TWI839476B - 介白素-2多肽共軛物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供了通過使用與影響表達介白素-2受體的細胞的生物活性分子相共軛的介白素-2(IL-2)變體來靶向 (targeting) 表達所述介白素-2受體的細胞並特別是抑制此類細胞的生長所述之方法。

Description

介白素-2多肽共軛物及其用途

本發明提供了通過使用介白素-2(interleukin-2，IL-2)變體(variant)來調節介白素-2的生物活性以及特別是調節特異性受體(specific receptor)相互作用的方法，所述IL-2變體在所述IL-2蛋白的胺基酸序列中與介白素-2受體相互作用的位置處共軛(conjugated)到聚合物。

癌症是最重要的健康病症之一。在美國，癌症具有僅次於心臟病的第二大死亡率，占死亡人數的四分之一。人們普遍預計，癌症的發病率將隨著美國人口的老齡化而增加，進一步加劇這種病症的影響。在1970年代和1980年代確立的當前用於癌症的治療方案尚未發生太大變化。當在大多數晚期常見癌症中使用時，包括化療、輻射和其他方式(包括較新的靶向療法(targeted therapies))在內的這些治療顯示出有限的總體生存獲益(overall survival benefit)，因為這些療法主要靶向腫瘤塊(tumor bulk)。

更具體來說，迄今為止，常規的癌症診斷和療法試圖選擇性地檢測並根除主要是快速生長的贅生性細胞(neoplastic cells)(即形成腫瘤塊的細胞)。標準的腫瘤學治療方案通常主要被設計成給藥沒有過度的毒性的最高劑量 的輻射或化學治療劑，即通常被稱為「最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)」或「未觀察到不良反應的水準(no observed adverse effect level，NOAEL)」。許多常規癌症化療(例如烷基化藥劑如環磷醯胺、抗代謝藥如5-氟尿嘧啶和植物生物鹼如長春新鹼(vincristine))和常規放療主要通過幹擾參與細胞生長和DNA複製的細胞機制來發揮它們對癌細胞的毒性效應。化療方案通常還包括給藥化學治療劑的組合以試圖提高治療功效。儘管可以獲得大量不同的化學治療劑，但這些療法具有許多缺點。例如，由於對不論是正常還是惡性的快速生長的細胞的非特異性副作用，化學治療劑眾所周知是有毒的；例如，化學治療劑引起顯著且通常是危險的副作用，包括骨髓抑制、免疫抑制和胃腸道不適等。

癌症幹細胞

癌症幹細胞包含腫瘤的獨特子群體(通常為0.1-10%左右)，其相對於其餘90%左右的腫瘤(及腫瘤塊)來說具有更高的腫瘤原性(tumorigenic)，生長相對更慢或靜息(quiescent)，並且與腫瘤塊相比通常相對更具化療耐藥性。考慮到常規療法和方案大部分被設計成攻擊快速增殖的細胞(即構成腫瘤塊的那些癌細胞)，因此與快速生長的腫瘤塊相比通常生長緩慢的癌症幹細胞可能對常規療法和方案相對更有抗性。癌症幹細胞可以表現出使它們相對更具化療耐藥性的其他特點，例如多藥耐藥性和抗凋亡途徑(anti-apoptotic pathways)。上述因素構成了標準腫瘤治療方案未能在具有晚期癌症的大多數患者中確保長期益處，即未能足夠地靶向並根除癌症幹細胞的關鍵原因。在某些情況下，癌症幹細胞是腫瘤的生成細胞(即它是構成腫瘤塊的癌細胞的前身(progenitor))。

IL-2已被用於治療幾種癌症，例如腎細胞癌和轉移性黑素瘤。可商購的IL-2 Aldesleukin®是一種重組蛋白，其是非糖基化的，具有移除的丙胺酸-1並用絲胺酸-125代替殘基半胱胺酸-125(Whittington等，1993)。儘管IL-2是癌症治療中最早的FDA批准的細胞因數，但已顯示IL-2在以高劑量使用時表現出嚴重副作用。這極大限制了它在潛在患者上的應用。所述嚴重副作用的潛在機制已被歸因於IL-2與其受體之一IL-2Rα的結合。通常，IL-2不僅可以與其包括IL-2Rα(或CD25)、IL-2Rβ(或CD122)和IL-2Rγ(或CD132)(當所有三種受體存在於組織中時)在內的受體形成異三聚體複合物，而且可以與IL-2Rβ和IL-2Rγ形成異二聚體複合物。在臨床背景中，當使用高劑量IL-2時，IL-2開始結合IL-2αβγ，其是Treg細胞中的主要受體形式。Treg細胞的抑制效應引起在癌症免疫療法中應用IL-2的不想要的效應。為了減輕IL-2的副作用，以前已使用了許多方法。Nektar製造了一種形式的IL-2，其使用6個PEG化的離胺酸來掩蔽IL-2表面上的IL2Rα結合區(Charych等，2016)。這種PEG化的IL-2形式具有延長的半衰期，包含單和多PEG化的形式的混合物，含有非常大量的PEG，而且顯示出改善的副作用。然而，來自於活性研究的結果顯示，在這種非均質6-PEG化的IL-2混合物中有效的PEG化的IL-2形式是僅僅單PEG化的形式。因此，需要調節IL-2的副作用的具有同源的(homogenous)明確的產物組成的更有效的PEG化的IL-2。

將非遺傳編碼(non-genetically encoded)的胺基酸併入到蛋白質中的能力允許引入可以為天然存在的官能團例如離胺酸的ε-NH2、半胱胺酸的巰基-SH、組胺酸的亞胺基等提供有價值的替選物的化學官能團。某些化學官能團已知對20種常見的遺傳編碼的胺基酸中存在的官能團是惰性的，但乾淨高效地反應形成穩定的鍵。例如，在本領域中已知疊氮基(azide groups)和乙炔基(acetylene groups)在水性條件下，在催化量的銅存在下經歷Huisgen[3+2]環加成反應。參見例如Tornoe等，(2002)J.Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599。通過例如在蛋白質結構中引入疊氮基組成部分，人們能夠併入對蛋白質中存在的胺、巰基、羧酸、羥基化學惰性，但與乙炔組成部分順利且高效地反應以形成環加成產物的官能團。重要的是，在不存在乙炔組成部分的情況下，所述疊氮基在其他蛋白質側鏈存在下和生理條件下保持化學惰性和無反應性。

除了其他問題之外，本發明致力於解決與IL-2多肽共軛物的活性和生產相關的問題，並且也致力於生產具有改進的生物或藥理性能例如對腫瘤的提高的活性及/或改進的共軛及/或改進的治療半衰期的IL-2多肽。本發明的IL-2多肽靶向已知表達三聚體IL-2受體(α、β和γ)的Treg細胞和主要表達IL-2受體的β和γ二聚體的CD8細胞兩者。本發明的IL-2多肽減少與Treg細胞的α受體的結合並促進與CD8細胞的β和γ二聚體的偏倚性結合，從而為IL-2受體α在其中高表達的疾病或病症提供了改進的治療應用和改進的治療預後(prognosis)。

本發明涉及具有一個或多個非天然編碼(non-naturally encoded)的胺基酸的介白素-2(IL-2)多肽。本發明還涉及具有一個或多個非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽共軛物(conjugates)。本發明還涉及一種IL-2多肽共軛物，其中水溶性聚合物例如PEG通過所述IL-2變體內的一個或多個非天然編碼的胺基酸共軛到所述IL-2變體。本發明還涉及具有一個或多個非天然編碼的胺基酸和一個或多個天然胺基酸替換的IL-2多肽共軛物。本發明還涉及具有一個或多個非天然編碼 的胺基酸和一個或多個天然胺基酸替換和一個或多個PEG分子的IL-2多肽共軛物。

本發明提供了調節本發明的IL-2多肽的受體相互作用的方法。本發明提供了使用本發明的PEG化的IL-2多肽抑制或降低PEG化的IL-2與三聚體IL-2受體的IL2Rα次單元(subunit)的相互作用的方法。

在一個實施例中，所述PEG-IL-2被單聚乙二醇化(monopegylated)。在一個實施例中，所述PEG-IL-2被二聚乙二醇化。在一個實施例中，所述PEG-IL-2具有附連到它的超過兩個(2)聚乙二醇分子。本發明的另一個實施例提供了使用本發明的PEG-IL-2多肽來調節免疫系統的細胞的活性的方法。

在本發明的這個或任何實施例中，所述PEG-IL-2可以包含連接到PEG聚合物的全長、成熟(缺少信號肽(signal peptide))的人類介白素-2。在本發明的這個或任何實施例中，所述PEG-IL-2可以包含通過共價鍵連接到PEG聚合物或其他生物活性分子的全長、成熟(缺少信號肽)的人類介白素-2。在某些實施例中，所述生物活性分子被修飾，作為非限制性實例所述生物活性分子可以包括一個或多個非天然編碼的胺基酸。

在PEG-IL2共軛物中，所述PEG或其他水溶性聚合物可以被直接地或通過接頭共軛到所述IL-2蛋白或所述生物活性分子。適合的接頭包括例如可切割(cleavable)和不可切割(non-cleavable)的接頭(linkers)。

本發明提供了一種通過給藥有效量的PEG-IL-2多肽在哺乳動物中治療癌症的方法，所述哺乳動物例如為包括但不限於具有一種或多種下述病症的那些的哺乳動物：硬塊腫瘤(solid tumor)，血液腫瘤，結腸癌，卵巢癌，乳 腺癌，黑素瘤，肺癌，成膠質細胞瘤和白血病。在某些實施例中，所述癌症以高水準的Treg細胞為特徵。在某些實施例中，所述癌症以IL-2受體α的高表達為特徵。在某些實施例中，本發明提供了一種通過向物件給藥有效量的包含本發明的IL-2多肽的組合物來治療癌症或病症或疾病的方法。在某些實施例中，本發明提供了一種通過向患者給藥有效量的本發明的IL-2組合物來治療遺傳病的方法。在某些實施例中，所述病症或疾病以IL-2受體α的高表達為特徵。在某些實施例中，所述病症或疾病以高水準的Treg細胞為特徵。在某些實施例中，所述癌症、病症或疾病通過降低、阻斷或沉默IL-2受體α的表達來治療。在某些實施例中，所述癌症、病症或疾病通過減少IL-2受體α在Treg細胞表面上的結合，導致在所述待治療的癌症、病症或疾病中Treg細胞增殖的減少來治療。

當在本發明中使用時，介白素2或IL-2被定義為具有下述性質的蛋白質：(a)具有與IL-2(包括IL-2突變蛋白質、成熟IL-2序列(即缺少分泌性前導序列)和在本申請的SEQ ID NO：1、2、3、5或7中所公開的IL-2)的已知序列基本上一致的胺基酸序列，和(b)具有本源型(native)或野生型(wild-type)IL-2共有的至少一種生物活性。出於本發明的目的，糖基化(例如在真核細胞如酵母或CHO細胞中生產的)和非糖基化(例如化學合成或在大腸桿菌(E.coli)中生產的)的IL-2兩者是等同的，並且可以互換使用。還包括保留IL-2的生物活性的其他突變體和其他類似物，包括病毒IL-2。

本發明提供了共軛(conjugated)到一個或多個水溶性(water-soluble)聚合物的IL-2多肽，其中所述PEG化的IL-2多肽也連接到另一種藥物或生物活性分子，並且其中所述IL-2多肽包含一個或多個非天然編碼的胺基酸。本發明還提供了IL-2多肽的單體和二聚體。本發明還提供了IL-2多肽的三聚 體。本發明提供了IL-2多肽的多聚體(multimers)。本發明還提供了包含一個或多個非天然編碼的胺基酸的IL-2二聚體。本發明提供了包含一個或多個非天然編碼的胺基酸的IL-2多聚體。本發明提供了包含一個或多個非天然編碼的胺基酸的同源的(homogenous)IL-2多聚體，其中每個IL-2多肽具有相同的胺基酸序列。本發明提供了異源的(heterogenous)IL-2多聚體，其中至少一個所述IL-2多肽包含至少一個非天然編碼的胺基酸，其中所述多聚體中的任一或每個IL-2多肽可以具有不同的胺基酸序列。

在某些實施例中，所述IL-2多肽包含一個或多個轉譯後修飾。在某些實施例中，所述IL-2多肽被連接到接頭、聚合物或生物活性分子。在某些實施例中，所述IL-2單體是同源的(homogenous)。在某些實施例中，所述IL-2二聚體是同源的(homogenous)。在某些實施例中，所述IL-2多聚體被共軛到一個水溶性聚合物。在某些實施例中，所述IL-2多聚體被共軛到兩個水溶性聚合物。在某些實施例中，所述IL-2多聚體被共軛到三個水溶性聚合物。在某些實施例中，所述IL-2多聚體被共軛到超過三個水溶性聚合物。在某些實施例中，所述IL-2多肽被連接到長得足以允許二聚體形成的接頭。在某些實施例中，所述IL-2多肽被連接到長得足以允許三聚體形成的接頭。在某些實施例中，所述IL-2多肽被連接到長得足以允許多聚體形成的接頭。在某些實施例中，所述IL-2多肽被連接到雙官能聚合物、雙官能接頭或至少一個另外的IL-2多肽。在某些實施例中，所述IL-2多肽包含一個或多個轉譯後修飾。在某些實施例中，所述IL-2多肽被連接到接頭、聚合物或生物活性分子。

在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸被連接到水溶性聚合物。在某些實施例中，所述水溶性聚合物包含聚乙二醇(PEG)組成部分(moiety)。 在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸使用接頭連接到所述水溶性聚合物或被鍵合到所述水溶性聚合物。在某些實施例中，所述聚乙二醇分子是雙官能聚合物。在某些實施例中，所述雙官能聚合物被連接到第二多肽。在某些實施例中，所述第二多肽是IL-2。在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含連接到包含聚乙二醇組成部分的水溶性聚合物的至少兩個胺基酸。在某些實施例中，至少一個胺基酸是非天然編碼的胺基酸。

在一個實施例中，本發明的IL-2或PEG-IL-2被連接到治療性藥劑例如免疫調節劑。所述免疫調節劑可以是對免疫細胞發揮治療作用的任何藥劑，其可用作治療性藥劑用於共軛到IL-2、PEG-IL-2或IL-2變體。

在某些實施例中，一個非天然編碼(non-naturally encoded)的胺基酸被併入(incorporated)到IL-2或其變體(variant)的一個或多個下述位置中：第1位之前(即在N-端處)，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133位，或被添加到所述蛋白質的羧基端(the carboxyl terminus)，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應(corresponding)胺基酸)。在某些實施例中，一個或多個生物活性分子被直接共 軛到所述IL-2變體。在某些實施例中，所述一個或多個生物活性分子被共軛到所述IL-2多肽中的所述一個或多個非天然編碼的胺基酸。在某些實施例中，本發明的IL-2變體被連接到接頭。在某些實施例中，所述連接到接頭的IL-2變體還包含生物活性分子。在本發明的某些實施例中，所述接頭被連接到非天然編碼的胺基酸。

在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第3、32、35、37、38、42、43、44、45、48、49、61、62、64、65、68、72、76和107位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位之前，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第35、37、42、45、49、61或65位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第45、61和65位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第45和65位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第3位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第32 位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第35位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第37位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第38位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第41位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第42位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第43位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第44位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第45位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第48位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第49位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第61位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第62位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第64位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第65位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第68位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第72位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺 基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第76位置處。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到本發明的IL-2或其變體中的第107位置處。

在某些實施例中，在IL-2或其變體中的一個或多個這些位置處的所述非天然存在的胺基酸被連接到藥物或其他生物活性分子，所述位置包括但不限於下述位置：第1位之前(即在N-端處)，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133位，或添加到所述蛋白質的羧基端，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。

在某些實施例中，在IL-2或其變體中的一個或多個這些位置處的所述非天然存在的胺基酸被連接到藥物或其他生物活性分子，所述位置包括但不限於在疏水相互作用(hydrophobic interactions)的位置處，在與IL-2受體次單元(包括IL2Rα)相互作用的位置處或附近，在第3或35至45胺基酸位置內，在前107個N-端胺基酸內，在第61-72胺基酸位置內；每個所述位置是SEQ ID NO：2的位置或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置。在某些實施例中，在IL-2或其變體中的一個或多個這些位置處的所述非天然存在的胺基酸被連接到藥物或其他生物活性分子，所述位置包括但不限於下述位置：SEQ ID NO：2的第1位之前 (即在N-端處)，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43位，及其任何組合；或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸。在某些實施例中，在IL-2或其變體中的一個或多個這些位置處的所述非天然存在的胺基酸被連接到藥物或其他生物活性分子，所述位置包括但不限於IL-2或其變體的下述位置：SEQ ID NO：2的第44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133位，或添加到所述蛋白質的羧基端，及其任何組合；或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中並連接到藥物或其他生物活性分子：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。

在某些實施例中，在IL-2或其變體中的一個或多個這些位置處的所述非天然存在的胺基酸被連接到接頭，所述位置包括但不限於下述位置：第1位之前(即在N-端處)，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133位，或添加到所述蛋白質的羧基端，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中並連接到接頭：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。

在某些實施例中，在IL-2或其變體中的一個或多個這些位置處的所述非天然存在的胺基酸被連接到接頭，所述接頭被進一步連接到水溶性聚合物或生物活性分子，所述位置包括但不限於下述位置：第1位之前(即在N-端處)，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133位，或添加到所述蛋白質的羧基端，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中並連接到接頭，所述接頭被進一步連接到水溶性聚合物或生物活性分子，所述位置包括但不限於下述位置：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位之前，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。

在某些實施例中，在IL-2或其變體中的一個或多個這些位置處的所述非天然存在的胺基酸被連接到水溶性聚合物，所述位置包括但不限於下述位置：第1位之前(即在N-端處)，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133位，或添加到所述蛋白質的羧基端，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中並連接到接頭，所述接頭被進一步連接到水溶性聚合物，所述位置包括但不限於下述位置：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、 64、65、68、72和107位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。

在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含調節所述IL-2對IL-2受體次單元或其變體的親和性(affinity)的替換(substitution)、添加(addition)或缺失(deletion)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含調節所述IL-2或其變體對IL-2受體或結合配偶體(binding partner)(包括但不限於蛋白質、多肽、脂類、脂肪酸、小分子或核酸)的親和性的替換、添加或缺失。在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含與不含替換、添加或缺失的相應IL-2的穩定性相比調節所述IL-2的穩定性的替換、添加或缺失。穩定性及/或溶解性可以使用本領域普通技術人員已知的大量不同測定法來測量。這些測定法包括但不限於SE-HPLC和RP-HPLC。在某些實施例中，所述IL-2包含與不含替換、添加或缺失的相應IL-2的免疫原性相比調節所述IL-2的免疫原性的替換、添加或缺失。在某些實施例中，所述IL-2包含與不含替換、添加或缺失的相應IL-2的血清半衰期或循環時間相比調節所述IL-2的血清半衰期或循環時間的替換、添加或缺失。

在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含與不含替換、添加或缺失的相應IL-2或其變體的水溶性相比提高所述IL-2的水溶性的替換、添加或缺失。在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含與不含替換、添加或缺失的相應IL-2或其變體的溶解性相比提高在宿主細胞(host cell)中生產的所述IL-2或其變體的溶解性的替換、添加或缺失。在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含與不含替換、添加或缺失的相應IL-2或其變體的表達或合成相比提高所述IL-2在宿主細胞中的表達或提高體外合成的替換、添加或缺失。所述包含這種替換的IL-2或其變體保留了激動劑(agonist)活性或保留或提高了在宿主細胞中的表達水準。在某些 實施例中，所述IL-2或其變體包含與不含替換、添加或缺失的相應IL-2或其變體的蛋白酶抗性相比提高所述IL-2或其變體的蛋白酶抗性的替換、添加或缺失。在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含與IL-2受體在與不含替換、添加或缺失的相應IL-2或其變體相互作用後的活性相比調節所述IL-2受體的信號轉導活性(signal transduction activity)的替換、添加或缺失。在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含與不含替換、添加或缺失的相應IL-2的結合相比調節它與另一個分子例如受體的結合的替換、添加或缺失。

在某些實施例中，本發明提供了使用PEG-IL-2和至少一種另外的治療或診斷性藥劑治療增殖性病症(proliferative condition)、癌症、腫瘤或癌前病症(precancerous condition)例如異常增生的方法。所述另外的治療性藥劑可以是例如細胞因數或細胞因數拮抗劑例如IL-12、干擾素-α或抗表皮生長因數受體抗體，多柔比星(doxorubicin)，表柔比星，抗葉酸劑例如甲胺蝶呤或氟尿嘧啶，伊立替康，環磷醯胺，放療，激素或抗激素療法例如雄激素、雌激素、抗雌激素抗體、氟他胺或二乙基己烯雌酚，手術，他莫昔芬(tamoxifen)(tamoxifen)，異環磷醯胺，二溴衛矛醇，烷基化藥劑例如美法侖或順鉑，依託泊苷，長春瑞濱，長春花鹼，長春地辛，糖皮質激素，組胺受體拮抗劑，血管生成抑制劑，輻射，輻射增敏劑，蒽環黴素，長春花生物鹼，紫杉烷例如紫杉醇和多西他賽，細胞週期抑制劑例如細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑，檢查點抑制劑，免疫調節性藥物，免疫刺激性藥物，針對另一種腫瘤抗原的單複製(clone)抗體，單複製(clone)抗體(monoclonal antibody)與生物活性分子的複合物，T細胞佐劑，骨髓移植物，或抗原呈遞細胞例如樹突狀細胞療法。疫苗可以被提供為例如可溶性蛋白或編碼所述蛋白的核酸(參見例如Le等，同上；Greco和Zellefsky主編(2000)《前 列腺癌的放療》(Radiotherapy of Prostate Cancer)，Harwood Academic,Amsterdam；Shapiro和Recht(2001)New Engl.J.Med.344：1997-2008；Hortobagyi(1998)New Engl.J.Med.339：974-984；Catalona(1994)New Engl.J.Med.331：996-1004；Naylor和Hadden(2003)Int.Immunopharmacol.3：1205-1215；The Int.Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group(2004)New Engl.J.Med.350：351-360；Slamon等，(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Kudelka等，(1998)New Engl.J.Med.338：991-992；van Netten等，(1996)New Engl.J.Med.334：920-921)。

還提供了治療癌症的髓外造血(EMH)的方法。EMH已被描述(參見例如Rao等，(2003)Leuk.Lymphoma 44：715-718；Lane等，(2002)J.Cutan.Pathol.29：608-612)。

在某些實施例中，所述PEG-IL-2或其變體包含與不含替換、添加或缺失的相應IL-2或其變體的受體或受體次單元結合活性相比調節其受體或受體次單元結合的替換、添加或缺失。在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含與不含替換、添加或缺失的相應IL-2或其變體的受體或受體次單元結合活性相比抑制它的與受體或受體次單元結合相關的活性的替換、添加或缺失。

在某些實施例中，所述IL-2或其變體包含與不含替換、添加或缺失的相應野生型IL-2的相容性相比提高所述IL-2或其變體與藥物防腐劑(例如間甲酚、苯酚、苯甲醇)的相容性的替換、添加或缺失。這種提高的相容性使得能夠製備在儲存期間維持所述蛋白質的物理化學性質和生物活性的保存完好的藥物製劑。

在某些實施例中，使用一個或多個非天然胺基酸產生一個或多個工程化改造的鍵。所述分子內鍵可以以許多方式產生，包括但不限於在適合條件下所述蛋白質中的兩個胺基酸之間的反應(一個或兩個胺基酸可以是非天然胺基酸)，在適合條件下與兩個胺基酸(每個胺基酸可以是天然編碼或非天然編碼的)、與接頭、聚合物或其他分子的反應等。

在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的一個或多個胺基酸替換可以使用一個或多個天然存在或非天然存在的胺基酸。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以使用天然存在或非天然存在的胺基酸，只要至少一個替換是使用非天然編碼的胺基酸即可。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的一個或多個胺基酸替換可以使用一個或多個天然存在的胺基酸，並且另外至少一個替換是使用非天然編碼的胺基酸。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以使用任何天然存在的胺基酸，並且至少一個替換是使用非天然編碼的胺基酸。在某些實施例中，一個或多個天然胺基酸可以在IL-2或其變體的一個或多個下述位置處替換：第1位之前(即在N-端處)，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，一個或多個天然胺基酸替換可以在IL-2或其變體的一個或多個下述位置處：第44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、 104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133位，或添加到所述蛋白質的羧基端，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以使用至少一個天然存在的胺基酸，並且至少一個替換是使用非天然編碼的胺基酸。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以使用至少兩個天然存在的胺基酸，並且至少一個替換是使用非天然編碼的胺基酸。在某些實施例中，所述一個或多個天然存在或編碼的胺基酸可以是20種常見胺基酸中的任一者，包括但不限於丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬醯胺酸(aspartic acid)、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。在某些實施例中，所述至少一個天然存在的胺基酸替換可以在IL-2或其變體的下述位置處：第38、46或65位。在某些實施例中，所述天然存在的胺基酸替換可以在IL-2或其變體的第38位置處。在某些實施例中，所述IL-2或其變體的第38位置處的天然存在的胺基酸替換可以選自20種常見天然胺基酸中的任一者，包括但不限於丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬醯胺酸(aspartic acid)、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。在某些實施例中，所述IL-2或其變體的第38位置處的天然存在的胺基酸替換可以是丙胺酸替換。在某些實施例中，所述天然存在的胺基酸替換可以在IL-2或其變體的第46位置處。在某些實施例中，所述IL-2或其變體的第46位置處的天然存在的胺基酸替換可以選自20種常見天然胺基酸中的任一者，包括但不 限於丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬醯胺酸(aspartic acid)、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。在某些實施例中，所述IL-2或其變體的第46位置處的天然存在的胺基酸替換可以是白胺酸或異白胺酸替換。在某些實施例中，所述天然存在的胺基酸替換可以在IL-2或其變體的第65位置處。在某些實施例中，所述IL-2或其變體的第65位置處的天然存在的胺基酸替換可以選自20種常見天然胺基酸中的任一者，包括但不限於丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬醯胺酸(aspartic acid)、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。在某些實施例中，所述IL-2或其變體的第65位置處的天然存在的胺基酸替換可以是精胺酸替換。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是第38、46或65位置處的天然存在的胺基酸替換，並且至少一個替換是使用併入到IL-2或其變體的一個或多個下述位置中的非天然編碼的胺基酸：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是第38位置處的天然存在的胺基酸替換，並且至少一個替換是使用併入到IL-2或其變體的一個或多個下述位置中的非天然編碼的胺基酸：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是第46位置處的天然存在的胺基酸替換，並且至少一個替換是使用併入到IL-2或其變體的一個或多個下述位置中的非 天然編碼的胺基酸：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是第65位置處的天然存在的胺基酸替換，並且至少一個替換是使用併入到IL-2或其變體的一個或多個下述位置中的非天然編碼的胺基酸：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是第38及/或46及/或65位置處的天然存在的胺基酸替換，並且至少一個替換是使用併入到IL-2或其變體的一個或多個下述位置中的非天然編碼的胺基酸：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是第38位置處的天然存在的胺基酸替換和在第42位中併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是第38和46位置處的天然存在的胺基酸替換和在第42位中併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是第38和65位置處的天然存在的胺基酸替換和在第42位中併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是第38、46和65位置處的天然存在的胺基酸替換和在第42位中併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸(SEQ ID NO：2， 或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是在第38位置處的天然存在的胺基酸替換和在第45位中併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是在第38和46位置處的天然存在的胺基酸替換和在第45位中併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是在第38和65位置處的天然存在的胺基酸替換和在第45位中併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是在第38、46和65位置處的天然存在的胺基酸替換和在第45位中併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是在第38位置處的天然存在的胺基酸替換和在第65位中併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。在某些實施例中，所述IL-2或其變體中的胺基酸替換可以是在第38和46位置處的天然存在的胺基酸替換和在第65位中併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置)。

在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸包含羰基、乙醯基、胺氧基、肼基(hydrazine)、醯肼基(hydrazide group)、胺基脲基(semicarbazide group)、疊氮基或炔基。

在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸包含羰基。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸具有下述結構：

其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；R₂是H、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基；R₃是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R₄是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。

在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸包含胺氧基。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸包含醯肼基。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸包含肼基。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸殘基包含胺基脲基。

在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸殘基包含疊氮基。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸具有下述結構：

其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R₂是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R₃是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。

在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸包含炔基。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸具有下述結構：

其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；X是O、N、S或不存在；m是0-10，R₂是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R₃是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。

在某些實施例中，所述多肽是IL-2激動劑(agonist)、部分激動劑、拮抗劑(antagonist)、部分拮抗劑或反向激動劑(inverse agonist)。在某些實施例中，所述IL-2激動劑、部分激動劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向激動劑包含連接到水溶性聚合物的非天然編碼的胺基酸。在某些實施例中，所述水溶性聚合物包含聚乙二醇組成部分。在某些實施例中，所述IL-2激動劑、部分激動劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向激動劑包含非天然編碼的胺基酸和一個或多個轉譯後修飾、接頭、聚合物或生物活性分子。

本發明還提供了分離的核酸，其包含編碼SEQIDNO：1、2、3、5或7的多肽的多核苷酸，並且本發明提供了分離的核酸，其包含在嚴緊條件下與編碼SEQIDNO：1、2、3、5或7的多肽的多核苷酸雜交(hybridizes)的多核苷酸(polynucleotide)。本發明還提供了分離的核酸，其包含編碼被顯示為SEQIDNO：1、2、3、5或7的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少一個選擇器密碼子(selector codon)。本發明還提供了分離的核酸，其包含編碼被顯示為SEQIDNO：1、2、3、5或7並具有一個或多個非天然編碼的胺基酸的多肽的多核苷酸。對於本領域普通技術人員而言顯而易見的是，許多不同的多核苷酸可以編碼本發明的任何多肽。

在某些實施例中，所述選擇器密碼子選自琥珀密碼子(amber codon)、赭石密碼子(ochre codon)、卵白石密碼子(opal codon)、獨特密碼子、稀有密碼子、五鹼基(five-base)密碼子和四鹼基密碼子。

本發明還提供了連接到生物活性分子的IL-2或其變體的製造方法。在某些實施例中，所述方法包括將分離的包含非天然編碼的胺基酸的IL-2或其變體與包含與所述非天然編碼的胺基酸反應的組成部分的生物活性分子相接觸。在某些實施例中，所述併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸對原本對20種常用胺基酸中的任一者無反應性的生物活性分子具有反應性。在某些實施例中，所述併入到IL-2中的非天然編碼的胺基酸對原本對連接到生物活性分子的20種常用胺基酸中的任一者無反應性的接頭、聚合物或生物活性分子具有反應性。

在某些實施例中，所述連接到水溶性聚合物或生物活性分子的IL-2或其變體通過將包含含羰基胺基酸的IL-2或其變體與包含胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基的水溶性聚合物或生物活性分子進行反應來製造。在某些實施例中，所述胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基通過醯胺鍵連接到所述生物活性分子。在某些實施例中，所述胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基通過胺基甲酸酯鍵連接到所述水溶性聚合物或生物活性分子。

本發明還提供了連接到水溶性聚合物的IL-2共軛物的製造方法。在某些實施例中，所述方法包括將分離的包含非天然編碼的胺基酸的IL-2-生物活性分子共軛物與包含與所述非天然編碼的胺基酸反應的組成部分的水溶性聚合物相接觸。在某些實施例中，所述併入到IL-2共軛物中的非天然編碼的胺基酸對原本對20種常用胺基酸中的任一者無反應性的水溶性聚合物具有反應性。在某些實施例中，所述併入到IL-2共軛物中的非天然編碼的胺基酸對原本對20種常用胺基酸中的任一者無反應性的接頭、聚合物或生物活性分子具有反應性。

本發明還提供了連接到水溶性聚合物的IL-2或其變體的製造方法。在某些實施例中，所述方法包括將分離的包含非天然編碼的胺基酸的IL-2或其變體與包含與所述非天然編碼的胺基酸反應的組成部分的水溶性聚合物相接觸。在某些實施例中，所述併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸對原本對20種常用胺基酸中的任一者無反應性的水溶性聚合物具有反應性。在某些實施例中，所述併入到IL-2中的非天然編碼的胺基酸對原本對20種常用胺基酸中的任一者無反應性(unreactive)的接頭、聚合物或生物活性分子具有反應性。

在某些實施例中，所述連接到水溶性聚合物的IL-2或其變體通過將包含含羰基胺基酸的IL-2或其變體與包含胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基的聚乙二醇分子進行反應來製造。在某些實施例中，所述胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基通過醯胺鍵連接到所述聚乙二醇分子。在某些實施例中，所述胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基通過胺基甲酸酯鍵連接到所述聚乙二醇分子。

在某些實施例中，所述連接到水溶性聚合物的IL-2或其變體通過將包含羰基的聚乙二醇分子與包含含有胺氧基、肼、醯肼或胺基尿素基的非天然編碼的胺基酸的多肽進行反應來製造。

在某些實施例中，所述連接到水溶性聚合物的IL-2或其變體通過將包含含炔基胺基酸的IL-2與包含疊氮基組成部分(moiety)的聚乙二醇分子進行反應來製造。在某些實施例中，所述疊氮基或炔基通過醯胺鍵連接到所述聚乙二醇分子。

在某些實施例中，所述連接到水溶性聚合物的IL-2或其變體通過將包含含疊氮基胺基酸的IL-2或其變體與包含炔基組成部分的聚乙二醇分 子進行反應來製造。在某些實施例中，所述疊氮基或炔基通過醯胺鍵連接到所述聚乙二醇分子。

在某些實施例中，所述聚乙二醇分子具有約0.1kDa至約100kDa之間的分子量。在某些實施例中，所述聚乙二醇分子具有0.1kDa至50kDa之間的分子量。在某些實施例中，所述聚乙二醇具有1kDa至25kDa之間或2至22kDa之間或5kDa至20kDa之間的分子量。例如，所述聚乙二醇聚合物的分子量可以是約5kDa或約10kDa或約20kDa。例如，所述聚乙二醇聚合物的分子量可以是5kDa或10kDa或20kDa。在某些實施例中，所述聚乙二醇分子是20K2-支鏈PEG。在某些實施例中，所述聚乙二醇分子是直鏈(linear)5KPEG。在某些實施例中，所述聚乙二醇分子是直鏈(linear)10KPEG。在某些實施例中，所述聚乙二醇分子是直鏈20KPEG。在某些實施例中，所述聚乙二醇聚合物的分子量是平均分子量。在某些實施例中，所述平均分子量是數均分子量(number average molecular weight，Mn)。所述平均分子量可以使用GPC或SEC、SDS/PAGE分析、RP-HPLC、質譜術(mass spectrometry)或毛細管電泳來確定或測量。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72或107位，及其任何組合(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到直鏈20K聚乙二醇分子。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第35、37、42、45、49、61或65位，及其任何組合(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到直鏈20K聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺 基酸被併入到IL-2或其變體中的第65位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到直鏈20K聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第61位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到直鏈20K聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第49位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到直鏈20K聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第45位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到直鏈20K聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第42位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到直鏈20K聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第37位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到直鏈20K聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第35位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到直鏈(linear)20K聚乙二醇分子。

在某些實施例中，所述聚乙二醇分子是支鏈(branched)聚合物。在某些實施例中，所述聚乙二醇支鏈聚合物的每個支鏈具有1kDa至100kDa之間或1kDa至50kDa之間的分子量。在某些實施例中，所述聚乙二醇支鏈聚合物的每個支鏈具有1kDa至25kDa之間或2至22kDa之間或5kDa至20kDa之間的分 子量。例如，所述聚乙二醇支鏈聚合物的每個支鏈的分子量可以是約5kDa或約10kDa或約20kDa。例如，所述聚乙二醇支鏈聚合物的每個支鏈的分子量可以是5kDa或10kDa或20kDa。在某些實施例中，所述聚乙二醇分子是20K2-支鏈PEG。在某些實施例中，所述聚乙二醇分子是20K4-支鏈PEG。在某些實施例中，所述聚乙二醇聚合物的分子量是平均分子量。在某些實施例中，所述平均分子量是數均分子量(Mn)。所述平均分子量可以使用GPC或SEC、SDS/PAGE分析、RP-HPLC、質譜術或毛細管電泳來確定或測量。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72或107位，及其任何組合(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K2-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第35、37、42、45、49、61或65位，及其任何組合(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K2-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第65位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K2-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第61位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K2-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第49位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K2-支鏈聚乙二 醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第45位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K2-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第42位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K2-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第37位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K2-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第35位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K2-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72或107位，及其任何組合(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K4-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第35、37、42、45、49、61或65位，及其任何組合(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K4-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第65位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K4-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第61位中(SEQIDNO：2，或 SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K4-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第49位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K4-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第45位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K4-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第42位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K4-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第37位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K4-支鏈聚乙二醇分子。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的第35位中(SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3、5或7中的相應胺基酸位置)，並且所述IL-2或其變體被連接到20K4-支鏈聚乙二醇分子。

在某些實施例中，所述連接到IL-2或其變體的水溶性聚合物包含聚亞烷基二醇(polyalkylene glycol)組成部分(moiety)。在某些實施例中，所述併入到IL-2中的非天然編碼的胺基酸殘基包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼、胺基脲基、疊氮基或炔基。在某些實施例中，所述併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸殘基包含羰基組成部分，並且所述水溶性聚合物包含胺氧基、醯肼、肼或胺基尿素組成部分。在某些實施例中，所述併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸殘基包含炔基組成部分，並且所述水溶性聚合物包 含疊氮基組成部分。在某些實施例中，所述併入到IL-2或其變體中的非天然編碼的胺基酸殘基包含疊氮基組成部分，並且所述水溶性聚合物包含炔基組成部分。

本發明還提供了組合物(compositions)，其包含含有非天然編碼的胺基酸的IL-2或其變體和可藥用載體(pharmaceutically acceptable carrier)。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸被連接到水溶性聚合物。

本發明還提供了細胞，其包含編碼IL-2或IL-2變體的包含選擇器密碼子的多核苷酸。在某些實施例中，所述細胞包含正交RNA合成酶(orthogonal RNA synthetase)及/或正交Trna(orthogonal tRNA)，用於將非天然編碼的胺基酸替換到所述IL-2中。

本發明還提供了細胞，其包含編碼IL-2或其變體的包含選擇器密碼子的多核苷酸。在某些實施例中，所述細胞包含正交RNA合成酶及/或正交tRNA，用於將非天然編碼的胺基酸替換到所述IL-2或其變體中。

本發明還提供了包含非天然編碼的胺基酸的PEG-IL-2、IL-2或其任何變體的製造方法。在某些實施例中，所述方法包括將包含編碼IL-2的一個或多個多核苷酸、正交RNA合成酶及/或正交tRNA的細胞在允許所述IL-2或其變體表達的條件下培養；和從所述細胞及/或培養基純化所述IL-2或其變體。

本發明還提供了增加IL-2或其變體的治療半衰期、血清半衰期或循環時間的方法。本發明還提供了調節IL-2或其變體的免疫原性(immunogenicity)的方法。在某些實施例中，所述方法包括將天然存在的IL-2或其變體中的任意一個或多個胺基酸用非天然編碼的胺基酸替換及/或將所述IL-2或其變體連接到接頭、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子。在本發明 的一個實施例中，所述接頭長得足以允許柔性並允許二聚體形成。在本發明的一個實施例中，所述接頭的長度為至少3個胺基酸或18個原子，以便允許二聚體形成。

本發明還提供了使用有效量的本發明的PEG-IL-2共軛物或其變體治療需要所述治療的患者的方法。在某些實施例中，所述方法包括向所述患者給藥治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含含有非天然編碼的胺基酸的PEG-IL-2或其變體和可藥用載體。在某些實施例中，所述方法包括向所述患者給藥治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含含有非天然編碼的胺基酸和天然胺基酸替換的PEG-IL-2或其變體和可藥用載體。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸被連接到水溶性聚合物。在某些實施例中，所述PEG-IL-2或其變體被糖基化。在某些實施例中，所述PEG-IL-2或其變體不被糖基化。

本發明還提供了使用有效量的本發明的IL-2或IL-2變體分子治療需要所述治療的患者的方法。在某些實施例中，所述方法包括向所述患者給藥治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含含有非天然編碼的胺基酸的IL-2或IL-2變體分子和可藥用載體。在某些實施例中，所述方法包括向所述患者給藥治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含含有一個或多個非天然編碼的胺基酸和一個或多個天然胺基酸替換的IL-2或其變體和可藥用載體。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸被連接到水溶性聚合物。在某些實施例中，所述天然胺基酸被連接到水溶性聚合物。在某些實施例中，所述IL-2被糖基化。在某些實施例中，所述IL-2不被糖基化(glycosylated)。在某些實施例中，所述需要治療的患者患有以IL-2受體α的高表達為特徵的癌症、病症或疾 病，但不限於此。在某些實施例中，本發明提供了一種通過向物件給藥治療有效量的本發明的IL-2組合物來治療癌症或病症或疾病的方法。在某些實施例中，本發明提供了一種通過向患者給藥治療有效量的本發明的IL-2組合物來治療遺傳病的方法。本發明的IL-2多肽被用於在具有IL-2受體α高表達的細胞中治療疾病或病症。在某些實施例中，所述癌症、病症或疾病通過降低、阻斷或沉默IL-2受體α表達來治療。本發明的IL-2多肽或變體被用於製造用於治療與IL-2受體α高表達相關的癌症、疾病或病症的藥物。本發明的IL-2多肽或變體被用於製造用於治療癌症的藥物。本發明的IL-2多肽或變體被用於製造用於治療遺傳病的藥物。

本發明還提供了包含SEQIDNO：1、2、3、5或7中示出的序列或任何其他IL-2序列，只是其中至少一個胺基酸被非天然編碼的胺基酸替換的IL-2。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸被連接到水溶性聚合物。在某些實施例中，所述水溶性聚合物包含聚乙二醇組成部分。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼基、胺基脲基、疊氮基或炔基。

本發明還提供了藥物組合物，其包含可藥用載體和包含SEQIDNO：1、2、3、5或7中示出的序列或任何其他IL-2序列的PEG-IL-2或其天然變體，其中至少一個胺基酸被非天然編碼的胺基酸替換。本發明還提供了藥物組合物，其包含可藥用載體和包含SEQIDNO：1、2、3、5或7中示出的序列的IL-2或其天然變體。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸包含糖類組成部分。在某些實施例中，所述水溶性聚合物通過糖類組成部分連接到所述 IL-2或其天然變體。在某些實施例中，接頭、聚合物或生物活性分子通過糖類組成部分連接到所述IL-2或其天然變體。

本發明還提供了一種IL-2或其天然變體，其包含在單一胺基酸處通過共價鍵連接到所述IL-2的水溶性聚合物。在某些實施例中，所述水溶性聚合物包含聚乙二醇組成部分。在某些實施例中，所述共價連接到所述水溶性聚合物的胺基酸是所述多肽中存在的非天然編碼的胺基酸。

本發明提供了一種包含至少一個接頭、聚合物或生物活性分子的IL-2或其變體，其中所述接頭、聚合物或生物活性分子通過經核糖體併入到所述多肽中的非天然編碼的胺基酸的官能團附連到所述多肽。在某些實施例中，所述IL-2或其變體被單PEG化。本發明還提供了一種IL-2或其變體，其包含附連到一個或多個非天然編碼的胺基酸的接頭、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然編碼的胺基酸在預先選擇的位置處經核糖體併入到所述多肽中。

本發明的範圍內包括聯結到IL-2編碼區的IL-2或其變體的前導或信號序列(leader or signal sequence)以及聯結到IL-2編碼區的異源信號序列(heterologous signal sequence)。所選的異源前導或信號序列應該是例如被宿主細胞分泌系統(secretion system)識別和加工以分泌，並且可能被宿主細胞的信號肽酶切割的序列。使用本發明的IL-2治療病症或障礙的方法意味著暗示用帶有或不帶有信號或前導肽(signal or leader peptide)的IL-2或其變體治療。

在另一個實施例中，所述包含一個或多個非天然存在的胺基酸的IL-2或其變體與另一個分子(包括但不限於PEG)的共軛，由於用於與所述非天然胺基酸共軛的獨特化學反應而提供了基本上純化的IL-2。包含一個或多個非天然編碼的胺基酸的IL-2或其變體與另一個分子例如PEG的共軛，可以使用 在所述共軛步驟之前或之後進行的其他純化技術來進行，以提供基本上純的IL-2或其變體。

1:IL-2受體α

2:IL-2受體β

3:IL-2受體γ

4:IL-2

5:待篩選的位點

6:PEG(聚乙二醇)

CD8+:CD8受體蛋白質

Kd:解離常數(dissociation constant)

Rβγ:受體βγ

Rαβγ:受體αβγ

Treg:調節T細胞

IL-2:介白素-2

IL-2Rα:IL-2受體

IL-2Rβ:IL-2受體

IL-2Rγ:IL-2受體

JAK1:酪氨酸蛋白激酶1

JAK3:酪氨酸蛋白激酶3

P:磷酸化作用

STAT5:信號轉導子和轉錄激活子5

圖1-示出了IL-2多肽的視圖的模型，其中潛在受體相互作用位點用IL-2Rα的結構及其與IL-2的介面標記。

圖2-示出了用於在大腸桿菌中表達IL-2的表達載體(expression vector)的質體圖譜(plasmid map)。

圖3A-示出了IL-2蛋白在大腸桿菌中的表達的西方墨點法(Western blot)分析。

圖3B-示出了大腸桿菌中的IL-2變體的滴定濃度(titer)。

圖4A-示出了野生型IL-2與CD25的結合動力學傳感圖(Binding kinetic sensorgram)和模型擬合線和計算測量值。

圖4B-示出了用於在哺乳動物細胞中表達IL-2的表達載體的質體圖譜。

圖5-示出了UPF1基因組DNA序列和CRISPR gRNA位點的設計。

圖6-示出了UPF1敲除(knockout)細胞株的序列驗證。

圖7A-示出了各種不同IL-2變體在哺乳動物細胞中的暫態表達(transient expression)。

圖7B-示出了在哺乳動物細胞中生產的野生型IL-2和IL-2變體的西方墨點法(Western blot)分析。

圖8-示出了IL-2的F42變體的CTLL-2增殖測定(expansion assay)。

圖9-示出了通過CTLL-2增殖測定法(proliferation assay)篩選IL-2變體。

圖10A-示出了野生型IL-2和F42變體的結合動力學傳感圖。

圖10B-示出了K35和Y45變體的結合動力學傳感圖。

圖10C-示出了T37和P65變體的結合動力學傳感圖。

圖11-IL-2受體二聚化測定法(receptor dimerization assay)的圖示說明。

圖12-離體pSTAT5測定法的圖示說明。

圖13-示出了在糖基化(glycosylated)或非糖基化(non-glycosylated)IL-2存在下CTLL-2細胞的複製生長(clonal outgrowth)和長期繁殖(long-term propagation)。

圖14-示出了在相應的野生型IL-2或其所選變體的穩定合併物(stable pools)產生之前和之後的滴定濃度(titer)的比較。

圖15A-示出了表達F42-R38A變體的哺乳動物細胞中的滴定濃度(titer)。

圖15B-示出了F42-R38A變體的CTLL-2結合測定。

圖15C-示出了F42-R38A變體的結合動力學傳感圖。

定義

應當理解，本發明不限於本發明描述的特定方法、實驗室指南(protocols)、細胞株(cell lines)、構建體(constructs)和試劑，並且它們本身可以 變化。還應理解，本發明中使用的術語僅僅出於描述特定實施例的目的，並不旨在限制本發明的範圍，本發明的範圍僅受隨附的申請專利範圍限制。

當在本發明中和隨附的申請專利範圍中使用時，不帶具體數量的單數形式包括複數指稱物，除非上下文明確指示不是如此。因此，例如，對「IL-2」、「PEG-IL-2」、「PEG-IL-2共軛物(PEG-IL-2 conjugate)」以及各種不同的大寫、帶連字號和不帶連字號的形式的指稱是指一個或多個此類蛋白質，並包括其對於本領域普通技術人員來說已知的等同物，等等。

除非另有定義，否則本發明中使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。儘管與本發明中描述的相似或等同的任何方法、裝置和材料均可用于本發明的實踐或試驗，但現在將描述優選的方法、裝置和材料。

本發明提到的所有出版物和專利均通過引用併入本發明，目的在於描述和公開例如在所述出版物中描述的可以與當前描述的發明相結合使用的構建體和方法。提供本發明中討論的出版物僅僅是因為它們的公開先於本申請的提交日期。本發明中的任何內容均不得解釋為承認發明人無權憑藉在先發明或任何其他原因而早於這些公開。

術語「基本上純化的(substantially purified)」是指這樣的IL-2或其變體，其可能基本上(substantially)或本質上(essentially)不含在天然存在的環境中、即在本源(native)細胞中或在重組生產的IL-2的情況下在宿主細胞中所發現的通常與所述蛋白質相伴或相互作用的組分。可能基本上不含細胞材料的IL-2包括具有少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或少於約1%(以淨重(dry weight)計) 的污染蛋白質的蛋白製備物。當所述IL-2或其變體由宿主細胞重組生產時，所述蛋白質可以以所述細胞淨重的約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%或更少的量存在。當所述IL-2或其變體由宿主細胞重組生產時，所述蛋白質可以以所述細胞淨重的約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約1g/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約1mg/L或更少的量存在於培養基中。因此，通過本發明的方法生產的「基本上純化的」IL-2可能具有至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%的純度水準，特別是至少約75%、80%、85%的純度水準，更特別是至少約90%的純度水準、至少約95%的純度水準、至少約99%或更高的純度水準，正如通過適合的方法例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛細管電泳所確定的。

「重組宿主細胞(recombinant host cell)」或「宿主細胞」是指包括外源(exogenous)多核苷酸的細胞，不論用於插入的方法如何，例如是直接攝取(direct uptake)、轉導、f-交配還是本領域中已知用於產生重組宿主細胞的其他方法。所述外源多核苷酸可以作為非整合型(nonintegrated)載體(vector)例如質體維持，或者可以整合(integrated)到宿主基因組中。

當在本發明中使用時，術語「培養基」包括任何培養基、溶液、固體、半固體或剛性支援物，其可以支援或含有任何宿主細胞，包括細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、CHO細胞、原核宿主細胞、大腸桿菌或假單胞菌屬(Pseudomonas)宿主細胞，和細胞內含物。因此，所述術語可以涵蓋宿主細胞已在其中生長的培養基例如IL-2已被分泌到其中的培養基，包括在增殖步驟之前或之後的培養 基。所述術語還可以涵蓋含有宿主細胞裂解物的緩衝液或試劑，例如在IL-2在細胞內生產並且所述宿主細胞被裂解或破碎以釋放出IL-2的情況下。

當在本發明中涉及蛋白質重折疊使用時，「還原劑」被定義為將巰基維持在還原狀態下並且還原分子內或分子間二硫鍵的任何化合物或材料。適合的還原劑包括但不限於二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、2-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、半胱胺酸、半胱胺(2-胺基乙硫醇)和還原型榖胱甘肽(glutathione)。對於本領域普通技術人員來說顯而易見的是，廣泛類型的還原劑適合用於本發明的方法和組合物。

當在本發明中涉及蛋白質重折疊使用時，「氧化劑」被定義為能夠從被氧化的化合物移除電子的任何化合物或材料。適合的氧化劑包括但不限於氧化型榖胱甘肽、胱胺酸、胱胺、氧化型二硫蘇糖醇、氧化型赤蘚糖醇和氧氣。對於本領域普通技術人員來說顯而易見的是，廣泛類型的氧化劑適合用於本發明的方法。

當在本發明中使用時，「變性劑(Denaturing agent或denaturant)」被定義為引起蛋白質的可逆解折疊的任何化合物或材料。變性劑的強度由所述特定變性劑的性質和濃度兩者決定。適合的變性劑可以是離液劑、去污劑、有機溶劑、與水混溶的溶劑、磷脂或兩種或更多種此類試劑的組合。適合的離液劑包括但不限於脲、胍和硫氰酸鈉。有用的去污劑可以包括但不限於強去污劑例如十二烷基硫酸鈉或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton去污劑)、Sarkosyl、溫和的非離子型去污劑(例如毛地黃皂苷)、溫和的陽離子型去污劑例如N-›2,3-(二油烯氧基)-丙基-N,N,N-三甲基銨、溫和的離子型去污劑(例如膽酸鈉或去氧膽酸鈉)或兩性離子去污劑，包括但不限於磺基甜菜鹼(Zwittergent)、3-(3-氯胺醯基丙基) 二甲基銨-1-丙烷硫酸鹽(CHAPS)和3-(3-氯胺醯基丙基)二甲基銨-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽(CHAPSO)。與水混溶的有機溶劑例如乙腈、低級烷醇(特別是C2-C4烷醇例如乙醇或異丙醇)或低級烷二醇(特別是C2-C4烷二醇例如乙二醇)可以用作變性劑。可用于本發明的磷脂可以是天然存在的磷脂例如磷脂醯乙醇胺、磷脂醯膽鹼、磷酯醯絲胺酸和磷脂醯肌醇或合成的磷脂衍生物或變體例如二己醯基磷脂醯膽鹼或二庚醯基磷脂醯膽鹼。

當在本發明中使用時，「重折疊(Refolding)」描述了將含有二硫鍵的多肽從不正確折疊(improperly folded)或解折疊(unfolded)狀態轉變到對於二硫鍵來說本源(native)或正確折疊的構象的任何過程、反應或方法。

當在本發明中使用時，「共折疊(Cofolding)」具體是指使用至少兩種彼此相互作用的多肽並導致解折疊或不正確折疊的多肽轉變成本源、正確折疊的多肽的重折疊過程、反應或方法。

當在本發明中使用時，「介白素-2」、「IL-2」及其帶連字號和不帶連字號的形式包括具有IL-2的至少一種生物活性的多肽和蛋白質，及其IL-2類似物、IL-2突變蛋白質(muteins)、IL-2變體(variants)、IL-2同型異構物(isoform)、IL-2模擬物(mimetics)、IL-2片段、雜合IL-2蛋白、融合蛋白、寡聚體(oligomers)和多聚體(multimers)、同源物(homologues)、糖基化模式變體(glycosylation pattern variants)、變體、拼接變體(splice variants)和突變蛋白質，不論其生物活性如何，並且也不論其合成和製造方法如何，所述方法包括但不限於重組(不論是從cDNA、基因組DNA、合成DNA還是其他形式的核酸生產)、體外、體內、通過核酸分子的微注射、合成、轉基因和基因活化方法。術語「IL-2」、 「IL-2變體」和「IL-2多肽」涵蓋了包含一個或多個胺基酸替換、添加或缺失的IL-2。

缺少前導序列並且在N-端處沒有甲硫胺酸的IL-2的序列參見本發明中的SEQ ID NO：2。沒有前導序列並且在N-端處具有甲硫胺酸的IL-2的序列參見SEQ ID NO：3、5或7。在某些實施例中，本發明的IL-2或其變體與SEQ ID NO：2、3、5或7或IL-2的任何其他序列基本上一致。編碼IL-2(包括突變體IL-2和其他變體)的核酸分子以及表達和純化這些多肽的方法在本領域中是公知的。

術語「IL-2」還包括天然存在的IL-2的可藥用鹽和前體藥物和所述鹽的前體藥物(prodrugs)、多形體、水合物、溶劑化物、生物活性片段、生物活性變體和立體異構體(stereoisomer)，以及天然存在的IL-2的激動劑、模擬物和拮抗劑變體及其多肽融合體。

各種不同的參考文獻公開了多肽通過聚合物共軛(conjugated)或糖基化進行的修飾。術語「IL-2」包括共軛到聚合物例如PEG的多肽，並且可以包含半胱胺酸、離胺酸或其他殘基的一個或多個另外的衍生化。此外，所述IL-2可以包含接頭或聚合物，其中所述接頭或聚合物被共軛到的胺基酸可以是根據本發明的非天然胺基酸，或者可以利用本領域中已知的技術共軛到天然編碼的胺基酸，例如共軛到離胺酸或半胱胺酸。

術語「IL-2多肽」還包括糖基化的IL-2，例如但不限於在任何胺基酸位置處糖基化的多肽、所述多肽的N-連接或O-連接的糖基化形式。含有單核苷酸變化的變體也被當作IL-2多肽的生物活性變體。此外，也包括拼接變體。

術語「IL-2」還包括通過化學手段相連或表達為融合蛋白的任一種或多種IL-2或任何其他多肽、蛋白質、糖類、聚合物、小分子、接頭、配體或 任何類型的其他生物活性分子的IL-2異二聚體、同二聚體、異多聚體或同多聚體，以及含有例如特定缺失或其他修飾但仍維持生物活性的多肽類似物。

當在本發明中使用時，不論是共軛到生物活性分子、共軛到聚乙二醇還是採取非共軛形式，「介白素-2」或「IL-2」是包含非共價聯結以形成同二聚體的兩個次單元(subunit)的蛋白質。當在本發明中使用時，「介白素-2」和「IL-2」可以是指人類或小鼠IL-2，其也被稱為「hIL-2」或「mIL-2」。

術語「PEG化的IL-2」、「PEG化的IL-2」或「PEG-IL-2」是具有一個或多個聚乙二醇分子的IL-2分子，所述聚乙二醇分子通過接頭共價附連到所述IL-2蛋白的一個或超過一個胺基酸殘基，使得所述附連是穩定的。術語「單PEG化的IL-2」和「單PEG-IL-2」意味著一個聚乙二醇分子通過接頭被共價附連到所述IL-2二聚體的一個次單元(subunit)上的單一胺基酸殘基。所述PEG組成部分的平均分子量優選在約5,000至約50,000道爾頓(daltons)(daltons)之間。PEG附連到IL-2的方法或位點並不重要，但優選地所述聚乙二醇化不改變或僅僅極小地改變所述生物活性分子的活性。優選地，半衰期的增加超過生物活性的任何降低。

對本發明中描述的IL-2中胺基酸位置的所有指稱是基於在SEQ ID NO：2中的位置，除非另有指明(即當陳述所述比較是基於SEQ ID NO：3、5、或7或其他IL-2時)。本領域技術人員將會認識到，在任何其他IL-2例如SEQ ID NO：3、5或7中與SEQ ID NO：2中的位置相對應的胺基酸位置可以被容易地鑒定。本領域技術人員將會認識到，在任何其他IL-2分子例如IL-2融合體、變體、片段等中與SEQ ID NO：2、3、5或7或任何其他IL-2序列中的位置相對應的胺基酸位置可以被容易地鑒定。例如，可以使用序列比對程式例如BLAST來比對並鑒定蛋白質中與SEQ ID NO：2、3、5或7或其他IL-2序列中的位置相對應的具體 位置。本發明中參考SEQ ID NO：2、3、5或7或其他IL-2序列描述的胺基酸的替換、缺失或添加，打算也指稱在本發明中描述的或本領域中已知的IL-2融合體、變體、片段等中的相應位置中的替換、缺失或添加，並且明確地被本發明涵蓋。

IL-2(IL3)：本領域中已知的任何形式的IL-2均可用于本發明描述的組合物中。對於實驗工作來說，IL-2的小鼠形式是特別有用的。本領域技術人員將會認識到，IL2中的某些胺基酸殘基可以被改變而不影響它的活性，並且這些IL2的修飾形式也可以被聯結到載體並用於本發明描述的方法中。

術語「IL-2」涵蓋包含一個或多個胺基酸替換、添加或缺失的IL-2。本發明的IL-2可以包含與一個或多個非天然胺基酸修飾聯合的一個或多個天然胺基酸的修飾。在天然存在的IL-2多肽中廣泛類型的胺基酸位置中的示例性替換已被描述，包括但不限於調節藥物穩定性、調節IL-2多肽的一種或多種生物活性例如但不限於提高激動劑活性、提高多肽的溶解性、降低蛋白酶敏感性、將所述多肽轉變成拮抗劑等的替換，並且被術語「IL-2多肽」所涵蓋。在某些實施例中，所述IL-2結抗劑包含連接到水溶性聚合物的非天然編碼的胺基酸，其存在於所述IL-2分子的受體結合區中。

在某些實施例中，所述IL-2或其變體還包含調節所述IL-2或變體多肽的生物活性的添加、替換或缺失。在某些實施例中，所述IL-2或變體還包含調節IL-2的已知且通過研究證實的性狀例如癌症的一種或多種症狀的治療或緩解的添加、替換或缺失。所述添加、替換或缺失可以調節IL-2或變體的一種或多種性質或活性。例如，所述添加、替換或缺失可以調節對IL-2受體或所述受體的一個或多個次單元(subunit)的親和性，調節循環半衰期，調節治療半衰期，調節所述多肽的穩定性，調節被蛋白酶的切割，調節劑量，調節釋放或生物利用度， 促進純化，或改善或改變特定給藥途徑。同樣地，IL-2或變體可以包含蛋白酶切割序列、反應性基團、抗體結合結構域(包括但不限於FLAG或聚His)或其他基於親和性的序列(包括但不限於FLAG、聚His、GST等)或被連接的分子(包括但不限於生物素)，其改進所述多肽的檢測(包括但不限於GFP)、純化或其他性狀。

術語「IL-2多肽」還涵蓋被連接的同二聚體、異二聚體、同多聚體或異多聚體，包括但不限於通過非天然編碼的胺基酸側鏈直接連接到相同或不同的非天然編碼的胺基酸側鏈、連接到天然編碼的胺基酸側鏈或通過接頭間接連接的那些。示例性的接頭包括但不限於小有機化合物、各種不同長度的水溶性聚合物例如聚乙二醇或葡聚糖或各種不同長度的多肽。

當在本發明中使用時，術語「本發明的共軛物(conjugate)」、「IL-2-生物活性分子共軛物」或「PEG-IL-2」是指共軛到生物活性分子、其部分或其類似物的與介白素-2受體或其次單元(subunit)結合的介白素-2或其部分、類似物或衍生物。除非另有指明，否則術語「本發明的化合物(compound)」和「本發明的組合物(composition)」被用作術語「本發明的共軛物」的可選替詞。

當在本發明中使用時，術語「細胞毒性藥劑」可以是對癌細胞或活化的免疫細胞具有治療效應，可用作治療性藥劑與IL-2、PEG-IL-2或IL-2變體聯合使用的任何藥劑(參見例如WO 2004/010957，「藥物共軛物及其用於治療癌症、自體免疫疾病或傳染病的用途」(Drug Conjugates and Their Use for Treating Cancer,An Autoimmune Disease or an Infectious Disease))。用於本發明的細胞毒性或免疫抑制性藥劑的類別包括例如抗微管蛋白劑、奧瑞他汀類、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、烷基化藥劑(例如鉑複合物(complexes)例如順鉑、單鉑、雙鉑和三核鉑複合物(complexes)和卡鉑)、蒽環類、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝 藥、化療增敏劑、倍癌黴素類、依託泊苷類(etoposides)、氟代嘧啶類、離子載體類、lexitropsins、亞硝基脲類、鉑醇類、預製化合物、嘌呤抗代謝藥、嘌呤黴素類、輻射增敏劑(radiation sensitizers)、甾類、紫杉烷類、拓撲異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitors)、長春花生物鹼(vinca alkaloids)等。

個體細胞毒性或免疫抑制性藥劑包括例如雄激素、安麯黴素(AMC)、天冬醯胺酶、5-氮雜胞苷、硫唑嘌呤、博來黴素、白消安、丁硫胺酸亞碸、喜樹鹼、卡鉑、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、順鉑、秋水仙鹼、環磷醯胺、阿糖胞苷、胞苷阿糖苷、細胞鬆弛素B、達卡巴嗪、更生黴素(以前稱為放線菌素)、柔紅黴素、達卡巴嗪、多西他賽、多柔比星、雌激素、5-氟去氧尿苷、5-氟尿嘧啶、短桿菌肽D、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、甲氯乙胺、美法侖、6-巰基嘌呤、甲胺蝶呤、光神黴素、絲裂黴素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡黴素、丙卡巴肼、鏈脲佐菌素、替尼泊苷、6-硫鳥嘌呤、硫代TEPA、拓撲替康、長春花鹼、長春新鹼、長春瑞濱、VP-16和VM-26。

在某些典型實施例中，所述治療性藥劑是細胞毒性藥劑。適合的細胞毒性藥劑包括例如尾海兔素類(dolastatins)(例如奧瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小溝結合劑(例如烯二炔類和lexitropsins)、倍癌黴素類、紫杉烷類(例如紫杉醇和多西他賽)、嘌呤黴素類、長春花生物鹼、CC-1065、SN-38、拓撲替康、嗎啉並-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、利索新、氰基嗎啉並-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、棘黴素、康普瑞汀、紡錘菌素、埃博黴素A和B、雌莫司汀、隱藻素類、西馬多丁、maytansinoids、圓皮海綿內酯(discodermolide)、五加素和米托蒽醌(mitoxantrone)。

「非天然編碼的胺基酸」是指不是20種常見胺基酸或吡咯離胺酸或硒代半胱胺酸之一的胺基酸。可以與術語「非天然編碼的胺基酸」同義使用的其他術語是「非天然胺基酸」、「非天然存在的胺基酸」及其各種不同的帶連字號和不帶連字號的形式。術語「非天然編碼的胺基酸」還包括但不限於通過天然編碼的胺基酸(包括但不限於20種常見胺基酸或吡咯離胺酸和硒代半胱胺酸)的修飾而產生，但本身不被轉譯複合物天然併入到生長的多肽鏈中的胺基酸。這樣的非天然存在的胺基酸的實例包括但不限於N-乙醯基葡萄糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯基葡萄糖胺基-L-蘇胺酸和O-磷酸酪胺酸。

「胺基端修飾基團」是指可以附連到多肽的胺基端的任何分子。同樣地，「羧基端修飾基團」是指可以附連到多肽的羧基端的任何分子。末端修飾基團包括但不限於各種不同的水溶性聚合物、肽或蛋白質例如血清白蛋白或增加肽的血清半衰期的其他組成部分。

術語「官能團」、「活性組成部分」、「活化基團」、「離去基團」、「反應性位點」、「化學反應性基團」和「化學反應性組成部分」在本領域和本發明中用於指稱分子的獨特的、可定義的部分或單元。所述術語在化學領域中多少是同義的，並在本發明中用於指示分子的執行某些功能或活性並且與其他分子具有反應性的部分。

術語「鍵(linkage)」、「連接(linkage)」或「接頭」在本發明中用於指稱通常作為化學反應的結果而形成的基團或鍵，並且通常是共價鍵。水解穩定的鍵意味著所述鍵在水中是基本上穩定的，並且在有用的pH值下(包括但不限於在生理條件下)長期、甚至可能是無限期不與水反應。水解不穩定的或可降解的鍵意味著所述鍵在水或水性溶液(包括例如血液)中是可降解的。酶不穩定的 或可降解的鍵意味著所述鍵可以被一種或多種酶降解。正如在本領域中理解的，PEG和相關聚合物可以在聚合物骨架中或在聚合物骨架與所述聚合物分子的一個或多個末端官能團之間的接頭基團中包括可降解的鍵。例如，通過PEG羧酸或活化的PEG羧酸與生物活性藥劑上的醇基團的反應形成的酯鍵，在生理條件下通常水解以釋放出所述藥劑。其他水解可降解的鍵包括但不限於碳酸酯鍵、從胺與醛的反應得到的亞胺鍵、通過醇與磷酸基團的反應形成的磷酸酯鍵、作為醯肼與醛的副產物的腙鍵、作為醛與醇的反應產物的縮醛鍵、作為甲酸與醇的反應產物的原酸酯鍵、由在包括但不限於聚合物例如PEG的末端處的胺基和肽的羧基形成的肽鍵、以及由在包括但不限於聚合物的末端處的亞磷醯胺基團和寡核苷酸的5'羥基形成的寡核苷酸鍵。

當在本發明中使用時，術語「生物活性分子」、「生物活性組成部分」或「生物活性藥劑」意味著可以影響與生物體相關的生物體系、途徑、分子或相互作用的任何物理或生物化學性質的任何物質，所述生物體包括但不限於病毒、細菌、噬菌體、轉座子、朊病毒(prion)、昆蟲、真菌、植物、動物和人類。具體來說，當在本發明中使用時，生物活性分子包括但不限於打算用於在人類或其他動物中診斷、治癒、減輕、治療或預防疾病或以其他方式增強人類或動物的身體或心理健康的任何物質。生物活性分子的實例包括但不限於肽、蛋白質、酶、小分子藥物、疫苗、免疫原、成癮藥物、不成癮藥物、糖類、無機原子或分子、染料、脂類、核苷、放射性核素、寡核苷酸、類毒素、生物活性分子、原核和真核細胞、病毒、多糖、得自於或源自於病毒、細菌、昆蟲、動物或任何其他細胞或細胞類型的核酸及其部分、脂質體、微粒和膠束。適合用於本發明的生物活性藥劑的類別包括但不限於藥物、前體藥物、放射性核素、 成像劑、聚合物、抗生素、殺真菌劑、膽汁酸樹脂、煙酸及/或他汀類藥物、消炎藥、抗腫瘤藥、心血管藥劑、抗焦慮藥、激素、生長因數、甾類藥劑、微生物來源的生物活性分子等。生物活性藥劑也包括醯胺化合物例如在Yamamori等人的專利申請公佈號20080221112中所描述的那些，其在本發明的IL-2多肽之前、之後給藥及/或與其共同給藥。

「雙官能聚合物」是指包含兩個分立的、能夠與其他組成部分(包括但不限於胺基酸側基)特異性反應以形成共價或非共價鍵的官能團的聚合物。具有一個與特定生物活性組分上的基團具有反應性的官能團和另一個與第二生物組分上的基團具有反應性的基團的雙官能接頭，可用于形成包括所述第一生物活性組分、雙官能接頭和第二生物活性組分的共軛物。用於將各種不同化合物附連到肽的許多程式和接頭分子是已知的。參見例如歐洲專利申請號188,256、美國專利號4,671,958、4,659,839、4,414,148、4,699,784、4,680,338和4,569,789，其通過引用併入本發明。「多官能聚合物」是指包含兩個或更多個分立的、能夠與其他組成部分(包括但不限於胺基酸側基)特異性反應以形成共價或非共價鍵的官能團的聚合物。雙官能聚合物或多官能聚合物可以具有任何所需的長度或分子量，並且可以被選擇成在連接到IL-2的一個或多個分子與其受體或IL-2之間提供特定的所需間隔或構象(conformation)。

當取代基由它們的從左至右書寫的常規化學式說明時，它們同樣地涵蓋了從右至左書寫所述結構而得到的化學上一致的取代基，例如，結構-CH₂O-等同於結構-OCH₂-。

術語「取代基」包括但不限於「非干擾性取代基」。「非干擾性取代基」是產生穩定化合物的基團。適合的非干擾性取代基或殘基包括但不限 於鹵素、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₂芳烷基、C₁-C₁₂烷芳基、C₃-C₁₂環烷基、C₃-C₁₂環烯基、苯基、取代的苯基、甲苯醯基、二甲苯基、聯苯基、C₂-C₁₂烷氧基烷基、C₂-C₁₂烷氧基芳基、C₇-C₁₂芳氧基烷基、C₇-C₁₂氧基芳基、C₁-C₆烷基亞磺醯基、C₁-C₁₀烷基磺醯基、--(CH₂)_m--O--(C₁-C₁₀烷基)(其中m是1至8)、芳基、取代的芳基、取代的烷氧基、氟代烷基、雜環基、取代的雜環基、硝基烷基、--NO₂、--CN、--NRC(O)--(C₁-C₁₀烷基)、--C(O)--(C₁-C₁₀烷基)、C₂-C₁₀烷硫基烷基、--C(O)O--(C₁-C₁₀烷基)、--OH、--SO₂、=S、--COOH、--NR₂、羰基、--C(O)--(C₁-C₁₀烷基)-CF3、--C(O)-CF3、--C(O)NR2、--(C₁-C₁₀芳基)-S--(C₆-C₁₀芳基)、--C(O)--(C₁-C₁₀芳基)、--(CH₂)_m--O--(--(CH₂)_m--O--(C₁-C₁₀烷基)(其中每個m是1至8)、--C(O)NR₂、--C(S)NR₂、--SO₂NR₂、--NRC(O)NR₂、--NRC(S)NR₂、其鹽等。當在本發明中使用時，每個R是H、烷基或取代的烷基、芳基或取代的芳基(aryl)、芳烷基(aralkyl)或烷芳基(alkaryl)。

術語「鹵素」包括氟、氯、碘和溴。

除非另有陳述，否則術語「烷基」本身或作為另一個取代基的一部分意味著直鏈或支鏈或環狀烴基或其組合，其可以是完全飽和、單或多不飽和的，並且可以包括二價和多價殘基，具有指定的碳原子數(即C₁-C₁₀意味著1至10個碳原子)。飽和烴基的實例包括但不限於基團例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環己基、(環己基)甲基、環丙基甲基、諸如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和異構體等。不飽和烷基是具有一個或多個雙鍵或三鍵的基團。不飽和烷基的實例包括但不限於乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和更高級的同系物和異構體。除非另有指明， 否則術語「烷基」也意味著包括在下文中更詳細定義的烷基的衍生物例如「雜烷基」。限於烴基的烷基被稱為「同烷基」。

術語「亞烷基(alkylene)」本身或作為另一個取代基的一部分意味著源自於烷烴的二價殘基，例如但不限於結構-CH₂CH₂-和-CH₂CH₂CH₂CH₂-，並且還包括下文中被描述為「亞雜烷基」的基團。通常，烷基(或亞烷基)具有1至24個碳原子，其中具有10個或更少碳原子的基團是本發明描述的方法和組合物的特定實施例。「低級烷基」或「低級亞烷基」是較短鏈的烷基或亞烷基，通常具有8個或更少的碳原子。

術語「烷氧基」、「烷基胺基」和「烷硫基」(或硫代烷氧基)以它們的常規含義使用，並且是指分別通過氧原子、胺基或硫原子附連到分子的剩餘部分的烷基。

除非另有陳述，否則術語「雜烷基(heteroalkyl)」本身或與另一個術語相結合，意味著由所陳述數目的碳原子和至少一個選自O、N、Si和S的雜原子構成的穩定的直鏈或支鏈或環狀烴基或其組合，並且其中所述氮和硫原子可以任選被氧化，並且所述氮雜原子可以任選被季銨化(quaternized)。雜原子O、N、S和Si可以被放置在所述雜烷基的任何內部位置處或所述烷基被附連到分子的剩餘部分的位置處。實例包括但不限於-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH=CH-O-CH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH=N-OCH₃和-CH=CH-N(CH₃)-CH₃。至多兩個雜原子可以是連續的，例如-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。同樣地，術語「亞雜烷基」本身或作為另一個取代基的一部分意味著源自於雜烷基的二價殘基，例如但不限於-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和- CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。對於亞雜烷基來說，相同或不同的雜原子也可以佔據任一或兩個鏈末端(包括但不限於亞烷基氧基、亞烷基二氧基、亞烷基胺基、亞烷基二胺基、胺氧基亞烷基等)。此外，對於亞烷基和亞雜烷基連接基團來說，所述連接基團的結構式書寫的方向並不暗示所述連接基團的取向。例如，式-C(O)₂R’-代表-C(O)₂R’-和-R’C(O)₂-兩者。

除非另有陳述，否則術語「環烷基」和「雜環烷基(heterocycloalkyl)」本身或與其他術語相組合，分別表示「烷基」和「雜烷基」的環狀形式。因此，環烷基或雜環烷基包括飽和、部分不飽和和完全不飽和的環狀連接。此外，對於雜環烷基來說，雜原子可以佔據所述雜環附連到分子的剩餘部分之處的位置。環烷基的實例包括但不限於環戊基、環己基、1-環己烯基、3-環己烯基、環庚基等。雜環烷基的實例包括但不限於1-(1,2,5,6-四氫吡啶基)、1-呱啶基、2-呱啶基、3-呱啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-呱嗪基、2-呱嗪基等。此外，所述術語涵蓋了雙環和三環環結構。同樣地，術語「亞雜環烷基」本身或作為另一個取代基的一部分意味著源自於雜環烷基的二價殘基，並且術語「亞環烷基」本身或作為另一個取代基的一部分意味著源自於環烷基的二價殘基。

當在本發明中使用時，術語「水溶性聚合物」是指在水性溶劑中可溶的任何聚合物。水溶性聚合物與IL-2的連接可以引起變化，包括但不限於相對於未修飾形式提高或受調節的血清半衰期或提高或受調節的治療半衰期，受調節的免疫原性，受調節的物理締合特徵例如聚集和多聚體形成，改變的受體結合，改變的與一種或多種結合配偶體的結合，以及改變的受體二聚化或多聚化。所述水溶性聚合物可以具有或可以不具有其自身的生物活性，並且可作為 接頭用於將IL-2附連到其他物質，包括但不限於一個或多個IL-2或一個或多個生物活性分子。適合的聚合物包括但不限於聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述在美國專利號5,252,714中，其通過引用併入本發明)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚胺基酸、二乙烯醚馬來酸酐、N-(2-羥基丙基)-甲基丙烯醯胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括葡聚糖硫酸酯)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纖維素和纖維素衍生物(包括但不限於甲基纖維素和羧甲基纖維素)、澱粉和澱粉衍生物、多肽、聚亞烷基二醇及其衍生物、聚亞烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚(2-羥基乙基)-DL-天冬醯胺等，或其混合物。這些水溶性聚合物的實例包括但不限於聚乙二醇和血清白蛋白。

當在本發明中使用時，術語「聚亞烷基二醇」是指聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。術語「聚亞烷基二醇」涵蓋了直鏈和支鏈聚合物兩者，並且平均分子量在0.1kDa至100kDa之間。其他示例性實施例列於例如商業化供應商的目錄中，例如Shearwater Corporation的目錄「用於生物醫學應用的聚乙二醇和衍生物」(Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications)(2001)。

除非另有陳述，否則術語「芳基」意味著多不飽和的芳香族烴類取代基，其可以是單個環或稠合在一起或共價連接的多個環(包括但不限於1至3個環)。術語「雜芳基」是指含有1至4個選自N、O和S的雜原子的芳基(或環)，其中所述氮和硫原子任選被氧化，並且所述氮原子任選被季銨化。雜芳基可以通過雜原子附連到分子的剩餘部分。芳基和雜芳基的非限制性實例包括苯基、 1-萘基、2-萘基、4-聯苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基(2-imidazolyl)、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基(2-oxazolyl,)、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基(2-thiazolyl)、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯並噻唑基、嘌呤基、2-苯並咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基(2-quinoxalinyl)、5-喹喔啉基、3-喹啉基(3-quinolyl)和6-喹啉基。對於每個上面提到的芳基和雜芳基環系統來說，取代基選自下文描述的可接受的取代基。

簡短來說，術語「芳基」當與其他術語相組合使用時(包括但不限於芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)包括如上所定義的芳基和雜芳基環兩者。因此，術語「芳烷基」意味著包括其中芳基附連到烷基(包括但不限於苯甲基、苯乙基、吡啶甲基等)的那些殘基，所述烷基包括其中碳原子(包括但不限於亞甲基)已被例如氧原子代替的烷基(包括但不限於苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。

每個上述術語(包括但不限於「烷基」、「雜烷基」、「芳基」和「雜芳基」)意味著包括所指明的殘基的取代和未取代的形式兩者。下文提供了每種類型的殘基的示例性取代基。

用於烷基和雜烷基殘基(包括常常被稱為亞烷基、烯基、亞雜烷基、雜烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基和雜環烯基的基團)的取代基可以是選自但不限於以下的各種不同基團中的一者或多者：-OR’，=O，=NR’，=N-OR’，-NR’R”，-SR’，-鹵素，-SiR’R”R'''，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO₂R’，-CONR’R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR’-C(O)NR”R'''，-NR”C(O)₂R’， -NR-C(NR’R”R''')=NR''''，-NR-C(NR’R”)=NR'''，-S(O)R’，-S(O)₂R’，-S(O)₂NR’R”，-NRSO₂R’，-CN和-NO₂，其數目在0至(2m’+1)的範圍內，其中m’是這種殘基中的碳原子總數。R’、R”、R'''和R''''各自獨立地是指氫、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基(包括但不限於被1-3個鹵素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。當本發明的化合物包括超過一個R基團時，例如，每個所述R基團被獨立地選擇，當存在超過一個R’、R”、R'''和R''''基團時，每個這些基團也是如此。當R’和R”被附連到同一個氮原子時，它們可以與所述氮原子組合形成5、6或7元環。例如，-NR’R”意味著包括但不限於1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從上述取代基的討論，本領域技術人員將會理解，術語“烷基”意味著包括包含結合到氫基團之外的基團的碳原子的基團，例如鹵代烷基(包括但不限於-CF₃和-CH₂CF₃)和醯基(包括但不限於-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

與為烷基殘基所描述的取代基相似，用於芳基和雜芳基的取代基是可變化的，並且選自但不限於：鹵素，-OR’，=O，=NR’，=N-OR’，-NR’R”，-SR’，-鹵素，-SiR’R”R'''，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO₂R’，-CONR’R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR’-C(O)NR”R'''，-NR”C(O)₂R’，-NR-C(NR’R”R''')=NR''''，-NR-C(NR’R”)=NR'''，-S(O)R’，-S(O)₂R’，-S(O)₂NR’R”，-NRSO₂R’，-CN和-NO₂，-R’，-N₃，-CH(Ph)₂，氟代(C₁-C₄)烷氧基和氟代(C₁-C₄)烷基，其數目在0至所述芳香環系統上開放價的總數的範圍內；並且其中R’、R”、R'''和R''''獨立地選自氫、烷基、雜烷基、芳基和雜芳基。當本發明的化合物包括超過一個R基團時，例如，每個所述R基團被獨立地選擇，當存在超過一個R’、R”、R'''和R''''基團時，每個這些基團也是如此。

當在本發明中使用時，術語「調節的血清半衰期」意味著修飾的IL-2相對於它的未修飾的形式的循環半衰期(circulating half-life)的正或負變化。血清半衰期通過在IL-2給藥後各個不同時間點獲取血液樣品並確定每個樣品中該分子的濃度來測量。血清濃度與時間的相關性允許計算血清半衰期。提高的血清半衰期理想地具有至少約兩倍，但更小的提高也可能是有用的，例如在它能夠實現令人滿意的給藥方案或避免毒性作用的情況下。在某些實施例中，所述提高是至少約三倍、至少約五倍或至少約十倍。

當在本發明中使用時，術語「調節的治療半衰期」意味著治療有效量的IL-2相對於它的未修飾的形式的半衰期的正或負變化。治療半衰期通過在給藥後的各個不同時間點測量所述分子的藥物代謝動力學及/或藥效學性質來測量。提高的治療半衰期理想地能夠實現特別有益的給藥方案、特別有益的總劑量或避免不良作用。在某些實施例中，所述提高的治療半衰期由效力的提高、修飾的分子與其靶的結合的提高或降低、所述分子被酶例如蛋白酶分解的提高或降低或所述未修飾的分子的另一種作用參數或作用機制的提高或降低或所述分子的受體介導的清除的提高或降低引起。

術語「分離的(isolated)」當用於核酸或蛋白質時，表示所述核酸或蛋白質至少不含在自然狀態下與其相伴的某些細胞組分，或所述核酸或蛋白質已被濃縮到高於它的體內或體外生產的濃度的水準。它可以處於均質(homogeneous)狀態下。分離的物質可以處於乾燥或半乾燥狀態下，或者在溶液(包括但不限於水性溶液)中。它可以是另外包含可藥用載體及/或賦形劑的藥物組合物的組分。純度和均質性通常使用分析化學技術例如聚丙烯醯胺凝膠電泳 或高效液相色譜來確定。作為製劑中存在的主要物質的蛋白質是基本上純化的。具體來說，分離的基因與在所述基因側翼並編碼感興趣的基因之外的蛋白質的開放閱讀框分離開。術語「純化的」表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中基本上產生一個條帶。具體來說，這可能意味著所述核酸或蛋白質是至少85%純、至少90%純、至少95%純、至少99%或更高純的。

術語「核酸」是指去氧核糖核苷酸、去氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其採取單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非特別限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，其具有與參比核酸相似的結合性質並且以與天然存在的核苷酸相似的方式代謝。除非另有特別限制，否則所述術語還指寡核苷酸類似物，包括PNA(肽核酸)、在反義技術中使用的DNA的類似物(硫代磷酸酯、胺基磷酸酯等)。除非另有指明，否則特定核酸序列也暗示地涵蓋其保守修飾的變體(包括但不限於簡並密碼子替換)和互補序列以及所述明確指示的序列。具體來說，簡並密碼子替換可以通過產生其中一個或多個所選(或所有)密碼子的第三位置被混合鹼基及/或去氧肌苷殘基替換的序列來實現(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。

術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本發明中可互換地用於指稱胺基酸殘基的聚合物。也就是說，針對多肽的描述同等地適用於肽的描述和蛋白質的描述，反之亦然。所述術語適用于天然存在的胺基酸聚合物以及其中一個或多個胺基酸殘基是非天然編碼的胺基酸的胺基酸聚合物。當在本發明中使用時，所述術語涵蓋任何長度的胺基酸鏈，包括全長蛋白質，其中所述胺基酸殘基通過共價肽鍵相連。

術語「胺基酸」是指天然存在和非天然存在的胺基酸，以及以與所述天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然編碼的胺基酸是20種常見胺基酸(丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬醯胺酸(aspartic acid)、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸)以及吡咯離胺酸和硒代半胱胺酸。胺基酸類似物是指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構、即結合到氫、羧基、胺基和R基團的α碳的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。這些類似物具有修飾的R基團(例如正白胺酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。對胺基酸的指稱包括例如天然存在的蛋白質L-胺基酸，D-胺基酸，化學修飾的胺基酸例如胺基酸變體和衍生物，天然存在的非蛋白質胺基酸例如β-丙胺酸、鳥胺酸等，以及具有本領域中已知是胺基酸特有的性質的化學合成的化合物。非天然存在的胺基酸的實例包括但不限於α-甲基胺基酸(例如α-甲基丙胺酸)、D-胺基酸、組胺酸樣胺基酸(例如2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、α-氟代甲基-組胺酸和α-甲基-組胺酸)、在側鏈中具有額外亞甲基的胺基酸(「屬人的(homo)」胺基酸)和其中側鏈中的羧酸官能團被磺酸基團代替的胺基酸(例如磺基丙胺酸)。非天然胺基酸(包括合成的非天然胺基酸、取代的胺基酸或一種或多種D-胺基酸)在本發明的蛋白質中的併入，可能以大量不同方式有利。含有D-胺基酸的肽等與含有L-胺基酸的對應物相比表現出提高的體外或體內穩定性。因此，當希望或需要更高的細胞內穩定性時，摻有D-胺基酸的肽等的構造可能是特別有用的。更具體來說，D-肽等對內源肽酶(endogenous peptidases)和蛋白酶有抗性(resistant)，因此當這些性質合乎需要時提供了所述分 子的提高的生物利用度和延長的體內壽命。此外，D-肽等不能被高效加工以用於II類主要組織相容性複合物限制的向T輔助細胞的呈遞(presentation)，因此不太可能在完整生物體中誘導體液免疫反應(humoral immune responses)。

胺基酸在本發明中可以用它們的公知的三字母符號或用IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號來指稱。同樣地，核苷酸可以用它們的普遍接受的單字母編碼來指稱。

「保守修飾的變體(Conservatively modified variants)」適用於胺基酸和核酸序列兩者。對於特定核酸序列而言，「保守修飾的變體」是指編碼一致或基本上一致的胺基酸序列的核酸，或者在所述核酸不編碼胺基酸序列的情況下是指基本上一致的序列。由於遺傳密碼的簡併性(degeneracy)，大量功能上一致的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸由密碼子指定的每個位置處，所述密碼子可以被改變成所描述的任一相應密碼子，而不改變被編碼的多肽。這些核酸變異是「沉默變異(silent variations)」，其是保守修飾的變異中的一種。本發明中每個編碼多肽的核酸序列也描述了所述核酸的每個可能的沉默變異。本領域普通技術人員將會認識到，核酸中的每個密碼子(除了通常是甲硫胺酸的唯一密碼子的AUG和通常是色胺酸的唯一密碼子的TGG之外)都可以被修飾以產生功能上一致的分子。因此，在每個所描述的序列中暗示了編碼多肽的核酸的每個沉默變異。

對於胺基酸序列而言，本領域普通技術人員將會認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白質序列進行的改變、添加或缺失了所述被編碼序列中的單個胺基酸或少量百分數的胺基酸的各個替換、缺失或添加是「保守修飾的變 體」，其中所述改變引起胺基酸的缺失、胺基酸的添加或胺基酸被化學上相似的胺基酸的替換。提供了功能上相似的胺基酸的保守替換表對於本領域普通技術人員來說是已知的。這些保守修飾的變體此外還是並且不排除本發明的多態性變體、種間同系物和等位基因。

提供了功能上相似的胺基酸的保守替換表對於本領域普通技術人員來說是已知的。下述8組各自含有彼此來說是保守替換的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬醯胺酸(aspartic acid)(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)；(參見例如Creighton，《蛋白質：結構和分子性質》(Proteins：Structures and Molecular Properties)(W H Freeman & Co.，第二版(December 1993))。

在兩個或更多個核酸或多肽序列的情況下，術語「一致(identical)」或百分「同一性(identity)」是指兩個或更多個序列或子序列是相同的。通過使用下述序列比較演算法之一(或本領域普通技術人員可獲得的其他演算法)或通過手動對齊和目測檢查來測量，當將序列在比較視窗或指定區域內比較並對齊以獲得最大對應性時，如果它們具有一定百分率的相同的胺基酸殘基或核苷酸(即在規定區域內約60%的同一性、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%的同一性)，則所述序列是「基本上一致的」。這個定義也針對測試序列的互補序列。所述同一性可以存在于長度為至少約50個胺基酸或核苷酸的區域內或長度為75-100個胺基酸或核苷酸的區域內，或者在沒有指明的情況下橫跨多核苷酸或多肽的整個序列。編碼本發明的多肽(包括來自於人類之外的 物種的同源物)的多核苷酸，可以通過包括下述步驟的方法來獲得：在嚴緊雜交條件下使用具有本發明的多核苷酸序列或其片段的標記的探針來篩選文庫，並分離含有所述多核苷酸序列的全長cDNA和基因組複製(clone)。這種雜交技術對於專業技術人員來說是公知的。

短語「選擇性(或特異性)雜交到(selectively(or specifically)hybridizes to)」是指當特定核苷酸序列存在於複雜混合物(包括但不限於總細胞或文庫DNA或RNA)中時，在嚴緊雜交條件下分子僅僅與該特定序列結合、形成雙聯體或雜交。

正如本領域中已知的，短語「嚴緊雜交條件(stringent hybridization conditions)」是指DNA、RNA、PNA或其他核酸類比物或其組合的序列在低離子強度和高溫條件下的雜交。通常，在嚴緊條件下，探針將與核酸的複雜混合物(包括但不限於總細胞或文庫DNA或RNA)中它的靶子序列雜交，但是不與所述複雜混合物中的其他序列雜交。嚴緊條件是序列依賴性的，並且在不同情況下不同。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。

當在本發明中使用時，術語「真核生物」是指屬於真核生物系統域的生物體，例如動物(包括但不限於哺乳動物、昆蟲、爬行類、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包括但不限於單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。

當在本發明中使用時，術語「非真核生物(non-eukaryote)」是指非真核的生物體。例如，非真核生物體可以屬於真細菌(包括但不限於大腸桿菌(Escherichia coli)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等)系統域或古菌(包括但不限於詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、Methanobacterium thermoautotrophicum、鹽桿菌(Halobacterium)例如火山嗜鹽桿菌(Haloferax volcanii)和鹽桿菌屬(Halobacterium)物種NRC-1、Archaeoglobus fulgidus、激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)、Pyrococcus horikoshii、Aeuropyrum pernix等)系統域。

當在本發明中使用時，術語「物件(subject)」是指作為治療、觀察或實驗的目標的動物，在某些實施例中是哺乳動物，並且在其他實施例中是人類。動物可以是伴侶動物(例如狗、貓等)、農場動物(例如奶牛、綿羊、豬、馬等)或實驗動物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。

當在本發明中使用時，術語「有效量(effective amount)」是指給藥的所述修飾的非天然胺基酸多肽的在一定程度上緩解所述待治療的疾病、病症或障礙的一種或多種症狀的量。含有本發明中描述的修飾的非天然胺基酸多肽的組合物可以被給藥以用於預防、增強及/或治療性治療。

術語「增強」意味著在效力或持續時間任一方面提高或延長所需效果。因此，對於增強治療性藥劑的效果而言，術語「增強」是指在效力或持續時間任一方面提高或延長其他治療性藥劑對系統的效果的能力。當在本發明中使用時，「增強有效量」是指在所需系統中足以增強另一種治療性藥劑的效果的量。當在患者中使用時，對這種用途有效的量取決於所述疾病、障礙或病症的嚴重性和過程、以前的治療、患者的健康狀況和對所述藥物的回應以及治療醫生的判斷。

當在本發明中使用時，術語「修飾的」是指對給定多肽做出的任何改變，例如對所述多肽的長度、胺基酸序列、化學結構、多肽的共轉譯修飾 或轉譯後修飾的改變。術語「(修飾的)」形式意味著所討論的多肽任選被修飾，也就是說，所討論的多肽可以被修飾或未被修飾。

術語「轉譯後修飾(post-translationally modified)」是指天然或非天然胺基酸在已被併入到多肽鏈中之後發生在這個胺基酸上的任何修飾。僅僅作為示例，所述術語涵蓋了共轉譯(co-translational)體內修飾、共轉譯體外修飾(例如在無細胞轉譯系統(cell-free translation system)中)、轉譯後體內修飾和轉譯後體外修飾。

在預防性應用中，將含有所述IL-2的組合物給藥到易感或以其他方式具有特定疾病、障礙或病症的風險的患者。這種量被定義為「預防有效量(prophylactically effective amount)」。在這種用途中，精確量也取決於所述患者的健康狀況、體重等。通過常規實驗(例如劑量遞增臨床試驗)確定這種預防有效量，被認為完全在本領域技術範圍之內。

在治療性應用中，將含有所述修飾的非天然胺基酸多肽的組合物以足以治癒或至少部分阻止疾病、病症或障礙的症狀的量給藥到已經患有所述疾病、病症或障礙的患者。這種量被定義為「治療有效量(therapeutically effective amount)」，並且將取決於所述疾病、障礙或病症的嚴重性和過程、以前的治療、患者的健康狀況和對所述藥物的回應以及治療醫生的判斷。通過常規實驗(例如劑量遞增臨床試驗)確定這種治療有效量，被認為完全在本領域技術範圍之內。

術語「治療」被用於指稱預防性及/或治療性治療中的任一者。

本發明中提出的非天然編碼的胺基酸多肽可以包括同位素標記的化合物，其具有被原子量或質量數不同於自然界中通常發現的原子量或質量數的原子代替的一個或多個原子。可以併入到本發明的化合物中的同位素的實 例包括氫、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分別例如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl。本發明中描述的某些同位素標記的化合物，例如其中併入了放射性同位素例如³H和¹⁴C的化合物，可能在藥物及/或物質的組織分佈測定中有用。此外，用同位素例如氘即²H替換，可以得到由更高的代謝穩定性產生的某些治療優點，例如提高的體內半衰期或降低的劑量要求。

所有異構體(isomers)，包括但不限於非對映異構體(diastereomers)、對映異構體(enantiomers)及其混合物被認為是本發明描述的組合物的一部分。在另外的或其他實施例中，所述非天然編碼的胺基酸多肽在給藥到需要的生物體後被代謝以產生代謝物，其隨後被用於產生所需效果，包括所需治療效果。在其他或另外的實施例中是非天然編碼的胺基酸多肽的活性代謝物。

在某些情況下，非天然編碼的胺基酸多肽可以作為互變異構體存在。此外，本發明中描述的非天然編碼的胺基酸多肽可以以非溶劑化形式以及與可藥用溶劑例如水、乙醇等的溶劑化形式存在。所述溶劑化形式也被認為是在本發明中公開。本領域普通技術人員將會認識到，本發明中的某些化合物可以以幾種互變異構體形式存在。所有這些互變異構體形式被認為是本發明描述的組合物的一部分。

除非另有指明，否則使用在本領域技術範圍之內的質譜術、NMR、HPLC、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術和藥理學的常規方法。

I.簡介

在本發明中提供了包含至少一個非天然胺基酸的IL-2分子。在本發明的某些實施例中，所述具有至少一個非天然胺基酸的IL-2包括至少一個轉譯 後修飾。在一個實施例中，所述至少一個轉譯後修飾包括利用本領域普通技術人員已知適合於特定反應性基團的化學方法，將包含第二反應性基團的分子附連到包含第一反應性基團的至少一個非天然胺基酸，所述分子包括但不限於標記物、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交聯劑、放射性核素、細胞毒性化合物、藥物、親和標記物、光親和標記物、反應性化合物、樹脂、第二蛋白質或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因數、脂肪酸、糖類、多核苷酸、DNA、RNA、反義多核苷酸、糖、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、奈米粒子、自旋標記物、螢光團、含金屬組成部分、放射活性組成部分、新官能團、與其他分子共價或非共價相互作用的基團、光籠化組成部分、光化輻射可激發的組成部分、可光異構化的組成部分、生物素、生物素的衍生物、生物素類似物、摻有重原子的組成部分、化學可切割基團、光可切割基團、延長的側鏈、碳連接的糖、氧化還原活性劑、胺基硫代酸、毒性組成部分、同位素標記的組成部分、生物物理探針、磷光基團、化學發光基團、電子緻密基團、磁性基團、嵌入基團、發色團、能量轉移試劑、生物活性藥劑、可檢測標記物、小分子、量子點、奈米發射體、放射性核苷酸、放射性發射體、中子捕獲劑或上述分子的任何組合或任何其他所需化合物或物質。例如，所述第一反應性基團是炔基組成部分(包括但不限於所述非天然胺基酸中的對炔丙氧基苯丙胺酸，其中所述炔丙基有時也被稱為乙炔組成部分)並且所述第二反應性基團是疊氮基組成部分，並且利用[3+2]環加成化學方法。在另一個實例中，所述第一反應性基團是疊氮基組成部分(包括但不限於所述非天然胺基酸中的對疊氮基-L-苯丙胺酸或pAZ，正如在本說明書中它有時被稱為的)並且所述第二反應性基團是炔基組成部分。在本發明的修飾的 IL-2的某些實施例中，使用包含至少一個轉譯後修飾的至少一個非天然胺基酸(包括但不限於含有酮官能團的非天然胺基酸)，其中所述至少一個轉譯後修飾包含糖組成部分。在某些實施例中，所述轉譯後修飾在真核細胞中或在非真核細胞中體內製造。接頭、聚合物、水溶性聚合物或其他分子可以將所述分子附連到所述多肽。在另一個實施例中，所述附連到IL-2的接頭長得足以允許二聚體的形成。所述分子也可以被直接連接到所述多肽。

在某些實施例中，所述IL-2蛋白包含至少一個由一種宿主細胞在體內製造的轉譯後修飾，其中所述轉譯後修飾通常不由另一種宿主細胞類型製造。在某些實施例中，所述蛋白質包括至少一個由真核細胞在體內製造的轉譯後修飾，其中所述轉譯後修飾通常不由非真核細胞製造。轉譯後修飾的實例包括但不限於糖基化、乙醯化、醯化、脂質修飾、棕櫚醯化、棕櫚酸添加、磷酸化、糖脂連接修飾等。

在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個非天然編碼的胺基酸，用於所述多肽的糖基化、乙醯化、醯化、脂質修飾、棕櫚醯化、棕櫚酸添加、磷酸化或糖脂連接修飾。在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個非天然編碼的胺基酸，用於所述多肽的糖基化。在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個天然編碼的胺基酸，用於所述多肽的糖基化、乙醯化、醯化、脂質修飾、棕櫚醯化、棕櫚酸添加、磷酸化或糖脂連接修飾。在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個天然編碼的胺基酸，用於所述多肽的糖基化。

在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個非天然編碼的胺基酸添加及/或替換，其增強所述多肽的糖基化。在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個缺失，其增強所述多肽的糖基化。在某些實施例中，所述IL-2包含一個 或多個非天然編碼的胺基酸添加及/或替換，其增強所述多肽中不同胺基酸處的糖基化。在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個缺失，其增強所述多肽中不同胺基酸處的糖基化。在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個非天然編碼的胺基酸添加及/或替換，其增強所述多肽中非天然編碼的胺基酸處的糖基化。在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個非天然編碼的胺基酸添加及/或替換，其增強所述多肽中天然編碼的胺基酸處的糖基化。在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個天然編碼的胺基酸添加及/或替換，其增強所述多肽中不同胺基酸處的糖基化。在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個非天然編碼的胺基酸添加及/或替換，其增強所述多肽中天然編碼的胺基酸處的糖基化。在某些實施例中，所述IL-2包含一個或多個非天然編碼的胺基酸添加及/或替換，其增強所述多肽中非天然編碼的胺基酸處的糖基化。

在一個實施例中，所述轉譯後修飾包括將寡糖(包括但不限於其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等的情況)通過GlcNAc-天冬醯胺連接附連到天冬醯胺。在另一個實施例中，所述轉譯後修飾包括將寡糖(包括但不限於Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)通過GalNAc-絲胺酸、GalNAc-蘇胺酸、GlcNAc-絲胺酸或GlcNAc-蘇胺酸連接附連到絲胺酸或蘇胺酸。在某些實施例中，本發明的蛋白質或多肽可以包含分泌或定位序列、表位標籤、FLAG標籤、聚組胺酸標籤、GST融合體等。分泌信號序列的實例包括但不限於原核分泌信號序列、真核分泌信號序列、5’-優化以用於細菌表達的真核分泌信號序列、新的分泌信號序列、果膠酸裂解酶分泌信號序列、Omp A分泌信號序列和噬菌體分泌信號序列。分泌信號序列的實例包括但不限於STII(原核生物)、Fd GIII和M13(噬菌體)、Bgl2(酵母)和源自於轉座子的信號序列bla。任何此類序列可以被 修飾以為所述多肽提供所需結果，包括但不限於將一個信號序列用不同信號序列替換，將前導序列用不同前導序列替換等。

所述感興趣的蛋白質或多肽可以含有至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或十個或更多個非天然胺基酸。所述非天然胺基酸可以是相同或不同的，例如，在所述蛋白質中可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個不同位點，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個不同的非天然胺基酸。在某些實施例中，在所述蛋白質的天然存在的形式中存在的至少一個但少於所有的特定胺基酸被非天然胺基酸替換。

本發明提供了基於包含至少一個非天然編碼的胺基酸的IL-2的方法和組合物。至少一個非天然編碼的胺基酸在IL-2中的引入，可以允許使用涉及包括但不限於與一個或多個非天然編碼的胺基酸反應同時不與常見的20種胺基酸反應的特定化學反應的共軛化學。在某些實施例中，包含所述非天然編碼的胺基酸的IL-2通過所述非天然編碼的胺基酸的側鏈連接到水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)。本發明提供了一種用PEG衍生物選擇性修飾蛋白質的高效方法，所述方法包括對選擇器密碼子做出回應將非遺傳編碼的胺基酸(包括但不限於含有在20種天然併入的胺基酸中不存在的官能團或取代基(包括但不限於酮、疊氮基或乙炔組成部分)的胺基酸)選擇性併入到蛋白質中，隨後用適合的反應性PEG衍生物修飾那些胺基酸。一旦併入後，然後可以利用本領域普通技術人員已知的適合於所述非天然編碼的胺基酸中存在的特定官能團或取代基的化學方法來修飾胺基酸側鏈。廣泛類型的已知化學方法適合在本發明中用於將水溶性聚合物併入到所述蛋白質中。這些方法包括但不限於分別使用包括但不限於乙炔或 疊氮化物衍生物的Huisgen[3+2]環加成反應(參見例如Padwa,A.，《綜合有機合成》(Comprehensive Organic Synthesis)，Vol.4,(1991)Ed.Trost,B.M.,Pergamon,Oxford,p.1069-1109；和Huisgen,R.，《1,3-偶極環加成化學》(1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry)，(1984)Ed.Padwa,A.,Wiley,New York,p.1-176)。

由於所述Huisgen[3+2]環加成方法涉及環加成而不是親核取代反應，因此蛋白質可以以極高的選擇性修飾。通過向反應混合物添加催化量的Cu(I)鹽，所述反應可以在室溫下在水性條件中以極好的區位選擇性(1,4>1,5)進行。參見例如Tornoe等，(2002)J.Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599；以及WO 03/101972。可以通過[3+2]環加成添加到本發明的蛋白質的分子事實上包括具有適合的官能團或取代基的任何分子，包括但不限於疊氮基或乙炔衍生物。這些分子可以被添加到具有乙炔基團的非天然胺基酸，包括但不限於對炔丙氧基苯丙胺酸，或具有疊氮基的非天然胺基酸，包括但不限於對疊氮基-苯丙胺酸。

所述從Huisgen[3+2]環加成得到的5元環在還原環境中通常不可逆，並且在水性環境中針對水解長期穩定。因此，廣泛類型的物質的物理和化學特性可以在高要求的水性條件下用本發明的活性PEG衍生物修改。甚至更重要的是，由於疊氮基和乙炔組成部分是彼此特異的(並且不與例如20種常用的遺傳編碼的胺基酸中的任一者反應)，因此蛋白質可以在一個或多個特定位點中以極高的選擇性修飾。

本發明還提供了水溶性和水解穩定的PEG衍生物和相關的具有一個或多個乙炔或疊氮基組成部分的親水性聚合物。所述含有乙炔組成部分的PEG聚合物衍生物，對於與對選擇器密碼子做出回應已被選擇性引入到蛋白質中的 疊氮基組成部分的共軛來說是高選擇性的。同樣地，含有疊氮基組成部分的PEG聚合物衍生物，對於與對選擇器密碼子做出回應已被選擇性引入到蛋白質中的乙炔組成部分的共軛來說是高選擇性的。

更具體來，所述疊氮基組成部分包括但不限於烷基疊氮化物、芳基疊氮化物和這些疊氮化物的衍生物。所述烷基和芳基疊氮化物的衍生物可以包括其他取代基，只要乙炔特異性反應性得以維持即可。所述乙炔組成部分包含烷基和芳基乙炔化合物和每一者的衍生物。所述烷基和芳基乙炔化合物的衍生物可以包括其他取代基，只要所述疊氮基特異性反應性得以維持即可。

本發明提供了具有廣泛類型的官能團、取代基或組成部分的物質與其他物質的共軛物，所述其他物質包括但不限於標記物、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交聯劑、放射性核素、細胞毒性化合物、藥物、親和標記物、光親和標記物、反應性化合物、樹脂、第二蛋白質或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因數、脂肪酸、糖類、多核苷酸、DNA、RNA、反義多核苷酸、糖、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、奈米粒子、自旋標記物、螢光團、含金屬組成部分、放射活性組成部分、新官能團、與其他分子共價或非共價相互作用的基團、光籠化組成部分、光化輻射可激發的組成部分、可光異構化的組成部分、生物素、生物素的衍生物、生物素類似物、摻有重原子的組成部分、化學可切割基團、光可切割基團、延長的側鏈、碳連接的糖、氧化還原活性劑、胺基硫代酸、毒性組成部分、同位素標記的組成部分、生物物理探針、磷光基團、化學發光基團、電子緻密基團、磁性基團、嵌入基團、發色團、能量轉移試劑、生物活性藥劑、可檢測標記物、小分子、量子點、奈米發射體、放射性核苷酸、放射性 發射體、中子捕獲劑或上述物質的任何組合或任何其他所需化合物或物質。本發明還包括具有疊氮基或乙炔組成部分的物質與具有相應的乙炔或疊氮基組成部分的PEG聚合物衍生物的共軛物。例如，含有疊氮基組成部分的PEG聚合物可以在所述蛋白質中含有帶有乙炔官能團的非遺傳編碼的胺基酸的位置處共軛到生物活性分子。將所述PEG與所述生物活性分子共軛的連接包括但不限於Huisgen[3+2]環加成產物。

在本領域中已明確PEG可用於修飾生物材料的表面(參見例如美國專利6,610,281；Mehvar,R.,J.Pharm Sci.,3(1)：125-136(2000)，它們通過引用併入本發明)。本發明還包括表面具有一個或多個反應性疊氮基或乙炔位點並且一種或多種本發明的含疊氮基或乙炔的聚合物通過Huisgen[3+2]環加成連接共軛到所述表面的生物材料。生物材料和其他物質也可以通過疊氮基或乙炔連接之外的連接，例如通過包含羧酸、胺、醇或硫醇組成部分的連接共軛到所述疊氮基或乙炔活化的聚合物衍生物，以留下可用於後續反應的所述疊氮基或乙炔組成部分。

本發明包括合成本發明的含疊氮基和乙炔的聚合物的方法。在所述含疊氮基PEG衍生物的情況下，所述疊氮基可以被直接鍵合到所述聚合物的碳原子。或者，所述含疊氮基PEG衍生物可以通過將具有疊氮基組成部分的連接試劑附連到常規活化的聚合物的一個末端來製備，使得所述得到的聚合物在其末端具有所述疊氮基組成部分。在所述含乙炔PEG衍生物的情況下，所述乙炔可以被直接鍵合到所述聚合物的碳原子。或者，所述含乙炔PEG衍生物可以通過將具有乙炔組成部分的連接試劑附連到常規活化的聚合物的一個末端來製備，使得所述得到的聚合物在其末端具有所述乙炔組成部分。

更具體來說，在所述含疊氮基PEG衍生物的情況下，具有至少一個活性羥基組成部分的水溶性聚合物經歷反應，以產生在其上具有更高反應性組成部分例如甲磺酸酯、三苯甲酸酯、甲苯磺酸酯或鹵素離去基團的取代的聚合物。含有磺醯鹵、鹵素原子和其他離去基團的PEG衍生物的製備和使用對於本領域普通技術人員來說是已知的。所述得到的取代的聚合物然後經歷反應，以用所述更高反應性組成部分取代所述聚合物末端處的疊氮基組成部分。或者，具有至少一個活性親核或親電組成部分的水溶性聚合物與在一個末端處具有疊氮基的連接試劑經歷反應，以便在所述PEG聚合物與所述連接試劑之間形成共價鍵，並且所述疊氮基組成部分位於所述聚合物的末端處。親核和親電組成部分，包括胺、硫醇、醯肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等，對於本領域普通技術人員來說是已知的。

更具體來說，在所述含乙炔PEG衍生物的情況下，具有至少一個活性羥基組成部分的水溶性聚合物經歷反應，以從含有乙炔組成部分的前體置換鹵素或其他活化的離去基團。或者，具有至少一個活性親核或親電組成部分的水溶性聚合物與在一個末端處具有乙炔的連接試劑經歷反應，以便在所述PEG聚合物與所述連接試劑之間形成共價鍵，並且所述乙炔組成部分位於所述聚合物的末端處。鹵素組成部分、活化的離去基團、親核和親電組成部分在有機合成的背景中和PEG衍生物的製備和使用中的用途，對於本領域中的從業人員來說是明確的。

本發明還提供了一種選擇性修飾蛋白質以向所述修飾的蛋白質添加其他物質的方法，所述其他物質包括但不限於水溶性聚合物例如PEG和含有疊氮基或乙炔組成部分的PEG衍生物。所述含疊氮基和乙炔的PEG衍生物可用於 修改其中生物相容性、穩定性、溶解性和缺少免疫原性是重要的表面和分子的性質，並在同時提供將所述PEG衍生物附連到蛋白質的比本領域中以前已知的更具選擇性的手段。

II.用於本發明的通用重組核酸方法

在本發明的大量實施例中，編碼感興趣的IL-2(IL-2 of interest)的核酸將使用重組方法來分離、複製(clone)並通常進行改變。這些實施例用於包括但不限於蛋白質表達或源自於IL-2的變體、衍生物、表達盒(expression cassettes)或其他序列的產生期間。在某些實施例中，編碼本發明的多肽的序列被可操作連接到異源啟動子(heterologous promoter)。

成熟人類IL-2蛋白的胺基酸序列示出在下面的表1中。

編碼包含非天然編碼的胺基酸的IL-2的核苷酸序列可以在包括但不限於具有SEQ ID NO：1、2、3、5或7中示出的胺基酸序列的母體多肽的胺基酸序列的基礎上合成，然後改變所述核苷酸序列以便執行相關胺基酸殘基的引入(即併入或替換)或移除(即缺失或替換)。所述核苷酸序列可以按照常規方法通過定點誘變(site-directed mutagenesis)方便地修改。或者，所述核苷酸序列可以通過化學合成來製備，包括但不限於通過使用寡核苷酸合成儀，其中寡核苷酸 在所需多肽的胺基酸序列的基礎上設計，並優選地選擇那些在將要在其中生產所述重組多肽的宿主細胞中有利的密碼子。例如，編碼所需多肽的部分的幾個小的寡核苷酸可以通過PCR、連接或連接鏈反應來合成和組裝。參見例如Barany等，Proc.Natl.Acad.Sci.88：189-193(1991)；美國專利6,521,427，其通過引用併入本發明。

複製(clone)到pKG0269表達質體中的合成的人類IL-2基因的DNA序列在上文表1中被顯示為SEQ ID NO：4。該DNA序列已進行大腸桿菌密碼子優化。

本發明利用重組遺傳學領域中的常規技術。公開了本發明中使用的通用方法的基礎性文本包括Sambrook等，《分子複製(clone)實驗指南》(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)(第3版，2001)；Kriegler，《基因轉移和表達實驗指南》(Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual)(1990)；和《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等主編，1994)。

本發明還涉及用於通過正交tRNA/RS對體內併入非天然胺基酸的真核宿主細胞、非真核宿主細胞和生物體。宿主細胞用本發明的多核苷酸或包括本發明的多核苷酸的構建體(包括但不限於本發明的載體)進行遺傳工程改造(包括但不限於轉化、轉導或轉染)，所述載體可以是例如複製(clone)載體或表達載體。

將靶核酸引入到細胞中的幾種公知的方法是可用的，其中的任一者可用于本發明。這些方法包括：受體細胞與含有所述DNA的細菌原生質體的融合，電穿孔，彈丸轟擊，和用病毒載體感染(在下文進一步討論)等。細菌細胞 可用於擴增含有本發明的DNA構建體的質體的數目。將所述細菌生長至對數期，並可以通過本領域中已知的各種不同方法(參見例如Sambrook)分離所述細菌內的質體。此外，用於從細菌純化質體的試劑盒是可商購的(參見例如均來自於Pharmacia Biotech的EasyPrep^TM、FlexiPrep^TM；來自於Stratagene的StrataClean^TM；和來自於Qiagen的QIAprep^TM)。然後將所述分離和純化的質體進一步操作，以產生用於轉染細胞或併入到相關載體中以感染生物體的其他質體。典型的載體含有轉錄和轉譯終止子、轉錄和轉譯起始序列和可用於調控所述特定靶核酸的表達的啟動子。所述載體任選地包含通用表達盒，其含有至少一個獨立的終止子序列、允許所述表達盒在真核生物或原核生物或兩者中複製的序列(包括但不限於穿梭載體)和用於原核和真核系統兩者的選擇標記。載體適合於在原核生物、真核生物或兩者中複製和整合。參見Gillam & Smith,Gene 8：81(1979)；Roberts等，Nature,328：731(1987)；Schneider,E.等，Protein Expr.Purif.6(1)：10-14(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(全部同上)。可用於複製(clone)的細菌和噬菌體的目錄被例如ATCC提供，例如《ATCC細菌和噬菌體目錄》(ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage)(1992)，Gherna等主編，由ATCC出版。其他用於測序、複製(clone)的基本程式和分子生物學的其他方面以及隱含的理論考慮，也在Watson等，(1992)，《重組DNA》(Recombinant DNA)第二版，Scientific American Books,NY中找到。此外，實質上任何核酸(和實際上任何標記的核酸，不論是標準還是非標準的)可以從各種不同的商業來源中的任一種定制或標準訂購，所述來源例如Midland Certified Reagent Company(Midland,TX，可以在萬維網網址mcrc.com處獲得)、The Great American Gene Company(Ramona,CA，可以在萬維 網網址genco.com處獲得)、ExpressGen Inc.(Chicago,IL，可以在萬維網網址expressgen.com處獲得)、Operon Technologies Inc.(Alameda,CA)和許多其他來源。

選擇器密碼子(Selector codons)

本發明的選擇器密碼子擴展了蛋白質生物合成機器的遺傳密碼子構架。例如，選擇器密碼子包括但不限於獨特的三鹼基密碼子、無義密碼子例如終止密碼子(包括但不限於琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或卵白石密碼子(UGA))、非天然密碼子、四或更多鹼基密碼子、稀有密碼子等。對於本領域普通技術人員來說顯而易見的是，可以引入到所需基因或多核苷酸中的選擇器密碼子的數目具有廣闊範圍，包括但不限於在編碼所述IL-2的至少一部分的單一多核苷酸中一個或多個、兩個或更多個、三個或更多個、4、5、6、7、8、9、10個或更多個。

在一個實施例中，所述方法包括將作為終止密碼子的選擇器密碼子用於在體內併入一個或多個非天然胺基酸。例如，生產了一種O-tRNA，其識別終止密碼子(包括但不限於UAG)，並被帶有所需非天然胺基酸的O-RS胺醯化，這個O-tRNA不被天然存在的宿主的胺醯基-tRNA合成酶識別。常規的定點誘變可用於將所述終止密碼子(包括但不限於TAG)引入到感興趣的多肽中的感興趣的位置處。參見例如Sayers,J.R.等，(1988)，基於硫代磷酸酯的寡核苷酸引導的誘變(mutagenesis)中的5’-3’外切核酸酶(5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis)，Nucleic Acids Res,16：791-802。當所述O-RS、O-tRNA和編碼所述感興趣的多肽的核酸在體內組合 時，對所述UAG密碼子做出回應所述非天然胺基酸被併入，以給出在指定位置處含有所述非天然胺基酸的多肽。

非天然胺基酸的體內併入可以在不顯著擾亂真核宿主細胞的情況下進行。例如，由於UAG密碼子的抑制效率取決於所述O-tRNA(包括但不限於琥珀抑制子tRNA)與真核釋放因數(包括但不限於eRF)(其結合到終止密碼子並啟動生長的肽從核糖體的釋放)之間的競爭，因此所述抑制效率可以通過包括但不限於提高O-tRNA及/或抑制子tRNA的表達水準來調節。

非天然胺基酸也可以用稀有密碼子編碼。例如，已證明當在體外蛋白質合成反應中精胺酸的濃度降低時，稀有精胺酸密碼子AGG通過用丙胺酸醯化的合成的tRNA高效地插入Ala。參見例如Ma等，Biochemistry,32：7939(1993)。在這種情況下，所述合成的tRNA與作為次要品種存在于大腸桿菌中的天然存在的tRNAArg競爭。某些生物體不使用所有三聯體密碼子。藤黃微球菌(Micrococcus luteus)中未指派的密碼子AGA已被用於在體外轉錄/轉譯提取物中用於插入胺基酸。參見例如Kowal和Oliver，Nucl.Acid.Res.,25：4685(1997)。可以產生本發明的組分以在體內使用這些稀有密碼子。

選擇器密碼子還包括延長的密碼子，包括但不限於四或更多鹼基密碼子例如四、五、六或更多鹼基密碼子，四鹼基密碼子的實例包括但不限於AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五鹼基密碼子的實例包括但不限於AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本發明的特點包括使用基於移碼抑制的延長的密碼子。四或更多鹼基密碼子可以將包括但不限於一個或多個非天然胺基酸插入到同一蛋白質中。例如，在具有反密碼子環例如具有至少8-10nt的反密碼子環的突變的O-tRNA(包括但不限於特殊移碼抑制子tRNA)存 在下，所述四或更多鹼基密碼子被讀為單一胺基酸。在其他實施例中，所述反密碼子環可以解碼包括但不限於至少四鹼基密碼子、至少五鹼基密碼子或至少六鹼基密碼子或更多鹼基密碼子。由於存在256種可能的四鹼基密碼子，因此可以使用四或更多鹼基密碼子在同一細胞中編碼多種非天然胺基酸。參見Anderson等，探索密碼子和反密碼子尺寸的限制(Exploring the Limits of Coden and Anticodon Size)，Chemistry and Biology,9：237-244,(2002)；Magliery，擴展遺傳密碼：四鹼基密碼子的高效抑制子的選擇和在大腸桿菌中使用文庫方法鑒定“移動的”四鹼基密碼子(Expanding the Genetic Code：Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codens and Identification of “Shifty” Four-base Codens with a Library Approach in Escherichia coli)，J.Mol.Biol.307：755-769(2001)。

例如，四鹼基密碼子已被用於在體外生物合成方法中將非天然胺基酸併入到蛋白質中。參見例如Ma等，Biochemistry,32：7939,(1993)；和Hohsaka等，J.Am.Chem.Soc.,121：34(1999)。CGGG和AGGU被用於在體外使用兩種化學醯化的移碼抑制子tRNA，同時將2-萘基丙胺酸和離胺酸的NBD衍生物併入到鏈親合素中。參見例如Hohsaka等，J.Am.Chem.Soc.,121：12194(1999)。在體內研究中，Moore等檢查了具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可以是U、A、G或C)的能力，並發現所述四聯體UAGA可以被具有UCUA反密碼子的tRNALeu以13至26%的效率解碼，並且在0或-1框中很少解碼。參見Moore等，J.Mol.Biol.,298：195(2000)。在一個實施例中，基於稀有密碼子或無義密碼子的延長的密碼子可用于本發明，其可以減少在其他不想要的位置處的錯義通讀(missense readthrough)和移碼抑制(frameshift suppression)。

對於給定系統來說，選擇器密碼子也可以包括天然的三鹼基密碼子之一，其中所述內源系統不使用(或罕見使用)所述天然的鹼基密碼子。例如，這包括缺少識別所述天然的三鹼基密碼子的tRNA的系統及/或其中所述三鹼基密碼子是稀有密碼子的系統。

選擇器密碼子任選地包括非天然鹼基對。這些非天然鹼基對進一步擴展了現有的遺傳字母表。一個額外的鹼基對將三聯體密碼子的數目從64增加到125。第三鹼基對的性質包括穩定和選擇性鹼基配對，被聚合物以高保真度高效地酶促併入到DNA中，以及在新生的非天然鹼基對合成後高效的繼續引物延伸。可以被改造以適用於方法和組合物的非天然鹼基對的描述包括例如Hirao等，用於將胺基酸類似物併入到蛋白質中的非天然鹼基對(An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein)，Nature Biotechnology,20：177-182,(2002)。也參見Wu,Y.等，J.Am.Chem.Soc.124：14626-14630(2002)。其他相關的出版物在下文列出。

對於體內使用來說，所述非天然核苷是可透過膜的，並被磷酸化以形成相應的三磷酸酯。此外，所述增加的遺傳信息是穩定的，並且不被細胞的酶破壞。以前由Benner和其他人做出的嘗試利用了與經典的Watson-Crick對中不同的氫鍵結合模式，其最值得注意的實例是iso-C：iso-G對。參見例如Switzer等，J.Am.Chem.Soc.,111：8322(1989)；和Piccirilli等，Nature,343：33(1990)；Kool，Curr.Opin.Chem.Biol.,4：602(2000)。這些鹼基通常在一定程度上與天然鹼基錯誤配對，並且不能被酶促複製。Kool和合作者證實了鹼基之間的疏水堆積相互作用可以代替氫鍵結合來驅動鹼基對的形成。參見Kool，Curr.Opin.Chem.Biol.,4：602(2000)；和Guckian和Kool，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36,2825(1998)。在 開發滿足所有上述要求的非天然鹼基對的嘗試中，Schultz、Romesberg和合作者系統性地合成並研究了一系列非天然疏水鹼基。發現PICS：PICS自身配對比天然鹼基對更加穩定，並且可以通過大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)高效併入到DNA中。參見例如McMinn等，J.Am.Chem.Soc.,121：11585-6(1999)；和Ogawa等，J.Am.Chem.Soc.,122：3274(2000)。3MN：3MN自身配對可以通過KF以對生物功能來說足夠的效率和選擇性而合成。參見例如Ogawa等，J.Am.Chem.Soc.,122：8803(2000)。然而，兩種鹼基對於進一步複製來說起到鏈終止劑的作用。最近已進化出突變的DNA聚合酶，其可用於複製PICS自身配對。此外，7AI自身配對可以被複製。參見例如Tae等，J.Am.Chem.Soc.,123：7439(2001)。新的金屬鹼基對Dipic：Py也已被開發，其在結合Cu(II)後形成穩定的對。參見Meggers等，J.Am.Chem.Soc.,122：10714(2000)。由於延長的密碼子和非天然密碼子固有地與天然密碼子正交，因此本發明的方法可以利用這種性質來產生用於它們的正交tRNA。

轉譯旁路系統(translational bypassing system)也可用于將非天然胺基酸併入到所需多肽中。在轉譯旁路系統中，大的序列被併入到基因中但不被轉譯成蛋白質。所述序列含有充當線索以誘導核糖體跳過所述序列並在所述插入的下游恢復轉譯的結構。

在某些實施例中，在本發明的方法及/或組合物中，感興趣的蛋白質或多肽(或其部分)由核酸編碼。通常，所述核酸包含至少一個選擇器密碼子、至少兩個選擇器密碼子、至少三個選擇器密碼子、至少四個選擇器密碼子、至少五個選擇器密碼子、至少六個選擇器密碼子、至少七個選擇器密碼子、至少八個選擇器密碼子、至少九個選擇器密碼子、十個或更多個選擇器密碼子。

為感興趣的蛋白質(protein of interest)或多肽編碼的基因可以使用本領域普通技術人員已知並且在本發明中描述的方法來誘變，以包含例如一個或多個用於併入非天然胺基酸的選擇器密碼子。例如，用於感興趣的蛋白質的核酸被誘變以包含一個或多個選擇器密碼子，以供一個或多個非天然胺基酸的併入。本發明包括任何蛋白質的任何此類變體，包括但不限於突變體形式，例如包括至少一個非天然胺基酸。同樣地，本發明還包括相應的核酸，即具有編碼一個或多個非天然胺基酸的一個或多個選擇器密碼子的任何核酸。

編碼感興趣的蛋白質例如IL-2的核酸分子可以被容易地突變，以在所述多肽的任何所需位置處引入半胱胺酸。半胱胺酸被廣泛用於在感興趣的蛋白質上引入反應性分子、水溶性聚合物、蛋白質或廣泛類型的其他分子。適合於將半胱胺酸併入到多肽的所需位置中的方法對於本領域普通技術人員來說是已知的，例如在通過引用併入本發明的美國專利號6,608,183中所描述的和標準的誘變技術。

III.非天然編碼的胺基酸

廣泛類型的非天然編碼的胺基酸適用于本發明。可以將任何數目的非天然編碼的胺基酸引入到IL-2中。一般來說，所述引入的非天然編碼的胺基酸對20種常見的遺傳編碼的胺基酸(即丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬醯胺酸(aspartic acid)、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸)是基本上化學惰性的。在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸包括與20種常見胺基酸中不存在的官能團(包括但不限於疊氮基、酮、醛和胺氧基)高效並選擇性地反應以形成共軛物的側鏈官能團。例如，包括含有疊氮基 官能團的非天然編碼的胺基酸的IL-2可以與聚合物(包括但不限於聚乙二醇或含有炔基組成部分的第二多肽)反應以形成穩定的共軛物，這是因為所述疊氮基和炔官能團的選擇性反應以形成Huisgen[3+2]環加成產物。

α-胺基酸的通用結構示出如下(式I)：

非天然編碼的胺基酸通常是具有上面列出的結構式的任何結構，其中R基團是在20種天然胺基酸中使用的取代基之外的任何取代基，並且可以被適合地用於本發明。由於本發明的非天然編碼的胺基酸通常僅僅在側鏈的結構上不同于天然胺基酸，因此所述非天然編碼的胺基酸與其他胺基酸(包括但不限於天然或非天然編碼的胺基酸)形成醯胺鍵，其方式與它們在天然存在的多肽中形成的方式相同。然而，所述非天然編碼的胺基酸具有不同于所述天然胺基酸的側鏈基團。例如，R任選地包括烷基-、芳基-、醯基-、酮-、疊氮基-、羥基-、肼、氰基-、鹵代-、醯肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒代-、磺醯基-、硼酸酯、硼酸基、磷醯基、膦醯基、膦、雜環、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、胺基等或其任何組合。可能適用于本發明的其他感興趣的非天然存在的胺基酸包括但不限於包含可光活化的交聯劑的胺基酸、自旋標記的胺基酸、螢光胺基酸、結合金屬的胺基酸、含金屬胺基酸、放射性胺基酸、具有新官能團的胺基酸、與其他分子共價或非共價相互作用的胺基酸、光籠化及/或可光異構化的胺基酸、包含生物素或生物素類似物的胺基酸、糖基化胺基酸例如糖取代的絲胺酸、其他糖類修飾的胺基酸、含酮基胺基酸、包含聚乙二醇或聚醚的胺基 酸、重原子取代的胺基酸、化學可切割及/或光可切割胺基酸、具有與天然胺基酸相比延長的側鏈(包括但不限於聚醚或長鏈烴類，包括但不限於大於約5或大於約10個碳的長鏈烴類)的胺基酸、碳連接的含糖胺基酸、氧化還原活性胺基酸、含有胺基硫代酸的胺基酸和包含一個或多個毒性組成部分的胺基酸。

可能適合用於本發明並且可用于與水溶性聚合物反應的示例性的非天然編碼的胺基酸包括但不限於具有羰基、胺氧基、肼、醯肼、胺基脲、疊氮基和炔反應性基團的非天然編碼的胺基酸。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸包含糖組成部分。此類胺基酸的實例包括N-乙醯基-L-葡萄糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯基-L-半乳糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯基-L-葡萄糖胺基-L-蘇胺酸、N-乙醯基-L-葡萄糖胺基-L-天冬醯胺和O-甘露糖胺基-L-絲胺酸。此類胺基酸的實例還包括其中所述胺基酸與糖之間的天然存在的N-或O-連接被自然界中不常見的共價連接(包括但不限於烯烴、肟、硫醚、醯胺等)代替的實例。此類胺基酸的實例還包括在天然存在的蛋白質中不常見的糖類例如2-去氧葡萄糖、2-去氧半乳糖等。

本發明中提供的許多非天然編碼的胺基酸是可商購的，例如從Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)、Novabiochem(EMD Biosciences的分部，Darmstadt,Germany)或Peptech(Burlington,MA,USA)商購。那些不可商購的非天然編碼的胺基酸任選地如本發明中所提供或使用本領域普通技術人員已知的標準方法來合成。對於有機合成技術，參見例如Fessendon和Fessendon的《有機化學》(Organic Chemistry)第二版，Willard Grant Press,Boston Mass(1982)；March的《高等有機化學》(Advanced Organic Chemistry)第三版，Wiley and Sons,New York(1985)；以及Carey和Sundberg的《高等有機化學》(Advanced Organic Chemistry)第三版，部分A和B，Plenum Press,New York(1990)。也參見美國專利號7,045,337和7,083,970，其通過引用併入本發明。除了含有新的側鏈的非天然胺基酸之外，可能適合用於本發明的非天然胺基酸也任選地包含修飾的骨架結構，包括但不限於由式II和III的結構所示出的：

其中Z通常包含OH、NH₂、SH、NH-R'或S-R'；X和Y可以相同或不同，通常包含S或O，並且任選地相同或不同的R和R'通常選自與上文為具有式I的非天然胺基酸所描述的R基團相同的組成成分名單以及氫。例如，本發明的非天然胺基酸任選地在胺基或羧基中包含取代，正如為式II和III所示。這種類型的非天然胺基酸包括但不限於α-羥基酸、α-硫代酸、α-胺基硫代羧酸酯，包括但不限於具有對應於常見20種天然胺基酸的側鏈或非天然側鏈的這些化合物。此外，在所述α-碳處的取代任選地包括但不限於L、D或α-α-雙取代的胺基酸例如D-麩胺酸、D-丙胺酸、D-甲基-O-酪胺酸、胺基丁酸等。其他結構可替選物包括環狀胺基酸例如脯胺酸類似物以及3、4、6、7、8和9元環脯胺酸類似物，β和γ胺基酸例如取代的β-丙胺酸和γ-胺基丁酸。

許多非天然胺基酸是基於天然胺基酸例如酪胺酸、麩醯胺酸、苯丙胺酸等，並且適用于本發明。酪胺酸類似物包括但不限於對位取代的酪胺酸、 鄰位取代的酪胺酸和間位取代的酪胺酸，其中所述取代的酪胺酸包含包括但不限於酮基(包括但不限於乙醯基)、苯甲醯基、胺基、肼、羥胺、硫醇基、羧基、異丙基、甲基、C6-C20直鏈或支鏈烴類、飽和或不飽和烴類、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。此外，還考慮到了多取代的芳基環。可以適用于本發明的麩醯胺酸類似物包括但不限於α-羥基衍生物、γ-取代的衍生物、環狀衍生物和醯胺取代的麩醯胺酸衍生物。可以適用于本發明的苯丙胺酸類似物的實例包括但不限於對位取代的苯丙胺酸、鄰位取代的苯丙胺酸和間位取代的苯丙胺酸，其中所述取代基包含包括但不限於羥基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、疊氮基、碘代、溴代、酮基(包括但不限於乙醯基)、苯甲醯基、炔基等。可以適用于本發明的非天然胺基酸的具體實例包括但不限於對乙醯基-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcβ-絲胺酸、L-多巴、氟代苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對-醯基-L-苯丙胺酸、對-苯甲醯基-L-苯丙胺酸、L-磷醯絲胺酸、膦醯絲胺酸、膦醯酪胺酸、對-碘-苯丙胺酸、對-溴苯丙胺酸、對-胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸和對-炔丙氧基-苯丙胺酸等。可以適用于本發明的各種不同的非天然胺基酸的結構的實例被提供在例如題為“非天然胺基酸的體內併入”(In vivo incorporation of unnatural amino acids)的WO 2002/085923中。對於其他的甲硫胺酸類似物，也參見Kiick等，通過Staudinger連接將疊氮化物併入到重組蛋白中用於化學選擇性修飾(Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation)，PNAS 99：19-24(2002)，其通過引用併入本發明。通過引用併入本發明的題為“含有非天然胺基酸和多肽的組合物、涉及它們的方法及其用途”(Compositions Containing,Methods Involving,and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides)的國際申請號PCT/US06/47822描述了芳香族胺組成部分(包括但不限於對胺基-苯丙胺酸)的還原烷基化和還原胺化。

在本發明的另一個實施例中，所述具有一個或多個非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽被共價修飾。與生物系統的多樣化官能團正交的選擇性化學反應被認為是化學生物學中的重要工具。作為合成化學大家庭中的相對後來者，這些生物正交反應激發了用於化合物文庫合成、蛋白質工程、功能蛋白質組學和細胞表面化學重塑的新策略。疊氮化物作為用於生物共軛的獨特化學處理發揮了重要作用。Staudinger連接已與膦化物一起使用，以標記代謝引入到細胞糖共軛物中的疊氮基糖。所述Staudinger連接可在活體動物中進行，對生理無害；然而，所述Staudinger反應並非沒有不利因素。必需的膦化物易受空氣氧化的影響，並且為增加水溶性和提高反應速率而進行的優化已被證明在合成上具有挑戰性。

疊氮基具有可選的生物正交反應性模式：由Huisgen描述的與炔烴的[3+2]環加成。在其經典形式中，這種反應由於合理的反應速率需要升高的溫度(或壓力)而在生物系統中具有受限的適用性。Sharpless和合作者通過開發被稱為“點擊化學”的銅(I)催化的形式克服了這個障礙，這種形式在生理溫度下和豐富官能化的生物環境中容易進行。這一發現使得能夠對來自於複雜組織裂解物的病毒粒子、核酸和蛋白質進行選擇性修飾。不幸的是，強制性的銅催化劑對細菌和哺乳動物細胞兩者有毒，因此阻礙了其中細胞必須保持存活的應用。已報導了由吸電子取代基活化的炔烴的無催化劑的Huisgen環加成在環境溫度下發生。然而，這些化合物與生物親核物質經歷邁克爾反應(Michael reaction)。

在一個實施例中，提供了包含非天然胺基酸(例如對-(炔丙氧基)-苯丙胺酸)的IL-2的組合物。還提供了包含對-(炔丙氧基)-苯丙胺酸的各種不同組合物，包括但不限於蛋白質及/或細胞。一方面，包含所述對-(炔丙氧基)-苯丙胺酸非天然胺基酸的組合物還包含正交tRNA。所述非天然胺基酸可以被鍵合(包括但不限於共價地)到所述正交tRNA，包括但不限於通過胺基-醯基鍵共價鍵合到所述正交tRNA，共價鍵合到所述正交tRNA的末端核糖的3’OH或2’OH等。

可以通過非天然胺基酸併入到蛋白質中的化學組成部分為所述蛋白質提供了各種不同的優點和操作。例如，酮官能團的獨特反應性允許在體外或體內用大量含有肼或羥胺的試劑中的任一者進行蛋白質的選擇性修飾。例如，重原子非天然胺基酸可能對X-射線結構資料的定相有用。使用非天然胺基酸的重原子的位點特異性引入也在為重原子選擇位置中提供了選擇性和靈活性。光反應性非天然胺基酸(包括但不限於具有二苯甲酮和芳基疊氮化物(包括但不限於苯基疊氮化物)側鏈的胺基酸)允許例如蛋白質的高效體內和體外光交聯。光反應性非天然胺基酸的實例包括但不限於對疊氮基-苯丙胺酸和對苯甲醯基-苯丙胺酸。具有光反應性非天然胺基酸的蛋白質因此可以通過所述光反應性基團的激發被隨意交聯，提供了時間控制。在一個實例中，非天然胺基酸的甲基可以被包括但不限於同位素標記的甲基取代，在包括但不限於使用核磁共振和振動光譜時作為局部結構和動力學的探針。炔基或疊氮基官能團允許例如通過[3+2]環加成反應用分子進行蛋白質的選擇性修飾。

在胺基端處併入到多肽中的非天然胺基酸可以由作為在20種天然胺基酸中使用的取代基之外的任何取代基的R基團和不同于通常存在於α-胺基酸中的NH2基團的第二反應性基團構成(參見式I)。類似的非天然胺基酸可以 在羧基端處併入，其具有不同于通常存在於α-胺基酸中的COOH基團的第二反應性基團(參見式I)。

可以選擇或設計本發明的非天然胺基酸，以提供在20種天然胺基酸中不可獲得的其他特性。例如，非天然胺基酸可以被任選地設計或選擇，以修改例如它們被併入到其中的蛋白質的生物學性質。例如，通過將非天然胺基酸包含在蛋白質中，可以任選地修改下述性質：毒性，生物分佈，溶解性，穩定性例如熱、水解、氧化穩定性、對酶降解的抗性(resistance to enzymatic degradation)等，純化和加工的容易性，結構性質，光譜性質，化學及/或光化學性質，催化活性，氧化還原電勢，半衰期，與其他分子例如共價或非共價反應的能力等。

在某些實施例中，本發明提供了通過肟鍵(oxime bond)連接到水溶性聚合物例如PEG的IL-2。許多類型的非天然編碼的胺基酸適用于形成肟鍵。它們包括但不限於含有羰基、二羰基或羥胺基團的非天然編碼的胺基酸。這些胺基酸被描述在美國專利公佈號2006/0194256、2006/0217532和2006/0217289以及題為“含有非天然胺基酸和多肽的組合物、涉及它們的方法及其用途”(Compositions Containing,Methods Involving,and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides)的WO 2006/069246中，它們整體通過引用併入本發明。非天然編碼的胺基酸也被描述在美國專利號7,083,970和美國專利號7,045,337中，它們整體通過引用併入本發明。

本發明的某些實施例利用在一個或多個位置處被對乙醯基苯丙胺酸胺基酸替換的IL-2多肽。對乙醯基-(+/-)-苯丙胺酸和間乙醯基-(+/-)-苯丙胺酸的合成被描述在通過引用併入的Zhang,Z.等，Biochemistry 42：6735-6746(2003) 中。其他含羰基或二羰基的胺基酸可以由本領域普通技術人員類似地製備。此外，本發明中包括的非天然胺基酸的非限制性的示例性合成呈現在美國專利號7,083,970的圖4、24-34和36-39中，其整體通過引用併入本發明。

具有親電反應性基團的胺基酸允許使用各種不同的反應，尤其是通過親核加成反應來連接分子。這樣的親電反應性基團包括羰基(包括酮基和二羰基)、羰基樣基團(其具有與羰基(包括酮基和二羰基)相似的反應性並在結構上與羰基類似)、掩蔽的羰基(其可以被容易地轉變成羰基(包括酮基和二羰基))或保護的羰基(其在去保護後具有與羰基(包括酮基和二羰基)相似的反應性)。這些胺基酸包括具有式(IV)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；B是任選的，並且在存在時是選自低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、低級亞雜烷基、取代的低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S(O)_k-(其中k 是1、2或3)、-S(O)_k(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)CO-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)_kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)_kN(R’)-、-N(R’)-N=、-C(R’)=N-、-C(R’)=N-N(R’)-、-C(R’)=N-N=、-C(R’)₂-N=N-和-C(R’)₂-N(R’)-N(R’)-的接頭，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；J是

、

、

、

、

、

、

或

；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；每個R”獨立地是H、烷基、取代的烷基或保護基團，或者當存在超過一個R”基團時，兩個R”任選地形成雜環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；每個R₃和R₄獨立地是H、鹵素、低級烷基或取代的低級烷基，或者R₃和R₄或兩個R₃基團任選地形成環烷基或雜環烷基； 或者-A-B-J-R基團一起形成包含至少一個羰基的雙環或三環環烷基或雜環烷基，所述羰基包括二羰基、保護的羰基(包括保護的二羰基)或掩蔽的羰基(包括掩蔽的二羰基)；或者-J-R基團一起形成包含至少一個羰基的單環或雙環環烷基或雜環烷基，所述羰基包括二羰基、保護的羰基(包括保護的二羰基)或掩蔽的羰基(包括掩蔽的二羰基)；前提是當A是亞苯基並且每個R₃是H時，B存在；並且當A是-(CH₂)₄-並且每個R₃是H時，B不是-NHC(O)(CH₂CH₂)-；並且當A和B不存在並且每個R₃是H時，R不是甲基。

此外，包括具有式(V)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；B是任選的，並且在存在時是選自低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、低級亞雜烷基、取代的低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或取代 的亞烷基)-、-S(O)_k-(其中k是1、2或3)、-S(O)_k(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)CO-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)_kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)_kN(R’)-、-N(R’)-N=、-C(R’)=N-、-C(R’)=N-N(R’)-、-C(R’)=N-N=、-C(R’)₂-N=N-和-C(R’)₂-N(R’)-N(R’)-的接頭，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；前提是當A是亞苯基時，B存在；並且當A是-(CH₂)₄-時，B不是-NHC(O)(CH₂CH₂)-；並且當A和B不存在時，R不是甲基。

此外，包括具有式(VI)的結構的胺基酸：

其中： B是選自低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、低級亞雜烷基、取代的低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S(O)_k-(其中k是1、2或3)、-S(O)_k(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)CO-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)_kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)_kN(R’)-、-N(R’)-N=、-C(R’)=N-、-C(R’)=N-N(R’)-、-C(R’)=N-N=、-C(R’)₂-N=N-和-C(R’)₂-N(R’)-N(R’)-的接頭，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；每個R_a獨立地選自H、鹵素、烷基、取代的烷基、-N(R’)₂、-C(O)_kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)₂、-OR’和-S(O)_kR’，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基。

此外，包括了下述胺基酸：

其中這些化合物任選地胺基被保護、羧基被保護或者是其鹽。此外，任何下述非天然胺基酸可以被併入到非天然胺基酸多肽中。

此外，包括下述具有式(VII)的結構的胺基酸：

其中B是任選的，並且在存在時是選自低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、低級亞雜烷基、取代的低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S(O)_k-(其中k是1、2或3)、-S(O)_k(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)CO-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)C(O)O-、 -S(O)_kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)_kN(R’)-、-N(R’)-N=、-C(R’)=N-、-C(R’)=N-N(R’)-、-C(R’)=N-N=、-C(R’)₂-N=N-和-C(R’)₂-N(R’)-N(R’)-的接頭，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；每個R_a獨立地選自H、鹵素、烷基、取代的烷基、-N(R’)₂、-C(O)_kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)₂、-OR’和-S(O)_kR’，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；並且n是0至8；前提是當A是-(CH₂)₄-時，B不是-NHC(O)(CH₂CH₂)-。

此外，包括下述胺基酸：

其中這些化合物任選地胺基被保護、任選地羧基被保護、任選地胺基被保護且羧基被保護，或者是其鹽。此外，這些非天然胺基酸和任何下述的非天然胺基酸可以被併入到非天然胺基酸多肽中。

此外，包括下述具有式(VIII)的結構的胺基酸：

其中A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；B是任選的，並且在存在時是選自低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、低級亞雜烷基、取代的低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S(O)_k-(其中k是1、2或3)、-S(O)_k(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)CO-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)_kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)_kN(R’)-、-N(R’)-N=、-C(R’)=N-、-C(R’)=N-N(R’)-、-C(R’)=N-N=、-C(R’)₂-N=N- 和-C(R’)₂-N(R’)-N(R’)-的接頭，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸。

此外，包括下述具有式(IX)的結構的胺基酸：

B是任選的，並且在存在時是選自低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、低級亞雜烷基、取代的低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S(O)_k-(其中k是1、2或3)、-S(O)_k(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)CO-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)_kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)_kN(R’)-、-N(R’)-N=、-C(R’)=N-、-C(R’)=N-N(R’)-、-C(R’)=N-N=、-C(R’)₂-N=N-和-C(R’)₂-N(R’)-N(R’)-的接頭，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的 烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；其中每個R_a獨立地選自H、鹵素、烷基、取代的烷基、-N(R’)₂、-C(O)_kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)₂、-OR’和-S(O)_kR’，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基。

此外，包括下述胺基酸：

其中這些化合物任選地胺基被保護、任選地羧基被保護、任選地胺基被保護且羧基被保護，或者是其鹽。此外，這些非天然胺基酸和任何下述的非天然胺基酸可以被併入到非天然胺基酸多肽中。

此外，包括下述具有式(X)的結構的胺基酸：

其中B是任選的，並且在存在時是選自低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、低級亞雜烷基、取代的低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S(O)_k-(其中k是1、2或3)、-S(O)_k(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)CO-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)_kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)_kN(R’)-、-N(R’)-N=、-C(R’)=N-、-C(R’)=N-N(R’)-、-C(R’)=N-N=、-C(R’)₂-N=N-和-C(R’)₂-N(R’)-N(R’)-的接頭，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；每個R_a獨立地選自H、鹵素、烷基、取代的烷基、-N(R’)₂、-C(O)_kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)₂、-OR’和-S(O)_kR’，其中每個 R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；並且n是0至8。

此外，包括下述胺基酸：

其中這些化合物任選地胺基被保護、任選地羧基被保護、任選地胺基被保護且羧基被保護，或者是其鹽。此外，這些非天然胺基酸和任何下述的非天然胺基酸可以被併入到非天然胺基酸多肽中。

除了單羰基結構之外，本發明中描述的非天然胺基酸可以包括諸如二羰基、二羰基樣、掩蔽的二羰基和保護的二羰基的基團。

例如，包括下述具有式(XI)的結構的胺基酸：

其中A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；B是任選的，並且在存在時是選自低級亞烷基、取代的低 級亞烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、低級亞雜烷基、取代的低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S(O)_k-(其中k是1、2或3)、-S(O)_k(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)CO-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)_kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)_kN(R’)-、-N(R’)-N=、-C(R’)=N-、-C(R’)=N-N(R’)-、-C(R’)=N-N=、-C(R’)₂-N=N-和-C(R’)₂-N(R’)-N(R’)-的接頭，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸。

此外，包括下述具有式(XII)的結構的胺基酸：

B是任選的，並且在存在時是選自低級亞烷基、取代的低 級亞烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、低級亞雜烷基、取代的低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S(O)_k-(其中k是1、2或3)、-S(O)_k(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)CO-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)_kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)_kN(R’)-、-N(R’)-N=、-C(R’)=N-、-C(R’)=N-N(R’)-、-C(R’)=N-N=、-C(R’)₂-N=N-和-C(R’)₂-N(R’)-N(R’)-的接頭，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；其中每個R_a獨立地選自H、鹵素、烷基、取代的烷基、-N(R’)₂、-C(O)_kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)₂、-OR’和-S(O)_kR’，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基。

此外，包括下述胺基酸：

其中這些化合物任選地胺基被保護、任選地羧基被保護、任選地胺基被保護且羧基被保護，或者是其鹽。此外，這些非天然胺基酸和任何下述的非天然胺基酸可以被併入到非天然胺基酸多肽中。

此外，包括下述具有式(XIII)的結構的胺基酸：

其中B是任選的，並且在存在時是選自低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、低級亞雜烷基、取代的低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-S(O)_k-(其中k是1、2或3)、-S(O)_k(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)CO-(亞烷基或取代的亞烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)_kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)_kN(R’)-、-N(R’)-N=、-C(R’)=N-、-C(R’)=N-N(R’)-、-C(R’)=N-N=、-C(R’)₂-N=N-和-C(R’)₂-N(R’)-N(R’)-的接頭，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基； R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；每個R_a獨立地選自H、鹵素、烷基、取代的烷基、-N(R’)₂、-C(O)_kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)₂、-OR’和-S(O)_kR’，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基；並且n是0至8。

此外，包括下述胺基酸：

其中這些化合物任選地胺基被保護、任選地羧基被保護、任選地胺基被保護且羧基被保護，或者是其鹽。此外，這些非天然胺基酸和任何下述的非天然胺基酸可以被併入到非天然胺基酸多肽中。

此外，包括下述具有式(XIV)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；X₁是C、S或S(O)；並且L是亞烷基、取代的亞烷基、N(R’)(亞烷基)或N(R’)(取代的亞烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基。

此外，包括下述具有式(XIV-A)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基； R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；L是亞烷基、取代的亞烷基、N(R’)(亞烷基)或N(R’)(取代的亞烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基。

此外，包括下述具有式(XIV-B)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；L是亞烷基、取代的亞烷基、N(R’)(亞烷基)或N(R’)(取代的亞烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基。

此外，包括下述具有式(XV)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；X₁是C、S或S(O)；並且n是0、1、2、3、4或5；並且每個CR⁸R⁹基團上的每個R⁸和R⁹獨立地選自H、烷氧基、烷基胺、鹵素、烷基、芳基，或者任何R⁸和R⁹可以一起形成=O或環烷基，或者任何相鄰的R⁸基團可以一起形成環烷基。

此外，包括下述具有式(XV-A)的結構的胺基酸：

其中： A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；n是0、1、2、3、4或5；並且每個CR⁸R⁹基團上的每個R⁸和R⁹獨立地選自H、烷氧基、烷基胺、鹵素、烷基、芳基，或者任何R⁸和R⁹可以一起形成=O或環烷基，或者任何相鄰的R⁸基團可以一起形成環烷基。

此外，包括下述具有式(XV-B)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞 雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；n是0、1、2、3、4或5；並且每個CR⁸R⁹基團上的每個R⁸和R⁹獨立地選自H、烷氧基、烷基胺、鹵素、烷基、芳基，或者任何R⁸和R⁹可以一起形成=O或環烷基，或者任何相鄰的R⁸基團可以一起形成環烷基。

此外，包括下述具有式(XVI)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、 胺基酸、多肽或多核苷酸；X₁是C、S或S(O)；並且L是亞烷基、取代的亞烷基、N(R’)(亞烷基)或N(R’)(取代的亞烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基。

此外，包括下述具有式(XVI-A)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；L是亞烷基、取代的亞烷基、N(R’)(亞烷基)或N(R’)(取代的亞烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基。

此外，包括下述具有式(XVI-B)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；R是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；L是亞烷基、取代的亞烷基、N(R’)(亞烷基)或N(R’)(取代的亞烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基。

此外，包括具有式(XVII)的結構的胺基酸：

其中：A是任選的，並且在存在時是低級亞烷基、取代的低級亞 烷基、低級亞環烷基、取代的低級亞環烷基、低級亞烯基、取代的低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、取代的亞雜烷基、低級亞雜環烷基、取代的低級亞雜環烷基、亞芳基、取代的亞芳基、亞雜芳基、取代的亞雜芳基、亞烷芳基、取代的亞烷芳基、亞芳烷基或取代的亞芳烷基；M是-C(R₃)-、

、

、

、

、

、

、

或

，其中(a)指示鍵合到A基團，並且(b)指示鍵合到相應的羰基，R₃和R₄獨立地選自H、鹵素、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基，或者R₃和R₄或兩個R₃基團或兩個R₄基團任選地形成環烷基或雜環烷基；R是H、鹵素、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；T₃是鍵、C(R)(R)、O或S，並且R是H、鹵素、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸。

此外，包括具有式(XVIII)的結構的胺基酸：

其中：M是-C(R₃)-、

、

、

、

、

、

、

或

，(a)(a)指示鍵合到A基團，並且(b)指示鍵合到相應的羰基，R₃和R₄獨立地選自H、鹵素、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基，或者R₃和R₄或兩個R₃基團或兩個R₄基團任選地形成環烷基或雜環烷基；R是H、鹵素、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；T₃是鍵、C(R)(R)、O或S，並且R是H、鹵素、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；R₁是任選的，並且在存在時是H、胺基保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；並且R₂是任選的，並且在存在時是OH、酯保護基團、樹脂、胺基酸、多肽或多核苷酸；每個R_a獨立地選自H、鹵素、烷基、取代的烷基、-N(R’)₂、-C(O)_kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)₂、-OR’和-S(O)_kR’，其中每個R’獨立地是H、烷基或取代的烷基。

此外，包括具有式(XIX)的結構的胺基酸：

其中： R是H、鹵素、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基；並且T₃是O或S。

此外，包括具有式(XX)的結構的胺基酸：

其中：R是H、鹵素、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基。

此外，包括下述具有式(XXI)的結構的胺基酸：

在某些實施例中，包含非天然胺基酸的多肽被化學修飾以產生反應性羰基或二羰基官能團。例如，可用於共軛反應的醛官能團可以從具有相鄰的胺基和羥基的官能團產生。例如在所述生物活性分子是多肽的情況下，N-端絲胺酸或蘇胺酸(其可能正常存在或者可能通過化學或酶消化而被暴露)可用于在溫和的氧化切割條件下使用高碘酸鹽產生醛官能團。參見例如Gaertner等，Bioconjug.Chem.3：262-268(1992)；Geoghegan,K.& Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Gaertner 等，J.Biol.Chem.269：7224-7230(1994)。然而，本領域中已知的方法局限於在肽或蛋白質的N-端處的胺基酸。

在本發明中，帶有相鄰的羥基和胺基的非天然胺基酸可以作為“掩蔽的(masked)”醛官能團併入到多肽中。例如，5-羥基離胺酸帶有與ε胺基相鄰的羥基。用於產生醛的反應條件通常包括在溫和條件下添加摩爾過量的偏高碘酸鈉，以避免在多肽內的其他位置處氧化。所述氧化反應的pH通常為約7.0。典型的反應包括向所述多肽的緩衝的溶液添加約1.5倍摩爾(molar)過量的偏高碘酸鈉，然後在暗處培養(incubation)約10分鐘。參見例如美國專利號6,423,685。

羰基或二羰基官能團可以與含有羥胺的試劑在溫和條件下，在水性溶液中選擇性地反應，以形成在生理條件下穩定的相應的肟鍵。參見例如Jencks,W.P.，J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.和Tam,J.P.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。此外，羰基或二羰基的獨特的反應性允許在其他胺基酸側鏈存在下進行選擇性修飾。參見例如Cornish,V.W.等，J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.& Stroh,J.G.，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Mahal,L.K.等，Science 276：1125-1128(1997)。

A.羰基反應性基團(Carbonyl reactive groups)

具有羰基反應性基團的胺基酸允許進行各種不同的反應以連接分子(包括但不限於PEG或其他水溶性分子)，尤其是通過親核加成或醇醛縮合反應。

示例性的含羰基胺基酸可以如下表示：

其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；R₂是H、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基；並且R₃是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R₄是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在某些實施例中，n是1，R₁是苯基並且R₂是簡單烷基(即甲基、乙基或丙基)，並且所述酮組成部分位於相對於烷基側鏈的對位中。在某些實施例中，n是1，R₁是苯基並且R₂是簡單烷基(即甲基、乙基或丙基)，並且所述酮組成部分位於相對於烷基側鏈的間位中。

對乙醯基-(+/-)-苯丙胺酸和間乙醯基-(+/-)-苯丙胺酸的合成描述在Zhang,Z.等，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中，其通過引用併入本發明。其他含羰基胺基酸可以由本領域普通技術人員類似地製備。

在某些實施例中，包含非天然編碼的胺基酸的多肽被化學修飾以產生反應性羰基官能團。例如，用於共軛反應的醛官能團可以從具有相鄰的胺基和羥基的官能團產生。例如，在所述生物活性分子是多肽的情況下，N-端絲胺酸或蘇胺酸(其可能正常存在或者可能通過化學或酶消化而暴露出來)可用于在溫和的氧化切割條件下使用高碘酸鹽來產生醛官能團。參見例如Gaertner等，Bioconjug.Chem.3：262-268(1992)；Geoghegan,K.& Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Gaertner等，J.Biol.Chem.269：7224-7230(1994)。然而，本領域中已知的方法局限於在所述肽或蛋白質的N-端處的胺基酸。

在本發明中，帶有相鄰的羥基和胺基的非天然編碼的胺基酸可以作為“掩蔽的”醛官能團併入到多肽中。例如，5-羥基離胺酸帶有與ε胺基相鄰的羥基。用於產生醛的反應條件通常包括在溫和條件下添加摩爾過量的偏高碘酸鈉，以避免在多肽內的其他位置處氧化。所述氧化反應的pH通常為約7.0。典型的反應包括向所述多肽的緩衝的溶液添加約1.5倍摩爾過量的偏高碘酸鈉，然後在暗處培養(incubation)約10分鐘。參見例如美國專利號6,423,685，其通過引用併入本發明。

羰基官能團可以與含有肼、醯肼、羥胺或胺基脲的試劑在溫和條件下在水性溶液中選擇性地反應，以分別形成在生理條件下穩定的相應的腙、肟或半卡巴腙鍵。參見例如Jencks,W.P.，J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.和Tam,J.P.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。此外，羰基的獨特的反應性允許在其他胺基酸側鏈存在下進行選擇性修飾。參見例如Cornish,V.W.等，J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.& Stroh,J.G.，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Mahal,L.K.等，Science 276：1125-1128(1997)。

B.肼(hydrazine)、醯肼(hydrazide)或胺基脲(semicarbazide)反應性基團

含有親核基團例如肼、醯肼或胺基尿素的非天然編碼的胺基酸允許與各種不同的親電基團反應，以形成共軛物(包括但不限於與PEG或其他水溶性聚合物的共軛物)。

示例性的含肼、醯肼或胺基脲的胺基酸可以如下表示：

其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基或不存在；X是O、N或S或不存在；R₂是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R₃是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。

在某些實施例中，n是4，R₁不存在，並且X是N。在某些實施例中，n是2，R₁不存在，並且X不存在。在某些實施例中，n是1，R₁是苯基，X是O，並且氧原子位於所述芳基環上脂族基團的對位。

含醯肼、肼和胺基脲的胺基酸可以從商業化來源獲得。例如，L-麩胺酸-γ-醯肼可以從Sigma Chemical(St.Louis,MO)獲得。其他不可商購的胺基酸可以由本領域普通技術人員製備。參見例如美國專利號6,281,211，其通過引用併入本發明。

含有帶醯肼、肼或胺基尿素官能團的非天然編碼的胺基酸的多肽可以與含有醛或具有相似化學反應性的其他官能團的分子高效且選擇性地反應。參見例如Shao,J.和Tam,J.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。醯肼、肼和胺基脲官能團的獨特反應性使它們與20種常見胺基酸上存在的親核基團(包括但不限於絲胺酸或蘇胺酸的羥基或離胺酸和N-端處的胺基)相比對醛、酮和其他親電基團具有顯著更高的反應性。

C.含胺氧基(Aminooxy-containing)胺基酸

含有胺氧基(也被稱為羥胺(hydroxylamine))基團的非天然編碼的胺基酸允許與各種不同的親電基團反應，以形成共軛物(包括但不限 於與PEG或其他水溶性聚合物的共軛物)。與肼、醯肼和胺基脲類似，胺氧基的高親核性允許它與含有醛或具有相似化學反應性的其他官能團的各種不同分子高效且選擇性地反應。參見例如Shao,J.和Tam,J.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi，Acc.Chem.Res.34：727-736(2001)。儘管與肼基反應的結果是相應的腙，但從胺氧基與含羰基基團例如酮的反應通常得到肟。

示例性的含有胺氧基的胺基酸可以如下表示：

其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10；Y=C(O)或不存在；R₂是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R₃是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在某些實施例中，n是1，R₁是苯基，X是O，m是1，並且Y存在。在某些實施例中，n是2，R₁和X不存在，m是0，並且Y不存在。

含胺氧基的胺基酸可以從容易獲得的胺基酸前體(高絲胺酸、絲胺酸和蘇胺酸)製備。參見例如M.Carrasco和R.Brown，J.Org.Chem.68：8853-8858(2003)。某些含胺氧基的胺基酸例如L-2-胺基-4-(胺氧基)丁酸已從天然來源分離(Rosenthal,G.，Life Sci.60：1635-1641(1997))。其他含胺氧基的胺基酸可以由本領域普通技術人員製備。

D.疊氮基和炔反應性基團

疊氮基和炔官能團的獨特反應性使得它們對多肽和其他生物分子的選擇性修飾極為有用。有機疊氮化物、特別是脂族疊氮化物和炔烴通常對常用的反應性化學條件穩定。具體來說，疊氮基和炔官能團兩者對天然存在的多肽中存在的20種常見胺基酸的側鏈(即R基團)是惰性的。然而，當靠近時，疊氮基和炔基的“彈簧載入”本質被揭示出來，並且它們通過Huisgen[3+2]環加成反應選擇性並高效地反應，以產生相應的三唑。參見例如ChinJ.等，Science 301：964-7(2003)；Wang,Q.等，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Chin,J.W.等，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)。

由於Huisgen環加成反應涉及選擇性環加成反應(參見例如Padwa,A.，《綜合有機合成》(Comprehensive Organic Synthesis)，Vol.4，Trost,B.M.主編(1991)，p.1069-1109；Huisgen,R.，《1,3-偶極環加成化學》(1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY)，Padwa,A.主編，(1984)，p.1-176)而不是親核取代，因此帶有含疊氮基和炔基側鏈的非天然編碼的胺基酸的併入允許得到的多肽在所述非天然編碼的胺基酸的位置處被選擇性修飾。涉及含疊氮基或炔基IL-2的環加成反應可以在室溫和在水性條件下，通過在用於將Cu(II)還原成Cu(I)的還原劑存在下添加催化量的Cu(II)(包括但不限於以催化量的CuSO₄的形式)在原位進行。參見例如Wang,Q.等，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Tornoe,C.W.等，J.Org.Chem.67：3057-3064(2002)；Rostovtsev等，Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599(2002)。示例性的還原劑包括但不限於抗壞血酸鹽、金屬銅、奎寧、氫醌、維生素K、榖胱甘肽、半胱胺酸、Fe²⁺、Co²⁺以及施加的電勢。

在某些情況下，在需要疊氮化物與炔烴之間的Huisgen[3+2]環加成反應時，所述IL-2包含含有炔基組成部分的非天然編碼的胺基酸和待附連到所述胺基酸的含有疊氮基組成部分的水溶性聚合物。或者，也可以進行相反的反應(即使用所述胺基酸上的疊氮基組成部分和所述水溶性聚合物上存在的炔基組成部分)。

疊氮基官能團也可以與含有芳基酯並用芳基膦組成部分適合地官能化的水溶性聚合物選擇性反應，以產生醯胺鍵。所述芳基膦基團原位還原所述疊氮基，並且得到的胺然後與鄰近的酯鍵高效反應，產生相應的醯胺。參見例如E.Saxon和C.Bertozzi，Science 287,2007-2010(2000)。所述含疊氮基胺基酸可以是烷基疊氮化物(包括但不限於2-胺基-6-疊氮基-1-己酸)或芳基疊氮化物(對疊氮基-苯丙胺酸)。

含有芳基酯和膦組成部分的示例性水溶性聚合物可以如下表示：

其中X可以是O、N、S或不存在，Ph是苯基，W是水溶性聚合物，並且R可以是H、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基。示例性的R基團包括但不限於-CH₂、-C(CH₃)₃、-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-C(O)R’、-CONR’R”、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-CN和-NO₂。R’、R”、R'''和R''''各自獨立地是指氫、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基(包括但不限於被1-3個鹵素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。當本發明的化合物包括超過一個R基團 時，例如，每個所述R基團獨立地選擇，當存在超過一個R’、R”、R'''和R''''基團時，每個這些基團也是如此。當R’和R”被附連到相同氮原子時，它們可以與所述氮原子組合以形成5、6或7元環。例如，-NR’R”意味著包括但不限於1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從上述取代基的討論，本領域技術人員將會理解，術語“烷基”意味著包括包含結合到氫基團之外的基團的碳原子的基團例如鹵代烷基(包括但不限於-CF₃和-CH₂CF₃)和醯基(包括但不限於-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

所述疊氮基官能團也可以與含有硫酯並用芳基膦組成部分適合地官能化的水溶性聚合物選擇性反應，以產生醯胺鍵。所述芳基膦基團原位還原所述疊氮基，並且得到的胺然後與硫酯鍵高效反應，產生相應的醯胺。含有硫酯和膦組成部分的示例性水溶性聚合物可以如下表示：

其中n是1-10；X可以是O、N、S或不存在，Ph是苯基，並且W是水溶性聚合物。

示例性的含炔基胺基酸可以如下表示：

其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10，R₂是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R₃是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在某些實施例中，n是1，R₁是苯基，X不存在，m是0並且乙炔組成部分位於 相對於烷基側鏈的對位中。在某些實施例中，n是1，R₁是苯基，X是O，m是1並且炔丙氧基位於相對於烷基側鏈的對位中(即O-炔丙基-酪胺酸)。在某些實施例中，n是1，R₁和X不存在並且m是0(即炔丙基甘胺酸)。

含炔基胺基酸是可商購的。例如，炔丙基甘胺酸可以從Peptech(Burlington,MA)商購。或者，含炔基胺基酸可以按照標準方法製備。例如，對炔丙氧基苯丙胺酸可以例如如Deiters,A.等，J.Am.Chem.Soc.125：11782-11783(2003)中所述來合成，並且4-炔基-L-苯丙胺酸可以如Kayser,B.等，Tetrahedron 53(7)：2475-2484(1997)中所述來合成。其他含炔基胺基酸可以由本領域普通技術人員來製備。

示例性的含疊氮基胺基酸可以如下表示：

其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R₂是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R₃是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在某些實施例中，n是1，R₁是苯基，X不存在，m是0並且疊氮基組成部分位於烷基側鏈的對位。在某些實施例中，n是0-4並且R₁和X不存在，並且m=0。在某些實施例中，n是1，R₁是苯基，X是O，m是2並且β-疊氮基乙氧基組成部分位於相對於烷基側鏈的對位中。

含疊氮基胺基酸可以從商業化來源獲得。例如，4-疊氮基苯丙胺酸可以從Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,IL)獲得。對於那些不可商購的含疊氮基胺基酸來說，所述疊氮基可以使用本領域普 通技術人員已知的標準方法相對容易地製備，包括但不限於通過適合的離去基團(包括但不限於鹵化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯)的置換或通過適當保護的內酯的打開。參見例如March的《高等有機化學》(Advanced Organic Chemistry)(第三版，1985，Wiley and Sons,New York)。

E.胺基硫醇(Aminothiol)反應性基團

β-取代的胺基硫醇官能團的獨特反應性使它們通過噻唑烷的形成而對含有醛基的多肽和其他生物分子的選擇性修飾極為有用。參見例如J.Shao和J.Tam，J.Am.Chem.Soc.,117(14)3893-3899(1995)。在某些實施例中，β-取代的胺基硫醇胺基酸可以被併入到IL-2多肽中，然後與包含醛官能團的水溶性聚合物反應。在某些實施例中，水溶性聚合物、藥物共軛物或其他有效負荷可以通過噻唑烷的形成被共軛到包含β-取代的胺基硫醇胺基酸的IL-2。

F.另外的反應性基團

可以被併入到本發明的IL-2多肽中的另外的反應性基團和非天然編碼的胺基酸(包括但不限於對胺基-苯丙胺酸)被描述在全都整體通過引用併入本發明的下述專利申請中：美國專利公佈號2006/0194256，美國專利公佈號2006/0217532，美國專利公佈號2006/0217289，美國臨時專利號60/755,338；美國臨時專利號60/755,711；美國臨時專利號60/755,018；國際專利申請號PCT/US06/49397；WO 2006/069246；美國臨時專利號60/743,041；美國臨時專利號60/743,040；國際專利申請號PCT/US06/47822；美國臨時專利號60/882,819；美國臨時專利號60/882,500；和美國臨時專利號60/870,594。這些申請也討論了 可能存在於PEG或其他聚合物上用於共軛的反應性基團，包括但不限於羥胺(胺氧基)基團。

具有非天然胺基酸的多肽

非天然胺基酸的併入可以出於各種不同的目的而進行，包括但不限於調節蛋白質與其受體或其受體的一個或多個次單元(subunit)的相互作用，定制蛋白質結構及/或功能的變化，改變尺寸、酸性、親核性、氫鍵形成、疏水性、蛋白酶靶位點的可接近性，靶向組成部分(包括但不限於用於蛋白質陣列)，添加生物活性分子，附連聚合物，附連放射性核素，調節血清半衰期，調節組織穿透性(例如腫瘤)，調節主動運輸，調節組織、細胞或器官特異性或分佈，調節免疫原性，調節蛋白酶抗性等。包括非天然胺基酸的蛋白質可以具有增強的或甚至全新的催化或生物物理性質。例如，通過將非天然胺基酸包括在蛋白質內，任選地修改下述性質：受體結合，毒性，生物分佈，結構性質，光譜性質，化學及/或光化學性質，催化能力，半衰期(包括但不限於血清半衰期)，與其他分子反應(包括但不限於共價或非共價反應)的能力等。包含包括至少一個非天然胺基酸的蛋白質的組合物可用於包括但不限於新的治療劑、診斷劑、催化酶、工業酶、結合蛋白(包括但不限於抗體)，並且包括但不限於蛋白質結構和功能的研究。參見例如Dougherty，非天然胺基酸作為蛋白質結構和功能的探針(Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function)，Current Opinion in Chemical Biology,4：645-652(2000)。

在本發明的一個方面，組合物包括至少一種蛋白質，其具有至少一個包括但不限於至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、 至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個或更多個非天然胺基酸。所述非天然胺基酸可以是相同或不同的，包括但不限於在所述蛋白質中可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個不同位點，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種或更多種不同的非天然胺基酸。另一方面，組合物包括蛋白質，在所述蛋白質中存在的至少一個但少於所有的特定胺基酸被非天然胺基酸替換。對於具有超過一個非天然胺基酸的給定蛋白質來說，所述非天然胺基酸可以是一致或不同的(包括但不限於所述蛋白質可以包括兩種或更多種不同類型的非天然胺基酸，或者可以包括兩個相同的非天然胺基酸)。對於具有超過兩個非天然胺基酸的給定蛋白質來說，所述非天然胺基酸可以是相同、不同的或多個相同類型的非天然胺基酸與至少一種不同非天然胺基酸的組合。

具有至少一個非天然胺基酸的感興趣的蛋白質或多肽是本發明的特點。本發明還包括使用本發明的組合物和方法生產的具有至少一個非天然胺基酸的多肽或蛋白質。賦形劑(包括但不限於可藥用賦形劑)也可以伴隨所述蛋白質存在。

通過在真核細胞中生產具有至少一個非天然胺基酸的感興趣的蛋白質或多肽，蛋白質或多肽通常將包括真核轉譯後修飾。在某些實施例中，蛋白質包括至少一個非天然胺基酸和由真核細胞在體內製造的至少一個轉譯後修飾，其中所述轉譯後修飾不由原核細胞製造。例如，所述轉譯後修飾包括但不限於乙醯化、醯化、脂質修飾、棕櫚醯化(palmitoylation)、棕櫚酸添加、磷酸化、糖脂連接修飾(glycolipid-linkage modification)、糖基化等。

非天然胺基酸的一個優點在於它提供了可用于添加其他分子的另外的化學組成部分。這些修飾可以在真核或非真核細胞體內或者在體外做出。因此，在某些實施例中，所述轉譯後修飾是通過所述非天然胺基酸來實現的。例如，所述轉譯後修飾可以通過親核-親電反應來實現。當前用於蛋白質的選擇性修飾的大多數反應涉及親核與親電反應配偶體之間的共價鍵形成，包括但不限於α-鹵代酮與組胺酸或半胱胺酸側鏈的反應。在這些情況下，選擇性由所述蛋白質中親核殘基的數目和可接近性決定。在本發明的蛋白質中，可以在體外和體內使用其他更具選擇性的反應，例如非天然酮基-胺基酸與醯肼或胺氧基化合物的反應。參見例如Cornish等，J.Am.Chem.Soc.,118：8150-8151(1996)；Mahal等，Science,276：1125-1128(1997)；Wang等，Science 292：498-500(2001)；Chin等，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)；Chin等，Proc.Natl.Acad.Sci.,99：11020-11024(2002)；Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.,100：56-61(2003)；Zhang等，Biochemistry,42：6735-6746(2003)；和Chin等，Science,301：964-7(2003)，其全都通過引用併入本發明。這允許用大量試劑(包括螢光團、交聯劑、糖衍生物和細胞毒性分子)選擇性標記事實上任何蛋白質。參見題為“糖蛋白合成”(Glycoprotein synthesis)的美國專利號6,927,042，其通過引用併入本發明。轉譯後修飾(包括但不限於通過疊氮基胺基酸實現的轉譯後修飾)，可以通過Staudinger連接做出(包括但不限於使用三芳基膦試劑)。參見例如Kiick等，通過Staudinger連接將疊氮化物併入到重組蛋白中用於化學選擇性修飾(Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation)，PNAS 99：19-24(2002)。

IV.包含非天然編碼的胺基酸的IL-2的體內產生

本發明的IL-2多肽可以在體內使用修飾的tRNA和tRNA合成酶產生，以添加或替換在天然存在的系統中不被編碼的胺基酸。

使用在天然存在的系統中不被編碼的胺基酸的tRNA和tRNA合成酶的產生方法被描述在例如美國專利號7,045,337和7,083,970中，其通過引用併入本發明。這些方法涉及產生不依賴于轉譯系統內源的合成酶和tRNA起作用的(並且因此有時被稱為“正交的”)轉譯機器。通常，所述轉譯系統包含正交tRNA(O-tRNA)和正交胺醯基tRNA合成酶(O-RS)。通常，所述O-RS優先用所述轉譯系統中的至少一個非天然存在的胺基酸將O-tRNA胺醯化，並且所述O-tRNA識別所述系統中不被其他tRNA識別的至少一個選擇器密碼子。因此，所述轉譯系統對編碼的選擇器密碼子做出回應，將所述非天然編碼的胺基酸插入到在所述系統中產生的蛋白質中，由此將胺基酸“替換”到所述編碼的多肽中的位置中。

在本領域中已經描述了用於將特定的合成胺基酸插入到多肽中的廣泛種類的正交tRNA和胺醯基tRNA合成酶，並且它們通常適合用於本發明。例如，酮基特異性O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶被描述在Wang,L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：56-61(2003)和Zhang,Z.等，Biochem.42(22)：6735-6746(2003)中。示例性的O-RS或其部分由多核苷酸序列編碼，並包括在美國專利號7,045,337和7,083,970中公開的胺基酸序列，每個所述專利通過引用併入本發明。與所述O-RS一起使用 的相應的O-tRNA分子也描述在美國專利號7,045,337和7,083,970中，其通過引用併入本發明。O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶對的另外的實例描述在WO 2005/007870、WO 2005/007624和WO 2005/019415中。

疊氮基特異性O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶系統的實例描述在Chin,J.W.等，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)中。用於對疊氮基-L-Phe的示例性O-RS序列包括但不限於在通過引用併入本發明的美國專利號7,083,970中所公開的核苷酸序列SEQ ID NO：14-16和29-32以及胺基酸序列SEQ ID NO：46-48和61-64。適合用於本發明的示例性O-tRNA序列包括但不限於在通過引用併入本發明的美國專利號7,083,970中所公開的核苷酸序列SEQ ID NO：1-3。特異性針對特定的非天然編碼的胺基酸的O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶對的其他實例描述在通過引用併入本發明的美國專利號7,045,337中。在釀酒酵母(S.cerevisiae)中併入含酮基和疊氮基的胺基酸兩者的O-RS和O-tRNA被描述在Chin,J.W.等，Science 301：964-967(2003)中。

已報導了幾種其他的正交對(orthogonal pairs)。源自於釀酒酵母tRNA和合成酶的麩醯胺酸醯基(參見例如Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：4780-4785)、天冬胺醯基(參見例如Pastrnak,M.等，(2000)Helv.Chim.Acta 83：2277-2286)和酪胺醯基(參見例如Ohno,S.等，(1998)J.Biochem.(Tokyo,Jpn.)124：1065-1068；和Kowal,A.K.等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：2268-2273)系統已被描述用於在大腸桿菌中潛在地併入非天然胺基酸。源自于大腸桿菌麩醯胺酸醯基(參見例如Kowal,A.K.等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.98：2268-2273)和酪胺醯基(參見例如Edwards,H.和Schimmel,P.(1990)Mol.Cell.Biol.10：1633-1641)合成酶的系統已被描述用於釀酒酵母中。所述大腸桿菌酪胺醯基系統已被用於在哺乳動物細胞中在體內併入3-碘-L-酪胺酸。參見Sakamoto,K.等，(2002)Nucleic Acids Res.30：4692-4699。

O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶的使用涉及編碼非天然編碼的胺基酸的特異性密碼子(選擇器密碼子)的選擇。儘管可以使用任何密碼子，但通常希望選擇在表達所述O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶的細胞中稀有或從不使用的密碼子。例如，示例性密碼子包括無義密碼子例如終止密碼子(琥珀、赭石和卵白石)、四或更多鹼基密碼子和其他稀有或不使用的天然三鹼基密碼子。

特定的選擇器密碼子可以使用本領域中已知的誘變方法(包括但不限於位點特異性誘變、盒式誘變、限制性選擇誘變等)引入到IL-2編碼序列中的適合位置中。

V.IL-2中非天然存在的胺基酸的位置

本發明設想了將一個或多個非天然存在的胺基酸併入到IL-2中。一個或多個非天然存在的胺基酸可以被併入在不破壞所述多肽的活性的特定位置處。這可以通過製造“保守”替換來實現，包括但不限於用疏水胺基酸替換疏水胺基酸、用大體積胺基酸替換大體積胺基酸、用親水胺基酸替換親水胺基酸及/或將所述非天然存在的胺基酸插入到對活性來說不需要的位置中。

可以使用各種不同的生物化學和結構方法為所述IL-2內 非天然編碼的胺基酸的替換選擇所需位點。對於本領域普通技術人員來說顯而易見的是，所述多肽鏈的任何位置適合於選擇以併入非天然編碼的胺基酸，並且選擇可以基於合理設計或通過隨機選擇，用於任何或沒有特定所需目的。所需位點的選擇可用於產生具有任何所需性質或活性的IL-2分子，包括但不限於調節受體結合或與其受體的一個或多個次單元(subunit)、激動劑、超級激動劑、反向激動劑、拮抗劑、受體結合調節劑、受體活性調節劑的結合，二聚體或多聚體形成，相對于本源分子不改變活性或性質，或操縱所述多肽的任何物理或化學性質例如溶解性、聚集或穩定性。例如，所述多肽中IL-2的生物活性所需的位置，可以使用本領域中已知的點突變分析、丙胺酸掃描、飽和誘變和生物活性篩選或同源掃描方法來鑒定。其他方法可用於鑒定用於IL-2的修飾的殘基，包括但不限於序列剖析(Bowie和Eisenberg，Science 253(5016)：164-70,(1991))、旋轉異構體文庫選擇(Dahiyat和Mayo，Protein Sci 5(5)：895-903(1996)；Dahiyat和Mayo，Science 278(5335)：82-7(1997)；Desjarlais和Handel，Protein Science 4：2006-2018(1995)；Harbury等，PNAS USA 92(18)：8408-8412(1995)；Kono等，Proteins：Structure,Function and Genetics 19：244-255(1994)；Hellinga和Richards，PNAS USA 91：5803-5807(1994))和殘基配對潛力(Jones，Protein Science 3：567-574(1994))以及使用Protein Design Automation^®技術的合理設計(參見美國專利號6,188,965、6,269,312、6,403,312、WO98/47089，其通過引用併入本發明)。通過丙胺酸或同源掃描誘變被鑒定為對生物活性來說關鍵的殘基之外的殘基可能是使用非天然編碼的胺基酸的替換的良好候 選者，這取決於為所述多肽尋求的所需活性。或者，被鑒定為對生物活性來說關鍵的位點也可能是使用非天然編碼的胺基酸的替換的良好候選者，這同樣取決於為所述多肽尋求的所需活性。另一種可選方案是在所述多肽鏈上的每個位置中用非天然編碼的胺基酸簡單地製造系列替換並觀察對所述多肽的活性的影響。對於本領域普通技術人員來說顯而易見的是，為任何多肽中使用非天然胺基酸的替換選擇位置的任何手段、技術或方法均適合用於本發明。

也可以檢查含有缺失的IL-2多肽突變體的結構和活性，以確定所述蛋白質的可能對使用非天然編碼的胺基酸的替換耐受的區域。以類似的方式，蛋白酶消化和單複製(clone)抗體可用於鑒定IL-2的負責結合IL-2受體的區域。一旦可能對使用非天然編碼的胺基酸的替換不耐受的殘基已被消除後，可以檢查在每個剩餘位置處所提出的替換的影響。因此，本領域普通技術人員可以容易地鑒定可以用非天然編碼的胺基酸替換的胺基酸位置。

本領域普通技術人員認識到這種IL-2的分析能夠確定與埋藏在所述蛋白質的三級結構內的胺基酸殘基相比，哪些胺基酸殘基被表面暴露。因此，本發明的實施例是用非天然編碼的胺基酸替換作為表面暴露的殘基的胺基酸。

在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到LI-2中的一個或多個下述位置中：第1位之前(即在N-端處)，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133位，或添加到所述蛋白質的羧基端，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。

在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到IL-2或其變體中的一個或多個下述位置中：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位之前，及其任何組合(SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸)。

在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入到對應於IL-2或其變體中如下所述的二級結構或特定胺基酸的一個或多個下述區域中的任何位置處：在疏水相互作用的位置處；在與IL-2受體次單元(包括IL2Rα)相互作用的位置處或附近；在第3或35至45胺基酸位置內；在前107個N-端胺基酸內；在第61-72胺基酸位置內；每個所述位置為SEQ ID NO：2的位置或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸位置。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入在IL-2或其變體的一個或多個下述位置處：SEQ ID NO：2的第1位之前(即在N-端處)，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43位，及其任何組合；或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸。在某些實施例中，一個或多個非天然編碼的胺基酸被併入在IL-2或其變體的一個或多個下述位置處：SEQ ID NO：2的第44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133位，或添加到所述蛋白質的羧基端，及其任何組合；或SEQ ID NO：3、5或7中的相應胺基酸。

在某些實施例中，所述IL-2多肽是激動劑，並且一個或多個這些區域中的非天然存在的胺基酸被連接到水溶性聚合物，包括但不限於：第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位。在某些實施例中，所述IL-2多肽是激動劑，並且一個或多個這些區域中的非天然存在的胺基酸被連接到水溶性聚合物，包括但不限於：在第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位附近。

廣泛種類的非天然編碼的胺基酸可以被替換或併入到IL-2中的給定位置中。通常，用於併入的具體的非天然編碼的胺基酸在下述基礎上選擇：IL-2多肽或其他IL-2家族成員與其受體的三維晶體結 構的檢查，保守替換的偏好性(即基於芳基的非天然編碼的胺基酸例如對乙醯基苯丙胺酸或O-炔丙基酪胺酸替換Phe、Tyr或Trp)，以及人們希望引入到所述IL-2中的特定共軛化學(例如如果人們希望與帶有炔基組成部分的水溶性聚合物實現Huisgen[3+2]環加成或者與帶有芳基酯並因而併入膦組成部分的水溶性聚合物實現醯胺鍵形成，則引入4-疊氮基苯丙胺酸)。

在一個實施例中，所述方法還包括：在所述蛋白質中併入所述非天然胺基酸，其中所述非天然胺基酸包含第一反應性基團；以及將所述蛋白質與包含第二反應性基團的分子相接觸(所述分子包括但不限於標記物、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交聯劑(photocrosslinker)、放射性核素、細胞毒性化合物、藥物、親和標記物、光親和標記物、反應性化合物、樹脂、第二蛋白質或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因數、脂肪酸、糖類、多核苷酸、DNA、RNA、反義多核苷酸、糖、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、奈米粒子(nanoparticle)、自旋標記物、螢光團、含金屬組成部分、放射活性組成部分、新官能團、與其他分子共價或非共價相互作用的基團、光籠化組成部分、光化輻射可激發的組成部分、可光異構化的組成部分、生物素、生物素的衍生物、生物素類似物、摻有重原子的組成部分、化學可切割基團、光可切割基團、延長的側鏈、碳連接的糖、氧化還原活性劑、胺基硫代酸、毒性組成部分、同位素標記的組成部分、生物物理探針、磷光基團、化學發光基團、電子緻密基團、磁性基團、嵌入基團、發色團、能量轉移試劑、生物活性藥劑、可檢測 標記物、小分子、量子點、奈米發射體、放射性核苷酸、放射性發射體、中子捕獲劑或上述分子的任何組合或任何其他所需化合物或物質)。所述第一反應性基團通過[3+2]環加成與所述第二反應性基團反應，以將所述分子附連到所述非天然胺基酸。在一個實施例中，所述第一反應性基團是炔基或疊氮基組成部分，並且所述第二反應性基團是疊氮基或炔基組成部分。例如，所述第一反應性基團是炔基組成部分(包括但不限於非天然胺基酸對炔丙氧基苯丙胺酸中的)，並且所述第二反應性基團是疊氮基組成部分。在另一個實例中，所述第一反應性基團是疊氮基組成部分(包括但不限於非天然胺基酸對疊氮基-L-苯丙胺酸中的)，並且所述第二反應性基團是炔基組成部分。

在某些情況下，將所述非天然編碼的胺基酸替換與所述IL-2內的其他添加、替換或缺失相組合，以影響所述IL-2多肽的其他生物性狀。在某些情況下，所述其他添加、替換或缺失可以提高所述IL-2的穩定性(包括但不限於蛋白水解降解的抗性)或提高所述IL-2對其受體的親和性。在某些情況下，所述其他添加、替換或缺失可以提高所述IL-2的製藥穩定性。在某些情況下，所述其他添加、替換或缺失可以增強所述IL-2的腫瘤抑制及/或腫瘤減小活性。在某些情況下，所述其他添加、替換或缺失可以提高所述IL-2或變體的溶解性(包括但不限於當在大腸桿菌或其他宿主細胞中表達時)。在某些實施例中，添加、替換或缺失可以提高所述IL-2在大腸桿菌或其他重組宿主細胞中表達後的溶解性。在某些實施例中，除了用於併入導致所述多肽在大腸桿菌或其他重組宿主細胞中表達後的溶解性提高的非天然胺基酸的另一個位點之外，還選擇 用於天然編碼的或非天然胺基酸的替換的位點。在某些實施例中，所述IL-2多肽包含另一個添加、替換或缺失，其調節對IL-2受體、結合蛋白或相關配體的親和性，調節結合到IL-2受體後的信號轉導，調節循環半衰期，調節釋放或生物利用度，促進純化，或改進或改變特定給藥途徑。在某些實施例中，所述IL-2多肽包含提高所述IL-2變體對其受體的親和性的添加、替換或缺失。在某些實施例中，所述IL-2包含提高所述IL-2變體對IL-2-R1及/或IL-2-R2的親和性的添加、替換或缺失。同樣地，IL-2多肽可以包含化學或酶切割序列、蛋白酶切割序列、反應性基團、抗體結合結構域(包括但不限於FLAG或聚His)或其他基於親和性的序列(包括但不限於FLAG、聚His、GST等)或連接的分子(包括但不限於生物素)，其改善檢測(包括但不限於GFP)、純化、通過組織或細胞膜的轉運、前體藥物釋放或活化、IL-2尺寸減小或所述多肽的其他性狀。

在某些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸的替換產生IL-2拮抗劑。在某些實施例中，非天然編碼的胺基酸被替換或添加在與受體結合相關的區域中。在某些實施例中，IL-2拮抗劑包含導致IL-2起到拮抗劑作用的至少一個替換。在某些實施例中，所述IL-2拮抗劑包含存在於所述IL-2分子的受體結合區中的連接到水溶性聚合物的非天然編碼的胺基酸。

在某些情況下，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個胺基酸被一個或多個非天然編碼的胺基酸替換。在某些情況下，所述IL-2還包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個天然存在的胺基酸被一個或多個非天然編碼的胺基酸的替換。例如，在某些實施例 中，IL-2中的一個或多個殘基被一個或多個非天然編碼的胺基酸替換。在某些情況下，所述一個或多個非天然編碼的殘基被連接到一個或多個較低分子量的直鏈或支鏈PEG，由此相對于附連到單個較高分子量的PEG的物質提高結合親和性和可比的血清半衰期。

VI.在非真核生物和真核生物中的表達

為了獲得複製(clone)的IL-2多核苷酸的高水準表達，人們通常將編碼本發明的IL-2多肽的多核苷酸亞複製(clone)在表達載體中，所述表達載體含有指導轉錄的強啟動子、轉錄/轉譯終止子，以及如果用於編碼蛋白質的核酸的話用於轉譯起始的核糖體結合位點。適合的細菌啟動子對於本領域普通技術人員來說是已知的，並描述在例如Sambrook等和Ausubel等中。

在包括但不限於大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和沙門氏菌(Salmonella)中，用於表達本發明的IL-2的細菌表達系統是可用的(Palva等，Gene 22：229-235(1983)；Mosbach等，Nature 302：543-545(1983))。用於這些表達系統的試劑盒是可商購的。用於哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統對於本領域普通技術人員來說是已知的，並且也是可商購的。在使用正交tRNA和胺醯基tRNA合成酶(上述)來表達本發明的IL-2多肽的情況下，用於表達的宿主細胞在它們使用所述正交組分的能力的基礎上選擇。示例性的宿主細胞包括革蘭氏陽性細菌(包括但不限於短芽孢桿 菌(B.brevis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或鏈黴菌(Streptomyces))和革蘭氏陰性細菌(大腸桿菌(E.coli)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida))以及酵母和其他真核細胞。包含O-tRNA/O-RS對的細胞可以如本發明中所述使用。

本發明的真核宿主細胞或非真核宿主細胞提供了以有用的大量合成包含非天然胺基酸的蛋白質的能力。在一種情況下，所述組合物任選地包含包括但不限於至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多的包含非天然胺基酸的蛋白質，或者可以使用體內蛋白質生產方法獲得的量(關於重組蛋白生產和純化的詳情提供在本發明中)。在另一種情況下，所述蛋白質任選地以包括但不限於至少10微克蛋白質/升、至少50微克蛋白質/升、至少75微克蛋白質/升、至少100微克蛋白質/升、至少200微克蛋白質/升、至少250微克蛋白質/升、至少500微克蛋白質/升、至少1毫克蛋白質/升或至少10毫克蛋白質/升或更高的濃度存在於所述組合物中，包括但不限於在細胞裂解物、緩衝液、藥物緩衝液或其他液體懸液中(包括但不限於在包括但不限於約1nl至約100L或更大之間的任何體積中)。包括至少一個非天然胺基酸的蛋白質在真核細胞中的大量(包括但不限於比使用其他方法(包括但不限於體外轉譯)所通常可能的量更大)生產，是本發明的特點。

本發明的真核宿主細胞或非真核宿主細胞提供了以有用 的大量生物合成包含非天然胺基酸的蛋白質的能力。例如，包含非天然胺基酸的蛋白質可以以包括但不限於至少10μg/升、至少50μg/升、至少75μg/升、至少100μg/升、至少200μg/升、至少250μg/升或至少500μg/升、至少1mg/升、至少2mg/升、至少3mg/升、至少4mg/升、至少5mg/升、至少6mg/升、至少7mg/升、至少8mg/升、至少9mg/升、至少10mg/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900mg/升、1g/升、5g/升、10g/升或更高的蛋白質濃度在細胞提取物、細胞裂解物、培養基、緩衝液等中生產。

適合於IL-2的表達的大量載體是可商購的。用於真核宿主的有用的表達載體包括但不限於包含來自於SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細胞病毒的表達控制序列的載體。這樣的載體包括pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)和pCI-neo(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)。可以使用細菌質體例如來自於大腸桿菌的質體，包括pBR322、pET3a和pET12a，廣宿主範圍質體例如RP4，噬菌體DNA例如λ噬菌體例如NM989和其他DNA噬菌體例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體的大量衍生物。2μ質體及其衍生物、POT1載體(通過引用併入本發明的美國專利號4,931,373)、在(Okkels,Ann.New York Aced.Sci.782,202 207,1996)中描述的pJSO37載體和pPICZ A、B或C(Invitrogen)，可以與酵母宿主細胞一起使用。對於昆蟲細胞來說，載體包括但不限於pVL941、pBG311(Cate等，“用於苗勒管抑制物質的牛和人類基因的分離和所述人類基因在動物細胞中的表達”(Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells)，Cell,45,pp.685 98(1986))、pBluebac 4.5和pMelbac(Invitrogen,Carlsbad,CA)。

編碼IL-2或其變體的核苷酸序列可以也包括或者可以不包括編碼信號肽的序列。當所述多肽要從它在其中表達的細胞分泌時，所述信號肽存在。這些信號肽可以是任何序列。所述信號肽可以是原核的或真核的。Coloma,M(1992)J.Imm.Methods 152：89 104描述了在哺乳動物細胞中使用的信號肽(鼠類Ig κ輕鏈信號肽)。其他信號肽包括但不限於來自於釀酒酵母的α-因數信號肽(通過引用併入本發明的美國專利號4,870,008)、小鼠唾液澱粉酶的信號肽(O.Hagenbuchle等，Nature 289,1981,pp.643-646)、改良的羧肽酶信號肽(L.A.Valls等，Cell 48,1987,pp.887-897)、酵母BAR1信號肽(WO 87/02670，其通過引用併入本發明)和酵母天冬醯胺酸(aspartic acid)蛋白酶3(YAP3)信號肽(參見M.Egel-Mitani等，Yeast 6,1990,pp.127-137)。

適合的哺乳動物宿主細胞的實例對於本領域普通技術人員來說是已知的。這些宿主細胞可以是中華倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如CHO-K1；ATCC CCL-61)、綠猴細胞(COS)(例如COS1(ATCC CRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))、小鼠細胞(例如NS/O)、幼倉鼠腎(BHK)細胞株(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人類細胞(例如HEK 293(ATCC CRL-1573))，以及組織培養物中的植物細胞。這些細胞株和其他細胞株可以從公共保藏庫例如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,Md)獲得。為了提供IL-2多肽的提高的糖基化，可以對哺乳動物宿主細胞進行修飾以表達唾液酸基轉移酶例 如1,6-唾液酸基轉移酶，例如在通過引用併入本發明的美國專利號5,047,335中所描述的。

用於將外源DNA引入到哺乳動物宿主細胞中的方法包括但不限於磷酸鈣介導的轉染、電穿孔、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體介導的轉染、病毒載體和Life Technologies Ltd,Paisley,UK描述的使用Lipofectamin 2000和Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,USA描述的使用FuGENE 6的轉染方法。這些方法在本領域中是公知的，並且被Ausbel等主編，1996，《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons,New York,USA來描述。哺乳動物細胞的培養可以按照已建立的方法來進行，例如在(《動物細胞生物技術、方法和方案》(Animal Cell Biotechnology,Methods and Protocols)，Nigel Jenkins主編，1999，Human Press Inc.Totowa,N.J.,USA以及Harrison Mass.和Rae IF，《細胞培養的通用技術》(General Techniques of Cell Culture)，Cambridge University Press 1997)中所公開的。

I. 大腸桿菌(E.Coli)、假單胞菌物種(Pseudomonas species)和其他原核生物 細菌表達技術對於本領域普通技術人員來說是已知的。可獲得大量各種不同的載體用於細菌宿主中。所述載體可以是單拷貝或者低或高多拷貝載體。載體可用於複製(clone)及/或表達。有鑒於關於載體的大量文獻、許多載體的商業可獲得性和甚至是描述載體及其限制性圖譜和特徵的手冊，在這裡並不需要深入討論。正如眾所周知的，載體通常包含允許進行選擇的標記，所述標記可能提供細胞毒性藥劑抗性、原養型或免疫力。通常存在提供不同特徵的多個標記。

細菌啟動子是能夠結合細菌RNA聚合酶並啟動下游(3')編碼序列(例如結構基因)轉錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子具有轉錄起始區，其通常位於編碼序列的5'末端附近。這個轉錄起始區通常包括RNA聚合酶結合位點和轉錄起始位點。細菌啟動子還可以具有被稱為操縱子的第二個結構域，其可以與RNA合成開始處的鄰近RNA聚合酶結合位點交疊。所述操縱子允許負調控的(可誘導的)轉錄，因為基因阻遏蛋白可以結合所述操縱子並因此抑制特定基因的轉錄。在不存在負調控元件例如操縱子的情況下可能發生組成型表達。此外，正調控可以通過基因啟動蛋白結合序列來實現，所述序列如果存在的話，通常在所述RNA聚合酶結合序列附近(5')。基因啟動蛋白的實例是分解代謝物啟動蛋白(CAP)，其在大腸桿菌中幫助起始lac操縱子的轉錄(Raibaud等，ANNU.REV.GENET.(1984)18：173)。因此，調控表達可以是正或負的，從而增強或減弱轉錄。

編碼代謝途徑酶的序列提供了特別有用的啟動子序列。實例包括源自於糖代謝酶例如半乳糖、乳糖(lac)(Chang等，NATURE(1977)198：1056)和麥芽糖的啟動子序列。其他實例包括源自于生物合成酶例如色胺酸(trp)的啟動子序列(Goeddel等，NUC.ACIDS RES.(1980)8：4057；Yelverton等，NUCL.ACIDS RES.(1981)9：731；美國專利號4,738,921；歐洲專利公佈號036 776和121 775，其通過引用併入本發明)。β-半乳糖苷酶(bla)啟動子系統(Weissmann(1981)，干擾素的複製(clone)和其他錯誤(The cloning of interferon and other mistakes)，Interferon 3(I.Gresser主編))、噬菌體λPL(Shimatake等，NATURE(1981)292：128)和T5(美國專利號4,689,406，其通過引用併入本發明)啟動子系統也提供了有用的啟動子序 列。本發明的優選方法利用強啟動子例如T7啟動子來以高水準誘導IL-2多肽。這些載體的實例對於本領域普通技術人員來說是已知的，並包括來自於Novagen的pET29系列和在通過引用併入本發明的WO99/05297中描述的pPOP載體。這些表達系統在宿主中生產高水準的IL-2多肽，而不損害宿主細胞生存力或生長參數。pET19(Novagen)是本領域中已知的另一種載體。

此外，自然界中不存在的合成啟動子(synthetic promoters)也起到細菌啟動子的作用。例如，可以將一種細菌或噬菌體啟動子的轉錄啟動序列與另一種細菌或噬菌體啟動子的操縱子序列聯結，產生合成的雜合啟動子(美國專利號4,551,433，其通過引用併入本發明)。例如，tac啟動子是一種雜合的trp-lac啟動子，包含trp啟動子和受到lac阻遏蛋白調控的lac操縱子序列兩者(Amann等，GENE(1983)25：167；de Boer等，PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80：21)。此外，細菌啟動子可以包括具有結合細菌RNA聚合酶並起始轉錄的能力的非細菌來源的天然存在的啟動子。非細菌來源的天然存在的啟動子也可以與相容的RNA聚合酶耦合，以在原核生物中產生某些基因的高水準表達。噬菌體T7 RNA聚合酶/啟動子系統是耦合啟動子系統的實例(Studier等，J.MOL.BIOL.(1986)189：113；Tabor等，Proc Natl.Acad.Sci.(1985)82：1074)。此外，雜合啟動子也可以包含噬菌體啟動子和大腸桿菌操縱子區(歐洲專利公佈號267 851)。

除了有功能的啟動子序列之外，高效的核糖體結合位點對於外來基因在原核生物中的表達也是有用的。在大腸桿菌中，所述核糖體結合位點被稱為Shine-Dalgarno(SD)序列，並包括起始密碼子(ATG)和位於所述起始密碼子上游3-11個核苷酸的長度為3-9個核苷酸的序列(Shine等，NATURE(1975)254：34)。所述SD序列據認為通過SD序列與大腸桿菌16S rRNA的 3'末端之間的鹼基配對來促進mRNA與核糖體的結合(Steitz等，信使RNA中的遺傳信號和核苷酸序列(Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA)，《生物調控和發育：基因表達》(Biological Regulation and Development：Gene Expression)(R.F.Goldberger主編，1979))。為了表達具有弱的核糖體結合位點的真核基因和原核基因(Sambrook等，複製(clone)的基因在大腸桿菌中的表達(Expression of cloned genes in Escherichia coli)，《分子複製(clone)實驗指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，1989)。

術語“細菌宿主”或“細菌宿主細胞”是指可以用作或已被用作重組載體或其他轉移DNA的受體的細菌。所述術語包括已被轉染的原始細菌宿主細胞的後代。應該理解，由於偶然或故意的突變，單一親代細胞的後代可能不一定在形態或整套基因組或總DNA上與原始親代完全一致。所述親代細胞的通過相關性質例如編碼IL-2多肽的核苷酸序列的存在來表徵的與所述親代足夠相似的後代，被包括在該定義所打算的後代之內。

用於表達IL-2多肽的適合的宿主細菌的選擇為本領域普通技術人員所知。在選擇用於表達的細菌宿主中，適合的宿主可以包括那些顯示出具有尤其是良好的包含體形成能力、低蛋白水解活性和總體穩健性的宿主。細菌宿主通常可以從各種不同的來源獲得，包括但不限於加利福尼亞大學生物物理學和醫學物理學系細菌遺傳儲用物保藏中心(Bacterial Genetic Stock Center,Department of Biophysics and Medical Physics,University of California(Berkeley,CA))和美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection(“ATCC”)(Manassas,VA))。工業/製藥發酵通常使用源自於K株的細菌(例如W3110)或源自於B株的細菌(例如BL21)。這些菌株由於它們的生長參數被 極好地瞭解並且是穩健的，因此是特別有用的。此外，這些菌株是非致病的，這出於安全性和環境原因在商業上是重要的。適合的大腸桿菌宿主的其他實例包括但不限於BL21、DH10B菌株或其衍生株。在本發明的方法的另一個實施例中，所述大腸桿菌菌株是蛋白酶減弱菌株，包括但不限於OMP-和LON-。所述宿主細胞菌株可以是假單胞菌屬(Pseudomonas)物種，包括但不限於螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。被命名為MB101株的螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)生物變種1，已知對重組生產有用並且可用於治療性蛋白生產過程。假單胞菌表達系統的實例包括可以從The Dow Chemical Company作為宿主菌株獲得的系統(Midland,MI，可以在萬維網網址dow.com處獲得)。

一旦重組宿主細胞菌株已被建立後(即表達構建體已被引入到宿主細胞中並且分離到帶有正確的表達構建體的宿主細胞)，將所述重組宿主細胞菌株在適合於生產IL-2多肽的條件下培養。正如對於本領域普通技術人員來說顯而易見的，培養所述重組宿主細胞菌株的方法取決於使用的表達構建體的本質和所述宿主細胞的身份。重組宿主菌株通常使用本領域普通技術人員已知的方法來培養。重組宿主細胞通常在含有可同化的碳、氮和無機鹽來源並任選地含有維生素、胺基酸、生長因數和本領域普通技術人員已知的其他蛋白質培養增補物的液體培養基中培養。用於宿主細胞培養的液體培養基可以任選地含有用於防止不想要的微生物生長的抗生素或抗真菌劑及/或用於選擇含有表達載體的宿主細胞的化合物，包括但不限於抗生素。

重組宿主細胞可以以分批或連續方式培養，並以分批或連續方式進行細胞收穫(在所述IL-2多肽在細胞內積累的情況下)或培養上清液收穫。對於在原核宿主細胞中的生產來說，分批培養和細胞收穫是優選的。

本發明的IL-2多肽通常在重組系統中表達之後被純化。所述IL-2多肽可以通過本領域中已知的各種不同方法從宿主細胞或培養基純化。在細菌宿主細胞中生產的IL-2多肽可能溶解性不良或不溶解(採取包含體的形式)。在本發明的一個實施例中，可以利用本發明中公開的以及本領域中已知的方法在所述IL-2中容易地進行胺基酸替換，所述替換被選擇成用於提高重組生產的蛋白質的溶解性的目的。在不溶性蛋白質的情況下，所述蛋白質可以從宿主細胞裂解物通過離心來收集，並且隨後可以進一步進行細胞的均質化。在溶解性不良的蛋白質的情況下，可以添加化合物(包括但不限於聚乙烯亞胺(PEI))以引起部分可溶的蛋白質的沉澱。然後可以通過離心方便地收集所述沉澱的蛋白質。重組宿主細胞可以通過本領域普通技術人員已知的各種不同方法破碎或均質化，以從細胞內釋放出所述包含體。宿主細胞破碎或均質化可以使用公知的技術來進行，包括但不限於酶法細胞破碎、超聲處理、杜恩斯均質化或高壓釋放破碎。在本發明的方法的一個實施例中，使用高壓釋放技術來破碎大腸桿菌宿主細胞，以釋放出所述IL-2多肽的包含體。在處理IL-2多肽的包含體時，使均質化重複時間最小化可能是有利的，以便使包含體的得率最大化而沒有由諸如溶解、機械剪切或蛋白水解等因素造成的損失。

然後可以使用本領域中已知的多種適合的增溶劑中的任一種來溶解不可溶或沉澱的IL-2多肽。所述IL-2多肽可以用尿素或鹽酸胍溶解。所述溶解的IL-2多肽的體積應該被最小化，以便可以使用可方便管理的批量大小來生產 大量批次。這個因素在可能在數千升體積的批次中生長重組宿主的大規模商業化背景中可能是重要的。此外，當在大規模商業化背景中製造IL-2多肽，尤其是用於人類製藥用途時，如果可能，應避免使用會損壞機器和容器或蛋白質產品本身的苛刻的化學物質。在本發明的方法中已顯示，較溫和的變性劑尿素可以代替較苛刻的變性劑鹽酸胍用於溶解IL-2多肽包含體。尿素的使用顯著降低了損壞在IL-2多肽的製造和純化過程中使用的不銹鋼設備的風險，同時有效地溶解IL-2多肽包含體(inclusion bodies)。

在可溶性IL-2蛋白的情況下，所述IL-2可能被分泌到周質空間中或培養基中。此外，可溶性IL-2可能存在於宿主細胞的細胞質中。在進行純化步驟之前可能希望濃縮可溶性IL-2。可以使用本領域普通技術人員已知的標準技術從例如細胞裂解物或培養基濃縮可溶性IL-2。此外，可以使用本領域普通技術人員已知的標準技術來破碎宿主細胞，並從所述宿主細胞的細胞質或周質空間釋放出可溶性IL-2。

通常來說，有時希望變性並還原表達的多肽，然後使所述多肽重折疊成優選的構象。例如，可以向感興趣的轉譯產物添加胍、脲、DTT、DTE及/或伴侶蛋白。還原、變性和複性蛋白質的方法對於本領域普通技術人員來說是已知的(參見上面的參考文獻，以及Debinski等，(1993)J.Biol.Chem.,268：14065-14070；Kreitman和Pastan，(1993)Bioconjug.Chem.,4：581-585；和Buchner等，(1992)Anal.Biochem.,205：263-270)。例如，Debinski等描述了包含體蛋白在胍-DTE中的變性和還原。所述蛋白質可以在含有包括但不限於氧化型榖胱甘肽和L-精胺酸的氧化還原緩衝液中重折疊。可以使重折疊試劑流動或以其他方式移動以與一種或多種多肽或其他表達產物相接觸，反之亦可。

在IL-2多肽的原核生產的情況下，由此生產的IL-2多肽可能錯誤折疊並因此缺少或具有降低的生物活性。所述蛋白質的生物活性可以通過“重折疊”來恢復。一般來說，錯誤折疊的IL-2多肽通過使用例如一種或多種離液劑(例如脲及/或胍)和能夠還原二硫鍵的還原劑(例如二硫蘇糖醇DTT或2-巰基乙醇2-ME)溶解(其中IL-2多肽也是不可溶的)、解折疊和還原所述多肽鏈來重折疊。然後在中等濃度的離液劑下添加允許二硫鍵重新形成的氧化劑(例如氧、胱胺酸或胱胺)。IL-2多肽可以使用本領域中已知的標準方法來重折疊，例如在通過引用併入本發明的美國專利號4,511,502、4,511,503和4,512,922中描述的方法。所述IL-2多肽也可以與其他蛋白質共折疊，以形成異二聚體或異多聚體。

在重折疊後，所述IL-2可以被進一步純化。IL-2的純化可以使用本領域普通技術人員已知的各種不同技術來完成，包括疏水相互作用層析、孔徑排阻層析、離子交換層析、反相高效液相色譜、親和層析等或其任何組合。另外的純化也可以包括純化的蛋白的乾燥或沉澱的步驟。

在純化後，可以通過本領域中已知的各種不同方法中的任一者，包括但不限於滲濾和透析，將IL-2在不同的緩衝液中交換及/或濃縮。作為單一純化蛋白提供的IL-2可能會經歷聚集和沉澱。

所述純化的IL-2可以是至少90%純(正如通過反相高效液相色譜RP-HPLC或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳SDS-PAGE所測量的)或至少95%純或至少96%純或至少97%純或至少98%純或至少99%或更高純。不論所述IL-2的純度的準確數值如何，所述IL-2對於用作藥品或用於進一步加工例如與水溶性聚合物例如PEG共軛來說足夠純。

某些IL-2分子可以在不存在其他活性成分或蛋白質(在賦形劑、載體和穩定劑、血清白蛋白等之外)的情況下用作治療性藥劑，或者它們可以與另一種蛋白質或聚合物複合。

以前已顯示，通過向用含有所需琥珀無義突變的基因程式設計的蛋白質合成反應添加化學胺醯化的抑制子tRNA，可以將非天然胺基酸在體外位點特異性地併入到蛋白質中。使用這些方法，人們可以使用對特定胺基酸營養缺陷的菌株將許多常見20種胺基酸用結構相近的同源物替換，例如用氟代苯丙胺酸替換苯丙胺酸。參見例如Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.，用於在蛋白質中位點特異性併入非天然胺基酸的通用方法(A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins)，Science,244：182-188(1989)；M.W.Nowak等，Science 268：439-42(1995)；Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala,E.S.，非天然胺基酸在多肽中的生物合成位點特異性併入(Biosynthetic site-specific Incorporation of a unnatural amino acid into a polypeptide)，J.Am Chem Soc,111：8013-8014(1989)；N.Budisa等，FASEB J.13：41-51(1999)；Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C.J.,Schultz,P.G.，用於將非天然胺基酸位點特異性引入到蛋白質中的生物合成方法(Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins)，Methods in Enz.,vol.202,301-336(1992)；和Mendel,D.,Cornish,V.W.& Schultz,P.G.，使用擴展遺傳密碼的定點誘變(Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code)，Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24,435-62(1995)。

例如，製備了識別終止密碼子UAG並用非天然胺基酸化學胺醯化的抑制子tRNA。使用常規的定點誘變在蛋白質基因中感興趣的位置處引入所述 終止密碼子TAG。參見例如Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.，基於硫代磷酸酯的寡核苷酸指導的誘變中的5'-3'外切核酸酶(5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis)，Nucleic Acids Res,16(3)：791-802(1988)。當所述醯化的抑制子tRNA和突變體基因被合併在體外轉錄/轉譯系統中時，對所述UAG密碼子做出回應併入所述非天然胺基酸，給出在所述特定位置處含有該胺基酸的蛋白質。使用[³H]-Phe的實驗和使用α-羥基酸的實驗證實了只有所述所需胺基酸被併入在由UAG密碼子指定的位置處，並且這個胺基酸不被併入在所述蛋白質中的任何其他位置處。參見例如Noren等，同上；Kobayashi等，(2003)Nature Structural Biology 10(6)：425-432；和Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.，新骨架結構在蛋白質中的位點特異性併入(Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins)，Science,255(5041)：197-200(1992)。

tRNA可以通過任何方法或技術用所需胺基酸胺醯化，包括但不限於化學或酶促胺醯化。

胺醯化可以通過胺醯基tRNA合成酶或其他酶分子(包括但不限於核酶)來完成。術語“核酶”可以與“催化性RNA”互換。Cech和合作者(Cech，1987,Science,236：1532-1539；McCorkle等，1987,Concepts Biochem.64：221-226)證實了可以充當催化劑的天然存在的RNA(核酶)的存在。然而，儘管這些天然RNA催化劑僅顯示出作用於核糖核酸反應基質(substrate)用於切割和拼接，但核酶人工進化的最新發展已將催化譜擴展到各種不同的化學反應。研究已鑒定到可以在其自身的(2')3'-末端上催化胺醯基-RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等，1995 Science 267：643-647)和可以將胺基酸從一個RNA分子轉移到另一個RNA分子的RNA分子(Lohse等，1996,Nature 381：442-444)。

通過引用併入本發明的美國專利申請公佈2003/0228593描述了構建核酶的方法及其在用天然編碼和非天然編碼的胺基酸將tRNA胺醯化中的用途。可以將tRNA胺醯化的酶分子(包括但不限於核酶)的基質固定化的形式，可能能夠對所述胺醯化的產物進行高效親和純化。適合的基質的實例包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠。核酶的基質固定化的形式的生產和用於胺醯化的用途描述在Chemistry and Biology 2003,10：1077-1084和美國專利申請公佈2003/0228593中，它們通過引用併入本發明。

化學胺醯化方法包括但不限於下述研究者所介紹的方法：Hecht和合作者(Hecht,S.M.Acc.Chem.Res.1992,25,545；Heckler,T.G.；Roesser,J.R.；Xu,C.；Chang,P.；Hecht,S.M.Biochemistry 1988,27,7254；Hecht,S.M.；Alford,B.L.；Kuroda,Y.；Kitano,S.J.Biol.Chem.1978,253,4517)；Schultz、Chamberlin、Dougherty等人(Cornish,V.W.；Mendel,D.；Schultz,P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621；Robertson,S.A.；Ellman,J.A.；Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722；Noren,C.J.；Anthony-Cahill,S.J.；Griffith,M.C.；Schultz,P.G.Science 1989,244,182；Bain,J.D.；Glabe,C.G.；Dix,T.A.；Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013；Bain,J.D.等，Nature 1992,356,537；Gallivan,J.P.；Lester,H.A.；Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4,740；Turcatti等，J.Biol.Chem.1996,271,19991；Nowak,M.W.等，Science,1995,268,439；Saks,M.E.等，J.Biol.Chem.1996,271,23169；Hohsaka,T.等，J.Am.Chem.Soc.1999,121,34)，所述 文獻通過引用併入本發明，以避免在胺醯化中使用合成酶。這些方法或其他化學胺醯化方法可用於將tRNA分子胺醯化。

用於產生催化性RNA的方法可以包括產生隨機化核酶序列的分開的合併物，對所述合併物進行定向進化，從所述合併物篩選所需的胺醯化活性，以及選擇那些表現出所需胺醯化活性的核酶的序列。

也可以使用重構的轉譯系統。純化的轉譯因數的混合物也已被成功地用於將mRNA轉譯成蛋白質，裂解物的組合或增補有純化的轉譯因數例如起始因數-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延伸因數T(EF-Tu)或終止因數的裂解物也是如此。無細胞系統也可以與轉錄/轉譯系統耦合，其中將DNA引入到所述系統中，轉錄成mRN並轉譯所述mRNA，正如在特別地通過引用併入本發明的《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等主編，Wiley Interscience,1993)中所描述的。在真核轉錄系統中轉錄的RNA可以採取異核RNA(hnRNA)或5'-末端加帽(7-甲基鳥苷)和3'末端poly A加尾的成熟mRNA的形式，這在某些轉譯系統中可能是有利的。例如，在網織紅細胞裂解物系統中加帽的mRNA以高效率被轉譯。

IX.共軛到IL-2多肽的大分子聚合物(Macromolecular Polymers)

對本發明描述的非天然胺基酸多肽的各種不同修飾可以使用本發明中描述的組合物、方法、技術和策略來實施。這些修飾包括將其他官能團併入到所述多肽的非天然胺基酸組分上，所述其他官能團包括但不限於標記物、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交聯劑、放射性核素、細胞毒性化合物、藥物、親和標記物、光親和標記物、反應性化合物、樹脂、第二蛋白質或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因數、 脂肪酸、糖類、多核苷酸、DNA、RNA、反義多核苷酸、糖、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、奈米粒子、自旋標記物、螢光團、含金屬組成部分、放射活性組成部分、新官能團、與其他分子共價或非共價相互作用的基團、光籠化組成部分、光化輻射可激發的組成部分、可光異構化的組成部分、生物素、生物素的衍生物、生物素類似物、摻有重原子的組成部分、化學可切割基團、光可切割基團、延長的側鏈、碳連接的糖、氧化還原活性劑、胺基硫代酸、毒性組成部分、同位素標記的組成部分、生物物理探針、磷光基團、化學發光基團、電子緻密基團、磁性基團、嵌入基團、發色團、能量轉移試劑、生物活性藥劑、可檢測標記物、小分子、量子點、奈米發射體、放射性核苷酸、放射性發射體、中子捕獲劑或上述物質的任何組合或任何其他所需化合物或物質。作為本發明中描述的組合物、方法、技術和策略的說明性而非限制性實例，下面的描述將聚焦於將大分子聚合物添加到非天然胺基酸多肽，並且應該理解所述組合物、方法、技術和策略也適用於(如有必要進行適當修改，並且本領域技術人員可以利用本公開做出這些修改)添加其他官能團，包括但不限於上面列出的那些。

可以將廣泛種類的大分子聚合物和其他分子連接到本發明的IL-2多肽，以調節所述IL-2多肽的生物學性質及/或為所述IL-2分子提供新的生物學性質。這些大分子聚合物可以通過天然編碼的胺基酸、通過非天然編碼的胺基酸、或者天然或非天然胺基酸的任何有功能的取代基、或者添加到天然或非天然胺基酸的任何取代基或官能團，連接到所述IL-2多肽。所述聚合物的分子量可以具有廣闊範圍，包括但不限於約100Da至約100,000Da之間或更大。所述聚合物的分子量可以在約100Da至約100,000Da之間，包括但不限於100,000Da、95,000 Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在某些實施例中，所述聚合物的分子量在約100Da至約50,000Da之間。在某些實施例中，所述聚合物的分子量在約100Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，所述聚合物的分子量在約1,000Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，所述聚合物的分子量在約5,000Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，所述聚合物的分子量在約10,000Da至約40,000Da之間。

本發明提供聚合物：蛋白質共軛物的基本上同源的(homogenous)製備物。當在本發明中使用時，“基本上同源的(homogenous)”意味著觀察到聚合物：蛋白質共軛物分子超過總蛋白的一半。所述聚合物：蛋白質共軛物具有生物學活性，並且本發明中提供的“基本上同源的(homogenous)”PEG化的IL-2多肽製備物是足以表現出均質製備物的優點例如在臨床應用中易於獲得批次間藥物代謝動力學的可預測性的均質製備物。

人們也可以選擇製備聚合物：蛋白質共軛物分子的混合物，並且本發明中提供的優點在於人類可以選擇包含在所述混合物中的單聚合物：蛋白質共軛物的比例。因此，如果需要，人們可以製備附連有各種不同數目(即二、三、四等)的聚合物組成部分的各種不同蛋白的混合物，並將所述共軛物與使用本發明的方法製備的單聚合物：蛋白質共軛物合併，獲得具有預定比例的單聚合物：蛋白質共軛物的混合物。

所選的聚合物可以是水溶性的，使得它所附連到的蛋白質在水性環境例如生理環境中不沉澱。所述聚合物可以是分支或不分支的。為了最終產物製備物的治療性使用，所述聚合物將是可藥用的。

聚合物的實例包括但不限於聚烷基醚及其烷氧基封端的類似物(例如聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/丙二醇及它們特別是聚氧乙二醇的甲氧基或乙氧基封端的類似物，聚氧乙二醇也被稱為聚乙二醇或PEG)，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯基烷基醚，聚噁唑啉，聚烷基噁唑啉和聚羥基烷基噁唑啉，聚丙烯醯胺，聚烷基丙烯醯胺和聚羥基烷基丙烯醯胺(例如聚羥基丙基甲基丙烯醯胺及其衍生物)，聚丙烯酸羥基烷基酯，聚唾液酸及其類似物，親水性肽序列，多糖及其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、葡聚糖硫酸酯、胺基葡聚糖，纖維素及其衍生物例如羧甲基纖維素、羥基烷基纖維素，幾丁質及其衍生物例如殼聚糖、琥珀醯殼聚糖、羧甲基幾丁質、羧甲基殼聚糖，透明質酸及其衍生物，澱粉，藻酸鹽，硫酸軟骨素，白蛋白，普魯蘭和羧甲基普魯蘭，聚胺基酸及其衍生物例如聚麩胺酸、聚離胺酸、聚天冬醯胺酸(aspartic acid)、聚天冬胺醯胺，馬來酸酐共聚物例如苯乙烯馬來酸酐共聚物、二乙烯基乙醚馬來酸酐共聚物，聚乙烯醇，它們的共聚物，它們的三元聚合物，它們的混合物，以及上述物質的衍生物。

聚乙二醇分子與蛋白質分子的比例可變，它們在反應混合物中的濃度也是如此。通常，最佳比率(就反應效率而言，因為存在極少過量的未反應的蛋白質或聚合物)可以由所選的聚乙二醇的分子量和可用的反應性基團的數目決定。對於分子量而言，通常聚合物的分子量越高，可以附連到蛋白質的聚合 物分子的數目越少。同樣地，當優化這些參數時，應該將聚合物的分支考慮在內。通常來說，分子量越高(或分支越多)，聚合物：蛋白質比率越高。

當在本發明中使用時，並且當考慮PEG：IL-2多肽共軛物時，術語“治療有效量”是指向患者提供所需益處的量。所述量隨著個體而變，並且取決於許多因素，包括患者的總體身體狀況和待治療的病症的根本原因。用於療法的IL-2多肽的量提供了可接受的改變速率並將所需回應維持在有益的水準。本發明的組合物的治療有效量可以由本領域普通技術人員使用可公開獲得的材料和程式容易地確定。

所述水溶性聚合物可以具有任何結構形式，包括但不限於直鏈、分叉或支鏈。通常，所述水溶性聚合物是聚亞烷基二醇例如聚乙二醇(PEG)，但其他水溶性聚合物也可以使用。作為實例，使用PEG來描述本發明的某些實施例。

PEG是一種公知的水溶性聚合物，其可以商購或者可以按照本領域普通技術人員已知的方法通過乙二醇的開環聚合來製備(Sandler和Karo，《聚合物合成》(Polymer Synthesis)，Academic Press,New York,Vol.3，第138-161頁)。術語“PEG”被廣義地用於涵蓋任何聚乙二醇分子，不論尺寸如何或在PEG的末端處是否具有修飾，並且當連接到IL-2多肽時可以由下式表示：XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y

其中n是2至10,000，並且X是H或末端修飾，包括但不限於C_1-4烷基、保護基團或末端官能團。

在某些情況下，在本發明中使用的PEG在一個末端用羥基或甲氧基封端，即X是H或CH₃(“甲氧基PEG”)。或者，所述PEG可以用反應性基團封端，由此形成雙官能聚合物。典型的反應性基團可以包括常用於與20種常見 胺基酸中存在的官能團反應的反應性基團(包括但不限於馬來醯亞胺基團、活化的碳酸酯(包括但不限於對硝基苯基酯)、活化的酯(包括但不限於N-羥基琥珀醯亞胺、對硝基苯基酯)和醛)，以及對20種常見胺基酸是惰性的但與非天然編碼的胺基酸中存在的互補官能團特異性反應的官能團(包括但不限於疊氮基、炔基)。值得注意的是，在上式中用Y示出的所述PEG的另一個末端將通過天然存在或非天然編碼的胺基酸直接或間接地附連到IL-2多肽。例如，Y可以是與所述多肽的胺基(包括但不限於離胺酸的ε胺基或N-端胺基)相連的醯胺、胺基甲酸酯或脲鍵。或者，Y可以是與硫醇基(包括但不限於半胱胺酸的硫醇基)相連的馬來醯亞胺鍵。或者，Y可以是通往20種常見胺基酸通常不可接近的殘基的鍵。例如，所述PEG上的疊氮基可以與所述IL-2多肽上的炔基反應，以形成Huisgen[3+2]環加成產物。或者，所述PEG上的炔基可以與非天然編碼的胺基酸中存在的疊氮基反應，以形成類似的產物。在某些實施例中，在適用時強親核劑(包括但不限於肼、醯肼、羥胺、胺基脲)可以與非天然編碼的胺基酸中存在的醛或酮基反應，以形成腙、肟或半卡巴腙，其在某些情況下可以通過用適合的還原劑處理來進一步還原。或者，所述強親核劑可以通過非天然編碼的胺基酸併入到所述IL-2多肽中，並用於優先與所述水溶性聚合物中存在的酮或醛基反應。

對於PEG來說，可以根據實際所需使用任何分子品質，包括但不限於根據需要約100道爾頓(daltons)(Da)至100,000Da或更大(包括但不限於有時0.1-50kDa或10-40kDa)。所述PEG的分子量可以具有廣闊範圍，包括但不限於約100Da至約100,000Da之間或更大。PEG可以在約100Da至約100,000Da之間，包括但不限於100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000 Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在某些實施例中，PEG在約100Da至約50,000Da之間。在某些實施例中，PEG在約100Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，PEG在約1,000Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，PEG在約5,000Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，PEG在約10,000Da至約40,000Da之間。也可以使用支鏈PEG，包括但不限於每條鏈具有1-100kDa(包括但不限於1-50kDa或5-20kDa)範圍內的MW的PEG分子。所述支鏈PEG的每條鏈的分子量可以包括但不限於在約1,000Da至約100,000Da之間或更大。所述支鏈PEG的每條鏈的分子量可以在約1,000Da至約100,000Da之間，包括但不限於100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在某些實施例中，所述支鏈PEG的每條鏈的分子量在約1,000Da至約50,000Da之間。在某些實施例中，所述支鏈PEG的每條鏈的分子量在約1,000Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，所述支鏈PEG的每條鏈的分子量在約5,000Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，所述支鏈PEG的每條鏈的分子量在約5,000Da至約20,000Da之間。廣範圍的PEG分子被描述在包括但 不限於Shearwater Polymers,Inc.目錄、Nektar Therapeutics目錄中，所述目錄通過引用併入本發明。

通常，所述PEG分子的至少一個末端可用於與所述非天然編碼的胺基酸反應。例如，帶有炔和疊氮基組成部分並用於與胺基酸側鏈反應的PEG衍生物，可用於將PEG附連到本發明中所描述的非天然編碼的胺基酸。如果所述非天然編碼的胺基酸包含疊氮基，則所述PEG通常將含有炔基組成部分以執行[3+2]環加成產物的形成，或者含有包含膦基團的活化的PEG物質(即酯、碳酸酯)以執行醯胺鍵的形成。可選地，如果所述非天然編碼的胺基酸包含炔，則所述PEG通常將含有疊氮基組成部分以執行[3+2]Huisgen環加成產物的形成。如果所述非天然編碼的胺基酸包含羰基，則所述PEG通常將包含強親核劑(包括但不限於醯肼、肼、羥胺或胺基脲官能團)，以便分別執行相應的腙、肟和半卡巴腙鍵的形成。在其他可選方式中，可以使用上述反應性基團的方向的顛倒，即所述非天然編碼的胺基酸中的疊氮基組成部分可以與含有炔的PEG衍生物反應。

在某些實施例中，所述帶有PEG衍生物的IL-2多肽變體含有與所述非天然編碼的胺基酸的側鏈上存在的化學官能團具有反應性的化學官能團。

在某些實施例中，本發明提供了含有疊氮化物和乙炔的聚合物衍生物，其包含平均分子量為約800Da至約100,000Da的水溶性聚合物骨架。所述水溶性聚合物的聚合物骨架可以是聚乙二醇。然而，應該理解，廣泛種類的水溶性聚合物，包括但不限於聚乙二醇和其他相關聚合物，包括聚葡萄糖和聚丙二醇，也適用于本發明的實踐，並且術語PEG或聚乙二醇的使用旨在涵蓋 並包括所有此類分子。術語PEG包括但不限於採取任何形式的聚乙二醇，包括雙官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、分叉PEG、支鏈PEG、懸垂PEG(即具有從聚合物骨架懸垂的一個或多個官能團的PEG或相關聚合物)或其中具有可降解的鍵的PEG。

PEG通常透明，無色，無臭，可溶于水，對熱穩定，對許多化學試劑惰性，不水解或變質，並且通常是無毒的。聚乙二醇被認為是生物相容的，也就是說PEG能夠與活組織或生物體共存而不引起損害。更具體來說，PEG是基本上無免疫原性的，也就是說PEG在體內不傾向於產生免疫反應。當附連到在體內具有某種所需功能的分子例如生物活性藥劑時，PEG傾向於掩蔽所述藥劑並且可以減少或消除任何免疫反應，使得生物體可以耐受所述藥劑的存在。PEG共軛物不傾向於產生顯著免疫反應或引起凝血或其他不良作用。具有式--CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2--(其中n為約3至約4000，通常為約20至約2000)的PEG適合用於本發明。在本發明的某些實施例中，具有約800Da至約100,000Da的分子量的PEG作為聚合物骨架特別有用。PEG的分子量可以具有廣闊範圍，包括但不限於約100Da至約100,000Da之間或更高。PEG的分子量可以在約100Da至約100,000Da之間，包括但不限於100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在某些實施例中，PEG的分子量在約100Da至約50,000Da之間。在某些實施例中， PEG的分子量在約100Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，PEG的分子量在約1,000Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，PEG的分子量在約5,000Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，PEG的分子量在約10,000Da至約40,000Da之間。

所述聚合物骨架可以是直鏈或支鏈的。支鏈聚合物骨架在本領域中通常是已知的。通常，支鏈聚合物具有中央支鏈核心組成部分和連接到所述中央支鏈核心的多個線性聚合物鏈。PEG常常以支鏈形式使用，其可以通過將氧化乙烯加成到各種不同的多元醇例如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇來製備。所述中央支鏈組成部分也可以源自於幾種胺基酸例如離胺酸。所述支鏈聚乙二醇可以以通用形式表示成R(-PEG-OH)m，其中R源自於核心組成部分例如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇，並且m表示臂的數量。多臂PEG分子例如在各自整體通過引用併入本發明的美國專利號5,932,462、5,643,575、5,229,490、4,289,872、美國專利申請2003/0143596、WO 96/21469和WO 93/21259中所描述的那些，也可用作所述聚合物骨架。

支鏈PEG也可以採取由PEG(--YCHZ2)n所表示的分叉PEG的形式，其中Y是連接基團，Z是活化的末端基團，其通過確定長度的原子鏈連接到CH。

另一種支鏈形式懸垂PEG具有沿著PEG骨架而不是在PEG鏈的末端處的反應性基團，例如羧基。

除了這些形式的PEG之外，所述聚合物也可以被製備成在骨架中具有弱的或可降解的鍵。例如，PEG可以被製備成在聚合物骨架中具有易於水解的酯鍵。如下所示，這種水解導致所述聚合物被切割成較低分子量的片段： -PEG-CO₂-PEG-+H₂O→PEG-CO₂H+HO-PEG-

本領域普通技術人員應該理解，術語聚乙二醇或PEG代表或包括了本領域中已知的所有形式，包括但不限於本發明中公開的那些。

許多其他聚合物也適合用於本發明。在某些實施例中，水溶性的、具有2至約300個末端的聚合物骨架在本發明中特別有用。適合的聚合物的實例包括但不限於其他聚亞烷基二醇例如聚丙二醇(“PPG”)、其共聚物(包括但不限於乙二醇和丙二醇的共聚物)、其三元聚合物、其混合物等。儘管聚合物骨架的每條鏈的分子量可變，但它通常在約800Da至約100,000Da，通常為約6,000Da至約80,000Da的範圍內。所述聚合物骨架的每條鏈的分子量可以在約100Da至約100,000Da之間，包括但不限於100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在某些實施例中，所述聚合物骨架的每條鏈的分子量在約100Da至約50,000Da之間。在某些實施例中，所述聚合物骨架的每條鏈的分子量在約100Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，所述聚合物骨架的每條鏈的分子量在約1,000Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，所述聚合物骨架的每條鏈的分子量在約5,000Da至約40,000Da之間。在某些實施例中，所述聚合物骨架的每條鏈的分子量在約10,000Da至約40,000Da之間。

本領域技術人員將會認識到，前述基本上水溶性骨架的名單絕不是窮舉的，而僅僅是說明性的，並且具有上述性質的所有聚合材料均被認為適合用於本發明。

在本發明的某些實施例中，聚合物衍生物是“多官能的”，意味著所述聚合物骨架具有至少兩個末端並可能多達約300個末端被官能團官能化或活化。多官能聚合物衍生物包括但不限於具有兩個末端的直鏈聚合物，每個末端被鍵合到可能相同或不同的官能團。

在一個實施例中，所述聚合物衍生物具有下述結構：X-A-POLY-B-N=N=N

其中：N=N=N是疊氮基組成部分；B是連接組成部分，其可以存在或不存在；POLY是水溶性無抗原性聚合物；A是連接組成部分，其可以存在或不存在並且可以與B相同或不同；並且X是第二官能團。

連接組成部分A和B的實例包括但不限於多官能化的烷基，其含有至多18個碳原子，並且可以含有1-10個之間的碳原子。雜原子例如氮、氧或硫可以被包括在所述烷基鏈內。所述烷基鏈也可以在雜原子處分支。連接組成部分A和B的其他實例包括但不限於多官能化的芳基，其含有至多10個碳原子，並且可以含有5-6個碳原子。所述芳基可以被一個或多個碳原子、氮、氧或硫原子取代。適合的連接基團的其他實例包括那些在各自通過引用併入本發 明的美國專利號5,932,462、5,643,575和美國專利申請公佈2003/0143596中所描述的連接基團。本領域普通技術人員將會認識到，前述連接組成部分的名單絕不是窮舉的，而僅僅是說明性的，並且具有上述性質的所有連接組成部分均被認為適合用於本發明。

適合用作X的官能團的實例包括但不限於羥基、保護的羥基、烷氧基、活性酯例如N-羥基琥珀醯亞胺基酯和1-苯並三唑基酯、活性碳酸酯例如N-羥基琥珀醯亞胺基碳酸酯和1-苯並三唑基碳酸酯、縮醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、活性碸、胺、胺氧基、保護的胺、醯肼、保護的醯肼、保護的硫醇、羧酸、保護的羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來醯亞胺、乙烯基碸、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙醯胺、環氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三苯甲酸酯、烯烴、酮和疊氮化物。正如本領域普通技術人員所理解的，所選的X組成部分應該與所述疊氮基相容，使得不發生與所述疊氮基的反應。所述含疊氮基的聚合物衍生物可以是同雙官能的，意味著所述第二官能團(即X)也是疊氮基組成部分，或者是異雙官能的，意味著所述第二官能團是不同的官能團。

術語“保護的”是指存在防止化學反應性官能團在某些反應條件下反應的保護基團或組成部分。所述保護基團根據待保護的化學反應性基團的類型而變。例如，如果所述化學反應性基團是胺或醯肼，則所述保護基團可以選自叔丁氧基羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。如果所述化學反應性基團是硫醇，則所述保護基團可以是鄰吡啶基二硫化物。如果所述化學反應性基團是羧酸例如丁酸或丙酸或羥基，則所述保護基團可以是苯甲基或烷基例如甲基、乙基或叔丁基。本領域中已知的其他保護基團也可用於本發明。

文獻中的末端官能團的具體實例包括但不限於N-琥珀醯亞胺基碳酸酯(參見例如美國專利號5,281,698、5,468,478)、胺(參見例如Buckmann等，Makromol.Chem.182：1379(1981)，Zalipsky等，Eur.Polym.J.19：1177(1983))、醯肼(參見例如Andresz等，Makromol.Chem.179：301(1978))、琥珀醯亞胺基丙酸酯和琥珀醯亞胺基丁酸酯(參見例如Olson等，《聚乙二醇化學和生物學應用》(Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications)，pp 170-181，Harris & Zalipsky主編，ACS,Washington,D.C.,1997；也參見美國專利號5,672,662)、琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(參見例如Abuchowski等，Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)和Joppich等，Makromol.Chem.180：1381(1979))、琥珀醯亞胺基酯(參見例如美國專利號4,670,417)、苯並三唑碳酸酯(參見例如美國專利號5,650,234)、縮水甘油基醚(參見例如Pitha等，Eur.J Biochem.94：11(1979)，Elling等，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))、氧基羰基咪唑(參見例如Beauchamp等，Anal.Biochem.131：25(1983)，Tondelli等，J.Controlled Release 1：251(1985))、對硝基苯基碳酸酯(參見例如Veronese等，Appl.Biochem.Biotech.,11：141(1985)；和Sartore等，Appl.Biochem.Biotech.,27：45(1991))、醛(參見例如Harris等，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)，美國專利號5,824,784，美國專利號5,252,714)、馬來醯亞胺(參見例如Goodson等，Biotechnology(NY)8：343(1990)，Romani等，Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984)和Kogan,Synthetic Comm.22：2417(1992))、鄰吡啶基二硫化物(參見例如Woghiren等，Bioconj.Chem.4：314(1993))、丙烯醇(參見例如Sawhney等，Macromolecules,26：581(1993))、乙烯基碸(參見例如美國專利號5,900,461)。所有上述參考文獻和專利通過引用併入本發明。

在本發明的某些實施例中，本發明的聚合物衍生物包含具有下述結構的聚合物骨架：X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N=N=N

其中：X是如上所述的官能團；並且n為約20至約4000。

在另一個實施例中，本發明的聚合物衍生物包含具有下述結構的聚合物骨架：X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-W-N=N=N

其中：W是包含1-10個之間的碳原子的脂族或芳香族接頭組成部分；n為約20至約4000；並且X是如上所述的官能團。m在1至10之間。

本發明的含疊氮基PEG衍生物可以通過本領域中已知的及/或本發明中公開的各種不同方法來製備。在一種方法中，如下所示，將平均分子量為約800Da至約100,000Da、聚合物骨架具有鍵合到第一官能團的第一末端和鍵合到適合的離去基團的第二末端的水溶性聚合物骨架與疊氮基陰離子(其可以與大量適合的平衡離子中的任一者(包括鈉、鉀、叔丁基銨等)配對)進行反應。所述離去基團經歷親核置換並被所述疊氮基組成部分代替，得到所需的含疊氮基PEG聚合物。

X-PEG-L+N₃ ^-→X-PEG-N₃

正如所示，適合用於本發明的聚合物骨架具有式X-PEG-L，其中PEG是聚乙二醇，X是不與疊氮基反應的官能團，並且L是適合的離去基團。適合的官能團的實例包括但不限於羥基、保護的羥基、縮醛、烯基、胺、胺氧基、保護的胺、保護的醯肼、保護的硫醇、羧酸、保護的羧酸、馬來醯亞胺、二硫代吡啶以及乙烯基吡啶和銅。適合的離去基團的實例包括但不限於氯、溴、碘、甲磺酸酯、三苯甲酸酯和甲苯磺酸酯。

在用於製備本發明的含疊氮基聚合物衍生物的另一個方法中，將帶有疊氮基官能團的連接試劑與平均分子量為約800Da至約100,000Da的水溶性聚合物骨架相接觸，其中所述連接試劑帶有與所述PEG聚合物上的化學官能團選擇性反應的化學官能團，以形成其中疊氮基通過連接基團與所述聚合物骨架分隔開的含疊氮基的聚合物衍生物產物。

示例性反應圖式如下所示：X-PEG-M+N-接頭-N=N=N→PG-X-PEG-接頭-N=N=N

其中：PEG是聚乙二醇，X是封端基團例如烷氧基或如上所述的官能團；並且M是與疊氮基官能團沒有反應性但將與N官能團高效且選擇性反應的官能團。

適合的官能團的實例包括但不限於如果N是胺的話，M為羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N是醯肼或胺氧基組成部分的話，M是酮；如果N是親核劑的話，M是離去基團。

粗產物的純化可以通過已知方法來完成，包括但不限於所述產物的沉澱，如果需要的話隨後進行層析。

更具體的實例在下面以PEG二胺為例示出，其中一個胺基被保護基團組成部分例如叔丁基-Boc保護，並將得到的單保護的PEG二胺與帶有疊氮基官能團的連接組成部分反應：BocHN-PEG-NH₂+HO₂C-(CH₂)₃-N=N=N

在這種情況下，可以使用各種不同的活化劑例如亞硫醯氯或碳二亞胺試劑和N-羥基琥珀醯亞胺或N-羥基苯並三唑將所述胺基團共軛到羧酸基團，以在所述單胺PEG衍生物與所述帶有疊氮基的接頭組成部分之間產生醯胺鍵。在所述醯胺鍵成功形成之後，得到的N-叔丁基-Boc保護的含疊氮基衍生物可直接用於修飾生物活性分子，或者它可以被進一步精心設計以安裝其他有用的官能團。例如，可以通過用強酸處理來水解所述N-t-Boc基團，以產生ω-胺基-PEG-疊氮化物。得到的胺可以用作合成把手以安裝其他有用的官能團例如馬來醯亞胺基團、活化的二硫化物、活化的酯等，用於產生有價值的異雙官能試劑。

當希望將不同分子附連到聚合物的每個末端時，異雙官能衍生物是特別有用的。例如，ω-N-胺基-N-疊氮基PEG允許將具有活化的親電基團的分子例如醛、酮、活化的酯、活化的碳酸酯等附連到所述PEG的一個末端，並將具有乙炔基團的分子附連到所述PEG的另一個末端。

在本發明的另一個實施例中，所述聚合物衍生物具有下述結構：X-A-POLY-B-C≡C-R

其中：R可以是H或烷基、烯基、烷氧基或芳基或取代的芳基； B是連接組成部分，其可以存在或不存在；POLY是水溶性無抗原性聚合物；A是連接組成部分，其可以存在或不存在，並且可以與B相同或不同；並且X是第二官能團。

連接組成部分A和B的實例包括但不限於多官能化的烷基，其含有至多18個碳原子，並且可以含有1-10個之間的碳原子。雜原子例如氮、氧或硫可以被包括在所述烷基鏈內。所述烷基鏈也可以在雜原子處分支。連接組成部分A和B的其他實例包括但不限於多官能化的芳基，其含有至多10個碳原子，並且可以含有5-6個碳原子。所述芳基可以被一個或多個碳原子、氮、氧或硫原子取代。適合的連接基團的其他實例包括那些在各自通過引用併入本發明的美國專利號5,932,462、5,643,575和美國專利申請公佈2003/0143596中所描述的連接基團。本領域普通技術人員將會認識到，前述連接組成部分的名單絕不是窮舉的，而僅僅是說明性的，並且具有上述性質的廣泛種類的連接組成部分被認為在本發明中有用。

適合用作X的官能團的實例包括羥基、保護的羥基、烷氧基、活性酯例如N-羥基琥珀醯亞胺基酯和1-苯並三唑基酯、活性碳酸酯例如N-羥基琥珀醯亞胺基碳酸酯和1-苯並三唑基碳酸酯、縮醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、活性碸、胺、胺氧基、保護的胺、醯肼、保護的醯肼、保護的硫醇、羧酸、保護的羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來醯亞胺、乙烯基碸、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙醯胺、環氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三苯甲酸酯、烯烴、酮和乙炔。正如將會理解的， 所選的X組成部分應該與所述乙炔基相容，使得不發生與所述乙炔基的反應。所述含乙炔聚合物衍生物可以是同雙官能的，意味著所述第二官能團(即X)也是乙炔組成部分，或者是異雙官能的，意味著所述第二官能團是不同的官能團。

在本發明的另一個實施例中，所述聚合物衍生物包含具有下述結構的聚合物骨架：X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-C≡CH

其中：X是如上所述的官能團；n為約20至約4000；並且m在1至10之間。

每種異雙官能PEG聚合物的具體實例在下文中示出。

本發明的含乙炔PEG衍生物可以使用本領域普通技術人員已知的及/或本發明公開的方法來製備。在一種方法中，將平均分子量為約800Da至約100,000Da、聚合物骨架具有鍵合到第一官能團的第一末端和鍵合到適合的親核基團的第二末端的水溶性聚合物骨架與帶有乙炔官能團和適合於與所述PEG上的親核基團反應的離去基團兩者的化合物進行反應。當將所述帶有親核組成部分的PEG聚合物與所述帶有離去基團的分子合併時，所述離去基團經歷親核取代並被所述親核組成部分代替，得到所需的含乙炔聚合物。

X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR’

正如所示，用於所述反應的優選聚合物骨架具有式X-PEG-Nu，其中PEG是聚乙二醇，Nu是親核組成部分，並且X是不與Nu、L或乙炔官能團反應的官能團。

Nu的實例包括但不限於主要通過SN2-類型的機制反應的胺、烷氧基、芳氧基、硫氫基、亞胺基、羧酸、醯肼、胺氧基。Nu基團的其他實例包括主要通過親核加成反應進行反應的官能團。L基團的實例包括氯、溴、碘、甲磺酸酯、三苯甲酸酯和甲苯磺酸酯和預期經歷親核置換的其他基團，以及酮、醛、硫酯、烯烴、α-β不飽和羰基、碳酸酯和預期通過親核劑經歷加成的其他親電基團。

在本發明的另一個實施例中，A是1-10個碳原子之間的脂族接頭或6-14個碳原子之間的取代的芳基環。X是不與疊氮基反應的官能團，並且L是適合的離去基團。

在用於製備本發明的含乙炔聚合物衍生物的另一種方法中，將平均分子量為約800Da至約100,000Da、在一個末端帶有保護的官能團或封端劑並且在另一個末端帶有適合的離去基團的PEG聚合物與乙炔陰離子相接觸。

示例性的反應圖式如下所示：X-PEG-L+-C≡CR’→X-PEG-C≡CR’

其中：PEG是聚乙二醇，X是封端基團例如烷氧基或如上所述的官能團；並且R’是H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或取代的烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。

在上述實例中，離去基團L應該具有足夠的反應性，以在與足夠濃度的乙炔陰離子接觸時經歷SN2類型的置換。實現離去基團被乙炔陰離子的SN2置換所需的反應條件對於本領域普通技術人員來說是已知的。

粗產物的純化通常可以通過本領域中已知的方法來完全，包括但不限於所述產物的沉澱，隨後如果需要的話進行層析。

水溶性聚合物可以被連接到本發明的IL-2多肽。所述水溶性聚合物可以通過併入到所述IL-2多肽中的非天然編碼的胺基酸、或非天然編碼或天然編碼的胺基酸的任何官能團或取代基、或添加到非天然編碼或天然編碼的胺基酸的任何官能團或取代基來連接。可選地，所述水溶性聚合物通過天然存在的胺基酸(包括但不限於半胱胺酸、離胺酸或N-端殘基的胺基)連接到併入有非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽。在某些情況下，本發明的IL-2多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個非天然胺基酸，其中一個或多個非天然編碼的胺基酸被連接到水溶性聚合物(包括但不限於PEG及/或寡糖)。在某些情況下，本發明的IL-2多肽還包含連接到水溶性聚合物的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個天然編碼的胺基酸。在某些情況下，本發明的IL-2多肽包含連接到水溶性聚合物的一個或多個非天然編碼的胺基酸和連接到水溶性聚合物的一個或多個天然存在的胺基酸。在某些實施例中，在本發明中使用的水溶性聚合物提高所述IL-2多肽相對於未共軛形式的血清半衰期。

連接到本發明的IL-2多肽的水溶性聚合物的數目(即PEG化或糖基化的程度)可以被調整，以提供改變的(包括但不限於提高或降低的)藥理學、藥物代謝動力學或藥效學特徵例如體內半衰期。在某些實施例中，IL-2的半衰期相對於未修飾的多肽被提高至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90%、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少約100倍。

含有強親核基團(即醯肼、肼、羥胺或胺基脲)的PEG衍生物

在本發明的一個實施例中，將包含含羰基非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽用含有被直接連接到PEG骨架的末端肼、羥胺、醯肼或胺基脲組成部分的PEG衍生物修飾。

在某些實施例中，所述羥胺末端的PEG衍生物具有下述結構：RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，並且n是100-1,000(即平均分子量在5-40kDa之間)。

在某些實施例中，所述含有肼或醯肼的PEG衍生物具有下述結構：RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，並且n是100-1,000，X任選地是可以存在或不存在的羰基(C=O)。

在某些實施例中，所述含有胺基脲的PEG衍生物具有下述結構：RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，並且n是100-1,000。

在本發明的另一個實施例中，將包含含羰基胺基酸的IL-2多肽用含有利用醯胺鍵連接到PEG骨架的末端羥胺、醯肼、肼或胺基脲組成部分的PEG衍生物修飾。

在某些實施例中，所述羥胺末端的PEG衍生物具有下述結構：RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-O-NH₂

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，並且n是100-1,000(即平均分子量在5-40kDa之間)。

在某些實施例中，所述含有肼或醯肼的PEG衍生物具有下述結構：RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，n是100-1,000，並且X任選地是可以存在或不存在的羰基(C=O)。

在某些實施例中，所述含有胺基脲的PEG衍生物具有下述結構：RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，並且n是100-1,000。

在本發明的另一個實施例中，將包含含羰基胺基酸的IL-2多肽用含有末端肼、羥胺、醯肼或胺基脲組成部分的支鏈PEG衍生物修飾， 其中所述支鏈PEG的每條鏈具有10-40kDa並且可以為5-20kDa範圍內的MW。

在本發明的另一個實施例中，將包含非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽用具有支鏈結構的PEG衍生物修飾。例如，在某些實施例中，所述肼或醯肼末端的PEG衍生物具有下述結構：[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，並且n是100-1,000，並且X任選地是可以存在或不存在的羰基(C=O)。

在某些實施例中，所述含有胺基脲基的PEG衍生物具有下述結構：[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X任選為NH、O、S、C(O)或不存在，m是2-10，並且n是100-1,000。

在某些實施例中，所述含有羥胺基團的PEG衍生物具有下述結構：[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-O-NH₂

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X任選為NH、O、S、C(O)或不存在，m是2-10，並且n是100-1,000。

所述水溶性聚合物被連接到所述IL-2多肽的程度和位點可以調節所述IL-2多肽與IL-2受體的結合。在某些實施例中，所述連接被安 排成使得所述IL-2多肽以約400nM或更低的K_d、以150nM或更低的K_d並且在某些情況下以100nM或更低的K_d結合IL-2受體，所述K_d通過平衡結合測定法來測量，例如在Spencer等，J.Biol.Chem.,263：7862-7867(1988)中所描述的。

用於聚合物的活化以及用於肽的共軛的方法和化學已在文獻中描述並且在本領域中是已知的。用於聚合物活化的常用方法包括但不限於使用溴化氰、高碘酸鹽、戊二醛、雙環氧化物、表氯醇、二乙烯碸、碳二亞胺、磺醯鹵、三氯代三嗪等的官能團活化(參見R.F.Taylor,(1991)，《蛋白質固定化：基礎與應用》(PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS)，Marcel Dekker,N.Y.；S.S.Wong,(1992)，《蛋白質共軛和交聯的化學》(CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING)，CRC Press,Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，《固定化親和配體技術》(IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES)，Academic Press,N.Y.；Dunn,R.L.等主編，《聚合物藥物和藥物遞送系統》(POLYMERICDRUGS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS)，ACS Symposium Series Vol.469,American Chemical Society,Washington,D.C.1991)。

關於PEG的官能化和共軛，有幾篇綜述和單行本可用。參見例如Harris,Macromol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten,Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong等，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky,Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)。

用於聚合物活化的方法也可以在WO 94/17039、美國專利號5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193、美國專利號5,219,564、美國專利號5,122,614、WO 90/13540、美國專利號5,281,698和WO 93/15189中找到，以及用於活化的聚合物和酶之間的共軛的方法包括但不限於凝血因數VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、載氧分子(美國專利號4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等，App.Biochem.Biotech.11：141-52(1985))。引用的所有參考文獻和專利通過引用併入本發明。

含有非天然編碼的胺基酸例如對疊氮基-L-苯丙胺酸的IL-2多肽的PEG化(即任何水溶性聚合物的添加)通過任何方便的方法來進行。例如，將IL-2多肽用末端為炔基的mPEG衍生物PEG化。簡單來說，在室溫下，在攪拌下向含有對疊氮基-L-Phe的IL-2多肽的水性溶液添加過量的固體mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH。通常，將所述水性溶液用pK_a接近反應將要進行時的pH(通常為約pH 4-10)的緩衝劑緩衝。用於例如pH 7.5下的PEG化的適合的緩衝劑的實例包括但不限於HEPES、磷酸鹽、硼酸鹽、TRIS-HCl、EPPS和TES。連續監測pH並在必要時調整。通常允許所述反應繼續約1-48小時之間。

隨後對反應產物進行疏水相互作用層析，以將所述PEG化的IL-2多肽變體與游離的mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH和所述PEG化的IL-2多肽的任何高分子量複合物分離開，所述複合物可能在未被阻斷的PEG在分子的兩個末端被活化，從而交聯IL-2多肽變體分子時形成。疏水相互作用層析過程中的條件使得游離的mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH流過柱，而任 何交聯的PEG化的IL-2多肽變體複合物在所需形式後洗脫，所述所需形式含有共軛到一個或多個PEG基團的一個IL-2多肽變體分子。適合的條件隨著交聯的複合物相對於所需共軛物的相對尺寸而變，並且由本領域普通技術人員容易地確定。將所述含有所需共軛物的溶析液(eluent)通過超濾濃縮(ultrafiltration)並通過滲濾(diafiltration)脫鹽(desalted)。

使用上文概述的洗脫方法可以生產基本上純化的PEG-IL-2，其中產生的PEG-IL-2具有至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%的純度水準，特別是至少約75%、80%、85%的純度水準，更特別是至少約90%的純度水準、至少約95%的純度水準、至少約99%或更高的純度水準，正如通過適合的方法例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛細管電泳所確定的。如有必要，從所述疏水層析獲得的PEG化的IL-2多肽可以通過本領域普通技術人員已知的一個或多個程式進一步純化，所述程式包括但不限於親和層析、陰離子或陽離子交換層析(使用包括但不限於DEAE SEPHAROSE)、矽膠層析、反相HPLC、凝膠過濾(使用包括但不限於SEPHADEX G-75)、疏水相互作用層析、孔徑排阻層析、金屬螯合劑層析、超濾/滲濾、乙醇沉澱、硫酸銨沉澱、層析聚焦、置換層析、電泳程式(包括但不限於製備型等電聚焦)、差異溶解性(包括但不限於硫酸銨沉澱)或萃取。表觀分子量可以通過GPC，通過與球狀蛋白標準品進行比較來估算(Preneta,AZ，《蛋白質純化方法：實用方法》(PROTEIN PURIFICATION METHODS,A PRACTICAL APPROACH)(Harris & Angal主編)，IRL Press 1989,293-306)。IL-2-PEG共軛物的純度可以通過蛋白水解降解(包括但不 限於胰蛋白酶切割)，然後進行質譜分析來評估。Pepinsky RB.等，J.Pharmcol.& Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。

連接到本發明的IL-2多肽的胺基酸的水溶性聚合物可以不受限制地進一步衍生化或取代。

含疊氮基PEG衍生物

在本發明的另一個實施例中，將IL-2多肽用含有將與非天然編碼的胺基酸的側鏈上存在的炔基組成部分反應的疊氮基組成部分的PEG衍生物修飾。通常，所述PEG衍生物將具有1-100kDa範圍內並且在某些實施例中10-40kDa範圍內的平均分子量。

在某些實施例中，所述疊氮基末端的PEG衍生物具有下述結構：RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-N₃

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，並且n是100-1,000(即平均分子量在5-40kDa之間)。

在另一個實施例中，所述疊氮基末端的PEG衍生物具有下述結構：RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-N₃

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10，並且n是100-1,000(即平均分子量在5-40kDa之間)。

在本發明的另一個實施例中，將包含含炔基胺基酸的IL-2多肽用含有末端疊氮基組成部分的支鏈PEG衍生物修飾，所述支鏈PEG 的每條鏈具有10-40kDa範圍內並且可以為5-20kDa範圍內的MW。例如，在某些實施例中，所述疊氮基末端的PEG衍生物具有下述結構：[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pN₃

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10，n是100-1,000，並且X任選地是O、N、S或羰基(C=O)，其在每種情況下可以存在或不存在。

含炔基PEG衍生物

在本發明的另一個實施例中，將IL-2多肽用含有將與非天然編碼的胺基酸的側鏈上存在的疊氮基組成部分反應的炔基組成部分的PEG衍生物修飾。

在某些實施例中，所述炔基末端的PEG衍生物具有下述結構：RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH2)_m-C≡CH

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，並且n是100-1,000(即平均分子量在5-40kDa之間)。

在本發明的另一個實施例中，將包含含炔基非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽用含有利用醯胺鍵連接到PEG骨架的末端疊氮基或末端炔基組成部分的PEG衍生物修飾。

在某些實施例中，所述炔基末端的PEG衍生物具有下述結構：RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-C≡CH

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10，並且n是100-1,000。

在本發明的另一個實施例中，將包含含疊氮基胺基酸的IL-2多肽用含有末端炔基組成部分的支鏈PEG衍生物修飾，所述支鏈PEG的每條鏈具有10-40kDa範圍內並且可以為5-20kDa範圍內的MW。例如，在某些實施例中，所述炔基末端的PEG衍生物具有下述結構：[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pC≡CH

其中R是簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10，n是100-1,000，並且X任選地是O、N、S或羰基(C=O)或不存在。

含膦PEG衍生物

在本發明的另一個實施例中，將IL-2多肽用含有活化的官能團(包括但不限於酯、碳酸酯)並進一步包含將與非天然編碼的胺基酸的側鏈上的疊氮基組成部分反應的芳基膦基團的PEG衍生物修飾。通常，所述PEG衍生物具有1-100kDa範圍內並且在某些實施例中10-40kDa範圍內的平均分子量。

在某些實施例中，所述PEG衍生物具有下述結構：

其中n是1-10；X可以是O、N、S或不存在，Ph是苯基，並且W是水溶性聚合物。

在某些實施例中，所述PEG衍生物具有下述結構：

其中X可以是O、N、S或不存在，Ph是苯基，W是水溶性聚合物，並且R可以是H、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基。示例性的R基團包括但不限於-CH₂、-C(CH₃)₃、-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-C(O)R’、-CONR’R”、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-CN和-NO₂。R’、R”、R'''和R''''各自獨立地是指氫、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基(包括但不限於被1-3個鹵素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或者芳烷基。當例如本發明的化合物包括超過一個R基團時，每個所述R基團獨立地選擇，當存在超過一個R’、R”、R'''和R''''基團時，每個這些基團也是如此。當R’和R”被附連到同一個氮原子時，它們可以與所述氮原子組合以形成5、6或7元環。例如，-NR’R”意味著包括但不限於1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從上述取代基的討論，本領域技術人員將會理解，術語“烷基”意味著包括包含鍵合到氫基團之外的其他基團的碳原子的基團，例如鹵代烷基(包括但不限於-CF₃和-CH₂CF₃)和醯基(包括但不限於-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

其他PEG衍生物和通用PEG化技術

可以連接到IL-2多肽的其他示例性PEG分子以及PEG化方法包括但不限於在例如下述文獻中所描述的：美國專利公佈號2004/0001838，2002/0052009，2003/0162949，2004/0013637，2003/0228274，2003/0220447，2003/0158333，2003/0143596，2003/0114647，2003/0105275，2003/0105224，2003/0023023，2002/0156047，2002/0099133，2002/0086939， 2002/0082345，2002/0072573，2002/0052430，2002/0040076，2002/0037949，2002/0002250，2001/0056171，2001/0044526，2001/0021763，美國專利號6,646,110，5,824,778，5,476,653，5,219,564，5,629,384，5,736,625，4,902,502，5,281,698，5,122,614，5,473,034，5,516,673，5,382,657，6,552,167，6,610,281，6,515,100，6,461,603，6,436,386，6,214,966，5,990,237，5,900,461，5,739,208，5,672,662，5,446,090，5,808,096，5,612,460，5,324,844，5,252,714，6,420,339，6,201,072，6,451,346，6,306,821，5,559,213，5,747,646，5,834,594，5,849,860，5,980,948，6,004,573，6,129,912，WO 97/32607，EP 229,108，EP 402,378，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，WO95/13090，WO 95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/32134，WO 99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO 95/06058，EP 439 508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921 131，WO 98/05363，EP 809 996，WO 96/41813，WO 96/07670，EP 605 963，EP 510 356，EP 400 472，EP 183 503和EP 154 316，它們通過引用併入本發明。本發明中描述的任何PEG分子可以以任何形式使用，包括但不限於單鏈、支鏈、多臂鏈(multiarm chain,)、單官能、雙官能、多官能或其任何組合。

其他聚合物和PEG衍生物包括但不限於羥胺(胺氧基)PEG衍生物，被描述在全都整體通過引用併入本發明的下述專利申請中：美國專利公佈號2006/0194256，美國專利公佈號2006/0217532，美國專利公佈號2006/0217289，美國臨時專利號60/755,338，美國臨時專利號60/755,711， 美國臨時專利號60/755,018，國際專利申請號PCT/US06/49397，WO 2006/069246，美國臨時專利號60/743,041，美國臨時專利號60/743,040，國際專利申請號PCT/US06/47822，美國臨時專利號60/882,819，美國臨時專利號60/882,500和美國臨時專利號60/870,594。

X.IL-2多肽的糖基化

本發明包括併入有一個或多個帶有糖殘基的非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽。所述糖殘基可以是天然(包括但不限於N-乙醯基葡萄糖胺)或非天然的(包括但不限於3-氟半乳糖)。所述糖可以通過N-或O-連接的糖苷鍵(包括但不限於N-乙醯基半乳糖-L-絲胺酸)或非天然的鍵(包括但不限於肟或相應的C-或S-連接的糖苷)連接到所述非天然編碼的胺基酸。

所述糖(包括但不限於糖基)組成部分可以在體內或體外添加到IL-2多肽。在本發明的某些實施例中，將包含含羰基非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽用使用胺氧基衍生化的糖修飾，以產生通過肟鍵連接的相應的糖基化多肽。一旦附連到所述非天然編碼的胺基酸後，所述糖可以通過用糖基轉移酶和其他酶的處理進一步精心設計，以產生鍵合到所述IL-2多肽的寡糖。參見例如H.Liu等，J.Am.Chem.Soc.125：1702-1703(2003)。

在本發明的某些實施例中，將包含含羰基非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽用被製備成胺氧基衍生物的具有確定結構的聚糖直接修飾。本領域普通技術人員將會認識到，其他官能團(包括疊氮化物、炔、醯肼、肼和胺基脲)可用於將所述糖連接到所述非天然編碼的胺基酸。在本發明的某些實施例中，然後可以將包含含有疊氮基或炔基的非天然編碼的胺基酸 的IL-2多肽分別用包括但不限於炔基或疊氮基衍生物，通過包括但不限於Huisgen[3+2]環加成反應進行修飾。這種方法允許以極高的選擇性修飾蛋白質。

XI.IL-2二聚體(Dimers)和多聚體(Multimers)

本發明還提供了IL-2和IL-2類似物組合例如同二聚體、異二聚體、同多聚體或異多聚體(即三聚體、四聚體等)，其中含有一個或多個非天然編碼的胺基酸的IL-2被結合到另一個IL-2變體或不是IL-2變體的任何其他多肽，所述結合是直接結合到多肽骨架或通過接頭結合。由於與單體相比分子量增加，所述IL-2二聚體或多聚體共軛物可能表現出新的或所需的性質，包括但不限於相對於單體IL-2不同的藥理學、藥物代謝動力學、藥效學性質、調節的治療半衰期或調節的血漿半衰期。在某些實施例中，本發明的IL-2二聚體調節IL-2受體的信號轉導(signal transduction)。在其他實施例中，本發明的IL-2二聚體或多聚體將充當IL-2受體拮抗劑、激動劑或調節劑(modulator)。

在某些實施例中，含有IL-2的二聚體或多聚體中存在的一個或多個IL-2分子包含連接到水溶性聚合物的非天然編碼的胺基酸。在某些實施例中，所述IL-2多肽通過包括但不限於Asn-Lys醯胺鍵或Cys-Cys二硫鍵直接相連。在某些實施例中，所述IL-2多肽及/或連接的非IL-2分子包含不同的非天然編碼的胺基酸以促進二聚化，包括但不限於第一IL-2多肽的一個非天然編碼的胺基酸中的炔基和第二個分子的第二個非天然編碼的胺基酸中的疊氮基將通過Huisgen[3+2]環加成被共軛。可選地，包含含酮非天然編碼的胺基酸的IL-2及/或連接的非IL-2分子可以被共軛到包 含含羥胺非天然編碼的胺基酸的第二多肽，並且所述多肽通過相應的肟的形成進行反應。

可選地，所述兩個IL-2多肽及/或連接的非IL-2分子通過接頭相連。可以使用任何異或同雙官能接頭來連接所述兩個可以具有相同或不同的一級序列的分子及/或連接的非IL-2分子。在某些情況下，所述用於將所述IL-2及/或連接的非IL-2分子拴系在一起的接頭可以是雙官能PEG試劑。所述接頭可以具有廣範圍的分子量或分子長度。更大或更小分子量的接頭可用於提供IL-2與所述連接的實體之間或IL-2與其受體之間或如果有的話所述連接的實體與其結合配偶體之間的所需空間關係或構象。具有更長或更短的分子長度的接頭也可用於提供IL-2與所述連接的實體之間或如果有的話所述連接的實體與其結合配偶體之間的所需空間或柔性。

在某些實施例中，本發明提供了具有啞鈴(dumbbell)結構的水溶性雙官能接頭，其包括：a)在聚合物骨架的至少第一末端上的含有疊氮化物、炔、肼、醯肼、羥胺或羰基的組成部分；和b)在所述聚合物骨架的第二末端上的至少一個第二官能團。所述第二官能團可以與所述第一官能團相同或不同。在某些實施例中，所述第二官能團與所述第一官能團沒有反應性。在某些實施例中，本發明提供了水溶性化合物，其包含支鏈分子結構的至少一個臂。例如，所述支鏈分子結構可以是樹枝狀的。

在某些實施例中，本發明提供了包含一個或多個IL-2多肽的多聚體，其通過與具有下述結構的水溶性活化聚合物的反應來形成：R-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X

其中n是約5至3,000，m是2-10，X可以是含有疊氮化 物、炔、肼、醯肼、胺氧基、羥胺、乙醯基或羰基的組成部分，並且R是可以與X相同或不同的封端基團、官能團或離去基團。R可以是例如選自羥基、保護的羥基、烷氧基、N-羥基琥珀醯亞胺基酯、1-苯並三唑基酯、N-羥基琥珀醯亞胺基碳酸酯、1-苯並三唑基碳酸酯、縮醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、活性碸、胺、胺氧基、保護的胺、醯肼、保護的醯肼、保護的硫醇、羧酸、保護的羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來醯亞胺、乙烯基碸、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙醯胺、環氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三苯甲酸酯、烯烴和酮的官能團。

XII.IL-2多肽活性和IL-2多肽對IL-2受體的親和性的測量

IL-2多肽活性可以使用標準的或已知的體外或體內測定法來確定。PEG-IL-2可以通過本領域中已知的適合的方法來分析生物活性。這些測定法包括但不限於IL-2回應性基因的活化、受體結合測定法、抗病毒活性測定法、細胞病理效應抑制測定法、抗增殖測定法、免疫調節測定法和監測MHC分子的誘導的測定法。

可以分析PEG-IL-2多肽啟動IL-2敏感性信號轉導途徑的能力。一個實例是干擾素刺激的響應元件(ISRE)測定法。將組成性表達IL-2受體的細胞用ISRE-螢光素酶載體(pISRE-luc,Clontech)暫態轉染。在轉染後，將所述細胞用IL-2多肽處理。測試了許多蛋白濃度例如0.0001-10ng/mL，以產生劑量響應曲線。如果所述IL-2多肽結合並活化IL-2受體，則得到的信號轉導級聯誘導螢光素酶表達。發光可以以大量方式測量，例 如通過使用TopCount^TM或Fusion^TM微孔板讀板器和Steady-Glo^R螢光素酶測定系統(Promega)。

可以分析IL-2多肽結合到IL-2受體的能力。對於包含非天然胺基酸的未PEG化或PEG化的IL-2多肽來說，IL-2對其受體的親和性可以使用BIAcore^TM生物感測器(Pharmacia)來測量。適合的結合測定法包括但不限於BIAcore測定法(Pearce等，Biochemistry 38：81-89(1999))和AScreen^TM測定法(PerkinElmer)。

不論使用何種方法產生IL-2多肽，都對所述IL-2多肽進行生物活性測定。通常，用於生物活性的試驗應該提供所需結果的分析，例如生物活性的提高或降低(與修飾的IL-2相比)、不同的生物活性(與修飾的IL-2相比)、受體或結合配偶體親和性分析、IL-2本身或其受體的構象或結構變化(與修飾的IL-2相比)或血清半衰期分析。

XIII.效力、功能性體內半衰其和藥物代謝動力學參數的測量

本發明的一個重要方面是通過構建共軛有或不共軛有水溶性聚合物組成部分的IL-2多肽來獲得延長的生物半衰期。IL-2多肽血清濃度在給藥後的快速下降，使得評估對使用共軛和非共軛的IL-2多肽及其變體的治療的生物學回應變得重要。本發明的共軛和非共軛的IL-2多肽及其變體在給藥例如通過皮下或i.v.給藥後也可能具有延長的血清半衰期，使得通過例如ELISA方法或通過初篩測定法進行測量成為可能。可以使用來自于商業化來源例如Invitrogen(Carlsbad,CA)的ELISA或RIA試劑盒。體內生物半衰期的測量如本發明中所述來進行。

包含非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽的效力和功能性體內半衰期可以按照本領域普通技術人員已知的方案來確定。

包含非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽的藥物代謝動力學參數可以在正常的Sprague-Dawley雄性大鼠中評估(每個治療組N=5只動物)。動物接收25ug/大鼠iv或50ug/大鼠sc的單劑量，並根據預先確定的時間過程獲取大約5-7個血液樣品，所述時間過程通常覆蓋對於未共軛到水溶性聚合物的包含非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽來說的約6小時到對於包含非天然編碼的胺基酸並共軛到水溶性聚合物的IL-2多肽來說的約4天。可以將不含非天然編碼的胺基酸的IL-2的藥物代謝動力學資料與為包含非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽獲得的資料進行直接比較。

XIV.給藥和藥物組合物

本發明的多肽或蛋白質(包括但不限於IL-2、合成酶、包含一個或多個非天然胺基酸的蛋白質等)任選地用於治療性用途，包括但不限於與適合的藥物載體相組合。這些組合物包含例如治療有效量的所述化合物和可藥用載體或賦形劑。這種載體或賦形劑包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及/或其組合。製造製劑以適合於給藥方式。總的來說，給藥蛋白質的方法對於本領域普通技術人員來說是已知的，並且可以應用于本發明的多肽的給藥。組合物可以採取水溶性形式，例如作為可藥用鹽存在，這意味著包括酸和鹼加成鹽兩者。

包含本發明的一種或多種多肽的治療性組合物任選地按照本領域普通技術人員已知的方法在一種或多種適合的體外及/或體內疾病動物模型中試驗，以確認功效、組織代謝並估算劑量。具體來說，劑量最 初可以通過本發明中的非天然多肽與天然胺基酸同源物的活性、穩定性或其他適合的度量的比較(包括但不限於被修飾成包括一個或多個非天然胺基酸的IL-2多肽與天然胺基酸IL-2多肽的比較和被修飾成包括一個或多個非天然胺基酸的IL-2多肽與目前可用的IL-2治療的比較)，即在相關測定法中確定。

給藥通過常用于引入分子以最終與血液或組織細胞接觸的任何途徑來進行。本發明的非天然胺基酸多肽以任何適合的方式，任選地與一種或多種可藥用載體一起給藥。在本發明的情形中將這些多肽給藥到患者的適合的方法是可用的，並且儘管超過一種途徑可用於給藥特定組合物，但特定途徑通常可以提供比另一種途徑更加即時且更加有效的作用或反應。

可藥用載體部分由待給藥的具體組合物並由給藥所述組合物的具體方法決定。因此，本發明的藥物組合物存在廣泛種類的適合製劑。

本發明的IL-2多肽可以通過適合於蛋白質或肽的任何常規途徑給藥，包括但不限於腸胃外，例如注射，包括但不限於皮下或靜脈內或任何其他形式的注射或輸注。多肽組合物可以通過多種途徑(包括但不限於口服、靜脈內、腹膜內、肌肉內、透皮、皮下、局部、舌下或直腸方式)給藥。包含修飾或未修飾的非天然胺基酸多肽的組合物也可以通過脂質體給藥。這些給藥途徑和適合的製劑對於本領域技術人員來說是公知的。IL-2多肽可以單獨地或與其他適合的組分例如藥物載體相組合使用。IL-2多肽可以與其他藥劑或治療劑相組合使用。

單獨或與其他適合的組分相組合的包含非天然胺基酸的IL-2多肽，也可以被製造成氣溶膠製劑(即它們可以被“霧化”)以通過吸入給藥。氣溶膠製劑可以被放置在可接受的加壓的推進劑例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等中。

適合於腸胃外給藥例如通過關節內、靜脈內、肌肉內、真皮內、腹膜內和皮下途徑給藥的製劑包括水性和非水性等滲無菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和向製劑賦予與目標接受者的血液等滲的溶質，還包括水性和非水性無菌懸液，其可以包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。IL-2的製劑可以存在于單劑量或多劑量密封容器例如安瓿和小管中。

腸胃外給藥和靜脈內給藥是優選的給藥方法。具體來說，已經用於天然胺基酸同源物治療劑的給藥途徑(包括但不限於常用於EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN例如IL-2、介白素、抗體、FGF及/或任何其他藥物遞送的蛋白質的給藥途徑)以及目前正在使用的製劑，為本發明的多肽提供了優選的給藥途徑和製劑。

在本發明的情形中，給藥到患者的劑量足以隨時間在所述患者中獲得有益的治療回應或其他適合的活性，這取決於應用。所述劑量由特定載體或製劑的功效、使用的非天然胺基酸多肽的活性、穩定性或血清半衰期、患者的狀況以及待治療的患者的體重或表面積決定。劑量的大小也由特定患者中與特定載體、製劑等的給藥相伴的任何不良副作用的存在、本質和程度決定。

在將在疾病(包括但不限於中性粒細胞減少症、再生障礙性貧血、週期性中性粒細胞減少症、特發性中性粒細胞減少症、Chdiak-Higashi綜合征、系統性紅斑狼瘡(SLE)、白血病、骨髓增生異常綜合征和骨髓纖維化等)的治療或預防中給藥的載體或製劑的有效量的確定中，醫生們評估迴圈血漿水準、製劑毒性、疾病進展及/或在相關時抗非天然胺基酸多肽抗體的產生。

給藥到例如70千克的患者的劑量通常在與常用治療性蛋白的劑量等效的範圍內，並根據相關組合物的改變的活性或血清半衰期進行調整。本發明的載體或藥物製劑可以通過任何已知的常規療法(包括抗體給藥，疫苗給藥，細胞毒性藥劑、天然胺基酸多肽、核酸、核苷酸類似物、生物回應改良劑等的給藥)來補充治療條件。

對於給藥來說，本發明的製劑以一定速率給藥，所述速率由相關製劑的LD-50或ED-50及/或非天然胺基酸多肽在各種不同濃度下的任何副作用的觀察決定，包括但不限於適用于所述患者的體重和總體健康。給藥可以通過單劑量或分劑量來完成。

如果經歷製劑輸注的患者發生發熱、寒戰或肌肉疼痛，則他/她接受適合劑量的阿司匹林、布洛芬、對乙醯胺基酚或其他控制疼痛/發熱的藥物。經歷對輸注的反應例如發熱、肌肉疼痛和寒戰的患者在將來的輸注之前30分鐘預先給藥阿司匹林、對乙醯胺基酚或包括但不限於苯拉海明。呱替啶被用於對退燒藥和抗組胺藥沒有快速回應的更嚴重的寒戰和肌肉疼痛。根據所述反應的嚴重性減緩或中斷細胞輸注。

本發明的人類IL-2多肽可以直接給藥到哺乳動物物件。給藥通過常用於將IL-2多肽引入到物件的任何途徑來進行。根據本發明的實施例所述的IL-2多肽組合物包括適合於口服、直腸、局部、吸入(包括但不限於通過氣溶膠)、頰(包括但不限於舌下)、陰道、腸胃外(包括但不限於皮下、肌肉內、真皮內、關節內、胸膜內、腹膜內、腦內、動脈內或靜脈內)、局部(及皮膚和粘膜表面兩者，包括氣道表面)、肺、眼內、鼻內和透皮給藥的組合物，儘管在任何給定情況下最適合的途徑取決於待治療的病症的本質和嚴重性。給藥可以是局部或全身性的。化合物的製劑可以存在于單劑量或多劑量密封容器例如安瓿和小管中。本發明的IL-2多肽可以以單位劑量注射形式用可藥用載體製備成混合物(包括但不限於溶液、懸液或乳液)。本發明的IL-2多肽也可以通過連續輸注(使用包括但不限於小型泵例如滲透泵)、單次快速濃注或緩慢釋放儲庫製劑來給藥。

適合於給藥的製劑包括水性和非水性溶液，可以含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和向製劑賦予等滲的溶質的等滲無菌溶液，以及可以包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸液。溶液和懸液可以從以前描述的種類的無菌粉劑、顆粒劑和片劑製備。

冷凍乾燥是一種用於呈現蛋白質的常用技術，其用於從感興趣的蛋白質製備物中除去水。冷凍乾燥或凍幹是將待乾燥的材料首先冷凍，然後在真空環境中通過昇華除去冰或冷凍的溶劑的過程。在凍幹前的製劑中可以包括賦形劑，以提高冷凍乾燥過程中的穩定性及/或提高凍幹產品在儲存後的穩定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等，Pharm.Res.8(3)：285-291(1991)。

藥物的噴霧乾燥對於本領域普通技術人員來說也是已知的。例如參見Broadhead,J.等，藥物的噴霧乾燥(The Spray Drying of Pharmaceuticals)，Drug Dev.Ind.Pharm,18(11 & 12),1169-1206(1992)。除了小分子藥物之外，各種不同的生物材料已被噴霧乾燥，它們包括：酶，血清，血漿，微生物和酵母。噴霧乾燥是一種有用的技術，因為它可以在一步過程中將液體藥物製劑轉變成細小、無塵或團聚的粉末。基本技術包括下述四個步驟：a)進料溶液霧化成噴霧劑；b)噴霧劑-空氣接觸；c)噴霧劑的乾燥；和d)乾燥的產物與乾燥空氣的分離。通過引用併入本發明的美國專利號6,235,710和6,001,800描述了通過噴霧乾燥製備重組促紅細胞生成素。

本發明的藥物組合物(compositions)和製劑(formulations)可以包含可藥用載體、賦形劑(excipient)或穩定劑(stabilizer)。可藥用載體部分由待給藥的具體組合物以及由用於給藥所述組合物的具體方法決定。因此，本發明的藥物組合物存在廣泛種類的適合製劑(包括任選的可藥用載體、賦形劑或穩定劑)(參見例如《Remington製藥學》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第17版，1985)。

適合的載體包括但不限於緩衝劑，包括琥珀酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、組胺酸、咪唑、乙酸鹽、碳酸氫鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括但不限於抗壞血酸；低分子量多肽，包括但不限於小於約10個殘基的多肽；蛋白質，包括但不限於血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，包括但不限於聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，包括但不限於甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸、組胺酸或組胺酸衍生物、 甲硫胺酸、麩胺酸或離胺酸；單糖、二糖和其他糖類，包括但不限於海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，包括但不限於EDTA和乙二胺四乙酸二鈉；二價金屬離子，包括但不限於鋅、鈷或銅；糖醇，包括但不限於甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽平衡離子，包括但不限於鈉和氯化鈉；填充劑例如微晶體纖維素、乳糖、玉米和其他澱粉；粘合劑；甜味劑和其他調味劑；著色劑；及/或非離子型表面活性劑，包括但不限於Tween^TM(包括但不限於Tween 80(聚山梨醇酯80)和Tween 20(聚山梨醇酯20)、Pluronics^TM和其他普朗尼克酸(包括但不限於普朗尼克酸F68(泊洛沙姆188))或PEG。適合的表面活性劑包括例如但不限於基於聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯即(PEO-PPO-PEO)或聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙烯即(PPO-PEO-PPO)的聚醚或其組合。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO可以在商品名Pluronics^TM、R-Pluronics^TM、Tetronics^TM和R-Tetronics^TM下商購(BASF Wyandotte Corp.,Wyandotte,Mich.)，並且被進一步描述在整體通過引用併入本發明的美國專利號4,820,352中。其他乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可能是適合的表面活性劑。表面活性劑或表面活性劑的組合可用於使PEG化的IL-2針對一種或多種脅迫(包括但不限於由攪動引起的脅迫)穩定。某些上述物質可以被稱為“增量劑”。某些物質也可以被稱為“張力調節劑”。抗微生物防腐劑也可用於獲得產品穩定性和抗微生物有效性；適合的防腐劑包括但不限於苯甲醇、苯紮氯銨、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯/丙酯、甲酚和苯酚或其組合。通過引用併入本發明的美國專利號7,144,574描述了可能適合於本發明的藥物組合物和製劑和其他遞送製劑的其他材料。

本發明的IL-2多肽，包括連接到水溶性聚合物例如PEG的IL-2多肽，也可以通過持續釋放系統或作為其一部分給藥。持續釋放組合物包括包括但不限於採取塑形制品形式的半透性聚合物基質，包括但不限於薄膜或微膠囊。持續釋放基質包括來自于生物相容材料例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15：267-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))、乙烯-乙酸乙烯酯(Langer等，同上)或聚D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美國專利號3,773,919；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酸酐、L-麩胺酸和γ-乙基-L-麩胺酸的共聚物(Sidman等，BioPolymers,22,547-556(1983))、聚原酸酯、多肽、透明質酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚胺基酸、胺基酸例如苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和矽酮。持續釋放組合物還包括脂質體包裹的化合物。含有化合物的脂質體通過本身已知的方法來製備：DE 3,218,121；Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82：3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美國專利號4,619,794；EP 143,949；美國專利號5,021,234；日本專利申請83-118008；美國專利號4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。引用的所有參考文獻和專利通過引用併入本發明。

脂質體包裹的IL-2多肽可以通過例如下述文獻中描述的方法來製備：DE 3,218,121；Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82：3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77： 4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美國專利號4,619,794；EP 143,949；美國專利號5,021,234；日本專利申請83-118008；美國專利號4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。脂質體的組成和大小是公知的，或者能夠由本領域普通技術人員憑經驗容易地確定。脂質體的一些實例描述在例如下述文獻中：Park JW等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D主編，《脂質體的醫學應用》(MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES)(1998)；Drummond DC等，用於癌症療法的脂質體藥物遞送系統(Liposomal drug delivery systems for cancer therapy)，Teicher B主編，《癌症藥物發現與開發》(CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT)(2002)；Park JW等，Clin.Cancer Res.8：1172-1181(2002)；Nielsen UB等，Biochim.Biophys.Acta 1591(1-3)：109-118(2002)；Mamot C等，Cancer Res.63：3154-3161(2003)。引用的所有參考文獻和專利通過引用併入本發明。

在本發明的情形中，給藥到患者的劑量應該足以隨時間在所述物件中引起有益回應。通常，每劑腸胃外給藥的本發明的IL-2多肽的總治療有效量在每天約0.01μg/kg至約100μg/kg或約0.05mg/kg至約1mg/kg患者體重的範圍內，儘管這取決於治療判斷。在這個實施例的特定情況下，所述共軛物可以以每天大於4μ/kg至每天約20μg/kg的範圍內的劑量給藥。在其他情況下，所述共軛物可以以每天大於4μg/kg至每天約9μg/kg的範圍內的劑量給藥。在其他情況下，所述共軛物可以以每天約4μg/kg至每天約12.5μg/kg的範圍內的劑量給藥。在特定情況下，所述共軛物可以以等於或低於沒有過度毒性的耐受的最高劑量的劑量給藥。此外，所述共軛物 可以每週給藥至少兩次，或者所述共軛物可以每週給藥至少三次、每週至少四次、每週至少五次、每週至少六次或每週七次。在特定情況下，在所述共軛物給藥超過一次的情況下，所述共軛物可以以每天每次大於4μg/kg的劑量給藥。具體來說，所述共軛物可以在兩周或更長的時間內給藥。在某些情況下，與參比樣品、即不與本發明的共軛物接觸的細胞的樣品相比，表達介白素-2受體的細胞的生長可以被抑制至少50%、至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。在這個實施例的特定情況下，所述共軛物可以以每天約5.3μg/kg的劑量或以每天約7.1μg/kg的劑量或以每天約9.4μg/kg的劑量或以每天約12.5μg/kg的劑量給藥。給藥的頻率也取決於治療判斷，並且與被批准用於人類的可商購的IL-2多肽產品相比可以更加頻繁或更不頻繁。通常，本發明的IL-2多肽、PEG化的IL-2多肽、共軛的IL-2多肽或PEG化的共軛的IL-2多肽可以通過上述的任何給藥途徑來給藥。

XV.本發明的IL-2多肽的治療性用途

本發明的IL-2多肽可用於治療廣範圍的障礙。本發明還包括有風險、正患有及/或已患有對IL-2、CD8+ T-細胞刺激及/或IL-2製劑具有回應性的癌症的哺乳動物的治療方法。IL-2多肽的給藥可以對觀察的幾種臨床參數產生短期效果，即，即時的有益效果，這可以是從給藥起12或24小時，並且另一方面，也可能產生長期效果，有益地減緩腫瘤生長的進展，減小腫瘤尺寸及/或提高迴圈CD8+ T細胞水準，並且本發明的IL-2多肽可以通過本領域技術人員已知的任何手段來給藥，並且可以有利地通 過輸注，例如以足以獲得所需藥理效果的劑量通過動脈、腹膜內或靜脈內注射及/或輸注來給藥。

所述IL-2多肽的劑量可以在每次治療每kg體重10-200mg或40-80mg IL-2多肽的範圍內。例如，給藥的IL-2多肽的劑量可以是每kg體重約20-100mg IL-2多肽，作為快速濃注及/或作為臨床上必要的時間長度例如從幾分鐘至幾小時例如最長24小時時間段的輸注來提供。如有必要，所述IL-2多肽給藥可以重複一次或幾次。IL-2多肽的給藥可以與其他藥劑例如化學治療劑的給藥相組合。此外，本發明涉及一種預防及/或治療癌症的方法，所述方法包括向需要的物件給藥有效量的IL-2多肽。

所述IL-2的平均量可以改變，並且具體來說應該基於合格醫師的推薦意見和處方。IL-2的準確量是偏好性問題，取決於諸如待治療病症的準確類型、待治療患者的狀況以及組合物中的其他成分等因素。本發明還提供了治療有效量的另一種活性藥劑的給藥。待給藥的量可以由本領域普通技術人員根據使用IL-2的療法容易地確定。

實施例

提供了下述實施例以說明但不是限制所要求保護的發明。

實施例1-IL-2中待突變成琥珀終止密碼子以併入非天然胺基酸的殘基位置的確定

IL-2已被用於治療幾種癌症例如腎細胞癌和轉移黑素瘤。可商購的IL-2 Aldesleukin®是一種重組蛋白，其未被糖基化，已除去丙胺酸-1並且用絲胺酸-125替換了殘基半胱胺酸-125(Whittington等，Drugs,46(3)： pp：446-514(1993))。儘管IL-2是癌症治療中最早被FDA批准的細胞因數，但已顯示IL-2在以高劑量使用時表現出嚴重副作用。這極大限制了它在潛在患者上的應用。所述嚴重副作用的根本機制已被歸因於IL-2與其受體之一IL-2Rα的結合。通常，當包括IL-2Rα(或CD25)、IL-2Rβ(或CD122)和IL-2Rγ(或CD132)的所有三種受體都存在于組織中時，IL-2不僅可以與這些受體形成異三聚體複合物，而且可以與IL-2Rβ和IL-2Rγ形成異二聚體複合物。在臨床背景中，當使用高劑量IL-2時，IL-2開始結合IL-2αβγ，這是T_reg細胞中的主要受體形式。T_reg細胞的抑制性效應引起IL-2在癌症免疫療法中的應用的不想要的效應。為了減輕IL-2的副作用，以前已使用過許多方法。主要突破之一是來自于Nektar的發明，其使用6個PEG化的離胺酸來掩蔽IL-2表面上的IL2Rα結合區(Charych等，Clin Cancer Res,22(3)：pp：680-90(2016))。PEG化的IL-2不僅具有延長的半衰期，而且顯示出急劇降低的副作用。然而，來自於活性研究的結果顯示，在這種非均質6-PEG化的IL-2混合物中PEG化的IL-2的有效形式是僅僅單PEG化的形式。因此，需要具有均質產物的更有效的PEG化的IL-2。

在本申請中，併入的非天然胺基酸提供了在IL-2 PEG化中使用的獨特共軛位點(unique conjugation sites)。得到的PEG化的IL-2突變蛋白質具有均質產物而不是以前來自於Nektar的異源的(heterogenous)6-PEG化的IL-2。

在產生IL-2突變蛋白質中使用的位點可以通過分析IL-2及其異三聚體受體的現有晶體結構來選擇。具體來說，IL-2Rα及其與IL-2的介面的結構已被詳細調查(圖1)。所述介面被分成包含疏水中心和極化區 的兩個區域。所述疏水中心在IL-2Rα殘基Leu-2^α、Met-25^α、Leu-42^α和Tyr-43^α與IL-2殘基Phe-42^IL-2、Phe-44^IL-2、Tyr-45^IL-2、Pro-65^IL-2和Leu-72^IL-2之間形成。所述極化區在IL-2Rα和IL-2的5個離子對(包括Lys-38^α/Glu-61^IL-2、Arg-36^α/Glu-62^IL-2、Glu-1^α/Lys-35^IL-2、Asp-6^α/Arg-38^IL-2和Glu-29^α/Lys-43^IL-2)之間形成。此外，靜電作圖(electrostatic mapping)表明某些其他殘基可能在介導IL-2Rα與IL-2之間的相互作用中發揮作用。這些殘基是Thr-37^IL-2、Thre-41^IL-2、Lys-64^IL-2、Glu-68^IL-2和Tyr-107^IL-2。因此，可以使用的位點是Phe-42^IL-2、Phe-44^IL-2、Tyr-45^IL-2、Pro-65^IL-2、Leu-72^IL-2、Glu-61^IL-2、Glu-62^IL-2、Lys-35^IL-2、Arg-38^IL-2、Lys-43^IL-2、Thr-37^IL-2、Thr-3^IL-2、Lys-64^IL-2、Glu-68^IL-2和Tyr-107^IL-2。用於生產具有非天然胺基酸的突變蛋白質的蛋白質序列的名單列於下面的表2中：表2.具有在PEG化中使用的潛在位點的IL-2蛋白序列

*U：非天然胺基酸

實施例2：人類IL-2表達系統

本節描述了用於包含非天然胺基酸的IL-2多肽的表達方法。將宿主細胞用正交tRNA、正交胺醯基tRNA合成酶和包含選擇器密碼子的如SEQ ID NO：4、6或8中所示的編碼IL-2多肽的多核苷酸或編碼SEQ ID NO：1、2、3、5、7和9至23中所示的胺基酸序列的多核苷酸的構建體轉化。

大腸桿菌表達載體構建和序列驗證：本實施例詳述了包括非天然編碼的胺基酸的人類IL-2(hIL-2)在大腸桿菌中的複製(clone)和表達。所有人類IL-2表達質體如下所述通過基於重組的複製(clone)方法使用Gibson組裝試劑盒(New England Biolabs(NEB),Ipswich,MA)或使用QuikChange誘變試劑盒(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)，在大腸桿菌NEB5α複製(clone)菌株(New England Biolabs,MA)中構建。所述大腸桿菌表達質體示出在圖2中。

Gibson組裝：用於擴增含有供體片段的各種不同的感興趣基因(GOI)的引物(primer)在它們的5’-端具有約18-24個鹼基對(bp)的與受體載體序列交疊的序列用於同源重組，並且在Integrated DNA Technologies(IDT)(San Diego,CA)合成。所述PCR片段使用高保真DNA聚合酶混合物Pfu Ultra II Hotstart PCR主混合物(目錄號600852，Agilent Technologies)來擴增。將PCR產物用Dpn1限制性酶(NEB# R0176L)在37℃消化2小時以除去質體背景，然後使用Qiagen PCR柱純化試劑盒(Qiagen,Valencia,CA；# 28104)進行柱純化，並通過Nanodrop(ThermoFisher,Carlsbad,CA)定量。將受體載體通過用所述載體內獨有 的限制性酶(NEB,MA)在供應商推薦的溫度下消化3至5小時進行線性化，PCR柱純化並定量。將供體插入片段和適合製備的受體載體以3：1的摩爾比混合，使用Gibson組裝試劑盒(NEB # E2611S)在50℃培養(incubation)15min，然後用於轉化到大腸桿菌NEB5α菌株(NEB # 2987)中。

重組體通過將Gibson組裝混合物在含有適合的抗生素的LB瓊脂板上鋪板來回收。第二天，將4至6個良好分離的單菌落接種到5mL LB+50μg/mL硫酸卡那黴素(Sigma,St Louis,MO；cat# K0254)培養基中，並在37℃生長過夜。使用Qiagen質體DNA小量製備試劑盒(Qiagen #27104)分離重組質體，並通過DNA測序(Eton Biosciences,San Diego,CA)驗證。完整GOI區加上100bp上游和100bp下游序列使用基因特異性測序引物來驗證。

QuickChange誘變(QuickChange Mutagenesis，QCM)：所有含有TAG終止密碼子的琥珀變體使用QuickChange Lightning定點誘變試劑盒(Agilent Technologies # 201519)來產生。所有QCM寡核苷酸使用QuickChange Web Portal(Agilent Technologies)來設計，並從IDT(San Diego,CA)訂購。QCM PCR混合物含有5μl 10x緩衝液，2.5μl dNTP混合物，1μl(100ng)質體範本，1μl寡聚物混合物(各10uM濃度)，1μl QuickChange Lightning酶，2.5μl Quick溶液和37μl蒸餾水(DW)。所述DNA使用試劑盒推薦的PCR程式擴增僅僅18個迴圈。

在PCR反應完成後，將混合物用伴隨試劑盒(Agilent Technologies)而來的DpnI酶在37℃消化2-3小時，並在凝膠上運行以檢查擴增的PCR產物的存在。隨後，將2.5至5μl PCR產物轉化到大腸桿菌NEB5α菌株中。然後分離來自於4至6個菌落的重組質體，並如在上文Gibson組裝部分中所述進行序列驗證。

表達菌株(AXID)構建和驗證(construction and verification)：為了製備AXID生產菌株，將化學感受態(chemically competent)大腸桿菌W3110B60宿主細胞用序列驗證的質體DNA(50ng)轉化，重組細胞在含有50μg/mL硫酸卡那黴素(Sigma,cat# K0254)的2xYT+1%葡萄糖瓊脂板上選擇，並在37℃培養(incubation)過夜。然後將來自於新鮮轉化平板的單菌落在含有50μg/mL硫酸卡那黴素的2xYT+1%葡萄糖瓊脂板上，通過連續三次劃線並在37℃培養(incubation)過夜來繁殖三次。最後，將來自於第三次劃線平板的單菌落接種在含有50μg/mL硫酸卡那黴素(Sigma，cat# K0254)的20mL Super Broth(Fisher-Optigrow^TM，#BP1432-10B1)中，並在37℃和250rpm下培養(incubation)過夜。然後將生長過夜的培養物用甘油稀釋到最終甘油濃度為20%(w/v)(KIC，Ref# 67790-GL99UK)。然後將該細胞懸液分配成1mL等分試樣，置於幾個冷凍管中並在-80℃冷凍，作為AXID生產菌株管。

在如上所述產生AXID生產菌株的甘油管後，將它們通過DNA測序和抗生素抗性標記的表型表徵進一步驗證。為了確認AXID生產菌株管具有在生產宿主中的正確質體，對質體進行序列驗證。將含有50μg/mL硫酸卡那黴素的20mL LB用來自於AXID複製(clone)的甘油管的穿刺物接種，並在37℃和250rpm下生長過夜。使用Qiagen小量製備試劑盒(#27104)分離質體DNA，並通過DNA測序(Eton Biosciences,CA)確認所述分離的質體中存在完整的GOI ORF。

為了進一步驗證所述AXID生產菌株的菌株基因型，將來自于同一個管的細胞在4個獨立的LB平板上劃線：含有50ug/mL硫酸卡那黴素的LB，含有15ug/mL四環素的LB，含有34ug/mL氯黴素的LB和含有75ug/mL甲氧苄啶 的LB。然後檢查它們在所有這些平板上的陽性生長，正如對W3110B60生產宿主菌株的菌株基因型所預期的。

表達系統：hIL-2的胺基酸序列和編碼hIL-2的大腸桿菌密碼子優化的DNA序列示出在表1和2中。包含正交tRNA(O-tRNA)和正交胺醯基tRNA合成酶(O-RS)的引入的轉譯系統被用於表達含有非天然編碼的胺基酸的hIL-2(參見質體圖譜pKG0269；圖2)。所述O-RS優先用非天然編碼的胺基酸將所述O-tRNA胺醯化。進而，所述轉譯系統對編碼的選擇器密碼子做出回應將所述非天然編碼的胺基酸插入到IL-2或IL-2變體中。適合的O-RS和O-tRNA序列描述在題為“胺醯基-tRNA合成酶組合物及其用途”(Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof)的WO2006/068802和題為“tRNA的組合物及其用途”(Compositions of tRNA and Uses Thereof)的WO2007/021297中，所述專利申請整體通過引用併入本發明。

用含有所述修飾的IL-2變體多核苷酸序列和正交胺醯基tRNA合成酶/tRNA對(特異性針對所需非天然編碼的胺基酸)的質體轉化大腸桿菌，允許將非天然編碼的胺基酸位點特異性併入到所述IL-2多肽中。IL-2變體多肽的表達在T7啟動子的控制之下，並通過在培養基中添加阿拉伯糖來誘導(參見質體圖譜pKG0269；圖2)。

使用對乙醯基-苯丙胺酸(pAF)的抑制：將用於表達IL-2多肽的質體轉化到W3110B60大腸桿菌細胞中。向所述細胞添加對乙醯基-苯丙胺酸(pAF)，並通過添加阿拉伯糖來誘導蛋白質表達。進行IL-2多肽的表達的SDS-PAGE分析，並觀察所述IL-2多肽。運行了多個泳道，用於原始的野生型IL-2 多肽與pAF替換的IL-2多肽之間的比較，後者是具有在特定胺基酸殘基處製造的例如對乙醯基苯丙胺酸替換的IL-2。T7聚合酶的表達在阿拉伯糖可誘導的T7噬菌體啟動子的控制之下。向所述細胞添加對乙醯基-苯丙胺酸(pAF)，並通過添加阿拉伯糖(最終0.2%)來誘導蛋白質表達。將培養物在37℃培養(incubation)幾小時(3-5小時)。

用於在大腸桿菌中提高hIL-2表達的其他構建體：為了提高hIL-2在大腸桿菌中的生產，除了本發明中報告的在大腸桿菌密碼子用法的基礎上的DNA序列優化之外，可以進一步優化下述表達參數：測試除了T7噬菌體啟動子之外的不同啟動子，例如阿拉伯糖B(araB)、pTrc和噬菌體T5啟動子；hIL-2mRNA的穩定化；除了標準的W3110B60菌株之外的不同大腸桿菌宿主菌株的篩選；生產過程參數優化例如溫度、培養基、誘導物濃度等；轉錄和轉譯控制元件優化，例如起始和終止密碼子、核糖體結合位點(RBS)、轉錄終止子等；質體拷貝數和質體穩定性優化；轉譯起始區(TIR)優化。

實施例3-本實施例詳細描述了大腸桿菌搖瓶表達(shake flask expression)試驗和高細胞密度發酵

搖瓶表達試驗(Shake-flask expression testing)：使用如上所述的AXID生產菌株在搖瓶實驗中試驗hIL-2表達。簡單來說，將來自于AXID甘油管的接種物置於含有50μg/mL硫酸卡那黴素(Sigma,MO)的5mL Super Broth(Fisher-Optigrow^TM，#BP1432-10B1)培養基中，並在37℃振搖生長過夜。將所述過夜培養物在含有50μg/mL硫酸卡那黴素(Sigma,MO)的Super Broth(Fisher-Optigrow^TM，#BP1432-10B1)培養基中1：100稀釋，並在37℃振搖生長。當培養物密度達到OD600為0.6-0.8時，將它用添加的0.2%阿拉伯糖和pAF誘 導，隨後在生產幾小時(通常為3至5小時)後收穫。取出收穫的細胞的等分試樣並通過SDS-PAGE進行分析。通過改變溫度、誘導持續時間和誘導物濃度對hIL-2的最適表達進行標準化。按照下述用於分析hIL2表達的Western測定法，使用針對hIL-2的標準單複製(clone)抗體對粗提物進行的免疫印跡證實了hIL-2的表達(圖3A)：將收穫的細胞沉積物歸一化到OD600為5，並溶解在含有溶菌酶(100μg/ml)和DNase 1(1U/ml)的計算量的B-PER溶液(ThermoFisher)中。通過以高速渦旋振盪2-5分鐘並通過在37℃和250rpm下培養(incubation)所述混合物，將所述沉積物混合。將所述樣品與製造商提供的樣品緩衝液(4X)和樣品還原劑(10x)混合，將終濃度調整到1x。將總共20μl樣品與hIL2標準品(R&D Systems,Minneapolis,MN)一起裝載到預製聚丙烯醯胺凝膠(ThermoFisher)上，並在1x MES緩衝液(ThermoFisher)中進行電泳分離。使用iBlot裝置和凝膠轉移堆疊將蛋白質樣品轉移到硝基纖維素膜上。將hIL2用山羊抗人IL-2抗原抗體(R&D Systems)捕獲，並通過HRP共軛的抗山羊IgG第二抗體(R&D Systems)使用opti 4CN比色法反應基質(substrate)(Bio-Rad,Hercules,CA)來檢測。

高細胞密度發酵：用於生產hIL-2的發酵過程由兩個階段構成：(i)接種物製備，和(ii)發酵罐生產。所述接種物從單個甘油管開始，融化，在250mL帶擋板錐形瓶中在50mL確定種子培養基中1：1000(v/v)稀釋，並在37℃和250rpm下培養(incubation)。在使用之前，將發酵罐清潔並壓熱滅菌。向發酵罐添加特定量的基礎培養基並蒸氣滅菌。在接種之前向所述基礎培養基添加特定量的硫酸卡那黴素溶液、進料培養基和P2000消泡劑。在壓熱滅菌後添加到發酵罐的所有溶液在無菌添加之前被0.2μm過濾或壓熱滅菌。

將所述發酵罐批式裝料4L利用甘油作為碳源的化學限定培養基。向發酵罐添加種子培養物至初始OD600nm為0.05。使用480至1200rpm的攪拌以及6psig的頭部壓力和5slpm的空氣流量的氧氣富集，將溶氧維持在30%空氣飽和度。溫度和pH分別被控制在37℃和7.0。當所述培養物達到OD600nm為35±5時，開始以0.25mL/L/min的速率補料。因此，L-Ala-pAcF(也被稱為L-Ala-pAF)二肽以0.4g/L的量添加。在二肽添加後15分鐘，將培養物用終濃度為2g/L的L-阿拉伯糖誘導。在誘導後6h收穫培養物。

反相HPLC滴定濃度(titer)分析：首先將1.0mL大腸桿菌發酵樣品(細胞糊)乾燥並稱重，以確定用於樣品製備的品質。將Lysonase Bioprocessing試劑(EMD Millipore #71230)和Benzonase核酸酶試劑(EMD Millipore # 70664)各自在BugBuster蛋白質提取試劑(EMD Millipore # 70584)中1：500稀釋，並用於細胞糊的化學裂解。向1.0mL乾燥的細胞糊添加1.0mL所述Bugbuster-Lysonase-Benzonase混合物，並將得到的混合物劇烈渦旋振盪。然後將混合物放置在Eppendorf Thermomixer R搖床上，在22℃下以1000rpm振搖20分鐘。在培養(incubation)後，將細胞裂解物(lysate)以16,050rcf離心5分鐘以沉積細胞碎片。然後將細胞裂解物上清液的200μL等分試樣通過0.22μm PVDF離心管式篩檢程式(EMD Millipore #UFC30GVNB)以16,050rcf離心過濾1分鐘。然後通過反相層析分析過濾的產物，以確定發酵樣品中存在的hIL2的量。使用裝填有3.5μm粒子的4.6 x 150mm Zorbax 300SB-C3(Agilent #863973-909)反相柱將hIL2與宿主細胞蛋白污染物分離開。在水中含有0.1%三氟乙酸的流動相A被用於結合hIL2。在乙腈中含有0.1%三氟乙酸的流動相B被用於將hIL2從柱洗脫。樣品中hIL2的量通過將來自於固定進樣體積的觀察到的面積計數針對從使用純化的 hIL2產生的標準曲線獲得的線性方程進行比較來確定。如圖3B中所示例的幾種試驗的IL-2琥珀變體，在高細胞密度大腸桿菌發酵中顯示出約65至150mg/L範圍內的高滴定濃度(titer)表達。

實施例4-本實施例詳細描述了包含體製備、重折疊、純化和PEG化

包含體(Inclusion body)製備和溶解：將從高細胞密度發酵收穫的細胞糊在4℃的包含體(IB)緩衝液I(50mM Tris pH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1% Triton X-100；4℃)中通過混合重懸浮至最終10%固形物。通過將所述重懸浮的材料通過微射流機總共兩次，將細胞裂解。然後將樣品離心(14,000g；15分鐘；4℃)，傾析上清液。將包含體沉積物通過重懸浮在另外體積的IB緩衝液I(50mM Tris pH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1% Triton X-100；4℃)中進行洗滌，並將所述重懸浮的材料通過微射流機總共兩次。然後將樣品離心(14,000g；15分鐘；4℃)，傾析上清液。將包含體沉積物各自重懸浮在1體積的緩衝液II(50mM Tris pH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；4℃)中。將所述樣品離心(14,000g；15分鐘；4℃)，傾析上清液。將包含體沉積物重懸浮在½體積的緩衝液II(50mM Tris pH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；4℃)中。然後將所述包含體在適合的容器中分成等分試樣。將樣品離心(14,000g；15分鐘；4℃)，傾析上清液。將所述包含體溶解或儲存在-80℃下直至進一步使用。

將包含體在增溶緩衝液(20mM Tris，pH 8.0；8M胍；10mM β-ME)中溶解到終濃度在10-15mg/mL之間。然後將所述溶解的包含體在室溫下，在恒定混合下培養(incubation)1小時或直至完全溶解。然後將樣品離心(10,000g； 20分鐘；4℃)以除去任何未溶解的材料。然後如果蛋白質濃度高，則通過用另外的增溶緩衝液稀釋來調節每個樣品的蛋白質濃度。

重折疊(Refolding)和純化：通過將所述樣品在20mM Tris，pH 8.0；60%蔗糖；4℃中稀釋至終濃度為0.5mg/mL來進行重折疊。允許重折疊在4℃下進行5天。將重折疊的材料用Milli-Q H₂O 1：1稀釋。將材料通過0.22μm PES濾器過濾，並裝載到在20mM Tris，pH 8.0；0.15M NaCl(緩衝液A)中平衡的Blue Sepharose FF柱(GE Healthcare)上。在沖洗流中，將柱用5倍柱體積的30%緩衝液B(20mM Tris，pH 8.0；2M NaCl；50%乙二醇)洗滌。通過用10倍柱體積的100%緩衝液B沖洗柱來洗脫IL-2多肽。

PEG化和PEG化後的純化：取IL-2合併物並用Milli-Q水稀釋10X。用50%冰醋酸將每個樣品的pH調整到4.0。將樣品濃縮至~1.0mg/mL。向每個樣品添加1：12摩爾過量的活化的PEG(羥胺PEG)。然後將所述樣品在27℃下培養(incubation)48-72小時。取出樣品並將樣品用水(<8m/S)稀釋8-10倍，並裝載到在緩衝液A(50mM NaAc，pH 6.0；50mM NaCl；0.05% Zwittergent 3-14)中平衡的SP HP柱(GE Healthcare)上。用5倍柱體積的緩衝液B(50mM NaAc，pH 6.0；500mM NaCl；0.05% Zwittergent 3-14)洗脫IL-2多肽。將IL-2的級分合併，並在IL-2儲存緩衝液(20mM NaAc，pH 5.0；150mM NaCl；0.05% Zwittergent 3-14)中平衡的Superdex 200孔徑排阻柱上運行。收集PEG化的材料並儲存在4℃下。

實施例5-本實施例詳細描述了從大腸桿菌和哺乳動物表達系統純化IL-2。本實施例還公開了PEG化、位點特異性(Site Specific)共軛以及PEG-IL-2純化過程。

從大腸桿菌包含體製備物製備：通過一系列洗滌步驟分離IL-2包含體。將冷凍的細胞糊重懸浮在洗滌緩衝液I(50mM Tris，pH 8.0；1% triton X-100；1M尿素，5mM EDTA，1mM PMSF)中至10%(W/V)的濃度，在4℃均質化，然後離心(15,000g，30分鐘，4℃)。捨棄上清液，並將包含體沉積物重懸浮在洗滌緩衝液II(50mM Tris，pH 8.0；1% triton X-100；1M尿素，5mM EDTA)中。將重懸浮的包含體在4℃以15,000g離心30分鐘。捨棄上清液，並將包含體沉積物重懸浮在洗滌緩衝液III(50mM Tris，pH 8.0；去氧膽酸鈉，5mM EDTA)中。將重懸浮的包含體在4℃下以15,000g離心30分鐘。捨棄上清液，並將包含體沉積物重懸浮在水中，然後在4℃下以15,000g離心30分鐘。將洗滌過的包含體儲存在-80℃下直至進一步使用。

重折疊：通過在水中重懸浮並將混合物的pH調整到pH 12.2來溶解IL-2包含體。通過離心(12,000g，15分鐘)除去不溶性材料。溶解的IL-2通過將pH調低到pH 8.8±0.2進行重折疊。通過向重折疊反應添加50μM胱胺酸來促進適合的二硫鍵形成。允許所述重折疊反應在室溫放置16-22小時。通過用鹽酸將所述重折疊反應調整到pH 6.8來沉澱宿主細胞污染物。通過離心(12,000g，15分鐘)除去沉澱物，用氫氧化鈉將澄清的上清液調整到pH 7.8並進行0.22μm過濾。

柱純化(Column Purification)：將重折疊的IL-2裝載到在緩衝液A(20mM磷酸鈉，pH 7.8)中平衡的Capto Adhere Impres(GE Healthcare)柱上。在裝載後，將所述柱用緩衝液A(20mM磷酸鈉，pH 7.8)洗滌，並使用在20個柱體積內直至100%緩衝液B(20mM磷酸鈉，20mM檸檬酸，pH 4.0)的線性pH梯度將IL-2從柱上洗脫。收集含有IL-2的級分，用10%乙酸將pH調整到4.0，然後在20mM乙 酸鈉，2.5%海藻糖，pH 4.0中進行緩衝液交換。將IL-2濃縮到1-10mg/mL，0.22μM過濾，並儲存在-80℃下。

從真核表達系統純化IL-2：將含有帶His標籤的IL-2的細胞培養基用氫氧化鈉將pH調整到7.8，並裝載到在20mM磷酸鈉，pH 7.8中平衡的Ni Excel柱(GE Healthcare)上。在裝載後，將所述柱用緩衝液A(20mM磷酸鈉，pH 7.8)洗滌，然後用洗滌緩衝液B(20mM磷酸鈉，1.0M氯化鈉，30mM咪唑，pH 7.8)洗滌，以除去宿主細胞污染物。用洗脫緩衝液(10mM磷酸鈉，300mM咪唑，pH 7.8)將IL-2從柱上洗脫，並將含有IL-2的級分合併。將所述IL-2合併材料裝載到在緩衝液A(20mM磷酸鈉，pH 7.8)中平衡的Capto Adhere Impres(GE Healthcare)柱上。在裝載後，將所述柱用緩衝液A(20mM磷酸鈉，pH 7.8)洗滌，並使用在20個柱體積內直至100%緩衝液B(20mM磷酸鈉，20mM檸檬酸，pH 4.0)的線性pH梯度將IL-2從柱上洗脫。收集含有IL-2的級分，用10%乙酸將pH調整到4.0，然後在20mM乙酸鈉，2.5%海藻糖，pH 4.0中進行緩衝液交換。將IL-2濃縮到1-10mg/mL，0.22μM過濾，並儲存在-80℃下直至進一步使用。

位點特異性共軛(Site Specific Conjugation)和PEG-IL-2純化：將含有非天然胺基酸(nnAA)對乙醯基苯丙胺酸的IL-2變體在共軛緩衝液(20mM乙酸鈉，pH 4.0)中進行緩衝液交換，並濃縮至1-10mg/mL。向反應添加最終100mM的乙醯肼，然後添加10倍摩爾過量的胺氧基官能化的PEG。將所述共軛反應在25-30℃培養(incubation)18-20小時。在共軛後，將所述PEG化的IL-2用20mM pH 5.0的乙酸鈉1：10稀釋，並裝載到Capto SP Impres柱上。在裝載後，將所述柱用緩衝液A(20mM乙酸鈉，pH 5.0)洗滌，並使用在20個柱體積內直至100%緩衝液B(20mM乙酸鈉，1.0M氯化鈉，pH 5.0)的線性梯度將PEG化的IL-2從柱上洗脫。 收集含有PEG化的IL-2的級分，並在10mM磷酸鈉、100mM氯化鈉、2.5%海藻糖、pH 7.0中進行緩衝液交換。將IL-2濃縮到1-2mg/mL，0.22μM過濾，並儲存在-80℃下直至進一步使用。

通過生物層干涉儀(Bio-Layer Interferometery)進行IL-2/CD-25結合測定：IL-2/CD25多濃度結合動力學實驗在Octet RED96(PALL/ForteBio)儀器上，在30℃下進行。將抗人類Fc抗體捕獲生物感測器(PALL/ForteBio，目錄號18-5063)用1X HBS-P+緩衝液(GE Healthcare，目錄號BR-1008-27)中的純化的CD25-Fc融合蛋白裝載。達到0.8nm至1.0nm之間的固定化水準。將載樣的生物感測器用1X HBS-P+緩衝液洗滌，以在測量結合和解離動力學之前除去任何未結合的蛋白質。對於結合階段的監測來說，將IL-2分析物樣品用1X HBS-P+緩衝液稀釋並轉移到實心黑色96孔板(Greiner Bio-One，目錄號655209)。允許IL-2樣品與裝載有CD25-Fc的生物感測器結合60秒。解離階段在含有1X HBS-P+緩衝液的實心黑色96孔板的孔中記錄90秒。使用平行緩衝液空白減除法引用資料，將基線與y軸對齊，並在10.0版Octet資料分析軟體(PALL/ForteBio)中通過Savitzky-Golay篩檢程式進行平滑處理。使用描述1：1結合化學計量學的Langmuir模型對處理後的動力學傳感圖進行全域擬合(圖4A)。

實施例6-本實施例詳細描述了包括非天然編碼的胺基酸的IL-2在哺乳動物系統中的複製(clone)和表達。本實施例還描述了評估修飾的IL-2的生物學活性的方法。

在哺乳動物細胞中製備IL-2變體。天然人類IL-2是一種糖基化蛋白，其在Thr-3上具有O-連接的糖基化(Conradt等，Eur J Biochem,153(2)：pp：255-61(1985))。儘管已顯示非糖基化IL-2具有與糖基化IL-2相似的活性，但糖基 化人類IL-2已顯示在活化的人類T細胞的複製(clone)生長和長期繁殖方面具有更好的活性。也有一些報告表明天然IL-2具有更高的特異性活性。還已表明，IL-2在哺乳動物細胞中的表達與它們在大腸桿菌中的表達相比具有優勢(Kim等，J Microbiol Biotechnol,14(4),810-815(2004))。在本發明中，野生型IL-2及其分別在上文表1和2中設計的各種不同的突變蛋白質，可以在CHO細胞中生產(正如在本發明實施例中所描述的)。

為了生產在所需位置處含有非天然胺基酸的IL-2突變蛋白質，將每種突變蛋白質在穩定的合併物或穩定的細胞株中生產，所述細胞株源自於轉染的平臺細胞株，其含有工程化的正交tRNA/tRNA合成酶對(Tian等，Proc Natl Acad Sci U S A,111(5)：pp：1766-71(2014)和PCT/2018US/035764：其各自整體通過引用併入本發明)。簡單來說，將CHOK1細胞工程化改造成穩定表達專有正交tRNA合成酶(O-RS)及其同源琥珀抑制性tRNA(O-tRNA)的平臺細胞株，用於例如在CHO細胞中將非天然胺基酸例如pAF高效併入到治療性蛋白例如IL-2中。然後使所述平臺細胞株預先適應懸浮生長，用於在生物反應器中快速發展。所述平臺細胞株已被充分表徵和進化，具有提高的非天然胺基酸併入效率和複製(clone)選擇效率。所述平臺細胞株被用作母體細胞，以通過快速且高效的暫態表達以高於100mg/L的滴定濃度(titer)生產用於早期研究使用的併入有非天然胺基酸的治療性蛋白質。進行暫態轉染和穩定的合併物生產，以評估候選分子的表達並為鑒定先導分子的功能測定法提供材料。通過將GS表達系統中含有琥珀無義密碼子的感興趣基因轉染到平臺細胞株中來產生生產細胞株，以生產併入有非天然胺基酸的IL-2蛋白。使用所述平臺細胞株作為母體細胞來實施穩定細胞株 開發策略，以獲得在3-4個月內具有5-10 PCD並在6個月內具有20-30 PCD的生產細胞株。

在本發明中，合成了具有其天然信號肽序列的人類IL-2 cDNA(NM_000586.3)並將其複製(clone)到含有GS選擇標記的哺乳動物表達載體中(圖4B)。如表1中所示，所述複製(clone)的野生型人類IL-2 cDNA保留了它的每個胺基酸的原始DNA序列，沒有任何突變。相反，在IL-2變體(表2)的產生期間，所述15種突變蛋白質中的每一者具有獨特位置被突變成琥珀終止密碼子(TAG)，其可以在工程化細胞中被抑制和表達以生產含有nnAA的蛋白質。

用於IL-2變體表達的工程化CHO細胞的建立。工程化CHO細胞源自于以前建立的專有平臺細胞(PCT/2018US/035764，其整體通過引用併入本發明)的基因敲除(knockout)。簡單來說，使用基於網路的靶發現工具CRISPy來快速鑒定在CHO-K1細胞中具有零脫靶的優選在早期外顯子中的gRNA靶序列。將所述gRNA複製(clone)到共表達CHO密碼子優化形式的Cas9的哺乳動物表達載體pGNCV中。用蛋白表達載體轉染生產細胞株以產生細胞合併物，然後進行複製(clone)以鑒定具有基因敲除的單細胞分離株。來自於多個專案的組合結果的插入缺失(插入/缺失)頻率，對於細胞合併物和單細胞分離株來說分別為30-90%和50-80%。使用CRISPR來敲除CHO細胞中的靶基因。具體來說，為了提高IL-2的mRNA穩定性，使用CRISPR技術敲除UPF1基因。用於敲除的gRNA示出在圖5中。在篩選了192個複製(clone)後獲得兩個UPF1-KO細胞株，並通過測序確認其具有UPF1敲除(圖6)。然後將所述得到的UPF1-KO細胞株用於暫態表達IL-2變體。

IL-2在工程化CHO細胞中的暫態表達(Transient expression)。將IL-2變體在如上實施例中所公開獲得的UPF1-KO細胞株中暫態表達。使用用於懸 浮細胞的Amaxa試劑盒(Lonza)，使用電穿孔進行轉染。將6ug如上實施例中所公開製備的質體轉染到2 X 10⁶個工程化CHO細胞中。在轉染後，將細胞在37℃下培養(incubation)4天，然後使用來自於Invitrogen(Carlsbad,CA)的商品化試劑盒通過ELISA分析滴定濃度(titer)。如圖7A和7B中所示，在暫態表達期間，在15種變體中變體F42表現出最高的表達水準。

IL-2變體在CTLL-2細胞中的T細胞擴增試驗(expansiontest)。使用來自於被轉染的工程化CHO細胞的暫態表達的F42變體上清液進行CTLL-2細胞擴增測定法。在所述細胞增殖測定法期間，將野生型IL-2用作100%增殖的對照(示出在圖8中)。在所述測定法中將變體F42製備成連續稀釋液，10ng/mL、3.33ng/mL、1.11ng/mL、0.37ng/mL、0.12ng/mL和0.04ng/mL。使用Cell Titer Glo(Promega,WI)來進行細胞增殖。在TECAN genios pro上讀取發光信號。正如在圖8中所示，F42顯示出0.24ng/mL左右的EC₅₀，同時與其野生型對照相比保留95%的功能。用於研究本發明的IL-2變體的通用程式顯示如下：

實施例7-通過CTLL-2細胞擴增(expansion)篩選IL-2變體

利用如實施例中所公開的CTLL-2細胞擴增測定法(cell expansion assay)，篩選了包括本領域中已知的16個最初選擇的位點(包括野生型)和4個其他位點(K32、K48、K49、K76)的20種不同的IL-2變體(Charych,D.等，PLoS One,12(7)：p.e0179431,2017)。如圖9和表3中所示，大多數變體在誘變(mutagenesis)後保留它們的活性。由於CTLL-2細胞具有殘留的IL-2Rα表達這一性質，帶有與CTLL2細胞結合最低的誘變的變體仍表現出一定的與IL-2Rα的固有結合，儘管這種結合極低。例如，觀察到與IL-2Rα表現出最低結合的P65 IL-2變體與IL-2Rα顯示出一定的固有的偏倚結合(inherent biased binding)。鑒定到的變體被進一步分析它們在PEG化之後的結合能力。

實施例8-使用體外結合測定法分析所選的變體

使用在上述實施例中所描述的體外結合測定法生物層干涉儀測定法，進行了所選變體P65、Y45、E61、F42、K35、K49和T37的分析。每個變體分別在它們的特定位置處共軛有20K PEG。然後通過在實施例中別處描述的BLI(生物層干涉儀)測定法分析PEG化的變體。如圖10A-10C中所示，在Octet上測試了PEG化的變體與IL-2Rα的結合。在測定中使用野生型IL-2作為陽性對照。在PEG化後，大多數變體顯示出在92.9%至99.9%之間的急劇降低的與IL-2Rα的結合。在所測試的PEG化變體中，P65和Y45顯示出活性阻斷超過99%，表4。

實施例9-使用PathHunter二聚化測定法(PathHunter Dimerization assay)分析所選的變體

為了發現用於PEG共軛的最佳位點，使用了由DiscoverX(Fremont,CA)開發的PathHunter二聚化測定法。總的來說，所述測定法系統使用外源表達的IL-2受體，其已被工程化改造成具有酶的互補結合結構域，一旦以前分開的受體通過添加IL-2分子二聚化後被啟動，產生化學發光信號(圖11)。在U2OS細胞中產生了兩種細胞株。一種細胞株表達三種受體IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ。另一種細胞株表達IL-2Rβ和IL-2Rγ。每種變體的結合EC₅₀值的比率(EC₅₀-βγ/EC₅₀-αβγ)被用於估算它們的相對保留結合能力。如表5中所示，可能最好的變體具有1的值，意味著它們的100%的βγ結合能力得以保留，而α結合被100%阻斷。正如注意到的，變體Y45-BR4(共軛有20K 4-支鏈PEG的變體Y45)和P65-PEG20K(共軛有20K-直鏈PEG的變體P65)顯示出最低的值，表明這兩種PEG化的變體將是用於進一步評估的最佳候選者。

正如表6中所示，在進行的另一項實驗中，除了變體Y45-BR4和P65-PEG20K之外，變體P65-BR4(共軛有20K 4-支鏈PEG的變體P65)和P65-BR2(共軛有20K 2-支鏈PEG的變體P65)也被選擇作為用於進一步評估的候選者。

實施例10-IL-2變體的離體pSTAT5測定法(Ex vivo pSTAT5 assay)

為了進一步評估PEG化的變體的體外功能，使用了利用PBMC的離體測定法(ex vivo assay)。如圖12中所示，IL-2與其受體的結合觸發了STAT5的磷酸化(pSTAT5)的提高。因此，檢測pSTAT5水準將是IL-2變體與內源IL-2受體的結合的指示物。將人類全PBMC用所選的PEG化的變體例如Y45-BR2(共軛有20K 2-支鏈PEG的變體Y45)、 Y45-BR4(共軛有20K 4-支鏈PEG的變體Y45)和P65-PEG20K(共軛有直鏈20K PEG的變體P65)處理，然後分離成兩個群體CD8+ T細胞和CD4+ Treg細胞。正如表7中所示，所有三種變體對於它們的保留的βγ結合活性和阻斷的α結合活性而言，表現出大大改進的活性。這些結果得到了如表8中所示的另一項pSTAT5測定法中試驗的變體的進一步支持。來自於這個pSTAT5測定法(表8)的結果顯示，對於它們的降低的與Treg細胞結合的能力和相對維持的與CD8+細胞的結合而言，許多變體具有急劇改進的活性。在表8中，計算的CD8+/Treg比率被用於指示變體的排序，以便可以通過相似的排序系統將PathHunter測定法結果直接與pSTAT5測定法結果進行比較。

表8-使用離體測定法的IL-2變體的改進的結合活性-實驗2

實施例11-在CHO哺乳動物細胞中生產的糖基化IL-2和大腸桿菌中生產的非糖基化IL-2的存在下CTLL-2細胞的複製(clone)生長和長期繁殖的比較

已報導本源人類IL-2是一種糖基化蛋白，其在Thr-3上具有O-連接的糖基化(Conradt等，Eur J Biochem 153(2)：255-261(1985))。與非糖基化IL-2相比，這種糖基化的功能與在生理pH下更高的溶解性、更慢的體內清除和在癌症療法中更低的免疫原性相關(Robb等，Proc Natl Acad Sci U S A 81(20)：6486-6490(1984)；Goodson等，Biotechnology(NY)8(4)：343-346(1990))。更重要的是，已顯示在促進同種活化的人類T細胞的複製(clone)生長和長期繁殖中，糖基化IL-2優於非糖基化IL-2(Pawelec等，Immunobiology 174(1)：67-75(1987))，表明在治療性應用中糖基化IL-2是更好的選擇。

為了進一步分析糖基化IL-2和非糖基化IL-2的生物功能，進行了分析CTLL-2細胞的複製(clone)生長速率和長期繁殖頻率的實驗(圖13)。將單個CTLL-2細胞放置在具有γ-輻照過的CF1-MEF(小鼠胚胎成纖維細胞)細胞的預包 被飼養細胞層的96孔板(Thermo Fisher,Waltham,MA,CAT#A34180)中。在使用各種不同濃度(0.005nM、0.05nM、0.5nM和5nM)的從CHO細胞或大腸桿菌生產的野生型IL-2的單一處理的19天生長期間，對長出的集落數目的百分率和19天培養(incubation)結束時存活的集落的百分率進行計數和分析。如圖13中所示(以0.5nM處理為例)，糖基化IL-2與非糖基化IL-2相比在促進複製(clone)生長中顯示出優越活性。平均來說，在作為CTLL-2細胞生長的最適細胞培養條件的0.5nM IL-2濃度存在下，糖基化IL-2促進複製(clone)生長的能力為非糖基化IL-2的兩倍高。在長期培養(incubation)(~19天)後，來自於糖基化IL-2處理的集落存活率為非糖基化IL-2處理的4倍高。所述資料清楚地證明糖基化IL-2在促進IL-2回應性細胞的複製(clone)生長和長期繁殖方面具有優越的活性，並進一步支援了它的有希望的治療應用。

實施例12-在新的穩定宿主CHO細胞株中IL-2表達的滴定濃度(titer)提高

在本領域中已嘗試了許多方法來提高野生型IL-2及其變體在CHO細胞中的表達(參見例如Kim等，J Microbiol Biotechnol,14(4),810-815(2004))。然而，在工業中提高含有非天然胺基酸的蛋白質的表達，受到在哺乳動物細胞中相對低的產率的挑戰。在本發明中為了解決這一難題，利用了在PCT/2018US/035764(其整體通過引用併入本發明)中公開的用於在真核細胞株中改進蛋白質滴定濃度(titer)生產的專有技術來產生IL-2及其變體的穩定的合併細胞，並將其用於所產生的穩定IL-2細胞株。

簡單來說，發現表達Bax/Bak敲除的不同的五代平臺細胞株急劇提高IL-2的蛋白質表達，並將IL-2蛋白產量提高到比母體細胞株高約40%。除了通過Bax/Bak敲除在這些細胞中抑制凋亡之外，還發現UPF1敲除進一步提高IL-2的表達。

野生型IL-2及其變體(F42、Y45和P65)兩者已通過產生它們的穩定合併物進行試驗。如圖13中所示，三種IL-2變體F42、Y45和P65、包括野生型IL-2的穩定合併物，與本領域中已有的水準相比具有極大提高的表達水準(參見例如Kim等，J Microbiol Biotechnol.,14(4),810-815,(2004))，在產生各自的穩定合併物後對於野生型來說高達約740mg/L，對於F42變體來說高達120mg/L(示出在圖14中)。所述資料顯示，通過產生具有高效摻入的非天然胺基酸的新的CHO細胞株，可以改進或提高IL-2蛋白的生產或產率。還已表明，表達水準和功能是位點特異性相關的。

實施例13-IL-2變體F42-R38A顯示出IL-2R α結合的完全阻斷

正如本發明中所公開的，將所述非天然編碼的胺基酸替換與所述IL-2內的其他添加、替換或缺失相組合，以影響所述IL-2多肽的其他生物學性狀，包括但不限於提高所述IL-2的穩定性(包括但不限於對蛋白水解降解的抗性)或提高所述IL-2對其受體的親和性，提高所述IL-2的藥物穩定性，增強所述IL-2的腫瘤抑制及/或腫瘤減小的活性，提高所述IL-2或變體的溶解性(包括但不限於當在大腸桿菌或其他宿主細胞中表達時)，提高所述IL-2在大腸桿菌或其他重組宿主細胞中表達後的溶解性，提高所述多肽在大腸桿菌或其他重組宿主細胞中表達後的溶解性，調節對IL-2受體、結合蛋白或相關配體的親和性，調節與IL-2 受體結合後的信號轉導，調節循環半衰期，調節釋放或生物利用度，促進純化，或改善或改變特定給藥途徑，提高IL-2變體對其受體的親和性，提高IL-2變體對IL-2-Rβ及/或IL-2-Rγ的親和性。

因此，為了改進變體F42的功能，在CHO細胞中製備了具有另外的突變R38A的新變體。如圖15A中所示，在穩定細胞株產生期間，在穩定的合併物中使用IL-2變體F42中的非天然胺基酸和天然胺基酸替換的組合，滴定濃度(titer)提高到118mg/L。在R38A突變存在下，變體F42的蛋白質表達水準不僅得以維持，而且顯示出20%的提高。為了試驗PEG化的F42-R38A變體的功能，進行了CTLL-2細胞結合測定法。如表9中所示，F42-R38A 20K 2-支鏈PEG(變體F42-R38-BR2)共軛物顯示出15.9nM的EC50，與此相比F42顯示出3.6nM的EC50，因此結合阻斷效率提高超過4倍(圖15B)。基於野生型IL-2的0.025nM的EC50，結合阻斷效率超過99.9%。就高的蛋白質表達水準和阻斷與IL-2Rα結合的效率而言，這種變體顯示出用於治療性應用的極大潛力。

通過BLI評估了F42pAF變體、R38A-F42pAF變體(包含非天然胺基酸和點突變)和F42-R38A-PEG20K-BR2的結合動力學，以確定R38A突變對於IL-2Rα的結合的影響。圖15C示出了三種構建體的結合傳感圖，並且相關的結合常數(KD)示出在表10中。正如在表10中看到的，IL-2-F42pAF具有20nM的IL-2Rα結合KD。添加R38A突變後，IL-2-F42-R38ApAF具有233nM的IL-2Rα結合KD， 這對應於IL-2Rα結合的12倍的降低。在將IL-2-R38A-F42pAF與20K 2-支鏈PEG分子共軛後，IL-2Rα結合被阻止。所述結果清楚地證明，添加的突變有效地阻斷F42-R38A與其受體IL-2Rα的結合。

應當理解，本發明描述的實施例和實施例僅用於說明目的，並且根據其進行的各種不同修改或改變將被本領域普通技術人員建議，並將被包括在本申請的精神和範圍以及隨附的申請專利範圍的範圍之內。在本申請中引用的所有出版物、專利、專利申請及/或其他文獻為所有目的整體通過引用併入本發明，其程度等同於每個單獨的出版物、專利、專利申請及/或其他文獻被單獨地指明為所有目的通過引用併入本發明。

本發明通過下述編號的實施例進一步描述。

1.一種包含一個或多個非天然編碼的胺基酸的IL-2多肽，其中所述IL-2多肽與野生型IL-2相比與其受體次單元的相互作用降低。

2.實施例1的IL-2，其中所述IL-2多肽與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：390%同源。

3.實施例1的IL-2，其中所述IL-2多肽與SEQ ID NO：2至少95%同源。

4.實施例1的IL-2，其中所述IL-2多肽與SEQ ID NO：2至少98%同源。

5.實施例1的IL-2，其中所述IL-2多肽與SEQ ID NO：2至少99%同源。

6.實施例1的IL-2，其中所述IL-2被共軛到一個或多個水溶性聚合物。

7.實施例6的IL-2，其中至少一個所述水溶性聚合物被連接到至少一個所述非天然編碼的胺基酸。

8實施例7的IL-2，其中所述水溶性聚合物是PEG。

9.實施例8的IL-2，其中所述PEG具有10至50之間的分子量。

10.實施例1的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸被替換在選自下述殘基的位置處：第1位之前(即在N-端處)，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133位，或被添加到所述蛋白質的羧基端，及其任何組合。

11.實施例10的IL-2，其中所述IL-2與野生型IL-2相比包含調節所述IL-2多肽對其IL2Rα受體次單元的親和性的一個或多個胺基酸替換、添加或缺失。

12.實施例10的IL-2，其中所述IL-2包含提高所述IL-2的穩定性或溶解性的一個或多個胺基酸替換、添加或缺失。

13.實施例10的IL-2，其中所述IL-2包含提高所述IL-2多肽在重組宿主細胞中的表達或體外合成的一個或多個胺基酸替換、添加或缺失。

14.實施例10的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸被替換在選自第3、35、37、38、41、42、43、44、45、61、62、64、65、68、72和107位殘基及其任何組合的位置處。

15.實施例10的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸對原本對所述多肽中的20種常見胺基酸中的任一者無反應性的接頭、聚合物或生物活性分子具有反應性。

16.實施例10的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸包含羰基、胺氧基、肼基、醯肼基、胺基脲基、疊氮基或炔基。

17.實施例16的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸包含羰基。

18.實施例10的IL-2，其中所述IL-2被連接到生物活性分子、細胞毒性藥劑、水溶性聚合物或免疫刺激劑。

19.實施例18的IL-2，其中共軛的IL-2被附連到一個或多個水溶性聚合物。

20.實施例18的IL-2，其中所述生物活性分子、細胞毒性藥劑或免疫刺激劑通過接頭連接到所述IL-2。

21.實施例18的IL-2，其中所述生物活性分子、細胞毒性藥劑或免疫刺激劑通過可切割或不可切割的接頭連接到所述IL-2。

22.實施例18的IL-2，其中所述生物活性分子、細胞毒性藥劑或免疫刺激劑被直接共軛到所述IL-2中的一個或多個所述非天然編碼的胺基酸。

23.實施例10的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸具有下述結構：

其中n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；R2是H、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基；R3是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團；並且R4是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。

24.實施例23的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸包含胺氧基。

25.實施例23的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸包含醯肼基。

26.實施例23的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸包含肼基。

27.實施例23的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸殘基包含胺基脲基。

28.實施例23的IL-2多肽，其中所述非天然編碼的胺基酸殘基包含疊氮基。

29.實施例1的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸具有下述結構：

其中n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R2是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R3是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。

30.實施例29的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸包含炔基。

31.實施例1的IL-2，其中所述非天然編碼的胺基酸具有下述結構：

其中n是0-10；R1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R2是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R3是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。

32.實施例7的IL-2，其中所述水溶性聚合物具有約0.1kDa至約100kDa之間的分子量。

33.實施例32的IL-2多肽，其中所述水溶性聚合物具有約0.1kDa至約50kDa之間的分子量。

34.實施例16的IL-2，其中所述胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基通過醯胺鍵連接到所述水溶性聚合物。

35.實施例19的IL-2，其通過將包含羰基的水溶性聚合物與包含含有胺氧基、肼、醯肼或胺基尿素基的非天然編碼的胺基酸的多肽進行反應來製造。

36.實施例1的IL-2，其中所述IL-2被糖基化。

37.實施例1的IL-2，其中所述IL-2多肽還包含通過所述非天然編碼的胺基酸連接到所述多肽的接頭、聚合物或生物活性分子。

38.實施例37的IL-2，其中所述接頭、聚合物或生物活性分子通過糖組成部分連接到所述多肽。

39.一種製造實施例1的IL-2的方法，所述方法包括將包含非天然編碼的胺基酸的分離的IL-2多肽與包含與所述非天然編碼的胺基酸反應的組成部分的接頭、聚合物或生物活性分子相接觸。

40.實施例39的方法，其中所述聚合物包含選自水溶性聚合物和聚乙二醇的組成部分。

41.實施例39的方法，其中所述非天然編碼的胺基酸包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼基、胺基脲基、疊氮基或炔基。

42.實施例39的方法，其中所述非天然編碼的胺基酸包含羰基組成部分，並且所述接頭、聚合物或生物活性分子包含胺氧基、肼、醯肼或胺基脲組成部分。

43.實施例39的方法，其中所述胺氧基、肼、醯肼或胺基脲組成部分通過醯胺鍵連接到所述接頭、聚合物或生物活性分子。

44.實施例39的方法，其中所述非天然編碼的胺基酸包含炔基組成部分，並且所述接頭、聚合物或生物活性分子包含疊氮基組成部分。

45.實施例39的方法，其中所述非天然編碼的胺基酸包含疊氮基組成部分，並且所述接頭、聚合物或生物活性分子包含炔基組成部分。

46.實施例7的IL-2多肽，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇組成部分。

47.實施例46的IL-2多肽，其中所述聚乙二醇組成部分是支鏈或多臂聚合物。

48.一種組合物，其包含實施例10的IL-2和可藥用載體。

49.實施例48的組合物，其中所述非天然編碼的胺基酸被連接到水溶性聚合物。

50.一種治療具有受IL-2調節的障礙的患者的方法，所述方法包括向所述患者給藥治療有效量的實施例42的組合物。

51.一種組合物，其包含共軛到生物活性分子的實施例10的IL-2和可藥用載體。

52.一種組合物，其包含實施例10的IL-2和可藥用載體，所述IL-2還包含接頭和共軛物。

53.一種製造包含非天然編碼的胺基酸的IL-2的方法，所述方法包括將包含編碼IL-2多肽的包含選擇器密碼子的一種或多種多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的細胞在允許包含非天然編碼的胺基酸的所述IL-2多肽的表達的條件下培養；和純化所述多肽。

54.一種調節IL-2多肽的血清半衰期或迴圈時間的方法，所述方法包括用一個或多個非天然編碼的胺基酸替換所述多肽中的任意一個或多個天然存在的胺基酸。

55.一種IL-2多肽，其包含在重組宿主細胞中提高所述IL-2多肽的表達的一個或多個胺基酸替換、添加或缺失。

56.一種IL-2多肽，其包含至少一個接頭、聚合物或生物活性分子，其中所述接頭、聚合物或生物活性分子通過經核糖體併入到所述多肽中的非天然編碼的胺基酸的官能團附連到所述多肽。

57.一種IL-2多肽，其包含附連到一個或多個非天然編碼的胺基酸的接頭、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然編碼的胺基酸在預選的位置處經核糖體併入到所述多肽中。

58.一種在被診斷為患有癌症的人中減少腫瘤細胞的數目的方法，所述方法包括向需要這種減少的人給藥包含實施例56的PEG-IL-2A的藥物組合物。

59.實施例58的方法，其中所述共軛物以約0.1μ/kg至約50μ/kg的劑量給藥。

<110> 大陸商北京泰德製藥股份有限公司(Beijing Tide Pharmaceuticals Co Ltd)

<120> 介白素-2多肽共軛物及其用途

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<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> Xaa=*U=非天然編碼的胺基酸

<400> 17

<210> 18

<211> 133

<212> PRT

<213> Human

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(43)

<223> Xaa=*U=非天然編碼的胺基酸

<400> 18

<210> 19

<211> 133

<212> PRT

<213> Human

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(37)

<223> Xaa=*U=非天然編碼的胺基酸

<400> 19

<210> 20

<211> 133

<212> PRT

<213> Human

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=*U=非天然編碼的胺基酸

<400> 20

<210> 21

<211> 133

<212> PRT

<213> Human

<220>

<221> misc_feature

<222> (64)..(64)

<223> Xaa=*U=非天然編碼的胺基酸

<400> 21

<210> 22

<211> 133

<212> PRT

<213> Human

<220>

<221> misc_feature

<222> (68)..(68)

<223> Xaa=*U=非天然編碼的胺基酸

<400> 22

<210> 23

<211> 133

<212> PRT

<213> Human

<220>

<221> misc_feature

<222> (107)..(107)

<223> Xaa=*U=非天然編碼的胺基酸

<400> 23

1:IL-2受體α

2:IL-2受體β

3:IL-2受體γ

4:IL-2

5:待篩選的位點

6:PEG(聚乙二醇)

CD8+:CD8受體蛋白質

Kd:解離常數(dissociation constant)

Rβγ:受體βγ

Rαβγ:受體αβγ

Treg:調節T細胞

Claims (41)

1. 一種包含一個或多個非天然編碼的(non-naturally encoded)胺基酸的介白素-2(interleukin-2，IL-2)多肽，其中該IL-2多肽與野生型IL-2相比與其受體次單元(receptor subunit)的相互作用降低，該IL-2多肽與SEQ ID NO：2至少99%同源(homologous)，以及其中該非天然編碼的胺基酸被替換在第45位殘基的位置處，其中該IL-2多肽被共軛到一個或多個PEG，以及該IL-2多肽被糖基化。
2. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中至少一個PEG被連接到至少一個該非天然編碼的胺基酸。
3. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該PEG具有10至50kDa之間的分子量。
4. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該IL-2多肽與野生型IL-2相比包含調節該IL-2多肽對其IL2Rα受體次單元的親和性的一個或多個胺基酸替換、添加或缺失。
5. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該IL-2多肽包含提高該IL-2多肽的穩定性或溶解性的一個或多個胺基酸替換、添加或缺失。
6. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該IL-2多肽包含提高該IL-2多肽在重組宿主細胞中的表達或體外合成的一個或多個胺基酸替換、添加或缺失。
7. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸對原本對該多肽中的20種常見胺基酸中的任一者無反應性(unreactive)的接頭(linker)、聚合物或生物活性分子具有反應性。
8. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸包含羰基、胺氧基、肼基、醯肼基、胺基脲基(semicarbazide)、疊氮基或炔基。
9. 如請求項8所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸包含羰基。
10. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該IL-2多肽被連接到生物活性分子、細胞毒性藥劑或免疫刺激劑。
11. 如請求項10所述之IL-2多肽，其中該生物活性分子、細胞毒性藥劑或免疫刺激劑通過可切割或不可切割的接頭連接到該IL-2多肽。
12. 如請求項10所述之IL-2多肽，其中該生物活性分子、細胞毒性藥劑或免疫刺激劑被直接共軛到該IL-2多肽中的一個或多個該非天然編碼的胺基酸。
13. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸具有下述結構：

    

    其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；R₂是H、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基；R₃是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團；並且R₄是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
14. 如請求項13所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸包含胺氧基。
15. 如請求項13所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸包含醯肼基。
16. 如請求項13所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸包含肼基。
17. 如請求項13所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸殘基包含胺基脲基(semicarbazide)。
18. 如請求項13所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸殘基包含疊氮基。
19. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸具有下述結構：

    

    其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R₂是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R₃是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
20. 如請求項19所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸包含炔基。
21. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該非天然編碼的胺基酸具有下述結構：

    

    其中n是0-10；R₁是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R₂是H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，並且R₃是H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
22. 如請求項8所述之IL-2多肽，其中該胺氧基、肼基、醯肼基或胺基脲基通過醯胺鍵連接到該水溶性聚合物。
23. 如請求項1所述之IL-2多肽，其通過將包含羰基的水溶性聚合物與包含含有胺氧基、肼基、醯肼基或胺基尿素基的非天然編碼的胺基酸的多肽進行反應來製造。
24. 如請求項1所述之IL-2多肽，其中該IL-2多肽還包含通過該非天然編碼的胺基酸連接到該多肽的接頭、聚合物或生物活性分子。
25. 如請求項24所述之IL-2多肽，其中該接頭、聚合物或生物活性分子通過糖組成部分(saccharide moiety)連接到該IL-2多肽。
26. 一種製造如請求項1所述之IL-2多肽的方法，該方法包括將包含非天然編碼的胺基酸的分離的該IL-2多肽與包含與該非天然編碼的胺基酸反應的組成部分的接頭、聚合物或生物活性分子相接觸。
27. 如請求項26所述之方法，其中該非天然編碼的胺基酸包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼基、胺基脲基、疊氮基或炔基。
28. 如請求項26所述之方法，其中該非天然編碼的胺基酸包含羰基組成部分，並且該接頭、聚合物或生物活性分子包含胺氧基、肼基、醯肼基或胺基尿素基的組成部分(moiety)。
29. 如請求項26所述之方法，其中該胺氧基、肼基、醯肼基或胺基尿素基組成部分通過醯胺鍵連接到該接頭、聚合物或生物活性分子。
30. 如請求項26所述之方法，其中該非天然編碼的胺基酸包含炔基組成部分，並且該接頭、聚合物或生物活性分子包含疊氮基組成部分。
31. 如請求項26所述之方法，其中該非天然編碼的胺基酸包含疊氮基組成部分，並且該接頭、聚合物或生物活性分子包含炔基組成部分。
32. 一種組合物，其包含如請求項1所述之IL-2多肽和可藥用載體(pharmaceutically acceptable carrier)。
33. 如請求項32所述之組合物，其中該非天然編碼的胺基酸被連接到水溶性聚合物。
34. 一種治療有效量(therapeutically-effective amount)的如請求項32的組合物在製備藥物中的用途，其中所述藥物用於治療具有受IL-2調節的障礙的患者。
35. 一種組合物，其包含共軛到生物活性分子的如請求項1所述之IL-2多肽和可藥用載體。
36. 一種組合物，其包含如請求項1所述之IL-2多肽和可藥用載體，該IL-2多肽還包含接頭和共軛物。
37. 一種製造如請求項1所述之IL-2多肽的方法，該方法包括將包含編碼IL-2多肽的包含選擇器密碼子(selector codon)的一種或多種多核苷酸、正交RNA合成酶(orthogonal RNA synthetase)和正交tRNA(orthogonal tRNA)的細胞在允許包含非天然編碼的胺基酸的該IL-2多肽多肽的表達(expression)的條件下培養；和純化該IL-2多肽多肽。
38. 一種調節IL-2多肽的血清半衰期(serum half-life)或循環時間(serum circulation time)的方法，該方法包括如請求項1所限定的用一個或多個非天然編碼的胺基酸替換該多肽中的任意一個或多個天然存在的胺基酸。
39. 一種如請求項36所述的組合物在製備藥物中的用途，其中所述藥物用於在被診斷為患有癌症的人中減少腫瘤細胞的數目。
40. 如請求項39所述之用途，其中該藥物組合物以0.1μ/kg至50μ/kg的劑量給藥。
41. 一種組合物，其包含如請求項1所述之IL-2多肽和可藥用載體，其中所述的組合物在製備藥物中的用途，其中所述藥物用於治療癌症。

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