselinska sekvenca primernog humanog IL-2 prikazana je u SEQ ID NO: 1. Neprerađeni humani IL-2 dodatno sadrži N-terminalni signalni peptid sa 20 aminokiselina, koji ima sekvencu SEQ ID NO: 272, koja nije prisutna u zrelom molekulu IL-2.
Naziv "IL-2 mutant" ili "mutant IL-2 polipeptid", kao što je ovde korišćen, utvrđen je kako bi obuhvatio bilo koje mutant forme raznih oblika molekula IL-2, koje uključuju IL-2 pune dužine, skraćene oblike IL-2 i oblike u kojima je IL-2 povezan za sa drugim molekulom, na primer posredstvom fuzije ili hemijske konjugacije. "Puna dužina", kada se koristi u vezi sa IL-2, određena je kako bi označila zreli molekul IL-2 prirodne dužine. Na primer, humani IL-2 pune dužine odnosi se na molekul koji ima 133 aminokiseline {vidi, npr., SEQ ID NO: 1). Razni oblici IL-2 mutanata karakterisani su posedovanjem najmanje jedne aminokiselinske mutacije, koja zahvata interakciju IL-2 sa CD25. Ova mutacija može uključiti supstituciju, deleciju, skraćivanje ili modifikaciju aminokiselinskog ostatka divljeg tipa koji se normalno nalazi na toj poziciji. Poželjni su mutanti koji se dobijaju supstitucijom aminokiselina. Ukoliko nije drugačije naznačeno, IL-2 mutant se, ovde, može označiti kao IL-2 mutant peptidna sekvenca, IL-2 mutant polipeptid, IL-2 mutant protein ili IL-2 mutant analog.
Označavanje raznih oblika IL-2 ovde je izvršeno u odnosu na sekvencu datu u SEQ ID NO: 1. Ovde mogu biti korišćena različita označavanja koja bi ukazivala na istu mutaciju. Na primer, mutacija kojom se menja fenilalanin na položaju 42 za alanin, može se označiti kao: 42A, A42, A42, F42A ili Phe42Ala.
Naziv "mutacija aminokiseline", kao što je ovde korišćen, utvrđen je kako bi obuhvatio supstitucije, delecije, umetnja i modifikacije aminokiselina. Može biti izvršena bilo koja kombinacija supstitucija, delecija, umetanja i modifikacija, kako bi se postigla konačna konstrukcija, pod uslovom da konačna konstrukcija poseduje željene karakteristike, npr., smanjeno vezivanje za CD25. Delecije i umetanja aminokiselinske sekvence obuhvataju amino-i/ili karboksi-terminalne delecije i umetanja aminokiselina. Primer terminalne delecije je delecija alaninskog ostatka na položaju 1 humanog IL-2 pune dužine. Poželjne aminokiselinske mutacije su supstitucije aminokiselina. Za potrebe menjanja, npr., vezujućih karakteristika IL-2 polipeptida, posebno su poželjne ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije, t.j., zamena jedne aminokiseline drugom aminokiseliom koja poseduje različite strukturne i/ili hemijske karakteristike. Poželjne aminokiselinske supstitucije uključuju zamenu hidrofobne aminokiseline hidrofilnom aminokiselinom. Supstitucije aminokiselina obuhvataju zamenu aminokiselinama koje ne postoje u prirodi ili zamenu derivatima aminokiselina koje postoje u prirodi od dvadeset standardnih aminokiselina {npr., 4-hidroksiprolin, 3-metilhistidin, ornitin, homoserin, 5-hidroksilizin). Mutacije aminokiselina mogu se izvršiti korišćenjem, u struci dobro oznatih, genetskih ili hemijskih postupaka. Genetski postupci mogu uključiti mutagenezu usmerenu ka položaju, PCR, gensku sintezu i slične postupke. Smatra se da postupci, kao što su izmena grupe bočnih lanaca aminokiselina posredstvom postupaka koji ne spadaju u genetski inženjering, kao što je hemijska modifikaccija, takođe mogu biti od koristi.
Kako je ovde korišćen, oblik IL-2 "divljeg tipa" jeste oblik IL-2 koji je gotovo istovetan mutant IL-2 polipeptidu, s razlikom što oblik divljeg tipa ima aminokiselinu divljeg tipa na svakom aminokiselinskom položaju mutant IL-2 polipeptida. Na primer, ukoliko je IL-2 mutant IL-2 pune dužine (t.j., IL-2 koji nije spojen ili konjugovan sa bilo kojim drugim molekulom), oblik divljeg tipa ovog mutanta jeste nativni IL-2 pune dužine. Ukoliko IL-2 mutant predstavlja fuziju između IL-2 i drugog polipeptida, koji je kodiran nishodno od IL-2 (npr., lanac antitela) oblik divljeg tipa ovog IL-2 mutanta je IL-2 sa aminokiselinskom sekvencom divljeg tipa koja je spojena sa istovetnim nishodnim polipeptiđom. Pored toga, ukoliko je IL-2 mutant skraćeni oblik IL-2 (mutirana ili modifikovana sekvenca unutar ne-skraćenog dela IL-2), tada je oblik divljeg tipa ovog IL-2 mutanta na istovetan način skraćeni IL-2 kao i sekvenca divljeg tipa. Za potrebe poređenja afiniteta vezivanja IL-2 za receptor ili poređenja biološke aktivnosti raznih oblika IL-2 mutanata sa odgovarajućim oblikom divljeg tipa IL-2, naziv divlji tip obuhvata oblike IL-2 koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih mutacija, koje ne utiču na vezivanje IL-2 za receptor, u poređenju sa nativnim IL-2 koji postoji u prirodi, kao što je, npr., supstitucija cisteina na poziciji koja odgovara ostatku 125 humanog IL-2 alaninom. U nekim ostvarenjima, IL-2 divljeg tipa za potrebe tekućeg izlaganja uključuje susptituciju aminokiseline C125A (vidi SEQ ID NO: 3). U određenim ostvarenjima u skladu sa izlaganjem, IL-2 polipeptid divljeg tipa sa kojim se mutant IL-2 polipeptid upoređuje, sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1. U drugim ostvarenjima, IL-2 polipeptid divljeg tipa sa kojim se mutant IL-2 polipeptid upoređuje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEG ID NO: 3.
Naziv "CD25" ili "a-podjedinica receptora IL-2", kao što je ovde korišćen, odnosi se na bilo koji nativni CD25 iz bilo kog izvora kičmanjaka, uključujući sisare kao što su primati (npr., ljudi) i glodare (npr., miševi i pacovi),ukoliko nije drugačije naznačeno. Naziv obuhvata CD25 "pune dužine", koji nije prerađen, kao i bilo koji oblik CD25, koji je proistekao iz procesa u ćeliji. Naziv, isto tako, obuhvata varijante CD25 koje postoje u prirodi, npr., spojene varijante ili alelske varijante. U određenim ostvarenjima, CD25 je humani CD25. Aminokiselinska sekvenca primernog humanog CD25 (sa signalnom sekvencom, Avi-tag i His-tag) prikazana je u SEQ ID NO: 278.
Izraz "IL-2 receptor visokog afiniteta", kako je ovde korišćen, odnosi se na heterotrimernu formu IL-2 receptora, koja se sastoji od y-podjedinice receptora (koja je, takođe, poznata kao opšta v-podjedinica citokinskog receptora, vc ili CD132), B-podjedinice receptora (koja je, takođe, poznata kao CD122 ili p70) i a-podjedinice receptora (koja je, takođe, poznata kao CD25 ili p55). Izraz "IL-2 receptor srednjeg afiniteta", za razliku od prethodnog, odnosi se na IL-2 receptor koji uključuje samo v-podjedinicu i B-podjedinicu, bez a-podjedinice (za prikaza pogledajte npr., Olejniczak i Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)).
"Afinitet" se odnosi na jačinu zbira ukupnih ne-kovalentnih interakcija između pojedinačnog vezujućeg položaja molekula (npr., receptora) i njegovog vezujućeg partnera (npr., liganda). Ukoliko nije drugačije naznačeno, "vezujući afinitet", kao što je ovde korišćen, odnosi se na unutrašnji afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr., receptora i liganda). Afinitet molekula X za njegovog partnera Y može se uopšteno predstaviti posredstvom konstante disocijacije (Kq), koja je odnos konstanti disocijacije i asocijacije (k0ff, odnosno kon). Sledstveno tome, ekvivalentni afiniteta mogu uključivati različite konstante brzine, sve dotle dok odnos konstanti brzine ostaje isti. Afinitet se
može izmeriti uz pomoć, u struci poznatih, dobro utemeljenih postupaka, uključujući one koji su ovde opisani.
Afinitet mutant IL-2 polipeptida ili IL-2 polipeptida divljeg tipa za različite oblike IL-2 receptora može se odrediti u skladu sa postupkom, navedenim u Primerima, posredstvom površinske plazmon rezonance (SPR), uz korišćenje standardnih instrumenata, kao što je BlAcore instrument (GE Healthcare), i receptorskih podjedinica, što se može postići uz pomoć rekombinantne ekspresije (vidi, npr., Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). Alternativno, afinitet vezivanja IL-2 mutanata za različite oblike IL-2 receptora može biti procenjen korišćenjem ćelijskih nizova, za koje se zna da ekspresuju jedan ili drugi od navedenih oblika receptora. Ovde su u nastavku opisana specifična ilustrativna i primerna ostvarenja za merenje afiniteta vezivanja.
Pod "regulatornom T ćelijom" ili "Treg ćelijom" se podrazumeva specijalizovana vrsta CD4<+>T ćelija, koje mogu suprimirati odgovore drugih T ćelija. Treg ćelije su karakterisane ekspresijom a-podjedinice IL-2 receptora (CD25) i transkripcionog faktora "forkhead box" P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)), a igra ključnu uiogu u indukciji i održavanju periferne samo-tolerancije na antigene, uključujući one koji se ekspresuju od strane tumora. Treg ćelije zahtevaju IL-2 za svoje funkcionisanje i razvijanje i indukciju svojih supresivnih karakteristika.
Kako je ovde korišćen, naziv "efektorske ćelije" odnosi se na populaciju limfocita koji posreduju u citotoksičnim efektima IL-2. Efektorske ćelije uključuju efektor T ćelije, kao što su CD8<*>citotoksične T ćelije, NK ćelije, limfokinima-aktivirane kiler (LAK) ćelije i makrofage/monocite.
Kako je ovde korišćen, naziv "antigen-vezujući deo" odnosi se na polipeptidni molekul koji se specifično vezuju sa antigenom determinantom. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući deo je u stanju da se usmeri ka entitetu za koji se vezuje (npr., citokin ili drugi antigen-vezujući deo) za ciljani položaj, na primer, za specifičnu vrstu tumorske ćelije ili tumorsku stroma koja nosi antigenu determinantu. Antigen-vezujući delovi uključuju antitela i njihove fragmente, kao što su dalje definisani. Poželjni antigen-vezujući delovi uključuju antigen-vezujući domen antitela, koji sadrži varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. U određenim ostvarenjima, antigen-vezujući delovi mogu uključiti konstantne regione antitela, kako su dalje definisani i poznati u struci. Korisni konstantni regioni teškog lanca uključuju bilo koji od pet izotipova: a, 5, e, v ili m. Korisni konstantni regioni lakog lanca uključuju bilo koji od dva izotipaki A.
Pod "specifično vezivati" misli se na vezivanje koji je selektivno za antigen i može se razlikovati od neželjenih ili ne-specifičnih interakcija. Sposobnost antigen-vezujućeg dela da se vezuje za specifičnu antigenu determinantu može se utvrditi ili posredstvom enzimski-vezanog imunosorbent testa (ELISA) ili posredstvom drugih tehnika, bliskih stručnjaku u ovoj oblasti, npr., tehnika površinske plazmon rezonance (analiza vršena na BlAcore instrumentu) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) i uobičajeni testovi vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)).
Kako je ovde korišćen, naziv "antigena determinanta" je sinonim za "antigen" i "epitop" i odnosi se na položaj (npr., susedni niz aminokiselina ili konformacijska konfiguracija izrađena od različitih regiona aminokiselina koje nisu susedne) na polipeptidnom makromolekulu, za koji se vezuje antigen-vezujući deo, čime se formira kompleks antigen vezujući deo-antigen. Korisne antigene determinante mogu se naći, na primer, na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih virusima, na površinama drugih obolelih ćelija, koje su slobodne u krvnom serumu, i/ili u ekstracelularnom matriksu (ECM).
Kako je ovde korišćen, naziv "polipeptid" odnosi se na molekul, koji je sastavljen od monomera (aminokiseline) linearno vezanih uz pomoć amidnih veza (poznatih, takođe, kao peptidne veze). Naziv "polipeptid" se odnosi na bilo koji lanac od dve ili više aminokiselina, i ne odnosi se na specifičnu dužinu proizvoda. Sledstveno tome, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, "protein", "aminokiselinski lanac" ili bilo koji drugi naziv, koji se koristi u vezi sa lancem od dve ili više aminokiselina, uključeni su unutar okvira definicije "polipeptida", a naziv "polipeptid" može se koristiti umesto ostalih ili kao zamena bilo kom od ovih naziva. Naziv "polipeptid" je, takođe, utvrđen kako bi se odnosio na proizvode post-ekspresionih modifikacija polipeptida, uključujući, ali bez ograničavanja, glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju, posredstvom poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičko otcepljivanje, ili modifikacije od strane aminokiselina koje ne postoje u prirodi. Polipeptid može biti dobijen iz prirodnog biološkog izvora ili se može proizvesti rekombinantnom tehnologijom, ali nije neophodno da se izvrši translacija iz naznačene sekvence nukleinske kiseline. Navedeno može biti izvršeno na bilo koji način, uključujući hemijsku sintezu. Poliipeptid, kao što je ovde opisan, može biti veličine od oko 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 500 ili više, 1,000 ili više, ili 2,000 ili više aminokiselina. Polipeptidi mogu imati definisanu tro-dimenzionalnu strukturu, premda ne moraju neophodno biti takve strukture. Polipeptidi sa definisanom tro-dimenzionalnom strukturom označavaju se kao savijeni, a polipeptidi koji ne poseduju definisanu tro-dimenzionalnu strukturu, već pre mogu poprimiti veliki broj različitih konformacija, označene su kao nesavijeni polipeptidi.
Pod "izolovanim" polipeptiđom ili njegovom varijantom ili derivatom, misli se na polipeptid, koji nije u svom prirodnom miljeu. Nije potreban poseban nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid može biti izvučen iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini koji se ekspresuju u ćelijama domaćina, smatraju se izolovanim za potrebe izlaganja, budući da su oni nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su izdvojeni, frakcionisani ili parcijalno ili suštinski prečišćeni bilo kojom pogodnom tehnikom.
"Procent (%) istovetnosti aminokiselinske sekvence" u odnosu na referentnu polipeptidnu sekvencu definiše se kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidat sekvenci koji je identičan sa ostacima aminokiselina u referentnoj polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja šupljina, ukoliko je to potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat istovetnosti sekvenci, ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvenci. Poravnavanje za potrebe utvrđivanja procenta istovetnosti aminokiselinske sekvence može biti izvedeno na razne načine, koji su unutar okvira upućenosti u ovu oblast, na primer, uz korišćenje javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu odrediti odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, koji uključuju bilo kakve algoritme, koji su potrebni za postizavanje maksimalnog slaganja preko pune dužine sekvenci koje se upoređuju. Za potrebe ovog izlaganja, međutim, vrednosti % istovetnosti aminokiselinske sekvence dobijaju se korišćenjem kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 autorizovan je od strane Genentech, Inc., a izvorni kod je podnesen sa dokumentacijom korisnika u U.S. Copvright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod registraskim brojem U.S. Copvright Registration No. TXU510087. ALIGN-2 program je javno dostupan posredstvom Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornija, ili se može skinuti sa izvornog koda. ALIGN-2 program bi se mogao skinuti za korišćenje na UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Svi parametri poređenja sekvenci navedeni su u ALIGN-2 programu i nema varijacija. U situacijama gde se ALIGN-2 koristi za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % istovetnosti aminokiselinske sekvence date sekvence aminokiseline A u odnosu, sa ili prema datoj aminokiselinskoj sekvenci B (koji alternativno može biti izražen kao data aminokiselinska sekvenca A koja poseduje ili sadrži određeni % istovetnosti aminokiselinske sekvence u odnosu, sa ili prema datoj sekvenci aminokiseline B) izračunava se na sledeći način:
100 puta frakcija X/Y
pri čemu je X broj aminokiselinskih ostataka koji se računaju kao identična podudaranja posredstvom ALIGN-2 programa poravnavanja sekvenci u takvom programskom poravnavanju A i B, i pri čemu je Y ukupni broj ostataka aminokiselina u B. Uzeće se u obzir da kada dužina aminokiselinske sekvence A nije ista kao dužina sekvence aminokiselina B, % istovetnosti aminokiselinske sekvence A prema B neće biti jednak % istovetnosti sekvence aminokiselina B prema A. Ukoliko nije specifično drugačije navedeno, sve vrednosti % istovetnosti sekvenci aminokiselina, koje su ovde korišćene, dobijene su na način kako što je opisano u pasusu, koji neposredno prethodi, uz korišćenje kompjuterskog programa ALIGN-2.
Naziv "polinukleotid" odnosi se na izolovani molekul ili konstrukciju nukleinske kiseline, npr., glasnička RNK (mRNK), RNK, dobijena iz virusa ili plazmid DNK (pDNA). Polinukleotid može da sadrži konvencionalnu fosfodiestarsku vezu ili ne-konvencionalnu vezu (npr., amidnu vezu, kao što se nalazi u peptidima nukleinskih kiselina (PNA). Naziv "molekul nukleinske kiseline" odnosi se na bilo koji ili na više segmenata nukleinskih kiselina, npr., fragmenti DNK ili RNK, koji su prisutni u polinukleotidu.
Pod "izolovanim" molekulom nukleinske kiseline ili polinukleotida podrazumeva se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je odstranjen iz svog prirodnog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira terapeutski polipeptid, sadržan u vektoru, smatra se izolovanim za potrebe ovog izlaganja. Dalji primeri izolovanog polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide, koji se drže u heterolognim ćelijama domaćina ili prečišćene (parcijalno ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. Izolovani polinukleotid uključuje polinukleotidni molekul, koji je sadržan u ćelijama, koje uobičajeno sadrže polinukleotidni molekul, ali je molekul polinukleotida prisutan van hromosoma, ili na hromosomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromosomske lokacije. Izolovani molekuli RNK uključuju, ovde opisane,in vivoiliin vitroRNK transkripte, kao i pozitivne i negativne lančane forme, i dvo-struke forme. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom dalje uključuju takve molekule, koji su sintetski proizvedeni. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu biti ili mogu uključiti regulatorni element, kao što je promoter, ribosomski vezujući položaj ili transkripcioni terminator.
Pod nukleiskom kiselinom ili polinukleotidom, koji poseduje nukleotidnu sekvencu, koja je najmanje, na primer, 95% "identična" sa referentnom nukleotidnom sekvencom, koja je ovde opisana, podrazumeva se da je nukleotida sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci, s tom razlikom što polinukieotidna sekvenca može da uključi do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid, koji poseduje nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 95% identična sa referentnom nukleotidnom sekvencom, sve do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti izbrisano ili supstituisano sa drugim nukleotidom, ili broj nukleotida sve do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti umetnut u referentnu sekvencu. Ove izmene na referentnoj sekvenci mogu se desiti na 5' ili 3' terminalnim položajima referentne nukieotidne sekvence ili bilo gde drugo između ovih terminalnih položaja, tako što su ili rasuti pojedinačno između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence. Sa praktične strane, bez obzira da li je bilo koja određena polinukleotidna sekvenca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa nukleotidnom sekvencom, koja je ovde opisana, to se može utvrditi na konvencionalan način, korišćenjem poznatih kompjuterskih programa, kao što su oni koji su razmotreni prethodno u vezi sa polipeptidima (npr., ALIGN-2).
Izraz "ekspresiona kaseta" odnosi se na polinukleotid, proizveden rekombinantno ili sintetski, sa serijama specifikovanih elemenata nukleinskih kiselina, koji omogućuju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljnoj ćeliji. Rekombinantna ekspresiona kaseta može se ugraditi u plazmid, hromosom, mitohondrijalnu DNK, plastid DNK, virus ili fragment nukleinske kiseline. Uobičajeno, ekspresioni vektor kao deo rekombinantne ekspresione kasete uključuje, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koja se transkribuje i promoter. U određenim ostvarenjima, ovde opisana ekspresiona kaseta sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju mutant IL-2 polipeptide ili imunokonjugate, kao što su ovde opisani ili njihove fragmente.
Naziv "vektor" ili "ekspresioni vektor" je sinonim za "ekspresionu konstrukciju", a odnosi se na molekul DNK, koji se koristi za uvođenje i usmeravanje ekspresije specifičnog gena, za koji je on operativno vezan u ciljnoj ćeliji. Naziv uključuje vektor kao samo-replikujuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor koji je ugrađen u genom domaćinske ćelije u koju se isti uvodi. Ovde opisani ekspresioni vektor obuhvata ekspresionu kasetu. Ekspresioni vektori omogućuju transkripciju velikih količina stabilne mRNK. Čim se ekspresioni vektor nađe unutar ciljne ćelije, molekul ribonukleinske kiseline ili protein, koji je kodiran od strane gena, proizvodi se posredstvom ćelijske transkripcione i/ili translacione mašinerije. U jednom ostvarenju, ovde opisani ekspresioni vektor sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju mutant IL-2 polipeptide ili imunokonjugate, kao što su ovde opisani, ili njihove fragmente.
Naziv "veštački" odnosi se na sintetsku smešu ili smešu koja nije dobijena iz ćelije domaćina, npr., hemijski sintetisani oligonukleotid.
Nazivi "ćelija domaćina", "ćelijski niz domaćina" i "kultura ćelija domaćina" koriste se kao zamena jedan drugom, a odnose se na ćelije u koje se uvodi egzogena nukleinska kiselina, uključujući ćelije proistekle iz takve ćelije. Ćelije domaćina uključuju "transformante" i "transformisane ćelije", koje obuhvataju primarno transformisanu ćeliju i ćelije iz njih proistekle, bez obzira na broj pasaža. Ćelije naslednice ne moraju u potpunosti biti identične po sadržaju nukleinske kiseline sa matičnom ćelijom, ali mogu da sadrže mutacije. Ovde su, takođe, uključene proistekle mutant ćelije koje imaju istovetnu funkciju ili biološku aktivnost kao i skrinirane ili odabrane ćelije u originalno transformisanoj ćeliji.
Naziv "antitelo" ovde se koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, monoklonska antitela, poliklonska antitela, muItispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), i fragmente antitela, sve dotle dok ona ispoljavaju željenu aktivnost vezivanja antigena.
Nazivi "antitelo pune dužine", "intaktno antitelo" i "celo antitelo" koriste se kao zamena jedan drugom, kako bi se odnosilo na antitelo koje ima strukturu koja je suštinski slična strukturi nativnog antitela ili koje poseduje teške lance koji sadrže Fc region, kao što je ovde definisan.
"Fragment antitela" se odnosi na molekul koji se razlikuje od intaktnog antitela, i koji sadrži deo intaktnog antitela koji vezuje antigen, za koji se intaktno antitelo vezuje. Primeri fragmenata antitela obuhvataju, ali bez ograničavanja na njih, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diatela, linearna antitela, molekule jedno-lančanih antitela, (npr., scFv) i multispecifična antitela koja se obrazuju od fragmenata antitela. Za pregled pojedinih fragmenata antitela, vidi Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Za pregled scFv fragmenata, vidi, npr., Pluckthun, u The Pharmacologv of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); vidi, isto tako, WO 93/16185; i U.S. Patent Nos. 5,571,894 i 5,587,458. Za razmatranje o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže sakupljene ostatke receptor-vezujućeg epitopa i poseduju produženi in vivo polu-život, vidi U.S. Patent No. 5,869,046. Diatela su fragmenti antitela sa dva antigen-vezujuća položaja, koji mogu biti bivalentni ili bispecifični. Vidi, na primer, EP 404,097; VVO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134
(2003); i Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Triatela i tetratela su, takođe, opisali Hudson i saradnici, u Nat Med 9, 129-134 (2003). Fragmenti antitela mogu biti izrađeni različitim tehnikama, koje uključuju, ali bez ograničavanja na njih, proteolitičku digestiju intaktnog antitela, kao i proizvodnju posredstvom rekombinantnih ćelija domaćina (npr., E. coli ili fag), kao što je ovde opisano.
Naziv "imunoglobulinski molekul" odnosi se na protein koji poseduje strukturu antitela koje postoji u prirodi. Na primer, imunoglobulini IgG klase su heterotetramerni glikoproteini od približno 150,000 daltona, koji su sastavljeni od dva laka lanca i dva teška lanca, koji su vezani posredstvom disulfida. Od N- do C-terminusa, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe naziva varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, koga slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe označavaju kao konstantni region teškog lanca. Na sličan, od N- do C-terminusa, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe naziva varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, koga sledi konstantni laki (CL) domen, koji se isto tako naziva konstantni region lakog lanca. Teški lanac imunoglobuiina može se pripisati jednoj od pet klasa, koje se nazivaju a (IgA), 5 (ID), e (IgE), y (IgG) ili m (IgM), od kojih neke mogu biti dalje podeljene na podklase, npr., yi(lgG1),Y2(lgG2). Y3CgGa),Y4(lgG4), a-, (IgA,) i a2(lgA2). Laki lanac imunoglobuiina može biti pripisan jednom od dva tipa, koji se nazivaju kapa (k) i lambda (A), na osnovu aminokiselinske sekvence njegovog konstantnog domena. Imunoglobulin se suštinski sastoji od dva Fab molekula i Fc domena, koji su povezani preko zglobnog regiona imunoglobuiina.
Naziv "antigen-vezujući domen" odnosi se na deo antitela koji sadrži region koji se specifično vezuje za ili je komplementaran delu ili ćelom antigenu. Antigen-vezujući domen može biti dobijen, na primer, od jednog ili više varijabilnih domena antitela (koji se, isto tako, nazivaju varijabilni regioni antitela). Poželjno, antigen-vezujući domen sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) i varijabilni region teškog lanca (VH).
Naziv "varijabilni region" ili "varijabilni domen" odnosi se na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH, odnosno VL) nativnog antitela, uopšteno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri konzervisana regiona okvira (FR-i) i tri hipervarijabilna regiona (HVR-i). Vidi, npr., Kindt et al., Kuby lmmunology, 6. izdanje, W.H. Freeman i Co., strana 91 (2007). Pojedinačni VH ili VL domen može biti dovoljan za dobijanje specifičnosti vezivanja antigena.
Naziv "hipervarijabilni region" ili "HVR", kako se ovde koristi, odnosi se na svaki od regiona varijabilnog domena antitela, koji je po sekvenci hipervarijabilan i/ili koji formira strukturno definisane petlje ("hipervarijabilne petlje"). Uopšteno, nativna četvoro-lančana antitela sadrže šest HVR-a; tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). HVR-i uopšteno sadrže aminokiselinske ostatke iz hipervarijabilnih petlji i/ili iz regiona koji određuju komplementarnost (CDR-i), pri čemu je ovaj poslednji sa najvišom varijabilnošću sekvence i/ili je uključen u prepoznavanje antigena. Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR-i uopšteno sadrže aminokiselinske ostatke koji obrazuju hipervarijabilne petlje. Hipervarijabilni regioni (HVR-i) se, takođe označavaju kao "regioni koji određuju komplementarnost" (CDR-i), a ovi izrazi su ovde korišćeni kao zamena jedan drugom, u odnosu na delove varijabilnog regiona, koji formiraju antigen-vezujuće regione. Ovaj određeni region opisali su Kabat i saradnici, U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) i Chothia i saradnici, J Mol Biol 196:901-917 (1987), pri čemu definicije uključuju preklapanje ili podgrupe aminokiseliskih ostataka kada se upoređuju jedan sa drugim. Pored svega toga, određeno je da primena bilo koje definicije koja se odnosi CDR antitela ili njihovih varijanti, bude unutar okvira naziva, kako je ovde definisan i korišćen. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR-e, kako su definisani u svakoj od prethodno citiranih referenci, navedeni su dalje u Tabeli 1, u nastavku, kao poređenje. Tačan broj ostataka koje uključuje određeni CDR variraće u zavisnosti od sekvence i veličine CDR-a. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu rutinski utvrditi koji ostaci obrazuju pojedini CDR date aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona antitela.
Kabat i saradnici su, takođe, definisali sistem brojčanog označavanja za sekvence varijabilnog regiona, koji se može primeniti na bilo koje antitelo. Stručnjak u ovoj oblasti može nedvosmisleno dodeliti brojčanu oznaku ovog sistema "Kabat brojčanog označavanja" bilo kojoj sekvenci varijabilnog regiona, ne oslanjajući se na bilo kakve eksperimantalne podatke van same sekvence. Kako je ovde korišće, sistem "Kabat brojčanog označavanja" odnosi se na sistem numeracije koji su naveli Kabat i saradnici, U.S. Dept. of Health and Human Services, u "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Ukoliko nije drugačije naznačeno, reference koje se odnose na brojčane oznake položaja specifičnih aminokiselinskih ostataka u varijabilnom regionu antitela su u skladu sa Kabat sistemom brojčanog označavanja.
Polipeptidne sekvence sa spiska sekvenci (t.j., SEQ ID NO-i: 23, 25, 27, 29, 31, 33, itd.) nisu numerisane prema Kabat sistemu brojčanog označavanja. Međutim, licu uobičajene stručnosti u ovoj oblasti poznat je način prevođenja numeracije sekvenci sa Spiska sekvenci na Kabat brojčano označavanje.
"Region okvira" ili "FR" odnosi se na ostatke varijabilnog domena koji se razlikuju od ostataka hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena uopšteno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Sledstveno tome, HVR i FR sekvence se uopšteno pojavljuju sledećim redosledom u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"Klasa" antitela odnosi se na tip konstantnog domena ili konstantnog regiona, koji je u posedu njegovog teškog lanca. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neki od njih mogu biti dalje podeljeni na podklase (izotipove), npr., lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 i lgA2. Konstantni domeni teškog lanca, koji odgovaraju različitim klasama imunoglobuiina nazivaju se a, 5, e, y, odnosno\ i.
Naziv "Fc region" ovde je korišćen za definisanje C-terminalnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca, koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Naziv uključuje Fc regione nativne sekvence i varijante Fc regiona. Premda bi granice Fc regiona teškog lanca IgG mogle neznatno varirati, Fc region teškog lanca humanog IgG se uglavnom definiše kao da se proteže od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog kraja teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali ne mora biti prisutan.
"Modifikacija koja podstiče heterodimerizaciju" predstavlja manipulaciju peptidnom osnovom, ili post-translacijske modifikacije polipeptida, npr., teškim lancem imunoglobuiina, kojima se smanjuje ili sprečava udruživanje polipeptida sa identičnim polipeptiđom, da bi se obrazovao homodimer. Modifikacija koja podstiče heterodimerizaciju, kako je ovde korišćena, posebno uključuje zasebne modifikacije, koje su izvršene na svakom od dva polipeptida, za koje se želi formiranje dimera, pri čemu su modifikacije komplementarne jedna u odnosu na drugu, tako da se podstiče udruživanje dva polipeptida. Na primer, modifikacijom koja podstiče heterodimerizaciju može se izmeniti struktura ili naelektrisanje jednog ili oba polipeptida, za koje se želi formiranje dimera, tako da se njihova veza učini sterički, odnosno elektrostatski povoljnom. Heterodimerizacija se može odvijati između dva ne-identična polipeptida, kao što su dva teška lanca imunoglobuiina, pri čemu dalje komponente imunokonjugata, koje su spojene za svaki od teških lanaca (npr., IL-2 polipeptid) nisu istovetne. U imunokonjugatima ovog izlaganja, modifikacija koja podstiče heterodimerizaciju je na teškom lancu(lancima), specifično u Fc domenu imunoglobulinskog molekula. U nekim ostvarenjima, modifikacija koja podstiče heterodimerizaciju obuhvata aminokiselinsku mutaciju, specifično aminokiselinsku supstituciju.
U određenom ostvarenju, modifikacija koja podstiče heterodimerizaciju obuhvata zasebnu aminokiselinsku mutaciju, određenije aminokiselinsku supstituciju, u svakom od dva teška lanca imunoglobuiina.
Naziv "efektorske funkcije", kada se koriste u vezi sa antitelima, odnose se na one biološke aktivnosti, koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, što može varirati prema izotipu antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC), vezivanje za Fc receptor, antiteio-zavisnu ćelijski-posredovanu citotoksičnost (ADCC), antiteio-zavisnu ćelijsku fagocitozu (ADCP), sekreciju citokina, nishodnu regulaciju receptora ćelijske površine (npr., B-ćelijski receptor), i aktivaciju B-ćelija.
"Aktivirajući Fc receptor" je Fc receptor koji nakon zauzimanja od strane Fc regiona antitela potiče signalizacijska dešavanja koja stimulišu ćeliju koja nosi receptor da izvrši efektorske funkcije. Aktivirajući Fc receptori uključuju: FcvRllla (CD16a), Fc¥RI (CD64), FcvRlla (CD32) i FcaRI (CD89).
Kako su ovde korišćeni, smatra se da izrazi "inženjer, podvrgnut inženjeringu, inženjering" obuhvataju bilo koju manipulaciju peptidnom osnovom ili post-translacijske modifikacije polipeptida koji postoji u prirodi ili rekombinantnog polipeptida ili njegovog fragmenta. Inženjering obuhvata modifikacije aminokiselinske sekvence, ili glikozilacijskog obrasca, ili grupe bočnog lanca pojedinačnih aminokiselina, kao i kombinacije ovih pristupa.
Kako je ovde korišćen, naziv "imunokonjugat" odnosi se na polipeptidni molekul koji sadrži najmanje jedan IL-2 deo i najmanje jedan antigen-vezujući deo. U određenim ostvarenjima, imunokonjugat sadrži najmanje jedan IL-2 deo, i najmanje dva antigen-vezujuća dela. Pojedini imunokonjugati u skladu sa sa izlaganjem suštinski su sačinjeni od jednog IL-2 dela i dva antigen-vezujuća dela, povezana posredstvom jedne ili više sekvenci linkera. Antigen-vezujući deo može biti povezan sa IL-2 delom posredstvom brojnih interakcija i u raznolikim konfiguracijama, kao što je ovde opisano.
Kao što je ovde korišćen, izraz "kontrolni antigen-vezujući deo" odnosi se na antigen-vezujući deo, budući da bi on mogao postojati bez drugih antigen-vezujućih delova i efektorskih delova. Na primer, kada se upoređuje imunokonjugat Fab-IL2-Fab, kao što je ovde opisan, sa kontrolnim antigen-vezujućim delom, kontrolni antigen-vezujući deo je bez Fab, pri čemu se i Fab-IL2-Fab imunokonjugat i slobodni Fab molekul mogu specifično vezivati za istu antigenu determinantu.
Kako su ovde korišćeni, izrazi "prvi" i "drugi" u vezi sa antigen-vezujućim delovima, itd., koriste se da bi se na pogodan način napravila razlika kada postoji više od jedne vrste ovog dela. Namera korišćenja ovih izraza nije da se dodeli specifični redosleđ ili orijentacija imunokonjugatu, ukoliko nije eksplicitno tako navedeno.
"Efektivna količina" sredstva odnosi se na količinu koja je neophodna da bi se postigla fiziološka promena u ćeliji ili tkivu na kome se primenjuje.
"Terapeutski efektivna količina" sredstva, npr., farmaceutske smeše, odnosi se na količinu koja je, u potrebnim dozama i tokom neophodnog vremena, delotvorna u postizavanju željenog terapeutskog ili prolaktičkog rezultata. Terapeutski efektivna količina sredstva, na primer, eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizuje ili sprečava nepovoljne efekte bolesti.
"Pojedinac" ili "ispitanik" je sisar. Sisari uključuju, ali bez ograničavanja na njih, domaće životinje (npr., krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr., ljude i primate koji nisu ljudi, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr., miševe i pacove). Poželjno, pojedinac ili ispitanik je čovek.
Naziv "farmaceutska smeša" odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da je omogućeno da biološka aktivnost aktivnog sastojka, sadržanog u njemu, bude delotvorna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljive toksičnosti za ispitanika, kome bi se smeša primenjivala.
"Farmaceutski prihvatljivi nosač" odnosi se na sastojak, koji nije aktivni sastojak, i koji nije toksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljivi nosač uključuje, ali ne ograničavajući se na njih, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans,
Kako je ovde korišćen, izraz "tretman" (i njegove gramatičke varijacije, kao što su "lećiti" ili "lečenje") odnosi se na kliničku intervenciju koja se izvodi u cilju izmene prirodnog toka bolesti kod pojedinca koji se podvrgava lečenju, a može se vršiti ili u profilaktičke svrhe ili tokom trajanja kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali bez ograničavanja na njih, sprečavanje pojave ili ponovne pojave bolesti, ublažavanje simptoma, umanjivanje bilo kakvih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaziranja, smanjivanje brzine progresije bolesti, poboljšavanje ili smirivanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanje prognoze bolesti. U nekim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, koji su ovde opisani, korišćeni su za odlaganje razvoja bolesti ili usporavanje progresije bolesti.
Detaljni opis ostvarenja
Ovaj pronalazak ima za cilj obezbeđivanje mutant IL-2 polipeptida koji ima unapređene karakteristike za imunoterapijsku upotrebu. Određenije, pronalazak ima za cilj eliminisanje farmakoloških svojstava IL-2, koja doprinose toksičnosti, a nisu od suštinskog značaja za efikasnost IL-2. Kao što je ranije razmotreno, različiti oblici IL-2 receptora sastoje se od različitih podjedinica i ispoljavaju različite afinitete za IL-2. IL-2 receptor srednjeg afiniteta, koji se sastoji od B i v receptorskih podjedinica, ekspresuje se na efektorskim ćelijama u stanju mirovanja i dovoljan je za signalizaciju IL-2. IL-2 receptor visokog afiniteta, koji dodatno sadrži a-podjedinicu receptora, uglavnom se ekspresuje na regulatornim T (Treg) ćelijama, kao i na aktiviranim efektorskim ćelijama, gde njegovo zaposedanje od strane IL-2 može podstaći imunosupresiju posredovanu Treg ćelijama, odnosno ćelijsku smrt indukovanu aktivacijom (AICD). Sledstveno tome, a bez želje da se veže za određenu teoriju, redukovanje ili ukidanje afiniteta IL-2 za a-podjedinicu IL-2 receptora moglo bi smanjiti IL-2-indukovanu nishodnu regulaciju funkcije efektorskih ćelije posredstvom regulatomih T ćelija i razvoj tumorske tolerancije posredstvom AICD procesa. Sa druge strane, održavanje afiniteta prema IL-2 receptoru srednjeg afiniteta moglo bi sačuvati indukciju proliferacije i aktivaciju efektorskih ćelija, kao što su NK i T ćelije, posredstvom IL-2.
Nekolicina IL-2 mutanata već je poznata u struci, međutim, pronalazači su otkrili nove aminokiselinske mutacije na IL-2 polipeptidu i njihove kombinacije, koje su posebno pogodne za pružanje željenih karakteristika IL-2 za imunoterapiju.
Izlaganje obezbeđuje mutant interleukin-2 (IL-2) polipeptid, koji sadrži aminokiselinsku mutaciju kojom se ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora i zadržava afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa. Mutanti humanog IL-2 (hlL-2) sa smanjenim afinitetom za CD25 mogu, na primer, biti proizvedeni posredstvom supstitucije aminokiselina na aminokiselinskim položajima 35, 38, 42, 43, 45 ili 72 ili njihovim kombinacijama. Primeri aminokiselinskih supstitucija uključuju K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. Određeni, ovde opisani, IL-2 mutanti, sadrže mutaciju na aminokiselinskom položaju koji odgovara ostatku 42, 45 ili 72 humanog IL-2, ili njihovoj kombinaciji. Ovi mutanti ispoljavaju u suštini slične afinitete vezivanja za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, i poseduju značajno redukovani afinitet za a-podjedinicu IL-2 receptora i IL-2 receptor visokog afiniteta, u poređenju sa formom IL-2 mutanta divljeg tipa.
Ostale karakteristike korisnih mutanata mogu uključiti sposobnost indukovanja proliferacije T i/ili NK ćelija koje nose IL-2 receptor, sposobnost da se indukuje IL-2 signalizacija u T i/ili NK ćelijama koje nose IL-2 receptor, sposobnost proizvodnje interferona (IFN)-v, kao sekundarnog citokina, od strane NK ćelija, smanjenje sposobnosti izazivanja izrade sekundarnih citokina - posebno IL-10 i TNF-a, od strane mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC-i), smanjenje sposobnosti da se aktiviraju regulatorne T ćelije, smanjenje sposobnosti indukovanja apoptoze u T ćelijama, i smanjenje profila toksičnosti in vivo.
U jednom ostvarenju u skladu sa izlaganjem, aminokiselinska mutacija kojom se ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor visokog afiniteta i zadržava afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta nalazi se na položaju koji odgovara ostatku 72 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedena mutacija aminokiseline je aminokiselinska supstitucija. U jednom ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U još specifičnijem ostvarenju, navedena aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija L72G.
U određenom aspektu izlaganje obezbeđuje mutant IL-2 polipeptid, koji sadrži prvu i drugu aminokiselinsku mutaciju kojom se ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora i zadržava afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta IL-2 receptora. U jednom ostvarenju, navedena prva aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 72 humanog IL-2. u jednom ostvarenju, navedena prva aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija. U specifičnom ostvarenju, navedena prva aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju sačinjavaju L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U još određenijem ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je L72G. Navedena druga aminokiselinska mutacija je na različitom položaju u odnosu na prvu aminokiselinsku mutaciju. U jednom ostvarenju, navedena druga aminokiselinska mutacija je na položaju, koji je odabran od položaja, koji odgovara ostatku 35, 38, 42, 43 i 45 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedena aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija. U specifičnom ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je odabrana iz grupe koju sačinjavaju: K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U određenom ostvarenju, navedena aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 42 ili 45 humanog IL-2. U specifičnom ostvarenju, navedena druga aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju čine: F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U još specifičnijem ostvarenju, navedena aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija F42A ili Y45A. U određenijem ostvarenju, navedena druga aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 42 humanog IL-2. U specifičnom ostvarenju, navedena druga aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju sačinjavaju F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R i F42K. U još specifičnijem ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je F42A. U drugom ostvarenju, navedena druga aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 45 humanog IL-2. U specifičnom ostvarenju, navedena druga aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju sačinjavaju: Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U još specifičnijem ostvarenju navedena aminokiselinska supstitucija je Y45A. U određenim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptid sadrži treću aminokiselinsku mutaciju, kojom se ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora i zadržava afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa. Navedena treća aminokiselinska mutacija je na položaju koji se razlikuje od položaja navedenih prvih i drugih aminokiselinskih mutacija. U jednom ostvarenju, navedena treća aminokiselinska mutacija je na položaju, koji je odabran od položaja koji odgovara ostatku 35, 38, 42, 43 i 45 humanog IL-2. U poželjnom ostvarenju, navedena treća aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 42 ili 45 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedena treća aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 42 humanog IL-2. U drugom ostvarenju, navedena treća aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 45 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedena treća aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina. U specifičnom ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je odabrana iz grupe koju sačinjavaju: K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U još specifičnijem ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je odabrana iz grupe koju čine: F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U jednom još specifičnijem ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je F42A ili Y45A. U jednom ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je F42A. U drugom ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je Y45A. U određenim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptid ne sadrži aminokiselinsku mutaciju na položaju koji odgovara ostatku 38 humanog IL-2.
U jednom još određenijem aspektu izlaganja obezbeđen je mutant IL-2 polipeptid, koji sadrži tri aminokiselinske mutacije kojima se ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora, ali se zadržava afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta. U jednom ostvarenju, navedene tri aminokiselinske mutacije se nalaze na položajima koji odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedene tri aminokiselinske mutacije su aminokiselinske supstitucije. U jednom ostvarenju, navedene tri aminokiselinske mutacije su aminokiselinske supstitucije, odabrane iz grupe koju sačinjavaju: F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U specifičnom ostvarenju, navedene tri aminokiselinske mutacije su aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G.
U određenim ostvarenjima, navedena aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora za najmanje 5-puta, specifično za najmanje 10-puta, a još određenije za najmanje 25-puta. U ostvarenjima u kojima postoji više od jedne aminokiselinske mutacije, kojom se redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može redukovati afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora za najmanje 30-puta, za najmanje 50-puta, ili za čak najmanje 100-puta. U jednom ostvarenju, navedenom aminokiselinskom mutacijom ili kombinacijom aminokiselinskih mutacija ukida se afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora, tako da se vezivanje ne može detektovati posredstvom površinske plazmon rezonance, kao što je ovde u nastavku opisano.
Suštinski slično vezivanje za receptor srednjeg afiniteta, t.j., očuvanje afiniteta vezivanja mutant IL-2 polipeptida za navedeni receptor, postiže se kada IL-2 mutant ispoljava afinitet koji je veći od približno 70% afiniteta forme divljeg tipa IL-2 mutanta za IL-2 receptor srednjeg afiniteta. IL-2 mutanti, kao što su ovde opisani, mogu ispoljavati afinitet koji je veći od oko 80% i čak veći od oko 90% takvog afiniteta.
Pronalazači su utvrdili da se smanjivanjem afiniteta IL-2 za a-podjedinicu IL-2 receptora u kombinaciji sa eliminisanjem O-glikozilacije IL-2, proizvodi IL-2 protein sa poboljšanim karakteristikama. Na primer, eliminisanjem O-glikozilacijskog položaja proizvodi se još homogeniji proizvod kada se mutant IL-2 polipeptid ekspresuje u ćelijama sisara, kao što su CHO ili HEK ćelije.
Sledstveno tome, u određenim ostvarenjima, ovde opisani mutant IL-2 polipeptid sadrži dodatnu aminokiselinsku mutaciju, kojom se eliminiše O-glikozilacijski položaj IL-2 molekula na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedena dodatna aminokiselinska mutacija kojom se eliminiše O-glikozilacijski položaj IL-2 molekula na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2 je aminokiselinska supstitucija. Primeri aminokiselinskih supstitucija uključuju: T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K i T3P. U specifičnom ostvarenju, navedena dodatna aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija T3A.
U određenim ostvarenjima mutant IL-2 polipeptid je u suštini IL-2 molekul pune dužine. U određenim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptid je molekul humanog IL-2. U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1 sa najmanje jednom aminokiselinskom mutacijom koja ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora, ali održava afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, u poređenju sa IL-2 polipeptiđom koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1 bez navedene mutacije. U drugom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 3 sa najmanje jednom aminokiselinskom mutacijom kojom se ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora, ali se održava afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, u poređenju sa IL-2 polipeptiđom koji sadrži SEQ ID NO: 3,bez
navedene mutacije.
U specifičnom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid može pobuditi jedan ili više celularnih odgovora, odabranih iz grupe koju sačinjavaju: proliferacija u aktiviranim T-limfocitnim ćelijama, diferencijacija na nivou aktiviranih T-limfocitnih ćelija, citotoksična aktivnost T-ćelija (CTL), proliferacija na nivou aktiviranih B-ćelija, diferencijacija aktiviranih B-ćelija, proliferacija natural kiler (NK) ćelija, diferencijacija na nivou NK ćelija, sekrecija citokina od strane aktiviranih T ćelija ili NK ćelija i N K/l i mfočiti ma aktivirana kiler (LAK) antitumorska citotoksičnost.
U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid ima smanjenu sposobnost indukovanja IL-2 signalizacije u regulatornim T ćelijama, u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa. U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid indukuje manje aktivacijom indukovane ćelijske smrti (AICD) u T ćelijama, u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa. U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid ima redukovani profil toksičnosti in vivo, u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa. U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid ima produženi polu-život u serumu, u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa.
Određeni mutant IL-2 polipeptid, koji je ovde opisan, sadrži četiri aminokiselinske supstitucije na položajima koji odgovaraju ostacima 3, 42, 45 i 72 humanog IL-2. Specifične aminokiselinske supstitucije su: T3A, F42A, Y45A i L72G. Kao što je demonstrirano u priključenim Primerima, navedeni mutant IL-2 polipeptid sa četiri supstitucije ne pokazuje detektibilno vezivanje za CD25, ima smanjenu sposobnost indukovanja apoptoze u T ćelijama, smanjenu sposobnost izazivanja signalizacije IL-2 u Treg ćelijama i umanjen profil toksičnosti in vivo. Međutim, on zadržava sposobnost aktivacije signalizacije IL-2 u efektorskim ćelijama, indukovanja proliferacije efektorskih ćelija i proizvodnje IFN-v kao sekundarnog citokina od strane NK ćelija.
Pored toga, navedeni mutant IL-2 polipeptid ima dalje povoljne karakteristike, kao što su smanjena površinska hidrofobičnost, dobra stabilnost i dobar ekspresioni prinos, kao što je opisano u Primerima. Neočekivano, navedeni mutant IL-2 polipeptid, takođe, ispoljava produženi serumski polu-život u poređenju sa IL-2 divljeg tipa. IL-2 mutanti, kao što su ovde opisani, pored toga što poseduju mutacije u regionu IL-2, kojima se formira pristup vezivanju IL-2 sa CD25 ili glikozilacijskom položaju, takođe mogu imati jednu ili više mutacija u aminokiselinskoj sekvenci van ovih regiona. Takve dodatne mutacije u molekulu humanog IL-2 mogu obezbediti dodatne prednosti, kao što je povećana ekspresija ili stabilnost. Na primer, cistein na položaju 125 može biti zamenjen neutralnom aminokiselinom, kao što je serin, alanin, treonin ili valin, čime se proizvode C125S IL-2, C125A IL-2, C125T IL-2, odnosno C125V IL-2, kao što je opisano u U.S. Patentu broj 4,518,584. Kao što je u njemu opisano, moguće je, takođe, brisanje N-terminalnog alaninskog ostatka IL-2, čime se dobijaju mutanti, kao što su des-A1 C125S ili des-A1 C125A. Alternativno ili u kombinaciji s navedenim, IL-2 mutant može uključiti mutaciju kojom se metionin koji normalno postoji na položaju 104 humanog IL-2 divljeg tipa, zamenjuje neutralnom aminokiselinom, kao što je alanin (vidi U.S. Patent broj 5,206,344). Dobijeni mutanti, npr., des-A1 M104A IL-2, des-A1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2 ili M104A C125S IL-2 (ovi i drugi mutanti mogu se naći u U.S. Patentu Broj 5,116,943 i u VVeiger et al., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)), mogu biti korišćeni zajedno sa određenim mutacijama IL-2, kako su ovde opisane.
Tako, u određenim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptid, koji je ovde opisan, sadrži dodatnu aminokiselinsku mutaciju na položaju koji odgovara ostatku 125 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedena dodatna aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija C125A.
Stručnjak u ovoj oblasti biće u stanju da utvrdi koje dodatne mutacije mogu obezbediti dodatne prednosti za potrebe ovog pronalaska. Na primer, stručno lice će proceniti da aminokiselinske mutacije u sekvenci IL-2, kojima se redukuje ili ukida afinitet IL-2 za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, kao što su D20T, N88R ili 0.126D (vidi, npr., US 2007/0036752), ne moraju biti pogodne za uključivanje u, ovde opisani, mutant IL-2 polipeptid.
U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid, koji je ovde opisan, sadrži sekvencu, odabranu iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 19. U specifičnom ostvarenju, ovde opisani mutant IL-2 polipeptid, sadrži sekvencu SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 19. U još specifičnijem ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 19.
Mutant IL-2 polipeptidi, kao što su ovde opisani, posebno su korisni u kontekstu IL-2 fuzionih proteina, kao što su imunokonjugati koji nose IL-2. Takvi fuzioni proteini sadrže mutant IL-2 polipeptid, kao što ovde opisan, koji je spojen sa delom koji nije IL-2. Deo koji nije IL-2 može biti sintetski ili prirodni protein ili njegov deo ili varijanta. Primeri delova koji nisu IL-2 uključuju albumin ili domene antitela, kao što su Fc domeni ili antigen-vezujući domeni imunoglobuiina.
Imunokonjugati koji nose IL-2 su fuzioni proteini koji sadrže antigen-vezujući deo i IL-2 deo. Oni značajno povećavaju efikasnost terapije sa IL-2, putem direktnog ciljanog delovanja IL-2 npr., u mikrookruženje tumora. U skladu sa ovim izlaganjem, antigen-vezujući deo može biti celo antitelo ili imunoglobulin, ili njegov deo ili varijanta, koji poseduju biološko dejstvo, kao što je afinitet vezivanja specifičnog antitela.
Koristi od terapije imunokonjugatom lako su uočljive. Na primer, antigen-vezujući deo imunokonjugata prepoznaje tumor-specifični epitop i njegovo korišćenje dovodi do ciljanog delovanja molekula imunokonjugata na tumorski položaj. Sledstveno tome, visoke koncentracije IL-2 mogu biti oslobođene u tumorsko mikrookruženje, čime se postiže aktivacija i proliferacija brojnih imunskih efektorskih ćelija, koje su ovde pomenute, uz korišćenje mnogo niže doze imunokonjugata nego što bi bila potrebna za nekonjugovani IL-2. Pored toga, budući da primena IL-2 u obliku imunokonjugata omogućuje korišćenje manjih doza samog citokina, mogućnost neželjenih sporednih efekata IL-2 je ograničena, a ciljano delovanje IL-2 na specifični položaj u organizmu uz pomoć imunokonjugata može, isto tako, dovesti do smanjenja sistemske izloženosti i, sledstveno tome, do manje sporednih efekata, nego što se javljaju kod korišćenja nekonjugovanog IL-2. Pored navedenog, povećan cirkulišući polu-život imunokonjugata, u poređenju sa nekonjugovanim IL-2, doprinosi efikasnosti imunokonjugata. Međutim, ove karakteristike IL-2 imunokonjugata mogu, ponovno, pogoršati stanje u vezi sa potencijalnim sporednim efektima molekula IL-2: Zbog značajno dužeg cirkulišućeg polu-života imunokonjugata IL-2 u cirkulaciji krvi, u odnosu na nekonjugovani IL-2, povećana je mogućnost da IL-2 ili drugi delovi molekula fuzionog proteina aktiviraju komponente koje su uopšteno prisutne u vaskulaturi. Isti problem se odnosi i na druge fuzione proteine, koji sadrže IL-2, koji je spojen sa drugim delom, kao što je Fc ili albumin, što dovodi do produženog polu-života IL-2 u cirkulaciji. Sledstveno tome, posebno je koristan imunokonjugat koji sadrži mutant IL-2 polipeptid, kao što je ovde opisan, sa redukovanom toksičnošću u poređenju sa oblicima IL-2 divljeg tipa.
Sledstveno tome, izlaganje dalje obezbeđuje mutant IL-2 polipeptid, kao što je ovde ranije opisan, koji je vezan sa najmanje jednim delom koji nije IL-2. U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid i deo koji nije IL-2 obrazuju fuzioni protein, t.j., mutant IL-2 polipeptid deli peptidnu vezu sa delom koji nije IL-2. U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid je vezan sa prvim i drugim delom koji nije IL-2. U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim antigen-vezujućim delom, a drugi antigen-vezujući deo deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa i) mutant IL-2 polipeptiđom ili ii) prvim antigen-vezujućim delom. U specifičnom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa navedenim prvim delom koji nije IL-2, a amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim delom koji nije IL-2. U jednom ostvarenju, navedeni deo koji nije IL-2 jeste ciljni deo. U određenom ostvarenju, navedeni deo koji nije IL-2, jeste antigen-vezujući deo (koji sledstveno tome, obrazuje imunokonjugat sa mutant IL-2 polipeptiđom, kao što je detaljnije opisano u nastavku). U određenim ostvarenjima, antigen-vezujući deo je antitelo ili fragment antitela. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući deo je antitelo pune dužine. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući deo je imunoglobulinski molekul, posebno imunoglobulinski molekul IgG klase, a još određenije molekul imunoglobuiina koji pripada podklasi lgG1. U jednom takvom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa jednim od teških lanaca imunoglobuiina. U drugom ostvarenju, antigen-vezujući deo je fragment antitela. U nekim ostvarenjima, navedeni antigen-vezujući deo sadrži antigen-vezujući domen antitela, koji sadrži varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. U još specifičnijem ostvarenju, antigen-vezujući deo je Fab molekul ili scFv molekul. U određenom ostvarenju, antigen-vezujući deo je Fab molekul. U drugom ostvarenju, antigen-vezujući deo je scFv molekul. U jednom ostvarenju, navedeni antigen-vezujući deo je usmeren prema antigenu koji je prisutan na tumorskoj ćeliji ili u okruženju tumorske ćelije. U poželjnom ostvarenju, navedeni antigen je odabran iz grupe koju sačinjavaju: protein aktivacije fibroblasta (FAP), A1 domen tenascina-C (TNC A1), A2 domen tenascina-C (TNC A2), ekstra domen B fibronektina (EDB), karcinoembrijski antigen (CEA) i hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP). Kada je mutant IL-2 polipeptid vezan za više od jednog antigen-vezujućeg dela, npr., prvi i drugi antigen-vezujući deo, svaki antigen-vezujući deo može biti nezavisno odabran od različitih oblika antitela i fragmenata antitela. Na primer, prvi antigen-vezujući deo može biti Fab molekul, a drugi antigen-vezujući deo može biti scFv molekul. U specifičnom ostvarenju, svaki od navedenog prvog i navedenog drugog antigen-vezujućeg dela je scFv molekul ili je svaki od navedenog prvog i navedenog drugog antigen-vezujućeg dela Fab molekul. U određenom ostvarenju, svaki od navedenog prvog i navedenog drugog antigen-vezujućeg dela je Fab molekul. Isto tako, kada je mutant IL-2 polipeptid vezan sa više od jednog antigen-vezujućeg dela, npr., sa prvim i drugim antigen-vezujućim delom, antigen prema kome je svaki od antigen-vezujućih delova usmeren, može biti nezavisno odabran. U jednom ostvarenju, navedeni prvi i navedeni drugi antigen-vezujući delovi usmeren i su prema različitim antigenima. U drugom ostvarenju, navedeni prvi i navedeni drugi antigen-vezujući delovi usmereni su prema istom antigenu. Kao što je prethodno opisano, antigen je određenije antigen koji je prisutan na tumorskoj ćeliji ili u okruženju tumorske ćelije, a još određenije antigen koji je odabran iz grupe koju sačinjavaju: protein aktivacije fibroblasta (FAP), A1 domen tenascina-C (TNC A1), A2 domen tenascina-C (TNC A2), ekstra domen B fibronektina (EDB), karcinoembrijski antigen (CEA) i hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP). Antigen-vezujući region može dalje uključivati bilo koje karakteristike, pojedinačne ili kombinovane, koje su ovde opisane u vezi sa antigen-vezujućim domenima imunokonjugata.
Imunokonjugati
U određenom aspektu, izlaganje obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži mutant IL-2 polipeptid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija, kojima se ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora i održava afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, i najmanje jedan antigen-vezujući deo. U jednom ostvarenju, koje je ovde opisano, aminokiselinska mutacija, kojima se ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora i održava afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta nalazi se na poziciji koja je odabrana od položaja koji odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedena aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija. U jednom ostvarenju, navedena aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju sačinjavaju: F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K, još određenije aminokiselinska supstitucija odabrana iz grupe koju sačinjavaju: F42A, Y45A i L72G. U jednom ostvarenju, aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 42 humanog IL-2. U specifičnom ostvarenju, navedena aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju sačinjavaju: F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R i F42. U još specifičnijem ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je F42A. U drugom ostvarenju, aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 45 humanog IL-2. U specifičnom ostvarenju, navedena aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija, koja je odabrana iz grupe, sastavljene od: Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U još specifičnijem ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je Y45A. U jednom drugom ostvarenju, aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 72 humanog IL-2. U specifičnom ostvarenju, navedena aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija, odabrana iz grupe koju sačinjavaju: L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U još specifičnijem ostvarenju, navedena aminokiselinska supstitucija je L72G. U određenim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptid, koji je ovde opisan, ne sadrži aminokiselinsku mutaciju na položaju koji odgovara ostatku 38 humanog IL-2. U pojedinom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid, koji je sadržan u, ovde opisanom, imunokonjugatu, sadrži najmanje prvu i drugu aminokiselinsku mutaciju, koja ukida ili redukuje afinitet mutant IL-2 polipeptida za a-podjedinicu IL-2 receptora i održava afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta. U jednom ostvarenju, navedena prva i druga aminokiselinska mutacija nalaze se na dva položaja, koja su odabrana od položaja koji odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2. U jednom ostvarenju, navedene prva i druga aminokiselinska mutacija su aminokiselinske supstitucije. U jednom ostvarenju, navedene prva i druga aminokiselinska mutacija su aminokiselinske supstitucije, odabrane iz grupe koju sačinjavaju: F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U određenom ostvarenju, navedene prva i druga aminokiselinska mutacija su supstitucije aminokiselina, odabrane iz grupe koja je sastavljena od: F42A, Y45A i L72G. Mutant IL-2 polipeptid može, dalje, uključivati bilo koje od karakteristika, pojedinačnih ili u kombinaciji, koje su opisane u prethodnim paragrafima, u vezi sa mutant IL-2 polipeptidima iz ovog izlaganja. U jednom ostvarenju, navedeni mutant IL-2 polipeptid deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa navedenim antigen-vezujućim delom, koji je sadržan u imunokonjugatu, t.j., imunokonjugat je fuzioni protein. U određenim ostvarenjima, navedeni antigen-vezujući deo je antitelo ili fragment antitela. U nekim ostvarenjima, navedeni antigen-vezujući deo sadrži antigen-vezujući domen antitela, koji uključuje varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. Antigen-vezujući region može uključivati bilo koje od karakteristika, pojedinačnih ili u kombinaciji, koje su ovde prethodno i u nastavku opisane u vezi sa antigen-vezujućim domenima.
Formati imunokonjugata
Posebno poželjni formati imunokonjugata opisani su u PCT publikaciji broj WO 2011/020783. Ovi imunokonjugati sadrže najmanje dva antigen-vezujuća domena. Stoga, u jednom ostvarenju, imunokonjugat u skladu sa ovim izlaganjem sadrži najmanje prvi mutant IL-2 polipeptid, kao što je ovde opisan, i najmanje prvi i drugi antigen-vezujući deo. U određenom ostvarenju, navedeni prvi i drugi antigen-vezujući deo nezavino je odabran iz grupe koju sačinjavaju Fv molekul, posebno scFv molekul, i Fab molekul. U specifičnom ostvarenju, navedeni prvi mutant IL-2 polipeptid deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa navedenim prvim antigen-vezujućim delom, a navedeni drugi antigen-vezujući deo deli amino-ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa i) prvim mutant IL-2 polipeptiđom ili ii) prvim antigen-vezujućim delom. U određenom ostvarenju, imunokonjugat sadrži u suštini prvi mutant IL-2 polipeptid i prve i druge antigen-vezujuće delove, spojene posredstvom jedne ili više sekvenci linkera. Prednost takvih formata je u tome što se oni vezuju sa visokim afinitetom za ciljani antigen (kao što je tumorski antigen), ali samo uz monomerno vezivanje za IL-2 receptor, čime se izbegava ciljano delovanje imunokonjugata na imune ćelije koje nose IL-2 receptor na drugim lokacijama, nego što je ciljani položaj. U pojedinom ostvarenju, prvi mutant IL-2 polipeptid deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim antigen-vezujućim delom i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim antigen-vezujućim delom. U drugom ostvarenju, prvi antiigen-vezujući deo deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim mutant IL-2 polipeptiđom, i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim antigen-vezujućim delom. U drugom ostvarenju, prvi antigen-vezujući deo deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa prvim mutant IL-2 polipeptiđom, i dalje deli karboksi-terminalni peptid sa drugim antigen-vezujućim delom. U određenom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim varijabilnim regionom teškog lanca i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim varijabilnim regionom teškog lanca. U drugom ostvarenju mutant IL-2 polipeptid deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim varijabilnim regionom lakog lanca i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim varijabilnim regionom lakog lanca. U drugom ostvarenju, prvi varijabilni region teškog ili lakog lanca povezan je pomoću karboksi-terminalne peptidne veze za prvi mutant IL-2 polipeptid i dalje je spojen uz pomoć amino-terminalne peptidne veze za drugi varjabiilni region teškog ili lakog lanca. U drugom ostvarenju, prvi varijabilni region teškog ili lakog lanca povezan je uz pomoć amino-terminalne peptidne veze za prvi mutant IL-2 polipeptid, i dalje je povezan pomoću karboksi-terminalne peptidne veze za drugi varijabilni region teškog ili lakog lanca. U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim Fab teškim ili lakim lancem, i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim ili lakim lancem. U drugom ostvarenju, prvi teški ili laki lanac Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim mutant IL-2 polipeptiđom i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim teškim ili lakim lancem Fab. U drugim ostvarenjima, prvi Fab teški ili laki lanac deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa prvim mutant IL-2 polipeptiđom i dalje, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim ili lakim lancem. U jednom ostvarenju, imunokonjugat sadrži najmanje prvi mutant IL-2 polipeptid, koji deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa jednim ili više scFv molekula i dalje deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa jednim ili više scFv molekula.
Drugi naročito pogodni formati imunokonjugata sadrže imunoglobulinski molekul kao antigen-vezujući deo. U jednom takvom ostvarenju, imunokonjugat sadrži najmanje jedan mutant IL-2 polipeptid, kao što je ovde opisan, i imunoglobulinski molekul, posebno IgG molekul, a još određenije \ gG^ molekul. U jednom ostvarenju, imunokonjugat ne sadrži više od jednog mutant IL-2 polipeptida. U jednom ostvarenju, imunoglobulinski molekul je humani molekul. U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa imunoglobulinskim molekulom. U jednom ostvarenju, imunokonjugat u suštini sadrži mutant IL-2 polipeptid i imunoglobulinski molekul, posebno IgG molekul, a još određenije \ gGi molekul, koji su spojeni posredstvom jedne ili više linker sekvenci. U specifičnom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid je povezan sa svojom amino-terminalnom aminokiselinom za karboksi-terminalnu aminokiselinu jednog od teških lanaca imunoglobuiina. U određenim ostvarenjima, imunoglobulinski molekul sadrži u Fc domenu heterodimerizaciju dva ne-identična imunoglobulinska teška lanca, koja je podstaknuta modifikacijom. Položaj najobimnije protein-protein interakcije između dva polipeptidna lanca Fc domena humanog IgG je u CH3 domenu Fc domena. Sledstveno tome, u jednom ostvarenju, navedena modifikacija je u CH3 domenu Fc domena. U specifičnom ostvarenju, navedena modifikacija je modifikacija tipa "knob-into-hole", koja uključuje modifikaciju tipa čvora u jednom od teških lanaca imunoglobuiina i modifikaciju tipa šupljine u nekom drugom teškom lancu imunoglobuiina. Tehnologija "knob-into-hole" opisana je npr., u US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Čarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Uopšteno, postupak obuhvata uvođenje čvora ("knob") na pristupni položaj prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine ("hole") na pristupni položaj drugog polipeptida, na takav način da čvor može biti pozicioniran u šupljini tako da se podstakne formiranje heterodimera i spreči formiranje homodimera. Čvorovi su konstruisani zamenom malih bočnih aminokiselinskih lanaca iz pristupnog položaja prvog polipetida sa većim bočnim lancima (npr., tirozin ili triptofan). Kompenzatorne šupljine sa veličinama koje su identične ili slične veličini čvora kreiraju se na pristupnom položaju drugog polipeptida zamenom većih bočnih aminokiselinskih lanaca sličnim lancima (npr., alanin ili treonin). Čvor i šupljina mogu biti izrađeni zamenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr., posredstvom mutageneze sa specifičnošću prema položaju, ili posredstvom peptidne sinteze. U specifičnom ostvarenju "knob" modifikacija uključuje aminokiselinsku supstituciju T366VV u jednom od dva teška lanca imunoglobuiina, a "hole" modifikacija uključuje aminokiselinske supstitucije T366S, L368A i Y407V u onom drugom od dva teška lanca imunoglobuiina. U daljem specifičnom ostvarenju, teški lanac imunoglobuiina koji sadrži "knob" modifikaciju dodatno uključuje aminokiselinsku supstituciju S354C, a teški lanac imunoglobuiina koji sadrži "hole" modifikaciju dodatno uključuje aminokiselinsku supstituciju Y349C. Uvođenje ova dva cisteinska ostatka dovodi do formiranja disulfidnog mosta između dva teška lanca, čime se dalje stabilizuje dimer (Čarter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
U određenom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid je vezan za karboksi-terminalnu aminokiselinu teškog lanca imunoglobuiina, koja sadrži "knob" modifikaciju.
U alternativnom ostvarenju, modifikacija koja podstiče heterodimerizaciju dva ne-identična polipeptidna lanca uključuje modifikaciju, koja posreduje u elektrostatičkim steričkim efektima, kao što je npr., opisano u PCT publikaciji WO 2009/089004. Uopšteno, ovaj postupak obuhvata zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka u međuprostoru dva polipeptidna lanca naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da formiranje homodimera postaje elektrostatički nepovoljno, ali heterodimerizacija postaje elektrostatički povoljna.
Fc domen pruža imunokonjugatu povoljne farmakokinetičke karakteristike, koje uključuju dug serumski polu-život, koji doprinosi dobroj akumulaciji u ciljnom tkivu i povoljan odnos distribucije u tkivu i krvi. U isto vreme, to, međutim, može da dovede do nepoželjnog ciljanog delovanja imunokonjugata na ćelije koje ekspresuju Fc receptore, pre nego na ćelije koje nose poželjni antigen. Pored toga, ko-aktivacija Fc receptorskog puta signalizacije može dovesti do oslobađanja citokina, koji, u kombinaciji sa IL-2 polipeptiđom i dugim polu-životom imunokonjugata, dovodi do obimne aktivacije citokinskih receptora i ozbiljnih sporednih efekata, nakon sistemske primene. U vezi sa navedenim, opisano je da su konvencionalni lgG-IL-2 imunokonjugati udruženi sa infuzionim reakcijama (vidi, npr., King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)).
Sledstveno tome, u određenim ostvarenjima imunoglobulinski molekul, koji je sadržan u, ovde opisanom, imunokonjugatu, podvrgnut je inženjeringu, kako bi dobio redukovani afinitet vezivanja za Fc receptor. U jednom takvom ostvarenju, imunoglobulin u svom Fc domenu sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija, kojima se redukuje afinitet vezivanja imunokonjugata za Fc receptor. Uobičajeno, isovetna mutacija kao jedna ili više navedenih aminokiselinskih mutacija, prisutna je u svakom od dva teška lanca imunoglobuiina. U jednom ostvarenju, navedenom aminokiselinskom mutacijom smanjuje se afinitet vezivanja imunokonjugata za Fc receptor za najmanje 2-puta, za najmanje 5-puta ili za najmanje 10-puta. U ostvarenjima u kojima postoji više od jedne aminokiselinske mutacije, kojom se smanjuje afinitet vezivanja imunokonjugata za Fc receptor, kombinacija ovih mutacija aminokiselina može smanjiti afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor, za najmanje 10-puta, najmanje 20-puta ili za čak najmanje 50-puta. U jednom ostvarenju, imunokonjugat koji sadrži inženjeringom proizvedeni molekul imunoglobuiina ispoljava manje od 20%, posebno manje od 10%, a još određenije manje od 5% afinitteta vezivanja za Fc receptor, u poređenju sa imunokonjugatom koji sadrži imunoglobulinski molekul koji nije proizvod inženjeringa. U jednom ostvarenju, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U specifičnom ostvarenju, Fc receptor je Fcy receptor, a još određenije FcvRllla, FcvRI ili FcvRHa receptor. Poželjno, vezivanje za svaki od ovih receptora je smanjeno. U nekim ostvarenjima, afinitet vezivanja za komponentu komplementa, specifično afinitet vezivanja za C1q, takođe je redukovan. U jednom ostvarenju, afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) nije redukovan. Suštinski istovetno vezivanje za FcRn, t.j., očuvanje afiniteta vezivanja imunoglobuiina za navedeni receptor, postiže se kada imunoglobulin (ili imunokonjugat koji sadrži navedeni imunoglobulin) ispoljava afinitet vezivanja koji je veći od oko 70% afiniteta vezivanja imunoglobulinskog oblika koji nije prozveden inženjeringom (ili imunokonjugata koji sadrži navedeni oblik imunoglobuiina koji nije proizveden inženjeringom) za FcRn. Imunoglobulini ili imunokonjugati koji sadrže navedene imunoglobuline, mogu ispoljavati afinitet koji je veći od oko 80% i čak veći od oko 90% takvog afiniteta. U jednom ostvarenju, aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija. U jednom ostvarenju, imunoglobulin uključuje aminokiselinsku supstituciju na položaju P329 imunoglobulinskog teškog lanca (brojčano označavanje prema Kabatu). U još specifičnijem ostvarenju, aminokiselinska supstitucija je P329A ili P329G, a posebno P329G. U jednom ostvarenju, imunoglobulin uključuje dalju aminokiselinsku supstituciju na položaju, koji je odabran od: S228, E233, L234, L235, N297 i P331 teškog lanca imunoglobuiina. U još specifičnijem ostvarenju, dalja aminokiselinska supstitucija je: S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. U pojedinom ostvarenju, imunoglobulin uključuje aminokiselinske supstitucije na položajima P329, L234 i L235 teškog lanca imunoglobuiina. U još određenijem ostvarenju, imunoglobulin uključuje aminokiselinske mutacije L234A, L235A i P329G (LALA P329G). Ova kombinacija aminokiselinskih supstitucija gotovo u potpunosti ukida vezivanje za Fcv receptor humanog IgG molekula, i stoga smanjuje efektorsku funkciju, koja uključuje antiteio-zavisnu ćelijski-posredovanu citotoksičnost (ADCC).
U određenim ostvarenjima, imunokonjugat sadrži jedan ili više proteolitičkih položaja otcepljivanja, koji su locirani između mutant IL-2 polipeptida i antigen-vezujućih delova.
Komponente imunokonjugata (npr., antigen-vezujući delovi i/ili mutant IL-2 polipeptid) mogu biti povezane direktno ili posredstvom raznih linkera, posebno peptidnih linkera, koji sadrže jednu ili više aminokiselina, obično oko 2-20 aminokiselina, koje su ovde opisane ili su u struci poznate. Pogodni, ne-imunogeni linker peptidi, obuhvataju, na primer, (G4S)n, (SG4)nili G4(SG4)nlinker peptide, pri čemu je n uopšteno broj između 1 i 10, obično između 2 i 4.
Antigen-vezujući delovi
Antigen-vezujući deo, ovde opisanog, imunokonjugata je uopšteno polipeptidni molekul koji se vezuje za specifičnu antigenu determinantu i u stanju je da se usmeri prema entitetu za koji se vezuje( npr.,mutant IL-2 polipeptid ili drugi antigen-vezujući deo) za ciljani položaj, na primer, za specifični tip tumorske ćelije ili tumorsku stromu koja nosi antigenu determinantu. Imunokonjugat se može vezivati za antigene determinante, koje se nalaze, primera radi, na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih viruusom, na površinama drugih obolelih ćelija, koje su slobodne u krvnom serumu i/ili u ekstracelularnom matriksu (ECM).
Ne-ograničavajući primeri tumorskih antigena uključuju: MAGE, MART-1/Melan-A, gp100, dipeptidil peptidazu IV (DPPIV), adenozin deaminaza-vezujući protein (ADAbp), ciklofilin b, kolorektalno-povezani antigen (CRC)-C017-1A/GA733, karcinoembrionski antigen (CEA) i njegove imunogene epitope CAP-1 i CAP-2, etv6, amll, prostata-specifični antigen (PSA) i njegove imunogene epitope PSA-1, PSA-2 i PSA-3, prostata-specifični membranski antigen (PSMA), T-ćelijski receptor/CD3-zeta lanac, MAGE-familiju tumorskih antigena (npr., MAGE-A1, MAGE-A2, MAGEA3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGEXp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), GAGE-familiju tumorskih antigena (npr., GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirozinazu, p53, MUC familiju, HER2/neu, p21ras, RCAS1, a-fetoprotein, E-kadherin, a-katenin, B-katenin i y-katenin, p120ctn, gp100 Pmel117 PRAME, NYESO-1, cdc27, adenomatozni polipozni koli protein (APC), fodrin, koneksin 37, Ig-idiotip, p15, gp75, GM2 i GD2 gangliozidaze, virusne proizvode, kao što su proteini humanog papiloma virusa, Smad familiju tumorskih antigena, lmp-1, P1A, EBV-kodirani nuklearni antigen (EBNA)-1, moždanu glikogen fosforilazu, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 i CT-7, i c-erbB-2.
Ne-ograničavajući primeri virusnih antigena uključuju hemaglutinin virusa influence, LMP-1 Epstein-Barr virusa, E2 glikoprotein virusa hepatitisa C, HIV gp160 i HIV gp120.
Ne-ograničavajući primeri ECM antigena uključuju: sindekan, heparanazu, integrine, osteopontin, link, kadherine, laminin, laminin tipa EGF, lektin, fibronektin, notch, tenascin i matriksin.
Ovde opisani imunokonjugati mogu da se vezuju sa sledećim specifičnim ne-ograničavajućim primerima antigena ćelijske površine: FAP, Her2, EGFR, IGF-1R, CD2 (T-ćelijski površinski antigen), CD3 (heteromultimerno-udružen sa TCR), CD22 (B-ćelijski receptor), CD23 (IgE receptor slabog afiniteta), CD30 (citokinski receptor), CD33 (površinski antigen mijeloidne ćelije), CD40 (receptor tumor nekrozis faktora), IL-6R (receptor IL6), CD20, MCSP i PDGFBR (receptor B faktora rasta, dobijenog iz trombocita).
U jednom ostvarenju, ovde opisani imunokonjugat sadrži dva ili više antigen-vezujućih delova, pri čemu se svaki od ovih antigen-vezujućih delova specifično vezuju za istu antigenu determinantu. U drugom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dva ili više antigen-vezujućih delova, pri čemu se svaki od ovih antigen-vezujućih delova specifično vezuju za različite antigene determinante.
Antigen-vezujući deo može biti antitelo bilo kog tipa ili njegov fragment, koji zadržava specifično vezivanje za antigenu determinantu. Fragmenti antitela uključuju, ali bez ograničavanja na njih, VHfragmente, VLfragmente, Fab fragmente, F(ab')2fragmente, scFv fragmente, Fv fragmente, minitela, diatela, triatela i tetratela (vidi, npr., Hudson i Souriau, Nature Med 9, 129-134 (2003)).
Posebno pogodni antigen-vezujući delovi opisani su u PCT publikaciji broj WO 2011/020783.
U jednom ostvarenju, imunokonjugat sadrži najmanje jedan, a obično dva ili više antigen-vezujućih delova, koji su specifični za ekstra domen B fibronektina (EDB). U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži najmanje jedan, obično dva ili više antigen-vezujućih delova, koji mogu ulaziti u kompeticiju sa monoklonskim antitelom L19 za vezivanje za epitop EDB-a. Vidi, npr., PCT publikaciju WO 2007/128563 A1. U jednom drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, pri čemu prvi Fab teški lanac, koji je dobijen iz L19 monoklonskog antitela deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem, koji je dobijen iz L19 monoklonskog antitela. U jednom drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj prvi Fab laki lanac, koji je dobijen iz L19 monoklonskog antitela, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab lakim lancem, koji je dobijen iz L19 monoklonskog antitela. U daljem ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi scFv, koji je dobijen iz L19 monoklonskog antitela, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim scFv, dobijenim iz L19 monoklonskog antitela.
U još specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 199 ili njegovu varijantu, koja zadržava funkcionalnost. U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži laki lanac Fab, koji je dobijen iz L19 monoklonskog antitela. U još specifičnijem ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 201 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost. U jednom drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 199 i SEQ ID NO: 201 ili njihovim varijantama, koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, polipeptidi su uobičajeno povezani, npr., uz pomoć disulfidne veze.
U jednom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži najmanje jedan, a obično dva ili više antigen-vezujućih delova, koji su specifični za A1 domen tenascina (TNC-A1). U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži najmanje jedan, a obično dva ili više antigen-vezujućih delova, koji mogu ulaziti u kompeticiju sa monoklonskim antitelom F16 za vezivanje za epitop TNC-A1. Vidi, npr., PCT Publikaciju VVO 2007/128563 A1. U jednom ostvarenju, imunokonjugat sadrži najmanje jedan, a obično dva ili više antigen-vezujućih delova, koji su specifični za A1 i/ili A4 domen tenascina (TNC-A1 ili TNC-A4 ili TNC-A1/A4). U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj prvi Fab teški lanac, koji je specifičan za A1 domen tenascina deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem, koji je specifičan za A1 domen tenascina. U jednom drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj prvi laki lanac Fab, koji je specifičan za A1 domen tenascina deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab lakim lancem, koji je specifičan za A1 domen tenascina. U daljem ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi scFv, koji je specifičan za A1 domen tenascina, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim scFv, koji je specifičan za A1 domen tenascina. U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj imunoglobulinski teški lanac deli, koji je specifičan za TNC-A1, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom.
U specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 35, ili njihovim varijantama, koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 31, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 35, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 31, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost.
U drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 34 ili SEQ ID NO: 36. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence, koja je ili SEQ ID NO: 34 ili SEQ ID NO: 36. U drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 32. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence, koja je ili SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 32.
U specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 203 ili njihovim varijantama, koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, ovde opisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 205 ili SEQ ID NO: 215, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 207 ili SEQ ID NO: 237, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 205 i SEG ID NO: 207, ili njihovim varijantama, koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dve polipeptidne sekvence, koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 215 i SEQ ID NO: 237 ili njihovim varijantama, koje zadržavaju funkcionalnost.
U specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 204. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, kodiranu od strane polinukleotidne sekvence SEQ ID NO: 204. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 206 ili SEQ ID NO: 216. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence SEQ ID NO: 206 ili SEQ ID NO: 216. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 208 ili SEQ ID NO: 238. U jednom drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, kodiranu od strane polinukleotidne sekvence SEQ ID NO: 208 ili SEQ ID NO: 238.
U jednom ostvarenju, imunokonjugat sadrži najmanje jedan, a obično dva ili više antigen-vezujućih delova, koji su specifični za A2 domen tenascina (TNC-A2). U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj prvi Fab teški lanac, koji je specifičan za A2 domen tenascina deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa IL mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem, koji je specifičan za A2 domen tenascina. U jednom drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj prvi Fab laki lanac, koji je specifičan za A2 domen tenascina, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab lakim lancem, koji je specifičan za A2 domen tenascina. U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj imunoglobulinski teški lanac, koji je specifičan za TNC-A2, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom.
U specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, koja je odabrana iz grupe, sastavljene od: SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 i SEQ ID NO: 187, ili njihovih varijanti, koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 i SEQ ID NO: 185, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 i SEQ ID NO: 187, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe, koja je sastavljena od: SEQ ID NO: 23, SEG ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 i SEQ ID NO: 185, ili njihovih varijanti koje zadržavaju funkcionalnost.
U drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 i SEQ ID NO: 188. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence, koja je odabrana iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 i SEQ ID NO: 188. U drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 i SEQ ID NO: 186. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence, koja je odabrana iz grupe, sastavljene od: SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 i SEQ ID NO: 186.
U specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, koja je odabrana iz grupe koja je sastavljena od: SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 i SEQ ID NO: 245, ili njihovih varijanti koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, ovde opisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 i SEQ ID NO: 251, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 i SEQ ID NO: 245 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 i SEQ ID NO: 251 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, ovde opisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 241 i/ili SEQ ID NO: 249 ili SEQ ID NO: 251, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 243 i/ili SEQ ID NO: 247 ili SEQ ID NO: 249, ili njihovima varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 245 i SEQ ID NO: 247, ili njihovima varijantama koje zadržavaju funkcionalnost.
U specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244 i SEQ ID NO: 246. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence, koja je odabrana iz grupe, sastavljene od: SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244 i SEQ ID NO: 246. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koju sačinjavaju: SEG ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 i SEQ ID NO: 252. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence, koja je odabrana iz grupe, sastavljene od: SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 i SEQ ID NO: 252.
U jednom ostvarenju, imunokonjugat sadrži najmanje jedan, a obično dva ili više antigen-vezujućih delova koji su specifični za aktivirani protein fibroblasta (FAP). U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj prvi Fab teški lanac, koji je specifičan za FAP, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem, koji je specifičan za FAP. U jednom drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi Fab laki lanac, koji je specifičan za FAP, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab lakim lancem, koji je specifičan za FAP. U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj imunoglobulinski teški lanac, specifičan za FAP, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom.
U specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 i SEQ ID NO: 155, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koja je sastavljena od: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ !D NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 i SEQ ID NO: 153, ili njihovih varijanti koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, koja je odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 i SEQ ID NO: 155, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEG ID NO: 149 i SEQ ID NO: 153, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 41 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 39. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 51 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 49. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 111 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 109. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 143 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 141. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 151 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 149.
U drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 i SEQ ID NO: 156. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence koja je odabrana iz grupe, koja je sastavljena od: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEG ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 i SEQ ID NO: 156. U drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koja je sastavljena od: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEG ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 i SEQ ID NO: 154. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence koja je odabrana iz grupe koja je sastavljena od: SEG ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEG ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 i SEQ ID NO: 154.
U drugom specifičnom ostvarenju, ovde opisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227 i SEQ ID NO: 229 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235 i SEQ ID NO: 239 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, ovde opisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 211 ili SEQ ID NO: 219 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 233 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227 i SEQ ID NO: 229, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U daljem specifičnom ostvarenju, ovde opisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 213 i SEQ ID NO: 235 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost, U jednom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dve polipeptidne sekvence, koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 217 i SEQ ID NO: 239 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 219 i SEQ ID NO: 233 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dve polipeptidne sekvence, koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 221 i SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 223 i SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 225 i SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 227 i SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, ovde opisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 229 i SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 211 i SEQ ID NO: 233 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost.
U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301 i SEQ ID NO: 315, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303 i SEQ ID NO: 317, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 297 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 299 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 233 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 301 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 303 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 231 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 315 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 317 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 233 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost.
U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom, odabranom iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 i SEQ ID NO: 230. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence, odabranu iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 i SEQ ID NO: 230. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom koja je odabrana iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 i SEQ ID NO: 240. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence, koja je odabrana iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 i SEQ ID NO: 240.
U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom, koja je odabrana iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302 i SEQ ID NO: 316. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je odabrana iz grupe, sastavljene od: SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302 i SEQ ID NO: 316. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom koja je odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 300, SEG ID NO: 304 i SEQ ID NO: 318. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je odabrana iz grupe, sastavljene od: SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 304 i SEQ ID NO'318.
U jednom ostvarenju, imunokonjugat sadrži najmanje jedan, a obično dva ili više antigen-vezujućih delova, koji su specifični za proteoglikan hondroitin sulfata melanoma (MCSP). U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj prvi Fab teški lanac, koji je specifičan za MCSP, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem, koji je specifičan za MCSP. U jednom drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj prvi Fab laki lanac, koji je specifičan za MCSP, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa IL-2 molekulom, koja opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab lakim lancem, koji je specifičan za MCSP. U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj imunoglobulinski teški ianac, koji je specifičan za MCSP, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom.
U specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 189 ili SEQ ID NO: 193 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%>, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 191 ili SEG ID NO: 197 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 189 ili SEQ ID NO: 193, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 191 ili SEQ ID NO: 197, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 189, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 191. U drugom specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 193, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 191.
U drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 190 ili SEQ ID NO: 194. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence koja je ili SEQ ID NO: 190 ili SEQ ID NO: 194. U drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 192 ili SEQ ID NO: 198. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence koja je SEQ ID NO: 192 ili SEQ ID NO: 198.
U specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 253 ili SEQ ID NO: 257, ili sa njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 255 ili SEQ ID NO: 261, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, ovde opisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 253 ili SEQ ID NO: 257, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 255 ili SEQ ID NO: 261, ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 253 ili njenim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 255 ili njenim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 257 ili njenim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEG ID NO: 255 ili njenim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost.
U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 254 ili SEQ ID NO: 258. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence SEG ID NO: 254 ili SEQ ID NO: 258. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 256 ili SEQ ID NO: 262. U jednom druugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je ili SEQ ID NO: 256 ili SEQ ID NO: 262.
U jednom ostvarenju, imunokonjugat sadrži najmanje jedan, a obično dva ili više antigen-vezujućih delova koji su specifični za karcinoembrionski antigen (CEA). U drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj prvi Fab teški lanac, koji je specifičan za CEA, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji opet deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem, koji je specifičan za CEA. U jednom drugom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi Fab teški lanac, koji je specifičan za CEA deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom, koji sa druge strane deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem, koji je specifičan za CEA. U jednom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, u kojoj teški lanac imunoglobuiina, koji je specifičan za CEA, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutant IL-2 polipeptiđom. U specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 313 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost. U drugom specifičnom ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 311 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, antigen-vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 313, ili njenom varijantom koja zadržava fuunkcionalnost, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%o ili 100% identična s sekvencom SEQ ID NO: 311, ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost.
U drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 314. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence od SEQ ID NO: 314. U drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 312. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen-vezujućih delova imunokonjugata kodirana je od strane polinukleotidne sekvence od SEQ ID NO: 312.
U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 319, ili njenim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 321, ili njenim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu kojaa je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 323, ili njenim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U još specifičnijem ostvarenju, imunokonjugat, koji je ovde opisan, sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 319 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 321 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost, i polipeptidnu sekvencu, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 323 ili njenom varijantom koja zadržava funkcionalnost.
U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 320. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence SEQ ID NO: 320. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 322. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence SEQ ID NO: 322. U drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu, koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 324. U jednom drugom specifičnom ostvarenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana od strane polinukleotidne sekvence SEQ ID NO: 324.
Antigen-vezujući delovi, koji su ovde opisani, uključuju one sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa peptidnim sekvencama, koje su navedene pod SEQ ID NO-i 23-261 (neparni brojevi), 297-303 (neparni brojevi), 311 i 313, uključujući njihove funkcionalne fragmente ili varijante, izlaganje, takođe, obuhvata antigen-vezujuće delove, koji uključuju sekvence SEQ ID NO-i 23-261 (neparni brojevi), 297-303 (neparni brojevi), 311 i 313 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.
Polinukleotidi
Izlaganje, dalje, obezbeđuje izolovane polinukleotide, koji kodiraju mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat koji sadrži mutant IL-2 polipeptid, kao što je ovde opisan.
Polinukleotidi, koji su ovde opisani, uključuju one koji su najmanje oko 80%, 85%, 907o, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični sa sekvencama, koje su navedene pod SEQ ID NO-i: 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24-262 (parni brojevi), 293-296 i 298-324 (parni brojevi), uključujući njihove fuunkcionalne fragmente ili varijante.
Polinukleotidi, koji kodiraju mutant IL-2 polipeptide, koji nisu vezani za deo koji nije IL-2, uopšteno se ekspresuju kao jedan polinukleotid, koji kodira celokupni polipeptid.
U jednom ostvarenju, ovo izlaganje je usmereno na izolovani polinukleotid, koji kodira mutant IL-2 polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu mutant IL-2 od SEQ ID NO: 7, 11, 15 ili 19. Izlaganje, isto tako, obuhvata izolovani polinukleotid, koji kodira mutant IL-2 polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira mutant IL-2 polipeptid od SEQ ID NO: 7, 11, 15 ili 19 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.
U drugom ostvarenju, izlaganje se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira mutant IL-2 polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa nukleotidnom sekvencom, koja je odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ !D NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 i SEQ ID NO: 296. U drugom ostvarenju, izlaganje se odnosi na izolovani polinukleotid koji kodira mutant IL-2 polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je odabrana iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 i SEQ ID NO: 296. U drugom ostvarenju, izlaganje je usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nuukleinske kiseline koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa nukleotidnom sekvencom, koja je odabrana iz grupe, koja je sastavljena od: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 i SEQ ID NO: 296. U drugom ostvarenju, izlaganje se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je odabrana iz grupe koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 i SEQ ID NO: 296. Polinukleotidi koji kodiraju imunokonjugate, kao što su ovde opisani, mogu biti ekspresovani kao jedan polinukleotid koji kodira celokupni imunokonjugat ili kao višestruki (npr., dva ili više) polinukleotidi koji se ko-ekspresuju. Polipeptidi, koje ekspresuju polinukleotidi, koji se ko-ekspresuju mogu da se povežu posredstvom, npr., disulfidnih veza ili na druge načine da bi se obrazovao funkcionalni imunokonjugat. Na primer, teški lanac kao deo antigen-vezujućeg dela može biti kodiran od strane zasebnog polinukleotida iz dela imunokonjugata, koji sadrži deo lakog lanca antigen-vezujućeg dela i mutant IL-2 polipeptid. Kada se vrši ko-ekspresovanje, polipeptidi teškog lanca udružiće se sa polipeptidima lakog lanca, da bi se obrazovao antigen-vezujući deo. Alternativno, u drugom primeru, deo lakog lanca iz antigen-vezujućeg dela mogao bi biti kodiran od strane zasebnog polinukleotida iz dela imunokonjugata koji sadrži deo teškog lanca iz antigen-vezujućeg dela i mutant IL-2 polipeptid. U jednom ostvarenju, izolovani polinukleotid, kao što je ovde opisan, kodira fragment imunokonjugata, koji uključuje mutant IL-2 polipeptid i antigen-vezujući deo. U jednom ostvarenju, izolovani polinukleotid, kao što je ovde opisan, kodira teški lanac antigen-vezujućeg dela i mutant IL-2 polipeptid. U drugom ostvarenju, izolovani polinukleotid, kao što je ovde opisan, kodira laki lanac antigen-vezujućeg dela i mutant IL-2 polipeptid.
U specifičnom ostvarenju, izolovani polinukleotid, kao što je ovde opisan, kodira fragment imunokonjugata, koji sadrži barem jedan mutant IL-2 polipeptid, i najmanje jedan, a poželjno dva ili više antigen-vezujućih delova, pri čemu prvi mutant IL-2 polipeptid deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim antigen-vezujućim delom, a drugi antigen-vezujući deo deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim mutant IL-2 polipeptiđom ili prvim antigen-vezujućim delom. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući delovi su nezavisno odabrani iz grupe koju sačinjavaju: Fv molekul, posebno scFv molekul i Fab molekul. U drugom specifičnom ostvarenju, polinukleotid kodira teške lance iz dva antigen-vezujuća dela i jedan mutant IL-2 polipeptid. U drugom specifičnom ostvarenju, polinukleotid kodira lake lance iz dva antigen-vezujuća dela i jedan mutant IL-2 polipeptid. U drugom specifičnom ostvarenju, polinukleotid kodira jedan laki lanac iz jednog od antigen-vezujućih delova, jedan teški lanac iz drugog antigen-vezujućeg dela ijedan mutant IL-2 polipeptid.
U drugom specifičnom ostvarenju, izolovani polinukleotid, kao što je ovde opisan, kodira fragment imunokonjugata, pri čemu polinukleotid kodira teške lance iz dva Fab molekula i mutant IL-2 polipeptid. U drugom specifičnom ostvarenju, izolovani polinukleotid, kao što je ovde opisan, kodira fragment imunokonjugata, pri čemu polinukleotid kodira lake lance iz dva Fab molekula i mutant IL-2 polipeptid. U drugom specifičnom ostvarenju, izolovani polinukleotid, kao što je ovde opisan, kodira fragment imunokonjugata, pri čemu polinukleotid kodira teški lanac iz jednog Fab molekula, laki lanac drugog Fab molekula i mutant IL-2 polipeptid.
U jednom ostvarenju, izolovani polinukleotid, kao što je ovde opisan, kodira imunokonjugat, koji sadrži najmanje jedan mutant IL-2 polipeptid, spojen na svojim amino- i karboksi-terminalnim aminokiselinama za jedan ili više scFv molekula.
U jednom ostvarenju, izolovani polinukleotid, kao što je ovde opisan, kodira fragment imunokonjugata, pri čemu polinukleotid kodira teški lanac imunoglobulinskog molekula, posebno IgG molekula, još određenije lgG1 molekula, i mutant IL-2 polipeptid. U još specifičnijem ostvarenju, izolovani polinukleotid kodira teški lanac imunoglobulinskog molekula i mutant IL-2 polipeptid, pri čemu mutant IL-2 polipeptid deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem imunoglobuiina.
U drugom ostvarenju, ovo izlaganje se odnosi na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona, kao što je prikazana u SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 ili 313. U drugom ostvarenju, ovo izlaganje se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 ili 323. U drugom ostvarenju, izlaganje je dalje usmereno na izolovani polinukleotid, koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa nukleotidnom sekvencom, koja je prikazana u SEG ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 312, 314, 316, 318, 320, 322 ili 324. U drugom ostvarenju, izlaganje se odnosi na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline, koja je prikazana u SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118. 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 312, 314, 316, 318, 320, 322 ili 324. U drugom ostvarenju, izlaganje je usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 ili 313. U drugom ostvarenju, izlaganje se odnosi na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 ili 323. Izlaganjem je obuhvaćen izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvence varijabilnog regiona SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 ili 313, sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. Izlaganje, takođe, uključuje izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat, kao što je ovde opisan, ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidne sekvence SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 ili 323, sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.
U određenim ostvarenjima, polinukleotid ili nukieinska kiselina je DNK. U ostalim ostvarenjima, polinukleotid, kao što je ovde opisan, jeste RNK, na primer, u obliku glasničke RNK (mRNK), RNK, kao što je ovde opisana, može biti jednolančana ili dvolančana.
Rekombinantni postupci
Mutant IL-2 polipeptidi, kao što su ovde opisani, mogu biti pripremljeni uz pomoć delecije, supstitucijje, umetanja ili modifikacije, uz korišćenje genetskih ili hemijskih postupaka, koji su u struci dobro poznati. Genetski postupci mogu uključiti mutagenezu koja je specifična u odnosu na položaj kodirajuće DNK sekvence, PCR, gensku sintezu i slične postupke. Ispravne nukleotidne izmene mogu biti verifikovane, na primer, sekvenciranjem. U odnosu na navedeno, nukleottdnu sekvencu nativnog IL-2 opisali su Taniguchi i saradnici (Nature 302, 305-10 (1983)), a nukieinska kiselina koja kodira humani IL-2 dostupna je iz javnih skladišta deponovanih kultura, kao što je American Type Culture Collection (Rockville MD), Sekvenca nativnog humanog IL-2 prikazana je u SEQ ID NO: 1. Supstitucija ili umetanje može da uključi prirodne aminokiselinske ostatke, kao i aminokiselinske ostatke koji u prirodi ne postoje. Aminokiselinska modifikacija uključuje dobro poznate postupke hemijske modifikacije, kao što je adicija glikozilacijskih položaja ili položaja vezivanja ugljenih hidrata, i slične postupke.
Mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, kao što su ovde opisani, mogu biti dobijeni, na primer, posredstvom sinteze peptida u čvrstom stanju ili rekombinantne proizvodnje. U slučaju rekombinantne proizvodnje, jedan ili više polinukleotida koji kodiraju navedeni mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat (fragment), npr., kao što je prethodno opisan, izdvaja se i umeće u jedan ili više vektora za dalje kloniranje i/ili ekspresiju u ćeliji domaćina. Takav polinukleotid se može jednostavno izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih procedura. U jednom ostvarenju, obezbeđen je vektor, poželjno ekspresioni vektor, koji sadrži jedan ili više polinukleotida, koji su ovde opisani. Postupci, koji su stručnjacima u ovoj oblasti dobro poznati, mogu biti korišćeni za konstruisanje ekspresionih vektora, koji sadrže kodirajuću sekvencu mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata (njegovog fragmenta) zajedno sa odgovarajućim transkripciono/translacijskim kontrolnim signalima. Ovi postupci uključujuin vitrorekombinantne DNK tehnike, sintetske postupke iin vivorekombinaciju/genetsku rekombinaciju.Vidi,na primer, tehnike koje su opisali Maniatis i saradnici u MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratorv, N.Y. (1989); i Ausubel i saradnici u CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Ekspresioni vektor može biti deo plazmida i virusa ili može biti fragment nukleinske kiseline. Ekspresioni vektor sadrži ekspresionu kasetu u koju je kloniran polinukleotid koji kodira IL-2 mutant ili imunokonjugat (fragment) (t.j., kodirajući region), i koji je operativno povezan sa promoterom i/ili drugim transkripcionim ili translacijskim kontrolnim elementima. Kako je ovde korišćen, "kodirajući region" je deo nukleinske kiseline, koji je sastavljen od kodona, translacijom prenesenih u aminokiseline. Premda se "stop kodon" (TAG, TGA ili TAA) ne prenosi u aminokiselinu, on se može smatrati delom kodirajućeg regiona, ukoliko je prisutan, ali bilo koja od bočno vezanih sekvenci, kao što su, na primer, promoteri, ribosomski vezujući položaji, transkripcioni terminatori, introni, 5' i 3' netranslatovani regioni, i slične sekvence, nije deo kodirajućeg regiona. Dva ili više kodirajućih regiona može biti prisutno u pojedinačnoj konstrukciji polinukleotida,npr.,u jednom vektoru, ili u zasebnim polinukleotidnim konstrukcijama,npr,u odvojenim (različitim) vektorima. Pored toga, bilo koji vektor može sadržavati pojedinačni kodirajući region, ili može da sadrži dva ili više kodirajućih regiona,npr.,vektor, kao što je ovde opisan, može kodirati jedan ili više poliproteina, koji su post- ili ko-translacijom razdvojeni u završne proteine, posredstvom proteolitičkog otcepljivanja. Dodatno, vektor, polinukleotid ili nukieinska kiselina, kao što su ovde opisani, mogu kodirati heterologne kodirajuće regione, koji su ili spojeni ili su razdvojeni, u odnosu na prvi ili drugi polinukleotid koji kodira, ovde opisane, polipeptide, ili njihove varijante ili derivate. Heterologni kodirajući regioni uključuju, bez ograničavanja, specijalizovane elemente ili motive, kao što je sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen. Operativno povezivanje se odvija kada se kodirajući region za genski proizvod,npr.,polipeptid, udružuje sa jednom ili više regulatornih sekvenci na takav način da se ekspresija genskog proizvoda stavlja pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence(sekvenci). Dva fragmenta DNK (kao što je polipeptidni kodirajući region i promoter, povezan s njima) su "operativno povezani" ukoliko indukcija promoterske funkcije dovodi do transkripcije mRNK, koja kodira željeni genski proizvod i ukoliko priroda veze između dva fragmenta DNK ne interferira sa sposobnošću ekspresionih regulatornih sekvenci da usmeravaju ekspresiju genskog proizvoda ili ne interferira sa sposobnošću šablona DNK da bude transkribovan. Sledstveno tome, region promotera bi bio operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid, ukoliko je promoter u stanju da deluje na transkripciju te nukleinske kiseline. Promoter može biti ćelijski-specifičan promoter, koji suštinski značajnu transkripciju DNK provodi samo u predodređenim ćelijama. Ostali elementi kontrole transkripcije, pored promotera, na primer, regioni za pojačavanje, operateri, represori i signali transkripcione terminacije, mogu biti operativno povezani sa polinukleotidom, da bi usmeravali ćelijski-specifičnu transkripciju. Pogodni promoteri i drugi regioni kontrole transkripcije ovde su prikazani. Brojni regioni kontrole transkripcije poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Oni uključuju, ali ne ograničavajući se njima, regione kontrole transkripcije, koji imaju funkciju u ćelijama kičmenjaka, kao što su, ali bez ograničavanja na njih, segmenti promotera i regiona za pojačavanje iz citomegalovirusa( npr.,veoma rani promoter, u vezi sa intronom-A), majmunskog virusa 40( npr.,rani promoter) i retrovirusa (kao što je,npr.,virus Rous sarkoma). Ostali regioni kontrole transkripcije uključuju regione koji su dobijeni iz gena kičmenjaka, kao što su: aktin, protein toplotnog šoka, goveđi hormon rasta i zečji B-globin, kao i druge sekvence koje su u stanju da kontrolišu gensku ekspresiju u eukariotskim ćelijama. Dodatni pogodni regioni kontrole transkripcije uključuju tkivno-specifične promotere i regione pojačavanja, kao i promotere koji se mogu indukovati( npr.,promoteri koje je moguće indukovati tetraciklinima). Slično navedenim, brojni drugi elementi kontrole translacije poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Oni obuhvataju, ali ne ograničavajući se istima, položaje vezivanja ribosoma, elemente inicijacije translacije i terminacione kodone, i elemente, koji se dobijaju iz virusnih sistema (posebno interni položaj ribosomskog ulaza, ili IRES, koji se, takođe, označava kao CITE sekvenca). Ekspresiona kaseta može, isto tako, da uključi ostale elemente karakteristika, kao što su elementi početka replikacije i/ili elementi hromosomske integracije, kao što su retrovirusni dugi terminalni ponovci (LTR-i) ili obrnuti, sa adeno-virusima (AAV) povezani terminalni ponovci (ITR-i).
Kodirajući regioni polinukleotida i nukleinskih kiselina, koji su ovde opisani, mogu biti udruženi sa dodatnim kodirajućim regionima, koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide, koji usmeravaju sekreciju polipeptida, kodiranog od strane polinukleotida, kako je ovde opisano. Na primer, ukoliko je poželjna sekrecija mutant IL-2 polipeptida, DNK koja kodira signalnu sekvencu može biti postavljena ushodno u odnosu na nukleinsku kiselinu koja kodira zrele aminokiseline mutant IL-2. Isto se primenjuje na, ovde opisane, imunokonjugate ili njihove fragmente. U skladu sa hipotezom o signalima, proteini, koje sekretuju ćelije sisara, imaju signalni peptid ili sekretornu lider sekvencu, koja se otcepljuje sa zrelog proteina, čim se pokrene izlazak rastućeg lanca proteina duž grubog endoplazmatskog retikuluma. Stručnjaci u ovoj oblasti su svesni činjenice da polipeptidi, koje sekretuju ćelije kičmenjaka, uopšteno imaju signalni peptid spojen sa N-krajem polipeptida, koji se otcepljuje sa translatovanog polipeptida, da bi se proizvela sekretovana ili "zrela" forma polipeptida. Na primer, vrši se translacija humanog IL-2 sa signalnom sekvencom od 20 aminokiselina na N-terminusu polipeptida, koja se nakon toga otcepljuje, da bi se proizveo zreli, humani IL-2 sa 133 aminokiseline. U određenim ostvarenjima, koristi se nativni signalni peptid,npr.,signalni peptid IL-2 ili signalni peptid imunoglobulinskog teškog lanca ili lakog lanca, ili funkcionalni derivat te sekvence, koji zadržava sposobnost usmeravanja sekrecije polipeptida, sa kojim se operativno povezuje. Alternativno, može biti korišćen heterologni signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, lider sekvenca divljeg tipa može biti supstituisana sa lider sekvencom humanog tkivnog aktivatora plazminogena (TPA) ili mišje B-glukuronidaze. Primeri aminokiselinskih i polinukleotidnih sekvenci sekretornih signalnih peptida prikazani su u SEQ ID NO-i 236-273.
DNK koja kodira kratku proteinsku sekvencu, koja bi se mogla koristiti za olakšavanje prečišćavanja koje sledi (npr., histidinski tag) ili asistiranje u obeležavanju IL-2 mutanta ili imunokonjugata, može biti uključena unutar okvira ili na krajevima IL-2 mutanta ili imunokonjugata (fragmenta), koji kodira polinukleotid.
U daljem ostvarenju, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži jedan ili više polinukleotida, kao što su ovde opisani. U određenim ostvarenjima, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži jedan ili više vektora, kao što su ovde opisani. Polinukleotidi i vektori mogu uključiti bilo koju od karakteristika, pojedinačnih ili u kombinaciji, koje su ovde opisane u vezi sa polinukleotidima, odnosno vektorima. U jednom takvom ostvarenju, ćelija domaćina sadrži (npr., tako da je izvršeno transformisanje ili transfekcija njime) vektor, koji uključuje polinukleotid, koji kodira aminokiselinsku sekvencu, koju sadrži mutant IL-2 polipeptid, koji je ovde opisan. Kako je ovde korišćen, naziv "ćelija domaćina" odnosi se na bilo koju vrstu ćelijskog sistema koji može biti proizveden inženjeringom, da bi se proizveli mutant IL-2 polipeptidi ili imunokonjugati, koji su ovde opisani, ili njihovi fragmenti. Ćelije domaćina, koje su pogodne za replikaciju i za potporu ekspresiji mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, dobro su poznate u struci. Takve ćelije mogu biti podvrgnute transfekciji ili transdukciji, prema tome što je korisnije za pojedini ekspresioni vektor i velike količine vektora, koji sadrže ćelije, da bi se mogle uzgojiti za zasejavanje u sudovima za fermentaciju velikih obima, da bi se dobile dovoljne količine IL-2 mutanta ili imunokonjugata za kliničke primene. Pogodne ćelije domaćina uključuju prokariotske mikroorganizme, kao što je E. coli, ili razne eukariotske ćelije, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelije insekta ili slične ćelije. Na primer, polipeptidi mogu biti proizvedeni u bakterijama, posebno kada nije potrebna glikozilacija. Nakon ekspresije, polipeptid se može izolovati iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji i može biti dalje prečišćen. Pored prokariota, i eukariotski mikroorganizmi, kao što filamentozne gljive ili kvasci, pogodni su kao domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju polipeptide, uključujući sojeve gljivica i kvasaca, čiji putevi glikozilacije su "humanizovani", što za posledicu ima proizvodnju polipeptida sa parcijalno ili potpuno humanim modelom glikozilacije. Vidi, Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), i Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Pogodne domaćinske ćelije za ekspresiju (glikozilovanih) polipeptida takođe se dobijaju iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji se mogu koristiti zajedno sa ćelijama insekata, posebno za transfekcijuSpodoptera frugiperdaćelije. Kulture biljnih ćelija takođe se mogu koristiti kao domaćini. Vidi, npr., US Patente Br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 i 6,417,429 (koji opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenskim biljkama). Kao domaćini takođe se mogu koristiti ćelije kičmenjaka. Na primer, od koristi mogu biti ćelijski nizovi sisara, koji su adaptirani na rast u suspenziji. Ostali primeri korisnih ćelijskih nizova sisara su: ćelijski niz bubrega majmuna CV1, transformisan sa SV40 (COS-7); humani embrionski ćelijski niz bubrega (293 ili 293T ćelije, kao što su opisane, npr., u Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), ćelijski niz mišjih sertolijevih ćelija (TM4 ćelije, kao što su opisane, npr., u Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), ćelije humanog cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije psećeg bubrega (MDCK), bivolje-pacovske jetrene ćelije (BRL 3A), humane plućne ćelije (W138), humane jetrene ćelije (Hep G2), mišje ćelije tumora dojke (MMT 060562), TRI ćelije (kao što su opisane, npr., u Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), MRC 5 ćelije i FS4 ćelije. Ostali korisni domaćinski ćelijski nizovi sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući dhfr-CHO ćelije (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)) i ćelijske nizove mijeloma, kao što su YO, NSO, P3X63 id Sp2/0. Za prikaz određenih domaćinskih ćelijskih nizova sisara, koji su pogodni za proizvodnju proteina, vidi, npr., Vazaki i Wu, Methods in Molecular Biologv, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totovva, NJ), pp. 255-268 (2003). Ćelije domaćina obuhvataju kultivisane ćelije, npr., kultivisane ćelije sisara, ćelije kvasaca, ćelije insekata, ćelije bakterija i ćelije biljaka, od samo nekoliko rodova, ali, isto tako, i ćelije, koje su sadržane u okviru transgenske životinje, transgenske biljke ili kultivisane biljke ili životinjskog tkiva. U jednom ostvarenju, ćelija domaćina je eukariotska ćelije, poželjno ćelije sisara, kao što je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelija humanog embrionalnog bubrega (HEK) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NSO, Sp20 ćelija).
U struci su poznate standardne tehnologije za ekspresiju stranih gena u ovim sistemima. Ćelije koje ekspresuju mutant-IL-2 polipeptid, koji je spojen sa teškom lancem ili lakim lancem antigen-vezujućeg domena, kao što je antitelo, mogu biti izrađene inženjeringom, tako da ekspresuju, takođe, i druge lance antitela, tako da je ekspresovani mutant IL-2 fuzioni proizvod antitelo koje poseduje i teški i laki lanac.
U jednom ostvarenju, obezbeđen je postupak proizvodnje mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, kao što je ovde opisan, pri čemu postupak uključuje kultivisanje domaćinske ćelije koja sadrži polinukleotid, koji kodira mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, kao što je ovde dat, pod uslovima koji su pogodni za ekspresiju mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, i opciono, dobijanje mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata iz ćelije domaćina (ili iz medijuma za kultivaciju ćelije domaćina).
U određenim ostvarenjima, ovde opisani mutant IL-2 polipeptid je povezan sa najmanje jednim delom koji nije IL-2. IL-2 mutant se može pripremiti kada se segment mutant IL-2 polipeptida poveže sa jednim ili više molekula, kao što su: polipeptid, protein, ugljeni hidrat, lipid, nukieinska kiselina, polinukleotid ili molekuli koji predstavljaju kombinacije ovih molekula (npr., glikoproteini, glikolipidi, itd.). Mutant IL-2 polipeptid se, isto tako, može povezati sa organskim delom, neorganskim delom ili farmaceutskim lekom. Kako je ovde korišćen, farmaceutski lek je organsko jedinjenje koje sadrži jedinjenje od oko 5,000 daltona ili manje. Mutant IL-2 polipeptid može, takođe, biti spojen sa bilo kojim biološkim sredstvom, uključujući terapeutska jedinjenja, kao što su anti-neoplastična sredstva, anti-mikrobni agensi, hormoni, imunomodulatori i anti-inflamatorna sredstva i slična jedinjenja. Takođe su uključeni radioizotopi, kao što su oni koji su korisni za snimanja i za terapijske potrebe.
Mutant IL-2 polipeptid može, isto tako, biti spojen sa više molekula istog tipa ili sa molekulima više od jednog tipa. U određenim ostvarenjima, molekul, koji se vezuje sa IL-2, može preneti sposobnost ciljanog delovanja na IL-2 specifičnim tkivima ili ćelijama kod životinje, a ovde se označava kao "ciljani deo". U ovim ostvarenjima, ciljani deo može posedovati afinitet za ligand ili receptor u ciljanom tkivu ili ćeliji, čime se IL-2 usmerava na ciljano tkivo ili ćeliju. U određenom ostvarenju, ciljani deo usmerava IL-2 na tumor. Ciljani delovi uključuju, na primer, antigen-vezujuće delove (npr., antitela i njihove fragmente), koji su specifični za ćelijsku površinu ili unutarćelijske proteine, ligande bioloških receptora i slične delove. Takvi antigen-vezujući delovi mogu biti specifični za antigene povezane sa tumorom, kao što su oni koji su ovde opisani.
Mutant IL-2 polipeptid može biti genetski spojen sa drugim polipeptiđom, npr., jednolančanim antitelom, ili (delom) teškim ili lakim tancima antitela, ili se može hemijski konjugovati na drugi molekul. Fuzija mutant IL-2 polipeptida sa delom teškog lanca antitela opisana je u Primerima. IL-2 mutant, koji je fuzija između mutant IL-2 polipeptida i drugog polipeptida, može biti dizajniran tako da se IL-2 sekvenca direktno spoji sa polipeptiđom ili da se povezuje indirektno posredstvom linker sekvence. Sastav i dužina linker sekvence može se utvrditi u skladu sa, u struci dobro poznatim, postupcima i može se ispitati njihova efikasnost. Primer linker sekvence između IL-2 i teškog lanca antitela nalazi se u sekvencama, koje prikazane, npr., u SEQ ID NO-i 209, 211, 213, itd.. Takođe se mogu uključiti dodatne sekvence, da bi se pridružio položaj otcepljivanja, kako bi se razdvojile pojedinačne komponente fuzije, ukoliko je to poželjno, na primer, sekvenca prepoznavanja endopeptidaze. Pored toga, IL-2 mutant ili njihov fuzioni protein, mogu, takođe, biti sintetisani hemijskim putem, korišćenjem postupaka sinteze polipeptida, koji su u struci dobro poznati (npr., Merrifield sinteza čvrste faze). Mutant IL-2 polipeptidi mogu biti hemijski konjugovani sa drugim molekulima, npr., drugim polipeptiđom, koristeći dobro poznate postupke hemijskog konjugovanja. Za ove potrebe mogu se koristiti bi-funkcionalni reagensi za unakrsno povezivanje, kao što su homofunkcionalni i heterofunkcionalni reagensi unakrsnog povezivanja, dobro poznati u ovoj oblasti. Vrsta reagensa koji bi se koristi za unakrsno povezivanje zavisi od prirode molekula koji se kupluje sa IL-2, a stručnjaci u ovoj oblasti lako ga mogu identifikovati. Alternativno, ili dodatno, mutant IL-2 i/ili molekul sa kojim se namerava izvršiti konjugovanje, može se dobiti hemijskim putem, tako da se ova dva učesnika mogu konjugovati u zasebnoj reakciji, što je u struci, takođe, dobro poznato.
U određenim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptid se povezuje sa jednim ili više antigen-vezujućih delova (t.j., deo je imunokonjugata), koji sadrže najmanje jedan varijabilni region antitela koji je u stanju da se vezuje sa antigenom determinantom. Varijabilni regioni mogu formirati deo i biti dobijeni iz antitela i njihovih fragmenata koji postoje u prirodi ili ih u prirodi nema. Postupci za proizvodnju poliklonskih antitela i monoklonskih antitela dobro su poznati u struci {vidi, npr., Harlovv i Lane, "Antibodies, a laboratorv manual", Cold Spring Harbor Laboratorv, 1988). Antitela koja ne postoje u prirodi mogu se konstruisati korišćenjem sinteze peptida čvrste faze, mogu se proizvesti postupcima rekombinovanja (npr., kao što je opisano u U.S. patentu No. 4,186,567) ili se mogu dobiti, na primer, skriniranjem kombinovanih biblioteka, koje sadrže varijabilne teške lance i varijabilne lake lance (vidi, npr., U.S. Patent. No. 5,969,108 od McCaffertija). Imunokonjugati, antigen-vezujući delovi i postupci za proizvodnju istih takođe su detaljno opisani u PCT publikaciji br. WO 2011/020783.
Bilo koja životinjska vrsta antitela, fragmenta antitela, antigen-vezujućeg domena ili varijabilnog regiona može biti povezana na mutant IL-2 polipeptid. Ne-ograničavajuća antitela, fragmenti antitela, antigen-vezujući domeni ili varijabilni regioni, koji su od koristi u ovom pronalasku, mogu biti mišjeg porekla, porekla od primata ili humanog porekla. Ukoliko je mutant IL-2/antitelo konjugat ili fuzija namenjen za ljudsku upotrebu, može biti korišćena himerična forma antitela, u kojoj su konstantni regioni antitela humanog porekla. Humanizovani ili potpuno humani oblik antitela može, takođe, biti pripremljen u skladu sa postupcima, dobro poznatim u struci (vidi, npr., U.S. Patent Br. 5,565,332 od VVintera). Humanizovanje se može izvršiti brojnim postupcima koji uključuju, ali bez ograničavanja na njih (a) nanošenje u vidu grafta ne-humanog (npr., donorsko antitelo) CDR-a na humani (npr., antitelo primaoca) okvir i konstantne regione sa ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr., onih koji su značajni za održavanje dobrog afiniteta vezivanja antigena ili funkcija antitela), (b) nanošenje u vidu grafta samo ne-humanih regiona koji određuju specifičnost (SDR-i ili a-CDR-i; ostaci koji su presudni za interakciju antitelo-antigen) na humani okvir i konstantne regione, ili (c) transplantaciju celokupnih ne-humanih varijabilnih domena, ali "prekrivajući" ih delom koji je sličan humanom delu, putem zamene površinskih ostataka. Humanizovana antitela i postupci njihove izrade prikazani su, npr., u Almagro i Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), a dalje su opisani, npr., u Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US Patent Br. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison i Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeven et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (koji opisuje nanošenje SDR (a-CDR) grafta); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (koji opisuje ponovno postavljanje površine ili "resurfacing "); Dali' Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)
(koji opisuje "mešanje FR"); i Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) i Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (koji opisuje pristup "navođenog biranja" za mešanje FR). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu biti proizvedeni korišćenjem raznih, u struci poznatih,
tehnika. Humana antitela su uopšteno opisana u van Dijk i van de VVinkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) i Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humani varijabilni regioni mogu formirati deo i biti dobijen i iz humanih monoklonskih antitela, izrađenih hibridoma postupkom (vidi, npr., Monoclonal Antibodv Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu, takođe, biti pripremljeni primenom imunogena transgenskoj životinji, na kojoj je izvršena modifikacija tako da proizvodi intaktna humana antitela ili intaktna antitela sa humanim varijabilnim regionima u odgovoru na antigen (vidi, npr., Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125
(2005). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu, isto tako, biti proizvedeni posredstvom izolovanja sekvenci varijabilnog regiona Fv klona, odabranih iz biblioteka izloženih faga humanog porekla (vidi, npr., Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biologv 178, 1-37 (O'Brien et al., ed , Human Press, Totowa, NJ, 2001); i McCaffertv et al.. Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Fag obično nosi fragmente antitela, ili kao jedno-lančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Detaljni opis izrade antigen-vezujućih delova za imunokonjugate posredstvom izloženih faga može se naći u Primerima, priključenim PCT publikaciji br. WO 2011/020783. U određenim ostvarenjima, antigen-vezujući delovi, koji su od koristi u ovom pronalasku, mogu biti proizvedeni inženjeringom, da bi imali povećani afinitet vezivanja u skladu sa, primera radi, postupcima, koji su izloženi u PCT publikaciji br. WO 2011/020783 (vidi Primere koji se odnose na razvijanje afiniteta) ili U.S. Pat. Appl. Publ. No. 2004/0132066. Sposobnost imunokonjugata, koji je ovde opisan, da se vezuje sa specifičnom antigenom determinantom, može se izmeriti ili posredstvom enzimski-vezanog imunosorbent testa (ELISA) ili drugim tehnikama, koje su bliske stručnjaku u ovoj oblasti, npr., tehnika površinske plazmon rezonance (sa izvođenjem analize na BIACORE T100 sistemu) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i uobičajeni testovi vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Kompetitivni testovi mogu biti korišćeni za identifikovanje antitela, fragmenta antitela, antigen-vezujućeg domena ili varijabilnog domena, koji ulaze u kompeticiju sa referentnim antitelom za vezivanje sa određenim antigenom, npr., antitelo koje ulazi u kompeticiju sa L19 antitelom za vezivanje sa ekstra domenom B fibronektina (EDB). U određenim ostvarenjima, takvo kompetitivno antitelo vezuje se za isti epitop (npr., linearni ili konformacijski epitop), za koji se vezuje referentno antitelo. Detaljni postupci sa primerima za mapiranje epitopa za koje se antitelo vezuje dati su u Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols" u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primernom kompetitivnom testu, imobilisani antigen (npr., EDB) inkubira se u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje sa antigenom (npr., L19 antitelo) i drugo neobeleženo antitelo, kome se ispituje sposobnost da ulazi u kompeticiju sa prvim antitelom za vezivanje sa antigenom. Drugo antitelo može biti prisutno u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji omogućuju vezivanje prvog antitela za antigen, višak nevezanog antitela se odstranjuje, a količina obeleživača, koji je povezan sa imobilisanim antigenom, utvrđuje se merenjem. Ukoliko je količina obeleživača, koji je povezan sa imobilisanim antigenom, značajno smanjena u test uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, to upućuje da je drugo antitelo ušlo u kompeticiju sa prvim antitelom za vezivanje za antigen. Vidi Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual, poglavlje14 (Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor, NY). Može biti poželjna dalja hemijska modifikacija, ovde opisanog, mutant IL-2 mutanta ili imunokonjugata. Na primer, problemi imunogeničnosti i kratkog polu-života mogu biti prevaziđeni putem konjugovanja za suštinski ravno-lančane polimere, kao što je polietilen glikol (PEG) ili polipropilen glikol (PPG) (vidi, npr., WO 87/00056). IL-2 mutanti i imunokonjugati, koji su pripremljeni kao što je ovde opisano, mogu biti prečišćeni posredstvom, u struci poznatih, tehnika, kao što je tečna hromatografija visokih performansi, jon izmenjivačka hromatografija, gel elektroforeza, afinitetna hromatografija, hromatografija sa isključivanjem prema veličini i slično. Tekući uslovi, koji su korišćeni za prečišćavanje određenog proteina zavisiće, delom, od faktora, kao što je naelektrisanje, hidrofobičnost, hidrofilnost, itd., i biće očigledni stručnjacima u ovoj oblasti. Za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom, mogu se koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen, za koje se mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat vezuje. Na primer, može biti korišćeno antitelo koje se specifično vezuje sa mutant IL-2 polipeptiđom. Za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom imunokonjugata, kao što su ovde opisani, može se koristiti matriks sa proteinom A ili proteinom G. Na primer, može se koristiti afinitetna hromatografija uzasopno sa proteinom A ili G i hromatografija sa isključivanjem prema veličini, da bi se izolovao imunokonjugat, u suštini na način kao što je opisan u Primerima. Čistoća mutant IL-2 polipeptida i njihovih fuzionih proteina može se utvrditi bilo kojim od brojnih dobro poznatih analitičkih postupaka, koji uključuju gel elektroforezu, tečnu hromatografiju visokog pritiska i slične postupke. Na primer, pokazalo se da su fuzioni proteini sa teškim lancima, koji su ekspresovani kao što je opisano u Primerima, intaktni i ispravno spojeni, kao što je demonstrirano posredstvom SDS-PAGE sa reduktivnim uslovima (vidi, npr, Sliku 14). Dve trake su razdvojene na približno Mr 25,000 i Mr 60,000, što odgovara pretpostavljenim molekulskim težinama fuzionog proteina - imunoglobulinski laki lanac i teški lanac/lL-2.
Testovi
Mutant IL-2 polipeptidima i imunokonjugatima, koji su ovde prikazani, mogu biti identifikovane, skrinirane ili okarakterisane njihove fiziko/hemijske karakteristike i/ili biološke aktivnosti uz pomoć raznih testova, poznatih u struci.
Testovi afiniteta
Afinitet mutant IL-2 polipeptida ili IL-2 polipeptida divljeg tipa za razne oblike IL-2 receptora može se utvrditi u skladu sa postupkom navedenim u Primerima, posredstvom površinske plazmon rezonance (SPR), uz korišćenje standardnih instrumenta, kao što je BlAcore instrument (GE Healthcare), i receptorskih podjedinica, koje se mogu dobiti uz pomoć rekombinantne ekspresije (vidi, npr., Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). Heterodimer rekombinantni IL-2 receptor B/v-podjedinica može se proizvesti spajanjem svake od podjedinica sa monomerom Fc domena antitela, koji je modifikovan korišćenjem "knobs-into-holes" tehnologije (vidi, npr., U.S. Pat. No. 5,731,168), da bi se podstakla heterodimerizacija fuzionih proteina - odgovarajuća receptorska podjedinica/Fc (vidi SEQ ID NO-i 102 i 103). Alternativno, afinitet vezivanja IL-2 mutanata za različite forme IL-2 receptora može se proceniti korišćenjem ćelijskih linija za koje se zna da ekspresuju jednu ili drugu formu receptora. Specifično, ilustrativno i primerno ostvarenje za merenje afiniteta vezivanja opisano je u sledećim Primerima u nastavku. U skladu sa jednim ostvarenjem, KDse meri uz pomoć površinske plazmon rezonance, koristeći BIACORE® T100 instrument (GE Healthcare) na 25°C, sa IL-2 receptorima imobilisanim na CM5 čipovima. Ukratko, karboksimetilovani dekstran biosenzorni čipovi (CM5, GE Healthcare) aktivirani su sa hidrohloridom N-etil-N'-{3-dimetilaminopropil)-karbodiimida (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS), prema uputstvu snabdevača. Rekombinantni IL-2 receptor se razblažuje sa 10 mM natrijum acetatom, pH 5.5, do nivoa od 0.5-30 u.g/ml, pre injiciranja, pri brzini protoka od 10^l/minut, da postiglo približno 200 - 1000 (za a-podjedinicu IL-2R) ili 500-3000 (za Bv "knobs-into-holes" heterodimer IL-2R) jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injiciranja IL-2 receptora, injicira se 1M etanolamin, da bi se blokirale grupe koje nisu reagovale. Za kinetička merenja, serije trostrukih razblaženja mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata (raspon između -0.3 nM i 300 nM) injicirane su u HBS-EP+ (GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.05% surfaktant P20, pH 7.4) na 25°C, pri brzini protoka od približno 30^l/min. Brzine asocijacije (k0n) i brzine disocijacije (koff) izračunate su korišćenjem jednostavnog jedan-na-jedan Langmuirovog modela vezivanja (BIACORE ® T100 evaluacioni softver verzija 1.1.1), simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Konstanta ravnoteže disocijacije (KD) izračunava se kao odnos koff/kon. Vidi, npr., Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).
Vezivanje imunokonjugata, kao što su ovde opisani, za Fc receptore može se jednostavno utvrditi npr., ELISA testom, ili površinskom plazmon rezonancom (SPR), uz korišćenje standardnih instrumenta, kao što je BlAcore instrument (GE Healthcare) i Fc receptora, kakvi se mogu dobiti putem rekombinantne ekspresije. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili imunokonjugata, koji sadrže Fc domen, za Fc receptore, može se proceniti korišćenjem ćelijskih nizova, za koje se zna da ekspresuju određene Fc receptora, kao što su NK ćelije koje ekspresuju Fcvllla receptor. U skladu sa jednim ostvarenjem, KDse meri uz pomoć površinske plazmon rezonance, koristeći BIACORE® T100 instrument (GE Healthcare) na 25°C sa Fc receptorima, koji su imobilisani na CM5 čipovima. Ukratko, karboksimetilovani dekstran biosenzorni čipovi (CM5, GE Healthcare) aktivirani su sa hidrohloridom N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimida (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS), prema uputstvu snabdevača. Rekombinantni Fc receptor se razblažuje sa 10 mM natrijum acetatom, pH 5.5, do nivoa od 0.5-30 u.g/ml, pre injiciranja, pri brzini protoka od 10^l/minut, da bi se postiglo približno 100-5000 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injiciranja Fc receptora, injicira se 1M etanolamin, da bi se blokirale grupe koje nisu reagovale. Za kinetička merenja, tro-struka do peto-strukih serijskih razblaženja imunokonjugata (raspon između -0.01 nM do 300 nM) injiciraju se u HBS-EP+ (GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.05% surfaktant P20, pH 7.4) na 25°C, pri brzini protoka od približno 30-50^l/min. Brzine asocijacije {kon) i brzine disocijacije (koff) izračunavaju se korišćenjem jednostavnog Langmuirovog modela vezivanja jedan-na-jedan (BIACORE ® T100 evaluacioni softver verzije 1.1.1), simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Konstanta ravnoteže disocijacije (KD) izračunava se kao odnos koff/kon. Vidi, npr., Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).
Testovi aktivnosti
Sposobnost IL-2 mutanta da se vezuje za receptore IL-2 može se indirektno utvrditi, posredstvom analize efekata imune aktivacije, koja se odvija nishodno od vezivanja za receptor.
U jednom aspektu, obezbeđeni su testovi za identifikovanje mutant IL-2 polipeptida koji poseduju biološku aktivnost. Biološke aktivnosti mogu uključiti, npr., sposobnost indukovanja proliferacije T i/ili NK ćelija koje nose IL-2 receptor, sposobnost indukovanja IL-2 signalizacije u T i/ili NK ćelijama koje nose IL-2 receptor, sposobnost da se proizvodi interferon (IFN)-y, kao sekundarni citokin, od strane NK ćelija, smanjena sposobnost indukovanja obrade sekundarnih citokina, posebno IL-10 i TNF-a, od strane mononuklearnih ćelija periferne krvi {PBMC-i), smanjena sposobnost da se indukuje apoptoza u T ćelijama, sposobnost da se izazove regresija tumora i/ili poboljšanje preživljavanja i smanjeni profil toksičnosti, posebno smanjena vazopermeabilnost, in vivo. Takođe su obezbeđen! mutant IL-2 polipeptidi, koji poseduju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro.
U određenim ostvarenjima, mutant IL-2 polipeptid, kao što je ovde opisan, testiran je na posedovanje takve biološke aktivnost. U ovoj oblasti je dobro poznato mnoštvo različitih postupaka za određivanje bioloških aktivnosti IL-2, a detalji mnogih od ovih postupaka izloženi su, takođe, u Primerima, priključenim izlaganju. Primeri obezbeđuju pogodan test za ispitivanje IL-2 mutanata, kao što su ovde opisani, na njihovu sposobnost da pokrenu proizvodnju IFN-y od strane NK ćelija. Kultivisane NK ćelije inkubiraju se sa mutant IL-2 polipeptiđom ili imunokonjugatima, koji su ovde opisani, a nakon toga se meri koncentracija IFN-v u medijumu kulture uz pomoć ELISA testa.
Signalizacija indukovana od strane IL-2 pokreće nekoliko puteva signalizacije i uključuje signalizacijske molekule JAK (Janus kinaza) i STAT (signalni transducer i aktivator transkripcije). Interakcija IL-2 sa receptorskim B- i v-podjedinicama dovodi do fosforilacije receptora i molekula JAK1 i JAK3, koji su povezani sa p-, odnosnoY-podjedinicom. Nakon toga se STAT5 udružuje sa fosforilisanim receptorom, a i sam se fosforiliše na ključnom tirozinskom ostatku. Ovo dovodi do disocijacije STAT5 sa receptora, do dimerizacije STAT5 i translociranja STAT5 dimera do jezgra, gde on potiče transkripciju ciljanih gena. Sposobnost mutant IL-2 polipeptida da indukuju signalizaciju preko IL-2 receptora može, sledstveno tome, biti, procenjena, na primer, merenjem fosforilacije STAT5. Detalji ovog postupka izloženi su u Primerima. PBMC-i su tretirani sa mutant IL-2 polipeptidima ili imunokonjugatima, kao što su ovde opisani, a nivoi fosfori I i sa nog STAT5 određeni su protočnom citometrijom.
Proliferacija T ćelija ili NK ćelija u odgovoru na IL-2, može biti izmerene puutem inkubiranja T ćelija ili NK ćelija, koje su izdvojene iz krvi, sa mutant IL-2 polipeptidima ili imunokonjugatima, kao što su ovde opisani, nakon čega je sledilo utvrđivanje sadržaja ATP u lizatima tretiranih ćelija. Pre tretmana, T ćelije se mogu prethodno stimulisati sa fitohemaglutininom (PHA-M). Ovaj test, koji je opisan u Primerima, omogućuje senzitivno kvantitativno određivanje broja održivih ćelija, međutim postoje brojni pogodni alternativni testovi, koji su poznati u struci (npr., test sa uključivanjem [<3>H]-timidina, testovi Glo ATP ćelijskog titra, test sa Alamar Blu, VVST-1 test, MTT test).
Test za određivanje apoptoze T ćelija i AICD, takođe je obezbeđen u Primerima, pri čemu su T ćelije tretirane sa antitelom koje indukuje apoptozu, nakon inkubacije sa mutant IL-2 polipeptidima ili imunokonjugatima, kao što ovde opisani, a ćelije izložene apoptozi kvantitativno su određene posredstvom detekcije protočnom citometrijom izloženosti fosfatidil serin/aneksinu. Ostali testovi su poznati u struci.
Efekti mutant IL-2 na tumorski rast i preživljavanje mogu se proceniti na brojnim modelima životinjskih tumora, koji su poznati u struci. Na primer, ksenograftovi ćelijskih nizova humanih malignih bolesti mogu se implantirati imunodeficijentnim miševima, i tretirati sa mutant IL-2 polipeptidima ili imunokonjugatima, kao što su ovde opisani u Primerima.
In vivo toksičnost mutant IL-2 polipeptida i imunokonjugata, kao što su ovde opisani, može se utvrditi na osnovu mortaliteta, posmatranja uživo (vidljivi simptomi nepovoljnih efekata, npr., ponašanje, telesna težina, telesna temperatura) i kliničke i anatomske patologije (npr., vrednosti biohemijskih analiza u krvi i/ili hi sto patološke analize).
Vazopermeabilnost, koja se indukuje tretmanom sa IL-2, može se ispitati na životinjskom modelu vazopermeabilnosti sa pretretmanom. Uopšteno, IL-2 mutant ili imunokonjugat, koji je ovde opisan, primenjuje se pogodnoj životinji, npr., mišu, a kasnije se životinji injicira reporter molekul za vaskularno curenje, čija diseminacija iz vaskulature odražava stepen vaskularne permeabilnosti. Poželjno je reporter molekul za vaskularno curenje dovoljne veličine da bi se otkrila permeabilnost sa divljom formom IL-2, koja je korišćena za pretretman. Primer reporter molekula za vaskularno curenje može biti serumski protein, kao što je albumin ili imunoglobulin. Reporter molekul za vaskularno curenje poželjno je detektibilno obeležen, na primer sa radioizotopom, da bi olakšalo kvantitativno određivanje tkivne distribucije molekula. Vaskularna permeabilnost može biti izmerena na krvnim sudovima, prisutnim u bilo kom od unutrašnjih organa, kao što su jetra, pluća i slični organi, kao i u tumoru, uključujući tumor tipa ksenografta. Pluća su poželjni organ za merenje vazopermeabilnosti primenom IL-2 mutanata pune dužine.
Smeše, formulacijeiputevi primene
U daljem aspektu, izlaganje obezbeđuje farmaceutske smeše, koje sadrže bilo koji od mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, koji su ovde prikazani, npr., za korišćenje u bilo kom od terapeutskih postupaka, datih u nastavku. U jednom ostvarenju, farmaceutska smeša sadrži bilo koji od mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, prikazanih ovde, i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom ostvarenju, farmaceutska smeša sadrži bilo koji od mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, koji su ovde dati, i najmanje jedno dodatno terapeutsko sredstvo, kao što je, npr., opisano u nastavku.
Dalje je obezbeđen postupak za proizvodnju mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, kao što su ovde opisani, u obliku, koji je pogodan za primenu in vivo, pri čemu postupak obuhvata (a) dobijanje mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, kao što je ovde opisan, i (b) formulisanje mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, čime je preparat mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata formulisan za primenu in vivo.
Farmaceutske smeše, koje su ovde opisane, sadrže terapeutski efektivnu količinu jednog ili više mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, rastvorenih ili raspršenih u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Izrazi "farmaceutski ili farmakološki prihvatljiv" odnosi se na molekulske entitete i smeše, koji su uopšteno ne-toksični za primaoca u korišćenim dozažama i koncentracijama, t.j., ne proizvode štetne, alergijske ili na drugi način nepovoljne reakcije kada se primenjuju životinji, kao što je, ukoliko je to pogodno, na primer, čovek. Preparat od farmaceutske smeše, koji sadrži najmanje jedan mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat i opciono dodatni aktivni sastojak, biće poznat stručnjacima u ovoj oblasti s obzirom na ovo izlaganje, kao što je primerima prikazano u Remingtonovom Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje. Mack Printing Companv, 1990.. Pored toga, podrazumevaće se da bi za primenu životinji (ili npr., čoveku), preparati trebalo da zadovoljavaju standarde sterilnosti, pirogenosti, opšte bezbednosti i čistoće, kakvi se zahtevaju od strane FDA Office of Biological Standards ili odgovarajućih institucija u drugim zemljama. Poželjne smeše su liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori. Primeri IL-2 smeša opisani su u U.S. Patentima Br. 4,604,377 i 4,766,106. Kao što je ovde korišćen, "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuje bilo koje i sve rastvarače, pufere, disperzivne medijume, sredstva za oblaganje, surfaktante, antioksidanse, konzervanse (npr., antibaterijska sredstva, protugljivična sredstva), izotonična sredstva, sredstva za odlaganje apsorpcije, soli, sredstva za konzervisanje, antioksidanse, proteine, lekove, stabilizatore lekova, polimere, gelove, vezujuća sredstva, ekscipijense, sredstva za dezintegrisanje, lubrikante, sredstva za zaslađivanje, sredstva za ukus, boje, materijale slične njima i njihove kombinacije, što bi licima uobičajene stručnosti u ovoj oblasti bilo poznato (vidi, na primer, Remingtonov Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje. Mack Printing Companv, 1990, pp. 1289-1329). Sve dotle dok bilo koji uobičajeni nosač nije inkompatibilan sa aktivnim sastojkom, predviđeno je njegovo korišćenje u terapeutskoj ili farmaceutskoj smeši.
Smeša može sadržavati različite vrste nosača, u zavisnosti od toga da li će biti primenjivana u čvrstoj ili tečnoj formi ili u obliku aerosola, i zavisno od toga da li je potrebno da bude sterilna za puteve primene kao što je injiciranje. Mutant IL-2 polipeptidi ili imunokonjugati, kao što su ovde opisani (i bilo koji dodatni teraputski agens) mogu biti primenjeni intravenski, intradermalno, intraarterijski, intraperitonealno, intralezijski, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatski, intrasplenalno, intrarenalno, intrapleuralno, intratrahealno, intranazalno, intravitrealno, intravaginalno, intrarektaino, intratumoralno, intramuskularno, intraperitonealno, subkutano, subkonjunktivalno, intravezikularno, mukozno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, oralno, površinski, lokalno, putem inhalacije (npr., inhalacija aerosola), injekciono, infuziono, putem kontinuirane infuzije, lokalizovanom perfuzijom plasiranjem ciljanih ćelija u tečnosti direktno, putem katetera, uz pomoć lavaže, u kremovima, u lipidnim smešama (npr., liposomi), ili bilo kojim drugim postupkom ili bilo kojom kombinacijom prethodno navedenih načina primene, što bi licu uobičajene stručnosti u ovoj oblasti bilo poznato (vidi, na primer, Remingtonov Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje. Mack Printing Companv, 1990). Parenteralna primena, posebno intravensko injiciranje, najčešće je korišćeni način za primenu polipeptidnih molekula, kao što su mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, koji su ovde opisani.
Parenteralne smeše uključuju one smeše koje su dizajnirane za primenu putem injekcije, npr., supkutanim, intradermalnim, intralezijskim, intravenskim, intraarterijskim, intramuskularnim, intratekalnim ili intraperitonealnim injiciranjem. Za primenu putem injekcije, mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, koji su ovde opisani, mogu biti formulisani u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što je Hanksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slani pufer. Rastvor može sadržavati sredstva za formulisanje, kao što su sredstva za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu biti u obliku praška za rekonstituisanje sa pogodnim vehikulumom, npr., sterilna voda bez pirogena, pre upotrebe. Sterilni injekcioni rastvori pripremaju se putem uključivanja IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, koji su ovde opisani, u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač, sa raznim drugim sastojcima, koji su pobrojani u nastavku, ukoliko je to neophodno. Sterilnost se može jednostavno postići, npr., pomoću filtracije preko sterilnih filtracionih membrana. Uopšteno, disperzije se pripremaju posredstvom uključivanja raznih sterilisanih aktivnih sastojaka u sterilni vehikulum, koji sadrži bazični disperzivni medijum i/ili druge sastojke. U slučaju sterilnih praškova za izradu sterilnih injekcionih rastvora, suspenzija ili emulzije, poželjni postupci za izradu su tehnike vakuumskog sušenja ili sušenja zamrzavanjem, kojima se proizvodi prašak aktivnog sastojka uz bilo koji dodatni željeni sastojak iz njihovog tečnog medijuma koji je prethodno sterilno-filtriran. Tečni medijum bi trebalo na pogodan način puferisati, ukoliko je to potrebno, a tečni razblaživač se najpre učini izotoničnim, pre injiciranja sa dovoljnom količinom slanog rastvora ili glukoze. Smeša mora biti stabilna pod uslovima proizvodnje i čuvanja, i zaštićena od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i glivice. Podrazumevaće se da bi kontaminaciju endotoksinom trebalo održavati minimalno na bezbednom nivou, koji je, na primer, manji od 0.5 ng/mg protein. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju, ali bez ograničavanja na njih: pufere, kao što su fosfatni, citratni pufer i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, koji uključuju askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide sa malom molekulskom težinom (koji su manji od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, koji uključuju glukozu, manozu ili dekstrine; helatirajuća sredstva, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; jone suprotnog naelektrisanja za obrazovanje soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr., komplekse Zn-protein); i/ili ne-jonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Vodene injekcione suspenzije mogu sadržavati jedinjenja koja povećavaju viskoznost suspenzije, kao što je natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, dekstran ili slična jedinjenja. Opciono, suspenzija može, takođe, sadržavati pogodne stabilizatore ili sredstva koja povećavaju solubilnost jedinjenja, da bi se omogućila izrada veoma koncentrovanih rastvora. Dodatno, suspenzije aktivnih jedinjenja mogu biti pripremljene kao pogodne uljne injekcione suspenzije. Pogodni lipofilni rastvarači ili vehikulumi uključuju masna ulja, kao što je susamovo ulje, ili sintetske estre masnih kiselina, kao što su etil oleati ili trigliceridi, ili liposomi.
Aktivni sastojci mogu biti sadržani u mikrokapsulama, koje se pripremaju, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilcelulozne ili želatinske mikrokapsule, odnosno poli-(metilmetacilat) mikrokapsule, u koloidnim sistemima za oslobađanje lekova (na primer, liposomi, albuminske mikrokuglice, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su izložene u Remingtonovom Pharmaceutical Sciences (18. izdanje. Mack Printing Companv, 1990). Mogu se izraditi preparati produženog oslobađanja. Pogodni primeri preparata produženog oslobađanja uključuju semipermeabilne matrikse od čvrstih hidrofobnih polimera, koji sadrže polipeptid, pri čemu su matriksi u formi oblikovanih materijala, npr., filmova ili mikrokapsula. U određenim ostvarenjima, produžena apsorpcija injekcione smeše može se postići korišćenjem u smeši sredstava za odlaganje apsorpcije, kao što je, na primer, aluminijum monostearat, želatin ili njihove kombinacije.
Pored prethodno opisanih smeša, imunokonjugati mogu, takođe, biti formulisani u vidu depo preparata. Takve dugo-delujuće formulacije mogu se primenjivati uz pomoć implantacije (na primer, supkutano ili intramuskularno) ili posredstvom intramuskularne injekcije. Sledstveno tome, na primer, mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu biti formulisani sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer u vidu emulzije u prihvatljivom ulju) ili jon-izmenjivačkih smola, ili u vidu slabo rastvorljivih derivata, na primer, u vidu slabo rastvorljive soli.
Farmaceutske smeše koje sadrže mutant IL-2 polipeptide i imunokonjugate, koji su ovde opisani, mogu biti proizvedeni uz pomoć uobičajenih postupaka mešanja, rastvaranja, emulgovanja, inkapsuliranja, obuhvaćanja ili liofilizovanja. Farmaceutske smeše mogu biti formulisane na uobičajeni način, uz korišćenje jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, razblaživača, ekscipijenasa ili pomoćnih sredstava, koja olakšavaju preradu proteina u preparate, koji se mogu farmaceutski koristiti. Ispravna formulacija zavisi od izabranog puta primene.
Mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu biti formulisani u smešu u slobodnoj kiselini ili bazi, u neutralnoj formi ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje suštinski zadržavaju biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. One uključuju kisele adicione soli, npr., one soli koje se obrazuju sa slobodnim amino grupama proteinske smeše, ili koje se obrazuju sa neorganskim kiselinama, kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili sa organskim kiselinama, kao što je sirćetna, oksalna, vinska ili bademova kiselina. Soli koje se obrazuju sa slobodnim karboksilnim grupama, takođe mogu biti dobijene iz neorganskih baza, kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksidi; ili iz organskih baza, kao što je izopropilamin, trimetilamin, histidin ili prokain. Farmaceutske soli imaju tendenciju bolje rastvorljivosti u vodenim i drugim protonskim rastvaračima, nego odgovarajući oblici slobodne baze.
Terapeutski postupci smeše
Bilo koji od ovde obezbeđenih mutant IL-2 polipeptida i imunokonjugata može biti korišćen u terapeutskim postupcima. Mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, koji su ovde opisani, mogu biti korišćeni kao imunoterapeutska sredstva, na primer, u lečenju malignih bolesti.
Za korišćenje u terapeutskim postupcima, mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, kao što su ovde opisani, bili bi formulisani, dozirani i primenjivani na način usklađen sa dobrom medicinskom praksom. U ovom kontekstu, faktori za razmatranje uključuju: određeni poremećaj koji se leči, određenog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinog pacijenta, uzrok poremećaja, položaj oslobađanja sredstva, postupak za primenu, raspored primene, i druge faktore, koji su poznati medicinskim izvršiocima.
Mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, kao što su ovde opisani, od koristi su u lečenju stanja bolesti, u kojima je stimulacija imunog sistema domaćina korisna, a posebno stanja u kojima je poželjan pojačani ćelijski imuni odgovor. Ova stanja mogu uključiti stanja bolesti u kojima je imuni odgovor domaćina insuficijentan ili deficijentan. Stanja bolesti u kojima se mogu primenjivati, ovde opisani, mutant IL-2 polipeptidi ili imunokonjugati, uključuju, na primer, tumor ili infekciju, u kojima bi ćelijski imuni odgovor bio ključni mehanizam za specifični imunitet. Specifična stanja bolesti u kojima se, IL-2 mutanti, kao što su ovde opisani, mogu koristiti, uključuju malignu bolest, na primer karcinom renalnih ćelija ili melanom; imunu deficijenciju, posebno kod HlV-pozitivnih pacijenata, pacijenata sa imunosupresijom, hroničnom infekcijom i slična stanja. Mutant IL-2 polipeptidi ili imunokonjugati, koji su ovde opisani, mogu se primenjivati per se ili u bilo kojoj pogodnoj farmaceutskoj smeši.
U jednom aspektu, obezbeđeni su mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, kao što su ovde opisani, za korišćenje u vidu leka. U daljim aspektima, obezbeđeni su mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, kao što su ovde opisani, za korišćenje u lečenju bolesti. U određenim ostvarenjima, obezbeđeni su mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, kao što su ovde opisani, za korišćenje u postupku lečenja. U jednom ostvarenju, izlaganje obezbeđuje mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, kao što je ovde opisan, za korišćenje u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U određenim ostvarenjima, izlaganje obezbeđuje mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, za korišćenje u postupku lečenja pojedinca koji boluje od navedene bolesti, koji uključuje primenu pojedincu terapeutski efektivne količine mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata. U određenim ostvarenjima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U poželjnom ostvarenju, bolest je rak. U određenim ostvarenjima, postupak dalje uključuje primenu pojedincu terapeutski efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, npr., antikancerskog sredstva, ukoliko je bolest koja se leči rak. U daljim ostvarenjima, izlaganje obezbeđuje mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat za korišćenje u stimulisanju imunog sistema. U određenim ostvarenjima, izlaganje obezbeđuje mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat za korišćenje u postupku stimulisanja imunog sistema kod pojedinca koji uključuje primenu pojedincu efektivne količine mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, da bi se stimulisao imuni sistem. "Pojedinac", u skladu sa bilo kojim od prethodnih ostvarenja je sisar, poželjno čovek. "Stimulacija imunog sistema" u skladu sa bilo kojim od prethodnih ostvarenja, može uključiti bilo jedan ili više uopštenih povećanja imune funkcije, povećanje T-ćelijske funkcije, povećanje funkcije B-ćelija, ponovno uspostavljanje funkcije limfocita, povećanje ekspresije IL-2 receptora, povećanje T-ćelijskog odgovora, povećanje aktivnosti natura! kiler ćelija ili limfokinom-aktivirane aktivnosti ćelija ubica (LAK), i slično.
U daljem aspektu, izlaganje obezbeđuje korišćenje mutant IL-2 polipeptida ili imunkonjugata, kao što su ovde opisani, u proizvodnji ili izradi leka za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U jednom ostvarenju, lek je namenjen za korišćenje u postupku lečenja bolesti, pri čemu postupak uključuje primenu pojedincu koji boluje od navedene bolesti, terapeutski efektivne količine leka. U određenim ostvarenjima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U poželjnom ostvarenju, bolest je rak. U jednom takvom ostvarenju, postupak dalje uključuje primenu pojedincu terapeutski efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, npr., anti-kancerskog sredstva, ukoliko je bolest koja se leči rak. U daljem ostvarenju, lek je namenjen stimulisanju imunog sistema. U daljem ostvarenju, lek je namenjen za korišćenje u postupku stimulisanja imunog sistema kod pojedinca koji uključuje primenu pojedincu efektivne količine leka za stimulisanje imunog sistema. "Pojedinac", u skladu sa bilo kojim od prethodnih ostvarenja je sisar, poželjno čovek. "Stimulacija imunog sistema" u skladu sa bilo kojim od prethodnih ostvarenja, može uključiti bilo jedan ili više uopštenih povećanja imune funkcije, povećanje T- ćelijske funkcije, povećanje funkcije B-ćelija, ponovno uspostavljanje funkcije limfocita, povećanje ekspresije IL-2 receptora, povećanje T-ćelijskog odgovora, povećanje aktivnosti natural kiler ćelija ili limfokinom aktivirane aktivnosti ćelija ubica (LAK), i slično.
U daljem aspektu, izlaganje obezbeđuje postupak za lečenje bolesti kod pojedinca, koji obuhvata primenu navedenom pojedincu terapeutski efektivne količine mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, kao što su ovde opisani. U jednom ostvarenju, smeša se primenjuje navedenom pojedincu, pri čemu smeša sadrži mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, koji se ovde opisuje, u farmaceutski prihvatljivom obliku. U određenim ostvarenjima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U poželjnom ostvarenju, bolest je rak. U određenim ostvarenjima, postupak dalje uključuje primenu pojedincu terapeutski efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, npr., anti-kancerskog sredstva, ukoliko je bolest koja se leči rak. U daljem aspektu, izlaganje obezbeđuje postupak za stimulisanja imunog sistema kod pojedinca koji uključuje primenu pojedincu efektivne količine mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, da bi se stimulisao imuni sistem. "Pojedinac", u skladu sa bilo kojim od prethodnih ostvarenja jeste sisar, poželjno čovek. "Stimulacija imunog sistema" u skladu sa bilo kojim od prethodnih ostvarenja, može uključiti bilo jedan ili više uopštenih povećanja imune funkcije, povećanje T- ćelijske funkcije, povećanje funkcije B-ćelija, ponovno uspostavljanje funkcije limfocita, povećanje ekspresije IL-2 receptora, povećanje T-ćelijskog odgovora, povećanje aktivnosti natural kiler ćelija ili limfokinom aktivirane aktivnosti ćelija ubica (LAK), i slično.
Podrazumeva sa da bilo koji od prethodnih terapeutskih postupaka može biti izvršen korišćenjem imunokonjugata, kao što je ovde opisan, umesto ili pored mutant IL-2 polipeptida.
U određenim ostvarenjima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj, poželjno rak. Ne-ograničavajući primeri malignih bolesti uključuju: rak mokraćne bešike, rak mozga, rak glave i vrata, rak gušterače, rak pluća, rak dojke, rak jajnika, rak materice, rak cerviksa, rak endometrijuma, rak jednjaka, rak debelog creva, kolorektalni kancer, rak rektuma, rak želuca, rak prostate, rak krvi, rak kože, karcinom skvamoznih ćelija, rak kosti i rak bubrega. Ostali poremećaji ćelijske proliferacije, koji se mogu lečiti korišćenjem mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata ovog izlaganja, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, neoplazme, koje su locirane u: abdomenu, kostima, dojci, digestivnom sistemu, jetri, gušterači, peritoneumu, endokrinim žlezdama (u nadbubregu, paratiroidnoj žlezdi, hipifizi, testisima, jajniku, timusu, štitnjači), oku, glavi i vratu, nervnom sistemu (centralnom i perifernom), limfnom sistemu, karlici, koži, mekom tkivu, slezini, torakalnom području i urogenitalnom sistemu. Takođe su uključena pre-kancerozna stanja ili lezije i metastaze raka. U određenim ostvarenjima, rak je odabran iz grupe, koju sačinjavaju: rak renalnih ćelija, rak kože, rak pluća, kolorektalni kancer, rak dojke, rak mozga, rak glave i vrata. Slično tome, takođe se i drugi poremećaji ćelijske proliferacije mogu lečiti mutant IL-2 polipeptidima i imunokonjugatima, koji su ovde opisani. Primeri takvih poremećaja ćelijske proliferacije uključuju, ali ne ograničavajući se na njih: hipergamaglobulinemiju, limfoproliferativne poremećaje, paraproteinemije, purpuru, sarkoidozu, sindrom Sezarv, Valdenstremovu makroglobulinemiju, Gaucherovu bolest, histiocitozu i druge bolesti ćelijske proliferacije, pored neoplastičnih bolesti, koje se javljaju u, prethodno navedenom, organskom sistemu. U drugom ostvarenju, bolest se odnosi na autoimune poremećaje, odbacivanje transplantata, post-traumatske imune odgovore i infektivne bolesti (npr., HIV). Još specifičnije, mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu biti korišćeni u odstranjivanju ćelija, uključenih u poremećaje posredovane imunim ćelijama, koji obuhvataju: limfom; autoimunost, odbacivanje transplantata, bolest grafta protiv domaćina, ishemiju i šlog. Stručnjak u ovoj oblasti lako prepoznaje da u mnogim slučajevima mutant IL-2 polipeptidi ili imunokonjugati ne moraju pružiti izlečenje, već mogu obezbediti samo parcijalnu korist. U nekim ostvarenjima, fiziološka promena koja pruža povoljan efekat, se, isto tako, može smatrati terapeutski povoljnom. Sledstveno tome, u nekim ostvarenjima, količina mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, koja pruža fiziološku promenu, smatra se "efektivnom količinom" ili "terapeutski efektivnom količinom". Ispitanik, pacijent ili pojedinac, kome je lečenje potrebno, obično je sisar, određenije čovek.
Imunokonjugati, koji su ovde opisani, takođe su korisni kao dijagnostički reagensi. Vezivanje imunokonjugata za antigenu determinantu može se lako detektovati korišćenjem sekundarnog antitela, specifičnog za IL-2 polipeptid. U jednom ostvarenju, sekundarno antitelo i imunokonjugat olakšavaju detekciju vezivanja imunokonjugata za antigenu determinantu, lociranu na površini ćelije ili tkiva.
U nekim ostvarenjima, efektivna količina mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, koji su ovde opisani, primenjuje se na ćeliju. U drugim ostvarenjima, terapeutski efektivna količina mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, koji su ovde opisani, primenjuje se pojedincu u svrhu lečenja bolesti.
Za potrebe prevencije ili lečenja bolesti, odgovarajuća dozaža mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, kao što su ovde opisani (kada se koriste sami ili u kombinaciji sa jednim ili više ostalih dodatnih terapeutskih sredstava) zavisiće od tipa bolesti koja se leči, puta primene, telesne težine pacijenta, vrste polipeptida (npr., nekonjugovani IL-2 ili imunokonjugat), ozbiljnosti i toka bolesti, od toga da li se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, od ranijih ili istovremenih terapeutskihi intervencija, od pacijentove kliničke istorije i njegovog odgovora na mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, a prema odluci ordinirajućeg lekara. Lekar koji je odgovoran za primenu, odrediće, u svakom slučaju, koncentraciju aktivnog sastojka(sastojaka) u smeši i odgovarajuću dozu(doze) za pojedinačnog ispitanika. Ovde su razmotreni razni rasporedi doziranja, koji uključuju, ali bez ograničavanja na njih, jednokratne ili višestruke primene, tokom različitih vremenskih razdoblja, primenu u vidu bolusa i pulsirajuće infuzije.
Pojedinačna primena nekonjugovanog IL-2 može se kretati u rasponu od oko 50,000 U/kg do oko 1,000,000 IJ/kg ili više, još češće oko 600,000 IJ/kg IL-2. Ovakva primena se može ponoviti nekoliko puta na dan (npr., 2-3 x), tokom nekoliko dana (npr.,oko 3-5 uzastopnih dana), a nakon toga se može ponoviti jedan ili više puta tokom perioda mirovanja (npr., oko 7-14 dana). Tako, terapeutski efektivna količina može uključivati samo jednokratnu primenu ili više primena tokom određenog vremenskog trajanja (npr., oko 20-30 pojedinačnih primena doze od oko 600,000 IJ/kg IL-2, datih svakom ispitaniku tokom perioda od oko 10-20 dana). Kada se primenjuje u formi imunkonjugata, terapeutski efektivna količina mutant IL-2 polipeptida može biti niža od nekonjugovanog mutant IL-2 polipeptida.
Slično tome, imunokonjugat se pogodno primenjuje pacijentu u jednoj primeni ili tokom serija tretmana. U zavisnosti od vrste i ozbiljnosti bolesti, doza od oko 1 ug/kg do 15 mg/kg {npr., 0.1 mg/kg - 10 mg/kg) imunokonjugata može biti moguća početna dozaža za primenu pacijentu, bilo da se, na primer, primenjuje u vidu jednokratnih ili više zasebnih primena, ili u vidu kontinuirane infuzije. Jedna uobičajena dnevna dozaža mogla bi se kretati od oko 1 u.g/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od prethodno pomenutih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje bi se uopšteno moglo produžiti sve dok se ne postigne željena supresija simptoma bolesti. Jedna primerna dozaža imunokonjugata kretala bi se u rasponu od oko 0.005 mg/kg do oko 10 mg/kg. U drugim ne-ograničavajućim primerima, takođe može biti uključena doza od oko 1 mikrogram/kg/telesne težine, oko 5 mikrogram/kg/telesne težine, oko 10 mikrogram/kg/telesne težine, oko 50 mikrogram/kg/telesne težine, približno 100 mikrogram/kg/telesne težine, približno 200 mikrogram/kg/telesne težine, približno 350 mikrogram/kg/telesne težine, oko 500 mikrogram/kg/telesne težine, oko 1 miligram/kg/telesne težine, oko 5 miligram/kg/telesne težine, oko 10 miligram/kg/telesne težine, oko 50 miligram/kg/telesne težine, oko 100 miligram/kg/telesne težine, oko 200 miligram/kg/telesne težine, približno 350 miligram/kg/telesne težine, oko 500 miligram/kg/telesne težine do približno 1000 mg/kg/telesne težine ili više po primeni, kao i bilo koji raspon, izveden iz navedenih raspona. U ne-ograničavajućim primerima raspona, izvedenih iz ovde nabrojanih raspona, može se primenjivati raspon od oko 5 mg/kg/telesne težine do približno 100 mg/kg/telesne težine, oko 5 mikrogram/kg/telesne težine do oko 500 miligram/kg/telesne težine, itd.., na osnovu prethodno opisanih brojčanih raspona. Sledstveno tome, pacijentu može biti primenjena jedna ili više doza od oko 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg ili 10 mg/kg {ili bilo koja njihova kombinacija). Takve doze mogu biti primenjivane povremeno, npr., svake nedelje ili svake tri nedelje (npr., tako da pacijent prima od oko dve do oko dvadeset doza, ili, npr., oko šest doza imunokonjugata). Može biti primenjena početna veća doza, nakon koje bi sledila jedna ili više nižih doza. Međutim, mogu biti od koristi i drugi režimi doziranja. Tok ove terapije jednostavno se prati posredstvom uobičajenih tehnika i testova.
Mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, koji su ovde opisani, uopšteno će biti korišćeni u količini, koja je efektivna za postizavanje nameravane svrhe. Za korišćenje u svrhu lečenja ili prevencije stanja bolesti, mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, koji su ovde opisani, ili njihova farmaceutska smeša, primenjuju se ili aplikuju u terapeutski efektivnoj količini. Određivanje terapeutski efektivne količine je u okviru sposobnosti stručnih lica u ovoj oblasti, posebno u svetlu, ovde obezbeđenog, detaljnog izlaganja.
Za potrebe sistemske primene, terapeutski efektivna doza može se inicijalno utvrditi na osnovuin vitrotestova, kao što su testovi na ćelijskim kulturama. Doza, nakon toga, može biti formulisana na životinjskim modelima, da bi se postigao raspon cirkulišućih koncentracija koji uključuje IC50, kako je utvrđen u ćelijskoj kulturi. Takva informacija može biti iskorišćena za tačnije određivanje korisnih doza kod ljudi.
Početne dozaže mogu, isto tako, biti određene na osnovuin vivopodataka,npr.,na životinjskim modelima, koristeći, u struci dobro poznate, tehnike. Lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti lako bi moglo optimizirati primenu ljudima, na osnovu podataka na životinjskim modelima.
Količina i interval dozaže može se prilagođavati pojedincu, da bi se obezbedili plazmatski nivoi mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, koji su dovoljni za održavanje terapeutskog efekta. Korisne doze za pacijenta za primenu putem injekcije, kreću se u rasponu od oko 0.1 do 50 mg/kg/dan, uobičajeno od oko 0.5 do 1 mg/kg/dan. Terapeutski efektivni plazmatski nivoi mogu se postići primenom višestrukih doza svaki dan. Koncentracije u plazmi mogu se izmeriti, primera radi, uz pomoć HPLC.
U slučajevima lokalne primene ili selektivnog prihvatanja, efektivna lokalna koncentracija imunokonjugata ne mora biti povezana sa plazmatskom koncentracijom. Stručnjak u ovoj oblasti će biti u stanju da optimizuje terapeutski efektivne lokalne dozaže, bez nepotrebnog eksperimentisanja.
Terapeutski efektivna doza mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, koji su ovde opisani, uopšteno će obezbediti terapeutsku korist, bez izazivanja značajne toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost IL-2 mutanta ili imunokonjugata može se utvrditi standardnim farmaceutskim procedurama na ćelijskoj kulturi ili na eksperimentalnim životinjama (vidi, npr., Primere 8 i 9). Testovi na ćelijskim kulturama i studije na životinjama korišćene su da bi se odredila vrednost LD50(doza, letalna za 50% populacije) i ED50(doza koja je terapeutski efektivna kod 50% populacije). Dozni odnos između toksičnih i terapeutskih efekata jeste terapeutski indeks, koji može biti izražen kao odnos LD50/ED5o. Poželjni su IL-2 mutanti i imunokonjugati koji ispoljavaju obimni terapeutski indeks. U jednom ostvarenju, mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, koji su ovde opisani, pokazuju visoki terapeutski indeks. Podaci, dobijeni iz testova na ćelijskim kulturama i studija na životinjama, mogu biti iskorišćeni za formulisanje raspona dozaža, koji su pogodni za korišćenje na ljudima. Dozaža se poželjno nalazi unutar raspona cirkulišućih koncentracija koje uključuju ED50sa malom toksičnošću ili bez toksičnosti. Dozaža može varirati unutar ovog raspona, u zavisnosti od brojnih faktora, npr., upotrebljeni oblik dozaže, korišćeni put primene, stanje ispitanika i slični faktori, ispravna formulacija, put primene i dazaža mogu biti odabrani od strane pojedinog lekara u odnosu na stanje pacijenta. (Vidi, npr., Fingl et al., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1).
Lekar koji prati pacijenta, koji se leči sa IL-2 mutantima ili imunokonjugatima, kao što su ovde opisani, trebalo bi da zna kako i kada da završi, prekine ili prilagodi primenu, zbog toksičnosti, disfunkcije organa i sličnih faktora. Suprotno tome, prateći lekar bi trebalo, isto tako, da zna kako da lečenje podesi na više dozne nivoe, ukoliko klinički odgovor nije bio adekvatan (uz isključivanje toksičnosti). Broj primenjenih doza pri praćenju poremećaja od značaja, variraće u zavisnosti od ozbiljnosti stanja koje se leči, puta primene i sličnih faktora. Ozbiljnost stanja može, primera radi, biti, delom, procenjena, uz pomoć standardnih postupaka prognostičke evaluacije. Pored toga, doza i učestalost mogućih doza, takođe će varirati u skladu sa starošću, telesnom težinom i odgovorom pojedinog pacijenta.
Maksimalna terapeutska doza mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, koji sadrži navedeni polipeptid, može se povećati u odnosu na dozu koja se koristi za IL-2 divljeg tipa, odnosno imunokonjugat, koji sadrži IL-2 divljeg tipa.
Druga sredstva i lečenja
Mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, koji su ovde opisani, mogu biti primenjeni u kombinaciji sa jednim ili više drugih sredstava u terapiji. Na primer, mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, kao što su ovde opisani, mogu biti primenjivani uporedo sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim sredstvom. Naziv "terapeutsko sredstvo" obuhvata bilo koje sredstvo koje se primenjuje u svrhu lečenja simptoma ili bolesti kod pojedinca kome je takvo lečenje potrebno. Takvo dodatno terapeutsko sredstvo može sadržavati bilo koje aktivne sastojke, koji su pogodni za pojedinu indikaciju koja se leči, poželjno one koji poseduju komplementarne aktivnosti, koje ne ispoljavaju nepovoljni efekat jedan prema drugom. U određenim ostvarenjima, dodatno terapeutsko sredstvo je imunomodulatorno sredstvo, citostatsko sredstvo, inhibitor ćelijske adhezije, citotoksično sredstvo, aktivator ćelijske apoptoze ili sredstvo koje povećava osetljivost ćelija na sredstva za indukciju apoptoze. U pojedinom ostvarenju, dodatno terapeutsko sredstvo je anti-kancersko sredstvo, na primer, sredstvo za mikrotubularno razaranje, antimetabolit, inhibitor topoizomeraze, sredstvo za umetanje DNK, alkilacijsko sredstvo, agens hormonske terapije, inhibitor kinaze, receptorski antagonist, aktivator apoptoze tumorskih ćelija ili sredstvo sa antiangiogenim dejstvom.
Takva druga sredstva su pogodno u kombinaciji prisutna u količinama koje su delotvorne za nameravanu svrhu. Efektivna količina takvih drugih sredstava zavisi od upotrebljene količine mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, od vrste poremećaja ili lečenja, i od drugih, prethodno razmotrenih faktora. Mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati se uopšteno koriste u istim dozažama i korišćenjem puteva primene kao što su ovde opisani, ili sa približno od 1 do 99% ovde opisanih dozaža, ili u bilo kojoj dozaži ili bilo kojim putem za koji je empirijski/klinički utvrđeno da su odgovarajući.
Takve kombinovane terapije, navedene prethodno, obuhvataju kombinovanu primenu (kada je dva ili više terapeutskih sredstava uključeno u istu smešu ili u zasebne smeše), i odvojenu primenu, u kom slučaju se primena mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, koji su ovde opisani, odvija pre, istovremeno i/ili nakon primene dodatnog terapeutskog sredstva i/ili adjuvansa. Mutant IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, kao što su ovde opisani, mogu, isto tako, biti korišćeni u kombinaciji sa zračnom terapijom.
Proizvodi izrade
U drugom aspektu izlaganja, obezbeđen je proizvod izrade koji sadrži materijale, koji su od koristi za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostiku, ovde opisanih, poremećaja. Predmet izrade sadrži kontejner i nalepnicu ili umetak na pakovanju, koji se nalaze u kontejneru ili su povezani s njim. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, flaše, bočice, špriceve, kese sa rastvorom za IV primenu, itd.. Kontejneri mogu biti izrađeni od brojnih materijala, kao što su staklo ili plastika. U kontejneru je sadržana smeša, koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom, delotvorna u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostici stanja, a može posedovati sterilni ulazni otvor (na primer, kontejner može biti kesa sa intravenskim rastvorom ili bočica koja ima zapušač, koji se mogu probušiti iglom za potkožno injiciranje). Najmanje jedno aktivno sredstvo u smeši je mutant IL-2 polipeptid, kao što je ovde opisan. Nalepnica ili umetak u pakovanju označavaju da se smeša koristi za lečenje izabranog stanja. Pored toga, proizvod izrade može sadržavati (a) prvi kontejner sa smešom, sadržanom u njemu, pri čemu smeša sadrži mutant IL-2 polipeptid, kao što je ovde opisan; i (b) drugi kontejner sa smešom, sadržanom u njemu, pri čemu smeša sadrži dodatni citotoksični ili na drugi način povoljni terapeutski agens. Predmet izrade u ovom ostvarenju izlaganja može, dalje, da sadrži umetak u pakovanju, koji pokazuje da se smeše mogu koristiti za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, predmet izrade može, dalje, da uključuje drugi (ili treći) kontejner, koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BVVFI), slani rastvor puferisan fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. On, pored toga, može sadržavati druge materijale, koje su sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, poželjni, a koji uključuju druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Podrazumeva se da bilo koji od predhodnih predmeta izrade može sadržavati imunokonjugat, kao stoje ovde opisan, umesto ili pored mutant IL-2 polipeptida.
Kratki opis Slika
Slika 1. Šematsko predstavljanje Fab-IL-2-Fab (A) i lgG-IL-2 (B) formata imunokonjugata, koji sadrže mutant IL-2 polipeptid.
Slika 2. Prečišćavanje ogoljene konstrukcije IL-2 divljeg tipa. (A) Hromatogram prečišćavanja sa His tagom ogoljenog IL-2 divljeg tipa; <B) SDS PAGE prečišćenog proteina (8-12% Bis-Tris (NuPage, invitrogen), MES radni pufer).
Slika 3. Prečišćavanje ogoljene konstrukcije IL-2 divljeg tipa. (A) Hromatogram dobijen hromatografijom sa isključivanjem prema veličini za IL-2 divljeg tipa; (B) SDS PAGE prečišćenog proteina (8-12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES radni pufer).
Slika 4. Analitička hromatografija sa isključivanjem prema veličini za IL-2 divljeg tipa, kako je utvrđeno na Superdex-u 75, 10/300 GL. Pul 1 sadrži 74% vrste sa 23 kDa i 26% vrste sa 20 kDa, Pul 2 sadrži 40% vrste sa 22 kDa i 60% vrste sa 20 kDa.
Slika 5. Prečišćavanje ogoljene kvadripl mutant konstrukcije IL-2. (A) Hromatogram prečišćavanja kvadripl mutant IL-2 sa His tagom; (B) SDS PAGE prečišćenog proteina (8-12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES radni pufer).
Slika 6. Prečišćavanje ogoljene kvadripl mutant konstrukcije IL-2. (A) Hromatogram dobijen hromatografijom sa isključivanjem prema veličini za kvadripl mutant IL-2; (B) SDS PAGE prečišćenog proteina (8-12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES radni pufer).
Slika 7. Analitička hromatografija sa isključivanjem prema veličini za kvadripl mutant IL-2, kako je utvrđeno na Superdex-u 75, 10/300 GL (Pul 2, 20 kDa).
Slika 8. Simultano vezivanje za IL-2R i humani FAP od strane FAP-ciljanog 29B11-baziranog Fab-IL-2-Fab koji sadrži IL-2 divljeg tipa ili kvadripl mutant IL-2. (A) Postavka SPR testa; (B) SPR senzorgram.
Slika 9. Indukcija oslobađanja IFN-v iz NK92 ćelija uz pomoć FAP-ciljanog 4G8-baziranog Fab-IL-2-Fab koji sadrži IL-2 divljeg tipa ili mutant IL-2, u poređenju sa proleukinom, u rastvoru.
Slika 10. Indukcija proliferacije izolovanih NK ćelija (dno) pomoću FAP-ciljanog 4G8-baziranog Fab-IL-2-Fab koji sadrži IL-2 divljeg tipa ili mutant IL-2, u poređenju sa proleukinom, u rastvoru.
Slika 11. Indukcija proliferacije aktiviranih CD3<+>T ćelija uz pomoć FAP-ciljanog 4G8-baziranog Fab-IL-2-Fab koji sadrži IL-2 divljeg tipa ili mutant IL-2, u poređenju sa proleukinom, u rastvoru.
Slika 12. Izazivanje aktivacije indukovane ćelijske smrti (AICD) prekomerno stimulisanih T ćelija pomoću FAP-ciljanih 4G8-baziranih Fab-IL-2-Fab koji sadrži IL-2 divljeg tipa ili mutant IL-2, u poređenju sa proleukinom, u rastvoru.
Slika 13. Fosfo-STAT5 FACS test u rastvoru sa FAP-ciljanim 4G8-baziranim Fab-IL-2-Fab koji sadrži IL-2 divljeg tipa ili kvadripl mutant IL-2, u poređenju sa proleukinom, u rastvoru. (A) regulatorne T ćelije (CD4*CD25TOXP3+); (B) CD8<*>T ćelije (CD3<*>CD8<+>); (C) CD4<*>T ćelije (CD4<+>CD25-CD127<+>); (D) NK ćelije (CD3-CD56<+>).
Slika 14. Prečišćavanje FAP-ciljanog 28H1 -baziranog Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata. (A) Profil eluacije na koloni sa proteinom G. (B) Profil eluacije na Superdex 200 koloni sa isključivanjem prema veličini. (C) Novex Tris-glicin 4-20% SDS-PAGE završnog proizvoda sa ne-redukovanim i redukovanim uzorkom.
Slika 15. Prečišćavanje 4G8-baziranog FAP-ciljanog Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata. (A) Profil eluacije na koloni sa proteinom A. (B) Profil eluacije na Superdex 200 koloni sa isključivanjem prema veličini. (C) NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel (Invitrogen), sa MOPS radnim puferom, završnog proizvoda sa ne-redukovanim i redukovanim uzorkom.
Slika 16. Prečišćavanje MHLG1 KV9 MCSP-ciljanog Fab-IL2QM-Fab imunokonjugata. (A) Profil eluacije na koloni sa proteinom A, B) Profil eluacije na Superdex 200 koloni sa isključivanjem prema veličini. C) NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, sa MOPS radnim puferom, završnog proizvoda sa ne-redukovanim i reduukovanim uzorkom.
Slika 17. Ciljano vezivanje Fab-IL-2-Fab konstrukcija za HEK 293-humane FAP ćelije.
Slika 18. Ciljano vezivanje Fab-IL-2-Fab konstrukcija za HEK 293-humane FAP ćelije.
Slika 19. Specifičnost vezivanja Fab-IL-2-Fab konstrukcija, kako je utvrđena na HEK 293-humanim DPPIV i HEK 293 lažno-transfektovanim ćelijama. Vezivanje specifičnog DPPIV (CD26) antitela prikazano je desno.
Slika 20. Analiza internalizacije FAP nakon vezivanja Fab-IL-2-Fab kostrukcija za FAP na GM05389 fibroblastima.
Slika 21. IL-2 indukovano oslobađanje IFN-y od strane NK92 ćelija u rastvoru.
Slika 22. IL-2 indukovano oslobađanje IFN-y od strane NK92 ćelija u rastvoru.
Slika 23. IL-2 indukovana proliferacija NK92 ćelija u rastvoru.
Slika 24. Utvrđivanje Fab-IL-2-Fab klonova 28H1 vs. 29B11 vs. 4G8 u STAT5 fosforilacijskom testu sa PBMC ćelijama u rastvoru. (A) NK ćelije (CD3 CD56*); (B) CD8<+>T ćelije (CD3<+>CD8<+>); (C) CD4<+>T ćelije (CD3<+>CD4<+>CD25"CD127<+>); (D) regulatorne T ćelije (CD4<+>CD25<+>FOXP3<+>).
Slika 25. Efikasnost FAP-ciljanih 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata
na ćelijskom nizu ACHN adenokarcinoma humanih renalnih ćelija.
Slika 26. Efikasnost FAP-ciljanih 4G8 FAP-IL-2 qm-Fab i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata na ćelijskom nizu LLC1 mišjeg Lewis karcinoma pluća.
Slika 27. Efikasnost FAP-ciljanog 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata na ćelijskom nizu LLC1 mišjeg Lewis karcinoma pluća.
Slika 28. Slika sa malim uvećanjem (100x) pluća miševa, tretiranih sa vehikulumom kao kontrolom (A) ili sa 9\ xg/ gwt IL-2 (B) ili qm IL-2 (C). Pluća miševa, tretiranih sa 9[ xg/ gwt IL-2 pokazuju vazocentrični mononuklearni infiltrat, koji se pomera u alveolarne prostore. Takođe su prisutni edem i hemoragija. Kod miševa, koji su tretirani sa qm IL-2, zapaža se marginalni infiltrat oko nekoliko krvnih sudova.
Slika 29. Slika sa većim uvećanjem (200x) pluća prikazanih na Slici 28. Marginalna proširenost i infiltracija mononuklearnih ćelija u i oko krvnih sudova ozbiljnije je kod miševa koji su tretirani sa wt IL-2 (A) nego kod miševa koji su tretirani sa qm IL-2 (B i C).
Slika 30. Slika sa malim uvećanjem (100x) jetri miševa, koji su tretirani sa vehikulumom kao kontrolom (A) ili 9\ xg/ gwt IL-2 (B) ili qm IL-2 (C). Vazocentrična infiltracija se nalazi kod miševa, tretiranih sa wt IL-2.
Slika 31. Sekrecija IFN-v od strane NK92 ćelija nakon inkubacije sa različitim preparatima IL-2 divljeg tipa (wt) i kvadripl mutant IL-2 (qm) tokom 24 (A) ili 48 sati (B).
Slika 32. Proliferacija NK92 ćelija nakon inkubacije sa različitim preparatima IL-2 divljeg tipa (wt) i kvadripl mutant IL-2 (qm) tokom 48 sati.
Slika 33. Proliferacija NK92 ćelija nakon inkubacije sa različitim preparatima IL-2 divljeg tipa (wt) i kvadripl mutant IL-2 (qm) tokom 48 sati.
Slika 34. Proliferacija NK ćelija nakon inkuubacije sa različitim FAP-ciljanim 28H1 IL-2 imunokonjugatima ili proleukinom tokom 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana.
Slika 35. Proliferacija CD4 T-ćelija nakon inkuubacije sa različitim FAP-ciljanim 28H1 IL-2 imunokonjugatima ili proleukinom tokom 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana.
Slika 36. Proliferacija CD8 T-ćelija nakon inkuubacije sa različitim FAP-ciljanim 28H1 IL-2 imunokonjugatima ili proleukinom tokom 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana.
Slika 37. Proliferacija NK ćelija (A), CD4 T-ćelija (B) i CD8 T-ćelija (C) nakon inkuubacije sa različitim IL-2 imunokonjugatima ili proleukinom tokom 6 dana.
Slika 38. STAT fosforilacija u NK ćelijama (A), CD8 T-ćelija ma (B), CD4 T-će lijama (C) i regulatornim T-ćelijama (D) nakon 30-minutne inkubacije sa proleukinom, IL-2 divljeg tipa spostvene uzrade i kvadripl mutant IL-2.
Slika 39. STAT fosforilacija u NK ćelijama (A), CD8 T-ćelijama (B), CD4 T-ćelijama (C) i regulatornim T-ćelijama (D) nakon 30-minutne inkubacije sa proleukinom, lgG-IL-2 koji sadrži IL-2 divljeg tipa ili lgG-IL-2 koji sadrži kvadripl mutant IL-2.
Slika 40. Preživljavanje Black 6 miševa nakon primene (jednom dnevno tokom sedam dana) različitih doza IL-2 imunokonjugata koji sadrže IL-2 divljeg tipa ili kvadripl mutant IL-2.
Slika 41. Serumske koncentracije IL-2 imunokonjugata nakon jednokratne i.v. primene FAP-ciljanih (A) i ne-ciljanih (B) lgG-IL-2 konstrukcija koje sadrže ili IL-2 divljeg tipa (wt) ili kvadripl mutant (qm) IL-2.
Slika 42. Serumske koncentracije IL-2 imunokonjugata nakon jednokratne i.v. primene ne-ciljanih Fab-IL-2-Fab konstrukcija koje sadrže ili IL-2 divljeg tipa (wt) ili kvadripl mutant (qm) IL-2.
Slika 43. Prečišćavanje kvadripl mutant IL-2. (A) Jonska hromatografija sa imobilisanim metalnim jonima; (B) hromatografija sa isključivanjem prema veličini; (C) SDS PAGE pod ne-redukujućim uslovima (NuPAGE Novex Bis-Tris gel (Invitrogen), MES radni pufer); (D) analitička hromatografija sa isključivanjem prema veličini (Superdex 75 10/300 GL).
Slika 44. Proliferacija prethodno-aktiviranih CD8 (A) i CD4 (B) T ćelija nakon šest dana inkubacije sa različitim imunokonjugatima IL-2.
Slika 45. Aktivacija indukovane ćelijske smrti CD3<+>T ćelija nakon šestodnevne inkubacije sa različitim imunokonjugatima IL-2 i tretmana tokom noći sa anti-Fas antitelom.
Slika 46. Prečišćavanje FAP-ciljanog 4G8-baziranog lgG-IL-2 kvadripl mutant (qm) imunokonjugata. A) Profil eluacije sa korakom afinitetne hromatografije sa proteinom A. B) Profil eluacije sa korakom hromatografije sa isključivanjem prema veličini. C) Analitička SDS-PAGE
(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, sa MOPS radnim puferom) konačnog proizvoda. D) Analitička hromatografija sa isključivanjem prema veličini, konačnog proizvoda na Superdex 200 koloni (sadržaj monomera 97%).
Slika 47. Prečišćavanje FAP-ciljanog 28H1-baziranog lgG-IL-2 qm imunokonjugata. A) Profil eluacije sa korakom afinitetne hromatografije sa proteinom A. B) Profil eluacije sa korakom hromatografije sa isključivanjem prema veličini. C) Analitička SDS-PAGE (redukovana: NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, MOPS radni pufer; ne-redukovana: NuPAGE Tris-acetat, Invitrogen, Tris-acetatni radni pufer) konačnog proizvoda. D) Analitička hromatografija sa isključivanjem prema veličini, konačnog proizvoda na Superdex 200 koloni (sadržaj monomera 100%).
Slika 48. Vezivanje FAP-ciljanog 4G8-baziranog lgG-IL-2 qm imunokonjugata za humani FAP, koji je ekspresovan na stabilno transfektovanim HEK 293 ćelijama, kako je izmereno posredstvom FACS-a, u poređenju sa odgovarajućom Fab-IL-2 qm-Fab konstrukcijom.
Slika 49. Oslobađanje interferona (IFN)-y u NK92 ćelijama, indukovano uz pomoć FAP-ciljanog 4G8-baziranog lgG-IL-2 qm imunokonjugata u rastvoru, u poređenju sa 28H1-baziranom Fab-IL-2 qm-Fab konstrukcijom.
Slika 50. Detekcija fosforilisanog STAT5 uz pomoć FACS-a u različitim tipovima ćelija nakon stimulacije tokom 20 minuta sa FAP-ciljanim 4G8-baziranim lgG-IL-2 qm imunokonjugatom u rastvoru, u poređenju sa 28H1 -baziranim Fab-IL-2-Fab i Fab-IL-2 qm-Fab konstrukcijama, kao i sa proleukinom. A)NKćelije (CD3CD56+); B) CD8<+>T ćelije (CD3<+>CD8<+>); C) CD4<+>T ćelije (CD3+CD4+CD25 CD127+); D) regulatorne T ćelije (CD4<+>CD25<+>FOXP3<+>).
Primeri
Sledeći primeri su primeri postupaka i smeša pronalaska. Podrazumeva se da se i druga ostvarenja mogu praktično koristiti, primenjujući, prethodno obezbeđeni, opšti opis.
Primer 1
Opšti postupci
Tehnike rekombinantne DNK
Za manipulisanje sa DNK korišćeni su standardni postupci, kao što su ih opisali Sambrook i saradnici u Molecular cloning: A laboratorv manual; Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Korišćeni su reagensi za molekularnu biologiju, prema uputstvima proizvođača. Opšti podaci koji se odnose na nukleotidne sekvence lakih i teških lanaca humanih imunoglobuiina dati su u: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242.
Sekvenciranje DNK
Sekvence DNK su određene sekvenciranjem dvostrukog lanca.
Sinteza gena
Željeni segmenti gena, kada su potrebni, prozvode se ili uz pomoć PCR-a, koristeći odgovarajuće kalupe ili se sintetišu posredstvom Geneart AG (Regensburg, Nemačka) iz sintetskih oligonukleotida i PCR proizvoda, putem automatizovane sinteze gena. U slučajevima kada tačna genska sekvenca nije dostupna, dizajnirani su oligonukleotidni prajmeri na osnovu sevenci najbliže homologne sekvence, a geni su izolovani posredstvom RT-PCR iz RNK-a, koja vodi poreklo iz odgovarajućeg tkiva. Segmenti gena, koji su okruženi pojedinačnim restriktivnim položajima endonukleaznog otcepljivanja, klonirani su u standardne klonirajuće/ sekvencirajuće vektore. Plazmid DNK je prečišćena iz transformisanih bakterija, a koncentracija je određena UV spektroskopijom. DNK sekvenca subkloniranih genskih fragmenata potvrđena je sekvenciranjem DNK. Segmenti gena su dizajnirani sa pogodnim restriktivnim položajima, kako bi se omogućilo sub-kloniranje u odgovarajuće ekspresione vektore. Sve konstrukcije su dizajnirane sa 5'-krajem koda DNK sekvence za lider peptid, koji ciljano deluje na proteine za sekreciju u eukariotskim ćelijama. SEQ ID NO-i 263-273 pružaju primere sekvenci lider peptida i polinukleotida koji ih kodiraju.
Izrada fuzija IL-2R6ypodjedinica-Fcifuzije IL-2Rapodjedinica Fc
Da bi se ispitao afinitet vezivanja IL-2 receptora, razvijeno je sredstvo koje omogućuje ekspresiju heterodimernog IL-2 receptora; 8-podjedinica IL-2 receptora je spojena sa Fc molekulom, koji je proizveden inženjeringom, da bi se izvršila heterodimerizacija (Fc("hole")) (vidi SEQ ID NO-i 274 i 275), koristeći "knobs-into-holes" tehnologiju (Merchant et al., Nat Biotech. 16, 677-681 (1998)). -/-podjedinica IL-2 receptora je, nakon toga, spojena sa Fc("knob") varijantom (vidi SEQ ID NO-i 276 i 277), čime se vrši heterodimerizacija sa Fcfhole"). Ovaj heterodimerni Fc-fuzioni protein je, zatim, korišćen kao supstrat za ispitivanje interakcije IL-2/IL-2 receptor. a-podjedinica IL-2R je ekspresovana kao monomerni lanac sa AcTev položajem cepanja i Avi His tagom (SEQ ID NO-i 278 i 279). Odgovarajuće podjedinice IL-2R su tranzitorno ekspresovane na HEK EBNA 293 sa serumom za konstrukciju IL-2R Bv podjedinica i bez seruma za konstrukciju sa a-podjedinicom. Konstrukcija IL-2R 8y podjedinica prečišćena je na proteinu A (GE Healthcare), nakon čega je sledilo podvrgavanje hromatografiji sa isključivanjem prema veličini (GE Healthcare, Superdex 200). Konstrukcija IL-2R a-podjedinica je prečišćena uz pomoć His taga na NiNTA koloni (Oiagen), nakon čega je sledilo podvrgavanje hromatografiji sa isključivanjem prema veličini (GE Healthcare, Superdex 75).
Izrada imunokonjugata
Detalji u vezi sa izradom i prečišćavanjem Fab-IL-2-Fab imunokonjugata, uključujući stvaranje i afinitetno sazrevanje antigen-vezujućih delova, mogu se naći u Primerima, koji su priključeni PCT publikaciji broj WO 2011/020783. Kako je u njima opisano, razni antigen-vezujući domeni, koji su usmereni ka FAP, proizvedeni su uz pomoć izloženih faga, uključujući one koji su označeni sa 4G8, 3F2, 28H1, 29B11, 14B3 i 4B9, koji su korišćeni u sledećim primerima. Klon 28H1 je afinitetno-sazrelo antitelo, na osnovu matičnog klona 4G8, dok su klonovi 29B11, 14B3 i 4B9 antitela sazrelog afiniteta, na osnovu matičnog klona 3F2. Antitgen-vezujući domen, označen sa MHLG1 KV9, koji je ovde korišćen, usmeren je prema MCSP.
Sekvence imunokonjugata, koji sadrži IL-2 divljeg tipa, koje su korišćene u sledećim primerima, takođe se mogu naći u PCT publikaciji broj WO 2011/020783. Sekvence koje odgovaraju imunokonjugatima, koji sadrže kvadripl mutant IL-2, koje su korišćene u sledećim primerima su: 4G8: SEQ ID NO-i 211 i 233; 3F2: SEQ ID NO-i 209 i 231; 28H1: SEQ ID NO-i 219 i 233; 29B11: SEQ ID NO-i 221 i 231; 14B3: SEQ ID NO-i 229 i 231; 4B9: SEQ ID NO-i 227 i 231; MHLG1-KV9: SEQ ID NO-i 253 i 255. Sekvence DNK su proizvedene posredstvom genske sinteze i/ili klasičnih tehnika molekularne biologije i subklonirane su u ekspresione vektore sisara (jedan za fuzioni protein sa lakim lancem, a drugi za fuzioni protein teški lanac/IL-2) pod kontrolom MPSV promotera i ushodno od sintetskog poliA položaja, pri čemu svaki vektor nosi EBV OriP sekvencu. Imunokonjugati, kao što su korišćeni u primerima u nastavku, proizvedeni su posredstvom ko-transfekcije HEK293-EBNA ćelija eksponencijalnog rasta sa ekspresionim vektorima sisara, uz korišćenje transfekcije sa kalcijum fosfatom. Alternativno, HEK293 ćelije, koje se uzgajaju u suspenziji, transfektovane su sa polietileniminom (PEi), sa odgovarajućim ekspresionim vektorima. Alternativno, stabilno transfektovani pulovi CHO ćelija ili klonovi CHO ćelija korišćeni su za proizvodnju u medijumima bez seruma. Dok 4G8-bazirane FAP-ciljane Fab-IL-2-Fab konstrukcije, koje sadrže IL-2 divljeg tipa ili (kvadripl) mutant IL-2 mogu biti prečišćene uz pomoć afinitetne hromatografije, koristeći matriks od proteina A, afinitetno zrele 28H1-bazirane FAP-ciljane Fab-IL-2-Fab konstrukcije prečišćavaju se afinitetnom hromatografijom na matriksu od proteina G u maloj količini.
Ukratko, FAP-ciljane 28H1 Fab-IL-2-Fab konstrukcije, koje sadrže IL-2 divljeg tipa ili (kvadripl) mutant IL-2, prečišćene su iz ćelijskih supernatanata, putem jednog afinitetnog koraka (protein G), nakon čega je sledilo podvrgavanje hromatografiji sa isključivanjem prema veličini (Superdex 200, GE Healthcare). Kolona sa proteinom G je uravnotežena u 20 mM natrijum fosfatu i 20 mM natrijum citratu na pH 7.5, postavljen je supernatant, a kolona je isprana sa 20 mM natrijum fosfatom, 20 mM natrijum citratom na pH 7.5. Eluiranje Fab-IL-2-Fab je izvršeno sa 8.8 mM mravljom kiselinom na pH 3. Eluirane frakcije su sjedinjene u pul, i prečišćene su podvrgavanjem hromatografiji sa isključivanjem prema veličini u završnom puferu za formulisanje: 25 mM kalijum fosfat, 125 mM natrijum hlorid, 100 mM glicin pH 6.7. Rezultati prečišćavanja i analiziranja dati su u nastavku kao primeri.
FAP-ciljani 3F2 Fab-IL-2-Fab ili 4G8 Fab-IL-2-Fab, koje sadrže IL-2 divljeg tipa ili (kvadripl) mutant IL-2, prečišćene su sličnim postupkom, koga je činio jedan korak afinitetne hromatografije uz korišćenje proteina A, nakon čega je sledila hromatografija sa isključivanjem prema veličini (Superdex 200, GE Healthcare). Kolona sa proteinom A je uravnotežena u 20 mM natrijum fosfatu, 20 mM natrijum citratu na pH 7.5, postavljen je supernatant, kolona je isprana sa 20 mM natrijum fosfatom, 20 mM natrijum citratom, 500 mM natrijum hloridom na pH 7.5, nakon čega je sledilo ispiranje sa 13.3 mM natrijum fosfatom, 20 mM natrijum citratom, 500 mM natrijum hloridom na pH 5.45. Opcioni se izvodi i treće ispiranje sa 10 mM MES, 50 mM natrijum hloridom na pH 5. Fab-IL-2-Fab se eluira sa 20 mM natrijum citratom, 100 mM natrijum hloridom, 100 mM glicinom, pH 3. Eluirane frakcije su sjedinjene u pul, i prečišćene su podvrgavanjem hromatografiji sa isključivanjem prema veličini u završnom puferu za formulisanje: 25 mM kalijum fosfat, 125 mM natrijum hlorid, 100 mM glicin pH 6.7. Primerne detaljne procedure prečišćavanja i rezultati dati su, za odabrane konstrukcije, u nastavku.
FAP-ciljani lgG-IL-2 qm fuzioni proteini proizvedeni su na osnovu FAP-antitela 4G8, 4B9 i 28H1, pri čemu je jedan pojedinačni IL-2 kvadripl mutant (qm) spojen sa C-terminusom jednog heterodimernog teškog lanca, kao što je prikazano na Slici 1B. Ciljano delovanje na tumorsku stromu, pri čemu je FAP selektivno ekspresovan, postiže se preko Fab regiona dvovalentnog antitela (efekat avidnosti). Heterodimerizacija, koja se dešava u prisustvu pojedinačnog IL-2 kvadripl mutanta, postiže se primenom "knob-into-hole" tehnologije. Da bi se minimizovalo stvaranje homodimernih IgG-citokin fuzija, citokin se spaja sa C-krajem (sa delecijom C-terminalnog ostatka lizina) teškog lanca IgG koji sadrži čvor, posredstvom G4-(SG^- ili (G4S)3-linkera. Fuzija antitelo-citokin ima karakteristike slične IgG imunoglobulinu. Da bi se redukovalo FcyR vezivanje/efektorska funkcija i sprečila ko-aktivacija FcR, u Fc domen su uvedene mutacije P329G L234A L235A (LALA). Sekvence ovih imunokonjugata date su u SEQ ID NO-i 297, 299 i 233 (28H1), SEQ ID NO-i 301, 303 i 231 (4B9) i SEQ ID NO-i 315, 317 i 233 (4G8)). Pored toga, razvijen je CEA-ciljani lgG-IL-2 qm fuzioni protein i kontrolni DP47GS ne-ciljani lgG-IL-2 qm fuzioni protein, u kome se IgG ne vezuje za naznačenu metu. Sekvence ovih imunokonjugata date su u SEQ ID NO-i 305, 307 i 309 (DP47GS), i SEQ ID NO-i 319, 321 i 323 (CH1A1A).
lgG-IL-2 konstrukcije proizvedene su privremenom ekspresijom u HEK293 EBNA ćelijama, a suštinski su prečišćene kao što je prethodno opisano za Fab-IL-2-Fab konstrukcije. Ukratko, lgG-IL-2 fuzioni proteini prečišćeni su uz pomoć jednog afinitetnog koraka sa proteinom A (HiTrap ProtA, GE Healthcare), uz uravnoteživanje u 20 mM natrijum fosfatu, 20 mM natrijum citratu pH 7.5. Nakon punjenja supernatanta, kolona se najpre ispire sa 20 mM natrijum fosfatom, 20 mM natrijum citratom, pH 7.5, a nakon toga se ispiranje vrši sa 13.3 mM natrijum fosfatom, 20 mM natrijum citratom, 500 mM natrijum hloridom, pH 5.45. Fuzioni protein IgG-citokin je eluiran sa 20 mM natrijum citratom, 100 mM natrijum hloridom, 100 mM glicinom, pH 3. Frakcije su neutralisane, sjedinjene u pul i prečišćene posredstvom hromatografije sa isključivanjem prema veličini (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare) u konačnom puferu za formulisanje: 25 mM kalijum fosfat, 125 mM natrijum hlorid, 100 mM glicin pH 6.7. Primerne detaljne procedure prečišćavanja i rezultati dati su, za odabrane konstrukcije, u nastavku. Koncentracija proteina u prečišćanim uzorcima proteina određena je merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, uz korišćenje molarnog ekstinkcionog koeficijenta, izračunatog na osnovu aminokiselinske sekvence. čistoća i molekulska težina imunokonjugata analizirani su posredstvom SDS-PAGE, u prisustvu i odsustvu reduktivnog sredstva (5 mM 1,4-ditiotreitol) i obojeni su sa Coomassie blue bojom (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen). NuPAGE<®>Pre-Cast gel sistem (Invitrogen) korišćen je prema uputstvima proizvođača (4-20% Tris-glicin gelovi ili 3-
12% Bis-Tris). Agregatni sadržaj uzoraka imunokonjugata analiziran je korišćenjem analitičke kolone Superdex 200 10/300GL sa isključivanjem prema veličini (GE Healthcare) u 2 mM MOPS, 150 mM NaCI, 0.02% NaN3, pH 7.3 radnom puferu na 25°C.
Afinitet vezivanja za FAP
Afinitet vezivanja za FAP otcepljenih fragmenata Fab, koji su u ovim primerima korišćeni kao antigen-vezujući delovi, utvrđen je posredstvom površinske plazmon rezonance (SPR) na Biacore aparatu. Ukratko, anti-His antitelo (Penta-His, Oiagen 34660) je imobilisano na CM5 čipovima, da bi se izvršilo prihvatanje 10 nM humanih, mišjih ili majmunskih FAP-His (20 s). Temperatura je bila 25°C, a kao pufer je korišćen HBS-EP. Koncentracija analita Fab bila je 100 nM sve do 0.41 nM (duplikati), pri brzini protoka od 50^ml/min (asocijacija: 300 s, disocijacija: 600 s (4B9, 14B3, 29B11, 3F2) ili 1200 s (28H1, 4G8), regeneracija: 60 s 10 mM glicin pH 2). Izvršeno je podešavanje na bazi 1:1 modela vezivanja, Rl=0, Rmax=lokalno (zbog formata prihvatanja). Tabela 2 prikazuje monovalentne afinitete, kako su utvrđeni posredstvom
SPR.
Testovi biološke aktivnosti sa ciljanim IL-2 imunokonjugatima
Biološka aktivnost FAP- ili MCSP-ciljanih Fab-IL-2-Fab imunokonjugata i FAP-ciljanih lgGIL-2 imunokonjugata, obuhvatajući divlji tip ili (kvadripl) mutant IL-2, istražena je pomoću nekoliko ćelijskih testova tako što je upoređena sa komercijalno nabavljenim IL-2 (Proleukin, Novartis, Chiron).
IFN-v oslobađanje iz NK ćelija (u rastvoru)
IL-2 ispošćene NK92 ćelije (100000 ćelija/reakcionom mestu u ploči sa 96-U-reakcionih mesta) su inkubirane sa različitim koncentracijama IL-2 imunokonjugata, obuhvatajući divlji tip ili (kvadripl) mutant IL-2, u toku 24 h u NK medijumu (MEM alfa od Invitrogena (#22561-021) koji je obogaćen sa 10% FCS, 10% konjskog seruma, 0.1 mM 2-merkaptoetanola, 0.2 mM inozitola i 0.02 mM folne kiseline). Supernatanti su sakupljeni i oslobađanje IFN-y je analizirano korišćenjem anti-humanog IFN-y ELISA Kita II od Becton Dickinson (#550612). Kao pozitivna kontrola za aktivaciju ćelija koju posreduje IL-2 koristio se Proleukin (Novartis).
Proliferacija NK ćelija
Krv zdravih volontera je uzeta u špriceve sa heparinom i, izoluju se PBMCs. Netaknute humane NK ćelije se izoluju iz PBMCs korišćenjem pakovanja Human NK Cell Isolation Kit II od Miltenvi Biotec (#130-091-152). CD25 ekspresija u ćelijama je proverena protočnom citometrijom. Za testove proliferacije, inkubirano je 20000 izolovanih humanih NK ćelija u toku2 dana u vlažnom inkubatoru na 37°C, sa 5% C02u prisustvu različitih IL-2 imunokonjugata, uključujući divlji tip ili (kvadripl) mutant IL-2. Proleukin (Novartis) je poslužio kao kontrola. Posle 2 dana, sadržaj ATP-a u lizatima ćelija izmeren je upotrebom CellTiter-Glo Luminescent Cell Viabilitv Assay od Promega (#G7571/2/3). Procenat rasta je izračunat podešavanjem najviše koncentracije Proleukina na 100 % proliferacije i netretiranih ćelija bez IL-2 stimulusa na 0 % proliferacije.
Test fosforilacijeST ATS
Krv zdravih volontera je uzeta u špriceve sa heparinom i, izoluju se PBMCs. PBMCs sutretirane sa IL-2 imunokonjugatima, uključujući divlji tip ili (kvadripl) mutant IL-2, pri naznačenim koncentracijama ili sa Proleukinom (Novartis) kao kontrolom. Posle 20 min inkubacije na 37°C, PBMCs su fiksirane sa prethodno zagrejanim Cytofix puferom (Becton Dickinson #554655) u toku 10 min na 37°C, a zatim je usledila permeabilizacija sa puferom Phosflow Perm Buffer III (Becton Dickinson #558050) u toku 30 min na 4°C. Ćelije su isprane dva puta sa PBS koji ima 0.1 % BSA pre FACS bojenja koje je izvedeno korišćenjem smeša antitela za protočnu citometriju radi detekcije različitih ćelijskih populacija i fosforilacije STAT5. Uzorci su analizirani korišćenjem FACSCantoll sa HTS od Becton Dickinson.
NK ćelije su definisane kao CD3-CD56\ CD8 pozitivne T ćelije su definišane kao CD3<+>CD8<+>, CD4 pozitivne T ćelije su definisane kao CD4+CD25 CD127+ i Treg ćelije su definisane kao CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>.
ProliferacijaiAICD Tćelija
Krv zdravih volontera je uzeta u špriceve sa heparinom i, izoluju se PBMCs. Netaknute T ćelije se izoluju korišćenjem pakovanja Pan T Cell Isolation Kit II od Miltenyi Biotec (#130-091-156). T ćelije su prethodno stimulisane sa 1 ug/ml PHA-M (Sigma Aldrich #L8902) u toku 16 h pre dodavanja Proleukina ili Fab-IL-2-Fab imunokonjugata, uključujući divlji tip ili (kvadripl) mutant IL-2, u isprane ćelije tokom još 5 dana. Posle 5 dana, sadržaj ATP-a u lizatima ćelija izmeren je upotrebom CellTiter-Glo luminescentnog testa vijabilnosti ćelija od Promega (#G7571/2/3). Relativna proliferacija je izračunata podešavanjem najviše koncentracije Proleukina na 100 % proliferaciju.
Izlaganje fosfatidilserinu (PS) i ćelijska smrt T ćelija je ispitano analizom pomoću protočne citometrije (FACSCantoll, BD Biosciences) aneksin V (Annexin-V-FLUOS Staining Kit, Roche Applied Science) i propidijum jodid (Pl)-obojenih ćelija. Da bi se indukovala ćelijska smrt aktivacijom (AICD), T ćelije su tretirane sa anti-Fas antitelom koje izaziva apoptozu (Millipore klon Ch11) tokom 16 h nakon 16 h PHA-M i 5 dana tretmana sa Fab-IL-2-Fab imunokonjugatima. Aneksin V bojenje je izvedeno prema uputstvima proizvođača. Ukratko, ćelije su isprane sa puferom za vezivanje Ann-V (1x matični: 0.01 M Hepes/NaOH pH 7.4, 0.14 M NaCI, 2.5 mM CaCI2) i bojene u toku 15 min na RT u mraku sa Annexin V FITC (Roche). Ćelije su ponovo isprane u Ann-V-vezujućem puferu pre dodavanja 200 nl/reakcionom mestu Ann-V-vezujućeg pufera koji sadrži Pl (0.3 ug/ml). Ćelije su odmah analizirane protočnom citometrijom.
Vezivanje za ćelije koje ekspresuju FAP
Vezivanje FAP-ciljanih lgG-IL-2 qm i Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata za humani FAP koji se ekspresuje na stabilno transfektovanim HEK293 ćelijama je meren pomoću FACS. Ukratko, 250 000 ćelija po reakcionom mestu se inkubira sa naznačenom koncentracijom imunokonjugata u ploči sa 96 reakcionih mesta zaobljenih dna, inkubira se u toku 30 min na 4°C, pa se ispira jednom sa PBS/0.1% BSA. Vezani imunokonjugati se detektuju nakon inkubacije od 30 min na 4°C sa FITC-konjugovanim AffiniPure F(ab')2 fragmentom kozijeg anti-humanog F(ab')2 specifičnog (Jackson Immuno Research Lab #109-096-097, radni rastvor: 1:20 razblažen u PBS/0.1% BSA, sveže pripremljen) korišćenjem FACS Cantoll (Softvvare FACS Diva).
Analiza FAP internalizacije tokom vezivanjazaFACS
Za nekoliko FAP antitela za koje se zna u ovoj oblasti, navedeno je da ona indukuju FAP internalizaciju tokom vezivanja (opisano npr., kod Baum et al., J Drug Target 15, 399-406
(2007); Bauer et al., Journal of Clinical Oncologv, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition), vol. 28 (May 20 Supplement), abstract no. 13062 (2010); Ostermann et al., Clin Cancer Res 14, 4584-4592 (2008)). Tako, analizirali smo svojstva internalizacije naših Fab-IL-2-Fab imunokonjugata. Ukratko, GM05389 ćelije (fibroblasti pluća čoveka) uzgajane u EMEM mediju mu sa 15% FCS, bile su odvojene, isprane, izbrojane, proverene na vijabilnost i zasejane pri gustini od 2x10<5>ćelija/reakcionom mestu u pločama sa 12-reakcionih mesta. Sledećeg dana, FAP-ciljani Fab-IL-2-Fab imunokonjugati su razblaženi u hladnom medijumu i ostavljeni da se vežu za površinu ćelija tokom 30 min na ledu. Višak nevezanog antitela je otpran korišćenjem hladnog PBS i ćelije su zatim inkubirane u 0.5 ml kompletnog prethodno zagrejanog medijuma na 37°C tokom naznačenih vremenskih perioda. Kada su ostvarene razne vremenske tačke, ćelije su prenesene na led, isprane jednom sa hladnim PBS i inkubirane sa sekundarnim antitelom (FITC-konjugovani AffiniPure F(ab')2 fragment kozjeg anti-humanog F(ab')2 specifičnog, Jackson Immuno Research Lab# 109-096-097, 1:20 razblaženje) u toku 30 min na 4°C. Ćelije su zatim isprane dva puta sa PBS/0.1% BSA, prenesene u ploču sa 96 reakcionih mesta, centrifugirane u toku 4 min na 4°C, 400 x g i, ćelijski talog se ponovo suspenduje uz mešanje na vorteksu. Ćelije se fiksiraju upotrebom 100 ?! 2% PFA. Za FACS merenja, ćelije se resuspenduju u 200 u.l/uzorku PBS/0.1% BSA i, izvrši se merenje uz protokol za ploče na FACS Cantoll (Software FACS Diva).
Primer 2
Dizajnirali smo mutirane verzije IL-2 koje sadrže jednu ili više sledećih mutacija (u poređenju sa divljim tipom IL-2 sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1):
1. T3A - "knockout" predikcionog O-glikozilacionog položaja
2. F42A - "knockout" IL-2/IL-2R a interakcije
3. Y45A - "knockout" IL-2/IL-2R a interakcije
4. L72G - "knockout" IL-2/IL-2R a interakcije
5. C125A - prethodno opisana mutacija da se izbegnu disulfidno-premošćeni IL-2 dimeri
Mutant IL-2 polipeptida koji sadrži sve mutacije 1-4 je ovde označen kao IL-2 kvadripl mutant (qm). Može dalje imati mutaciju 5 (vidi SEQ ID NO: 19).
Osim tri mutacije F42A, Y45A i L72G, označene da interferiraju sa vezivanjem za CD25, T3A mutacija je izabrana da eliminiše O-glikozilacioni položaj i da se dobije proteinski proizvod sa većom homogenošću i čistoćom kada se IL-2 qm polipeptid ili imunokonjugat ekspresuje u eukariotskim ćelijama, kao što su CHO ili HEK293 ćelije.
Za svrhe prečišćavanja His6 tag je unesen na C-terminus povezan preko VD sekvence. Radi poređenja ne-mutiranih analoga, verzija IL-2 je generisana tako da sadrži samo C145A mutaciju kako bi se izbegli neželjeni inter-molekularni disulfidni mostovi (SEQ ID NO: 3). Pojedinačne molekulske težine bez signalne sekvence su bile 16423 D za goli IL-2 i 16169 D za goli IL-2 qm. Divlji-tip i kvadripl mutant IL-2 sa His tagom su transfektovani u HEK EBNA ćelijama u medijumu bez seruma (F17 medijum) Filtriranom supernatantu je promenjen pufer preko membrane, pre stavljanja na NiNTA Superflovv kertridž {5 ml, Oiagen). Kolona je isprana sa puferom za ispiranje: 20 mM natrijum fosfat, 0.5 M natrijum hlorid pH 7.4 i eluirana sa puferom za eluaciju: 20 mM natrijum fosfat, 0.5 M natrijum hlorid 0.5 M imidazol pH 7.4. Posle punjenja, kolona je isprana sa 8 zapremina kolone (CV) sa puferom, 10 CV 5% puferom za eluiranje (odgovara 25 mM imidazolu), zatim eluirana uz gradijent na 0.5 M imidazola. Sjedinjeni eluat je ujednačen pomoću hromatografije isključivanja prema veličini na HiLoad 16/60 Superdex75 (GE Healthcare) koloni u 2 mM MOPS, 150 mM natrijum hlorida, 0.02% natrijum azida pH 7.3. Slika 2 prikazuje hromatogram prečišćavanja His tag za divlji-tip golog IL-2. Pooi 1 je sastavljen od frakcija 78-85, pool 2 od frakcija 86-111. Slika 3 prikazuje hromatogram hromatografije isključivanja prema veličini za divlji-tip IL-2, za svaki pool frakcije 12 do 14 su sjedinjene. Slika 4 prikazuje analitičku hromatografiju isključivanja prema veličini za divlji-tip IL-2 što je određeno na Superdex 75, 10/300 GL (GE Healthcare) koloni u 2 mM MOPS, 150 mM natrijum hlorida, 0.02% natrijum azida pH 7.3. Pool 1 i 2 su sadržavali 2 proteina od ca. 22 i 20 kDa. Pool 1 je imao više većeg proteina, a pool 2 je imao više malog proteina, predpostavlja se da je ova razlika posledica razlika u O-glikozilaciji. Dobici su bili ca. 0.5 mg/L supernatanta za pool 1 i ca. 1.6 mg/L supernatanta za pool 2. Slika 5 prikazuje hromatogram His tag prečišćavanja za kvadripl mutant IL-2. Pool 1 je bio sastavljen od frakcija 59-91, pool 2 od frakcija 92-111. Slika 6 prikazuje hromatogram hromatografije isključivanja prema veličini za kvadripl mutant IL-2, ovde su samo pool 2 frakcije 12 do 14 zadržane. Slika 7 prikazuje analitičku hromatografiju isključivanja prema veličini za kvadripl mutant IL-2 što je određeno na Superdex 75, 10/300 GL (GE Healthcare) koloni u 2 mM MOPS, 150 mM natrijum hlorida, 0.02% natrijum azida pH 7.3. Preparat golog kvadripl mutanta IL-2 sadržavao je samo jedan protein od 20 kD. Ovaj protein ima izbačeno O-glikozilaciono mesto. Alikvoti golog IL-2 divljeg-tipa i kvadripl mutanta su čuvani zamrznuti na -80<C>C. Dobici su bili ca 0.9 mg/L supernatanta.
Druga serija His-tagovanog kvadripl mutanta IL-2 je prečišćena kako je prethodno opisano putem afinitetne hromatografije sa imobilisanim jonom metala (IMAC) i zatim, hromatografijom isključivanja prema veličini (SEC). Puferi korišćeni za IMAC su bili: 50 mM Tris, 20 mM imidazol, 0.5M NaCI pH 8 za uravnotežavanje kolone i ispiranje i, 50 mM Tris, 0.5 M imidazol, 0.5 M NaCI pH 8 za eluaciju. Pufer korišćen za SEC i pufer konačne formulacije je bio: 20 mM histidin, 140 mM NaCI pH 6. Slika 43 prikazuje rezultat tog prečišćavanja. Dobitak je bio 2.3 ml/L supernatanta.
Posle toga, određen je afinitet za IL-2R Sy heterodimer i a-subjedinicu IL-2R pomoću površinske plazmon rezonance (SPR). Ukratko, ligand - bilo humana a-subjedinica IL-2R (Fc2) bilo humani 6 čvornovatiyceli heterodimer (Fc3) IL2-R - je imobilisan na CMS čipu. Zatim, se na čip aplikuju goli divlji tip (pool 1 i 2) ili kvadripl mutant IL-2, kao i Proleukin (Novartis/Chiron) kao analiti na 25°C u HBS-EP puferu, u opsegu koncentracija od 300 nM sve do 1.2 nM (1:3 razbl.). Brzina protoka je bila 30 pil/min i korišćeni su sledeći uslovi za asocijaciju:180s, disocijaciju: 300 s, i regeneraciju: 2 x 30 s 3M MgC^ za IL2-R 6 čvornovati y celi heterodimer, 10 s 50 mM NaOH za IL-2R a-subjedinicu. Primenjeno je 1:1 vezivanje za podešavanje (1:1 vezivanje Ri*0, Rmax=lokal za IL-2R 67, očiglednu KD, 1:1 vezivanje Rl=0, Rmax=lokal za IL-2R a). Tabela 3 prikazuje KDvrednosti za vezivanje humanog divljeg tipa i kvadripl mutanta IL-2, kao i Proleukina za IL-2R 3y i IL-2R a-subjedinicu.
Podaci pokazuju da goli IL-2 kvadripl mutant ispoljava željeno ponašanje i nema vezivanje za IL-2R a-subjedinicu dok je vezivanje za IL-2R |3y zadržano u poređenju sa respektivnom divlji-tip IL-2 konstrukcijom i Proleukinom. Razlike između poolova 1 i 2 divljeg-tipa IL-2 verovatno mogu da se pripišu razlikama u O-glikozilaciji. Ova varijabilnost i heterogenost se prevazilazi sa IL-2 kvadripl mutantom uvođenjem T23A mutacije.
Primer3
Tri mutacije F42A, Y45A i L72G i mutacija T3A su uvedene u Fab-IL-2-Fab format (Slika 1A) korišćenjem anti-FAP antitela 4G8 kao modela ciljanja domena bilo kao pojedinačnih mutanata: 1) 4G8 IL-2 T3A, 2) 4G8 IL-2 F42A, 3) 4G8 IL-2 Y45A, 4) 4G8 IL-2 L72G, ili su ovi ukombinovani u Fab-IL-2 mt-Fab konstrukcije, kao: 5) tripl mutant F42A/Y45A/L72G, ili kao: 6) kvadripl mutant T3A/F42A/Y45A/L72G i da bi se inaktiviralo O-glikozilaciono mesto. 4G8-bazirani Fab-IL-2 wt-Fab je poslužio za poređenje. Sve konstrukcije su imale C145A mutaciju da bi se izbegli disulfidno premošćeni IL-2 dimeri. Različite Fab-IL 2-Fab konstrukcije se ekspresuju u HEK 293 ćelijama i prečišćavaju kako je gore opisano preko proteina A hromatografije isključivanja prema veličini što je prethodno opisano. Zatim, određen je afinitet odabranih IL 2 varijanti za humani i mišiji IL 2R 67 heterodimer i za humanu i mišiju IL-2R a-subjedinicu pomoću površinske plazmon rezonance (SPR) (Biacore) korišćenjem rekombinantnog IL-2R 67 heterodimera i monomerne IL-2R a-subjedinice u sledećim uslovima:
IL-2R a-subjedinica je imobilisana u dve gustine i, protočna ćelija sa višim stepenom imobilizacije je korišćena za mutante koji su izgubili CD25 vezivanje. Korišćeni su sledeći uslovi: hemijska imobilizacija: humani IL-2R Py heterodimer 1675 RU; mišiji IL-2R (3y heterodimer 5094 RU; humana IL-2R a-subjedinica 1019 RU; human IL-2R a-subjedinica 385 RU, misija IL-2R a-subjedinica 1182 RU; mišija IL-2R a-subjedinica 378 RU, temperatura: 25°C, analiti: 4G8 Fab-IL 2 varijante-Fab konstrukacija 3.1 nM do 200 nM, protok 40 (al/min, asocijacija: 180 s, disocijacija: 180 s, regeneracija: 10 mM glicin pH 1.5, 60 s, 40^l/min. Podešvanje: reakcioni model dva stanja (promena konformacije), Rl=0 Rmax=lokalno. Rezultati kinetičkih analiza su prikazani u Tabeli 4.
Istovremeno vezivanje za IL 2R By heterodimer i FAP je pokazano SPR. Ukratko, humana IL 2R (3y "knob-into-hole" konstrukcija se hemijski imobiliše na CM5 čipu i 10 nM Fab-IL-2-Fab konstrukcija se zarobljava 90 s. Humani FAP služi kao analit u koncentracijama od 200 nM sve do 0.2 nM. Uslovi su bili: temperatura: 25°C, pufer: HBS-EP, protok: 30 nl/min, asocijacija:90 s, disocijacija: 120 s. Regeneracija je izvedena u toku 60 s sa 10 mM glicinom pH 2. Podešavanje je napravljeno po modelu za 1:1 vezivanje, Rlt0, Rmax=global. Test SPR premošćavanja je pokazao da Fab-IL-2-Fab konstrukcije, obe i divlji-tip i kvadripl mutant, kao i one zasnovane na afinitetno zrelom FAP vezivaču 28H1 ili matičnim 3F2 ili 4G8 antitelima, mogu da se vežu pri koncentracijama od 10 nM istovremeno i za IL 2R 6y heterodimer imobilisan na čipu i za humani FAP korišćen kao analit (Slika 8).Određeni afiniteti su prikazani u Tabeli 5.
Kada se posmatraju zajedno, SPR podaci pokazuju da i) T3A mutacija ne utiče na vezivanje za CD25, ii) tri mutacije F42A, Y45A i L72G ne utiču na afinitet prema IL 2R Bv heterodimeru dok smanjuju afinitet prema CD25 ovim redosledom: wt = T3A > Y45A (ca. 5x manji) > L72G (ca. 10x manji) > F42A (ca. 33x manji); iii) kombinacija tri mutacije F42A, Y45A i L72G sa ili bez mutanta O-glikozilacionog položaja T3A dovodi do potpunog gubitka CD25 vezivanja kada se određuje u SPR uslovima, iv) tako je afinitet humanog IL-2 za misiji IL-2R Bv heterodimer i IL-2R a-subjedinicu smanjen za u prošeku faktor 10 u poređenju sa humanim IL-2 receptorima, odabrane mutacije ne utiču na afinitet prema mišijem IL-2R By heterodimeru, ali onemogućavaju vezivanje za mišiju IL-2R a-subjedinicu. Ovo ukazuje na to da miš predstavlja validan model za ispitivanje farmakoloških i toksikoloških efekata IL-2 mutanata, mada ukupno gledano IL-2 ispoljava manje toksičnosti kod glodara nego kod ljudi.
Osim gubitka O-glikozilacije, još jedna prednost kombinacije četiri mutacije T3A, F42A, Y45A, L72G jeste snižena površinska hidrofobnost IL-2 kvadripl mutanta zahvaljujući promeni površinski izloženih hidrofobnih ostataka, kao što su fenilalanin, tirozin ili leucin za alanin. Analiza temperature agregacije putem dinamičkog rasipanja svetlosti pokazuje da je temperatura agregacije za FAP-ciljane Fab-IL-2-Fab imunokonjugate uključujući divlji tip ili kvadripl mutant IL-2 bila u istom opsegu: ca. 57-58°C za 3F2 matični Fab-IL-2-Fab i za 29B11 3F2-derivat zrelog afiniteta; i u opsegu od 62-63°C za 4G8 matični Fab-IL-2-Fab i 28H1, 4B9 i 14B3 4G8-derivate zrelog afiniteta, ukazujući na to da kombinacija četiri mutacije nije imala negativan upliv na stabilnost proteina. Kao potpora željenim svojstvima odabranog IL-2 kvadripl mutanta, prolazni dobici ekspresije ukazuju na to da kvadripl mutant kod Fab-IL-2 qm-Fab formata čak može dovesti do većih dobitaka ekspresije nego što su oni zapaženi kod poredbenih Fab-IL-2 wt-Fab konstrukcija. Konačno, farmakokinetičke analize pokazuju da oba 4G8-bazirani Fab-IL-2 qm-Fab i Fab-IL-2 wt-Fab imaju poredbena PK svojstva (vidi Primer 9 u nastavku). Na osnovu ovih podataka i ćelijskih podataka opisanih u Primeru 4 u nastavku, kvadripl mutant T3A, F42A, Y45A, L72G je odabran kao idealna kombinacija mutacija da bi se izbeglo CD25 vezivanje IL-2 u ciljanom Fab-IL-2-Fab imunokonjugatu.
Primer 4
4G8-bazirani FAP-ciljani Fab-IL 2-Fab imunokonjugati, uključujući divlji tip IL-2 ili pojedinačne mutante 4G8 IL-2 T3A, 4G8 IL-2 F42A, 4G8 IL-2 Y45A, 4G8 IL-2 L72G ili tripl (F42A/Y45A/L72G) ili kvadripl mutant (T3A/F42A/Y45A/L72G) IL-2, zatim su testirani u ćelijskim testovima poredeći ih sa Proleukinom, kako je prethodno opisano.
Oslobađanje IFN-y indukovano pomoću IL-2 je mereno nakon inkubacije NK ćelijske linije NK92 sa konstrukcijama (Slika 9). Na svojoj površini, NK92 ćelije ekspresuju CD25. Rezultati su pokazali da je Fab-IL-2-Fab imunokonjugat uključujući divlji tip IL-2 manje moćan u indukovanju oslobađanja IFN-y od Proleukina što se može i očekivati zbog ca. 10-puta nižeg afiniteta Fab-IL-2 wt-Fab prema IL-2R By heterodimeru. Uvođenje pojedinačnih mutacija koje ometaju CD25 vezivanje, kao i kombinacije tri mutacije koja ometa CD25 vezivanje u IL-2 tripl mutantu dovodi do Fab-IL-2-Fab konstrukcija koje su se mogle uporediti sa divlji tip IL-2 konstrukcijom u smislu potencije i apsolutne indukcije oslobađanja IFN-y sa greškom, koja je unutar greške postupka.
Zatim, indukcija proliferacije izolovanih humanih NK ćelija putem Fab-IL-2-Fab imunokonjugata je ispitana pomoću testa proliferacije (Cell Titer Glo, Promega) (Slika 10). Suprotno NK92 ćelijama, sveže izolovane NK ćelije ne ekspresuju CD25 (ili samo u veoma malim količinama). Rezultati pokazuju daje Fab-IL-2-Fab imunokonjugat, uključujući divlji tip IL-2, bio ca. 10-puta manje moćan u izazivanju NK ćelijske proliferacije od Proleukina, što bi se moglo očekivati sa ca. 10-puta manjim afinitetom Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugata prema IL-2R (3v heterodimeru. Uvođenje pojedinačnih mutacija koje interferiraju sa CD25 vezivanjem, kao i kombinacije tri mutacije koja interferira sa CD25 u IL-2 tripl mutant dovodi do Fab-IL-2-Fab konstrukcija koje su bile uporedive sa divljim tipom IL-2 konstrukcije u smislu mogućnosti i apsolutne indukcije proliferacije; postojalo je samo malo skretanje u potenciji, koje je zapaženo za Fab-IL-2-Fab tripl mutant. U drugom eksperimentu, indukcija proliferacije PHA-aktiviranih T ćelija je ispitana posle inkubacije sa različitim količinama Proleukina i Fab-IL-2-Fab imunokonjugata (Slika 11). Kao aktivirane, T ćelije ekspresuju CD25, jasna redukcija proliferacije T ćelija može se zapaziti u toku inkubacije sa imunokonjugatima, uključujući IL-2 pojedinačne mutante F42A, L72G ili Y45A; uz to da F42A pokazuje najsnažniju redukciju i, zatim L72G i Y45A, dok kada se koriste Fab-IL-2 wt-Fab ili Fab-IL-2 (T3A)-Fab, aktivacija je bila uglavnom zadržana u poređenju sa Proleukinom. Ovi podaci oslikavaju smanjenje afiniteta za CD25 što je određeno pomoću SPR (primer gore). Kombinacija tri mutacije koja interferira sa CD25 vezivanjem u IL-2 tripl mutantu kao rezultat ima imunokonjugat koji posreduje značajno sniženu indukciju T ćelijske proliferacije u rastvoru. Paralelno sa ovim nalazima, merili smo ćelijsku smrt T ćelija što je određeno aneksin V/PI bojenjem po prekomernoj stimulaciji indukovanoj prvom stimulacijom od 16 h sa 1[ig/ml PHA, drugom stimulacijom od 5 dana sa Proleukinom ili respektivnim Fab-IL-2-Fab imunokonjugatima, potom i trećom stimulacijom sa 1 ng/ml PHA. U ovom ispitivanju smo zapazili da je aktivacijom indukovana ćelijska smrt (AICD) u prekomerno stimulisanim T ćelijama bila snažnije snižena sa Fab-IL-2-Fab imunokonjugatima uključujući IL-2 pojedinačne mutante F42A, L72G i Y45A interferirajući sa CD25 vezivanjem, uz to da su F42A i L72G pokazali jaču redukciju, koja je bila slična redukciji postignutoj sa kombinacijom tri mutacije u imunokonjugatu uključujući IL-2 tripl mutant (Slika 12). U poslednjoj grupi eksperimenata, ispitivali smo efekte Fab-IL-2 qm-Fab kod uvođenja STAT5 fosforilacije u poređenju sa Fab-IL-2 wt-Fab i Proleukinom na humane NK ćelije, CD4<+>T ćelije, CD8<+>T ćelije i Treg ćelije iz humanih PBMCs (Slika 13). Za NK ćelije i CD8<+>T ćelije, koje nisu ili su pokazale veoma nisku CD25 ekspresiju (što znači da je IL-2R signaliziranje posredovano preko 8y heterodimera IL-2R) rezultati pokazuju da je Fab-IL-2-Fab format uključujući divlji tip IL-2 bio ca. 10-puta manje moćan u indukovanju STAT5 fosforilacije od Proleukina i, da je Fab-IL-2 qm-Fab bio uporediv sa Fab-IL-2 wt-Fab konstrukcijom. Na CD4<*>T ćelijama, koje pokazuju brzu ushodnu regulaciju CD25 u toku stimulisanja, Fab-IL-2 qm-Fab je bio manje moćan od Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugata, ali je još uvek pokazivao uporedivu indukciju IL-2R signaliziranja pri koncentracijama zasićenja. Ovo je suprotno Treg ćelijama gde je mogućnost Fab-IL-2 qm-Fab značajno smanjena u poređenju sa Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugatom zbog visoke CD25 ekspresije na Treg ćelijama i zatim, visokog afiniteta vezivanja Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugata za CD25 na Treg ćelijama. Kao posledica onemogućavanja CD25 vezivanja u Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatu, IL-2 signaliziranje u Tfeg ćelijama se aktivira samo putem Bv heterodimera IL-2R u koncentracijama pri kojima se IL-2R signaliziranje aktivira na CD25-negativnim efektornim ćelijama preko By heterodimera IL-2R. Ukupno, ovde opisani IL-2 kvadripl mutant može aktivirati IL-2R signaliziranje preko Bv heterodimera 1L-2R, ali ne dovodi ni do AICD ni do prvenstvene stimulacije Treg ćelija nad drugim efektornim ćelijama.
Primer 5
Na osnovu podataka iznetih u primerima 2 i 3 generisani su FAP-ciljani Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati zrelog afiniteta na bazi klonova 28H1 ili 29B11 i, prečišćeni kako je prethodno opisano u delu opštih postupaka. Detaljnije, FAP-ciljani 28H1 koji je ciljan Fab-IL-2 qm-Fab je prečišćen jednim afinitetnim korakom (protein G) i, zatim hromatografijom isključivanja na osnovu veličine (Superdex 200). Uravnotežavanje kolone je izvedeno u PBS i, supernatant od stabilnog CHO pool-a (CDCHO medijum) je stavljen na proteinsku G kolonu (GE Healthcare), kolona je isprana sa PBS i, uzorci su zatim eluirani sa 2.5 mM HCI i frakcije su neposredno neutralisane sa 10x PBS. Hromatografija isključivanja prema veličini je izvedena u puferu konačne formulacije: 25 mM natrijum fosfat, 125 mM natrijum hlorid, 100 mM glicin pH 6.7 na Superdex 200 koloni. Slika 14 prikazuje profile eluacije tokom prečišćavanja i rezultate iz analitičkog opisa proizvoda putem SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel 4-20%, Invitrogen, MOPS pufer izvođenja, redukovani i neredukovani). Dat je nizak kapacitet vezivanja 28H1 Fab fragmenta za protein G i protein A, dodatni koraci zarobljavanja mogu dovesti do viših prinosa.
FAP-ciljani 4G8, 3F2 i 29B11 Fab-IL-2 qm-Fab i MCSP-ciljani MHLG1 KV9 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su prečišćeni jednim afinitetnim korakom (protein A) kog je pratila hromatografija isključivanja prema veličini (Superdex 200). Uravnotežavanje kolone je izvedeno u 20 mM natrijum fosfatu, 20 mM natrijum citratu pH 7.5 i, supernatant je stavljen na protein A kolonu. Prvo ispiranje je izvedeno u 20 mM natrijum fosfatu, 20 mM natrijum citratu, pH 7.5 a, zatim je usledilo drugo ispiranje: 13.3 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, 500 mM natrijum hlorida, pH 5.45. Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su eluirani sa 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina pH 3. Hromatografija isključivanja prema veličini je izvedena sa puferom konačne formulacije: 25 mM kalijum fosfat, 125 mM natrijum hlorid, 100 mM glicin pH 6.7. Slika 15 prikazuje profile eluacije tokom prečišćavanja i nastaje iz analitičkog opisa proizvoda putem SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel 4-20%, Invitrogen, MOPS pufer za izvođenje, redukovani i neredukovani) za 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab i Slika 16 za MHLG1 KV9 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat.
FAP-ciljani lgG-IL-2 qm fuzioni proteini na bazi FAP-antitela 4G8, 4B9 i 28H1, kao i kontrolni DP47GS ne-ciljani lgG-IL-2 qm fuzioni protein su generisani kako je prethodno opisano u delu opštih postupaka. Slike 46 i 47 prikazuju respektivne hromatograme i profile eluacije tokom prečišćavanja (A, B) kao i analitičke SDS-PAGE i hromatografije isključivanja na osnovu veličine konačno prečišćenih konstrukcija (C, D) za 4G8- i 28H1 -zasnovane konstrukcije. Prolazni ekspresioni dobici su bili 42 mg/L za 4G8-bazirani i 20 mg/L za 28H1-bazirani lgGIL-2 qm imunokonjugat.
FAP vezujuća aktivnost lgG-IL-2 qm imunokonjugata na bazi 4G8 i 28H1 anti-FAP antitela je određena površinskom plazmon rezonancom (SPR) na Biacore mašini u poređenju sa odgovarajućim nemodifikovanim IgG antitelima. Ukratko, anti-His antitelo (Penta-His, Oiagen 34660) je imobilisano na CM5 čipovima da zarobi 10 nM His-ciljanog humanog FAP (20 s). Temperatura je bila 25°C i, korišćen je HBS-EP kao pufer. Koncentracija analita je bila 50 nM sve do 0.05 nM pri brzini protoka od 50 u.l/min (asocijacija: 300 s, disocijacija: 900 s, regeneracija:60 s sa 10 mM glicinom pH 2). Podešavanje je izvedeno na bazi modela 1:1 vezivanja, Rl=0, Rmax=lokal (zbog zarobljenog formata). Tabela 7 daje izmerene očigledne bivalentne afinitete (pM poželjnost) što je određeno SPR podešavanjem sa 1:1 vezivanjem Rl=0, Rmax=lokal.
Podaci pokazuju da je, u okviru greške postupka, afinitet za humani FAP zadržan za 28H1 -bazirani imunokonjugat ili samo neznatno oslabljen za 4G8-bazirani imunokonjugat u poređenju sa odgovarajućim nemodifikovanim antitelima.
Primer 6
Afiniteti FAP-ciljanih, afinitetno zrelih 28H1 i 29B11-baziranih Fab-IL-2-Fab imunokonjugata, pri čemu svaki uključuje divlji tip ili kvadripl mutant IL-2, a od 3F2-baziranih Fab-IL-2 wt-Fab su određeni površinskom plazmon rezonancom (SPR) za humani, misiji i cinomolgus IL-2R By heterodimer, korišćenjem rekombinantnog IL-2R By heterodimera u sledećim uslovima: ligand: humani, mišiji i cinomolgus IL-2R (3 čvornovati y celokupni heterodimer imobilisan na CM5 čipu, analit: 28H1 ili 29B11 Fab-IL-2-Fab (uključujući divlji tip ili kvadripl mutant IL-2), 3F2 Fab-IL-2-Fab (uključujući divlji tip IL-2), temperatura: 25°C ili 37°C, pufer: HBS-EP, koncentracija analita: 200 nM sve do 2.5 nM, protok: 30 ul/min, asocijacija: 300 s, disocijacija: 300 s, regeneracija: 60 s 3M MgCI2, podešavanje: 1:1 vezivanje, Rl#0, Rmax=ukupno. Afiniteti FAP-ciljanog afinitetno zrelog 28H1 i 29B11-baziranog Fab-IL-2-Fab imunokonjugata, svaki uključuje divlji tip ili kvadripl mutant IL-2, kao i 3F2-baziranog Fab-IL-2 wt-Fab su određeni površinskom plazmon rezonancom (SPR) za humanu, misiju i cinomolgus IL-2R a-subjedinicu korišćenjem rekombinantne monomerne IL-2R a-subjedinice u sledećim uslovima: ligand: humana, mišija i cinomolgus IL-2R a-subjedinica imobilisana na CMS čipu, analit: 28H1 ili 29B11 Fab-IL-2-Fab (uključujući divlji tip ili mutant IL-2), 3F2 Fab-IL-2-Fab (uključujući divlji tip IL-2), temperatura: 25°C ili 37°C, pufer: HBS-EP, koncentracija analita 25 nM sve do 0.3 nM, protok: 30 u,l/min, asocijacija: 120 s, disocijacija: 600 s, regeneracija: nema, podešavanje: 1:1 vezivanje, Rl=0, Rmax=ukupno.
Rezultati kinetičkih analiza sa IL-2R 8y heterodimerom su dati u Tabeli 8.
Dok je afinitet humanog IL-2 prema humanom IL 2R By heterodimeru naveden da je oko 1 nM, oba Fab-IL-2-Fab imunokonjugata (uključujući divlji tip ili kvadripl mutant IL-2) imaju smanjen afinitet, između 6 i 10 nM, i, kao što je prikazano za goli IL-2, veći od afiniteta prema mišijem IL-2R je oko 10 puta slabiji od onog prema humanom i cinomolgous IL-2R.
Rezultati kinetičkih analiza sa IL-2R a-subjedinicom su dati u Tabeli 9. Pod odabranim uslovima nema detektabilnog vezivanja imunokonjugata uključujući IL-2 kvadripl mutant za humanu, misiju ili cino IL-2R a-subjedinicu.
Afiniteti MCSP-ciljanih MHLG1-KV9 Fab-IL-2-Fab imunokonjugata, uključujući divlji tip ili kvadripl mutant IL-2, su određeni površinskom plazmon rezonancom (SPR) za humani IL-2R By heterodimer korišćenjem rekombinantnog IL-2R By heterodimera u sledećim uslovima: humani IL-2R p čvornovatiyceli heterodimer je imobilisan na CMS čipu (1600 RU). MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab i Fab-IL-2 qm-Fab su korišćeni kao analit na 25°C u HBSP puferu. Koncentracija analita je bila 300 nM sve do 0.4 nM (1:3 rabi.) za IL-2R By pri protoku od 30 u.l/min (vreme asocijacije 180 s, vreme disocijacije 300 s). Regeneracija je urađena za 2x30 s sa 3M MgCI2za IL-2R By. Podaci su podešeni korišćenjem 1:1 vezivanje, RI^O, Rmax=lokalno za IL-2R By.
Afiniteti MCSP-ciljanih MHLG1-KV9 Fab-IL-2-Fab imunokonjugata, uključujući divlji tip ili kvadripl mutant IL-2, su određeni površinskom plazmon rezonancom (SPR) za humanu IL-2R a-subjedinicu korišćenjem rekombinantne monomerne IL-2R a-subjedinice u sledećim uslovima: humana IL-2R a-subjedinica je imobilisana na CMS čipu (190 RU). MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab i Fab-IL-2 qm-Fab su korišćeni kao analit na 25°C u HBS-P puferu. Koncentracija analita je bila 33.3 nM sve do 0.4 nM (1:3 razbl.) za IL-2R a pri protoku od 30 \ i\/ mm (vreme asocijacije 180 s, vreme disocijacije 300 s). Regeneracija je urađena za 10 s sa 50 mM NaOH za IL-2R a. Podaci su podešeni korišćenjem 1:1 vezivanje, Rl=0, Rmax=ukupno za IL-2R a.
Rezultati kinetičkih analiza sa IL-2R By heterodimerom su dati u Tabeli 10.
Podaci potvrđuju da je MCSP-ciljani MHLG1-KV9 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat zadržao afinitet prema IL-2R By receptom, dok je afinitet vezivanja za CD25 izbrisan u poređenju sa imunokonjugatom koji uključuje divlji tip IL-2.
Zatim, određeni su afiniteti 4G8- i 28H1-baziranih lgG-IL-2 qm imunokonjugata za IL-2R By heterodimer i IL-2R a-subjedinicu, korišćenjem površinske plazmon rezonance (SPR) putem direktne komparacije sa Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat formatom. Ukratko, ligandi - bilo humana IL-2R a-subjedinica ili humani IL-2R By heterodimer - su imobilisani na CMS čipu. Zatim, 4G8- i 28H1-bazirani lgG-IL-2 qm imunokonjugati ili 4G8- i 28H1-bazirani Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su primenjeni na čip kao analiti na 25°C u HBS-EP puferu u koncentracijama u opsegu od 300 nM sve do 1.2 nM (1:3 raubl.). Brzina protoka je bila 30^l/min i sledeći uslovi su primenjeni za asocijaciju: 180s, disocijaciju: 300 s, i regeneraciju: 2 x
30 s sa 3 M MgCI2za IL-2R By heterodimer, 10 s sa 50 mM NaOH za IL-2R a-subjedinicu. 1:1 vezivanje je upotrebljeno za podešavanje (1:1 vezivanje RI^O, Rmax=lokalno za IL-2R B<y>, očigledna KD, 1:1 vezivanje Rl=0, Rmax=lokalno za IL-2R a). KDvrednosti za svaki su date u Tabeli 11.
Podaci su pokazali da se 4G8- i 28H1-bazirani lgG-IL-2 qm imunokonjugati vezuju sa barem dobrim afinitetom kao Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati za IL-2R By heterodimer, dok se ne vezuju za IL-2R a-subjedinicu zbog uvođenja mutacija koje interferiraju sa CD25 vezivanjem. U poređenju sa odgovarajućim Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatima, čini se da je afinitet lgG-IL-2 qm fuzionih proteina blago uvećan u okviru greške postupka.
Primer 7
U prvoj grupi eksperimenata potvrdili smo da su FAP-ciljani Fab-IL-2-Fab imunokonjugati uključujući bilo divlji tip ili mutant IL-2, sposobni da se vežu za humane FAP-ekspresujuće HEK 293-FAP ćelije putem FACS (Slika 17) i da IL-2 kvadripl mutacija nije imala uticaja na vezivanje za FAP-ekspresujuće ćelije (Slika 18).
Naročito, ovi eksperimenti vezivanja su pokazali da afinitetno zreli FAP vezivači 28H1, 29B11, 14B3 i 4B9 kao Fab-IL-2 qm-Fab pokazuju superiorno apsolutno vezivanje za HEK 293-FAP ciljne ćelije u poređenju sa Fab-IL-2-Fab imunokonjugatima na bazi matičnih FAP vezivača 3F2 (29B11, 14B3, 4B9) i 4G8 (28H1) (Slika 17), dok zadržavaju visoku specifičnost i ne vezuju se za HEK 293 ćelije transfektovane sa DPPIV, bliski homolog FAP, ili HEK 293 "mock"-transfektovane ćelije (lažno-transfektovane, prim. prev.). Za poređenje, korišćen je klon mišijeg anti-humanog CD26-PE DPPIV antitela M-A261 (BD Biosciences, #555437) kao pozitivna kontrola (Slika 19). Analiza svojstava internalizacije je pokazala da vezivanje Fab-IL-2-Fab imunokonjugata ne dovodi do indukcije FAP internalizacije (Slika 20).
U sledećem eksperimentu, vezivanje FAP-ciljanih 4G8-baziranih lgG-IL-2 qm i Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata za humani FAP ekspresovan na stabilno transfektovanim HEK293 ćelijama je meren sa FACS. Rezultati su prikazani na Slici 48. Podaci pokazuju da se lgG-IL-2 qm imunokonjugat vezuje za FAP-ekspresujuće ćelije sa vrednošću EC5ood 0.9 nM, u poređenju sa onom odgovarajuće 4G8-bazirane Fab-IL-2 qm-Fab konstrukcije (0.7 nM).
Afinitetno zreli anti-FAP Fab-IL-2-Fab imunokonjugati koji uključuju divlji-tip IL-2 ili kvadripl mutant su zatim testirani u ćelijskim testovima u poređenju sa Proleukinom, kako je opisano u gornjim primerima.
Oslobađanje IFN-y koje je indukovano sa IL-2 je mereno u supernatantu korišćenjem testa ELISA nakon inkubacije NK ćelijske linije NK92 sa ovim imunokonjugatima (Slika 21) u toku 24 h. NK92 ćelije ekspresuju CD25 na svojoj površini. Rezultati pokazuju da je Fab-IL-2-Fab imunokonjugat koji uključuje divlji-tip IL-2 bio manje potentan u indukovanju oslobađanja IFN-y od Proleukina što se moglo očekivati iz ca. 10-puta nižeg afiniteta Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugata prema IL-2R By heterodimeru. Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su bili sasvim uporedivi sa respektivnom konstrukcijom divljeg-tipa za odabrani klon u smislu potencije i apsolutne indukcije oslobađanja IFN-y uprkos činjenici da NK92 ćelije ekspresuju nešto CD25. Može se, međutim, zapaziti da 29B11 Fab-IL-2 qm-Fab indukuje manje oslobođenog citokina u poređenju sa 29B11 Fab-IL-2 wt-Fab kao i sa 28H1 i 4G8 konstrukcijama, za koje je zapaženo samo malo pomeranje u potenciji za Fab-IL-2 qm-Fab prema Fab-IL-2 wt-Fab.
Osim toga, MCSP-ciljani MHLG1-KV9-bazirani Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat je upoređen sa 28H1 i 29B11 baziranim Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatima u testu oslobađanja IFN-y na NK92 ćelijama. Slika 22 prikazuje da je MCSP-ciljani MHLG1-KV9-bazirani Fab-IL-2 qm-Fab sasvim uporediv u indukovanju oslobađanja IFN-y sa FAPciljanim Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatima.
Zatim je testirana indukcija proliferacije NK92 ćelija pomoću IL-2 tokom perioda od 3 dana u testu proliferacije gde se meri ATP korišćenjem CellTiter Glo (Promega) (Slika 23). Kako NK92 ćelije ekspresuju manje količine CD25, razlika između Fab-IL-2-Fab imunokonjugata koji uključuju divlji-tip IL-2 i imunokonjugata koji uključuju kvadripl mutant IL-2 bi mogla da se detektuje testom proliferacije, međutim, u uslovima zasićenja oba su postigla približno iste apsolutne indukcije proliferacije.
Sledećim ekperimentom smo ispitivali efekte 28H1 afinitetno zrelog FAP-usmerenog Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata na indukciju STAT5 fosforilacije u poređenju prema 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab i Proleukin u na humane NK ćelije, CD4<+>T ćelije, CD8<*>T ćelije i Treg ćelije od humanih PBMCs (Slika 24). Za NK ćelije i CD8<+>T ćelije, koje nisu ili su ispoljile veoma nisku CD25 ekspresiju (što znači da se IL-2R signaliziranje posreduje preko IL-2R Bv heterodimera), rezultati su pokazali da je Fab-IL-2-Fab imunokonjugat koji uključuje divlji-tip IL-2 bio ca. >10-puta manje potentan u indukovanju oslobađanja IFN-v od Proleukina i, da je Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat bio samo veoma neznatno manje moćan od Fab-IL-2 wt-Fab konstrukcije. Na CD4<+>T ćelijama koje su pokazale brzu ushodnu regulaciju CD25 tokom stimulacije, Fab-IL-2 qm-Fab je bio značajno manje potentan od Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugata, ali je još uvek ispoljavao uporedivu indukciju IL-2R signaliziranja pri koncentracijama zasićenja. Ovo je u suprotnosti sa Treg ćelijama, gde je potencija Fab-IL-2 qm-Fab bila značajno snižena u poređenju sa Fab-IL-2 wt-Fab konstrukcijom zbog visoke CD25 ekspresije na Treg ćelijama i posledičnog visokog afiniteta vezivanja Fab-IL-2 wt-Fab konstrukcije za CD25 na Treg ćelijama. Kao posledica onemogućavanja CD25 vezivanja u Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatu, IL-2 signaliziranje u Tre9ćelijama se aktivira jedino preko IL-2R Bv heterodimera pri koncentracijama gde je IL-2R signaliziranje aktivirano na CD25 negativnoj efektornoj ćeliji preko IL-2R Bv heterodimera. U Tabeli 13., prikazane su respektivne pM EC50vrednosti.
U sledećem setu eksperimenata, ispitana je biološka aktivnost FAP-ciljanih 4G8-baziranih lgG-IL-2 qm i Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata kroz nekoliko ćelijskih testova.
FAP-ciljani 4G8-bazirani lgG-IL-2 qm i 28H1-bazirani Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su ispitani na indukciju oslobađanja IFN-v od strane NK92 ćelija koja je indukovana aktivacijom IL-2R py signaliziranja. Slika 49 prikazuje da je FAP-ciljani 4G8-bazirani lgG-IL-2 qm imunokonjugat bio jednako efikasan u indukovanju oslobađanja IFN-v kao afinitetno zreli 28H1-bazirani Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat.
Takođe smo ispitali efekte FAP-ciljanog 4G8-baziranog lgG-IL-2 qm imunokonjugata na indukciju STAT5 fosforilacije u poređenju sa 28H1 baziranim Fab-IL-2 wt-Fab i Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatima kao i Proleukinom na humanim NK ćelijama, CD4<+>T ćelijama, CD8<+>T ćelijama i Treg ćelijama iz humanih PBMCs. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na Slici 50. Za NK ćelije i CD8<*>T ćelije 4G8-bazirani lgG-IL-2 qm imunokonjugat je bio <10-puta slabiji u indukovanju STAT5 fosforilacije od Proleukina, ali blago moćniji od 28H1-baziranih Fab-IL-2 wt-Fab i Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata. Na CD4<+>T ćelijama, 4G8-bazirani lgG-IL-2 qm imunokonjugat bio je slabiji od 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugata, ali blago moćniji od 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata i, još uvek je pokazivao indukciju IL-2R signaliziranja pri koncentracijama zasićenja u poređenju sa Proleukinom i 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab. Ovo je u suprotnosti sa Treg ćelijama gde je potencija 4G8-baziranih lgG-IL-2 qm i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata bila značajno snižena u poređenju sa Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugatom.
Sve u svemu, ovde opisani IL-2 kvadripl mutant može da aktivira IL-2R signaliziranje preko IL-2R By heterodimera slično divljem-tipu IL-2, ali ne dovodi do a stimulacije pre svega Treg ćelija u odnosu na druge efektorne ćelije.
Primer 8
Antitumorski efekti FAP-ciljanih Fab-IL-2 qm-Fab imonokonjugata ispitani su in vivo u poređenju sa FAP-ciljanim Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugatima na ACHN ksenograftu i LLC1 singenimskim modelima. Svi FAPciljani Fab-IL-2-Fab imunokonjugati (koji uključuju divlji-tip ili kvadripl mutant IL-2) prepoznaju mišiji FAP kao i mišiji IL-2R. Dok je ACHN ksenograft model kod SCID-humanih FcyRIII transgenskih miševa snažno pozitivan na FAP kod IHC, on je imunokompromitovan model i može samo refiektovati imune efektorne mehanizme koje posreduju NK ćelije i/ili makrofagi/monociti, ali bez T ćelijski posredovanog imuniteta pa tako ne može refiektovati AICD ili efekte koji su posredovani Treg ćelijama. Suprotno, singenenimski LLC1 model kod u potpunosti imunokompetentnih miševa može refiektovati i imune efektorne mehanizme posredovane adaptivnim T ćelijama, ali ispoljava dosta nisku ekspresiju FAP na stromi miševa. Svaki od ovih modela, prema tome, samo delimično reflektuje situaciju koja se sreće kod tumora kod ljudi.
Modelksenografta karcinomaACHNbubrežnih ćelija
FAP-ciljani 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab and 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su testirani korišćenjem ćelijske linije humanog adenokarinoma bubrežnih ćelija ACHN, koja je intra-renalno injektovana SCID-humanim FcyRIII transgenskim miševima. ACHN ćelije su početno nabavljene od ATCC (American Type Culture Collection) i posle ekspanzije odložene u Glycart internal banku ćelija. ACHN su uzgojene u DMEM koji sadrži 10% FCS, na 37°C u atmosferi zasićenoj vodom pri 5% C02.In vitroprolaz 18 je korišćen za intrarenalnu injekciju, sa vijabilnošću od 98.4%. Napravi se mala incizija (2 cm) na desnom boku i peritonealnom zidu anesteziranih SCID miševa. Pedeset^l ćelijske suspenzije (1x10<6>ACHN ćelija u AimV medijumu) se injektuje 2 mm subkapsularno u bubreg. Kožni otvori i peritonealni zid se zatvore korišćenjem spona. Ženke SCID-FcyRIII miševa (GLYCART-RCC), starosti 8-9 nedelja na početku eksperimenta (odgajene na RCC, Switzerland) držane su pod uslovima bez specifičnog-patogena u dnevnim ciklusima 12 h svetlost / 12 h mrak u skladu sa ustanovljenim vodičima (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalnog ispitivanja je bio objavljen i odobrila ga je lokalna nadležna služba (P 2008016). Pošto su pristigle, životinje su ostavljene jednu nedelju da se adaptiraju na novu okolinu i radi posmatranja. Kontinuirano se pratilo zdravstveno stanje na regularnim osnovama. Miševima je intrarenalno, na dan 0 studije, injektovano 1x10<6>ACHN ćelija, koje su randomizovane i odmerene. Nedelju dana posle injekcije ćelija tumora, miševima je i.v. injektovano 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab tri puta nedeljno u toku tri nedelje. Svim miševima je i.v. injektovano 200^l odgovarajućeg rastvora. Miševima u grupi vehikuluma je injektovan PBS dok je grupama na tretmanu injektovan 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab ili 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat. Da bi se postigla odgovarajuća količina imunokonjugata u 200nl, matični rastvori su razblaženi sa PBS kada je bilo neophodno. Slika 25 pokazuje da i 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat posreduju visoku efikasnost u smislu povećanog srednjeg preživljavanja u poređenju vehikulum grupe uz prednost koju je imao 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab nad 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatom u smislu efikasnosti.
LLC1 singenimski model Lewisovog plućnog karcinoma
FAP-ciljani 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su testirani korišćenjem ćelijske linije mišijeg Lewisovog karcinoma pluća LLC1, i.v. injektovane crnim miševima 6. LLC1 ćelije Levvisovog karcinoma pluća su originalno dobijene od ATCC i nakon ekspanzije deponovane u Glvcart internal ćelijsku banku. Tumorska ćelijska linija se rutinski uzgaja u DMEM koji sadrži 10 % FCS (Gibco) na 37°C u atmosferi zasićenoj vodom pri 5% C02. Prolaz 10 je korišćen za transplantaciju, uz vijabilnost od 97.9%. Injektovano je i.v. 2x10<5>ćelija po životinji u venu na repu u 200 uJ Aim V medij uma ćelijske kulture (Gibco). Crnih 6 miševa (Charles River, Germanv), starosti 8-9 nedelja na početku eksperimenta, držane su pod uslovima bez specifičnog-patogena u dnevnim ciklusima 12 h svetlost /12 h mrak u skladu sa ustanovljenim vodičima (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalnog ispitivanja je bio objavljen i odobrila ga je lokalna nadležna služba (P 2008016). Pošto su pristigle, životinje su ostavljene jednu nedelju da se adaptiraju na novu okolinu i radi posmatranja. Kontinuirano se pratilo zdravstveno stanje na regularnim osnovama. Miševima je na dan 0 studije i.v. injektovano 2x10<5>LLC1 ćelija, randomizovanih i odmerenih. Nedelju dana posle injektovanja tumorskih ćelija, miševima je i.v. injektovano 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab ili 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab, tri puta nedeljno u toku tri nedelje. Svim miševima je i.v. injektovano 200 \ x\ odgovarajućeg rastvora. Miševima u grupi vehikuluma je injektovan PBS dok je grupama na tretmanu injektovana 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab ili 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab konstrukcija. Da bi se postigla odgovarajuća količina imunokonjugata u 200 u.l, matični rastvori su razblaženi sa PBS kada je bilo neophodno. Slika 26 prikazuje da 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab ili afinitetno zrele 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab konstrukcije posreduju superiornu efikasnost u smislu povećavanja srednjeg preživljavanja u poređenju sa grupom vehikuluma.
U drugom eksperimentu, FAP-ciljani 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su testirani na istoj ćelijskoj liniji mišijeg Lewisovog plućnog karcinoma LLC1, i.v. injektovanoj crnim miševima 6. Prolaz 9 je korišćen za transplantaciju, uz vijabilnost od 94.5%. Injektovano je i.v. 2x10<6>ćelija po životinji u venu na repu u 200 u.l Aim V medijuma ćelijske kulture (Gibco). Miševima je na dan 0 studije i.v. injektovano 2x10<5>LLC1 ćelija, randomizovanih i odmerenih. Nedelju dana posle injektovanja tumorskih ćelija, miševima je i.v. injektovano 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab ili 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab, tri puta nedeljno u toku tri nedelje. Svim miševima je i.v. injektovano 200 ul odgovarajućeg rastvora. Miševima u grupi vehikuluma je injektovan PBS dok je grupi na tretmanu injektovana 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab ili 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab konstrukcija. Da bi se postigla odgovarajuća količina imunokonjugata u 200 u.l, matični rastvori su razblaženi sa PBS kada je bilo neophodno. Slika 27 prikazuje da 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati posreduju superiornu efikasnost u smislu povećavanja srednjeg preživljavanja u poređenju sa grupom vehikuluma uz neznatnu prednost 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab nad 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatom u smislu efikasnosti.
Primer 9
4G8 bazirani FAP-ciljani Fab-IL-2 qm-Fab je zatim upoređen sa 4G8 baziranim FAP-ciljanim Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugatom u sedmodnevnoj studiji intravenske toksičnosti i toksikokinetike na crnih 6 miševa. Tabela 15 prikazuje dizajn studije toksičnosti i toksikokinetike.
Svrha studije je bila se da opiše i uporedi toksičnost i profili toksikokinetike FAP-ciljanog 4G8 Fab-IL2-Fab divljeg tipa (wt) interleukina-2 (IL-2) i FAP-ciljanog G48 Fab-IL-2-Fab kvadripl mutanta IL-2 (qm) nakon jednodnevne intravenske primene mužjacima miševa bez tumora u toku 7 dana. Za ovu studiju, 5 grupa od 5 mužjaka miševa po grupi je intravenski primilo 0 (vehikulum kontrola), 4.5 ili 9 (ag/g/dan wt IL-2, ili 4.5 ili 9 jag/g/dan qm IL-2. Još 4 grupe od 6 mužjaka miševa po grupi je primilo 4.5 ili 9^g/g/dan wt IL-2, ili 4.5 ili 9 n-g/g/dan qm IL-2 u cilju ispitivanja toksikokinetika. Trajanje studije je smanjeno sa 7 dana na 5 dana zbog kliničkih znakova zapaženih kod životinja kojima je dato 4.5 i 9 i^g/g/dan wt IL-2. Određivanje toksičnosti je bazirano na mortalitetu, observacijama uživo, telesnoj težini, kao i kliničkoj i anatomskoj patologiji. Krv je od životinja sakupljana u različitim vremenskim tačkama po toksikokinetičkim grupama za toksikokinetičku analizu. Podaci toksikokinetike pokazuju da su miševi tretirani sa wt IL-2 ili qm IL-2 imaii merljive plazmatske nivoe sve do poslednjeg vremena uzorkovanja krvi, indikujući da su miševi bili izloženi respektivnim jedinjenjima sve vreme trajanja tretmana. Dana 1., AUCO-inf vrednosti pokazuju komparabilno izlaganje wt IL-2 i qm IL-2 za oba dozna nivoa. Uzeti su retki uzorci na Dan 5 i pokazali su jednake plazmatske koncentracije kao Dana 1, što sugeriše da nije došlo do nakupljanja posle 5 dana od doziranja ni jednog jedinjenja. Detaljnije, zapaženi su sledeći nalazi.
Toksikokinetike
Tabela 16 zbirno prikazuje srednju vrednost parametara plazmatske toksikokinetike za FAP-ciljani 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab i FAP-ciljani 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab što je određeno pomoću VVinNonLin Version 5.2.1 i komercijalnom kappa-specifičnom ELISA (Human Kappa ELISA Ouantitation Set, Bethyl Laboratories).
Pojedinačne serumske koncentracije su date u sledećem:
Ovi podaci pokazuju da oba, 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab i 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab imaju komparabilna farmakokinetska svojstva sa neznatno većim izlaganjem za 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab.
Mortalitet
U grupi 9^g/g FAP-ciljanog 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, mortalitet koji se vezuje za tretman javio se kod jedne životinje pre nekropsije na Dan 5. Hipoaktivnost, hladna koža, kao i povijeni stav nisu zapaženi pre smrti. Ova životinja je najverovatnije umrla zbog kombinacije ćelijske infiltracije u plućima koja je bila udružena sa edemom i hemoragijom i značajne nekroze kostne srži. Mortalitet je zbirno prikazan u Tabeli 17.
imunokonjugatom su značajno pogođeni 5. dana i uspavani su jer se nije očekivalo da će preživeti.
Klinička zapažanja
Kod životinja, kojima je primenjeno 4.5 i 9 mg/g/dan wt IL-2, zabeležena su sledeća zapažanja hipoaktivnost, hladna koža i povijeni stav. Klinička zapažanja su zbirno prikazana u Tabeli 18.
Telesna težina
Umereno smanjenje telesne težine zapaženo je nakon 5 dana lečenja kod životinja kojima je primenjeno 4.5 i 9 (9% odnosno, 11%)^g/g/dan wt IL-2. Neznatno smanjenje telesne težine je zapaženo posle 5 dana tretmana kod životinja kojima je primenjeno 4.5 ili 9 (2% odnosno, 1%)^g/g/dan qm IL-2. Umereno (9%) smanjenje telesne težine je, isto tako, posle 5 dana tretmana zapaženo kod kontrolnih životinja tretiranih vehikulumom. Međutim, procenat smanjenja bi bio 5% ukoliko bi se potencijalna životinja koja odskače (Životinja #3) isključila. Gubitak telesne težine kod životinja u grupi tretiranoj vehikulumom može se pripisati stresu.
Hematologija
Sniženi broj trombocita je zapažen kod životinja kojima je primenjeno 4.5 (-4.5 puta) i 9 ug/g/dan (-11 puta) 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, što je bilo u korelaciji sa sniženim megakariocitima u kostnoj srži, kao i sa sistemskim efektima potrošnje (fibrin) u slezini i plućima ovih životinja (vidi Histopatološki deo u nastavku) Ovi nalazi su ukazali na to da je sniženje trombocita verovatno posledica kombinovanih efekata potrošnje i pada produkcije/pretrpanosti kostne srži zbog porasta produkcije limfocita / mijeloidnih ćelija bilo kao direktnog ili indirektnog dejstva IL-2.
Hematološke nalaze koji nisu izvesno bili povezani sa primenom jedinjenja, činio je pad apsolutnog broja limfocita sa 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab u dozi od 4.5 (~5-puta) i u dozi 9\ ig/ g(~3-puta) u poređenju sa srednjom vrednosti kontrolne grupe na vehikulumu. Ovi nalazi nemaju jasnu doznu-zavisnost, ali se mogu smatrati sekundarnim, kao posledica efekata koji su povezani sa stresom koji su notirani u observacijama življenja životinja ili preteranom farmakologijom jedinjenja (limfociti migriraju u tkiva). Nije bilo hematoloških promena povezanih sa lečenjem koje su se mogle pripisati primeni 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab. Nekoliko izolovanih hematoloških nalaza je bilo statistički različito u odnosu na njihove kontrole. Ipak, ovi nalazi su imali nedovoljan opseg da bi ukazali na patološki značaj.
Ukupno patologija i histopatologija
Ukupni nalazi, koji se povezuju sa tretmanom, obuhvataju uvećanu slezinu nađenu kod 5/5 i 4/5 miševa u grupi tretiranoj sa 4.5 odnosno, 9 u.g/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, kao i kod 1/5 u obe grupe lečene sa 4.5 i 9 j^g/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab.
Histopatološki nalazi, koji se povezuju sa tretmanom, bili su prisutni u grupama kojima je davano 4.5 i 9 ng/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4.5 i 9^g/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab u plućima, kostnoj srži, jetri, slezini i timusu, sa razlikama u incidenci, gradusu težine ili prirode promena, kako je prikazano u nastavku.
Histopatološki nalazi u plućima koji su u vezi sa tretmanom sastojali su se od mononuklearne infiltracije koja je bila blaga do naznačena kod 5/5 miševa u 4.5 i 9\ xg/ g4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupama i marginalna kod 5/5 miševa u 4.5 i 9[ig/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupama. Mononuklearna infiltracija se sastojala od limfocita (od kojih su neki imali citoplazmatske granule) kao i reaktivnih makrofaga. Ove ćelije su uglavnom zabeležene da imaju vazocentrične profile, često sa zapaženom marginacijom unutar krvnih sudova u plućima. Zapaženo je da ove ćelije, isto tako, okružuju sudove, ali u mnogo težim slučajevima, profil je bio više difuzan. Hemoragija je viđena marginalna do blaga kod 5/5 miševa u 4.5 i 9 u.g/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupama i marginalna kod 2/5 miševa u 9y. g/ g4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupi, lako je hemoragija najčešće zapažena perivaskularno, u mnogo ozbiljnijim slučajevima, zapažena je u alveolarnim prostorima. Edem je zapažen blag do umeren kod 5/5 miševa u 4.5 i 9 \ xg/ g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupama i marginalni kod 5/5 miševa u 9 ug/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupama, lako je edem najčešće zapažen perivaskularno, u mnogo ozbiljnijim slučajevima, zapažen je i u alveolarnim prostorima. Marginalna ćelijska degeneracija i karioreksis su zapaženi kod 2/5 odnosno 5/5 miševa u 4.5 i 9^g/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupama i, sastojala se od degeneracije infiltrativnim ili reaktivnim leukocitima. Odabrane životinje sa MSB bojenjem su bile pozitivne na fibrin nađen unutar pluća životinja i u 4.5 i 9^g/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupama što je bilo delom u korelaciji sa sniženim trombocitima zapaženim kod ovih životinja.
Promene u kostnoj srži koje su u vezi sa tretmanom obuhvatale su marginalno do blagi porast ukupne sržne celularnosti kod 5/5 miševa odnosno 2/5 miševa u obe 4.5 i 5/5 miševa odnosno 2/5 miševa u obe 9 ng/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe. Ovo je opisano porastom marginalne do umerene limfocitne-mijelocitne hiperplazije u ovim grupama što je delom potpomognuto porastom broja CD3 pozitivnih T ćelija unutar srži i sinusa (specifično T-limfocita, što je potvrđeno imunohistohemijom sa pan-T-ćelijskim markerom CD3 i izvedeno na odabranim životinjama). Porast CD3 pozitivnih T ćelija je bio umeren u obe 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe i marginalan do blag u obe 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe. Marginalan do blag pad megakariocita je zapažen kod 2/5 miševa u 4.5 i kod 5/5 miševa u 9\ xglg4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi i, marginalan do umeren pad prekursora eritrocitne loze je zapažen kod 3/5 miševa u 4.5 i kod 5/5 miševa u 9^ig/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi. Nekroza kostne srži je zapažena kod 1/5 miševa u 4.5 (minimalna) i kod 5/5 miševa u 9 (blaga do izražena) ng/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi. Smanjeni broj megakariocita u kostnoj srži je u korelaciji sa smanjenim brojem trombocita što bi trebalo da je posledica direktnog zagušenja kostne srži povećanjem limfocitnih/mijeloidnih prekursora i/ili nekroze kostne srži i/ili potrošnje trombocita kao posledice inflamacije u različitim tkivima (vidi slezinu i pluća). Smanjenje prekursora eritrocitne loze, zapaženo u kostnoj srži, nije bilo u korelaciji sa hematološkim nalazima u perifernoj krvi najverovatnije zbog privremenih efekata (viđenih u kostnoj srži pre periferne krvi) i dužeg polu-života eritrocita na periferiji (u poređenju sa trombocitima). Mehanizam nekroze kostne srži u koštanoj srži može biti sekundaran zbog očiglednog zagušenja u kostnoj šupljini (zahvaljujući proizvodnji i rastu limfocita / mijeloidnih ćelija), sistemskom ili lokalnom oslobađanju citokina iz proliferišućih vrsta ćelija, moguće zbog lokalnog uticaja hipoksije ili drugih farmakoloških efekata jedinjenja.
Nalazi u jetri koji se povezuju sa tretmanom sastojali su se od blagog do umerenog primarno vazokoncentričnog mononuklearnog ćelijskog infiltrata i marginalne do blage pojedinačne nekroze ćelija kod 5/5 miševa u 4.5 i 9\ xg/ g4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupama. Marginalna pojedinačna nekroza ćelija je viđena kod 2/5 i kod 4/5 miševa u 4.5 odnosno 9^g/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupama. Mononuklearni infiltrat se sastojao primarno od limfocita {specifično T-limfocita, što je potvrđeno imunohistohemijom sa pan-T-ćelijskim markerom CD3 i izvedeno na odabranim životinjama) koji su najčešće viđeni vazocentrično kao i granično unutar centralnog i portalnog krvnog suda. Odabrane životinje za imunohistohemijsko bojenje na F4/80 pokazuju porast broja i veličine (aktiviranih) makrofaga/Kupfferovih ćelija duž sinusoida u jetri u 9 ng/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupama.
Nalazi u slezini koji se povezuju sa tretmanom sastojali su se od umerene do naznačene limfoidne hiperplazije/infiltracije i blage do umerene makrofagne hiperplazije/ infiltracije kod 5/5 miševa u 4.5 i 9 ng/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupama i blage do umerene limfoidne hiperplazije/infiltracije sa marginalnom do blagom makrofagnom hiperplazijom/ infiltracijom kod 5/5 miševa u 4.5 i 9^g/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupama. Imunohistohemija za 9ng/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab pokazuje različite profile korišćenjem pan-T ćelijskog markera CD3, kao i makrofagnog markera F4/80. Za 9 ug/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, profil T-ćelijske i makrofagne imunoreaktivnosti ostaje pre svega unutar oblasti crvene pulpe, kako je arhitektura primarnih folikula izmenjena limfocitolizom i nekrozom (opisano u nastavku). Za 9 \ j. g/ g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, specijalna bojenja su pokazala profil sličan onom kod kontrole sa vehikulumom, ali uz ekspanziju periarteriolarnog limfoidnog omotača (PALS) bele pulpe, T-ćelijskom populacijom i većom, proširenom oblasti crvene pulpe. Isto tako, evidentna je bila i pozitivnost na T-ćelije i makrofage unutar crvene pulpe, sa sličnim profilom kao i kontrolna grupa na vehikulumu, ali proširen. Ovi nalazi su u korelaciji sa ukupnim nalazima uvećane slezine. Nekroza je zapažena marginalno kod 3/5 miševa i marginalno do blago kod 5/5 miševa u 4.5 odnosno 9\ ig/ g4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi. Nekroza je obično bila lokalizovana oko oblasti primarnih folikula i odabrane životinje su sa MSB bojenjem bile pozitivne na fibrin u obe 4.5 i 9\ ig/ g4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe što je bilo u korelaciji delom i sa sniženim trombocitima što je kod ovih životinja notirano. Limfocitoza je viđana u 4.5 ng/g (minimalna do blaga) i 9 ug/g (blaga do markirana) 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupama.
Nalazi u timusu koji se povezuju sa tretmanom uključuju minimalan do blagi porast limfocita i u 4.5 i u 9 u,g/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i u 4.5 ug/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupi. Korteks i medula nisu bili pojedinačno evidentni, u 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi, ali imunohistohemija za pan T ćelijski marker (CD3) na odabranim životinjama u 9 ug/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 9[ ig/ g4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupi je pokazala snažnu pozitivnost za glavninu ćelija unutar timusa. Povećanje limfocita u timusu se smatra direktnim farmakoločkim efektom oba jedinjenja, pri čemu je IL-2 indukovana proliferacija limfocita koji migriraju u timus (T ćelije) iz kostne srži za dalju diferencijaciju i klonsku ekspanziju. Ovo se javlja u svim grupama osim u 9 ng/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, u kojoj je pre svega privremeni efekat. Limfocitoliza je bila blaga u 4.5\ xg/ g4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi, a umerena do značajna u 9y. g/ g4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi. Umereno limfoidno trošenje je zapaženo u obe 4.5 i 9 ng/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe. Dok se čini da su ovi nalazi više izraženi u 4.5 i 9\ iglg4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupama, ove životinje su na dan 5. opisane kao umiruće, pa se blaga do značajna limfocitoliza kao i umereno limfoidno trošenje može povezati sa ovim observacijama uživo (efekti povezani sa stresom zbog slabog fizičkog stanja).
Histopatološki nalazi neizvesne povezanosti sa primenjenim jedinjenjem u jetri su se sastojali od marginalnog infiltrata mešanih ćelija (limfociti i makrofagi) / aktivacije zapažene u vidu malih fokusa /mikrogranuloma nasumično rasutih kroz jetru, kod 5/5 miševa u obe 4.5 i 9\ xg/ g4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe. Ove marginalne promene su takođe viđene i u kontrolnoj vehikulum grupi, ali sa manjom incidencom i težinom. Glandularna dilatacija želudca i atrofija je viđena marginalno do blago kod 5/5 miševa, a atrofija vilusa ileusa je viđena marginalno kod 3/5 miševa u 9\ xg/ g4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi. Ovi nalazi se pripisuju slabom fizičkom stanju, viđenom kod ovih miševa u observacijama uživo, kao što je snižena telesna težina, posebno u 9 u.g/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi.
Nalazi na mestu injekcije uključujući mešani ćelijski infiltrat, perivaskularni edem i miodegeneraciju, koja se zapaža isto u grupi kontrole vehikuluma, 9\ xg/ g4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 9\ igfg4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupama. Jedna životinja je imala epidermalnu nekrozu. Ovi nalazi nisu pripisani samom(im) tretmanu(ima), već dnevnim i.v. injekcijama i postupku s repovima. Druga životinja je imala infiltraciju makrofaga u skeletnom mišiću (primećeno na histološkim isečcima plućnog tkiva) udruženu sa miodegeneracijom i mioregeneracijom, najverovatnije zbog hronične lezije i nije pripisana tretmanu. Marginalna limfoidna potrošnja je primećena kod 3/5 i 4/5 miševa u 4.5 odnosno 9 u,g/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupama, i najverovatnije je uzrokovana normalnim fiziološkim promenama koje se viđaju u timusu kako miševi stare (takođe viđeno sa istom incidencom, 4/5 miševa i težinom kod kontrolnih životinja u vehikulum grupi).
U zaključku, dnevno intravensko primenjivanje 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab ili 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab u dozama od 4.5 ili 9 (^g/g/dan do 5 dana kod mužjaka miševa dovodi do sličnih histoloških nalaza koji se povezuju sa tretmanom sa oba jedinjenja. Ipak, nalazi su imali generalno veću prevalencu i daleko teži kod FAP-ciljanog 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab u: plućima (Slika 28 i 29) (mononuklearna infiltracija koja se sastojala od limfocita i reaktivnih makrofaga, hemoragija i edem), koštanoj srži (limfo-mijelo hiperplazija i povećana celularnost), jetri (Slika 30) (pojedinačna ćelijska nekroza, porast broja i aktivacije Kupfferovih ćelija/makrofaga), slezini (ukupno uvećanje, infiltracija makrofagima i limfocitima/hiperplazija) i timusu (povećanje limfocita).. Sem toga, smrtnost, limfocitoliza, nekroza ili ćelijska degradacija u plućima, slezini, koštanoj srži i timusu, kao i smanjenje megakariocita i eritrocita u kostnoj srži i smanjenje trombocita u perifernoj krvi, viđeni su samo kod životinja kojima je davan wt IL-2. Na osnovu kliničkih i anatomskih patoloških nalaza, kao i kliničkih observacija i uporedivih sistemskih izlaganja oboma jedinjenjima, qm IL-2 u uslovima ove studije je ispoljio značajno manju sistemsku toksičnost posle 5 doza u odnosu na wt IL-2.
Primer 10
Indukcija NK ćelijske sekrecije IFN-v pomoću divljeg-tipa i kvadripl mutanta IL-2
NK-92 ćelije su sakupljene 2 h pre zasejavanja 100000 ćelija/reakcionom mestu u ploči sa F-dnom i 96 reakcionih mesta. IL-2 konstrukcije su titrirane na zasejane NK-92 ćelije. Posle 24 h ili 48 h, ploče su centrifugirane pre sakupljanja supernatanata radi određivanja količine humanog IFN-y korišćenjem komercijalne IFN- y ELISA (BD #550612).
Testirana su dva različita preparata divljeg-tipa IL-2 domaće izrade (koji se verovatno razlikuju neznatno u svojim O-glikozilacionim profilima, vidi Primer 2), komercijalno nabavljen divlji-tip IL-2 (Proleukin) i kvadripl mutant IL-2 proizveden in-house (prva serija).
Slika 31 prikazuje da je kvadripl mutant IL-2 jednako potentan kao i komercijalno nabavljeni (Proleukin) ili divlji-tip IL-2 domaće izrade u indukovanju sekrecije IFN-y od strane NK ćelija u toku 24 (A) ili 48 sati (B).
Primer 11
Indukcija proliferacije NK ćelija pomoću divljeg-tipaikvadripl mutanta IL-2
NK-92 ćelije nisu hranjene 2 h pre zasejavanja 10000 ćelija/reakcionom mestu u pločama sa F-providnim dnom i 96 reakcionih mesta. IL-2 konstrukcije su titrirane na zasejane NK-92 ćelije. Posle 48 h, izmeren je sadržaj ATP kako bi se odredio broj vijabilnih ćelija korišćenjem Promega kita "CellTiter-Glo Luminescent Cell Viabilitv Assay", prema uputstvima proizvođača.
Testirani su isti IL-2 preparati kao u Primeru 10.
Slika 32 prikazuje da su svi testirani molekuli bili u mogućnosti da indukuju proliferaciju NK ćelija. Pri niskim koncentracijama (< 0.01 nM) kvadripl mutant IL-2 je bio neznatno manje aktivan u odnosu na divlji tip IL-2 domaće izrađen, i svi "in-house" preparati su bili manje aktivni od komercijalno nabavljenog divljeg-tipa IL-2 (Proleukin).
U drugom eksperimentu, testirana su sledeća dva preparata IL-2: divlji-tip IL-2 (pool 2), kvadripl mutant IL-2 (prva i druga serija).
Slika 33 prikazuje da su svi testirani molekuli otprilike jednako aktivni u indukciji proliferacije NK ćelija putem dva preparata mutanta IL-2, pri čemu su samo minimalno manje aktivni u odnosu na divlji-tip IL-2 preparata pri najnižim koncentracijama.
Primer 12
Indukcija proliferacije humanih PBMC pomoću imunokonjugata koji uključuju divlji-tip ili
kvadripl mutant IL-2
Mononuklearne ćelije perifernekrvi (PBMC) su pripremljene korišćenjem Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, USA). Ukratko, venska krv zdravih volontera je izvađena u heparinizirane špriceve. Krv je razblažena 2:1 sa PBS bez kalcijuma- i magnezijuma i, i postavljena po Histopaque-1077. Gradijent je centrifugiran na 450 x g u toku 30 min na sobnoj temperaturi (RT) bez lomova. Međufaza koja je sadržavala PBMCs je sakupljena i isprana tri puta sa PBS (350 x g zatim, 300 x g tokom 10 min na RT).
Zatim, PBMCs su obeležene sa 40 nM CFSE (karboksifluorescein sukcinimidil estrom) u toku 15 min na 37°C. Ćelije su isprane sa 20 ml medijuma pre povraćaja PBMCs tokom 30 min na 37°C. Ćelije su isprane, izbrojane i 100000 ćelije je zasejano u ploče sa U-dnom i sa 96 reakcionih mesta. Prethodno razblažen Proleukin (komercijalno nabavljen divlji-tip IL-2) ili IL2-imunokonjugati su titrirani na zasejane ćelije koje su inkubirane u naznačenim vremenskim tačkama. Posle 4-6 dana, ćelije su isprane, obojene na odgovarajuće markere ćelijske površine i, analizirane pomoću FACS korišćenjem BD FACSCantoll. NK ćelije su definisane kao CD37CD56<+>, CD4 T ćelije kao CD3<+>/CD8" i, CD8 T ćelije kao CD37CD8<+>.
Slika 34 prikazuje proliferaciju NK ćelija nakon inkubacije sa različitim FAP-ciljanim 28H1 IL-2 imunokonjugatima tokom 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana. Sve testirane konstrukcije indukuju NK ćelijsku proliferaciju na koncentraciono-zavisan način. Proleukin je imao veću efikasnost od imunokonjugata pri nižim koncentracijama, ova razlika, međutim, više nije postojala pri višim koncentracijama. U ranijim vremenskim tačkama {dan 4), lgG-IL2 konstrukcije su bile blago moćnije od Fab-IL2-Fab konstrukcija. U kasnijim vremenskim tačkama (dan 6), sve konstrukcije su imale uporedivu efikasnost, uz to da je Fab-IL2 qm-Fab konstrukcija bila najmanje potentna pri niskim koncentracijama.
Slika 35 prikazuje proliferaciju CD4 T-ćelija nakon inkubacije sa različitim FAP-ciljanim 28H1 IL-2 imunokonjugatima tokom 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana. Sve testirane konstrukcije indukuju CD4 T ćelijsku proliferaciju na koncentraciono-zavisan način. Proleukin je imao veću aktivnost od imunokonjugata, a imunokonjugati koji uključuju divlji tip IL-2 su bili neznatno više potentni od onih koji uključuju kvadripl mutant IL-2. Kao i kod NK ćelija, Fab-IL2 qm-Fab konstrukcija je imala najnižu aktivnost. Najverovatnije su proliferišuće CD4 T ćelije delimično regulatorne T ćelije, bar za divlji-tip IL-2 konstrukcija.
Slika 36 pokazuje proliferaciju CD8 T-ćelija posle inkubacije sa različitim FAP-ciljanim 28H1 IL-2 imunokonjugatima u toku 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana. Sve testirane konstrukcije indukuju CD8 T ćelijsku proliferaciju na koncentraciono-zavisan način. Proleukin je imao veću aktivnost od imunokonjugata, a imunokonjugati koji uključuju divlji tip IL-2 su bili neznatno više potentni od onih koji uključuju kvadripl mutant IL-2. Kao za NK i za CD4 T ćelije, Fab-IL2 qm-Fab konstrukcija je imala najnižu aktivnost.
Slika 37 prikazuje rezultate drugog eksperimenta, gde su upoređeni FAP-ciljani 28H1 lgG-IL-2, koji uključuje bilo divlji-tip bilo kvadripl mutant IL-2, i Proleukin. Vreme inkubacije je bilos 6 dana. Kako je prikazano na slici, sve tri IL-2 konstrukcije indukuju NK (A) i CD8 T-ćelijsku (C) proliferaciju na dozno-zavisni način sa sličnom potencijom. Za CD4 T-ćelije (B), IgG-IL2 qm imunokonjugat je imao nižu aktivnost, naročito pri srednjim koncentracijama, što bimoglo biti posledica njegovog manjka aktivnosti na CD25-pozitivnim (uključiv i regulatorne) T ćelijama koje su podgrupa CD4 T ćelija.
Primer 13
Aktivacija efektorne ćelije pomoću divljeg tipa i kvadripl mutanta IL-2 (pSTAT5 test)
PBMCs su pripremljeni kako je gore opisano. 500000 PBMCs/reakciono mesto je zasejano u pločama sa U dnom i 96-reakcionih mesta i, ostavljeni su 45 min na 37°C u RPMI medijumu koji sadrži 10% FCS i 1% Glutamax (Gibco). Posle toga, PBMCs su inkubirani sa Proleukinom, divljim-tipom IL-2 proizvedenim domaćom izradom ili kvadripl mutantom IL-2 u naznačenim koncentracijama tokom 20 min na 37°C kako bi se indukovala fosforilacija STAT5. Zatim, ćelije su odmah fiksirane (BD Cytofix Buffer) u toku 10 min na 37°C iisprane jednom, a zatim je sledio korak permeabilizacije (BD Phosflow Perm Buffer III) u toku 30 min na 4°C. Posle toga, ćelije su isprane sa PBS / 0.1% BSA i obojene sa smešama FACS antitela za detekciju NK ćelija (CD37CD56<*>), CD8<+>T ćelija (CD37CD8+), CD4<+>T ćelija (CD37CD47CD25"/CD127<+>) ili Tre9ćelija (CD47CD25<+>/CD127/FoxP3<+>), kao i pSTAT5 tokom 30 min na RT u mraku. Ćelije su isprane dva puta sa PBS / 0.1% BSA i ponovo suspendovane u 2% PFA pre analiza protočnom citometrijom (BD FACSCantoll). Slika 38 pokazuje STAT fosforilaciju u NK ćelijama (A), CD8 T-ćelijama (B), CD4 T-ćelijama (C) i regulatornim T-ćelijama (D) nakon 30 min inkubacije sa Proleukinom, divljim-tipom IL-2 proizvedenim domaćom izradom (pool 2) i kvadripl mutantom IL-2 (serija 1). Sva tri IL-2 preparata jednako su moćna u indukovanju STAT fosforilacije u NK kao i u CD8 T-ćelijama. U CD4 T-ćelijama i još više u regulatornim T-ćelijama, kvadripl mutant IL-2 je imao nižu aktivnost nego divlji-tip IL-2 preparati.
Primer 14
Aktivacija efektornećelijepomoću divljeg tipaikvadripl mutanta lgG-IL-2 (pSTAT5test)
Eksperimentalni uslovi su bili kao oni koji su gore opisani (vidi Primer 13).
Slika 39 prikazuje STAT fosforilaciju u NK ćelijama (A), CD8 T-ćelijama (B), CD4 T-ćelijama (C) i regulatornim T-ćelijama (D) nakon 30 min inkubacije sa Proleukinom, !gG-IL-2 koji uključuje divlji-tip IL-2 ili lgG-IL-2 koji uključuje kvadripl mutant IL-2. Na svim vrstama ćelija Proleukin je bio moćniji u indukovanju STAT fosforilacije od lgG-IL-2 imunokonjugata. lgG-IL-2 divlji-tip i kvadripl mutant konstrukcije bile su jednako potentne prema NK kao i prema CD8 T-ćelijama. Na CD4 T-ćelijama i još više na regulatornim T-ćelijama, lgG-IL-2 kvadripl mutant je imao manju aktivnost od lgG-IL-2 divljeg-tipa imunokonjugata.
Primer 15
Maksimalna tolerisana doza (MTD) FAP-ciljanih Fab-IL2 wt-Fab i Fab-IL2 qm-Fab
imunokonjugata
Ispitivano je povećavanje doza FAP-ciljanih Fab-IL2-Fab imunokonjugata, koji uključuju ili divlji tip (wt) ili kvadripl mutant (qm) IL-2, na imunokompetentnim crnim 6 miševa bez tumora. Ženke crnih 6 miševa (Charles River, Germanv), starosti 8-9 nedelja na početku eksperimenta su držane u uslovima bez prisustva specifičnih patogena, sa dnevnim ciklusima 12 h svetlost / 12 h mrak, u skladu sa odgovarajućim vodičima (GV-Solas; Felasa; TierschG). Lokalne nadležne službe su protokol eksperimenta ispitivanja pregledale i odobrile (P 2008016). Po dolasku, životinje su jednu nedelju dana ostavljene da se priviknuna novu sredinu i radi posmatranja. Kontinuirano praćenje zdravlja je sprovođeno na regularnoj osnovi.
Miševima je i.v. injektovan jednom dnevno u toku 7 dana 4G8 Fab-IL2 wt-Fab u dozama od 60, 80 i 100^g/miš ili 4G8 Fab-IL2 qm-Fab u dozama od 100, 200, 400, 600 i 1000M.g/miš. Svim miševima je injektovano i.v. 200 ?) odgovarajućeg rastvora. Da bi se postigla odgovarajuća količina imunokonjugata na 200 ni, matični rastvori su razblaženi sa PBS ukoliko je neophodno.
Slika 40 prikazuje da MTD (maksimalna tolerisana doza) za Fab-IL2 qm-Fab je 10-puta viša od one za Fab-IL2 wt-Fab, tačnije 600^g/miš dnevno tokom 7 dana za Fab-IL2 qm-Fab vs. 60 u.g/miš dnevno tokom 7 dana za Fab-IL2 wt-Fab.
Primer 16
Farmakokinetike jedne doze FAP-ciljanih i neciljanih lgG-IL2 wt i qm
Ispitivanje jednodoznih farmakokinetika (PK)je izvedeno na imunokompetentnim 129 miševa bez tumora, za FAPciljane lgG-IL2 imunokonjugate koji su uključivali ili divlji tip ili kvadripl mutant IL-2, kao i neciljane lgG-IL2 imunokonjugate koji su uključivali ili divlji tip ili kvadripl mutant IL-2.
Ženke 129 miševa (Harlan, United Kingdom), starosti 8-9 nedelja na početku eksperimenta su držane u uslovima bez prisustva specifičnih patogena, sa dnevnim ciklusima 12 h svetlost / 12 h mrak, u skladu sa odgovarajućim vodičima (GV-Solas; Felasa; TierschG). Lokalne nadležne službe su protokol eksperimenta ispitivanja pregledale i odobrile (P 2008016). Po dolasku, životinje su jednu nedelju dana ostavljene da se priviknuna novu sredinu i radi posmatranja. Kontinuirano praćenje zdravlja je sprovođeno na regularnoj osnovi.
Miševima je i.v. jednom injektovan FAP-ciljani 28H1 lgG-IL2 wt (2.5 mg/kg) ili 28H1 lgG-IL2 qm (5 mg/kg), ili neciljani DP47GS lgG-IL2 wt (5 mg/kg) ili DP47GS lgG-IL2 qm (5 mg/kg). Svim miševima je injektovano i.v. 200\ x\odgovarajućeg rastvora. Da bi se postigla odgovarajuća količina imunokonjugata na 200\ x\,matični rastvori su razblaženi sa PBS ukoliko je neophodno.
Miševima je uzimana krv u 1,8, 24, 48, 72, 96 h; i, nakon toga, svakog 2. dana tokom 3 nedelje. Serum je izdvojen i čuvan na -20°C do ELISA analize. Koncentracije imunokonjugata u serumu su određene korišćenjem ELISA radi određivanja IL2-imunokonjugata u serumu su određene korišćenjem ELISA radi određivanja IL2-imunoconjugata antitela (Roche-Penzberg). Apsorpcija je merena na mernoj talasnoj dužini od 405 nm i referentnoj talasnoj dužini od 492 nm (rider za mikrotitarske ploče: VersaMax tunable microplate reader, Molecular Devices). Slika 41 prikazuje farmakokinetike ovih IL-2 imunokonjugata. I FAP-ciljane (A) i neciljane (B) lgG-IL2 qm konstrukcije imaju duži serumski polu-život (otpr. 30 h) nego odgovarajuće lgG-IL2 wt konstrukcije (otpr. 15 h).
Primer 17
Farmakokinetike jedne doze neciljanog Fab-IL2 wt-Fab i Fab-IL2 qm-Fab
Ispitivanje jednodoznih farmakokinetika (PK) je izvedeno na imunokompetentnim 129 miševa bez tumora, za neciljane Fab-IL2-Fab imunokonjugate koji uključuju ili divlji tip ili kvadripl mutant IL-2.
Ženke 129 miševa (Harlan, United Kingdom), starosti 8-9 nedelja na početku eksperimenta su držane u uslovima bez prisustva specifičnih patogena, sa dnevnim ciklusima 12 h svetlost / 12 h mrak, u skladu sa odgovarajućim vodičima {GV-Solas; Felasa; TierschG). Lokalne nadležne službe su protokol eksperimenta ispitivanja pregledale i odobrile (P 2008016). Po dolasku, životinje su jednu nedelju dana ostavljene da se priviknuna novu sredinu i radi posmatranja. Kontinuirano praćenje zdravlja je sprovođeno na regularnoj osnovi.
Miševima je i.v. jednom injektovan DP47GS Fab-IL2 wt-Fab u dozi od 65 nmol/kg ili DP47GS Fab-IL2 qm-Fab u dozi od 65 nM/kg. Svim miševima je injektovano i.v. 200 ?! odgovarajućeg rastvora. Da bi se postigla odgovarajuća količina imunokonjugata na 200^l, matični rastvori su razblaženi sa PBS ukoliko je neophodno.
Miševima je uzimana krv u 0.5, 1, 3, 8, 24, 48, 72, 96 satu i, nakon toga, svakog 2. dana tokom 3 nedelje. Serum je izdvojen i čuvan na -20°C do ELISA analize. Koncentracije imunokonjugata u serumu su određene korišćenjem ELISA radi određivanja IL2-imunoconjugata antitela (Roche-Penzberg). Apsorpcija je merena na mernoj talasnoj dužini od 405 nm i referentnoj talasnoj dužini od 492 nm (rider za mikrotitarske ploče: VersaMax tunable microplate reader, Molecular Devices).
Slika 42 prikazuje farmakokinetike ovih IL-2 imunokonjugata. Fab-IL2-Fab wt i qm konstrukcije imaju otprilike serumski polu-život od 3-4 h. Razlika serumskog polu-života između konstrukcija koje uključuju divlji-tip ili kvadripl mutant IL-2 je manje izražena za Fab-IL2-Fab konstrukcije nego za IgG-slične imunokonjugate, koji sami imaju duže polu-živote.
Primer 18
Aktivacijom indukovana ćelijska smrt IL-2 aktiviranih PBMCs
Sveže izolovani PBMCs od zdravih donora prethodno se preko noći aktiviraju sa PHA-M pri 1j^g/ml u RPMI1640 sa 10% FCS i 1% glutamina. Nakon pre-aktivacije PBMCs se sakupe, obeleže sa 40 nM CFSE u PBS, i zaseju u ploče sa 96-pozicija pri 100 000 ćelija/poziciji. Pre-aktivirani PBMCs se stimulišu sa različitim koncentracijama IL-2 imunokonjugata (4B9 lgG-IL-2 wt, 4B9 lgG-IL-2 qm, 4B9 Fab-IL-2 wt-Fab, i 4B9 Fab-IL-2 qm-Fab). Posle šest dana IL-2 tretmana, PBMCs se tretiraju sa 0.5 ng/ml aktivirajućim anti-Fas antitelom preko noći. Proliferacija CD4 (CD3<+>CD8~) i CD8 (CD3<*>CD8<*>) T ćelija se analizira posle šest dana putem CFSE dilucije. Procenat živih T ćelija nakon tretmana sa anti-Fas je određen pomoću prolaska CD3<+>aneksin V negativnih živih ćelija.
Kako je prikazano na Slici 44, sve konstrukcije indukuju proliferaciju pre-aktiviranih T ćelija. Pri niskim koncentracijama, konstrukcije uključujući divlji tip IL-2 wt su bile više aktivne od konstrukcija koje su sadržavale IL-2 qm. lgG-IL-2 wt, Fab-IL-2 wt-Fab i Proleukin su imali sličnu aktivnost. Fab-IL-2 qm-Fab je bio neznatno manje aktivan od lgG-IL-2 qm. Konstrukcije koje uključuju divlji tip IL-2 su bile više aktivne na CD4 T ćelije nego prema CD8 T ćelijama, najverovatnije zbog aktivacije regulatornih T ćelija. Konstrukcije koje uključuju kvadripl mutant IL-2 su imale sličnu aktivnost prema CD8 i CD4 T ćelijama.
Kako je prikazano na Slici 45, T ćelije stimulisane sa visokim koncentracijama divljeg tipa IL-2 su osetljivije na anti-Fas indukovanu apoptozu od T ćelija tretiranih sa kvadripl mutantom IL-2.

Claims (23)

1. Mutant interleukin-2 (IL-2) polipeptid, koji sadrži tri aminokiselinske mutacije koje ukidaju ili smanjuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor visokog afiniteta i zadržavaju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u predenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa, pri čemu su navedene tri aminokiselinske mutacije na položajima koji odgovaraju ostacima 42, 45 i 72 humanog IL-2 (SEQ ID NO: 1).
2. Mutant interleukin-2 polipeptid iz zahteva t, pri čemu su navedene tri aminokiselinske mutacije aminokiselinske supstitucije, odabrane iz grupe, koju sačinjavaju: F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K.
3. Mutant interleukin-2 polipeptid iz zahteva 1 ili 2, pri čemu navedena aminokiselinska mutacija na položaju koji odgovara ostatku 72 humanog IL-2 jeste aminokiselinska supstitucija L72G.
4. Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 do 3, pri čemu navedena aminokiselinska mutacija na položaju koji odgovara ostatku 42 humanog IL-2 jeste aminokiselinska supstitucija F42A.
5. Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 do 4, pri čemu navedena aminokiselinska mutacija na položaju koji odgovara ostatku 45 humanog IL-2 jeste aminokiselinska supstitucija Y45A.
6. Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 do 5, pri čemu su navedene tri aminikiselinske mutacije aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G.
7. Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 do 6, koji dalje sadrži aminokiselinsku mutaciju koja odstranjuje O-glikozilacioni položaj IL-2 na položaju koji odgovara ostatku 3 humanog IL-2.
8. Mutant interleukin-2 polipeptid iz zahteva 7, pri čemu je navedena aminokiselinska mutacija koja odstranjuje O-glikozilacioni položaj IL-2 na položaju koji odgovara ostatku 3 humanog IL-2, supstitucija aminokiselina, koja je odabrana iz grupe, koju čine: T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K i T3P.
9. Mutant interleukin-2 polipeptid iz zahteva 7 ili 8, pri čemu je navedena aminokiselinska mutacija koja odstranjuje O-glikozilacioni položaj IL-2 na položaju koji odgovara ostatku 3 humanog IL-2, supstitucija aminokiselina T3A.
10. Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 do 9, pri čemu je navedeni mutant IL-2 polipeptid humani molekul IL-2.
11. Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 do 10, pri čemu navedeni mutant IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 19.
12. Mutant interleukin-2 polipeptid iz bilo kog od zahteva 1 do 11, pri čemu je navedeni mutant IL-2 polipeptid vezan za deo koji nije IL-2.
13. Imunokonjugat koji sadrži mutant IL-2 polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 12 i antigen-vezujući deo.
14. Imunokonjugat iz zahteva 13, pri čemu je navedeni antigen-vezujući deo antitelo ili fragment antitela.
15. Imunokonjugat iz zahteva 13, pri čemu je navedeni antigen-vezujući deo odabran od Fab molekula i scFv molekula.
16. Imunokonjugat iz zahteva 13, pri čemu je navedeni antigen-vezujući deo molekul imunoglobuiina, posebno IgG molekul.
17. Imunokonjugat iz bilo kog od zahteva 13 do 16, pri čemu je navedeni antigen-vezujući deo usmeren prema antigenu, prisutnom na tumorskoj ćeliji ili u okruženju tumorske ćelije.
18. Izolovani polinukleotid koji kodira mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat iz bilo kog od zahteva 1 do 17.
19. Ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid iz zahteva 18.
20. Postupak proizvodnje mutant IL-2 polipeptida koji sadrži tri aminokiselinske mutacije koje ukidaju ili smanjuju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor visokog afiniteta i zadržavaju afinitet mutant IL-2 polipeptida za IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u poređenju sa IL-2 polipeptiđom divljeg tipa, pri čemu su navedene tri aminokiselinske mutacije na položajima koji odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2 (SEQ ID NO: 1), ili njegovog imunokonjugata, koji uključuje kultivaciju ćelije domaćina iz zahteva 19 pod uslovima koji su pogodni za ekspresiju mutant IL-2 polipeptida ili imunokonjugata.
21. Farmaceutska smeša koja sadrži mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat iz bilo kog od zahteva 1 do 17 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
22. Mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat iz bilo kog od zahteva 1 do 17 za korišćenje u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno.
23. Mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat iz zahteva 22 za korišćenje u lečenju bolesti, pri čemu je navedena bolest rak.
RS20160397A 2011-02-10 2012-02-07 Mutant interleukin-2 polipeptidi RS54802B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11153964 2011-02-10
EP11164237 2011-04-29
PCT/EP2012/051991 WO2012107417A1 (en) 2011-02-10 2012-02-07 Mutant interleukin-2 polypeptides
EP12702045.1A EP2673294B1 (en) 2011-02-10 2012-02-07 Mutant interleukin-2 polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS54802B1 true RS54802B1 (sr) 2016-10-31

Family

ID=45560919

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210996A RS62238B1 (sr) 2011-02-10 2012-02-07 Mutantni interleukin-2 polipeptidi
RS20181250A RS57767B1 (sr) 2011-02-10 2012-02-07 Mutantni interleukin-2 polipeptidi
RS20160397A RS54802B1 (sr) 2011-02-10 2012-02-07 Mutant interleukin-2 polipeptidi

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210996A RS62238B1 (sr) 2011-02-10 2012-02-07 Mutantni interleukin-2 polipeptidi
RS20181250A RS57767B1 (sr) 2011-02-10 2012-02-07 Mutantni interleukin-2 polipeptidi

Country Status (35)

Country Link
US (5) US9266938B2 (sr)
EP (4) EP2673294B1 (sr)
JP (2) JP5878182B2 (sr)
KR (2) KR101667096B1 (sr)
CN (3) CN112210000A (sr)
AR (1) AR085335A1 (sr)
AU (2) AU2012215573B2 (sr)
BR (1) BR112013018932B1 (sr)
CA (1) CA2824253C (sr)
CL (1) CL2013001987A1 (sr)
CO (1) CO6741186A2 (sr)
CR (1) CR20130314A (sr)
CY (1) CY1117842T1 (sr)
DK (3) DK3489255T3 (sr)
EA (1) EA033369B1 (sr)
EC (1) ECSP13012815A (sr)
ES (3) ES2883371T3 (sr)
HR (3) HRP20160917T1 (sr)
HU (3) HUE029139T2 (sr)
IL (3) IL269687B (sr)
LT (2) LT3489255T (sr)
MA (1) MA35803B1 (sr)
MX (2) MX340671B (sr)
MY (1) MY190604A (sr)
PE (2) PE20181077A1 (sr)
PH (2) PH12013501657A1 (sr)
PL (3) PL3075745T3 (sr)
PT (3) PT2673294T (sr)
RS (3) RS62238B1 (sr)
SG (2) SG192673A1 (sr)
SI (3) SI3489255T1 (sr)
TW (2) TWI666027B (sr)
UA (2) UA117294C2 (sr)
WO (1) WO2012107417A1 (sr)
ZA (1) ZA201305282B (sr)

Families Citing this family (284)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5992710A (ja) * 1982-11-16 1984-05-29 関西電力株式会社 直接水冷線路の立坑部の布設方法
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
DK3029066T3 (da) 2010-07-29 2019-05-20 Xencor Inc Antistoffer med modificerede isoelektriske punkter
NZ703653A (en) 2010-08-13 2016-09-30 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
MX340671B (es) 2011-02-10 2016-07-20 Roche Glycart Ag Polipeptidos interleuquina- 2 mutantes.
MY164647A (en) * 2011-03-02 2018-01-30 Roche Glycart Ag Cea antibodies
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
DK2714912T3 (en) 2011-06-01 2018-08-13 Intrexon Actobiotics Nv POLYCISTRONIC EXPRESSION SYSTEM FOR BACTERIA
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
EP3434695B1 (en) * 2012-08-07 2020-12-02 Roche Glycart AG Improved immunotherapy
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
JP6444874B2 (ja) 2012-10-08 2018-12-26 ロシュ グリクアート アーゲー ２つのＦａｂフラグメントを含むＦｃ不含抗体および使用方法
CN104781279A (zh) * 2012-11-30 2015-07-15 罗切格利卡特公司 利用包含癌细胞靶向性mhc i类的多功能蛋白通过循环中的病毒特异性细胞毒性t细胞清除癌细胞
KR20150097688A (ko) 2012-12-21 2015-08-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 디술피드-연결 다가 ｍｈｃ 클래스 ｉ 포함 다관능 단백질
AU2014205086B2 (en) 2013-01-14 2019-04-18 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9738722B2 (en) 2013-01-15 2017-08-22 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
KR20150122761A (ko) 2013-02-26 2015-11-02 로슈 글리카트 아게 Ｔ 세포 활성화 항원 결합 분자
NZ708182A (en) * 2013-02-26 2019-08-30 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US9546203B2 (en) * 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
WO2014145907A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Xencor, Inc. Targeting t cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
LT3041854T (lt) 2013-08-08 2020-03-25 The Scripps Research Institute Nukleorūgščių specifinės vietos žymėjimo fermentais in vitro būdas, įvedant nenatūralius nukleotidus
WO2015118016A1 (en) * 2014-02-06 2015-08-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
JP6775422B2 (ja) 2014-03-28 2020-10-28 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３８及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体
TWI638047B (zh) 2014-04-09 2018-10-11 史基普研究協會 藉由核酸三磷酸酯轉運子將非天然或經修飾的核苷三磷酸酯輸入至細胞中
CN106604932B (zh) 2014-07-10 2024-12-10 苏黎世大学 人白细胞介素-2的免疫刺激单克隆抗体
EA038361B1 (ru) * 2014-07-21 2021-08-13 Делиниа, Инк. Молекулы, которые избирательно активируют регуляторные t-клетки, для лечения аутоиммунных заболеваний
SMT202400235T1 (it) 2014-08-04 2024-07-09 Hoffmann La Roche Molecole bispecifiche leganti l’antigene di attivazione delle cellule t
SG11201700629TA (en) 2014-08-11 2017-02-27 Delinia Inc Modified il-2 variants that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
SI3186283T1 (sl) * 2014-08-29 2020-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Kombinirana terapija z imunocitokini različice IL-2, usmerjenimi proti tumorju in protitelesi proti humanemu PD-L1
MX391388B (es) 2014-11-14 2025-03-21 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de tnf.
CN107206072B (zh) 2014-11-20 2022-01-21 豪夫迈·罗氏有限公司 T细胞活化性双特异性抗原结合分子CD3 ABD叶酸受体1(FolR1)和PD-1轴结合拮抗剂的组合疗法
ES2808853T3 (es) 2014-11-20 2021-03-02 Hoffmann La Roche Cadenas ligeras comunes y procedimientos de uso
HRP20201747T1 (hr) 2014-11-20 2020-12-25 F. Hoffmann - La Roche Ag Bispecifične antigen vezujuće molekule koje aktiviraju t stanice, protiv folr1 i cd3
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US10526417B2 (en) 2014-11-26 2020-01-07 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
AU2015353409B2 (en) 2014-11-26 2019-05-09 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EP4382535A3 (en) 2014-12-15 2024-08-21 Washington University Compositions and methods for targeted cytokine delivery
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
EP3277305B1 (en) 2015-03-31 2021-07-21 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
MX2018003820A (es) 2015-10-02 2018-12-10 F Hoffmann ­La Roche Ag Anticuerpos biespecificos especificos para un receptor de tnf coestimulador.
BR112018000835A2 (pt) 2015-10-02 2018-09-11 Hoffmann La Roche molécula, um ou mais polinucleotídeos, um ou mais vetores, célula, método de produção da molécula, composição, uso da molécula, método de tratamento de uma doença e método para induzir a lise de uma célula-alvo
ES2886569T3 (es) 2015-10-02 2021-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecíficos específicos para PD1 y TIM3
US11702477B2 (en) 2015-11-06 2023-07-18 Orionis Biosciences BV Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
KR102213790B1 (ko) 2015-12-04 2021-02-09 노파르티스 아게 항체 시토카인 그라프트된 조성물 및 면역조절을 위한 사용 방법
US10227410B2 (en) 2015-12-07 2019-03-12 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
IL313608A (en) 2015-12-09 2024-08-01 Hoffmann La Roche Antibody against CD20 type II to reduce the formation of antibodies against drugs
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
WO2017106767A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a crispr/cas9 system
EP3400246B1 (en) 2016-01-08 2020-10-21 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
KR20180100224A (ko) 2016-01-11 2018-09-07 노바르티스 아게 인간 인터루킨-2에 대한 면역-자극 인간화 단일클론 항체, 및 이의 융합 단백질
CA3011331C (en) 2016-01-14 2025-05-13 Intrexon Actobiotics N.V. COMPOSITIONS AND TREATMENT METHODS FOR TYPE 1 DIABETES
US20170204154A1 (en) * 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
JP6991979B2 (ja) 2016-02-05 2022-03-04 オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ Ｃｄ８結合物質
KR20180117116A (ko) * 2016-02-05 2018-10-26 워싱턴 유니버시티 표적화된 사이토카인 전달을 위한 조성물 및 방법들
US11248057B2 (en) 2016-03-07 2022-02-15 Vib Vzw CD20 binding single domain antibodies
ES2947230T3 (es) 2016-03-22 2023-08-03 Hoffmann La Roche Moléculas biespecíficas para linfocitos T activadas por proteasa
EP3455245A2 (en) 2016-05-13 2019-03-20 Orionis Biosciences NV Therapeutic targeting of non-cellular structures
CA3023883A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
CN110352070B (zh) 2016-06-14 2024-09-17 Xencor股份有限公司 双特异性检查点抑制剂抗体
BR112018076281A2 (pt) 2016-06-20 2019-03-26 Kymab Limited imunocitocina, uso de uma imunocitocina, método, composição farmacêutica, método para tratar uma doença proliferativa em um animal, ácido nucleico, vetor, hospedeiro e anticorpo ou fragmento do mesmo
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
HUE060123T2 (hu) 2016-06-24 2023-01-28 Scripps Research Inst Új nukleozid-trifoszfát-transzporter és alkalmazásai
EP4050032A1 (en) 2016-06-28 2022-08-31 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
KR102050463B1 (ko) 2016-08-10 2019-11-29 아주대학교산학협력단 항체 중쇄불변부위 이종이중체 (heterodimeric Fc)에 융합된 사이토카인 (heterodimeric Fc-fused cytokine) 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
AU2017335771A1 (en) 2016-09-28 2019-02-28 Musc Foundation For Research Development Antibodies that bind interleukin-2 and uses thereof
PL3519437T3 (pl) 2016-09-30 2022-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała dwuswoiste przeciwko p95HER2
CR20230179A (es) 2016-10-14 2023-06-12 Xencor Inc PROTEÍNAS DE FUSIÓN FC HETERODIMÉRICAS IL 15/IL15Ra (Divisional 2019-0229)
WO2018073365A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing an immunoconjugate
CN110114368B (zh) 2016-10-24 2024-08-02 奥睿尼斯生物科学私人有限公司 靶向突变干扰素-γ及其用途
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
JP2019532996A (ja) * 2016-11-08 2019-11-14 デリニア，インコーポレーテッド 自己免疫疾患を処置するためのｉｌ−２変異体
CU24483B1 (es) * 2016-11-15 2020-04-02 Ct Inmunologia Molecular Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina-2
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
CN117024560A (zh) * 2016-12-22 2023-11-10 库尔生物制药有限公司 T细胞调节性多聚体多肽及其使用方法
EP3576765B1 (en) 2017-02-06 2025-07-16 Orionis Biosciences, Inc. Targeted engineered interferon and uses thereof
WO2018141964A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences Nv Targeted chimeric proteins and uses thereof
CN110520436A (zh) 2017-03-15 2019-11-29 潘迪恩治疗公司 靶向免疫耐受性
CN111010875B (zh) * 2017-03-15 2024-04-05 库尔生物制药有限公司 用于调节免疫应答的方法
EP3606947B1 (en) * 2017-04-03 2022-12-21 F. Hoffmann-La Roche AG Immunoconjugates of il-2 with an anti-pd-1 and tim-3 bispecific antibody
JP7426825B2 (ja) * 2017-04-03 2024-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｐｄ－１抗体と突然変異ｉｌ－２とまたはｉｌ－１５とのイムノコンジュゲート
CA3053358A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap
TWI690538B (zh) 2017-04-05 2020-04-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 特異性結合至pd1至lag3的雙特異性抗體
JP6928668B2 (ja) * 2017-04-11 2021-09-01 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 増大した熱安定性を有する変異型逆転写酵素、ならびにそれに関する生成物、方法および使用
WO2018189220A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 F. Hoffmann-La Roche Ag An interleukin-2 immunoconjugate, a cd40 agonist, and optionally a pd-1 axis binding antagonist for use in methods of treating cancer
EP3630163A4 (en) 2017-05-24 2021-06-09 Pandion Operations, Inc. Targeted immunotolerance
US20200362058A1 (en) * 2017-05-24 2020-11-19 Novartis Ag Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
JOP20190271A1 (ar) 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
CN110662762A (zh) * 2017-05-24 2020-01-07 诺华股份有限公司 抗体细胞因子移植蛋白和用于治疗癌症的方法
CN111132733A (zh) 2017-06-30 2020-05-08 Xencor股份有限公司 含有IL-15/IL-15Rα和抗原结合结构域的靶向异源二聚体Fc融合蛋白
KR20250171416A (ko) 2017-07-11 2025-12-08 신톡스, 인크. 비천연 뉴클레오티드의 도입 및 그의 방법
BR112020002272A2 (pt) * 2017-08-03 2020-07-28 Synthorx, Inc. conjugados de citocina para o tratamento de doenças autoimunes
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3706793A1 (en) 2017-11-08 2020-09-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
KR102777151B1 (ko) 2017-11-21 2025-03-05 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 인터루킨-2의 부분 효능제
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
USRE50550E1 (en) 2017-12-06 2025-08-26 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
CN111655718B (zh) 2017-12-19 2025-07-22 Xencor股份有限公司 经过工程化的il-2 fc融合蛋白
JP7336457B2 (ja) * 2017-12-26 2023-08-31 ナンジン、ジェンスクリプト、バイオテック、カンパニー、リミテッド 抗体Ｆｃ領域を主鎖として用いた融合タンパク質二量体及びその使用
CN112105627B (zh) 2017-12-29 2024-07-02 斯克利普斯研究所 非天然碱基对组合物及使用方法
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
US20200354424A1 (en) 2018-01-26 2020-11-12 Orionis Biosciences, Inc. Xcr1 binding agents and uses thereof
CA3090406A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
EP3749361A1 (en) 2018-02-08 2020-12-16 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
WO2019173832A2 (en) 2018-03-09 2019-09-12 AskGene Pharma, Inc. Novel cytokine prodrugs
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
PE20210313A1 (es) 2018-03-28 2021-02-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso
SG11202007524QA (en) * 2018-03-28 2020-09-29 Ascendis Pharma Oncology Div A/S Il-2 conjugates
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
JP2021521784A (ja) 2018-04-18 2021-08-30 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＦｃ融合タンパク質とＰＤ−１抗原結合ドメインを含むＰＤ−１標的化ヘテロダイマー融合タンパク質およびそれらの使用
US11505595B2 (en) 2018-04-18 2022-11-22 Xencor, Inc. TIM-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15RA Fc-fusion proteins and TIM-3 antigen binding domains
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
AU2019311233B2 (en) * 2018-07-24 2025-01-09 BioNTech SE IL2 agonists
WO2020023702A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 AskGene Pharma, Inc. Novel il-21 prodrugs and methods of use thereof
EP4678241A2 (en) 2018-08-01 2026-01-14 ImmunityBio, Inc. A quadricistronic system comprising a homing receptor or a cytokine, and chimeric antigen receptor for genetic modification of immunotherapies
PL3849614T3 (pl) * 2018-09-11 2024-04-22 Ambrx, Inc. Koniugaty polipeptydu interleukiny-2 i ich zastosowania
WO2020060122A1 (ko) 2018-09-17 2020-03-26 (주)지아이이노베이션 Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
TWI846731B (zh) 2018-09-18 2024-07-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 組織蛋白酶(cathepsin)S抑制劑之對抗抗藥抗體形成之用途
JP7512210B2 (ja) * 2018-09-21 2024-07-08 イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッド 新規インターロイキン２およびその使用
AU2019344875B2 (en) * 2018-09-21 2021-12-23 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Novel interleukin 2 and use thereof
EP3856764A4 (en) * 2018-09-27 2022-11-02 Xilio Development, Inc. MASKED CYTOKINE POLYPEPTIDES
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
KR20210080460A (ko) * 2018-10-23 2021-06-30 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. 이종이량체성 Fc-융합된 단백질
KR20210087965A (ko) * 2018-10-29 2021-07-13 1글로브 바이오메디칼 씨오., 엘티디. 신규 합리적으로 디자인된 단백질 조성물
EP3890773A4 (en) 2018-11-08 2022-11-09 Orionis Biosciences, Inc. MODULATION OF DENDRITIC CELL LINES
AU2019409196A1 (en) * 2018-12-21 2021-06-17 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Human interleukin-2 variant or derivative thereof
KR20200078312A (ko) * 2018-12-21 2020-07-01 한미약품 주식회사 신규 면역 억제 인터루킨 2 (Interleukin 2) 아날로그
EP3898682A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
BR112021012027A2 (pt) 2018-12-21 2021-11-03 Ose Immunotherapeutics Molécula bifuncional direcionada contra pd-1 humano
CN113924311A (zh) * 2019-01-07 2022-01-11 印希比股份有限公司 包含修饰的il-2多肽的多肽及其用途
WO2020148612A1 (en) * 2019-01-14 2020-07-23 Ignite Immunotherapy, Inc. Recombinant vaccinia virus and methods of use thereof
US20200246467A1 (en) 2019-02-06 2020-08-06 Synthorx, Inc. Il-2 conjugates and methods of use thereof
AU2020224681A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
SG11202109061YA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
AU2020232605A1 (en) 2019-03-01 2021-10-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
CN111647068A (zh) * 2019-03-04 2020-09-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人白细胞介素2变体或其衍生物
CN111944036B (zh) * 2019-05-14 2024-09-06 上海盖浦生物科技有限公司 一种增殖免疫细胞的突变体蛋白
CN111944008A (zh) * 2019-05-14 2020-11-17 上海盖浦生物科技有限公司 一种突变蛋白的方法以及得到的突变体蛋白
MX2021014178A (es) 2019-05-20 2022-01-04 Pandion Operations Inc Inmunotolerancia dirigida a la molecula de adhesion celular de adresina vascular de mucosas (madcam).
SG11202111409YA (en) 2019-05-20 2021-12-30 Cytune Pharma IL-2/IL-15Rßy AGONIST DOSING REGIMENS FOR TREATING CANCER OR INFECTIOUS DISEASES
US11845801B2 (en) 2019-06-12 2023-12-19 AskGene Pharma, Inc. IL-15 prodrugs and methods of use thereof
JP7728181B2 (ja) 2019-06-14 2025-08-22 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 半合成生物における複製、転写および翻訳のための試薬ならびに方法
US20220170028A1 (en) * 2019-06-14 2022-06-02 Cugene Inc Novel interleukin-2 variants and bifunctional fusion molecules thereof
TW202115105A (zh) * 2019-06-24 2021-04-16 德商拜恩迪克Ｒｎａ製藥有限公司 Ｉｌ２激動劑
WO2021001289A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates comprising a mutant interleukin-2 and an anti-cd8 antibody
AR119382A1 (es) * 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
KR20220035931A (ko) 2019-07-19 2022-03-22 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 2세대 세네카 밸리 바이러스 종양용해 요법: 이의 조성물 및 방법
AU2020316002A1 (en) * 2019-07-25 2022-03-03 The University Of Chicago Compositions and methods comprising protease-activated therapeutic agents
EP4004025A1 (en) 2019-07-26 2022-06-01 Visterra, Inc. Interleukin-2 agents and uses thereof
AU2020329216A1 (en) * 2019-08-12 2022-02-24 AskGene Pharma, Inc. IL-2 fusion proteins that preferentially bind ILl-2ralpha
MX2022001934A (es) 2019-08-15 2022-03-11 Igm Biosciences Inc Moleculas de union multimericas inmunoestimuladoras.
EP4028060A1 (en) 2019-09-10 2022-07-20 Synthorx, Inc. Il-2 conjugates and methods of use to treat autoimmune diseases
US20220378933A1 (en) * 2019-09-19 2022-12-01 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-2 compositions and methods of use thereof
CA3156035A1 (en) 2019-09-27 2021-04-01 Intrexon Actobiotics Nv D/B/A Precigen Actobio Treatment of celiac disease
AU2020379735A1 (en) * 2019-11-05 2022-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. N-terminal SCFV multispecific binding molecules
JP7425195B2 (ja) 2019-11-20 2024-01-30 ジーアイ・セル・インコーポレイテッド 調節ｔ細胞培養用組成物及びその用途
BR112022009532A2 (pt) 2019-11-20 2022-08-02 Gi Cell Inc Composição para cultura de células exterminadoras naturais e método para preparação de células exterminadoras naturais usando a mesma
CN114829585B (zh) 2019-11-20 2024-08-23 吉爱希公司 用于培养t细胞的组合物及使用其来培养t细胞的方法
JP7488337B2 (ja) 2019-11-27 2024-05-21 ジーアイ・セル・インコーポレイテッド Ｉｌ－２タンパク質及びｃｄ８０タンパク質を含む融合タンパク質及びｎｋ細胞を含む抗癌治療用組成物
US20230014358A1 (en) * 2019-11-27 2023-01-19 Gi Cell, Inc. Composition for anticancer treatment, comprising nk cells and fusion protein which comprises il-2 protein and cd80 protein
CA3161303A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 Gi Innovation, Inc. Pharmaceutical composition for treating cancer comprising fusion protein comprising il-2 protein and cd80 protein and immune checkpoint inhibitor
CN111018961B (zh) * 2019-12-17 2022-03-18 北京志道生物科技有限公司 白介素-2衍生物
JOP20220151A1 (ar) 2019-12-17 2023-01-30 Amgen Inc ناهض مستقبل إنترلوكين -2 / tnf المزدوج للاستخدام في العلاج
US12091440B2 (en) 2019-12-20 2024-09-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL2 and peptide-MHC complex fusion proteins and methods of use thereof
EP4084823A4 (en) 2020-01-03 2024-05-15 Marengo Therapeutics, Inc. ANTI-TCR ANTIBODY MOLECULES AND THEIR USES
BR112022013521A2 (pt) * 2020-01-09 2022-09-13 Pfizer Vírus vaccinia recombinante
EP4087865A2 (en) 2020-01-10 2022-11-16 Bright Peak Therapeutics AG Modified il-2 polypeptides and uses thereof
MX2022008771A (es) 2020-01-14 2022-10-07 Synthekine Inc Metodos y composiciones de muteinas de il2 sesgadas.
CA3166420A1 (en) 2020-01-14 2021-07-22 Synthekine, Inc. Il2 orthologs and methods of use
US11230699B2 (en) 2020-01-28 2022-01-25 Immunitybio, Inc. Chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells targeting EGFR super-family receptors
EP4107187A4 (en) 2020-02-21 2024-07-03 Pandion Operations, Inc. TISSUE-TARGETED IMMUNOTOLERANCE WITH A CD39 EFFECTOR
TWI839476B (zh) * 2020-02-26 2024-04-21 大陸商北京泰德製藥股份有限公司 介白素-2多肽共軛物及其用途
WO2021178833A2 (en) * 2020-03-05 2021-09-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Designed il-2 variants
US20230139890A1 (en) * 2020-03-18 2023-05-04 Gi Innovation, Inc. Fusion protein comprising il-2 protein and cd80 protein fragment or variant thereof, and uses thereof
TWI855242B (zh) 2020-03-18 2024-09-11 南韓商Ｇｉ醫諾微新股份有限公司 包含含有il-2蛋白與cd80蛋白之融合蛋白及抗癌藥物的用於治療癌症的藥學組成物
CN115666522B (zh) 2020-03-18 2025-05-27 Gi医诺微新 包含il-2蛋白和cd80蛋白的融合蛋白制剂
CN115698052A (zh) * 2020-03-19 2023-02-03 信达生物制药(苏州)有限公司 白介素2突变体及其用途
CA3175728A1 (en) 2020-03-19 2021-09-23 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Interleukin-2 mutant and use thereof
TW202204388A (zh) * 2020-04-01 2022-02-01 美商艾希利歐發展股份有限公司 經遮蔽之il-2細胞激素及其裂解產物
CR20220512A (es) 2020-04-15 2022-11-07 Hoffmann La Roche Inmunoconjugados
EP4139341A1 (en) * 2020-04-21 2023-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-2 variants with reduced binding to il-2 receptor alpha and uses thereof
AR121891A1 (es) 2020-04-22 2022-07-20 Merck Sharp & Dohme CONJUGADOS DE INTERLEUCINA 2 HUMANA SESGADOS AL DÍMERO DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA 2 bgᶜ Y CONJUGADOS CON UN POLÍMERO HIDROSOLUBLE NO PEPTÍDICO
IL298038A (en) 2020-05-11 2023-01-01 Hoffmann La Roche Combination therapy with modified pbmcs and an immunoconjugate
CA3169949A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Cue Biopharma, Inc. Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof
JP2023526282A (ja) 2020-05-13 2023-06-21 ボナム セラピューティクス，インク． タンパク質複合体の組成物及びその使用方法
CN113667004A (zh) * 2020-05-14 2021-11-19 上海盖浦生物科技有限公司 一种白介素2突变体
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
EP4161956A1 (en) 2020-06-03 2023-04-12 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Il-2 sequences and uses thereof
KR102373965B1 (ko) 2020-06-05 2022-03-15 (주)지아이이노베이션 Ｉｌ-２ 단백질 및 ｃｄ８０ 단백질을 포함하는 융합단백질을 포함하는 방사선 치료 증진용 약학적 조성물
EP4168447A1 (en) 2020-06-19 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to cd3 and cd19
CN115916827A (zh) 2020-06-19 2023-04-04 豪夫迈·罗氏有限公司 免疫活化Fc结构域结合分子
US20230257438A1 (en) 2020-06-30 2023-08-17 Gi Innovation, Inc. Fusion protein comprising anti-lag-3 antibody and il-2, and use thereof
JP2023534793A (ja) * 2020-07-09 2023-08-14 ユーティレックス カンパニー リミテッド Ｉｌ－２バリアント
KR20220014531A (ko) * 2020-07-29 2022-02-07 (주)메디톡스 헤테로이량체 Ｆｃ 융합 단백질, 및 관련 조성물, 용도 및 방법
TW202221031A (zh) 2020-07-30 2022-06-01 英商阿法克塔生命科學有限公司 血清半衰期延長之pd-l1抑制多肽
IL300666A (en) 2020-08-19 2023-04-01 Xencor Inc ANTI–CD28 COMPOSITIONS
WO2022048640A1 (zh) * 2020-09-04 2022-03-10 江苏先声药业有限公司 Il-2突变体及其应用
EP4211149A4 (en) 2020-09-09 2024-10-09 Cue Biopharma, Inc. MULTIMERIC POLYPEPTIDES MODULATING MHC CLASS II T CELLS FOR THE TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES MELLITUS (T1D) AND METHODS OF USE THEREOF
US20240025956A1 (en) * 2020-09-18 2024-01-25 Miyagi Prefectural Hospital Organization Il-2 mutant protein and medicine containing same
CN118598977A (zh) * 2020-10-18 2024-09-06 北京志道生物科技有限公司 经修饰的il-2分子及其用途
CN114369153A (zh) * 2020-10-18 2022-04-19 北京志道生物科技有限公司 一种白介素-2突变体
TW202406932A (zh) 2020-10-22 2024-02-16 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
EP4232068A1 (en) 2020-10-26 2023-08-30 Cytune Pharma IL-2/IL-15RBetaGamma AGONIST FOR TREATING NON-MELANOMA SKIN CANCER
AU2021367887A1 (en) 2020-10-26 2023-06-01 Cytune Pharma IL-2/IL-15Rβү AGONIST FOR TREATING SQUAMOUS CELL CARCINOMA
US20240325495A1 (en) 2020-10-29 2024-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Fusion proteins for the treatment of disease
CN114437228B (zh) * 2020-10-30 2024-02-06 中国科学院生物物理研究所 一种il-2与抗体亚单位构成的双功能融合蛋白
TW202227123A (zh) 2020-11-13 2022-07-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 一種包含人白細胞介素２變體或其衍生物的醫藥組成物及其用途
CN112724259B (zh) * 2020-11-16 2022-12-20 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
KR20230113581A (ko) 2020-11-25 2023-07-31 실리오 디벨럽먼트, 인크. 종양 특이적 절단성 링커
WO2022117692A2 (en) 2020-12-04 2022-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Ph-dependent mutant interleukin-2 polypeptides
TW202237171A (zh) 2020-12-04 2022-10-01 美商威特拉公司 使用介白素-2藥劑之方法
WO2022148853A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
CN116761883A (zh) * 2021-01-19 2023-09-15 塞内卡治疗公司 武装的塞尼卡谷病毒溶瘤性治疗组合物及其方法
WO2022189377A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugates and fap/4-1bb binding molecules
US20240262913A1 (en) 2021-03-09 2024-08-08 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugate and anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies
JP2024511319A (ja) 2021-03-09 2024-03-13 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｃｌｄｎ６に結合するヘテロ二量体抗体
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
CA3207652A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Stephanie Cornen Cytokine anchors for nkp46-binding nk cell engager proteins
EP4314032A1 (en) 2021-03-30 2024-02-07 F. Hoffmann-La Roche AG Protease-activated polypeptides
MX2023011964A (es) 2021-04-09 2024-01-08 Ose Immunotherapeutics Nuevo andamio para moléculas bifuncionales con propiedades mejoradas.
CN113321722A (zh) * 2021-04-13 2021-08-31 苏州复融生物技术有限公司 白介素2突变体及其应用
CN117321078A (zh) 2021-04-30 2023-12-29 豪夫迈·罗氏有限公司 针对用抗cd20/抗cd3双特异性抗体和抗cd79b抗体药物缀合物进行组合治疗的给药
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
JP2024521405A (ja) 2021-06-09 2024-05-31 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム Ｎｋｐ４６、サイトカイン受容体、腫瘍抗原およびｃｄ１６ａに結合する多特異性タンパク質
CN117529504A (zh) 2021-06-09 2024-02-06 先天制药公司 结合至cd20、nkp46、cd16并缀合至il-2的多特异性抗体
TW202317623A (zh) 2021-06-14 2023-05-01 美商再生元醫藥公司 基於il2之治療劑及其使用方法
WO2022266467A2 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Recombinant histone polypeptide and uses thereof
WO2023281484A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Bright Peak Therapeutics Ag Synthetic il-7 and il-7 immunocytokines
WO2023281480A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Bright Peak Therapeutics Ag Conjugates of checkpoint inhibitors with il-2, and uses thereof
US20230201365A1 (en) 2021-07-09 2023-06-29 Bright Peak Therapeutics Ag Modified cd20 antibodies and uses thereof
JP2024526297A (ja) 2021-07-09 2024-07-17 ブライト ピーク セラピューティクス エージー 抗体コンジュゲートおよびその製造
US20240368238A1 (en) * 2021-07-30 2024-11-07 Dracoterpin Biomedicine Llc Human interleukin-2 variant and use thereof
US20240350589A1 (en) 2021-08-13 2024-10-24 Cytune Pharma Il-2/il-15rbetagamma agonist combination with antibody-drug conjugates for treating cancer
MX2024002261A (es) 2021-08-24 2024-03-06 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Molecula de union de fap/cd40 y uso medicinal de la misma.
US20250000946A1 (en) * 2021-09-26 2025-01-02 WuXi Biologics Ireland Limited Il-2 variants and fusion proteins thereof
MX2024004451A (es) 2021-10-14 2024-05-08 Hoffmann La Roche Nuevos inmunoconjugados de interleucina-7.
JP2024537096A (ja) 2021-10-14 2024-10-10 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんの治療のための代替的なＰＤ１－ＩＬ７ｖイムノコンジュゲート
CU24763B1 (es) 2021-12-21 2025-07-09 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteína agonista de interleucina 2
KR20230095612A (ko) * 2021-12-22 2023-06-29 한미약품 주식회사 신규 면역 억제 인터루킨 2 (Interleukin 2) 아날로그
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
US20230303650A1 (en) * 2022-01-21 2023-09-28 Aetio Biotherapy, Inc. Immunoconjugates of Interlukin-2 Mutant Polypeptides with Antibodies
JP2025507320A (ja) * 2022-02-11 2025-03-18 カナプ セラピューティクス インコーポレイテッド がん処置のための医薬組成物であって、ｉｌ－１２及び抗ｆａｐ抗体を含む融合タンパク質並びに抗がん剤を含む医薬組成物
AU2022316521B2 (en) * 2022-02-21 2023-10-26 Ctcells, Inc. A fusion protein comprising an antigen binding domain and a cytokine trimer domain
WO2023161857A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Bright Peak Therapeutics Ag Bifunctional cytokine compositions
CN116769013A (zh) * 2022-03-10 2023-09-19 广东菲鹏制药股份有限公司 白细胞介素2突变体以及含有其的复合物
US20250222027A1 (en) 2022-04-01 2025-07-10 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
TW202413442A (zh) 2022-06-16 2024-04-01 美商希佛隆有限責任公司 抗pd-1抗體減弱之il-2免疫結合物及其用途
TW202409069A (zh) * 2022-07-01 2024-03-01 大陸商北京星奇原生物科技有限公司 Ｉｌ－２多肽和使用方法
JP2025523846A (ja) 2022-07-11 2025-07-25 ジェヌーヴ インク． サイトカイン融合タンパク質
US11773160B1 (en) 2022-08-05 2023-10-03 Anaveon AG Immune-stimulating IL-2 fusion proteins
TWI875131B (zh) * 2022-08-16 2025-03-01 國立陽明交通大學 介白素-2變異體及其於治療癌症的用途
EP4594345A1 (en) 2022-09-29 2025-08-06 F. Hoffmann-La Roche AG Protease-activated polypeptides
CN116041539B (zh) * 2022-10-31 2023-07-21 山东博安生物技术股份有限公司 Il-2突变体免疫缀合物
WO2024119193A2 (en) 2022-12-02 2024-06-06 AskGene Pharma, Inc. Mutant il-2 polypeptides and il-2 prodrugs
WO2024150174A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated immunocytokines and methods of use
WO2024150175A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated proteins and methods of use
CR20250288A (es) 2023-01-20 2025-08-29 Hoffmann La Roche POLIPÉPTIDOS DE DOMINIO Fc -VARIANTE DE IL2 RECOMBINANTES Y POLITERAPIA CON POLIPÉPTIDOS DE UNIÓN AL ANTÍGENO ANCLADOS A LA MEMBRANA
CN120603852A (zh) 2023-02-24 2025-09-05 上海迈晋生物医药科技有限公司 一种fap/cd40结合分子的药物组合物及其医药用途
EP4674868A1 (en) 2023-03-01 2026-01-07 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Fap/4-1bb/cd40 binding molecule and medicinal use thereof
WO2024215989A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Sotio Biotech Inc. ENGINEERED IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-2/IL-15 RECEPTOR βγ AGONISTS
TW202509065A (zh) 2023-05-16 2025-03-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 經ｐｄ－１調節之ｉｌ－２免疫結合物及其用途
WO2024251884A1 (en) 2023-06-09 2024-12-12 Innate Pharma Nk cell engager proteins comprising anti-cd20 and ant-nkp46 antibody, linked to il-2 in treatment of r/r b-nhl
WO2025137093A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Cephalon Llc Uses for attenuated il-2 immunoconjugates
WO2025202147A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukin-7 immunoconjugates
WO2025242836A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of auto-immune or inflammatory diseases and disorders
WO2025242835A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of cancer

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4186567A (en) 1977-04-18 1980-02-05 Hitachi Metals, Ltd. Ornament utilizing rare earth-cobalt magnet
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4604377A (en) 1984-03-28 1986-08-05 Cetus Corporation Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
DE3676670D1 (de) 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE19607751A1 (de) 1996-02-29 1997-09-04 Henkel Kgaa Neue Aminophenol-Derivate und deren Verwendung
BR9712410A (pt) 1996-10-18 1999-10-19 Genentech Inc Anticorpo isolado, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para fazer um anticorpo anti-erbb2, método para a determinação da presença de erbb2, kit, método paa a indução da morte celular e artigo manufaturado
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
EP0953639A1 (en) 1998-04-30 1999-11-03 Boehringer Ingelheim International GmbH FAPalpha-specific antibody with improved producibility
US6455677B1 (en) 1998-04-30 2002-09-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh FAPα-specific antibody with improved producibility
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6955807B1 (en) * 1998-05-15 2005-10-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation IL-2 selective agonists and antagonists
ATE412433T1 (de) 1999-02-12 2008-11-15 Scripps Research Inst Methoden zur behandlung von tumoren und metastasen unter verwendung einer anti-angiogenen und immun-therapien
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
JP2003530092A (ja) 2000-03-17 2003-10-14 ベーリンガー インゲルハイム ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト ヒトＦＡＰ−α−特異抗体
JP4936299B2 (ja) 2000-08-21 2012-05-23 メレクシス・テクノロジーズ・ナムローゼフェンノートシャップ 磁場方向検出センサ
US7396917B2 (en) 2000-12-05 2008-07-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Rationally designed antibodies
HUP0402250A3 (en) 2001-04-13 2007-06-28 Biogen Idec Inc Antibodies to vla-1
WO2003011878A2 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2003015697A2 (en) * 2001-08-13 2003-02-27 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
BR0214650A (pt) * 2001-12-04 2005-05-03 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
ATE471946T1 (de) * 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
NZ591970A (en) 2003-01-22 2012-11-30 Roche Glycart Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
MXPA06007236A (es) 2003-12-22 2006-08-31 Chiron Corp Uso de polimorfismos de receptor fc como diagnosticos para estrategias de tratamiento para trastornos de la respuesta inmune.
CN1930300A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 希龙公司 预测患者治疗药物耐受性的体外试验系统
JP2007527242A (ja) 2004-03-05 2007-09-27 カイロン コーポレーション 治療剤の患者耐容性を予測するためのインビトロ試験システム
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
CN101258162A (zh) 2005-05-11 2008-09-03 菲罗根股份公司 抗纤连蛋白ed-b和白细胞介素12的抗体l19的融合蛋白
EP1806365A1 (en) 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
BRPI0709787A2 (pt) 2006-05-08 2011-03-29 Philogen Spa citocinas com anticorpos alvejados para terapia
EP2038417A2 (en) 2006-07-06 2009-03-25 Merck Patent GmbH Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
US8231706B2 (en) 2006-09-20 2012-07-31 Mt-Biomethan Gmbh Method and device for separating methane and carbon dioxide from biogas
JP2010510794A (ja) * 2006-11-28 2010-04-08 ハナル ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びこの治療用用途
WO2009126558A1 (en) 2008-04-10 2009-10-15 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (dnl) technology
EP2158318A2 (en) 2007-05-14 2010-03-03 Biogen Idec MA, Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
WO2009013543A2 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Astrazeneca Ab Targeted binging agents directed to kdr and uses thereof - 035
EP2018877A1 (en) 2007-07-27 2009-01-28 The Procter and Gamble Company Absorbent article comprising water-absorbing polymeric particles and method for the production thereof
WO2009061853A2 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides
AU2008343589A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Design and generation of human de novo pIX phage display libraries via fusion to pIX or pVII, vectors, antibodies and methods
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
ES2382058T3 (es) 2008-01-17 2012-06-04 Philogen S.P.A. Combinación de una proteína de fusión de un anticuerpo dirigido contra el EDB de la fibronectina-IL-2, y una molécula de unión a los linfocitos B, progenitores de los linfocitos B y/o sus homólogos cancerosos
WO2009138396A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Molmed S.P.A. Conjugates for the treatment of mesothelioma
MX2011007647A (es) * 2009-01-21 2011-09-01 Amgen Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
RU2650594C1 (ru) * 2009-01-29 2018-04-17 Медиммун, Ллк Человеческие анти-il-6 антитела с пролонгированным периодом выведения in vivo и их применение при лечении онкологических, аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний
CA2756393C (en) 2009-03-24 2017-06-20 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin antibodies
WO2010117448A2 (en) 2009-04-05 2010-10-14 Provenance Biopharmaceuticals Corp. Chimeric immunocytokines and methods of use thereof
US20120107270A1 (en) 2009-06-30 2012-05-03 Manuela Kaspar Immunocytokines In Combination With Anti-ErbB Antibodies For The Treatment Of Cancer
CN102573922B (zh) * 2009-08-17 2015-08-05 罗切格利卡特公司 靶向性免疫缀合物
AU2010288469A1 (en) 2009-08-31 2012-03-01 Roche Glycart Ag Affinity-matured humanized anti CEA monoclonal antibodies
DK2483310T3 (da) 2009-09-29 2014-09-01 Roche Glycart Ag Bispecifik dødsreceptor-agonistiske antistoffer
NZ703653A (en) 2010-08-13 2016-09-30 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
CU23923B1 (es) 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
MX340671B (es) 2011-02-10 2016-07-20 Roche Glycart Ag Polipeptidos interleuquina- 2 mutantes.
MY164647A (en) 2011-03-02 2018-01-30 Roche Glycart Ag Cea antibodies
TR201815420T4 (tr) 2011-03-29 2018-11-21 Roche Glycart Ag Antikor fc varyantları.
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
EP3434695B1 (en) 2012-08-07 2020-12-02 Roche Glycart AG Improved immunotherapy
JP2015530983A (ja) 2012-08-08 2015-10-29 ロシュ グリクアート アーゲー インターロイキン−１０融合タンパク質及びその使用
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
KR20160005345A (ko) 2013-05-07 2016-01-14 에프. 호프만-라 로슈 아게 삼량체성 항원 결합 분자
SI3186283T1 (sl) 2014-08-29 2020-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Kombinirana terapija z imunocitokini različice IL-2, usmerjenimi proti tumorju in protitelesi proti humanemu PD-L1

Also Published As

Publication number Publication date
IL252230A0 (en) 2017-07-31
MX2013009226A (es) 2013-12-06
CR20130314A (es) 2013-08-09
IL227095B (en) 2018-06-28
EA201300896A1 (ru) 2014-02-28
EP3489255A1 (en) 2019-05-29
SG10201604160WA (en) 2016-07-28
HRP20211318T1 (hr) 2021-11-26
PH12013501657A1 (en) 2013-10-07
SG192673A1 (en) 2013-09-30
US20190077881A1 (en) 2019-03-14
IL269687B (en) 2022-08-01
HUE055284T2 (hu) 2021-11-29
PL2673294T3 (pl) 2016-11-30
CO6741186A2 (es) 2013-08-30
US20120244112A1 (en) 2012-09-27
JP5878182B2 (ja) 2016-03-08
HK1217020A1 (zh) 2016-12-16
CL2013001987A1 (es) 2014-01-31
EP3971206A1 (en) 2022-03-23
PL3075745T3 (pl) 2019-07-31
US10323098B2 (en) 2019-06-18
LT3075745T (lt) 2018-11-26
PE20140303A1 (es) 2014-03-22
CN105440123A (zh) 2016-03-30
UA113729C2 (xx) 2017-03-10
RS57767B1 (sr) 2018-12-31
PT3489255T (pt) 2021-08-13
US20180142037A1 (en) 2018-05-24
CN103492411A (zh) 2014-01-01
PT3075745T (pt) 2018-11-14
TW201718029A (zh) 2017-06-01
US10184009B2 (en) 2019-01-22
ECSP13012815A (es) 2013-10-31
SI3075745T1 (sl) 2018-12-31
KR20150092367A (ko) 2015-08-12
ZA201305282B (en) 2016-07-27
SI3489255T1 (sl) 2021-11-30
SI2673294T1 (sl) 2016-08-31
TWI666027B (zh) 2019-07-21
NZ710742A (en) 2017-04-28
IL252230B (en) 2019-10-31
ES2579987T3 (es) 2016-08-18
PT2673294T (pt) 2016-07-07
AU2012215573A1 (en) 2013-05-02
AU2012215573B2 (en) 2015-11-26
PH12017500954A1 (en) 2017-11-27
KR101667096B1 (ko) 2016-10-18
LT3489255T (lt) 2021-08-25
JP2015229676A (ja) 2015-12-21
EP3075745A1 (en) 2016-10-05
CA2824253A1 (en) 2012-08-16
UA117294C2 (uk) 2018-07-10
TWI577801B (zh) 2017-04-11
US11111312B2 (en) 2021-09-07
TW201237165A (en) 2012-09-16
CN103492411B (zh) 2016-12-07
DK3075745T3 (en) 2018-11-26
ES2883371T3 (es) 2021-12-07
WO2012107417A1 (en) 2012-08-16
AU2015249085A1 (en) 2015-11-12
MX356675B (es) 2018-06-08
MX340671B (es) 2016-07-20
KR101852245B1 (ko) 2018-04-25
HRP20160917T1 (hr) 2016-09-23
HUE040326T2 (hu) 2019-03-28
CY1117842T1 (el) 2017-05-17
MY190604A (en) 2022-04-27
HUE029139T2 (hu) 2017-02-28
US20160208017A1 (en) 2016-07-21
PE20181077A1 (es) 2018-07-05
EP3489255B1 (en) 2021-06-16
JP6155300B2 (ja) 2017-06-28
RS62238B1 (sr) 2021-09-30
JP2014506793A (ja) 2014-03-20
CA2824253C (en) 2019-09-17
EA033369B1 (ru) 2019-10-31
DK3489255T3 (da) 2021-08-23
NZ611749A (en) 2015-08-28
PL3489255T3 (pl) 2021-11-22
US20190322765A1 (en) 2019-10-24
AU2015249085B2 (en) 2017-12-14
PH12017500954B1 (en) 2020-06-03
IL269687A (en) 2019-11-28
AR085335A1 (es) 2013-09-25
ES2694564T3 (es) 2018-12-21
CN105440123B (zh) 2020-10-09
EP3075745B1 (en) 2018-09-05
HRP20181736T1 (hr) 2018-12-28
MA35803B1 (fr) 2014-12-01
US9266938B2 (en) 2016-02-23
BR112013018932A2 (pt) 2017-05-02
CN112210000A (zh) 2021-01-12
KR20130118363A (ko) 2013-10-29
EP2673294A1 (en) 2013-12-18
BR112013018932B1 (pt) 2020-11-17
DK2673294T3 (en) 2016-05-30
EP2673294B1 (en) 2016-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11111312B2 (en) Mutant interleukin-2 polypeptides
US20240092853A1 (en) Ph-dependent mutant interleukin-2 polypeptides
NZ611749B2 (en) Mutant interleukin-2 polypeptides
NZ710742B2 (en) Mutant interleukin-2 polypeptides
EA040858B1 (ru) Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
HK1217020B (zh) 突变体白介素-2多肽
HK1189901B (en) Mutant interleukin-2 polypeptides
HK1189901A (en) Mutant interleukin-2 polypeptides