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CN113166220A - 创新细胞因子前药 - Google Patents

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CN113166220A
CN113166220A CN201980017081.7A CN201980017081A CN113166220A CN 113166220 A CN113166220 A CN 113166220A CN 201980017081 A CN201980017081 A CN 201980017081A CN 113166220 A CN113166220 A CN 113166220A
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CN
China
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seq
prodrug
antibody
moiety
polypeptide
Prior art date
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CN201980017081.7A
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English (en)
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于春晓
吕越峰
卢建丰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Aosaikang Biomedical Co ltd
Original Assignee
Askgene Pharma Inc
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Publication date
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Abstract

本文提供了细胞因子突变蛋白和细胞因子前药及其制备和使用方法。

Description

创新细胞因子前药
交叉引用相关申请
本申请要求于2018年3月9日提交的临时申请，62/640,969，于2018年3月14日提交的临时申请62/643,104，于2018年3月17日提交的临时申请62/644,384，于2018年3月18日提交的临时申请62/644,577，于2018年6月5日提交的临时申请62/680,707，和于2019年2月6日提交的临时申请62/801,649的权益。前述优先权申请的内容通过全文引用并入本文。
发明背景
白细胞介素-2(IL-2)在淋巴细胞生成、存活和体内平衡中起着重要作用。它具有133个氨基酸，结构上由四个反平行的两亲性α螺旋组成，而这些螺旋形成对其功能必不可少的四级结构(Smith，Science 240：1169-76(1988)；Bazan，Science 257：410-13(1992))。
IL-2通过与最多由三个独立的亚基组成的IL-2受体(IL-2R)结合来发挥其活性。α(CD25或Tac抗原)，β(CD122)和γ(γc，共同的γ链或CD132)亚基缔合而形成IL-2的高亲和力三聚体受体(KD～0.01nM)。由β和γ亚基组成的二聚体IL-2受体称为中间亲和性IL-2R(KD～1nM)。单独的α亚基独自形成单体低亲和力IL-2受体(KD～10nM)。见例如Kim et al.，Cytokine Growth Factor Rev.17：349-66(2006)。尽管二聚体中间亲和力IL-2受体的结合亲和力比三聚体高亲和力受体低约100倍，IL-2的二聚体和三聚体都可以在IL-2结合后传递信号(Minami et al.，Annu RevImmunol.11：245-68(1993))。因此，似乎α亚基虽然赋予受体与IL-2的高亲和力结合，但对于IL-2信号传导并非必需的，但是，β和γ亚基对于IL-2信号传导却是至关重要(Krieg et al.，Proc Natl Acad Sci.107：11906-11(2010))。三聚体IL-2受体是由CD4+FoxP3+调节性T(Treg)细胞表达，而Treg细胞在体内始终表达最高水平的IL-2Rα(CD25)(Fontenot et al.，Nature Immunol 6：1142-51(2005))。三聚体IL-2受体也在常规活化的T细胞上被瞬时诱导，而在静止状态下，这些细胞仅表达二聚体IL-2受体。
取决于目的，IL-2已被突变以增强或降低对CD25的结合亲和力。基于已发表的IL-2/IL-2R配合物之晶体结构，突变通常发生在已知与CD25极为接近的IL-2区域内或附近(Wang et al.，Science 310：1159-63(2005))。IL-2残基K35，R38，F42，K43，F44，Y45，E61，E62，K64，P65，E68，V69，L72和Y107被认为与CD25有所接触(U.S.Pat.9,732,134)。
为了减少IL-2治疗剂的副作用，研究人员使IL-2突变以降低其对CD25的结合亲和力。例如，WO 2008/0034473是指R38W和F42K突变，而WO 2012/107417是指位置72的突变。U.S.Pat.Pub.2003/0124678提到引入R38W突变以消除IL-2的血管通透性活性。Heaton等人(Cancer Res.53：2597-602(1993)；U.S.Pat.5,229,109)描述了引入R38A和F42K的两个突变以获得IL-2突变蛋白，而使其降低了诱导自然杀手(NK)细胞分泌促炎性细胞因子的能力。EP2639241B1提及在刺激Treg细胞方面比天然IL-2效力至少低1000倍的IL-2突变蛋白，并且是指具有选自1)R38K，F42I，Y45N，E62L和E68V的突变的IL-2突变蛋白；2)R38A，F42I，Y45N，E62L和E68V；3)R38K，F42K，Y45R，E62L和E68V；或4)R38A，F42A，Y45A和E62A。U.S.Pat.Pub.2014/0328791则提到对CD25亲和力降低的聚乙二醇化IL-2(pegylated IL-2)。一些IL-2突变蛋白已与靶向肿瘤抗原(例如CEA，FAP和PD-L1)的抗体偶联，参见例如Klein等人，Oncoimmunology 6(3)：e1277306(2017)；Soerensen等，J Clin Onc。36：15suppl(2018)；WO 2017/220989；U.S.Pat.9,206,260。
白细胞介素-15(IL-15)是与IL-2具有结构相似性的细胞因子。IL-15与IL-2Rβγ受体结合并通过其发出信号，而IL-15是在病毒感染后由单核吞噬细胞和其他免疫细胞所分泌。IL-15可诱导NK和其他先天免疫系统细胞的增殖，并参与消灭病毒感染细胞和癌细胞。
不幸的是，当前的IL-2和IL-15候选药物皆具显著副作用，而限制了细胞因子的剂量。再者，T和其他免疫细胞的激活并非为位点特异性的。此外，IL-2突变蛋白似乎伴有药动学沉降，尽管其对CD25的亲和力有显著降低。因此，當前仍有必要开发更优化的细胞因子治疗，使其在激活免疫细胞时具有位点选择性，在有较强功效的同时更降低其副作用。
发明概述
本发明提供了包含细胞因子部份、掩蔽部分和载体部份的前药，其中所述掩蔽部分与细胞因子部分结合并抑制细胞因子部分的生物活性(例如，防止细胞因子部分与靶细胞上的受体结合，或降低细胞因子部分上的一或多种生物活性)，细胞因子部分则融合至载体部分，而其掩蔽部分则经由可切割的连接肽，融合至细胞因子部分或载体部分。在一些实施方案中，掩蔽部分包含了细胞因子部分受体的细胞外结构域(ECD)。
在一些实施方案中，细胞因子部份是野生型人细胞因子或是其突变蛋白，例如，人IL-2激动剂多肽，诸如包含SEQ ID NO：1的多肽，或包含与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，人IL-2激动剂多肽包含在选自T3、K35、R38、F42、Y45、E62、E68、L72、A73、N88、C125和Q126的一个或多个位置处的突变(编号根据(SEQ ID NO：1)。在一些特定方案中，人IL-2激动剂多肽包含选自SEQ ID NO：8-17、19-33、36、37和39-46的一段氨基酸序列。
在一些实施方案中，本前药的掩蔽部份包含人IL-2Rβ的ECD或其功能类似物。在一些进一步的实施方案中，掩蔽部份包含(i)两个人IL-2Rβ的ECD复制体，或其经连接肽融合在一起的功能类似物，或(ii)人IL-2Rβ的ECD，或是其与人IL-2Rγ的ECD融合的其功能类似物，或是其经由肽连接的功能类似物。在一些实施方案中，人IL-2Rγ的ECD或其功能类似物包含SEQ ID NO：6或与SEQ ID NO：6至少90％相同的氨基酸序列。在一些特定实施方案中，人IL-2Rβ的ECD或其功能类似物包含SEQ ID NO：3、4或5，或与SEQ ID NO：3、4或5至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本前药的细胞因子部份是人IL-15激动剂多肽。此人IL-15激动剂多肽包含SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-15激动剂多肽包含或进而包含(i)包含SEQ ID NO：7的IL-15Rα的sushi结构域或(ii)与SEQ ID NO：7至少90％相同的氨基酸序列。在一些特定实施方案中，IL-15掩蔽结构域包含人IL-2Rβ的ECD，及其功能类似物，或是人IL-2Rγ及其功能类似物。在某些特定实施方案中，IL-15掩蔽结构域包含SEQ ID NO：3、4、5或6，或与SEQ ID NO：3、4、5或6至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，前药进而包含第二效应物多肽，例如，(i)包含在126号位置(根据SEQ ID NO：1编号)上突变的人IL-2激动剂多肽，或(ii)CCL19多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO：123具有至少90％的同一性。
在本前药的一些实施方案中，细胞因子部份通过不可切割的连接肽，例如选自SEQID NO：47-51的一种，与载体部份融合。
在本前药的一些实施方案中，在将掩蔽部分直接或间接(例如，通过细胞因子部分)通过可切割连接肽连接至载体部分上，可切割连接肽包含尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)，基质金属肽酶(MMP)2或MMP9的底物序列。在一些进一步的实施方案中，可切割的连接肽包含(i)uPA和MMP2两者的底物序列，(ii)uPA和MMP9两者的底物序列，或(iii)uPA、MMP2和MMP9的底物序列。I在一些特定的实施方案中，可切割的连接肽包含选自SEQ ID NO：18、34、35、38、52-121和217的氨基酸序列。在某些特定实施方案中，可切割的连接肽可被位于肿瘤部位或其周围环境的一种或多种蛋白酶切割，而此切割导致前药在肿瘤部位或其周围环境的活化。
在本前药的一些实施方案中，载体部分是PEG分子、白蛋白(例如人血清白蛋白)或其片段、抗体Fc结构域、抗体或其抗原结合片段。在一些特定实施方案中，载体部分是抗体Fc结构域，或是包含L234A和L235A(“LALA”)突变的抗体(EU编号)。I在一些特定实施方案中，载体部分是抗体Fc结构域或包含knobs-into-holes突变的抗体，而其中细胞因子部分和掩蔽部分，则与抗体Fc结构域上各种多肽链，或与抗体上各种重链融合。在一些实施方案中，细胞因子部分和掩蔽部分，与抗体Fc结构域上两个不同多肽链的C末端，或与抗体上两个不同重链的C末端融合。在其他一些实施方案中，细胞因子部分和掩蔽部分，则与抗体Fc结构域上两个不同多肽链的N末端，或与抗体上两个不同重链的N末端融合。在某些实施方案中，knobs-into-holes突变包括在Fc结构域上多肽链或抗体上重链的T366Y“knob”突变，以及在Fc结构域上其他多肽链或抗体上另一条重链的Y407T“hole”突变(EU编号)。在某些实施方案中，knobs-into-holes突变包括“knob链”中CH3结构域的Y349C和/或T366W突变，和“hole链”中CH3结构域的E356C，T366S，L368A和/或Y407V突变(EU编号)。
在一些特定的实施方案中，载体部分是包含两个多肽链的抗体Fc结构域，其氨基酸序列分别包含一段选自SEQ ID NOs：195-198的氨基酸序列，以及一段选自SEQ ID NOs：132-137和139的氨基酸序列。
在一些实施方案中，载体部分是抗体或其抗原结合片段，其特异性结合一种或多种选自下述生物分子的抗原：鸟苷酸环化酶C(GCC)，碳水化合物抗原19-9(CA19-9)，糖蛋白A33的抗原的抗体或其抗原结合片段(gpA33)，粘蛋白1(MUC1)，癌胚抗原(CEA)，胰岛素样生长因子1受体(IGF1-R)，人表皮生长因子受体2(HER2)，人表皮生长因子受体3(HER3)，δ样蛋白3(DLL3)，δ样蛋白4(DLL4)，表皮生长因子受体(EGFR)，glypican-3(GPC3)，c-MET，血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)，Nectin-4，Liv-1，糖蛋白NMB(GPNMB)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，Trop-2，碳酸酐酶IX(CA9)，内皮素B受体(ETBR)，六种跨膜上皮抗原前列腺1(STEAPl)，叶酸受体α(FR-α)，SLIT和NTRK样蛋白6(SLITRK6)，碳酸酐酶VI(CA6)等核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(ENPP3)，间皮素，滋养层糖蛋白(TPBG)，CD19，CD20，CD22，CD33，CD40，CD56，CD66e，CD70，CD74，CD79b，CD98，CD123，CD138，CD352，CD352，CD47，信号-调节蛋白d(SIRPα)，PD1，Claudin 18.2，Claudin 6、5T4，BCMA，PD-L1，PD-1，成纤维细胞活化蛋白α(FAPalpha)，与黑素瘤相关的硫酸软骨素硫酸蛋白多糖(MCSP)和EPCAM。
在一些特定的实施方案中，载体部分为包含两条重链及轻链的抗体，其重链氨基酸序列分别包含SEQ ID N0：209和一个选自SEQ ID N0：210-215的序列，而其两条轻链氨基酸序列则包含SEQ ID NO：216。在某特定实施方案中，作为载体部分的抗体上，两条重链的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO：191，以及一个选自SEQ ID NO：192、193和206-208的序列，而其两条轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：189。
在另一方面，本发明提供了一种在A73位突变的IL-2突变蛋白、一种包含K35N突变的IL-2突变蛋白，以及一种IL-2突变蛋白其包含了选自SEQ ID N0：23-33、36、37和39-41IL-2的氨基酸序列。这些新的IL-2突变蛋白对与IL-2三聚体受体的结合或有显着降低。
在其他方面，本发明亦提供了：药物的成分，其包含本发明的前药，或本发明的IL-2突变蛋白，以及药学上可接受的赋形剂；编码着前药或IL-2突变蛋白的一个或多个多核苷酸；包含一个或多个多核苷酸的一个或多个表达载体；和一包含载体的宿主细胞，而其宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，例如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本发明亦提供了剔除的一个或多个编码uPA、MMP-2和/或MMP-9基因的哺乳动物宿主细胞(例如，包含这些基因中一个或多个的无效突变)。因此，本发明亦提供了一种制备前药或IL-2突变蛋白的方法，其包含在前药或IL-2突变蛋白表达允许的条件下，培养宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，并分离前药或IL-2突变蛋白。
.本发明亦对需要其的患者(例如，人类患者)提供了治疗癌症、传染性疾病或刺激免疫系统的方法，其包括向患者投药治疗有效量的前药、IL-2突变蛋白或本发明的药物成分。患者可能患有例如病毒感染(如HIV感染)，或是患有乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、睾丸癌、结直肠癌和胃癌等其中之一的癌症。于此亦提供了细胞因子前药或IL-2突变蛋白在本方法中用于治疗癌症，或传染性疾病，或刺激免疫系统的用途；前药或IL-2突变蛋白在本方法中用于治疗癌症，或传染性疾病，或刺激免疫系统的药物制造上的用途；包含一个或多个剂量单位的本前药或IL-2突变蛋白的制品(例如，药盒)。
本发明的其他特征，目的和优点可显见于下述的详细描述中。应当理解的是，然而，此详细说明虽然表明指出了本发明的实施方案和各个方面，但是仅仅用于说明而非限制。藉由详细描述，本发明范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图简述
图1显示了与载体蛋白融合的突变IL-2多肽的SDS-PAGE分析。
图2A-C显示了与载体蛋白融合的IL-2突变蛋白的基于CTLL2的生物活性测定的结果。图2A是列出融合蛋白的表。图2B显示了IL-2突变蛋白/Fc融合蛋白的结果。图2C显示了IL-2突变蛋白/人血清白蛋白(HSA)融合蛋白的结果。
图3是说明基于抗体的IL-2或IL-15前药的示意图。将IL-2或IL-15激动剂多肽任选地通过不可裂解的肽接头与载体抗体的重链之一的C-末端融合。IL-2或IL-15拮抗剂多肽(掩蔽部分，例如IL-2Rβ细胞外结构域)通过可切割的肽连接，与载体抗体的另一条重链的C末端融合。
图4显示了在HEK293细胞中表达的589A-IL-2前药的SDS-PAGE分析，589A是对Claudin 18.2的人源化抗体，源自兔B细胞克隆。前药样品通过蛋白A亲和层析纯化，“活化的”样品是用蛋白酶处理的样品，SDS-PAGE在非还原条件下进行分析。
图5显示了抗体589A和前药589A-IL-2E的SEC-HPLC分析。
图6显示在基于CTLL2的活性测定法中，589A-IL-2前药的活化。JR1.55.1：589A-IL-2E。JR1.55.2：589-IL-2F。MT：Matriptase(一种蛋白酶)。
图7A和B示出了589A-IL-2E(JR1.74.1)前药的活化。图7A显示了在FACS分析中，589A-IL-2E及其活化形式(+MT)，与表达IL-2Rαβγ或IL-2Rβγ的HEK293细胞的结合。MFI：平均荧光强度。图7B显示了前药的总结合程度为11μg/ml。
图8显示在基于CTLL2的活性测定法中，αPD-L1-IL-2B前药的活化。MT：matriptase。
图9显示了在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的分析中，589A抗体、具有增强ADCC功能的589A、与IL-2融合的具增强ADCC功能的589A的测量。
图10显示通过在单个小鼠中肿瘤体积，测量589A-IL-2E前药的体内抗癌功效。
Figure GDA0002842149240000071
：anti-PD-L1抗体atezolizumab。
图11显示通过每个小鼠组中平均的肿瘤体积，测量589A-IL-2E前药的体内抗癌功效。与图10所示为相同研究。
图12显示通过存活率，测量589A-IL-2E前药的体内抗癌功效。与图10所示为相同研究。
发明详述
本文和所附权利要求所用的术语，单数形式的“一个、某个”，“或”和“该、此、这”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。
本文中对“约”值或参数的提及包括(及描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。此外，在任何系列的数字之前使用“大约”包括在该系列中的每个所述数字“大约”。例如，提及“大约X，Y或Z”的描述旨在描述“大约X，大约Y或大约Z”。
术语“抗原结合部分”是指多肽或一组相互作用的多肽，其与抗原且包括抗体但不限于抗体的特异性结合(例如，单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、双特异性(dualspecificorbispecific)抗体、抗独特型抗体或双功能混合抗体)，或其抗原结合片段(例如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，二硫键连接的Fv，scFv，单域抗体(dAb)或双抗体)，或单链抗体和含Fc的多肽，比如免疫粘附素。在一些实施方案中，抗体可以是任何重链种型(例如，IgG，IgA，IgM，IgE或IgD)或亚型(例如，IgGl，IgG2，IgG3或IgG4)。在一些实施方案中，抗体可以是任何轻链种型(例如kappa或lambda)。抗体可以是人的，非人的(例如，来自小鼠，大鼠，兔，山羊或另种非人的动物)，嵌合的(例如，具有非人可变区和人源恒定区)或人源化的(例如，具有非人CDR，人源构架和恒定区)。在一些实施方案中，抗体是衍生的抗体。
术语“细胞因子激动剂多肽”是指野生型细胞因子或其类似物。野生型细胞因子的类似物具有与野生型细胞因子相同的生物学特异性(例如，与相同的受体结合并激活相同的靶细胞)，尽管该类似物的活性水平可能与野生型细胞因子有所不同。类似物可以是，例如野生型细胞因子的突变蛋白(比如，突变的多肽)，并且可以包含至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个或至少十个相对于野生型细胞因子的突变。
术语“细胞因子拮抗剂”或“细胞因子掩蔽”是指其部分(例如多肽)与细胞因子结合，并由此抑制细胞因子与其在靶细胞表面上的受体结合，和/或在被拮抗剂或掩蔽结合的同时，抑制细胞因子发挥其生物功能。细胞因子拮抗剂或掩蔽的例子包括但不限于，源自于与细胞因子接触的细胞因子天然受体上胞外域的多肽。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指化合物或成分足以治疗特定病症、病状或疾病，例如改善、缓和、减轻和/或延迟一种或多种症状。关于更多的症状诸如癌症，有效量可以是足以延迟癌症发展或进展的剂量(例如，降低肿瘤生长速率，和/或延迟或防止肿瘤血管生成、癌细胞转移、或渗入周围器官的量)、减少上皮样细胞数量、导致癌症消退(例如缩小或根除肿瘤)，和/或预防或延迟癌症的发生或复发。有效量可以一次或多次给药。
术语“功能类似物”是指与参考分子具有相同的生物特异性(例如，结合至相同的配体)和/或活性(例如，激活或抑制靶细胞)的分子。
关于两个多肽序列的术语“融合”，其是指两个多肽序列通过主链肽键的连接。两个多肽可以直接融合，亦可以通过一个或多个氨基酸长的连接肽融合。融合多肽可以通过重组技术，由包含着两个融合部份体的各自编码序列的一段编码序列制备，其间可具或不具连接肽的编码序列。在一些实施方案中，融合涵盖化学缀合。
术语“药学上可接受的赋形剂”当用于指组合物中的成分时，是指该赋形剂适合于施用于治疗对象，包括人，而不会对该对象造成过大的有害副作用，且不会影响活性药物成分(API)的生物活性。
术语“受试对象”是指哺乳动物，包括但不限于人，宠物(例如犬或猫)，农场动物(例如牛或马)，啮齿动物，或灵长类动物。
如本文所用，“治疗“是用于获得有益或期望的临床结果的途径。有益或期望临床结果包括但不限于以下一种或多种：减轻由疾病引起的一种或多种症状、减轻疾病的程度、改善疾病状态、稳定疾病(例如，预防或延缓疾病的恶化或进展)、预防或延缓疾病的扩散(例如转移)、预防或延缓疾病的复发、提供疾病的部分或全部缓解、减少一种或多种其他药物治疗疾病所需的剂量、增加患者生活质量，和/或延长生存期。本发明的方法考虑了其中任何一个或多个的治疗方面。
应当理解，本文描述的各种实施方案的一种、一些或全部性质，均可以组合以形成本发明的其他实施方案。本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应将其解释为限制在此描述的主题。
细胞因子前药
本发明提供了在体内代谢成为活性细胞因子治疗剂的细胞因子前药。与先前的细胞因子治疗剂相比，此细胞因子前药具有更少的副作用，更好的体内药动学(例如，更长的半衰期)和更好的靶标特异性，并且更为有效。本发明的前药包含与载体部分连接，并被细胞因子拮抗剂(掩蔽部分)掩蔽(结合)的细胞因子激动剂多肽(细胞因子部分)。此细胞因子拮抗剂可以是，例如，细胞因子受体的胞外结构域，其通过可切割的连接(比如，可切割的连接肽)与细胞因子部分或载体部分相连。而此掩蔽与细胞因子结合时会抑制细胞因子部分的生物功能。前药可在患者的靶向位点(例如，在肿瘤部位或其周围环境)被激活，其是以通过切割连接并随后从前药上释出细胞因子掩蔽，从而暴露先前被掩蔽的细胞因子部分，允许其与靶细胞上的受体结合，并在靶细胞上发挥其生物功能。在一些实施方例中，前药的载体是在靶位点上与抗原结合的抗原结合部分，例如抗体。
在一些实施方案中，本发明的前药是促炎细胞因子前药，其在其载体标靶的体内靶点处上代谢成为促炎细胞因子。在进一步的实施方案中，前药中的载体是标靶肿瘤抗原的抗体，其使得前药被递送至患者中的肿瘤部位，并通过切割连着细胞因子掩蔽与载体或细胞因子部分的连接，以达到定点局部的前药代谢(例如，在肿瘤内部或其附近微环境)，进而产生促炎性细胞因子部分与靶细胞上的受体相互作用，而定点局部地刺激目标免疫细胞。
尽管以下描述举例说明了IL-2和IL-15前药，但在本发明中也考虑了用于其他细胞因子的前药，特别是自身为强效免疫调节剂而有强副作用的细胞因子。这些其他细胞因子前药，可以根据与以下针对IL-2和IL-15前药所述的相同原理制备。
A.前药的细胞因子部分
在一些实施方案中，本发明的前药包含促炎细胞因子激动剂多肽，例如IL-2激动剂多肽或IL-15激动剂多肽。
1.IL-2激动剂多肽
IL-2前药可包含IL-2激动剂多肽(细胞因子部分)，载体(载体部分)和IL-2拮抗剂(掩蔽部分)，其中IL-2激动剂多肽与载体直接或通过连接融合(例如，可切割或不可切割的连接肽)，而IL-2拮抗剂则通过可切割的连接肽与IL-2激动剂多肽或载体相连。在本发明的IL-2前药中，IL-2激动剂多肽可以是野生型IL-2多肽，例如野生型人IL-2多肽(SEQ ID NO：1)，或是IL-2突变蛋白，例如衍自人IL-2的IL-2突变蛋白。与野生型IL-2相比，IL-2突变蛋白对CD25或三聚体高亲和力IL-2R的亲和力可能显著降低。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白对高亲和力IL-2R的结合亲和力比野生型IL-2低100倍、300倍、500倍、1，000倍或10，000倍。除非另有说明，否则本文所述IL-2和IL-2突变蛋白中的所有残基编号均与SE9 ID NO：1中的编号一致。
在一方面，本发明提供了新颖的IL-2突变蛋白，其可用作IL-2前药中的IL-2激动剂多肽。此新的IL-2突变蛋白包含A73的突变(例如，T或另一个氨基酸残基的突变)和/或K35N突变。A73先前尚未被确定是与CD25相互作用的氨基酸残基之一。因此，本发明人惊讶于在该位置引入突变(例如，A73T)，能够导致IL-2突变蛋白对三聚体IL-2受体的结合亲和力显着降低，其类似于具有R38S/F42A/Y45A/E62A突变的IL-2突变蛋白，或具有F42A/Y45A/L72G突变的IL-2突变蛋白(参见下面的实施方案1)。不受理论的束缚，本发明人预期A73和K35是IL-2上的潜在糖基化位点，并且这些糖基化位点的突变调节了IL-2突变蛋白对某些IL-2R的亲和力。此新型突变蛋白将具有更安全的临床特征，且可用于需要IL-2活性的患者，例如需要免疫系统受刺激的患者(比如，癌症患者和艾滋病患者)。新型IL-2突变蛋白可以用作单独的实体，或于偶联物之中使用(例如，与比如本发明前药中的载体融合)。
在一些实施方案中，本发明的新型IL-2突变蛋白可包含在A73(例如，A73T)处的突变，并且在选自T3、D20、K35、R38、F42、F44、Y45、E62、E68、L72、N88、N90、C125和Q126中的一或多处突变。在某些实施方案中，新型IL-2突变蛋白包含了R38，F42，Y45和A73处的突变。
在一些实施方案中，本发明的新型IL-2突变蛋白可包含选自T3、D20、R38、F42、F44、Y45、E62、E68、L72、A73、N88、N90、C125和Q126中的一或多处突变。在某些实施方案中，新的IL-2突变蛋白包含K35N突变和在R38，F42和Y45处的额外突变，且具有或不具有在A73处突变。
在一些实施方案中，用于IL-2前药的IL-2激动剂多肽可在K35、R38、F42、F44、Y45、E62、E68、L72和A73处包含一个或多个突变。在一些实施方案中，IL-2激动剂多肽在D20、N88、N90和Q126处进而包含一个或多个突变。T3和/或C125处的额外突变也可能包括在内。在某些特定的实施方案中，IL-2激动剂多肽包含了选自SEQ ID NO：8-17、19-33、36、37和39-46的氨基酸序列。
在一些实施方案中，为了确保基本水平的IL-2激动活性，本发明的IL-2前药可进而包含第二个IL-2激动剂多肽，与野生型IL-2相比，该第二IL-2激动剂多肽包含了导致与二聚体中级亲和力受体的亲和力显着降低的突变。例如，具有带有(SEQ ID NO：130)或不带有(SEQ ID NO：129)连接的T3A/R38S/F42A/Y45A/E62A/C125S/Q126W(SEQ ID NOs：30)突变的IL-2突变蛋白，均显示出低水平但可检测的IL-2活性(参见下面的实施方案1)。
2.IL-15激动剂多肽
在本发明的IL-15前药中，IL-15激动剂多肽可以是野生型IL-15多肽，例如野生型人IL-15多肽(SEQ ID NO：2)，或是IL-15突变蛋白，例如衍生自人野生型IL-15的IL-15突变蛋白，与野生型IL-15相比，其对IL-15Rα或IL-2Rβ(CD122)的亲和力降低。
B.前药的掩蔽部分
本发明前药中的细胞因子拮抗剂，比如掩蔽部分，可包含与前药中的细胞因子部分结合的肽，或抗体，或抗体片段，其可掩蔽细胞因子部分并抑制其生物功能的肽或抗体或抗体片段。
举例来说，IL-2和IL-15拮抗剂可包含与IL-2或IL-15结合的肽和抗体，其干扰IL-2或IL-15部分与其受体结合，而导致被掩蔽时，IL-2或IL-15部分的生物活性降低。在一些实施方案中，IL-2拮抗剂包含IL-2Rβ或IL-2Rγ胞外域或其功能类似物，比如自人IL-2Rβ或IL-2Rγ的衍生物(例如，SEQ ID NO：3-6中之一)。在一些实施方案中，IL-2拮抗剂包含了从肽库筛选中找到的肽。在一些实施方案中，IL-2拮抗剂包含阻断IL-2或IL-2突变蛋白与IL-2受体结合的抗体或其片段在某些特定实施方案中，IL-2拮抗剂包含了scFv，Fab或单链Fab，其具有与选自融合瘤克隆4E12B2D10、4E12B2和4E12的抗体相同的CDR序列，如美国专利No.4，411，993所示。
人IL-2以相对较低的亲和力(KD～3μM，与IL-2相比，其对中间亲和力受体IL-2Rβγ的结合亲和力弱1，000倍)与IL-2Rβ(CD122)结合(Johnsonet al.，Eur Cytokine Netw.5(1)：23-34(1994))。因此，本发明人感到惊讶的是，当IL-2Rβ的胞外域(ECD)与IL-2突变蛋白激动剂多肽融合到相同的载体分子时，IL-2突变蛋白激动剂多肽的基于细胞活性被显着抑制。(参见下面的示例4)。
对于IL-15前药，所述掩蔽部分可以是IL-2Rβ或IL-2Rγ的细胞外结构域或其功能类似物(例如，SEQ ID NO：3-6之一)。
C.前药的载体部分
本发明前药的载体部分可以是抗原结合部分，或者不是抗原结合部分的部分。载体部分可以改善药动学，例如细胞因子激动剂多肽的血清半衰期，并且还可以将细胞因子激动剂多肽靶向体内的靶位点，例如肿瘤位点。
1.抗原结合载体部分
载体部分可以是抗体或其抗原结合片段或免疫粘附素。在一些实施方案中，抗原结合部分是具有两条重链和两条轻链的完整抗体，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，Fv片段，二硫键连接的Fv片段，单域抗体，纳米抗体或单链可变片段(scFv)的全长抗体。在一些实施方案中，抗原结合部分是双特异性抗原结合部分，并可以结合相同抗原上的两个不同抗原，或两个不同表位。抗原结合部分可以为细胞因子激动剂多肽，提供额外的和潜在的协同治疗功效。
细胞因子(例如，IL-2或IL-15)激动剂多肽及其掩蔽，可与抗原结合部分的轻链和/或重链的N-末端或C-末端融合。举例来说，细胞因子(例如IL-2或IL-15)激动剂多肽及其掩蔽，可以与抗体重链或其抗原结合片段融合，或与抗体轻链或其抗原结合片段融合。在一些实施方案中，细胞因子(例如IL-2或IL-15)激动剂多肽融合至抗体的一条或两条重链的C-末端，并且通过可切割的连接肽，将细胞因子的掩蔽融合至细胞因子激动剂多肽的另一末端。在一些实施方案中，细胞因子(例如，IL-2或IL-15)激动剂多肽融合至抗体的一条重链的C-末端，并且通过可切割的连接肽，将细胞因子的掩蔽融合至抗体的另一条重链的C-末端，其两条重链中，则包含着允许两条不同重链特异性配对的突变。
形成异二聚体的策略是众所周知的(参见，例如，Spies et al.，Mol Imm.67(2)(A)：95-106(2015))。例如，前药中的两个重链多肽可以通过“knobs-into-holes”突变形成稳定的异二聚体。进行“knobs-into-holes”突变以促进抗体重链的异二聚体的形成，并且普遍用于制造双特异性抗体(参见，例如，美国专利号8,642,745)。例如，抗体的Fc结构域可在“knob chian”的CH3结构域中包含T366W突变，而在“holechain”的CH3结构域中包含T366S，L368A和/或Y407V突变。还可以使用CH3域之间的另一个链间二硫桥，例如，通过将Y349C突变引入“knobs chain”的CH3域，并将E356C或S354C突变引入“hole chain”的CH3域中(参见，例如，Merchant et al.，Nature Biotech 16：677-81(1998))。在其他实施方案中，抗体部分可在两个CH3结构域之一中包含Y349C和/或T366W突变，在另一个CH3结构域中包含E356C，T366S，L368A和/或Y407V突变。在某些特定实施方案中，抗体部分可在两个CH3结构域之一中包含Y349C和/或T366W突变，在另一个CH3结构域中包含S354C(或E356C)，T366S，L368A和/或Y407V突变；另外以一个CH3结构域上额外的Y349C突变，和另一个CH3结构域上额外的E356C或S354C突变，形成一个链间二硫键(编号始终根据Kabat的EU索引编号；Kabat et al.，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”5th ed.，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。其他knobs-in-holes技术，比如EP1870459A1中所述的，均可以替代或附加地使用。于是，抗体部分的knobs-in-holes突变的另一个例子是在“knob chain”的CH3域中带有R409D/K370E突变，在“hole chain”的CH3域中带有D399K/E357K突变(EU编号)。
在一些实施方案中，前药中的抗体部分在其Fc结构域中包含L234A和L235A(“LALA”)突变。LALA突变消除了补体结合和固定，以及Fcγ依赖性ADCC(参见，例如，Hezareh et al.J.Virol.75(24)：12161-8(2001))。在一些进一步的实施方案中，除了knobs-in-holes突变之外，LALA突变亦存在于抗体部分之中。
在一些实施方案中，抗体部分包含在Fc结构域中M252Y/S254T/T256E(“YTE”)突变。YTE突变允许同步调节血清半衰期，组织分布和IgGl的活性(参见Dall’Acqua et al.，JBiol Chem.281：23514-24(2006)；和Robbie et al.，Antimicrob Agents Chemother.57(12)：6147-53(2013)。在一些进一步的实施方案中，除了knobs-in-holes突变之外，YTE突变亦存在于抗体部分中。在某些特定的实施方案中，抗体部分具有YTE，LALA和knobs-in-holes突变或其任何组合。
抗原结合部分可以结合细胞表面上的抗原，比如免疫细胞，其又如T细胞、NK细胞和巨噬细胞，而该抗原结合部分又或可与细胞因子结合。例如，抗原结合部分可以结合PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CTLA-4或TGF-beta，而该抗原结合部分亦可以是抗体。该抗体可能具有激活免疫细胞并增强其抗癌活性的能力。
抗原结合部分可以结合肿瘤细胞表面上的抗原。例如，抗原结合部分可以结合FAPα、5T4、Trop-2、PD-L1、HER-2、EGFR，Claudin 18.2，DLL-3，GCP3，或癌胚抗原(CEA)，而该抗原结合部分可以是抗体。该抗体可以具有或不具有ADCC活性。该抗体也可以进而与细胞毒性药物偶联。
在一些实施方案中，抗原结合部分结合至鸟苷酸环化酶C(GCC)，碳水化合物抗原19-9(CA19-9)，糖蛋白A33(gpA33)，粘蛋白1(MUCl)，胰岛素样生长因子1受体(IGF1-R)，人表皮生长因子受体2(HER2)，人表皮生长因子受体3(HER3)，δ样蛋白3(DLL3)，δ样蛋白4(DLL4)，表皮生长因子受体(EGFR)，glypican-3(GPC3)，c-MET，血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)，Nectin-4，Liv-1，糖蛋白NMB(GPNMB)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，Trop-2，碳酸酐酶IX(CA9)，内皮素B受体(ETBR)，前列腺1的六种跨膜上皮抗原(STEAP1)，叶酸受体α(FR-α)，SLIT和NTRK样蛋白6(SLITRK6)，碳酸酐酶VI(CA6)，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(ENPP3)，间皮素，滋养层糖蛋白(TPBG)，CD19，CD20，CD22 CD33，CD40，CD56，CD66e，CD70，CD74，CD79b，CD98，CD123，CD138，CD352，CD47，信号调节蛋白α(SIRPα)，Claudin18.2，Claudin6，BCMA或EPCAM。在一些实施方案中，抗原结合部分结合至DLL3的表皮生长因子(EGF)样结构域。在一些实施方案中，抗原结合部分结合至DLL3的Delta/Serrate/Lag2(DSL)样结构域。在一些实施方案中，抗原结合部分结合位于GPC3上第374个氨基酸之后的表位。在一些实施方案中，抗原结合部分与GPC3的硫酸肝素聚糖结合。在一些实施方案中，抗原结合部分与Claudin18.2结合，而不与Claudin18.1结合。在一些实施方案中，抗原结合部分与Claudin18.1结合的亲和力，比起与Claudin18.2结合的亲和力，至少弱了十倍。
示例性的抗原结合部分包括曲妥珠单抗，利妥昔单抗，本妥昔单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗，GC33(或其人源化形式)，anti-EGFR抗体mAb806(或其人源化形式)，anti-dPNAG抗体F598，和其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合部分与曲妥珠单抗，利妥昔单抗，本妥昔单抗，西妥昔单抗或帕尼单抗，GC33(或其人源化版本)，anti-EGFR抗体mAb806(或其人源化版本)，anti-dPNAG抗体F598，或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合部分带有的抗体重链与曲妥珠单抗，利妥昔单抗，本妥昔单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗，GC33(或其人源化版本)，anti-EGFR抗体mAb806(或其人源化版本)，anti-dPNAG抗体F598等的抗体重链，或其片段，至少有90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％d的同一性。在一些实施方案中，抗原结合部分带有的抗体轻链与曲妥珠单抗，利妥昔单抗，本妥昔单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗，GC33(或其人源化版本)的抗体轻链，anti-EGFR抗体mAb806(或其人源化版本)，anti-dPNAG抗体F598等的抗体轻链，或其片段，至少有90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。该抗原结合部分融合至IL-2激动剂多肽。在一些实施方案中，抗原结合部分包含曲妥珠单抗，利妥昔单抗，本妥昔单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗，GC33，anti-EGFR抗体mAb806，或anti-dPNAG抗体F598的六个互补决定区(CDR)。
许多CDR描述是本领域已知的，并且在本文中涵盖。本领域技术人员可以基于重链或轻链可变区的序列，轻易地确定所给定描述的CDR。Kabat”CDR乃基于序列可变性且最为常用(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。Chothia”CDR是指结构环的位置(Chothia&Lesk，Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins，J.Mol.Biol.，vol.196，pp.901-917(1987))。“AbM”CDR代表了Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，其亦被牛津分子(OxfordMolecular)的AbM抗体建模软件使用。Contact”CDR为基于对可用复杂晶体结构的分析。参考常见的抗体编号方案，这些CDR的各个残基在下表1中列出。除非本文另有说明，否则抗体中的氨基酸编号是指如上文Kabat等人所述的Kabat编号方案，其包括当参照Kabat，Chothia，AbM或Contact方案进行CDR描述时。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少或额外的氨基酸，其对应于可变结构域的框架区(FR)或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可以包括在H 2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)，亦包括在重链FR残基82之后的插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a，82b和82c等)。对于所给定的抗体，通过在抗体序列同源区域与“标准”Kabat编号序列进行比对，可以确定其抗体残基的Kabat编号。
表1.根据各种方案的CDR描述
Figure GDA0002842149240000161
Figure GDA0002842149240000171
在一些实施方案中，CDR是“扩展的CDR”，且包含根据不同方案开始或终止的区域。例如，扩展CDR可以如下：L24-L36，L26-L34或L26-L36(VL-CDR1)；L46-L52，L46-L56或L50-L55(VL-CDR2)；L91-L97(VL-CDR3)；H47-H55，H47-H65，H50-H55，H53-H58或H53-H65(VH-CDR2)；和/或H93-H102(VH-CDR3)。
在一些实施方案中，抗原结合部分与HER2结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：148或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：149或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：148的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：149的CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与CD20结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：150或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：151或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含来自SEQ ID NO：150的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：151的CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与CD30结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：152或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：153或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：152的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：153的CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与EGFR结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：154或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：155或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：154的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：155的CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与EGFR结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：156或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：157或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：156的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：157的CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与c-MET结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：158或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：159或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：158的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：159的CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与GPC3结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：160或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：161或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：160的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：161的CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与Claudin 18.2结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：162或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：163或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：162的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ IDNO：163的CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与FAPalpha结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：180或181或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：182或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：180或181的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：182的CDR1，CDR2和CDR3。在一些实施方案中，抗原结合部分与FAPalpha结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：183或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ IDNO：184或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：183的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：184的CDR1，CDR2和CDR3。在一些特定的实施方案中，人源化的FAP抗体包含SEQ ID NO：180或181中所示的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：182中所示的重链氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原结合部分与癌胚抗原(CEA)结合，且其抗原结合部分可衍自抗体PR1A3(美国专利号8，642，742)。该anti-CEA抗体，包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：178或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：179或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：176的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：177的CDR1，CDR2和CDR3。在一些特定的实施方案中，PR1A3为人源化抗体，其包含SEQ ID NO：178中所示的轻链可变域氨基酸序列，和SEQ ID NO：179中所示的重链可变域氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原结合部分与PDL1结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：189或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：190或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：189的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ ID NO：190的CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与5T4结合，且包含一轻链和一重链，其轻链氨基酸序列与SEQ ID NO：187或188，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，有97％，98％或99％的相同性，其重链氨基酸序列与SEQ ID NO：185、186或其片段，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含了来自SEQ ID NO：187或188的CDR1，CDR2和CDR3，以及来自SEQ IDNO：185或186的CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与Trop-2结合，且包含着一轻链和一重链可变区，其轻链可变区包含着含有KASQDVSIAVA(SEQ ID NO：164)氨基酸序列的CDRl，含有SASYRYT(SEQ ID NO：165)氨基酸序列的CDR2，和含有QQHYITPLT(SEQ ID NO：166)氨基酸序列的CDR3；而其重链可变区则包含着含有NYGMN(SEQ ID NO：167)氨基酸序列的CDR1，含有WINTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO：168)氨基酸序列的CDR2，和含有GGFGSSYWYFDV(SEQ IDNO：169)氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分与间皮素结合，且包含着一轻链和一重链可变区，其轻链可变区包含着含有SASSSVSYMH(SEQ ID NO：170)氨基酸序列的CDR1，含有DTSKLAS(SEQ ID NO：171)氨基酸序列的CDR2，和含有(SEQ ID NO：172)氨基酸序列的CDR3；而其重链可变区则包含着含有GYTMN(SEQ ID NO：173)氨基酸序列的CDR1，含有LITPYNGASSYNQKFRG(SEQ ID NO：174)氨基酸序列的CDR2，和含有GGYDGRGFDY(SEQ ID NO：175)氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合部分包含一个，两个或三个抗原结合结构域。例如，抗原结合部分是双特异性的，而其与选自HER2、HER3、EGFR、5T4、FAPα、Trop-2、GPC3、VEGFR2、Claudin18.2和PD-L1中的两种不同抗原结合。在一些实施方案中，所述双特异性抗原结合部分结合至HER2的两个不同表位。
2.其他载体部分
其他非抗原结合载体部分亦可以用于本发明的前药。例如，抗体Fc结构域(例如人IgGl，IgG2，IgG3或IgG4Fc)，聚合物(例如PEG)，白蛋白(例如人白蛋白)，或其片段，或纳米颗粒，均可使用。
举例来说，可以将细胞因子(例如，IL-2或IL-15)激动剂多肽和其拮抗剂与抗体Fc结构域融合，形成Fc融合蛋白。在一些实施方案中，细胞因子(例如IL-2或IL-15)激动剂多肽与至Fc结构域多肽链之一的C端或N端融合(直接融合或通过连接肽)，而细胞因子掩蔽则通过可切割的连接肽，与另一条Fc结构域多肽链的C端或N端融合，其中两条Fc结构域多肽链包含了允许两条不同的Fc链特异性配对的突变。在一些实施方案中，Fc结构域包含上述的holes-into-holes突变。在一些进一步实施方案中，Fc结构域亦可包含上述的YTE和/或LALA突变。
前药的载体部分可包含白蛋白(例如人血清白蛋白)或其片段。白蛋白的示例性序列显示于SEQ ID NO：124中。在一些实施方案中，白蛋白或白蛋白片段为约85％或更多，约90％或更多，约91％或更多，约92％或更多，约93％或更多，约94％或更多，约95％或更多，约96％或更多，约97％或更多，约98％或更多，约99％或更多，约99.5％或更多，或约99.8％或更多地与人血清白蛋白或其片段相同。
在一些实施方案中，载体部分包含氨基酸长度约10或更大，20或更大，30或更大，40或更大，50或更大，60或更大，70或更多，80或更多，90或更多，100或更多，120或更多，140或更多，160或更多，180或更多，200或更多，250或更多，300或更多，350或更多，400或更多长度为450或更多，500或更多或550或更多的白蛋白片段(例如，人血清白蛋白片段)。在一些实施方案中，白蛋白片段的长度在约10个氨基酸与约584个氨基酸之间(例如在约10与约20，约20与约40，约40与约80，约80与约160，约160与约250，约250和约350，约350和约450，或约450和约550个氨基酸之间)。在一些实施方案中，白蛋白片段包括Sudlow I结构域或其片段，或是Sudlow II结构域或其片段。
D.前药的连接体组成
细胞因子(例如，IL-2或IL-15)激动剂多肽可以在具有或不具有连接肽的情况下与载体部分融合。连结肽可以是不可切割的。在一些实施方案中，连接肽选自SEQ ID NO：47-51。在一些特定的实施方案中，连接肽包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：49)。
细胞因子(例如，IL-2或IL-15)掩蔽可以通过可切割的连结与细胞因子部分或与载体融合。可切割的连结可包含一个或多个(例如，两或三个)可切割的部分(CM)。每个CM可以是选自豆蔻蛋白酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、组织蛋白酶、胱天蛋白酶、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、uPA和PSA的酶或蛋白酶的底物。可切割连接的实例包括但不限于那些选自SEQ ID NO：18、34、35、38、52-121和217的氨基酸序列。
细胞因子激动剂多肽，细胞因子掩蔽，载体，连结肽和前药的具体而非限制性实例，显示于以下的序列章节中。此外，本发明的前药和新型IL-2突变蛋白可以通过众所周知的重组技术制备。例如，可以将包含前药中多肽链的编码序列的另一种表达载体，转染至哺乳动物宿主细胞(例如，CHO细胞)中，且在允许编码序列表达并将表达的多肽组装成前药复合物的条件下培养细胞。为了使前药保持无活性，可以使用不表达或微量表达uPA，MMP-2和/或MMP-9的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可包含这些蛋白酶基因的无效突变(敲除)。
药物成分
对包含了本发明中前药和突变蛋白(例如，活性药物成分或API)的药物成分，可藉将所需纯度的API与一或多种可选择的药学上可接受赋形剂混合来制备(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th Edition.，Osol，A.Ed.(1980))in theform of lyophilized formulations or aqueous solutions.)，其形式为冻干制剂配分或水溶液。药学上可接受的赋形剂(或载体)通常在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，包括但不限于：缓冲液含有例如，磷酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，组氨酸，乙酸盐或另一种无机或有机酸或其盐；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；间苯二酚；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括蔗糖，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，例如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。
缓冲液用于将pH控制在使治疗效果最优化的范围内，特别是如果其稳定性取决于pH。缓冲液优选于约50mM至约250mM的浓度范围内。适用于本发明的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐，磷酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，富马酸盐，葡萄糖酸盐，草酸盐，乳酸盐和乙酸盐。另外，缓冲液亦可包含组氨酸和三甲胺盐，例如三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
防腐剂被添加以减缓微生物生长，且其使用量通常在0.2％-1.0％(w/v)的范围内。适用于本发明的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵卤化物(例如氯化物，溴化物，碘化物)，苄索氯铵；硫柳汞，苯酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚，间苯二酚；环己醇，3-戊醇和间甲酚。
张度剂，有时称为“稳定剂”，是用以调节或维持成分中液体的张力。当其与带电荷的大型生物分子(如蛋白质和抗体)一起使用时，它们通常被称为“稳定剂”，因其可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，从而降低了分子间和分子内相互作用的可能性。当考虑其他成分的相对量时，张度剂可在0.1％至25％重量比之间的任何量使用，或更优选于1％至5％重量比之间。优选的张度剂包括多元糖醇，更优选地为三元或更高级的糖醇，例如甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。
非离子表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)，被用以帮助溶解治疗剂，并保护治疗蛋白避免因搅动所导致的聚集，其亦允许了该制剂配方可暴露于剪切表面应力而不引起活性治疗性蛋白或抗体的变性。非离子表面活性剂的使用范围为约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选地为约0.07mg/ml至约0.2mg/ml。
合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(20、40、60、65、80等)，泊咯沙姆(184、188等)，普朗尼克多元醇，曲拉通，聚氧乙烯山梨糖醇单醚(吐温-20，吐温-80等)，聚桂醇400，聚氧化烯硬脂酸酯40，聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，单硬脂酸甘油酯，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子去污剂包括月桂基硫酸钠，磺基琥珀酸二辛酯钠和磺酸二辛基钠。阳离子去污剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
可根据预期的给药途径和标准制药规范选择药物载体，赋形剂或稀释剂。药物成分可额外包含任何一或多种合适的粘合剂，润滑剂，助悬剂，包衣剂或增溶剂。
取决于不同的传递系统，可能需要不同的成分/制剂要求。举例来说，本发明中有用的药物成分可被配制成适用于微型泵或通过粘膜途径传递，例如，作为鼻用喷雾剂或气雾剂用于吸入或可吸收溶液，亦或配制成注射形式的成分以肠胃外地给药，其藉由例如静脉内，肌内或皮下途径传递。
在一些实施方案中，本发明的药物成分是冻干的蛋白制剂配方。在一些其他实施方案中，药物成分可以是术性液体制剂配方。
治疗方法
细胞因子(例如，IL-2或IL-15)前药可用于治疗疾病，其取决于抗原结合结构域所结合的抗原。在一些实施方案中，IL-2或IL-15前药用于治疗癌症。在一些实施方案中，IL-2或IL-15前药用于治疗感染，例如当药物分子是抗细菌剂或抗病毒剂时。
在一些实施方案中，治疗对象疾病(例如癌症，病毒感染或细菌感染)的方法包含向对象施用有效量的IL-2或IL-15前药。
在一些实施方案中，癌症是实体癌。在一些实施方案中，癌症是血液癌或实体瘤。可治疗的示例性癌症包括但不限于，白血病，淋巴瘤，肾癌，膀胱癌，泌尿道癌，子宫颈癌，脑癌，头颈癌，皮肤癌，子宫癌，睾丸癌，食道癌，肝癌，大肠癌，胃癌，鳞状细胞癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌，例如非小细胞肺癌，胆管癌，乳腺癌和卵巢癌。
在一些实施方案中，细胞因子(例如，IL-2或IL-15)前药用于治疗细菌感染，例如败血症。在一些实施方案中，引起细菌感染的细菌是抗药性细菌。在一些实施方案中，抗原结合部分结合至细菌抗原。
在一些实施方案中，细胞因子(例如，IL-2或IL-15)前药用于治疗病毒感染。在一些实施方案中，引起病毒感染的病毒是丙型肝炎(HCV)，乙型肝炎(HBV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，人乳头瘤病毒(HPV)。在一些实施方案中，抗原结合部分结合至病毒抗原。
通常，根据标准制药规范，本发明药物成分的剂量和给药途径根据给药对象的尺寸大小和状况来决定。在一些实施方案中，药物成分通过任何途径施用于给药对象，包括口服，透皮，吸入，静脉内，动脉内，肌肉内，直接施用至创伤部位，施用于手术部位，腹膜内，栓剂，口服，经皮，皮下，皮内，经皮，雾化，胸膜内，心室内，关节内，眼内，颅内或脊髓内。在一些实施方案中，该成分经静脉内施用于给药对象。
在一些实施方案中，药物成分的剂量是单剂量或重复剂量。在一些实施方案中，剂量为每天一次，每天两次，每天三次，或每天四次或更多次给予给药对象。在一些实施方案中，一周内给予约1或更多(例如约2、3、4、5、6或7或更多)剂量。在一些实施方案中，药物成分以每周一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每周一次，三周中的两周中的每周，或四周中的三周中的每周，来实施给药。在一些实施方案中，多次剂量于几天，几周，几个月或几年的过程中给予。在一些实施方案中，治疗过程为约1或更多剂量(例如约2、3、4、5、7、10、15或20或更多剂量)。
除非本文另外定义，否则与本发明相关的科学和技术术语，应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。尽管本文描述的那些类似或等同的方法和材料亦可被用于本发明的实践或试验中，但示例性方法和材料如下所描述。如有冲突，以本规范说明，包括定义，为准。通常，本文所述相关于细胞和组织培养，分子生物学，免疫学，微生物学，遗传学，分析化学，合成有机化学，医学和药物化学，以及蛋白质和核酸化学，以及杂交混合的命名法和技术均为本领域众所周知和常用的。酶促反应和纯化技术乃根据制造商的规范说明执行，如本领域通常达成的或如本文所述。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。在整个规范说明和实施方案中，词语“具有”和“包含”，或其同义、替代词及变体，将被理解为暗示着包括了所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。应当理解，本文所述发明的方面和变化包括″由……组成″和/或″基本上由……组成″的方面和变化。尽管本文引用了许多文件，但该引用并不构成承认这些文件中的任何文件形成本领域公知常识的一部分。
示例性实施方案
本发明的其他特定实施方案描述如下。这些实施方案旨在说明本发明中描述的成分和方法，而并非旨在限制本发明的范围。
1.一个分离出的突变白介素-2(IL-2)多肽，其中所述突变IL-2多肽包含具有最多七个氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中一个突变位于73号位置。
2.一个分离出的突变体白介素-2(IL-2)多肽，其中所述突变IL-2多肽包含具有最多七个氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中突变之一是K35N。
3.一个分离出的突变体白介素-2(IL-2)多肽，其中所述突变体IL-2多肽包含具有最多七个氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中突变之一是A73T。
4.实施方案1-3中任一例的突变白介素-2多肽，其进而包含额外的氨基酸突变，其中所述突变位于对应于人IL-2的42和45号残基位置。
5.实施方案1-3中任一例的突变白介素-2多肽，其进而包含额外的氨基酸突变，其中所述突变位于对应于人IL-2的38、42和45号残基位置。
6.实施方案1-3中任一例的突变白介素-2多肽，其进而包含额外的氨基酸突变，其中所述突变位于对应于人IL-2的38、42、45和62号残基位置。
7.实施方案4-6中任一例的突变白介素-2多肽，其中第42号位置的突变选自F42A，F42G，F42I，F42S，F42T，F42Q，F42E，F42N，F42D，F42R和F42K的群中。
8.实施方案4-6中任一例的突变白介素-2多肽，其中第42号位置的突变选自Y45A，Y45G，Y45S，Y45T，Y45Q，Y45E，Y45N，Y45D，Y45R和Y45K的群中。
9.实施方案5和6中任一例的突变白介素-2多肽，其中第38号位置的突变选自R38A，R38K和R38S的群中。
10.实施方案6中的突变白介素-2多肽，其中第62号位置的突变选自E62L，E62A和E62I的群中。
11.实施方案1-10中任一例的突变白介素-2多肽，其进而包含T3A和C125S的突变。
12.一个嵌合分子，其包含实施方案1至11中任一例的突变白介素-2多肽和一载体，其中所述突变IL-2多肽可操作上地连接至所述载体，其中所述载体选自PEG分子，白蛋白分子，白蛋白片段，IgG Fc和抗原结合分子7。
13.实施方案12中的嵌合分子，其中所述载体为抗原结合分子，且其中所述抗原结合分子是抗体或抗体片段。
14.实施方案12中的嵌合分子，其中所述载体是抗原结合分子，且其中所述抗原结合分子是双特异性抗体。
15.实施方案13和14中任一例的嵌合分子，其中所述抗原选自PD-L1，PD-1，成纤维细胞活化蛋白α(FAPalpha)，CEA，BCMA，CD20，Trop-2，HER2、5T4，黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，PSMA，EGFR和Claudin 18.2。
16.一个细胞因子(例如IL-2或IL-15)的前药，其包含细胞因子(例如IL-2或IL-15)突变蛋白，细胞因子(例如IL-2或IL-15)的掩蔽部分或拮抗剂，以及可切割的连结肽，例如IL-2的前药，而其前药包含IL-2激动剂多肽(A)，掩蔽部分(MM)和至少一个可切割的连接肽；其中所述掩蔽部分包含IL-2受体β亚基胞外结构域或其功能类似物。
17.实施方案16中的前药，其中所述IL-2拮抗剂或掩蔽部分(MM)包含IL-2受体β亚基的细胞外结构域，其包含至少85％，至少90％，或至少95％与SEQ ID NO：3相同的氨基酸序列。
18.实施方案16中的前药，其中所述IL-2拮抗剂或掩蔽部分包含IL-2受体β亚基的细胞外结构域，其包含SEQ ID NO：3中的一段氨基酸序列。
19.实施方案16-18中任一例的前药，其中所述IL-2激动剂多肽(A)包含与SEQ IDNO：1至少90％相同的氨基酸序列，或所述IL-15激动剂多肽(A)包含与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列。
20.实施方案16-18中任一例的前药，其中所述IL-2激动剂多肽(A)包含人IL-2的类似物，其在选自T3，K35，R38，F42，Y45E62，E68，L72，A73和C125的一个或多个位置上包含一个或多个突变；而其中所述突变是参照于具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的人IL-2的编号。
21.实施方案16-18中任一例的前药，其中所述IL-2激动剂多肽(A)是选自实施方案1-11中任一例的突变IL-2。
22.实施方案16-18中任一例的前药，其中所述IL-2激动剂多肽包含选自SEQ IDNO：8-17、19-33、36、37和39-46的氨基酸序列。
23.实施方案16-22中任一例的前药，其中其进而包含载体(C)，其中所述载体选自PEG分子，白蛋白，白蛋白片段，Fc和抗原结合分子。
24.一个IL-2(或IL-15)的前药，其中其IL-2(或IL-15)活性在肿瘤部位或其周围区域被激活，其包括：可操作地与载体融合或缀合的IL-2(或IL-15)，抑制或影响上述IL-2(或IL-15)激动剂多肽与其受体结合的IL-2(或IL-15)拮抗剂；和将IL-2(或IL-15)拮抗剂与所述IL-2(或IL-15)激动剂多肽或其载体连接的可切割连接肽；其中所述可切割的连接肽可以被肿瘤或其周围环境中的一种或多种蛋白酶切割；其中所述载体选自蛋白，抗体或聚乙二醇(PEG)聚合物。
25.实施方案24的前药，其中所述IL-2或IL-15拮抗剂包含IL-2受体β亚基的细胞外结构域或其功能类似物。
26.实施方案24和25中任一例的前药，其中所述IL-2或IL-15拮抗剂或掩蔽部分(MM)包含IL-2受体β亚基的细胞外结构域，其包含至少85％，至少90％或至少95％，与SEQID NO：3相同的氨基酸序列。
27.实施方案24和25中任一例的前药，其中所述IL-2或IL-15拮抗剂或掩蔽部分是IL-2受体β亚基的细胞外结构域，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
28.实施方案24-27中任一例的前药，其中所述IL-2或IL-15拮抗剂或掩蔽部分进而包含IL-2受体γ亚基或其功能等同物。
29.实施方案24-27中任一例的前药，其中所述IL-2或IL-15拮抗剂或掩蔽部分进而包含第二IL-2受体β亚基或其功能等同物。
30.实施方案24-29中任一例的前药，其中所述IL-2激动剂多肽(A)具有与SEQ IDNO：1至少90％相同的氨基酸序列。
31.实施方案24-29中任一例的前药，其中所述IL-2激动剂多肽(A)是人IL-2的类似物，其含有选自T3，K35，R38，F42，Y45，E62，E68，L72，A73和C125(例如，A73处的突变和K35N突变)中一或多处位置上的突变；其中所述突变是参照于具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的人IL-2的编号。
32.实施方案24-29中任一例的前药，其中所述IL-2激动剂多肽(A)是选自实施方案1-11中任一例的突变体IL-2。
33.实施方案24-29中任一例的前药，其中所述IL-2激动剂多肽包含选自SEQ IDNO：8-17、19-33、36、37和39-46中的氨基酸序列。
34.一个IL-15的前药，其包含IL-15激动剂多肽(A)，掩蔽部分(MM)，载体(C)和至少一个可裂解的肽接头；其中所述IL-15激动剂多肽(A)包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列至少90％，至少95％或100％相同的氨基酸序列；所述掩蔽部分(MM)选自IL-2受体β亚基胞外域、所述IL-2受体β亚基细胞外域的功能类似物、通过连接肽与IL-2受体γ亚基胞外域融合的IL-2受体β亚基细胞外域，以及通过可切割的连接肽相互连接的IL-2受体β亚基胞外域的二聚体；所述载体，其选自白蛋白，白蛋白片段，Fc和抗原结合分子。
35.实施方案34的前药，其中所述IL-15的前药亦包含IL-15受体α亚基的Sushi结构域；而其中所述Sushi结构域包含与SEQ ID NO：7至少95％或100％相同的氨基酸序列。
36.实施方案34和35中任一例的前药，其中所述IL-2受体β亚基细胞外结构域包含与SEQ ID NO：3至少95％或100％相同的氨基酸序列。
37.实施方案28和34中任一例的前药，其中所述γ亚基胞外域包含与SEQ ID NO：6至少95％或100％相同的氨基酸序列。
38.实施方案23-37中任一例的前药，其中所述载体(C)是抗原结合分子；而其中所述抗原结合分子是包含两个重链和两个轻链的抗体。
39.实施方案38的前药，其中所述细胞因子(例如，IL-2或IL-15)激动剂多肽选择性地通过肽接头与所述抗体的重链之一上的C末端融合，且所述细胞因子(例如，IL-2或IL-15)拮抗剂或掩蔽部分(MM)通过可切割的连接肽与第二重链上的C末端融合；其中两个重链融合蛋白经由“knobs-into-holes”突变形成异源二聚体。
40.实施方案38的前药，其中所述细胞因子(例如，IL-2或IL-15)激动剂多肽选择性地通过肽接头与所述抗体的重链之一上的N末端融合，且所述细胞因子(例如，IL-2或IL-15)拮抗剂或掩蔽部分(MM)通过可切割的连接肽与第二重链上的N末端融合；其中两个重链融合蛋白经由“knobs-into-holes”突变形成异源二聚体。
41.实施方案38的前药，其中所述细胞因子(例如IL-2或IL-15)激动剂多肽直接或通过所述抗体或抗体片段的一条或两条重链的N末端融合或缀合，且所述细胞因子(例如IL-2或IL-15)拮抗剂或掩蔽部分(MM)通过可切割的连接肽与轻链的N端融合，以形成重链融合多肽和轻链融合多肽。
42.实施方案23-41中任一例的前药，其中所述载体是抗原结合分子，其中所述抗原结合分子与的一或多种选自鸟苷酸环化酶C(GCC)，碳水化合物抗原19-9(CA19-9)，糖蛋白A33(gpA33)，粘蛋白1(MUC1)，癌胚抗原(CEA)，胰岛素样生长因子1受体(IGF1-R)，人表皮生长因子受体2(HER2)，人表皮生长因子受体3(HER3))，δ样蛋白3(DLL3)，δ样蛋白4(DLL4)，表皮生长因子受体(EGFR)，glypicain-3(GPC3)，c-MET，血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)，Nectin-4，Liv-1，糖蛋白NMB(GPNMB)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，Trop-2，碳酸酐酶IX(CA9)，内皮素B受体(ETBR)，六个跨膜前列腺上皮抗原1(STEAPl)，叶酸受体α(FR-α)，SLIT和NTRK样蛋白6(SLITRK6)，碳酸酐酶VI(CA6)，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(ENPP3)，间皮素，滋养层糖蛋白(TPBG)，CD19，CD20，CD22，CD33，CD40，CD56，CD66e，CD70，CD74，CD79b，CD98，CD123，CD138，CD352，CD47，信号调节蛋白α(SIRPα)，PD1，Claudin 18.2，Claudin 6，FAP-α，5T4，BCMA，PD-L1，PD-1和EPCAM的抗原结合。
43.实施方案23-42中任一例的前药，其中其进而包含另一种效应子多肽。
44.实施方案23-42中任一例的前药，其中其进而包含另一种效应子多肽，其中所述效应子多肽是在126号位置处包含氨基酸突变的另一种IL-2突变蛋白。
45.实施方案23-42中任一例的前药，其中其进而包含另一种效应子多肽，其中所述效应子多肽是CCL19多肽，其包含与SEQ ID NO：123至少95％相同的氨基酸序列。
46.实施方案16-45中任一例的前药，其中所述可切割的连接肽可被在肿瘤部位或其周围环境中的一种或多种蛋白酶裂解。
47.实施方案16-45中任一例的前药，其中所述前药在肿瘤部位是可活化的。
48.实施方案16-45中任一例的前药，其中所述可切割的连接肽包含uPA的底物。
49.实施方案16-45中任一例的前药，其中所述可切割的连接肽包含MMP2和/或MMP9的底物。
50.实施方案16-45中任一例的前药，其中所述可切割的连接肽包含uPA和MMP2，uPA和MMP9或uPA，MMP2和MMP9的底物。
51.实施方案16-45中任一例的前药，其中所述可切割的连接肽包含选自LSGRSDNH(SEQ ID NO：52)，ISSGLLSS(SEQ ID NO：53)和GPLGVR(SEQ ID NO：54)的酶底物氨基酸序列。
52.实施方案16-45中任一例的前药，其中所述可切割的连接肽包含酶底物氨基酸序列LSGRSDNH(SEQ ID NO：52)和ISSGLLSS(SEQ ID NO：53)。
53.实施方案16-45中任一例的前药，其中所述可切割的连接肽包含酶底物氨基酸序列LSGRSDNH(SEQ ID NO：52)和GPLGVR(SEQ ID NO：54)；或ISSGLLSS(SEQ ID NO：53)和GPLGVR(SEQ ID NO：54)。
54.实施方案16-45中任一例的前药，其中所述可切割的连接肽包含选自SEQ IDNO：55-78的氨基酸序列。
55.一个多核苷酸，其编码实施方案1-11中任一例的突变IL-2。
56.一个或多个多核苷酸，其编码实施方案12-15中任一例的嵌合分子，或实施方案16-54中任一例的前药。
57.一个或多个表达载体，其包含实施方案55或56中的一个或多个多核苷酸。
58.用实施方案57的载体转染的宿主细胞。
59.实施方案58的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有一个或多个敲除编码uPA，MMP-2和/或MMP-9的基因。
60.一种生产实施方案1-11中任一所述突变IL-2，实施方案12-15中任一所述嵌合分子，或实施方案16-54中任一所述前药的方法，其包括培养实施方案58或59中的宿主细胞。
61.一种药物成分包含实施方案1-11中任一例的突变IL-2，或实施方案16-54中任一例的前药作为活性成分。
62.一种药物成分包含实施方案12-15中任一例的嵌合分子作为活性成分。
63.一种于有需要的人给药对象中治疗乳腺癌，肺癌，胰腺癌，食道癌，甲状腺髓样癌，卵巢癌，子宫癌，前列腺癌，睾丸癌，结肠癌，直肠癌或胃癌或传染病的方法，其包括对人给药对象施用实施方案61或62中所述药物成分。
为了本发明可被更好地理解，于此阐述以下示例。这些示例仅出于说明目的，而不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
下述实施例1-6中研究使用的材料和方法。
HEK293细胞的瞬时转染
使用PEI(聚乙烯亚胺)将表达质粒以2.5-3μg/ml共转染到3 x 106细胞/ml的自由式HEK293细胞中。对于基于Fc的IL-2前药，Fc-IL-2突变蛋白融合多肽和Fc-掩蔽部分融合多肽的比例为1∶2。对于基于抗体的IL-2前药，knob重链(包含IL-2激动剂多肽)和hole重链(包含掩蔽部分)与轻链DNA的摩尔比为2∶1∶2。转染后6天，通过在9,000rpm下离心45分钟，而后0.22μM过滤，来收获细胞培养物。
蛋白质纯化
基于抗体的IL-2前药的蛋白质纯化，通过使用三个色谱步骤来实践，包括：1)蛋白质A亲和色谱；2)Q SepharoseFastFlow和3)Capto MMC ImpRes。Q FF经由含有25mM Tris和100mM NaCl(pH 7.5)的缓冲液进行平衡。Capto MMC ImpRes则使用缓冲液A(20mM磷酸盐，30mM NaCl，pH 6.2)平衡，并使用10CV的缓冲液B(20mM磷酸盐，0.5M精氨酸，pH 6.2)进行线性梯度洗脱。
SEC-HPLC分析
SEC-HPLC的分析乃是使用配置有订自Tosoh Bioscience的TSKgel G3000SWXL色谱柱(7.8mmIDX 30cm，粒径5μm)的Agilent 1100系列HPLC系统进行。上样至多100μl，色谱柱的运行是用含有200mM K3PO4、250mM KCl，pH 6.5的缓冲液，流速为0.5ml/min，该柱在室温下运行。蛋白质洗脱于220nm和280nm监测。
SDS-PAGE分析
将10μl培养物上清液或20μg纯化的蛋白样品与具有或不具有还原剂的BoltTMLDS样品缓冲液(Novex)混合。样品于70℃加热3分钟，然后加载到NuPAGETM 4-12％BisTris凝胶(Invitrogen)上。该凝胶在NuPAGETM MOPS SDS运行缓冲液(Invitrogen)中以200伏特运行40分钟，然后使用考马斯染色。
蛋白水解处理
蛋白酶，人u-纤溶酶原激活剂(uPA)/尿激酶(R&Dsystems或人Matriptase/ST14(R&Dsystems))分别以81nM和250nM添加至前体分子，并置于37℃下过夜。
CTLL2试验
CTLL2细胞在辅有L-谷氨酰胺，10％胎牛血清，10％非必需氨基酸，10％丙酮酸钠和55μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中生长。CTLL2细胞为非粘附性，其应于含100ng/mlIL-2的培养基中维持在5 x 104-1 x 106细胞/ml的密度。通常，细胞每周分裂两次。如用于生物测定，最好在传代后至少48小时内使用细胞。
在96孔板中以50μl每孔将样品以2x浓度稀释。于12个孔中，将IL-2标准品从20ng/ml(2倍浓度)滴定至3x连续稀释。适当地对样品进行滴定度测试。将CTLL2细胞洗涤5次以去除IL-2，而后以50μl将5000个细胞分配至每孔中，并与样品培养过夜或至少18小时。随后，每孔加入100μl的Cell Titer Glo试剂(Promega)并测量发光度。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
PBS中的10μg/ml IL-2蛋白以100μl每孔接种到96孔板上，并在4度下包被过夜。用PBS洗涤各孔3次，并使用100μl的12％乳/PBS封闭1小时。而后再以PBS将孔洗涤3次，并向其中添加100μl的3倍连续稀释度的蛋白质样品，置于室温下1小时。在以PBS洗涤3次之后，加入100μlHRP偶联的anti-IgG抗体，并放至室温下1小时。随后，再次用PBS将孔洗涤3次，添加检测试剂并测量OD450nm。
FACS分析
培养表达IL-2Rαβγ或IL-2Rβγ的稳定HEK 293细胞系。用非酶细胞解离溶液使细胞脱壁。计数细胞，并用FAGS洗涤缓冲液将细胞密度调整至约3百万个细胞每毫升，该缓冲液于PBS中包含的3％FBS。将50μl的细胞(150,000个细胞)添加到96孔板的各孔中。将第一抗体或表达目的抗体的上清液以预定的浓度添加至细胞中，并将孔板置于冰上1小时。之后使用FAGS洗涤缓冲液洗涤孔板3次。将荧光偶联的第二抗体添加到细胞中(浓度取决于制造说明)，并将孔板置于冰上1小时。再次洗涤孔板，添加0.1μg/ml的PI染色溶液，并将孔板置于冰上10分钟。之后使用流式细胞仪测量细胞荧光。
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
分析了Claudin18.2抗体，具ADCC增强的Claudin18.2抗体，和Claudin18.2抗体-IL-2样品，对稳定表达人CLD18.2或人CLD18.1的HEK293细胞的ADCC诱导能力。
为浓缩人外周血单核细胞，健康供体的人血在磷酸盐缓冲液(PBS)中被稀释了两次，并将血细胞铺在Ficoll(淋巴细胞分离培养基1077g/ml，PAA Laboratories，目录号J15-004)。从相界间收集外周血单核细胞(MNC)，洗涤并重悬于辅有10％热灭活胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。
设置ADCC分析，使用荧光增强配体(BADTA，Perkin Elmer细胞毒性分析试剂盒DELFIA EuTDA细胞毒性试剂，目录号AD0116)标记靶细胞30分钟。在使用辅有10mM丙磺舒(Sigma，目录号P8761)，10-20mM HEPES和10％热灭活胎牛血清的RPMI-10中彻底洗涤后，将细胞密度调至1×105细胞每毫升。将标记的靶细胞，效应细胞(MNC)和含有已调整至10μg/ml浓度的单克隆抗体的上清液添加到圆底微量滴定板中。对于分离的效应细胞，使用100∶1的效应物与靶标(E∶T)比例(未显示50∶1和25∶1的数据)。在37℃下温育2小时后，通过离心终止测定，并于时间分辨荧光计中以铕计数测量重复样品的荧光配体释放。细胞毒性百分比使用以下公式计算：特异性裂解％(实验释放计数-自发释放计数)/(最大释放计数-自发释放计数)×100，其中该荧光配体最大释放的测定是通过添加Triton X-100(0.25％最终浓度)至靶细胞，而自发释放则是在没有抗体和效应细胞的情况下测量。
同源肿瘤模型的体内功效研究
对六周大的Balb/c小鼠(Taconic Biosciences)经皮下注射入1 X 106 CT26/18.2细胞。7天后，使用数字卡尺测量肿瘤并计算肿瘤体积(V＝(ab2)p/6，其中b是所测量的二维尺寸中的较短者)。之后将小鼠随机分为治疗组，以使所有组的平均肿瘤大小均大致相同(127.6mm3)。然后通过腹腔注射100μl的10mg/Kg安慰剂或测试物品以治疗小鼠。于第7、9、11、13、15和18天进行给药，每2-3天测量一次肿瘤，当肿瘤达到2000mm3时就牺牲小鼠。
实施例1：突变IL-2激动剂多肽的表达和测试
人IL-2(SEQ ID NO：1)是具有133个氨基酸的多肽。许多突变人IL-2激动剂多肽被表达为融合分子的一部分，并对其生物活性进行了测试(表2)。配对多肽，如有，亦于此显示。
表2.选择的突变IL-2激动剂多肽融合体
Figure GDA0002842149240000341
Figure GDA0002842149240000351
序列：SEQ ID NO。HSA：人血清白蛋白。N-HSA：载体HSA位于IL-2多肽的N-末端；N-Fc：载体Fc位于IL-2多肽的N-末端。C-Fc：载体Fc位于IL-2多肽的C-末端。
通过SDS-PAGE测试表达的IL-2多肽(图1)。使用上述基于CTLL2细胞的活性试验以测试其生物活性。如图2B所示，具有IL-2突变蛋白T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/A73T(SEQID NO：135)和T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/E62A(SEQ ID NO：132)的两个Fc融合蛋白在基于细胞的测定之中表现相似活性，其EC50约为60nM，而具有IL-2突变蛋白T3A/C125S/K35N/R38S/F42A/Y45A/A73T(SEQ ID NO：136)的Fc融合蛋白显示较低的活性，其EC50约为140nM。具有IL-2突变蛋白T3A/C125S/R38S/F42R/Y45K/E62A(SEQ ID NO：133)的Fc融合蛋白显示约87nM的EC50(数据未显示)。具有IL-2突变蛋白T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/E62A(SEQ IDNO：137)的Fc融合蛋白，此蛋白在IL-2突变蛋白与Fc之间没有连接肽，而其EC50约为72nM(数据未显示)。图2C显示具有IL-2突变蛋白T3A/C125S/F42A/Y45A/L72G(SEQ ID NO：126)和T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/E62A(SEQ ID NO：127)的两个人白蛋白融合蛋白表现相似的基于细胞的活性，其EC50分别约为77nM和76nM。
这些结果表明，向IL-2突变蛋白中引入另外的A73T突变对IL-2活性具有与E62A突变相似的作用。通常，SEQ ID NO：135、132、126和127所示的IL-突变蛋白具有相似的基于细胞的活性，其显着低于野生型IL-2的活性。据推测这是由于突变蛋白与IL-2Rα的结合显着降低或消除了。如图8所示(亦参阅下文)，具有T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/E62A(SEQ IDNO：132)突变的IL-2突变蛋白具有显着降低的IL-2Rα结合亲和力。另外，A73T和K35N额外两个突变的引入进一步降低了IL-2突变蛋白的活性。
我们亦注意到，位置126处的其他突变导致基于细胞的活性水平进一步显着降低，尽管它们仍然具有某些IL-2活性，如IL-2突变蛋白T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/E62A/Q126W(SEQ ID NO：130)和T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/E62A/Q126W(无连接体)(SEQ IDNO：129)(图2C)所示。
实施例2：IL-2拮抗剂或掩蔽部分的设计
为了构建IL-2的前药平台，我们使用人IL-2受体β亚基和γ亚基设计了各种IL-2拮抗剂(掩蔽)。表3列出了示例性的掩蔽设计，其中包括：
1)IL-2Rβ亚基胞外域的单拷贝，其通过含有一个蛋白酶底物肽(SEQ ID NO：195)的可切割连接肽(GGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNHGGGGS；SEQ ID NO：18)与Fc片段的C末端融合；
2)IL-2Rβ亚基胞外域的拷贝与一IL-2Rgamma亚基胞外域的拷贝融合，其通过包含两个蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：196)的可切割连接肽(GGGGSGGGGSGGGGSISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNHGGGGS；SEQ ID NO：38)融合到Fc的C末端；
3)IL-2Rβ亚基胞外域的单拷贝，其通过可切割连接体SEQ ID NO：38(SEQ ID NO：197)与Fc的C末端融合；
4)IL-2Rβ亚基胞外域的两个拷贝彼此连接，其通过可切割的连接体SEQ ID NO：38(SEQ ID NO：198)与Fc的C末端融合，其中下划线表示的是蛋白酶底物序列。
表3.IL-2拮抗剂或掩蔽的设计
Figure GDA0002842149240000361
Figure GDA0002842149240000371
SEQ：SEQ ID NO.
在这些掩蔽多肽中使用的Fc片段包含“hole”Y407T突变。IL-2突变蛋白与包含“knob”T366Y突变的Fc片段融合。
IL-2前药的设计显示在表4中。每个所述前药包含与Fc的C-末端融合的IL-2激动剂多肽(SEQ ID NO：132、133或136)，而其前药是与Fc-掩蔽融合多肽(SEQ ID NO：195、196、197或198)的其中之一共同表达。
表4.IL-2前药的设计
Figure GDA0002842149240000372
前药经由蛋白酶，人u-纤溶酶原激活剂(uPA)/尿激酶或人Matriptase/ST14处理。数据表明，蛋白酶处理导致CTLL2试验中IL-2功能达0.5到22倍的活化(表4)。结果表明，IL-2Rβ胞外域和IL-2Rβ胞外域的二聚体皆可作为IL-2激动剂多肽的掩蔽。具有一个或两个可切割位点的可切割连接肽均起到作用。我们注意到，同时包含IL-2Rβ和γ亚基胞外域的掩蔽无法很好地表达。
实施例3：掩蔽部分的优化
为了发现在蛋白酶切割时，具有更高的活化倍数的IL-2拮抗剂或掩蔽的改进形式，于是构建了IL-2Rβ胞外域中的许多突变。该构建体在HEK293细胞中表达为同型二聚体，而通过上述ELISA方法所测得的与IL-2结合亲和力则如表5所示。在ELISA试验中，具有R15Y(SEQ ID N0：199)，V75Q(SEQ ID NO：202)或V75F(SEQ ID NO：203)单突变的IL-2Rβ胞外域完全失去了与IL-2的结合亲和力。具S69H(SEQ ID NO：201)或E136Q(SEQ ID NO：204)单一突变的IL-2Rβ胞外域在pH 7.4时失去了与IL-2的结合活性，但在pH 6.4下却显示出了比两倍更好的对IL-2结合亲和力(表5)。具有E136Q/H138R(SEQ ID NO：205)双突变的IL-2Rβ胞外域在pH 7.4时对IL-2的结合亲和力与野生型相似，但在pH 6.4时其与IL-2的结合亲和力则增强了两倍(表5)。具有D68E(SEQ ID NO：200)突变的IL-2Rβ胞外域在pH 7.4和pH 6.4下均显示出增加了两倍的IL-2结合亲和力(表5)。
表5.IL-2Rβ突变的设计及其对IL-2的结合亲和力
Figure GDA0002842149240000381
“-”：无或极小结合
示例4：以抗体分子为载体的IL-2前药
将细胞因子多肽与抗体融合可允许将细胞因子靶向传递至疾病部位。然而，如果免疫细胞上有高亲和力的细胞因子受体，则会与细胞因子受体的结合方面将存在显著的竞争，而此广泛可见于免疫器官中。在此研究中，对IL-2Rα具明显降低的结合亲和力的IL-2突变蛋白被融合至抗体载体。这种抗体IL-2前药可以在抗体靶向的疾病部位被激活，且可具显着改善的药动学曲线，并增强疾病部位的特异性。
以抗Claudin18.2(589A序列)的抗体和抗PD-L1(阿妥珠单抗)的抗体为例来证明新型IL-2前药平台的可行性。基于抗体的前药结构于图3中示出。表6列出了589A-IL-2-掩蔽融合分子的不同组合设计。
表6.589A-IL-2前药的设计
Figure GDA0002842149240000391
HC：重链。LC：轻链。序列：SEQ ID NO。
超过80％的589A-IL-2A分子在没有蛋白酶处理的情况下被切割，这可能是由于蛋白酶存在于细胞中，或蛋白酶在细胞培养期间由细胞分泌(图4)。具有不可切割的连接体[(GGGGS)3](SEQ ID NO：49)的589A-IL-2B在CTLL2试验中显示出异四聚体抗体的稳定组装，并且没有显示刺激的活性(图4，表7))。该数据表明掩蔽部分作为IL-2拮抗剂的有效性。589A-IL-2C分子被正确地组装并显表现出对IL-2突变蛋白活性的38倍抑制(图4和表7)。589A-IL-2E和589A-IL-2F分子的被组装的更加稳定，并且对IL-2突变蛋白活性表现出超过4，000倍的抑制作用(图4和表7)。可能是由于掩蔽突变蛋白D68E的亲和力更高，因此与589A-IL2-F相比，589A-IL-2E在生产过程中展现出更好的前药稳定性(图4)。
表7.589A-IL-2前药的CTLL2活性
Figure GDA0002842149240000401
在单独的实验中，在蛋白酶处理后，新一批的589A-IL-2E对于HEK293-IL-2Rαβγ和HEK293-IL-2Rβγ细胞系的结合增加了约10至20倍(图6)。此外，589A-IL-2E对于HEK293-IL-2Rαβγ和HEK293-IL-2Rβγ皆有相似的结合，这说明了α亚基对于IL-2突变蛋白的结合并没有太大贡献，而具有T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/E62A突变的IL-2突变蛋白则对IL-2Rα有明显降低的结合亲和力(图7A和B)。
表8列出了anti-PD-L1-IL-2前药的设计。
表8.抗PD-L1-IL-2前药的设计
Figure GDA0002842149240000402
Figure GDA0002842149240000411
anti-PD-L1-IL-2A分子在其可切割的连接肽处具有两个切割位点，并且在HEK293中的表达期间显示出条带的切割，这可能是由于在细胞培养基或细胞中蛋白酶的存在(数据未显示)。anti-PDL1-IL-2B显示异四聚体分子的正确组装，且其纯化样品在蛋白酶切割后显示出显着的活化(图8)。anti-PD-L1-IL-2C，anti-PD-L1-IL-2D和anti-PD-L1-IL-2E未被正确组装，而形成了HC-IL-2的同型二聚体(数据未显示)，且其在CTLL2试验中并未显示出对IL-2活性的抑制。这些数据意味着，较短的切割连接体可能会干扰正确的异四聚体分子的形成。
示例5：589A-IL-2突变蛋白融合分子的ADCC活性
如上所述，在ADCC试验中测试了anti-Claudin18.2抗体589A，589A的非糖基化形式(af-589A)以及IL-2突变蛋白与af-589A的融合体的体外活性。Af-589A的N-聚糖中无或几乎没有岩藻糖，而其具增强的ADCC功能。IL-2突变蛋白含有T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/E62A(SEQ ID NO：10)的突变。数据表示出，向589A抗体中添加IL-2突变蛋白进一步增强了其ADCC活性(图9)。
示例6：589A-IL-2前药的体内功效
体内抗癌功效研究是以589A-IL-2E结合anti-PD-L1抗体进行。所述前药和PD-L1抗体每隔一天以10mg/kg皮下给药。将以人Claudin18.2转染的CT26小鼠肿瘤细胞接种到Balb/c小鼠中。当肿瘤大小达到大约100mm3时，根据小鼠的肿瘤大小将其随机分为三组。每只小鼠经皮下注射接受缓冲剂安慰剂(组1)(图10，左上图)，10mg/kg的anti-PD-L1抗体(组2)(图10，右上图)或10mg/kg的anti-PD-L1抗体加上10mg/kg的589A-IL-2E前药(组3)(图10，底部)。给药于第7、9、11、13、15和18天进行。在研究过程中对肿瘤的大小和体重进行监测。
如图10所示，与安慰剂和PD-L1抗体组相比，同时施用前药和抗体的治疗组具有更均一的肿瘤大小。如图11所示，同时施用前药和PD-L1抗体的治疗组，直到大约第35天其肿瘤生长最慢，而存活曲线直到第42天才交叉(图12)。治疗于第18天停止。不希望受到理论束缚，我们认为与PD-L1抗体组发生交叉转换的潜在原因之一是由于小鼠为野生型，所以其可能会产生针对589A-IL-2E对抗体。589A乃是衍生白兔B细胞克隆的人源化抗体。
上述非限制性示例仅出于说明性目的而提供，以便于更全面地理解所公开的主题。这些示例不应被解释为限制本说明书中描述的任何实施方案，包括那些涉及抗体，药物成分，或用于治疗癌症，神经变性或感染性疾病的方法和用途的实施方案。
序列
于下面的序列中，带框的残基表示突变。可切割连接体上的下划线表示蛋白酶底物序列。
SEQ ID NO：1-人IL-2
Figure GDA0002842149240000431
SEQ ID NO：2-人IL-15
Figure GDA0002842149240000432
SEQ ID NO：3-人IL-2受体β亚基胞外域(https://www.uniprot.org/uniprot/P14784)
Figure GDA0002842149240000433
SEQ ID NO：4-人IL-2受体β亚基胞外域突变D68E
(https://www.uniprot.org/uniprot/P14784)
Figure GDA0002842149240000434
SEQ ID NO：5-人IL-2受体β亚基胞外域突变E136Q/H138R
(https://www.uniprot.org/uniprot/P14784)
Figure GDA0002842149240000435
SEQ ID NO：6-人IL-2受体Gamma亚基胞外域(http://www.uniprot.org/uniprot/P31785)
Figure GDA0002842149240000436
SEQ ID NO：7-IL15受体α亚基Sushi结构域
Figure GDA0002842149240000437
SEQ ID NO：8-IL-2激动剂多肽
Figure GDA0002842149240000438
其中Xaa3为N或A；其中Xaa 125为C或S；其中Xaa35选自K和N；其中Xaa42选自A，G，S，T，Q，E，N，D，R和K；其中Xaa45选自A，G，S，T，Q，E，N，D，R和K；其中Xaa72选自A，G，S，T，Q，E，N，D，R和K；并且其中Xaa73选自A和T。
SEQ ID NO：9-具有L72G的IL-2激动剂多肽
Figure GDA0002842149240000441
SEQ ID NO：10-具有T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000442
SEQ ID NO：11-具有C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000443
ID NO：12-具有T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62L的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000444
SEQ ID NO：13-具有T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62L/E68V的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000445
SEQ ID NO：14-具有T3A/C125S-R38S/F42I/Y45A/E62A的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000446
SEQ ID NO：15-具有T3A/C125S-R38S/F42K/Y45A/E62A的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000447
SEQ ID NO：16-具有T3A/C125S-R38S/F42K/Y45N/E62A的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000448
SEQ ID NO：17-具有T3A/C125S-R38S/F42A/Y45R/E62A的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000449
SEQ ID NO：18-可切割的连接体
Figure GDA00028421492400004411
SEQ ID NO：19-具有T3A/C125S-R38S/F42K/Y45A/E62A/E68V的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA00028421492400004410
SEQ ID NO：20-具有T3A/C125S-R38S/F42A/Y45N/E62A/E68V的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000451
SEQ ID NO：21-具有T3A/C125S-R38S/F42A/Y45R/E62A/E68V的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000452
SEQ ID NO：22-具有T3A/R38S/F42A/Y45A/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000453
SEQ ID NO：23-具有T3A/K35N/R38S/F42A/Y45A/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000454
SEQ ID NO：24-具有T3A/R38S/F42I/Y45A/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000455
SEQ ID NO：25-具有T3A/K35N/R38S/F42I/Y45A/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000456
SEQ ID NO：26-具有T3A/R38S/F42K/Y45A/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000457
SEQ ID NO：27-具有T3A/K35N/R38S/F42K/Y45A/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000458
SEQ ID NO：28-具有T3A/R38S/F42A/Y45N/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000459
SEQ ID NO：29-具有T3A/R38S/F42A/Y45R/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA00028421492400004510
SEQ ID NO：30-具有T3A/R38S/F42A/Y45A/E62A/C125S/Q126W的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000461
SEQ ID NO：31-具有T3A/R38S/F42K/Y45A/E62A/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000462
SEQ ID NO：32-具有T3A/R38S/F42A/Y45N/E62A/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000463
SEQ ID NO：33-具有T3A/R38S/F42A/Y45R/E62A/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000464
SEQ ID NO：34-可切割的连接肽
Figure GDA0002842149240000465
SEQ ID NO：35-cleavable peptide linkerSEQ ID NO：35-可切割的连接肽
Figure GDA0002842149240000466
SEQ ID NO：36-具有T3A/K35N/R38S/F42A/Y45N/A73T/C125S的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000467
SEQ ID NO：37-IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000468
SEQ ID NO：38-可切割的连接体
Figure GDA0002842149240000469
SEQ ID NO：39-IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA00028421492400004610
SEQ ID NO：40-IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA00028421492400004611
SEQ ID NO：41-IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000471
SEQ ID NO：42-IL-2agonist polypeptide mutein with Q126WSEQ ID NO：42-具有Q126W的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000472
SEQ ID NO：43-具有T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/E62A/N88A/Q126H的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000473
SEQ ID NO：44-具有T3A/C125S/R38S/F42A/Y45A/E62A/Q126A的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000474
SEQ ID NO：45-具有Q126W的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000475
SEQ ID NO：46-具有Q126W的IL-2激动剂多肽突变蛋白
Figure GDA0002842149240000476
SEQ ID NO：47-51连接肽
GGGGS(SEQ ID NO：47)
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：48)
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：49)
GGGGSGGGGXGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：50)，X＝A or N
GGGGSGGGGXGGGGYGGGGS(SEQ ID NO：51)，X＝S，A or N，and Y＝A or N
SEQ ID NO：52-121-可切割的连接肽
LSGRSDNH(SEQ ID NO：52)
ISSGLLSS(SEQ ID NO：53)
GPLGVR(SEQ ID NO：54)
SGRSA(SEQ ID NO：55)
GGGGSISSGLLSSGGSGGSLGGSGRSANAILEGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)
GGGGSISSGLLSSGGSLGGSGRSANAILEGGGGS(SEQ ID NO：57)
GGGGSLGGSGRSANAILEGGSGGSISSGLLSSGGGGS(SEQ ID NO：58)
GGGGSLGGSGRSANAILEGGSISSGLLSSGGGGS(SEQ ID NO：59)
GGGGSLGGSGRSANAILEGGSGGSISSGLLSSGGGGSGGGGS(SEO ID NO：60)
GGGGSLGGSGRSANAILEGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：61)
GGGGSGGGGSGGGGSISSGLLSSGGGGS(SEQ ID NO：62)
GGGGSLSGRSDNHGGGGS(SEQ ID NO：63)
(GGGGS)nGGWHTGRN(GGGGS)m(SEQ ID NO：64)
(GGGGS)nTGRGPSWV(GGGGS)m(SEQ ID NO：65)
(GGGGS)nSARGPSRW(GGGGS)m(SEQ ID NO：66)
(GGGGS)nTARGPSFK(GGGGS)m(SEQ ID NO：67)
(GGGGS)nTARGPSW(GGGGS)m(SEQ ID NO：68)
(GGGGS)nLSGRSDNH(GGGGS)m(SEQ ID NO：69)
(GGGGS)n LGGSGRSANAILEGPLGVR(GGGGS)m(SEQ ID NO：70)
(GGGGS)n LGGSGRSANAILEGGSGPLGVR(GGGGS)m(SEQ ID NO：71)
(GGGGS)n LGGSGRSANAILEGGSGGSGPLGVR(GGGGS)m(SEQ ID NO：72)
(GGGGS)n ISSGLLSSLSGRSDNH(GGGGS)m(SEQ ID NO：73)
(GGGGS)n ISSGLLSSGGSLSGRSDNH(GGGGS)m(SEQ ID NO：74)
(GGGGS)n ISSGLLSSGGSGGGSLSGRSDNH(GGGGS)m(SEQ ID NO：75)
wherein n＝0，1，2，3，or 4；and whereinm＝0，1，2，3，or 4
VNGGGGSGPLGVRAAQPA(SEQ ID NO：76)
GGGGSGPLGVRGGGGS(SEQ ID NO：77)
GGGGSGPLGVRGGS(SEQ ID NO：78)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 PLGL(GGGGS)n3(SEQ ID NO：79)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 HTGRSGAL(GGGGS)n3(SEQ ID NO：80)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 PLTGRSGG(GGGGS)n3(SEQ ID NO：81)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 AARGPAIH(GGGGS)n3(SEQ ID NO：82)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 RGPAFNPM(GGGGS)n3(SEQ ID NO：83)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 SSRGPAYL(GGGGS)n3(SEQ ID NO：84)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 RGPATPIM(GGGGS)n3(SEQ ID NO：85)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 RGPA(GGGGS)n3(SEQ ID NO：86)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 GGQPSGMWGW(GGGGS)n3(SEQ ID NO：87)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 FPRPLGITGL(GGGGS)n3(SEQ ID NO：88)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 VILMPLGFLGP(GGGGS)n3(SEQ ID NO：89)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 SPLTGRSG(GGGGS)n3(SEQ ID NO：90)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 SAGFSLPA(GGGGS)n3(SEQ ID NO：91)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 LAPLGLQRR(GGGGS)n3(SEQ ID NO：92)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 SGGPLGVR(GGGGS)n3(SEQ ID NO：93)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 GPLGVR(GGGGS)n3(SEQ ID NO：94)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 ISSGLLSS(GGGGS)n3(SEQ ID NO：95)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 QNQALRMA(GGGGS)n3(SEQ ID NO：96)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 AQNLLGMV(GGGGS)n3(SEQ ID NO：97)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 STFPFGMF(GGGGS)n3(SEQ ID NO：98)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 PVGYTSSL(GGGGS)n3(SEQ ID NO：99)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 DWLYWPGI(GGGGS)n3(SEQ ID NO：100)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 MIAPVAYR(GGGGS)n3(SEQIDNO：101)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 RPSPMWAY(GGGGS)n3(SEQID NO：102)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 WATPRPMR(GGGGS)n3(SEQ ID NO：103)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 FRLLDWQW(GGGGS)n3(SEQID NO：104)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 LKAAPRWA(GGGGS)n3(SEQID NO：105)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 GPSHLVLT(GGGGS)n3(SEQID NO：106)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 LPGGLSPW(GGGGS)n3(SEQIDNO：107)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 MGLFSEAG(GGGGS)n3(SEQ ID NO：108)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 SPLPLRVP(GGGGS)n3(SEQ ID NO：109)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 RMHLRSLG(GGGGS)n3(SEQID NO：110)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 LAAPLGLL(GGGGS)n3(SEQID NO：111)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 AVGLLAPP(GGGGS)n3(SEQID NO：112)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 LLAPSHRA(GGGGS)n3(SEQIDNO：113)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 PAGLWLDP(GGGGS)n3(SEQID NO：114)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 ISSGLSS(GGGGS)n3(SEQ ID NO：115)
(GGGGS)n1 ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(GGGGS)n3(SEQ ID NO：116)
(GGGGS)n1 LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(GGGGS)n3(SEQ ID NO：117)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 LSGRSDNH(GGGGS)n3(SEQ ID NO：118)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 TARGPSFK(GGGGS)n3(SEQ ID NO：119)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 TARGPSW(GGGGS)n3(SEQ ID NO：120)
(GGGGS)n1(QGQSGQ)n2 GGWHTGRN(GGGGS)n3(SEQ ID NO：121)
wherein n1＝0，1，2，3，or 4；n2＝0 or 1；and n3＝0，1，2，3，or 4
SEQ ID NO：122-人IL-7氨基酸序列
Figure GDA0002842149240000491
SEQ ID NO：123-人CCL19氨基酸序列
Figure GDA0002842149240000492
SEQ ID NO：124-人白蛋白
Figure GDA0002842149240000493
SEQ ID NO：125-具有增强的FCRN结合亲和力的人白蛋白(K573P)
Figure GDA0002842149240000494
SEQ ID NO：126-人白蛋白-IL-2-T3A/C125S-F42A/Y45A/L72G
Figure GDA0002842149240000495
Figure GDA0002842149240000501
SEQ ID NO：127-人白蛋白-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A
Figure GDA0002842149240000502
SEQ ID NO：128-人白蛋白-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A/N88A/Q126H
Figure GDA0002842149240000503
SEQ ID NO：129-人白蛋白-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A/Q126W(无连接体)
Figure GDA0002842149240000504
SEQ ID NO：130-人白蛋白-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A/Q126W
Figure GDA0002842149240000505
Figure GDA0002842149240000511
SEQ ID NO：131-人白蛋白-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A/Q126A，无连接体
Figure GDA0002842149240000512
SEQ ID NO：132-IgG1FC(具有LALA and Knob)-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A
Figure GDA0002842149240000513
SEQ ID NO：133-IgG1FC(具有LALA and Knob)-IL-2-T3A/C125S-R38A/F42R/Y45K/E62A
Figure GDA0002842149240000514
SEQ ID NO：134-IgG1FC(具有LALA and Knob)-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A/Q126H
Figure GDA0002842149240000515
SEQ ID NO：135-IgGlFC(具有LALA and Knob)-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/A73T
Figure GDA0002842149240000516
SEQ ID NO：136-IgGlFC(具有LALA and Knob)-IL-2-T3A/C125S-K35N/R38S/F42A/Y45A/A73T
Figure GDA0002842149240000521
SEQ ID NO：137-IgG1FC(具有LALA and Knob)-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42R/Y45A/E62A no linker
Figure GDA0002842149240000522
SEQ ID NO：138人白蛋白-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A/N88A/Q126H具有可切割连接体
Figure GDA0002842149240000523
SEQ ID NO：139-IgG1FC(具有LALA and Knob)-IL-2-T3A/C125S-F42A/Y45A/E62A/N88E
Figure GDA0002842149240000524
SEQ ID NO：140-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A/Q126W-IgG4 Fc
Figure GDA0002842149240000525
SEQ ID NO：141-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A/Q126W-IgG1 Fc同型二聚体
Figure GDA0002842149240000531
SEQ ID NO：142-IgG4 Fc-IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A/Q126A
Figure GDA0002842149240000532
SEQ ID NO：143-IgG1Fc具有YTE/LALA/IL-2 N88A/Q126H/beta/gamma
Figure GDA0002842149240000533
SEQ ID NO：144-IgG1Fc具有YTE/LALA/IL-2/Hole
Figure GDA0002842149240000534
SEQ ID NO：145-IgG1Fc具有YTE/LALA/Knob/beta
Figure GDA0002842149240000535
Figure GDA0002842149240000541
SEQ ID NO：146-IgG1Fc具有YTE/LALA/IL-
Figure GDA0002842149240000542
SEQ ID NO：147-IgG1Fc具有YTE/LALA/IL-2/Knob/Beta/gamma
Figure GDA0002842149240000543
SEQ ID NO：148-曲妥珠单抗轻链
Figure GDA0002842149240000544
SEQ ID NO：149-曲妥珠单抗重链
Figure GDA0002842149240000545
SEQ ID NO：150-利妥昔单抗轻链
Figure GDA0002842149240000546
SEQ ID NO：151-利妥昔单抗重链
Figure GDA0002842149240000547
Figure GDA0002842149240000551
SEQ ID NO：152-布伦妥昔单抗轻链
Figure GDA0002842149240000552
SEQ ID NO：153-布伦妥昔单抗重链
Figure GDA0002842149240000553
SEQ ID NO：154-西妥昔单抗轻链
Figure GDA0002842149240000554
SEQ ID NO：155-西妥昔单抗重链
Figure GDA0002842149240000555
SEQ ID NO：156-帕尼单抗轻链
Figure GDA0002842149240000556
SEQ ID NO：157-帕尼单抗重链
Figure GDA0002842149240000557
SEQ ID NO：158-anti-c-MET抗体轻链
Figure GDA0002842149240000561
SEQ ID NO：159-anti-c-MET抗体重链
Figure GDA0002842149240000562
SEQ ID NO：160-anti-GPC3抗体轻链
Figure GDA0002842149240000563
SEQ ID NO：161-anti-GPC3抗体重链
Figure GDA0002842149240000564
SEQ ID NO：162-anti-Claudin 18.2抗体轻链
Figure GDA0002842149240000565
SEQ ID NO：163-anti-Claudin 18.2抗体重链
Figure GDA0002842149240000566
SEQ ID NO：164-anti-Trop-2抗体轻链CDR1
Figure GDA0002842149240000567
SEQ ID NO：165-anti-Trop-2抗体轻链CDR2
Figure GDA0002842149240000568
SEQ ID NO：166-anti-Trop-2抗体轻链CDR3
Figure GDA0002842149240000571
SEQ ID NO：167-anti-Trop-2抗体重链CDR1
Figure GDA0002842149240000572
SEQ ID NO：168-anti-Trop-2抗体重链CDR2
Figure GDA0002842149240000573
SEQ ID NO：169-anti-Trop-2抗体重链CDR3
Figure GDA0002842149240000574
SEQ ID NO：170-anti-间皮素抗体轻链CDR1
Figure GDA0002842149240000575
ID NO：171-anti-间皮素抗体轻链CDR2DTSKLAS
Figure GDA0002842149240000576
SEQ ID NO：172-anti-间皮素抗体轻链CDR3
Figure GDA0002842149240000577
SEQ ID NO：173-anti-间皮素抗体重链CDR1
Figure GDA0002842149240000578
SEQ ID NO：173-anti-间皮素抗体重链CDR1
Figure GDA0002842149240000579
SEQ ID NO：175-anti-间皮素抗体重链CDR3
Figure GDA00028421492400005710
SEQ ID NO：176-PR1A3的轻链可变域。
Figure GDA00028421492400005711
SEQ ID NO：177-PR1A3的重链可变域。
Figure GDA00028421492400005712
SEQ ID NO：178-人源化轻链可变域PR1A3。
Figure GDA00028421492400005713
SEQ ID NO：179-PR1A3的人源化重链可变域。
Figure GDA00028421492400005714
ID NO：180-anti-FAP版本1LC(蛋白质序列)
Figure GDA0002842149240000581
SEQ ID NO：181-anti-FAP LC版本2(蛋白质序列)
Figure GDA0002842149240000582
SEQ ID NO：182-anti-FAP VH(蛋白质序列)
Figure GDA0002842149240000583
SEQ ID NO：183-FAPalpha抗体BIBH1的人源化轻链可变域
Figure GDA0002842149240000584
SEQ ID NO：184-FAPalpha抗体BIBH1的人源化重链可变域
Figure GDA0002842149240000585
SEQ ID NO：185-人源化H8anti-5T4版本1VH(蛋白质序列)
Figure GDA0002842149240000586
SEQ SEQ ID NO：186-人源化H8anti-5T4 VH版本2(蛋白质序列)
Figure GDA0002842149240000587
SEQ ID NO：187-人源化H8anti-5T4版本1VL(蛋白质序列)
Figure GDA0002842149240000588
SEQ ID NO：188-人源化H8anti-5T4 VL版本2(蛋白质序列)
Figure GDA0002842149240000589
SEQ ID NO：189-anti-PDL1阿妥珠单抗LC
Figure GDA00028421492400005810
Figure GDA0002842149240000591
SEQ ID NO：190-anti-PDL1阿妥珠单抗HC(蛋白质序列)
Figure GDA0002842149240000592
SEQ ID NO：191-与IL-2-T3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A融合的anti-PDL1抗体阿妥珠单抗HC(蛋白质序列)，其中Fc具有T366Y突变
Figure GDA0002842149240000593
SEQ ID NO：192-具有(Y407T)和2xbeta(孔)的anti-PDL1阿妥珠单抗HC
Figure GDA0002842149240000594
SEQ ID NO：193-anti-PDL1抗体阿妥珠单抗HC通过可切割的连接肽与IL-2Rbeta融合，其中其Fc包含Y407T突变
Figure GDA0002842149240000595
Figure GDA0002842149240000601
SEQ ID NO：194-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)
Figure GDA0002842149240000602
SEQ ID NO：195-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)，具有β亚基
Figure GDA0002842149240000603
SEQ ID NO：196-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)，具有β亚基和γ亚基
Figure GDA0002842149240000604
SEQ ID NO：197-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)，具有β亚基-两个可切割底物
Figure GDA0002842149240000605
SEQ ID NO：198-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)，具有IL-2Rbeta亚基的二聚体
Figure GDA0002842149240000606
Figure GDA0002842149240000611
SEQ ID NO：199-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)，其融合了包含R15Y突变的β亚基
Figure GDA0002842149240000612
SEQ ID NO：200-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)，其融合了有含突变的β亚基(D68E)
Figure GDA0002842149240000613
SEQ ID NO：201-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)，其融合了包含突变的β亚基(S69H)
Figure GDA0002842149240000614
SEQ ID NO：202-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)，其融合了包含突变的β亚基(V75Q)
Figure GDA0002842149240000615
SEQ ID NO：203-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)，其融合了包含突变的β亚基(V75F)
Figure GDA0002842149240000616
Figure GDA0002842149240000621
SEQ ID NO：204-具有LALA和hole突变的Fc(L234A-L235A-Y407T)，其融合了包含突变的β亚基(E136Q)
Figure GDA0002842149240000622
SEQ ID NO：205-具有LALA和hole突变的anti-PDL1阿妥珠单抗HC(L234A-L235A-Y407T)，其融合了包含突变的β亚基(E136Q/H138R)
Figure GDA0002842149240000623
SEQ ID NO：206-具有hole突变的anti-PDL1阿妥珠单抗HC(Y407T)-具有beta，单个可切割位点(带下划线)
Figure GDA0002842149240000624
SEQ ID NO：207-具有hole突变的anti-PDL1阿妥珠单抗HC(Y407T)-具有beta，单个可切割位点(带下划线)
Figure GDA0002842149240000625
Figure GDA0002842149240000631
SEQ ID NO：208-具有hole突变的anti-PDL1阿妥珠单抗HC(Y407T)-具有betaD68E(带框)，单个可切割位点(带下划线)
Figure GDA0002842149240000632
SEQ ID NO：209-589A人源化重链(HC)-knob突变(带框)-IL2 T-3A/C125S-R38S/F42A/Y45A/E62A(带下划线)，连接体(斜体)
Figure GDA0002842149240000633
SEQ ID NO：210-589A-人源化HC-hole突变(带框)-具有胞外域的Beta亚基，也称为“beta”(带下划线)，可切割(可切割的连接体为斜体)
Figure GDA0002842149240000634
SEQ ID NO：211-589A-人源化HC-hole突变(带框)-Beta(带下划线)，不可切割
Figure GDA0002842149240000635
Figure GDA0002842149240000641
SEQ ID NO：212-589A-人源化HC孔突变(带框)-具有Beta(带下划线)，单个可切割位点(带下划线和斜体)
Figure GDA0002842149240000642
SEQ ID NO：213-589A-人源化HC-hole突变(带框)-Beta(带下划线)，单个可切割位点2(带下划线和斜体)
Figure GDA0002842149240000643
SEQ ID NO：214-589A-人源化HC-hole-具有Beta(带下划线)，单个可切割位点(带下划线和斜体)/较短的连接体(斜体)
Figure GDA0002842149240000644
SEQ ID NO：215-589A-人源化HC-Hole突变(带框)-具有Beta(带下划线)，单个可切割位点/较短连接体(带下划线和斜体)/β突变D68E(带框，下划线和粗体)
Figure GDA0002842149240000645
Figure GDA0002842149240000651
SEQ ID NO：216-589A人源化LC-589A LC
Figure GDA0002842149240000652
SEQ ID NO：217-可切割的连接肽
Figure GDA0002842149240000653

Claims (50)

1.一种前药，其包含细胞因子部分，掩蔽部分和载体部分，其中
掩蔽部分与细胞因子部分结合并抑制细胞因子部分的一种生物学活性，
细胞因子部分与载体部分融合，并且
掩蔽部分通过可切割的连接肽与细胞因子部分或与载体部分融合。
2.如权利要求1所述的前药，其中所述掩蔽部分包含细胞因子部分受体的细胞外结构域(ECD)。
3.如权利要求1或2所述的前药，其中所述细胞因子部分是野生型人细胞因子或其突变蛋白。
4.如权利要求3所述的前药，其中所述细胞因子部分是人IL-2激动剂多肽。
5.如权利要求4所述的前药，其中所述人IL-2激动剂多肽包含SEQ ID NO：1或与SEQ IDNO：1至少90％相同的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的前药，其中所述人IL-2激动剂多肽包含一个或多个选自T3，K35，R38，F42，Y45，E62，E68，L72，A73，N88，C125，和Q126(根据SEQ ID NO：1编号)位置上的突变。
7.如权利要求6所述的前药，其中所述人IL-2激动剂多肽包含选自SEQ ID NO：8-17、19-33、36、37和39-46的氨基酸序列。
8.如权利要求4-7中任一项所述的前药，其中所述掩蔽部分包含人IL-2Rβ的ECD或其功能类似物。
9.如权利要求8所述的前药，其中所述掩蔽部分包含(i)人IL-2Rβ的ECD的两个拷贝，或其通过连接肽融合在一起的功能类似物，或(ii)ECD人IL-2Rβ，或通过连接肽与人IL-2Rγ的ECD融合的功能类似物，或通过连接肽的其功能类似物。
10.如权利要求9所述的前药，其中人IL-2Rγ的ECD或其功能类似物包含SEQ ID NO：6，或与SEQ ID NO：6至少90％相同的氨基酸序列。
11.如权利要求8-10中任一项所述的前药，其中人IL-2Rβ的ECD或其功能类似物包含SEQ ID NO：3、4或5，或至少是SEQ ID NO：3、4或5的90％的氨基酸序列。
12.如权利要求3所述的前药，其中所述细胞因子部分是人IL-15激动剂多肽。
13.如权利要求12所述的前药，其中所述人IL-15激动剂多肽包含SEQ ID NO：2或与SEQID NO：2至少90％相同的氨基酸序列。
14.如权利要求12或13所述的前药，其中所述IL-15激动剂多肽包含(i)包含SEQ IDNO：7的IL-15Rαsushi结构域，或(ii)与SEQ ID NO：7至少90％相同的氨基酸序列。
15.如权利要求12-14中任一项所述的前药，其中所述掩蔽结构域包含人IL-2Rβ的ECD或其功能类似物，或IL-2Rγ或其功能类似物。
16.如权利要求15所述的前药，其中所述掩蔽结构域包含SEQ ID NO：3、4、5或6，或与SEQ ID NO：3、4、5或6至少90％相同的氨基酸序列。
17.如权利要求1-16中任一项所述的前药，其中所述前药进一步包含第二效应子多肽。
18.如权利要求17所述的前药，其中所述第二效应子多肽是(i)包含在位置126(编号根据SEQ ID NO：1)上突变的人IL-2激动剂多肽，或(ii)CCL19多肽，其包含与SEQ ID NO：123至少90％相同的氨基酸序列。
19.前述权利要求中任一项的前药，其中所述细胞因子部分通过不可切割的连接肽与所述载体部分融合。
20.如权利要求19所述的前药，其中所述不可切割的连接肽选自SEQ ID NO：47-51。
21.前述权利要求中任一项的前药，其中所述可切割的连接肽包含尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，基质金属肽酶(MMP)2或MMP9的底物序列。
22.如权利要求21所述的前药，其中所述可切割的连接肽包含以下的底物序列：(i)uPA和MMP2，(ii)uPA和MMP9，或(iii)uPA，MMP2和MMP9。
23.如权利要求21所述的前药，其中所述可切割的连接肽包含选自SEQ ID NO：18、34、35、38、52-121和217的氨基酸序列。
24.前述权利要求中任一项的前药，其中所述可切割的连接肽可被位于肿瘤部位或其周围环境的一种或多种蛋白酶切割，而所述切割导致前药在肿瘤部位或周围环境的活化。
25.前述权利要求中任一项的前药，其中所述载体部分是PEG分子，白蛋白，白蛋白片段，抗体Fc结构域或抗体或其抗原结合片段。
26.如权利要求25中任一项所述的前药，其中所述载体部分是抗体Fc结构域或抗体，包含L234A和L235A突变(“LALA”)(EU编号)。
27.如权利要求25或26所述的前药，其中所述掩蔽部分通过可切割的连接肽与细胞因子部分融合。
28.如权利要求25或26所述的前药，包含knobs-into-holes突变的其中所述载体部分为抗体Fc结构域或抗体，且其中所述细胞因子部分和掩蔽部分与所述抗体Fc结构域的不同多肽链融合，或与抗体的不同重链融合。
29.如权利要求28所述的前药，其中所述细胞因子部分和所述掩蔽部分与所述Fc结构域的两条不同多肽链的C末端或与所述抗体的两条不同重链的C末端融合。
30.如权利要求28所述的前药，其中所述细胞因子部分和所述掩蔽部分与所述Fc结构域的两条不同多肽链的N末端或与所述抗体的两条不同重链的N末端融合。
31.如权利要求28-31中任一项所述的前药，其中所述knobs-into-holes突变包含Fc结构域上多肽链或者是抗体的重链的T366Y“knob”突变，以及Fc结构域上另一个多肽或者是抗体的另一重链的Y407T“hole”突变(EU编号)。
32.如权利要求28-31中任一项所述的前药，其中所述knobs-into-holes突变包括“knobchain”的CH3结构域中Y349C和/或T366W的突变，以及“holechain”的CH3结构域中E356C，T366S，L368A和/或Y407V的突变(EU编号)。
33.如权利要求25所述的前药，其中所述载体部分为包含两个多肽链的抗体Fc结构域，其所述多肽链分别包含一个选自SEQ ID NO：195-198的氨基酸序列，以及一个选自SEQ IDNO：132-137和139的氨基酸序列。
34.如权利要求25-33中任一项所述的前药，其中所述载体部分是一个抗体或一个抗原结合片段，其特异性结合一种或多种选自鸟苷酸环化酶C(GCC)，碳水化合物抗原19-9(CA19-9)，糖蛋白A33(gpA33)，粘蛋白1(MUC1)，癌胚抗原(CEA)，胰岛素样生长因子1受体(IGF1-R)，人表皮生长因子受体2(HER2)，人表皮生长因子受体3(HER3)，δ样蛋白3(DLL3)，δ样蛋白4(DLL4)，表皮生长因子受体(EGFR)，glypican-3(GPC3)，c-MET，血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)，Nectin-4，Liv-1，糖蛋白NMB(GPNMB)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，Trop-2，碳酸酐酶IX(CA9)，内皮素B受体(ETBR)，前列腺1的六种跨膜上皮抗原(STEAP1)，叶酸受体α(FR-α)，SLIT和NTRK样蛋白6(SLITRK6)，碳酸酐酶VI(CA6)，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(ENPP3)，间皮素，滋养层糖蛋白(TPBG)，CD19，CD20，CD22，CD33，CD40，CD56，CD66e，CD70，CD74，CD79b，CD98，CD123，CD138，CD352，CD47，信号调节蛋白α(SIRPα)，PD1，Claudin 18.2，Claudin 6、5T4，BCMA，PD-L1，PD-1，成纤维细胞活化蛋白α(FAPalpha)，黑素瘤相关软骨素硫酸蛋白多糖(MCSP)和EPCAM。
35.如权利要求25所述的前药，其中所述载体部分是包含两条重链及两条轻链的抗体，其两重链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO：209和从SEQ ID NO：210-215中选择的一个，而其两轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：216。
36.如权利要求25所述的前药，其中所述载体部分是包含两条重链及两条轻链的抗体，其两重链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO：191和从SEQ ID NO：192，193和206-208中选择的一个，而其两轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO：189。
37.如权利要求25所述的前药，其中所述载体部分是人血清白蛋白(HSA)。
38.一种IL-2突变蛋白，其包含在位置A73处的突变。
39.一种IL-2突变蛋白，其包含K35N的突变。
40.一种IL-2突变蛋白，其包含SEQ ID NO:23-33,36,37,和39-41中之一。
41.一种药物成分，其包含权利要求1-37中任一项的前药或权利要求38-40中任一项的IL-2突变蛋白，以及药学上可接受的赋形剂。
42.一种或多种多核苷酸，编码权利要求1-37中任一项的前药或权利要求38-40中任一项的IL-2突变蛋白。
43.一种或多种表达载体，其包含权利要求42的一种或多种多核苷酸。
44.一种宿主细胞，其包含权利要求43的载体。
45.如权利要求44所述的宿主细胞，其中在宿主细胞中敲除编码uPA，MMP-2和/或MMP-9的基因。
46.一种制备权利要求1-37中任一项的前药或权利要求38-40中任一项的IL-2突变蛋白的方法，包括
在允许前药或IL-2突变蛋白表达的条件下，培养权利要求44或45的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，以及
分离前药或IL-2突变蛋白。
47.一种于有需要的患者中治疗癌症或感染性疾病或刺激免疫系统的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求41的药物成分。
48.如权利要求47所述的方法中，一种细胞因子前药或IL-2突变蛋白，用于治疗癌症或感染性疾病或刺激免疫系统。
49.如权利要求47所述的方法中，前药或IL-2突变蛋白用于制造治疗癌症或传染性疾病或刺激免疫系统的药物。
50.如权利要求47所述的方法，用于权利要求48或用于权利要求49的前药或IL-2突变蛋白，其中所述患者患有HIV感染，或选自乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠直肠癌和胃癌的癌症。
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