CN111647068A - 一种人白细胞介素2变体或其衍生物 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种人白细胞介素2变体或其衍生物。具体而言，本公开涉及具有一个或多个氨基酸突变的IL‑2或其衍生物，具有消除或降低的对高亲和力受体(IL‑2Rα/β/γ)的亲和力，并保留对中等亲和力受体(IL‑2Rβ/γ)的亲和力。所述IL‑2变体或其衍生物为蛋白成药提供了良好的基础。

Description

一种人白细胞介素2变体或其衍生物

技术领域

本公开涉及具有一个或多个氨基酸突变的人白细胞介素-2(IL-2)变体或其衍生物。所述IL-2变体或衍生物具有消除或降低的对高亲和力受体(IL-2Rα/β/γ)的亲和力，并保留对中等亲和力受体(IL-2Rβ/γ)的亲和力。本公开还涉及包含所述人IL-2变体或其衍生物的免疫缀合物、编码多核苷酸、载体、宿主细胞、药物组合物、制备方法及治疗方法和用途。

背景技术

人白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，也称为T细胞生长因子(TCGF)，基因位于4号染色体(4q27)，包括共7kb的序列，由133个氨基酸组成，分子量约15kD。1976年和1977年，Doris Morgan,Francis Ruscetti,Robert Gallo和Steven Gillis,Kendal Smith等分别发现活化后的T细胞培养液可以促进T细胞增殖。之后培养液中的刺激因子被纯化并被鉴定为单一的蛋白质即IL-2。

最初的体外细胞实验表明T细胞在通过TCR和CD28活化之后，可以分泌IL-2并在细胞表面表达IL-2受体(IL-2R)。IL-2和其受体的结合可以引起T细胞的增殖和使T细胞产生效应。这一模型使得IL-2成为T细胞免疫反应中起到中心作用的一个分子。不过随后的体内实验发现在敲除IL-2或其受体后，动物产生了自身免疫。随后的实验表明IL-2不仅可以激活如T细胞和NK细胞的效应细胞，还可以激活调节性T细胞，从而抑制过量的针对自身的免疫。

IL-2通过IL-2R发生作用。IL-2R包括三个亚基，IL-2Rα(即CD25)、IL-2Rβ(即CD122)和IL-2Rγ(即CD132)。三个亚基可以形成三种受体形式：高结合力受体包含所有三个亚基IL-2Rα/β/γ，中结合力受体包含IL-2Rβ/γ和低结合力受体IL-2Rα。其中，IL-2Rβ和IL-2Rγ是IL-2激活下游信号通路所必需的，当IL-2同时结合IL-2Rβ和IL-2Rγ时，两个受体亚基形成异源二聚体，磷酸化细胞内的STAT5，进入细胞核导致相应的基因转录和表达；IL-2Rα并非信号所必需，但可以促进IL-2与IL-2Rβ和IL-2Rγ的结合。IL-2Rγ在所有免疫细胞中均有表达；IL-2Rβ在CD8+T细胞、NK细胞、调节性T细胞中均有表达，而且在T细胞被激活后还会提升表达水平；IL-2Rα在调节性T细胞持续高表达，在被激活的CD8+T细胞中会有短暂表达，随即下调表达水平。

IL-2主要由活化的T细胞，尤其是CD4+辅助T细胞合成。它刺激T细胞的增殖和分化，诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成以及外周血淋巴细胞分化成细胞毒性细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞，促进T细胞表达细胞因子和细胞溶解分子，促进B细胞的增殖和分化以及通过B细胞的免疫球蛋白合成，并刺激天然杀伤(NK)细胞的生成、增殖和活化。

IL-2在体内扩充淋巴细胞群体和提高这些细胞的效应器功能的能力使得其具有抗肿瘤效果，IL-2免疫疗法成为某些转移性癌症患者的治疗选择，目前，高剂量IL-2已被批准用于治疗转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤。

已有的IL-2变体研究显示，在38、42、45、62、68中的至少四个位点具有突变的IL-2变体，对调节性T细胞的刺激作用降低(WO2012062228)；同时包含72、42、45位突变的IL-2变体，对高结合力IL-2受体的结合力降低或消除，但仍保留对中等结合力IL-2受体的结合力(CN201280017730.1)；在91、126位突变的变体，所述突变使得IL-2能与CD25(IL2Rα)结合，但不激活调节性T细胞上的IL-2R(US8906356)；至少包含一个E15、H16、Q22、D84、N88或E95突变的IL-2R，用于治疗受试者中移植物抗宿主病(US9732134)；至少包含R38W的IL-2变体能降低血管通透性，治疗实体瘤(US7371371；US7514073；US8124066；US7803361)；IL-2变体与Fc的融合蛋白治疗疾病，所述IL-2存在N88R突变(WO2016014428)；嵌合多肽，包含连接在免疫细胞表面蛋白靶向配体上的细胞因子，其中细胞因子可以为IL-2的变体(WO2017136818)等。

然而，现有技术中仍然缺少具有更高稳定性的、对调节性T细胞的激活水平降低的、不影响对免疫效应细胞激活的IL-2变体。提供这样的IL-2变体及其衍生物，以增强IL-2治疗有效性，是本领域中亟需解决的问题。

发明内容

本公开涉及具有一个或多个氨基酸突变的人白介素2变体或其衍生物。

第一方面，本公开提供IL-2变体或其衍生物，其在与IL-2受体α亚基(IL-2Rα)相结合的区域包含一个或多个氨基酸突变，所述突变是将人白细胞介素15(IL-15)上与IL-2Rα相结合的区域的一个或多个氨基酸替换到IL-2上与IL-2Rα相结合的区域。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物与IL-2Rα的亲和力降低，与IL-2Rβ和/或IL-2Rγ的亲和力不变或提高。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物与高亲和力受体(IL-2Rα/β/γ)的亲和力是降低的，但保留对中等亲和力受体(IL-2Rβ/γ)的亲和力。

一些实施方式中，上述的IL-2变体或其衍生物对调节性T细胞(Treg)的激活降低，和/或对免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的激活不受影响或增高。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物的突变发生在IL-2的第29-44位，或第41-44位，或第35-44位中的一个或多个氨基酸残基。

一些实施方式中，所述的变体是在野生型人白介素2(SEQ ID NO:2)序列的26位天冬酰胺(N)和/或30位天冬酰胺(N)和/或11位谷氨酰胺(Q)和/或132位亮氨酸(L)和/或70位亮氨酸(L)和/或82位脯氨酸(P)和/或27位甘氨酸(G)和/或78位苯丙氨酸(F)和/或29位天冬酰胺(N)和/或30位天冬酰胺(N)和/或31位酪氨酸(Y)和/或32位赖氨酸(K)和/或33位天冬酰胺(N)和/或34位脯氨酸(P)和/或35位赖氨酸(K)和/或36位亮氨酸(L)和/或37位苏氨酸(T)和/或38位精氨酸(R)和/或39位甲硫氨酸(M)和/或40位亮氨酸(L)和/或41位苏氨酸(T)和/或42位苯丙氨酸(F)和/或43位赖氨酸(K)和/或44位苯丙氨酸(F)突变和/或45位酪氨酸(Y)和/或71位天冬酰胺(N)突变为其它氨基酸。所述位点的编号是从人IL-2成熟蛋白的第2位开始计数。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物包含第26位突变为Gln(Q)和/或第30位突变为Ser(S)和/或11位突变为Cys(C)和/或132位突变为Cys(C)和/或70位突变为Cys(C)和/或82位突变为Cys(C)和/或27位突变为Cys(C)和/或78位突变为Cys(C)和/或29-44位突变为Gln-Ser-Met-His-Ile-Asp-Ala-Thr-Leu(QSMHIDATL)和/或45位突变为丙氨酸(A)和/或72位突变为甘氨酸(G)和/或71位突变为Gln(Q)。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物包含第26位突变为Gln(Q)和/或29位突变为Ser(S)和/或30位突变为Ser(S)和/或11位突变为Cys(C)和/或132位突变为Cys(C)和/或70位突变为Cys(C)和/或82位突变为Cys(C)和/或27位突变为Cys(C)和/或78位突变为Cys(C)和/或41-44位突变Asp-Ala-Thr-Leu(DATL)和/或45位突变为丙氨酸(A)和/或72位突变为甘氨酸(G)和/或71位突变为Gln(Q)。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物包含第26位突变为Gln(Q)和/或29位突变为Ser(S)和/或30位突变为Ser(S)和/或11位突变为Cys(C)和/或132位突变为Cys(C)和/或70位突变为Cys(C)和/或82位突变为Cys(C)和/或27位突变为Cys(C)和/或78位突变为Cys(C)和/或35-44位突变Met-His-Ile-Asp-Ala-Thr-Leu(MHIDATL)和/或42位突变为丙氨酸(A)和/或45位突变为丙氨酸(A)和/或72位突变为甘氨酸(G)和/或71位突变为Gln(Q)。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物包含第26位Asn突变为Gln(N26Q)和/或第30位Asn突变为Ser(N30S)和/或第11位Gln突变为Cys(Q11C)和/或第132位Leu突变为Cys(L132C)和/或第70位Leu突变为Cys(L70C)和/或第82位Pro突变为Cys(P82C)和/或第27位Gly突变为Cys(G27C)和/或第78位Phe突变为Cys(F78C)和/或29-44位Gln-Gln-Tyr-Lys-Gln-Pro-Lys-Leu-Thr-Arg-Met-Leu-Thr-Phe-Lys-Phe(NNYKNPKLTRMLTFKF)突变为Gln-Ser-Met-His-Ile-Asp-Ala-Thr-Leu(QSMHIDATL)和/或第45位酪氨酸突变为丙氨酸(Y45A)和/或第72位亮氨酸突变甘氨酸(L72G)和/或第71位Asn突变为Gln(N71Q)。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物包含第26位Asn突变为Gln(N26Q)和/或第29位Asn突变为Ser(N29S)和/或第30位Asn突变为Ser(N30S)和/或第11位Gln突变为Cys(Q11C)和/或第132位Leu突变为Cys(L132C)和/或第70位Leu突变为Cys(L70C)和/或第82位Pro突变为Cys(P82C)和/或第27位Gly突变为Cys(G27C)和/或第78位Phe突变为Cys(F78C)和/或35-44位Lys-Leu-Thr-Arg-Met-Leu-Thr-Phe-Lys-Phe(KLTRMLTFKF)突变为Met-His-Ile-Asp-Ala-Thr-Leu(MHIDATL)和/或第45位酪氨酸突变为丙氨酸(Y45A)和/或第72位亮氨酸突变甘氨酸(L72G)和/或第71位Asn突变为Gln(N71Q)。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物包含第26位Asn突变为Gln(N26Q)和/或第29位Asn突变为Ser(N29S)和/或第30位Asn突变为Ser(N30S)和/或第11位Gln突变为Cys(Q11C)和/或第132位Leu突变为Cys(L132C)和/或第70位Leu突变为Cys(L70C)和/或第82位Pro突变为Cys(P82C)和/或第27位Gly突变为Cys(G27C)和/或第78位Phe突变为Cys(F78C)和/或第41-44位Thr-Phe-Lys-Phe(TFKF)突变为Asp-Ala-Thr-Leu(DATL)和/或第45位酪氨酸突变为丙氨酸(Y45A)和/或第72位亮氨酸突变甘氨酸(L72G)和/或第71位Asn突变为Gln(N71Q)。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物包含Q11C/L132C和/或L70C/P82C和/或G27C/F78C。

一些实施方式中，上述IL-2变体或其衍生物中，当包含Q11C/L132C时，第11位的C和第132位的C之间形成二硫键；当包含L70C/P82C时，第70位的C和第82位的C之间形成二硫键；当包含G27C/F78C时，第27位的C和第78位的C之间形成二硫键。

一些实施方式中，IL-2具有一个或多个氨基酸突变，选自以下(I)-(VII)中的任一组，或其任意组合：

(I)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL，或41-44位的TFKF突变为DATL，或35-44位的KLTRMLTFKF突变为MHIDATL；

(II)N26Q；

(III)N29S；

(IV)N30S；

(V)Q11C/L132C，或L70C/P82C，或G27C/F78C；

(VI)F42A/Y45A，或F42A/L72G，或Y45A/L72G，或F42A，或Y45A，或L72G，或F42A/Y45A/L72G；

(VII)N71Q。

以上的突变组合方式，包括但不限于如下的(1)-(540)中的任一组：

(1)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL；

(2)Q11C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L132C；

(3)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L70C/P82C；

(4)G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/F78C；

(5)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A；

(6)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/N71Q；

(7)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L72G；

(8)Q11C/N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L132C；

(9)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L70C/P82C；

(10)N26Q/G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/F78C；

(11)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A；

(12)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/N71Q；

(13)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L72G；

(14)Q11C/N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L132C；

(15)Q11C/N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/N71Q/L132C；

(16)Q11C/N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L72G/L132C；

(17)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L70C/P82C；

(18)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L70C/N71Q/P82C；

(19)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L70C/L72G/P82C；

(20)N26Q/G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/F78C；

(21)N26Q/G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/N71Q/F78C；

(22)N26Q/G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L72G/F78C；

(23)Q11C/N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/N71Q/L132C；

(24)Q11C/N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L72G/L132C；

(25)Q11C/N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/N71Q/L72G/L132C；

(26)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L70C/P82C；

(27)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L70C/N71Q/P82C；

(28)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L70C/L72G/P82C；

(29)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L70C/N71Q/P82C；

(30)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L70C/L72G/P82C；

(31)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L70C/N71Q/L72G/P82C；

(32)Q11C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L132C；

(33)Q11C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/N71Q/L132C；

(34)Q11C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L72G/L132C；

(35)Q11C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/N71Q/L132C；

(36)Q11C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L72G/L132C；

(37)Q11C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/N71Q/L72G/L132C；

(38)Q11C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/N71Q/L72G/L132C；

(39)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L70C/P82C；

(40)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L70C/N71Q/P82C；

(41)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L70C/L72G/P82C；

(42)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L70C/N71Q/P82C；

(43)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L70C/L72G/P82C；

(44)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L70C/N71Q/L72G/P82C；

(45)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L70C/N71Q/L72G/P82C；

(46)G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/F78C；

(47)G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/N71Q/F78C；

(48)G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/L72G/F78C；

(49)G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/N71Q/L72G/F78C；

(50)G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/N71Q/L72G/F78C；

(51)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/N71Q；

(52)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L72G；

(53)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/N71Q/L72G；

(54)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/N71Q/L72G；

(55)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/N71Q；

(56)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L72G；

(57)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/N71Q/L72G；

(58)Q11C/N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/N71Q/L72G/L132C；

(59)N26Q/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/L70C/N71Q/L72G/P82C；

(60)N26Q/G27C/29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL/Y45A/N71Q/L72G/F78C；

第(61)-(120)组，对应于第(1)-(60)组中的“29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL”替换为“41-44位的TFKF突变为DATL”；

第(121)-(180)组，对应于第(61)-(120)组中进一步包含N29S的突变；

第(181)-(240)组，对应于第(61)-(120)组中进一步包含N30S的突变；

第(241)-(300)组，对应于第(61)-(120)组中进一步包含N29S/N30S的突变；

第(301)-(360)组，对应于第(1)-(60)组中的“29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL”替换为“35-44位的KLTRMLTFKF突变为MHIDATL”；

第(361)-(420)组，对应于第(301)-(360)组中进一步包含N29S的突变；

第(421)-(480)组，对应于第(301)-(360)组中进一步包含N30S的突变；

第(481)-(540)组，对应于第(301)-(360)组中进一步包含N29S/N30S的突变。

在一些实施方式中，所述的IL-2变体或其衍生物的氨基酸序列包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：40所示序列。所述的氨基酸序列号如下表所示：

表1.人IL-2野生型及变体序列

(注1：上述的突变位点编号按人IL-2成熟蛋白编号计算，人IL-2成熟蛋白不含有第1位的氨基酸M，因此编号从第2位的氨基酸A开始计数。其中，“/”表示在同一个IL-2变体中，所述突变是同时存在的。注2：所有突变体均含有C125A，以免形成二聚体。)

一些实施方式中，IL-2变体的衍生物包括涉及本公开IL-2变体的全长、部分蛋白或在本公开IL-2变体的基础上进一步突变获得的突变蛋白，功能性衍生物，功能性片段，生物活性肽，融合蛋白，同种型或其盐。例如，包含IL-2变体的融合蛋白，所述IL-2变体的单体或二聚物或三聚物或多聚物，所述IL-2变体的各种修饰形式(如PEG化，聚乙二醇化，糖基化，白蛋白缀合或融合，Fc融合或缀和，羟乙基化，去除O-糖基化等)，以及所述IL-2变体在各物种中的同源物。所述IL-2的修饰不会导致对治疗相关的免疫原性的不利影响。

一些实施方式中，IL-2变体或衍生物是PEG化的(可以表示为PEG-IL-2)，例如是单或双PEG化的IL-2变体或衍生物。PEG-IL-2变体或衍生物包括SC-PEG连接基。在另一些实施方式中，PEG-IL-2变体或衍生物包括甲氧基-PEG-醛(mPEG-ALD)连接基。在某些实施方式中，PEG部分的平均分子量在约5KD至约50KD，具体地5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50KD；或约5KD至约40KD，或约10KD至约30KD，或约10KD至约30KD之间，或约15KD至约20KD之间。某些具体实施方式中，mPEG-ALD连接基包括具有选自下列平均分子量的PEG分子：约5KDa、约12KDa或约20KDa。在某些实施方式中，mPEG-ALD的醛基可以是乙醛、丙醛或丁醛等。在一个实施方式中，IL-2变体或其衍生物相比于野生型IL-2或其衍生物具有延长的血清半衰期。

一些实施方式中，IL-2变体或其衍生物能引发一种或多种选自下组的细胞应答：激活的T淋巴细胞中的增殖、激活的T淋巴细胞中的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、激活的B细胞中的增殖、激活的B细胞中的分化、天然杀伤(NK)细胞中的增殖、NK细胞中的分化、通过激活的T细胞或NK细胞的细胞因子分泌、和NK/淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)抗肿瘤细胞毒性。一些实施方式中，IL-2变体或其衍生物与野生型IL-2多肽相比具有降低的诱导调节性T细胞中IL-2信号传导的能力。在一个实施方式中，IL-2变体或其衍生物相比于野生型IL-2或其衍生物诱导T细胞中更少的激活诱导的细胞死亡(AICD)。一些具体实施方式中，IL-2变体或其衍生物相比于野生型IL-2或其衍生物具有减小的体内毒性。

一些实施方式中，提供包含29-44位突变(29-44位突变为QSMHIDATL，或41-44位突变为DATL，或35-44位突变为MHIDATL)的IL-2变体，其对IL-Rα结合力降低、对IL-Rβ/γ结合力基本不变。

一些实施方式中，提供包含29-44位突变(包括29-44位突变为QSMHIDATL，或41-44位突变为DATL，或35-44位突变为MHIDATL)，同时包含N26Q、N29S、N30S、Q11C/L132C、L70C/P82C、G27C/F78C中的一个或几个突变的IL-2变体，在稳定性提高的同时对IL-Rα结合力降低、对IL-Rβ/γ结合力基本不变。

当IL-2变体与IL-2Rα结合力降低、与IL-2Rβ/γ的结合力基本不变时，使得IL-2变体相对于野生型IL-2对于调节性T细胞的激活水平降低，而对于免疫效应细胞的激活基本不变，从而增加疗效。

第二方面，本公开提供IL-2变体或其衍生物直接或通过接头间接地与非IL-2模块连接的连接体或缀和物。一些实施方式中，其为免疫缀合物，其中，非IL-2模块为抗原结合模块。一些实施方式中，所述抗原结合模块靶向肿瘤细胞上呈现的或肿瘤细胞环境中的抗原。

一些实施方式中，IL-2变体连接于至少一个非IL-2模块。一些实施方式中，IL-2变体和非IL-2模块形成融合蛋白，即IL-2变体与非IL-2模块共享肽键。一些实施方式中，IL-2变体连接于至少一个非IL-2模块，例如第一和第二非IL-2模块。一些实施方式中，非IL-2模块为抗原结合模块。一些实施方式中，IL-2变体与第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键，且第二抗原结合模块与以下共享氨基或羧基端肽键：i)IL-2变体或ii)第一抗原结合模块。一些具体的实施方式中，IL-2变体与所述第一非IL-2模块共享羧基端肽键，而与所述第二非IL-2模块共享氨基末端肽键。一些实施方式中，所述非IL-2模块是抗原结合模块。所述抗原结合模块可以是抗体或抗原结合片段，包括但不限于免疫球蛋白分子(例如IgG(例如IgG1)类免疫球蛋白分子)、抗体或其抗原结合片段。一些具体实施方式中，抗体或其抗原结合片段选自包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区的多肽复合物、Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scFv、sdAb、sdFv、纳米抗体、肽抗体peptibody、结构域抗体和多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scFv、串联三-scFv)。在IL-2变体连接于超过一个抗原结合模块例如第一和第二抗原结合模块的情况下，每个抗原结合模块可以独立地选自各种形式的抗体和抗原结合片段，例如，第一抗原结合模块可以是Fab分子，而第二抗原结合模块可以是scFv分子，或第一和第二抗原结合模块中的每一个都是scFv分子，或第一和第二抗原结合模块中的每一个是Fab分子。一些实施方式中，在IL-2变体连接于超过一个抗原结合模块例如第一和第二抗原结合模块的情况下，能独立地选择每个抗原结合模块所针对的抗原，例如，所述第一和所述第二抗原结合模块针对不同的抗原或针对同一抗原。

一些实施方式中，所述抗原结合模块结合的抗原可以选自下组：生腱蛋白C的A1域(TNC A1)、生腱蛋白C的A2域(TNC A2)、纤连蛋白的外域(Extra Domain B)(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑素瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。一些实施方式中，肿瘤抗原包括但不限于MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环素(cyclophilin)b、结肠直肠有关的抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-zeta链、肿瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白(catenin)、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤样结肠息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein，APC)、胞衬蛋白(fodrin)、连接蛋白(Connexin)37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物如人乳头状瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的Smad家族、lmp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、以及c-erbB-2。一些实施方式中，病毒抗原的非限制性例子包括流感病毒血凝素、Epstein-Barr病毒LMP-1、丙肝病毒E2糖蛋白、HIV gp160和HIV gp120。一些实施方式中，ECM抗原的非限制性例子包括多配体聚糖(syndecan)、类肝素酶(heparanase)、整联蛋白、骨桥蛋白(osteopontin)、link、钙粘蛋白、层粘连蛋白、EGF型层粘连蛋白、凝集素、纤连蛋白、notch、生腱蛋白和matrixin。

第三方面，本公开提供药物组合物，其含有上述IL-2变体或其衍生物或免疫缀合物，任选地可包含药学上可接受的稀释剂、载体或助剂。所述药物组合物可以为冻干制剂或可注射溶液。

在一些具体实施方案中，药物组合物单位计量中可含有0.01至99重量％的IL-2变体或其衍生物或免疫缀合物，或药物组合物单位剂量中含有的IL-2变体或其衍生物或免疫缀合物的量为0.1-2000mg(例如1-1000mg)。

第四方面，本公开提供编码上述IL-2变体或其衍生物的核酸序列和氨基酸序列。所述核酸序列可以包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39所示的核酸序列。所述氨基酸序列可以包含SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：40所示的氨基酸序列。

第五方面，本公开提供含有上述IL-2变体或其衍生物的核酸序列的表达载体。所述载体可以是真核表达载体、原核表达载体、病毒载体。

第六方面，本公开提供表达上述载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核或真核细胞。一些实施方式中，宿主细胞包括原核微生物(如大肠杆菌)或各种真核生物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚胎肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)、昆虫细胞等)。一些实施方案中，可以使用表达糖基化多肽的宿主细胞，由多细胞生物体(包括例如无脊椎动物和脊椎动物)衍生，例如植物和昆虫细胞。脊椎动物细胞也可以用作宿主细胞，例如，悬浮生长的哺乳动物细胞系、猴肾CV1系(COS-7)、人胚胎肾系(293或293T细胞)、幼仑鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather等，Annals N.Y.Acad Sci383，44-68(1982))、MRC5细胞和FS4细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0，以及在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。

第七方面，本公开提供IL-2变体或其衍生物、缀合物或其药物组合物用于制备治疗增生性疾病、免疫性疾病、调节T细胞介导的免疫应答、刺激个体免疫系统的药物中的用途。所述增生性疾病可以是肿瘤或癌(例如转移性肿瘤或癌)，可以是实体瘤(例如转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤)。

一些实施方式中，本公开的IL-2变体或其衍生物、免疫缀合物可用于治疗刺激宿主的免疫系统以获益的疾病情形，特别是期望增强细胞免疫应答的状况，可以包括宿主免疫应答不足或缺陷性的疾病情形。一些实施方式中，施用IL-2变体或其衍生物、免疫缀合物的疾病情形包括细胞免疫应答是特异性免疫的关键机制的肿瘤或感染，例如癌症(例如肾细胞癌或黑素瘤)、免疫缺陷(例如HIV阳性患者中、免疫受抑制的患者)、慢性感染等。一些实施方式中，增强细胞免疫应答可以包括以下任一种或多种：免疫功能的一般升高、T细胞功能升高、B细胞功能升高、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达提高、T细胞应答性提高、天然杀伤细胞活性或淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞活性升高等。

一些实施方式中，本公开的IL-2变体或其衍生物、免疫缀合物用于治疗的疾病是增殖性病症，例如癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头和颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血液癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。其它可使用本公开的IL-2变体或其衍生物治疗的细胞增殖病症包括但不限于位于以下处的新生物：腹部、骨、乳房、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部、和泌尿生殖系统。还包括癌症前期状况或损伤以及癌症转移。在某些实施方式中，癌症选自下组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头和颈癌。类似地，其它细胞增殖病症也可用本公开的IL-2变体或其衍生物治疗，包括但不限于：高丙种球蛋白血症(hypergammaglobulinemia)、淋巴增生性病症、病变蛋白血症(paraproteinemias)、紫癜(purpura)、结节病、塞扎里综合征(Sezary Syndrome)、Waldenstron's巨球蛋白血症、高歇氏病(Gaucher's Disease)、组织细胞增多病(histiocytosis)以及任何其它位于上文所列的器官系统中的瘤形成(neoplasia)外的细胞增殖疾病。在另一些实施方式中，所述疾病涉及自身免疫性、移植排斥、外伤后免疫应答和传染性疾病(例如HIV)。

一些实施方式中，提供其中每日至少2次、每日至少1次、每48小时至少1次、每72小时至少一次、每周至少一次、每2周至少一次、每个月至少一次、每2个月至少一次或每3个月至少一次向受试者施用IL-2的方法。可通过任何有效途径施用IL-2。在一些实施方式中，通过肠胃外注射包括皮下注射施用IL-2。具体实施方式涉及包含药学上可接受的量的IL-2(例如，治疗有效量)(包括上述的那些试剂)连同一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂(例如，等渗注射溶液)的药物组合物。所述药物组合物通常为适于人施用的药物组合物。此外，在一些实施方式中，所述药物组合物包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。一些实施方式含有上述药物组合物之一和任选地一种或多种另外的组分的无菌容器。

第八方面，本公开提供制备IL-2变体或衍生物的方法，包括向野生型人IL-2中引入前述IL-2变体或其衍生物的突变，或使用前述核酸序列，或使用前述表达载体，或使用前述宿主细胞。

附图说明

图1：通过ELISA实验检测的野生型IL-2及其变体IL-2-01、IL-2-02、IL-2-03、IL-2-04、IL-2-05、IL-2-06、IL-2-07、IL-2-08、IL-2-09、IL-2-13与IL-2Rα的结合力测定结果。

图2：野生型IL-2及其变体IL-2-01、IL-2-02、IL-2-07、IL-2-08、IL-2-09对小鼠T淋巴细胞CTLL2的STAT5磷酸化活性影响测定结果。

图3A-图3F：野生型IL-2及其变体的热稳定性测定结果，A-F分别是IL-2(WT)(图3A)、IL-2-01(图3B)、IL-2-02(图3C)、IL-2-03(图3D)、IL-2-04(图3E)、IL-2-05(图3F)的热稳定性测定结果。

图4：变体IL2-06不结合IL-15Rα的测定结果。

发明详述

为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本公开中的它处另有明确定义，否则本公开使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本文中所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

术语

“白介素-2”或“IL-2”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然的IL-2。该术语涵盖未加工的IL-2以及源自细胞中的加工的任何形式的IL-2。该术语还涵盖天然存在的IL-2变体，例如剪接变体或等位变体。例示性野生型人IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。未加工的人IL-2额外包含N端20个氨基酸的信号肽(如WO2012107417中的SEQ ID NO：272所示)，所述信号肽在成熟的IL-2分子中是缺乏的。

“氨基酸突变”包括氨基酸取代、缺失、插入、修饰及其任意组合，以实现最终构建体，使得最终构建体拥有期望的特性，例如增强的稳定性。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。末端缺失的例子是在全长人IL-2的位置1缺失丙氨酸残基。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。为了改变例如IL-2多肽的结合特性，可以将非保守性的氨基酸取代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。优选的氨基酸取代包括用亲水性氨基酸替换疏水性氨基酸。氨基酸取代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变，包括定点诱变、PCR、基因合成、化学修饰等方法。

“野生型IL-2”是在其它方面与变体IL-2多肽相同，只是在变体IL-2多肽的每个氨基酸位置具有野生型氨基酸的IL-2形式。例如，如果IL-2变体是全长IL-2(即未与任何其它分子融合或缀合的IL-2)，那么此变体的野生型形式是全长天然的IL-2。如果IL-2变体是IL-2与在IL-2下游编码的另一种多肽(例如抗体链)之间的融合物，那么此IL-2变体的野生型形式是具有与相同下游多肽融合的野生型氨基酸序列的IL-2。此外，如果IL-2变体是IL-2的截短形式(在IL-2的非截短部分内的经突变或修饰的序列)，那么此IL-2变体的野生型形式是具有野生型序列的类似截短的IL-2。为了对各种形式的IL-2变体与相应的IL-2野生型形式比较IL-2受体结合亲和力或生物学活性，术语“野生型”涵盖相比于天然存在的、天然的IL-2，包含一处或多处不影响对IL-2受体结合的氨基酸突变的IL-2形式，例如在与人IL-2的残基125对应的位置处的半胱氨酸取代为丙氨酸C125A。在一些实施方案中，野生型IL-2包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

“衍生物”旨在被广义地解释，包括任意IL-2相关的产品。包括但不限于人和非人的IL-2同系物、片段或截短体、融合蛋白(如与信号肽融合或其他活性、非活性成份融合，活性成份例如抗体或其抗原结合片段)、修饰形式(如PEG化、糖基化、白蛋白缀合/融合、Fc缀和/融合、羟乙基化等)、和保守修饰的蛋白等。

“CD25”或“IL-2受体的α亚基”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD25，包括“全长”的未加工的CD25以及源自细胞中的加工的任何形式的CD25，还包括天然存在的CD25变体，例如剪接变体或等位变体。在某些实施方案中，CD25是人CD25，例示性序列如SEQ ID NO：37所示。

“高亲和力IL-2受体”指IL-2受体的异型三聚体形式，其由受体γ亚基(也称为通用细胞因子受体γ亚基、γc或CD132)、受体β亚基(也称为CD122或p70)和受体α亚基(也称为CD25或p55)组成。比较而言，“中等亲和力IL-2受体”指仅包含γ亚基和β亚基而无α亚基的IL-2受体(参见例如Olejniczak和Kasprzak，MedSci Monit14，RA179-189(2008))。

“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，本文的“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如受体和配体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(K_D)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K_解离和K_结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域常规的方法来测量，包括本文中所描述的方法。

“调节性T细胞”或“T_调节细胞”意指一种能抑制其它T细胞的应答的特殊化CD4+T细胞类型。T调节细胞的特征在于表达IL-2受体的α亚基(CD25)和转录因子叉头框P3(FOXP3)(Sakaguchi,AnnuRevImmunol22,531-62(2004))，并在诱导和维持对抗原(包括那些由肿瘤表达的抗原)的外周自体耐受性中起着关键作用。调节性T细胞需要IL-2来实现其功能和发育以及其抑制性特征的诱导。

“效应细胞”指介导IL-2的细胞毒性效果的淋巴细胞群体。效应细胞包括效应T细胞如CD8+细胞毒性T细胞、NK细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和巨噬细胞/单核细胞。

“抗原结合模块”指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。在一些实施方式中，抗原结合模块能指导其附接的实体(例如细胞因子或第二抗原结合模块)到达靶位点，例如到达特定类型的肿瘤细胞或携有抗原决定簇的肿瘤间质。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。优选地抗原结合模块包括抗体的抗原结合域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方式中，抗原结合模块可以包含抗体恒定区，如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任意一种：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括任意以下2种同种型中的任意一种：κ和λ。

“免疫缀合物”指包含至少一个IL-2模块和至少一个抗原结合模块的多肽分子。在某些实施方式中，所述免疫缀合物包含至少一个IL-2模块和至少两个抗原结合模块。依照本公开的具体的免疫缀合物基本由通过一种或多种接头序列连接的一个IL-2模块和两个抗原结合模块组成。可以通过多种相互作用并以多种构造将抗原结合模块与IL-2模块连接。

“特异性结合”意指此结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特异性抗原决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等，Glyco J17，323-329(2000))，以及传统的结合测定法来测量(Heeley，Endocr Res28，217-229(2002))。

“抗体”在本文中以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，只要它们展现出期望的抗原结合活性，所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗原结合片段。抗体可以包括鼠源抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、骆驼抗体。例示性的，抗体可以是免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。

“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，单链Fv(即sFv)，纳米抗体(即VHH)，VH/VL结构域。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗原结合片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。

“保守修饰”适用于氨基酸和核苷酸序列。对于特定的核苷酸序列，保守改性是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核苷酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的核苷酸序列。对于氨基酸序列，“保守修饰”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecμlar Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。

“PEG化”是指至少一个PEG分子与另一个分子(例如治疗性蛋白)连接。例如，批准Adagen(腺苷脱氨酶的PEG化制剂)用于治疗严重联合免疫缺陷病。已经显示，聚乙二醇的连接可以防止蛋白水解作用(参见，例如，Sada等人，(1991)J.Fermentation Bioengineering71：137-139)。在最常见形式中，PEG是在一端与羟基连接的直链或支链聚醚，并且具有下列常规结构：HO-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-OH。为了使PEG与分子(多肽、多糖、多核苷酸和小的有机分子)偶联，可以通过制备一些或两个末端具有官能团的PEG的衍生物来活化PEG。蛋白的PEG缀合的常见途径是用官能团活化PEG，该官能团适合与赖氨酸和N-末端氨基酸基团的反应。尤其是，参与缀合的常见反应基团是赖氨酸的α或ε氨基。聚乙二醇化连接基与蛋白的反应可导致PEG部分主要在下列位点处的连接：蛋白的N-末端的α氨基、赖氨酸残基侧链上的ε氨基、或组氨酸残基侧链上的咪唑基。由于大部分重组蛋白质具有单个α和许多ε氨基和咪唑基，可以根据连接基团的化学性质，产生许多位置异构体。

“载体”、“表达载体”与“表达构建体”同义并指用于导入与其可操作联合的特定基因并指导其在靶细胞中表达的DNA分子，包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到其所导入的宿主细胞的基因组中的载体。本文的表达载体包含表达盒，允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内，就通过细胞转录和/或翻译体系生成基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。

“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有与原始转化细胞中所筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变后代。

“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“施用”、“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予受试者内用或外用治疗剂，诸如包含本公开的任一种IL-2变体及其衍生物或包含所述变体或衍生物的组合物，所述受试者确诊患有、疑似患有、易感于一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床不可测量的程度。

有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。

“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定受试者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

本公开中，“IL-2”可以与“IL2”互换使用。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。

实施例1:野生型IL-2及变体的构建和表达

1.基因合成及重组表达载体构建

野生型IL-2核酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

合成的野生型IL-2核酸序列如SEQ ID NO：1所示，在5’端加了一个Nde I酶切位点，在3’端添加了一个BamH I酶切位点。核苷酸序列如下：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTTGTCAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：1

斜体部分分别是NdeI和BamHI酶切位点。

对应的蛋白序列如下所示：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

SEQ ID NO：2

本公开所使用的表达载体是购自Novagen公司的大肠杆菌表达载体pET-9a(Novagen,Cat.69431-3)。IL-2核酸序列合成后，连接至pET-9a的Nde I和BamH I两个酶切位点，得到野生型IL-2的表达载体。

2.在野生型IL-2氨基酸序列中引入本公开中所述的氨基酸突变。

在一种变体中，26位的天冬酰胺置换成谷氨酰胺，将其对应的核苷酸序列76-78位处的密码子AAC变为CAG。突变后的核酸序列如下：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATCAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：3

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-01变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：4

在一种变体中，将30位的天冬酰胺置换成丝氨酸，将其对应的核苷酸序列88-90位处的密码子AAC变为AGC。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAACAGCTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：5

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-02变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINSYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：6

在一种变体中，将11位的谷氨酰胺置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列31-33位处的密码子CAG变为TGT；将132位的亮氨酸置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列394-396位处的密码子CTG变为TGT。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCTGTCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCTGTACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：7

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-03变体序列：

MAPTSSSTKKTCLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTCT

SEQ ID NO：8

在一种变体中，将70位的亮氨酸置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列208-210位处的密码子CTG变为TGT；将82位的脯氨酸置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列244-246位处的密码子CCG变为TGT。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTTGTAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTTGTCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：9

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-04变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVCNLAQSKNFHLRCRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：10

在一种变体中，将27位的甘氨酸置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列79-81位处的密码子GGC变为TGT；将78位的苯丙氨酸置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列232-234位处的密码子TTT变为TGT。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACTGTATCAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTGTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：11

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-05变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNCINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNCHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：12

在一种变体中，将29-44位的肽段置换为QSMHIDATL，将其对应的核苷酸序列85-132位处的密码子AACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTC变为CAGAGCATGCATATTGATGCAACCCTG。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCCAGAGCATGCATATTGATGCAACCCTGTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：13

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-06变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGIQSMHIDATLYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：14

在一种变体中，将42位的苯丙氨酸置换成丙氨酸，将其对应的核苷酸序列124-126位处的密码子TTC变为GCA；将45位的酪氨酸置换成丙氨酸；将其对应的核苷酸序列133-135位处的密码子TAC变为GCA。突变后的核酸序列如下所示：CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAATTCGCAATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：15

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-07变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：16

在一种变体中，将42位的苯丙氨酸置换成丙氨酸，将其对应的核苷酸序列124-126位处的密码子TTC变为GCA；将72位的亮氨酸置换成甘氨酸；将其对应的核苷酸序列214-216位处的密码子CTG变为GGC。突变后的核酸序列如下所示：CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：17

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-08变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：18

在一种变体中，45位的酪氨酸置换成丙氨酸，将其对应的核苷酸序列133-135位处的密码子TAC变为GCA；将72位的亮氨酸置换成甘氨酸，将其对应的核苷酸序列214-216位处的密码子CTG变为GGC。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTCGCAATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：19

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-09变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：20

在一种变体中，26位的天冬酰胺置换成谷氨酰胺，将其对应的核苷酸序列76-78位处的密码子AAC变为CAG；将30位的天冬酰胺置换成丝氨酸，将其对应的核苷酸序列88-90位处的密码子AAC变为AGC；将42位的苯丙氨酸置换成丙氨酸，将其对应的核苷酸序列124-126位处的密码子TTC变为GCA；将72位的亮氨酸置换成甘氨酸，将其对应的核苷酸序列214-216位处的密码子CTG变为GGC。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATCAACAGCTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：21

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-10变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGINSYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：22

在一种变体中，将11位的谷氨酰胺置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列31-33位处的密码子CAG变为TGT；将26位的天冬酰胺置换成谷氨酰胺，将其对应的核苷酸序列76-78位处的密码子AAC变为CAG；将30位的天冬酰胺置换成丝氨酸，将其对应的核苷酸序列88-90位处的密码子AAC变为AGC；将42位的苯丙氨酸置换成丙氨酸，将其对应的核苷酸序列124-126位处的密码子TTC变为GCA；将72位的亮氨酸置换成甘氨酸，将其对应的核苷酸序列214-216位处的密码子CTG变为GGC；将132位的亮氨酸置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列394-396位处的密码子CTG变为TGT。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCTGTCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATCAACAGCTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCTGTACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：23

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-11变体序列：

MAPTSSSTKKTCLQLEHLLLDLQMILQGINSYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTCT

SEQ ID NO：24

在一种变体中，26位的天冬酰胺置换成谷氨酰胺，将其对应的核苷酸序列76-78位处的密码子AAC变为CAG；将30位的天冬酰胺置换成丝氨酸，将其对应的核苷酸序列88-90位处的密码子AAC变为AGC；将42位的苯丙氨酸置换成丙氨酸，将其对应的核苷酸序列124-126位处的密码子TTC变为GCA；将70位的亮氨酸置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列208-210位处的密码子CTG变为TGT；将72位的亮氨酸置换成甘氨酸，将其对应的核苷酸序列214-216位处的密码子CTG变为GGC；将82位的脯氨酸置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列244-246位处的密码子CCG变为TGT。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATCAACAGCTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTTGTAATGGCGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTTGTCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：25

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-12变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGINSYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVCNGAQSKNFHLRCRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：26

在一种变体中，26位的天冬酰胺置换成谷氨酰胺，将其对应的核苷酸序列76-78位处的密码子AAC变为CAG；将27位的甘氨酸置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列79-81位处的密码子GGC变为TGT；将30位的天冬酰胺置换成丝氨酸，将其对应的核苷酸序列88-90位处的密码子AAC变为AGC；将42位的苯丙氨酸置换成丙氨酸，将其对应的核苷酸序列124-126位处的密码子TTC变为GCA；将72位的亮氨酸置换成甘氨酸，将其对应的核苷酸序列214-216位处的密码子CTG变为GGC；将78位的苯丙氨酸置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列232-234位处的密码子TTT变为TGT。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGTGTATCAACAGCTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGCACAGAGCAAAAACTGTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：27

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-13变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQCINSYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNCHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：28

在一种变体中，29位的天冬酰胺置换成丝氨酸，将其对应的核苷酸序列85-87位处的密码子AAC变为AGC；将42位的苯丙氨酸置换成丙氨酸，将其对应的核苷酸序列124-126位处的密码子TTC变为GCA；将72位的亮氨酸置换成甘氨酸，将其对应的核苷酸序列214-216位处的密码子CTG变为GGC。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAGCAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：29

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-14变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：30

在一种变体中，26位的天冬酰胺置换成谷氨酰胺，将其对应的核苷酸序列76-78位处的密码子AAC变为CAG；29位的天冬酰胺置换成丝氨酸，将其对应的核苷酸序列85-87位处的密码子AAC变为AGC；将42位的苯丙氨酸置换成丙氨酸，将其对应的核苷酸序列124-126位处的密码子TTC变为GCA；将72位的亮氨酸置换成甘氨酸，将其对应的核苷酸序列214-216位处的密码子CTG变为GGC。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATCAGCAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATGGCGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：31

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-21变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGISNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：32

在一种变体中，26位的天冬酰胺置换成谷氨酰胺，将其对应的核苷酸序列76-78位处的密码子AAC变为CAG；29位的天冬酰胺置换成丝氨酸，将其对应的核苷酸序列85-87位处的密码子AAC变为AGC；将42位的苯丙氨酸置换成丙氨酸，将其对应的核苷酸序列124-126位处的密码子TTC变为GCA；将71位的天冬酰胺置换成谷氨酰胺，将其对应的核苷酸序列211-213位处的密码子AAT变为CAG。将72位的亮氨酸置换成甘氨酸，将其对应的核苷酸序列214-216位处的密码子CTG变为GGC。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGCAGGGCATCAGCAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGCAAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGCAGGGCGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：33

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-22变体序列：

MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILQGISNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLQGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：34

在一种变体中，11位的谷氨酰胺置换成半胱氨酸，将其对应的核苷酸序列31-33位处的密码子CAG变为TGT；29-44位的肽段置换为QSMHIDATL，将其对应的核苷酸序列85-132位处的密码子AACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTC变为CAGAGCATGCATATTGATGCAACCCTG。将132位的亮氨酸置换成半胱氨酸；将其对应的核苷酸序列394-396位处的密码子CTG变为TGT。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCTGTCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCCAGAGCATGCATATTGATGCAACCCTGTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCTGTACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：35

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL-2-23变体序列：

MAPTSSSTKKTCLQLEHLLLDLQMILNGIQSMHIDATLYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTCT

SEQ ID NO：36

在一种变体中，41-44位的肽段置换为DATL；将其对应的核苷酸序列120-132位处的密码子AACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTC变为GATGCAACCCTG。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCAACAACTACAAAAATCCGAAACTGACCCGTATGCTGGATGCAACCCTGTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：37

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL2-G1变体序列：

MAPASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLDATLYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：38

在一种变体中，35-44位的肽段置换为MHIDATL；将其对应的核苷酸序列85-132位处的密码子AAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAATTC变为ATGCATATTGATGCAACCCTG。突变后的核酸序列如下所示：

CATATGGCACCGACCAGCAGCAGCACCAAAAAAACCCAGCTGCAACTGGAACATCTGCTGTTAGATCTGCAAATGATTCTGAACGGCATCATGCATATTGATGCAACCCTGTACATGCCGAAAAAAGCAACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGTCTGGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAGGTTCTGAATCTGGCACAGAGCAAAAACTTTCATCTGCGTCCGCGTGATCTGATTAGCAATATTAACGTTATTGTGCTGGAACTGAAAGGTAGCGAAACCACCTTTATGTGTGAATATGCCGATGAAACCGCAACCATTGTGGAATTTCTGAATCGTTGGATTACCTTTGCACAGAGCATTATTAGCACCCTGACCTAATGAGGATCC

SEQ ID NO：39

其对应的氨基酸序列如下所示，即IL2-G2变体序列：

MAPASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPMHIDATLYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

SEQ ID NO：40

上述变体的基因序列经合成后，连接至pET-9a的Nde I和BamH I两个酶切位点，得到IL-2各变体的重组表达载体。

3.野生型IL-2及变体的重组表达与制备

将上述重组表达载体转化到从Novagen公司购买的BL21(DE3)菌株(Novagen，Cat.69450-3)，得到野生型IL-2及变体的重组菌，将重组菌涂布在含Kan抗性的LB平板进行筛选。

挑取Kan筛选后的单菌落于10mL LB培养基，37℃，220rpm培养至OD₆₀₀为1.2±0.2，加入50％甘油至终浓度为10％，分装至冻存管中(1mL/管)，保存于-80℃。

取冻存的甘油管1支，于37℃水浴中复苏，接种至1L LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD₆₀₀为0.6～1.0，加入1M IPTG使其终浓度为1mM，37℃，220rpm诱导培养4h。诱导结束后，收集菌体。

菌体经破碎，包涵体变性、复性、纯化获得目的蛋白。

实施例2:野生型IL-2及变体与白介素2受体alpha(IL-2Rα)的结合力测定

使用ELISA实验检测实施例1中制备获得的IL-2及其突变体与IL-2Rα的结合特性。包被带his标签的IL-2Rα重组蛋白，加入IL-2后，通过加入HRP偶联的抗IL-2多克隆抗体和HRP底物TMB检测抗体与抗原结合的活性。

用2μg/mL带his标签的IL-2Rα重组蛋白(SinoBiological，Cat#10165-H08H)包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗涤震荡10秒以保证充分清洗。加入200μl/孔封闭液室温孵育2小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗涤震荡10秒以保证充分清洗。每孔加100μl用稀释液稀释好的IL-2及其突变体。室温孵育1小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl用稀释液按0.1μg/mL的HRP标记的抗IL-2多克隆抗体(SinoBiological,Cat#11848-T16)。室温孵育1小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl TMB，避光反应15分钟。加入50μl每孔的0.16M硫酸。Thermo MultiSkanFc酶标仪读取450nm OD值，计算IL-2及其突变体与IL-2Rα的结合EC50值。

实施例1中突变体与IL-2Rα的ELISA结合数据见图1和表2。结果表明，第一类突变，即N26Q,N30S,Q11C/L132C,L70C/P82C,G27C/F78C，N29S突变并不影响IL-2与IL-2Rα的结合。而第二类突变，即F42A/Y45A、F42A/L72G、Y45A/L72G、29-44突变为QSMHIDATL、41-44位的TFKF突变为DATL、35-44位的KLTRMLTFKF突变为MHIDATL，则极大的降低了IL-2与IL-2Rα的结合，在实验条件下几乎观测不到二者的结合。将两类突变进行组合，由于含有第二类突变，也降低了IL-2与IL-2Rα的结合。

表2.IL-2野生型及其变体与低亲合力受体IL-2Rα的ELISA结合EC50

(注：N.A.,not available,由于这些突变体与IL-2Rα的结合力较低，在实验所用浓度范围内无法通过拟合数据得到EC50。)

实施例3:野生型IL-2及变体与IL-2受体beta/gamma(IL-2Rβ/γ)的结合力测定Biacore实验被用来检测实施例1中IL-2及其突变体与IL-2Rβ/γ的结合力。

首先，IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基(SEQ ID NO：41和42)被分别克隆、融合到Fc hole和Fc knob上，用于制备工具分子IL-2Rβ/γ-Fc异源二聚体。IL-2Rβ-Fc-hole和IL-2Rγ-Fc-knob被同时转染到HEK293细胞中。异源二聚体先后用Protein A和分子筛Superdex 200纯化。

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARCAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTGAQDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：41

MLKPSLPFTSLLFLQLPLLGVGLNTTILTPNGNEDTTADFFLTTMPTDSLSVSTLPLPEVQCFVFNVEYMNCTWNSSSEPQPTNLTLHYWYKNSDNDKVQKCSHYLFSEEITSGCQLQKKEIHLYQTFVVQLQDPREPRRQATQMLKLQNLVIPWAPENLTLHKLSESQLELNWNNRFLNHCLEHLVQYRTDWDHSWTEQSVDYRHKFSLPSVDGQKRYTFRVRSRFNPLCGSAQHWSEWSHPIHWGSNTSKENPFLFALEAGAQDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：42

用Biacore仪器(Biacore T200，GE)的Protein A传感芯片(GE,Cat#29127556)捕获IL-2Rβ/γ-Fc，其中IL-2Rβ/γ-Fc用1×HBS-EP稀释至1μg/mL，以10μL/min的流速持续30秒。然后于芯片表面以30μL/min的流速流经一系列浓度梯度下的IL-2及其突变体，结合持续120秒，解离持续360秒，利用Biacore仪器(Biacore X100，GE)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用10mM Gly-HCl pH 1.5将芯片洗净再生。实验得到的数据以1:1binding模型进行拟合，得出实施例1中突变体与中亲合力受体IL-2Rβ/γ的结合力数值，见表3。

结果表明，N26Q,N30S,Q11C/L132C,L70C/P82C,G27C/F78C，F42A/Y45A,F42A/L72G,Y45A/L72G,N26Q/N30S/F42A/L72G，29-44位突变为QSMHIDATL，包括突变之间的组合，均对IL-2与IL-2Rβ/γ的结合影响不大。41-44位的TFKF突变为DATL、35-44位的KLTRMLTFKF突变为MHIDATL与29-44位突变为QSMHIDATL一样，对IL-2与IL-2Rβ/γ的结合影响不大，结果此处未予显示。

表3.IL-2野生型及其变体与中亲合力受体IL-2Rβ/γ的亲合力

名称	K<sub>on</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)	K<sub>off</sub>(s<sup>-1</sup>)	K<sub>d</sub>(nM)
				IL-2(WT)	9.36×10<sup>5</sup>	2.40×10<sup>-4</sup>	0.257
IL-2-01	9.02×10<sup>5</sup>	2.20×10<sup>-4</sup>	0.244
				IL-2-02	1.03×10<sup>6</sup>	2.12×10<sup>-4</sup>	0.206
IL-2-03	5.33×10<sup>5</sup>	1.35×10<sup>-4</sup>	0.253
				IL-2-04	4.98×10<sup>5</sup>	1.50×10<sup>-4</sup>	0.302
IL-2-05	3.36×10<sup>5</sup>	9.68×10<sup>-5</sup>	0.288
				IL-2-06	8.56×10<sup>5</sup>	4.36×10<sup>-4</sup>	0.509
IL-2-07	8.22×10<sup>5</sup>	2.15×10<sup>-4</sup>	0.261
				IL-2-08	9.20×10<sup>5</sup>	2.06×10<sup>-4</sup>	0.224
IL-2-09	6.46×10<sup>5</sup>	2.22×10<sup>-4</sup>	0.344
				IL-2-10	1.62×10<sup>6</sup>	4.30×10<sup>-4</sup>	0.266

实施例4:野生型IL-2及变体的CTLL2细胞增殖活性测定

依据在不同白介素-2(IL-2)的浓度下，其细胞依赖株CTLL-2增殖速率，检测IL-2的生物学活性。

完全培养液：RPMI 1640+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+10％胎牛血清+10％T-STIM culture supplement with concanavalin-A(含有IL-2)；基础培养基：RPMI 1640+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+10％胎牛血清。

CTLL-2细胞增殖实验：CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5％二氧化碳条件下培养至每毫升2.0×10⁵个细胞的密度，对细胞进行传代，3-4天后离心收集CTLL-2细胞，用PBS洗涤3次，重悬于基础培养液中配制成每毫升含2.0×10⁵个细胞的细胞悬液，置于96孔板中，每孔90微升细胞。加入10微升10×相应浓度的用基础培养液调配的IL-2浓缩液，把细胞置于37℃、5％二氧化碳条件下。培养24小时后，每孔加入裂解液100微升CELLTITER-Glo试剂(Promega)，混匀细胞板中的液体，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行拟合，并按下式进行计算结果：供试品相对生物学活性(％)＝对照品EC₅₀/供试品EC₅₀(EC₅₀：半最大效应浓度)。

结果表明，第一类突变，即N26Q,N30S,Q11C/L132C,L70C/P82C,G27C/F78C，N29S突变并不影响甚至略有增强IL-2的CTLL2细胞增殖活性；而第二类突变，即F42A/Y45A、F42A/L72G、Y45A/L72G、29-44突变为QSMHIDATL、41-44位的TFKF突变为DATL、35-44位的KLTRMLTFKF突变为MHIDATL，则由于降低了IL-2与IL-2Rα的结合，这些突变体也降低了IL-2的CTLL2细胞增殖活性。

实施例1中突变体的活性数据见表4。

表4.IL-2野生型及其变体的CTLL2-细胞增殖活性

实施例5:野生型IL-2及变体的CTLL2细胞STAT5磷酸化活性测定

依据在不同IL-2的浓度下，其细胞依赖株CTLL-2中STAT5磷酸化水平，检测IL-2的生物学活性。

完全培养液：RPMI 1640+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+10％胎牛血清+10％T-STIM culture supplement with concanavalin-A(含有IL-2)；基础培养基：RPMI 1640+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+10％胎牛血清。

CTLL-2细胞STAT5磷酸化实验：CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5％二氧化碳条件下培养至每毫升2.0×10⁵个细胞的密度，用PBSA(PBS，pH7.2，1％BSA)洗涤1次，调整密度至每毫升含1.0×10⁶个细胞，按每管500μL的体积分装至流式管中，加入相应浓度的用基础培养液调配的IL-2浓缩液，室温孵育20分钟后，立即加入多聚甲醛，至终浓度1.5％，涡旋混匀，室温孵育10分钟。加入1毫升PBS，4℃、1400rpm离心5分钟，去除多聚甲醛。重悬细胞，加入1毫升4℃预冷的100％甲醇，涡旋混匀，4℃孵育20分钟。加入3毫升PBSA缓冲液，4℃、1400rpm离心5分钟，清洗细胞2次。加入偶联了Alexa Fluor 647的抗STAT5-pY694抗体(BD,Cat#612599)室温避光孵育30分钟。加入3mL PBSA清洗两次，用流式细胞仪进行检测。数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行拟合，按下式进行计算结果：供试品相对生物学活性(％)＝对照品EC₅₀/供试品EC₅₀(EC₅₀：半最大效应浓度)

结果表明，N26Q,N30S突变并不影响甚至略有增强IL-2的CTLL2细胞STAT5磷酸化活性，而F42A/Y45A,F42A/L72G,Y45A/L72G,由于降低了IL-2与IL-2Rα的结合，这些突变体也降低了IL-2的CTLL2细胞STAT5磷酸化活性。

实施例1中突变体的CTLL2细胞STAT5磷酸化活性数据见图2和表5。

表5.IL-2野生型及其变体的CTLL2-细胞STAT5磷酸化活性

实施例6:野生型IL-2及变体的稳定性研究

用Uncle(Unchained labs)仪器对约1mg/mL IL-2样品(缓冲体系为10mM醋酸-醋酸钠缓冲液,pH4.5，10％海藻糖)进行稳定性研究。样品的温度以0.3℃/分钟的速度从25℃升至95℃，同时以266nm光激发样品中的色氨酸，并观测样品在300-400nm下的发射光(emission)。按照下面的公式计算熔解温度(T_m)，其中λ为波长(300-400nm)，I(λ)为该波长下发射光强，BCM为barycentric mean，即以光强加权的波长。

随着温度的增加，样品的BCM参数发生变化，反映了蛋白质构象的变化。野生型IL-2存在两个熔解温度，说明IL-2在完全去折叠前经历了两个阶段，第一个去折叠阶段需要的能量相对于第二阶段较低。N26Q和N30S突变虽然基本不影响第一个熔解温度，但却使得第二个熔解温度显著升高；而IL-2-03,IL-2-04,IL-2-05则不存在第一个熔解温度，第二个熔解温度相比野生型也有显著升高。实验结果说明N26Q,N30S,Q11C/L132C,L70C/P82C,G27C/F78C突变提高了IL-2的热稳定性。

IL-2突变体的热稳定性实验结果见图3A-图3F和表6。

表6.IL-2野生型及其变体的溶解温度

名称	T<sub>m1</sub>(℃)	T<sub>m2</sub>(℃)
			IL-2	61.5	77.5
IL-2-01	60.8	90.5
			IL-2-02	61.8	89.1
IL-2-03	不存在	92.1
			IL-2-04	不存在	91.8
IL-2-05	不存在	92.5
			IL-2-06	未测定	未测定

实施例6:突变体IL2-06与IL-15受体α的结合力测定

ELISA实验被用来检测实施例1中白介素2突变体IL2-6与IL-15Rα的结合特性。

首先，在IL2-06上加入His标签(SEQ ID NO：31)。在HEK293细胞中进行瞬时表达，并通过Ni-NTA亲和力柱和Superdex 200分子筛柱进行纯化。

用2μg/mL带Fc标签的IL-2Rα重组蛋白(SinoBiological,Cat#183666-H02H)包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗涤震荡10秒以保证充分清洗。加入200μl/孔封闭液室温孵育2小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗涤震荡10秒以保证充分清洗。每孔加100μl用稀释液稀释好的野生型IL15(SinoBiological,Cat#10360-H07E)或IL2-06。室温孵育1小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl用稀释液按0.5μg/mL的HRP偶联的抗6*His抗体。室温孵育1小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl TMB，避光反应15分钟。加入50μl每孔的0.16M硫酸。Thermo MultiSkanFc酶标仪读取450nm OD值，计算IL2及其突变体与低亲和力IL-2Rα的结合EC50值。

野生型IL15或IL2-06与IL-15Rα的ELISA结合数据见图4。结果表明，IL2-06无法结合IL-15Rα。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

上海恒瑞医药有限公司

上海盛迪医药有限公司

<120> 一种人白细胞介素2变体或其衍生物

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> 野生型IL-2核酸序列

<400> 1

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc aacaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgacct tcaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatc tggcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttaccttttg tcagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 2

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> 野生型IL-2氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 3

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-01的核酸序列

<400> 3

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gcagggcatc aacaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgacct tcaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatc tggcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 4

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-01的氨基酸序列

<400> 4

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Gln Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 5

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-02的核酸序列

<400> 5

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc aacagctaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgacct tcaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatc tggcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 6

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-02的氨基酸序列

<400> 6

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 7

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-03的核酸序列

<400> 7

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacctgtc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc aacaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgacct tcaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatc tggcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcacct gtacctaatg aggatcc 417

<210> 8

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-03的氨基酸序列

<400> 8

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Cys Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Cys Thr

130

<210> 9

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-04的核酸序列

<400> 9

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc aacaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgacct tcaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gtttgtaatc tggcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtt gtcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 10

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-04的氨基酸序列

<400> 10

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Cys Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Cys Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 11

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-05的核酸序列

<400> 11

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaactgtatc aacaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgacct tcaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatc tggcacagag caaaaactgt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 12

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-05的氨基酸序列

<400> 12

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Cys Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Cys His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 13

<211> 396

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(396)

<223> IL-2-06的核酸序列

<400> 13

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc cagagcatgc atattgatgc aaccctgtac 120

atgccgaaaa aagcaaccga gctgaaacat ctgcagtgtc tggaagaaga actgaaaccg 180

ctggaagagg ttctgaatct ggcacagagc aaaaactttc atctgcgtcc gcgtgatctg 240

attagcaata ttaacgttat tgtgctggaa ctgaaaggta gcgaaaccac ctttatgtgt 300

gaatatgccg atgaaaccgc aaccattgtg gaatttctga atcgttggat tacctttgca 360

cagagcatta ttagcaccct gacctaatga ggatcc 396

<210> 14

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(124)

<223> IL-2-06的氨基酸序列

<400> 14

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Gln Ser Met

20 25 30

His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

35 40 45

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

50 55 60

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

65 70 75 80

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

85 90 95

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

100 105 110

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

115 120 125

<210> 15

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-07的核酸序列

<400> 15

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc aacaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgaccg caaaattcgc aatgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatc tggcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 16

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-07的氨基酸序列

<400> 16

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 17

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-08的核酸序列

<400> 17

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc aacaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgaccg caaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatg gcgcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 18

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-08的氨基酸序列

<400> 18

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 19

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-09的核酸序列

<400> 19

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc aacaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgacct tcaaattcgc aatgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatg gcgcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 20

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-09的氨基酸序列

<400> 20

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Ala Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 21

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-10的核酸序列

<400> 21

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gcagggcatc aacagctaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgaccg caaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatg gcgcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 22

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-10的氨基酸序列

<400> 22

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Gln Gly Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 23

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-11的核酸序列

<400> 23

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacctgtc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gcagggcatc aacagctaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgaccg caaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatg gcgcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcacct gtacctaatg aggatcc 417

<210> 24

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-11的氨基酸序列

<400> 24

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Cys Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Gln Gly Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Cys Thr

130

<210> 25

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-12的核酸序列

<400> 25

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gcagggcatc aacagctaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgaccg caaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gtttgtaatg gcgcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtt gtcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 26

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-12的氨基酸序列

<400> 26

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Gln Gly Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Cys Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Cys Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 27

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-13的核酸序列

<400> 27

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gcagtgtatc aacagctaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgaccg caaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatg gcgcacagag caaaaactgt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 28

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-13的氨基酸序列

<400> 28

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Gln Cys Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Cys His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 29

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-14的核酸序列

<400> 29

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc agcaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgaccg caaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatg gcgcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 30

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-14的氨基酸序列

<400> 30

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 31

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-21的核酸序列

<400> 31

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gcagggcatc agcaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgaccg caaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatg gcgcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 32

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-21的氨基酸序列

<400> 32

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 33

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL-2-22的核酸序列

<400> 33

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gcagggcatc agcaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctgaccg caaaattcta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgcagg gcgcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 34

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL-2-22的氨基酸序列

<400> 34

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Gln Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 35

<211> 396

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (1)..(396)

<223> IL-2-23的核酸序列

<400> 35

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacctgtc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc cagagcatgc atattgatgc aaccctgtac 120

atgccgaaaa aagcaaccga gctgaaacat ctgcagtgtc tggaagaaga actgaaaccg 180

ctggaagagg ttctgaatct ggcacagagc aaaaactttc atctgcgtcc gcgtgatctg 240

attagcaata ttaacgttat tgtgctggaa ctgaaaggta gcgaaaccac ctttatgtgt 300

gaatatgccg atgaaaccgc aaccattgtg gaatttctga atcgttggat tacctttgca 360

cagagcatta ttagcacctg tacctaatga ggatcc 396

<210> 36

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(127)

<223> IL-2-23的氨基酸序列

<400> 36

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Cys Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Gln Ser Met

20 25 30

His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

35 40 45

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

50 55 60

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

65 70 75 80

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

85 90 95

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

100 105 110

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Cys Thr

115 120 125

<210> 37

<211> 417

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(417)

<223> IL2-G1核酸序列

<400> 37

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc aacaactaca aaaatccgaa actgacccgt 120

atgctggatg caaccctgta catgccgaaa aaagcaaccg agctgaaaca tctgcagtgt 180

ctggaagaag aactgaaacc gctggaagag gttctgaatc tggcacagag caaaaacttt 240

catctgcgtc cgcgtgatct gattagcaat attaacgtta ttgtgctgga actgaaaggt 300

agcgaaacca cctttatgtg tgaatatgcc gatgaaaccg caaccattgt ggaatttctg 360

aatcgttgga ttacctttgc acagagcatt attagcaccc tgacctaatg aggatcc 417

<210> 38

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(134)

<223> IL2-G1氨基酸序列

<400> 38

Met Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Asp Ala Thr Leu Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 39

<211> 390

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(390)

<223> IL2-G2核酸序列

<400> 39

catatggcac cgaccagcag cagcaccaaa aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 60

ttagatctgc aaatgattct gaacggcatc atgcatattg atgcaaccct gtacatgccg 120

aaaaaagcaa ccgagctgaa acatctgcag tgtctggaag aagaactgaa accgctggaa 180

gaggttctga atctggcaca gagcaaaaac tttcatctgc gtccgcgtga tctgattagc 240

aatattaacg ttattgtgct ggaactgaaa ggtagcgaaa ccacctttat gtgtgaatat 300

gccgatgaaa ccgcaaccat tgtggaattt ctgaatcgtt ggattacctt tgcacagagc 360

attattagca ccctgaccta atgaggatcc 390

<210> 40

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(131)

<223> IL2-G2氨基酸序列

<400> 40

Met Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Met Pro Lys Lys Ala

35 40 45

Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu

50 55 60

Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro

65 70 75 80

Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly

85 90 95

Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile

100 105 110

Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser

115 120 125

Thr Leu Thr

130

<210> 41

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(466)

<223> IL-2Rβ-Fc-hole

<400> 41

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Phe Pro Gly Ala Arg Cys Ala Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys

20 25 30

Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly

35 40 45

Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg

50 55 60

Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp

65 70 75 80

Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr

85 90 95

Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp

100 105 110

Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu

115 120 125

Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys

130 135 140

Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His

145 150 155 160

Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu

165 170 175

Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu

180 185 190

Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro

195 200 205

Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala

210 215 220

Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Gly Ala Gln Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 42

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(492)

<223> IL-2Rγ-Fc-knob

<400> 42

Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu

1 5 10 15

Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly

20 25 30

Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp

35 40 45

Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val

50 55 60

Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro

65 70 75 80

Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn

85 90 95

Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr

100 105 110

Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe

115 120 125

Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln

130 135 140

Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu

145 150 155 160

Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn

165 170 175

Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp

180 185 190

Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe

195 200 205

Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg

210 215 220

Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp

225 230 235 240

Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe

245 250 255

Leu Phe Ala Leu Glu Ala Gly Ala Gln Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

260 265 270

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

275 280 285

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

290 295 300

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

305 310 315 320

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

325 330 335

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

340 345 350

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

355 360 365

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

370 375 380

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg

385 390 395 400

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

405 410 415

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

420 425 430

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

435 440 445

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

450 455 460

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

465 470 475 480

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485 490

Claims (19)

1.一种人白细胞介素2(IL-2)变体或其衍生物，其在与IL-2受体α亚基(IL-2Rα)相结合的区域包含一个或多个氨基酸突变，所述突变是将人白细胞介素15(IL-15)与IL-2Rα相结合的区域的一个或多个氨基酸替换到IL-2与IL-2Rα相结合的区域。

2.根据权利要求1所述的IL-2变体或其衍生物，其与IL-2Rα的亲和力降低，与IL-2Rβ和/或IL-2Rγ的亲和力不变或提高；或与IL-2Rα/β/γ的亲和力降低，并保留对IL-2Rβ/γ的亲和力。

3.根据权利要求1-2所述的IL-2变体或其衍生物，其对调节性T细胞的激活降低，和/或对免疫效应细胞的激活不受影响或增高。

4.根据前述权利要求任一项所述的IL-2变体或其衍生物，所述突变发生在IL-2的第29-44位，或第41-44位，或第35-44位中的一个或多个氨基酸残基。

5.根据权利要求4所述的IL-2变体或其衍生物，其中：

(1)除29-44位的一个或多个氨基酸残基突变外，还包含11、26、27、45、70、72、78、82、132位的一个或多个氨基酸突变；

(2)除41-44位的一个或多个氨基酸残基突变外，还包含11、26、27、29、30、45、70、72、78、82、132位的一个或多个氨基酸突变；或

(3)除35-44位的一个或多个氨基酸残基突变外，还包含11、26、27、29、30、45、70、72、78、82、132位的一个或多个氨基酸突变；

优选地，所述氨基酸的突变类型是：第11位突变为C，第26位突变为Q，第27位突变为C，第29位突变为S，第30位突变为S，第45位突变为A，第70位突变为C，第72位突变为G，第78位突变为C，第82位突变为C，第132位突变为C。

6.根据前述权利要求任一项所述的IL-2变体或其衍生物，其中：

(1)29-44位突变为QSMHIDATL；

(2)41-44位突变为DATL；或

(3)35-44位突变为MHIDATL；

优选地，

(1)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL；

(2)41-44位的TFKF突变为DATL；或

(3)35-44位的KLTRMLTFKF突变为MHIDATL。

7.根据权利要求6所述的IL-2变体或其衍生物，其中：

(1)29-44位的NNYKNPKLTRMLTFKF突变为QSMHIDATL，还包含N26Q、Q11C/L132C、L70C/P82C、G27C/F78C、Y45A、N71Q、L72G中的一个或多个突变；

(2)41-44位的TFKF突变为DATL，还包含N26Q、N29S、N30S、Q11C/L132C、L70C/P82C、G27C/F78C、Y45A、N71Q、L72G中的一个或多个突变；

(3)35-44位的KLTRMLTFKF突变为MHIDATL，还包含N26Q、N29S、N30S、Q11C/L132C、L70C/P82C、G27C/F78C、Y45A、N71Q、L72G中的一个或多个突变。

8.根据权利要求7所述的IL-2变体或其衍生物，其包含选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求1-8任一项的IL-2变体或其衍生物，其均含有C125A突变。

10.根据权利要求1-9任一项所述的IL-2变体或其衍生物，其是单体，和/或PEG化的，和/或糖基化的，和/或白蛋白缀合或融合的，和/或Fc融合的，和/或羟乙基化的，和/或去除O-糖基化的；

优选地，PEG连接至IL-2变体的N端；

更优选地，PEG分子量为20KD。

11.缀合物，其包含如前述权利要求任一项所述的IL-2变体或其衍生物，所述IL-2变体或其衍生物直接或通过接头间接地与非IL-2模块连接；

优选地，所述非IL-2模块是抗原结合模块；

更优选地，所述抗原结合模块是抗体或其抗原结合片段；

最优选地，所述抗体或其抗原结合片段靶向肿瘤细胞上或肿瘤细胞环境中呈现的抗原。

12.药物组合物，其含有权利要求1-10任一项所述的IL-2变体或其衍生物，以及药学上可接受的稀释剂、载体或助剂。

13.多核苷酸，编码权利要求1-10任一项所述IL-2变体或其衍生物。

14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：37、SEQID NO：39所示的核酸序列。

15.载体，包含权利要求12或13的多核苷酸。

16.宿主细胞，其包含权利要求15所述的表达载体，或表达权利要求1-10任一项所述的IL-2变体或其衍生物、权利要求11所述的缀合物，

优选地，所述宿主细胞为原核或真核细胞；

更优选地，所述宿主细胞为为细菌或酵母菌或哺乳动物细胞；

最优选地，所述宿主细胞为酿酒酵母或大肠杆菌。

17.权利要求1-10任一项所述的IL-2变体或其衍生物、权利要求11的缀合物或权利要求12的药物组合物用于制备治疗增生性疾病、免疫性疾病、调节性T细胞介导的免疫应答、刺激个体免疫系统的药物中的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，所述增生性疾病是肿瘤或癌，

优选地，所述肿瘤或癌选自上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌、乳头状瘤病毒引起的癌、腺癌、癌肿、黑素瘤、肉瘤、畸胎癌、肺部肿瘤、转移性肺癌、淋巴瘤和转移性肾细胞癌。

19.一种制备IL-2变体或衍生物的方法，包括向野生型人IL-2中引入权利要求1-10任一项中所述的突变，或使用权利要求13-14的核酸序列，或使用权利要求15的表达载体，或使用权利要求16的宿主细胞进行重组表达。

Images