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JP2022532217A - 分離部分及びその使用方法 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、様々な治療ペイロードと共に使用するのに適した分離部分を提供する。分離部分は、条件的に活性の巨大分子を生成するように機能し、これにより、巨大分子は、分離部分が特定の条件下で修飾されるまで、生物学的活性が低減するまたは最小になる。本明細書では、高効率の分離部分及び／またはリンカーを生成及び使用するための組成物及び方法を提供する。リンカーは、付着したペイロード（単数または複数）の生物学的活性に対し部位選択性を付与することができる。いくつかの実施形態において、分離部分及び／またはリンカーは、疾患または障害、例えば、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病などを治療するために、治療用タンパク質と共に使用される。

Description

本出願は２０１９年５月１４日出願の米国仮出願第６２／８４７，９１４号及び２０１９年１１月２１日出願の米国仮出願第６２／９３８，７８６号の利益を主張するものであり、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、当該配列表の全体が参照により本明細書に援用される。前述のＡＳＣＩＩコピーは２０２０年５月１４日に作成され、名称は７６１１４６＿０００１４０＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズは８９６，８１５バイトである。
２つ以上の機能性ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、タンパク質の精製、イメージング、治療薬、薬物送達での使用を含めて、多くの分野で利用されている。例えば、タンパク質薬物は、標的化のために抗体のＦｃドメインまたは担体タンパク質（すなわち、ヒト血清アルブミン）に融合して、血漿中半減期を延長及び／または治療効果を達成することができる。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９．
機能的なポリペプチドまたはドメインをリンカーなしで直接融合させると、融合タンパク質のミスフォールディング（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，（２００８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．， ６１：７３－７７）、タンパク質産生の低収率（Ａｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２６：５２３－５２８）、または生物活性以上（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：７２９２－７２９６）を含めた多くの望ましくないアウトカムを招く恐れがある。このような問題を克服する１つのアプローチとしては、融合タンパク質の成分ポリペプチドまたはドメイン間にリンカー配列を使用するというものがある。しかし、タンパク質ドメインの連結に適したリンカーの選択は複雑であり得、融合タンパク質の設計では軽視されがちである。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９． リンカー配列の特性（例えば、長さ、疎水性、アミノ酸組成、二次構造、及び全体的なフォールディング）は、リンカーの適合性に影響を及ぼす可能性があり、適切なリンカーを設計及び選択する際に考慮する必要がある。加えて、選択された条件下または選択された生物学的位置（例えば、腫瘍微小環境）で切断して活性の治療薬剤（例えば、治療用ポリペプチド）を送達することができるリンカーは、治療薬剤の標的化された薬理学的活性をもたらし、望ましくない全身作用を低減することができる。これにより、好適なリンカーの設計はさらに複雑なものとなる。
選択された条件下で切断することができるリンカーを含めて、安定した融合タンパク質の調製に使用され得る改良されたライナー配列が必要とされている。したがって、新規の分離部分またはリンカーを本明細書で開示する。本明細書で開示する分離部分またはリンカーを利用して、例えば、プロドラッグ（例えば、条件的に活性の及び／または標的化されたサイトカイン）を、リンカーが生物活性を活性化するように処理される標的部位に特異的に送達することができる。
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，（２００８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．， ６１：７３－７７ Ａｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２６：５２３－５２８
本明細書では、高効率の分離部分及び／またはリンカーを生成及び使用するための組成物及び方法を提供する。リンカーは、付着したペイロード（単数または複数）の生物学的活性に対し部位選択性を付与することができる。いくつかの実施形態において、分離部分及び／またはリンカーは、疾患または障害、例えば、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病などを治療するために、治療用タンパク質と共に使用される。
本明細書では、分離部分を含む組換えポリペプチドであって、分離部分が、酵素（具体的にはプロテアーゼ）の基質であるアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチドを開示する。プロテアーゼは、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰα（プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰとしても知られている））、カテプシンＬ（ＣＴＳＬ１）、ＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、及びＡＤＡＭＴＳ１から選択される）、ならびにＭＭＰ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、またはＭＭＰ１４から選択される）からなる群より選択され得る。また、切断性部分は、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、及び／またはカテプシンＬ）の基質であってもよい。好ましくは、カテプシンはカテプシンＬである。好ましくは、プロテアーゼはＭＭＰ１４またはカテプシンＬである。切断性部分は、少なくとも２つのプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態において、分離部分は２つ以上の切断性部分を含み、当該切断性部分の各々がプロテアーゼの基質である。分離部分は、第１のプロテアーゼの基質である第１のアミノ酸配列を含む第１の切断性部分と、第２のプロテアーゼの基質である第２のアミノ酸配列を含む第２の切断性部分とを含み得る。実施形態において、本開示は、本明細書で開示するプロテアーゼ切断モチーフを含む分離部分を含む組換えポリペプチドに関する。組換えポリペプチドは、配列番号１９５～２２０からなる群より選択されたアミノ酸配列、または配列番号１９５～２２０に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む分離部分を含み得る。好ましい分離部分は、配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）を含む。また、本開示は、配列番号１９５～２２０を含む分離部分の機能的バリアントにも関する。配列番号１９５の機能的バリアントは、配列番号２５８～３３１のいずれかを含み得る。配列番号１９８の機能的バリアントは、配列番号１９９または配列番号３３２～４０８のいずれかを含み得る。本明細書で開示する分離部分は、式Ｉ：［Ｄ１］－［Ｌ１］－［Ｄ２］を含み得る。Ｄ１は第１の目的ドメインである。Ｌ１は、Ｄ１をＤ２に接続または結合する分離部分であり、当該分離部分は、配列番号１９５～２２０から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１９５～２２０に対し少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。Ｄ２は第２の目的ドメインである。
１つの実施形態において、組換えポリペプチドはさらに、非切断性リンカー配列を含み得る。組換えポリペプチドは、治療用タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、抗体の抗原結合部分（例えば、ｓｃＦＶ、ｄＡｂ）などを含み得る。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、またはこれらの任意の組合せを含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む。１つの実施形態において、組換えポリペプチドは、細胞表面受容体、キメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを含む。１つの実施形態において、組換えポリペプチドは、抗原結合ポリペプチド、抗体またはその抗原結合部分を含む。
１つの実施形態において、切断性部分は、１つ以上のプロテアーゼにより、参照ポリペプチド配列よりも（ａ）大きな触媒効率、（ｂ）大きな特異性、または（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方で切断される。別の実施形態において、１つ以上のプロテアーゼは、ＦＡＰα、ＣＴＳＬ１、ＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、及びＡＤＡＭＴＳ１から選択される）、ならびにＭＭＰ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、及びＭＭＰ１４から選択される）からなる群より選択される。また、１つ以上のプロテアーゼは、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、及び／またはカテプシンＬ）から選択されるプロテアーゼも含み得る。別の実施形態において、参照ポリペプチド配列は、ＦＡＰα、ＣＴＳＬ１、ＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、及びＡＤＡＭＴＳ１から選択される）ならびにＭＭＰ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、及びＭＭＰ１４から選択される）、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、及び／またはカテプシンＬ）、またはこれらの組合せの天然ポリペプチド基質中に存在する。別の実施形態において、切断性部分は、１つ以上のプロテアーゼにより、参照ポリペプチド配列よりも低減された触媒効率で切断される。別の実施形態において、切断性部分は、１つ以上の血清プロテアーゼにより、低減された触媒効率で切断される。別の実施形態において、切断性部分は、１つ以上の肝プロテアーゼにより、低減された触媒効率で切断される。別の実施形態において、切断性部分は、１つ以上の第Ｘａ因子、ヘプシン、またはトロンビンにより、低減された触媒効率で切断される。
１つの実施形態において、組換えポリペプチドは２つ以上の分離部分を含む。１つの実施形態において、組換えポリペプチドは、ポリペプチド部分、脂質部分、核酸部分、検出可能部分、及び小分子からなる群より選択される部分に作用可能に結合している。
本明細書では、組換えプロタンパク質であって、以下：プロテアーゼの基質である切断性部分を含む組換えポリペプチドであって、切断性部分が、配列番号１９５～２２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、組換えプロタンパク質と、生物学的活性を有するポリペプチドとを含み、プロタンパク質の生物学的活性が減弱しており、プロテアーゼによる切断性部分の切断により、生物学的活性が減弱していないポリペプチドが産生される、組換えプロタンパク質を提供する。１つの実施形態において、生物学的活性を有するポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、またはこれらの組合せを含む。いくつかの好ましい態様において、リンカーは治療に有用な融合タンパク質の成分であり、リンカーは、末梢循環内では切断されないまたは低効率で切断されるが、体内の所望の位置、例えば、腫瘍微小環境や炎症部位では高効率で切断される。別の実施形態において、生物活性を有するポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態において、生物学的活性を有するポリペプチドは、細胞表面受容体、キメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを含む。別の実施形態において、生物学的活性を有するポリペプチドは、抗原結合ポリペプチド、抗体またはその抗原結合部分を含む。
また、本開示は、融合タンパク質であって、以下：ａ．シグナル伝達タンパク質または分子と、ｂ．立体的ブロッキング部分、特異的ブロッキング部分、及びこれらの組合せから選択されるブロッキング部分と、ｃ．少なくとも１つのプロテアーゼ切断性配列を有する切断性部分（例えば、本明細書で開示する切断性部分）を含むペプチドリンカーとを含む、融合タンパク質にも関する。１つの実施形態において、融合タンパク質は、（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）によって作用可能に結合している。別の実施形態において、融合タンパク質は、ペプチドリンカーが同じ切断性部分の２つ以上のコピーを含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、立体的ブロッキング部分がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または抗ＨＳＡ抗体を含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、シグナル伝達タンパク質が、（ｉ）非ネイティブなＮ末端及び／または（ｉｉ）非ネイティブなＣ末端を含むインターロイキン２アミノ酸配列である。別の実施形態において、融合タンパク質は、シグナル伝達タンパク質がインターロイキン２アミノ酸配列である。別の実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の半減期延長ドメインをさらに含み、当該ドメインが特異的ブロッカーでもあるわけではない。別の実施形態において、融合タンパク質は、非ネイティブのＮ末端及び／またはＣ末端が環状に並べ替えることによって生成される。
本明細書で提供する融合ポリペプチドは、プロテアーゼ切断性リンカーによってリガンドに結合している第１のポリペプチド融合パートナーを含み得、このとき、切断性リンカーの触媒効率は最適化されており、リガンドは任意選択で修飾されており、第１のポリペプチド融合パートナーは、プロテアーゼ切断性リンカーの切断まで、修飾されたリガンドと標的受容体または標的受容体のサブユニットとの結合を防止するブロッキング部分である。
また、本明細書で提供する融合ポリペプチドは、プロテアーゼ切断性リンカーによってリガンドに結合している第１のポリペプチド融合パートナーを含む融合ポリペプチドであってもよく、このとき、切断性リンカーの触媒効率は最適化されており、リガンドは、任意選択で、環状並べ替えによるものを含めて修飾されて、ネイティブなリガンドと比較して非ネイティブなＮ末端及び新規のＣ末端を作出し、修飾されたリガンドの新規のＮ末端または新規のＣ末端のうちの少なくとも一方は、第１のポリペプチド融合パートナーに作用可能に結合して融合ポリペプチドを形成し、第１のポリペプチド融合パートナーは、プロテアーゼ切断性リンカーの切断まで、修飾されたリガンドと標的受容体または標的受容体のサブユニットとの結合を防止するブロッキング部分である。
１つの実施形態において、第１のポリペプチド融合パートナーは、抗体、抗体フラグメント、及びアルブミン分子からなる群より選択される。別の実施形態において、第１のポリペプチド融合パートナーはさらに、第２のブロッキング部分を含む第２のポリペプチド融合パートナーを含む。別の実施形態において、第２のポリペプチド融合パートナーは、第１のポリペプチド融合パートナーとは異なる種類のブロッキング部分である。別の実施形態において、第１のポリペプチド融合パートナーはアルブミンであり、第２のポリペプチド融合パートナーは、サイトカインの活性をブロックする相補的なアミノ酸配列を含むドメインである。別の実施形態において、第１のポリペプチド融合パートナーは立体的ブロッカー、例えばアルブミンであり、第２のポリペプチドは特異的ブロッカー、例えば、サイトカイン受容体、サイトカイン受容体の一部、サイトカインに特異的な新規アフィニティーペプチド、または融合ポリペプチドのサイトカインに特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントである。別の実施形態において、第２のポリペプチド融合パートナーは、第１のポリペプチド融合パートナーと同じ種類のブロッキング部分である。
１つの実施形態において、融合タンパク質はさらに、腫瘍抗原結合成分を含む。別の実施形態において、融合タンパク質はさらに、血清半減期延長ドメインを含む。別の実施形態において、リガンドは、ヘリックスバンドルタンパク質及びサイトカイン（限定されるものではないが、成長ホルモン、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３ｐ１９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－２１、ＩＬ－３０（ＩＬ２７ｐ２８）、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮγ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、オンコスタチンＭ、ＣＬＣＦ－１、ＧＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、フェリチン、レプチン、胎盤性ラクトゲン、プロラクチン、アポリポタンパク質ｅを含む）、ｂ－トレフォイルタンパク質（限定されるものではないが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６Ｒａ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、ＩＬ－３６ｇ、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＬ１Ｈｙ２、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８ａ、ＦＧＦ－８ｂ、ＦＧＦ－８ｅ、ＦＧＦ－８ｆ、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０、ＦＧＦ－１１、ＦＧＦ－１２、ＦＧＦ－１３、ＦＧＦ－１４、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１７、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－１９、ＦＧＦ－２０、ＦＧＦ－２１、ＦＧＦ－２２、ＦＧＦ－２３を含む）、α／β（ＴＩＭ）バレルタンパク質（限定されるものではないが、トリオースリン酸イソメラーゼを含む）、ベータサンドイッチタンパク質（限定されるものではないが、ガレクチン－１、ガレクチン－３を含む）、ＴＮＦ－ベータ、７つのβプロペラタンパク質、クラス１ ＭＨＣ α１α２ドメイン、インテグリンＩドメイン、ＧＹＦドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン（例えば、ｃＰＬＡ２、ＰＫＣ、シナプトタグミン）、ＰＤＺドメイン、Ｃ３ｄ、Ｃ５ａからなる群より選択される。１つの実施形態において、リガンドは、ＩＬ－２ポリペプチドまたはそのフラグメント（単数もしくは複数）を含む。別の実施形態において、プロテアーゼ切断性リンカーポリペプチドは、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、エラスターゼ、ＦＡＰ、ＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、及びＡＤＡＭＴＳ１から選択される）、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、ならびに腫瘍細胞表面プロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１つのプロテアーゼによって切断されることが可能な配列を含む。別の実施形態において、サイトカインまたはそのフラグメントもしくはムテインは、プロテアーゼ切断性ポリペプチドリンカーがプロテアーゼによって切断された後、サイトカインブロッキング部分から実質的に解離している。
本明細書では、以下の各々の少なくとも１つ：サイトカインポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくはムテイン［Ａ］；サイトカインブロッキング部分［Ｂ］；最適化されたプロテアーゼ切断性ポリペプチドリンカー［Ｌ］、を含む融合ポリペプチドであって、ブロッキング部分が、抗体、抗体フラグメント、及びアルブミンからなる群より選択され、サイトカインが、環状に並べ替えられたサイトカインを含む、融合ポリペプチドを開示する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はさらに、腫瘍抗原結合成分及び／または血清半減期延長ドメインを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、サイトカインペプチドまたはその機能的フラグメントもしくはムテインが、ヘリックスバンドルタンパク質及びサイトカイン（限定されるものではないが、成長ホルモン、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３ｐ１９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－２１、ＩＬ－３０（ＩＬ２７ｐ２８）、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮγ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、オンコスタチンＭ、ＣＬＣＦ－１、ＧＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、フェリチン、レプチン、胎盤性ラクトゲン、プロラクチン、アポリポタンパク質ｅを含む）、ＦＡＰ（例えば、Ｆａｐα）、ＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、及びＡＤＡＭＴＳ１から選択される）、ｂ－トレフォイルタンパク質（限定されるものではないが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６Ｒａ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、ＩＬ－３６ｇ、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＬ１Ｈｙ２、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８ａ、ＦＧＦ－８ｂ、ＦＧＦ－８ｅ、ＦＧＦ－８ｆ、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０、ＦＧＦ－１１、ＦＧＦ－１２、ＦＧＦ－１３、ＦＧＦ－１４、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１７、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－１９、ＦＧＦ－２０、ＦＧＦ－２１、ＦＧＦ－２２、ＦＧＦ－２３を含む）、α／β（ＴＩＭ）バレルタンパク質（限定されるものではないが、トリオースリン酸イソメラーゼを含む）、ベータサンドイッチタンパク質（限定されるものではないが、ガレクチン－１、ガレクチン－３を含む）、ＴＮＦ－β、７つのβプロペラタンパク質、クラス１ ＭＨＣ α１α２ドメイン、インテグリンＩドメイン、ＧＹＦドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン（例えば、ｃＰＬＡ２、ＰＫＣ、シナプトタグミン）、ＰＤＺドメイン、Ｃ３ｄ、Ｃ５ａからなる群より選択される。１つの実施形態において、サイトカインペプチドまたはその機能的フラグメントもしくはムテインは、ＩＬ－２を含む。別の実施形態において、サイトカインブロッキング部分は、サイトカインの同族受容体のリガンド結合ドメインまたはフラグメントもしくはムテイン、サイトカインポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくはムテインに結合するシングルドメイン抗体またはｓｃＦｖ、あるいはサイトカインの受容体に結合する抗体または抗体フラグメントを含む。別の実施形態において、抗体はシングルドメイン抗体またはｓｃＦｖである。別の実施形態において、ブロッキング部分は、サイトカインまたはそのフラグメントの血清半減期を延長する。
本明細書では、プロテアーゼ切断性部分を含む融合ポリペプチドであって、配列が、ある特定のプロテアーゼによる切断に対し触媒的に最適化されており、プロテアーゼ切断が、組成物を腫瘍微小環境内で誘導可能にする、融合ポリペプチドを開示する。１つの実施形態において、融合タンパク質はさらに、生物学的に不活性のポリペプチドを含み、プロテアーゼによる切断性部分の切断が、生物学的に不活性のポリペプチドを生物学的に活性のポリペプチドに変換する。１つの実施形態において、生物学的に不活性のポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、または可溶性受容体を含む。別の実施形態において、生物学的に不活性のポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態において、生物学的に不活性のポリペプチドは、細胞表面受容体、キメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを含む。別の実施形態において、生物学的に不活性のポリペプチドは、抗原結合ポリペプチド、抗体またはその抗原結合部分を含む。
本開示はさらに、本明細書で開示する任意のポリペプチドをコードする核酸と、本明細書で開示する任意のポリペプチドをコードする任意の核酸を含むベクターと、当該ベクターを含む宿主細胞とに関する。
本明細書では、医薬組成物を作製する方法であって、本明細書で開示する任意のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む宿主細胞を、所望のポリペプチドの発現及び採取に適した条件下で培養することを含む、方法を提供する。本明細書で開示する任意のポリペプチドを使用する方法であって、このようなポリペプチドを含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法について記載する。例えば、本明細書で開示する疾患または障害を有する対象を治療するための使用について記載する。
本明細書では、医薬組成物であって、本明細書で開示する任意の組換えポリペプチド、任意のプロタンパク質、任意の融合タンパク質、任意の融合ポリペプチド、任意の核酸、任意のベクター、またはこのようなベクターを含む任意の宿主細胞の有効量を含む、医薬組成物を提供する。例えば、本明細書で開示する疾患または障害を有する対象を治療するための医薬組成物を提供する。
また、本明細書で開示する疾患または障害を治療するための医薬品の製造のための、本明細書で開示する組換えポリペプチド、プロタンパク質、融合タンパク質、融合ポリペプチド、核酸、ベクター、またはこのようなベクターを含む宿主細胞の使用も開示する。
ブロッキング部分を含むプロテアーゼ活性化サイトカインまたはケモカインを示す模式図である。ブロッキング部分は、任意選択で血清半減期延長ドメインとして機能し得る。矢印の左側の図は、サイトカインがプロテアーゼ切断性リンカーを介しブロッキング部分に接続しており、このようにして受容体に結合するサイトカインの能力をブロックすることを示している。矢印の右側の図は、炎症または腫瘍環境において、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断してブロッキング部分を放出し、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示している。 プロテアーゼ活性化サイトカインまたはケモカインを示す模式図であり、ＨＳＡ（ブロッキング部分）が目的サイトカインまたはケモカインに直接結合しており、ＨＳＡと目的サイトカインまたはケモカインとの間にプロテアーゼ切断部位がある。矢印の左側の図は、サイトカインがプロテアーゼ切断性リンカーを介しブロッキング部分に接続しており、このようにして受容体に結合するサイトカインの能力をブロックすることを示している。矢印の右側の図は、炎症または腫瘍環境において、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断してブロッキング部分を放出し、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示している。 プロテアーゼ活性化サイトカインまたはケモカインを示す模式図であり、複数のＨＳＡ（ブロッキング部分）が目的分子に直接結合している。所望に応じて、１つ以上のＨＳＡが、リンカー（例えば、プロテアーゼ切断部位を含むリンカー）を介してサイトカインまたはケモカインに結合してもよい。矢印の左側の図は、サイトカインがプロテアーゼ切断性リンカーを介しブロッキング部分に接続しており、このようにして受容体に結合するサイトカインの能力をブロックすることを示している。矢印の右側の図は、炎症または腫瘍環境において、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断してブロッキング部分を放出し、サイトカインが受容体に結合するのを可能にすることを示している。これでサイトカインは、ネイティブのサイトカインと比較して同様のｐＫ特性（例えば、短い半減期）を有する。 同じタイプまたは異なるタイプの複数のサイトカインを含むプロテアーゼ活性化サイトカインまたはケモカインを示す模式図であり、各々がプロテアーゼ切断性リンカーを介し結合ドメインに結合している。矢印の左側の図は、サイトカインがプロテアーゼ切断性リンカーを介しブロッキング部分に接続しており、このようにして受容体に結合するサイトカインの能力をブロックすることを示している。矢印の右側の図は、炎症または腫瘍環境において、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断してブロッキング部分を放出し、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示している。 少なくとも１つのプロテアーゼ切断性リンカーによって接続されたサイトカインまたはケモカインポリペプチドと、ブロッキング部分と、血清半減期延長ドメインとを含む、プロテアーゼ活性化サイトカインまたはケモカインを示す模式図である。矢印の左側の図は、サイトカインがプロテアーゼ切断性リンカーを介しブロッキング部分に接続しており、このようにして受容体に結合するサイトカインの能力をブロックすることを示している。また、サイトカインは個別の半減期延長エレメントにも結合しており、このエレメントは血清中の半減期を延長する。矢印の右側の図は、炎症または腫瘍環境において、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断して血清半減期延長エレメント及びブロッキング部分を放出し、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示している。これでサイトカインは、ネイティブのサイトカインと比較して同様のｐＫ特性（例えば、短い半減期）を有する。 少なくとも１つのプロテアーゼ切断性リンカーによって接続されたサイトカインまたはケモカインポリペプチドと、ブロッキング部分と、標的化ドメインとを含む、プロテアーゼ活性化サイトカインまたはケモカインを示す模式図である。矢印の左側の図は、サイトカインがプロテアーゼ切断性リンカーを介しブロッキング部分及び標的化ドメインに接続しており、このようにして受容体に結合するサイトカインの能力をブロックすることを示している。矢印の右側の図は、炎症または腫瘍微小環境において、プロテアーゼがリンカー内のプロテアーゼ切断部位で切断して標的化ドメイン及びブロッキング部分を放出し、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示している。 少なくとも１つのプロテアーゼ切断性リンカーによって接続されたサイトカインまたはケモカインポリペプチドと、ブロッキング部分と、標的化ドメインと、血清半減期延長ドメインとを含む、プロテアーゼ活性化サイトカインまたはケモカインを示す模式図であり、サイトカインポリペプチド及び標的化ドメインがプロテアーゼ切断性リンカーによって接続されている。矢印の左側の図は、サイトカインまたはケモカインがプロテアーゼ切断性リンカー（複数可）を介し標的化ドメイン、ブロッキング部分、及び半減期延長エレメントに接続しており、このようにして受容体に結合するサイトカインまたはケモカインの能力をブロックすることを示している。矢印の右側の図は、炎症または腫瘍微小環境において、プロテアーゼがリンカー（複数可）上のプロテアーゼ切断部位で切断して血清半減期延長エレメント、標的化ドメイン、及びブロッキング部分を放出し、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示している。これでサイトカインは、ネイティブのサイトカインと比較して同様のｐＫ特性（例えば、短い半減期）を有する。 少なくとも１つのプロテアーゼ切断性リンカーによって接続されたサイトカインまたはケモカインポリペプチドと、ブロッキング部分と、標的化ドメインと、血清半減期延長ドメインとを含む、プロテアーゼ活性化サイトカインまたはケモカインを示す模式図である。矢印の左側の図は、サイトカインがプロテアーゼ切断性リンカー（複数可）を介し標的化ドメイン、ブロッキング部分、及び半減期延長エレメントに接続しており、このようにして受容体に結合するサイトカインの能力をブロックすることを示している。矢印の右側の図は、炎症または腫瘍微小環境において、プロテアーゼがリンカー（複数可）上のプロテアーゼ切断部位で切断して血清半減期延長エレメント及びブロッキング部分を放出し、サイトカインが受容体に結合するのを可能にすることを示している。標的化部分は結合を保ち、サイトカインを腫瘍の微小環境内に保持する。これでサイトカインは、ネイティブのサイトカインと比較して同様のｐＫ特性（例えば、短い半減期）を有する。 リンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）及びリンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）が肺細胞、腎細胞、及び肝細胞で最小限に切断されることを示すグラフを示している。 Ａ～Ｂは、組換えヒトＩＬ－２及びリンカー１（ＧＰＡＧＭＫＧＬ、配列番号１９６）、リンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）、またはリンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）の配列を含むポリペプチドが、健康な肺線維芽細胞によって処理されないことを示すグラフである。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示すグラフである。グラフはＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。増殖アッセイはＨＳＡなしで実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方をアッセイで使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示すグラフである。グラフはＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。増殖アッセイはＨＳＡありで実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方をアッセイで使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示すグラフである。グラフはＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。増殖アッセイはＨＳＡなしで実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方をアッセイで使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示すグラフである。グラフはＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。増殖アッセイはＨＳＡありで実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方をアッセイで使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示すグラフである。グラフはＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。増殖アッセイはＨＳＡなしで実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方をアッセイで使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示すグラフである。グラフはＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。増殖アッセイはＨＳＡありで実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方をアッセイで使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示すグラフである。グラフはＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。増殖アッセイはＨＳＡなしで実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方をアッセイで使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示すグラフである。グラフはＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。増殖アッセイはＨＳＡありで実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方をアッセイで使用した。 Ａ～Ｆは、ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 ＩＬ－２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ－２における例示的なＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、ＩＬ－２増殖アッセイの結果を示しており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の発光ベース細胞生存率アッセイによって定量化されている。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 タンパク質切断アッセイの結果を示している。融合タンパク質ＡＣＰ１６を、切断形態及び非切断形態の両方においてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で実行した。ゲルで分かるように、切断は完全であった。 Ａ～Ｂは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質及び組換えヒトＩＬ１２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－１２）で実施したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイの結果を示す一連のグラフである。解析は、試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（登録商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いた分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けるものである。 ４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果をＭＭＰ９による切断の前後で示しているグラフである。解析は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の試薬を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。このデータは、完全な融合タンパク質よりも切断ＩＬ１２の方が活性が大きいことを示している。試験したコンストラクトは、ＡＣＰ０６である。 ４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果をＭＭＰ９による切断の前後で示しているグラフである。解析は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の試薬を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。このデータは、完全な融合タンパク質よりも切断ＩＬ１２の方が活性が大きいことを示している。試験したコンストラクトは、ＡＣＰ０８である。 ４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果をＭＭＰ９による切断の前後で示しているグラフである。解析は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の試薬を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。このデータは、完全な融合タンパク質よりも切断ＩＬ１２の方が活性が大きいことを示している。試験したコンストラクトは、ＡＣＰ０７である。 ４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果をＭＭＰ９による切断の前後で示しているグラフである。解析は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の試薬を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。このデータは、完全な融合タンパク質よりも切断ＩＬ１２の方が活性が大きいことを示している。試験したコンストラクトは、ＡＣＰ０９である。 ４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果をＭＭＰ９による切断の前後で示しているグラフである。解析は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の試薬を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。このデータは、完全な融合タンパク質よりも切断ＩＬ１２の方が活性が大きいことを示している。試験したコンストラクトは、ＡＣＰ１０である。 ４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果をＭＭＰ９による切断の前後で示しているグラフである。解析は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の試薬を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。このデータは、完全な融合タンパク質よりも切断ＩＬ１２の方が活性が大きいことを示している。試験したコンストラクトは、ＡＣＰ１１である。 タンパク質切断アッセイの結果を示している。融合タンパク質ＡＣＰ１１を、切断形態及び非切断形態の両方においてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で実行した。ゲルで分かるように、切断は完全であった。 誘導性サイトカインタンパク質の非限定的な例を示す模式図であり、サイトカインの２つのサブユニット間に付着したリンカーがプロテアーゼ切断されたときにコンストラクトが活性化される。 ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質及び組換えヒトＩＬ１２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－１２）で実施したＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイの結果を示すグラフである。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けるものである。各増殖アッセイは、ＨＳＡあり及びＨＳＡなしで実施した。 ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質及び組換えヒトＩＬ１２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－１２）で実施したＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイの結果を示すグラフである。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けるものである。各増殖アッセイは、ＨＳＡあり及びＨＳＡなしで実施した。 ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質及び組換えヒトＩＬ１２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－１２）で実施したＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイの結果を示すグラフである。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けるものである。各増殖アッセイは、ＨＳＡあり及びＨＳＡなしで実施した。 ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質及び組換えヒトＩＬ１２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－１２）で実施したＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイの結果を示すグラフである。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けるものである。各増殖アッセイは、ＨＳＡあり及びＨＳＡなしで実施した。 Ａ～Ｆは、例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性を示す一連のグラフであり、ＷＥＨＩ ２７９細胞生存アッセイを用いてマウスＩＦＮγ対照の活性と比較している。各アッセイは、ＨＳＡを含む培地（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含まない培地（－ＨＳＡ）で実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方をアッセイで使用した。 Ａ～Ｆは、例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性を示す一連のグラフであり、Ｂ１６レポーターアッセイを用いてマウスＩＦＮγ対照の活性と比較している。各アッセイは、ＨＳＡを含む培地（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含まない培地（－ＨＳＡ）で実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方をアッセイで使用した。 Ａ～Ｂは、タンパク質切断アッセイの結果を示している。ＡＣＰ３１（ＩＦＮ－ａ融合タンパク質；Ａ）及びＡＣＰ５５（ＩＦＮ－γ融合タンパク質；Ｂ）の２つのコンストラクトを、切断形態及び非切断形態の両方においてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で実行した。ゲルで分かるように、切断は完全であった。 Ａ～Ｂは、例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性を示す一連のグラフであり、Ｂ１６レポーターアッセイを用いてマウスＩＦＮγ対照の活性と比較している。各アッセイはＨＳＡを含む培養基で実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含む。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 Ａ～Ｂは、例示的なＩＦＮα融合タンパク質の活性を示す一連のグラフであり、Ｂ１６レポーターアッセイを用いてマウスＩＦＮアルファＡ対照の活性と比較している。各アッセイはＨＳＡを含む培地で実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含む。各アッセイでは、融合タンパク質の非切断バージョン及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断バージョンの両方を使用した。 Ａ～Ｄは、ＭＣ３８細胞株を用いた腫瘍成長試験の結果を示す一連のグラフである。Ａ～Ｃは、異なる投与レベル及びスケジュール（μｇ＝マイクログラム、ＢＩＤ＝１日２回、ＢＩＷ＝週２回、ＱＷ＝週１回）を用いて腹腔内（ＩＰ）に注入した場合の、ＩＦＮγ及びＩＦＮγ融合タンパク質が腫瘍成長に及ぼす効果を示している。Ｄは、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の腫瘍内（ＩＴ）注入が腫瘍成長に及ぼす効果を示している。 Ａ～Ｂは、ＭＭＰ９プロテアーゼによって切断された例示的なＩＦＮγ融合タンパク質（ＡＣＰ５１及びＡＣＰ５２）の活性を示す一連のグラフであり、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて非切断融合タンパク質の活性と比較している。各融合タンパク質は、抗ＨＳＡ結合剤及び腫瘍標的化ドメインを含む。 Ａ～Ｂは、ＭＭＰ９プロテアーゼによって切断された例示的なＩＦＮγ融合タンパク質（ＡＣＰ５３及びＡＣＰ５４）の活性を示す一連のグラフであり、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて非切断融合タンパク質の活性と比較している。各融合タンパク質は、アルブミンと直接融合したＩＦＮγを含む。 Ａ～Ｂは、正常患者及びがん患者のヒト血清中でのリンカー１（ＧＰＡＧＭＫＧＬ、配列番号１９６）、リンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）、またはリンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）を含むＩＬ－２融合タンパク質の安定性を示す２つのグラフである。Ａは、リンカー１（ＧＰＡＧＭＫＧＬ、配列番号１９６）、リンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）、またはリンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）を含むＩＬ－２融合タンパク質の２４時間時の安定性を示している。図２４Ｂは、リンカー１（ＧＰＡＧＭＫＧＬ、配列番号１９６）、リンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）、またはリンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）を含むＩＬ－２融合タンパク質の７２時間時の安定性を示している。 ＨＳＡの存在下でのＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイにおけるＡＣＰ１６の解析を示すグラフである。 ＨＳＡの存在下でのＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイにおけるＡＣＰ１２４の解析を示すグラフである。丸はカットなしのポリペプチドの活性、四角はカットありのポリペプチドの活性、三角は対照としてのＩＬ－２単独を示している。 ＣＴＬＬ－２増殖アッセイの結果を示すグラフである。４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むまたは含まない培養基に、ＣＴＬＬ２細胞（ＡＴＣＣ）を５００，０００細胞／ウェルの濃度で懸濁させて平板培養し、３７℃及び５％ ＣＯ２で７２時間、組換えｈＩＬ２または活性化可能ｈＩＬ２の希釈系列で刺激した。非切断及び切断活性化可能ＡＣＰ１６の活性を試験した。活性ＭＭＰ９とインキュベートすることにより、切断活性化可能ｈＩＬ２が生成された。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）発光ベース細胞生存率アッセイを用いて細胞活性を評価した。三角はｗｉｌｅタイプサイトカイン、丸はインタクトな融合タンパク質、四角はプロテアーゼ切断融合タンパク質を示している。 Ａ～Ｃは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。Ａは、カットあり及びカットなしＡＣＰ１１（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質）の活性を示すグラフである。Ｂは、ＡＣＰ９１（キメラ型ＩＬ－１２融合タンパク質）の解析を示すグラフである。四角はカットなしＡＣＰ９１ポリペプチドの活性を示し、三角はカットありポリペプチド（ＡＣＰ９１＋ＭＭＰ９）の活性を示している。各々のＥＣ５０値は表に示されている。Ｃは、ＡＣＰ１３６（キメラ型ＩＬ－１２融合タンパク質）の解析を示すグラフである。四角はカットなしＡＣＰ１３６ポリペプチドの活性を示し、三角はカットありポリペプチド（ＡＣＰ１３６＋ＭＭＰ９）の活性を示している。各々のＥＣ５０値は表挿入で示されている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイにおいて切断ＩＬ－１２ポリペプチドが活性であることを示すグラフである。融合タンパク質をカットなし（丸）及びカットあり（四角）の両方で評価しており、図２７Ａでは野生型ＩＬ２を対照＋ＨＳＡとして使用している。ＡＣＰ３１＋ＨＳＡのデータが示されている。各々のＥＣ５０値は、各グラフの下の表に示されている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイにおいて切断ＩＬ－１２ポリペプチドが活性であることを示すグラフである。融合タンパク質をカットなし（丸）及びカットあり（四角）の両方で評価しており、図２７Ｂでは野生型ＩＬ２を対照＋ＨＳＡとして使用している。ＡＣＰ１２５＋ＨＳＡのデータが示されている。各々のＥＣ５０値は、各グラフの下の表に示されている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイにおいて切断ＩＬ－１２ポリペプチドが活性であることを示すグラフである。融合タンパク質をカットなし（丸）及びカットあり（四角）の両方で評価しており、図２７Ｃでは野生型ＩＬ２を対照＋ＨＳＡとして使用している。ＡＣＰ１２６＋ＨＳＡのデータが示されている。各々のＥＣ５０値は、各グラフの下の表に示されている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイにおいて切断ＩＬ－１２ポリペプチドが活性であることを示すグラフである。融合タンパク質をカットなし（丸）及びカットあり（四角）の両方で評価しており、図２７ＤではＡＣＰ１３１を対照（三角）として使用している。ＡＣＰ１２７のデータが示されている。各々のＥＣ５０値は、各グラフの下の表に示されている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイにおいて切断ＩＬ－１２ポリペプチドが活性であることを示すグラフである。融合タンパク質をカットなし（丸）及びカットあり（四角）の両方で評価しており、図２７ＥではＡＣＰ１３１を対照（三角）として使用している。ＡＣＰ１２８のデータが示されている。各々のＥＣ５０値は、各グラフの下の表に示されている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイにおいて切断ＩＬ－１２ポリペプチドが活性であることを示すグラフである。融合タンパク質をカットなし（丸）及びカットあり（四角）の両方で評価しており、図２７ＦではＡＣＰ１３１を対照（三角）として使用している。ＡＣＰ１２９のデータが示されている。各々のＥＣ５０値は、各グラフの下の表に示されている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＰＣ５６の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＰＣ５７の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＰＣ５８の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＰＣ５９の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＰＣ６０の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＰＣ６１＋ＨＳＡの活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＣＰ３０＋ＨＳＡの活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＣＰ７３の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＣＰ７０＋ＨＳＡの活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＣＰ７１の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＣＰ７２の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＣＰ７３の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＣＰ７４の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＦＮαレポーターアッセイにおけるＡＣＰ７５の活性を示すグラフである。各融合物について、カットあり（四角）及びカットなし（丸）の場合の活性を試験した。マウスＩＦＮγの解析は、比較として各グラフに含まれている。 Ａ～Ｂは、腫瘍異種移植片モデルにおけるＡＣＰ３１（マウスＩＦＮα１融合タンパク質）及びＡＣＰ１１（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質）の解析結果を示す２つのグラフである。Ａは、３３μｇ ＡＣＰ３１（丸）、１１０μｇ ＡＣＰ３１（三角）、３３０μｇ ＡＣＰ３１（菱形）、ならびに対照としての１μｇマウス野生型ＩＦＮα１（破線、四角）及び１０μｇ ｍＩＦＮα１（破線、小丸）で処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示している。ビヒクル単独は、大きな白丸によって示されている。データは、ＡＣＰ３１で処置したマウスにおいて腫瘍体積が用量依存的に経時的に減少していることを示している。Ｂは、１７．５μｇ ＡＣＰ１１（四角）、１７５μｇ ＡＣＰ３１（三角）、５２５μｇ ＡＣＰ３１（丸）、ならびに対照としての２μｇ ＡＣＰ０４（破線、三角）及び１０μｇ ＡＣＰ０４（破線、菱形）で処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示している。ビヒクル単独は、大きな白丸によって示されている。このデータは、ＡＣＰ１１及びＡＣＰ０４（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質）両方で処置したマウスにおいて用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少していることを示している。 Ａ～Ｆは、ビヒクル単独（Ａ）、２μｇ ＡＣＰ０４（Ｂ）、１０μｇ ＡＣＰ０４（Ｃ）、１７．５μｇ ＡＣＰ１１（Ｄ）、１７５μｇ ＡＣＰ１１（Ｅ）、及び５２５μｇ ＡＣＰ１１（Ｆ）で各々処置したマウス異種移植片腫瘍モデルにおける経時的な腫瘍体積を示す一連のスパゲッティプロットである。各線は各マウスを表す。 Ａ～Ｃは、腫瘍異種移植片モデルにおけるＡＣＰ１６及びＡＣＰ１２４の解析結果を示す３つのグラフを示している。Ａは、４．４μｇ ＡＣＰ１６（四角）、１７μｇ ＡＣＰ１６（三角）、７０μｇ ＡＣＰ１６（逆三角）、２３２μｇ ＡＣＰ１６（暗色丸）、ならびに比較対象としての１２μｇ野生型ＩＬ－２（破線、三角）及び３６μｇ野生型ＩＬ－２（破線、菱形）で処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示している。ビヒクル単独は、大きな白丸によって示されている。データは、高濃度のＡＣＰ１６で処置したマウスの腫瘍体積が用量依存的に経時的に減少していることを示している。Ｂは、１７μｇ ＡＣＰ１２４（四角）、７０μｇ ＡＣＰ１２４（三角）、２３０μｇ ＡＣＰ１２４（下三角）、及び７００μｇ ＡＣＰ１２４で処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示している。ビヒクル単独は、大きな白丸によって示されている。Ｃは、１７μｇ ＡＣＰ１６（三角）、７０μｇ ＡＣＰ１６（丸）、２３２μｇ ＡＣＰ１６（暗色丸）、ならびに比較対象としての１７μｇ ＡＣＰ１２４（破線、三角）、７０μｇ ＡＣＰ１２４（破線、菱形）、２３０μｇ ＡＣＰ１２４（破線、菱形）で処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示している。ビヒクル単独は濃色の逆三角形によって示されている。データは、ＡＣＰ１２４ではなくＡＣＰ１６で処置したマウスでは、腫瘍体積が用量依存的に経時的に減少することを示している。 ＭＣ３８マウス異種移植片モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のスパゲッティプロットである。プロットの各線は各マウスである。 ＭＣ３８マウス異種移植片モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のスパゲッティプロットである。プロットの各線は各マウスである。 同上。 ＭＣ３８マウス異種移植片モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のスパゲッティプロットである。プロットの各線は各マウスである。 同上。 対照マウス（白丸）及びＡＰ１６処置マウス（四角）の腫瘍成長を示すマウス異種移植片モデルの経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 切断性融合タンパク質で処置した後のマウスの経時的な生存率を示す一連の生存プロットである。Ａは、ビヒクル単独（灰色の線）、１７μｇ ＡＣＰ１６（濃色の線）、及び１μｇ ＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示している。Ｂは、ビヒクル単独（灰色の線）、７０μｇ ＡＣＰ１６（濃色の線）、及び７０μｇ ＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示している。Ｃは、ビヒクル単独（灰色の線）、２３２μｇ ＡＣＰ１６（濃色の線）、及び２３０μｇ ＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示している。Ｄは、ビヒクル単独（灰色の線）、２３２μｇ ＡＣＰ１６（濃色の線）、及び７００μｇ ＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示している。 ＭＣ３８マウス異種移植片モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のスパゲッティプロットである。全てのマウス群に合計４回用量を投与した。ただし、１週間／２回用量後に致命的毒性が検出されたＡＣＰ１３２の最高３回の投与を除く。ビヒクル単独（上）、１７、５５、７０、及び２３０μｇ ＡＣＰ１６（上段全列）、９、２８、３６、及び１１９μｇ ＡＣＰ１３２（中段全列）、１３、４２、５４、及び１７７μｇ ＡＣＰ２１（下段全列）が示されている。プロットの各線は個々の動物を表している。 同上。 ４つの細胞株におけるＦＲＥＴエンドポイントアッセイによる条件完全（＋ＦＢＳ）培地中の基質切断活性を示す模式図である。腫瘍ｖｓ対照の活性の比率は、３つの腫瘍細胞株を平均し、シグナルが検出可能な対照の筋線維芽細胞株と比較することによって概算した。図３６では、配列番号２０１、１９８、１９７、１９６、及び１９５をそれぞれ出現順に開示している。 細胞培養物中のＡＤＡＭ１７＿２基質の動態を示す模式図である。図３７では、配列番号２３５を開示している。 条件培地中のＦＡＰα＿１基質の動態を示す模式図である。図３８では、配列番号１９７を開示している。 細胞ライセート中のＦＡＰα＿１基質の動態を示す模式図である。図３９では、配列番号１９７を開示している。 細胞ライセート中のＭＭＰ９＿１基質の動態を示す模式図である。図４０では、配列番号１９６を開示している。 ＦＲＥＴエンドポイントアッセイによる細胞ライセート中の基質切断活性を示す模式図である。図４１では、配列番号１９８及び１９７をそれぞれ出現順に開示している。 細胞ライセート中のＣＴＳＬ１＿１基質の動態を示す模式図である。図４２では、配列番号１９８を開示している。 細胞ライセート中のＭＭＰ１４＿１基質の動態を示す模式図である。図４３では、配列番号１９５を開示している。 細胞培養由来試料当たりの酵素当量の計算濃度を示す模式図である。図４４では、配列番号２０１、１９８、１９７、１９６、及び１９５をそれぞれ出現順に開示している。 ＣＳＴＬ１＿２ ｖｓ ＣＴＳＬ１＿１のＣＴＳＬ１切断の酵素進行曲線を示す模式図である。図４５では、配列番号１９８、１９９、及び２３６をそれぞれ出現順に開示している。 ＣＴＳＬ１＿１（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）ｖｓ ＣＴＳＬ１＿２（ＡＬＦＦＳＳＰＰ、配列番号１９９）の３０ｍｅｒ切断を示す模式図である。 ＣＴＳＫの切断に対するＣＴＳＬ１ ＦＲＥＴ基質の感受性を示す模式図である。産物形成の速度は、単位ｐｍｏｌ分－１μｇ－１の比活性として測定した。参照基質Ｚ－ＬＲ－ＡＭＣの閾値は、破線で示されている。図４７では、配列番号１９８及び１９９をそれぞれ出現順に開示している。 ＭＭＰ９による３０ｍｅｒ基質分解を示す模式図である。相対的な分解速度による基質のランク付けを「＋」で示し、非切断基質を「－」で示す。図４８では、配列番号２０４、２０５、２１４、２１６、２０２、２１７、２０３、２１１、２１９、２０７、２１５、２１２、２１３、２０６、２０８、２０９、２１０、２１８、及び２２０をそれぞれ出現順に開示している。 ＭＭＰ９によるタンデムＭＭＰ１４＿１モチーフ分解を示す模式図である。上：基質分解のトレース、一次動態によりモデル化。下：複合的動態を示す産物形成のトレース。図４９では、配列番号２０２～２０５をそれぞれ出現順に開示している。 ＦＡＰαによる３０ｍｅｒ基質分解を示す模式図である。相対的な分解速度による基質のランク付けを「＋」で示し、非切断基質を「－」で示している。図５０では、配列番号２０５、２０４、２０６、２１７、２０３、２１８、２１９、２１３、２１６、２０７、２１４、２１０、２０２、２１１、２０８、２０９、２１２、２１５、及び２２０をそれぞれ出現順に開示している。 ＣＴＳＬ１による３０ｍｅｒ基質分解を示す模式図である。相対的な分解速度による基質のランク付けを「＋」で示し、非切断基質を「－」で示している。図５１では、配列番号２０７、２０８、２０２、２１８、２１９、２１２、２１５、２１７、２１１、２０９、２１４、２０６、２１３、２１０、２１６、２０３、２０４、２０５、及び２２０をそれぞれ出現順に開示している。 ＡＤＡＭ１７による３０ｍｅｒ基質分解を示す模式図である。相対的な分解速度による基質のランク付けを「＋」で示し、非切断基質を「－」で示している。図５２では、配列番号２０８、２０９、２１１、２１４、２１７、２１９、２１３、２１８、２１５、２１０、２１２、２１６、２０７、２０６、２０２、２０３、２０４、２０５、２２０をそれぞれ出現順に開示する。 第Ｘａ因子による３０ｍｅｒ基質分解を示す模式図である。相対的な分解速度による基質のランク付けを「＋」で示し、非切断基質を「－」で示している。図５３では、配列番号２２０、２０６、２０２、２１４、２０８、２０９、２１５、２１０、２１８、２１７、２０７、２１３、２１６、２１１、２１２、２１９、２０３、２０４、２０５をそれぞれ出現順に開示する。 トロンビンによる３０ｍｅｒ基質分解を示す模式図である。相対的な分解速度による基質のランク付けを「＋」で示し、非切断基質を「－」で示している。図５４では、配列番号２２０、２０４、２０２、２０７、２０５、２１１、２１２、２１５、２０９、２１８、２１９、２１７、２１０、２１３、２１６、２１４、２０８、２０６、及び２０３をそれぞれ出現順に開示している。 ヘプシンによる３０ｍｅｒ基質分解を示す模式図である。相対的な分解速度による基質のランク付けを「＋」で示し、非切断基質を「－」で示している。図５５では、配列番号２２０、２０９、２１６、２１５、２１０、２１３、２０６、２１４、２１２、２０７、２１７、２０８、２１１、２１８、２１９、２０２、２０３、２０４、及び２０５をそれぞれ出現順に開示している。 ＩＬ－２抗体でプロービングしたウェスタンブロットを示しており、９０％血清中のＡＣＰ１６の安定性を示している。血清はヒトドナー３例からプールした。目的コンストラクトをＰＢＳ、血清、またはＭＭＰ９プロテアーゼとインキュベートし、Ｔ＝０時間時及びＴ＝２４時間時に切断を評価した。 ＩＬ－２抗体でプロービングしたウェスタンブロットを示しており、９０％血清中のＡＣＰ１５３の安定性を示している。血清はヒトドナー３例からプールした。目的コンストラクトをＰＢＳ、血清、またはＭＭＰ９プロテアーゼとインキュベートし、Ｔ＝０時間時及びＴ＝２４時間時に切断を評価した。 ＩＬ－２抗体でプロービングしたウェスタンブロットを示しており、９０％血清中のＡＣＰ１５７の安定性を示している。血清はヒトドナー３例からプールした。目的コンストラクトをＰＢＳ、血清、またはＭＭＰ９プロテアーゼとインキュベートし、Ｔ＝０時間時及びＴ＝２４時間時に切断を評価した。 ＩＬ－２抗体を用いたウェスタンブロットを示しており、ＡＣＰ１５３、ＡＣＰ１５５、ＡＣＰ１５６、ＡＣＰ１６、及びＡＣＰ３７２が９０％血清中で安定していることを示している。血清はヒトドナー３例からプールした。目的コンストラクトをＰＢＳ、血清、またはＭＭＰ９プロテアーゼとインキュベートし、Ｔ＝２４時間時及びＴ＝７２時間時に切断を評価した。図５７Ａはヒトの血清を用いた場合の結果を示している。 ＩＬ－２抗体を用いたウェスタンブロットを示しており、ＡＣＰ１５３、ＡＣＰ１５５、ＡＣＰ１５６、ＡＣＰ１６、及びＡＣＰ３７２が９０％血清中で安定していることを示している。血清はヒトドナー３例からプールした。目的コンストラクトをＰＢＳ、血清、またはＭＭＰ９プロテアーゼとインキュベートし、Ｔ＝２４時間時及びＴ＝７２時間時に切断を評価した。図５７Ｂはマウスの血清を用いた場合の結果を示している。 ＭＣ３８マウス異種移植片モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のスパゲッティプロットを示している。ビヒクル単独（図５８Ａ、上）、１７、５５、及び２３０μｇ ＡＣＰ１６（図５８Ａ）が示されている。プロットの各線は個々の動物を表している。 ＭＣ３８マウス異種移植片モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のスパゲッティプロットを示している。５５及び２３０μｇ ＡＣＰ１５３が示されている。プロットの各線は個々の動物を表している。 ＭＣ３８マウス異種移植片モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のスパゲッティプロットを示している。５５及び２３０μｇ ＡＣＰ１５５が示されている。プロットの各線は個々の動物を表している。 ＭＣ３８マウス異種移植片モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のスパゲッティプロットを示している。５５及び２３０μｇ ＡＣＰ１５６が示されている。プロットの各線は個々の動物を表している。 ＩＬ－２融合タンパク質及び組換えヒトＩＬ２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－２）に対し実施したＳＴＡＴ活性化レポーターアッセイの結果を示すグラフを示している。解析は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の試薬を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。 ＩＬ－２融合タンパク質及び組換えヒトＩＬ２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－２）に対し実施したＳＴＡＴ活性化レポーターアッセイの結果を示すグラフを示している。解析は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の試薬を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。 ＩＬ－２融合タンパク質及び組換えヒトＩＬ２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－２）に対し実施したＳＴＡＴ活性化レポーターアッセイの結果を示すグラフを示している。解析は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の試薬を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。 ＩＬ－２融合タンパク質及び組換えヒトＩＬ２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－２）に対し実施したＳＴＡＴ活性化レポーターアッセイの結果を示すグラフを示している。解析は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の試薬を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化に基づいて実施した。 同上。 本明細書に記載の操作された切断基質、及び関連するプロテアーゼを用いて観察された切断の程度を報告する表を示している。フランキング配列は小文字、第１の切断性配列は下線、第２の切断性配列は太字フォント、第３の切断性配列はイタリック体で示されている。場合によっては切断性配列間にはオーバーラップが存在し、それに応じて示される。図６３では、配列番号２０２～２２０をそれぞれ出現順に開示している。 同上。 誘導性四価抗体の形式の模式図である。 Ａ～Ｂは、多価４－１ＢＢ抗体が誘導可能に４－１ＢＢを刺激できることを示している。
本開示は、新規の分離部分またはリンカーと、リンカーを含むポリペプチド（例えば、融合タンパク質）とに関する。リンカーは、好ましくはプロテアーゼ切断性であり、第１の目的アミノ酸配列（例えば第１の目的ドメイン）を第２の目的アミノ酸配列（例えば第２の目的ドメイン）に結合させる。
本開示の分離部分は、付着したペイロード（単数または複数）の作用に対し部位選択性を付与する。ペイロードは、治療薬剤、半減期延長剤、ブロッキング剤など、またはこれらの任意の組合せであり得る。分離部分を使用して、任意の目的ペイロード（例えば、サイトカイン、抗体、細胞ベース治療薬などを含む）に付着させることができる。分離部分は個別に使用してもよく、または分離部分が約１００アミノ酸よりも小さい限りは、タンデム、三重、四重などで使用してもよい。個々の分離部分は、互いに直接連結していてもよく、非切断性リンカーが散在してもよく、いずれであっても高効率及び部位特異性を促進する。
本開示の様々な実施形態を、以下の段落でさらに詳細に説明する。
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての専門用語、表記、及びその他の科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解する意味を有するように意図されている。場合によっては、一般的に理解されている意味を有する用語が、明快性及び／または容易な参照のために本明細書で定義されており、このような定義を本明細書に含めることは、必ずしも、当技術分野で一般的に理解されている内容との相違を表すものと解釈されるべきではない。本明細書に記載または参照されている技術及び手順は、当業者が概して十分に理解し、従来的な方法論を用いて一般的に採用しているものである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。適宜、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順は、概して、別段の記載がない限り、製造業者が定義するプロトコル及び条件に従って行われる。
「サイトカイン」は周知された専門用語であり、細胞、特に免疫系細胞によって分泌され、免疫系調節物質である、任意のクラスの免疫調節タンパク質（例えば、インターロイキンまたはインターフェロンなど）を指す。本明細書で開示する融合タンパク質で使用できるサイトカインポリペプチドとしてとしては、限定されるものではないが、形質転換成長因子、例えばＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）；インターフェロン、例えば、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、インターフェロン－カッパ、及びインターフェロン－オメガ；インターロイキン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２５；腫瘍壊死因子、例えば腫瘍壊死因子アルファ及びリンホトキシン；形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦベータ）ファミリータンパク質、ケモカイン（例えば、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）、ならびにサイトカインの同族受容体を活性化するこのようなポリペプチドのフラグメント（すなわち、前述の機能的フラグメント）が挙げられる。「ケモカイン」とは、付近の応答性細胞に指示された走化性を誘導する能力を有する任意の小型サイトカインのファミリーを指す技術用語である。
サイトカインは血清中半減期が短いことが周知されており、その半減期はわずか数分であることが多い。血清中の半減期を延長しつつ受容体アゴニスト活性を保持するように意図されたアミノ酸配列の変更を有するサイトカイン形態であっても、典型的には、血清中半減期は同様に短い。本明細書で使用する場合、「短期半減期サイトカイン」とは、対象の血清中を循環する半減期が実質的に短いサイトカイン、例えば、血清半減期が１０分未満、１５分未満、３０分未満、６０分未満、９０分未満、１２０分未満、２４０分未満、または４８０分未満のサイトカインを指す。本明細書で使用する場合、短期半減期サイトカインには、対象の体内で通常よりも長い半減期を達成するために配列が修飾されていないサイトカインと、血清中の半減期を延長しつつ受容体アゴニスト活性を保持するように意図されたアミノ酸配列の変更を有するポリペプチドとが含まれる。この後者の事例は、異種タンパク質ドメイン、例えば真正な半減期延長エレメント、例えば血清アルブミンの追加を含むことは意図されていない。
本明細書で使用する場合、「保存的」アミノ酸置換とは、概して、ペプチドの構造を変化させ得るがペプチドの生物学的活性は実質的に維持されるように、あるアミノ酸残基を認識された群内の別のアミノ酸で置換することを指す。アミノ酸の保存的置換は、当業者に知られている。アミノ酸の保存的置換は、限定されるものではないが、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換を挙げることができる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。例えば、当業者であれば、単独で、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、スレオニンをセリンで置き換え、または同様にあるアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で置き換えても、得られる分子の生物学的活性に大きな影響を及ぼさないことを合理的に予想する。
「ソルターゼ」とは、標的タンパク質またはペプチドに埋め込まれたまたは末端に付着したカルボキシル末端選別シグナルを認識及び切断することによってタンパク質を修飾するトランスペプチダーゼである。ソルターゼＡは、標的タンパク質上のＴｈｒ残基及びＧｌｙ残基の間にあるＬＰＸＴＧモチーフ（Ｘは任意の標準的なアミノ酸である）（配列番号２３７）の切断を触媒し、酵素上でのＴｈｒ残基と活性部位Ｃｙｓ残基との一時的付着により、酵素－チオアシル中間体を形成する。ペプチド転移を完了しペプチド－単量体結合体を作出するには、Ｎ末端に求核性基を有する生体分子（典型的にはオリゴグリシンモチーフ）が中間体を攻撃し、ソルターゼＡを置換して２つの分子を連結する。
本明細書で使用する場合、「立体的ブロッカー」という用語は、リンカーなどの他の部分を介し、例えばキメラ型ポリペプチド（融合タンパク質）の形態で、直接的または間接的にサイトカインポリペプチドに共有結合することができ、ただし他の場合にはサイトカインポリペプチドに共有結合しない、ポリペプチドまたはポリペプチド部分を指す。立体的ブロッカーは、例えば、静電結合、疎水結合、イオン結合、または水素結合により、サイトカインポリペプチドに非共有結合することができる。立体的ブロッカーは、サイトカイン部位への近位性及び比較上のサイズのため、典型的にはサイトカイン部分の活性を阻害またはブロックする。
本明細書では、「半減期延長エレメント」とは、例えば、サイズ（例えば、腎臓濾過カットオフを上回るように）、形状、流体力学的半径、電荷、または吸収、体内分布、代謝、及び消失のパラメーターを変更することにより、血清半減期を増加させｐＫを改善するキメラ型ポリペプチドの一部である。
本明細書で使用する場合、「分離部分」または「リンカー」という用語は、連続するポリペプチド鎖内で、第１の目的アミノ酸配列（例えば、フォールディングして第１のタンパク質ドメインを形成するアミノ酸配列）を第２の目的アミノ酸配列（例えば、フォールディングして第２のタンパク質ドメインを形成するアミノ酸配列）に接続または結合する、典型的には約１００アミノ酸未満のアミノ酸配列を指す。分離部分またはリンカーは、典型的には１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含むため、プロテアーゼ切断性である。「タンデムリンカー」とは、同一または異なるプロテアーゼによって切断され得る２つ以上のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーを指す。タンデムリンカーは任意の所望の方向で配置させることができ、例えば、一方の切断部位が他方の切断部位に隣接しても、一方の切断部位が他方の切断部位に重なっても、２つの切断部位間に介在するアミノ酸によって一方の切断部位の後に他方の切断部位が続いてもよい。
本明細書で使用する場合、「活性化可能」、「活性化する」、「誘導する」、「誘導性」という用語は、結合体の一部であるタンパク質、すなわちサイトカインにおける、結合体から追加のエレメントが切断されたときに受容体に結合し活性を発揮する能力を指す。
本明細書で使用する場合、「プラスミド」または「ウイルスベクター」は、本開示の核酸を分解なしで細胞内に輸送する作用物質であり、送達された細胞内で核酸分子及び／またはポリペプチドを発現させるプロモーターがこれに含まれる。
本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、大まかにはペプチド結合によって結合する２つ以上のアミノ酸を意味するように使用される。またタンパク質、ペプチド、及びポリペプチドは、本明細書ではアミノ酸配列を指すためにも交換可能に使用される。認識されたいのは、ポリペプチドという用語が、本明細書では当該分子を構成する特定のサイズまたは数のアミノ酸を示唆するためには使用されないこと、及び本発明のペプチドが、最大数個のアミノ酸残基またはそれ以上を含み得ることである。
全体において使用する場合、「対象」とは、脊椎動物、より具体的には哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、及びモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び任意の他の動物とすることができる。当該用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、雄か雌かにかかわらず、成体及び新生仔の対象が網羅されるように意図されている。
本明細書で使用する場合、「患者」または「対象」は交換可能に使用され得、疾患または障害（例えば、がん）を有する対象を指し得る。患者または対象という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。
本明細書で使用する場合、「治療」、「治療する」、「治療すること」という用語、または文法的に関連する用語は、疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症状の影響を低減する方法を指す。したがって、本開示の方法において、治療とは、確立された疾患もしくは状態の重症度、または疾患もしくは状態の症状を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または実質的に完全に低減することを指し得る。例えば、疾患を治療するための方法は、対象の疾患の１つ以上の症状が、対照と比較して１０％低減する場合、治療であると見なされる。したがって、この低減は、ネイティブまたは対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％～１００％の間の任意の低減パーセントであり得る。当技術分野では、治療が、必ずしも疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な消失を指すわけではないことが十分に理解されている。望ましい治療効果としては、限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行速度の低減、疾患状態の回復または一時緩和、及び寛解または予後の改善が挙げられる。
本明細書で使用する場合、疾患または障害を「防止する」、「防止すること」、及びその「防止」という用語は、対象が疾患もしくは障害の１つ以上の症状を示し始める前に、または示し始めるのとほぼ同時に生じる、疾患または障害の１つ以上の症状の発症または増悪を阻害または遅延させる行為、例えば、キメラ型ポリペプチドまたはキメラ型ポリペプチドをコードする核酸配列の投与を指す。
本明細書で使用する場合、「減少させる」、「低減する」、または「阻害する」についての言及は、好適な対照レベルと比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上の変化を含む。このような用語は、機能または特性（例えば、アゴニスト活性）の完全な消失を含むこともあるが、必ずしも含むわけではない。
「減弱したサイトカイン受容体アゴニスト」とは、サイトカイン受容体の天然由来のアゴニストと比較して、受容体アゴニスト活性が減少したサイトカイン受容体アゴニストである。減弱したサイトカインアゴニストは、受容体の天然アゴニストと比較して、少なくとも約１０×、少なくとも約５０×、少なくとも約１００×、少なくとも約２５０×、少なくとも約５００×、少なくとも約１０００×、またはそれ以下のアゴニスト活性を有し得る。本明細書に記載のサイトカインポリペプチドを含む融合タンパク質が「減弱している」または「減弱した活性」を有すると表現される場合、当該融合タンパク質が減弱しているサイトカイン受容体アゴニストであることを意味する。
「インタクトな融合タンパク質」とは、例えばプロテアーゼによる切断によって、融合タンパク質からドメインが除去されていない融合タンパク質である。ドメインは、プロテアーゼ切断または他の酵素活性によって除去可能であるが、融合タンパク質が「インタクト」である場合、これは生じていない。
本明細書で使用する場合、「部分」とは、分子内で特徴的な機能を有する分子の一部を指し、その機能は、別の分子の文脈で当該部分によって実施され得る。部分は、特定の機能を有する化学的実体、または特定の機能を有する生物学的分子の一部であり得る。例えば、融合タンパク質内の「ブロッキング部分」とは、融合ポリペプチドの一部または全部の活性をブロックすることが可能な融合タンパク質の一部である。これは、タンパク質ドメイン（例えば、血清アルブミン）であってもよい。
Ａ．分離部分またはリンカー
本開示は、新規のプロテアーゼ切断性分離部分に関する。本明細書に記載のように、プロテアーゼ切断性分離部分は、所望の位置のプロテアーゼ（例えば、腫瘍微小環境で選択的に発現するまたは高レベルで発現するプロテアーゼ）によって高効率で切断され、ただし他の位置（例えば周辺部、例えば健常組織または血清）では安定性であり切断されないまたは低効率で切断されるように設計された。
プロテアーゼ切断性分離部分は、標的適応症における発現（例えば、特定のタイプの腫瘍（例えば、大腸癌、肺癌、乳癌、黒色腫）における発現）に基づき、分離部分を切断するのに適したプロテアーゼを優先順位付けすることを含むプロセスを用いて設計された。標的適応症におけるプロテアーゼの発現増加または特異的発現に関する複数のデータソース（ｍＲＮＡ、プロテオミクス、及び組織染色データを含む）を使用した。また、プロテアーゼを、その比活性及び固有の特異性に基づいて優先順位付けし、高い比活性及び高い固有の活性を好ましいものとした。血清中での安定性は重要な設計の考慮事項であり、血清プロテアーゼによる分離部分のオフターゲット切断の潜在可能性を回避するため、基質中のアルギニンに依存しないプロテアーゼを選択した。これは、多くのオフターゲット酵素がアルギニン残基に対し活性であるためである。
設計プロセスにおける開始配列は、多様なペプチドライブラリーをプロテアーゼの基質として用いて選択し、プロテアーゼ切断産物を質量分析で検出して、各候補プロテアーゼに好ましい配列モチーフを同定した。選択された初期モチーフに対し、候補プロテアーゼに好ましい配列モチーフに調整した新たなペプチドライブラリーを設計し、作出し、解析した。また、ペプチドモチーフは、血清プロテアーゼのトロンビン及び第Ｘａ因子による切断、ならびに肝／腎プロテアーゼのヘプシンによる切断についてもカウンタースクリーニングした。このプロセスにより、ある特定の腫瘍関連プロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）、ＭＭＰ１４、及び／またはカテプシンＬ）によって高効率で切断され、ただし血清または正常な健常組織中では安定している（切断されない、または低効率で切断される）（例えば、トロンビン、第Ｘａ因子、及びヘプシンなどにより）、配列モチーフを含むペプチドが得られた。本明細書で開示する分離部分は、ヒト腫瘍による効率的な切断であり、正常な組織または血清による最小限の切断である。
本開示は、第１の目的アミノ酸配列（例えば、第１の目的ドメイン）を第２の目的アミノ酸配列（例えば、第２の目的ドメイン）に接続する分離部分またはリンカーに関する。典型的には、第１の目的アミノ酸配列及び第２の目的アミノ酸配列が、天然タンパク質中で一緒に見出されることはない。例えば、分離部分は、融合タンパク質の第１の目的ドメイン及び第２の目的ドメインを接続または結合することができる。分離部分は、任意の好適な長さとすることができるアミノ酸配列であり、好ましくはプロテアーゼによって切断することができる。
本明細書で開示する分離部分は、柔軟性及び切断される能力を含めた機能性を付与することができる。フレキシブルリンカーは、通常、連結したドメインがある程度の動きまたは相互作用を必要とする際に適用される。切断性リンカーは、遊離した機能的なドメインをｉｎ ｖｉｖｏで標的部位に放出するために導入する。本明細書で開示する分離部分は、少なくとも２つの目的ドメインを接続する機能を果たす。分離部分は、協同的なドメイン間相互作用または生物学的活性の保持を維持することができる。分離部分は、標的部位（例えば、腫瘍微小環境）で分離部分から放出される機能的ドメイン（例えば、ペイロード及び半減期延長エレメント）を連結することができる。
好ましい実施形態において、分離部分は、切断作用物質、例えば酵素によって切断性である。好ましくは、分離部分はプロテアーゼ切断部位を含む。場合によっては、分離部分は１つ以上の切断部位を含む。分離部分は、単一のプロテアーゼ切断部位を含み得る。また、分離部分は、２つ以上のプロテアーゼ切断部位も含み得る。例えば、２つの切断部位、３つの切断部位、４つの切断部位、５つの切断部位、またはそれ以上の切断部位を含み得る。分離部分が２つ以上のプロテアーゼ切断部位を含む場合、切断部位は同じプロテアーゼによって切断されることも、異なるプロテアーゼで切断されることもある。２つ以上の切断部位を含む分離部分は、「タンデムリンカー」と称される。２つ以上の切断部位は、任意の所望の方向（限定されるものではないが、一方の切断部位が他方の切断部位に隣接する場合、一方の切断部位が他方の切断部位に重なる場合、または２つの切断部位間に介在するアミノ酸によって一方の切断部位が他方の切断部位に続く場合を含む）に配置することができる。
本発明で特に対象となるのは、疾患特異的なプロテアーゼ切断性リンカーである。また、プロテアーゼ切断性リンカーは、末梢循環に比べて、腫瘍微小環境などの体内の所望の場所で優先的に切断されることが好ましい。例えば、プロテアーゼ切断性リンカーが腫瘍微小環境で切断される速度は、体内の所望の位置（例えば腫瘍微小環境）において末梢循環内（例えば、血漿中）と比較して少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１０，０００倍速い可能性がある。
疾患細胞または組織に関連することが知られているプロテアーゼとしては、限定されるものではないが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンＢ。カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫｌ、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメライシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ。アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒｌ－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグメイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰα）、ジペプチジルペプチダーゼ、メプリン、グランザイム、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられる。リンカーアミノ酸配列を切断可能なプロテアーゼ（本明細書で提供するキメラ型核酸配列によってコードされ得る）は、例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、ディスインテグリン・メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、腫瘍細胞表面プロテアーゼ、及びエラスターゼからなる群より選択することができる。ＭＭＰは、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１４（ＭＭＰ１４）であり得る。加えて、または代替的に、リンカーは、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、及び／またはカテプシンＬ）によって切断され得る。好ましくは、リンカーは、ＭＭＰ１４またはカテプシンＬによって切断され得る。
リンカーの切断に有用な、及び本明細書で開示する方法で使用するためのプロテアーゼを表１に示し、例示的なプロテアーゼ及びその切断部位を表１ａに示す。
Figure 2022532217000002
Figure 2022532217000003
Figure 2022532217000004
Figure 2022532217000005
例示的なプロテアーゼリンカーとしては、限定されるものではないが、カリクレイン切断性リンカー、トロンビン切断性リンカー、キマーゼ切断性リンカー、カルボキシペプチダーゼＡ切断性リンカー、カテプシン切断性リンカー、エラスターゼ切断性リンカー、ＦＡＰ切断性リンカー、ＡＤＡＭ切断性リンカー、ＰＲ－３切断性リンカー、グランザイムＭ切断性リンカー、カルパイン切断性リンカー、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断性リンカー、プラスミノーゲン活性化因子切断性リンカー、カスパーゼ切断性リンカー、トリプターゼ切断性リンカー、または腫瘍細胞表面プロテアーゼが挙げられる。具体的には、ＭＭＰ９切断性リンカー、ＡＤＡＭ切断性リンカー、ＣＴＳＬ１切断性リンカー、ＦＡＰα切断性リンカー、カテプシン切断性リンカーである。好ましいプロテアーゼ切断性リンカーは、ＭＭＰ及び／またはカテプシンによって切断される。
本明細書で開示する分離部分は、典型的には１００アミノ酸未満である。このような分離部分は、異なる長さであり得、例えば、１アミノ酸（例えばＧｌｙ）～３０アミノ酸、１アミノ酸～４０アミノ酸、１アミノ酸～５０アミノ酸、１アミノ酸～６０アミノ酸、１アミノ酸～７０アミノ酸、１アミノ酸～８０アミノ酸、１アミノ酸～９０アミノ酸、１アミノ酸～１００アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーの長さは、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００アミノ酸である。好ましいリンカーは、典型的には約５アミノ酸～約３０アミノ酸である。
好ましくは、リンカーの長さは２～３０アミノ酸で変動し、リンカーが結合したドメインの立体構造または相互作用にいかなる制約も与えないように、各条件に対し最適化される。
いくつかの実施形態において、分離部分は、配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）；ＧＰＡＧＭＫＧＬ（配列番号１９６）；ＰＧＧＰＡＧＩＧ（配列番号１９７）；ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）；ＡＬＦＦＳＳＰＰ（配列番号１９９）；ＬＡＱＲＬＲＳＳ（配列番号２００）；ＬＡＱＫＬＫＳＳ（配列番号２０１）；ＧＡＬＦＫＳＳＦＰＳＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＳＧＫＧＧＳＧＫ（配列番号２０２）；ＲＧＳＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＳＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＳＧＫ（配列番号２０３）；ＫＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＰＡＧＬＹＡＱＧＰＡＧＬＹＡＱＧＳＲ（配列番号２０４）；ＲＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＫ（配列番号２０５）；ＫＧＧＡＬＦＫＳＳＦＰＧＧＰＡＧＩＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＳ（配列番号２０６）；ＳＧＧＰＧＧＰＡＧＩＧＡＬＦＫＳＳＦＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＧ（配列番号２０７）；ＲＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＡＬＦＫＳＳＦＰＧＧＰＡＧＩＧＧＧＧＫ（配列番号２０８）；ＧＧＧＡＬＦＫＳＳＦＰＬＡＱＫＬＫＳＳＰＧＧＰＡＧＩＧＧＧＲ（配列番号２０９）；ＲＧＰＧＧＰＡＧＩＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＡＬＦＫＳＳＦＰＧＧＧ（配列番号２１０）；ＲＧＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＰＧＧＰＡＧＩＧＡＬＦＫＳＳＦＰＧＫ（配列番号２１１）；ＲＳＧＧＰＡＧＬＹＡＱＡＬＦＫＳＳＦＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＧ（配列番号２１２）；ＧＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＡＬＦＫＳＳＦＰＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＲ（配列番号２１３）；ＧＧＡＬＦＫＳＳＦＰＧＰＡＧＬＹＡＱＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＫ（配列番号２１４）；ＲＧＧＡＬＦＫＳＳＦＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＫ（配列番号２１５）；ＲＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＰＬＡＱＫＬＫＳＳＡＬＦＫＳＳＦＰＧＧ（配列番号２１６）；ＳＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＰＡＧＬＹＡＱＡＬＦＫＳＳＦＰＧＳＫ（配列番号２１７）；ＫＧＧＰＧＧＰＡＧＩＧＰＬＡＱＲＬＲＳＳＡＬＦＫＳＳＦＰＧＲ（配列番号２１８）；ＫＳＧＰＧＧＰＡＧＩＧＡＬＦＦＳＳＰＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＲ（配列番号２１９）；またはＳＧＧＦＰＲＳＧＧＳＦＮＰＲＴＦＧＳＫＲＫＲＲＧＳＲＧＧＧＧ（配列番号２２０）を含む。
ある特定の好ましい分離部分は、配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）を含む。本明細書で開示する分離部分は、同じまたは異なる１つ以上の切断モチーフまたは機能的バリアントを含み得る。分離部分は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の切断モチーフまたは機能的バリアントを含み得る。３０アミノ酸を含む分離部分は、２つの切断モチーフまたは機能的バリアント、３つの切断モチーフまたは機能的バリアント、またはそれ以上を含み得る。分離部分の「機能的バリアント」は、標的部位（例えば、高レベルのプロテアーゼを発現する腫瘍微小環境）で高効率で切断される能力を保持し、周辺部（例えば、血清）では切断されないまたは低効率で切断される。例えば、機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０のいずれか１つを含む分離部分の切断効率の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９５％、または以上を保持する。
複数の切断モチーフを含む分離部分は、配列番号１９５～２０１及びその組合せから選択することができる。複数の切断モチーフを含む好ましい分離部分は、配列番号２０２～２２０から選択されるアミノ酸を含む。
分離部分は、ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）及びＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の両方を含み得る。分離部分は、各々が配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）を有する２つの切断モチーフを含み得る。代替的または追加的に、分離部分は、各々が配列ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）を有する２つの切断モチーフを含み得る。分離部分は、同じまたは異なる第３の切断モチーフを含み得る。
いくつかの実施形態において、分離部分は、配列番号１９５～２２０の全長にわたって配列番号１９５～２２０に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
また、本開示は、配列番号１９５～２２０を含む分離部分の機能的バリアントにも関する。配列番号１９５～２２０を含む分離部分の機能的バリアントは、概して配列番号１９５～２２０に対し１個または数個のアミノ酸（置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組合せを含む）が異なり、プロテアーゼによって切断される能力を実質的に保持する。
機能的なバリアントは、配列番号１９５～２２０を含む分離部分に対し、少なくとも１個以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含み得る。機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０を含む分離部分と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸変化を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０を含む分離部分に対し１０個未満、８個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、または１個のアミノ酸変化（例えば、アミノ酸の置換または欠失）が異なる。他の実施形態において、機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸置換は、保存的置換であっても非保存的置換であってもよいが、好ましくは保存的置換である。
他の実施形態において、分離部分の機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０を含む分離部分と比較して、１、２、３、４、または５個、またはそれ以上の非保存的アミノ酸置換を含み得る。非保存的アミノ酸置換は、当業者であれば認識することができるであろう。分離部分の機能的バリアントは、好ましくは、１、２、３、４、または５個以下のアミノ酸欠失を含む。
分離部分において開示するアミノ酸配列は、被切断（ｓｉｓｓｉｌｅ）結合に対する分離部分内の相対的な線形位置によって説明することができる。当業者であれば十分に理解できるであろうが、８つのアミノ酸プロテアーゼ基質（例えば、配列番号１９５～２０１）を含む分離部分は、位置Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’にアミノ酸を含み、被切断結合はＰ１とＰ１’との間にある。例えば、配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）を含む分離部分のアミノ酸位置は、以下のように記載することができる。
Figure 2022532217000006
配列ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）を含む分離部分のアミノ酸位置は、以下のように記載することができる。
Figure 2022532217000007
好ましくは、切断部位を囲むアミノ酸（例えば、配列番号１９５～２０１の位置Ｐ１及びＰ１’）は置換されていない。
実施形態において、分離部分は、配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）もしくはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）、または配列番号１９５の機能的バリアントもしくは配列番号１９８の機能的バリアントを含む。本明細書に記載のように、ＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントは、１個以上のアミノ酸置換を含み、プロテアーゼによって切断される能力を実質的に保持することができる。具体的には、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントはＭＭＰ１４によって切断され、ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントはカテプシンＬ（ＣＴＳＬ１）によって切断される。また、機能的バリアントは、標的部位（例えば、高レベルのプロテアーゼを発現する腫瘍微小環境）で高効率で切断される能力も保持する。例えば、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントは、それぞれアミノ酸配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）を含む分離部分の切断効率を、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９５％、またはそれ以上保持する。
好ましくは、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントは、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）と比較して、１、２、３、４、または５個以下の保存的アミノ酸置換を含む。好ましくは、位置Ｐ１及びＰ１’のアミノ酸は置換されていない。配列番号１９５の位置Ｐ１及びＰ１’のアミノ酸はＧ及びＬであり、配列番号１９８の位置Ｐ１及びＰ１’のアミノ酸はＫ及びＳである。
ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントは、好ましくは以下の１つ以上を含み得る：ａ）位置Ｐ４のアルギニンのアミノ酸置換、ｂ）位置Ｐ３のロイシン、バリン、アスパラギン、もしくはプロリンのアミノ酸置換、ｃ）位置Ｐ２のアスパラギンのアミノ酸置換、ｄ）位置Ｐ１のヒスチジン、アスパラギン、もしくはグリシンのアミノ酸置換、ｅ）位置Ｐ１’のアスパラギン、イソロイシン、もしくはロイシンのアミノ酸置換、ｆ）位置Ｐ２’のチロシンもしくはアルギニンのアミノ酸置換、ｇ）位置Ｐ３’のグリシン、アルギニン、もしくはアラニンのアミノ酸置換、またはｈ）位置Ｐ４’のセリン、グルタミン、もしくはリジンのアミノ酸置換。ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントにおいては、以下のアミノ酸置換が好まれない：ａ）位置Ｐ３のアルギニンまたはイソロイシン、ｂ）位置Ｐ２のアラニン、ｃ）位置Ｐ１のバリン、ｄ）位置Ｐ１’のアルギニン、グリシン、アスパラギン、またはスレオニン、ｅ）位置Ｐ２’のアスパラギン酸またはグルタミン酸、ｆ）位置Ｐ３’のイソロイシン、ｇ）位置Ｐ４’のバリン。いくつかの実施形態において、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントは、位置Ｐ１及び／またはＰ１’のアミノ酸置換を含まない。
ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントのアミノ酸置換は、好ましくは、位置Ｐ４及び／またはＰ４’のアミノ酸置換を含む。例えば、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントは、位置Ｐ４にロイシン、または位置Ｐ４にセリン、グルタミン、リジン、またはフェニルアラニンを含み得る。代替的または追加的に、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントは、位置Ｐ４’にグリシン、フェニルアラニン、またはプロリンを含み得る。
いくつかの実施形態において、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の位置Ｐ２またはＰ２’のアミノ酸置換は好ましくない。
いくつかの実施形態において、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントは、配列番号２５８～３３１から選択されるアミノ酸配列を含む。ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の具体的な機能的バリアントとしては、ＧＰＬＧＬＹＡＱ（配列番号２９５）及びＧＰＡＧＬＫＧＡ（配列番号２８５）が挙げられる。
ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントは、好ましくは疎水性アミノ酸置換を含む。ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントは、好ましくは以下の１つ以上を含み得る：（ａ）位置Ｐ４のリジン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、ロイシン、プロリン、またはフェニルアラニン；（ｂ）位置Ｐ３のリジン、ヒスチジン、グリシン、プロリン、アスパラギン、フェニルアラニン、（ｃ）位置Ｐ２のアルギニン、ロイシン、アラニン、グルタミン、またはヒスタチン；（ｄ）位置Ｐ１のフェニルアラニン、ヒスチジン、スレオニン、アラニン、またはグルタミン；（ｅ）位置Ｐ１’のヒスチジン、ロイシン、リジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、フェニルアラニン、アスパラギン、グルタミン酸、またはグリシン；（ｆ）位置Ｐ２’のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アラニン、グルタミン、またはプロリン；（ｇ）位置Ｐ３’のフェニルアラニン、ロイシン、グリシン、セリン、バリン、ヒスチジン、アラニン、またはアスパラギン；及びフェニルアラニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、セリン、バリン、グルタミン、リジン、またはロイシン。
配列番号１９８の機能的バリアントにアスパラギン酸及び／またはグルタミン酸が含まれることは概して好まれず、回避される。ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントにおいては、以下のアミノ酸置換も好まれない：（ａ）位置Ｐ３のアラニン、セリン、またはグルタミン酸；（ｂ）位置Ｐ２のプロリン、スレオニン、グリシン、またはアスパラギン酸；（ｃ）位置Ｐ１のプロリン；（ｄ）位置Ｐ１’のプロリン；（ｅ）位置Ｐ２’のグリシン；（ｆ）位置Ｐ３’のリジンまたはグルタミン酸、（ｇ）位置Ｐ４’のアスパラギン酸。
ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントのアミノ酸置換は、好ましくは位置Ｐ４及び／またはＰ１のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントの位置Ｐ４’のアミノ酸置換は好ましくない。
いくつかの実施形態において、ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントは、配列番号３３２～４０８から選択されるアミノ酸配列を含む。ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の具体的な機能的バリアントとしては、ＡＬＦＦＳＳＰＰ（配列番号１９９）、ＡＬＦＫＳＦＰＰ（配列番号３８１）、ＡＬＦＫＳＬＰＰ（配列番号３８２）、ＡＬＦＫＨＳＰＰ（配列番号３７０）、ＡＬＦＫＳＩＰＰ（配列番号３８３）、ＡＬＦＫＳＳＬＰ（配列番号３９０）、またはＳＰＦＲＳＳＲＱ（配列番号３３３）が挙げられる。
本明細書で開示する分離部分は、分離部分が結合するアミノ酸配列（例えばドメイン）と共に生理的条件下で安定した複合体を形成することができ、その一方でプロテアーゼによって切断可能である。例えば、分離部分は、循環内では安定しており（例えば、切断されないまたは低効率で切断される）、標的部位（すなわち、腫瘍微小環境）では高効率で切断される。したがって、本明細書で開示するリンカーを含む融合ポリペプチドは、所望の場合、別々の分子実体としての融合ポリペプチドの成分と比較して循環半減期が延長し、及び／または循環内での生物学的活性が低下する。さらに、所望の位置（例えば、腫瘍微小環境）にある際は、リンカーは効率的に切断されてリンカーによって連結された成分を放出し、別々の分子実体としての成分の半減期及び生物学的活性を回復させるまたはほぼ回復させることができる。
分離部分は、望ましくは、循環内で少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間、少なくとも４５時間、少なくとも５０時間、少なくとも６０時間、少なくとも６５時間、少なくとも７０時間、少なくとも８０時間、少なくとも９０時間、またはそれ以上安定性を保つ。
いくつかの実施形態において、分離部分は、標的位置と比較して、循環内で９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、２０％、５％、または１％未満切断される。また、リンカーを切断可能な酵素の不在下でも分離部分は安定している。しかし、好適な酵素（すなわち、プロテアーゼ）に曝露すると、分離部分が切断され、その結果、結合しているドメインが分離する。
Ｂ．分離部分を含むポリペプチド及び組成物
本明細書で開示する分離部分は、幅広い用途で使用することができる。限定されるものではないが、分離部分は融合タンパク質にも適している。本明細書でさらに説明されるように、分離部分は、融合タンパク質の治療的な生物学的活性が減弱されており、この減弱が分離部分の切断によって除去される、治療用融合タンパク質を調製するのに特に有用である。分離部分は、治療薬剤及び／または診断薬剤などの様々なペイロードを担体や標的化作用物質（例えば、抗体及び抗体のフラグメント、ナノ粒子）と結合化させるのに使用することもできる。このような結合体の調製に適した方法は当技術分野で周知されており、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２０１３を参照。例示的なペイロードとしては、限定されるものではないが、サイトカイン、抗体、細胞ベース治療薬、抗生物質、細胞傷害性薬物、または他の組換えポリペプチド複合体が挙げられる。特に対象となるのは、腫瘍の微小環境を標的化するまたはそれに標的化されたペイロードと共に使用するのに適した分離部分である。
本開示は、組換えポリペプチドであって、本明細書で開示するような分離部分が、第１の目的アミノ酸配列（例えば、第１の目的ドメイン）を第２の目的アミノ酸配列（例えば、第２の目的ドメイン）に結合させる、組換えポリペプチドに関する。典型的には、第１の目的アミノ酸配列及び第２の目的アミノ酸配列が、天然タンパク質中で一緒に見出されることはない。好ましいリンカーは配列番号１９５～２２０である。実施形態において、第１の目的アミノ酸配列及び第２の目的アミノ酸配列のうちの少なくとも一方は、治療用ポリペプチドのアミノ酸配列である。第１の目的アミノ酸配列及び第２の目的アミノ酸配列のうちの少なくとも一方が治療用ポリペプチドのアミノ酸配列であるいくつかの実施形態において、他方の目的アミノ酸配列は、標的化ポリペプチド、半減期延長ポリペプチド、及び／またはブロッキングポリペプチドのアミノ酸配列であり得る。
分離部分を含むポリペプチドは、式Ｉ：［Ｄ１］－［Ｌ１］－［Ｄ２］によって表すことができ、式中、Ｄ１は第１の目的アミノ酸配列（例えば目的ドメイン）であり、Ｌ１はＤ１をＤ２に接続または結合させる分離部分であり、Ｄ２は第２の目的アミノ酸配列（例えば第２の目的ドメイン）である。好ましくは、Ｌ１はプロテアーゼ切断性分離部分であり、より好ましくは、Ｌ１は配列番号１９５～２２０のいずれかを含むまたはそれからなる。
またポリペプチドは、式ＩＩ：［Ｄ１］－［Ｌ１］－［Ｄ２］－［Ｌ２］－［Ｄ３］によって表すこともでき、式中、Ｄ１は、第１の目的アミノ酸（例えば目的ドメイン）であり、Ｌ１及びＬ２は各々独立的にリンカーであり、Ｄ２は第２の目的アミノ酸配列（例えば目的ドメイン）であり、Ｄ３は第３の目的アミノ酸（例えば、目的ドメイン）であり、Ｌ１及びＬ２のうちの少なくとも一方はプロテアーゼ切断性分離部分であり、好ましくは、Ｌ１及びＬ２のうちの少なくとも一方は配列番号１９５～２２０のいずれかを含むまたはそれからなる。
また、ポリペプチドはまた、式ＩＩＩ：［Ｄ１］－［Ｌ１］－［Ｄ２］－［Ｌ２］－［Ｄ３］－［Ｌ３］－［Ｄ４］によって表すこともでき、式中、Ｄ１は第１の目的アミノ酸（例えば目的ドメイン）であり、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は各々独立的にリンカーであり、Ｄ２は、第２の目的アミノ酸配列（例えば目的ドメイン）であり、Ｄ３は第３の目的アミノ酸（例えば目的ドメイン）であり、Ｄ４は第４の目的アミノ酸（例えば目的ドメイン）であり、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の少なくとも１つはプロテアーゼ切断性分離部分であり、好ましくは、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の少なくとも１つは配列番号１９５～２２０のいずれかを含むまたはそれからなる。
分離部分のさらなる具体的な用途については、本明細書でさらに詳細に説明する。
ｉ．ペイロードの送達
本明細書に記載の分離部分は、治療用薬物部分を付着させるのに使用することができる。このアプローチでは、治療薬物部分を分離部分に付着させて治療薬部分複合体を作製する。個別の薬物部分複合体は、標的プロテアーゼがプロドラッグを切断して遊離薬物を放出するまで、不活性のプロドラッグであり得る。
ｉｉ．抗体－薬物結合体
分離部分の別の使用例は、主にがんの治療を対象とする抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）の分野である。ＡＤＣは、典型的には、細胞傷害性部分（例えば、細胞傷害性薬物）に結合する抗体である。ＡＤＣは、健常細胞及び疾患細胞を識別し、疾患細胞に薬物（例えば、細胞傷害性薬物）の標的化された送達をもたらす。ＡＤＣは典型的には、腫瘍細胞に特異的な腫瘍マーカーを標的化する抗体を含み、抗体が自らを腫瘍細胞に付着させるとＡＤＣが細胞内に吸収され、これによって細胞傷害性成分を放出して腫瘍細胞を死滅させることができる。ＡＤＣの重要な態様は、抗体成分と細胞傷害性薬剤との間に安定したリンカーを提供することである。このような用途では、リンカーは切断性であっても非切断性であってもよい。非切断性リンカーの場合は、抗体、リンカー、及び細胞傷害性ユニットが腫瘍細胞内に取り込まれる。リンカーの性質は、典型的には、細胞傷害性薬剤の放出プロファイルを決定する。例えば、抗体と細胞傷害性薬剤との間の切断性リンカーは、典型的には、腫瘍細胞内または腫瘍微小環境内の酵素によって触媒され、このとき、抗体及び細胞傷害性薬剤が切断されて細胞傷害性薬剤を放出する。
特定の実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、薬物部分を抗体部分に結合または接続させる。
ｉｉｉ．ペプチド－薬物結合体
本明細書で開示する分離部分は、ペプチド－薬物結合体における使用に適している。このような化合物は、典型的には、細胞傷害性ペイロード及びリンカーを含むが、ペプチド－薬物結合体は、抗体の代わりに、腫瘍に浸透する能力を有するペプチドを装備しているため、カーゴを腫瘍内に送達することができる。いくつかの実施形態において、分離部分は、細胞傷害性ペイロードをペプチドに結合または接続させる。ペプチド－薬物結合体は、標的プロテアーゼが分離部分を切断するまで、安定性を保ち生物学的活性を有しない。
ｉｖ．誘導性養子細胞療法
本明細書で開示する分離部分は、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法で使用するために設計されたコンストラクトに使用するのに適している。現在、養子細胞移植（ＡＣＴ）の分野は、Ｔ細胞の標的を細胞表面に発現した標的（例えば、表面標的を発現する腫瘍細胞）にするキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）操作Ｔ細胞（及び次世代の治療法）と、細胞内抗原を標的化することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）操作Ｔ細胞とから構成されている。
１つの実施形態において、分離部分は、標的化部分をＣＡＲコンストラクトに繋留するのに使用される。ＣＡＲは、内在性ＴＣＲ複合体を、ヒトまたはマウスの抗体のフラグメントを使用してがん細胞の外部の標的に結合する新たな受容体で置き換える。抗体フラグメントは、ＣＡＲがその標的に結合した際に受容体活性化を媒介するＴ細胞内の様々なシグナル伝達タンパク質に結合している。Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）ＮＥＪＭ，３６５：７２５－７３３；Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＮＥＪＭ，３６８：１５０９－１５１８；ＵＳ１０２２１２４５／ＷＯ／２０１４／１５３２７０，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．
別の実施形態において、分離部分は、標的化部分をＴＣＲコンストラクトに繋留するのに使用される。ＴＣＲは、Ｔ細胞内に既に天然に存在するタンパク質受容体の遺伝子に基づいている。所望のＴＣＲの遺伝子は、単一の患者内で、例えば、あるタイプのがんに対し有効な免疫応答を開始することができる患者内で発見され得る。この遺伝子は、次に、ＴＣＲ Ｔ細胞コンストラクトに組み込むことによって他の患者内に導入することができ、またはＭＨＣ標的との結合相互作用を改善するように再操作することができる。Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４（３）：２６２－７０；Ｋｕｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５；３：１５９；Ｆｅｓｎａｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１６（９）：５６６－５８１．
このようなタイプの操作されたＴ細胞は、自己か同種異系かにかかわらず、単離されたヒト抗体またはヒト化抗体などの標的化作用物質を含む操作されたＴ細胞受容体成分を含む。ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＣＲ－Ｔ細胞においては、標的化部分の結合親和性は、標的化部分をコンストラクト及びＴ細胞の残部に繋留する分離部分の立体的、化学的、または柔軟性の特性によって影響を受けることがある。本明細書で開示する分離部分は、ＣＡＲ Ｔ細胞及びＴＣＲ Ｔ細胞を作製するための操作されたコンストラクトと共に使用するのに適している。
ｖ．抗原結合タンパク質
本明細書で開示する分離部分は、抗原結合タンパク質で使用するのに適している。「抗原結合タンパク質」（ＡＢＰ）とは、抗原またはエピトープに特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含むタンパク質である。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、天然の抗体と同様の特異性及び親和性で抗原またはエピトープに結合する。典型的には、分離部分は、ＡＢＰの抗原結合部位がその同族抗原と結合するのをブロックするポリペプチドを結合する。しかし、分離部分が切断されると、ブロッキングポリペプチドはＡＢＰ抗原結合部位から離れて拡散し、ＡＢＰはその同族抗原に結合することができる。ＡＢＰの抗原結合部位をブロックすることができる例示的な結合ポリペプチドとしては、立体的ブロッカー（例えば、ヒト血清アルブミン）、及びＡＢＰの抗原結合部位内の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ以上と相互作用するペプチドが挙げられる。このようなブロッキングペプチドは、ライブラリーをスクリーニングすることにより、または目的ＡＢＰの同族抗原のペプチドフラグメントをスクリーニングすることにより、得ることができる。典型的には、ＡＢＰが抗体の抗原結合部位を含む場合、分離部分及びブロッカーは、抗体軽鎖のアミノ末端または抗体重鎖のアミノ末端に結合して、ブロッカーは抗原結合部位付近に繋留され、抗原結合部位を容易にブロックするようになる。ＡＢＰが結合部位のための代替的スキャフォールドを含む場合は、このアプローチの好適なバリエーションが使用される。同様に、単鎖抗体結合部位（例えば、ｄＡｂのｓｃＦＶ）が使用される場合は、ブロッカー分離部分は、典型的には抗原結合部位の付近のアミノ末端に結合する。ある特定の実施形態において、ＡＢＰは、ＶＨ及びＶＬを含む抗体結合部位を含み、ブロッカー分離部分は、ＶＬのアミノ末端に結合している。
ＡＢＰは、抗体（例えば、第１及び第２の抗原結合ドメインが抗体の形態をとる）であってもよい。好ましくは、ＡＢＰの少なくとも１つの抗原結合ドメインが抗体の形態をとる。別の好ましい実施形態において、第１または第２の抗原結合ドメインは抗体の形態をとり、第１または第２の抗原結合ドメインは抗原結合フラグメントの形態をとる（例えば、第１の抗原結合ドメインが抗体であり、第２の抗原結合ドメインが抗原結合フラグメントである。代替的に、第１の抗原結合ドメインが抗原結合フラグメントであり、第２の抗原結合ドメインが抗体である）。
いくつかの実施形態において、ＡＢＰは抗体からなる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは抗体から本質的になる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは代替的スキャフォールドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは代替的スキャフォールドからなる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは代替的スキャフォールドから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは抗体フラグメントからなる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは抗体フラグメントから本質的になる。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、抗体と共に使用するのに適している。「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用されており、抗原またはエピトープに特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含む、ある特定のタイプの免疫グロブリン分子を含む。抗体には、具体的には、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリン）、抗体フラグメント、及び多特異性抗体が含まれる。抗体は１つのタイプのＡＢＰである。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、代替的スキャフォールドを含む抗原結合タンパク質と共に使用するのに適している。「代替的スキャフォールド」とは、抗原またはエピトープに特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを産生するように１つ以上の領域が多様化されている分子を指す。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体と同様の特異性及び親和性で抗原またはエピトープに結合する。例示的な代替的スキャフォールドとしては、フィブロネクチン（例えばＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標））、βサンドイッチ（例えばｉＭａｂ）、リポカリン（例えばＡｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標））、ＥＥＴＩ－ＩＩ／ＡＧＲＰ、ＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ－Ｄ１／ＩＴＩ－Ｄ２（例えばクニッツドメイン）、チオレドキシンペプチドアプタマー、プロテインＡ（例えばＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））、アンキリンリピート（例えばＤＡＲＰｉｎ）、ガンマ－Ｂ－クリスタリン／ユビキチン（例えばＡｆｆｉｌｉｎ）、ＣＴＬＤ３（例えばＴｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）、ファイノマー、及びＬＤＬＲ－Ａモジュール（例えばＡｖｉｍｅｒ）が挙げられる。代替的スキャフォールドに関するさらなる情報は、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５ ２３：１２５７－１２６８；Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００７ １８：２９５－３０４；及びＳｉｌａｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，２８９：１４３９２－１４３９８に示されており、これらの各々は、その全体が参照により援用される。代替的スキャフォールドはＡＢＰの１つのタイプである。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、抗体フラグメントと共に使用するのに適している。「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）フラグメント、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメントが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、１つ以上のＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントと共に使用するのに適している。「Ｆｖ」フラグメントは、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの非共有結合二量体を含む。「Ｆａｂ」フラグメントは、重鎖及び軽鎖可変ドメインに加えて、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、例えば、組換え法によって、または完全長抗体のパパイン消化によって生成することができる。「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントは、ジスルフィド結合によってヒンジ領域付近で連結した２つのＦａｂ’フラグメントを含む。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば、組換え法によって、またはインタクトな抗体のペプシン消化によって生成することができる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、例えば、１－メルカプトエタノールで処理することによって解離させることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃと共に使用するのに適している。「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、単一のポリペプチド鎖内にＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。ＶＨ及びＶＬは、概してペプチドリンカーによって結合している。Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．（１９９４）を参照。任意の好適なリンカーを使用することができる。
いくつかの実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２３１）である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１、２、３、４、５、または６である。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｉｎ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｍ．＆ Ｍｏｏｒｅ Ｇ．Ｐ．（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｖｏｌ．１１３（ｐｐ．２６９－３１５）． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照（その全体が参照により援用される）。「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フラグメントは、Ｆｃドメインに付着したｓｃＦｖを含む。例えば、ＦｃドメインはｓｃＦｖのＣ末端に付着していてもよい。Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖの可変ドメインの向き（すなわちＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）に応じて、ＶＨまたはＶＬの後に続いている。当技術分野で知られている、または本明細書に記載の任意の好適なＦｃドメインを使用することができる。場合によっては、ＦｃドメインはＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、シングルドメイン抗体と共に使用するのに適している。「シングルドメイン抗体」という用語は、抗体の１つの可変ドメインが、別の可変ドメインの存在を伴わずに抗原に特異的に結合する分子を指す。シングルドメイン抗体及びそのフラグメントについては、Ａｒａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，４１４：５２１－５２６及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．，２００１，２６：２３０－２４５で説明されている（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。シングルドメイン抗体は、ｓｄＡｂまたはナノボディとしても知られている。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、単一特異性ＡＢＰと共に使用するのに適している。「単一特異性ＡＢＰ」とは、同じエピトープに特異的に結合する１つ以上の結合部位を含むＡＢＰである。単一特異性ＡＢＰの例として天然のＩｇＧ分子がある。この分子は、二価（２つの抗原結合ドメインを有する）であるものの、２つの抗原結合ドメインの各々で同じエピトープを認識する。結合特異性は、任意の好適な価数で存在し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、モノクローナル抗体と共に使用するのに適している。「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団からの抗体を指す。実質的に均質な抗体の集団は、モノクローナル抗体の産生中に通常生じ得るバリアントを除いては、実質的に類似し、同じエピトープ（複数可）に結合する抗体を含む。このようなバリアントは、概してわずかな量しか存在しない。モノクローナル抗体は、典型的には、複数の抗体から単一の抗体を選択することを含むプロセスによって得られる。例えば、選択プロセスは、複数のクローン（例えば、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプール）からユニークなクローンを選択することであり得る。選択した抗体は、例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバータンパク質に対する親和性の改善（「親和性成熟」）、抗体のヒト化、細胞培養での産生量の改善、及び／または対象における免疫原性の低減のために、さらに変更することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、キメラ型抗体と共に使用するのに適している。「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、その一方で重鎖及び／または軽鎖の残部が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、ヒト化抗体と共に使用するのに適している。非ヒト抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小限の配列を含むキメラ型抗体である。ヒト化抗体とは、概して、ヒト抗体（レシピエント抗体）であって、１つ以上のＣＤＲからの残基が非ヒト抗体（ドナー抗体）の１つ以上のＣＤＲの残基で置き換えられたヒト抗体である。ドナー抗体は、所望の特異性、親和性、または生物学的効果を有する任意の好適な非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、または非ヒト霊長類の抗体）であり得る。いくつかの場合では、レシピエント抗体の選択されたフレームワーク領域残基が、ドナー抗体からの対応するフレームワーク領域残基によって置き換えられている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基も含み得る。このような修飾は、抗体機能をさらに精緻化するために行われ得る。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６：３２１－５２２（５２５）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３（３２９）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．，１９９２，２：５９３－５９６で説明されている（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、ヒト抗体と共に使用するのに適している。「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有するもの、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒトの抗体コード配列（例えば、ヒト供給源から得られたもの、または新規に設計したもの）を利用する非ヒト供給源に由来するものを指す。ヒト抗体は、具体的にはヒト化抗体を排除する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するＡＢＰは、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質は、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＬＴ－ベータＲ、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、またはＯＸ－４０である。ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質は、任意の好適な標的細胞の表面に発現することができる。いくつかの実施形態において、標的細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はエフェクターＴ細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は調節性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は骨髄由来細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は骨髄由来サプレッサー細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は樹状細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するＡＢＰは抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するＡＢＰは抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するＡＢＰは代替的スキャフォールドである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するＡＢＰは免疫グロブリン分子を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するＡＢＰは免疫グロブリン分子からなる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するＡＢＰは、免疫グロブリン分子から本質的になる。いくつかの態様において、免疫グロブリン分子は抗体を含む。いくつかの態様において、免疫グロブリン分子は抗体からなる。いくつかの態様において、免疫グロブリン分子は抗体から本質的になる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するＡＢＰは軽鎖を含む。いくつかの態様において、軽鎖はカッパ軽鎖である。いくつかの態様において、軽鎖はラムダ軽鎖である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するＡＢＰは重鎖を含む。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＡである。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＤである。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＥである。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＧである。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＭである。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＧ１である。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＧ２である。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＧ３である。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＧ４である。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＡ１である。いくつかの態様において、重鎖はＩｇＡ２である。
いくつかの実施形態において、分離部分はさらなるブロッキング部分に接続する。
いくつかの実施形態において、分離部分は、抗原結合タンパク質サブユニットの動きが制限されるように配置される。
ａ．多特異性及び単一特異性の多価抗原結合タンパク質
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する分離部分は、多特異性抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）と共に使用するのに適している。本明細書で提供する多特異性ＡＢＰは複数の抗原に結合する。例えば、多特異性抗体は、２つの抗原、３つの抗原、４つの抗原、５つの抗原、またはそれ以上の抗原に結合することができる。代替的に、多特異性ＡＢＰは、２つ以上の異なるエピトープに結合することができる。ＡＢＰが２つ以上のエピトープに結合する場合、２つ以上の異なるエピトープは、同じ抗原（例えば、１つの細胞が発現した単一のＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質分子）上のエピトープであっても、異なる抗原（例えば、同じ細胞が発現した異なるＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質分子、または、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質分子及び非ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質分子）上のエピトープであってもよい。いくつかの態様において、多特異性ＡＢＰは２つの異なるエピトープに結合する（すなわち、「二特異性ＡＢＰ」）。いくつかの態様において、多特異性ＡＢＰは３つの異なるエピトープに結合する（すなわち、「三特異性ＡＢＰ」）。いくつかの態様において、多特異性ＡＢＰは４つの異なるエピトープに結合する（すなわち、「四特異性ＡＢＰ」）。いくつかの態様において、多特異性ＡＢＰは５つの異なるエピトープに結合する（すなわち、「五特異性ＡＢＰ」）。いくつかの態様において、多特異性ＡＢＰは６、７、８つ、またはそれ以上の異なるエピトープに結合する。各結合特異性は、任意の好適な価数で存在し得る。
様々な実施形態において、抗原結合タンパク質はブロッキングドメインを含む。本明細書で開示する分離部分は、ブロッキングドメインを第１の抗原結合ドメインに結合させ、その結果、ブロッキングドメインは、（ａ）エピトープ上の抗原結合タンパク質の結合親和性もしくはアビディティー、及び／または（ｂ）エピトープ上の抗原結合タンパク質のアゴニストもしくはアンタゴニスト活性を阻害することができる。好ましくは、分離部分は切断部位を含む。疾患特異的酵素（すなわち、プロテアーゼ）によって分離部分が切断されると、（ａ）エピトープに対する抗原結合タンパク質の結合親和性またはアビディティー、及び／または（ｂ）エピトープに対する抗原結合タンパク質のアゴニストもしくはアンタゴニスト活性が増加する。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、追加のブロッキングドメインを抗原結合ドメインに結合または接続する追加の分離部分を含む。追加の分離部分は切断部位を含む。
様々な実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書で開示するような切断性分離部分によって抗原結合ドメイン（例えば、第２、第３、または第４の抗原結合ドメイン）に作用可能に結合している追加のブロッキングドメイン（例えば、第２、第３、または第４のブロッキングドメイン）を含む。ブロッキングドメインは、立体的なブロッカーであっても特異的ブロッカーであってもよい。いくつかの実施形態において、立体的ブロッカーは、独立的に、抗体結合タンパク質の細胞外部分のフラグメント、血清アルブミン、血清アルブミンのフラグメント、及び血清アルブミンを結合する抗体またはその抗原結合フラグメントからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、特異的ブロッカーは、独立的に、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の第１、第２、第３、または第４の抗原結合ドメインに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される。好ましくは、ブロッキングドメインは、血清アルブミンもしくはそのフラグメント、または血清アルブミンに結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。
抗原結合ドメインはさらに、標的抗原に対する結合特異性を各々有する第３の抗原結合ドメイン及び第４の抗原結合ドメインを含み得る。ＴＮＦＲスーパーファミリー標的抗原は当技術分野で周知されており、本開示に包含される。例示的なＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーとしては、限定されるものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａ）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂ）、ＣＤ４０、ＣＤ９５（Ｆａｓ／Ａｐｏ－１）、ＨＶＥＭ、ＬＴ－ベータＲ、ＧＩＴＲ、神経成長因子受容体、またはＯＸ－４０（ＣＤ３４）が挙げられる。好ましいＴＮＦＲスーパーファミリー標的抗原は、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、及びＯＸ４０である。
抗原に対し特異性を有する抗原結合ドメインは、同じ抗原上の同じエピトープに対し結合特異性を有することもあれば、同じ抗原上の異なるエピトープに対し結合特異性を有することもある。例えば、第１、第２、及び第３の抗原結合ドメインが、同じエピトープに対し結合特異性を有することも、異なるエピトープに対し結合特異性を有することもあり、抗原結合ドメインのうちの２つが同じエピトープに対し結合特異性を有することもあれば、抗原結合ドメインのうちの３つが同じエピトープに対し結合特異性を有することもある。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質はさらに、腫瘍抗原に特異的な第５の抗原結合ドメインを含み得る。
いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドはＦｃ領域を含む。１つの形式では、２つの抗原結合ドメインがＦｃ領域の両端に位置する。別の形式では、２つの抗体アームがＦｃ領域のＮ末端に付着しており、各アームは２つの抗原結合ドメインを含む。また、抗原結合ドメインは、半減期延長ドメインも含み得る。半減期延長ドメインは、アルブミン、アルブミンを動員する抗原結合ドメイン、または免疫グロブリンＦｃもしくはそのフラグメントであり得る。いくつかの実施形態において、半減期延長ドメインは、切断性リンカーによって抗原結合ポリペプチドに作用可能に結合している。
また、本開示は、少なくとも第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む抗原結合タンパク質にも関する。第１のポリペプチドは、抗体重鎖定常領域及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも一部を含む。第２のポリペプチドは、抗体軽鎖定常領域及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも一部を含む。第１及び第２のポリペプチドのうちの少なくとも一方はさらに、プロテアーゼ切断性リンカーを介しＶＨまたはＶＬに作用可能に結合しているブロッキングドメインを含む。第１のポリペプチドは第２のポリペプチドと会合し、ＶＨ及びＶＬは、標的抗原（例えば、４－１ＢＢまたはＣＳ２７）に対し結合特異性を有する抗原結合部位を形成する。ブロッキングドメインは、抗原結合部位が標的抗原（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２７）に結合するのを阻害する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドはさらに第２のＶＨを含み、第１のポリペプチドは、当該第２のポリペプチドのうちの２つと会合して、各々がヒト４－１ＢＢに対し特異性を有する２つのＶＨ／ＶＬ抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、第１のポリペプチド及び会合した第２のポリペプチドの二量体である。抗原結合タンパク質はさらに、第３、第４、第５、または第６のポリペプチドを含み得る。
いくつかの実施形態において、ＡＢＰは単一特異性多価ＡＢＰである。このような形式は様々な構造を有し得、好適な抗体操作技法を用いて調製することができる。例えば、ＶＨ－ＣＨ１－非切断性ライナー－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３という構造の重鎖を含む二重Ｆａｂ抗体を調製することができる。このような重鎖を発現させ、２つの軽鎖と対合させることができる。重鎖は、従来的な鎖間ジスルフィド結合を介し二量化して、４つのＦａｂ抗原結合部位を含む抗体形式を形成することができる。このような形式では、本明細書に記載の分離部分を軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に結合して、ブロッカーをＦａｂ抗原結合部位の各々に結合することができる。他の好適な単一特異性多価ＡＢＰの形式は、当業者が容易に想定することができる。１つのこのような例では、ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ－ＣＨ１という構造を有する重鎖が調製される。このような２つの重鎖が二量体化し、４つの軽鎖と会合して、単一特異性四価ＡＢＰ形式を形成する。このような形式では、本明細書に記載の分離部分を軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に結合して、ブロッカーをＦａｂ抗原結合部位の各々に結合することができる。このような単一特異性四価ＡＢＰの結合活性は、ブロッキングドメインによって遮蔽されており、この遮蔽は、（例えば、腫瘍の微小環境内で）分離ドメインが切断されると除去され、ＡＢＰはその同族抗原に結合することができる。
単一特異性多価ＡＢＰ形式は、任意の所望の抗原に対し結合特異性を有することができる。いくつかの実施形態において、単一特異性多価ＡＢＰ形式は、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａ）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂ）、ＣＤ４０、ＣＤ９５（Ｆａｓ／Ａｐｏ－１）、ＨＶＥＭ、ＬＴ－ベータＲ、ＧＩＴＲ、神経成長因子受容体、またはＯＸ－４０（ＣＤ３４））の細胞外ドメインに特異的に結合する。
実施形態において、多価抗原結合タンパク質は、標的抗原（例えば、ＣＤ２７またはＴＮＦＲ１）に対し特異性を有する第１の抗原結合部位と、標的抗原に対し特異性を有する第２の抗原結合部位と、ブロッキングポリペプチドと、少なくとも１つのプロテアーゼ切断性リンカーと、任意選択の半減期延長エレメントとを含み得る。このような実施形態において、第１のブロッキングポリペプチドは、プロテアーゼ切断性リンカーによって第１の抗原結合部位に作用可能に結合しており、任意選択で、第２のブロッキングポリペプチドは、プロテアーゼ切断性リンカーによって第２の抗原結合部位に作用可能に結合している。好ましくは、ブロッキングポリペプチドは、プロテアーゼ切断性リンカーによって第２の抗原結合部位に作用可能に結合している。ブロッキングポリペプチドは、（ａ）標的抗原に対する抗原結合タンパク質の結合親和性もしくはアビディティー、及び／または、（ｂ）標的抗原に対する抗原結合タンパク質のアゴニストもしくはアンタゴニスト活性を阻害し、プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、（ａ）標的抗原に対する抗原結合タンパク質の結合親和性もしくはアビディティー、及び／または（ｂ）標的抗原に対する抗原結合タンパク質のアゴニスト活性が増加する。任意選択の半減期延長エレメントは、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介し、第１の抗原結合部位及び／または第２の抗原結合部位に作用可能に結合していてもよい。このような実施形態において、第１及び第２の結合部位は、同じエピトープまたは異なるエピトープに対し特異性を有し得る。
実施形態において、抗原結合タンパク質はさらに、同じ標的抗原に対し特異的な第３の抗原結合部位を含む。抗原結合タンパク質はさらに、第１、第２、及び第３の抗原結合部位と同じ標的抗原に対し特異性を有する第４の抗原結合部位を含み得る。第３及び第４の抗原結合部位は、各々がさらに、プロテアーゼ切断性リンカーを介し抗原結合部位に作用可能に結合しているブロッキングポリペプチドを含み得る。
また、本開示は、四価抗原結合タンパク質にも関し、当該タンパク質は、抗体重鎖定常領域及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、抗体軽鎖定常領域及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも一部を含む第２のポリペプチドとを含み得る。第１のポリペプチドは第２のポリペプチドと会合し、ＶＨ及びＶＬは、標的抗原に対する結合特異性を有する抗原結合部位を形成する。四価抗原結合タンパク質はさらに、プロテアーゼ切断性リンカーを介しＶＨまたはＶＬに作用可能に結合しているブロッキングポリペプチドを含む。ブロッキングポリペプチドは、抗原結合部位が標的抗原に結合するのを阻害する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドはさらに、第２のＶＨを含み得る。第１のポリペプチドは２つの第２のポリペプチドと会合して、各々が標的抗原に対し特異性を有する２つのＶＨ／ＶＬ抗原結合部位を形成する。
四価抗原結合タンパク質はさらに、第３のポリペプチド、第４のポリペプチド、第５のポリペプチド、第６のポリペプチド、第７のポリペプチド、及び第８のポリペプチドを含み得る。第３のポリペプチドは、抗体重鎖定常領域及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも一部を含み得る。第４のポリペプチドは、抗体軽鎖定常領域、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも一部を含み得る。第５のポリペプチドは、抗体重鎖定常領域及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも一部を含み得る。第６のポリペプチドは、抗体軽鎖定常領域、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも一部を含み得る。第７のポリペプチドは、抗体重鎖定常領域及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも一部を含み得る。第８のポリペプチドは、抗体軽鎖定常領域、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも一部を含み得る。
いくつかの実施形態において、第３のポリペプチド及び第４のポリペプチドのうちの少なくとも一方はさらに、プロテアーゼ切断性リンカーを介しＶＨまたはＶＬに作用可能に結合しているブロッキングポリペプチドを含む。第３のポリペプチドは第４のポリペプチドと会合し、ＶＨ及びＶＬは標的抗原に対し結合特異性を有する抗原結合部位を形成し、ブロッキングドメインは、抗原結合部位が標的抗原に結合するのを阻害する。
いくつかの実施形態において、第５及び第６のポリペプチドはさらに、プロテアーゼ切断性リンカーを介しＶＨまたはＶＬに作用可能に結合しているブロッキングポリペプチドを含む。第５のポリペプチドは第６のポリペプチドと会合し、ＶＨ及びＶＬは標的抗原に対し結合特異性を有する抗原結合部位を形成し、ブロッキングドメインは、抗原結合部位が標的抗原に結合するのを阻害する。
いくつかの実施形態において、第７及び第８のポリペプチドはさらに、プロテアーゼ切断性リンカーを介しＶＨまたはＶＬに作用可能に結合しているブロッキングポリペプチドを含む。第７のポリペプチドは第８のポリペプチドと会合し、ＶＨ及びＶＬは標的抗原に対し結合特異性を有する抗原結合部位を形成し、ブロッキングドメインは、抗原結合部位が標的抗原に結合するのを阻害する。
ｖｉ．誘導性サイトカイン
本明細書では、誘導性サイトカインを含むコンストラクトを操作及び使用するための方法及び組成物を開示する。サイトカインは強力な免疫アゴニストであり、そのためオンコロジーにおける有望な治療薬剤とみなされている。しかし、サイトカインは治療ウインドウが非常に狭い。サイトカインは血清半減期が短く、効力が高いとも考えられている。その結果、サイトカインの治療的投与は、望ましくない全身作用及び毒性をもたらす。この作用及び毒性は、意図されたサイトカイン作用部位（例えば、腫瘍）で所望のレベルのサイトカインを達成するのに大量のサイトカインを投与する必要があることにより、さらに悪化した。残念ながら、サイトカインの生物学的性質のため、そしてその活性を有効に標的化し制御することができないため、サイトカインは腫瘍の治療において期待される臨床的利点を達成していない。
本明細書では、オンコロジーにおけるサイトカインの臨床的使用を厳しく限定してきた毒性及び短い半減期の問題を克服する融合タンパク質を開示する。融合タンパク質は、受容体アゴニスト活性を有するサイトカインポリペプチドを含む。しかし、融合タンパク質の文脈では、サイトカイン受容体のアゴニスト活性が減弱し、循環半減期が延長される。融合タンパク質は、所望のサイトカイン活性部位（例えば、腫瘍）に関連するプロテアーゼによって切断されるプロテアーゼ切断部位を含み、典型的には所望の活性部位で濃縮されるか、または選択的に存在する。このように、融合タンパク質は、所望の活性部位で優先的（または選択的）かつ効率的に切断されて、腫瘍微小環境などの所望の活性部位に対するサイトカイン活性を実質的に限定する。所望の活性部位（例えば、腫瘍微小環境）でプロテアーゼが切断されると、サイトカイン受容体アゴニストとしての活性が融合タンパク質よりもはるかに高い（典型的には融合タンパク質よりも活性が少なくとも約１００倍）サイトカインの形態が融合タンパク質から放出される。融合タンパク質の切断時に放出されるサイトカインの形態は、典型的には半減期が短く、これはしばしば、天然のサイトカインの半減期と実質的に類似しており、腫瘍微小環境に対するサイトカイン活性をさらに制限する。融合タンパク質の半減期が延長されても、循環する融合タンパク質が減弱し、活性のサイトカインが腫瘍微小環境に標的化されるため、毒性は劇的に低減または消失する。本明細書に記載の融合タンパク質は、サイトカインの活性を実質的に腫瘍微小環境に限定して、腫瘍を治療するためのサイトカインの有効治療用量を投与することを初めて可能にし、サイトカインの望ましくない全身性の作用及び毒性を劇的に低減または消失させる。
概して、サイトカインの治療的使用は、その全身毒性によって強く限定されている。例えば、ＴＮＦは当初、いくつかの腫瘍の出血性壊死を誘導する能力及び様々な腫瘍株に及ぼすｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性作用が発見されたが、その後、強力な炎症促進活性を有することが判明し、過剰産生条件下では人体に危険な作用を及ぼす恐れがある。全身毒性は、ヒトにサイトカインの薬理学的活性量を使用する際に根本的問題となるため、現在、このクラスの生物学的エフェクターの毒性作用を低減しつつ治療有効性を維持することを目的とした新規の誘導体及び治療戦略の評価が行われている。
ＩＬ－２は、免疫系において刺激的かつ調節的な機能を発揮し、他の共通のγ鎖（γｃ）サイトカインファミリーのメンバーと共に免疫恒常性の中心的存在である。ＩＬ－２は、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に結合することで、その作用を媒介する。当該受容体は、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）、及びＩＬ－２Ｒγ（γｃ、ＣＤ１３２）鎖から構成された三量体受容体または二量体βγＩＬ－２Ｒのいずれかからなる（１、３）。いずれのＩＬ－２Ｒバリアントも、ＩＬ－２が結合するとシグナルを伝達することができる。ただし、三量体αβγＩＬ－２Ｒは、ＩＬ－２に対する親和性が二量体βγＩＬ－２Ｒよりもおよそ１０～１００倍高い（３）。このことから、ＣＤ２５は、ＩＬ－２の受容体への高親和性結合を付与するものの、シグナル伝達には不可欠ではないということが示唆される。三量体ＩＬ－２Ｒは、活性化Ｔ細胞及びＣＤ４＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋Ｔ調節性細胞（Ｔｒｅｇ）に見出され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－２に感受性を有する。逆に、抗原経験を有する（メモリー）ＣＤ８＋、ＣＤ４４高メモリー表現型（ＭＰ）ＣＤ８＋、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、高レベルの二量体のβγＩＬ－２Ｒが付与され、これらの細胞もｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－２に活発に応答する。
高親和性ＩＬ－２Ｒの発現は、Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで一時的に利用可能な低濃度のＩＬ－２に応答するために不可欠である。ＩＬ－２Ｒα発現はナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞には見られないが、抗原活性化後に誘導される。ＩＬ－２Ｒβは、ＮＫ、ＮＫＴ、及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞によって構成的に発現するが、ナイーブＴ細胞上でも抗原活性化後に誘導される。γｃは、調節の厳重性がはるかに低く、全てのリンパ系細胞によって構成的に発現する。抗原によって高親和性ＩＬ－２Ｒが誘導されると、ＩＬ－２Ｒシグナル伝達は、部分的にはＳｔａｔ５依存性のＩｌ２ｒａ転写の調節を介し、ＩＬ－２Ｒαの発現を上方調節する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００１）。このプロセスは、ＩＬ－２の供給源が残存する一方で、高親和性ＩＬ－２Ｒの発現を維持し、ＩＬ－２シグナル伝達を保持する機構に相当する。
ＩＬ－２は、極性の周辺部に囲まれた大きな疎水性結合面を介してＩＬ－２Ｒαによって捕捉され、その結果、相対的に弱い相互作用（Ｋｄ １０－８Ｍ）及び迅速なオンオフ結合動態をもたらす。しかし、ＩＬ－２Ｒα－ＩＬ－２二元複合体は、ＩＬ－２に非常に小さな立体構造変化をもたらし、それによってＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβとの間の明確な極性相互作用を介しＩＬ－２Ｒβとの会合が促進される。ＩＬ２／α／β三量体複合体の擬似的な高親和性（すなわちＫｄ約３００ｐＭ）は、三量体複合体がα鎖のみに結合したＩＬ２（Ｋｄ＝１０ｎＭ）またはβ鎖のみに結合したＩＬ２（Ｋｄ＝４５０ｎＭ）よりも安定していることを明確に示している。いずれにしても、ＩＬ２／α／β三量体は、次にγ鎖をシグナル伝達可能な四量体に動員する。これは、ＩＬ２に結合したβ鎖上のγ鎖との大きな複合結合部位によって促進される。
言い換えれば、ＩＬ－２Ｒα－ＩＬ－２Ｒβ－ＩＬ－２の三元複合体は、ＩＬ－２との弱い相互作用及びＩＬ－２Ｒβとの強い相互作用によってγｃを動員して、安定した四元高親和性ＩＬ－２Ｒ（Ｋｄ １０－１１Ｍ、すなわち１０ｐＭ）を産生する。高親和性四元ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ複合体が形成されるとチロシンキナーゼＪａｋ１及びＪａｋ３（それぞれＩＬ－２Ｒβ及びγｃと会合）を介したシグナル伝達がもたらされる（Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｅｒｆｏｒｄ，１９９８）。四元ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ複合体は迅速に内在化され、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒβ、及びγｃは迅速に分解されるが、ＩＬ－２Ｒαは細胞表面に再利用される（Ｈｅｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｙｕ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ，２００１）。このように、ＩＬ－２Ｒシグナル伝達の持続を必要とするこのような機能的活性には、ＩＬ－２Ｒαと係合し、さらなるＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒシグナル伝達複合体を形成するための継続的なＩＬ－２供給源が必要である。
サイトカインの４アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのもう１つのメンバーであるインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）も、がん治療のための免疫調節物質として浮上している。ＩＬ－１５は最初に、抗原提示樹状細胞、単球、及びマクロファージに発現するＩＬ－１５Ｒαを介して捕捉される。ＩＬ－１５は幅広い活性を示し、ＩＬ－１５／ＩＬ－２－Ｒ－β（ＣＤ１２２）及び共通のγ鎖（ＣＤ１３２）を介したシグナル伝達により、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の分化及び増殖を誘導する。また、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性も強化し、長期間持続する抗原経験を有するＣＤ８＋ＣＤ４４メモリーＴ細胞を誘導する。ＩＬ－１５は、Ｂ細胞による分化及び免疫グロブリン合成を促進し、樹状細胞の成熟を誘導する。免疫抑制性のＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）は刺激しない。したがって、腫瘍微小環境で選択的にＩＬ－１５活性をブーストすることにより、自然免疫及び特異的免疫が強化され、腫瘍と闘うことができると考えられる（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＩＬ－１５は当初、共通の受容体成分（ＩＬ－２Ｒ／１５Ｒβ－γｃ）と、ＪＡＫ１／ＪＡＫ３及びＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ５を介したシグナル伝達とによる、ＩＬ－２に類似した方法でＴ細胞の増殖を刺激する能力が同定された。ＩＬ－２と同様に、ＩＬ－１５は、活性化ＣＤ４－ＣＤ８－、ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を刺激すると共に、細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導、ならびにＮＫ細胞の生成、増殖、及び活性化を促進することが示されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかし、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）発現ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞を維持しこれらの細胞を末梢内に保持するために必要とされるＩＬ－２とは異なり、ＩＬ－１５はＴｒｅｇにほとんど影響を及ぼさない（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９） これは、ＦＯＸＰ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ＴｒｅｇがエフェクターＴ細胞を阻害し、それによって腫瘍に対するものを含めた免疫応答を阻害するため、重要である。また、ＩＬ－２は、自己反応性Ｔ細胞の排除をもたらすプロセスである活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）の開始に不可欠な役割も果たしており、一方、ＩＬ－１５はＴ細胞の抗アポトーシス因子である（Ｍａｒｋｓ－Ｋｏｎｃｚａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＩＬ－１５及びＨＩＶペプチドワクチンの同時送達は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の長命を促進し、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスをブロックすることにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞欠乏を克服することが示されている（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００８）。さらに、ＩＬ－１５は、ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉメモリーＴ細胞の長期維持を促進する（Ｋａｎｅｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
Ｔ細胞及びＮＫ細胞の発達に対するＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαの重要性は、ＩＬ－１５Ｒα－／－及びＩＬ－１５－／－マウスの表現型によってさらに強調される。ノックアウトマウスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数が減少し、メモリー表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、及び腸管上皮内リンパ球のいくつかのサブセットが欠乏していることが実証されており、このことは、ＩＬ－１５が、必須の正の恒常性維持機能をこれらの細胞サブセットにもたらすことを示すものである（Ｌｏｄｏｌｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。これらの２系統のノックアウトマウスの表現型の類似性から、ＩＬ－１５Ｒαが生理的に適切なＩＬ－１５シグナルの維持に重要であることが示唆される。
ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５受容体アルファ鎖により、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面に示されるＩＬ－１５Ｒβγｃ複合体にトランス提示される（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＩＬ－１５Ｒａ鎖はシャペロンタンパク質の役割を果たし、ＩＬ－１５の活性を安定化及び増加させる（Ｄｅｓｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ，２０１６）。外因性ＩＬ－１５は、がん患者で頻繁に下方調節されるＩＬ－１５Ｒａに依存するため、がん患者に及ぼす影響が限定的であり得ることが示されている。そのため、ＩＬ１５Ｒａのｓｕｓｈｉ＋ドメインがリンカーを介しＩＬ－１５に結合した構成の融合タンパク質ＲＬＩが、ＩＬ１５療法の代替的アプローチとして提案されている（Ｂｅｓｓａｒｄ ｅｔ ａｌ，２００９）。可溶性のＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体の投与により、ＩＬ－１５の血清半減期及びバイオアベイラビリティがｉｎ ｖｉｖｏで大きく増強されることが分かった（Ｓｔｏｋｌａｓｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
ＩＬ－１５は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞に及ぼす作用に加えて、他の免疫系成分にもいくつかの作用を及ぼす。ＩＬ－１５は、好中球をアポトーシスから保護し、貪食作用を調節し、ＩＬ－８及びＩＬ－１Ｒアンタゴニストの分泌を刺激する。ＩＬ－１５は、ＪＡＫ２、ｐ３８及びＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ、Ｓｙｋキナーゼ、ならびにＮＦ－ｋＢ転写因子の活性化により機能する（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。マスト細胞においては、ＩＬ－１５は成長因子及びアポトーシス阻害剤として機能する。このような細胞では、ＩＬ－１５はγｃ結合を必要とすることなくＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５経路を活性化する（Ｔａｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。また、ＩＬ－１５は、Ｂリンパ球の増殖及び分化も誘導し、免疫グロブリン分泌を増加させる（Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。また、Ｆａｓ媒介性アポトーシスを防止し、ＣＤ４ヘルプとは部分的に独立して抗体応答の誘導を可能にする（Ｄｅｍｅｒｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。単球、マクロファージ、及び樹状細胞は、有効にＩＬ－１５を転写及び翻訳する。また、ＩＬ－１５刺激にも応答する。マクロファージは、食作用を増大させ、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、及びＭＣＰ－１発現を誘導し、ＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＴＮＦαを分泌することによって応答する（Ｂｕｄａｇｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＩＬ－１５と共にインキュベートした樹状細胞は、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ４０、及びＭＨＣクラスＩＩ発現増加を伴って成熟を示し、またアポトーシスにも抵抗性であり、インターフェロン－γ分泌の増強を示す（Ａｎｇｕｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。
また、ＩＬ－１５は、筋細胞、脂肪細胞、内皮細胞、及び神経細胞を含めた非血液細胞にも作用を及ぼすことが示されている。ＩＬ－１５は筋肉に同化作用を及ぼし、筋肉細胞分化を指示し得る（Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＩＬ－１５は、筋細胞及び筋線維を刺激して収縮タンパク質を蓄積させ、また、がん関連カヘキシーを有するラットの筋消耗を遅らせることができる（Ｆｉｇｕｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。また、ＩＬ－１５は、血管新生を刺激し（Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、ミクログリアの成長及び生存を誘導することも示されている（Ｈａｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
インターロイキン７（ＩＬ－７）は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５ファミリーにも属し、十分に特性評価された多面発現性サイトカインであり、間質細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、及びケラチノサイトによって発現し、活性化後は樹状細胞によっても発現する（Ａｌｐｄｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。当初、ＩＬ－７は前駆Ｂリンパ球の成長及び分化因子として説明されていたが、その後の研究により、Ｔリンパ球の発生及び分化に決定的に関与することが示された。インターロイキン７シグナル伝達は、最適なＣＤ８ Ｔ細胞の機能、ホメオスタシス、及びメモリーの確立に不可欠であり（Ｓｃｈｌｕｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ほとんどのＴ細胞サブセットの生存に必要であり、その発現はＴ細胞数の調節に重要であることが提唱されている。
ＩＬ－７は、ＩＬ－７Ｒα及びγｃを含む二量体受容体に結合して三元複合体を形成し、当該複合体は、細胞外マトリックスのリモデリング、Ｔ細胞及びＢ細胞の発生及び恒常性に根本的な役割を果たしている（Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｕｍ，２００７）。また、ＩＬ－７Ｒαは、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）及びその受容体（ＴＳＬＰＲ）と交差反応して三元複合体を形成し、ＴＳＬＰ経路を活性化し、その結果ヒトの場合はＴ細胞及び樹状細胞が増殖し、マウスの場合はＢ細胞がさらに発生する（Ｌｅｏｎａｒｄ，２００２）。そのため、当該複合体によって活性化されるシグナル伝達カスケードの緊密な調節は、正常な細胞機能にとって不可欠である。ＩＬ－７Ｒα外部ドメインの変異によって引き起こされるＩＬ－７経路の刺激不足は、Ｔ細胞及びＢ細胞の発達を阻害し、その結果、重篤な複合免疫不全（ＳＣＩＤ）形態を有する患者が発生する（Ｇｉｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐｕｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
ＩＬ－７は、細胞傷害性化学療法を受けた後のがん患者の免疫再構築を強化する役割を果たし得る。ＩＬ－７療法は、免疫再構築を強化し、少数の胸腺移出細胞であってもその末梢拡大を促進することにより、限定された胸腺機能であっても増強することができる。そのため、ＩＬ－７療法は、細胞傷害性化学療法によって枯渇した患者の免疫系を修復する潜在可能性がある（Ｃａｐｉｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
インターロイキン１２（ＩＬ－１２）は、２つの別々にコードされたサブユニット（ｐ３５及びｐ４０）のジスルフィド結合ヘテロ二量体であり、これらは共有結合して、いわゆる生物活性ヘテロ二量体（ｐ７０）分子を生じる（Ｌｉｅｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ヘテロ二量体（ＩＬ－１２及びＩＬ－２３）の形成とは別に、ｐ４０サブユニットは単量体（ｐ４０）及びホモ二量体（ｐ４０２）としても分泌される。当技術分野では、ヘテロ二量体が、ｐ３５をｐ４０サブユニットに接続するリンカーを有する単一の鎖として合成されると、ヘテロ二量体の完全な生物学的活性が維持されることが知られている。ＩＬ－１２は、感染症に対する初期の炎症応答及びＴｈ１細胞（細胞媒介性免疫に有利である）の生成に不可欠な役割を果たしている。ＩＬ－１２は、複数の自己免疫性炎症疾患（例えば、ＭＳ、関節炎、１型糖尿病）の発症に関与するため、その過剰産生が宿主にとって危険であることが分かっている。
ＩＬ－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）は、活性化Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞の表面に発現するＩＬ－１２Ｒβ１鎖及びＩＬ－１２Ｒβ２鎖からなるヘテロ二量体複合体である（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＩＬ－１２Ｒβ１鎖はＩＬ－１２ｐ４０サブユニットに結合し、一方、ＩＬ－１２ｐ３５はＩＬ－１２Ｒβ２と会合して細胞内シグナル伝達能力を付与する（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＩＬ－１２Ｒを介したシグナル伝達は、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ２）及びチロシンキナーゼ（Ｔｙｋ２）のリン酸化を誘導し、これらはシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、及びＳＴＡＴ５をリン酸化し活性化する。ＩＬ－１２の特異的細胞作用は、主にＳＴＡＴ４の活性化によるものである。ＩＬ－１２は、ナチュラルキラー細胞及びＴ細胞を誘導してサイトカイン、詳細にはインターフェロン（ＩＦＮ）γを産生し、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１表現型への分化を含めたＩＬ－１２の炎症促進活性の多くを媒介する（Ｍｏｎｔｅｐａｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
Ｔｒｅｇ細胞は、活発に免疫系の活性化を抑制し、病的な自己反応性及び結果的な自己免疫疾患を防止する。自己免疫疾患の治療のための制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する薬物及び方法の開発は熱心な研究の主題であり、活性インターロイキンを炎症部位に選択的に送達することができる本発明が開発されるまで、大部分は不成功であった。Ｔｒｅｇは、他の免疫細胞の活性を抑制するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞のクラスである。Ｔｒｅｇは、免疫系恒常性の中心的存在であり、自己抗原に対する忍容性の維持及び外来抗原に対する免疫応答の調節に大きな役割を果たしている。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含めた複数の自己免疫疾患及び炎症性疾患は、Ｔｒｅｇ細胞数及びＴｒｅｇ機能が欠乏していることが示されている。
したがって、Ｔｒｅｇ細胞の数及び／または機能をブーストする治療の開発に大きな関心が寄せられている。検討されている自己免疫疾患の１つの治療アプローチとしては、ｅｘ ｖｉｖｏ増殖させた自己Ｔｒｅｇ細胞の移植がある（Ｔａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｍｅｄ．，３：１－１５）。このアプローチは、動物疾患モデルの処置及びいくつかの初期段階のヒト臨床試験で有望視されているが、患者自身のＴ細胞を用いた個別化治療を必要とし、侵襲性であり、技術的にも複雑である。もう１つのアプローチは、低用量のインターロイキン２（ＩＬ－２）による治療である。Ｔｒｅｇ細胞は、サブユニットＩＬ２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ２Ｒβ（ＣＤ１２２）、及びＩＬ２Ｒγ（ＣＤ１３２）から構成された高親和性ＩＬ－２受容体ＩＬ２Ｒαβγを高い構成的レベルで発現していることを特徴とし、Ｔｒｅｇ細胞成長はＩＬ－２に依存的であることが示されている（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３３：１５３－６５）。
逆に、ＩＬ－２を用いた免疫活性化も達成されており、組換えＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））がある特定のがんの治療に承認されている。高用量ＩＬ－２は、全生存率に長期的影響を及ぼす転移性黒色腫及び転移性腎細胞癌の患者の治療に使用される。
慢性ＧＶＨＤ患者（Ｋｏｒｅｔｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３６５：２０５５－６６）及びＨＣＶ関連自己免疫血管炎患者（Ｓａａｄｏｕｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３６５：２０６７－７７）の低用量ＩＬ－２治療の臨床試験では、Ｔｒｅｇレベルの増加及び臨床的有効性の徴候が実証されている。他の複数の自己免疫疾患及び炎症性疾患におけるＩＬ－２の有効性を検討する新たな臨床試験が開始している。いわゆる低用量ＩＬ－２を使用する理由は、Ｔｒｅｇｓ上で構成的に発現する三量体ＩＬ－２受容体の高ＩＬ－２親和性を活用すると共に、高親和性受容体を発現しない他のＴ細胞を不活性化状態にしておくためであった。これらの試験で使用されたＩＬ－２の組換え形態のアルデスロイキン（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡによりＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）として販売）は、高い毒性に関連する。アルデスロイキンは、転移性黒色腫及び転移性腎癌の治療用に承認されているが、その副作用が非常に重篤であるため、集中治療にアクセス可能な病院環境での使用のみが推奨されている（Ｗｅｂアドレス：ｗｗｗ．ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ．ｃｏｍ／ａｓｓｅｔｓ／ｐｄｆ／ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ．ｐｄｆ）。
自己免疫疾患におけるＩＬ－２の臨床試験では、Ｔｒｅｇ細胞の標的化のために低用量のＩＬ－２が用いられている。これは、Ｔｒｅｇ細胞が、ＩＬ２Ｒアルファを発現することにより、他の多くの免疫細胞タイプよりも低濃度のＩＬ－２に応答するためである（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ Ｄ，２０１５ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２８３－９４）。しかし、このような低用量であっても安全性及び忍容性の問題が生じ、使用する治療では、毎日の皮下注入を慢性的に、または断続的な５日間の治療コースで用いている。そのため、Ｔｒｅｇ細胞の数及び機能を増強し、ＩＬ－２よりもＴｒｅｇ細胞を特異的に標的化し、安全性及び忍容性がより高く、投与頻度がより低い自己免疫疾患療法が必要とされている。
ＩＬ－２ベース療法の治療指数を改善するために提案されている１つのアプローチは、他の免疫細胞よりもＴｒｅｇ細胞に選択的であるＩＬ－２のバリアントを使用することである。ＩＬ－２受容体は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好酸球、及び単球を含めた様々な異なる免疫細胞タイプ上で発現し、この幅広い発現パターンが、免疫系に及ぼす多面的な影響及び高い全身毒性に寄与する可能性がある。詳細には、活性化Ｔエフェクター細胞は、肺上皮細胞と同様にＩＬ２Ｒαβγを発現する。しかし、Ｔエフェクター細胞の活性化は、免疫応答を下方調節及び制御するという目的に真っ向から矛盾するものであり、肺上皮細胞の活性化は、肺水腫を含めた既知のＩＬ－２の用量制限副作用につながる。実際に、高用量ＩＬ－２免疫療法の主な副作用は血管漏出症候群（ＶＬＳ）であり、これは、肺及び肝臓などの臓器に血管内の液体が蓄積し、その後肺水腫及び肝細胞損傷を引き起こすものである。ＶＬＳの治療は、ＩＬ－２の中止以外に存在しない。低用量ＩＬ－２レジメンは、ＶＬＳを回避するために患者に対し試験を行っているが、準最適な治療結果を代償としている。
文献によると、ＶＬＳはＩＬ－２活性化ＮＫ細胞から炎症性サイトカインが放出されることによって引き起こされると考えられている。しかし、肺水腫は、ＩＬ－２が、機能的αβγ ＩＬ－２Ｒを低～中レベルで発現した肺内皮細胞に直接結合することから生じるという強力な証拠が存在する。そして、ＩＬ－２と肺内皮細胞との相互作用に関連する肺水腫は、ＣＤ２５欠損宿主マウスにおいては抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）でＣＤ２５との結合を阻害することにより、またはＣＤ１２２特異的ＩＬ－２／抗ＩＬ－２ ｍＡｂ（ＩＬ－２／ｍＡｂ）複合体を使用することにより抑止され、よってＶＬＳが防止された。
ＩＬ－２以外のインターロイキンサイトカインを用いた治療はより限定されている。ＩＬ－１５は、ＩＬ－２と同様の免疫細胞刺激活性を示すが、同じ阻害作用を伴わないため、有望な免疫療法候補となる。転移性悪性黒色腫または腎細胞癌の治療に組換えヒトＩＬ－１５を用いた臨床試験では、免疫細胞の分布、増殖、及び活性化に明らかな変化が実証され、抗腫瘍活性の潜在可能性が示唆された（Ｃｏｎｌｏｎ ｅｔ．ａｌ．，２０１４）。現在、ＩＬ－１５は様々な形態のがんの治療のための臨床試験が行われている。ただし、ＩＬ－１５療法は、望ましくない毒性作用、例えば、ある特定の白血病の増悪、移植片対宿主病、低血圧、血小板減少、及び肝傷害を伴うことが知られている。（Ｍｉｓｈｒａ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０１２，２２（５）：６４５－５５；Ａｌｐｄｏｇａｎ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５（２）：８６６－７３；Ｃｏｎｌｏｎ ＫＣ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２０１５，３３（１）：７４－８２）
ＩＬ－７は、胸腺でのリンパ球発生を促進し、末梢でのナイーブ及びメモリーＴ細胞の恒常性の存続を維持する。さらに、ＩＬ－７は、リンパ節（ＬＮ）の器官形成にとっても、二次リンパ器官（ＳＬＯ）に動員された活性化Ｔ細胞の維持にとっても重要である（Ｇａｏ ｅｔ．ａｌ．，２０１５）。ＩＬ－７の臨床試験では、ＩＬ－７を投与した患者はＣＤ４＋及びＣＤ８＋両方のＴ細胞の増加を示したが、ＦｏｘＰ３の発現によってモニタリングされる調節性Ｔ細胞数は有意に増加しなかった（Ｓｐｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）。２００６、２００８、及び２０１０年に報告された臨床試験では、転移性黒色腫または肉腫などの異なる種類のがん患者に異なる用量のＩＬ－７を皮下注入した。一過性の発熱及び軽度の紅斑を除き、毒性はほとんど認められなかった。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の循環レベルは顕著に増加し、Ｔｒｅｇ数は低減された。ＴＣＲレパートリー多様性は、ＩＬ－７療法後に増加した。しかし、ＩＬ－７の抗腫瘍活性は十分に評価されなかった（Ｇａｏ ｅｔ． ａｌ．，２０１５）。結果からは、ＩＬ－７療法が免疫応答を強化し広げ得ることが示唆される。
ＩＬ－１２は多面発現性サイトカインであり、その作用は自然免疫と適応免疫との相互接続をもたらす。ＩＬ－１２は当初、ＰＭＡ誘導ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株から分泌される因子として報告された。ＩＬ－１２は、その作用に基づき、細胞傷害性リンパ球成熟因子及びナチュラルキラー細胞刺激因子と呼ばれている。ＩＬ－１２は、自然免疫と適応免疫との橋渡しをし、抗がん防御の自然な機構を調整するサイトカインＩＦＮγの産生を強力に刺激することから、ヒトにおける腫瘍免疫療法の理想的な候補に思われた。しかし、臨床研究でＩＬ－１２の全身投与に伴う重篤な副作用が認められたことと、このサイトカインの治療指数が非常に狭いこととにより、がん患者にこのサイトカインを使用することへの関心は顕著に低下した（Ｌａｓｅｋ ｅｔ．ａｌ．，２０１４）。サイトカインの送達を腫瘍に向けるＩＬ－１２療法のアプローチは、ＩＬ－１２療法の過去の問題を解消し得るものであり、現在がん向けの臨床試験で行われている。
ＩＬ－２をアゴニストとして直接使用してＩＬ－２Ｒに結合し免疫応答を調節することは、十分に実証された治療上のリスク（例えば、その短い半減期及び高い毒性）により、問題となっている。これらのリスクにより、他のサイトカインの療法開発及び使用も限定されている。これらのリスクを低減する新たな形態のサイトカインが必要である。本明細書では、このようなリスクに対処し、必要とされる免疫調節治療薬を提供するために設計された、ＩＬ－２及びＩＬ－１５ならびに他のサイトカイン、サイトカインの機能的フラグメント及びムテイン、ならびに条件的活性サイトカインを含む組成物及び方法を開示する。
本発明は、直接的なＩＬ－２療法及び他のサイトカインを用いた療法の欠点に対処するように、例えば、サイトカインブロッキング部分、例えば、立体的ブロッキングポリペプチド、血清半減期延長ポリペプチド、標的化ポリペプチド、結合ポリペプチド（プロテアーゼ切断性リンカーを含む）、及びこれらの組合せを用いて設計されている。サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、及びＩＦＮγを含めたＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα、リンホトキシン）、形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）は、患者に投与したときの効力が高い。本明細書で使用する場合、「ケモカイン」とは、付近の応答性細胞における方向づけられた走化性を誘導する能力を有する小分子サイトカインのファミリーを意味する。サイトカインは強力な療法をもたらし得るが、臨床的な制御が困難な望ましくない作用を伴うことにより、サイトカインの臨床使用は制限されてきた。本開示は、望ましくない作用を低減または消失させて患者に使用することができる新たな形態のサイトカインに関する。詳細には、本開示は、キメラ型ポリペプチド（融合タンパク質）と、融合タンパク質をコードする核酸と、対応するサイトカインと比較してサイトカイン受容体を活性化する活性が減少したサイトカインまたはサイトカインの活性フラグメントもしくはムテインを含む前述の医薬製剤とを含む、医薬組成物に関する。ただし、選択された条件下、または選択された生物学的環境下では、キメラ型ポリペプチドは、対応する天然サイトカインと同じまたはそれよりも高い効力で同族受容体を活性化する。本明細書に記載のように、これは典型的には、一般的な条件下ではサイトカイン、その活性フラグメントまたはムテインの受容体活性化機能をブロックまたは阻害するが、選択された条件下、例えば、サイトカイン活性の所望の部位（例えば、炎症部位または腫瘍）に存在する条件下では当該機能をブロックまたは阻害しない、サイトカインブロッキング部分を用いて達成される。
キメラ型ポリペプチド及びキメラ型ポリペプチドをコードする核酸は、任意の好適な方法を用いて作製することができる。例えば、キメラ型ポリペプチドをコードする核酸は、組換えＤＮＡ技法、合成化学、またはこれらの技法の組合せを用いて作製し、ＣＨＯ細胞などの好適な発現系で発現させることができる。キメラ型ポリペプチドも同様に作製することができ、例えば、合成または半合成化学技法を用いて、好適な核酸を発現させることなどによって作製することができる。いくつかの実施形態において、ブロッキング部分は、ソルターゼ媒介性結合体化によってサイトカインポリペプチドに付着させることができる。「ソルターゼ」とは、標的タンパク質またはペプチドに埋め込まれたまたは末端に付着したカルボキシル末端選別シグナルを認識及び切断することによってタンパク質を修飾するトランスペプチダーゼである。ソルターゼＡは、標的タンパク質上のＴｈｒ残基及びＧｌｙ残基の間にあるＬＰＸＴＧモチーフ（Ｘは任意の標準的なアミノ酸である）（配列番号２３７）の切断を触媒し、酵素上でのＴｈｒ残基と活性部位Ｃｙｓ残基との一時的付着により、酵素－チオアシル中間体を形成する。ペプチド転移を完了しペプチド－単量体結合体を作出するには、Ｎ末端に求核性基を有する生体分子（典型的にはオリゴグリシンモチーフ）が中間体を攻撃し、ソルターゼＡを置換して２つの分子を連結する。
サイトカインブロッキング部分結合体を形成するには、最初にサイトカインポリペプチドのＮ末端をポリグリシン配列でタグ化、またはＣ末端をＬＰＸＴＧ（配列番号２３７）モチーフでタグ化する。ブロッキング部分または他のエレメントには、タグ化ポリペプチドの受容体部位として機能するそれぞれのペプチドが付着している。そのＮ末端を介し付着しているＬＰＸＴＧ（配列番号２３７）受容体ペプチドを保有するドメインと結合体化する場合、ポリペプチドのＮ末端をポリグリシンストレッチでタグ化する。そのＣ末端を介し付着しているポリグリシンペプチドを保有するドメインと結合体化する場合は、ポリペプチドのＣ末端をＬＰＸＴＧ（配列番号２３７）ソルターゼ認識配列でタグ化する。ポリグリシン及びＬＰＸＴＧ（配列番号２３７）配列を認識したソルターゼは、ポリマーペプチドとタグ化ポリペプチドとの間にペプチド結合を形成する。ソルターゼ反応はグリシン残基を中間体として切断するものであり、室温で行われる。
様々な機構を活用して、ブロッキング部分によって引き起こされる阻害を除去または低減することができる。例えば、医薬組成物は、サイトカイン部分及びブロッキング部分（例えば立体的ブロッキング部分）を含み得、プロテアーゼ切断性リンカーは、サイトカインとサイトカインブロッキング部分との間、またはサイトカインブロッキング部分内に位置するプロテアーゼ切断部位を含む。プロテアーゼ切断部位が切断されると、ブロッキング部分がサイトカインから解離し、次にサイトカインがサイトカイン受容体を活性化することができる。
任意の好適なリンカーを使用することができる。例えば、リンカーは、グリシン－グリシン、ソルターゼ認識モチーフ、またはソルターゼ認識モチーフ及びペプチド配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２３８）もしくは（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２３９）（ｎは１、２、３、４、または５である）を含み得る。典型的には、ソルターゼ認識モチーフはペプチド配列ＬＰＸＴＧ（配列番号２３７）（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む。いくつかの実施形態において、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＣ末端に付着した反応性リジン残基と、ブロッカーまたは他のドメインのＮ末端に付着した反応性アスパラギン酸との間に存在する。他の実施形態において、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＮ末端に付着した反応性アスパラギン酸残基と、ブロッカーまたは別のドメインのＣ末端に付着した反応性リジン残基との間に存在する。
したがって、本明細書で詳細に説明するように、使用するサイトカインブロッキング部分は立体的ブロッカーであり得る。本明細書で使用する場合、「立体的ブロッカー」とは、リンカーなどの他の部分を介し、例えばキメラ型ポリペプチド（融合タンパク質）の形態で、直接的または間接的にサイトカインポリペプチドに共有結合することができ、ただし他の場合にはサイトカインポリペプチドに共有結合しない、ポリペプチドまたはポリペプチド部分を指す。立体的ブロッカーは、例えば、静電結合、疎水結合、イオン結合、または水素結合により、サイトカインポリペプチドに非共有結合することができる。立体的ブロッカーは、サイトカイン部位への近位性及び比較上のサイズのため、典型的にはサイトカイン部分の活性を阻害またはブロックする。サイトカイン部分の立体的阻害は、サイトカイン部分を立体的ブロッカーから空間的に分離することによって除去することができ、これは例えば、立体的ブロッカー及びサイトカインポリペプチドを含む融合タンパク質を、立体的ブロッカーとサイトカインポリペプチドとの間の部位で酵素的に切断することによって行われ得る。
本明細書で詳細に説明するように、ブロッキング機能は、医薬組成物中の追加の機能的成分（例えば、標的化ドメイン、血清半減期延長エレメント、及びプロテアーゼ切断性結合ポリペプチド）と組み合わされ得、またはそれらの存在に起因するものであり得る。例えば、血清半減期延長ポリペプチドは立体的ブロッカーでもあり得る。
本発明の全範囲の簡潔な開示内容を示すため、本発明の態様は、ＩＬ－２を例示的なサイトカインとして用いて詳細に説明する。ただし、本発明及び本開示は、ＩＬ－２に限定されない。当業者には、開示された方法、ポリペプチド、及び核酸を含めた本開示が、他のサイトカイン、フラグメント、及びムテイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、リンホトキシン、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、及び前述のいずれかの機能的フラグメントまたはムテイン）の使用を的確に説明し可能にすることが明らかであろう。
様々なエレメントが、優先的に所望のＩＬ－２活性部位でＩＬ－２の送達及び活性を確保し、血清半減期延長戦略に優先的に結びついたブロッキング及び／または標的化戦略を介してインターロイキンへの全身曝露を厳しく限定することを確実にする。この血清半減期延長戦略においては、インターロイキンのブロックされたバージョンは長時間（優先的には１～２週間またはそれ以上）循環するが、活性化バージョンは当該インターロイキンの典型的な血清半減期を有する。
血清半減期延長バージョンと比較すると、静脈内投与されたＩＬ－２の血清半減期は、約１０分に過ぎない。これは、平均サイズの成人で約１５Ｌと大きい全身の細胞外空間内に分布するためである。その後、ＩＬ－２は腎臓により、約２．５時間の半減期で代謝される（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．”Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２４０（２００１）を参照）。他の測定値によると、ＩＬ－２の血漿中半減期は静脈内投与の場合に８５分、皮下投与の場合に３．３時間と非常に短い（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，Ｇ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：５－１０）。本発明のいくつかの実施形態において、半減期延長エレメントはリンカーを介しインターロイキンに結合しており、このリンカーは作用部位で（例えば、炎症特異的プロテアーゼによって）切断され、所望の部位でインターロイキンの完全な活性を放出すると共に、これを非切断バージョンの半減期延長エレメントから分離する。このような実施形態において、完全に活性であり遊離型のインターロイキンは、数週間ではなく数時間の半減期という、非常に異なる薬物動態（ｐＫ）特性を有すると考えられる。加えて、活性サイトカインへの曝露は、所望のサイトカイン活性のある部位（例えば、炎症部位や腫瘍）に限定され、活性サイトカインへの全身曝露ならびに関連する毒性及び副作用が低減される。
本発明で想定される他のサイトカインは、ＩＬ－２と同様の薬理学を有し（例えば、ＩＬ－１５（Ｂｌｏｏｄ ２０１１ １１７：４７８７－４７９５；ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１０－１０－３１１４５６による報告））、したがって、本発明の設計は、これらの薬剤を直接的に使用することの欠点に対処するものであり、延長された半減期を有し、及び／または所望の活性部位（例えば、炎症部位または腫瘍）に標的化することができるキメラ型ポリペプチドを提供する。
所望に応じて、ＩＬ－２は、対応する野生型ＩＬ－２とは異なる親和性で、ＩＬ－２Ｒ複合体に一般的に、または３つのＩＬ－２Ｒサブユニットのうちの１つに特異的に結合して、例えばＴｒｅｇまたはＴｅｆｆ（エフェクターＴ細胞）を選択的に活性化するように設計することができる。例えば、野生型ＩＬ－２との比較において、ＩＬ－２受容体の二量体ベータ／ガンマ形態に対しより高い親和性を三量体形態に有するとされるＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ６０５６８－１を有するヒトＩＬ－２のアミノ酸２１～１５３を含む成熟ＩＬ－２タンパク質）に関して、以下の変異セットのうちの１つを含むアミノ酸配列を有し得る：（ａ）Ｋ６４Ｒ、Ｖ６９Ａ、及びＱ７４Ｐ；（ｂ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＴ１０１Ａ；（ｃ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ｔ；（ｄ）Ｎ３０Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＦ１０３Ｓ；（ｅ）Ｋ４９Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ、及びＫ７６Ｅ；（ｆ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｔ１０１Ａ、及びＴ１３３Ｎ；（ｇ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ａ；（ｈ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＳ９９Ｐ；（ｉ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ｔ；（ｊ）Ｋ９Ｔ、Ｑ１１Ｒ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、及びＱ７４Ｐ；（ｋ）Ａ１Ｔ、Ｍ４６Ｌ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ６１Ｄ、Ｖ６９Ａ、及びＨ７９Ｒ；（ｌ）Ｋ４８Ｅ、Ｅ６８Ｄ、Ｎ７１Ｔ、Ｎ９０Ｈ、Ｆ１０３Ｓ、及びＩ１１４Ｖ；（ｍ）Ｓ４Ｐ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＴ１３３Ａ；（ｎ）Ｅ１５Ｋ、Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ；（ｏ）Ｎ３０Ｓ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｋ７６Ｒ、及びＮ９０Ｈ；（ｐ）Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｃ、Ｔ３７Ａ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ、Ｑ７４Ｐ、Ｈ７９Ｒ、及びＩ１２８Ｔ；（ｑ）Ｎ２６Ｄ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ５４Ｒ、Ｅ６７Ｇ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ；（ｒ）Ｋ８Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ；ならびに（ｓ）Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＩ８９Ｖ。このアプローチは、他のサイトカイン（インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、及びＩＦＮガンマを含めたＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン）、形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）、ならびに顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）を含む）のムテインの調製にも適用することができる。例えば、同族受容体に対し所望の結合親和性を有するムテインを調製することができる。
上述のように、本明細書で開示する任意の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、記載の配列を含み得、また、記載の配列に限定され、それ以外は配列番号１と同一であってもよい。さらに、本明細書で開示する任意の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、任意選択で、位置１２５のシステイン残基の別の残基（例えば、セリン）による置換を含み得、及び／または任意選択で、配列番号１の位置１のアラニン残基の欠失を含み得る。
ＩＬ－２ベース療法の治療指数を改善するもう１つのアプローチは、Ｔｒｅｇ細胞を最大限に活性化させるように分子の薬物動態を最適化することである。初期のＩＬ－２作用の研究では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＴ細胞増殖をＩＬ－２で刺激するには、有効濃度のＩＬ－２に最低５～６時間曝露する必要があることが実証された（Ｃａｎｔｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：１３１２－１３１６）。ヒト患者に投与する場合、ＩＬ－２の血漿中半減期は静脈内投与の場合に８５分、皮下投与の場合に３．３時間と非常に短い（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，Ｇ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：５－１０）。ＩＬ－２は半減期が短いため、Ｔ細胞増殖を刺激するのに必要なレベル以上の循環ＩＬ－２を必要な期間の間維持するには、Ｔｒｅｇ細胞のＥＣ５０を顕著に上回るピークＩＬ－２レベルをもたらす高用量または高頻度の投与が必要となる。このような高いＩＬ－２ピークレベルは、ＩＬ２Ｒβγ受容体を活性化し、他の意図されないまたは有害な作用、例えば上述のようなＶＬＳをもたらす可能性がある。ＩＬ－２アナログ、すなわち、ＩＬ－２をＦｃＲｎ受容体との結合を可能にするドメインに付着させた多機能タンパク質は、ＩＬ－２よりも循環半減期が長く、ＩＬ－２よりも低用量かつ低いピークレベルで、指定された期間の間、標的薬物濃度を達成することができる。そのため、このようなＩＬ－２アナログは、Ｔｒｅｇ細胞を有効に刺激するのに必要な用量または投与頻度がＩＬ－２よりも少ない。ＩＬ－２薬物の皮下投与の頻度が少なければ、患者の忍容性も高まる。このような特徴を有する治療薬は、臨床的には薬理学的有効性の改善、毒性の低減、療法に対する患者のコンプライアンス改善につながる。代替的に、ＩＬ－２またはＩＬ－２のムテイン（本明細書では「ＩＬ－２＊」とする）は、意図された作用部位（例えば、炎症部位）に選択的に標的化してもよい。この標的化は、切断されるＩＬ－２（またはムテイン）のブロッカーを含むドメインを投与する薬剤に追加すること、ドメインを標的化すること、またはこの２つの組合せを含めたいくつかの戦略のうちの１つによって達成することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２＊部分アゴニストは、所望の標的に応じてより高いまたは低い親和性で結合するように調整することができる。例えば、ＩＬ－２＊は、受容体サブユニットのうちの１つに高い親和性で結合し、他のサブユニットには結合しないように操作することができる。このようなタイプの部分アゴニストは、完全アゴニストまたは完全アンタゴニストとは異なり、シグナル伝達特性を、望ましい機能的特性を誘発する振幅に調整し、望ましくない特性の閾値は満たさないようにすることができる。部分アゴニストの活性が異なることを考慮すれば、ほぼ完全なアゴニズムから部分的なアゴニズム、完全なアンタゴニズムに至るまで、さらに精細な程度の特徴的なシグナル活性を示すようにＩＬ－２のレパートリーを設計することができると考えられる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２＊は、ＩＬ－２Ｒαに対する親和性が変化している。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２＊は、野生型のＩＬ－２よりもＩＬ－２Ｒαに対する親和性が高い。他の実施形態において、ＩＬ－２＊は、ＩＬ－２Ｒβに対する親和性が変化している。１つの実施形態において、ＩＬ－２＊は、ＩＬ－２Ｒβ（例えばＩＬ－２ＲβのＮ末端）に対する結合親和性が強化されており、これによりＩＬ－２Ｒαの機能的要件が排除される。別の実施形態において、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性を増加させたがＩＬ－２Ｒγとの結合の減少を示し、それによってＩＬ－２Ｒβγのヘテロ二量化及びシグナル伝達が不完全であるＩＬ－２＊が生成される。
また、以下でさらに詳細に説明するブロッキング部分も、１つ以上の受容体との結合またはその活性化に好都合に働くように使用され得る。１つの実施形態において、ブロッキング部分は、ＩＬ－２Ｒβγの結合または活性化をブロックするがＩＬ－２Ｒαの結合または活性化を変化させないように追加される。別の実施形態において、ブロッキング部分は、ＩＬ－２Ｒαの結合または活性化が減弱されるように追加される。別の実施形態において、ブロッキング部分は、３つの受容体との結合及び活性化が阻害されるように追加される。このブロッキングは、特定の環境下でブロッキング部分を除去することにより、例えば、１つ以上のブロッキング部分をサイトカインに結合するリンカーをタンパク質分解性切断することにより、軽減可能であり得る。
同様のアプローチを他のサイトカインの改善にも適用することができ、詳細には、免疫刺激剤として、例えばがんを治療するために使用することができる。例えば、この態様において、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、及びＩＦＮγ、ＴＮＦα、リンホトキシン、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２１）の薬物動態及び／または薬力学は、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）及び／または細胞傷害性免疫応答促進細胞（例えば、樹状細胞成熟を誘導）を所望の活性部位で（例えば腫瘍内で、ただし全身的でないことが好ましい）最大限に活性化するように調整することができる。
したがって、本明細書では、少なくとも１つのサイトカインポリペプチド、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、及びＩＦＮγを含めたＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば。ＴＮＦ、リンホトキシン）、形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、ならびに顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）、または前述のいずれかの機能的フラグメントもしくはムテインを含む医薬組成物を提供する。またポリペプチドは、典型的には、少なくとも１つのリンカーアミノ酸配列も含み、このアミノ酸配列は、ある特定の実施形態においては内在性プロテアーゼによって切断可能である。１つの実施形態において、リンカーは、ＨＳＳＫＬＱ（配列番号２５）、ＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号２２１）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号２２２）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号２２３）、またはＳＧＥＳＰＡＹＹＴＡ（配列番号２２４）を含むアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、キメラ型ポリペプチドはさらに、インターロイキンポリペプチドの活性をブロック可能なブロッキング部分（例えば、立体的ブロッキングポリペプチド部分）を含む。ブロッキング部分は、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、または任意選択で分枝状もしくはマルチアーム型のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。代替的に、医薬組成物は、第１のサイトカインポリペプチドまたはそのフラグメントと、ブロッキング部分（例えば、立体的ブロッキングポリペプチド部分）とを含み、このとき、ブロッキング部分は、サイトカイン受容体上のサイトカインポリペプチドの活性をブロックし、またある特定の実施形態においては、ブロッキング部分はプロテアーゼ切断性ドメインを含む。いくつかの実施形態において、サイトカイン活性の遮断及び低減は、単に、非常に短いリンカーを有する追加のドメインをインターロイキンドメインのＮまたはＣ末端に付着させるだけで達成される。このような実施形態においては、ブロッキング部分のプロテアーゼ消化、またはブロッカーをインターロイキンにテザリングする短いリンカーのプロテアーゼ消化により、遮断が緩和されることが予測される。ひとたびドメインがクリッピングまたは放出されると、ドメインはサイトカイン活性の遮断が達成できなくなる。
医薬組成物、例えばキメラ型ポリペプチドは、２つ以上のサイトカインを含み得、これらは同じサイトカインポリペプチドであっても異なるサイトカインポリペプチドであってもよい。例えば、２つ以上の異なるタイプのサイトカインは相補的な機能を有する。いくつかの例では、第１のサイトカインはＩＬ－２であり、第２のサイトカインはＩＬ－１２である。いくつかの実施形態において、２つ以上の異なるタイプのサイトカインポリペプチドの各々が、他のサイトカインポリペプチドの活性を調節する活性を有する。２つのサイトカインポリペプチドを含むキメラ型ポリペプチドのいくつかの例では、第１のサイトカインポリペプチドがＴ細胞活性化性であり、第２のサイトカインポリペプチドが非Ｔ細胞活性化性である。２つのサイトカインポリペプチドを含むキメラ型ポリペプチドのいくつかの例では、第１のサイトカインは化学誘引物質、例えばＣＸＣＬ１０であり、第２のサイトカインは免疫細胞活性化物質である。
好ましくは、本明細書で開示する融合タンパク質に含まれるサイトカインポリペプチド（機能的フラグメントを含む）は、受容体結合親和性及び特異性または血清半減期を含めた天然のサイトカインの特性を変更するように変異または操作されていない。ただし、クローニングを容易にするための、及び所望の発現レベルを達成するための天然（野生型を含む）のサイトカインからのアミノ酸配列の変化は許容される。
ａ．ブロッキング部分
ブロッキング部分は、サイトカインがその受容体に結合する及び／または受容体を活性化する能力を阻害する任意の部分であり得る。ブロッキング部分は、サイトカインを立体的ブロックすること及び／またはサイトカインに非共有結合することにより、サイトカインのその受容体への結合及び／または活性化の能力を阻害することができる。好適なブロッキング部分の例としては、サイトカインの同族受容体の全長またはサイトカイン結合フラグメントもしくはムテインが挙げられる。また、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ科タイプナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、サイトカインに結合するｓｄＡｂなどを含めた、抗体及びそのフラグメントも使用することができる。サイトカインに結合する他の好適な抗原結合ドメインを使用してもよく、これには抗体結合及び／または構造を模倣する非イムノグロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、ファイノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、及び他の操作されたスキャフォールドに基づく結合ドメイン、例えば、ＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン、及びＣＴＬＡ４スキャフォールドが含まれる。好適なブロッキングポリペプチドのさらなる例としては、サイトカインがその同族受容体に結合するのを立体的に阻害またはブロックするポリペプチドが挙げられる。有利には、このような部分は半減期延長エレメントとしても機能し得る。例えば、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの結合体化によって修飾されているペプチドは、サイトカインがその受容体に結合するのを立体的に阻害または防止することができる。血清半減期が長いポリペプチドまたはそのフラグメント、例えば、血清アルブミン（ヒト血清アルブミン）、免疫グロブリンＦｃ、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）など、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント及びムテインも使用することができる。また、例えば、血清半減期の長いタンパク質（例えば、ＨＳＡ、免疫グロブリン、もしくはトランスフェリン）、または形質膜に再利用される受容体（例えば、ＦｃＲｎもしくはトランスフェリン受容体）に結合する抗体及び抗原結合ドメインも、特にそれらの抗原に結合した際に、サイトカインを阻害することができる。このような抗原結合ポリペプチドの例としては、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ科タイプナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ｓｄＡｂなどが挙げられる。サイトカインに結合する他の好適な抗原結合ドメインを使用してもよく、これには抗体結合及び／または構造を模倣する非イムノグロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、ファイノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、及び他の操作されたスキャフォールドに基づく結合ドメイン、例えば、ＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン、及びＣＴＬＡ４スキャフォールドが含まれる。
例示的な例では、ＩＬ－２がキメラ型ポリペプチドのサイトカインである場合、ブロッキング部分は、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒα）のアルファ鎖、またはＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒγ）のベータ（ＩＬ－２Ｒβ）もしくはガンマ鎖の全長またはフラグメントもしくはムテイン、抗ＩＬ－２シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはｓｃＦｖ、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメント、及び抗ＨＳＡ ｓｄＡｂまたはｓｃＦｖ、などであり得る。
ｂ．ｉｎ ｖｉｖｏ半減期延長エレメント
好ましくは、キメラ型ポリペプチドはｉｎ ｖｉｖｏ半減期延長エレメントを含む。天然の半減期が短い治療分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させることで、有効性を犠牲にすることなく、より許容性が高く管理しやすい投与レジメンが可能になる。本明細書で使用する場合、「半減期延長エレメント」とは、例えば、サイズ（例えば、腎臓濾過カットオフ以上になるように）、形状、流体力学的半径、電荷、または吸収、生体内分布、代謝、及び排泄のパラメーターを変更することにより、生体内半減期を延長しｐＫを改善する、キメラ型ポリペプチドの一部である。ポリペプチドのｐＫを改善する例示的な方法は、リソソームで分解されるのではなく細胞の形質膜に再利用される受容体に結合するエレメント（例えば、内皮細胞上のＦｃＲｎ受容体及びトランスフェリン受容体）をポリペプチド鎖内に発現させることである。３つのタイプのタンパク質、例えば、ヒトＩｇＧ、ＨＳＡ（またはそのフラグメント）、及びトランスフェリンは、そのサイズから予測されるよりもはるかに長くヒトの血清中に残存しており、これは、リソソームで分解されずに再利用される受容体に結合することができるという機能である。ＦｃＲｎ結合を保持するこれらのタンパク質またはそのフラグメントは、通常は血清半減期を延長するために他のポリペプチドに結合する。１つの実施形態において、半減期延長エレメントはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメインである。ＨＳＡ（配列番号２）は、医薬組成物に直接結合させても、短いリンカーを介し結合させてもよい。ＨＳＡのフラグメントも使用することができる。ＨＳＡ及びそのフラグメントは、ブロッキング部分及び半減期延長エレメントの両方として機能することができる。ヒトＩｇＧも同様の機能を実行することができる。
血清半減期延長エレメントは、血清アルブミン、トランスフェリンなどの血清半減期が長いタンパク質に結合する抗原結合ポリペプチドであってもよい。このようなポリペプチドの例としては、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ科タイプナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、サイトカインに結合するｓｄＡｂなどを含めた、抗体及びそのフラグメントが挙げられる。他の好適な抗原結合ドメインとしては、抗体結合及び／または構造を模倣する非イムノグロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、ファイノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、及び他の操作されたスキャフォールドに基づく結合ドメイン、例えば、ＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン、及びＣＴＬＡ４スキャフォールドが挙げられる。抗原結合ポリペプチドのさらなる例としては、所望の受容体のリガンド、受容体のリガンド結合部分、レクチン、及び１つ以上の標的抗原に結合または会合するペプチドが挙げられる。
いくつかの好ましい血清半減期延長エレメントとしては、相補性決定領域（ＣＤＲ）と任意選択で非ＣＤＲループとを含むポリペプチドがある。有利には、このような血清半減期延長エレメントは、サイトカインの血清半減期を延長することができ、また、サイトカインの阻害剤として（例えば、立体的ブロッキング、非共有結合相互作用、またはこれらの組合せを介し）及び／または標的化ドメインとしても機能する。いくつかの場合では、血清半減期延長エレメントは、免疫グロブリン分子（Ｉｇ分子）に由来するドメイン、あるいは抗体構造及び／または結合活性を模倣した操作されたタンパク質スキャフォールドである。Ｉｇは、任意のクラスまたはサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭなど）であってもよい。Ｉｇ分子のポリペプチド鎖は、ループによって結合した一連の平行なβ鎖に折り畳まれる。可変領域内では、３つのループが、分子の抗原結合特異性を決定する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を構成する。ＩｇＧ分子は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、またはこれらの抗原結合フラグメントを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に細分することができ、これは配列が高度に変化し、及び／または抗原認識に関与し、及び／または通常は構造的に定義されたループを形成し、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に並んでいる。本開示のいくつかの実施形態において、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のアミノ酸配列の少なくとも一部または全部が、本明細書に記載の結合部分の「非ＣＤＲループ」の一部である。免疫グロブリン分子の可変ドメインは、２つのシートに配置されたいくつかのβストランドを有する。免疫グロブリン軽鎖及び重鎖両方の可変ドメインは、３つの超可変ループ、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。Ｖドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）は、βバレルの一端でクラスター化している。ＣＤＲは、免疫グロブリンフォールディングのβストランドＢ－Ｃ、Ｃ’－Ｃ”、及びＦ－Ｇを接続するループであり、免疫グロブリンフォールディングのβストランドＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”－Ｄ、及びＥ－Ｆを接続するボトムループ、ならびに免疫グロブリンフォールディングのＤ－Ｅストランドを接続するトップループは非ＣＤＲループである。本開示のいくつかの実施形態において、定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３の少なくとも一部のアミノ酸残基は、本明細書に記載の結合部分の「非ＣＤＲループ」の一部である。非ＣＤＲループは、いくつかの実施形態において、ＩｇまたはＩｇ様分子のＣ１セットドメインのＡＢ、ＣＤ、ＥＦ、及びＤＥループ；ＩｇまたはＩｇ様分子のＣ２セットドメインのＡＢ、ＣＣ’、ＥＦ、ＦＧ、ＢＣ、及びＥＣ’ループ；ＩｇまたはＩｇ様分子のＩ（中間体）セットドメインのＤＥ、ＢＤ、ＧＦ、Ａ（Ａ１Ａ２）Ｂ、及びＥＦループのうちの１つ以上を含む。
可変ドメイン内では、ＣＤＲが抗原の認識及び結合を担うと考えられており、一方、ＦＲ残基はＣＤＲのスキャフォールドとみなされている。しかし、ある特定の場合には、ＦＲ残基の一部が抗原の認識及び結合に重要な役割を果たしている。Ａｇの結合に影響を及ぼすフレームワーク領域残基は、２つのカテゴリーに分けられる。第１には、抗原に接触し、結合部位の一部となっているＦＲ残基であり、これらの残基の一部は配列上ＣＤＲに近い。他の残基は、配列上はＣＤＲからかけ離れているが、分子の３Ｄ構造がＣＤＲ（例えば、重鎖のループ）に近い。
結合部分は任意の種類のポリペプチドである。例えば、ある特定の例では、結合部分は、天然ペプチド、合成ペプチド、またはフィブロネクチンスキャフォールド、または操作されたバルク血清タンパク質である。バルク血清タンパク質は、例えば、アルブミン、フィブリノーゲン、またはグロブリンを含む。いくつかの実施形態において、結合部分は操作されたスキャフォールドである。操作されたスキャフォールドは、例えば、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、免疫グロブリン様スキャフォールド（Ｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９． Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ １２（７）：５６３－５７１で示唆されている）、ＤＡＲＰｉｎ、シスチンノットペプチド、リポカリン、３ヘリックスバンドルスキャフォールド、プロテインＧ関連アルブミン結合モジュール、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマースキャフォールドを含む。
場合によっては、血清半減期延長エレメントは、バルク血清タンパク質の結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲはバルク血清タンパク質の結合部位を提供する。バルク血清タンパク質は、いくつかの例では、グロブリン、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３、ＩｇＡ単量体、第ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲン、ＩｇＥ、または五量体ＩｇＭである。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｉｇκ遊離軽鎖またはＩｇλ遊離軽鎖などの免疫グロブリン軽鎖の結合部位を形成する。
血清半減期延長エレメントは、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含めた任意のタイプの結合ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、結合部分は、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態において、結合部分は非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち抗体ミメティックであり、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、ファイノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディである。
他の実施形態において、血清半減期延長エレメントは、水溶性ポリマー、またはＰＥＧなどの水溶性ポリマーと結合体化したペプチドであり得る。本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」、「ポリ（エチレングリコール）」は交換可能であり、任意の非ペプチド性水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含する。また、「ＰＥＧ」という用語は、大部分、すなわち５０％超の－ＯＣＨ２ＣＨ２－反復サブユニットを含むポリマーも意味する。具体的な形態に関しては、ＰＥＧは、以下でより詳細に説明するように、任意の数の様々な分子量をとることができ、さらに、「分枝状」、「直鎖状」、「フォーク型」、「多機能型」などの構造または幾何学的配置をとることができる。ＰＥＧは、特定の構造に限定されるものではなく、直鎖状（例えば、エンドキャップされた、例えばアルコキシＰＥＧまたは二官能性ＰＥＧ）、分枝状またはマルチアーム型（例えば、フォーク型ＰＥＧまたはポリオールコアに付着したＰＥＧ）、樹状（またはスター型）アーキテクチャーとすることができ、各々１つ以上の分解可能な結合を伴うかまたは伴わない。さらに、ＰＥＧの内部構造は、任意の数の異なる反復パターンで編成することができ、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、及びブロックトリポリマーからなる群より選択することができる。ＰＥＧは、任意の好適な方法でポリペプチド及びペプチドと結合体化することができる。典型的には、反応性ＰＥＧ誘導体（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンアミジルエステルＰＥＧ）を、アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、またはヒドロキシル官能基を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、システイン、リジン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、チロシン、セリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸）を含むペプチドまたはポリペプチドと反応させる。
ｃ．標的化ドメイン及び保持ドメイン
ある特定の用途では、体内の所望の位置にコンストラクトが存在する時間量を最大化することが望ましい場合がある。これは、キメラ型ポリペプチド（融合タンパク質）に１つのさらなるドメインを含めて体内での動きに影響を及ぼすことにより、達成され得る。例えば、キメラ型核酸は、ポリペプチドを体内のある位置（例えば、腫瘍細胞もしくは炎症部位）に導くドメインをコードすることができ（このドメインは「標的化ドメイン」と称される）、及び／またはポリペプチドを体内のある位置（例えば、腫瘍細胞もしくは炎症部位）に保持するドメインをコードすることができる（このドメインは「保持ドメイン」と称される）。いくつかの実施形態において、ドメインは標的化ドメインと保持ドメインの両方として機能し得る。いくつかの実施形態において、標的化ドメイン及び／または保持ドメインは、プロテアーゼ豊富環境に特異的である。いくつかの実施形態において、コードされた標的化ドメイン及び／または保持ドメインは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に特異的であり、例えばＣＣＲ４またはＣＤ３９受容体を標的化する。他の好適な標的化及び／または保持ドメインは、炎症組織で過剰発現する同族リガンド（例えばＩＬ－１受容体、またはＩＬ－６受容体）を有するものを含む。他の実施形態において、好適な標的化及び／または保持ドメインは、腫瘍組織で過剰発現する同族リガンド（例えばＥｐｃａｍ、ＣＥＡ、またはメソテリン）を有するものを含む。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、リンカーを介してインターロイキンに結合しており、当該リンカーは（例えば、炎症またはがん特異的プロテアーゼによって）作用部位で切断され、所望の部位で完全活性のインターロイキンを放出する。いくつかの実施形態において、標的化及び／または保持ドメインは、（例えば、炎症またはがん特異的プロテアーゼによって）作用部位で切断されないリンカーを介してインターロイキンに結合しており、サイトカインを所望の部位にとどまらせる。
選択する抗原は、場合によっては、疾患細胞または組織（例えば、腫瘍またはがん細胞）の表面に発現する。腫瘍の標的化及び保持に有用な抗原としては、限定されるものではないが、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦｏＩＲ、及びＣＥＡが挙げられる。本明細書で開示する医薬組成物には、疾患細胞または組織上で発現することが知られている２つの異なる標的抗原に結合する２つの標的化及び／または保持ドメインを含むタンパク質も含まれる。抗原結合ドメインの例示的なペアとしては、限定されてるものではないが、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、及びＨＥＲ－２／ＨＥＲ－３が挙げられる。
好適な標的化及び／または保持ドメインとしては、抗原結合ドメイン、例えば、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ科タイプナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、サイトカインに結合するｓｄＡｂなどを含めた、抗体及びそのフラグメントが挙げられる。他の好適な抗原結合ドメインとしては、抗体結合及び／または構造を模倣する非イムノグロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、ファイノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、及び他の操作されたスキャフォールドに基づく結合ドメイン、例えば、ＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン、及びＣＴＬＡ４スキャフォールドが挙げられる。抗原結合ポリペプチドのさらなる例としては、所望の受容体のリガンド、受容体のリガンド結合部分、レクチン、及び１つ以上の標的抗原に結合または会合するペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態において、標的化及び／または保持ドメインは、細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、標的化及び／または保持ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦｏＩＲのうちの少なくとも１つから選択される腫瘍抗原に特異的かつ独立的に結合する。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドは、２つの異なる抗原に特異的かつ独立的に結合し、抗原の少なくとも１つは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦｏＩＲから選択される腫瘍抗原である。
標的化抗原及び／または保持抗原は、腫瘍細胞上に発現する腫瘍抗原であり得る。腫瘍抗原は当技術分野で周知されており、例えば、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦｏｌＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、及びＣＥＡ、５Ｔ４、ＡＦＰ、Ｂ７－Ｈ３、カドヘリン－６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＤＬＬ３、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＦＬＴ－３、ｇｐＮＭＢ、ＨＰＶ－１６ Ｅ６、ＨＰＶ－１６ Ｅ７、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＭＡＧＥ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｐ－カドヘリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ５、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＭ１、Ｔｒｏｐ２、ＷＴ１が含まれる。
標的化抗原及び／または保持抗原は、免疫チェックポイントタンパク質であり得る。免疫チェックポイントタンパク質の例としては、限定されるものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ－１、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、またはＶＩＳＴＡが挙げられる。
標的化抗原及び／または保持抗原は、タンパク質、脂質、多糖類などの細胞表面分子であり得る。いくつかの実施形態において、標的化抗原及び／または保持抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷赤血球、動脈プラーク細胞、炎症または線維化組織細胞上に存在する。標的化抗原及び／または保持抗原は、免疫応答調節物質を含み得る。免疫応答調節物質の例としては、限定されるものではないが、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３、またはＧＩＴＲが挙げられる。
標的化抗原及び／または保持抗原は、サイトカイン受容体であり得る。サイトカイン受容体の例としては、限定されるものではないが、Ｉ型サイトカイン受容体、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、Ｇ－ＣＳＦ受容体、Ｉ型ＩＬ受容体、Ｅｐｏ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＴＰＯ受容体；ＩＩ型サイトカイン受容体、例えば、ＩＦＮ－アルファ受容体（ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２）、ＩＦＢ－ベータ受容体、ＩＦＮ－ガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２）、ＩＩ型ＩＬ受容体；ＣＣケモカイン受容体、例えば、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、ＸＣケモカイン受容体；腫瘍壊死受容体スーパーファミリー受容体、例えば、ＴＮＦＲＳＦ５／ＣＤ４０、ＴＮＦＲＳＦ８／ＣＤ３０、ＴＮＦＲＳＦ７／ＣＤ２７、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＴＮＦＲ１／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ／ＴＮＦＲ２／ＣＤ１２０ｂ；ＴＧＦ－ベータ受容体、例えば、ＴＧＦ－ベータ受容体１、ＴＧＦ－ベータ受容体２；Ｉｇスーパーファミリー受容体、例えば、ＩＬ－１受容体、ＣＳＦ－１Ｒ、ＰＤＧＦＲ（ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ＳＣＦＲが挙げられる。
ｄ．リンカー
上述のように、医薬組成物は１つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、例えば、ブロッキング部分がサイトカインポリペプチドの活性を阻害可能であるように、ポリペプチド間の柔軟性を提供するように機能する。リンカー配列は、サイトカインポリペプチド、血清半減期延長エレメント、及び／またはブロッキング部分のいずれかまたは全ての間に配置することができる。本明細書に記載のように、リンカーのうちの少なくとも１つはプロテアーゼ切断性であり、（１つ以上の）所望のプロテアーゼのための（１つ以上の）切断部位を含む。好ましくは、所望のプロテアーゼは、所望のサイトカイン活性部位（例えば、腫瘍微小環境）で濃縮または選択的に発現される。したがって、融合タンパク質は、所望のサイトカイン活性部位で優先的または選択的に切断される。
医薬組成物の成分の方向性は、主に設計選択の問題であり、複数の方向性が可能であることが認識されており、全てが本開示に包含されるように意図されている。例えば、ブロッキング部分は、サイトカインポリペプチドのＣ末端側またはＮ末端側に配置することができる。
本明細書では、ポリペプチド配列を含む医薬組成物を提供する。全てのペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質（これらのフラグメントを含む）と同様に、キメラ型ポリペプチドのアミノ酸配列には、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の性質または機能を変更しない追加的な修飾（アミノ酸配列バリアント）が生じ得ることを理解されたい。このような修飾には保存的アミノ酸置換が含まれ、これについては以下でさらに詳細に説明する。
本明細書で提供される組成物は、所望の機能を有する。組成物は、少なくともサイトカインポリペプチド（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、もしくはＩＦＮγ）、またはケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、ブロッキング部分（例えば、立体的ブロッキングポリペプチド）、及び任意選択の血清半減期延長エレメント、及び任意選択の標的化ポリペプチドから構成され、１つ以上のリンカーが組成物中の各ポリペプチドを接続する。第１のポリペプチド、例えばＩＬ－２ムテインは活性薬剤として提供される。インターロイキンの活性をブロックするためのブロッキング部分が提供される。リンカーポリペプチド、例えば、プロテアーゼ切断性ポリペプチドは、活性薬剤の意図された標的で特異的に発現するプロテアーゼによって切断されるように提供される。任意選択で、ブロッキング部分は、インターロイキンポリペプチドを結合することにより、第１のポリペプチドの活性をブロックする。いくつかの実施形態において、ブロッキング部分（例えば、立体的ブロッキングペプチド）は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してインターロイキンに結合しており、当該リンカーは（例えば、炎症特異的プロテアーゼによって）作用部位で切断され、所望の部位で完全活性のサイトカインを放出する。
いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシン－グリシン、ソルターゼ認識モチーフ、またはソルターゼ認識モチーフ及びペプチド配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２３８）、または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２３９）（ｎは１、２、３、４または５である）を含む。１つの実施形態において、ソルターゼ認識モチーフはペプチド配列ＬＰＸＴＧ（Ｘは任意のアミノ酸である（配列番号２３７））を含む。１つの実施形態において、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＣ末端に付着した反応性リジン残基と、ブロッキング部分または他の部分のＮ末端に付着した反応性アスパラギン酸との間に存在する。１つの実施形態において、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＮ末端に付着した反応性アスパラギン酸残基と、ブロッキング部分または他の部分のＣ末端に付着した反応性リジン残基との間に存在する。
ｅ．切断及び誘導性
本明細書に記載のように、融合タンパク質の文脈でのサイトカインポリペプチドの活性は減弱し、所望の活性部位（例えば、腫瘍微小環境）でのプロテアーゼ切断により、サイトカイン受容体アゴニストとして融合タンパク質よりもはるかに活性の高いサイトカイン形態が融合タンパク質から放出される。例えば、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体活性化（アゴニスト）活性は、別々の分子実体としてのサイトカインポリペプチドのサイトカイン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍低いものであり得る。融合タンパク質の一部であるサイトカインポリペプチドは、サイトカインポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸を含み、追加のアミノ酸を実質的に含まず、他の分子と（共有結合または非共有結合によって）会合していない場合、別々の分子実体として存在する。必要な場合、別々の分子実体としてのサイトカインポリペプチドは、いくつかの追加のアミノ酸配列（例えば、発現及び／または精製を助けるためのタグまたは短い配列）を含んでもよい。
他の例では、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体活性化（アゴニスト）活性は、融合タンパク質中のプロテアーゼ切断性リンカーの切断によって産生されるサイトカインポリペプチドを含むポリペプチドのサイトカイン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または約１０００倍低い。言い換えれば、融合タンパク質中のプロテアーゼ切断性リンカーの切断によって産生されるサイトカインポリペプチドを含むポリペプチドのサイトカイン受容体活性化（アゴニスト）活性は、融合タンパク質のサイトカイン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍高い。他の例では、組換えポリペプチドは、切断性部分と結合体化しており、このとき切断性部分は、参照ポリペプチド配列よりも１つ以上のプロテアーゼによって低減された触媒効率で切断される。
いくつかの実施形態において、切断性部分は、１つ以上のプロテアーゼによるタンパク質分解性切断に対し抵抗性である。切断性部分は、配列が特定のプロテアーゼに対するカノニカル切断性モチーフ配列から変更された結合部位を含む場合、プロテアーゼに対し抵抗性である。いくつかの実施形態において、結合部位は、プロテアーゼ切断モチーフ配列内で１つ以上の置換を行うことにより、参照配列と比較して変更される。例えば、プロテアーゼのカテプシンＳは、配列ＧＡＶＶＲＧＡ（配列番号２４０）を切断する。配列は、アルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）に置換することで、電荷を帯びた残基をより短い極性の残基に変え、カテプシンＳが配列に結合して切断する能力を低減するように置換することができる。プロテアーゼ標的配列モチーフにおけるこのような半保存的アミノ酸置換は、結合能力の低減をもたらし、そのため、このような変更された配列モチーフはプロテアーゼ抵抗性である。プロテアーゼの標的配列モチーフに、プロリン（ペプチドの二次構造にカーブを生じさせる）またはヒスチジン（他のアミノ酸側鎖との立体的干渉を生じさせる）などの破壊的アミノ酸を挿入することにより、切断不能な部分を作製することができる。本明細書で使用する場合、「プロテアーゼ抵抗性」ペプチドリンカーとは、１つ以上の指定されたプロテアーゼによる切断が低減されたまたは検出不能なペプチドリンカーである。例示的なプロテアーゼ抵抗性ペプチドリンカーは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで、特定のプロテアーゼと共にインキュベートし、次にウェスタンブロットによって消化産物を解析することによって試験することができる。
ｆ．ポリペプチド置換
本明細書に記載のポリペプチドは、対応する天然のタンパク質（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＨＳＡ）と同じアミノ酸配列を有する、または所望の機能が維持される限りにおいて天然のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有し得る成分（例えば、サイトカイン、ブロッキング部分）を含み得る。本開示のタンパク質及びそれをコードする核酸の任意の既知の修飾物及び派生物または生じ得る修飾物及び派生物を定義する１つの方法は、特定の既知の参照配列に対する同一性の観点から配列バリアントを定義することによるものと理解されたい。具体的には、本明細書で提供されるキメラ型ポリペプチドに対し少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチド及び核酸が開示される。例えば、本明細書に記載の任意の核酸またはポリペプチドの配列に対し少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチドが提供される。これは、本明細書で提供する切断性リンカーの配列に対し少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチドまたは核酸を含む。これはまた、切断ドメイン配列からの１、２、３、４、５、または６つのバリアントを含むリンカーまたは誘導性ポリペプチドのバリアントも含む。当業者であれば、２つのポリペプチドまたは２つの核酸の同一性を判定する方法を容易に理解する。例えば、同一性は、２つの配列をアラインメントした後に同一性がその最高レベルになるように計算することができる。
同一性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実施することができる。比較のための最適な配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ ２：４８２（１９８１）の局所的同一性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、または検査によって行うことができる。
同じタイプの同一性は、核酸についても、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８－５２（１９８９）；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６－７７１０（１９８９）；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１－３０６（１９８９）で開示されたアルゴリズムによって得ることができ、これらは少なくとも核酸のアラインメントに関連する資料については参照により本明細書に援用される。任意の方法が典型的には使用され得ること、ならびにある特定の場合では、これらの様々な方法の結果は異なり得るが、当業者は、これらの方法のうちの少なくとも１つで同一性が見出されるのであれば、配列が記載された同一性を有し、本明細書で開示されているものとされることを理解する。
タンパク質の修飾はアミノ酸配列の修飾を含む。アミノ酸配列の修飾は、（例えば、遺伝的多型に起因する）アレルバリエーションとして自然に生じることもあれば、環境の影響に起因して（例えば、紫外線への曝露によって）生じることもあれば、ヒトの介入によって（例えば、クローニングされたＤＡＮ配列の変異誘発によって）、例えば、誘導された点変異体、欠失変異体、挿入変異体、及び置換変異体などが生じることもある。これらの修飾の結果、アミノ酸配列の変化、サイレント変異、制限部位の修飾、または他の特異的変異がもたらされ得る。アミノ酸配列修飾は、典型的には、置換修飾、挿入修飾、または欠失修飾の３つのクラスのうちの１つ以上に分類される。挿入には、アミノ及び／またはカルボキシル末端融合と、単一または複数のアミノ残基の配列内挿入とが含まれる。挿入は、通常は、アミノまたはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さい、例えば１～４個程度の残基の挿入である。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。典型的には、約２～６個以下の残基が、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失する。アミノ酸置換は、典型的には、単一の残基の置換であるが、一度に複数の異なる位置で生じてもよく、挿入は通常１～１０個程度のアミノ酸残基であり、欠失は１～３０個の範囲の残基である。欠失または挿入は、好ましくは隣接する対で行われ、すなわち、２個の残基の欠失または２個の残基の挿入となる。置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組合せを合わせて、最終的なコンストラクトを得ることができる。変異は、リーディングフレーム外に配列を配置してはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生し得る相補的領域を作出しない。置換修飾は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入される修飾である。このような置換は、概して以下の表２に従って行われ、保存的置換と称される。
Figure 2022532217000008
特異的アミノ酸置換を含めた修飾は、既知の方法によって行われる。例えば、修飾は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって行われ、これによって修飾をコードするＤＮＡが産生され、その後組み換え細胞培養物中でＤＮＡが発現する。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位において置換変異を行う技法は周知されており、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発がある。
修飾は、結合を最適化するように選択することができる。例えば、親和性成熟技法を使用して、相補性決定領域（ＣＤＲ）の内部にランダムな変異を導入することによってｓｃＦｖの結合を変更することができる。このようなランダムな変異は、放射線、化学的変異誘発物質、またはエラープローンＰＣＲを含めた様々な技法を用いて導入することができる。複数ラウンドの変異及び選択は、例えば、ファージディスプレイを用いて実施することができる。
また、本開示は、本明細書に記載のキメラ型ポリペプチドをコードする核酸と、キメラ型ポリペプチドを産生するための及び治療目的のためのこのような核酸の使用とに関する。例えば、本発明は、キメラ型ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ）を含み、このようなＤＮＡ及びＲＮＡ分子の治療的使用に対するものである。
ｇ．例示的な組成物
本発明の例示的な融合タンパク質は、上述のエレメントを様々な方向で組み合わせる。このセクションに記載の方向は例として意図されたものであり、限定的とみなさないものとする。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、サイトカイン、ブロッキング部分、及び半減期延長エレメントを含む。いくつかの実施形態において、サイトカインは、半減期延長エレメントとブロッキング部分との間に位置する。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ブロッキング部分及び半減期延長エレメントに対しＮ末端側にある。いくつかのこのような実施形態において、サイトカインはブロッキング部分に近位であり、いくつかのこのような実施形態において、サイトカインは半減期延長エレメントに近位である。サイトカインが切断時に活性となるように、全ての実施形態に少なくとも１つのプロテアーゼ切断性リンカーが含まれなければならない。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ブロッキング部分及び半減期延長エレメントに対しＣ末端側にある。追加のエレメントは、切断性リンカー、非切断性リンカー、または直接融合によって互いに付着することができる。
いくつかの実施形態において、使用するブロッキングドメインは半減期を延長可能であり、サイトカインはこのような２つのブロッキングドメイン間に位置する。いくつかの実施形態において、サイトカインは２つのブロックドメイン間に位置し、そのうちの１つは半減期を延長可能である。
いくつかの実施形態において、２つのサイトカインが同じコンストラクトに含まれる。いくつかの実施形態において、サイトカインはそれぞれ２つのブロッキングドメインに接続しており（１つの分子内に合計３つ）、２つのサイトカインドメイン間に１つのブロッキングドメインがある。いくつかの実施形態において、薬物動態特性を最適化するために、１つ以上の追加の半減期延長ドメインを含めることができる。
いくつかの実施形態において、３つのサイトカインが同じコンストラクトに含まれる。いくつかの実施形態において、第３のサイトカインは、２つのサイトカイン間のブロックドメインの代わりに、他の２つのサイトカインをブロックするように機能し得る。
融合タンパク質に使用される好ましい半減期延長エレメントは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、血清アルブミンに結合する抗体もしくは抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦＶ、ｄＡｂ）、ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、または前述のいずれかのフラグメントである。いくつかの好ましい実施形態において、ブロッキング部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または血清アルブミンに結合する抗体もしくは抗体フラグメント、サイトカインと結合しサイトカイン受容体の結合もしくは活性化を防止する抗体、別のサイトカイン、または前述のいずれかのフラグメントである。追加の標的化ドメインを含む好ましい実施形態において、標的化ドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、及びフィブロネクチンなどの、がん細胞の表面で濃縮されている細胞表面タンパク質に結合する抗体である。
ｖｉｉ．他の使用
本明細書で開示する分離部分は、抗体－抗生物質結合体に使用することができる。本明細書で開示する分離部分は、抗微生物性抗生物質を、細菌株に特異的な抗体（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ａｂ）に接続または結合する。抗体－抗生物質結合体は、抗体が抗生物質に結合したときに抗細菌活性を示さない。しかし、宿主細胞内で内在化すると、分離部分はプロテアーゼによって切断され、遊離型抗生物質が放出される。遊離型抗生物質は、細胞内の細菌を殺滅する。
本明細書で開示する分離部分は、タンパク質の検出及び単離のために使用される化学的プローブの用途に使用することができる。化学的プローブは、小分子化合物のタンパク質との相互作用に基づいて設計されている。プローブは典型的には、標的タンパク質と相互作用するための共有結合モチーフと、標的タンパク質の可視化／精製のための検出／精製タグと、リンカー基とを含む。本明細書に記載の分離部分を組み込んで目的タンパク質を検出及び単離できるようにすることができる。
Ｃ．治療の方法及び医薬組成物
さらに、疾患または障害、例えば、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫性障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病などを有する、または発症するリスクのある対象を治療する方法を提供する。当該方法は、典型的には医薬組成物として投与される本明細書で開示する融合タンパク質の有効量を、それを必要とする対象に投与するものである。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、このような疾患もしくは障害を有する、または発症するリスクのある対象を選択することを含む。医薬組成物は好ましくは、炎症部位で活性化されるブロックされたサイトカイン、そのフラグメントまたはムテインを含む。１つの実施形態において、キメラ型ポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、そのフラグメントまたはムテイン、及び血清半減期延長エレメントを含む。別の実施形態において、キメラ型ポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、そのフラグメントまたはムテイン、及びブロッキング部分（例えば、立体的ブロッキングポリペプチド）を含み、このとき、立体的ブロッキングポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、そのフラグメントまたはムテインの活性を立体的にブロック可能である。別の実施形態において、キメラ型ポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、そのフラグメントまたはムテイン、ブロッキング部分、及び血清半減期延長エレメントを含む。
炎症は、有害な刺激（例えば、病原体、損傷細胞、または刺激物）に対する身体組織の複雑な生物学的応答の一部であり、免疫細胞、血管、及び分子メディエーターが関与する防御応答である。炎症の機能は、細胞傷害の初期原因を排除し、最初の傷害及び炎症プロセスで損傷を受けた壊死細胞及び組織を取り除き、組織修復を開始することである。炎症は、感染症から、症状または疾患（例えば、がん、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、ミオパチー、ＨＩＶ、肥満、または自己免疫疾患）として生じ得る。自己免疫疾患とは、自己抗原に対する異常な免疫応答に起因する慢性疾患である。本明細書で開示するポリペプチドを用いて治療することができる自己免疫疾患としては、限定されるものではないが、ループス、セリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスが挙げられる。
医薬組成物は、１つ以上のプロテアーゼ切断性リンカー配列を含み得る。リンカー配列は、各ポリペプチドが第１のポリペプチドの活性を阻害可能であるように、ポリペプチド間の柔軟性を提供するように機能する。リンカー配列は、サイトカインポリペプチド、そのフラグメントまたはムテイン、ブロッキング部分、及び血清半減期延長エレメントのいずれかまたは全ての間に配置することができる。任意選択で、組成物は２、３、４、または５つのリンカー配列を含む。リンカー配列、２、３、または４つのリンカー配列は、同じリンカー配列であっても異なるリンカー配列であってもよい。１つの実施形態において、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２３２）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号２３３）、またはＧ（ＳＧＧＧ）２ＳＧＧＴ（配列番号２３４）を含む。別の実施形態において、リンカーは、ＨＳＳＫＬＱ（配列番号２５）、ＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号２２１）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号２２２）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号２２３）、またはＳＧＥＳＰＡＹＹＴＡ（配列番号２２４）からなる群より選択されるプロテアーゼ切断性配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、エラスターゼ、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、または腫瘍細胞表面プロテアーゼからなる群より選択されるプロテアーゼによって切断される。
さらに、がんを有する、またはがんに罹患するリスクのある対象を治療する方法を提供する。当該方法は、それを必要とする対象に、典型的には医薬組成物として投与される本明細書で開示するキメラ型ポリペプチド（融合タンパク質）の有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、がんを有するまたは発症するリスクのある対象を選択することを含む。医薬組成物は、好ましくは、腫瘍部位で活性化されるブロックされたサイトカイン、そのフラグメントまたはムテインを含む。好ましくは、腫瘍は固形腫瘍である。がんは、結腸癌、肺癌、黒色腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌であり得る。
当該方法はさらに、がんを治療するための１つ以上の追加の薬剤の投与、例えば、化学療法剤（例えば。アドリアマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、チオテパ、メトトレキサート、ビサントレン、ノアントロン、チグアニン、シタリビン、プロカラビジン）、イムノオンコロジー薬剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－１、抗ＣＤ４７、抗ＧＤ２）、細胞療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、Ｔ細胞療法）、腫瘍溶解性ウイルスなどの投与を伴い得る。
本明細書では、キメラ型ポリペプチドと医薬的に許容される担体とを含む医薬製剤または組成物を提供する。本明細書で提供する組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの投与に適している。医薬的に許容される担体とは、生物学的にまたは他の点で望ましくないわけではない材料を意味し、すなわち、当該材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる医薬製剤もしくは組成物の他の成分と有害な方式で相互作用することなく、対象に投与される。担体は、活性成分の分解を最小化し、対象の副作用を最小化するように選択される。
好適な担体及びその製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。典型的には、製剤を等張にするために、適切な量の医薬的に許容される塩が製剤中に使用されるが、所望に応じて製剤は高張または低張にしてもよい。医薬的に許容される担体の例としては、限定されるものではないが、滅菌水、生理食塩水、リンゲル液のような緩衝溶液、及びデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、概して約５～約８または約７～７．５である。他の担体としては、持続放出性調製物、例えば、免疫原性ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。マトリックスは、成形された物品（例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子）の形態をとる。ある特定の担体は、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、より好ましいものとなり得る。担体は、キメラ型ポリペプチドまたはキメラ型ポリペプチドをコードする核酸配列を、ヒトまたは他の対象に投与するのに適した担体である。
医薬製剤または組成物は、局所的治療または全身的治療が望ましいのか、及び治療する領域に応じて、複数の方法で投与される。組成物は、局所、経口、非経口、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、肝内、頭蓋内、噴霧／吸入、または気管支鏡検査を介した設置を含めた複数の投与経路のいずれかを介し投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、腫瘍内、関節内、髄腔内などを含めて局所的（非全身的）に投与される。
非経口投与用調製物には、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。水性担体には、水、アルコール／水性溶液、エマルジョン、または懸濁液（生理食塩水及び緩衝媒体を含む）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が含まれる。静注用ビヒクルには、液体及び栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などが含まれる。防腐剤及び他の添加物、例えば、抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどが任意選択で存在してもよい。
局所投与用の製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体、及び粉末が含まれる。従来の医薬用担体、水性、粉末、または油性の基剤、増粘剤などが任意選択で必要であるまたは望ましい。
経口投与用の組成物には、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ、または錠剤（ｔａｂｌｅ）が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤は任意選択で望ましい。
任意選択で、キメラ型ポリペプチドまたはキメラ型ポリペプチドをコードする核酸配列は、ベクターによって投与される。核酸分子及び／またはポリペプチドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、例えば発現ベクターを介し、細胞に送達するために使用することができる複数の組成物及び方法が存在する。これらの方法及び組成物は、２つのクラス：ウイルスベース送達系及び非ウイルスベース送達系に大きく分類することができる。このような方法は、当該技術分野で周知されており、本明細書に記載に組成物及び方法と共に使用するために容易に適合可能である。このような組成物及び方法をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞を形質移入または形質導入するために使用して、例えば、コードされたキメラ型ポリペプチドを発現し、好ましくは分泌する細胞株を産生する、または対象に核酸を治療的に送達することができる。本明細書で開示するキメラ型核酸の成分は、典型的には、融合タンパク質をコードするようにインフレームで作用可能に結合している。
本明細書で使用する場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、本開示の核酸を分解なしで細胞内に輸送する作用物質であり、送達された細胞内で核酸分子及び／またはポリペプチドを発現させるプロモーターがこれに含まれる。ウイルスベクターとは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビス、及びＨＩＶ骨格を有するウイルスを含めた他のＲＮＡウイルスである。また、これらのウイルスの特性を共有し、それによってベクターとしての使用に好適となった任意のウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスベクターについては、概してＣｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）で説明されており、ベクター及びその作製方法に関しては参照により本明細書に援用される。複製欠損アデノウイルスの構築についても説明されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２１３－２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．６：２８７２－８３（１９８６）；Ｈａｊ－Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７－７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２２６－３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８－７２（１９９３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの利点及び使用は、これらのウイルスが最初の感染細胞内で複製することはできても、新たな感染性ウイルス粒子を形成することができないため、他の細胞タイプに拡散し得る程度が限定されることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、中枢神経系実質、及び複数の他の組織部位に直接ｉｎ ｖｉｖｏ送達した後に高い効率を達成することが示されている。他の有用な系としては、例えば、複製ワクシニアウイルスベクター及び宿主制限された非複製ワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
提供されるポリペプチド及び／または核酸分子は、ウイルス様粒子を介し送達することができる。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスタンパク質（複数可）からなる。ウイルス様粒子を作製及び使用するための方法は、例えば、Ｇａｒｃｅａ ａｎｄ Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：５１３－７（２００４）に記載されている。
提供するポリペプチドは、ウイルス成分デンスボディ（ＤＢ）によって送達することができる。ＤＢは、膜融合によってタンパク質を標的細胞に輸送する。ＤＢを作製及び使用するための方法は、例えば、Ｐｅｐｐｅｒｌ－Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２７８－８４（２００３）に記載されている。
提供するポリペプチドは、テグメント凝集体によって送達することができる。テグメント凝集体を作製及び使用するための方法は、国際公開第ＷＯ２００６／１１０７２８号に記載されている。
非ウイルスベースの送達方法は、核酸分子と、ポリペプチドをコードする核酸配列とを含む発現ベクターを含み得、このとき、核酸は発現制御配列に作用可能に結合している。好適なベクター骨格としては、例えば、当技術分野で通常使用されているもの、例えば、プラスミド、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣが挙げられる。多数のベクター及び発現系が、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）などの企業から市販されている。ベクターは典型的には、１つ以上の調節領域を含む。調節領域としては、限定されるものではないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始点、終結配列、ポリアデニル化配列、及びイントロンが挙げられる。このようなベクターを使用して、ＣＨＯ細胞などの好適な宿主細胞での発現によってキメラ型ポリペプチドを作製することもできる。
哺乳類宿主細胞内でベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源から得ることができ、例えば、ウイルスのゲノム、例えばポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から、あるいは異種哺乳類プロモーター、例えばβ－アクチンプロモーターもしくはＥＦ１αプロモーター、またはハイブリッドもしくはキメラ型プロモーター（例えば、β－アクチンプロモーターと融合したＣＭＶプロモーター）から得ることができる。当然ながら、宿主細胞または関連種に由来するプロモーターも本明細書では有用である。
エンハンサーとは、概して、転写開始点から固定の距離を置かずに機能するＤＮＡの配列を指し、転写単位に対し５’側または３’側のいずれであってもよい。さらに、エンハンサーは、イントロン内にもコーディング配列自体の中にも存在し得る。通常、長さは１０～３００塩基対（ｂｐ）であり、シスで機能する。エンハンサーは通常、付近のプロモーターからの転写を増加させるように機能する。また、エンハンサーは、転写の調節を媒介する応答エレメントも含み得る。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、インスリン）からの多くのエンハンサー配列が知られているが、典型的には、一般的発現のために真核細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。好ましい例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーがある。
プロモーター及び／またはエンハンサーは、誘導性（例えば、化学的または物理的に調節されている）であり得る。化学的に調節されるプロモーター及び／またはエンハンサーは、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、または金属の存在によって調節され得る。物理的に調節されるプロモーター及び／またはエンハンサーは、温度及び光などの環境因子によって調節され得る。任意選択で、プロモーター及び／またはエンハンサー領域は、転写する転写ユニットの領域の発現を最大化するように構成的プロモーター及び／またはエンハンサーとして作用することができる。ある特定のベクターでは、プロモーター及び／またはエンハンサー領域は、細胞タイプ特異的な方式で活性であり得る。任意選択で、ある特定のベクターでは、プロモーター及び／またはエンハンサー領域は、細胞タイプに非依存的に全ての真核細胞内で活性であり得る。このタイプの好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、及びレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）である。
また、ベクターは、例えば、複製起点及び／またはマーカーも含み得る。マーカー遺伝子は、選択可能な表現型（例えば、抗生物質耐性）を細胞に付与することができる。マーカー製品は、ベクターが細胞に送達されたか、及び送達されたら発現しているかを判定するために使用される。哺乳類細胞の選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、及びブラスチジンがある。このような選択マーカーが首尾よく哺乳類宿主細胞に移行すると、形質転換した哺乳類宿主細胞は選択圧力下に置かれても生き残ることができる。他のマーカーの例としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びルシフェラーゼが挙げられる。加えて、発現ベクターは、発現したポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を容易にするように設計されたタグ配列を含み得る。タグ配列、例えば、ＧＦＰ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．）は、典型的には、コードされたポリペプチドとの融合物として発現する。このようなタグは、カルボキシルまたはアミノ末端のいずれかを含めたポリペプチド内の任意の位置に挿入することができる。
本明細書で使用する場合、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質という用語は、ペプチド結合によって結合する２つ以上のアミノ酸を意味するように広く使用される。またタンパク質、ペプチド、及びポリペプチドは、本明細書ではアミノ酸配列を指すためにも交換可能に使用される。認識されたいのは、ポリペプチドという用語が、本明細書では当該分子を構成する特定のサイズまたは数のアミノ酸を示唆するためには使用されないこと、及び本発明のペプチドが、最大数個のアミノ酸残基またはそれ以上を含み得ることである。全体において使用する場合、対象とは、脊椎動物、より具体的には哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、及びモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び任意の他の動物とすることができる。当該用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、雄か雌かにかかわらず、成体及び新生仔の対象が網羅されるように意図されている。本明細書で使用する場合、患者または対象は交換可能に使用され得、疾患または障害（例えば、がん）を有する対象を指し得る。患者または対象という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。
疾患または障害を発症するリスクのある対象は、当該疾患もしくは障害の遺伝的素因があり得、例えば、家族歴を有する、または遺伝子内に当該疾患もしくは障害を引き起こす変異を有する、または当該疾患もしくは障害の早期徴候もしくは症状を示し得る。現在疾患または障害を有する対象は、当該疾患または障害の１つ以上の症状を有し、当該疾患または障害と診断されている可能性がある。
本明細書に記載の方法及び薬剤は、予防的治療及び療法的治療の両方に有用である。予防的使用については、本明細書に記載のキメラ型ポリペプチドまたはキメラ型ポリペプチドをコードするキメラ型核酸配列の治療有効量を、発症前（例えば、がんもしくは炎症の明らかな徴候の前）または発症初期の間（例えば、がんもしくは炎症の最初の徴候及び症状の際）に対象に投与する。予防的投与は、がんまたは炎症の症状の発現前に数日から数年間行うことができる。予防的投与は、例えば、がんに対する遺伝的素因があると診断された対象の予防的治療で使用することができる。療法的治療は、がんまたは炎症（例えば、自己免疫疾患）の診断または発症後に、本明細書に記載のキメラ型ポリペプチドまたはキメラ型ポリペプチドをコードする核酸配列の治療有効量を対象に投与することを伴う。予防的使用は、患者が、炎症が予想される治療（例えば、化学療法）を受けている場合にも、適用することができる。
本明細書で教示されている方法によれば、対象は薬剤（例えば、キメラ型ポリペプチド）の有効量を投与される。有効量及び有効薬用量という用語は、交換可能に使用される。有効量という用語は、望ましい生理的応答をもたらすのに必要な量として定義される。薬剤を投与するための有効量及びスケジュールは、経験的に判断することができ、このような判断を行うことは、当業者の技量範囲内である。投与のための薬用量範囲は、疾患または障害の１つ以上の症状に影響を及ぼす（例えば、低減または遅延する）所望の作用をもたらすのに十分多い範囲である。薬用量は、実質的に有害な副作用（例えば、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応など）を引き起こすほど大量であってはならない。概して薬用量は、年齢、状態、性別、疾患のタイプ、疾患もしくは障害の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるかどうかによって変動し、当業者が判断することができる。薬用量は、任意の禁忌の発生時には個々の医師が調整することができる。薬用量は変動し得、１回以上の用量を毎日、１日または数日間投与することができる。所与のクラスの医薬製品における適切な薬用量についての指針は、文献に見出すことができる。
本明細書で使用する場合、治療、治療する、または治療することという用語は、疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症状の影響を低減する方法を指す。したがって、本開示の方法において、治療は、確立された疾患もしくは状態の重症度、または当該疾患もしくは状態の症状の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低減を指し得る。例えば、疾患を治療するための方法は、対象の疾患の１つ以上の症状が、対照と比較して１０％低減する場合、治療であると見なされる。したがって、この低減は、ネイティブまたは対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％～１００％の間の任意の低減パーセントであり得る。治療が必ずしも疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な消失を指すわけではないことを理解されたい。
本明細書で使用する場合、疾患または障害を防止する、防止すること、及びその防止という用語は、対象が疾患もしくは障害の１つ以上の症状を示し始める前に、または示し始めるのとほぼ同時に生じる、疾患または障害の１つ以上の症状の発症または増悪を阻害または遅延させる作用、例えば、キメラ型ポリペプチドまたはキメラ型ポリペプチドをコードする核酸配列の投与を指す。本明細書で使用する場合、減少、低減、または阻害に関する言及は、対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の変化を含む。このような用語は完全な消失を含むことがあるが、必ずしも含むわけではない。
ＩＬ２ＲβγよりもＩＬ２Ｒαβγに選択的であるＩＬ－２バリアントが開発されている（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１１９７－２０２；Ｃａｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．，８：２１７１－８３）。これらのバリアントは、ＩＬ２ＲＢに対する親和性を低減するアミノ酸置換を有する。ＩＬ－２はＩＬ２ＲＧとの親和性が検出不能のため、これらのバリアントは結果的にＩＬ２Ｒβγ受容体複合体に対する親和性が低減し、ＩＬ２Ｒβγ発現細胞を活性化する能力が低減するが、ＩＬ２ＲＡに結合する能力及びＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体に結合し活性化させる能力は保持する。
これらのバリアントの１つ、ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ（Ｂａｙ ５０－４７９８）は、免疫系刺激剤としてのＩＬ－２の低毒性バージョンとして、ＩＬ２Ｒβγ発現ＮＫ細胞が毒性の主な寄与因子であるという仮説に基づいて臨床試験が行われた。Ｂａｙ ５０－４７９８は、ＮＫ細胞に比べて活性化Ｔ細胞の増殖を選択的に刺激することが示されており、がん患者（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１３：３３１２－９）及びＨＩＶ患者（Ｄａｖｅｙ，Ｒ．Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，２００８，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，２８：８９－１００）を対象とした第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で評価が行われた。これらの臨床試験により、Ｂａｙ ５０－４７９８はアルデスロイキンよりもかなり安全かつ忍容性が高いことが示され、また、Ｔｒｅｇ細胞に富む細胞集団ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のレベルを増加させることも示された。これらの臨床試験の後、当該分野の研究でＴｒｅｇ細胞の内容がより完全に確証され、Ｔｒｅｇ細胞がＩＬ２Ｒαβγを選択的に発現することが実証された（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３３：１５３－６５で概説）。この新たな研究に基づき、今や、ＩＬ２Ｒαβγ選択的アゴニストがＴｒｅｇ細胞に選択的であるはずであることが理解され得る。
加えて、ネイティブＩｌ－２と比較してＣＤ２５鎖に対する親和性を選択的に変更する変異体を作製することができる。
ＩＬ－２は、対応する野生型ＩＬ－２または現在入手可能な変異体（位置１２５のシステイン残基がセリン残基で置き換えられているためＣ１２５Ｓと称される）とは異なる親和性で、ＩＬ－２Ｒ複合体に一般的に結合する変異体、またはＩＬ－２Ｒαサブユニットに特異的に結合する変異体を産生するように操作することができる。
したがって、本発明は、野生型ＩＬ－２に対し少なくとも８０％同一（例えば、８５、８７、９０、９５、９７、９８、または９９％同一）であるアミノ酸配列を含み、野生型ＩＬ－２と比較して、二量体ＩＬ－２受容体よりも高度にＩＬ－２三量体受容体に結合する、変異体インターロイキン－２（ＩＬ－２＊）ポリペプチドを特徴とする。典型的には、ムテインは、野生型ＩＬ－２がＩＬ－２Ｒαに結合する親和性よりも高い親和性で、ＩＬ－２受容体αサブユニット（ＩＬ－２Ｒα）にも結合する。変異体ＩＬ－２ポリペプチド内のアミノ酸配列は、保存的または非保存的な置換と考えられ得る１つ以上のアミノ酸置換を含む（またはそれのみを含む）ことにより、配列番号１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６０５６８）から変化することができる。非天然のアミノ酸も組み込むことができる。代替または追加として、アミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸残基を含むことならびに付加及び／または欠失させることによって配列番号１（「参照」配列とみなされ得る）から変化させてもよい。より具体的には、アミノ酸配列は、配列番号１の以下の位置：１、４、８、９、１０、１１、１３、１５、２６、２９、３０、３１、３５、３７、４６、４８、４９、５４、６１、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７５、７６、７９、８８、８９、９０、９２、９９、１０１、１０３、１１４、１２５、１２８、または１３３のうちの少なくとも１つの位置（またはこれらの組合せ）の変異によって配列番号１の配列と相違してもよい。前述のように、これらの位置のうちの１つのみを変更しても、これらの位置のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１、またはそれ以上（最大で全てを含む）を変更してもよい。例えば、アミノ酸配列は、位置６９及び７４、ならびにさらに位置３０、３５、及び１２８のうちの１つ以上において配列番号１と異なってもよい。また、アミノ酸配列は、以下の位置のセットのうちの１つにおいて配列番号２（ＵＳ７５６９２１５（参照により本明細書に援用される）に開示の通り）と異なってもよい：（ａ）位置６４、６９、及び７４；（ｂ）位置６９、７４、及び１０１；（ｃ）位置６９、７４、及び１２８；（ｄ）位置３０、６９、７４、及び１０３；（ｅ）位置４９、６９、７３、及び７６；（ｆ）位置６９、７４、１０１、及び１３３；（ｇ）位置３０、６９、７４、及び１２８；（ｈ）位置６９、７４、８８、及び９９；（ｉ）位置３０、６９、７４、及び１２８；（ｊ）位置９、１１、３５、６９、及び７４；（ｋ）位置１、４６、４９、６１、６９、及び７９；（ｌ）位置４８、６８、７１、９０、１０３、及び１１４；（ｍ）位置４、１０、１１、６９、７４、８８、及び１３３；（ｎ）位置１５、３０、３１、３５、４８、６９、７４、及び９２；（Ｏ）位置３０、６８、６９、７１、７４、７５、７６、及び９０；（ｐ）位置３０、３１、３７、６９、７３、７４、７９、及び１２８；（ｑ）位置２６、２９、３０、５４、６７、６９、７４、及び９２；（ｒ）位置８、１３、２６、３０、３５、３７、６９、７４、及び９２、ならびに（ｓ）位置２９、３１、３５、３７、４８、６９、７１、７４、８８、８９。これらの位置の変異以外では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸配列は、他の点では配列番号１と同一であり得る。特定の置換に関しては、アミノ酸配列は、以下の変異のうちの１つ以上を有することによって配列番号１と異なってもよい：Ａ１Ｔ、Ｓ４Ｐ、Ｋ８Ｒ、Ｋ９Ｔ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｅ１５Ｋ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｙ３１Ｈ、Ｙ３１Ｃ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｔ３７Ｒ、Ｍ４６Ｌ、Ｋ４８Ｅ、Ｋ４９Ｒ、Ｋ４９Ｅ、Ｋ５４Ｒ、Ｅ６１Ｄ、Ｋ６４Ｒ、Ｅ６７Ｇ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｔ、Ｎ７１Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ａ７３Ｖ、Ｑ７４Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｋ７６Ｅ、Ｋ７６Ｒ、Ｈ７９Ｒ、Ｎ８８Ｄ、Ｉ８９Ｖ、Ｎ９０Ｈ、Ｉ９２Ｔ、Ｓ９９Ｐ、Ｔ１０１Ａ、Ｆ１０３Ｓ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１２８Ｔ、Ｉ１２８Ａ、Ｔ１３３Ａ、またはＴ１３３Ｎ。発明者らの命名法は、科学文献の命名法と一致しており、すなわち、野生型配列または参照配列中のアミノ酸の一文字コードの後に、配列中のコードの位置、次に置換されたアミノ酸の一文字コードが示される。したがって、Ａ１Ｔは位置１のアラニン残基がスレオニンで置換されていることを示している。本発明の範囲内の他の変異体ポリペプチドとしては、Ｖ６９（例えばＡ）及びＱ７４（例えばＰ）に置換を有する配列番号２の変異体を含むものが挙げられる。例えば、アミノ酸配列は、配列番号２に関して、以下の変異のセットのうちの１つを含み得る。（ａ）Ｋ６４Ｒ、Ｖ６９Ａ、及びＱ７４Ｐ；（ｂ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＴ１０１Ａ；（ｃ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ｔ；（ｄ）Ｎ３０Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＦ１０３Ｓ；（ｅ）Ｋ４９Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ、及びＫ７６Ｅ；（ｆ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｔ１０１Ａ、及びＴ１３３Ｎ；（ｇ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ａ；（ｈ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＳ９９Ｐ；（ｉ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ｔ；（ｊ）Ｋ９Ｔ、Ｑ１１Ｒ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、及びＱ７４Ｐ；（ｋ）Ａ１Ｔ、Ｍ４６Ｌ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ６１Ｄ、Ｖ６９Ａ、及びＨ７９Ｒ；（ｌ）Ｋ４８Ｅ、Ｅ６８Ｄ、Ｎ７１Ｔ、Ｎ９０Ｈ、Ｆ１０３Ｓ、及びＩ１１４Ｖ；（ｍ）Ｓ４Ｐ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＴ１３３Ａ；（ｎ）Ｅ１５Ｋ、Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ；（ｏ）Ｎ３０Ｓ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｋ７６Ｒ、及びＮ９０Ｈ；（ｐ）Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｃ、Ｔ３７Ａ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ、Ｑ７４Ｐ、Ｈ７９Ｒ、及びＩ１２８Ｔ；（ｑ）Ｎ２６Ｄ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ５４Ｒ、Ｅ６７Ｇ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ；（ｒ）Ｋ８Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ；ならびに（ｓ）Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＩ８９Ｖ。配列番号２は、米国特許第７，５６９，２１５号で開示されており、これは、本発明で使用され得る例示的なＩＬ－２ポリペプチド配列として、参照により本明細書に援用される。
上述のように、本明細書で開示する任意の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、記載された配列を含み得、また当該ポリペプチドは、記載された配列に限定され他の点では配列番号１と同一であってもよい。さらに、本明細書に記載の任意の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、任意選択で、位置１２５のシステイン残基の他の残基（例えば、セリン）による置換を含んでもよく、及び／または任意選択で、配列番号１の位置１のアラニン残基の欠失を含んでもよい。
本明細書で開示する変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、約２８ｎＭ未満（例えば、約２５ｎＭ未満；約５ｎＭ未満；約１ｎＭ；約５００ｐＭ未満；または約１００ｐＭ未満）のＫｄでＩＬ－２Ｒαサブユニットに結合することができる。より具体的には、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、１．０ｎＭ未満（例えば、約０．８、０．６、０．４、または０．２ｎＭ）の親和性平衡定数を有し得る。また、親和性は、ＩＬ－２ＲαサブユニットまたはＩＬ－２受容体複合体（例えば、細胞表面に発現する複合体またはそうでなければ膜結合している複合体）からの解離の相対的速度として表すこともできる。例えば、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ポリペプチドまたはＩＬ－２ベース治療薬（例えば、ＩＬ－２＊）よりも減少した速度で、例えばＩＬ－２Ｒαから解離する。代替的に、親和性は、ＩＬ－２＊ポリペプチドが、例えばＩＬ－２Ｒを発現する細胞の表面上に残存する時間、または平均時間として特徴付けることができる。例えば、ＩＬ－２＊ポリペプチドは、少なくとも約２、５、１０、５０、１００、または２５０倍（またはそれ以上）、受容体上に残存することができる。
本開示の方法及び組成物のために使用され得る、それらと共に使用され得る、それらの調製で使用され得る、またはそれらの産物である、材料、組成物、及び成分が開示される。これら及びその他の材料が本明細書で開示されており、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示されている場合、これらの化合物の各々の様々な個別的及び集合的な組合せならびに並べ替えの具体的な言及は明示的に開示することができないが、各々が本明細書で具体的に企図され説明されることを理解されたい。例えば、方法が開示され論じられ、当該方法を含む複数の分子に対して行われ得る複数の修飾が論じられる場合、当該方法のあらゆる組合せ及び並べ替え、ならびに可能な修飾は、反対のことが具体的に示されない限り、具体的に企図されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも具体的に企図され開示される。この概念は、限定されるものではないが、本開示の組成物を用いた方法でのステップを含めた本開示の全ての態様に適用される。したがって、実施され得る様々な追加のステップが存在する場合、これらの追加のステップの各々は、本開示の方法の任意の具体的な方法ステップまたは方法ステップの組合せで実施され得、各々のこのような組合せまたは組合せのサブセットは、具体的に企図され、開示されているとみなすべきであることを理解されたい。
本明細書に引用された刊行物及びそれらが引用された資料は、その全体が参照により具体的に本明細書に援用される。
６．参照による援用
本開示で言及されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の出版物または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれているように示されている場合と同じ程度において、参照により本明細書に援用される。ただし、本明細書で参考文献を引用することが、このような文献が本発明の先行技術であることを肯定するものとして解釈されるべきではない。参照により援用された文献に示されている定義または用語が、本明細書に記載の用語または考察と異なる場合、現在の用語や定義が優先される。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。本明細書に示された一般的説明を考慮すれば、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解されよう。
実施例１．ＥＬＩＳＡによる融合タンパク質中のＩＬ－２、ＩＬ－２ムテイン、ＩＬ－２Ｒα、及びＩＬ－２Ｒγの検出
ＩＬ－２ムテインは、市販の抗体、例えば、抗ＩＬ－２モノクローナル（ＪＥＳ６－１Ａ１２）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて検出する。陽性対照は、モノクローナル抗体がサイトカインまたはムテインを認識しているかどうかを示すために使用する。また、ＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒγ鎖に対する抗体も使用する。９６ウェルプレートのウェルをＰＢＳ中の抗体（２．５μｇ／ｍｌ）でコーティングする。ウェルをＰＢＳ中５％無脂肪乳及び０．２％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳ－Ｍ－Ｔｗ）でブロックし、融合タンパク質を３７℃で１～２時間加える。洗浄後、抗ＩＬ－２ビオチン標識抗体（例えばＪＥＳ５Ｈ４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を加え、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）を用いて結合を検出する。ＥＬＩＳＡプレートを、５０μｌのＯ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．１Ｍクエン酸ｐＨ４．５及び０．０４％ Ｈ２Ｏ２に加えることによって展開し、５０μｌ／ウェルの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えることによって停止し、４９０ｎｍで吸光度を読み取る。
実施例２：ＭＭＰ９プロテアーゼによる融合タンパク質のプロテアーゼ切断
当業者であれば、タンパク質切断アッセイのセットアップ方法に精通していると考えられる。１×ＰＢＳ ｐＨ７．４中１００μｇのタンパク質を１μｇの活性ＭＭＰ９（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＳＡＥ００７８－５０またはＥｎｚｏカタログ番号ＢＭＬ－ＳＥ３６０）で切断し、室温で最大１６時間インキュベートした。消化したタンパク質は、次に機能的アッセイに使用するか、または試験する前に－８０℃で保存する。切断の程度を、当技術分野で周知されている方法を用いてＳＤＳ ＰＡＧＥによってモニタリングした。図１０、１３、１８Ａ、１８ｂ、及び２７Ａに示されているように、ＭＭＰ９プロテアーゼによる融合タンパク質の完全な切断が見られる。
実施例３：ＣＴＬＬ－２アッセイ
４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むまたは含まない培養基に、ＣＴＬＬ２細胞（ＡＴＣＣ）を５００，０００細胞／ウェルの濃度で懸濁させて平板培養し、３７℃及び５％ ＣＯ２で７２時間、組換えｈＩＬ２または活性化可能ｈＩＬ２の希釈系列で刺激した。非切断及び切断活性化可能ｈＩＬ２の活性を試験した。活性ＭＭＰ９と共にインキュベートすることにより、切断活性化可能ｈＩＬ２が生成された。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の発光スベース細胞生存率アッセイを用いて細胞活性を評価した。結果を図８Ａ～８Ｆ、図．９Ａ～９Ｚ、図２５Ｃに示す。
実施例４：ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒγキメラ型ポリペプチドのプロテアーゼ切断によって抗体及び生物学的活性ＩＬ－２ムテインへのアクセス性が向上する
ＩＬ－２ムテイン融合タンパク質を、プロテアーゼ（例えばＰＳＡ）による切断の前後に生化学的に特性評価する。イムノブロット解析は、融合タンパク質がＰＳＡによって切断され得ること、及びＰＳＡで試料を処理した後に、抗ＩＬ－２抗体に反応性であるおよそ２０ｋＤａの予測された低分子量切断産物の強度が増加することを示すであろう。切断の程度は、ＰＳＡの量及びインキュベート時間に依存する。興味深いことには、融合タンパク質をＰＳＡ処理の前後にＥＬＩＳＡで解析したところ、ＰＳＡ切断後にＩＬ－２の見かけ上の量が増加することが分かった。この実験では、このサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出されたＩＬ－２の見かけ上の量が、コンストラクトに応じおよそ２または４倍増加している。このことから、インタクト融合タンパク質では抗体結合が部分的に妨害されていることが示唆される。同じ試料のアリコートは、成長及び生存にＩＬ－２が必要なＣＴＬＬ－２細胞株を用いたＰＳＡ処理の後にも解析する。細胞の生存率は比色ＭＴＴアッセイを用いて確認することができる。このアッセイにおいて、上清は、より希釈するほどより生物学的に活性の高いＩＬ－２を含み、ＰＳＡ切断後には生物学的に活性のＩＬ－２の量が増加する。ＩＬ－２ムテイン量の増加により、ＰＳＡ切断後、抗ＩＬ－２抗体に反応性であるおよそ２０ｋＤａの予測された低分子量切断フラグメントの増加と、抗体アクセス性の増加と、最も重要なことには、生物学的に活性のＩＬ－２ムテインの量の増加とが示唆される。
実施例５．プロテアーゼ活性化融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ送達によって腫瘍成長が減少する
キメラ型ポリペプチドを調べて、ｉｎ ｖｉｖｏで生物学的効果を有し得るかを判定する。このような実験用に、腹腔内に注入した腫瘍細胞が、当初ミルキースポット（大網上に見出される一連の組織化された免疫凝集体）に急速かつ優先的に付着し成長する系を使用する（Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９：１７３９－５２（２００６））。このシステムは、融合タンパク質を腹腔内に複数回送達することができ、解離した大網細胞を調べることによって腫瘍成長を解析することができるため、融合タンパク質処置が腫瘍成長に及ぼす作用を調べるための好都合な方法を提供する。これらの実験においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＭＰ２及びＭＭＰ９両方を発現する、急速に成長する腫瘍細胞株Ｃｏｌｏｎ３８細胞株を使用することができる。通常、大網組織は比較的少量のＭＭＰ２及びＭＭＰ９を発現するが、大網にＣｏｌｏｎ３８腫瘍が存在するとＭＭＰレベルが上昇する。この腫瘍モデルを用いて、ＩＬ－２ムテイン融合タンパク質が腫瘍成長に影響を及ぼす能力を調べる。Ｃｏｌｏｎ３８細胞を腹腔内に注入し、１日間付着及び成長させ、次いで融合タンパク質を毎日腹腔内に投与する。７日目に動物を屠殺し、フローサイトメトリー及びコロニー形成アッセイを用いて大網の腫瘍成長を調べる。
実施例６：フローサイトメトリーによる抗原親和性の定量
活性化可能インターロイキンタンパク質のヒトＣＤ２０＋細胞及びカニクイザルＣＤ２０＋細胞に対する結合親和性を試験する。
ＣＤ２０＋細胞を、１００μＬの活性化可能インターロイキンタンパク質の段階希釈液及び少なくとも１つのプロテアーゼと共にインキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、同じ緩衝液中の０．１ｍＬの１０μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体と共に、氷上で４５分間インキュベートする。第２の洗浄サイクルの後、細胞を、０．１ｍＬの１５μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共に、以前と同じ条件下でインキュベートする。対照として、細胞を、抗Ｈｉｓ ＩｇＧと、続いてＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共に、活性化可能ＩＬ２タンパク質なしでインキュベートする。次いで細胞を再度洗浄し、死細胞を排除するため、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。１×１０４生細胞の蛍光を、ＭＸＰソフトウェアを用いたＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＩｎｃｙｔｅソフトウェアを使用したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定する。細胞試料の平均蛍光強度を、ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計算する。二次及び三次試薬のみで染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ６．００ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）の１サイト結合の方程式（双曲線）を用いてＫＤ値を計算する。
ＣＤ２０結合及び交差反応性をヒトＣＤ２０＋腫瘍細胞株上で評価する。交差反応性のＫＤ比は、組換えヒト抗原または組換えカニクイザル抗原を発現するＣＨＯ細胞株で定量したＫＤ値を用いて計算する。
実施例７：細胞傷害性アッセイ
活性化可能インターロイキンタンパク質のＣＤ２０＋標的細胞に対する免疫応答の媒介についてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する。
蛍光標識したＣＤ２０＋ＲＥＣ－１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３００４）を、活性化可能ＩＬ２タンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で、ランダムドナーの単離ＰＢＭＣまたはエフェクター細胞としてのＣＢ１５ Ｔ細胞（標準化されたＴ細胞株）と共にインキュベートする。加湿したインキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートした後、標的細胞から上清への蛍光色素の放出を分光蛍光計で定量する。活性化可能ＩＬ２タンパク質なしでインキュベートした標的細胞及びインキュベートの最後にサポニンを追加して完全に溶解した標的細胞を、それぞれ陰性対照及び陽性対照とした。
残存する標的生細胞の測定値に基づいて、以下の式に従って特異的な細胞溶解のパーセンテージを計算する：［１－（生標的数（試料）／生標的数（自発））］×１００％。シグモイド用量応答曲線及びＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いた非線形回帰／４パラメーターロジスティックフィットによって計算する。所与の抗体濃度で得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）ソフトウェアを用いた４パラメーターロジスティックフィット解析により、シグモイド用量応答曲線を計算する。
実施例８：活性化可能インターロイキンタンパク質の薬物動態
活性化可能インターロイキンタンパク質の半減期消失を動物実験で評価する。
活性化可能ＩＬ２タンパク質を、カニクイザルの伏在静脈に０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注入として投与する。別のカニクイザル群には、同等のサイズの、ただし血清半減期延長エレメントが欠如したＩＬ２コンストラクトを投与する。第３群及び第４群にはそれぞれ、血清半減期延長エレメントを有するＩＬ２コンストラクト、ならびにＣＤ２０及び血清半減期延長エレメントを有するサイトカインを投与する。これらはいずれも、活性化可能インターロイキンタンパク質と同等のサイズである。各試験群は５頭のサルからなる。血清試料を指示時点で採取し、段階希釈した後、ＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを用いてタンパク質の濃度を定量する。
試験品目の血漿濃度を用いて薬物動態解析を実施する。投与後の時間に対してプロットした場合、各試験品目の群平均血漿データは多次指数関数的プロファイルに適合する。データをボーラス入力ならびに分布相及び排出相の一次速度定数を有する標準的な２コンパートメントモデルによって適合させる。静脈内投与のデータに最も適当する一般方程式は以下の通り：ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔ（ｃ（ｔ）は時間ｔにおける血漿濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸の切片であり、α及びβはそれぞれ、分布相及び排出相の見かけ上の一次速度定数である）。α相はクリアランスの初期相であり、動物の全ての細胞外液へのタンパク質の分布を反映しており、減衰曲線の第２またはβ相部分は真の血漿クリアランスを表す。このような方程式を適合させるための方法は、当技術分野で周知されている。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α－ｋ２１）／（α－β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β－ｋ２１）／（α－β）、ならびにα及びβ（α＞βの場合）は、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝排出速度、ｋ１２＝コンパートメント１からコンパートメント２への移動速度、ｋ２１＝コンパートメント２からコンパートメント１への移動速度、Ｄ＝投与用量という推定パラメーターを用いた二次方程式：ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根である。
データ解析。濃度対時間プロファイルのグラフは、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６－１９９７． Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を用いて作製する。報告不能（ＬＴＲ：ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｒｅｐｏｒｔａｂｌｅ）として報告された値はＰＫ解析には含まれず、グラフにも表示されない。薬物動態パラメーターは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ．３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８－１９９９． Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を用いたコンパートメント解析によって決定する。薬物動態パラメーターは、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ，１９９９，ＩＮ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載のように計算する。
活性化可能インターロイキンタンパク質は、血清半減期延長エレメントが欠如したタンパク質と比較して、排出半減期の増加などの薬物動態パラメーターが改善されていることが予想される。
実施例９：異種移植片腫瘍モデル
活性化可能ＩＬ２タンパク質を異種移植片モデルで評価する。
雌の免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに致死量以下の放射線（２Ｇｙ）を照射し、４×１０６個のＲａｍｏｓ ＲＡ１細胞を右背側部に皮下接種する。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に達したら、動物を３つの処置群に割り付ける。第２群及び第３群（各８頭）には、１．５×１０７個の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内に注入する。３日後、続いて第３群の動物に、５０μｇの活性化可能インターロイキンタンパク質の静脈内用量を合計９回処置する。第１群及び第２群はビヒクルのみで処置する。体重及び腫瘍体積を３０日間定量する。
活性化可能インターロイキンタンパク質で処置した動物は、それぞれのビヒクル処置対照群と比較して、統計的に有意な腫瘍成長の遅延が予想される。
実施例１０：マウスＩＦＮγ ＷＥＨＩ細胞生存率アッセイ
１．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むまたは含まない培養基に、ＷＥＨＩ２７９細胞（ＡＴＣＣ）を２５，０００細胞／ウェルの濃度で懸濁させて平板培養し、３７℃及び５％ ＣＯ２で７２時間、組換えｍＩＦＮγまたは誘導性ｍＩＦＮγの希釈系列で刺激した。非切断及び切断誘導性ｍＩＦＮγの活性を試験した。切断誘導性ｍＩＦＮγは、活性ＭＭＰ９とのインキュベートによって生成した。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）発光ベース細胞生存率アッセイを用いて評価した。切断誘導性ｍＩＦＮγ分子のＥＣ５０値は、非切断誘導性ｍＩＦＮγ分子よりも少なくとも１００倍以上強力であった。図１６Ａ～１６に示されるように、培養基がヒト血清アルブミンを含むアッセイでは、より大きな誘導性が見られた。
実施例１１：保留
実施例１２：マウスＩＦＮγ Ｂ１６レポーター細胞アッセイ
１．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むまたは含まない培養基に、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮγ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を７５，０００細胞／ウェルの濃度で平板培養し、３７℃及び５％ ＣＯ２で２４時間、組換えｍＩＦＮγまたは誘導性ｍＩＦＮγの希釈系列で刺激した。非切断及び切断誘導性ｍＩＦＮγの活性を試験した。切断誘導性ｍＩＦＮγは、活性ＭＭＰ９とのインキュベートによって生成した。上清を採取し、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を加え、３７℃で２時間インキュベートし、６２０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＳＥＡＰ活性化を評価した。切断誘導性ｍＩＦＮγ分子のＥＣ５０値は、非切断誘導性ｍＩＦＮγ分子よりも少なくとも１００倍以上強力であった。結果を、例えば図１９Ａ～１９Ｂ、図２２Ａ～２２Ｂ、図２３Ａ～２３Ｂに示す。この実験は、ＩＦＮα結合体についてもＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮα／β細胞を用いて繰り返した。切断誘導性ｍＩＦＮα分子のＥＣ５０値は、非切断誘導性ｍＩＦＮα分子よりも少なくとも１００倍以上強力であった。図２０Ａ～２０Ｂを参照。
実施例１３．プロテアーゼ活性化融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ送達によって腫瘍成長が減少する
キメラ型ポリペプチドを調べて、ｉｎ ｖｉｖｏで生物学的効果を有し得るかを判定する。このような実験用に、腹腔内に注入した腫瘍細胞が、当初ミルキースポット（大網上に見出される一連の組織化された免疫凝集体）に急速かつ優先的に付着し成長する系を使用する（Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９：１７３９－５２（２００６））。このシステムは、融合タンパク質を腹腔内に複数回送達することができ、解離した大網細胞を調べることによって腫瘍成長を解析することができるため、融合タンパク質処置が腫瘍成長に及ぼす作用を調べるための好都合な方法を提供する。これらの実験においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＭＰ２及びＭＭＰ９両方を発現する、急速に成長する腫瘍細胞株Ｃｏｌｏｎ３８細胞株を使用することができる。通常、大網組織は比較的少量のＭＭＰ２及びＭＭＰ９を発現するが、大網にＣｏｌｏｎ３８腫瘍が存在するとＭＭＰレベルが上昇する。この腫瘍モデルを用いて、ＩＦＮ融合タンパク質が腫瘍成長に影響を及ぼす能力を調べる。Ｃｏｌｏｎ３８細胞を腹腔内に注入し、１日間付着及び成長させ、次いで融合タンパク質を毎日腹腔内に投与する。７日目に動物を屠殺し、フローサイトメトリー及びコロニー形成アッセイを用いて大網の腫瘍成長を調べる。
実施例１４：キメラ型ポリペプチドを調べてｉｎ ｖｉｖｏの生物学的効果を定量した。
ＭＣ３８細胞株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＭＰ９を発現する、急速に成長する結腸腺癌細胞株を使用した。この腫瘍モデルを用いて、ＩＦＮγ融合タンパク質が腫瘍成長に影響を及ぼす能力を調べた。ＭＣ３８細胞を皮下に注入し、１０～１４日間成長させ、次いで融合タンパク質を週２回腹腔内に、合計４回用量投与した。比較対照として、野生型のｍＩＦＮγを示された用量で、１日２回、５日オン／２日オフのスケジュールで２週間投与した（合計１０回用量）。腫瘍成長及び体重を週におよそ２回、２週間モニタリングした。
実施例１５：ＣＤ２０を標的化する例示的なＩＦＮγタンパク質の構築
１５．１ 活性化可能サイトカインドメインの生成
腫瘍中または腫瘍細胞上に存在するＣＤ２０ポリペプチドに結合可能なＩＦＮγポリペプチドを以下のように産生する。（１）ＩＦＮγポリペプチド配列、及び（２）１つ以上のポリペプチドリンカーをコードする核酸配列を含む核酸を産生する。活性化可能ＩＦＮγプラスミドコンストラクトは、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトまたは哺乳類細胞株にエレクトロポーレーションし、精製する。バリデーションアッセイには、プロテアーゼの存在下でＩＦＮγ刺激に応答性のＴ細胞を用いたＴ細胞活性化アッセイが含まれる。
１５．２ ｓｃＦｖ ＣＤ２０結合ドメインの生成
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球上に存在する細胞表面タンパク質の１つである。ＣＤ２０抗原は、正常及び悪性プレＢ及び成熟Ｂリンパ球（Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％超におけるものを含む）に見出される。この抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）、及び正常組織には存在しない。そのため、主にマウス由来のいくつかの抗体：１Ｆ５、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７、１Ｈ４が説明されている。
そのため、ヒトまたはヒト化抗ＣＤ２０抗体を使用して、活性化可能ＩＦＮγロイキンタンパク質のＣＤ２０結合ドメインのためのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得、コンストラクトのコドンは、任意選択でＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからの細胞での発現に最適化する。ＶＬ及びＶＨドメインがｓｃＦｖに出現する順序を変動させ（すなわち、ＶＬ－ＶＨまたはＶＨ－ＶＬ方向）、「Ｇ４Ｓ」（配列番号２４１）または「Ｇ４Ｓ」（配列番号２４１）サブユニット（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２４２）の３つのコピーが可変ドメインを接続してｓｃＦｖドメインを作出する。抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖプラスミドコンストラクトは、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトまたは哺乳類細胞株にエレクトロポーレーションし、精製する。バリデーションアッセイには、ＦＡＣＳによる結合解析、Ｐｒｏｔｅｏｎを用いた動態解析、及びＣＤ２０発現細胞の染色が含まれる。
１５．３ 活性化可能ＩＦＮγタンパク質をコードするＤＮＡ発現コンストラクトのクローニング
プロテアーゼ切断部位ドメインを有する活性化可能ＩＦＮγコンストラクトは、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖドメイン及び血清半減期延長エレメント（例えば、ＨＳＡ結合ペプチドまたはＶＨドメイン）と組み合わせて、活性化可能ＩＦＮγタンパク質を構築するために使用される。ＣＨＯ細胞で活性化可能ＩＦＮγタンパク質を発現させるため、全てのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳類発現ベクター系にクローニングする。簡潔に述べると、ペプチドリンカーＬ１及びＬ２と共に活性化可能ＩＦＮγドメイン、血清半減期延長エレメント、及びＣＤ２０結合ドメインをコードする遺伝子配列を別々に合成し、サブクローニングする。次に、得られたコンストラクトを、ＣＤ２０結合ドメイン－Ｌ１－ＩＦＮγサブユニット１－Ｌ２－プロテアーゼ切断ドメイン－Ｌ３－ＩＦＮγサブユニット２－Ｌ４－抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ－Ｌ５－血清半減期延長エレメントの順にライゲーションして、最終的なコンストラクトを得る。全ての発現コンストラクトは、タンパク質の分泌及び精製を促進するため、それぞれＮ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン（６ｘＨｉｓ）タグ（配列番号２４３）のコード配列を含むように設計されている。
１５．４ 安定的に形質移入したＣＨＯ細胞における活性化可能ＩＦＮγタンパク質の発現
ＣＨＯ－Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９６８；６０（４）：１２７５－８１）の誘導体、ＣＨＯ細胞発現系（Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。接着細胞を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが提供する標準的な細胞培養プロトコルに従って継代培養する。
懸濁液中の成長に適応させるため、組織培養フラスコから細胞を分離し、無血清培地に入れる。懸濁適合細胞を１０％ ＤＭＳＯを含む培地で凍結保存する。
分泌活性化可能ＩＦＮγタンパク質を安定的に発現する組換えＣＨＯ細胞株を、懸濁適合細胞の形質移入によって生成する。抗生物質ハイグロマイシンＢを用いた選択中は、週に２回、生細胞密度を測定し、細胞を遠心分離し、０．１×１０６生細胞／ｍＬの最大密度で新鮮な選択培地に再懸濁させる。活性化可能ＩＦＮγタンパク質を安定的に発現する細胞プールを、２～３週間の選択後に回復させ、その時点で細胞を振とうフラスコ内の標準培養基に移す。組換え分泌タンパク質の発現は、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実施することによって確認する。安定した細胞プールを、ＤＭＳＯを含む培地中で凍結保存する。
活性化可能ＩＦＮγタンパク質は、安定的に形質移入したＣＨＯ細胞株の１０日間の流加バッチ培養物において、細胞培養上清中に分泌させることによって産生する。細胞培養上清は、典型的には７５％超の培養生存率で１０日後に採取する。１日おきに培養液から試料を採取し、細胞密度及び生存率を評価する。採取日には、さらなる使用のために、細胞培養上清を遠心分離及び真空濾過によって清澄化する。
細胞培養上清中のタンパク質発現力価及び産物の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析する。
１５．５ 活性化可能ＩＦＮγタンパク質の精製
活性化可能ＩＦＮγタンパク質は、ＣＨＯ細胞培養上清から２ステップの手順で精製する。コンストラクトは、第１ステップでアフィニティークロマトグラフィーに供し、続いて第２ステップでＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００上の分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料を緩衝液交換し、限外濾過によって濃縮して典型的な１ｍｇ／ｍＬ超の濃度にする。最終試料の純度及び均質性（典型的には９０％超）はそれぞれ、還元条件及び非還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥを行い、続いて抗ＨＳＡ抗体または抗イディオタイプ抗体を用いたイムノブロッティングによって、及び分析的ＳＥＣによって評価される。精製したタンパク質は、使用するまで－８０℃でアリコートで保存する。
実施例１６：フローサイトメトリーによる抗原親和性の定量
活性化可能ＩＦＮγタンパク質のヒトＣＤ２０＋細胞及びカニクイザルＣＤ２０＋細胞に対する結合親和性を試験する。
ＣＤ２０＋細胞を、１００μＬの活性化可能ＩＦＮγタンパク質の段階希釈液及び少なくとも１つのプロテアーゼと共にインキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、同じ緩衝液中の０．１ｍＬの１０μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体と共に、氷上で４５分間インキュベートする。第２の洗浄サイクルの後、細胞を、０．１ｍＬの１５μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共に、以前と同じ条件下でインキュベートする。対照として、細胞を、抗Ｈｉｓ ＩｇＧと、続いてＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共に、活性化可能ＩＦＮγタンパク質なしでインキュベートする。次いで細胞を再度洗浄し、死細胞を排除するため、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。１×１０４生細胞の蛍光を、ＭＸＰソフトウェアを用いたＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＩｎｃｙｔｅソフトウェアを使用したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定する。細胞試料の平均蛍光強度を、ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計算する。二次及び三次試薬のみで染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ６．００ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）の１サイト結合の方程式（双曲線）を用いてＫＤ値を計算する。
ＣＤ２０結合及び交差反応性をヒトＣＤ２０＋腫瘍細胞株上で評価する。交差反応性のＫＤ比は、組換えヒト抗原または組換えカニクイザル抗原を発現するＣＨＯ細胞株で定量したＫＤ値を用いて計算する。
実施例１７：細胞傷害性アッセイ
活性化可能ＩＦＮγタンパク質のＣＤ２０＋標的細胞に対する免疫応答の媒介についてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する。
蛍光標識したＣＤ２０＋ＲＥＣ－１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３００４）を、活性化可能ＩＦＮγタンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で、ランダムドナーの単離ＰＢＭＣまたはエフェクター細胞としてのＣＢ１５ Ｔ細胞（標準化されたＴ細胞株）と共にインキュベートする。加湿したインキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートした後、標的細胞から上清への蛍光色素の放出を分光蛍光計で定量する。活性化可能ＩＦＮγタンパク質なしでインキュベートした標的細胞及びインキュベートの最後にサポニンを加えて完全に溶解した標的細胞を、それぞれ陰性対照及び陽性対照とした。
残存する標的生細胞の測定値に基づいて、以下の式に従って特異的な細胞溶解のパーセンテージを計算する：［１－（生標的数（試料）／生標的数（自発））］×１００％。シグモイド用量応答曲線及びＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いた非線形回帰／４パラメーターロジスティックフィットによって計算する。所与の抗体濃度で得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた４パラメーターロジスティックフィット解析により、シグモイド用量応答曲線を計算する。
実施例１８：活性化可能ＩＦＮγタンパク質の薬物動態
活性化可能ＩＦＮγタンパク質の半減期消失を動物実験で評価する。
活性化可能ＩＦＮγタンパク質を、カニクイザルの伏在静脈に０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注入として投与する。別のカニクイザル群には、同等のサイズの、ただし血清半減期延長エレメントが欠如したサイトカインを投与する。第３群及び第４群にはそれぞれ、血清半減期延長エレメントを有するサイトカイン、ならびにＣＤ２０及び血清半減期延長エレメントを有するサイトカインを投与する。これらはいずれも、活性化可能ＩＦＮγタンパク質と同等のサイズである。各試験群は５頭のサルからなる。血清試料を指示時点で採取し、段階希釈した後、ＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを用いてタンパク質の濃度を定量する。
試験品目の血漿濃度を用いて薬物動態解析を実施する。投与後の時間に対してプロットした場合、各試験品目の群平均血漿データは多次指数関数的プロファイルに適合する。データをボーラス入力ならびに分布相及び排出相の一次速度定数を有する標準的な２コンパートメントモデルによって適合させる。静脈内投与のデータに最も適当する一般方程式は以下の通り：ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔ（ｃ（ｔ）は時間ｔにおける血漿濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸の切片であり、α及びβはそれぞれ、分布相及び排出相の見かけ上の一次速度定数である）。α相はクリアランスの初期相であり、動物の全ての細胞外液へのタンパク質の分布を反映しており、減衰曲線の第２またはβ相部分は真の血漿クリアランスを表す。このような方程式をフィットさせる方法は、当技術分野で周知されている。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α－ｋ２１）／（α－β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β－ｋ２１）／（α－β）、ならびにα及びβ（α＞βの場合）は、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝排出速度、ｋ１２＝コンパートメント１からコンパートメント２への移動速度、ｋ２１＝コンパートメント２からコンパートメント１への移動速度、Ｄ＝投与用量という推定パラメーターを用いた二次方程式：ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根である。
データ解析。濃度対時間プロファイルのグラフは、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６－１９９７． Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を用いて作製する。報告不能（ＬＴＲ：ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｒｅｐｏｒｔａｂｌｅ）として報告された値はＰＫ解析には含まれず、グラフにも表示されない。薬物動態パラメーターは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ．３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８－１９９９． Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を用いたコンパートメント解析によって決定する。薬物動態パラメーターは、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ，１９９９，ＩＮ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載のように計算する。
活性化可能ＩＦＮγタンパク質は、血清半減期延長エレメントが欠如したタンパク質と比較して、排出半減期の増加などの薬物動態パラメーターが改善されていることが予想される。
実施例１９：異種移植片腫瘍モデル
活性化可能ＩＦＮγタンパク質を異種移植片モデルで評価する。
雌の免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに致死量以下の放射線（２Ｇｙ）を照射し、４×１０６個のＲａｍｏｓ ＲＡ１細胞を右背側部に皮下接種する。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に達したら、動物を３つの処置群に割り付ける。第２群及び第３群（各８頭）には、１．５×１０７個の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内に注入する。３日後、続いて第３群の動物に、５０μｇの活性化可能ＩＦＮγロイキンタンパク質の静脈内用量を合計９回処置する。第１群及び第２群はビヒクルのみで処置する。体重及び腫瘍体積を３０日間定量する。
活性化可能ＩＦＮγタンパク質で処置した動物は、それぞれのビヒクル処置対照群と比較して、統計的に有意な腫瘍成長の遅延が予想される。
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され説明されてきたが、このような実施形態が単に例として提供されていることは、当業者には明らかであろう。当業者には、本発明から逸脱することなしに多数の変形形態、変化、及び置換えが想到されよう。本発明を実施する際には、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物が用いられ得ることを理解されたい。以下の請求項が本発明の範囲を定義し、それにより、これらの請求項の範囲内の方法及び構造ならびにその等価物が網羅されることが意図されている。
実施例２０：ＨＥＫ Ｂｌｕｅアッセイ
４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むまたは含まない培養基に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を２５０，０００細胞／ウェルの濃度で懸濁させて平板培養し、３７℃及び５％ ＣＯ２で２４時間、組換えｈＩＬ１２、キメラ型ＩＬ１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）、または活性化可能ｈＩＬ１２の希釈系列で刺激した。非切断及び切断活性化可能ｈＩＬ１２の活性を試験した。切断誘導性ｈＩＬ１２は、活性ＭＭＰ９とのインキュベートによって生成した。ＩＬ１２活性は、試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）（比色ベースアッセイ）を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化によって評価した。
１５～４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むまたは含まない培養基に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を５０，０００細胞／ウェルの濃度で懸濁させて平板培養し、３７℃及び５％ ＣＯ２で２４時間、組換えｈＩＬ２または活性化可能ｈＩＬ２の希釈系列で刺激した。非切断及び切断活性化可能ｈＩＬ２の活性を試験した。切断誘導性ｈＩＬ２は、活性ＭＭＰ９または別のプロテアーゼとのインキュベートによって生成した。ＩＬ２活性は、試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）（比色ベースアッセイ）を用いて、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量化によって評価した。結果は図５９～６２に示されている。
実施例２１：脾臓細胞Ｔ芽細胞アッセイ
Ｔ芽細胞を、ＰＨＡと共に６日間インキュベートし、組換えｈＩＬ１２と共に２４時間インキュベートしたマウス脾臓細胞から誘導した。次いで、４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むまたは含まない培養基に、Ｔ芽細胞を２００，０００細胞／ウェルの濃度で懸濁させて平板培養し、３７℃及び５％ ＣＯ２で７２時間、組換えｈＩＬ１２、キメラ型ＩＬ１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）、またはマウスＩＬ１２の希釈系列で刺激した。非切断及び切断ＩＬ１２の活性を試験した。切断誘導性ｈＩＬ１２は、活性ＭＭＰ９とのインキュベートによって生成した。ＩＬ１２活性は、ｍＩＦＮγアルファＬＩＳＡを用いたＩＦＮγ産生量の下流定量化によって評価した。
実施例２２：プロテアーゼ活性化融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ送達によって腫瘍成長が減少する
キメラ型ポリペプチドを調べて、ｉｎ ｖｉｖｏで生物学的効果を有し得るかを判定する。このような実験用に、腹腔内に注入した腫瘍細胞が、当初ミルキースポット（大網上に見出される一連の組織化された免疫凝集体）に急速かつ優先的に付着し成長する系を使用する（Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９：１７３９－５２（２００６））。このシステムは、融合タンパク質を腹腔内に複数回送達することができ、解離した大網細胞を調べることによって腫瘍成長を解析することができるため、融合タンパク質処置が腫瘍成長に及ぼす作用を調べるための好都合な方法を提供する。これらの実験においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＭＰ２及びＭＭＰ９両方を発現する、急速に成長する腫瘍細胞株Ｃｏｌｏｎ３８細胞株を使用することができる。通常、大網組織は比較的少量のＭＭＰ２及びＭＭＰ９を発現するが、大網にＣｏｌｏｎ３８腫瘍が存在するとＭＭＰレベルが上昇する。この腫瘍モデルを用いて、ＩＬ－２ムテイン融合タンパク質が腫瘍成長に影響を及ぼす能力を調べる。Ｃｏｌｏｎ３８細胞を腹腔内に注入し、１日間付着及び成長させ、次いで融合タンパク質を毎日腹腔内に投与する。７日目に動物を屠殺し、フローサイトメトリー及びコロニー形成アッセイを用いて大網の腫瘍成長を調べる。
実施例２３Ａ：ＣＤ２０を標的化する例示的な活性化可能インターロイキンタンパク質の構築
２３．１ 活性化可能インターロイキンドメインの生成
ヒトＩＬ－１２ｐ３５鎖のカノニカル配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９４５９である。ヒトＩＬ－１２ｐ４０鎖のカノニカル配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９４６０である。ＩＬ－１２ｐ３５及びＩＬ－１２ｐ４０を発現コンストラクトにクローニングする。プロテアーゼ切断部位をＩＬ－１２ｐ３５ドメインとＩＬ－１２ｐ４０ドメインとの間に含める。腫瘍内または腫瘍細胞上に存在するＣＤ２０ポリペプチドに結合可能なＩＬ－１２ポリペプチドは、以下のように産生する。（１）ＩＦＮγポリペプチド配列、及び（２）１つ以上のポリペプチドリンカーをコードする核酸配列を含む核酸を産生する。活性化可能インターロイキンプラスミドコンストラクトは、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトまたは哺乳類細胞株にエレクトロポーレーションし、精製する。バリデーションアッセイには、プロテアーゼの存在下でＩＬ－１２刺激に応答性のＴ細胞を用いたＴ細胞活性化アッセイが含まれる。
２３．２ ｓｃＦｖ ＣＤ２０結合ドメインの生成
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球上に存在する細胞表面タンパク質の１つである。ＣＤ２０抗原は、正常及び悪性プレＢ及び成熟Ｂリンパ球（Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％超におけるものを含む）に見出される。この抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）、及び正常組織には存在しない。そのため、主にマウス由来のいくつかの抗体：１Ｆ５、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７、１Ｈ４が説明されている。
そのため、ヒトまたはヒト化抗ＣＤ２０抗体を使用して、活性化可能インターロイキンタンパク質のＣＤ２０結合ドメインのためのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得、コンストラクトのコドンは、任意選択でＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからの細胞での発現に最適化する。ＶＬ及びＶＨドメインがｓｃＦｖに出現する順序を変動させ（すなわち、ＶＬ－ＶＨまたはＶＨ－ＶＬ方向）、「Ｇ４Ｓ」（配列番号２４１）または「Ｇ４Ｓ」（配列番号２４１）サブユニット（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２４２）の３つのコピーが可変ドメインを接続してｓｃＦｖドメインを作出する。抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖプラスミドコンストラクトは、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトまたは哺乳類細胞株にエレクトロポーレーションし、精製する。バリデーションアッセイには、ＦＡＣＳによる結合解析、Ｐｒｏｔｅｏｎを用いた動態解析、及びＣＤ２０発現細胞の染色が含まれる。
２３．３ 活性化可能インターロイキンタンパク質をコードするＤＮＡ発現コンストラクトのクローニング
プロテアーゼ切断部位ドメインを有する活性化可能インターロイキンコンストラクトは、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖドメイン及び血清半減期延長エレメント（例えば、ＨＳＡ結合ペプチドまたはＶＨドメイン）と組み合わせて、活性化可能インターロイキンタンパク質を構築するために使用される。ＣＨＯ細胞で活性化可能インターロイキンタンパク質を発現させるため、全てのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳類発現ベクター系にクローニングする。簡潔に述べると、ペプチドリンカーＬ１及びＬ２と共に活性化可能インターロイキンドメイン、血清半減期延長エレメント、及びＣＤ２０結合ドメインをコードする遺伝子配列を別々に合成し、サブクローニングする。次に、得られたコンストラクトを、ＣＤ２０結合ドメイン－Ｌ１－１２ｐ３５－Ｌ２－プロテアーゼ切断ドメイン－Ｌ３－ＩＬ－１２ｐ４０－Ｌ４－抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ－Ｌ５－血清半減期延長エレメントの順にライゲーションして、最終的なコンストラクトを得る。全ての発現コンストラクトは、タンパク質の分泌及び精製を促進するため、それぞれＮ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン（６ｘＨｉｓ）タグ（配列番号２４３）のコード配列を含むように設計されている。
２３．４ 安定的に形質移入したＣＨＯ細胞における活性化可能インターロイキンタンパク質の発現
ＣＨＯ－Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８；６０（４）：１２７５－８１）の誘導体、ＣＨＯ細胞発現系（Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。接着細胞を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが提供する標準的な細胞培養プロトコルに従って継代培養する。
懸濁液中の成長に適応させるため、組織培養フラスコから細胞を分離し、無血清培地に入れる。懸濁適合細胞を１０％ ＤＭＳＯを含む培地で凍結保存する。
分泌活性化可能インターロイキンタンパク質を安定的に発現する組換えＣＨＯ細胞株を、懸濁適合細胞の形質移入によって生成する。抗生物質ハイグロマイシンＢを用いた選択中は、週に２回、生細胞密度を測定し、細胞を遠心分離し、０．１×１０６生細胞／ｍＬの最大密度で新鮮な選択培地に再懸濁させる。活性化可能インターロイキンタンパク質を安定的に発現する細胞プールを、２～３週間の選択後に回復させ、その時点で細胞を振とうフラスコ内の標準培養基に移す。組換え分泌タンパク質の発現は、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実施することによって確認する。安定した細胞プールを、ＤＭＳＯを含む培地中で凍結保存する。
活性化可能インターロイキンタンパク質は、安定的に形質移入したＣＨＯ細胞株の１０日間の流加バッチ培養物において、細胞培養上清中に分泌させることによって産生する。細胞培養上清は、典型的には７５％超の培養生存率で１０日後に採取する。１日おきに培養液から試料を採取し、細胞密度及び生存率を評価する。採取日には、さらなる使用のために、細胞培養上清を遠心分離及び真空濾過によって清澄化する。
細胞培養上清中のタンパク質発現力価及び産物の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析する。
２３．５ 活性化可能インターロイキンタンパク質の精製
活性化可能インターロイキンタンパク質は、ＣＨＯ細胞培養上清から２ステップの手順で精製する。コンストラクトは、第１ステップでアフィニティークロマトグラフィーに供し、続いて第２ステップでＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００上の分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料を緩衝液交換し、限外濾過によって濃縮して典型的な１ｍｇ／ｍＬ超の濃度にする。最終試料の純度及び均質性（典型的には９０％超）はそれぞれ、還元条件及び非還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥを行い、続いて抗ＨＳＡ抗体または抗イディオタイプ抗体を用いたイムノブロッティングによって、及び分析的ＳＥＣによって評価される。精製したタンパク質は、使用するまで－８０℃でアリコートで保存する。
実施例２３Ｂ：フローサイトメトリーによる抗原親和性の定量
活性化可能インターロイキンタンパク質のヒトＣＤ２０＋細胞及びカニクイザルＣＤ２０＋細胞に対する結合親和性を試験する。
ＣＤ２０＋細胞を、１００μＬの活性化可能インターロイキンタンパク質の段階希釈液及び少なくとも１つのプロテアーゼと共にインキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、同じ緩衝液中の０．１ｍＬの１０μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体と共に、氷上で４５分間インキュベートする。第２の洗浄サイクルの後、細胞を、０．１ｍＬの１５μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共に、以前と同じ条件下でインキュベートする。対照として、細胞を、抗Ｈｉｓ ＩｇＧと、続いてＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共に、活性化可能インターロイキンタンパク質なしでインキュベートする。次いで細胞を再度洗浄し、死細胞を排除するため、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。１×１０４生細胞の蛍光を、ＭＸＰソフトウェアを用いたＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＩｎｃｙｔｅソフトウェアを使用したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定する。細胞試料の平均蛍光強度を、ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計算する。二次及び三次試薬のみで染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ６．００ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）の１サイト結合の方程式（双曲線）を用いてＫＤ値を計算する。
ＣＤ２０結合及び交差反応性をヒトＣＤ２０＋腫瘍細胞株上で評価する。交差反応性のＫＤ比は、組換えヒト抗原または組換えカニクイザル抗原を発現するＣＨＯ細胞株で定量したＫＤ値を用いて計算する。
実施例２４：細胞傷害性アッセイ
活性化可能インターロイキンタンパク質のＣＤ２０＋標的細胞に対する免疫応答の媒介についてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する。
蛍光標識したＣＤ２０＋ＲＥＣ－１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３００４）を、活性化可能インターロイキンタンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で、ランダムドナーの単離ＰＢＭＣまたはエフェクター細胞としてのＣＢ１５ Ｔ細胞（標準化されたＴ細胞株）と共にインキュベートする。加湿したインキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートした後、標的細胞から上清への蛍光色素の放出を分光蛍光計で定量する。活性化可能インターロイキンタンパク質なしでインキュベートした標的細胞及びインキュベートの最後にサポニンを加えて完全に溶解した標的細胞を、それぞれ陰性対照及び陽性対照とした。
残存する標的生細胞の測定値に基づいて、以下の式に従って特異的な細胞溶解のパーセンテージを計算する：［１－（生標的数（試料）／生標的数（自発））］×１００％。シグモイド用量応答曲線及びＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いた非線形回帰／４パラメーターロジスティックフィットによって計算する。所与の抗体濃度で得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた４パラメーターロジスティックフィット解析により、シグモイド用量応答曲線を計算する。
実施例２５：活性化可能インターロイキンタンパク質の薬物動態
活性化可能インターロイキンタンパク質の半減期消失を動物実験で評価する。
活性化可能インターロイキンタンパク質を、カニクイザルの伏在静脈に０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注入として投与する。別のカニクイザル群には、同等のサイズの、ただし血清半減期延長エレメントが欠如したサイトカインを投与する。第３群及び第４群にはそれぞれ、血清半減期延長エレメントを有するサイトカイン、ならびにＣＤ２０及び血清半減期延長エレメントを有するサイトカインを投与する。これらはいずれも、活性化可能インターロイキンタンパク質と同等のサイズである。各試験群は５頭のサルからなる。血清試料を指示時点で採取し、段階希釈した後、ＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを用いてタンパク質の濃度を定量する。
試験品目の血漿濃度を用いて薬物動態解析を実施する。投与後の時間に対してプロットした場合、各試験品目の群平均血漿データは多次指数関数的プロファイルに適合する。データをボーラス入力ならびに分布相及び排出相の一次速度定数を有する標準的な２コンパートメントモデルによって適合させる。静脈内投与のデータに最も適当する一般方程式は以下の通り：ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔ（ｃ（ｔ）は時間ｔにおける血漿濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸の切片であり、α及びβはそれぞれ、分布相及び排出相の見かけ上の一次速度定数である）。α相はクリアランスの初期相であり、動物の全ての細胞外液へのタンパク質の分布を反映しており、減衰曲線の第２またはβ相部分は真の血漿クリアランスを表す。このような方程式をフィットさせる方法は、当技術分野で周知されている。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α－ｋ２１）／（α－β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β－ｋ２１）／（α－β）、ならびにα及びβ（α＞βの場合）は、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝排出速度、ｋ１２＝コンパートメント１からコンパートメント２への移動速度、ｋ２１＝コンパートメント２からコンパートメント１への移動速度、Ｄ＝投与用量という推定パラメーターを用いた二次方程式：ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根である。
データ解析。濃度対時間プロファイルのグラフは、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６－１９９７． Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を用いて作製する。報告不能（ＬＴＲ：ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｒｅｐｏｒｔａｂｌｅ）として報告された値はＰＫ解析には含まれず、グラフにも表示されない。薬物動態パラメーターは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ．３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８－１９９９． Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を用いたコンパートメント解析によって決定する。薬物動態パラメーターは、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ，１９９９，ＩＮ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載のように計算する。
活性化可能インターロイキンタンパク質は、血清半減期延長エレメントが欠如したタンパク質と比較して、排出半減期の増加などの薬物動態パラメーターが改善されていることが予想される。
実施例２６：異種移植片腫瘍モデル
活性化可能インターロイキンタンパク質を異種移植片モデルで評価する。
雌の免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに致死量以下の放射線（２Ｇｙ）を照射し、４×１０６個のＲａｍｏｓ ＲＡ１細胞を右背側部に皮下接種する。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に達したら、動物を３つの処置群に割り付ける。第２群及び第３群（各８頭）には、１．５×１０７個の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内に注入する。３日後、続いて第３群の動物に、５０μｇの活性化可能インターロイキンタンパク質の静脈内用量を合計９回処置する。第１群及び第２群はビヒクルのみで処置する。体重及び腫瘍体積を３０日間定量する。
Figure 2022532217000009
活性化可能インターロイキンタンパク質で処置した動物は、それぞれのビヒクル処置対照群と比較して、統計的に有意な腫瘍成長の遅延が予想される。
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され説明されてきたが、このような実施形態が単に例として提供されていることは、当業者には明らかであろう。当業者には、本発明から逸脱することなしに多数の変形形態、変化、及び置換えが想到されよう。本発明を実施する際には、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物が用いられ得ることを理解されたい。以下の請求項が本発明の範囲を定義し、それにより、これらの請求項の範囲内の方法及び構造ならびにその等価物が網羅されることが意図されている。
ＭＣ３８細胞株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＭＰ９を発現する、急速に成長する結腸腺癌細胞株を使用した。この腫瘍モデルを用いて、融合タンパク質腫瘍成長に影響を及ぼす能力を調べた。
実施例２７Ａ：ＭＣ３８ ＩＬ－２ＰＯＣ
２７Ａ．１ 薬剤及び処置
以下に説明するように、非腫瘍動物における追加の研究も行った。
Figure 2022532217000010
Figure 2022532217000011
Figure 2022532217000012
 実施例２７Ｂ：ＭＣ３８ ＩＬ－２
Figure 2022532217000013
２７Ｂ．１ 手順
マウスをイソフルランで麻酔して、潰瘍を低減するための細胞移植を行った。３０８頭のＣＲ雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に、０％マトリゲル中５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下投与してセットアップした。細胞注入体積は０．１ｍＬ／マウスとした。開始日のマウスは生後８～１２週であった。腫瘍が平均１００～１５０ｍｍ３のサイズになったらペアマッチを実施し、治療を開始した。体重を開始時に測定し、次いで最後まで隔週で測定した。キャリパー測定を最後まで隔週で行った。任意の有害作用は直ちに報告するものとした。３０％超の体重減少が１回でも観察された、または２５％超の体重減少が３回連続して観察された任意の個別の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超、または死亡率が１０％超の任意の群は投与を中止したが、その群は安楽死させず、回復が認められた。２０％超の体重減少が見られた群内では、個別の体重減少エンドポイントに達した個体を安楽死させた。群処置関連の体重減少が元の体重の１０％以内に回復した場合、より低用量またはより低頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置体重回復％の例外は、ケースバイケースで認められた。エンドポイントは腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）とした。動物を個別にモニタリングした。実験のエンドポイントは、腫瘍体積１５００ｍｍ３または４５日のいずれか早い方とした。応答者はより長く追跡した。エンドポイントに達したら、動物を安楽死させることとする。
２７Ｂ．２ 投与指示
塩形態の化合物は使用しなかった。１週間ごとに必要な量を計算し、それに応じて分取し、－２０℃で保存した。各週の投与ごとに１つの分取量を解凍し、４℃で保存し、各注入の直前にＰＢＳで必要量に希釈した。
ＩＬ－２－ＷＴＩは光からの保護を必要とし、製剤前は－４℃で保存、製剤後は－２０℃で保存した。凍結乾燥した材料は、上記と同様に説明書の指示通りに再構成した。ＡＣＰ１６、ＡＣＰ１３０、ＡＣＰ１２４、及びＩＬ－２ ＷＴＩをＰＢＳ中の投与用に調製した。ＩＬ－２－ＷＴＩはＰＢＳ中のＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（アルデスロイキン）を示し、ビヒクルはＰＢＳとした。
投与体積は、ＩＬ－２－ＷＴＩの場合は０．２ｍＬ／マウス、ＡＣＰ１６、ＡＣＰ１３０の場合は０．３ｍＬ、ＡＣＰ１２４の場合は０．５ｍＬとした。体重に合わせて調整しないこと。
２７Ｂ．３ 特別な指示
ＡＣＰ１６：現在の必要な化合物の量 － １３．４５ｍｇ
ＡＣＰ１３０：現在の必要な化合物の量 － ２５．８３ ｍｇ
ＡＣＰ１２４：現在の必要な化合物の量 － ４２．３１ｍｇ
ＩＬ－２－ＷＴＩ：現在の必要な化合物の量 － ９．９８ｍｇ
予期しない毒性が発生した場合には、剖検を実施することになっていた。
実施例２７Ｃ：ＭＣ３８ ＩＦＮα及びＩＬ－１２
２７Ｃ．１ 薬剤及び処置：
Figure 2022532217000014
Figure 2022532217000015
２７Ｃ．２ 手順
マウスをイソフルランで麻酔して、潰瘍を低減するための細胞移植を行った。３０８頭のＣＲ雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に、０％マトリゲル中５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下投与してセットアップした。細胞注入体積は０．１ｍＬ／マウスとした。開始日のマウスは生後８～１２週であった。腫瘍が平均１００～１５０ｍｍ３のサイズになったらペアマッチを実施し、治療を開始した。体重を開始時に測定し、次いで最後まで隔週で測定した。キャリパー測定を最後まで隔週で行った。任意の有害作用は直ちに報告するものとした。３０％超の体重減少が１回でも観察された、または２５％超の体重減少が３回連続して観察された任意の個別の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超、または死亡率が１０％超の任意の群は投与を中止したが、その群は安楽死させず、回復が認められた。２０％超の体重減少が見られた群内では、個別の体重減少エンドポイントに達した個体を安楽死させた。群処置関連の体重減少が元の体重の１０％以内に回復した場合、より低用量またはより低頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置体重回復％の例外は、ケースバイケースで認められた。エンドポイントは腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）とした。動物を個別にモニタリングした。実験のエンドポイントは、腫瘍体積１５００ｍｍ３または４５日のいずれか早い方とした。応答者はより長く追跡した。エンドポイントに達したら、動物を安楽死させることとする。
２７Ｃ．３ 投与指示
塩形態の化合物は使用しなかった。調製した投与溶液は以下の通り。ＩＬ－１２－ＨＭ－ＷＴＩは光から保護するように保存し、製剤前は－４℃、製剤後は－２０℃で保存した。ｍＩＦＮａ１－ＷＴＩは光から保護して－２０℃で保存した。製剤前は－２０℃で保存し、製剤後は－４℃で保存した。凍結乾燥した材料は説明書の指示に従って再構成した。１週間ごとに必要な量を計算し、それに応じて分取し、－２０℃で保存した。各週の投与ごとに１つの分取量を解凍し、４℃で保存し、各注入の直前に必要量をＰＢＳで希釈した。
ＡＣＰ１１、ＡＣＰ３１、ＡＣＰ１３１については、１週間ごとに必要な量を計算し、それに応じて分取し、－２０℃で保存した。各週の投与ごとに１つの分取量を解凍し、４℃で保存し、各注入の直前に必要量をＰＢＳで希釈した。
ＰＢＳは、全ての試験においてビヒクルとして使用した。
腹腔内（ｉｐ）投与体積ＡＣＰ１３１、ｍＩＦＮａ１－ＷＴＩ、ＩＬ－１２－ＨＭ－ＷＴＩ＝０．２ ｍＬ／マウス。ＡＣＰ１１の投与体積＝０．４ｍＬ（１８日目（１９年２月２６日）より前）、０．５５ｍＬ（１８日目（１９年２月２６日）以後）。
ＡＣＰ３１の投与体積＝０．３ｍＬ。薬用量は、体重に応じて調整しなかった。
第１６群ｍＩＦＮａ１－ＷＴＩ及び第１７群ＡＣＰ１３１の腫瘍内（ｉｔｕ）投与体積＝０．０５ｍＬ／マウス。薬用量は、体重に応じて調整しなかった。
実施例２７Ｄ：ＭＣ３８再チャレンジ
２７Ｄ．１ 薬剤及び処置：
Figure 2022532217000016
２７Ｄ．２ 手順
マウスをイソフルランで麻酔し、潰瘍を低減するために細胞を移植した。本研究のこの部分は、移植日（１日目）から開始した。第１群は３３頭のＣＲ雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなり、側腹部に０％マトリゲル中５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下投与してセットアップした。第２～６群は３３頭のＣＲ雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなり、左側腹部に０％マトリゲル中５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下投与してセットアップした。先のＭＣ３８実験（実施例２５ｘ）の腫瘍を各動物の右側腹部に移植した。細胞注入体積は０．１ｍＬ／マウスとした。開始時の対照マウスは生後１４～１７週であった。これらのマウスを、先のＭＣ３８実験（実施例２５ｘ）のマウスと週齢を合わせた。再チャレンジ中に活性薬剤は投与しなかった。体重を最後まで隔週で測定し、キャリパーも同様に測定した。いかなる有害作用または死亡も直ちに報告した。３０％超の体重減少が１回でも観察された、または２５％超の体重減少が３回連続して観察された任意の個別の動物は、安楽死させた。エンドポイントは腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）とした。動物を個別にモニタリングした。実験のエンドポイントは、腫瘍体積１０００ｍｍ３または４５日のいずれか早い方とした。応答者は可能な限り長く追跡した。エンドポイントに達したら、動物を安楽死させた。
実施例２７Ｅ：ＡＣＰ１６、ＡＣＰ１５３、ＡＣＰ１５５、及びＡＣＰ１５６による処置（図５８参照）
２７Ｅ．１ 薬剤及び処置：
Figure 2022532217000017
２７Ｅ．２ 手順：
マウスをイソフルランで麻酔し、潰瘍を低減するために細胞を移植した。ＣＲ雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に０％マトリゲル中５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下投与してセットアップした。細胞注入体積は０．１ｍＬ／マウスとした。開始日のマウスは生後８～１２週であった。腫瘍が平均１００～１５０ｍｍ３のサイズになったらペアマッチを実施し、治療を開始した。ＡＣＰ１６は１７、５５、２３０μｇ／動物、ＡＣＰ１５３、ＡＣＰ１５５、ＡＣＰ１５６は５５、２３０μｇ／動物で投与した。体重は投与開始時に測定し、次いで最後まで隔週で測定した。キャリパー測定を最後まで隔週で行った。任意の有害作用は直ちに報告するものとした。３０％超の体重減少が１回でも観察された、または２５％超の体重減少が３回連続して観察された任意の個別の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超、または死亡率が１０％超の任意の群は投与を中止したが、その群は安楽死させず、回復が認められた。２０％超の体重減少が見られた群内では、個別の体重減少エンドポイントに達した個体を安楽死させた。群処置関連の体重減少が元の体重の１０％以内に回復した場合、より低用量またはより低頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置体重回復％の例外は、ケースバイケースで認められた。エンドポイントは腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）とした。動物を個別にモニタリングした。実験のエンドポイントは、腫瘍体積１５００ｍｍ３または４５日のいずれか早い方とした。応答者はより長く追跡した。エンドポイントに達したら、動物を安楽死させることとする。結果を図５８Ａ～５８Ｄに示す。
実施例２８：条件培地のＦＲＥＴスクリーニング
表１０に挙げられた基質を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイにより、条件培地試料のタンパク質分解活性をスクリーニングした。
Figure 2022532217000018
２８．１ 反応条件
質量分析による多重基質プロファイリング（ＭＳＰ－ＭＳ）（例えばＯ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２０１２；９（１１）：１０９５－１１００で説明されている方法）を用いて、プロテアーゼ特異性スクリーニングを実施した。この方法では、物理化学的に多様なペプチドライブラリーをプロテアーゼの基質として用い、切断産物の質量分析検出によって反応を経時的にモニタリングする。得られた切断物を、酵素処理試料における特異的な切断について、酵素なし対照インキュベートの結果と比較することによって評価する。モチーフ解析用の配列ロゴは、ｉｃｅＬｏｇｏソフトウェア（ｖ．１．２）（ｉｏｍｉｃｓ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｉｃｅｌｏｇｏｓｅｒｖｅｒ／）を用いて作成した。
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅ）から、以下の組換えヒト酵素：ＣＴＳＬ１（＃９５２－ＣＹ）、ＡＤＡＭ１７（別名ＴＡＣＥ、ＴＮＦ－アルファ変換酵素）（＃９３０－ＡＤＢ）、ＦＡＰ－アルファ（＃９３０－ＡＤＢ－０１０）、ＭＭＰ－１４（＃９１８－ＭＰ－０１０）、フリン（＃１５０３－ＳＥ－０１０）、ＭＭＰ－９（＃９１１－ＭＰ－０１０）、トロンビン（＃２１９６－ＳＥ－２００）、サーモライシン（＃３０９７－ＺＮ）、第Ｘａ因子（＃１０６３－ＳＥ－０１０）、ヘプシン（＃４７７６－ＳＥ）、及びＡＤＡＭ－ＴＳ１（＃２１９７－ＡＤ）を調達した。酵素を製造業者の推奨に従って活性化し、アッセイした。
ＣＴＳＬ１については、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＭＥＳ、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝６）中で１５分間プレインキュベートすることにより酵素を活性化した。次いで、酵素及び基質を混合しながらＭＳＰ－ＭＳ反応を開始し、ＣＴＳＬ１の最終濃度は０．０４ｎｇ／μｌ（０．７７ｎＭ）、ペプチド基質濃度は５００ｎＭとした。
ＡＤＡＭ１７の活性は、製造業者の推奨条件に従い、ＦＲＥＴ基質Ｍｃａ－ＰＬＡＱＡＶ－Ｄｐａ－ＲＳＳＳＲ－ＮＨ２（配列番号２４４）を推奨のアッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＴＲＩＳ、２．５μＭ ＺｎＣｌ２（最適なｐＨ９．０で、そして生理的なｐＨ７．４でも））中で用いて、モニタリングした。ＡＤＡＭ１７酵素特異性を、１０ｎＭの酵素を用いたｐＨ９．０及び５０ｎＭの酵素を用いたｐＨ７．４のＭＳＰ－ＭＳ実験でプロファイリングした。
ＭＭＰ－１４は、製造業者の推奨条件に従い、酵素のフリンと共に（フリン：ＭＭＰ－１４のモル比は１：１００）と３７℃及びｐＨ９．０で１．５時間プレインキュベートすることによって活性化した。ＦＲＥＴアッセイは、２０ｎＭのＭＭＰ－１４を活性化緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ８．５）中で用いて、３７℃で実施した。
ＭＭＰ９は、１ｍＭ ｐ－アミノフェニルメルカプチド（ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストックから調製）と共に３７℃で２４時間、活性化緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｂｒｉｊ３５）中でインキュベートすることによって活性化した。蛍光アッセイに使用する最終酵素濃度は２．５ｎＭとした。
ＦＡＰα活性は、一般的なＺ－ＧＰ－ＡＭＣ基質を用いた蛍光検出で試験した。ＦＲＥＴアッセイにおいては、最終酵素濃度は５ｎＭ、緩衝液は５０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．５とした。
トロンビンは、製造業者の推奨条件に従い、酵素をサーモライシンと共に１５分間プレインキュベートすることによって活性化し、次いでサーモライシンを１，１０フェナンスロリン処理でクエンチした。活性化トロンビンを１．２ｎＭで、活性化緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、１０ ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．５）中でアッセイした。
第Ｘａ因子は、製造業者推奨の緩衝液（ ５０ｍＭ ＴＲＩＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中、３７℃、４．７ｎＭの酵素でアッセイした。
ヘプシンは、製造業者推奨の緩衝液（１００ｍＭ ＴＲＩＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｂｒｉｊ－３５、ｐＨ ８．０）中、３７℃で一晩プレ活性化した。緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中の２．４または２４ｎＭの酵素で活性を測定した。
ＡＤＡＭ－ＴＳ１は、製造業者推奨の緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中、５μＭの酵素濃度でアッセイした。
２８．２ 試料
条件培地及び細胞ライセート試料をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、マウス結腸癌細胞株：ＭＣ３８（上皮細胞）、ＣＴ２６（線維芽細胞）、及びＭＭＰ９のドキシサイクリン誘導性発現のためにレンチウイルスで形質導入したＣＴ２６（ＣＴ２６ ｐＬＶＸ ＭＭＰ９－５Ｔ４＋ｄｏｘ）のために入手した。不死化マウス腸管筋線維芽細胞株（ＡＢＭ Ｇｏｏｄ ＃Ｔ０５６５）を対照のストローマ細胞株として、製造業者推奨の条件下で成長させて使用した。また、条件培地及び細胞ライセート試料は、スクリーニング目的でＡＢＭ Ｇｏｏｄからも、不死化マウス結腸上皮細胞株ＹＡＭＣ（ＡＢＭ Ｇｏｏｄ ＃Ｔ０５６７）のために入手した。
条件培地試料を、対数期の細胞を用いて標準的プロトコルに従って調製した。簡潔に述べると、無血清培地または１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む完全培地のいずれかで、細胞を１６時間成長させた。条件付き培地を採取した後、接着細胞を洗浄し、次いで非変性溶解緩衝液を用いてプレート上で溶解して、細胞に関連したままの任意の活性を捕捉するための溶解した「細胞ペレット」を産生した。細胞培養物由来の条件培地試料、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製の細胞ライセート、及び内部由来の細胞ライセートは全て、試料間の比較ができるように同一の方法で処理した。
得られた条件培地をＰＢＳで緩衝液交換し、元の力価の１０倍になるように濃縮してストック液とした。
２８．３ 結果
これらの試料を用いた方法開発実験では、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む条件培地がＦＲＥＴスクリーニングに適用可能なことが示されたが、ＦＢＳの存在下で得られた各基質のバックグラウンド蛍光は少量であった。そのため、ＦＲＥＴ実験全体において、ＦＢＳのバックグラウンド対照を基質の各濃度におけるベースライン減算に使用した。
エンドポイントスクリーニングアッセイでは、１０倍濃縮試料の固定力価及び１０μＭの基質濃度を使用した。エンドポイント実験で報告する値は、秒当たりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）での初速度の測定値である。エンドポイント測定値はスクリーニングの出発点となるが、反応速度は基質濃度と非線形に関連する。そのため、より正確な活性の表現は、基質濃度の範囲を網羅する定常状態の動態学的測定値によってもたらされると考えられる。細胞株間の活性を比較するため、データをミカエリス・メンテンモデルで処理し、等価な酵素単位の濃度［Ｅ０］を解決した。
したがって、初速度は、２５０～１μＭの２倍希釈系列を用いて、基質濃度の関数として測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ８．０により、非線形最小二乗法を用いて、データをミカエリス・メンテン方程式にフィットさせた。
Figure 2022532217000019
 式中、ｋｃａｔは定常状態での産物形成の速度（単位ｓ－１）であり、ＫＭは、所与の酵素で反応の最大速度の半分がもたらされる基質濃度をモル単位（Ｍ）で示すミカエリス定数であり、［Ｅ０］は酵素濃度、［Ｓ］は基質濃度（Ｍ）である。
精製した組換え酵素を使用するアッセイでは、ミカエリス・メンテンパラメーターを上記のように古典的に定義する。条件培地試料については、アッセイごとの条件培地の有効力価を元の未処理培地試料のおよそ２倍に調整して、検出範囲が生成シグナルに確実に一致するようにした。計算上の酵素成分は、観測された累積活性に寄与する考えられるプロテアーゼの混合物として再定義され、各々が基質に対する固有の反応性を有する。この場合、ｋｃａｔ及びＫＭは、触媒作用の全体的効率を表す巨視的な定数とみなし、Ｅ０は濃度単位で表される酵素当量とするのがより適切である。データフィットを解決するため、ｋｃａｔ／ＫＭを組換え酵素のものに固定し、細胞培養体積当たりの酵素当量を出力することができる。この場合の酵素当量の有効力価は、異なる細胞株によって産生された活性を比較するために使用することができる。
腫瘍細胞株と対照細胞株との間の酵素当量の比率は、プロテアーゼ切断性リンカーを用いたプロドラッグの治療指数に対する寄与因子であり得る。
６つのモチーフ基質全てについて、腫瘍細胞株からは、対照の筋線維芽細胞細胞株からよりも大きな活性が条件培地で検出された（図３６）。
配列ＬＡＱＫＬＫＳＳ（ＡＤＡＭ１７＿２）（配列番号２０１）を有するＡＤＡＭ１７基質は、エンドポイントスクリーニング実験の結果に基づき、条件付き培地において、３つの腫瘍細胞株から産生された活性が筋線維芽細胞細胞株と比較しておよそ３倍大きかった（図３６、黒色のバー）。参照のため、１２ｎＭの組換えＡＤＡＭ１７の活性を同じアッセイ形式で示す。ＡＤＡＭ１７基質の定常状態動態学的曲線を図３７に示す。筋線維芽細胞の試料では、ＡＤＡＭ１７＿２のバックグラウンド活性は本質的に検出不能であった。
ＣＴＳＬ１基質ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）（ＣＴＳＬ１＿１）は、エンドポイントスクリーニング実験の結果に基づき、対照の筋線維芽細胞細胞株では活性が検出不能であり、同様にＭＣ３８及びＣＴ２６親細胞株の活性は低く、ＣＴ２６－ＭＭＰ９＋細胞株では活性が検出不能であった（図３６）。このアッセイは、１．５ｎＭのＣＴＳＬ１でベンチマークを行ったところ、４つの細胞株において、分泌ＣＴＳＬ１活性の細胞外濃度がこの有効濃度以下であることが示された。ＣＴＳＬ１＿１基質を用いた条件培地を定常状態動態解析を用いて再解析したところ、バックグラウンドを上回る測定可能な活性は認められなかった。
エンドポイントスクリーニング実験の結果に基づくＦＡＰαの分泌活性は非常に低いものであったものの、３つの腫瘍細胞株全てで検出された（図３６、青色のバー）。ＦＡＰα＿１の活性は、５ｎＭのＦＡＰα酵素でベンチマークを行った。この酵素は形質膜に会合した形態でも見出されるため、培地条件づけ手順の後に採取した細胞ペレット画分でもＦＡＰα活性を試験した。これらの結果については以下で論じる。
エンドポイントスクリーニングで観察されたように、条件培地をＦＡＰα＿１基質に対する活性について再解析したところ、細胞ライセートで測定した細胞ペレットに関連する活性よりも低い活性が示された（図３８及び図３９）。筋線維芽細胞の分泌活性は測定可能ではなかったが、細胞関連活性は有していた（図３８及び図３９）。
ＭＭＰ基質ＭＭＰ９＿１及びＭＭＰ１４＿１は、いずれもエンドポイントスクリーニングで高い活性を示し、その活性は、腫瘍細胞株において対照の筋線維芽細胞よりも顕著に高かった。ＭＭＰ９＿１（図３８の右から２番目の列）は、腫瘍株における活性が筋線維芽細胞対照のおよそ４倍であり、ＭＭＰ１４＿１は腫瘍株における活性がおよそ５７倍であった。ＭＭＰ１４＿１基質は、筋線維芽細胞において活性が最も低かったため、このアッセイでの高い腫瘍ｖｓ対照の比に寄与した。各腫瘍細胞株の条件培地中のＭＭＰ９＿１基質について、定常状態動態解析を用いて分泌活性を測定した（図３６）。筋線維芽細胞株では、ＭＭＰ９＿１の分泌活性の解析でアーテファクトが認められた（図３６）。これについては、より高い酵素力価での反復解析で対処する。ＭＭＰ９基質と同様、ＭＭＰ１４＿１基質も、腫瘍細胞からの条件培地では顕著な測定可能な活性が認められたが、筋線維芽細胞株では活性が認められなかった。
まとめると、条件培地のＦＲＥＴスクリーニングの結果は
酵素ＡＤＡＭ１７、ＣＴＳＬ１、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４に対する腫瘍特異的な活性を実証するものであった。可溶性ＦＡＰ－α活性は低かった。
実施例２９：細胞ライセート中のＦＡＰα基質に対する腫瘍特異的活性
細胞ペレット関連ＦＡＰα活性を試験するため、細胞ライセートを超遠心分離によって清澄化し、次いでＦＲＥＴアッセイでそのままアッセイした。図４１で示されているように、４つの細胞株全てにおいて、ＦＡＰα＿１の切断活性が検出された（青色のバー、各対の右側のバー）。３つの腫瘍細胞株では、筋線維芽細胞株に対し２倍以上の中程度の活性が検出された。比較のため、細胞ライセート中のＣＴＳＬ１活性も試験した。ＣＴＳＬ１はリソソーム酵素であるため、ＣＴＳＬ１＿１に対する活性は４つの細胞株全てで同様に豊富であることが予想された。このスクリーニング形式における腫瘍ｖｓ対照細胞株のＣＴＳＬ１＿１切断比率は約１倍であった（灰色のバー、各対の左側のバー、図４１）。ＦＡＰα（線維芽細胞活性化タンパク質－アルファ）は、線維芽細胞（ＣＴ２６）及び筋線維芽細胞細胞株のマーカーである。そのため、追加の非繊維芽細胞、上皮細胞株を代替的な陰性対照細胞株として入手した。これはＭＣ３８上皮細胞株と同等である。
実施例３０：ＣＴＳＬ１基質に対する細胞関連活性
ＣＴＳＬ１基質に対する細胞関連活性は全ての細胞ライセートで検出され、この酵素の細胞関連活性が示された。ＭＣ３８細胞における活性は、筋線維芽細胞、ＣＴ２６親細胞、ＣＴ２６－ＭＭＰ９＋細胞よりも顕著に大きかった（図４２）。
実施例３１：不死化筋線維芽細胞細胞株からの条件培地中の分泌活性
全ての筋線維芽細胞反応物において、低いバックグラウンド補正蛍光が観察された。したがって、不死化筋線維芽細胞株は、条件培地活性が低いと結論づけることができる。
実施例３２：追加の対照「正常」上皮細胞株のスクリーニング
不死化マウス結腸上皮細胞株（ＹＡＭＣ）を使用して、追加の対照「正常」上皮細胞の存在下で活性を試験した。ＹＡＭＣには、これら全ての定常状態実験から得られた計算上の酵素当量（ｎＭ）を与えて、試料ごとの当量活性の量の比較が可能になる。例えば、ＹＡＭＣ対照上皮細胞株は、ＡＤＡＭ１７＿２基質により、ＡＤＡＭ１７組換え酵素の０．５２±０．０３ｎＭと同等の活性をもたらした。この細胞株は、同様に上皮起源のＭＣ３８と直接比較すると、その活性は、ＡＤＡＭ１７組換え酵素の０．３２±０．０３ｎＭと同等であった。スクリーニングの結果からは、全ての基質において、ＹＡＭＣ細胞株は筋線維芽細胞株よりも概してバックグラウンド活性が高いことが示された。この細胞株は、マウスＩＦＮγを用いた成長及び低温での維持を含めた非標準的な細胞培養条件を必要としたため、上皮性細胞株の十分な代表例ではない可能性がある。
実施例３３：８ｍｅｒ ＦＲＥＴペプチドの文脈及び拡張タンデムリンカーの文脈におけるＣＴＳＬ１＿２モチーフの切断。
ＣＴＳＬ１酵素の新たな候補モチーフを特性評価するために、追加のｉｎ ｖｉｔｒｏ動態実験を実施した。ＣＴＳＬ１＿２モチーフは配列ＡＬＦＦＳＳＰＰ（配列番号１９９）を有する。ＣＴＳＬ１は、ＣＴＳＬ１＿１モチーフを有するＦＲＥＴ基質を高効率で切断する（図４６）。しかし、ＣＴＳＬ１＿２ ＦＲＥＴ基質を用いた最初の実験は、おそらくはＦＲＥＴアッセイにおけるアーテファクトが原因で不確定だったため、９ｍｅｒ配列ＡＬＦＦＳＳＰＰＳ（配列番号２３６）を用いて新たなＦＲＥＴペプチドコンストラクトを設計した。このＣＴＳＬ１＿２モチーフを有する９ｍｅｒ ＦＲＥＴ基質は、ＣＴＳＬ１＿１モチーフと同等の触媒効率をもたらした。
これらの研究で使用したＦＲＥＴ基質は全て、配列のＮ末端及びＣ末端にそれぞれ、メトキシクマリン（Ｍｃａ）蛍光団及びジニトロフェニル－リジル（Ｄｎｐ）消光剤の対を有する。モチーフＡＬＦＦＳＳＰＰ（配列番号１９９）は、先の実験で、ＭＳＰ－ＭＳ調整ライブラリーアッセイで使用した１４ｍｅｒペプチドコンストラクト内のＡＬＦＦ｜ＳＳＰＰ（配列番号１９９）（｜は被切断結合を示す）で効率的に切断された。また、このモチーフは、１４ｍｅｒペプチド内のＡＬＦ｜ＦＳＳＰＰ（配列番号１９９）及びＡＬＦＦＳ｜ＳＰＰ（配列番号１９９）部位でも切断されたことから、１４ｍｅｒペプチドの実験では、ＣＴＳＬ１＿２モチーフの酵素認識が＋／－１部位だけ配列の上または下にシフトしている可能性が示された。このことはまた、Ｍｃａ－ＡＬＦＦＳＳＰＰＫ－Ｄｎｐ（配列番号２４５）を用いた８ｍｅｒ設計では、シフトしたＰ４またはＰ４’位置の蛍光団／消光剤対との（立体的またはその以外の）好ましくない相互作用を有し得ることも示唆している。この相互作用は、Ｍｃａ－ＡＬＦＦＳＳＰＰＳＫ－Ｄｎｐ（配列番号２４６）を用いて９ｍｅｒ基質として再設計することにより、軽減された。このＦＲＥＴ実験から、この配列の切断には、＋／－１の位置シフトした部位での結合認識が必要である可能性が高く、蛍光団または消光剤がこの結合に干渉し得ることが示された。
この仮説は、ハイブリッドリンカー設計実験の文脈で試験された。図４６に、以下の配列を有する２つのマッチした３０ｍｅｒペプチドを切断した結果が示されている。
（ＣＴＳＬ１＿１）ＳＧＧＰＧＧＰＡＧＩＧＡＬＦＫＳＳＦＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＧ（配列番号２０７）
（ＣＴＳＬ１＿２）ＫＳＧＰＧＧＰＡＧＩＧＡＬＦＦＳＳＰＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＲ（配列番号２１９）
いずれのペプチドも、基質（四角）の急速な消失及び、標的被切断結合（部位０、青色の三角、図４６）における切断からの産物形成を示した。これらのペプチドの違いは、－１及び＋１部位での許容的切断にある。ＣＴＳＬ１＿１はＡＬＦ｜ＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）で－１部位産物を有した（逆三角）が、ＣＴＳＬ１＿２は有さず、＋１部位産物は、ＣＴＳＬ１＿２の基質（ＡＬＦＦＳ｜ＳＰＰ（配列番号１９９））から、ＣＴＳＬ１＿１基質（ＡＬＦＫＳ｜ＳＦＰ）（配列番号１９８）よりも迅速に形成された。
ＣＴＳＬ１＿１及びＣＴＳＬ１＿２のカウンタースクリーニングを、酵素カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）を用いて実施した。基質ＣＴＳＬ１＿２は、塩基性Ｐ１残基を欠いているものの（ＡＬＦＦＳＳＰＰ（配列番号１９９））、ＣＴＳＫによって測定可能に切断されたが、ＣＴＳＬ１＿１基質（ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８））に比べて１５倍低いレベルであった（図４７）。比較のため、Ｚ－ＬＲ－ＡＭＣやＺ－ＦＲ－ＡＭＣなどの参照基質の比活性は１５，０００～２５，０００ｐｍｏｌ／分／μｇであり、図４７ではその平均値を破線によって示している。
このように、これらの結果は、新たなＣＴＳＬ１＿２モチーフが、８ｍｅｒ ＦＲＥＴペプチドの文脈では切断されなかったが、９ｍｅｒのＦＲＥＴペプチドとしては切断され、拡張タンデムリンカーの文脈では迅速に切断されたことを示している。
実施例３４：質量分析検出によるタンデムリンカー解析
３４．１ 質量分析による基質プロファイリング
候補タンデムリンカー設計の触媒効率を解析するため、ＭＳＰ－ＭＳを用いた調整ライブラリーアプローチを適用した。調整ライブラリーでは、配列文脈が切断効率に影響を及ぼすかどうかを試験するために、３０アミノ酸長（３０ｍｅｒ）の１９個の合成ペプチドセットを設計した。ペプチドを、ＭＳＰ－ＭＳを用いて個々の組換え酵素の基質ライブラリーとして、多重形式でアッセイした。定量的比較のために、経時的な動態解析を実施し、結果は、一次動態の挙動が正常であれば触媒効率ｋｃａｔ／ＫＭとして報告し、または動態の挙動がより複雑な場合は観測された速度をｋｏｂｓとして報告する。
３４．２ タンデムリンカー配列のライブラリー
タンデムリンカー配列のライブラリーは、３つの個別のプロテアーゼモチーフをより長い３０ｍｅｒペプチド配列の文脈内に組み込むように設計した。表１１に３０ｍｅｒペプチドの配列及びモチーフ配置が収載されている。
Figure 2022532217000020
モチーフ間の間隔にわずかな差異がある１つ、２つ、または３つの反復ＭＭＰ１４＿１のモチーフを有することの相加効果を試験するため、４つのタンデムリンカーのセットを設計した（ＡＬＵ３０－１から－４）。
隣接する部位からの近接効果が、所与のプロテアーゼの標的モチーフに対する触媒効率を変更し得るかを試験するため、１つのセットに含まれる３つのモチーフを全ての並べ替えで配置した。例えば、モチーフＡ、Ｂ、及びＣの組合せは、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ｃ－Ａ－Ｂ、Ｂ－Ｃ－Ａ、Ｂ－Ａ－Ｃ、Ａ－Ｃ－Ｂ、及びＣ－Ｂ－Ａと配置することができる。これらの並べ替えを、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）活性に感受性の広いセットのモチーフとしてのＭＭＰ１４＿１、ＡＤＡＭ１７＿２、及びＣＴＳＬ１＿１のタンデム組合せ（ＡＬＵ３０－１１から－１６）、ならびにＭＭＰ感受性の低いセットとしてのＦＡＰａ＿１とＡＤＡＭ１７＿２及びＣＴＳＬ１＿１との組合せ（ＡＬＵ３０－５から－１０）に対し、試験した。
また、ＡＤＡＭ１７及びＣＴＳＬ１の２つの代替的基質についても試験した。２つのさらなるペプチド、すなわちＡＤＡＭ１７＿２モチーフをＡＤＡＭ１７＿１に交換したペプチド（ＡＬＵ３０－１７）、ＣＴＳＬ１＿１をＣＴＳＬ１＿２に交換したペプチド（ＡＬＵ３０－１８）を設計し、新たな個々のプロテアーゼモチーフを用いたさらなるタンデムリンカー設計を試験する戦略を示した。
３４．３ カウンタースクリーニング
トロンビン、第Ｘａ因子、ヘプシンの各酵素に対してもこのライブラリーを用いてカウンタースクリーニングを実施し、活性の較正のため、これらの酵素に好ましいモチーフを有する陽性対照ペプチドも設計した（ＡＬＵ３０－１９）。
これらのモチーフ以外にも、各タンデムリンカーペプチドのＮまたはＣ末端のブラケット配列に軽微な変化を施し、質量分析検出を用いたペプチドの区別を可能にするユニークな配列を生成した。
触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）推定値を使用して、ＭＳＰ－ＭＳ反応における切断基質の上位をランク付けした。ペプチドは、各ペプチドのＭＳ１前駆体イオンピーク面積から、質量分析標識フリー定量化によって定量化した。酵素進行曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて６つの時点の測定値からモデル化した。データは、非線形最小二乗法を用いて一次動態方程式にフィットさせた。
Figure 2022532217000021
 式中、Ｙ＝産物形成パーセントまたは基質消費率、ｔ＝時間である。観測された速度は、酵素濃度［Ｅ０］の関数であり、観測された触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）は単位Ｍ－１ｓ－１で示す。
３４．４ 結果
３０ｍｅｒタンデムリンカーライブラリーを用いた解析では、各々の組換え酵素による特異的な切断が示された。この実験では、基質分解速度及び産物形成速度の両方が、リンカー切断の効率を理解するための有用な比較となった。
例えば、３０ｍｅｒライブラリーのペプチドの基質分解トレースは、図５５のＭＭＰ９処理から示されている。最も効率的なＭＭＰ９基質は、ＭＭＰ１４＿１モチーフの３回反復を有する基質であった。次に効率的な基質は、ＭＭＰ１４＿１が直接ＡＤＡＭ１７＿２に続くモチーフの対を含んでいた。シングルまたはダブルのＭＭＰ１４＿１モチーフを有するペプチドは、その次であった。予想外の結果は、ＰＧＧＰＡＧ｜ＩＧＡＬＦ（配列番号２４７）でＣＴＳＬ１＿１モチーフに直接続くＦＡＰａ＿１を有するペプチド内でもＦＡＰａ＿１モチーフが切断されていたことであり、これらは低効率の切断であった。ただし、ＦＡＰａ＿１モチーフは、その後にＡＤＡＭ１７＿２モチーフやスペーシング残基ＧＧが続く場合は、ＭＭＰ９に切断されなかった。最も遅いペプチドは、３０ｍｅｒペプチドのＣ末端付近にＭＭＰ１４＿１モチーフを有する。この実験から、ＭＭＰ９は下流のプライム側位置にさらなる配列選好性を有し、ＡＤＡＭ１７＿２の上流にＭＭＰ１４＿１を組み合わせるのが最も効率的であるという傾向が浮上した。
ＭＭＰ９処理による産物形成の固有の速度をより十分に理解するために、これらの実験において特定のペプチド結合での切断産物をモニタリングすることも可能である。１、２、または３つのＭＭＰ１４＿１タンデムモチーフを有するペプチドの比較が図５０に示されている。最も迅速に分解されたペプチドは、ＭＭＰ１４＿１の３つの反復モチーフを有するペプチドであった（上パネル）。全体的には、１つまたは２つのＭＭＰ１４＿１モチーフを有するペプチドは、ほぼ同じ速度で分解された（上パネル）。しかし、個々の部位における結合切断の本質的な速度を考慮すると、結合９におけるＡｌｕ３０－２の切断産物は、結合１６のＡｌｕ３０－１または結合２１のＡｌｕ３０－２の切断産物よりも迅速に現れた（下パネル）。このように、Ａｌｕ３０－２ペプチドの特異的切断は、Ａｌｕ３０－１ペプチドよりも効率的であった。これらの個々の結合切断事象は、ユニークなペプチドフラグメントを追跡することによってモニタリングされ、データフィッティングには複雑すぎるものの、産物のランク付けは可能である。
ＦＡＰαは、ＦＡＰα＿１及びＭＭＰ１４＿１両方のモチーフを、それぞれＰＧＧＰ｜ＡＧＩＧ（配列番号１９７）とＧＰ｜ＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）で切断することができた。ＦＡＰαによる３０ｍｅｒペプチドの分解は、タンデムＭＭＰ１４＿１モチーフを有するペプチドに対し最も高い切断活性を示した（図５０、Ａｌｕ３０－４またはＡｌｕ３０－３）。また、２つのＭＭＰ１４＿１モチーフを有するペプチド（Ａｌｕ３０－２）も効率よく切断された。ＦＡＰα＿１モチーフは、ＡＤＡＭ１７＿１またはＡＤＡＭ１７＿２モチーフに続いて切断された場合の方が、ＣＴＳＬ１＿１またはＣＴＳＬ１＿２に続いて切断された場合よりも、効率的に切断された。これらのペプチドのうち、Ｌｙｓを有するＡＤＡＭ１７＿２またはＣＴＳＬ１＿１モチーフは、今回の実験で新たに試験したＡＤＡＭ１７＿１及びＣＴＳＬ１＿２モチーフよりも低効率であった。
別の傾向としては、ＦＡＰα＿１モチーフが、これらのペプチドのＮ末端に対し第１または第２の位置で切断される選好性が見られた。ＦＡＰα＿１モチーフがＣ末端に最も近い第３の位置にある場合、これらのペプチドは切断されなかった（Ａｌｕ３０－７またはＡｌｕ３０－８）。ＭＭＰ１４＿１モチーフは、Ｃ末端に最も近い第３の位置で容易に切断されたが、これは、Ｎ末端切断が３０ｍｅｒの短縮を支援するタンデムＭＭＰ１４＿１モチーフを有するペプチドにおいて、最も明らかであった。このように、ＦＡＰαは、ハイブリッドリンカー設計において、他の場所にある第１の酵素で活性化された後に二次的な切断酵素として機能する可能性がある。
３０ｍｅｒのペプチドライブラリーのＣＴＳＬ１処理によって、ＣＴＳＬ１＿１またはＣＴＳＬ１＿２モチーフを有する全てのペプチドが切断された（図５１）。最も効率的に切断されたペプチドは、ＦＡＰａ＿１、ＣＴＳＬ１＿１、及びＡＤＡＭ１７＿２のモチーフを複数の順番で含むペプチドであった。ＭＭＰ１４＿１モチーフを有するペプチドとＣＴＳＬ１＿１及びＡＤＡＭ１７＿２との組合せは、わずかに抵抗率であった。また、３０ｍｅｒペプチドの途中にあるＣＴＳＬ１モチーフも好ましかったことから、ＣＴＳＬ１はハイブリッドモチーフの第１の切断として機能できる可能性がある。
ＡＤＡＭ１７は、ＡＤＡＭ１７＿１またはＡＤＡＭ１７＿２モチーフを有する全てのペプチドにおいて同様に切断をもたらした（図５２）。最も効率的なペプチド切断は、ＡＤＡＭ１７＿２、ＣＴＳＬ１＿１、及びＦＡＰａ＿１のモチーフを含むペプチドで生じた。ＭＭＰ１４＿１をＡＤＡＭ１７＿２及びＣＴＳＬ１＿１と共に含むペプチドでは、わずかに低効率の切断が得られた。ＭＭＰ１４＿１モチーフのみを有するペプチドは切断されなかった。ＡＤＡＭ１７＿２モチーフ及びＡＤＡＭ１７＿１モチーフをそれぞれ含むペプチドＡｌｕ３０－９及びＡｌｕ３０－１７の切断効率は同様であった。
トロンビン、第Ｘａ因子、及びヘプシンを用いたカウンタースクリーニングも同じ解析に従って実施した。ライブラリーペプチドＡｌｕ３０－１９は、全体的な切断効率及び各モチーフ内の切断部位特異性を比較するために、各酵素の真正部位を含むように設計した。第Ｘａ因子用に設計した基質は、トロンビンの第Ｘａ因子切断部位に由来するＦＮＰＲ｜ＴＦＧＳ（配列番号２４８）というモチーフを有する。トロンビンの基質モチーフは、一般的ツール基質モチーフであるＦＰＲ｜であった。ヘプシンの基質モチーフは、フィラグリンからのＲＫＲＲ｜ＧＳＲＧ（配列番号２４９）であった。
図５３に第Ｘａ因子切断の結果が示されている。真正の切断部位モチーフはこのモチーフを有するペプチドＡｌｕ３０－１９であり、５分時点の前に完全に分解した。Ａｌｕ３０－１９切断の産物は、このペプチドの３つの部位全てから形成された。これに対し、顕著な切断を伴った唯一のライブラリーペプチドはＡｌｕ３０－５で、ＦＡＰａ＿１モチーフの上流のＣＴＳＬ１＿１モチーフＡＬＦＫＳ｜ＳＦＰ（配列番号１９８）で切断された。
他の場合において、ＣＴＳＬ１＿１モチーフを有する他の全てのペプチドは、ＡＬＦ｜ＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）またはＡＬＦＫＳ｜ＳＦＰ（配列番号１９８）のいずれかで第Ｘａ因子によって切断された。ＡＤＡＭ１７モチーフは、ＫＬＫ｜ＳＳＧＰ（配列番号２５０）、ＫＬＫＳＳ｜ＡＬＦ（配列番号２５１）、またはＲＬＲ｜ＳＳＡＬＦ（配列番号２５２）でも切断されたが、これらの切断は全て低効率であった。モチーフＣＴＳＬ１＿２を有するペプチドは、最も低効率で切断された。
トロンビンは第Ｘａ因子よりも高い活性を示し、３０ｍｅｒの各ペプチドを切断した。ＭＭＰ１４＿１モチーフはＧＰＡＧ｜ＬＹＡＱ（配列番号１９５）で切断され、ＣＴＳＬ１＿１モチーフはＡＬＦＫ｜ＳＳＦＰ（配列番号１９８）、ＡＤＡＭ１７＿２モチーフはＬＡＱＫ｜ＬＫＳＳ（配列番号２０１）またはＬＡＱＫＬＫ｜ＳＳ（配列番号２０１）（あるいはＡＤＡＭ１７＿１の場合ＬＡＱＲ｜ＬＲＳＳ（配列番号２００）及びＬＡＱＲＬ｜ＳＳ（配列番号２５３））で切断された。２つの代替的ＡＤＡＭ１７モチーフは同様の効率で切断された（ペプチドＡｌｕ３０－１７ ｖｓ Ａｌｕ３０－９）。ただし、ＣＴＳＬ１＿２モチーフの切断活性は、ＣＴＳＬ１＿１モチーフよりも低かった（ペプチドＡｌｕ３０－１８ ｖｓ Ａｌｕ３０－６）。Ａｌｕ３０－１及びＡｌｕ３０－３のペプチドはライブラリーの中で最も迅速に切断され、Ａｌｕ３０－４も効率的な基質であったことから、この実験におけるＭＭＰ１４＿１モチーフの感受性が示された。２つのＭＭＰ１４＿１モチーフを有するペプチドＡｌｕ３０－２は、トロンビンに対する感受性が低かったが、これはモチーフ間にグリシン残基が追加されたことで間隔が変化したことに起因する可能性がある。また、ＡＤＡＭ１７＿２及びＣＴＳＬ１＿１と組み合わせてＭＭＰ１４＿１モチーフを有するペプチドＡｌｕ３０－１２、Ａｌｕ３０－１３、及びＡｌｕ３０－１５は、トロンビンによる切断が低効率であった。したがって、モチーフ間の間隔の増加または特定の配置により、トロンビンに感受性のリンカー設計が救済される可能性がある（図５４）。
トロンビン感受性を低減するための好ましい配置としては、ＣＴＳＬ１＿１の上流でＡＤＡＭ１７＿２を使用すること、及びＦＡＰａ＿１の上流でＣＴＳＬ１＿１を使用することが挙げられる。
最後に、３０ｍｅｒライブラリーのヘプシン処理によって、全体的に切断効率が低くなった（図５５）。これらのペプチド分解反応の動態は、複数の切断産物が形成されたため複雑であった。例えば、Ａｌｕ３０－１９は、反応の最初の１５分以内にＲＫＲＲ｜（配列番号２５４）、ＦＰＲ｜、及びＦＮＰＲ｜（配列番号２５５）の３つのモチーフ全てで切断された。このモチーフを有するＦＲＥＴペプチドの触媒効率の文献値は３．５×１０５Ｍ－１ｓ－１であった。真正ペプチドＡｌｕ３０－１９、ならびに上位の切断ペプチドＡｌｕ３０－８、－９、－１２、及び－１４はいずれも、見かけ上の触媒効率が１０５Ｍ－１ｓ－１と同じ程度であった。ペプチドのヘプシン感受性を高める特徴は、ＡＤＡＭ１７＿２モチーフをペプチドの第２のモチーフ位置に置くこと、またはＡＤＡＭ１７＿２にＣＴＳＬ１＿１が続く組合せにあるように思われる。概して、ライブラリーのペプチドは全てＰ１のＬｙｓ部位、ＱＫＬＫ｜（配列番号２５６）またはＡＬＦＫ｜（配列番号２５７）で切断された。ＡＤＡＭ１７＿１モチーフはＡＤＡＭ１７＿２よりも低効率で切断され、代替的なＣＴＳＬ１＿２モチーフもＣＴＳＬ１＿１よりもはるかに遅い速度で切断された。
結論として、質量分析検出を用いたタンデムリンカー解析は、モチーフの順序の選好性及び予期しない副反応を明らかにした。
実施例３５：３０ｍｅｒタンデムリンカーの設計
最も効率的なタンデムリンカーを生成するために、３０ｍｅｒライブラリーペプチドに対する各標的化された酵素の切断効率を比較することができる（図６４）。
ペプチドＡｌｕ３０－１６にＡＤＡＭ１７＿２－ＭＭＰ１４＿１－ＣＴＳＬ１＿１を配置したタンデムリンカーは、５つの標的化された酵素の全てのセットに対し概して高い活性を示し、トロンビン、第Ｘａ因子、及びヘプシンに対する感受性は最も低かった。次に良好な構成は、Ａｌｕ３０－１５のＭＭＰ１４＿１－ＡＤＡＭ１７＿２－ＣＴＳＬ１＿１であり、ヘプシン感受性がわずかに高く、ＣＴＳＬ１活性が低いものの、ＣＴＳＬ１＿２モチーフに置き換えることで救済される可能性がある。また、ＡＤＡＭ１７＿２モチーフをＡＤＡＭ１７＿１で置き換えれば、ＡＤＡＭ１７の活性増強が軽微であったとしても、ＦＡＰ－アルファ及びＣＴＳＬ１に対する活性も増強される可能性があり、ヘプシン感受性が低減することが予測される。
実施例３６．血清及び血漿中での安定性
目的コンストラクトの安定性を、ヒトまたはマウス血清中で測定した。各コンストラクト（およそ３０ｍｇ／ｍＬ）を血清（コンストラクト：血清の比率は１：９）、ＭＭＰ９、またはＰＢＳと組み合わせた。混合物を３７℃で２４または７２時間インキュベートした。比較のために、Ｔ＝０時間で試料を採取した。インキュベート後、試料をＰＢＳで１：５００（ヒト血清の場合、図５６）または１：２００（マウス血清の場合、図５７）に希釈し、ウェスタンブロット解析のためにＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で実行した。ポリクローナル抗ＩＬ－２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してブロットをプロービングした。結果を図５６及び図５７に示す。
実施例３７．ＩＬ－２の血清安定性
ヒト血清（正常及びがん患者）中でのＩＬ２融合タンパク質の安定性を、キャピラリー電気泳動ベースのイムノアッセイ（Ｊｅｓｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いて測定した。融合タンパク質を濃縮して１０ｍｇ／ｍｌとし、血清（９０％）と共にインキュベートした。ゼロ時間の試料を直ちに氷上で保存し、２４時間及び７２時間の試料は３７℃で置いた。インキュベート後、試料を０．１×試料緩衝液（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）で１：１０００に希釈し、製造業者のプロトコルに従ってＪｅｓｓカートリッジに装填した。一次抗体はモノクローナルヒトＩＬ２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＡＦ－２０２－ＮＡ）、ストック濃度０．２ｍｇ／ｍｌ、作業濃度１：１００）とし、二次抗体はペルオキシダーゼ標識ＡｆｆｉｉｎｉＰｕｒｅウシ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（カタログ番号８０５－０３５－１８）、０．８ｍｇ／ｍｌで再構成、作業濃度１：５０００希釈）とした。全ての抗体をミルクフリー希釈液（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）で希釈した。Ｃｏｍｐａｓｓソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いてＩＬ２含有種の定量化を行い、切断の程度（すなわち、入力融合タンパク質よりも小さいＩＬ２含有種の量）を定量した。結果を図２４Ａ～２４Ｂに示す。
実施例３８：組織の安定性
初代ヒト肺上皮細胞及び腎上皮細胞をＡＴＣＣから入手した。初代肝細胞をＬｏｎｚａ及びＳｉｇｍａから入手した。細胞を解凍し、計数し、９６ウェルの丸底プレートに１ｅ４細胞ずつ、それぞれの成長培地中で平板培養した。組換えヒトＩＬ－２ならびにリンカー２及びリンカー３の配列を含むポリペプチドを、５μｇ／ｍＬの濃度で２４及び７２時間、細胞と共にまたは培地単独と共にインキュベートした。細胞培養上清を採取し、細胞を廃棄した。ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｐｌｅ ＪＥＳＳ ｓｙｓｔｅｍ及びＣｏｍｐａｓｓソフトウェアを用いて、ＩＬ－２のウェスタンブロットによってタンパク質切断を測定した。結果を図５に示す。
初代ヒト肺線維芽細胞をＡＴＣＣから入手した。プロセッシングアッセイの前に、ヒトＰＢＭＣを５ｕｇ／ｍＬ ＰＨＡで７２時間刺激してＴ芽細胞を生成し、次いでこれを凍結し、ポリペプチドプロセッシングの測定に使用した。初代ヒト線維芽細胞を解凍し、計数し、９６ウェル丸底プレートに１ｅ５細胞ずつ、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５培地中で平板培養した。組換えヒトＩＬ－２と、リンカー１（ＧＰＡＧＭＫＧＬ、配列番号１９６）、リンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）、もしくはリンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）の配列、または非切断性配列とを含むポリペプチドを、線維芽細胞と共にまたは線維芽細胞なしで、Ａ）３．３ｎＭまたはＢ）０．３３ｎＭのいずれかの濃度で４８時間インキュベートした。陽性対照として、いくつかのウェルはさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプレカットしたポリペプチドを用いて、１μｇの事前活性化ＭＭＰ９酵素と共に３７℃で一晩インキュベートした。４８時間後、細胞培養上清を採取し、健康な線維芽細胞を廃棄した。ポリペプチドのプロセッシングは、Ａ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｐｌｅ ＪＥＳＳシステムを用いたＩＬ－２のウェスタンブロット、またはＢ）細胞培養上清がＴ芽細胞増殖を刺激する能力の測定、のいずれかによって測定した。簡潔に述べると、Ｔ芽細胞を、予め健康なヒト線維芽細胞に曝露したポリペプチドを含む細胞培養上清と共に７２時間インキュベートした後、Ｔ芽細胞の増殖をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ解析によって測定した。結果を図６Ａ～６Ｂに示す。
実施例３９：リンカー２はヒト腫瘍細胞で効率的に切断される
ヒト試料由来の腫瘍組織内でのリンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）の切断効率を評価した。７つの固形腫瘍タイプから合計６６の試料を解析した。腫瘍タイプを以下の表５に示す。
簡潔に述べると、凍結した分離腫瘍細胞（ＤＴＣ）を解凍し、計数し、Ｘ－Ｖｉｖｏ培地中で平板培養した。細胞ウェルまたは「無細胞対照」ウェルを、リンカー１（本明細書に記載のプロセスを用いて設計されていない切断性リンカー）またはリンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）を含む誘導性ＩＬ－２サイトカインと共にインキュベートした。これらの誘導性ＩＬ－２タンパク質は、リンカーがインタクトの場合、ＩＬ－２生物学的活性がないまたは最小限の活性であり、リンカーが切断されるとＩＬ－２の生物学的活性が誘導される。細胞培養上清を採取し凍結した後に、Ｔ芽細胞増殖及びＪｅｓｓタンパク質アッセイを用いてＩＬ－２の生物学的活性を解析した。
ＩＬ－２活性の倍数変化の最小値は１．００、最大値は２．５０である。１．３倍の変化は、非切断対照と比較して生物学的活性が著しく増加したことを示すものである。表５は、リンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）の平均倍数変化を、非切断対照、切断対照、及びリンカー１と比較して示している。表１２において、記号「－」は活性の増加が本質的にないことを示し、「＋／－」は活性の増加があるが有意ではないことを示し、「＋」、「＋＋」、及び「＋＋＋」は、非切断対照と比較して活性が相対的に有意に増加していることを示す。リンカー２は、ヒト腫瘍タイプにおいて十分に切断されて、ＩＬ－２の生物学的活性を誘導している。
Figure 2022532217000022
実施例４０：リンカー３はヒト腫瘍細胞内で効率的に切断される
ヒト試料由来の腫瘍組織内でのリンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）の切断効率を評価した。７つの固形腫瘍タイプから合計６６の試料を解析した。腫瘍タイプを以下の表６に示す。
簡潔に述べると、凍結したＤＴＣ細胞を解凍し、計数し、Ｘ－Ｖｉｖｏ培地中で平板培養した。細胞ウェルまたは「無細胞対照」ウェルを、リンカー１（本明細書に記載のプロセスを用いて設計されていない切断性リンカー）またはリンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）を含む誘導性ＩＬ－２サイトカインと共にインキュベートした。これらの誘導性ＩＬ－２タンパク質は、リンカーがインタクトの場合、ＩＬ－２生物学的活性がないまたは最小限の活性であり、リンカーが切断されるとＩＬ－２の生物学的活性が誘導される。細胞培養上清を採取し凍結した後に、Ｔ芽細胞増殖及びＪｅｓｓタンパク質アッセイを用いてＩＬ－２の生物学的活性を解析した。
ＩＬ－２活性の倍数変化の最小値は１．００、最大値は２．５０である。１．３倍の変化は、非切断対照と比較して生物学的活性が著しく増加したことを示すものである。表６は、リンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）の平均倍数変化を、非切断対照、切断対照、及びリンカー１と比較して示している。表１３において、記号「－」は活性の増加が本質的にないことを示し、「＋／－」は活性の増加があるが有意ではないことを示し、「＋」、「＋＋」、及び「＋＋＋」は、非切断対照と比較して活性が相対的に有意に増加していることを示す。リンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）は、ヒト腫瘍タイプにおいて十分に切断されて、ＩＬ－２の生物学的活性を誘導している。
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実施例４１：アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体の誘導性の測定
ヒト４－１ＢＢを発現する安定したＨＴ－１０８０細胞株を確率した。これらの細胞内でのヒト４－１ＢＢの刺激により、ＩＬ－８の分泌量が増加した。四価単一特異性抗体、誘導性形式の四価単一特異性抗体（プロテアーゼ切断または非切断）、または三量体リガンドについて、４－１ＢＢを刺激する能力を試験した。
培養細胞に加える前に、試験する抗体のいくつかの試料を、タンパク質分解のための好適な条件下で適切なプロテアーゼと共にインキュベートした。いくつかの試料を非切断状態で維持した。誘導性の程度は、切断されていない（誘導されていない）誘導性形式四価単一特異性抗体と、対応するプロテアーゼで切断された誘導性形式四価単一特異性抗体とを比較することにより定量した。
３７℃、５％ ＣＯ２で６時間インキュベートした後、切断抗体及び非切断抗体のアゴニスト活性を、ＩＬ－８アルファＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＡを用いたＩＬ－８産生量の定量化によって評価した。ＥＣ５０及び最大ＩＬ－８レベルを比較した。結果を図６５Ａ～６５Ｂに示す。
実施例４２：ＭＭＰ９による抗４－１ＢＢ抗体のプロテアーゼ切断
当業者であれば、タンパク質切断アッセイのセットアップ方法に精通していると考えられる。１×ＰＢＳ ｐＨ７．４中１００μｇのタンパク質を１μｇの活性ＭＭＰ９（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＳＡＥ００７８－５０またはＥｎｚｏカタログ番号ＢＭＬ－ＳＥ３６０）で切断し、室温で最大１６時間インキュベートした。消化されたタンパク質は、次に、機能的アッセイに使用するか、または試験の前に－８０℃で保存する。切断の程度を、当技術分野で周知されている方法を用いてＳＤＳ ＰＡＧＥによってモニタリングした。
実施例４３：ＭＭＰ１４またはＣＴＳＬ１による抗４－１ＢＢ抗体のプロテアーゼ切断
当業者であれば、タンパク質切断アッセイのセットアップ方法に精通していると考えられる。１×ＰＢＳ ｐＨ７．４中１００μｇのタンパク質を１μｇの活性ＭＭＰ１４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号９５１８－ＭＰ－０１０）またはＣＴＳＬ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号９５２－ＣＹ）で切断し、室温で最大１６時間インキュベートした。消化されたタンパク質は、次に、機能的アッセイに使用するか、または試験の前に－８０℃で保存する。切断の程度を、当技術分野で周知されている方法を用いてＳＤＳ ＰＡＧＥによってモニタリングする。
８．その他の実施形態
上記の開示内容は、独立した有用性を有する複数の異なる発明を包含し得る。これらの発明の各々を、その好ましい形態（複数可）で開示してきたが、多数の変形形態が可能であるため、本明細書で開示及び示されている具体的な実施形態を限定的な意味で考えるべきではない。本発明の主題には、本明細書で開示する様々な要素、特徴、機能、及び／または特性の、全ての新規かつ非自明な組合せ及びサブコンビネーションが含まれる。以下の特許請求の範囲では、新規かつ非自明とみなされる、ある特定の組合せ及びサブコンビネーションを詳細に示している。本出願、本出願から優先権を主張する出願、または関連する出願において、特徴、機能、要素、及び／または特性の他の組合せ及びサブコンビネーションで具現化された発明が特許請求され得る。このような請求項は、異なる発明に向けられたものであっても、同じ発明に向けられたものであっても、また、元の請求項と比較して範囲が広い、狭い、等しい、または異なるものであっても、本開示の発明の主題に含まれるものとみなされる。
例示的なポリペプチドコンストラクトは、本明細書の付録Ａに詳述されている。リンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）、またはリンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）、または他の切断性リンカーを含む例示的なポリペプチドを付録Ａで開示するが、各コンストラクトについて、開示されたリンカーは、リンカー２（ＧＰＡＧＬＹＡＱ、配列番号１９５）、またはリンカー３（ＡＬＦＫＳＳＦＰ、配列番号１９８）、または本明細書で開示する他の切断性リンカーのいずれかで置き換えることができる。例えば、コンストラクトＡＣＰ３５５（ＩｇＧ４＿Ｆｃ（Ｓ２２８Ｐ）－Ｘ－ＣＤ２５ｅｃｄ＿Ｃ２１３Ｓ－ＬＸ－ＩＬ２－ＬＸブロッカー＿（ブロッカー＝ＶＨＶＬ．Ｆ２．高．Ａ０２＿Ｖｈ＼Ｖｌ＿Ａ４６Ｓ；Ｘ＝ＭＭＰ１４－１）はリンカー２を含み得るが、これをリンカー３で置き換えてもよい。代替的に、コンストラクトＡＣＰＴ４６４（ＩｇＧ４＿Ｆｃ（Ｓ２２８Ｐ）－Ｘ－ＩＬ２－ＬＸ－ブロッカー＿（ブロッカー＝ＶＨＶＬ．Ｆ２．高．Ａ０２＿Ｖｈ／Ｖｌ＿ＶＨ１０５－ＶＬ４３＿ジスルフィドｌ；Ｘ＝ＣＴＳＬ１－１）は、リンカー３を含み得るが、これをリンカー２で置き換えてもよい。
付録Ａに示されるポリペプチドコンストラクトの要素には、以下のような略語が含まれている。「Ｌ」、「Ｘ」、「ＬＸ」、及び「ＸＬ」は各々リンカーを指す。「Ｘ」は切断性リンカーを指す。「Ｌ」は光学的に切断性リンカーを指す。Ｌがポリペプチド内で唯一のリンカーであるとき、Ｌは切断性である。「ＬＸ」または「ＸＬ」は各々、切断性リンカー及びそれに隣接する延長された非切断性配列を指す。切断性リンカー（Ｃｌｅａｖ．Ｌｉｎ．） も切断性リンカーを指す。他の使用略語としては以下のものが挙げられ、「ｍＩＦＮｇ」はマウスインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）を意味し、（５）「ｈアルブミン」はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を意味し、（６）「ｍアルブミン」はマウス血清アルブミンを意味する。
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Claims (74)

  1. 配列番号１９５～２２０からなる群より選択されるプロテアーゼ切断性アミノ酸配列、または配列番号１９５～２２０に対し少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  2. 配列番号１９５もしくは配列番号１９５の機能的バリアント、または配列番号１９８もしくは配列番号１９８の機能的バリアントを含む、ポリペプチド。
  3. 前記配列番号１９５の機能的バリアントが配列番号２５８～３３１のいずれかを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. 前記配列番号１９８の機能的バリアントが配列番号１９９または配列番号３３２～４０８のいずれかを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
  5. 前記ポリペプチドが配列番号１９５を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
  6. 前記ポリペプチドが配列番号１９８を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
  7. 式Ｉを含むポリペプチドであって、
    ［Ｄ１］－［Ｌ１］－［Ｄ２］
    式中、Ｄ１が第１の目的ドメインであり、
    Ｌ１が、Ｄ１をＤ２に接続または結合する分離部分であり、前記分離部分が、配列番号１９５～２２０から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１９５～２２０に対し少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｄ２が第２の目的ドメインである、前記ポリペプチド。
  8. 前記分離部分が、配列番号１９５～２２０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号１９５～２２０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも９０％以上同一であるアミノ酸配列に隣接する少なくとも１つのプロリン残基を含む、請求項１または７に記載のポリペプチド。
  9. 前記分離部分が、２つ以上のプロテアーゼの基質である切断性部分を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  10. 前記プロテアーゼが、ＦＡＰａ、ＣＴＳＬ１、ＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、及びＡＤＡＭＴＳ１から選択される）、ならびにＭＭＰ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、及びＭＭＰ１４から選択される）からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  11. 前記プロテアーゼが、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ４、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、またはカテプシンＬから選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  12. 前記分離部分が、ヒト腫瘍の腫瘍微小環境に存在する少なくとも１つのプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  13. 前記分離部分が２つ以上の切断性部分を含み、前記切断性部分の各々がプロテアーゼの基質である、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  14. 第１のプロテアーゼの基質である第１のアミノ酸配列を含む第１の切断性部分と、第２のプロテアーゼの基質である第２のアミノ酸配列を含む第２の切断性部分とを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  15. 非切断性リンカー配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  16. 前記ポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１～８のいずれかに記載のポリペプチド。
  17. 前記ポリペプチドが、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項１～８のいずれかに記載のポリペプチド。
  18. 前記ポリペプチドが、細胞表面受容体、キメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを含む、請求項１～８のいずれかに記載のポリペプチド。
  19. 前記ポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド、抗体またはその抗原結合部分を含む、請求項１～８のいずれかに記載のポリペプチド。
  20. 前記切断性部分が、１つ以上のプロテアーゼにより、参照ポリペプチド配列よりも（ａ）大きな触媒効率、（ｂ）大きな特異性、または（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方で切断される、請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  21. 前記１つ以上のプロテアーゼが、ＦＡＰａ、ＣＴＳＬ１、ＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、及びＡＤＡＭＴＳ１から選択される）、ならびにＭＭＰ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、及びＭＭＰ１４から選択される）からなる群より選択される、請求項２０に記載のポリペプチド。
  22. 前記プロテアーゼが、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ４、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、またはカテプシンＬから選択される、請求項２１に記載のポリペプチド。
  23. 前記参照ポリペプチド配列が、ＦＡＰａ、ＣＴＳＬ１、ＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、及びＡＤＡＭＴＳ１から選択される）、ＭＭＰ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、及びＭＭＰ１４から選択される）、またはこれらの組合せの天然ポリペプチド基質中に存在する、請求項２１に記載のポリペプチド。
  24. 前記切断性部分が、１つ以上のプロテアーゼにより、参照ポリペプチド配列よりも低減された触媒効率で切断される、請求項１～２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  25. 前記切断性部分が、１つ以上の血清プロテアーゼにより、低減された触媒効率で切断される、請求項２４に記載のポリペプチド。
  26. 前記切断性部分が、１つ以上の肝プロテアーゼにより、低減された触媒効率で切断される、請求項２５に記載のポリペプチド。
  27. 前記切断性部分が、１つ以上の第Ｘａ因子、ヘプシン、またはトロンビンにより、低減された触媒効率で切断される、請求項２５に記載のポリペプチド。
  28. 前記ポリペプチドが、ポリペプチド部分、脂質部分、核酸部分、検出可能部分、及び小分子からなる群より選択される部分に作用可能に結合している、請求項１～２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  29. 組換えプロタンパク質であって、
    ａ．プロテアーゼの基質である切断性部分を含む組換えポリペプチドであって、前記切断性部分が、配列番号１９５～２２０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号１９５～２２０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む、前記組換えポリペプチドと、
    ｂ．
    生物学的活性を有するポリペプチドとを含み、
    前記プロタンパク質の生物学的活性が減弱しており、前記プロテアーゼによる前記切断性部分の切断により、生物学的活性が減弱していないポリペプチドが産生される、前記組換えプロタンパク質。
  30. 生物学的活性を有する前記ポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、またはこれらの組合せを含む、請求項２９に記載の組換えプロタンパク質。
  31. 生物学的活性を有する前記ポリペプチドが、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項２９に記載の組換えプロタンパク質。
  32. 生物学的活性を有する前記ポリペプチドが、細胞表面受容体、キメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを含む、請求項２９に記載の組換えプロタンパク質。
  33. 生物学的活性を有する前記ポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド、抗体またはその抗原結合部分を含む、請求項２９に記載の組換えプロタンパク質。
  34. 融合タンパク質であって、
    ａ．シグナル伝達タンパク質または分子と、
    ｂ．立体的ブロッキング部分、特異的ブロッキング部分、及びこれらの組合せから選択されるブロッキング部分と、
    ｃ．請求項２９で定義された切断性部分を含むペプチドリンカーとを含む、前記融合タンパク質。
  35. （ａ）及び（ｂ）が、（ｃ）によって作用可能に結合している、請求項３４に記載の融合タンパク質。
  36. 前記ペプチドリンカーが同じ切断性部分の２つ以上のコピーを含む、請求項３４に記載の融合タンパク質。
  37. 前記立体的ブロッキング部分がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または抗ＨＳＡ抗体を含む、請求項３４に記載の融合タンパク質。
  38. 前記シグナル伝達タンパク質が、（ｉ）非ネイティブなＮ末端及び／または（ｉｉ）非ネイティブなＣ末端を含むインターロイキン２アミノ酸配列である、請求項３４に記載の融合タンパク質。
  39. 前記シグナル伝達タンパク質がインターロイキン２アミノ酸配列である、請求項３４に記載の融合タンパク質。
  40. １つ以上の半減期延長ドメインをさらに含み、前記ドメインが特異的ブロッカーでもあるわけではない、請求項３４に記載の融合タンパク質。
  41. 非ネイティブなＮ末端及び／またはＣ末端が環状に並べ替えることによって生成される、請求項４０に記載の融合タンパク質。
  42. プロテアーゼ切断性リンカーによってリガンドに結合している第１のポリペプチド融合パートナーを含む融合ポリペプチドであって、前記切断性リンカーの触媒効率が最適化されており、前記リガンドが任意選択で修飾されており、前記第１のポリペプチド融合パートナーが、前記プロテアーゼ切断性リンカーの切断まで、前記修飾されたリガンドと標的受容体または標的受容体のサブユニットとの結合を防止するブロッキング部分である、前記融合ポリペプチド。
  43. プロテアーゼ切断性リンカーによってリガンドに結合している第１のポリペプチド融合パートナーを含む融合ポリペプチドであって、前記切断性リンカーの触媒効率が最適化されており、前記リガンドが、任意選択で、環状並べ替えによるものを含めて修飾されて、ネイティブなリガンドと比較して非ネイティブなＮ末端及び新規のＣ末端を作出し、前記修飾されたリガンドの新規のＮ末端または前記新規のＣ末端のうちの少なくとも一方が、第１のポリペプチド融合パートナーに作用可能に結合して融合ポリペプチドを形成し、前記第１のポリペプチド融合パートナーが、前記プロテアーゼ切断性リンカーの切断まで、前記修飾されたリガンドと標的受容体または標的受容体のサブユニットとの結合を防止するブロッキング部分である、前記融合ポリペプチド。
  44. 前記第１のポリペプチド融合パートナーが、抗体、抗体フラグメント、及びアルブミン分子からなる群より選択される、請求項４２または４３に記載の融合ポリペプチド。
  45. 第２のブロッキング部分を含む第２のポリペプチド融合パートナーをさらに含む、請求項４２または４３に記載の融合ポリペプチド。
  46. 第２のポリペプチド融合パートナーが、前記第１のポリペプチド融合パートナーとは異なる種類のブロッキング部分である、請求項４２または４３に記載の融合ポリペプチド。
  47. 前記第１のポリペプチド融合パートナーがアルブミンであり、第２のポリペプチド融合パートナーが、サイトカインの活性をブロックする相補的なアミノ酸配列を含むドメインである、請求項４２または４３に記載の融合ポリペプチド。
  48. 前記第１のポリペプチド融合パートナーが立体的ブロッカー、例えばアルブミンであり、第２のポリペプチドが特異的ブロッカー、例えば、サイトカイン受容体、サイトカイン受容体の一部、サイトカインに特異的な新規アフィニティーペプチド、または前記融合ポリペプチドのサイトカインに特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項４２または４３に記載の融合ポリペプチド。
  49. 前記第２のポリペプチド融合パートナーが、前記第１のポリペプチド融合パートナーと同じ種類のブロッキング部分である、請求項４７に記載の融合ポリペプチド。
  50. 腫瘍抗原結合成分をさらに含む、請求項３４、４２、または４３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
  51. 血清半減期延長ドメインをさらに含む、請求項３４、４２、または４３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
  52. 前記リガンドが、ヘリックスバンドルタンパク質及びサイトカイン（限定されるものではないが、成長ホルモン、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３ｐ１９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２１、ＩＬ－３０（ＩＬ２７ｐ２８）、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮγ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、オンコスタチンＭ、ＣＬＣＦ－１、ＧＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、フェリチン、レプチン、胎盤性ラクトゲン、プロラクチン、アポリポタンパク質ｅを含む）、ｂ－トレフォイルタンパク質（限定されるものではないが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６Ｒａ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、ＩＬ－３６ｇ、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＬ１Ｈｙ２、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８ａ、ＦＧＦ－８ｂ、ＦＧＦ－８ｅ、ＦＧＦ－８ｆ、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０、ＦＧＦ－１１、ＦＧＦ－１２、ＦＧＦ－１３、ＦＧＦ－１４、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１７、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－１９、ＦＧＦ－２０、ＦＧＦ－２１、ＦＧＦ－２２、ＦＧＦ－２３を含む）、α／β（ＴＩＭ）バレルタンパク質（限定されるものではないが、トリオースリン酸イソメラーゼを含む）、ベータサンドイッチタンパク質（限定されるものではないが、ガレクチン－１、ガレクチン－３を含む）、ＴＮＦ－ベータ、７つのβプロペラタンパク質、クラス１ ＭＨＣ α１α２ドメイン、インテグリンＩドメイン、ＧＹＦドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン（例えば、ｃＰＬＡ２、ＰＫＣ、シナプトタグミン）、ＰＤＺドメイン、Ｃ３ｄ、Ｃ５ａからなる群より選択される、請求項４２または４３に記載の融合ポリペプチド。
  53. 前記リガンドが、ＩＬ－２ポリペプチドまたはそのフラグメント（単数もしくは複数）を含む、請求項４２または４３に記載の融合ポリペプチド。
  54. プロテアーゼ切断性リンカーポリペプチドが、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、カテプシンＬ、エラスターゼ、ＦＡＰ、ＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、及びＡＤＡＭＴＳ１から選択される）、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、ならびに腫瘍細胞表面プロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１つのプロテアーゼによって切断されることが可能な配列を含む、請求項３４、４２、または４３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
  55. プロテアーゼ切断性ポリペプチドリンカーがプロテアーゼによって切断された後、サイトカインまたはそのフラグメントもしくはムテインがサイトカインブロッキング部分から実質的に解離する、請求項３４、４２、または４３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
  56. 融合ポリペプチドであって、
    ａ．サイトカインポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくはムテイン［Ａ］、
    ｂ．サイトカインブロッキング部分［Ｂ］、及び
    ｃ．最適化されたプロテアーゼ切断性ポリペプチドリンカー［Ｌ］
    の各々の少なくとも１つを含み、前記ブロッキング部分が、抗体、抗体フラグメント、及びアルブミンからなる群より選択され、前記サイトカインが、環状に並べ替えられたサイトカインを含む、前記融合ポリペプチド。
  57. 腫瘍抗原結合成分をさらに含む、請求項５６に記載の融合ポリペプチド。
  58. 血清半減期延長ドメインをさらに含む、請求項５６に記載の融合ポリペプチド。
  59. サイトカインペプチドまたはその機能的フラグメントもしくはムテインが、ヘリックスバンドルタンパク質及びサイトカイン（限定されるものではないが、成長ホルモン、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３ｐ１９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１７ｐ７０、ＩＬ－２１、ＩＬ－３０（ＩＬ２７ｐ２８）、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮγ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、オンコスタチンＭ、ＣＬＣＦ－１、ＧＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、フェリチン、レプチン、胎盤性ラクトゲン、プロラクチン、アポリポタンパク質ｅを含む）、ＦＡＰ、ＡＤＡＭ（ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、及びＡＤＡＭＴＳ１から選択される）、ｂ－トレフォイルタンパク質（限定されるものではないが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６Ｒａ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、ＩＬ－３６ｇ、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＬ１Ｈｙ２、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８ａ、ＦＧＦ－８ｂ、ＦＧＦ－８ｅ、ＦＧＦ－８ｆ、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０、ＦＧＦ－１１、ＦＧＦ－１２、ＦＧＦ－１３、ＦＧＦ－１４、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１７、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－１９、ＦＧＦ－２０、ＦＧＦ－２１、ＦＧＦ－２２、ＦＧＦ－２３を含む）、α／β（ＴＩＭ）バレルタンパク質（限定されるものではないが、トリオースリン酸イソメラーゼを含む）、ベータサンドイッチタンパク質（限定されるものではないが、ガレクチン－１、ガレクチン－３を含む）、ＴＮＦ－ベータ、７つのβプロペラタンパク質、クラス１ ＭＨＣ α１α２ドメイン、インテグリンＩドメイン、ＧＹＦドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン（例えば、ｃＰＬＡ２、ＰＫＣ、シナプトタグミン）、ＰＤＺドメイン、Ｃ３ｄ、Ｃ５ａからなる群より選択される、請求項５６に記載の融合ポリペプチド。
  60. サイトカインペプチドまたはその機能的フラグメントもしくはムテインがＩＬ－２を含む、請求項５６に記載の融合ポリペプチド。
  61. 前記サイトカインブロッキング部分が、前記サイトカインの同族受容体のリガンド結合ドメインまたはフラグメントもしくはムテイン、前記サイトカインポリペプチドまたはその機能的フラグメントもしくはムテインに結合するシングルドメイン抗体またはｓｃＦｖ、あるいは前記サイトカインの受容体に結合する抗体または抗体フラグメントを含む、請求項５６に記載の融合ポリペプチド。
  62. 前記抗体がシングルドメイン抗体またはｓｃＦｖである、請求項５６に記載の融合ポリペプチド。
  63. 前記ブロッキング部分が、前記サイトカインまたはそのフラグメントの血清半減期を延長する、請求項５６に記載の融合ポリペプチド。
  64. プロテアーゼ切断性部分を含む融合ポリペプチドであって、配列が、ある特定のプロテアーゼによる切断に対し触媒的に最適化されており、プロテアーゼ切断が、組成物を腫瘍微小環境内で誘導可能にする、前記融合ポリペプチド。
  65. 生物学的に不活性のポリペプチドをさらに含み、前記プロテアーゼによる前記切断性部分の切断が、前記生物学的に不活性のポリペプチドを生物学的に活性のポリペプチドに変換する、請求項６４に記載の融合ポリペプチド。
  66. 前記生物学的に不活性のポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、または可溶性受容体を含む、請求項６５に記載の融合ポリペプチド。
  67. 前記生物学的に不活性のポリペプチドが、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項６５に記載の融合ポリペプチド。
  68. 前記生物学的に不活性のポリペプチドが、細胞表面受容体、キメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを含む、請求項６５に記載の融合ポリペプチド。
  69. 前記生物学的に不活性のポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド、抗体またはその抗原結合部分を含む、請求項６５に記載の融合ポリペプチド。
  70. 請求項７～６９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  71. 請求項７０に記載の核酸を含むベクター。
  72. 請求項７１に記載のベクターを含む宿主細胞。
  73. 医薬組成物を作製する方法であって、請求項７２に記載の宿主細胞を、所望のポリペプチドの発現及び採取に適した条件下で培養することを含む、前記方法。
  74. 請求項１～６９のいずれか１項に記載のポリペプチドを使用する方法であって、医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
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