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TW202204388A - 經遮蔽之il-2細胞激素及其裂解產物 - Google Patents

經遮蔽之il-2細胞激素及其裂解產物 Download PDF

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TW202204388A
TW202204388A TW110112016A TW110112016A TW202204388A TW 202204388 A TW202204388 A TW 202204388A TW 110112016 A TW110112016 A TW 110112016A TW 110112016 A TW110112016 A TW 110112016A TW 202204388 A TW202204388 A TW 202204388A
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拉斐爾 羅澤尼費爾德
烏戈爾 埃斯基奧克
華偉 邱
派克 約翰遜
庫爾特 艾倫 詹金斯
里貝伊爾 瑪加利 彼得祖里
德拉吉 辛格 托馬爾
麗貝卡 凱 奧唐納
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美商艾希利歐發展股份有限公司
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Abstract

本發明係關於經遮蔽之IL-2細胞激素，其包含IL-2細胞激素或其功能片段、遮蔽部分及可經蛋白分解方式裂解之連接子。遮蔽部分遮蔽該IL-2細胞激素或其功能片段，藉此減少或阻止該IL-細胞激素或其功能片段與其同源受體之結合，但當可裂解連接子在目標位點處經過蛋白水解裂解時，該IL-2細胞激素或其功能片段變得活化，由此使得其能夠或更加能夠結合於其同源受體。

Description

經遮蔽之IL-2細胞激素及其裂解產物
本發明係關於經遮蔽之IL-2細胞激素及與其使用及製造相關之方法。本發明亦關於該等經遮蔽之IL-2細胞激素之裂解產物及與其使用相關之方法。
癌症在美國為排名第二之主要死亡原因，其導致之死亡比後五種主要原因(慢性呼吸道疾病、中風、事故、阿茲海默症(Alzheimer's disease)及糖尿病)多。儘管已取得巨大進步(尤其藉由靶向療法)，但此領域中仍需進行大量工作。免疫療法及此領域之分支—免疫腫瘤學，正在產生用於治療惡性病之可行的及振奮人心的治療選擇方案。特定言之，現發現癌症之一個標誌為免疫逃避且已進行大量工作以鑑別目標及研發針對此等目標之療法，從而使免疫系統再活化以識別及治療癌症。
細胞激素療法係一種有效刺激免疫系統來誘導抗腫瘤細胞毒性之策略。詳言之，FDA已批准阿地介白素(aldesleukin)(介白素-2 (IL-2)之一種重組形式)用於治療轉移性腎細胞癌及黑色素瘤。不幸的是，向患者投與之細胞激素通常具有極短半衰期，藉此需要頻繁給藥。舉例而言，以商標名稱Proleukin出售之阿地介白素產品標籤指出，該藥物展示在接受5分鐘靜脈內(IV)輸注之患者中具有85分鐘之半衰期。另外，投與高劑量之細胞激素可經由全身性免疫活化引起有害健康結果，諸如血管滲漏。此等研究結果說明需要研發可有效靶向腫瘤而不具有與全身性免疫活化相關聯之副作用之細胞激素治療劑。本文提供經遮蔽之IL-2細胞激素、該等經遮蔽之IL-2細胞激素之裂解產物及其組合物及其用於解決此需要之方法。
所揭示之發明係關於IL-2細胞激素或其功能片段，其經工程改造以在IL-2細胞激素或其功能片段之一或多個受體結合位點處由遮蔽部分遮蔽。藉由包括可經蛋白分解方式裂解之連接子，該等IL-2細胞激素經工程改造以在目標位點處，諸如在腫瘤微環境中，可藉由蛋白酶活化。在經遮蔽之細胞激素構築體中，該遮蔽部分減少或阻止該IL-2細胞激素或其功能片段與其同源受體之結合。在目標位點處可裂解連接子進行蛋白水解裂解後，該IL-2細胞激素或其功能片段變得活化，由此使得其能夠或更加能夠結合於其同源受體。
本文提供一種經遮蔽之IL-2細胞激素，其包括包含以下之蛋白質雜二聚體： a) 第一多肽鏈，其包含經由第一連接子連接於第一半衰期延長域之遮蔽部分；及 b) 第二多肽鏈，其包含經由第二連接子連接於第二半衰期延長域之IL-2細胞激素或其功能片段， 其中該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域締合，且 其中該第一連接子或該第二連接子中之一者為包含可經蛋白分解方式裂解之肽的可經蛋白分解方式裂解之連接子。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含第一Fc域或其片段且第二Fc域包含Fc域或其片段。
在一些實施例中，第一Fc域包含CH3域或其片段且第二Fc域包含CH3域或其片段。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段。
在一些實施例中，第一Fc域及/或第二Fc域各含有一或多個促進第一半衰期延長域與第二半衰期延長域之非共價締合的修飾。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含包括突變Y349C、T366S、L38A及Y407V以在第一半衰期延長域中形成『臼』之IgG1 Fc域或其片段且第二半衰期延長域包含包括突變S354C及T366W以在第二半衰期延長域中形成『杵』之IgG1 Fc域或其片段，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代N297A，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代I253A，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比經修飾。
在一些實施例中，經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾R38A、F42A、Y45A及E62A。
在一些實施例中，經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾C125A。
在一些實施例中，經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含R38A、F42A、Y45A、E62A及C125A。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
在一些實施例中，遮蔽部分包含IL-2Rβ或其片段、部分或變異體。
在一些實施例中，IL-2Rβ或其片段、部分或變異體包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
在一些實施例中，其中IL-2Rβ或其片段、部分或變異體包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。
在一些實施例中，第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得該第二連接子為可經蛋白分解方式裂解之連接子且第一連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得該第一連接子為不可經蛋白分解方式裂解之連接子。
在一些實施例中，第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得該第一連接子為可經蛋白分解方式裂解之連接子且第二連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得該第二連接子為不可經蛋白分解方式裂解之連接子。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子的長度為10個至25個胺基酸。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子內的可裂解肽包含選自由SEQ ID NO: 24、25、26、27及28組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子內的可裂解肽包含SEQ ID NO: 118。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子內的可裂解肽包含SEQ ID NO: 119。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含利用間隔子域側接在兩側的可經蛋白分解方式裂解之肽。
在一些實施例中，間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。
在一些實施例中，間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 16、17、18、19、20、21及22組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 19組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 17組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 118中所示之胺基酸序列且SD2具有如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 119中所示之胺基酸序列且SD2具有如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，SD2的長度為3個至6個胺基酸。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 115組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 116組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 117組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 112組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 114組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，不可經蛋白分解方式裂解之連接子的長度介於3個與18個胺基酸之間。
在一些實施例中，不可經蛋白分解方式裂解之連接子的長度介於3個與8個胺基酸之間。
在一些實施例中，其中不可經蛋白分解方式裂解之連接子富含胺基酸殘基G、S及P。
在一些實施例中，不可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。
在一些實施例中，不可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 38之第一多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 39之第一多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 125之第一多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 126之第一多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 127之第一多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 39之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 49之第二多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 40之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 51之第二多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 38之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 128之第二多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 38之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 129之第二多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 38之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 130之第二多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 125之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 51之第二多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 126之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 51之第二多肽鏈。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 127之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 51之第二多肽鏈。
本文提供一種經遮蔽之IL-2細胞激素，其包含遮蔽部分及IL-2細胞激素或其功能片段，其中該遮蔽部分遮蔽該IL-2細胞激素或其功能片段，從而減少或防止IL-細胞激素或其功能片段與其同源受體的結合，且其中可經蛋白分解方式裂解之肽存在於IL-2片段或其功能片段與遮蔽部分之間。
在一些實施例中，遮蔽部分及IL-2細胞激素或其功能片段係在單一多肽鏈中連接。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包括包含式1之多肽鏈： N'HL-L2-C-L1-MM C' (1) 其中HL為半衰期延長域，L1為第一連接子，MM為遮蔽部分，L2為第二連接子，且C為IL-2細胞激素或其功能片段，其中至少第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包括包含式2之多肽鏈： N'HL-L2-MM-L1-C C' (2) 其中HL為半衰期延長域，L1為第一連接子，MM為遮蔽部分，L2為第二連接子，且C為IL-2細胞激素或其功能片段，其中至少第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。
在一些實施例中，遮蔽部分包含IL-2Rβ或其片段、部分或變異體。
在一些實施例中，IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2β相比在胺基酸位置C122及C168處具有突變。
在一些實施例中，IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2β相比具有突變C122S及C168S。
在一些實施例中，半衰期延長域(HL)包含第一及第二半衰期延長域，該等半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段。
在一些實施例中，第一Fc域及/或第二Fc域各含有一或多個促進第一半衰期延長域與第二半衰期延長域之非共價締合的修飾。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含包括突變Y349C、T366S、L38A及Y407V以在第一半衰期延長域中形成『臼』之IgG1 Fc域或其片段且第二半衰期延長域包含包括突變S354C及T366W以在第二半衰期延長域中形成『杵』之IgG1 Fc域或其片段，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代N297A，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代I253A，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子內的可裂解肽包含SEQ ID NO: 118。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子內的可裂解肽包含SEQ ID NO: 119。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 118中所示之胺基酸序列且SD2具有如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 119中所示之胺基酸序列且SD2具有如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，SD2的長度為3個至6個胺基酸。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 115組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 116組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 112組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 114組成之群的胺基酸序列。
本文提供一種裂解產物，其能夠結合於其同源受體，該裂解產物包含IL-2細胞激素或其功能片段，可藉由如本文所述之陳述或實施例中之任一者中定義的經遮蔽之IL-2細胞激素中的可裂解肽之蛋白水解裂解製備。
本文提供一種經遮蔽之IL-2細胞激素之裂解產物，其中該裂解產物能夠結合於其同源受體，該裂解產物包括包含式3之多肽： PCP-SD-C (3) 其中PCP為可經蛋白分解方式裂解之肽之一部分；SD為間隔子域；且C為IL-2細胞激素或其功能片段。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2多肽之序列相比經修飾。
在一些實施例中，經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾R38A、F42A、Y45A及E62A。
在一些實施例中，經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾C125A。
在一些實施例中，經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段包含R38A、F42A、Y45A、E62A及C125A。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
在一些實施例中，間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。
在一些實施例中，間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
在一些實施例中，間隔子域包含SEQ ID NO: 29、30及31中之任一者的胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 24、25、26、27及28中之任一者的胺基酸序列的部分。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之部分。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之部分。
在一些實施例中，裂解產物包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列。
在一些實施例中，裂解產物包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
本文提供一種經遮蔽之IL-2細胞激素之裂解產物，其中該裂解產物能夠結合於其同源受體，該裂解產物包括包含以下之蛋白質雜二聚體： 第一多肽鏈，其包括包含式4之多肽： HL1-SD-PCP (4) 其中HL1為第一半衰期延長域；SD為間隔子域；且PCP為可經蛋白分解方式裂解之肽之一部分；及 第二多肽鏈，其包括包含式5之多肽： HL2-L2-C (5) 其中HL2為第二半衰期延長域；L2為連接子；且C為IL-2細胞激素或其功能片段；且 其中該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域締合。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比經修飾。
在一些實施例中，經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾R38A、F42A、Y45A及E62A。
在一些實施例中，經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾C125A。
在一些實施例中，經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段包含R38A、F42A、Y45A、E62A及C125A。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含第一Fc域或其片段且第二Fc域包含Fc域或其片段。
在一些實施例中，第一Fc域包含CH3域或其片段且第二Fc域包含CH3域或其片段。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段。
在一些實施例中，第一Fc域及/或第二Fc域各含有一或多個促進第一半衰期延長域與第二半衰期延長域之非共價締合的修飾。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代N297A，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代N297A及I253A，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。
在一些實施例中，第二連接子包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
在一些實施例中，間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。
在一些實施例中，間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
在一些實施例中，間隔子域包含SEQ ID NO: 32、33、34、35、36及37之胺基酸序列。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 24、25、26、27及28中之任一者之胺基酸序列的部分。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的部分。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的部分。
在一些實施例中，裂解產物包含具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之第二多肽鏈。
在一些實施例中，裂解產物包含具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列之第二多肽鏈。
在一些實施例中，裂解產物包含具有SEQ ID NO: 141之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 140之胺基酸序列之第二多肽鏈。
在一些實施例中，裂解產物包含具有SEQ ID NO: 143之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 142之胺基酸序列之第二多肽鏈。
本文提供一種核酸，其編碼本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素。
本文提供一種核酸，其編碼本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素的鏈中之一者。
本文提供一種載體，其包含本文所述之核酸。
本文提供一種載體，其包含編碼本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素的核酸。
本文提供一種載體，其包含編碼本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素的鏈中之一者的核酸。
本文提供一種宿主細胞，其包含本文所述之核酸。
在一個實施例中，宿主細胞為HEK細胞。在另一實施例中，宿主細胞為CHO細胞。
本文提供一種組合物，其包含本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素中的任一者。
本文提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素中的任一者及醫藥學上可接受之載劑。
本文提供一種套組，其包含本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素中的任一者、或組合物、或醫藥組合物。
本文提供一種產生本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素中的任一者的方法，其包含在產生該經遮蔽之IL-2細胞激素的條件下培養本文所述之宿主細胞。
本文提供一種核酸，其編碼本文所述之裂解產物中的任一者。
本文提供一種組合物，其包含本文所述之裂解產物中的任一者。
本文提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之裂解產物中的任一者及醫藥學上可接受之載劑。
本文提供如本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素，其用於藥物中。
本文提供如本文所述之裂解產物，其用於藥物中。
本文提供一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素。
本文提供一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如本文所述之組合物。
本文提供一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如本文所述之醫藥組合物。
本文提供一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素，藉此該經遮蔽之細胞激素在活體內經蛋白分解方式裂解以產生如本文所述之裂解產物。
本文提供一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含在活體內產生能夠結合於同源受體之裂解產物的步驟，其中該裂解產物如本文中所述。
本文提供如本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素，其用於治療或預防癌症。
本文提供如本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素，其用於治療或預防癌症之方法中，該方法包含向該個體投與有效量之該經遮蔽之IL-2細胞激素，藉此該經遮蔽之細胞激素在活體內經蛋白分解方式裂解以產生如本文所述之裂解產物。
本文提供如本文所述之裂解產物，其用於治療或預防癌症。
本文提供如本文所述之裂解產物，其用於治療或預防癌症，該方法包含向患者投與如本文所述之經遮蔽之細胞激素的步驟，藉此藉由該經遮蔽之細胞激素在活體內之蛋白水解裂解而產生該裂解產物。
本文提供如本文所述之裂解產物，其用於治療或預防個體之癌症的方法中，該方法包含藉由自向該個體投與之如本文所述之經遮蔽之細胞激素的活體內蛋白水解裂解而產生該裂解產物的步驟。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年4月1日申請之美國臨時申請案序列號63/003,824及2020年11月25日申請之63/118,571之優先權；其中每一者以全文引用之方式併入本文中。
藉由使用遮蔽部分，所投與之IL-2細胞激素或其功能片段之全身性副作用可藉由干擾IL-2細胞激素或其功能片段與其同源受體之結合能力而減小。
IL-2細胞激素受體為一種IL-2受體複合物，其包含三條分開及非共價連接之鏈：IL-2Rα鏈(亦稱為CD25)、IL-2Rβ鏈(亦稱為CD122)及IL-2Rγ鏈(亦稱為CD132)。三條受體鏈可以不同組合及次序組裝以產生低、中間及高親和力之IL-2受體。單獨α鏈以低親和力結合IL-2，β與γ之組合一起形成以中間親和力結合IL-2之複合物，且所有三條受體鏈(α、β及γ)之組合形成以高親和力結合IL-2之複合物。
舉例而言，高劑量重組IL-2 (阿地介白素)已經FDA批准用於治療轉移性腎細胞癌及黑色素瘤，但已與嚴重心血管、肝、肺、胃腸道、神經及血液副作用相關聯。臨床前研究顯示，例如IL-2誘發之肺水腫係由IL-2與肺內皮細胞上IL-2受體之IL-2Rα (CD25)次單元之間的相互作用引起，且此IL-2介導之肺水腫可藉由干擾IL-2結合IL-2Rα之能力而消除。參見Krieg等人 (2010) PNAS, 107(26): 11906-11911。因此，在一些實施例中，採用減少或阻止IL-2細胞激素或其功能片段與IL-2Rα之結合的遮蔽部分。為進一步減少全身效應，在一些實施例中，IL-2細胞激素或其片段與IL-2受體之IL-2Rβ及/或IL-2Rγ次單元的結合亦可藉由經遮蔽之細胞激素中之遮蔽部分來減少或阻止。
藉由使用包括可經蛋白分解方式裂解之肽的連接子遮蔽IL-2細胞激素或其功能片段，可藉由在腫瘤微環境下可裂解肽之裂解來恢復藉由使用遮蔽部分而干擾之結合能力。因此，本文中提供之經遮蔽之IL-2細胞激素經工程改造以藉由利用癌症之標誌之一，亦即活性蛋白酶之高局部濃度來使藥理學活性精確靶向腫瘤微環境。腫瘤微環境之此特徵用於將全身性惰性分子轉化為呈IL-2裂解產物形式之局部活性IL-2細胞激素或其功能片段。在腫瘤微環境下IL-2細胞激素或其功能片段之活化顯著地減少可能與投與個體之呈活性形式之藥物相關的全身毒性。因此，本發明之經遮蔽之IL-2細胞激素可視為前藥。
已發現本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素展示多種有利性質。已發現本文任何地方所述之經遮蔽之IL-2細胞激素能夠在蛋白水解裂解後優先在腫瘤微環境中且在周邊較低水準下活化免疫細胞(增殖及擴增)。已發現本文任何地方所述之經遮蔽之IL-2細胞激素能夠促進腫瘤根除(亦即展示抗腫瘤活性)且在蛋白水解裂解後抑制癌轉移。已發現本文任何地方所述之經遮蔽之IL-2細胞激素展現有利的長期藥物暴露。已發現本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素展現有利穩定性。已發現本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素展示有利耐受性。此外，已發現本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素展現有利效力。
1.   『雜二聚體』經遮蔽之細胞激素 在一些實施例中，本文提供一種經遮蔽之細胞激素，其包含第一多肽鏈中之遮蔽部分及第二多肽鏈中之IL-2細胞激素或其功能片段。此類經遮蔽之細胞激素可稱為『雜二聚體』經遮蔽之細胞激素。
在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素包括包含以下之蛋白質雜二聚體： a) 第一多肽鏈，其包含經由第一連接子連接於第一半衰期延長域之遮蔽部分；及 b) 第二多肽鏈，其包含經由第二連接子連接於第二半衰期延長域之IL-2細胞激素或其功能片段， 其中該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域締合，且 其中至少第一連接子或第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。
遮蔽部分、半衰期延長域、IL-2細胞激素或其功能片段、連接子及第一半衰期延長域與第二半衰期延長域之間的締合類型可為本文所述之彼等中之任一者，及本文所述之彼等的任何組合。
在一些實施例中，在第一多肽鏈中，第一半衰期延長域連接於第一連接子之胺基端且第一連接子之羧基端連接於遮蔽部分之胺基端，且在第二多肽鏈中，第二半衰期延長域連接於第二連接子之胺基端且第二連接子之羧基端連接於IL-2細胞激素或其功能片段之胺基端。此在以下式6 (第一多肽鏈)及5 (第二多肽鏈)中以N端至C端示意性展示： N'HL1-L1-MM C' (6) N'HL2-L2-C C' (5) 其中HL1為第一半衰期延長域，L1為第一連接子，MM為遮蔽部分，HL2為第二半衰期延長域，L2為第二連接子，且C為IL-2細胞激素或其功能片段。
1.1 IL-2 細胞激素 本文提供一種IL-2細胞激素或其功能片段，該IL-2細胞激素或其功能片段用於經遮蔽之細胞激素或其裂解產物中。細胞激素在細胞信號傳導中，尤其在免疫系統之細胞中起作用。IL-2係一種介白素，其為免疫系統中調節白血球活性之一種類型細胞激素信號傳導分子。
在真核細胞中，天然存在之IL-2係呈具有SEQ ID NO: 1之153個胺基酸之前驅多肽形式合成。其接著藉由移除胺基酸殘基1-20而加工成成熟IL-2。此產生由133個胺基酸(胺基酸殘基21-153)組成之IL-2之成熟形式，其具有SEQ ID NO: 2。IL-2細胞激素之「功能片段」包含全長細胞激素蛋白之一部分，其保留或具有改變之細胞激素受體結合能力(例如與全長細胞激素蛋白相比在至少50%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%活性內)。細胞激素受體結合能力可展示在例如細胞激素結合於細胞激素同源受體或其組分(例如，雜三聚體受體複合物之一或多個鏈)之能力。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段為能夠結合於介白素-2受體、尤其IL-2Rα鏈之任何天然存在之介白素-2 (IL-2)蛋白或其經修飾變異體。在IL-2細胞激素結合之情形下，目標蛋白可為IL-2R (包含IL-2Rα、IL-2Rβ及IL-2Rγ鏈)、IL-2Rα鏈、IL-2Rβ鏈或IL-2Rα/β二聚複合物。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基21-153的胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含成熟IL-2之胺基酸序列，SEQ ID NO: 2。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含如與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列相比具有至少一個胺基酸修飾之胺基酸序列。至少一個胺基酸修飾中之每一者可為任何胺基酸修飾，諸如取代、插入或缺失。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含如與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列相比具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個胺基酸取代的胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含如與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列相比具有至少5個胺基酸取代的胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含如與SEQ ID NO: 2之野生型IL-2之胺基酸序列相比具有一或多個降低IL-2肽或其功能片段對IL-2Rα (CD25)之親和力的胺基酸取代的胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含如與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列相比具有一或多個胺基酸取代的胺基酸序列，使得胺基酸殘基38、42、45及62中之一或多個為丙胺酸(A)。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含如與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列相比具有一或多個胺基酸取代的胺基酸序列，使得胺基酸殘基38、42、45及62為丙胺酸(A)。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段如與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列相比包含胺基酸序列取代C125A。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含如與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列相比具有一或多個胺基酸取代的胺基酸序列，使得胺基酸殘基38、42、45及62為丙胺酸(A)且胺基酸殘基125為丙胺酸(A)。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列中胺基酸殘基R38、F42、Y45及E62被取代成丙胺酸的胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列中胺基酸殘基R38、F42、Y45及E62被取代成丙胺酸(A)且胺基酸殘基C125被取代成丙胺酸(A)的胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，出於移除O-糖基化位點之目的，IL-2細胞激素或其功能片段與SEQ ID 2之成熟IL-2之胺基酸序列相比移除一或多個胺基酸殘基，例如殘基1-3。在一些實施例中，出於移除O-糖基化位點之目的，IL-2細胞激素或其功能片段與SEQ ID 2之成熟IL-2之胺基酸序列相比取代一或多個胺基酸殘基。在一些實施例中，出於移除O-糖基化位點之目的，IL-2細胞激素或其功能片段與SEQ ID 2之成熟IL-2之胺基酸序列相比例如在殘基1-3之區域中插入一或多個胺基酸殘基。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段在殘基1-3內不具有O-糖基化位點。
1.2 遮蔽部分 本文提供一種用於經遮蔽之細胞激素中的遮蔽部分。應瞭解遮蔽部分自經遮蔽之細胞激素裂解以形成其裂解產物。在經遮蔽之細胞激素中遮蔽部分遮蔽IL-2細胞激素或其功能片段，藉此減少或阻止IL-細胞激素或其功能片段與其同源受體之結合。在一些實施例中，遮蔽部分減少或阻止IL-2細胞激素或其功能片段與IL-2Rα (CD25)之結合。在一些實施例中，如本文所提供之遮蔽部分係指能夠結合於IL-2細胞激素或其功能片段(諸如抗IL-2抗體或IL-2同源受體蛋白質)或以其他方式對其展現親和力之部分。用於測定蛋白質(例如細胞激素)與同源蛋白質(例如細胞激素受體)之結合程度的方法為此項技術中所熟知。
在一些實施例中，遮蔽部分包含IL-2細胞激素受體或其次單元或功能片段。
在一些實施例中，遮蔽部分包含IL-2Rβ (亦稱為CD122)或保留或以其他方式展現對IL-2之親和力的其片段、部分或變異體。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在一些實施例中，遮蔽部分包含與SEQ ID NO: 4之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，遮蔽部分包含具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列及一至四個胺基酸取代之胺基酸序列。在一些實施例中，遮蔽部分包含具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列及一或兩個胺基酸取代之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比在胺基酸位置C122處具有突變。
在一些實施例中，IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比在胺基酸位置122處具有突變C122S。
在一些實施例中，遮蔽部分包含具有C122突變之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
在一些實施例中，遮蔽部分包含具有C122S突變之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比在胺基酸位置C168處具有突變。
在一些實施例中，IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比在胺基酸位置168處具有突變C168S。
在一些實施例中，遮蔽部分包含具有C168突變之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
在一些實施例中，遮蔽部分包含具有C168S突變之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
技術方案中任一項之經遮蔽之細胞激素，其中IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比在胺基酸位置C122及C168處具有突變。
技術方案中任一項之經遮蔽之細胞激素，其中IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比具有突變C122S及C168S。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。
1.3 連接子 本文提供用於經遮蔽之細胞激素或其裂解產物的連接子。如本文所提供之連接子係指用於將本文所述之經遮蔽之細胞激素中的兩個功能組分連接在一起的兩個或更多個胺基酸之肽。
經遮蔽之細胞激素包含第一連接子及第二連接子，其中至少該第一連接子或該第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。
在一些實施例中，第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽(連接子在本文中稱為『可經蛋白分解方式裂解之連接子』)且第一連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽(連接子在本文中稱為『不可經蛋白分解方式裂解之連接子』)。在一些實施例中，第一多肽鏈包含式7且第二多肽鏈包含式8，如下： N'HL1- 不可裂解 L1-MM C' (7) N'HL2- 可裂解 L2-C C' (8)
在一些實施例中，第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽(連接子在本文中稱為『可經蛋白分解方式裂解之連接子』或『可裂解連接子』)且第二連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽(連接子在本文中稱為『不可經蛋白分解方式裂解之連接子』或『不可裂解連接子』)。在一些實施例中，第一多肽鏈包含式9且該第二多肽鏈包含式10，如下： N'HL1- 可裂解 L1-MM C' (9) N'HL2- 不可裂解 L2-C C' (10)
以下更詳細地描述一些實施例之不可裂解連接子及可裂解連接子。
1.3.1 不可經蛋白分解方式裂解之連接子 在一些實施例中，不可裂解連接子的長度介於3個與18個胺基酸之間。
在一些實施例中，不可裂解連接子的長度介於3個與8個胺基酸之間。在一些實施例中，不可裂解連接子的長度介於4個與6個胺基酸之間。
在一些實施例中，不可裂解連接子富含胺基酸殘基G、S及P。
在一些實施例中，不可裂解連接子僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
在一些實施例中，不可裂解連接子包括『GS』重複序列。
在一些實施例中，不可裂解連接子包括N'端『P』殘基。
在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列(PGSGS)。
在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列(GGSSPPGGGSSGGGSGP)。
在一些實施例中，不可裂解連接子包含胺基酸序列GGS。
在一些實施例中，其中第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得第二連接子為可經蛋白分解方式裂解之連接子且第一連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得第一連接子為不可經蛋白分解方式裂解之連接子，該不可裂解連接子的長度介於3個與8個胺基酸之間。在一些實施例中，不可裂解連接子的長度介於4個與6個胺基酸之間。在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列(PGSGS)。
在一些實施例中，其中第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得第一連接子為可經蛋白分解方式裂解之連接子且第二連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得第二連接子為不可經蛋白分解方式裂解之連接子，該不可裂解連接子的長度介於3個與18個胺基酸之間。在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列(GGSSPPGGGSSGGGSGP)。
在一些實施例中，其中第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得第二連接子為可經蛋白分解方式裂解之連接子且第一連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得第一連接子為不可經蛋白分解方式裂解之連接子，該不可裂解連接子的長度介於3個與8個胺基酸之間。在一些實施例中，不可裂解連接子包含胺基酸序列GGS。
在一些實施例中，需要第一多肽鏈及第二多肽鏈的長度相同或類似，以便於第一半衰期延長域與第二半衰期延長域締合且遮蔽部分遮蔽所組裝構築體中之IL-2細胞激素或其功能片段。因此，在遮蔽部分為比IL-2細胞激素或其功能片段短的胺基酸序列的情況下，長度差異可完全或部分藉由使用較長連接子L1來補償。
1.3.2 可經蛋白分解方式裂解之連接子 在一些實施例中，可裂解連接子的長度為10個至25個胺基酸。
在一些實施例中，可裂解連接子包含利用間隔子域側接在兩側(SD)的可經蛋白分解方式裂解之肽(CP)，如式11中所示： SD-CP-SD (11)
可裂解肽 可裂解連接子包含可裂解肽。
可裂解肽為包括蛋白酶裂解位點之多肽，以使得可裂解肽可經蛋白分解方式裂解。蛋白酶為裂解及水解目標受質蛋白質之兩個特異性胺基酸殘基之間的肽鍵之酶。如本文所用之「裂解位點」係指用於使在包含本文所述之可裂解肽之任一連接子中發現的可裂解肽之一部分裂解的可識別位點。因此，可在如本文所述之可裂解肽之序列中發現裂解位點。在一些實施例中，裂解位點為由裂解劑識別及裂解之胺基酸序列。
在一些實施例中，蛋白酶裂解位點為腫瘤相關蛋白酶裂解位點。如本文所提供，「腫瘤相關蛋白酶裂解位點」為由表現係腫瘤細胞或其腫瘤細胞環境所特有或上調的蛋白酶識別之胺基酸序列。
腫瘤細胞環境複雜且可包含多種不同蛋白酶。因此，給定可裂解肽在腫瘤細胞環境中裂解之精確位點可在腫瘤類型之間、在具有相同腫瘤類型之患者之間及甚至在同一腫瘤中形成之裂解產物之間變化，視特定腫瘤細胞環境而定。此外，即使在裂解之後，例如藉由移除一或兩個末端胺基酸對初始裂解產物之進一步修飾亦可藉由腫瘤細胞環境中蛋白酶之進一步作用進行。因此，在投與如本文所述之經遮蔽之細胞激素的單一結構後，可預期在患者之腫瘤細胞環境中形成裂解產物之分佈。
應瞭解，如本文中所提及之裂解位點係指可裂解肽內兩個特定胺基酸殘基之間的位點，該等胺基酸殘基為已知與腫瘤細胞環境相關之蛋白酶的目標。在此意義上，如本文所述之可裂解肽中可存在超過一個裂解位點，其中不同蛋白酶在不同裂解位點裂解可裂解肽。超過一種蛋白酶亦可作用於可裂解肽內之同一裂解位點。蛋白酶裂解位點之論述可見於此項技術中。
因此，本文揭示之可裂解肽可藉由一或多種蛋白酶裂解。
在一些實施例中，可裂解肽為共定位於表現IL-2細胞激素受體、尤其IL-2Rα之區域或組織中之蛋白酶的受質。
在一些實施例中，可裂解肽為5聚體(亦即肽的長度為5個胺基酸)、6聚體(亦即肽的長度為6個胺基酸)、7聚體(亦即肽的長度為7個胺基酸)、8聚體(亦即肽的長度為8個胺基酸)、9聚體(亦即肽的長度為9個胺基酸)、10聚體(亦即肽的長度為10個胺基酸)、11聚體(亦即肽的長度為11個胺基酸)、12聚體(亦即肽的長度為12個胺基酸)、13聚體(亦即肽的長度為13個胺基酸)、14聚體(亦即肽的長度為14個胺基酸)、15聚體(亦即肽的長度為15個胺基酸)、16聚體(亦即肽的長度為16個胺基酸)、17聚體(亦即肽的長度為17個胺基酸)或18聚體(亦即肽的長度為18個胺基酸)。
在一些實施例中，可裂解肽的長度為5至18個胺基酸。在一些實施例中，可裂解肽的長度為6至10個胺基酸。
在一些實施例中，可裂解連接子內之可裂解肽包含選自由SEQ ID NO: 24、25、26、27及28組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解連接子內之可裂解肽包含選自由SEQ ID NO: 24、25、26、27、28及118及119組成之群的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 序列 (*指示可裂解肽內之可裂解位點)
24 MPYD*LYHP
25 DSGG*FMLT
26 HEQ*LTV
27 RAAA*VKSP
28 VPLS*LY
118 DLLA*VVAAS
119 ISSGLL*SG*RS
僅舉例而言，在上表中，*指示可裂解肽內之已知或觀測到的蛋白酶裂解位點。
在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，例如可裂解肽可包含SEQ ID NO: 324之胺基酸序列(VPLSLYSG)。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO: 119之胺基酸序列，例如該可裂解肽可包含SEQ ID NO: 323之胺基酸序列(ISSGLLSGRSDQP)。
在一些實施例中，可裂解肽由選自由SEQ ID NO: 24、25、26、27及28組成之群的胺基酸序列組成。在一些實施例中，可裂解肽由選自由SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、118及119組成之群的胺基酸序列組成。在一些實施例中，可裂解肽由SEQ ID NO: 24之胺基酸序列組成。在一些實施例中，可裂解肽由SEQ ID NO: 25之胺基酸序列組成。在一些實施例中，可裂解肽由SEQ ID NO: 26之胺基酸序列組成。在一些實施例中，可裂解肽由SEQ ID NO: 27之胺基酸序列組成。在一些實施例中，可裂解肽由SEQ ID NO: 28之胺基酸序列組成。在一些實施例中，可裂解肽由SEQ ID NO: 118之胺基酸序列組成。在一些實施例中，可裂解肽由SEQ ID NO: 119之胺基酸序列組成。在一些實施例中，可裂解肽由SEQ ID NO: 323之胺基酸序列組成(ISSGLLSGRSDQP)。在一些實施例中，可裂解肽由SEQ ID NO: 324之胺基酸序列組成(VPLSLYSG)。
已發現具有如SEQ ID NO: 118或119中所示之胺基酸序列的可裂解肽展現在腫瘤細胞環境中與非腫瘤細胞環境相比極具特異性之裂解。因此，當此等可裂解肽併入如本文任何地方所揭示之經遮蔽之IL-2細胞激素中時，可進一步減少所投與之IL-2細胞激素或其功能片段的任何全身性副作用。
間隔子域 間隔子域可由一或多種胺基酸組成。當存在時間隔子域之功能係將可經蛋白分解方式裂解之肽(CP)連接至本文所述之構築體中之其他功能組分。
應瞭解間隔子域不改變腫瘤細胞環境中或非腫瘤細胞環境中可經蛋白分解方式裂解之肽與蛋白酶之生物學相互作用。換言之，即使在間隔子域存在下，本文所揭示之本發明可經蛋白分解方式裂解之肽亦保持其有利腫瘤特異性。
在一些實施例中，側接可經蛋白分解方式裂解之肽的間隔子域係不同的。
在一些實施例中，間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。
在一些實施例中，間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
在一些實施例中，可裂解連接子包含式12： N'SD1-CP-SD2 C' (12) 其中SD1為第一間隔子域且SD2為第二間隔子域。
在一些實施例中，可裂解連接子包含式12： N'SD1-CP-SD2 C' (12)
在一些實施例中，第一多肽鏈包含式7且第二多肽鏈包含式13，如下： N'HL1- 不可裂解 L1-MM C' (7) N'HL2- SD1-CP-SD2 -C C' (13)
在一些實施例中，第一多肽鏈包含式14且第二多肽鏈包含式10，如下： N'HL1- SD1-CP-SD2 -MM C' (14) N'HL2- 不可裂解 L2-C C' (10)
在一些實施例中，SD1由甘胺酸(G)組成。
在一些實施例中，SD1之N端為甘胺酸(G)。
在一些實施例中，第一間隔子域(SD1)的長度介於3個與10個胺基酸之間。在一些實施例中，第一間隔子域(SD1)的長度介於4個與9個胺基酸之間。在一些實施例中，第一間隔子域(SD1)的長度介於3個與6個胺基酸之間。
在一些實施例中，SD1包含SEQ ID NO: 32、33、34、35、36或37。在一些實施例中，SD1包含SEQ ID NO: 32、33、34、35、36、120、121、122、123或124。在一些實施例中，SD1包含SEQ ID NO: 32、33、34、35、36、120、121、122、123、124、179 (PSGSSPG)或185 (SGSPS)。
在一些實施例中，SD1由SEQ ID NO: 32、33、34、35、36或37組成。在一些實施例中，SD1由SEQ ID NO: 32、33、34、35、36、120、121、122、123或124組成。在一些實施例中，SD1由SEQ ID NO: 32、33、34、35、36、120、121、122、123、124、179 (PSGSSPG)或185 (SGSPS)組成。
SD1之SEQ ID NO 序列
32 GGSSPP
33 GSGP
34 GSPG
35 GGSG
36 GPPSGSSPG
37 GPPSGSSP
120 GGPS
121 GSGPS
122 GSSGGP
123 GSP
124 GSGSPS
179 PSGSSPG
185 SGSPS
在一些實施例中，SD2由GP組成。
在一些實施例中，SD2之C端序列為-GP C'。
在一些實施例中，SD2之C端序列為SEQ ID NO: 29。
在一些實施例中，第二間隔子域(SD2)的長度介於3個與6個胺基酸之間。
在一些實施例中，SD2包含SEQ ID NO: 29、30或31。
在一些實施例中，SD2由SEQ ID NO: 29、30或31組成。
SD2之SEQ ID NO 序列
29 SGP
30 SGGG
31 GSGGG
可裂解連接子中SD1及SD2之示例性組合如下所示：
連接子結構 SD1序列 SD2序列
SD1-CP-SD2 GPPSGSSPG SGGG
SD1-CP-SD2 GPPSGSSPG GSGGG
SD1-CP-SD2 GPPSGSSP SGGG
SD1-CP-SD2 GGSSPP SGP
SD1-CP-SD2 GSPG SGP
SD1-CP-SD2 GGSG SGP
SD1-CP-SD2 GSGP SGP
SD1-CP-SD2 GGPS SGP
SD1-CP-SD2 GSGPS SGP
SD1-CP-SD2 GSSGGP SGP
SD1-CP-SD2 GSP SGP
SD1-CP-SD2 GSGSPS SGP
SD1-CP-SD2 G SGP
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 118中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。在一些實施例中，間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 119中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。在一些實施例中，間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 323中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。在一些實施例中，間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 118中所示之胺基酸序列且SD2具有如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，SD1的長度為3個至6個胺基酸。在一些實施例中，間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。在一些實施例中，間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 119中所示之胺基酸序列且SD2具有如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，SD1的長度為3個至6個胺基酸。在一些實施例中，其中該等間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。在一些實施例中，間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
示例性可裂解連接子如下所示：
可裂解連接子之SEQ ID NO    可裂解連接子序列(可裂解肽以粗體展示)
15 GPPSGSSPGDSGGFMLT SGGG
16 GPPSGSSPGVPLSLY GSGGG
17 GPPSGSSPMPYDLYHP SGGG
18 GGSSPPMPYDLYHP SGP
19 GSPGVPLSLY SGP
20 GGSGRAAAVKSP SGP
21 GGSGHEQLTV SGP
22 GSGPDSGGFMLT SGP
115 GGPSDLLAVVAAS SGP
116 GSGPSDLLAVVAAS SGP
117 GSSGGPDLLAVVAAS SGP
112 GSPDLLAVVAAS SGP
113 GSPGDLLAVVAAS SGP
114 GSGSPSDLLAVVAAS SGP
175 GISSGLLSGRSDQP SGP  
177 GISSGLLSGRS SGP  
在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 19。
在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 17。
在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 19且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 115且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 116且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 117且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 17且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 23。
在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 112且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 23。
在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 113且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 23。
在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 114且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 23。
在一些實施例中，其中第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得該第二連接子為可經蛋白分解方式裂解之連接子且第一連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得該第一連接子為不可經蛋白分解方式裂解之連接子，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 115且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 116且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 117且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，其中第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得該第一連接子為可經蛋白分解方式裂解之連接子且第二連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得該第二連接子為不可經蛋白分解方式裂解之連接子，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 112且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 23。在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 113且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 23。在一些實施例中，可裂解連接子包含SEQ ID NO: 114且不可裂解連接子包含SEQ ID NO: 23。
在一些實施例中，其中第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得該第二連接子為可經蛋白分解方式裂解之連接子且第一連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽以使得該第一連接子為不可經蛋白分解方式裂解之連接子，則可經蛋白分解方式裂解之肽連接子不具有胺基酸序列GGSGISSGLLSGRSSSGP或GISSGLLSGRSSSGP。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含由SEQ ID NO: 118之胺基酸序列組成之可裂解肽。(DLLA*VVAAS)。
在一些實施例中，可經蛋白分解方式裂解之連接子包含由SEQ ID NO: 119之胺基酸序列組成之可裂解肽。(ISSGLL*SGRS)。
示例性AK分子中所揭示之連接子組合可用於本文所揭示之任何IL-2細胞激素或其片段。示例性AK分子中所揭示之連接子組合可用於本文中所揭示之任何遮蔽部分。示例性AK分子中所揭示之連接子組合可用於任何半衰期延長域。換言之，示例性AK分子中所揭示之連接子可與任何本文中所揭示之IL-2細胞激素或其片段、本文中所揭示之遮蔽部分及/或本文中所揭示之半衰期延長域組合使用。
1.4 半衰期延長域 本文提供用於經遮蔽之細胞激素或其裂解產物的半衰期延長域。長的活體內半衰期對於治療性蛋白為重要的。不幸地，投與個體之細胞激素通常具有短半衰期，因為其通常藉由包括腎臟清除及內吞降解之機制自個體快速清除。因此，在本文所提供之經遮蔽之細胞激素中，半衰期延長域出於延長活體內細胞激素之半衰期的目的連接於經遮蔽之細胞激素。
術語「半衰期延長域」係指延長血清中目標組分之半衰期的域。術語「半衰期延長域」涵蓋例如抗體及抗體片段。
本文所提供之經遮蔽之細胞激素包含與第二半衰期延長域締合之第一半衰期延長域。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域係非共價締合的。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域係共價結合的。
在一些實施例中，第一半衰期延長域經由一或多個二硫鍵連接於第二半衰期延長域。
在一些實施例中，第一半衰期延長域經由半衰期延長域連接子(HLDL)連接於第二半衰期延長域。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域係非共價締合的，且此外，第一半衰期延長域經由二硫鍵連接於第二半衰期延長域。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含第一抗體或其片段，且第二半衰期延長域包含第二抗體或其片段。
能夠進行FcRn介導之再循環之抗體或其片段可降低或另外延遲經遮蔽之細胞激素自個體之清除，由此延長投與之經遮蔽之細胞激素之半衰期。在一些實施例中，抗體或其片段為能夠進行FcRn介導之再循環之任何抗體或其片段，諸如能夠進行FcRn介導之再循環之任何重鏈多肽或其部分(例如Fc域或其片段)。
抗體或其片段可為任何抗體或其片段。然而，在包含第一半衰期延長域及第二半衰期延長域之經遮蔽之細胞激素的一些實施例中，第一半衰期延長域或第二半衰期延長域可包含不結合於FcRn受體之抗體或其片段，諸如輕鏈多肽。舉例而言，在經遮蔽之細胞激素之一些實施例中，第一半衰期延長域包括包含不與FcRn受體直接相互作用之輕鏈多肽或其部分的抗體或其片段，但經遮蔽之細胞激素由於包含能夠與FcRn受體相互作用之第二半衰期延長域，諸如包含重鏈多肽而仍然具有延長的半衰期。此項技術中公認FcRn介導之再循環需要將FcRn受體結合於抗體或其片段之Fc區。舉例而言，研究已顯示殘基I253、S254、H435及Y436 (根據Kabat EU指數編號系統編號)對於人類Fc區與人類FcRn複合物之間的相互作用為重要的。參見例如Firan, M.等人, Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002；Shields, R.L.等人, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。亦已檢查及報導殘基248-259、301-317、376-382及424-437 (根據Kabat EU指數編號系統編號)之各種突變體。Yeung, Y.A.等人, (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671。
在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽或輕鏈多肽。在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽或輕鏈多肽之一部分。在一些實施例中，抗體或其片段包含Fc域或其片段。在一些實施例中，抗體或其片段包含CH2及CH3域或其片段。在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽之恆定域。在一些實施例中，抗體或其片段包含輕鏈多肽之恆定域。在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽或其片段(例如Fc域或其片段)。在一些實施例中，抗體或其片段包含輕鏈多肽。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含第一Fc域或其片段且第二半衰期延長域包含第二Fc域或其片段。
在一些實施例中，第一Fc域及/或第二Fc域各含有一或多個促進第一半衰期延長域與第二半衰期延長域之非共價締合的修飾。在一些實施例中，第一半衰期延長域包含包括突變Y349C、T366S、L38A及Y407V以在第一半衰期延長域中形成『臼』之IgG1 Fc域或其片段且第二半衰期延長域包含包括突變S354C及T366W以在第二半衰期延長域中形成『杵』之IgG1 Fc域或其片段。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1、IgG2或IgG4 Fc域或其片段。在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段。人類IgG1免疫球蛋白重鏈恆定γ1具有序列：
Figure 02_image001
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域來源於具有SEQ ID NO: 6之人類IgG1免疫球蛋白重鏈恆定γ1之序列(『親本序列』)，使得第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自包含具有一或多個胺基酸修飾之SEQ ID NO: 6或其片段。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自包含以上粗體所示之SEQ ID NO: 6之部分，視情況具有一或多個胺基酸修飾，亦即：
Figure 02_image003
Figure 02_image005
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域包含具有胺基酸取代以根據『杵臼』方法促進第一半衰期延長域及第二半衰期延長域之締合的SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，序列SEQ ID NO: 7含有突變Y349C、T366S、L38A及Y407V (根據Kabat EU編號系統編號)以在第一半衰期延長域中形成『臼』且含有突變S354C及T366W (根據Kabat EU編號系統編號)以在第二半衰期延長域中形成『杵』。此等經修飾之序列具有下文所示之SEQ ID NO 8及11： 第一半衰期延長域(Y349C；T366S；L38A；及Y407V) SEQ ID NO 8：
Figure 02_image007
第二半衰期延長域(S354C及T366W) SEQ ID NO 11：
Figure 02_image009
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自進一步包含胺基酸取代N297A，根據Kabat EU編號系統編號： 第一半衰期延長域(Y349C；T366S；L38A；Y407V及N297A) SEQ ID NO 9：
Figure 02_image011
Figure 02_image013
第二半衰期延長域(S354C、T366W及N297A) SEQ ID NO 12：
Figure 02_image015
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自進一步包含胺基酸取代I253A，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自進一步包含胺基酸取代N297A及I253A，根據Kabat EU編號系統編號： 第一半衰期延長域(Y349C；T366S；L38A；Y407V、N297A及I253A) SEQ ID NO 10：
Figure 02_image017
第二半衰期延長域(S354C、T366W、N297A及I253A) SEQ ID NO 13：
Figure 02_image019
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含與SEQ ID NO: 7、8、9及10中之任一者之任何胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，第二半衰期延長域包含與SEQ ID NO: 7、11、12及13中之任一者之任何胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含與SEQ ID NO: 7、8、9及10中之任一者之胺基酸序列相比具有一或多個修飾，諸如一或多個胺基酸取代、添加或缺失的胺基酸序列。在一些實施例中，第二半衰期延長域包含與SEQ ID NO: 7、11、12及13中之任一者之胺基酸序列相比具有一或多個修飾，諸如一或多個胺基酸取代、添加或缺失的胺基酸序列。一或多個修飾可為本文所述之任何修飾或改變，包括在一些實施例中，本文所揭示之促進多肽鏈之雜二聚化及/或遏制多肽鏈之均二聚、改變效應功能或增強效應功能的任何修飾或改變。
在一些實施例中，Fc域或其片段包含一或多個改變效應功能之胺基酸取代。在一些實施例中，半衰期延長域為IgG1 Fc域或其片段且包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N297A、N297G、N297Q、L234A、L235A、C220S、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、L234F、L235E、P331S、S267E、L328F、D265A及P329G，根據Kabat EU編號系統編號。在一些實施例中、半衰期延長域為IgG2 Fc域或其片段且包含胺基酸取代：V234A及G237A；H268Q、V309L、A330S及A331S；及/或V234A、G237A、P238S、H268A、V309L及A330S，根據Kabat EU編號系統編號。在一些實施例中、半衰期延長域為IgG2 Fc域或其片段且包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：V234A、G237A、H268Q、V309L、A330S、A331S、P238S、H268A及V309L，根據Kabat EU編號系統編號。在一些實施例中、半衰期延長域為IgG4 Fc域或其片段且包含胺基酸取代：L235A、G237A及E318A；S228P、L234A及L235A；H268Q、V309L、A330S及P331S；及/或S228P及L235A，根據Kabat EU編號系統編號。在一些實施例中、半衰期延長域為IgG2 Fc域或其片段且包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：L235A、G237A、E318A、S228P、L234A、H268Q、V309L、A330S及P331S，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，半衰期延長域包括包含一或多個增強效應功能之胺基酸取代之Fc域或其片段。在一些實施例中，半衰期延長域為IgG1 Fc域或其片段且包含胺基酸取代：S298A、E333A及K334A；S239D及I332E；S239D、A330L及I332E；P247I及A339D或A339Q；D280H及K290S；D280H、K290S及S298D或S298V；F243L、R292P及Y300L；F243L、R292P、Y300L及P396L；F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L；G236A、S239D及I332E；K326A及E333A；K326W及E333S；K290E、S298G及T299A；K290E、S298G、T299A及K326E；K290N、S298G及T299A；K290N、S298G、T299A及K326E；K334V；L235S、S239D及K334V；K334V及Q331M、S239D、F243V、E294L或S298T；E233L、Q311M及K334V；L234I、Q311M及K334V；K334V及S298T、A330M或A330F；K334V、Q311M及A330M或A330F；K334V、S298T及A330M或A330F；K334V、S239D及A330M或S298T；L234Y、Y296W及K290Y、F243V或E294L；Y296W及L234Y或K290Y；S239D、A330S及I332E、V264I；F243L及V264I；L328M；I332E；L328M及I332E；V264I及I332E；S239E及I332E；S239Q及I332E；S239E；A330Y；I332D；L328I及I332E；L328Q及I332E；V264T；V240I；V266I；S239D；S239D及I332D；S239D及I332N；S239D及I332Q；S239E及I332D；S239E及I332N；S239E及I332Q；S239N及I332D；S239N及I332E；S239Q及I332D；A330Y及I332E；V264I、A330Y及I332E；A330L及I332E；V264I、A330L及I332E；L234E、L234Y或L234I；L235D、L235S、L235Y或L235I；S239T；V240M；V264Y；A330I；N325T；I332E及L328D、L328V、L328T或L328I；V264I、I332E及S239E或S239Q；S239E、V264I、A330Y及I332E；A330Y、I332E及S239D或S239N；A330L、I332E及S239D或S239N；V264I、S298A及I332E；S298A、I332E及S239D或S239N；S239D、V264I及I332E；S239D、V264I、S298A及I332E；S239D、V264I、A330L及I332E；S239D、I332E及A330I；P230A；P230A、E233D及I332E；E272Y；K274T、K274E、K274R、K274L或K274Y；F275W；N276L；Y278T；V302I；E318R；S324D、S324I或S324V；K326I或K326T；T335D、T335R或T335Y；V240I及V266I；S239D、A330Y、I332E及L234I；S239D、A330Y、I332E及L235D；S239D、A330Y、I332E及V240I；S239D、A330Y、I332E及V264T；及/或S239D、A330Y、I332E及K326E或K326T，根據Kabat EU編號系統編號。在一些實施例中，半衰期延長域為IgG1 Fc域或其片段且包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：P230A、E233D、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、N325T、K326I、K326T、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R及T335Y。
在一些實施例中，半衰期延長域包含一或多個增強半衰期延長域與FcRn之結合的胺基酸取代。在一些實施例中，一或多個胺基酸取代增加酸性pH下含Fc之多肽(例如重鏈多肽或Fc域或其片段)與FcRn之結合親和力。在一些實施例中，半衰期延長域包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：M428F；T250Q及M428F；M252Y、S254T及T256E；P257I及N434H；D376V及N434H；P257I及Q3111；N434A；N434W；M428F及N434S；V259I及V308F；M252Y、S254T及T256E；V259I、V308F及M428F；T307Q及N434A；T307Q及N434S；T307Q、E380A及N434A；V308P及N434A；N434H；及V308P。
出於製造目的，信號肽可經工程改造在半衰期域上游以改善蛋白質之分泌。信號肽根據如此項技術中已知之細胞株要求來選擇。應瞭解，信號肽不表現為將純化且調配成藥品之蛋白質的一部分。1.4.1 雜二聚修飾 本文所述之半衰期延長域可包括一或多個促進兩種不同半衰期延長域之雜二聚的修飾。在一些實施例中，需要促進第一半衰期延長域與第二半衰期延長域之雜二聚，以使得有效產生呈正確雜二聚形式之經遮蔽之細胞激素。因此，可使用此項技術中可用之任何策略，包括如Klein等人 (2012), MAbs, 4(6): 653-663中所述之任何策略對第一半衰期延長域進行一或多個胺基酸修飾且可對第二半衰期延長域進行一或多個胺基酸修飾。在以下詳細描述示例性策略及修飾。杵臼方法 促進兩種不同半衰期延長域之雜二聚之一種策略為稱為「杵臼」之方法。
在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素包含第一半衰期延長域及第二半衰期延長域，其各自包含CH3域。在一些實施例中，包含CH3域之半衰期延長域為重鏈多肽或其片段(例如Fc域或其片段)。兩個半衰期延長域之CH3域可藉由「杵臼」技術改變，該技術以若干實例詳細描述於例如以下中：WO 1996/027011；Ridgway, J.B.等人, Protein Eng. (1996) 9(7): 617-621；Merchant, A.M.等人, Nat. Biotechnol. (1998) 16(7): 677-681。亦參見Klein等人 (2012), MAbs, 4(6): 653-663。使用杵臼方法，兩個CH3域之相互作用表面經改變以增加含有兩個改變之CH3域之兩個半衰期延長域的雜二聚。此藉由將大型殘基引入至半衰期延長域中之一者之CH3域中充當「杵」而發生。接著，為容納大型殘基，在另一半衰期延長域中形成可容納杵之「臼」。經改變CH3域中之任一者可為「杵」，而另一者可為「臼」。引入二硫橋鍵進一步穩定雜二聚體(Merchant, A.M.等人, Nat. Biotechnol. (1998) 16(7)；Atwell, S.等人, J. Mol. Biol. (1997) 270(1): 26-35)以及增加產率。
據報導，高於97%之雜二聚產率可藉由在重鏈中引入S354C及T366W突變以產生「杵」及藉由在重鏈中引入Y349C、T366S、L368A及Y407V突變以產生「臼」(殘基根據Kabat EU編號系統編號)來達成。Carter等人 (2001), J. Immunol. Methods, 248: 7-15；Klein等人 (2012), MAbs, 4(6): 653-663。
在包含第一半衰期延長域及第二半衰期延長域之一些實施例中，第一半衰期延長域包括包含胺基酸突變S354C及T366W(根據Kabat EU編號系統編號)之重鏈多肽或其部分(例如Fc域或其片段)，且第二半衰期延長域包括包含胺基酸突變Y349C、T366S、L368A及Y407V(根據Kabat EU編號系統編號)之重鏈多肽或其部分(例如Fc域或其片段)。在包含第一半衰期延長域及第二半衰期延長域之一些實施例中，第一半衰期延長域包括包含胺基酸突變Y349C、T366S、L368A及Y407V(根據Kabat EU編號系統編號)之重鏈多肽或其部分(例如Fc域或其片段)，且第二半衰期延長域包括包含胺基酸突變S354C及T366W(根據Kabat EU編號系統編號)之重鏈多肽或其部分(例如Fc域或其片段)。
可形成杵及臼之取代之額外實例包括US20140302037A1 (以引用之方式併入本文中)中所述之彼等取代。例如，在一些實施例中，可對各自含有Fc域之第一半衰期延長域(「第一域」)及配對之第二半衰期延長域(「第二域」)進行以下胺基酸取代中之任一者：(a)第一域中之Y407T及第二域中之T366Y；(b)第一域中之Y407A及第二域中之T366W；(c)第一域中之F405A及第二域中之T394W；(d)第一域中之F405W及第二域中之T394S；(e)第一域中之Y407T及第二域中之T366Y；(f)第一域中之T366Y及F405A及第二域中之T394W及Y407T；(g)第一域中之T366W及F405W及第二域中之T394S及Y407A；(h)第一域中之F405W及Y407A及第二域中之T366W及T394S；或(i)第一域中之T366W及第二域中之T366S、L368A及Y407V，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，可對各自含有Fc域之第一半衰期延長域(「第一域」)及配對之第二半衰期延長域(「第二域」)進行以下胺基酸取代中之任一者：(a)第一域中之Y407T及第二域中之T366Y；(b)第二域中之Y407A及第一域中之T366W；(c)第二域中之F405A及第一域中之T394W；(d)第二域中之F405W及第一域中之T394S；(e)第二域中之Y407T及第一域中之T366Y；(f)第二域中之T366Y及F405A及第一域中之T394W及Y407T；(g)第二域中之T366W及F405W及第一域中之T394S及Y407A；(h)第二域中之F405W及Y407A及第一域中之T366W及T394S；或(i)第二域中之T366W及第一域中之T366S、L368A及Y407V，根據Kabat EU編號系統編號。
在包含各自包含Fc域之第一半衰期延長域及第二半衰期延長域的實施例中，本文所述之雜二聚改變中之任一者可用於Fc域中以促進本文所述之經遮蔽之細胞激素中之任一者的雜二聚。
1.5 示例性經遮蔽之細胞激素 根據本發明之經遮蔽之細胞激素可組合如本文任何地方所述之IL-2細胞激素或其功能片段；如本文任何地方所述之遮蔽部分；如本文任何地方所述之第一及第二半衰期域；及如本文任何地方所述之可裂解及不可裂解連接子。
此外，在一實施例中，本文所揭示之任何特定序列可視情況包含進一步胺基酸取代，諸如一個、兩個或三個取代。在另一實施例中，本發明亦涵蓋與本文針對經遮蔽之細胞激素之域所揭示的任何特定序列具有至少90%、較佳95%、更佳99%同源性的序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10 (Y349C；T366S；L38A；Y407V、N297A及I253A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13 (S354C、T366W、N297A及I253A)。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10 (Y349C；T366S；L38A；Y407V、N297A及I253A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13 (S354C、T366W、N297A及I253A)。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10 (Y349C；T366S；L38A；Y407V、N297A及I253A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13 (S354C、T366W、N297A及I253A)。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10 (Y349C；T366S；L38A；Y407V、N297A及I253A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13 (S354C、T366W、N297A及I253A)
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10 (Y349C；T366S；L38A；Y407V、N297A及I253A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13 (S354C、T366W、N297A及I253A)。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10 (Y349C；T366S；L38A；Y407V、N297A及I253A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13 (S354C、T366W、N297A及I253A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10 (Y349C；T366S；L38A；Y407V、N297A及I253A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13 (S354C、T366W、N297A及I253A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10 (Y349C；T366S；L38A；Y407V、N297A及I253A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13 (S354C、T366W、N297A及I253A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10 (Y349C；T366S；L38A；Y407V、N297A及I253A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13 (S354C、T366W、N297A及I253A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列且遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9 (Y349C；T366S；L38A；Y407V；及N297A)且第二半衰期延長域包含SEQ ID NO 12 (S354C、T366W及N297A)且不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列。
2. 裂解產物 本文提供一種本文所述之『雜二聚體』經遮蔽之IL-2細胞激素的裂解產物。
本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素包含可裂解連接子。在可裂解連接子在裂解位點處進行蛋白水解裂解後，形成包含IL-2細胞激素或其功能片段之裂解產物。裂解產物中之IL-2細胞激素或其功能片段活化，因為其不再由遮蔽部分遮蔽。因此，裂解產物中之IL-2細胞激素或其功能片段能夠結合於目標蛋白。
腫瘤細胞環境複雜且可包含多種不同蛋白酶。因此，使經遮蔽之IL-2細胞激素內之給定可裂解肽在腫瘤細胞環境中裂解之精確位點可在腫瘤類型之間、在具有相同腫瘤類型之患者之間及甚至在同一腫瘤中形成之裂解產物之間變化。此外，即使在裂解之後，例如藉由移除一或兩個末端胺基酸對初始裂解產物之進一步修飾亦可藉由腫瘤細胞環境中蛋白酶之進一步作用進行。因此，在投與如本文所述之經遮蔽之細胞激素後，可預期在患者之腫瘤細胞環境中形成裂解產物之分佈。
本文提供一種能夠結合於IL-2R之裂解產物，該裂解產物包含IL-2細胞激素或其功能片段，可藉由如本文任何地方所定義之經遮蔽之IL-2細胞激素或其功能片段中的可裂解肽的蛋白水解裂解製備。
本文亦提供一種經遮蔽之IL-2細胞激素之裂解產物，其中該裂解產物能夠結合於IL-2R，該裂解產物包含如本文任何地方所定義之IL-2細胞激素或其功能片段。本文亦提供獲自或可獲自經遮蔽之IL-2細胞激素之單一結構的裂解產物的分佈，其中裂解產物之分佈內的各裂解產物(i)能夠結合於IL-2R及(ii)包含如本文任何地方所定義之IL-2細胞激素或其功能片段。
本文亦提供一種經遮蔽之IL-2細胞激素之裂解產物，其中該裂解產物能夠結合於IL-2R，該裂解產物包括包含式3之多肽：PCP-SD-C (3) 其中PCP為可經蛋白分解方式裂解之肽之一部分；SD為間隔子域；且C為IL-2細胞激素或其功能片段。
在一些實施例中，裂解產物具有與SEQ ID NO: 2之成熟IL-2具有至少90%同源性的胺基酸序列。
本文進一步提供一種經遮蔽之IL-2細胞激素之裂解產物，其中該裂解產物能夠結合於IL-2R，該裂解產物包括包含以下之蛋白質雜二聚體： a)       第一多肽鏈，其包含第一半衰期延長域；及 b)      第二多肽鏈，其包括包含式5之多肽：HL2-L2-C (5) 其中HL2為第二半衰期延長域；L2為不可裂解連接子；且C為IL-2細胞激素或其功能片段；且其中該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域締合。本文亦提供獲自或可獲自經遮蔽之IL-2細胞激素之單一結構的裂解產物的分佈，其中裂解產物之分佈內的各裂解產物(i)能夠結合於IL-2R及(ii)包括包含以下之蛋白質雜二聚體： a)       第一多肽鏈，其包含第一半衰期延長域；及 b)      第二多肽鏈，其包括包含式5之多肽：HL2-L2-C (5) 其中HL2為第二半衰期延長域；L2為不可裂解連接子；且C為IL-2細胞激素或其功能片段；且其中該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域締合。
本文進一步提供一種經遮蔽之IL-2細胞激素之裂解產物，其中該裂解產物能夠結合於IL-2R，該裂解產物包括包含以下之蛋白質雜二聚體： a)       第一多肽鏈，其包括包含式4之多肽：HL1-SD-PCP (4) 其中HL1為第一半衰期延長域；SD為間隔子域；且PCP為可經蛋白分解方式裂解之肽之一部分；及 b)      第二多肽鏈，其包括包含式5之多肽：HL2-L2-C (5) 其中HL2為第二半衰期延長域；L2為不可裂解連接子；且C為IL-2細胞激素或其功能片段；且 其中該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域締合。
在裂解產物內，遮蔽部分、半衰期延長域、IL-2細胞激素或其功能片段、連接子、間隔子域及第一半衰期延長域與第二半衰期延長域之間的締合類型可為本文所述之彼等中之任一者，及本文所述之彼等的任何組合。
可裂解肽之位置決定包含IL-2細胞激素之所得裂解產物的結構。
「可經蛋白分解方式裂解之肽之部分」係指在裂解位點發生裂解之後原始可經蛋白分解方式裂解之肽序列之一部分。在裂解之後，例如藉由移除一或兩個末端胺基酸對初始裂解產物之進一步修飾亦可藉由蛋白酶在腫瘤細胞環境中之進一步作用進行。因此，在投與經遮蔽之細胞激素後可能在患者之腫瘤細胞環境中形成的裂解產物之分佈內的裂解產物可能不含可經蛋白分解方式裂解之肽的任何部分。
在一些實施例中，「部分」係指原始可經蛋白分解方式裂解之肽序列的1個胺基酸、2個胺基酸、3個胺基酸、4個胺基酸、5個胺基酸或6個胺基酸。在一些實施例中，「部分」係指原始可經蛋白分解方式裂解之肽序列的2個胺基酸。在一些實施例中，「部分」係指原始可經蛋白分解方式裂解之肽序列的3個胺基酸。在一些實施例中，「部分」係指原始可經蛋白分解方式裂解之肽序列的4個胺基酸。
在一些實施例中，經蛋白分解方式裂解之肽之『部分』的長度為3至6個胺基酸。在一些實施例中，經蛋白分解方式裂解之肽之『部分』的長度為3或4個胺基酸。
下文揭示本文所揭示之可裂解連接子的裂解位點：
SEQ ID NO: 序列 (*指示可裂解肽內之裂解位點)
24 MPYD*LYHP
25 DSGG*FMLT
26 HEQ*LTV
27 RAAA*VKSP
28 VPLS*LY
118 DLLA*VVAAS
119 ISSGLL*SG*RS
僅舉例而言，在上表中，*指示可裂解肽內之已知或觀測到的蛋白酶裂解位點。
因此，本文揭示本文所揭示之經遮蔽之細胞激素中之任一者的裂解產物。
在一些實施例中，裂解產物包含與選自由SEQ ID NO: 52、53、54、55及56組成之群的胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物包含與選自由SEQ ID NO: 52、53、54、55、56及137組成之群的胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物包含與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物包含與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物包含與SEQ ID NO: 54之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物包含與SEQ ID NO: 55之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物包含與SEQ ID NO: 56之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物包含與SEQ ID NO: 137之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，裂解產物具有選自由SEQ ID NO: 52、53、54、55及56組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物具有選自由SEQ ID NO: 52、53、54、55、56及137組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物具有SEQ ID NO: 52之胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物具有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物具有SEQ ID NO: 54之胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物具有SEQ ID NO: 55之胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物具有SEQ ID NO: 56之胺基酸序列。在一些實施例中，裂解產物具有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
此等裂解產物之胺基酸序列與SEQ ID NO: 2之成熟IL-2的同源性%展示於下表1中：表 1
描述 與成熟 IL-2 SEQ ID NO: 2 之同源性 %
AK168裂解產物(「AK168CP」) 91.4
AK191裂解產物1(「AK191CP」) 91.4
AK197裂解產物(「AK197CP」) 92.1
AK203裂解產物3(「AK203CP」) 91.4
AK209裂解產物(「AK209CP) 92.8
成熟IL-2 (SEQ ID NO: 2) 100
在一些實施例中，裂解產物包含具有與SEQ ID NO: 136之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列的第一多肽鏈及具有與SEQ ID NO: 135之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列的第二多肽鏈。在一些實施例中，裂解產物包含具有與SEQ ID NO: 139之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列的第一多肽鏈及具有與SEQ ID NO: 138之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列的第二多肽鏈。在一些實施例中，裂解產物包含具有與SEQ ID NO: 141之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列的第一多肽鏈及具有與SEQ ID NO: 140之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列的第二多肽鏈。在一些實施例中，裂解產物包含具有與SEQ ID NO: 143之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列的第一多肽鏈及具有與SEQ ID NO: 142之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列的第二多肽鏈。
在一些實施例中，裂解產物具有具有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之第二多肽鏈。在一些實施例中，裂解產物具有具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列之第二多肽鏈。在一些實施例中，裂解產物具有具有SEQ ID NO: 141之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 140之胺基酸序列之第二多肽鏈。在一些實施例中，裂解產物具有具有SEQ ID NO: 143之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 142之胺基酸序列之第二多肽鏈。
3.   結合分析 諸如細胞激素或其功能片段與細胞激素或其功能片段特異性針對之結合搭配物(例如目標蛋白，諸如細胞激素受體)之間的免疫結合相互作用的強度或親和力可根據相互作用之解離常數(Kd)表示，其中Kd愈小，表示親和力愈大。IL-2細胞激素與IL-2細胞激素受體(例如IL-2R或其組分，諸如IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ或其組合)之結合可根據Kd表示。在一些實施例中，免疫結合相互作用係在經遮蔽之細胞激素(在存在或不存在蛋白酶下)與目標蛋白(諸如細胞激素受體)之間。在IL-2細胞激素結合之情形下，目標蛋白可為IL-2R (包含IL-2Rα、IL-2Rβ及IL-2Rγ鏈)、IL-2Rα鏈、IL-2Rβ鏈或IL-2Rα/β二聚複合物。蛋白質之免疫結合特性可使用此項技術中熟知之方法定量。舉例而言，一種方法包含量測細胞激素受體(例如IL-2R)/細胞激素(例如IL-2)複合物形成及解離之速率，其中彼等速率視複合搭配物之濃度、相互作用之親和力及同等影響兩個方向上速率之幾何參數而定。「締合速率常數」(Kon)及「解離速率常數」(Koff)可藉由計算濃度以及締合及解離之實際速率來確定。Koff/Kon之比率能夠抵消不與親和力相關之所有參數，且等於解離常數Kd。參見Davies等人, Annual Rev Biochem. 59:439-473, (1990)。
在一些態樣中，與包含遮蔽部分但不包含可裂解肽之親本細胞激素相比，本文所述之經遮蔽之細胞激素在經蛋白酶裂解後以約相同或更高親和力結合於目標蛋白。目標蛋白可為任何細胞激素受體。在一些實施例中，目標蛋白為IL-2R (包含IL-2Rα、IL-2Rβ及IL-2Rγ鏈)。在一些實施例中，目標蛋白為IL-2Rα。在一些實施例中，目標蛋白為IL-2Rβ。在一些實施例中，目標蛋白為IL-2Rα/β二聚體複合物。
在一些實施例中，本文提供的在連接子中不包含可裂解肽之經遮蔽之細胞激素與目標蛋白的解離常數(Kd)≤ 1M，≤150 nM，≤100 nM，≤50 nM，≤ 10 nM，≤1 nM，≤0.1 nM，≤0.01 nM，或≤ 0.001 nM (例如10-8 M或更少，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在一些實施例中，本文提供的在連接子中包含可裂解肽之經遮蔽之細胞激素在經蛋白酶裂解之前與目標蛋白的解離常數(Kd)≤ 1M，≤150 nM，≤100 nM，≤50 nM，≤ 10 nM，≤1 nM，≤0.1 nM，≤0.01 nM，或0.001 nM (例如10-8 M或更少，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在一些實施例中，本文提供的在連接子中包含可裂解肽之經遮蔽之細胞激素在經蛋白酶裂解之後與目標蛋白的解離常數(Kd)≤ 1M，≤150 nM，≤100 nM，≤50 nM，≤ 10 nM，≤1 nM，≤0.1 nM，≤0.01 nM，或0.001 nM (例如10-8 M或更少，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在一些實施例中，本文提供之經遮蔽之細胞激素的細胞激素或其功能片段與經遮蔽之細胞激素之遮蔽部分的解離常數(Kd)≥ 500M，≥ 250M，≥ 200M，≥ 150M，≥ 100M，≥ 50M，≥ 10M，≥ 1M，≥ 500 nM，≥ 250 nM，≥ 150 nM，≥ 100 nM，≥ 50 nM，≥ 10 nM，≥ 1 nM，≥ 0.1 nM，≥ 0.01 nM，或≥ 0.001 nM。在一些實施例中，本文提供的經遮蔽之細胞激素之細胞激素或其功能片段大解離常數(Kd)介於約200 M與約50 nM之間，諸如約或至少約175M、約或至少約150M、約或至少約125M、約或至少約100M、約或至少約75M、約或至少約50M、約或至少約25M、約或至少約5M、約或至少約1M約或至少約750 nM、約或至少約500 nM、約或至少約250 nM、約或至少約150 nM、約或至少約100 nM、約或至少約75 nM或約或至少約50 nM。用於評估結合親和力之分析為此項技術中所熟知。
在一些態樣中，提供展現期望之包藏率的經遮蔽之細胞激素。如本文所用，術語「包藏率」係指(a)在第一組條件下參數之最大偵測水準與(b)在第二組條件下參數之最小偵測值的比率。在經遮蔽之IL-2多肽的情況下，包藏率係指(a)在至少一種能夠使經遮蔽之IL-2多肽之可裂解肽裂解的蛋白酶存在下結合於經遮蔽之IL-2多肽之目標蛋白(例如IL-2R蛋白)的最大偵測水準與(b)在該蛋白酶不存在下結合於經遮蔽之IL-2多肽之目標蛋白(例如IL-2R蛋白)的最小偵測水準的比率。因此，經遮蔽之細胞激素之包藏率可藉由將經遮蔽之細胞激素在裂解前的EC50除以經遮蔽之細胞激素在裂解後的EC50來計算。經遮蔽之細胞激素之包藏率亦可計算為經遮蔽之細胞激素在裂解前的解離常數與經遮蔽之細胞激素在用蛋白酶裂解後的解離常數的比率。在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素之包藏率愈大，指示在能夠使經遮蔽之細胞激素之可裂解肽裂解的蛋白酶存在下經遮蔽之細胞激素結合目標蛋白的發生程度愈比在不存在蛋白酶下大(例如主要發生)。
在一些實施例中，本文提供具有最佳包藏率之經遮蔽之細胞激素。在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素之最佳包藏率指示經遮蔽之細胞激素具有適用於本文中考慮之方法或組合物的理想特性。在一些實施例中，本文提供之經遮蔽之細胞激素展現約2至約10,000，例如約80至約100之最佳包藏率。在本文提供之任一經遮蔽之細胞激素的另一實施例中，包藏率為約2至約7,500、約2至約5,000、約2至約2,500、約2至約2,000、約2至約1,000、約2至約900、約2至約800、約2至約700、約2至約600、約2至約500、約2至約400、約2至約300、約2至約200、約2至約100、約2至約50、約2至約25、約2至約15、約2至約10、約5至約10、約5至約15、約5至約20、約10至約100、約20至約100、約30至約100、約40至約100、約50至約100、約60至約100、約70至約100、約80至約100或約100至約1,000。在一些實施例中，本文提供之經遮蔽之細胞激素展現約2至約1,000之最佳包藏率。在經蛋白酶裂解之前及/或裂解之後經遮蔽之IL-2多肽與目標蛋白的結合可使用此項技術中熟知之技術，諸如藉由ELISA測定。
在一些實施例中，本文所述之遮蔽部分以比細胞激素或其功能片段與目標蛋白(例如細胞激素受體)之間的親和力低的親和力結合於如本文所述之細胞激素或其功能片段。在某些實施例中，本文提供之經遮蔽之細胞激素以≥ 500M、≥ 250M、≥ 200M、≥ 150M、≥ 100M、≥ 50M、≥ 10M、≥ 1M、≥ 500 nM、≥ 250 nM、≥ 150 nM、≥ 100 nM、≥ 50 nM、≥ 10 nM、≥ 1 nM、≥ 0.1 nM、≥ 0.01 nM或≥ 0.001 nM之解離常數(Kd)結合於如本文所述之細胞激素或其功能片段。 4.   具有變異遮蔽部分之經遮蔽之細胞激素 本文提供具有變異遮蔽部分之經遮蔽之細胞激素。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含遮蔽部分及IL-2細胞激素或其功能片段，其中該遮蔽部分遮蔽IL-2細胞激素或其功能片段，藉此減少或阻止IL-細胞激素或其功能片段與其同源受體之結合，且其中可經蛋白分解方式裂解之肽存在於IL-2片段素或其功能片段與遮蔽部分之間。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽在位置C122處具有胺基酸取代。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽具有胺基酸取代C122S。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比在位置C122處具有胺基酸取代。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比具有胺基酸取代C122S。
本文提供一種IL-2Rβ多肽，其包含具有C122突變之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
本文提供一種IL-2Rβ多肽，其包含具有C122S突變之SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽在位置C168處具有胺基酸取代。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽具有胺基酸取代C168S。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比在位置C168處具有胺基酸取代。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比具有胺基酸取代C168S。
本文提供一種IL-2Rβ多肽，其包含具有C168突變之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
本文提供一種IL-2Rβ多肽，其包含具有C168S突變之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽在位置C122及C168處具有胺基酸取代。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽具有胺基酸取代C122S及C168S。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比在位置C122及C168處具有胺基酸取代。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比具有胺基酸取代C122S及C168S。
本文提供一種IL-2Rβ多肽或其功能片段，其中該IL-2Rβ多肽包含SEQ ID NO: 5之胺基酸。
本文提供一種經遮蔽之細胞激素，其包含遮蔽部分及IL-2細胞激素或其功能片段，其中該遮蔽部分遮蔽IL-2細胞激素或其功能片段，藉此減少或阻止IL-2細胞激素或其功能片段與其同源受體之結合，且其中可經蛋白分解方式裂解之肽存在於IL-2細胞激素或其功能片段與遮蔽部分之間，且遮蔽部分為如本文任何地方所定義之IL-2Rβ多肽或其功能片段。
4.1 『雜二聚體』經遮蔽之細胞激素 在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含第一多肽鏈中之遮蔽部分及第二多肽鏈中之IL-2細胞激素或其功能片段。在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素如本文任何地方所述。在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含式6 (第一多肽鏈)及5 (第二多肽鏈)，如下： N'HL1-L1-MM C' (6) N'HL2-L2-C C' (5) 其中HL1為第一半衰期延長域，L1為第一連接子，MM為遮蔽部分，HL2為第二半衰期延長域，L2為第二連接子，且C為IL-2細胞激素或其功能片段，其中至少該第一連接子或該第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。在一些實施例中，第一半衰期延長域、第一連接子、遮蔽部分、第二半衰期延長域、第二連接子及IL-2細胞激素或其功能片段如本文中任何地方所述。
已發現具有如SEQ ID NO: 118或119中所示之胺基酸序列的可裂解肽展現在腫瘤細胞環境中與非腫瘤細胞環境相比極具特異性之裂解。因此，此等可裂解肽可有利地與本文所揭示之變異遮蔽部分組合使用。
4.2 『線性』經遮蔽之細胞激素 在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含連接在單一多肽鏈中之遮蔽部分及IL-2細胞激素或其功能片段。在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包括包含式1之多肽鏈： N'HL-L2-C-L1-MM C' (1) 其中HL為半衰期延長域，L1為第一連接子，MM為遮蔽部分，L2為第二連接子，且C為IL-2細胞激素或其功能片段，其中至少該第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包括包含式2之多肽鏈： N'HL-L2-MM-L1-C C' (2) 其中HL為半衰期延長域，L1為第一連接子，MM為遮蔽部分，L2為第二連接子，且C為IL-2細胞激素或其功能片段，其中至少該第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。在一些實施例中，第一連接子為如本文中任何地方所述之可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子為如本文中任何地方所述之不可裂解連接子。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段如本文中任何地方所述。在一些實施例中，半衰期延長域(HL)包括包含二聚Fc域(HL1-HL2)之抗體之Fc區(亦即，免疫球蛋白重鏈之C端區)或其片段。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基端。在一些實施例中，抗體之二聚Fc域(HL1-HL2)包含如本文任何地方所述之第一半衰期延長域及第二半衰期延長域，其中該第一半衰期延長域包含第一Fc域或其片段且該第二半衰期延長域包含第二Fc域或其片段。在一些實施例中，HL2為多肽鏈之組分且HL1與HL2二聚。
已發現具有如SEQ ID NO: 118或119中所示之胺基酸序列的可裂解肽展現在腫瘤細胞環境中與非腫瘤細胞環境相比極具特異性之裂解。
在一些實施例中，HL2為多肽鏈之組分且HL1二聚，使得： 第一多肽鏈包含： N'HL1 C' 且第二多肽鏈包含： N'HL2-L2-MM-L1-C C'
4.3 變異遮蔽部分 在一些實施例中，遮蔽部分如本文任何地方所述。在一些實施例中，遮蔽部分包含IL-2Rβ或其片段、部分或變異體。在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在一些實施例中，遮蔽部分包含與SEQ ID NO: 4之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，遮蔽部分包含具有具一至四個胺基酸取代之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的胺基酸序列。在一些實施例中，遮蔽部分包含具有具一或兩個胺基酸取代之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比在胺基酸位置122處具有突變C122S。在一些實施例中，遮蔽部分包含具有C122S突變之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比在胺基酸位置168處具有突變C168S。在一些實施例中，遮蔽部分包含具有C168S突變之SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2Rβ相比具有突變C122S及C168S。在一些實施例中，遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。
5.   具有變異半衰期延長域之經遮蔽之細胞激素 本文提供具有變異半衰期延長域之經遮蔽之細胞激素。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含遮蔽部分及IL-2細胞激素或其功能片段，其中該遮蔽部分遮蔽IL-2細胞激素或其功能片段，藉此減少或阻止IL-細胞激素或其功能片段與其同源受體之結合，且其中可經蛋白分解方式裂解之肽存在於IL-2片段或其功能片段與遮蔽部分之間。
本文提供一種IgG1 Fc域或其片段，其包含胺基酸取代I253A，根據Kabat EU編號系統編號。
本文提供一種IgG1 Fc域或其片段，其包含胺基酸取代N297A及I253A，根據Kabat EU編號系統編號。
本文提供一種二聚體，所述二聚體包括：第一多肽序列，所述第一多肽序列包括包含胺基酸取代I253A的IgG1 Fc域或其片段；及第二多肽序列，所述第二多肽序列包括包含胺基酸取代I253A之IgG1 Fc域或其片段。
本文提供一種二聚體，所述二聚體包括：第一多肽序列，所述第一多肽序列包括包含胺基酸取代N297A及I253A之IgG1 Fc域或其片段；及第二多肽序列，所述第二多肽序列包括包含胺基酸取代N297A及I253A之IgG1 Fc域或其片段。
本文提供一種二聚體，包含第一多肽序列包含SEQ ID NO: 10且第二多肽序列包含SEQ ID NO: 13。
本文提供一種經遮蔽之細胞激素，其包含遮蔽部分、IL-2細胞激素或其功能片段及半衰期延長域，其中該遮蔽部分遮蔽IL-2細胞激素或其功能片段，藉此減少或阻止IL-2細胞激素或其功能片段與其同源受體之結合，且其中可經蛋白分解方式裂解之肽存在於IL-2細胞激素或其功能片段與遮蔽部分之間，且半衰期延長域包含二聚IgG1 Fc域，如本文任何地方所定義。
5.1 『雜二聚體』經遮蔽之細胞激素 在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含第一多肽鏈中之遮蔽部分及第二多肽鏈中之IL-2細胞激素或其功能片段。在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素如本文任何地方所述。在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含式6 (第一多肽鏈)及5 (第二多肽鏈)，如下： N'HL1-L1-MM C' (6) N'HL2-L2-C C' (5) 其中HL1為第一半衰期延長域，L1為第一連接子，MM為遮蔽部分，HL2為第二半衰期延長域，L2為第二連接子，且C為IL-2細胞激素或其功能片段，其中至少該第一連接子或該第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。在一些實施例中，第一半衰期延長域、第一連接子、遮蔽部分、第二半衰期延長域、第二連接子及IL-2細胞激素或其功能片段如本文中任何地方所述。
已發現具有如SEQ ID No: 118或119中所示之胺基酸序列的可裂解肽展現在腫瘤細胞環境中與非腫瘤細胞環境相比極具特異性之裂解。
5.2 『線性』經遮蔽之細胞激素 在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包含連接在單一多肽鏈中之遮蔽部分及IL-2細胞激素或其功能片段。在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包括包含式1之多肽鏈： N'HL-L2-C-L1-MM C' (1) 其中HL為半衰期延長域，L1為第一連接子，MM為遮蔽部分，L2為第二連接子，且C為IL-2細胞激素或其功能片段，其中至少該第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素包括包含式2之多肽鏈： N'HL-L2-MM-L1-C C' (2) 其中HL為半衰期延長域，L1為第一連接子，MM為遮蔽部分，L2為第二連接子，且C為IL-2細胞激素或其功能片段，其中至少該第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。在一些實施例中，IL-2細胞激素或其功能片段如本文中任何地方所述。在一些實施例中，遮蔽部分如本文中任何地方所述。在一些實施例中，半衰期延長域(HL)包括包含二聚Fc域(HL1-HL2)之抗體之Fc區(亦即，免疫球蛋白重鏈之C端區)或其片段。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基端。在一些實施例中，抗體之二聚Fc域(HL1-HL2)包含如本文任何地方所述之第一半衰期延長域及第二半衰期延長域，其中該第一半衰期延長域包含第一Fc域或其片段且該第二半衰期延長域包含第二Fc域或其片段。在一些實施例中，HL2為多肽鏈之組分且HL1與HL2二聚。
在一些實施例中，HL2為多肽鏈之組分且HL1二聚，使得： 第一多肽鏈包含： N'HL1 C' 且第二多肽鏈包含： N'HL2-L2-MM-L1-C C'
已發現具有如SEQ ID NO: 118或119中所示之胺基酸序列的可裂解肽展現在腫瘤細胞環境中與非腫瘤細胞環境相比極具特異性之裂解。因此，此等可裂解肽可有利地與本文所揭示之變異半衰期延長域組合使用。
5.3 變異半衰期延長域 在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段。在一些實施例中，第一半衰期延長域包含包括突變I253A之IgG1 Fc域或其片段且第二半衰期延長域包含包括突變I253A之IgG1 Fc域或其片段。在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域來源於具有SEQ ID NO: 6之人類IgG1免疫球蛋白重鏈恆定γ1之序列(『親本序列』)，使得該第一半衰期延長域及該第二半衰期延長域各自包含具有一或多個胺基酸修飾之SEQ ID NO: 7或其片段。在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域包含具有胺基酸取代以根據『杵臼』方法促進第一半衰期延長域及第二半衰期延長域之締合的SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，序列SEQ ID NO: 7含有突變Y349C、T366S、L38A及Y407V (根據Kabat EU編號系統編號)以在第一半衰期延長域中形成『臼』且含有突變S354C及T366W (根據Kabat EU編號系統編號)以在第二半衰期延長域中形成『杵』。在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自進一步包含胺基酸取代N297A，根據Kabat EU編號系統編號。在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自進一步包含胺基酸取代I253A，根據Kabat EU編號系統編號。在一些實施例中，第一半衰期延長域及第二半衰期延長域各自進一步包含胺基酸取代N297A及I253A，根據Kabat EU編號系統編號。在一些實施例中，第一半衰期延長域包含與SEQ ID NO: 7、8、9及10中之任一者之任何胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，第二半衰期延長域包含與SEQ ID NO: 7、11、12及13中之任一者之任何胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
6.   經遮蔽之IL-2細胞激素之產生 使用此項技術中可利用之技術製備本文所述之經遮蔽之細胞激素，描述該等技術之示例性方法。
6.1 抗體產生 經遮蔽之IL-2細胞激素之一些實施例包含抗體或其片段。以下章節提供關於產生可用於本文提供之經遮蔽之IL-2細胞激素之一些實施例中的抗體及其抗體片段、變異體及衍生物的其他細節。在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素呈由經由二硫鍵締合之經遮蔽之IL-2細胞激素之兩個複本產生的二聚體形式。
1. 抗體片段 在一些實施例中，本發明涵蓋抗體片段。抗體片段可為任何抗體片段，在其他片段當中，諸如Fc域、重鏈一部分、輕鏈一部分、Fab、Fv或scFv。可藉由傳統手段(諸如酶消化)或藉由重組技術產生抗體片段。在某些情況下，存在將抗體片段而非完全抗體連接至本文所述之經遮蔽之細胞激素的優點。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人 (2003) Nat. Med. 9:129-134。
已開發出用於產生抗體片段之多種技術。傳統上，此等片段經由完整抗體之蛋白水解消化而獲得(參見例如Morimoto等人, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992))；及Brennan等人, Science, 229:81 (1985))。然而，此等片段現可藉由重組宿主細胞直接產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段皆可在大腸桿菌及其他細胞類型(諸如HEK293及CHO細胞)中表現且由其分泌，因此允許便捷產生大量此等片段。或者，可直接自培養基回收Fab-SH片段且以化學方式偶合以形成F(ab)2片段(Carter等人, Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。根據另一方法，F(ab)2片段可自重組宿主細胞培養物直接分離。活體內半衰期延長且包含FcRN/救助受體結合抗原決定基殘基之Fab及F(ab)2片段描述於美國專利第5,869,046號中。用於產生用於經遮蔽之細胞激素之抗體片段的其他技術對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。在某些實施例中，經遮蔽之細胞激素包含單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利第5,571,894號；及第5,587,458號。可構築scFv融合蛋白以在scFv之胺基或羧基端產生效應蛋白之融合。參見Antibody Engineering, 編輯Borrebaeck, 上述。另外，在一些實施例中，包含兩個經由多肽連接子連接之scFv的雙scFv可與經遮蔽之細胞激素一起使用。
在一些實施例中，本發明包括線性抗體(例如如美國專利第5,641,870號中所述)或包含經由適當連接子連接之抗體之重鏈及輕鏈序列的單鏈免疫球蛋白。此類線性抗體或免疫球蛋白可為單特異性或雙特異性。此類單鏈免疫球蛋白可以二聚合，以藉此保持類似彼等最初為四聚體之抗體之結構及活性。此外，在一些實施例中，抗體或其片段可為具有單一重鏈可變區且不具有輕鏈序列之抗體。此類抗體稱為單域抗體(sdAb)或奈米抗體。此等抗體亦涵蓋於根據本發明之抗體之功能片段的含義中。抗體片段可根據本文提供之指導連接於本文所述之經遮蔽之細胞激素。
2. 人類化抗體 在一些實施例中，本發明涵蓋人類化抗體或其抗體片段。在一些實施例中，人類化抗體可為任何抗體，包括任何抗體片段。人類化非人類抗體的多種方法在此項技術中已知。舉例而言，人類化抗體可具有一或多個由非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其典型地取自「輸入」可變域。人類化可基本上遵循Winter之方法(Jones等人(1986) Nature 321:522-525；Riechmann等人(1988) Nature 332:323-327；Verhoeyen等人(1988) Science 239:1534-1536)，藉由用高變區序列取代人類抗體之對應序列來進行。因此，此類「人類化」抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上少於已被來自非人類物種之對應序列取代之完整人類可變域。實際上，人類化抗體通常為一些高變區殘基及可能一些FR殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代之人類抗體。人類化抗體可根據本文提供之指導連接於本文所述之經遮蔽之細胞激素。
3. 人類抗體 本發明之一些實施例之人類抗體可藉由組合選自人類衍生之噬菌體呈現集合庫之Fv純系可變域序列與已知之人類恆定域序列來構築。或者，本發明之一些實施例之人類單株抗體可藉由雜交瘤方法，例如藉由使用小鼠、大鼠、牛(例如乳牛)或兔細胞例如產生人類單株抗體來製備。在一些實施例中，人類抗體及人類單株抗體可為結合於任何抗原之抗體。在一些實施例中，本發明之人類單株抗體可藉由用目標抗原對包含人類免疫球蛋白基因座之非人類動物進行免疫接種，且自經免疫接種之動物或自來源於經免疫接種之動物之細胞分離抗體來製備。適合非人類動物之實例包括轉殖基因或轉染色體動物，諸如HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.)、KM Mouse®、「TC小鼠」及Xenomouse™。參見例如Lonberg等人, (1994) Nature 368: 856-859；Fishwild, D.等人 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851；WO2002/43478；美國專利第5,939,598號；第6,075,181號；第6,114,598號；第6,150,584號；第6,162,963號；及Tomizuka等人 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727。
用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及鼠類-人類雜骨髓瘤細胞株已例如由以下所述：Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人, J. Immunol., 147: 86 (1991)。人類抗體可根據本文提供之指導連接於本文所述之經遮蔽之細胞激素。
4. 雙特異性抗體 雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體是人類或人類化抗體。在一些實施例中，其中一種結合特異性係針對第一抗原且另一結合特異性係針對第二抗原，該等抗原可為同一目標蛋白上之兩種不同抗原決定基或兩個不同目標蛋白上之兩種不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位至表現第一抗原及/或第二抗原之細胞。雙特異性抗體亦可用於募集細胞，諸如T細胞或自然殺手細胞，以殺死某些細胞，例如癌細胞。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。雙特異性抗體可根據本文提供之指導連接於本文所述之經遮蔽之細胞激素。
用於製備雙特異性抗體之方法係此項技術中已知。參見Milstein及Cuello, Nature, 305: 537 (1983)；1993年5月13日公開之WO 93/08829；Traunecker等人, EMBO J., 10: 3655 (1991)；Kontermann及Brinkmann, Drug Discovery Today, 20(7):838-847。有關產生雙特異性抗體之其他細節，參見例如Suresh等人, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)。雙特異性抗體包括交聯或「雜接合」抗體。舉例而言，雜接合物中之一種抗體可與抗生素蛋白偶合，另一種抗體與生物素偶合。雜接合抗體可使用任何適宜之交聯方法製得。適合的交聯劑以及許多交聯技術為此項技術中熟知的且揭示於美國專利第4,676,980號中。
5. 單域抗體 在一些實施例中，單域抗體根據本文提供之指導連接於經遮蔽之細胞激素。單域抗體可為任何抗體。單域抗體為包含抗體之全部或一部分重鏈可變域或全部或一部分輕鏈可變域之單一多肽鏈。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, Mass.；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。在一些實施例中，單域抗體由抗體之全部或一部分重鏈可變域組成。在一些實施例中，單域抗體為駱駝來源之抗體，其藉由用目標抗原對駱駝進行免疫接種而獲得。在一些實施例中，單域抗體為鯊魚來源之抗體，其藉由用目標抗原對鯊魚進行免疫接種而獲得。在一些實施例中，單域抗體為奈米抗體(參見例如WO 2004041865A2及US20070269422A1)。
6. 抗體變異體 在一些實施例中，考慮本文所述之抗體或其片段之胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改善抗體之FcRn結合親和力及/或pH依賴性FcRn結合親和力。亦可能需要藉由引入某些胺基酸修飾來促進抗體重鏈之雜二聚。用於促進抗體鏈之雜二聚的方法，包括用以促進雜二聚化之某些修飾，藉由Klein等人 (2012), MAbs, 4(6): 653-663描述。
可藉由將適當的變化引入編碼抗體之核苷酸序列或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此類修飾包括例如抗體之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵。可在製得序列時，在標的抗體胺基酸序列中引入胺基酸變化。
一種適用於鑑別抗體中作為用於突變誘發之較佳位置的某些殘基或區域之方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989) Science, 244:1081-1085所描述。本文中，鑑別一個殘基或一組目標殘基(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且經中性或帶負電之胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換，以影響胺基酸與抗原之相互相用。隨後，藉由在取代位點處或為取代位點引入另外的或其他變異體來優化對取代展現功能敏感性之彼等胺基酸位置。因此，儘管用於引入胺基酸序列變異之位點係預定的，但突變本身之性質無需為預定的。舉例而言，為分析既定位點處之突變效能，在目標密碼子或區域進行ala掃描或隨機突變誘發且根據所需活性篩選經表現之免疫球蛋白。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與增加抗體之血清半衰期之酶或多肽的融合。
在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素經修飾以消除、減少或以其他方式阻礙鉸鏈區附近之蛋白酶裂解。IgG之「鉸鏈區」通常定義為包括E216且在人類IgGl之P230處終止(根據如Kabat中之EU索引)，但在功能上，鏈之可撓性部分可視為包括稱為上鉸鏈區及下鉸鏈區之額外殘基，諸如自E216至G237 (Roux等人, 1998 J Immunol 161:4083)，且下鉸鏈稱為Fc區之殘基233至239，FcyR結合通常歸於該處。可例如根據以引用的方式併入本文中之US 20150139984A1中描述的方法以及藉由併入其中描述之任一修飾，對本文所述之經遮蔽之細胞激素中的任一者進行修飾。
在一些實施例中，改善藥物動力學之FcRn突變包括(但不限於)M428L、T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E、P257I/N434H、D376V/N434H、P257I/Q3111、N434A、N434W、M428L/N434S、V259I/V308F、M252Y/S254T/T256E、V259I/V308F/M428L、T307Q/N434A、T307Q/N434S、T307Q/E380A/N434A、V308P/N434A、N434H、V308P。在一些實施例中，此類突變在低pH值下增強抗體與FcRn之結合，但在中性pH值下不改變抗體親和力。
在某些實施例中，改變抗體或其片段以增加或降低抗體糖基化程度。多肽糖基化通常為N連接的或O連接的。N連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈之連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸，其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸，為用於將碳水化合物部分經酶連接於天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，在多肽中此等三肽序列中之任一者的存在產生潛在糖基化位點。O-連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者附接至羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，不過亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
宜藉由改變胺基酸序列，使得產生或移除上述三肽序列中之一或多者來實現經遮蔽之細胞激素之糖基化位點的添加或缺失(對於N-連接型糖基化位點)。亦可藉由原始抗體之序列的一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基之添加、缺失或取代來實現改變(對於O-連接型糖基化位點)。
在抗體或其片段包含Fc區之情況下，可改變附接於其上之碳水化合物。舉例而言，具有缺乏附接於抗體Fc區之岩藻糖之成熟碳水化合物結構的抗體描述於美國專利申請案第US 2003/0157108號(Presta, L.)中。亦參見US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。在附接至抗體Fc區之碳水化合物中具有等分N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)之抗體在Jean-Mairet等人之WO 2003/011878及Umana等人之美國專利第6,602,684號中提及。在附接至抗體Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體報導於Patel等人之WO 1997/30087中。關於具有附接至Fc區之經改變之碳水化合物的抗體，亦參見WO 1998/58964 (Raju, S.)及WO 1999/22764 (Raju, S.)。關於具有經修飾之糖基化之抗原結合分子，亦參見US 2005/0123546 (Umana等人)。
在某些實施例中，糖基化變異體包含Fc區，其中附接至Fc區之碳水化合物結構缺乏岩藻糖或具有減少之岩藻糖。此類變異體具有改良之ADCC功能。視情況，Fc區進一步包含一或多種進一步改善ADCC之胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334 (殘基之Eu編號)處之取代。關於「去岩藻糖基化」或「缺乏岩藻糖」抗體變異體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；W02005/053742；Okazaki等人 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。產生去岩藻糖基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lee 13 CHO細胞(Ripka等人 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 Al號, Presta, L；及WO 2004/056312 Al，Adams等人，尤其實例11)及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8剔除CHO細胞(Yamane-Ohnuki等人 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))及過度表現(31,4-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III (GnT-III)及高基體p-甘露糖苷酶II (Manll)之細胞。
在本文中之任何實施例中，經遮蔽之細胞激素可經工程改造以改善抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性。在一些實施例中，可在α1,6-岩藻糖基轉移酶(Fut8)基因剔除之細胞株中產生經遮蔽之細胞激素。在一些實施例中，宿主細胞已經修飾以具有降低之內在α1,6-岩藻糖基化活性。用於修飾哺乳動物宿主細胞中之岩藻糖基化路徑之方法的實例可見於例如Yamane-Ohnuki及Satoh, MAbs, 1(3): 230-236 (2009)，其內容以引用之方式併入本文中。用於使FUT8基因之表現部分或完全失活的方法及組合物之實例可見於例如美國公開案第20160194665A 1號、WO2006133148A2中，其內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，在CHO細胞之Lecl3變異體(參見例如Shields等人, J. Biol. Chem., 277(30):26733-40 (2002))或具有降低之FUT8活性之YB2/0細胞株(參見例如Shinkawa等人, J. Biol. Chem., 278(5): 3466-73 (2003))中產生經遮蔽之細胞激素。在一些實施例中，可引入針對與α1,6-岩藻糖基有關之基因的小干擾RNA (siRNA)(參見例如Mori等人, Biotechnol. Bioeng. 88(7): 901-908 (2004)；Imai-Nishiya等人, BMC Biotechnol. 7: 84 (2007)；Omasa等人, J. Biosci. Bioeng., 106(2): 168-173 (2008))。在一些其他實施例中，可在過度表現(31,4-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III (GnT-III)之細胞株中產生經遮蔽之細胞激素。在其他實施例中，細胞株另外過度表現高基體p-甘露糖苷酶II (Manll)。在本文中之一些實施例中，經遮蔽之細胞激素可在Fc區中包含至少一個改善ADCC活性之胺基酸取代。
在一些實施例中，改變經遮蔽之細胞激素以改善其血清半衰期。為延長細胞激素之血清半衰期，可將FcRN/救助受體結合抗原決定基併入連接之抗體(尤其抗體片段)，例如美國專利案第5,739,277號中所描述。如本文所用，術語「救助受體結合抗原決定基」係指負責延長IgG分子之活體內血清半衰期的IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc區之抗原決定基(US 2003/0190311、美國專利第6,821,505號；美國專利第6,165,745號；美國專利第5,624,821號；美國專利第5,648,260號；美國專利第6,165,745號；美國專利第5,834,597號)。
另一種類型變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體在抗體分子中具有至少一個由不同殘基置換之胺基酸殘基。取代型突變誘發之相關位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。保守取代以標題「較佳取代」展示於表2中。若此類取代引起生物活性之理想改變，則可引入更多的實質變化，表2中稱為「示例性取代」或如下文參考胺基酸類別進一步描述，且篩選產物。 表2：
初始殘基 示例性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
抗體之生物特性之實質修飾係藉由選擇對維持以下之作用上顯著不同的取代實現：(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如片或螺旋構形；(b)目標位點處分子之電荷或疏水性；或c)側鏈之體積。胺基酸可根據其側鏈特性之相似性來分組(A. L. Lehninger, Biochemistry, 第2版, 第73-75頁, Worth Publishers, New York (1975))： (1)    非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、lie (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M) (2)    不帶電極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gin (Q) (3)    酸性：Asp (D)、Glu (E) (4)    鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His (H) 或者，天然存在之殘基可以基於共同的側鏈特性分組： (1)    疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、he； (2)    中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin； (3)    酸性：Asp、Glu； (4)    鹼性：His、Lys、Arg； (5)    影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6)    芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要此等類別中之一者之成員換成另一個類別。此類經取代之殘基亦可引入保守性取代位點或引入其餘(非保守性)位點。
另一類型之取代型變異體涉及用非天然存在之胺基酸殘基取代天然存在之胺基酸殘基。非天然存在之胺基酸殘基可例如經由tRNA再編碼或經由如例如WO 2016154675A1中所描述之方法中之任一者併入，該文獻以引用之方式併入本文中。
一種類型之取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，所選擇的用於進一步開發之所得變異體相對於產生其之親本抗體而言具有經修飾(例如改良)之生物特性。用於產生此類取代型變異體之適宜方式涉及使用噬菌體呈現、酵母呈現或哺乳動物呈現之親和力成熟。簡言之，對若干高變區位點(例如6-7個位點)進行突變以在各位點產生所有可能的胺基酸取代。由此產生的抗體以與封裝於各顆粒內之噬菌體鞘蛋白(例如M13之基因III產物)之至少一部分之融合物形式自絲狀噬菌體顆粒呈現。隨後，針對噬菌體呈現變異體之生物活性(例如結合親和力)對其進行篩選。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可進行掃描突變誘發(例如丙胺酸掃描)以鑑別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。或者或另外，分析抗原-抗體複合物之晶體結構係有利的以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基為根據此項技術中已知之技術(包括本文中詳細描述之技術)進行取代之候選物。在此類變異體產生後，使用此項技術中已知之技術(包括本文中所描述之技術)對該組變異體進行篩選，且可選擇在一或多種相關分析法中具有優良特性之抗體用於進一步開發。
藉由此項技術中已知之多種方法製備編碼經遮蔽之細胞激素之胺基酸序列變異體的核酸分子。此等方法包括(但不限於)自天然來源(在天然存在之胺基酸序列變異體的情況下)分離或例如藉由抗體之早期製備之變異體或非變異體型式之寡醣介導(或定點)突變誘發、PCR突變誘發及卡匣突變誘發來製備。
可能需要在本發明之抗體之Fc區中引入一或多種胺基酸修飾，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置，包括鉸鏈半胱胺酸處包含胺基酸修飾(例如取代)的人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在一些實施例中，本文提供之經遮蔽之細胞激素包括具有效應功能增強之IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型的抗體或其片段。在一些實施例中，本文提供之經遮蔽之細胞激素包括具有效應功能增強之IgG1同型之抗體或其片段。在一些實施例中，本文提供之經遮蔽之細胞激素具有效應功能增強之IgG1同型。在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素經無岩藻糖基化。在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素具有增加含量之甘露糖部分。在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素具有增加含量之等分聚糖部分。在一些實施例中，IgG1包含胺基酸突變。
在一些實施例中，本文提供之經遮蔽之細胞激素包括具有IgG1同型(例如人類IgG1同型)之抗體。在一些實施例中，IgG1包含增強效應功能之一或多個胺基酸取代。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代S298A、E333A及K334A，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代S239D及I332E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代S239D、A330L及I332E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代P247I及A339D或A339Q，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代D280H、K290S，有或無S298D或S298V，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代F243L、R292P及Y300L，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代F243L、R292P、Y300L及P396L，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代G236A、S239D及I332E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K326A及E333A，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K326W及E333S，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K290E、S298G、T299A，有或無K326E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K290N、S298G、T299A，有或無K326E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K334V，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代L235S、S239D及K334V，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K334V及Q331M、S239D、F243V、E294L或S298T，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代E233L、Q311M及K334V，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代L234I、Q311M及K334V，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K334V及S298T、A330M或A330F，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K334V、Q311M及A330M或A330F，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K334V、S298T及A330M或A330F，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K334V、S239D及A330M或S298T，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代L234Y、Y296W及K290Y、F243V或E294L，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代Y296W及L234Y或K290Y，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代S239D、A330S及I332E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。
在一些實施例中，IgG1包含一或多個降低或抑制效應功能之胺基酸取代。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代N297A、N297G或N297Q，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代L234A或L235A，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代C220S、C226S、C229S及P238S，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代C226S、C229S、E233P、L234V及L235A，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代L234F、L235E及P331S，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代S267E及L328F，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。
根據本說明書及此項技術之教示內容，經考慮在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素之抗體或其片段與野生型對應抗體相比可例如在Fc區中包含一或多個改變。例如，認為可在Fc區中進行某些改變，該等改變將改變(亦即，改善或減弱) C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如如WO99/51642中所述。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO94/29351。WO00/42072 (Presta)及WO 2004/056312 (Lowman)描述具有改善或減弱之與FcRs之結合之抗體變異體。此等專利公開案之內容特定地以引用之方式併入本文中。亦參見Shields等人 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。半衰期延長且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)(Guyer等人, J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等人, J. Immunol. 24:249 (1994))之結合改善的抗體描述於US 2005/0014934A1 (Hinton等人)中。此等抗體包含具有一或多個改善Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。具有改變之Fc區胺基酸序列及增加或降低之C1q結合能力之多肽變異體描述於美國專利案第6,194,551B1號、WO99/51642中。彼等專利公開案之內容特定地以引用之方式併入本文中。亦參見Idusogie等人 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。
6.2 經遮蔽之 IL-2 細胞激素 - 藥物結合物 本發明亦提供經遮蔽之IL-2細胞激素-藥物結合物(MCDC)，其包含結合於一或多種藥劑的本文提供之經遮蔽之IL-2細胞激素，該細胞激素可為本文所揭示之任何IL-2經遮蔽之細胞激素。在一些實施例中，一或多種藥劑為細胞毒性劑，諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。在一些實施例中，一或多種藥劑為免疫刺激劑。
在一些實施例中，與經遮蔽之IL-2細胞激素結合之一或多種藥物包括(但不限於)類美登素(maytansinoid) (參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 Bl)；奧瑞他汀(auristatin)，諸如單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF (MMAE及MMAF) (參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及Lode等人, Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；蒽環黴素(anthracycline)，諸如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(參見Kratz等人, Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey等人, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov等人, Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik等人, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King等人, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及美國專利第6,630,579號)；甲胺喋呤(methotrexate)；長春地辛(vindesine)；紫杉烷，諸如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；單端孢黴毒素(trichothecene)；及CC1065。
在另一實施例中，與經遮蔽之IL-2細胞激素結合之一或多種藥物包括(但不限於)微管蛋白聚合抑制劑(例如類美登素及奧瑞他汀)、DNA損傷劑(例如吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體、卡奇黴素、倍癌黴素及引多-萊諾苯并二氮呯(indo-linobenzodiazepine)二聚體)及DNA合成抑制劑(例如依昔替康(exatecan)衍生物Dxd)。
在另一實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素-藥物結合物包含與酶活性毒素或其片段結合之如本文中所述之經遮蔽之IL-2細胞激素，該酶活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈(diphtheria A chain)、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思子毒素A鏈(abrin A chain)、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯族化合物(tricothecenes)。
在另一實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素-藥物結合物包含與放射性原子結合以形成放射性結合物的如本文中所述之經遮蔽之IL-2細胞激素。多種放射性同位素可用於製造放射性結合物。實例包括At211、1131、1125、Y90、Rel86、Rel88、Sml53、B1212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱磁共振成像，mriI)之自旋標記，又諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素-藥物結合物包含與一或多種免疫刺激劑結合的如本文中所述之經遮蔽之IL-2細胞激素。在一些實施例中，免疫刺激劑為干擾素基因刺激蛋白(STING)促效劑或鐸樣受體(TLR)促效劑。
STING促效劑可為STING之任何促效劑。在一些實施例中，STING促效劑為環狀二核苷酸(CDN)。CDN可為任何CDN或其衍生物或變異體。在一些實施例中，STING促效劑為選自由cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、cAIMP及c-di-IMP組成之群的CDN。在一些實施例中，STING促效劑為選自由cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、cAIMP及c-di-IMP組成之群的CDN之衍生物或變異體。在一些實施例中，STING促效劑為4-(2-氯-6-氟苯甲基)-N-(呋喃-2-基甲基)-3-側氧基-3,4-二氫-2H-苯并[b][l,4]噻𠯤-6-甲醯胺，或其衍生物或變異體。參見例如Sali等人 (2015) PloS Pathog., 11(12): e!005324。
TLR促效劑可為任何TLR，諸如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLR10之促效劑。在一些實施例中，TLR促效劑為在細胞表面上表現之TLR，諸如TLR1、TLR2、TLR4或TLR5之促效劑。在一些實施例中，TLR促效劑為在細胞內表現之TLR，諸如TLR3、TLR7、TLR8、TLR9或TLR10之促效劑。
可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製得經遮蔽之IL-2細胞激素與細胞毒性劑之結合物，該等雙官能蛋白質偶合劑為諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人, Science 238: 1098 (1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於將放射性核苷酸結合於抗體之示例性螯合劑。參見W094/11026。連接子可為「可裂解連接子」，促進細胞毒性藥物在細胞中釋放。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含有二硫鍵之連接子(Chari等人, Cancer Res. 52:127-131 (1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文中之MCDC明確考慮(但不限於)用交聯試劑製備之此類結合物，該等交聯劑包括(但不限於) BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，以及SVSB (丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，該等交聯劑可商購(例如購自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。
6.3 載體、宿主細胞及重組方法 為重組產生本發明之經遮蔽之IL-2細胞激素，分離一或多種編碼其之核酸且插入可複製載體中用於進一步選殖(DNA擴增)或表現。容易使用習知程序分離編碼經遮蔽之IL-2細胞激素(包括其組分)的DNA且定序。許多載體為可用的。載體之選擇部分地視所用宿主細胞而定。通常，宿主細胞具有原核或真核(通常哺乳動物)來源。應瞭解，適當時，抗體或其片段之任何同型之恆定區可用於達成此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此類恆定區可自任何人類或動物物種獲得。在一些實施例中，一種載體用於編碼經遮蔽之IL-2細胞激素。在一些實施例中，超過一種載體用於編碼經遮蔽之IL-2細胞激素。
1. 使用原核宿主細胞產生經遮蔽之 IL-2 細胞激素 a. 載體構築 編碼本發明之經遮蔽之細胞激素的多肽組分的聚核苷酸序列可使用標準重組技術獲得。抗體或其抗體片段之所需聚核苷酸序列可自抗體產生細胞(諸如融合瘤細胞)分離及定序。或者，聚核苷酸可使用核苷酸合成器或PGR技術合成，或自其他來源獲得。在獲得之後，將編碼經遮蔽之細胞激素之組分第序列插入能夠在原核宿主中複製及表現異源聚核苷酸之重組載體中。此項技術中可獲得且已知之許多載體可用於達成本發明之目的。選擇適當載體主要視插入載體中之核酸的尺寸及經載體轉型之特定宿主細胞而定。各載體含有各種組分，視其功能(異源聚核苷酸之擴增或表現，或其兩者)及與其駐存之特定宿主細胞之相容性而定。載體組分通常包括但不限於：複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入物及轉錄終止子序列。
一般而言，將含有來源於與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列的質體載體與此等宿主結合使用。載體通常攜帶複製位點以及能夠在經轉型之細胞中提供表型選擇之標記序列。舉例而言，大腸桿菌典型地使用pBR322 (來源於大腸桿菌物種之質體)轉型。pBR322含有編碼安比西林(ampicillin；Amp)及四環素(tetracycline；Tet)抗性之基因且因此提供容易鑑別經轉型之細胞之方式。pBR322、其衍生物或其他微生物質體或細菌噬菌體亦可含有或經修飾以含有可供微生物體用於表現內源性蛋白質之啟動子。用於表現特定抗體之pBR322衍生物之實例詳細地描述於Carter等人之美國專利第5,648,237號中。
此外，含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列的噬菌體載體可作為轉型載體與此等宿主結合使用。舉例而言，諸如7GEM.TM.-11之噬菌體可用於製備可用於使諸如大腸桿菌LE392之敏感宿主細胞轉型的重組載體。
本發明之表現載體可包含兩個或更多個編碼多肽組分中之每一者的啟動子-順反子對。啟動子為位於順反子上游(5')之調節其表現的未轉譯調節序列。原核啟動子典型地分為兩類：誘導型及組成型。誘導型啟動子為在其控制下，回應於培養條件之變化(例如存在或不存在營養物或溫度變化)而起始順反子之轉錄水準增加之啟動子。
已熟知由多種潛在宿主細胞所識別之許多啟動子。可藉由經由限制酶消化自源DNA中移除啟動子及將經分離之啟動子序列插入本發明之載體中，將所選啟動子可操作地連接至編碼經遮蔽之細胞激素中之任一鏈的順反子DNA。原生啟動子序列與許多異源啟動子皆可用於引導目標基因之擴增及/或表現。
在一些實施例中，與原生目標多肽啟動子相比，由於異源啟動子通常實現經表現之目標基因更大的轉錄及更高的產量，因此使用異源啟動子。
適於與原核宿主一起使用之啟動子包括PhoA啟動子、[3-半乳糖酶及乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統及雜交啟動子，諸如tac或trc啟動子。然而，其他在細菌中具有功能性之啟動子(諸如其他已知之細菌或噬菌體啟動子)亦為適合的。已公開其核苷酸序列，藉此允許熟練工作人員使用連接子或接附子將其可操作地接合至編碼例如包含輕鏈及重鏈之經遮蔽之細胞激素的目標輕鏈及重鏈之順反子(Siebenlist等人, (1980) Cell 20:269)，以供應任何所需限制位點。
在本發明之一個態樣中，重組載體內之各順反子包含分泌信號序列組分，其引導經表現之多肽跨越膜之易位。通常，信號序列可為載體之組分，或其可為插入載體中之目標多肽DNA之一部分。出於本發明之目的而選擇的信號序列應為被宿主細胞識別及加工(亦即，由信號肽酶裂解)之信號序列。對於不識別及加工異源多肽之原生信號序列的原核宿主細胞而言，信號序列經選自由例如以下組成之群的原核信號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定性腸毒素II (STII)前導子、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本發明之一個實施例中，表現系統之兩個順反子中所用的信號序列為STII信號序列或其變異體。
在另一態樣中，根據本發明之多肽組分的產生可在宿主細胞之細胞質中進行，且因此不需要各順反子內存在分泌信號序列。在彼方面，關於包含免疫球蛋白輕鏈及重鏈之實施例，例如，輕鏈及重鏈在有或無遮蔽部分之序列、連接序列等下表現，摺疊且組裝以在細胞質內形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxB-菌株)提供有利於二硫鍵形成之細胞質條件，藉此實現經表現之蛋白質次單元之正確摺疊及組裝。Proba及Pluckthun Gene, 159:203 (1995)。
本發明之經遮蔽之細胞激素亦可藉由使用如下表現系統產生，其中可調節所表現之多肽組分之定量比率以便使本發明之所分泌及正確組裝之抗體的產量最大化。此類調節係至少部分地藉由同時調節多肽組分之轉譯強度來實現。
適用於表現本發明之經遮蔽之細胞激素的原核宿主細胞包括太古細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性生物體。適用細菌之實例包括埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、桿菌(例如枯草桿菌(B. subtilis))、腸內細菌、假單胞菌種(例如綠膿假單胞菌(P. aeruginosa))、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙門氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)、志賀桿菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)或副球菌屬(Paracoccus)。在一個實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施例中，使用大腸桿菌細胞作為本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, 第2卷 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 第1190-1219頁；ATCC寄存編號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR之菌株33D3 (美國專利第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294 (ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌k1776 (ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308 (ATCC 31,608)亦為適合的。此等實例為說明性而非限制性的。用於構築具有所定義之基因型的任一種以上提及之細菌之衍生物的方法在此項技術中已知且描述於例如Bass等人, Proteins, 8:309-314 (1990)中。通常需要考慮複製子在細菌之細胞中之可複製性來選擇適當細菌。舉例而言，當使用熟知質體(諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)供應複製子時，宜使用大腸桿菌、沙雷氏菌屬(Serratia)或沙門氏菌物種作為宿主。通常，宿主細胞應分泌最少量的蛋白水解酶，且細胞培養物中宜併入其他蛋白酶抑制劑。
b.                              經遮蔽之細胞激素之產生 宿主細胞用上述表現載體轉型且在適當時經改良之習知營養培養基中培養以便誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所要序列之基因。
轉型意謂將DNA引入原核宿主，使得DNA可以染色體外元件形式或由染色體整合體複製。視所用宿主細胞而定，轉型係使用適於此類細胞之標準技術進行。採用氯化鈣之鈣處理通常用於含有實質性細胞壁障壁之細菌細胞。另一種轉型方法採用聚乙二醇/DMSO。另一種所用技術為電穿孔。
用於產生本發明之經遮蔽之細胞激素的原核細胞在此項技術中已知且適用於培養所選宿主細胞的培養基中生長。適合培養基之實例包括魯利亞培養液(luria broth；LB)加必需的營養補充劑。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構築所選的選擇劑，以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將安比西林添加至培養基中以用於表現安比西林抗性基因之細胞之生長。
亦可包括適合濃度之除碳、氮及無機磷酸鹽源以外的任何必需補充劑，其係單獨或以與諸如複合氮源之其他補充劑或培養基之混合物形式引入。視情況，培養基可含有一或多種選自由麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇組成之群的還原劑。
在適合溫度下培養原核宿主細胞。在某些實施例中，對於大腸桿菌生長，生長溫度在約20℃至約39℃、約25℃至約37℃範圍內，或為約30℃。主要視宿主生物體而定，培養基之pH值可為約5至約9範圍內之任何pH值。在某些實施例中，對於大腸桿菌，pH值為約6.8至約7.4，或約7.0。
若本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適用於活化啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一個態樣中，使用PhoA啟動子控制多肽之轉錄。因此，經轉型之宿主細胞在用於誘導之磷酸鹽限制性培養基中培養。在某些實施例中，磷酸鹽限制性培養基為C.R.A.P.培養基(參見例如Simmons等人, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147)。根據所用載體構築體，可使用多種其他誘導劑，如此項技術中已知。
在一個實施例中，所表現的本發明之經遮蔽之細胞激素分泌至宿主細胞之周質中且自宿主細胞之周質中回收。蛋白質回收典型地涉及通常藉由諸如滲壓衝擊、音波處理或溶胞之手段破壞微生物。在細胞破壞後，可藉由離心或過濾來移除細胞碎片或全細胞。可例如藉由親和樹脂層析進一步純化蛋白質。或者，可將蛋白質轉運至培養基中且自其中分離。可自培養物移除細胞，且過濾且濃縮培養物上清液以進一步純化所產生之蛋白質。所表現之多肽可使用通常已知之方法(諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點分析法(Western blot assay))進一步分離及鑑別。
在本發明之一個態樣中，藉由醱酵方法大量產生經遮蔽之細胞激素。可使用各種大規模分批饋料醱酵程序來產生重組蛋白質。大規模醱酵具有至少1000公升容量且在某些實施例中，具有約1,000至100,000公升容量。此等醱酵器使用攪拌器葉輪分配氧及營養物，尤其葡萄糖。小規模醱酵通常係指在體積容量不超過約100公升且範圍可在約1公升至約100公升範圍內的醱酵器中醱酵。
在醱酵過程中，典型地在細胞已在適合條件下生長至所需密度(例如約180-220之OD550)之後開始誘導蛋白質表現，在此階段，細胞處於早期固定相。根據所用載體構築體，可使用多種誘導劑，如此項技術中已知及上文所描述。細胞在誘導之前可生長更短的時段。細胞通常誘導約12-50小時，但可使用更長或更短的誘導時間。
為改良本發明之多肽之產量及品質，可修改各種醱酵條件。舉例而言，為改良例如所分泌之抗體多肽之正確組裝及摺疊，可使用過度表現伴隨蛋白之其他載體，諸如Dsb蛋白質(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及或DsbG)或FkpA (具有伴隨蛋白活性之肽基脯胺醯基順,反-異構酶)，使宿主原核細胞共轉型。已證明伴隨蛋白可促進細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白質之正確摺疊及溶解性。Chen等人 (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605；Georgiou等人, 美國專利第6,083,715號；Georgiou等人, 美國專利第6,027,888號；Bothmann及Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等人 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
為使所表現之異源蛋白質(尤其對蛋白水解敏感之異源蛋白質)的蛋白水解最小化，本發明可使用某些缺乏蛋白水解酶之宿主菌株。舉例而言，宿主細胞菌株可經修飾以在編碼已知細菌蛋白酶(諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)之基因中實現基因突變。可利用一些大腸桿菌蛋白酶缺乏之菌株且描述於例如Joly等人 (1998), 上述；Georgiou等人, 美國專利第5,264,365號；Georgiou等人, 美國專利第5,508,192號；Kara等人, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)。
在一些實施例中，使用缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或多種伴隨蛋白之質體轉型的大腸桿菌菌株作為本發明之表現系統中之宿主細胞。
c.                              經遮蔽之細胞激素純化 在一些實施例中，進一步純化本文中產生的經遮蔽之細胞激素以獲得實質上均質之製劑，以用於其他分析法及用途。可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化方法。以下程序為適合純化程序之示例：免疫親和或離子交換管柱上分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、在二氧化矽上或在陽離子交換樹脂(諸如DEAE)上層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱及使用例如Sephadex G-75進行的凝膠過濾。
在一些實施例中，使用固定在固相上之蛋白A對本發明之經遮蔽之細胞激素進行免疫親和純化。蛋白A為來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)之41 kD細胞壁蛋白質，其以高親和力結合於抗體之Fc區。Lindmark等人 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. 固定蛋白A之固相可為包含玻璃或二氧化矽表面之管柱，或受控微孔玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱經諸如甘油之試劑塗佈，以可能防止污染物之非特異性附著。
作為純化之第一步，可將如上文所述之來源於細胞培養物的製劑施用於固定蛋白A之固相上以實現所關注之經遮蔽之細胞激素與蛋白A的特異性結合。接著洗滌固相，以移除非特異性結合於固相之污染物。最後，藉由溶離自固相回收所關注之經遮蔽之細胞激素。
可根據此項技術中已知之標準蛋白質純化方法採用提供與經遮蔽之細胞激素之組分的高親和力結合的其他純化方法。
2. 使用真核宿主細胞產生經遮蔽之細胞激素 用於真核宿主細胞之載體通常包括以下非限制性組分中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多種標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。
a.信號序列組分 用於真核宿主細胞之載體亦可含有信號序列或在所關注成熟蛋白質或多肽之N端處具有特定裂解位點之其他多肽。所選擇的異源信號序列可為由宿主細胞識別及處理(亦即，由信號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現時，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導子，例如單純疱疹gD信號。
此類前驅體區域之DNA在閱讀框架中接合至編碼經遮蔽之細胞激素之DNA。
b.複製起點 通常，哺乳動物表現載體無需複製起點組分。舉例而言，通常可使用SV40起點，僅因為其含有早期啟動子。
c.選擇基因組分 表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選標記物。典型的選擇基因編碼如下蛋白質：(a)賦予針對抗生素或其他毒素(例如安比西林、新黴素、甲胺喋呤或四環素)之抗性，(b)補體營養缺陷性不足(若有關)，或(c)提供無法自複合培養基獲得之重要營養物。
選擇方案之一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞生長。彼等經異源基因成功轉型之細胞產生賦予耐藥性之蛋白質且因此在選擇療法中存活。此類顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)及潮黴素(hygromycin)。
適用於哺乳動物細胞之可選標記物之另一實例為實現鑑別能夠吸收編碼經遮蔽之細胞激素之核酸的細胞的標記物，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及金屬硫蛋白-II、靈長類動物金屬硫蛋白基因、腺苷脫胺酶、鳥胺酸去羧酶等。
舉例而言，在一些實施例中，首先藉由將所有轉型體在含有甲胺喋呤(Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑)的培養基中培養來鑑別經DHFR選擇基因轉型之細胞。在一些實施例中，當採用野生型DHFR時，適當的宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)細胞株(例如ATCC CRL-9096)。
或者，經編碼經遮蔽之細胞激素、野生型DHFR蛋白質及另一種可選標記物(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))的DNA序列轉型或共轉型的宿主細胞(尤其是含有內源性DHFR之野生型宿主)可藉由在含有針對可選標記物之選擇劑(諸如胺基糖苷抗生素，例如康黴素(kanamycin)、新黴素或G418)的培養基中進行細胞生長來選擇。參見美國專利第4,965,199號。宿主細胞可包括NS0，包括缺乏麩醯胺酸合成酶(GS)之細胞株。使用GS作為哺乳動物細胞之可選標記物之方法描述於美國專利第5,122,464號及美國專利第5,891,693號中。
d.啟動子組分
表現及選殖載體通常含有啟動子，其由宿主生物體識別且可操作地連接於編碼所關注之經遮蔽之細胞激素(其可為本文所述之任何經遮蔽之細胞激素)的核酸。已知真核生物之啟動子序列。舉例而言，幾乎所有的真核基因皆具有富含AT之區域，其位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處。在許多基因轉錄起點上游70至80個鹼基處發現的另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大部分真核基因之3'端處為AATAAA序列，其可為將聚腺苷酸尾添加至編碼序列之3'端之信號。在某些實施例中，任何或全部此等序列可適當地插入真核表現載體中。
例如藉由以下啟動子控制哺乳動物宿主細胞中自載體之轉錄：自諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40 (SV40)之病毒之基因體獲得的啟動子；異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；熱休克啟動子，限制條件為此類啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子宜以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制性片段形式獲得。人類細胞巨大病毒之即刻早期啟動子宜以Hindlll E限制性片段形式獲得。在哺乳動物宿主中使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之修改描述於美國專利第4,601,978號中。關於人類[3-干擾素cDNA在來自單純性疱疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下於鼠類細胞中之表現，亦參見Reyes等人, Nature 297:598-601 (1982)。或者，可使用勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列作為啟動子。
e.強化子元件組分 編碼本發明之經遮蔽之細胞激素的DNA由高級真核生物進行的轉錄通常藉由插入強化子序列至載體中而增加。現已知得自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)之許多強化子序列。然而，通常，將使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點之晚期一側(bp 100-270)上之SV40強化子、人類細胞巨大病毒早期啟動子強化子、鼠類細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點之晚期一側上之多瘤病毒強化子及腺病毒強化子。亦參見Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) (描述用於活化真核啟動子之強化子元件)。強化子可在經遮蔽之細胞激素編碼序列之5'或3'位置處剪接至載體中，但通常相對於啟動子位於5'位點。
f.轉錄終止組分 真核宿主細胞中所使用之表現載體亦可含有轉錄終止及使mRNA穩定所需之序列。此類序列通常可獲自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶爾3'未轉譯區。此等區域在編碼經遮蔽之細胞激素之mRNA的未轉譯部分中含有以聚腺苷酸化片段形式轉錄的核苷酸區段。一種適用轉錄終止組分為牛生長激素聚腺苷酸化區。參見W094/11026及其中揭示之表現載體。
g.宿主細胞之選擇及轉型 本文中適用於在載體中選殖或表現DNA之宿主細胞包括本文所述之高級真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中之繁殖已變成常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎臟CV1細胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(293或經次選殖以在懸浮培養物中生長之293細胞，Graham等人, J. Gen Virol. 36:59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；鼠類塞特利氏細胞(murine sertoli cell)(TM4，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；鼠類乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人, Annals N. Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤細胞株(Hep G2)。
宿主細胞經用於產生經遮蔽之細胞激素之上述表現或選殖載體轉型且在適當時經改良之習知營養培養基中培養，以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。
h. 培養宿主細胞 用於產生本發明之經遮蔽之細胞激素的宿主細胞可在多種培養基中培養。市售培養基(諸如Ham's F10 (Sigma)、最小必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM，Sigma))適用於培養宿主細胞。此外，可使用以下文獻中描述之培養基中之任一者作為宿主細胞之培養基：Ham等人, Meth. Enz. 58:44 (1979)；Barnes等人, Anal. Biochem. 102:255 (1980)；美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第A,921,162號、第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利復審案30,985。此等培養基中之任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN™藥物)、痕量元素(定義為通常以微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可以熟習此項技術者已知之適合濃度包括任何其他補充劑。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為先前用於經選擇用於表現之宿主細胞之培養條件，且對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。
i. 經遮蔽之細胞激素之純化 使用重組技術時，經遮蔽之細胞激素可在細胞內產生，或直接分泌至培養基中。若經遮蔽之細胞激素在細胞內產生，則作為第一步驟，可例如藉由離心或超濾來移除微粒碎片(宿主細胞或溶解片段)。在經遮蔽之細胞激素分泌至培養基中之情況下，可首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自此類表現系統之上清液。在任何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。
由細胞製備之經遮蔽之細胞激素組合物可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化，其中親和層析係便利之技術。蛋白A作為親和配位體之適合性視經遮蔽之細胞激素中存在的任何免疫球蛋白Fc域之種類及同型(若存在)而定。蛋白A可用於純化基於人類IgGl、IgG2或IgG4重鏈之抗體(Lindmark等人, J. Immunol. Methods 62:1-13 (1983))。建議蛋白G用於所有鼠類同型及人類y3 (Guss等人, EMBO J. 5:15671575 (1986))。與親和配位體連接之基質可為瓊脂糖，但可使用其他基質。與瓊脂糖可達成者相比，機械穩定性基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允許較快流動速率及較短處理時間。在經遮蔽之細胞激素包含CH3域之情況下，Bakerbond ABX™樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.)適用於純化。
亦可利用其他蛋白質純化技術，諸如離子交換管柱上之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)上肝素SEPHAROSE™層析之層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱，其視待回收之經遮蔽之細胞激素而定。
在任何初始純化步驟之後，包含所關注之經遮蔽之細胞激素及污染物的混合物可例如藉由使用pH值在約2.5-4.5之間的溶離緩衝液的低pH值疏水相互作用層析在低鹽濃度(例如約0-0.25 M鹽)下進行進一步純化。
通常，用於製備用於研究、測試及臨床用途之經遮蔽之細胞激素的各種方法係此項技術中公認的，符合上述方法及/或被熟習此項技術者視為適用於所關注之特定經遮蔽之細胞激素。
7.   組合物 在一些態樣中，本文亦提供包含本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素中的任一者的組合物。在一些實施例中，組合物包含本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素之示例性實施例中的任一者。在一些實施例中，組合物包含本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素中的任一者之二聚體。在一些實施例中，組合物為醫藥組合物。在一些實施例中，組合物包含經遮蔽之IL-2細胞激素且進一步包含如下文詳細描述之組分中之一或多者。例如，在一些實施例中，組合物包含一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、穩定劑、緩衝劑、防腐劑、張力劑、非離子型界面活性劑或清潔劑、或其他治療劑或活性化合物，或其組合。組合物之各種實施例在本文中有時稱為調配物。
藉由將具有所需純度之活性成分與視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備用於儲存之治療調配物(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Lippincott Williams & Wiklins, Pub., Gennaro編輯, Philadelphia, Pa. 2000)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝劑、抗氧化劑(包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、偏亞硫酸氫鈉)；防腐劑、等張劑、穩定劑、金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；螯合劑，諸如EDTA及/或非離子型界面活性劑。
緩衝劑可用於將pH值控制在最佳化治療有效性之範圍內，尤其在穩定性依賴於pH值之情況下。緩衝劑可以約50 mM至約250 mM範圍內之濃度存在。適用於本發明之緩衝劑包括有機酸及無機酸以及其鹽。例如，檸檬酸鹽、磷酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。此外，緩衝劑可包含組胺酸及三甲胺鹽，諸如Tris。
可添加防腐劑以防止微生物生長，且通常以約0.2%-1.0% (w/v)之範圍存在。通常用於治療劑之適合防腐劑的實例包括氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六羥季銨；鹵化苯甲烴銨(例如氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯銨；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇、3-戊醇、間甲酚、鄰甲酚、對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、乙醇、氯丁醇、硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑啶基脲、氯己定、去水醋酸鈉、氯甲酚、對羥基苯甲酸乙酯及氯苯甘油醚(3對氯苯氧基丙-l,2-二醇)。
可存在張力劑(有時稱為「穩定劑」)以調節或維持液體在組合物中之張力。當與大型帶電生物分子(諸如蛋白質及抗體)一起使用時，其通常稱為「穩定劑」，因為其可與胺基酸側鏈之帶電基團相互作用，藉此減小分子間及分子內相互作用之可能性。
考慮其他成分之相對量，張力劑可以約0.1重量%至約25重量%之間或約1至約5重量%之間的任何量存在。在一些實施例中，張力劑包括多羥基糖醇、三元醇或高級糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露醇。
額外賦形劑包括可充當以下中之一或多種之試劑：(1)增積劑，(2)溶解增強劑，(3)穩定劑，及(4)防止變性或黏著於容器壁之試劑。此類賦形劑包括：多羥基糖醇(上文所列舉)；胺基酸，諸如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖(myoinisitose)、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，諸如尿素、麩胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸鈉、硫代甘油、a-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙醣(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如糊精或聚葡萄糖。
可存在非離子型界面活性劑或清潔劑(亦稱為「濕潤劑」)以幫助溶解治療劑以及保護治療性蛋白質避免攪拌誘導之聚集，其亦允許調配物暴露於剪切表面應力而不引起活性治療性蛋白質或抗體之變性。非離子型界面活性劑以約0.05 mg/ml至約1.0 mg/ml或約0.07 mg/ml至約0.2 mg/ml之範圍存在。在一些實施例中，非離子型界面活性劑以約0.001%至約0.1% w/v或約0.01%至約0.1% w/v或約0.01%至約0.025% w/v之範圍存在。
適合非離子型界面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、PLURONIC®多元醇、TRITON®、聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN®-20、TWEEN®-80等)、聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧化乙烯氫化蓖麻油10、50及60、甘油單硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧甲基纖維素。可使用之陰離子型清潔劑包括月桂基硫酸鈉、磺基丁二酸鈉二辛酯及磺酸鈉二辛酯。陽離子型清潔劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。
為了使調配物可用於活體內投藥，其必須為無菌的。可藉由經無菌過濾膜過濾而使調配物為無菌的。本文中之治療性組合物通常置放於具有無菌存取口之容器中，例如具有可由皮下注射針刺穿之塞子之靜脈內溶液袋或瓶。
投與途徑係根據已知及可接受之方法，諸如藉由以適合的方式在長時段內之單次或多次推注注射或輸注，例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內或關節內途徑之注射或輸注，局部投與，吸入或藉由持續釋放或緩釋方式。
本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素中的任一者可單獨或與其他治療劑組合使用，本文所述之方法中亦如此。術語「組合」涵蓋相同或各別調配物中所包括之兩種或更多種治療劑(例如經遮蔽之IL15細胞激素及治療劑)。在一些實施例中，「組合」係指「同時」投藥，在此情況下，本發明之經遮蔽之IL-2細胞激素的投藥與一或多種其他治療劑之投藥同時進行(例如在相同時間或經遮蔽之IL-2細胞激素之投藥與一或多種其他治療劑之投藥之間間隔在一小時內)。在一些實施例中，「組合」係指依序投藥，在此情況下，本發明之經遮蔽之IL-2細胞激素的投藥在一或多種其他治療劑之投藥之前及/或之後進行(例如經遮蔽之IL-2細胞激素之投藥與一或多種其他治療劑之投藥之間間隔大於一小時)。本文中考慮之藥劑包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞激素、靶向免疫檢查點分子之藥劑、靶向免疫刺激分子之藥劑、生長抑制劑、免疫刺激劑、消炎劑或抗癌劑。
本文中之調配物亦可含有超過一種為所治療之特定適應症所必需之活性化合物，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的活性化合物。或者或另外，組合物可包含細胞毒性劑、細胞激素、靶向免疫檢查點分子或刺激分子之藥劑、生長抑制劑、免疫刺激劑、消炎劑或抗癌劑。此類分子適合以有效達成預期目的之量存在於組合中。
調配物可以任何適合狀態呈現，諸如液體調配物、固態(凍乾)調配物或冷凍調配物。製備用於治療用途之此等類型調配物中之每一者的方法為此項技術中所熟知。
8.   治療方法 本文提供用於治療或預防個體之疾病的方法，其包含向該個體投與有效量之本文所述之任何經遮蔽之IL-2細胞激素或其組合物。在一些實施例中，提供用於治療或預防個體之疾病的方法，其包含向該個體投與任何本文所述之組合物。在一些實施例中，個體(例如人類患者)已診斷患有癌症或處於罹患此類病症之風險下。在一些實施例中，提供用於治療或預防個體之疾病的方法，其包含向該個體投與有效量之本文所述之任何經遮蔽之IL-2細胞激素或其組合物，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素在由酶裂解後活化。在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素在腫瘤微環境下活化。經遮蔽之IL-2細胞激素在其裂解之後具有治療活性。因此，在一些實施例中，活性劑為裂解產物。
對於疾病之預防或治療，如上文所定義，活性劑之適當劑量將視所治療之疾病之類型、疾病之嚴重程度及病程、投與藥劑以達成預防還是治療目的、先前療法、個體之臨床病史及對藥劑之反應以及主治醫師之判斷而定。宜一次性或經一系列治療向個體投與藥劑。
在本文所述之方法之一些實施例中，本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素的投藥之間的時間間隔為約一週或更長時間。在本文所述之方法之一些實施例中，本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素的投藥之間的時間間隔為約兩天或更長時間、約三天或更長時間、約四天或更長時間、約五天或更長時間或者約六天或更長時間。在本文所述之方法之一些實施例中，本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素的投藥之間的時間間隔為約一週或更長時間、約兩週或更長時間、約三週或更長時間或者約四週或更長時間。在本文所述之方法之一些實施例中，本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素的投藥之間的時間間隔為約一個月或更長時間、約兩個月或更長時間或者約三個月或更長時間。如本文所用，投藥之間的時間間隔係指經遮蔽之IL-2細胞激素之一次投藥與經遮蔽之IL-2細胞激素之下一次投藥之間的時段。如本文所用，約一個月之時間間隔包括四週。在一些實施例中，治療包括經遮蔽之IL-2細胞激素之多次投藥，其中投藥之間的間隔可變化。舉例而言，第一次投藥與第二次投藥之間的時間間隔為約一週，且後續投藥之間的時間間隔為約兩週。在一些實施例中，第一次投藥與第二次投藥之間的時間間隔為約兩天、三天、四天或五天或六天，且後續投藥之間的時間間隔為約一週。
在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素在一段時間內在多個時刻投與。在一些實施例中，在多個時刻投與個體之劑量在各次投與時可為相同劑量，或在一些實施例中，經遮蔽之細胞激素可以兩個或更多個不同劑量投與個體。舉例而言，在一些實施例中，經遮蔽之IL-2細胞激素最初在一或多個時刻以一個劑量投與且稍後在稍後時間點開始之一或多個時刻以第二劑量投與。
在一些實施例中，本文所述之經遮蔽之IL-2多肽以均一劑量投與。在一些實施例中，本文所述之經遮蔽之IL-2多肽以每劑約25 mg至約500 mg之劑量投與個體。在一些實施例中，經遮蔽之IL-2多肽以每劑約25 mg至約50 mg、約50 mg至約75 mg、約75 mg至約100 mg、約100 mg至約125 mg、約125 mg至約150 mg、約150 mg至約175 mg、約175 mg至約200 mg、約200 mg至約225 mg、約225 mg至約250 mg、約250 mg至約275 mg、約275 mg至約300 mg、約300 mg至約325 mg、約325 mg至約350 mg、約350 mg至約375 mg、約375 mg至約400 mg、約400 mg至約425 mg、約425 mg至約450 mg、約450 mg至約475 mg或約475 mg至500 mg之劑量投與個體。
在一些實施例中，本文所述之經遮蔽之IL-2多肽以基於個體重量或體表面積(BSA)之劑量投與個體。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1 μg/kg至約15 mg/kg (例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)之經遮蔽之IL-2多肽可為向患者投與之初始候選劑量，無論例如藉由一或多次獨立投與還是藉由連續輸注。一種典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更多之範圍內，視上文所提及之因素而定。對於經歷數日或更長時間重複投藥，視病狀而定，治療一般持續至疾病症狀得到所需抑制為止。經遮蔽之IL-2多肽之一種示例性劑量將在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg(或其任何組合)之一或多個劑量。在一些實施例中，本文所述之經遮蔽之IL-2多肽以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg或約1.0 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投與個體。在一些實施例中，本文所述之經遮蔽之IL-2多肽以約以下中之任一者的劑量投與個體：0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、3.0 mg/kg、3.5 mg/kg、4.0 mg/kg、4.5 mg/kg、5.0 mg/kg、5.5 mg/kg、6.0 mg/kg、6.5 mg/kg、7.0 mg/kg、7.5 mg/kg、8.0 mg/kg、8.5 mg/kg、9.0 mg/kg、9.5 mg/kg或10.0 mg/kg。在一些實施例中，本文所述之經遮蔽之IL-2多肽以約或至少約0.1 mg/kg、約或至少約0.5 mg/kg、約或至少約1.0 mg/kg、約或至少約1.5 mg/kg、約或至少約2.0 mg/kg、約或至少約2.5 mg/kg、約或至少約3.0 mg/kg、約或至少約3.5 mg/kg、約或至少約4.0 mg/kg、約或至少約4.5 mg/kg、約或至少約5.0 mg/kg、約或至少約5.5 mg/kg、約或至少約6.0 mg/kg、約或至少約6.5 mg/kg、約或至少約7.0 mg/kg、約或至少約7.5 mg/kg、約或至少約8.0 mg/kg、約或至少約8.5 mg/kg、約或至少約9.0 mg/kg、約或至少約9.5 mg/kg、約或至少約10.0 mg/kg、約或至少約15.0 mg/kg、約或至少約20 mg/kg、約或至少約30 mg/kg、約或至少約40 mg/kg、約或至少約50 mg/kg、約或至少約60 mg/kg、約或至少約70 mg/kg、約或至少約80 mg/kg、約或至少約90 mg/kg或約或至少約100 mg/kg之劑量投與個體。可使用上述給藥頻率中之任一者。
本文中考慮之一種方法為用本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素或組合物中的任一者治療病症或疾病，諸如癌症。可用本發明之調配物治療之病症或疾病包括白血病、淋巴瘤、頭頸癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤、乳癌、神經母細胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌(例如梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma))或睪丸癌。
在一些實施例中，本文提供一種藉由投與任何本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素或組合物來治療或預防癌症的方法。在一些實施例中，本文提供一種藉由投與任何本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素或組合物以及抗癌劑來治療或預防癌症的方法。抗癌劑可為能夠減少癌症生長、干擾癌細胞複製、直接或間接殺死癌細胞、減少癌轉移、減少腫瘤血液供應或減少細胞存活之任何藥劑。在一些實施例中，抗癌劑係選自由以下組成之群：PD-1抑制劑、EGFR抑制劑、HER2抑制劑、VEGFR抑制劑、CTLA-4抑制劑、BTLA抑制劑、B7H4抑制劑、B7H3抑制劑、CSFIR抑制劑、HVEM抑制劑、CD27抑制劑、KIR抑制劑、NKG2A抑制劑、NKG2D促效劑、TWEAK抑制劑、ALK抑制劑、靶向CD52之抗體、靶向CCR4之抗體、PD-L1抑制劑、KIT抑制劑、PDGFR抑制劑、BAFF抑制劑、HD AC抑制劑、VEGF配位體抑制劑、靶向CD19之分子、靶向FOFR1之分子、靶向DFF3之分子、靶向DKK1之分子、靶向MUC1之分子、靶向MUG 16之分子、靶向PSMA之分子、靶向MSFN之分子、靶向NY-ES0-1之分子、靶向B7H3之分子、靶向B7H4之分子、靶向BCMA之分子、靶向CD29之分子、靶向CD151之分子、靶向CD 123之分子、靶向CD33之分子、靶向CD37之分子、靶向CDH19之分子、靶向CEA之分子、靶向緊密連接蛋白18.2之分子、靶向CFEC12A之分子、靶向EGFRVIII之分子、靶向EPCAM之分子、靶向EPHA2之分子、靶向FCRH5之分子、靶向FLT3之分子、靶向GD2之分子、靶向磷脂肌醇蛋白聚醣3之分子、靶向gpA33之分子、靶向GPRC5D之分子、靶向IL-23R之分子、靶向IL-1RAP之分子、靶向MCSP之分子、靶向RON之分子、靶向ROR1之分子、靶向STEAP2之分子、靶向TfR之分子、靶向CD166之分子、靶向TPBG之分子、靶向TROP2之分子、蛋白酶體抑制劑、ABE抑制劑、CD30抑制劑、FLT3抑制劑、MET抑制劑、RET抑制劑、IL-1(3抑制劑、MEK抑制劑、ROS1抑制劑、BRAE抑制劑、CD38抑制劑、RANKE抑制劑、B4GALNT1抑制劑、SLAMF7抑制劑、IDH2抑制劑、mTOR抑制劑、靶向CD20之抗體、BTK抑制劑、PI3K抑制劑、FLT3抑制劑、PARP抑制劑、CDK4抑制劑、CDK6抑制劑、EGFR抑制劑、RAF抑制劑、JAK1抑制劑、JAK2抑制劑、JAK3抑制劑、IL-6抑制劑、IL-17抑制劑、平滑抑制劑、IL-6R抑制劑、BCL2抑制劑、PTCH抑制劑、PIGF抑制劑、TGFB抑制劑、CD28促效劑、CD3促效劑、CD40促效劑、GITR促效劑、0X40促效劑、VISTA促效劑、CD137促效劑、LAG3抑制劑、TIM3抑制劑、TIGIT抑制劑及IL-2R抑制劑。
在一些實施例中，本文提供一種藉由投與任何本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素以及消炎劑治療或預防癌症的方法。消炎劑可為能夠預防、抵消、抑制或以其他方式減少發炎之任何藥劑。
在一些實施例中，消炎劑為環加氧酶(COX)抑制劑。COX抑制劑可為抑制COX-1及/或COX-2之活性的任何藥劑。在一些實施例中，COX抑制劑選擇性抑制COX-1 (亦即，COX抑制劑抑制COX-1之活性超過其抑制COX-2之活性)。在一些實施例中，COX抑制劑選擇性抑制COX-2 (亦即，COX抑制劑抑制COX-2之活性超過其抑制COX-1之活性)。在一些實施例中，COX抑制劑抑制COX-1與COX-2兩者。
在一些實施例中，COX抑制劑為選擇性COX-1抑制劑且選自由SC-560、FR122047、P6、莫苯唑酸(mofezolac)、TFAP、氟比洛芬(flurbiprofen)及酮基布洛芬(ketoprofen)組成之群。在一些實施例中，COX抑制劑為選擇性COX-2抑制劑且係選自由以下組成之群：塞內昔布(celecoxib)、羅非昔布(rofecoxib)、美洛昔康(meloxicam)、吡羅昔康(piroxicam)、德拉昔布(deracoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、依他昔布(etoricoxib)、𠳭烯衍生物、色滿衍生物、N-(2-環己基氧基硝基苯基)甲磺醯胺、帕瑞昔布、盧米羅可(lumiracoxib)、RS 57067、T-614、BMS-347070、JTE-522、S-2474、SVT-2016、CT-3、ABT-963、SC-58125、尼美舒利(nimesulide)、氟舒胺(flosulide)、NS-398、L-745337、RWJ-63556、L-784512、達布飛龍(darbufelone)、CS-502、LAS-34475、LAS-34555、S-33516、雙氯芬酸(diclofenac)、甲芬那酸(mefenamic acid)及SD-8381。在一些實施例中，COX抑制劑係選自由以下組成之群：布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、酮咯酸(ketorolac)、吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹林(aspirin)、萘普生(naproxen)、托美丁(tolmetin)、吡羅昔康(piroxicam)及甲氯芬那酸(meclofenamate)。在一些實施例中，COX抑制劑係選自由以下組成之群：SC-560、FR122047、P6、莫苯唑酸、TFAP、氟比洛芬、酮基布洛芬、塞內昔布、羅非昔布、美洛昔康、吡羅昔康、德拉昔布、帕瑞昔布、伐地昔布、依他昔布、𠳭烯衍生物、色滿衍生物、N-(2-環己基氧基硝基苯基)甲磺醯胺、帕瑞昔布、盧米羅可、RS 57067、T-614、BMS-347070、JTE-522、S-2474、SVT-2016、CT-3、ABT-963、SC-58125、尼美舒利、氟舒胺、NS-398、L-745337、RWJ-63556、L-784512、達布飛龍、CS-502、LAS-34475、LAS-34555、S-33516、雙氯芬酸、甲芬那酸、SD-8381、布洛芬、萘普生、酮咯酸、吲哚美辛、阿司匹林、萘普生、托美丁、吡羅昔康及甲氯芬那酸。
在一些實施例中，消炎劑為NF-kB抑制劑。NF-kB抑制劑可為抑制NF-kB路徑之活性的任何藥劑。在一些實施例中，NF-kB抑制劑係選自由以下組成之群：IKK複合物抑制劑、IkB降解抑制劑、NF-kB核易位抑制劑、p65乙醯化抑制劑、NF-kB DNA結合抑制劑、NF-kB反式活化抑制劑及p53誘導抑制劑。
在一些實施例中，IKK複合物抑制劑係選自由以下組成之群：TPCA-1、NF-kB活化抑制劑VI (BOT-64)、BMS-345541、胺來呫諾(amlexanox)、SC-514 (GK-01140)、IMD-0354及IKK-16。在一些實施例中，IkB降解抑制劑係選自由以下組成之群：BAY-11-7082、MG-115、MG-132、雷克塔西汀(lactacystin)、埃普黴素(epoxomicin)、小白菊內酯(parthenolide)、卡非佐米(carfilzomib)及MLN-4924(派伏司他(pevonedistat))。在一些實施例中，NF-kB核易位抑制劑係選自由JSH-23及洛利普南(rolipram)組成之群。在一些實施例中，p65乙醯化抑制劑係選自由五倍子酸(gallic acid)及漆樹酸(anacardic acid)組成之群。在一些實施例中，NF-kB DNA結合抑制劑係選自由GYY-4137、p-XSC、CV-3988及前列腺素E2 (PGE2)組成之群。在一些實施例中，NF-kB反式活化抑制劑係選自由LY-294002、渥曼青黴素(wortmannin)及美塞拉明(mesalamine)組成之群。在一些實施例中，p53誘導抑制劑係選自由奎納克林(quinacrine)及夫拉平度(flavopiridol)組成之群。在一些實施例中，NF-kB抑制劑係選自由以下組成之群：TPCA-1、NF-KB活化抑制劑VI (BOT-64)、BMS-345541、胺來呫諾、SC-514 (GK-01140)、IMD-0354、IKK-16、BAY-11-7082、MG-115、MG-132、雷克塔西汀、埃普黴素、小白菊內酯、卡非佐米、MLN-4924 (派伏司他)、JSH-23洛利普南、五倍子酸、漆樹酸、GYY-4137、p-XSC、CV-3988、前列腺素E2 (PGE2)、LY-294002、渥曼青黴素、美塞拉明、奎納克林及夫拉平度。
在一些實施例中，本文提供一種藉由投與任何本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素或組合物以及抗癌性治療性蛋白質來治療或預防癌症的方法。抗癌性治療性蛋白質可為能夠減少癌症生長、干擾癌細胞複製、直接或間接殺死癌細胞、減少癌轉移、減少腫瘤血液供應或減少細胞存活之任何治療性蛋白質。示例性抗癌性治療性蛋白可呈抗體或其片段、抗體衍生物、雙特異性抗體、嵌合抗原受體(CAR) T細胞、融合蛋白或雙特異性T細胞銜接分子(BiTE)形式出現。在一些實施例中，本文提供一種藉由投與任何本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素或組合物以及CAR-NK (自然殺手)細胞來治療或預防癌症的方法。
9.   製品或套組 在另一態樣中，提供一種製品或套組，其包含任何本文所述之經遮蔽之IL-2細胞激素。製品或套組可進一步包含細胞激素在本發明之方法中之使用說明書。因此，在某些實施例中，製品或套組包含關於使用經遮蔽之細胞激素用於治療或預防個體之病症(例如癌症)之方法中的說明書，該等方法包含向個體投與有效量之經遮蔽之細胞激素。例如，在某些實施例中，製品或套組包含關於使用經遮蔽之IL-2多肽用於治療或預防個體之病症(例如癌症)之方法中的說明書，該等方法包含向個體投與有效量之經遮蔽之IL-2多肽。在某些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體患有選自由以下組成之群之疾病：包括白血病、淋巴瘤、頭頸癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤、乳癌、神經母細胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌或睪丸癌。
製品或套組可進一步包含容器。合適容器包括例如瓶子、小瓶(例如雙腔室小瓶)、注射器(諸如單腔室注射器或雙腔室注射器)、試管及靜脈內(IV)袋。容器可由各種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器保存調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為液體調配物。
製品或套組可進一步包含位於容器上或與容器相關之標籤或藥品說明書，其可指示復原及/或使用調配物之指導。標籤或藥品說明書可進一步指示調配物適用於或意欲用於皮下、靜脈內或其他投藥模式，以用於治療或預防個體中之病症(例如癌症)。保存調配物之容器可為單次使用型小瓶或多次使用型小瓶，其允許重複投與經復原之調配物。製品或套組可進一步包含第二容器，其包含適合稀釋劑。製品或套組可進一步包括自商業、治療及使用者觀點來看需要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明書之藥品說明書。
在特定實施例中，本發明提供用於單次給藥型投藥單元之套組。此類套組包含治療性細胞激素之水性調配物之容器，包括單腔室或多腔室預填充注射器。示例性預填充注射器可自Vetter GmbH, Ravensburg, Germany獲得。
本文中之製品或套組視情況進一步包含容器，該容器包含第二藥物，其中該經遮蔽之細胞激素為第一藥物，且製品或套組進一步包含在標籤或藥品說明書上之關於以有效量之第二藥物治療個體的說明書。
在另一實施例中，本文提供一種製品或套組，其包含用於在自動注射器裝置中投與之本文所述之調配物。自動注射器可描述為注射裝置，其在啟動後將在無來自患者或投與者之其他必需操作之情況下遞送其內含物。其在遞送速率必須恆定且遞送時間超過一段時間時尤其適用於治療性調配物之自行用藥。
10. 定義 除非另有定義，否則本文所用之所有技術術語、標記法及其他技術及科學術語均意欲具有與所主張標的物所屬技術之一般技術人員通常所理解相同的含義。在一些情況下，出於清楚起見及/或方便參考，在本文中定義具有通常所理解含義之術語，且本文中包括此類定義不應必然解釋為表示與此項技術中一般所理解存在實質性差異。
應瞭解本發明不限於特定組合物或生物系統，因而當然可變化。亦應瞭解，本文所用術語僅為了描述特定實施例，而非意欲限制。除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個參考物。因此，舉例而言，提及「IL-2多肽」視情況包括兩種或更多種此類多肽之組合及其類似物。
如本文所用，術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉之相應值的常見誤差範圍。本文中對「約」一值或參數之提及包括(且描述)本身針對彼值或參數之實施例。
應瞭解本文所述之本發明之態樣及實施例包括「由態樣及實施例組成」及/或「基本上由態樣及實施例組成」。
如本文所用，術語「及/或」係指與此術語相關之項目中之任一個、該等項目之任何組合、或所有項目。舉例而言，短語「A、B及/或C」意欲涵蓋以下實施例中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A及B；A及C；B及C；A及B或C；B及A或C；C及A或B；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
術語「抗體」包括多株抗體、單株抗體(包括具有免疫球蛋白Fc區之全長抗體)、具有多抗原決定基特異性之抗體組合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、雙功能抗體及單鏈分子)以及抗體片段(例如Fab、F(ab')2及Fv)。在本文中，術語「免疫球蛋白」(Ig)可與「抗體」互換使用。
術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含連接於同一多肽鏈(VH-VL)中之輕鏈可變(VL)域的重鏈可變(VH)域。
基礎4鏈抗體單元係由兩條一致輕(L)鏈及兩條一致重(H)鏈構成的雜四聚醣蛋白。IgM抗體由5個基礎雜四聚體單元以及稱為J鏈之另外多肽組成，且含有10個抗原結合位點，而IgA抗體包含2至5個基礎4鏈單元，該等單元可聚合以與J鏈組合形成多價組裝體。在IgG之情況下，4鏈單元一般為約150,000道爾頓。各L鏈藉由一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈藉由一或多個二硫鍵彼此連接，視H鏈同型而定。各H鏈及L鏈亦具有有規律地隔開之鏈內二硫橋鍵。各H鏈在N端具有可變域(VH)，接著為各a及y鏈之三個恆定域(CH)以及p及s同型之4個CH域。各L鏈在N端具有可變域(VL)，隨後在其另一端具有恆定域。VL與VH對準且CL與重鏈之第一恆定域(CH1)對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成界面。VH與VL配對在一起而形成單一抗原結合位點。關於不同類別抗體之結構及特性，參見例如Basic and Clinical Immunology, 第8版, Daniel P. Sties, Abba I. Terr及Tristram G. Parsolw (編輯), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 第71頁及第6章。
來自任何脊椎動物物種之L鏈均可基於其恆定域之胺基酸序列而歸為兩種顯著不同類型(稱為κ及λ)中之一種。視免疫球蛋白之重鏈之恆定域(CH)的胺基酸序列而定，免疫球蛋白可歸為不同類別或同型。存在五種類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，分別具有稱為a、8、e、y及p之重鏈。基於CH序列及功能之相對較小差異，y及a類別進一步分成子類，例如人類表現以下子類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。IgG1抗體可以多個稱為異型之多晶型變異體形式存在(綜述於Jefferis及Lefranc 2009. mAbs 第1卷, 第4期1-7中)，其中任一者皆適用於本發明。人類群體中之常見異型變異體為由字母a、f、n、z指定之變異體。
「經分離」之抗體為已自其產生環境之組分鑑別、分離及/或回收(例如以天然或重組方式)之抗體。在一些實施例中，經分離之多肽與來自其產生環境之所有其他組分無關聯。其產生環境之污染組分(諸如由經重組轉染細胞產生之組分)係通常會干擾抗體之研究、診斷性或治療性用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶解物。在一些實施例中，將多肽純化達到：(1)如藉由例如勞立法(Lowry method)所測定，大於抗體之95重量%，且在一些實施例中，純化至大於99重量%；(1)足以藉由使用旋轉杯式定序儀獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(3)使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或銀染料在非還原或還原條件下藉由SDS-PAGE，均質。經分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體，此係因為抗體之天然環境之至少一種組分將不存在。然而，通常，經分離之多肽或抗體係藉由至少一個純化步驟來製備。
如本文所用，術語「單株抗體」係指一種自實質上均質之抗體群獲得之抗體，亦即，構成該群體之個別抗體除可能少量存在的可能天然存在之突變及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)之外其餘均相同。在一些實施例中，單株抗體在重鏈及/或輕鏈處具有C端裂解。舉例而言，1、2、3、4或5個胺基酸殘基在重鏈及/或輕鏈之C端處裂解。在一些實施例中，C端裂解自重鏈移除C端離胺酸。在一些實施例中，單株抗體在重鏈及/或輕鏈處具有N端裂解。舉例而言，1、2、3、4或5個胺基酸殘基在重鏈及/或輕鏈之N端處裂解。在一些實施例中，可藉由重組技術製得單株抗體之截短形式。在一些實施例中，單株抗體針對單一抗原位點具有高度特異性。在一些實施例中，單株抗體針對多個抗原位點具有高度特異性(諸如雙特異性抗體或多特異性抗體)。修飾語「單株」指示抗體之特徵為自實質上均質之抗體群獲得，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，待根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，該等技術包括例如融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現技術及用於在具有部分或所有的編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因的動物中產生人類抗體或人類樣抗體之技術。
術語「全長抗體」、「完整抗體」或「完全抗體」可互換使用以指代相較於抗體片段呈實質上完整形式之抗體。特定言之，完全抗體包括具有包括Fc區之重鏈及輕鏈之抗體。恆定域可為天然序列恆定域(例如人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。在一些情況下，完整抗體可具有一或多種效應功能。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，諸如完整抗體之抗原結合區及/或可變區，及/或完整抗體之恆定區。抗體片段之實例包括抗體之Fc區、Fc區之一部分或包含Fc區之抗體之一部分。抗原結合抗體片段之實例包括域抗體(dAb)、Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(參見美國專利第5,641,870號，實例2；Zapata等人, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995])；單鏈抗體分子，及由抗體片段形成之多特異性抗體。單重鏈抗體或單輕鏈抗體可經工程改造或在重鏈之情況下，可自經工程改造以產生單重鏈分子之駱駝、鯊魚、集合庫或小鼠分離。
木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱作「Fab」片段；及殘餘「Fc」片段，該名稱反映易於結晶之能力。Fab片段由整個L鏈以及H鏈之可變區域(VH)及一條重鏈之第一恆定域(CH1)組成。各Fab片段就抗原結合而言係單價的，亦即，其具有單一抗原結合位點。胃蛋白酶處理抗體產生單一較大的F(ab')2片段，該片段大致對應於經二硫鍵連接的具有不同抗原結合活性之兩個Fab片段且仍能夠交聯抗原。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，Fab'片段在CHI域之羧基端具有幾個另外的殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH為本文中恆定域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基之Fab'的名稱。F(ab')2抗體片段最初以其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對形式產生。抗體片段之其他化學偶合亦已知。Fc片段包含藉由二硫鍵結合在一起的兩個H鏈之羧基端部分。抗體之效應功能由Fc區中之序列及聚糖決定，該區亦由在某些類型之細胞上發現之Fc受體(FcR)識別。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之對準可以此項技術中之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。舉例而言，既定胺基酸序列A相對於、與或針對既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者，其可表述為相對於、與或針對既定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性%之既定胺基酸序列A)計算如下： 100×分數X/Y 其中X為在A與B之程式比對中藉由序列評為一致匹配之胺基酸殘基數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%不相等。
抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(例如天然序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區)的彼等生物活性，且隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：Clq結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
如本文所用，「結合親和力」係指分子(例如細胞激素)之單一結合位點與其結合搭配物(例如細胞激素受體)之間的非共價相互作用之強度。在一些實施例中，結合蛋白(例如細胞激素)之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所描述之彼等方法)來量測親和力。
編碼本文所述之細胞激素多肽的「經分離」之核酸分子為經鑑別且與至少一種在其產生環境中通常與其相關聯之污染性核酸分子分離的核酸分子。在一些實施例中，經分離之核酸不與所有與產生環境相關聯之組分相關聯。編碼本文中之多肽及細胞激素多肽的經分離之核酸分子所呈形式不同於在自然界中發現其的形式或環境。因此，經分離之核酸分子與細胞中天然存在的編碼本文中之多肽及細胞激素多肽之核酸不同。
術語「醫藥調配物」係指呈允許活性成分之生物活性有效之形式，且不含對調配物將投與之個體具有不可接受之毒性的其他組分之製劑。
此類調配物為無菌的。
如本文所用，「載劑」包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其在所使用之劑量及濃度下對暴露於其之細胞或哺乳動物無毒性。通常生理學上可接受之載劑係水性pH緩衝溶液。生理學上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS™。
如本文所用，術語「治療」係指經設計以改變所治療之個體或細胞在臨床病理學之病程期間的天然病程的臨床介入。所需治療效果包括降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。舉例而言，若與病症(例如贅生性疾病)相關之一或多種症狀緩解或消除，則成功「治療」個體。舉例而言，若治療提高罹患疾病之個體之生活品質、降低治療疾病所需之其他藥物之劑量、降低疾病之復發頻率、減輕疾病之嚴重程度、延緩疾病之發展或進程及/或延長個體之存活期，則成功「治療」個體。
如本文所用，「與……結合」或「與……組合」係指除一種治療形式以外亦投與另一種治療形式。因此「與……結合」或「與……組合」係指在向個體投與一種治療形式之前、期間或之後投與另一種治療形式。
如本文所用，術語「預防」包括提供關於個體中疾病之發生或復發之防治。個體可能傾向於患病、易患病或具有發展病症之風險，但尚未診斷患有病症。在一些實施例中，本文所述之經遮蔽之細胞激素用於延遲病症發展。
如本文所用，「具有發展病症之風險」的個體可具有或不具有可偵測之疾病或疾病症狀，且在本文所述之治療方法之前可能已經顯示或尚未顯示可偵測之疾病或疾病症狀。「具有風險」表示個體具有一或多種如此項技術中已知之風險因素，該等風險因素為與疾病發展相關的可量測之參數。具有此等風險因素中之一或多者的個體比不具有此等風險因素中之一或多者的個體具有更高的發展病症之機率。
「有效量」係指在所需劑量及時段下，至少有效達成所需或所指示之作用(包括治療或預防結果)之量。
可在一或多次投藥中提供有效量。「治療有效量」至少為實現特定病症之可量測的改善所需之最小濃度。在本文中，治療有效量可根據諸如以下之因素而變化：患者之疾病狀態、年齡、性別及體重，及抗體引起個體中之所需反應的能力。治療有效量亦可為治療有益作用超過經遮蔽之細胞激素之任何毒性或有害作用的量。「預防有效量」係指在必需劑量下且在必需時段內有效達成所需預防結果之量。通常但未必，由於預防劑量係在個體中患病之前或疾病早期階段使用，所以預防有效量可小於治療有效量。
「「慢性」投藥係指與急性模式相反，以持續模式投與藥物，以便長時間保持初始治療作用(活性)。「間歇性」投藥為不在無間斷情況下連續進行，而實際上循環進行之治療。
如本文所用，「個體」為哺乳動物。出於治療之目的，「哺乳動物」包括人類、家養及農場動物以及動物園、運動或寵物動物，諸如犬、馬、兔、牛、豬、倉鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、貓等。在一些實施例中，個體為人類。
11. 實例 參考以下實例將更充分理解本發明。然而，其不應解釋為限制本發明之範疇。應瞭解，本文所述之實例及實施例僅出於說明之目的，且根據其之各種修改或變化將由熟習此項技術者提出且包括在本申請案之精神及範圍以及隨附申請專利範圍之範疇內。
雖然一些實例描述IL-2多肽構築體之「經遮蔽」型式之工程改造、產生及/或測試，但一些實例亦採用IL-2多肽構築體之親本「未遮蔽」型式，諸如用於比較，或作為比較對照進行測試的包括本文所述之組分中之一或多者的其他構築體。因此，譬如在經遮蔽之IL-2多肽構築體上進行之測試道描述不一定意謂亦不測試該構築體之未遮蔽型式。
實例 1 ： 經遮蔽之 IL-2 多肽 根據本文中之教示產生經遮蔽之IL-2多肽構築體。在隨後實例中，一些實驗涉及使用呈單體形式之經遮蔽之IL-2多肽構築體，且一些實驗涉及使用呈二聚體形式之經遮蔽之IL-2構築體，諸如經由連接相同經遮蔽之多肽構築體之兩個拷貝的二硫鍵形成的二聚體(均二聚體)或由兩種不同多肽形成之雜二聚體(參見例如表5)。
產生包括IL-2多肽或其功能片段、遮蔽部分及半衰期延長域(諸如抗體或其片段(例如Fc區、重鏈及/或輕鏈))的經遮蔽之IL-2多肽構築體。亦產生包括連接於半衰期延長域之IL-2多肽或其功能片段的一些IL-2多肽構築體，其亦不包括遮蔽部分。一些構築體亦包括如下連接子，該連接子包含可裂解肽且將遮蔽部分連接至IL-2多肽或其功能片段，藉此產生可活化之經遮蔽之IL-2多肽構築體。一些構築體亦包括將IL-2多肽或其功能片段連接於半衰期延長域之連接子。一些構築體亦包括將IL-2多肽或其功能片段連接於遮蔽部分之連接子。在將IL-2多肽或其功能片段連接於遮蔽部分之連接子中不包括可裂解肽的經遮蔽之IL-2多肽構築體亦稱為不可活化之經遮蔽之IL-2多肽構築體或不可活化之IL-2多肽構築體，因為其不包括可裂解肽。示例性IL-2多肽構築體之結構及組成提供於表3中。 表3：
構築體編號 細胞激素或其功能片段(C) 連接子(L1) 遮蔽部分(MM) 連接子(L2) 半衰期延長域(H) 結構(N端至C端方向) 胺基酸序列
AK032 SEQ ID NO: 62 - - - SEQ ID NO: 65 H-C SEQ ID NO: 67
AK035 SEQ ID NO: 3 - - - SEQ ID NO: 65 H-C SEQ ID NO: 68
亦產生如下經遮蔽之IL-2多肽構築體，其包括IL-2多肽或其功能片段、第一遮蔽部分、第二遮蔽部分及半衰期延長域，諸如白蛋白、抗體或其片段(例如Fc區、重鏈及/或輕鏈)、白蛋白結合肽、IgG結合肽或聚胺基酸序列。一些構築體亦包括將第一遮蔽部分連接於IL-2多肽或其功能片段之連接子。一些構築體亦包括將第二遮蔽部分連接於IL-2多肽或其功能片段之連接子。一些構築體在將第一遮蔽部分連接於IL-2多肽或其功能片段之連接子及/或將第二遮蔽部分連接於IL-2多肽或其功能片段之連接子中包括可裂解肽，藉此產生可活化之經遮蔽之IL-2多肽構築體。一些構築體亦包括將第二遮蔽部分連接於半衰期延長域之連接子。在將IL-2多肽或其功能片段連接於第一遮蔽部分或第二遮蔽部分之任一連接子中不包括可裂解肽的經遮蔽之IL-2多肽構築體亦稱為不可活化之經遮蔽之IL-2多肽構築體或不可活化之IL-2多肽構築體，因為其不包括可裂解肽。示例性IL-2多肽構築體之結構及組成提供於表4中。 表4：
構築體編號 遮蔽部分(MM1) 連接子(L1) 細胞激素或其功能片段(C) 連接子(L2) 遮蔽部分(MM2) 連接子(L3) 半衰期延長域(H) 結構 (N端至C端方向) 胺基酸序列
AK041 SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 65 H-L1-MM1-L2-C-L3-MM2 SEQ ID NO: 66
亦產生如下經遮蔽之IL-2多肽構築體，其包括IL-2多肽或其功能片段、遮蔽部分、第一半衰期延長域及第二半衰期延長域、抗體或其片段(例如Fc區、重鏈及/或輕鏈)。遮蔽部分連接於第一半衰期延長域，IL-2多肽或其功能片段連接於第二半衰期延長域，且第一半衰期延長域及第二半衰期延長域含有促進第一半衰期延長域與第二半衰期延長域締合之修飾。在一示例性實施例中，遮蔽部分連接於第一半衰期延長域且包括SEQ ID NO: 38之胺基酸序列，且IL-2多肽或其功能片段連接於第二半衰期延長域且包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，且第一半衰期延長域及第二半衰期延長域含有促進第一半衰期延長域與第二半衰期延長域締合之修飾。在未經遮蔽之IL-2多肽構築體之一示例性實施例中，該實施例包含連接於第一半衰期延長域之IL-2多肽或其功能片段，且包含第二半衰期延長域，其中IL-2多肽或其功能片段連接於第一半衰期延長域且包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，且第二半衰期延長域包括SEQ ID NO: 79之胺基酸序列。一些構築體亦包括將遮蔽部分連接至第一半衰期延長域之連接子，及/或將IL-2多肽或其功能片段連接於第二半衰期延長域之連接子。亦連接一些構築體之第一半衰期延長域及第二半衰期延長域。在一些構築體中，一些構築體之第一半衰期延長域及第二半衰期延長域由連接子連接。一些構築體在將遮蔽部分連接於第一半衰期延長域之連接子及/或將IL-2多肽或其功能片段連接於第二半衰期延長域之連接子中包括可裂解肽，藉此產生可活化之經遮蔽之IL-2多肽構築體。在將IL-2多肽或其功能片段連接於第二半衰期延長域之連接子或將遮蔽部分連接於第一半衰期延長域之連接子中不包括可裂解肽的經遮蔽之IL-2多肽構築體亦稱為不可活化之經遮蔽之IL-2多肽構築體或不可活化之IL-2多肽構築體，因為其不包括可裂解肽。示例性IL-2多肽構築體之結構及組成提供於表5中。 表5
構築體編號 細胞激素或其功能片段 (C) 連接子(L1) 遮蔽部分(MM) 連接子(L2) 半衰期延長域(H) 結構 (N端至C端方向) 胺基酸序列
AK081 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 85
- - - - SEQ ID NO: 79 H SEQ ID NO: 79
AK109 - SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 80 H-L1-MM SEQ ID NO: 86
SEQ ID NO: 62 - - - SEQ ID NO: 81 H-C SEQ ID NO: 87
AK110 - SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 82 H-L1-MM SEQ ID NO: 88
SEQ ID NO: 62 - - - SEQ ID NO: 83 H-C SEQ ID NO: 89
AK111 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 85
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK165 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 83 H-L1-C SEQ ID NO: 90
- - - - SEQ ID NO: 84 H SEQ ID NO: 91
AK166 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 83 H-L1-C SEQ ID NO: 90
- SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO:82 H-L1-MM SEQ ID NO: 92
AK167 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 45
- - - - SEQ ID NO: 79 H SEQ ID NO: 79
AK168 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO:45
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK189 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 76 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 93
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK190 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 77 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 94
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK191 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 20 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 46
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK192 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 76 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO:95
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK193 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 77 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 96
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK197 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 21 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 47
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK203 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 22 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 48
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO:9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK209 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 49
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK210 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 20 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 97
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK211 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 23 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 98
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK215 SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 99
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO:38
AK216 SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 100
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK218 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 101
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO:38
AK219 SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 102
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK220 SEQ ID NO: 873 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 103
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK223 SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 18 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 104
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK235 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 49
- - - - SEQ ID NO: 79 H SEQ ID NO: 79
AK253 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 23 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 98
- - - - SEQ ID NO: 79 H SEQ ID NO: 79
AK304 SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 105
- - - - SEQ ID NO: 79 H SEQ ID NO: 79
AK305 SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 105
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK306 SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 106
- - - - SEQ ID NO: 79 H SEQ ID NO: 79
AK307 SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 106
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK308 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 107
- - - - SEQ ID NO: 79 H SEQ ID NO: 79
AK309 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 107
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK310 SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 108
- - - - SEQ ID NO: 79 H SEQ ID NO: 79
AK311 SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 108
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK312 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO:78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 109
- - - - SEQ ID NO: 79 H SEQ ID NO: 79
AK313 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 109
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK314 SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO:78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 110
- - - - SEQ ID NO: 79 H SEQ ID NO: 79
AK315 SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 110
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
AK316 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 78 - - SEQ ID NO: 12 H-L1-C SEQ ID NO: 112
- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 9 H-L1-MM SEQ ID NO: 38
實例 2 ：經遮蔽之 IL-2 多肽之活體外表徵 使用若干細胞及功能分析在活體外表徵實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體。
產生 將編碼構築體(例如經遮蔽之IL-2多肽構築體)之質體轉染至Expi293細胞(Life Technologies A14527)或HEK293-6E細胞(National Research Council；NRC)中。使用1 mg總DNA，使用PEIpro (Polyplus Transfection，115-100)，以與總DNA 1:1比率，進行轉染。將DNA及PEI各自添加至50 mL OptiMem (Life Technologies 31985088)培養基且無菌過濾。將DNA與PEI組合10分鐘且添加至Expi293細胞，其中expi293細胞或HEK293細胞之細胞密度分別為1.8-2.8×106 個細胞/毫升或0.85-1.20×106 個細胞/毫升，且存活率為至少95%。根據Expi293轉染使用之相同方案，在細胞密度及至少95%之存活率下進行HEK293-6E轉染。在5-7天之後，藉由以3000×g離心使細胞集結，且經由0.2 µm膜過濾上清液。將蛋白A樹脂(CaptivA，Repligen CA-PRI-0005)添加至經過濾上清液且在4℃下在震盪下培育至少2小時。將樹脂封裝於管柱中，用15管柱體積之20 mM檸檬酸鹽(pH 6.5)洗滌，且接著用15管柱體積之20 mM檸檬酸鹽、500 mM氯化鈉(pH 6.5)洗滌。用20 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl (pH 2.9)自管柱溶離結合之蛋白質。
所產生之示例性構築體，包括親本(例如未經遮蔽)及經遮蔽之構築體的力價(mg/L)提供於下表6中。表 6
構築體 ID 力價 (mg/L)    構築體 ID 力價 (mg/L)
AK032 5.8    AK312 154
AK035 16.7    AK313 81.2
AK081 23.5     
AK111 12.7     
AK165 13.5     
AK166 17.1     
AK167 56.4     
AK168 36.1     
AK203 83.2     
AK209 27.3     
AK211 43.8     
AK235 35.9     
AK253 41.4     
AK304 19.9     
AK305 53.2     
AK306 29.3     
AK307 62.9     
AK314 60     
AK315 59.8     
AK316 69.2     
AK308 74.5     
AK309 90.8     
AK310 44     
AK311 64.9     
SDS-PAGE 分析 對於SDS-PAGE分析，用4×Laemmli樣品緩衝液(BioRad目錄號1610747)製造蛋白質樣品。對於還原之樣品，添加0.1 M Bond Breaker TCEP溶液(Thermo Scientific 77720)且在65℃下加熱樣品5分鐘。將蛋白質裝載至12孔NuPage 4-12% Bis-Tris蛋白質凝膠(Invitrogen NP0322BOX)中，其中每孔裝載4 µg蛋白質。使用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen LC6065)將凝膠染色。
如圖4中所描繪，在示例性構築體(AK304、AK305、AK307、AK308、AK309、AK310、AK311、AK312、AK313、AK314及AK315)產生及純化之後對流過(FT)樣品(亦即，未結合於蛋白A管柱之蛋白質)及溶離(E)樣品(亦即，結合於蛋白A管柱且自其中溶離之蛋白質)進行SDS-PAGE分析。此示例性資料證明可成功地產生及純化如本文所述之構築體。
報導體生物分析 對經遮蔽之IL-2多肽構築體以及未經遮蔽之親本構築體或其他對照進行報導體生物分析，以監測諸如JAK-STAT路徑之下游路徑之活化。
在一些研究中，使用HEK-Blue IL-2報導細胞(Invivogen)根據以下方法測試JAK-STAT路徑之活化。將HEK-Blue IL-2細胞繼代6 (p6) (97%活)用分析培養基(DMEM + 10%熱不活化FBS)洗滌2次，於150 μL分析培養基中以5e4個細胞/孔接種於3個培養盤中，且在分析培養基中靜置約2小時以允許黏附至培養盤。將測試之各構築體在分析培養基中稀釋至300 pM，接著沿著盤向下1:2稀釋。添加50 μL各稀釋液，最終起始濃度為75 pM。在24小時之後收穫HEK-Blue IL-2細胞上清液，與Quantiblue (180 μL+20 μL上清液)加上3個孔/盤之分析培養基一起在37℃下培育1小時。使用Biotek Neo2在625 nm下讀取吸收率。
在一些研究中，使用CTLL2細胞根據以下方法測試JAK-STAT路徑之活化。將CTLL2細胞於具有10% FBS之RPMI中以每孔40,000個細胞塗鋪。添加所關注構築體之稀釋液且在37℃下培育。在6小時之後，添加Bio-Glo試劑且用BioTek Synergy Neo2盤式讀取器量測發光。
受體結合 評估實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體的結合。ELISA盤塗佈有受體次單元，諸如IL-2Rα (亦稱為CD25)、IL-2Rβ (亦稱為CD122)或IL-2Rγ (亦稱為CD132)或其組合。使經遮蔽之IL-2多肽構築體之稀釋液結合於受體次單元且使用抗huFc-HRP偵測抗體偵測。在存在及不存在蛋白酶裂解的條件下測定經遮蔽之IL-2多肽構築體的結合。
細胞上受體結合 評估實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體的細胞上受體結合。使經遮蔽之IL-2多肽構築體之稀釋液結合於周邊血液淋巴球或組織培養細胞，諸如CTLL2細胞，且藉由螢光活化細胞分選術(FACS)使用抗huFc-FITC或抗白蛋白-FITC偵測抗體來偵測。在存在及不存在蛋白酶裂解的條件下測定經遮蔽之IL-2多肽構築體的結合。
受體結合親和力 評估實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體地結合親和力。在存在及不存在蛋白酶裂解的條件下測定經遮蔽之IL-2多肽構築體之結合親和力。
對於測試經遮蔽之及未經遮蔽之IL-2多肽構築體之結合的SPR研究，將Reichert羧甲基聚葡萄糖水凝膠表面感測器晶片用10 mM乙酸鈉(pH 5.0)中30 μg/ml之所關注構築體(例如經遮蔽之IL-2多肽構築體或未經遮蔽之IL-2多肽構築體)塗佈，且經由利用EDC及NHS之胺偶合進行固定。製備CD25-Fc或Fc-CD122於PBST中之稀釋液(CD25: 16 nM、8 nM、4 nM、2 nM、1 nM及CD122：500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nM)。使用Reichert 4Channel SPR，CD25或CD122之稀釋液流過固定有構築體之夾頭，以確定25℃下之締合速率。在平衡下(約3分鐘)，將流動緩衝液改變為PBST，以測定經6分鐘之解離速率。在各操作之間，晶片用10 mM甘胺酸(pH 2.0)再生。
圖5A-5D描繪IL-2上的防止其與其α-受體結合之突變的功效，此使用SPR分析，測試示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體(AK168)與CD25-Fc之結合。圖5A描繪AK168與CD25-Fc之間的相互作用，圖5B描繪經MMP活化之AK168與CD25-Fc之間的相互作用，且圖5C描繪重組人類IL-2 (rhIL2)對照與CD25-Fc之間的相互作用。圖5D提供一表格，該表格總結針對締合常數(ka)、解離常數(kd)、平衡解離常數(KD)以及各相互作用之χ2值及U值所獲得的資料。此等結果證明此示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體(AK168)未展現可偵測之與CD25-Fc之結合，而野生型rhIL-2對照展現可偵測之結合。
圖6A-6D描繪IL-2對其β受體之遮蔽以及在用蛋白酶活化後結合之恢復，此使用SPR分析，測試示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體(AK111)與CD122Fc之結合。圖6A描繪AK111與CD122-Fc之間的相互作用，圖6B描繪經MMP活化之AK111與CD122-Fc之間的相互作用，且圖6C描繪重組人類IL-2 (rhIL-2)對照與CD122-Fc之間的相互作用。圖6D提供一表格，該表格總結針對締合常數(ka)、解離常數(kd)、平衡解離常數(KD)以及各相互作用之χ2值及U值所獲得的資料。此等結果證明此示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體(AK111)未展現可偵測之與CD122-Fc之結合，除非其經蛋白酶活化，而rhIL-2對照展現可偵測之結合。所測試之各種構築體，包括經遮蔽之及未經遮蔽之構築體的額外示例性SPR資料提供於下表7中。對於一些結構，適當時，針對先前經蛋白酶裂解或未裂解之構築體測定KD。表 7
構築體 對 CD25 之 KD ( 未經蛋白酶裂解 ) 對 CD122 之 KD ( 未經蛋白酶裂解 ) 對 CD122 之 KD ( 經蛋白酶裂解後 )
rhIL2 0.878 nM 124 nM N/A
AK032 1.76 nM 260 nM N/A
AK035 未偵測到結合 110 nM N/A
AK081 0.875 nM 347 nM N/A
AK109 1.67 nM 未偵測到結合 118 nM
AK110 0.911 nM 未偵測到結合 195 nM
AK111 0.4 nM 未偵測到結合 235 nM
AK168 未偵測到結合 未測定 175 nM
AK215 未偵測到結合      
AK216 未偵測到結合      
AK218 弱結合      
AK219 弱結合      
AK220 弱或未偵測到結合      
AK223 未偵測到結合      
裂解 如上所述，在蛋白酶存在或不存在下及在多個時間點諸如藉由添加EDTA使蛋白酶(若存在)失活之後培育經遮蔽之IL-2肽構築體後，進行受體結合分析來評估經遮蔽之IL-2多肽構築體之裂解速率。亦使用還原及非還原聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及藉由質譜分析全質量及肽圖分析來評估裂解速率。亦使用離體分析評估裂解速率，其中經遮蔽之IL-2多肽構築體暴露於人類、小鼠或食蟹獼猴周邊血液淋巴球或正常人類組織或人類腫瘤組織。
對於一些蛋白酶活化研究，將MMP10在MMP裂解緩衝液中稀釋至50 ng/μL且在37℃下用1 mM APMA活化2小時。將5 µL蛋白酶(總共250 ng)之活化蛋白酶與1 μM經遮蔽之細胞激素構築體一起培育且在37℃下培育2小時。藉由SDS-PAGE，使用AnykD™ Criterion™ TGXStain-Free™蛋白凝膠評估裂解。採用類似方法來測試藉由其他蛋白酶之裂解。
圖7A描繪在藉由蛋白酶，諸如與腫瘤環境相關之蛋白酶裂解之前(左)及之後(右)經遮蔽之IL-2多肽之一示例性結構。圖7B描繪在缺乏(左泳道)或存在(右泳道)MMP10蛋白酶下培育之示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體德SDS-PAGE分析。
增殖 評估IL-2反應性組織培養細胞株，諸如CTLL2、YT、TF1B、LGL、HH及CT6在用實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體處理後的增殖。對於涉及經遮蔽之IL-2多肽構築體之實驗，將細胞於缺乏IL-2之培養基中塗鋪於96孔組織培養盤中2-4小時且接著用各種濃度之經遮蔽之IL-2多肽構築體處理。在37℃下培育24-48小時之後，藉由添加MTS、alamar藍、螢光素酶或類似代謝偵測試劑測定細胞數目，且藉由盤式分光光度計讀取器偵測比色、螢光或螢光素酶讀數。
亦評估免疫細胞在用實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體處理後的增殖。將人類、小鼠或食蟹獼猴周邊血液單核細胞(PBMC)用各種濃度之構築體處理，且細胞類型(諸如自然殺手(NK)細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞及/或Treg細胞)之增殖藉由對特定細胞類型染色及經由螢光活化細胞分選術(FACS)分析分析來測定。在一些實驗中，用對照處理一些PBMC以進行比較。在一些實驗中，一些PBMC用阿地介白素(aldesleukin)處理，作為經遮蔽之IL-2多肽處理之對照。在一些實驗中，NK細胞染色為CD45+ CD3- CD56+，CD8+ T細胞染色為CD45+ CD3+ CD8+，CD4+ T細胞染色為CD45+ CD3+ CD4+ CD25-，且Treg細胞染色為CD45+ CD3+ CD4+ CD25+ FOXP3+。在一些實驗中，PBMC處理五天之時段。在一些實驗中，PBMC亦用Ki67 (一種細胞增殖標記物)染色。在一些實驗中，PBMC在處理之前經CFSE (Sigma-Aldrich)標記且增殖係藉由測定CFSE稀釋之程度來量測。在一些實驗中，各構築體以及阿地介白素及/或其他對照物以一或多種濃度，諸如在0.0001 nM至500 nM範圍內之一或多種濃度投與。
STAT5 活化 亦評估在用實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體處理後信號轉導與轉錄活化因子5(STAT5)之活化。將PBMC用構築體處理指定時段且接著立即固定以保持蛋白質(諸如STAT5)之磷酸化狀態。在一些實驗中，用對照處理一些PBMC以進行比較。在一些實驗中，一些PBMC用阿地介白素(aldesleukin)處理，作為經遮蔽之IL-2多肽處理之對照。在一些實驗中，在存在及不存在蛋白酶裂解(例如活化)的條件下測試經遮蔽之IL-2多肽構築體。在一些實驗中，將PBMC處理10分鐘、15分鐘、20分鐘或25分鐘。在一些實驗中，各構築體以及阿地介白素及/或其他對照物以一或多種濃度，諸如在0.0001 nM至500 nM範圍內之一或多種濃度投與。在一些實驗中，固定及滲透之PBMC接著用對磷酸化STAT5 (磷酸STAT5)具有特異性之抗體染色且藉由流動式細胞量測術分析。在一些實驗中，量測STAT5之總及磷酸化水準。某些細胞類型，諸如NK細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞及/或Treg細胞之磷酸STAT5狀態藉由特定細胞類型之染色來確定。在一些實驗中，NK細胞染色為CD45+ CD3- CD56+，CD8+ T細胞染色為CD45+ CD3+ CD8+，CD4+ T細胞染色為CD45+ CD3+ CD4+ CD25-，且Treg細胞染色為CD45+ CD3+ CD4+ CD25+ FOXP3+。
亦評估小鼠細胞株、諸如CTLL-2細胞中在用實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體處理後的STAT5活化。在一些實驗中，用對照處理一些CTLL-2細胞以進行比較。在一些實驗中，一些CTLL-2細胞用阿地介白素處理，作為經遮蔽之IL-2多肽處理之對照。在一些實驗中，在存在及不存在蛋白酶裂解(例如活化)的條件下測試經遮蔽之IL-2多肽構築體。在一些實驗中，將CTLL-2細胞處理10分鐘、15分鐘、20分鐘或25分鐘，且隨後固定以保持諸如STAT5之蛋白質的磷酸化狀態。在一些實驗中，各構築體以及阿地介白素及/或其他對照物以一或多種濃度投與。在一些實驗中，量測STAT5之總及磷酸化水準。
在一些研究中，藉由以下方法測定由IL-2誘發之細胞內STAT5活化(pSTAT5信號)之程度。使冷凍人類PBMC在水浴中解凍且添加至39 mL預溫熱培養基(RPMI1640培養基加10% FBS、1% P/S、1% NEA)中，旋轉且以10E6個細胞/毫升在培養基中復原。以每孔5E5個細胞將細胞塗鋪於96孔盤中。將在培養基中稀釋之IL-2 (例如rhIL-2或示例性含IL-2之多肽構築體)添加至各孔中，且在37℃下培育20分鐘。細胞隨後在4℃下用200微升/孔固定緩衝液(eBiosciences)固定隔夜。在離心之後，將固定細胞再懸浮於200 μl冷BD Phosflow緩衝液中且在4℃下培育30分鐘。在洗滌細胞兩次之後，將其在冰上用Biolegend Human TruStain FcX (於染色緩衝液中，2.5 μL，每個樣品總共50 μL)處理5分鐘。添加染色抗體；5 μl pSTAT5- APC (pY694，BD)、10 μl CD56-BV421 (5.1H11，Biolegend)、10 μl CD4-PerCP/Cy5.5 (A161A1，Biolegend)及10 μl CD3-FITC (UCHT1，Biolegend)，且在冰上培育30分鐘，避光。將細胞洗滌2次且再懸浮，且藉由流動式細胞量測術分析。
圖8A-8D描繪來自使用示例性構築體AK032、AK035、AK041或作為對照之rhIL-2進行如上所述之STAT5活化研究的結果。展示NK細胞、CD8+ T細胞、效應T細胞(Teff)及調節T細胞(Treg)之STAT5活化程度(%)。AK032及AK035構築體包括連接於Fc域之IL-2多肽，且AK041構築體包括連接於CD25域及CD122域之IL-2多肽。如所示，在一些實施例中，經工程改造之IL-2多肽構築體可減少Treg細胞之活化，同時保留或增強CD8+ T細胞及NK細胞之活化。
圖9A-9C描繪來自使用示例性構築體AK081及AK032之如上所述之STAT5活化研究的結果。測試在先前暴露於或未暴露於MMP10下之AK081構築體。亦測試同型對照以及無IL-2陰性對照。展示NK細胞、CD8+ T細胞及CD4+ T細胞之STAT5活化程度(%)。AK032及AK081構築體包括連接於Fc域之IL-2多肽，且AK081構築體在將IL-2多肽連接於Fc域之連接子中包括可裂解肽。如所示，在有或無蛋白酶活化下未經遮蔽之單體AK081 IL-2多肽構築體刺激PBMC之STAT5活化，類似於未經遮蔽之二聚AK032 IL-2多肽構築體。
圖10A-10D描繪來自使用示例性構築體AK081及AK111以及包括rhIL-2及抗RSV抗體之對照之STAT5活化研究的結果。亦測試無處理對照。AK111構築體為包括IL-2多肽之野生型形式(除C125A突變以外)的示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體。如圖10A-10D中所示，經遮蔽之IL-2多肽構築體AK111展現與未經遮蔽之IL-2多肽構築體AK081相比STAT5活化減少。圖10D提供AK081、AK111構築體以及rhIL-2對照之EC50 (pM)及變化倍數資料。
圖11A-11D描繪來自使用示例性構築體AK167及AK168以及包括rhIL-2及抗RSV抗體之對照之STAT5活化研究的結果。亦測試無處理對照。AK168構築體為包括消除或減少CD25結合之IL2多肽之突變形式的示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體。AK167構築體為包括相同突變型IL-2多肽之AK168構築體之親本未經遮蔽形式。如圖11A-11C中所示，未經遮蔽之AK167構築體與rhIL-2對照相比展現減少之STAT5活化，且經遮蔽之IL-2多肽構築體AK168不誘發可偵測之STAT5活化。圖11D提供AK167、AK168構築體以及rhIL-2對照之EC50 (pM)及變化倍數資料。AK168構築體之EC50為不可偵測的(n.d.)。
圖12A-12D描繪來自使用(+MMP10)或先前未暴露於MMP10蛋白酶之示例性構築體AK165及AK166以及同型對照及IL-2-Fc對照的如上所述之STAT5活化研究的結果。AK166構築體為包括IL-2多肽之野生型形式(除C125A突變以外)的示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體。AK165構築體為包括相同IL-2多肽之AK166構築體之親本未經遮蔽形式。如圖12A中所示之圖例亦適用於圖12B，且如圖12C中所示之圖例亦適用於圖12D。如圖12A-12D中所示，經遮蔽之AK166構築體(無蛋白酶裂解)的STAT5活化急劇減弱，但在暴露於活化蛋白酶MMP10後恢復至類似於IL2-Fc對照的程度。
圖13A-13C描繪來自使用(+MMP10)或先前未暴露於MMP10蛋白酶之示例性構築體AK109及AK110以及同型對照及IL-2-Fc對照的如上所述之STAT5活化研究的結果。AK109及AK110構築體為包括具有不同雜二聚突變之半衰期延長域的示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體。如圖13B中所示之圖例亦適用於圖13A。如圖13A-13C中所示，經遮蔽之AK109及AK110構築體(無蛋白酶裂解)的STAT5活化急劇減弱，但在暴露於活化蛋白酶MMP10後升高至接近IL2-Fc對照的程度。
圖14A-14D描繪來自使用構築體AK211、AK235、AK253、AK306、AK310、AK314及AK316以及rhIL-2對照之如上所述之STAT5活化研究的結果。此包括作為親本未經遮蔽之構築體(AK235、AK253、AK306、AK310、AK314)之構築體，其包括調節CD25結合之各種突變。圖14D提供各測試構築體以及rhIL-2對照之EC50資料。
圖15A-15D展示來自使用已經蛋白酶活化之構築體AK081、AK167、AK216、AK218、AK219、AK220及AK223以及rhIL-2對照的如上所述之STAT5活化研究的結果。亦測試無處理對照。此包括包含調節CD25結合之各種突變的經遮蔽之IL-2多肽構築體(AK216、AK218、AK219、AK220及AK223)。構築體在測試其活化STAT5之能力之前預先暴露於活化蛋白酶。圖15D提供各測試構築體以及rhIL-2對照之EC50資料。
圖16A-16C描繪來自使用構築體AK081、AK189、AK190及AK210以及抗RSV對照之如上所述之STAT5活化研究的結果。此包括如下經遮蔽之IL-2多肽構築體(AK189、AK190、AK210)，該等多肽構築體包括具有C125A突變之IL-2多肽且包括相同可裂解肽序列(RAAAVKSP；SEQ ID NO: 27)，但因蛋白酶裂解序列之N端上胺基酸殘基之差異而具有不同連接序列。如圖16A中所示之圖例亦適用於圖16B及16C。
圖17A-17C描繪來自使用構築體AK167、AK191、AK192及AK193以及抗RSV對照之如上所述之STAT5活化研究的結果。此包括如下經遮蔽之IL-2多肽構築體(AK189、AK190、AK210)，該等多肽構築體包括具有R38A、F42A、Y45A、E62A及C125A突變之IL-2多肽且包括相同可裂解肽序列(RAAAVKSP；SEQ ID NO: 27)，但因蛋白酶裂解序列之N端上胺基酸殘基之差異而具有不同連接序列。如圖17A中所示之圖例亦適用於圖17B及17C。
實例 3 ： 經遮蔽之 IL-2 多肽之活體內表徵 藥物動力學 使用小鼠模型在活體內評估實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體的藥物動力學。
將小鼠用構築體靜脈內、腹膜內或皮下處理且隨時間推移量測血漿中構築體之濃度。在一些實驗中，用對照處理一些小鼠以進行比較。在一些實驗中，一些小鼠用阿地介白素處理，作為經遮蔽之IL-2多肽處理之對照。在一些實驗中，所處理之小鼠具有腫瘤。在一些實驗中，所處理之小鼠無腫瘤。在一些實驗中，用構築體處理小鼠且在處理過程中的多個時間抽取血液，其可包括在開始處理之前抽取血液及加工血液以獲得血漿。在一些實驗中，在兩週、三週或四週或更多週處理過程內之多個時間點抽取血液。在一些實驗中，量測所投與構築體以及阿地介白素及/或其他對照物之平均血漿濃度。在PBS Tween中稀釋之後用IL-2及人類Fc特異性ELISA在血漿樣品中偵測經遮蔽之IL-2多肽構築體且使用針對各構築體產生之標準曲線定量。全長及裂解構築體之百分比藉由使用抗huFc-HRP及抗huIL-2-HRP之西方墨點法及藉由全質量及肽質譜分析來測定。
亦使用小鼠模型在活體內評估經遮蔽之IL-2多肽構築體在腫瘤中的藥物動力學。將具有腫瘤之小鼠用構築體靜脈內或皮下處理且評估小鼠腫瘤中構築體之濃度。在一些實驗中，用對照處理一些小鼠以進行比較。在一些實驗中，一些小鼠用阿地介白素處理，作為經遮蔽之IL-2多肽處理之對照。分析腫瘤之構築體之存在以及特定蛋白酶之存在。在一些實驗中，分析腫瘤之全長及裂解構築體之存在及百分比。
根據以下方法進行一些藥物動力學研究。C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，小鼠接受單次2 mg/kg靜脈內劑量之於PBS中所關注之構築體(例如未經遮蔽之親本IL-2多肽構築體、經遮蔽之IL-2多肽構築體或不可裂解之經遮蔽之IL-2多肽構築體)。測試構築體包括例如AK032、AK081、AK111、AK167、AK168、AK191、AK197、AK203、AK209及AK211。在給藥後5分鐘、第1天、第2天及第5天收集血漿。使用ELISA，利用抗人類IgG (純系M1310G05，Biolegend)作為捕捉抗體及多種偵測抗體，測定藥物含量。分別利用針對人類IgG (ab97225，Abcam)或CD122 (純系9A2，Ancell)及IL-2 (Poly5176，Biolegend)之HRP或生物素結合之偵測抗體偵測總及未裂解藥物含量。
圖18A-18D描述來自在負載腫瘤之小鼠中使用構築體AK032、AK081、AK111、AK167及AK168以及抗RSV對照如上所述進行的藥物動力學研究的結果。圖18A提供各測試構築體之結構的簡單描繪。如所指示，AK111及AK168為示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體。AK167及AK168構築體包括消除或減少與CD25之結合的突變(R38A、F42A、Y45A及E62A)。圖18A展示藉由偵測人類IgG之血漿中之Fc含量(µg/mL)，圖18C展示藉由偵測人類CD122之血漿中之Fc-CD122含量(µg/mL)，且圖18D展示藉由偵測人類IL-2之血漿中之Fc-IL2含量(µg/mL)。
圖19A-19D描述來自在負載腫瘤之小鼠中使用構築體AK167、AK191 AK197、AK203、AK209及AK211以及抗RSV對照如上所述進行的藥物動力學研究的結果。圖19A提供各測試構築體之結構的簡單描繪。如所指示，AK168、AK191、AK197、AK203及AK209為在將IL-2多肽連接於半衰期延長域之連接子中各自包括不同可裂解肽序列的示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體。圖19B展示藉由偵測人類IgG之血漿中之Fc含量(µg/mL)，圖19C展示藉由偵測人類IL-2之血漿中之Fc-IL2含量(µg/mL)，且圖19D展示藉由偵測人類CD122之血漿中之Fc-CD122含量(µg/mL)。如圖19B、19C及19D中所示，在所測試之經遮蔽之IL-2多肽構築體中，血漿中之Fc含量、Fc-IL2含量及Fc-CD122含量類似。
小鼠中之生物活性 使用小鼠模型，諸如C57BL/6小鼠在活體內評估實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體的活體內生物活性。將小鼠用構築體處理且評估活體內生物活性。在一些實驗中，用對照處理一些小鼠以進行比較。在一些實驗中，一些小鼠用阿地介白素處理，作為經遮蔽之IL-2多肽處理之對照。在一些實驗中，所處理之小鼠具有腫瘤。在一些實驗中，所處理之小鼠無腫瘤。在一些實驗中，在小鼠中評估免疫細胞之劑量依賴性擴增。在一些實驗中，將小鼠用各種劑量之構築體、阿地介白素或其他對照處理。在一些實驗中，將小鼠處理兩週之時程。在多個時間點自小鼠收集血液且接著使用針對所關注免疫細胞標記物之抗體染色。在一些實驗中，亦測定諸如CD8+ T細胞、NK細胞及Treg細胞之某些循環細胞類型之增殖及擴增的縱向動力學，以及CD8+ T細胞及NK細胞與CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞之比率。在一些實驗中，如藉由器官濕重及組織學所測定，諸如藉由評估如肺及肝臟之某些器官中的水腫及淋巴球浸潤來評估小鼠之血管滲漏。
在一些研究中，評估血管滲漏以便藉由進行以下方法評估由基於IL-2之療法介導之潛在毒性相關作用。使用C57BL/6雌性小鼠進行重複劑量毒性研究，該等小鼠係購自Charles River Laboratories且在開始研究時為8-10週齡，體重為18-22公克。一組5隻小鼠之組每天接受經遮蔽之及未經遮蔽之IL-2構築體在PBS中的每日腹膜內注射液，持續4或5天。測試構築體包括AK081、AK111、AK167及AK168。對照抗體亦作為對照投與。在最後一劑之後兩小時，所有小鼠均接受0.1 ml含1%伊凡氏藍(Evans blue) (Sigma，目錄號E2129)之PBS的靜脈內注射。在伊凡氏藍投與之後兩小時，將小鼠麻醉且灌注10 U/ml於PBS中之肝素。收穫脾臟、肺及肝臟，且在4℃下在3 ml 4% PFA中固定2天，然後在650 nm下用NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)量測上清液吸光度，作為伊凡氏藍之血管滲漏之指示物。將經固定之器官包埋於石蠟中，切片，且用蘇木精及伊紅染色。藉由NovoVita Histopath Laboratory, LLC. (Allston, MA)根據標準程序進行組織病理學研究及定量。圖25A-50D描繪來自使用示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體AK111及AK168以及未經遮蔽之IL-2多肽構築體AK081及AK167及抗RSV對照評估血管滲漏的如上所述之活體內研究的結果。圖25A展示體重減輕百分比(%)，且圖25B、25C及25D分別展示肝臟、肺及脾臟每一者之重量，以公克為單位。
亦針對AK081、AK111、AK167及AK168構築體以及抗RSV對照評估如藉由量測染料至組織中滲漏之程度所指示的血管滲漏，其中肝臟及肺之結果分別展示在圖26A及26B中。基於650 nm下之吸光度量測染料滲漏程度。
亦針對AK081、AK111、AK167及AK168構築體以及抗RSV對照評估如藉由量測單核細胞血管周侵入肝臟中之程度所指示的血管滲漏，其中肝臟及肺之結果分別展示在圖27A及27B中。各描繪肝臟中之單核細胞之平均數量(圖27A)及肺中之單核細胞之平均數量(圖27B)。如圖27B中所示，舉例而言，經遮蔽之IL-2多肽構築體AK111及AK168在肺中未產生可偵測數目之單核細胞，此不同於未經遮蔽之構築體AK081及AK167。
浸潤性免疫細胞表型 評估用實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體處理之小鼠模型中活體內免疫細胞浸潤性腫瘤的表型。將小鼠用構築體處理且評估腫瘤浸潤性免疫細胞之表型。在一些實驗中，用對照處理一些小鼠以進行比較。在一些實驗中，一些小鼠用阿地介白素處理，作為經遮蔽之IL-2多肽處理之對照。將負載腫瘤之小鼠用構築體、阿地介白素或另一對照處理，且在初始劑量之後的多個時間點，諸如在初始劑量之後五天、七天或十天收集腫瘤、組織(諸如肝臟、肺及脾臟)及血液。在一些實驗中，免疫細胞自腫瘤、組織及血液分離，且使用流式細胞量測術進行表型評估。在一些實驗中，使用所關注之標記物，諸如CD8+ T細胞、記憶CD8+ T細胞、活化NK細胞、CD4+ T細胞及CD4+ Treg細胞之標記物評估經分離之免疫細胞。
在一些研究中，使用以下方法評估活體內免疫細胞浸潤性腫瘤之表型。C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，小鼠接受單次2 mg/kg靜脈內劑量之於PBS中所關注之構築體(例如未經遮蔽之親本IL-2多肽構築體、經遮蔽之IL-2多肽構築體或不可裂解之經遮蔽之IL-2多肽構築體)。在第5天，藉由CO2窒息處死小鼠且收穫腫瘤、肝臟、脾臟及血液。藉由機械破碎且通過40 μm細胞過濾器自脾臟製備細胞懸浮液。使用Miltenyi腫瘤解離套組試劑(Miltenyi目錄號130-096-730)對腫瘤組織進行酶促消化，且gentleMACS解離劑(Miltenyi)用於機械解離步驟。使用ACK緩衝液(Gibco目錄號A10492)溶解脾臟及腫瘤細胞懸浮液及血液中之紅血球。將細胞懸浮液用以下抗體染色：CD45 (純系30-F11，eBioscience)、CD3 (純系2C11，Biolegend)、CD8 (純系53-6.7，BD Biosciences)、CD4 (純系RM-45，BD Biosciences)、FOXP3 (MF-14，Biolegend)、CD25 (3C7，Biolegend)、CD44 (純系IM7，eBioscience)及NKp46 (29A1.4，eBioscience)。在MACSQuant Analyzer流式細胞儀(Milenyi)上進行資料獲取，且使用FlowJo分析資料。
使用AK032、AK081、AK111、AK167及AK168構築體以及抗RSV IgG對照如上所述進行的測試脾臟、血液及腫瘤中CD4、CD8、NK及Treg百分比之活體內反應之研究的結果展示於圖20A-20L中。AK111及AK168為示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體。
使用AK167、AK168、AK191、AK197、AK203、AK209及AK211構築體以及抗RSV IgG對照如上所述進行的測試脾臟、血液及腫瘤中CD4、CD8、NK及Treg百分比之活體內反應之研究的結果展示於圖21A-21L中。AK168、AK191、AK197、AK203及AK209為在將IL-2多肽連接於半衰期延長域之連接子中各自包括不同可裂解肽序列的示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體。與不可裂解之AK211構築體相比，使用單向ANOVA進行統計分析。
使用AK235、AK191、AK192、AK193、AK210、AK189、AK190及AK211構築體如上所述進行的測試脾臟、血液及腫瘤中CD4、CD8、NK及Treg百分比之活體內反應之研究的結果展示於圖22A-22L中。AK191、AK192、AK193、AK210、AK189及AK190為在將IL-2多肽連接於半衰期延長域之連接子中各自包括可裂解肽序列的示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體。在此等構築體當中連接序列亦不同，視利用之連接序列而定。AK189、AK190及AK210包括具有C125A突變之IL-2多肽，且AK191、AK192及AK193包括具有C125A、R38A、F42A、Y45A及E62A突變之IL-2多肽。AK235構築體為未經遮蔽之構築體且AK211構築體包括不可裂解之連接序列。與不可裂解之AK211構築體相比，使用單向ANOVA進行統計分析。
使用AK235、AK191、AK192、AK193、AK210、AK189、AK190及AK211構築體如上所述進行的測試脾臟、血液及腫瘤中之活體內T細胞活化之研究的結果展示於圖23A-23I中。T細胞活化量測為脾臟、血液及腫瘤中CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或Foxp3+細胞之CD25之平均螢光強度(MFI)。與不可裂解之AK211構築體相比，使用單向ANOVA進行統計分析。
活體內裂解 評估經遮蔽之IL-2細胞激素構築體之活體內裂解。在一些研究中，投與對照抗體以進行比較。在一些研究中，藉由在小鼠中投與所關注構築體且在一定時段之後捕捉人類IgG且隨後量測例如人類IgG、CD122及IL-2之含量來評估活體內裂解。
在測試經遮蔽之IL-2多肽構築體之活體內裂解的一些研究中，使用ELISA，利用抗人類IgG (純系M1310G05，Biolegend)作為捕捉抗體及各種偵測抗體來測定藥物含量(亦即，所投與構築體之含量，包括裂解副產物)。分別利用針對人類IgG (ab97225，Abcam)或CD122 (純系9A2，Ancell)及IL-2 (Poly5176，Biolegend)之HRP或生物素結合之偵測抗體偵測總及未裂解藥物含量。藉由自總藥物濃度減去未裂解(亦即，完整)計算出裂解及釋放之IL-2之濃度。圖24A-24D展示來自測試示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體AK168 (可裂解肽序列：MPYDLYHP；SEQ ID NO: 24)及AK209 (可裂解肽序列：VPLSLY；SEQ ID NO: 28)之活體內裂解的研究的結果。AK167構築體為可裂解之未經遮蔽之IL-2多肽構築體，其包括與經遮蔽之AK168構築體相同的IL2多肽。如圖24A-24D中所示，經遮蔽之(AK168及AK209)及未經遮蔽之(AK167)構築體有效地裂解，且兩種可裂解肽序列均裂解。圖24E描繪來自針對AK167、AK168及AK209構築體之總含量及針對各構築體之未裂解形式之含量的總血漿IgG濃度(µg/mL)的藥物動力學研究的結果。
腫瘤根除及癌轉移之抑制 使用小鼠模型，諸如同基因型MC38、CT26及B16F10腫瘤模型，在活體內評估實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體促進腫瘤根除及抑制癌轉移的能力。
小鼠皮下植入腫瘤細胞，且使腫瘤生長至可觸尺寸。將負載腫瘤之小鼠用經遮蔽之IL-2構築體或經遮蔽之IL-15多肽構築體處理且在治療過程期間量測腫瘤體積。在一些實驗中，用對照處理一些小鼠以進行比較。在一些實驗中，一些小鼠用阿地介白素處理，作為經遮蔽之IL-2多肽處理之對照。在治療過程中週期性量測腫瘤體積。在一些實驗中，亦在治療過程期間週期性量測體重。在一些實驗中，在治療過程期間產生血漿樣品且分析藥物動力學、藥效學、裂解及血液標記物，諸如CD8+ T細胞、記憶CD8+ T細胞、活化NK細胞、CD4+ T細胞及CD4+ Treg細胞之血液標記物。
亦使用適合於癌轉移研究之小鼠模型，諸如用於評估肺癌轉移之同基因型CT26腫瘤模型，在活體內評估經遮蔽之IL-2多肽構築體抑制癌轉移的能力。小鼠皮下植入腫瘤細胞。在一些實驗中，使腫瘤在處理之前生長至可觸尺寸。在一些實驗中，治療在腫瘤生長至可觸尺寸之前開始。將負載腫瘤之小鼠用經遮蔽之IL-2構築體處理，評估腫瘤細胞至諸如肺、肝臟及淋巴結之組織中的癌轉移。
在一些研究中，根據以下方法使用同基因型腫瘤模型評估經遮蔽之IL-2多肽構築體減少腫瘤體積之能力。C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約125 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受2 mg/kg劑量之於PBS中之AK081、AK111、AK167或AK168或作為對照之抗RSV抗體。小鼠腹膜內給藥，一週三次，供6劑。使用帶表卡尺計算腫瘤體積(長度×(寬度^2)/2)且每週記錄體重兩次。圖28A及28B展示來自評估治療過程期間腫瘤體積及體重之同基因型腫瘤模型研究的結果。如圖28A中所示，使用示例性IL-2多肽構築體，包括經遮蔽之構築體AK111及AK168的處理與抗RSV對照相比隨時間推移引起腫瘤生長抑制。如圖28B中所示，當小鼠用經遮蔽之構築體AK111及AK168處理時，觀測到普遍缺乏體重降低。
食蟹獼猴中之生物活性 在食蟹獼猴中在活體內評估實例1中產生之經遮蔽之IL-2多肽構築體的活體內生物活性。將食蟹獼猴用構築體處理且評估活體內生物活性、藥物動力學及裂解。在一些實驗中，用對照處理一些猴以進行比較。在一些實驗中，一些猴用阿地介白素處理，作為經遮蔽之IL-2多肽處理之對照。在一些實驗中，將猴用各種劑量之構築體、阿地介白素或其他對照處理。在多個時間點自猴收集血液且接著評估某些細胞類型，諸如CD8+ T細胞、記憶CD8+ T細胞、活化NK細胞、CD4+ T細胞及CD4+ Treg細胞及/或所關注標記物，諸如總淋巴球、Ki67+及可溶性CD25之劑量反應。在一些實驗中，評估某些循環T細胞及NK細胞類型之增殖及擴增的縱向動力學。在一些實驗中，經遮蔽之IL-2多肽構築體之藥物動力學及裂解藉由ELISA、PAGE及質譜分析來測定。
為測試示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體在非人類靈長類動物中之安全概況，根據以下方法進行劑量範圍研究。將一組3個健康雄性食蟹獼猴(長尾獼猴(Macaca fascicularis))之組隨機分配以接受單次靜脈內推注劑量的2 mL/kg於100 mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 5.5)中10、30及100 nmol/kg的可活化(亦即可裂解)經遮蔽之IL-2多肽蛋白或不可裂解之經遮蔽之IL-2多肽蛋白。第三組接受3、10及30 nmol/kg親本未經遮蔽之可裂解蛋白，作為陽性對照。此第三組在較低範圍下給藥以考慮親本未經遮蔽之分子的較高效力。以莫耳計算劑量以考慮分子量差異。在給藥前及給藥後1、24、48、72、96、168、264及336小時採集血液樣品。自動化血液學分析器用於監測淋巴球子集及血清化學之變化。使用如上所述之常規ELISA自血漿量測總及完整(亦即，未裂解)藥物含量。可溶性CD25含量用ELISA (R&D systems，目錄號DR2A00)量測以監測免疫刺激。使用常規多路電化學發光分析(Meso Scale Discovery)定量發炎性細胞激素之血漿含量。監測作為血管滲漏症候群之指示物的血壓。使用捕捉IL-2及偵測人類Fc之ELISA及藉由捕捉人類Fc及偵測人類Fc之ELISA分析PK。
實例 4 ： C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，小鼠接受腹膜內給與單次高劑量之於PBS中之多種Fc-IL-2構築體。在給藥後5分鐘、第3天、第5天及第7天收集血漿。
所用構築體為：
AK443 (VPLSLY) IL-2死亡   
Figure 02_image021
AK211      
Figure 02_image023
AK235 (VPLSLY   
Figure 02_image025
AK209 (VPLSLY)   
Figure 02_image027
AK471 (VPLSLY) FcRn突變體
Figure 02_image029
使用基於FACS之方法進行免疫表型分型。在第5天，藉由CO2窒息處死小鼠且收穫腫瘤、肝臟、脾臟及血液。藉由機械破碎且通過40 μm細胞過濾器自脾臟製備細胞懸浮液。使用Miltenyi腫瘤解離套組試劑(Miltenyi目錄號130-096-730)對腫瘤組織進行酶促消化，且gentleMACS解離劑(Miltenyi)用於機械解離步驟。使用ACK緩衝液(Gibco目錄號A10492)溶解脾臟及腫瘤細胞懸浮液及血液中之紅血球。
將細胞懸浮液用以下抗體染色：CD45 (純系30-F11，eBioscience)、CD3 (純系2C11，Biolegend)、CD8 (純系53-6.7，BD Biosciences)、CD4 (純系RM-45，BD Biosciences)。在MACSQuant Analyzer流式細胞儀(Milenyi)上進行資料獲取，且使用FlowJo分析資料。
使用ELISA，利用抗人類IgG (純系M1310G05，Biolegend)作為捕捉抗體及多種偵測抗體，測定藥物含量。分別利用針對人類IgG (ab97225，Abcam)或CD122 (純系9A2，Ancell)及IL-2 (Poly5176，Biolegend)之HRP或生物素結合之偵測抗體偵測總及未裂解藥物含量。
如圖29A及29B中所示，具有I253A FcRn突變之AK471誘導TME中穩固之CD8 T細胞擴增，同時保持在周邊中非活性。
如圖30 A、B及C中所示，與aglyco-hIgG1相比，AK471具有略微更短之半衰期。
血漿中AK471無裂解或斷頭證據(圖31 A、B及C)。
實例 5 CD122 上 Cys 至 Ser 突變之概述 使CD122遮蔽域上之兩個游離半胱胺酸突變成絲胺酸以增加蛋白質穩定性且減少可發展性風險，理論上包括不限於聚集、氧化及免疫原性。在加速穩定性研究中評估突變體，其中在高溫(40℃)及多個pH值下將對照及Cys至Ser突變體培育長時間(3週)。進行多種分析以評估半胱胺酸突變之影響。結果表明如在應力下聚集顯著減少所證明，Cys至Ser突變體明顯地增強蛋白質穩定性。在pH 8.0下培育3週之後，與如藉由SEC-HPLC所量測，聚集百分比超過五十(50)百分比之不含半胱胺酸突變之對照構築體相比，半胱胺酸突變之構築體展現低聚集程度。CE-SDS顯示，對於pH 6.0及pH 8.0培育，具有突變半胱胺酸之構築體保持未聚集(＞99%)，其中對照構築體含有高達十五(15)百分比之聚集程度。
另外，在CD122遮蔽蛋白中具有突變半胱胺酸之構築體與IL-2蛋白以與含有野生型CD122遮蔽蛋白(亦即，不具有半胱胺酸殘基之突變)的對照構築體類似之方式相互作用。另外，在CD122遮蔽蛋白中具有突變半胱胺酸之構築體在功能分析與藥效學研究中與含有不具有半胱胺酸突變之CD122遮蔽蛋白的對照構築體類似。
實驗方案 穩定性研究 將樣品在設定成40℃之Galaxy 170 S空氣培育箱中培育。測試三種緩衝液系統：20 mM檸檬酸鹽pH 5.0、20 mM組胺酸pH 6.0及20 mM tris pH 8.0。各pH值在室溫下(大約27℃)校準且緩衝液用HCl/NaOH調節至0.05 pH單位內。藉由0.22 μm瓶頂式過濾器過濾緩衝液。經由旋轉濃縮，以大約3000倍將樣品經緩衝液更換成起始緩衝液。在第0天、第1天、第3天、第7天、第14天及第21天在無菌條件下移除樣品等分試樣，且儲存在-80℃下，隨後在以下分析測試中評估。
SEC-HPLC 使用HPLC系統評估培育樣品中之聚集程度；用分子量標準物校準系統。在各樣品中量測高分子量物種(「HMWS」)之含量。HMWS增加指示聚集程度增加。
此等研究結果展示於圖32A及32B中。圖例表示『AK』分子編號，其中AK341為Cys至Ser突變體且AK209為對照。
CE-SDS CE-SDS在labchip機上進行。一般而言，還原劑用於還原條件下之實驗。使樣品經受高熱，隨後將樣品裝載於96孔PCR盤中。重組人類IL-2用作低分子量蛋白質對照。在各樣品中量測HMWS之含量。HMWS增加指示聚集程度增加。
此等研究結果展示於圖33A-33D中。圖例表示『AK』分子編號，其中AK341為Cys至Ser突變體且AK209為對照。
實例 6 所用構築體如下：
AK# 蛋白酶受質 蛋白酶位點 半衰期延長
AK209 VPLSLY IL-2 agly-hlgG1
AK341* VPLSLY IL-2 agly-hlgG1
AK438 VPLSLY CD122 agly-hlgG1
AK471 VPLSLY IL-2 FcRn I253A
AK508 VPLSLY CD122 FcRn I253A
AK504 VPLSLY IL-2 hlgG4
AK511 VPLSLY CD122 hlgG4
AK203 DSGGFMLT IL-2 agly-hlgG1
AK442 DSGGFMLT CD122 agly-hlgG1
AK168 MPYDLYHP IL-2 agly-hlgG1
AK252 MPYDLYHP CD122 agly-hlgG1
AK509 MPYDLYHP IL-2 FcRn I253A
AK510 MPYDLYHP CD122 FcRn I253A
AK191 RAAAVKSP IL-2 agly-hlgG1
AK503 RAAAVKSP CD122 agly-hlgG1
AK211 - 不可裂解
AK253- 親本 ( 無遮蔽 ) ； 無裂解位點 ； 始終活性
AK341*在CD122上含有兩個cys à ser突變
i. 抗腫瘤活性 -AK438 及 AK442 C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受含在PBS中之Fc-IL-2構築體。在第0天、第3天及第6天靜脈內向小鼠給藥。使用帶表卡尺計算腫瘤體積(長度×(寬度^2)/2)且每週記錄體重兩次。在達到腫瘤負荷之人道終點(2000 mm3 )或體重因毒性而減輕(20%)時處死小鼠。
結果展示在圖34A及B中。
ii. 周邊 ( 脾臟 ) 對比腫瘤 CD8 T 細胞擴增 -AK438 及 AK442 C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受含在PBS中之極低劑量水準之AK253及高劑量水準之所有其他Fc-IL-2構築體。在第0天、第3天及第6天靜脈內向小鼠給藥。
在第7天使用基於FACS之方法自周邊血液進行免疫表型分型。使用ACK緩衝液(Gibco目錄號A10492)溶解紅血球。將細胞懸浮液用以下抗體染色：CD45 (純系30-F11，eBioscience)、CD3 (純系2C11，Biolegend)、CD8 (純系53-6.7，BD Biosciences)、CD4 (純系RM-45，BD Biosciences)及Ki-67 (純系SOLA15，eBioscience)。在MACSQuant Analyzer流式細胞儀(Milenyi)上進行資料獲取，且使用FlowJo分析資料。進行單向ANOVA及邦費羅尼事後檢驗(Bonferonni's post-test)以測定處理組與對照AK211之統計顯著性(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001)。
結果展示在圖35A及B中。
iii. 抗腫瘤活性 -AK252 、 AK438 、 AK209 及 AK471 C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受含在PBS中之極低劑量水準之AK253及高劑量水準之所有其他Fc-IL-2構築體。在第0天、第3天及第6天靜脈內向小鼠給藥。使用帶表卡尺計算腫瘤體積(長度×(寬度^2)/2)且每週記錄體重兩次。在達到腫瘤負荷之人道終點(2000 mm3 )或體重因毒性而減輕(20%)時處死小鼠。
結果展示在圖36A及36B中。
iv. 周邊(脾臟)對比腫瘤CD8 T細胞擴增-AK252、AK438、AK209、AK471 C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受含在PBS中之極低劑量水準之AK253及高劑量水準之所有其他Fc-IL-2構築體。在第0天、第3天及第6天靜脈內向小鼠給藥。
在第7天使用基於FACS之方法自周邊血液進行免疫表型分型。使用ACK緩衝液(Gibco目錄號A10492)溶解紅血球。將細胞懸浮液用以下抗體染色：CD45 (純系30-F11，eBioscience)、CD3 (純系2C11，Biolegend)、CD8 (純系53-6.7，BD Biosciences)、CD4 (純系RM-45，BD Biosciences)及Ki-67 (純系SOLA15，eBioscience)。在MACSQuant Analyzer流式細胞儀(Milenyi)上進行資料獲取，且使用FlowJo分析資料。進行單向ANOVA及邦費羅尼事後檢驗以測定處理組與對照AK211之統計顯著性(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001)。
結果展示在圖37A及37B中。
v. 抗腫瘤活性 -AK252 、 AK442 、 AK203 、 AK508 及 AK510 C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受含在PBS中之極低劑量水準之AK253及高劑量水準之所有其他Fc-IL-2構築體。在第0天、第3天及第6天經靜脈內向小鼠給藥。使用帶表卡尺計算腫瘤體積(長度×(寬度^2)/2)且每週記錄體重兩次。在達到腫瘤負荷之人道終點(2000 mm3 )或體重因毒性而減輕(20%)時處死小鼠。
結果展示在圖38A及38B中。
vi. 周邊 ( 脾臟 ) 對比腫瘤 CD8 T 細胞擴增 -AK252 、 AK442 、 AK203 、 AK508 及 AK510 C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受PBS中之極低劑量水準之AK253及高劑量水準之所有其他Fc-IL-2構築體。在第0天、第3天及第6天靜脈內向小鼠給藥。
在第7天使用基於FACS之方法自周邊血液進行免疫表型分型。使用ACK緩衝液(Gibco目錄號A10492)溶解紅血球。將細胞懸浮液用以下抗體染色：CD45 (純系30-F11，eBioscience)、CD3 (純系2C11，Biolegend)、CD8 (純系53-6.7，BD Biosciences)、CD4 (純系RM-45，BD Biosciences)及Ki-67 (純系SOLA15，eBioscience)。在MACSQuant Analyzer流式細胞儀(Milenyi)上進行資料獲取，且使用FlowJo分析資料。進行單向ANOVA及邦費羅尼事後檢驗以測定處理組與對照AK211之統計顯著性(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001)。
結果展示在圖39A及39B中。
vii. 抗腫瘤活性 -AK252 、 AK508 、 AK509 、 AK510 、 AK511 C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受PBS中之極低劑量水準之AK253及高劑量水準之所有其他Fc-IL-2構築體。在第0天、第3天及第6天靜脈內向小鼠給藥。使用帶表卡尺計算腫瘤體積(長度×(寬度^2)/2)且每週記錄體重兩次。在達到腫瘤負荷之人道終點(2000 mm3 )或體重因毒性而減輕(20%)時處死小鼠。
結果展示在圖40A-40D中。
viii. 周邊 ( 脾臟 ) 對比腫瘤 CD8 T 細胞擴增 -AK252 、 AK508 、 AK509 、 AK510 、 AK511 C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受含在PBS中之極低劑量水準之AK253及高劑量水準之所有其他Fc-IL-2構築體。在第0天、第3天及第6天經靜脈內向小鼠給藥。
在第7天使用基於FACS之方法自周邊血液進行免疫表型分型。使用ACK緩衝液(Gibco目錄號A10492)溶解紅血球。將細胞懸浮液用以下抗體染色：CD45 (純系30-F11，eBioscience)、CD3 (純系2C11，Biolegend)、CD8 (純系53-6.7，BD Biosciences)、CD4 (純系RM-45，BD Biosciences)及Ki-67 (純系SOLA15，eBioscience)。在MACSQuant Analyzer流式細胞儀(Milenyi)上進行資料獲取，且使用FlowJo分析資料。進行單向ANOVA及邦費羅尼事後檢驗以測定處理組與對照AK211之統計顯著性(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001)。
AK252++係內部產生之批次號AK252-06B，AK252係由ATUM批次號AK252-A-01A產生。
結果展示在圖41A及41B中。
ix. 抗腫瘤活性 -AK252 、 AK438 、 AK442 、 AK209 、 AK341 C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受含在PBS中之極低劑量水準之AK253及高劑量水準之所有其他Fc-IL-2構築體。在第0天、第3天及第6天靜脈內向小鼠給藥。使用帶表卡尺計算腫瘤體積(長度×(寬度^2)/2)且每週記錄體重兩次。在達到腫瘤負荷之人道終點(2000 mm3 )或體重因毒性而減輕(20%)時處死小鼠。
結果展示在圖42A及42B中。
x. 脾腫大及肺水腫 -AK252 、 AK438 、 AK442 、 AK209 、 AK341 C57BL/6雌性小鼠係購自Charles River Laboratories且在研究開始時為8-10週齡。將MC38腫瘤細胞(每隻小鼠5×105 個細胞)皮下注射至各小鼠之右側腹。在達到約100 mm3 尺寸腫瘤(第0天)後，將小鼠隨機分組以接受含在PBS中之極低劑量水準之AK253及高劑量水準之所有其他Fc-IL-2構築體。在第0天、第3天及第6天靜脈內向小鼠給藥。在第6天收集組織且稱重。
結果展示在圖43A及43B中。
實例 7 i.   NAT 對比 RCC 培養上清液對肽之裂解 將包含裂解肽之序列(在下文以粗體展示)在『NAT』 (正常相鄰組織)或『RCC』 (腎細胞癌)培養物上清液中培育，以測試各肽裂解之特異性。
為此，使用稱為藉由質譜分析之多路受質概況分析(MSP-MS)之公開技術，藉由質譜分析進行之肽定序用於鑑別下表中所示之合成肽所產生的裂解片段(O'Donoghue A.J.等人 Nat Methods. 2012年11月;9(11):1095-100.)。隨時間推移監測此等反應中之裂解，且發現最早時間點裂解之肽視為對條件培養基樣品中之蛋白水解活性最敏感。
結果如下：
受質 AMSP-MS合成肽序列(加粗序列展示可裂解肽；*指示裂解位點) NAT RCC 最早裂解時間點- NAT 最早裂解時間點- RCC
AK-15 RSGVPLS*LYSG SGGGK 0 3/5    15分鐘
AK-18 RSGMP *YDLY*HP SGK 5/5 5/5 15分鐘 15分鐘
AK-21 RGPDSGGF*ML*T SGK 3/5 5/5 15分鐘 15分鐘
AK-28 RGSGHEQLTV SGGSK 0 0      
AK-49 RSGR*AAAVKSP SGK 0 3/5    15-60-240分鐘
AK-02 RGSGISSGLLSGRS*D*N*H SGK 5/5 5/5 15-60分鐘 15-60分鐘
AK-50 RGDLLAVVA*AS GGK 0 5/5    15-60分鐘
AK-88 RGGISSGLL*SG*RS GK 0 5/5    15-60分鐘
發現裂解肽DLLAVVA*AS及ISSGLL*SG*RS係最具有特異性的。包含此等肽之序列在NAT培養物中不裂解，但在RCC培養中之每一操作中裂解。
實例 8 在此實例中使用以下構築體：
Figure 02_image031
關於各AK分子之域特徵及序列的細節如下：
AK904 第一多肽鏈： Fc(臼) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DNA158
第二多肽鏈：    Fc(杵)-IL15 V1不可裂解(N71Q、N79Q) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPGGGSSGGGSG PSGSPGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLY TESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASI HDTVENLIILAQNSLSSNGQVTESGCKECEEL EEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS AK904
AK910 第一多肽鏈：    Fc(臼) CD122(C122S、C168S) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGPGSGSAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQ DGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASW ACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMA IQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRSNISWEISQAS HYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWIS LETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAF RTKPAALGKD DNA440
第二多肽鏈：    Fc(杵)-IL15 V1不可裂解(N71Q、N79Q) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPGGGSSGGGSG PSGSPGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLY TESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASI HDTVENLIILAQNSLSSNGQVTESGCKECEEL EEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS DNA904
AK932 第一多肽鏈：    Fc(臼) CD122(C122S、C168S) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGPGSGSAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQ DGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASW ACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMA IQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRSNISWEISQAS HYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWIS LETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAF RTKPAALGKD DNA440
第二多肽鏈：    Fc(杵)-[DLLAVVAAS]-IL15 (N71Q、N79Q)    *可裂解肽呈粗體 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGSGSDLLAVVAAS SGPGSGNWVNVISDLKKIE DLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISL ESGDASIHDTVENLIILAQNSLSSNGQVTESGCKECEE LEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS DNA924
AK938 第一多肽鏈：    Fc(臼)-[DLLAVVAAS]-CD122    *可裂解肽呈粗體 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS RDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGSPSGD LLAVVAAS SGPGSGSPAVNGTSQFTCFYNSRANISC VWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPV SQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGV RWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRSN ISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTL KQKQEWISLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTT WSPWSQPLAFRTKPAALGKD DNA822
第二多肽鏈：    Fc(杵)-IL15 V1不可裂解(N71Q、N79Q) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPGGGSSGGGSG PSGSPGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLY TESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASI HDTVENLIILAQNSLSSNGQVTESGCKECEEL EEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS DNA904
AK930 第一多肽鏈： Fc(臼) CD122(C122S、C168S)       DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGPGSGSAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQ DGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASW ACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMA IQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRSNISWEISQAS HYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWIS LETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAF RTKPAALGKD DNA440
第二多肽鏈：    Fc(杵)-[ISSGLLSGRS]-IL15 (N71Q、N79Q)    *可裂解肽呈粗體 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSGGS PISSGLLSGRS SGPGSGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMH IDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDA SIHDTVENLIILAQNSLSSNGQVTESGCKECEELE EKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS DNA922
AK936 第一多肽鏈：    Fc(臼)-[ISSGLLSGRS]-CD122 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGGPPSGSSPISSGLLSGRS SGGGAV NGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAW PDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLT TVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMA PISLQVVHVETHRSNISWEISQASHYFERHLEFEAR TLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWISLETLTPDTQYE FQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD DNA823
第二多肽鏈：    Fc(杵)-IL15 V1不可裂解(N71Q、N79Q) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPGGGSSGGGSG PSGSPGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLY TESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASI HDTVENLIILAQNSLSSNGQVTESGCKECEEL EEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS DNA904
重要的是，AK932及AK930及其『翻轉』對應物AK938及AK936包括肽受質(其序列描繪於各分子上方之框中且在序列表中加粗)。AK904為不可裂解之未遮蔽之構築體，且AK910為不可裂解之經遮蔽之構築體，皆充當陰性對照。
以上AK分子包括IL-15域，然而，應瞭解，然而，此資料之結果及結論對於IL-2構築體而言同等相關。
包括肽受質之經遮蔽之構築體實現裂解。
將構築體與MMP7、9及10一起培育。各構築體之裂解藉由SDS-PAGE分析且藉由HEK-Blue IL-2生物分析證實。
如下進行HEK-Blue分析：條件 ：細胞盤：96孔盤。細胞密度：50K細胞/孔。測試HEK Blue偵測之時間點：1小時。構築體數目：測試總共14種構築體。分析流程圖：
Figure 02_image033
結果展示於下表中，其中『X』指示不完全裂解且『√』指示裂解：
ID MMP 裂解
AK904 7 X
9 X
10 X
AK910 7 X
9 X
10 X
AK932 7 √
9 -
10 -
AK938 7 √
9 -
10 -
AK930 7 (36小時) √
9 -
10 -
AK936 7 √
9 -
10 -
下表中展示來自HEK-Blue IL-2生物分析之特定EC50 讀取結果。
ID MMP EC50 (pM) Max
AK904 (1:1:2) - 14.78 1.44
7 17.08 1.37
9 16.00 1.43
10 22.93 1.45
AK910 (1:1:2) - 1219.34 1.31
7 284.17 1.42
9 519.09 1.40
10 490.52 1.40
AK932 (1:1:2) - 2403.11 1.22
7 9.30 1.43
9 - -
10 - -
AK938 (1:1:2) - 885.13 1.31
7 18.03 1.38
9 - -
10 - -
AK930  (1:1:2) - 1858.76 1.22
7 8.00 1.41
9 - -
10 - -
AK936 (1:1:2) - 785.85 1.37
7 16.11 1.40
9 - -
10 - -
SDS-PAGE凝膠結果展示於圖44A-D中。HEK-Blue IL-2生物分析結果展示於圖45A-F中。
本發明之結果不意欲限制在具體揭示之實施例的範疇中，該等實施例被提供用於例如說明本發明之各種態樣。對所描述之組合物及方法的各種修改將由本文中之描述及教示而變得顯而易見。此類變化形式可在不背離本發明之真正範疇及精神的情況下加以實踐且意欲屬於本發明之範疇內。
12. 序列
描述 新 SEQ ID NO. 示例性 AK 編號 胺基酸序列
IL-2前驅體 1    MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGIN NYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHL RPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL-2成熟 2    APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKK ATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL-2 (R38A、F42A、Y45A、E62A、C125A) 3 AK168 AK209 AK191 AK197 AK203 AK471 AK442 AK438 AK341 AK530 AK539 AK540 AK541 AK523 AK524 AK525 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKK ATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
  
MM 4 AK168 AK209 AK191 AK197 AK203 AK471 AK442 AK438 AK539 AK540 AK541 AK523 AK524 AK525 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQT CELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQ DFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLS PGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSP WSQPLAFRTKPAALGKD
MM (C122S、C168S) 5 AK341 AK530 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQT CELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQ DFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRSNISWEISQASHYFERHLEFEARTLS PGHTWEEAPLLTLKQKQEWISLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSP WSQPLAFRTKPAALGKD
  
親本IgG1_人類重鏈恆定γ1 6    ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
親本IgG1_人類重鏈恆定γ1 – Fc域 7    DKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
HL1 (Y349C、T366S、L38A、Y407V) 8    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
HL1 (Y349C、T366S、L38A、Y407V、N297A) 9 AK168 AK209 AK191 AK197 AK203 AK442 AK438 AK341 AK530 AK539 AK540 AK541 AK523 AK524 AK525 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
HL1 (Y349C、T366S、L38A、Y407V、N297A、I253A) 10 AK471    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
HL2 (S354C、T366W) 11    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HL2 (S354C、T366W、N297A) 12 AK168 AK209 AK191 AK197 AK203 AK442 AK438 AK341 AK530 AK539 AK540 AK541 AK523 AK524 AK525 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
HL2 (S354C、T366W、N297A、I253A) 13 AK471    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
  
第一連接子L1 (不可裂解)    14 AK168 AK209 AK191 AK197 AK203 AK471 AK341 AK539 AK540 AK541 PGSGS
第一連接子L1 (可裂解) 15 AK442    GPPSGSSPGDSGGFMLTSGGG
第一連接子L1 (可裂解) 16 AK438 GPPSGSSPGVPLSLYGSGGG
第一連接子L1 (可裂解) 17 AK530 GPPSGSSPMPYDLYHPSGGG
第一連接子L1 (可裂解) 112 AK523 GSPDLLAVVAASSGP
第一連接子L1 (可裂解) 113 AK524 GSPGDLLAVVAASSGP
第一連接子L1 (可裂解) 114 AK525 GSGSPSDLLAVVAASSGP
  
第二連接子L2 (可裂解) 18 AK168 GGSSPPMPYDLYHPSGP
第二連接子L2 (可裂解) 19 AK209 AK471 AK341 GSPGVPLSLYSGP
第二連接子L2 (可裂解) 20 AK191 GGSGRAAAVKSPSGP
第二連接子L2 (可裂解) 21 AK197 GGSGHEQLTVSGP
第二連接子L2 (可裂解) 22 AK203 GSGPDSGGFMLTSGP
第二連接子L2 (不可裂解) 23 AK442 AK438 AK530 AK523 AK524 AK525 GGSSPPGGGSSGGGSGP
第二連接子L2 (可裂解) 115 AK539 GGPSDLLAVVAASSGP
第二連接子L2 (可裂解) 116 AK540 GSGPSDLLAVVAASSGP
第二連接子L2 (可裂解) 117 AK541 GSSGGPDLLAVVAASSGP
  
可裂解肽 24 AK168 AK530 MPYD*LYHP    *指示裂解位點
可裂解肽 25 AK203 AK442    DSGG*FMLT    *指示裂解位點
可裂解肽  26 AK197 HEQ*LTV *指示裂解位點
可裂解肽 27 AK191 RAAA*VKSP *指示裂解位點
可裂解肽 28 AK209 AK471 AK341 AK438 VPLS*LY *指示裂解位點
可裂解肽 118 AK50 AK539 AK540 AK541 AK523 AK524 AK525 DLLA*VVAAS    *指示裂解位點
可裂解肽 119 AK88 ISSGLL*SG*RS    *指示裂解位點
  
C端間隔子域 29 AK168 AK209 AK191 AK197 AK203 AK471 AK348 AK539 AK540 AK541 AK523 AK524 AK525 SGP
C端間隔子域 30 AK442 AK530 SGGG
C端間隔子域 31 AK438 GSGGG
  
N端間隔子域 32 AK168 GGSSPP
N端間隔子域 33 AK203 GSGP
N端間隔子域 34 AK209 AK341 AK471 AK524 GSPG
N端間隔子域 35 AK191 AK197 GGSG
N端間隔子域 36 AK442 AK348 GPPSGSSPG
N端間隔子域 37 AK530 GPPSGSSP
N端間隔子域 120 AK539 GGPS
N端間隔子域 121 AK540 GSGPS
N端間隔子域 122 AK541 GSSGGP
N端間隔子域 123 AK523 GSP
N端間隔子域 124 AK525 GSGSPS
  
第一多肽鏈 - A (HL1-L1-MM) 38 AK168 AK191 AK197 AK203  AK209 AK539 AK540 AK541    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLV SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGPGSGSA VNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWN QTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWR VMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHL EFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKP LQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
第一多肽鏈 - B (HL1-L1-MM) 39 AK341    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGPGSGSAVNGTSQFTCFYNSRAN ISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAP DSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVE THRSNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWISLETL TPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
第一多肽鏈 - C (HL1-L1-MM) 40 AK530 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGPPSGSSPMPYD LYHPSGGGAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWP DRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREG VRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRSNISWEISQASHYFER HLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWISLETLTPDTQYEFQVRVKPL QGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
第一多肽鏈 - D (HL1-L1-MM) 41 AK442 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGGPPSGSSPGDSGGFMLTSGGGAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQD GALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIV TLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQAS HYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKP LQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
第一多肽鏈 - E (HL1-L1-MM) 42 AK438 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGGPPSGSSPGVPLSLYGSGGGAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSC QVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGV RWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEART LSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPL AFRTKPAALGKD
第一多肽鏈 - G (HL-L2-C) 43 AK471 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGPGSGSAVNGTSQFTCFYNSRA NISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILG APDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVH VETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWIC LETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
第一多肽鏈 – H (HL-L2-C) 44 AK252 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGPPSGSSPMPYDLYHPSGGGAVNGTSQF TCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASW ACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLM APISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEA PLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
第一多肽鏈 – I (HL-L1-MM) 125 AK523 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGGSPDLLAVVAASSGPAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSC QVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREG VRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFE ARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPW SQPLAFRTKPAALGKD
第一多肽鏈 – J (HL-L1-MM) 126 AK524 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGS PGDLLAVVAASSGPAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRR RWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKP FENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLT LKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
第一多肽鏈 – K (HL-L1-MM) 127 AK525 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGSPSDLLAV VAASSGPAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELL PVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISL QVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLE TLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
  
第二多肽鏈 - A (HL-L2-C) 45 AK168 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRD ELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGSSPPMPYDLYHPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN YKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQ SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW ITFAQSIISTLT
第二多肽鏈 - B (HL-L2-C) 46 AK191 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDE LTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG SGRAAAVKSPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN PKLTAMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNF HLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQ SIISTLT
第二多肽鏈 - C (HL-L2-C) 47 AK197 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDE LTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGG GSGHEQLTVSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNP KLTAMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFH LRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQS IISTLT
第二多肽鏈 - D (HL-L2-C) 48 AK203 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGGSGPDSGGFMLTSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLD LQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEAL KPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYAD ETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
第二多肽鏈 - E (HL-L2-C) 49 AK209 AK341 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC RDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGGSPGVPLSLYSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN YKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLA QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN RWITFAQSIISTLT
第二多肽鏈 - F (HL-L2-C) 50 AK471 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSPGVPLSLYSGP APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKK ATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
第二多肽鏈 - G (HL-L2-C) 51 AK442 AK438 AK530 AK252 AK523 AK524 AK525 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGGGSSPPGGGSSGGGSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAM LTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKG SETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
第二多肽鏈 - H (HL-L2-C) 128 AK539 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGGGPSDLLAVVAASSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTA MLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVL ELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
第二多肽鏈 - H (HL-L2-C) 129 AK540 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSG PSDLLAVVAASSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAK FAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELK GSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
第二多肽鏈 - H (HL-L2-C) 130 AK541 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GSSGGPDLLAVVAASSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTA KFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETT FMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
  
裂解產物 CP 52 AK168 LYHPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTA MLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLR PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQ SIISTLT
裂解產物 CP 53 AK191 VKSPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLT AMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFH LRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFA QSIISTLT
裂解產物 CP 54 AK197 LTVSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTA MLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLR PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQ SIISTLT
裂解產物 CP 55 AK203 FMLTSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLT AMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFH LRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF AQSIISTLT
裂解產物 CP    56 AK209 AK341 AK471 LYSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAM LTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLR PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFA QSIISTLT
裂解產物 CP 131 132 AK442    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPGGGSS GGGSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELK HLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIV EFLNRWITFAQSIISTLT；(第二多肽鏈 – SEQ ID NO: 131)    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGGPPSGSSPGDSGG (第一多肽鏈 – SEQ ID NO: 132)
裂解產物 CP 133 134 AK438 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPGGGSSGGGSGPAPT SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEE VLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT；(第二多肽鏈 – SEQ ID NO: 133)    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCT LPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGPPSGSSPGVPLS (第一多肽鏈 – SEQ ID NO: 134)
裂解產物 CP 135 136 AK530 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPGGGSSGGGSGPAPTSSSTKK TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELKHLQC LEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADET ATIVEFLNRWITFAQSIISTLT；(第二多肽鏈 – SEQ ID NO: 135)    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLP PSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGPPSGSSPMPYD (第一多肽鏈 - SEQ ID NO: 136)
裂解產物 CP 137 AK539 AK540 AK541 VVAASSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKF AMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELK GSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
裂解產物 CP 138 139 AK523 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGGGSSPPGGGSSGGGSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAM LTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKG SETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (第二多肽鏈 – SEQ ID NO: 138)    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSPDLLA (第一多肽鏈- – SEQ ID NO: 139)
裂解產物 CP 140 141 AK524    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGGGSSPPGGGSSGGGSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAM LTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKG SETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (第二多肽鏈 - SEQ ID NO: 140)    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGG SPGDLLA (第一多肽鏈 – SEQ ID NO: 141)
裂解產物 CP 142 143 AK525 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGGGSSPPGGGSSGGGSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAM LTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKG SETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (第二多肽鏈 – SEQ ID NO: 142)    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSG SPSDLLA (第一多肽鏈 - SEQ ID NO: 143)
12.1 其他序列：
描述 SEQ ID NO: 序列
MM1 60 ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQC QCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIY HFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICT
連接子L1 61 PA
IL-2域 62 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWI TFAQSIISTLT
連接子L2 63 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
MM2 64 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASW ACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVE THRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYE FQVRVKPLQ
HL 65 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
多肽鏈 66 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGPAELCDDDPPEIP HATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTT KQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYY QCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFY MPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCE YADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTGPPSGSSPMPYDLYHPSGGGAVNGTSQFTCFYNSR ANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLT TVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQWHVETHRCNISWEISQASH YFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQ
多肽鏈 67 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAPTSSSTKKTQLQ LEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 68 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAPTSSSTKKTQLQ LEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNL AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
IL-2域 69 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE ERLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWI TFAQSIISTLT
IL-2域 70 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTEKFYMPKKATELKHLQCLE EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWI TFAQSIISTLT
IL-2域 71 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE FSLKPLFFVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLFLKGSETTFMCFYADFTATIVFFLNRWI TFAQSIISTLT
IL-2域 72 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLE EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWI TFAQSIISTLT
IL-2域 73 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFRMPKKATELKHLQCLE EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWI TFAQSIISTLT
IL-2域 74 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTSKFYMPKKATELKHLQCLE ESLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWI TFAQSIISTLT
連接子L1 75 PGSG
連接子L1 76 GGSSPPRAAAVKSPSGP
連接子L1 77 GGPGGPRAAAVKSPSGP
連接子L1 78 GSPGVPLSLYSGP
HL 79 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HL 80 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRKELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL KSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
HL 81 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLD SDGSFFLVSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
HL 82 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRKKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
HL 83 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQESLSLSPG
HL 84 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRKKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
多肽鏈 85 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPMPYDL YHPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 86 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRKELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL KSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGPPSGSSPMPY DLYHPSGGGAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCE LLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAP ISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLE TLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
多肽鏈 87 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLD SDGSFFLVSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAPTSSSTKKTQLQ LEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 88 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRKKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGPPSGSSPMPY DLYHPSGGGAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCE LLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAP ISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLE TLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
多肽鏈 89 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQESLSLSPGAPTSSSTKKTQLQ LEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLA QSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 90 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQESLSLSPGGGSSPPMPYDLY HPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKH LQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEF LNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 91 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRKKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
多肽鏈 92 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRKKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGPGSGAVNGTSQ FTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILG APDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQWHVETHRCNIS WEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVK PLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKD
多肽鏈 93 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPMPYDL YHPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELK HLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 94 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGPGGPRAAAV KSPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 95 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPRAAAV KSPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELK HLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 96 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGPGGPRAAAV KSPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKKATELK HLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 97 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSGRAAAVKS PSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHL QCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFL NRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 98 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPGGGSS GGGSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFAMPKKATEL KHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI VEFLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 99 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPMPYDL YHPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK HLQCLEERLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 100 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPMPYDL YHPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTEKFYMPKKATELK HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 101 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPMPYDL YHPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK HLQCLEESLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 102 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPMPYDL YHPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELK HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 103 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPMPYDL YHPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFRMPKKATELK HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 104 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSSPPMPYDL YHPSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTSKFYMPKKATELK HLQCLFFSLKPLFEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSFTTFMCEYADETATIVE FLNRWITFAQSIISTLT
多肽鏈 105 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSPGVPLSLYSG PAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EERLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR WITFAQSIISTLT
多肽鏈 106 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSPGVPLSLYSG PAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTEKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW ITFAQSIISTLT
多肽鏈 107 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSPGVPLSLYSG PAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EESLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW ITFAQSIISTLT
多肽鏈 108 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSPGVPLSLYSG PAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW ITFAQSIISTLT
多肽鏈 109 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSPGVPLSLYSG PAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFRMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW ITFAQSIISTLT
多肽鏈 110 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSPGVPLSLYSG PAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTSKFYMPKKATELKHLQCL EESLKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATFVEFLNRW ITFAQSIISTLT
多肽鏈 111 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSPGVPLSLYSG PAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW ITFAQSIISTLT
12.2.   構築體列表 下表展示由『AK』參考編號標記之分子的完整序列。亦展示序列之組成部分以及在分子鏈中其組裝之次序。個別鏈由『DNA』參考編號標記：
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圖 1 展示經遮蔽之細胞激素之示例性實施例的結構，該經遮蔽之細胞激素包括遮蔽部分、細胞激素或其功能片段(「細胞激素」)、半衰期延長域及第一連接子，該第一連接子包括第一可裂解肽(「1CP」)、第一N端間隔子域(「1NSD」)及第一C端間隔子域(「1CSD」)。此等示例性實施例亦包括第二連接子，該第二連接子包括第二可裂解肽(「2CP」)、第二N端間隔子域(「2NSD」)及第二C端間隔子域(「2CSD」)。如箭頭所示，雖然示例性實施例展示遮蔽部分連接至第一連接子，且細胞激素或其功能片段連接至第一連接子及第二連接子，但遮蔽部分及細胞激素或其功能片段可互換，使得細胞激素或其功能片段連接至第一連接子，且遮蔽部分連接至第一連接子及第二連接子。圖 1 展示呈單體形式的經遮蔽之細胞激素之一例示性實施例的結構。
圖 2 展示經遮蔽之細胞激素之一示例性實施例的結構，該經遮蔽之細胞激素包括遮蔽部分、細胞激素或其功能片段(「細胞激素」)、第一半衰期延長域及第二半衰期延長域。圖 2 中所示之示例性實施例亦包括第一連接子，該第一連接子包括第一可裂解肽(「1CP」)、第一N端間隔子域(「1NSD」)及第一C端間隔子域(「1CSD」)；及第二連接子，該第二連接子包括第二可裂解肽(「2CP」)、第二N端間隔子域(「2NSD」)及第二C端間隔子域(「2CSD」)。示例性第一半衰期延長域及第二半衰期延長域包括「杵臼」修飾，該等修飾促進第一半衰期延長域與第二半衰期延長域之締合，如第一半衰期延長域中之「臼」及第二半衰期延長域中之「杵」所示。亦展示第一半衰期延長域及第二半衰期延長域至少部分因形成二硫鍵而締合。應瞭解，雖然「臼」被描繪成第一半衰期延長域之一部分(連接至遮蔽部分)且「杵」被描繪成第二半衰期延長域之一部分(連接至細胞激素)，但「臼」及「杵」可分別替代性地包括在第二半衰期延長域及第一半衰期延長域中，使得「臼」為第二半衰期延長域之一部分(連接至細胞激素)且「杵」為第一半衰期延長域之一部分(連接至遮蔽部分)。
圖 3A-3B 展示諸如在腫瘤微環境下在藉由蛋白酶裂解之前(左)及之後(右)經遮蔽之細胞激素之示例性實施例。圖 3A-3B 展示經遮蔽之IL-2細胞激素之示例性實施例。藉由蛋白酶裂解釋放出遮蔽部分(例如IL-2Rβ，如圖 3B 中所示)或釋放出IL-2 (圖 3A )。
圖 4 展示在IL-2構築體(AK304、AK305、AK307、AK308、AK309、AK310、AK311、AK312、AK313、AK314及AK315)產生及純化之後對流過(FT)樣品(亦即，未結合於蛋白A管柱之蛋白質)及溶離(E)樣品(亦即，結合於蛋白A管柱且自其中溶離之蛋白質)之SDS-PAGE分析。
圖 5A-5D 展示來自SPR分析之結果，該SPR分析測試示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體(AK168)或rhIL-2對照對CD25-Fc之結合。圖 5A 展示AK168與CD25-Fc之間的相互作用，圖 5B 展示經MMP活化之AK168與CD25-Fc之間的相互作用，且圖 5C 展示重組人類IL-2 (rhIL2)對照與CD25-Fc之間的相互作用。圖 5D 提供一表格，該表格總結針對締合常數(ka)、解離常數(kd)、平衡解離常數(KD)以及各相互作用之χ2值及U值所獲得的資料。
圖 6A-6D 展示來自SPR分析之結果，該SPR分析測試示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體(AK111)或rhIL-2對照對CD122-Fc之結合。圖 6A 展示AK111與CD122-Fc之間的相互作用，圖 6B 展示經蛋白酶活化之AK111與CD122-Fc之間的相互作用，且圖 6C 展示重組人類IL-2 (rhIL-2)對照與CD122-Fc之間的相互作用。圖 6D 提供一表格，該表格總結針對締合常數(ka)、解離常數(kd)、平衡解離常數(KD)以及各相互作用之χ2值及U值所獲得的資料。
圖 7A 展示諸如在腫瘤微環境下在藉由蛋白酶裂解之前(左)及之後(右)經遮蔽之細胞激素之一示例性實施例。圖 7B 展示在MMP10蛋白酶缺乏(左側泳道)或存在(右側泳道)下培育之示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體的SDS-PAGE分析，其證明IL-2自Fc部分釋放。
圖 8A-8D 展示用構築體AK032、AK035、AK041或作為對照之rhIL-2處理之PBMC中的STAT5活化(%)。如在與rhIL-2 (圖 8A )、AK032 (圖 8B )、AK035 (圖 8C )或AK041 (圖 8D )一起培育之後所測定，展示NK細胞、CD8+ T細胞、效應T細胞(Teff)及調節T細胞(Treg)之STAT5活化程度(%)。
圖 9A-9C 展示用構築體AK081或AK032處理之PBMC中的STAT5活化(%)。測試在先前暴露於或未暴露於MMP10下之AK081構築體。亦測試同型對照以及無IL-2陰性對照。展示NK細胞(圖 9A )、CD8+ T細胞(圖 9C )及CD4+ T細胞(圖 9B )之STAT5活化程度(%)。
圖 10A-10D 展示來自PBMC中使用構築體AK081及AK111以及包括rhIL-2及抗RSV抗體之對照之STAT5活化研究的結果。亦測試無處理對照。亦展示rhIL-2、AK081及AK111處理之EC50 (pM)。展示CD4+FoxP3+CD25+細胞(圖 10A )、CD8+細胞(圖 10B )及CD4+FoxP3-CD25-細胞(圖 10C )之STAT5活化(%)。圖 10D 提供AK081、AK111構築體以及rhIL-2對照之EC50 (pM)及變化倍數資料。
圖 11A-11D 展示來自PBMC中使用構築體AK167及AK168以及包括rhIL-2及抗RSV抗體之對照之STAT5活化研究的結果。亦測試無處理對照。亦展示rhIL-2、AK167及AK168處理之EC50 (pM)。展示CD4+FoxP3+CD25+細胞(圖 11A )、CD8+細胞(圖 11B )及CD4+FoxP3-CD25-細胞(圖 11C )之STAT5活化(%)。圖 11D 提供AK167及AK168構築體以及rhIL-2對照之EC50 (pM)及變化倍數資料。
圖 12A-12D 展示用(+MMP10)或先前未暴露於MMP10蛋白酶之構築體AK165或AK166或者同型對照或IL-2-Fc對照處理之PBMC中的STAT5活化(%)。如圖 12A 中所示之圖例亦適用於圖 12B ，且如圖 12C 中所示之圖例亦適用於圖 12D 。展示CD4+FoxP3+ T調節細胞(圖 12A )、CD4+FoxP3- T輔助細胞(圖 12B )、CD8+細胞毒性T細胞(圖 12C )及CD56+NK細胞(圖 12D )之STAT5活化(%)。
圖 13A-13C 展示用(+MMP10)或先前未暴露於MMP10蛋白酶之構築體AK109或AK110或者同型對照或IL-2-Fc對照處理之PBMC中的STAT5活化(%)。如圖 12B 中所示之圖例亦適用於圖 13A 。展示NK細胞(圖 13A )、CD8細胞(圖 13B )及CD4細胞(圖 13C )之STAT5活化(%)。
圖 14A-14D 展示來自PBMC中使用構築體AK211、AK235、AK253、AK306、AK310、AK314及AK316以及rhIL-2對照之STAT5活化研究的結果。展示CD3+CD4+FoxP3+細胞(圖 14A )、CD3+CD4+FoxP3-細胞(圖 14B )及CD3+CD8+細胞(圖 14C )之STAT5活化(%)。圖 14D 提供各測試構築體以及rhIL-2對照之EC50資料。
圖 15A-15D 展示來自PBMC中使用已經蛋白酶活化之構築體AK081、AK167、AK216、AK218、AK219、AK220及AK223以及rhIL-2對照之STAT5活化研究的結果。展示CD4+FoxP3+CD25+細胞(圖 15A )、CD4+FoxP3-CD25-細胞(圖 15B )及CD8+細胞(圖 15C )之STAT5活化(%)。圖 15D 提供各測試構築體以及rhIL-2對照之EC50資料。
圖 16A-16C 展示用構築體AK081、AK189、AK190或AK210或者抗RSV對照處理之PBMC中的STAT5活化(%)。如圖 16A 中所示之圖例亦適用於圖 16B 及16C 。展示調節T細胞(圖 16A )、CD4輔助T細胞(圖 16B )及CD8細胞(圖 16C )之STAT5活化(%)。
圖 17A-17C 展示用構築體AK167、AK191、AK192或AK193或者抗RSV對照處理之PBMC中的STAT5活化(%)。如圖 17A 中所示之圖例亦適用於圖 17B 及 17C 。展示調節T細胞(圖 17A )、CD4輔助T細胞(圖 17B )及CD8細胞(圖 17C )之STAT5活化(%)。
圖 18A-18D 展示來自藥物動力學研究之結果，所述藥物動力學研究在負載腫瘤之小鼠中使用構築體AK032、AK081、AK111、AK167或AK168或者抗RSV對照進行。圖 18A 提供各測試構築體之結構的簡單描繪。圖 18B 展示藉由偵測人類IgG所得之血漿中之Fc含量(µg/mL)，圖 18C 展示藉由偵測人類CD 122所得之血漿中之Fc-CD122含量(µg/mL)，且圖 18D 展示藉由偵測人類IL-2所得之血漿中之Fc-IL2含量(µg/mL)。在偵測步驟之前，抗人類IG用作捕捉抗體。
圖 19A-19D 展示來自藥物動力學研究之結果，所述藥物動力學研究在負載腫瘤之小鼠中使用構築體AK167、AK191、AK197、AK203、AK209或AK211或者抗RSV對照進行。圖 19A 提供各測試構築體之結構的簡單描繪。圖 19B 展示藉由偵測人類IgG所得之血漿中之Fc含量(µg/mL)，圖 19C 展示藉由偵測人類IL-2所得之血漿中之Fc-IL2含量(µg/mL)，且圖 19D 展示藉由偵測人類CD 122所得之血漿中之Fc-CD122含量(µg/mL)。在偵測步驟之前，抗人類IG用作捕捉抗體。
圖 20A-20L 展示來自如下研究之結果，該等研究使用AK032、AK081、AK111、AK167或AK168構築體或者抗RSV IgG對照測試脾臟、血液及腫瘤中之CD4、CD8、NK及Treg百分比之活體內反應。對於脾臟組織，展示CD3細胞之CD8細胞% (圖 20A )、CD3細胞之CD4% (圖 20B )、CD3-細胞之NK細胞% (圖 20C )、CD4細胞之FoxP3% (圖 20D )。對於血液，展示CD3細胞之CD8細胞% (圖 20E )、CD3細胞之CD4% (圖 20F )、CD3-細胞之NK細胞% (圖 20G )、CD4細胞之FoxP3% (圖 20H )。對於腫瘤組織，展示CD3細胞之CD8細胞% (圖 20I )、CD3細胞之CD4% (圖 20J )、CD3-細胞之NK細胞% (圖 20K )、CD4細胞之FoxP3% (圖 20L )。
圖 21A-21L 展示來自如下研究之結果，該等研究使用AK167、AK168、AK191、AK197、AK203、AK209或AK211構築體或者抗RSV IgG對照測試脾臟、血液及腫瘤中之CD4、CD8、NK及Treg百分比之活體內反應。對於脾臟組織，展示CD3細胞之CD8細胞% (圖 21A )、CD3細胞之CD4% (圖 21B )、CD3-細胞之NK細胞% (圖 21C )、CD4細胞之FoxP3% (圖 21D )。對於血液，展示CD3細胞之CD8細胞% (圖 21E )、CD3細胞之CD4% (圖 21F )、CD3-細胞之NK細胞% (圖 21G )、CD4細胞之FoxP3% (圖 21H )。對於腫瘤組織，展示CD3細胞之CD8細胞% (圖 21I )、CD3細胞之CD4% (圖 21J )、CD3-細胞之NK細胞% (圖 21K )、CD4細胞之FoxP3% (圖 21L )。
圖 22A-22L 展示來自如下研究之結果，該等研究使用AK235、AK191、AK192、AK193、AK210、AK189、AK190或AK211構築體或者抗RSV IgG對照測試脾臟、血液及腫瘤中之CD4、CD8、NK及Treg百分比之活體內反應。對於脾臟組織，展示CD3細胞之CD8細胞% (圖 22A )、CD3細胞之CD4% (圖 22B )、CD3-細胞之NK細胞% (圖 22C )、CD4細胞之FoxP3% (圖 22D )。對於血液，展示CD3細胞之CD8細胞% (圖 22E )、CD3細胞之CD4% (圖 22F )、CD3-細胞之NK細胞% (圖 22G )、CD4細胞之FoxP3% (圖 22H )。對於腫瘤組織，展示CD3細胞之CD8細胞% (圖 22I )、CD3細胞之CD4% (圖 22J )、CD3-細胞之NK細胞% (圖 22K )、CD4細胞之FoxP3% (圖 22L )。
圖 23A-23I 展示來自脾臟、血液及腫瘤中使用AK235、AK191、AK192、AK193、AK210、AK189、AK190或AK211構築體之活體內T細胞活化的結果。T細胞活化量測為脾臟、血液及腫瘤中CD8+ T細胞(圖 23A ；圖 23D ；圖 23G )、CD4+ T細胞(圖23B；圖23E；圖23H)或Foxp3+細胞(圖 23C ；圖 23F ；圖 23I )中CD25之平均螢光強度(MFI)。與不可裂解之AK211構築體相比，使用單向ANOVA進行統計分析。
圖 24A-24D 展示來自如下研究之結果，該等研究測試示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體AK168 (可裂解肽序列：MPYDLYHP；SEQ ID NO: 24)及AK209 (可裂解肽序列：VPLSLY；SEQ ID NO: 28)之活體內裂解。圖 24E 展示來自針對AK167、AK168及AK209構築體之總含量及針對各構築體之未裂解形式之含量的總血漿IgG濃度(µg/mL)的藥物動力學研究的結果。
圖 25A-25D 展示來自活體內研究之結果，該活體內研究使用示例性經遮蔽之IL-2多肽構築體AK111或AK168或者未遮蔽之IL-2多肽構築體AK081或AK167或者抗RSV對照評估血管滲漏。圖 25A 展示體重減輕百分比(%)，且圖 25B 、25C 及25D 分別展示肝臟、肺及脾臟每一者之重量，以公克為單位。
圖 26A 及26B 展示來自活體內研究之結果，該活體內研究如藉由量測投與AK081、AK111、AK167或AK168構築體或者抗RSV對照後染料滲漏至肝臟及肺組織中之程度所指示來評估血管滲漏。基於650 nm下之吸光度量測肝臟(圖 26A )及肺(圖 26B )中之染料滲漏程度。
圖 27A 及27B 展示來自活體內研究之結果，該活體內研究如藉由量測投與AK081、AK111、AK167或AK168構築體或者抗RSV對照後單核細胞血管周侵入肝臟及肺組織中之程度所指示來評估血管滲漏。各描繪肝臟中之單核細胞之平均數量(圖 27A )及肺中之單核細胞之平均數量(圖 27B )。
圖 28A 及28B 展示來自同基因型腫瘤模型研究之結果，該同基因型腫瘤模型研究評估用AK032、AK081、AK111、AK167或AK168構築體或者抗RSV對照處理過程中之腫瘤體積及體重。圖 28A 展示關於處理過程中之腫瘤體積的資料，且圖 28B 展示關於處理過程中之體重變化百分比(%)的資料。
圖 29A 及29B 展示具有I253A FcRn突變之AK471誘導TME中穩固之CD8 T細胞擴增，同時保持在周邊中非活性。
圖 30A-30C 展示AK471與aglyco-hIgG1相比半衰期略短。
圖 31A-31C 展示沒有證據顯示血漿中AK471裂解或去頭(decapitation)。
圖 32A 及 32B 展示實例5之結果。
圖 33A-33D 展示實例5之結果。
圖 34A 及 34B 展示實例6i之結果。圖 35A 及 35B 展示實例6ii之結果。圖 36A 及 36B 展示實例6iii之結果。圖 37A 及 37B 展示實例6iv之結果。圖 38A 及 38B 展示實例6v之結果。圖 39A 及 39B 展示實例6vi之結果。圖 40A-40D 展示實例6vii之結果。圖 41A 及 41B 展示實例6viii之結果。圖 42A 及 42B 展示實例6ix之結果。圖 43A 及 43B 展示實例6x之結果。
圖 44A-44D 及圖 45A-45F 展示SDS-PAGE及HEK-Blue IL-2生物分析之結果，該生物分析使用不包括肽受質之示例性IL-15構築體AK904及AK910及包括肽受質之構築體AK932、AK938、AK930及AK936。圖 44A-44D 展示SDS-PAGE凝膠結果。圖 45A-45F 展示HEK-Blue IL-2生物分析結果。
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Claims (149)

  1. 一種經遮蔽之IL-2細胞激素，其包括包含以下之蛋白質雜二聚體： a) 第一多肽鏈，其包含經由第一連接子連接於第一半衰期延長域之遮蔽部分；及 b) 第二多肽鏈，其包含經由第二連接子連接於第二半衰期延長域之IL-2細胞激素或其功能片段， 其中該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域締合，且 其中該第一連接子或該第二連接子中之一者為包含可經蛋白分解方式裂解之肽的可經蛋白分解方式裂解之連接子。
  2. 如請求項1之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一多肽鏈包含式6： N'HL1-L1-MM C' (6) 且該第二多肽鏈包含式5： N'HL2-L2-C C' (5) 其中HL1為該第一半衰期延長域，L1為該第一連接子，MM為該遮蔽部分，HL2為該第二半衰期延長域，L2為該第二連接子，且C為該IL-2細胞激素或其功能片段。
  3. 如請求項1或請求項2之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域包含第一Fc域或其片段且該第二半衰期延長域包含Fc域或其片段。
  4. 如請求項3之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一Fc域及/或該第二Fc域各含有一或多個促進該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域之非共價締合的修飾。
  5. 如請求項3或請求項4之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域及該第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段。
  6. 如請求項5之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域包含包括突變Y349C、T366S、L38A及Y407V以在該第一半衰期延長域中形成『臼』之IgG1 Fc域或其片段，且該第二半衰期延長域包含包括突變S354C及T366W以在該第二半衰期延長域中形成『杵』之IgG1 Fc域或其片段，根據Kabat EU編號系統編號。
  7. 如請求項5或6之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域及該第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代N297A，根據Kabat EU編號系統編號。
  8. 如請求項5至7中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域及該第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代I253A，根據Kabat EU編號系統編號。
  9. 如請求項1或請求項2之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，且該第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
  10. 如請求項1或請求項2之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列且該第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該IL-2細胞激素或其功能片段與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比為經修飾。
  12. 如請求項11之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾R38A、F42A、Y45A及E62A。
  13. 如請求項11或請求項12之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾C125A。
  14. 如請求項11至13中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含R38A、F42A、Y45A、E62A及C125A。
  15. 如請求項1至14中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
  16. 如請求項1至15中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該遮蔽部分包含IL-2Rβ或其片段、部分或變異體。
  17. 如請求項16之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該IL-2Rβ或其片段、部分或變異體包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
  18. 如請求項16之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該IL-2Rβ或其片段、部分或變異體包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。
  19. 如請求項1至18中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第二連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽，以使得該第二連接子為可經蛋白分解方式裂解之連接子，且該第一連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽，以使得該第一連接子為不可經蛋白分解方式裂解之連接子。
  20. 如請求項1至18中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽，以使得該第一連接子為可經蛋白分解方式裂解之連接子，且該第二連接子不包含可經蛋白分解方式裂解之肽，以使得該第二連接子為不可經蛋白分解方式裂解之連接子。
  21. 如請求項19或請求項20之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該不可經蛋白分解方式裂解之連接子的長度介於3個與18個胺基酸之間。
  22. 如請求項21之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該不可經蛋白分解方式裂解之連接子的長度介於3個與8個胺基酸之間。
  23. 如請求項19至22中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該不可經蛋白分解方式裂解之連接子富含胺基酸殘基G、S及P。
  24. 如請求項19至23中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該不可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。
  25. 如請求項19至23中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該不可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
  26. 如請求項1至25中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子的長度為10個至25個胺基酸。
  27. 如請求項1至26中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子內的該可裂解肽包含選自由SEQ ID NO: 24、25、26、27及28組成之群的胺基酸序列。
  28. 如請求項1至26中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子內的該可裂解肽包含SEQ ID NO: 118。
  29. 如請求項1至26中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子內的該可裂解肽包含SEQ ID NO: 119。
  30. 如請求項1至29中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含利用間隔子域側接在兩側的可經蛋白分解方式裂解之肽。
  31. 如請求項30之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該等間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。
  32. 如請求項30或請求項31之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該等間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
  33. 如請求項1至25中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 16、17、18、19、20、21及22組成之群的胺基酸序列。
  34. 如請求項33之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 19組成之群的胺基酸序列。
  35. 如請求項33之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 17組成之群的胺基酸序列。
  36. 如請求項30之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 118中所示之胺基酸序列且SD2具有如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列。
  37. 如請求項30之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 119中所示之胺基酸序列且SD2具有如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列。
  38. 如請求項36或請求項37之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中SD2的長度為3個至6個胺基酸。
  39. 如請求項25之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 115組成之群的胺基酸序列。
  40. 如請求項25之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 116及117組成之群的胺基酸序列。
  41. 如請求項25之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 112組成之群的胺基酸序列。
  42. 如請求項25之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列。
  43. 如請求項25之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 114組成之群的胺基酸序列。
  44. 如請求項1或請求項19之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 38之第一多肽鏈。
  45. 如請求項1或請求項19之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 39之第一多肽鏈。
  46. 如請求項1或請求項20之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 125之第一多肽鏈。
  47. 如請求項1或請求項20之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 126之第一多肽鏈。
  48. 如請求項1或請求項20之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 127之第一多肽鏈。
  49. 如請求項1之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 39之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 49之第二多肽鏈。
  50. 如請求項1之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 40之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 51之第二多肽鏈。
  51. 如請求項1之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 38之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 128之第二多肽鏈。
  52. 如請求項1之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 38之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 129之第二多肽鏈。
  53. 如請求項1之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 38之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 130之第二多肽鏈。
  54. 如請求項1之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 125之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 51之第二多肽鏈。
  55. 如請求項1之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 126之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 51之第二多肽鏈。
  56. 如請求項1之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包含SEQ ID NO: 127之第一多肽鏈及SEQ ID NO: 51之第二多肽鏈。
  57. 一種經遮蔽之IL-2細胞激素，其包含遮蔽部分及IL-2細胞激素或其功能片段，其中該遮蔽部分遮蔽該IL-2細胞激素或其功能片段，從而減少或防止該IL-細胞激素或其功能片段與其同源受體的結合，且其中可經蛋白分解方式裂解之肽存在於該IL-2片段或其功能片段與該遮蔽部分之間。
  58. 如請求項57之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該遮蔽部分及該IL-2細胞激素或其功能片段係在單一多肽鏈中連接。
  59. 如請求項57或請求項58之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包括包含式1之多肽鏈： N'HL-L2-C-L1-MM C' (1) 其中HL為該半衰期延長域，L1為該第一連接子，MM為該遮蔽部分，L2為該第二連接子，且C為該IL-2細胞激素或其功能片段，其中至少該第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。
  60. 如請求項57或請求項58之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該經遮蔽之IL-2細胞激素包括包含式2之多肽鏈： N'HL-L2-MM-L1-C C' (2) 其中HL為該半衰期延長域，L1為該第一連接子，MM為該遮蔽部分，L2為該第二連接子，且C為該IL-2細胞激素或其功能片段，其中至少該第一連接子包含可經蛋白分解方式裂解之肽。
  61. 如請求項57至60中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該遮蔽部分包含IL-2Rβ或其片段、部分或變異體。
  62. 如請求項61之經遮蔽之細胞激素，其中該IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2β相比在胺基酸位置C122及C168處具有突變。
  63. 如請求項61或請求項62之經遮蔽之細胞激素，其中該IL-2Rβ或其片段、部分或變異體與SEQ ID NO: 4之IL-2β相比具有突變C122S及C168S。
  64. 如請求項57至63中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該半衰期延長域(HL)包含第一及第二半衰期延長域，該等半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段。
  65. 如請求項64之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一Fc域及/或該第二Fc域各含有一或多個促進該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域之非共價締合的修飾。
  66. 如請求項64或請求項65之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域包含包括突變Y349C、T366S、L38A及Y407V以在該第一半衰期延長域中形成『臼』之IgG1 Fc域或其片段，且該第二半衰期延長域包含包括突變S354C及T366W以在該第二半衰期延長域中形成『杵』之IgG1 Fc域或其片段，根據Kabat EU編號系統編號。
  67. 如請求項64至66中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域及該第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代N297A，根據Kabat EU編號系統編號。
  68. 如請求項64至67中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，該第一半衰期延長域及該第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代I253A，根據Kabat EU編號系統編號。
  69. 如請求項64至67中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，且該第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
  70. 如請求項64至68中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列且該第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。
  71. 如請求項57至70中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子內的該可裂解肽包含SEQ ID NO: 118。
  72. 如請求項57至70中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子內的該可裂解肽包含SEQ ID NO: 119。
  73. 如請求項71之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 118中所示之胺基酸序列且SD2具有如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列。
  74. 如請求項72之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含SD1-CP-SD2，其中SD1為第一間隔子域，CP為可裂解肽且SD2為第二間隔子域，且其中CP具有如SEQ ID NO: 118中所示之胺基酸序列且SD2具有如SEQ ID NO: 29中所示之胺基酸序列。
  75. 如請求項73或請求項74之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中SD2的長度為3個至6個胺基酸。
  76. 如請求項57至70中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 115組成之群的胺基酸序列。
  77. 如請求項57至70中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 116組成之群的胺基酸序列。
  78. 如請求項57至70中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 112組成之群的胺基酸序列。
  79. 如請求項57至70中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列。
  80. 如請求項57至70中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該可經蛋白分解方式裂解之連接子包含選自由SEQ ID NO: 114組成之群的胺基酸序列。
  81. 一種裂解產物，其能夠結合於其同源受體，該裂解產物包含IL-2細胞激素或其功能片段，可藉由如請求項1至80中任一項所定義之經遮蔽之IL-2細胞激素中該可裂解肽經過蛋白水解裂解所製備。
  82. 一種經遮蔽之IL-2細胞激素之裂解產物，其中該裂解產物能夠結合於其同源受體，該裂解產物包括包含式3之多肽：PCP-SD-C (3) 其中PCP為可經蛋白分解方式裂解之肽之一部分；SD為間隔子域；且C為IL-2細胞激素或其功能片段。
  83. 如請求項81或請求項82之裂解產物，其中該IL-2細胞激素或其功能片段與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2多肽之序列相比係經修飾。
  84. 如請求項83之裂解產物，其中該經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾R38A、F42A、Y45A及E62A。
  85. 如請求項83或請求項84之裂解產物，其中該經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾C125A。
  86. 如請求項83至85中任一項之裂解產物，其中該經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含R38A、F42A、Y45A、E62A及C125A。
  87. 如請求項83至86中任一項之裂解產物，其中該IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
  88. 如請求項82至87中任一項之裂解產物，其中該間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。
  89. 如請求項82至88中任一項之裂解產物，其中該間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
  90. 如請求項82至89中任一項之裂解產物，其中該間隔子域包含SEQ ID NO: 29、30及31中之任一者的胺基酸序列。
  91. 如請求項82至90中任一項之裂解產物，其中該可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 24、25、26、27及28中之任一者之胺基酸序列的部分。
  92. 如請求項82至90中任一項之裂解產物，其中該可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的部分。
  93. 如請求項82至90中任一項之裂解產物，其中該可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的部分。
  94. 如請求項82之裂解產物，其包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列。
  95. 如請求項82之裂解產物，其包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
  96. 一種經遮蔽之IL-2細胞激素之裂解產物，其中該裂解產物能夠結合於其同源受體，該裂解產物包括包含以下之蛋白質雜二聚體： a) 第一多肽鏈，其包括包含式4之多肽：HL1-SD-PCP (4) 其中HL1為第一半衰期延長域；SD為間隔子域；且PCP為可經蛋白分解方式裂解之肽之一部分；及 b) 第二多肽鏈，其包括包含式5之多肽：HL2-L2-C (5) 其中HL2為第二半衰期延長域；L2為連接子；且C為IL-2細胞激素或其功能片段；且 其中該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域締合。
  97. 如請求項96之裂解產物，其中該IL-2細胞激素或其功能片段與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比係經修飾。
  98. 如請求項97之裂解產物，其中該經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾R38A、F42A、Y45A及E62A。
  99. 如請求項97或請求項98之裂解產物，其中該經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段相對於具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列包含修飾C125A。
  100. 如請求項97至99中任一項之裂解產物，其中該經修飾之IL-2細胞激素或其功能片段包含R38A、F42A、Y45A、E62A及C125A。
  101. 如請求項97至100中任一項之裂解產物，其中該IL-2細胞激素或其功能片段包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
  102. 如請求項96至101中任一項之裂解產物，其中該第一半衰期延長域包含第一Fc域或其片段且該第二Fc域包含Fc域或其片段。
  103. 如請求項102之裂解產物，其中該第一Fc域包含CH3域或其片段且該第二Fc域包含CH3域或其片段。
  104. 如請求項102或請求項103之裂解產物，其中該第一Fc域及/或該第二Fc域各含有一或多個促進該第一半衰期延長域與該第二半衰期延長域之非共價締合的修飾。
  105. 如請求項96至104中任一項之裂解產物，其中該第一半衰期延長域及該第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段。
  106. 如請求項105之裂解產物，其中該第一半衰期延長域及該第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代N297A，根據Kabat EU編號系統編號。
  107. 如請求項105或請求項106之裂解產物，該第一半衰期延長域及該第二半衰期延長域各自為IgG1 Fc域或其片段且各自包含胺基酸取代N297A及I253A，根據Kabat EU編號系統編號。
  108. 如請求項105之裂解產物，其中該第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，且該第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
  109. 如請求項105之裂解產物，其中該第一半衰期延長域包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列且該第二半衰期延長域包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。
  110. 如請求項96至109中任一項之裂解產物，其中該第二連接子包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
  111. 如請求項96至110中任一項之裂解產物，其中該間隔子域富含胺基酸殘基G、S及P。
  112. 如請求項96至111中任一項之裂解產物，其中該間隔子域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
  113. 如請求項96至112中任一項之裂解產物，其中該間隔子域包含SEQ ID NO: 32、33、34、35、36及37之胺基酸序列。
  114. 如請求項96至113中任一項之裂解產物，其中該可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 24、25、26、27及28中之任一者之胺基酸序列的部分。
  115. 如請求項96至113中任一項之裂解產物，其中該可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的部分。
  116. 如請求項96至113中任一項之裂解產物，其中該可經蛋白分解方式裂解之肽之部分為SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的部分。
  117. 如請求項96之裂解產物，其包含具有SEQ ID NO: 59-B之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 59-A之胺基酸序列之第二多肽鏈。
  118. 如請求項96之裂解產物，其包含具有SEQ ID NO: 139之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 138之胺基酸序列之第二多肽鏈。
  119. 如請求項96之裂解產物，其包含具有SEQ ID NO: 141之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 140之胺基酸序列之第二多肽鏈。
  120. 如請求項96之裂解產物，其包含具有SEQ ID NO: 143之胺基酸序列之第一多肽鏈及具有SEQ ID NO: 142之胺基酸序列之第二多肽鏈。
  121. 一種核酸，其編碼如請求項1至80中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素或編碼如請求項1至80中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素的多肽鏈中之一者。
  122. 一種載體，其包含如請求項121之核酸。
  123. 一種宿主細胞，其包含編碼如請求項1至80中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素的核酸。
  124. 一種組合物，其包含如請求項1至80中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素。
  125. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至80中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素及醫藥學上可接受之載劑。
  126. 一種套組，其包含如請求項1至80中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素或如請求項124之組合物或如請求項125之醫藥組合物。
  127. 一種產生如請求項1至80中任一項所定義之經遮蔽之IL-2細胞激素的方法，其包含在產生該經遮蔽之IL-2細胞激素的條件下培養如請求項123之宿主細胞。
  128. 一種核酸，其編碼如請求項81至120中任一項之裂解產物。
  129. 一種組合物，其包含如請求項81至120中任一項之裂解產物。
  130. 一種醫藥組合物，其包含如請求項81至120中任一項之裂解產物及醫藥學上可接受之載劑。
  131. 如請求項130之醫藥組合物，其中該醫藥組合物呈單一單位劑型。
  132. 如請求項130之醫藥組合物，其中該醫藥組合物經調配用於靜脈內投與且呈單一單位劑型。
  133. 如請求項130之醫藥組合物，其中該醫藥組合物經調配用於注射且呈單一單位劑型。
  134. 如請求項130之醫藥組合物，其中該醫藥組合物為液體且呈單一單位劑型。
  135. 如請求項1至80中任一項所定義之經遮蔽之IL-2細胞激素，其用於藥物中。
  136. 如請求項81至120中任一項所定義之裂解產物，其用於藥物中。
  137. 一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至80中任一項之經遮蔽之IL-2細胞激素。
  138. 一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項124或請求項129之組合物。
  139. 一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項125及130至134中任一項之醫藥組合物。
  140. 一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至80中任一項所定義之經遮蔽之IL-2細胞激素，藉此該經遮蔽之細胞激素在活體內經蛋白分解方式裂解，以產生如請求項81至120中任一項所定義之裂解產物。
  141. 一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含在活體內產生能夠結合於同源受體之裂解產物的步驟，其中該裂解產物如請求項81至120中之任一項中所定義。
  142. 如請求項137至141中任一項之方法，其中該癌症為實體腫瘤。
  143. 如請求項1至80中任一項所定義之經遮蔽之IL-2細胞激素，其用於治療或預防癌症。
  144. 如請求項1至80中任一項所定義之經遮蔽之IL-2細胞激素，其用於治療或預防癌症之方法中，該方法包含向該個體投與有效量之該經遮蔽之IL-2細胞激素，藉此該經遮蔽之細胞激素在活體內經蛋白分解方式裂解，以產生如請求項81至120中任一項所定義之裂解產物。
  145. 如請求項143或請求項144所使用之經遮蔽之IL-2細胞激素，其中該癌症為實體腫瘤。
  146. 如請求項81至120中任一項所定義之裂解產物，其用於治療或預防癌症。
  147. 如請求項81至120中任一項所定義之裂解產物，其用於治療或預防癌症，該方法包含向患者投與如請求項1至80中任一項所定義之經遮蔽之細胞激素的步驟，藉此由該經遮蔽之細胞激素在活體內經過蛋白水解裂解而產生該裂解產物。
  148. 如請求項81至120中任一項所定義之裂解產物，其用於治療或預防個體之癌症的方法中，該方法包含藉由從向該個體投與之如請求項1至80中任一項所定義之經遮蔽之細胞激素於活體內經過蛋白水解裂解而產生該裂解產物的步驟。
  149. 如請求項143至148中之任一項中所使用之裂解產物，其中該癌症為實體腫瘤。
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