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CN104245722A - 白细胞介素-10多肽结合物和其用途 - Google Patents

白细胞介素-10多肽结合物和其用途 Download PDF

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CN104245722A CN201380021501.1A CN201380021501A CN104245722A CN 104245722 A CN104245722 A CN 104245722A CN 201380021501 A CN201380021501 A CN 201380021501A CN 104245722 A CN104245722 A CN 104245722A
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克里斯汀·S.·艾顿
梅兰妮·尼尔森
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Abstract

本发明涉及白细胞介素-10(IL-10)多肽结合物，其包含至少一个非天然编码氨基酸。

Description

白细胞介素-10多肽结合物和其用途
技术领域
本发明涉及白细胞介素-10(interleukin-10；IL-10)多肽结合物，其包含至少一个非天然编码氨基酸。
背景技术
白细胞介素-10是一种细胞因子(cytokine)，其原先特征在于其抑制Th1细胞因子产生的活性。参见例如，德·弗里斯(de Vries)和德·瓦尔·梅勒菲特(de Waal Malefyt)(编，1995)白细胞介素-10兰德斯公司(Landes Co.),德克萨斯州奥斯汀(Austin,Tex.)；等。
免疫功能的抑制用于许多不同情况下。参见例如保罗(Paul)(编，1995)基本免疫学第3版(Fundamental Immunology 3d ed.),雷文出版社(Raven Press),纽约(NY)。具体来说，同种异体免疫很大程度上因其非凡力量而在移植情况下至关重要。随着器官和组织移植在医学情况下变得更常见，将来自组织排斥反应的问题减到最少的能力展现更大的经济优势。另外，将自体免疫性病状减到最少、阻断对颗粒性抗原(例如细菌和寄生虫)的某些响应和将对某些可溶性抗原(蛋白质和过敏原两者)的反应减到最少的手段将表示显著的治疗学进展。
缺乏将组织排斥反应、移植对宿主疾病或其它免疫响应减到最少或消除的完全有效治疗剂导致许多问题。本发明阐述许多这些问题并提供其解决方案。
尽管白细胞介素-10(IL-10)通常已经被认为是有利于肿瘤逃避免疫监视的消炎、免疫抑制性细胞因子，累积的迹象显示IL-10也具有一些免疫刺激特性。实际上，IL-10具有在不同实验模型中正面和负面地影响固有和适应性免疫功能的多效性能力。
IL-10在身体中的血清半衰期相对较短。举例来说，通过体外生物分析或通过败血性休克模型系统中功效所测量的小鼠中半衰期[参见史密斯(Smith)等人,细胞免疫学(Cellular Immunology)173:207214(1996)]是约2到6小时。
蛋白质的聚乙二醇化可以通过延迟肾清除率来延长其血清半衰期，因为PEG部分使蛋白质的流体动力学半径大量增加。然而，常规聚乙二醇化方法是针对单体蛋白质和更大的二硫键接复合物(例如单克隆抗体)。IL-10的聚乙二醇化呈现此项技术中已知的其它聚乙二醇化蛋白质未遇到的问题，因为IL-10二聚物通过非共价相互作用保持在一起。在聚乙二醇化期间可能增加的IL-10解离将导致聚乙二醇化的IL-10单体(PEG-IL-10单体)。PEG-IL-10单体不保持IL-10的生物活性。还注意到二-PEG-IL-10，亦即在IL-10的两个氨基酸残基上聚乙二醇化不保持明显体外生物活性。在保持生物活性或甚至提供生物活性增强或调节的治疗中使用一或多种IL-10多肽将是优势。本发明阐述这一点和此项技术中的其它相关需要。
癌症和肿瘤可以受到免疫系统控制或根除。免疫系统包括若干类型的淋巴和骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)、嗜酸性细胞、T细胞、B细胞和嗜中性白细胞。这些淋巴和骨髓细胞产生被称为细胞因子的分泌性信号传导蛋白质。细胞因子包括例如白细胞介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN.γ.)、IL-12和IL-23。免疫响应包括炎症，亦即免疫细胞全身性地或在身体特定位置中的累积。响应于感染剂或外来物质，免疫细胞分泌细胞因子，所述细胞因子随后调节免疫细胞增殖、发育、分化或迁移。免疫响应过度可能产生病理性结果(例如自身免疫病症)，而免疫响应削弱可能导致癌症。免疫系统的抗肿瘤响应包括例如由巨噬细胞、NK细胞和嗜中性白细胞介导的固有免疫和例如由抗原呈递细胞(APC)、T细胞和B细胞介导的适应性免疫(参见例如阿巴斯(Abbas)等人(编)(2000)细胞和分子免疫学(Cellular and MolecularImmunology),W.B.桑德斯公司(W.B.Saunders Co.),宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,Pa.)；奥本海姆(Oppenheim)和费尔德曼(Feldmann)(编)(2001)细胞因子参考文献(Cytokine Reference),学术出版社(Academic Press),加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.)；冯·安德里安(von Andrian)和麦基(Mackay)(2000)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)343:1020-1034；戴维森(Davidson)和戴蒙德(Diamond)(2001)新英格兰医学杂志345:340-350)。
调节免疫响应的方法已经用于治疗癌症，例如黑色素瘤。这些方法包括用细胞因子(例如IL-2、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、IFN.γ.、粒细胞巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)和转型生长因子(TGF))治疗或用细胞因子拮抗剂(例如抗体)治疗。白细胞介素-10首先被描述为细胞因子合成抑制性因子(CSIF；参见例如菲奥伦蒂诺(Fiorentino)等人(1989)实验医学杂志(J.Exp.Med.)170:2081-2095)。IL-10是由T细胞、B细胞、单核细胞产生的多效性细胞因子，其可以充当免疫抑制剂和免疫刺激剂两者(参见例如格鲁士(Groux)等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)160:3188-3193；和海根保尔(Hagenbaugh)等人(1997)实验医学杂志185:2101-2110)。
共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(缩写为PEG)是一种提高许多生物活性分子(包括蛋白质、肽，尤其是疏水性分子)的水溶性、生物利用率；延长血清半衰期；延长治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间的方法。PEG已被广泛用于医药品或人工移植物以及生物相容性、无毒和无免疫原性极为重要的其它应用中。
PEG衍生物常常是通过反应性化学官能团(例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N端和碳水化合物部分)与生物活性分子连接。蛋白质和其它分子常常具有少数反应性位点可供聚合物连接。最适合于通过聚合物连接而修饰的位点常常在受体结合中起到重要作用，并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，聚合物链与生物学活性分子上所述反应性位点的任意连接常常导致经聚合物修饰的分子的生物活性明显减少或甚至全部丧失。R.克拉克(R.Clark)等人,(1996),生物化学杂志(J.Biol.Chem.),271:21969-21977。为了形成聚合物分子量足够赋予目标分子所需优点的结合物，现有技术方法通常涉及大量聚合物臂与分子的无规连接，由此增加母体分子的生物活性减少或甚至完全丧失的风险。
形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应性位点可由蛋白质的结构指示。蛋白质(包括酶)由各种序列的α-氨基酸构成，其具有通式结构H2N--CHR--COOH。一个氨基酸的α-氨基部分(H2N--)与相邻氨基酸的羧基部分(--COOH)接合形成酰胺键，其可以表示为--(NH--CHR--CO)n--，其中下标“n”可以等于数百或数千。由R表示的片段可以含有用于蛋白质生物活性和连接PEG衍生物的反应性位点。
举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位中存在--NH2部分。ε-NH2在碱性pH条件下自由反应。用PEG进行蛋白质衍生化领域中的很多技术都是针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε-NH2部分的PEG衍生物。“用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation)”,奈克塔分子工程目录(Nektar Molecular Engineering Catalog),2003,第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共有的局限性，即，无法将其选择性地安装于蛋白质表面上存在的常常大量赖氨酸残基上。在其中赖氨酸残基对于蛋白质活性极为重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下，或在其中赖氨酸残基对于介导蛋白质与其它生物分子的相互作用起作用的情况下(如在受体结合位点的情况下)，这将会成为显著的局限性。
现有蛋白质聚乙二醇化方法的另一同等重要的难题在于，PEG衍生物可与除所需残基外的其它残基发生不必要的副反应。组氨酸含有一个反应性亚氨基部分，结构上表示为--N(H)--，但许多与ε--NH2反应的化学反应性物质也可以与--N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链带有一个游离硫氢基，结构上表示为-SH。在一些情况下，针对赖氨酸ε--NH2基团的PEG衍生物还与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可以产生经PEG衍生化的生物活性分子的复杂不均匀混合物，并且有破坏作为目标的生物活性分子活性的风险。需要开发出这样的PEG衍生物，其允许在蛋白质内的单一位点引入化学官能团，随后使一或多种PEG聚合物能够在蛋白质表面上明确界定并可预测的特定位点处与生物活性分子选择性偶合。
除赖氨酸残基外，此项技术中还曾就开发以其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N端)为目标的经活化PEG试剂进行了大量尝试。参见例如以引用的方式并入本文中的美国专利第6,610,281号，以及“用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物”，奈克塔分子工程目录,2003,第1-17页。可以使用定点诱变和此项技术中已知的其它技术，将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且可使由此得到的游离硫氢基部分与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。但这种方法比较麻烦，因为引入游离硫氢基会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，需要具有一种将化学官能团引入生物活性分子中的手段，其能使一或多种PEG聚合物与蛋白质选择性偶合，同时还与硫氢基以及蛋白质中常见的其它化学官能团相容(即，不会与之发生不必要的副反应)。
如从此项技术的抽样中可以看出，已经证明，已经开发出的用于连接到蛋白质侧链上，尤其赖氨酸氨基酸侧链上的--NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分上的许多这些衍生物在其合成和使用中有问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定的键，这些键经历水解，并因此分解、降解，或者另外在水性环境(例如血流)中不稳定。一些衍生物形成较为稳定的键，但会在形成键之前经历水解，这意味着PEG衍生物上的反应性基团可能会在连接蛋白质之前就失活。一些衍生物略带毒性，因此不太适合于体内使用。一些衍生物反应过慢而无法实际使用。一些衍生物会因连接到负责蛋白质活性的位点而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物对其将连接的位点不具特异性，这也会导致丧失所需活性以及缺乏结果的可再现性。为克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质相关的挑战，已经开发出更稳定(例如，美国专利6,602,498，其以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6,610,281，其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。
近来，已经报导了蛋白质科学中的一种全新技术，这项技术有望克服与蛋白质位点特异性修饰相关的众多局限。特定来说，已经将新组分添加到原核类大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)(例如L.王(L.Wang)等人,(2001),科学 (Science)292:498-500)和真核类酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae；S.cerevisiae)(例如J.秦(J.Chin)等人,科学301:964-7(2003))的蛋白质生物合成机构中，其使得能够将非基因编码氨基酸并入体内蛋白质中。已经使用此方法将多种具有新颖化学、物理或生物学特性的新氨基酸，包括光亲和力分类和可光异构化氨基酸、光交联氨基酸(参见例如秦,J.W.(Chin,J.W.)等人(2002)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A),99:11020-11024；和秦,J.W.等人,(2002)美国化学会志(J.Am.Chem. Soc.)124:9026-9027)、酮氨基酸、含有重原子氨基酸和糖基化氨基酸有效地且高保真地并入大肠杆菌中和酵母中响应于琥珀密码子(TAG)的蛋白质中。参见例如J.W.秦(J.W.Chin)等人,(2002),美国化学会志(Journal of the American Chemical  Society)124:9026-9027；J.W.秦和P.G.舒尔茨(P.G.Schultz),(2002),化学生物化学 (ChemBioChem)3(11):1135-1137；J.W.秦等人,(2002),美国国家科学院院刊(PNAS  United States of America)99:11020-11024；和L.王和P.G.舒尔茨,(2002),化学通讯 (Chem.Comm.),1:1-11。所有参考文献的全文都以引用的方式并入本文中。
本发明除了其它以外还阐述与IL-10多肽得活性和产生相关的问题，并且还阐述生物学或药理学特性改良(例如针对肿瘤的活性提高和/或治疗半衰期改良)的IL-10多肽的产生。
发明内容
本发明涉及具有一或多个非天然编码氨基酸的白细胞介素-10(IL-10)多肽。本发明进一步涉及结合于水溶性聚合物上的具有一或多个非天然编码氨基酸的IL-10多肽。
本发明提供抑制或减少肿瘤或癌症的方法，其包含用有效量的本发明IL-10多肽接触所述肿瘤。本发明提供抑制或减少肿瘤或癌症增长的方法，其包含用有效量的本发明聚乙二醇化IL-10(PEG-IL-10)多肽接触所述肿瘤。在一个实施例中，PEG-IL-10是单聚乙二醇化的。在一个实施例中，PEG-IL-10是双聚乙二醇化的。在一个实施例中，PEG-IL-10具有连接到其上的两个(2)以上聚(乙)二醇分子。本发明的另一个实施例提供使用本发明的PEG-IL-10多肽来调节CD8+T细胞和/或调节CD8+T细胞对肿瘤细胞的响应的方法。在另一个实施例中，本发明的IL-10和/或PEG-IL-10多肽调节至少一种发炎性细胞因子的表达，所述细胞因子可以选自由以下各者组成的群组：IFN.γ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-配体(RANK-L)。在某些实施例中，PEG-IL-10与至少一种化学治疗剂共投与。化学治疗剂可以选自由以下各者组成的群组：替莫唑胺(temozolomide)、吉西他滨(gemictabine)、多柔比星(doxorubicin)、IFN-α。在本发明的另一个实施例中，PEG-IL-10与至少一种化学治疗剂共投与。在本发明的一个实施例中，PEG-IL-10与以下各者之一共投与：替莫唑胺(剂量5mg-250mg)；吉西他滨(200mg-1g)；多柔比星(1mg/m2-50mg/m2)；干扰素-α(1μg/kg-300μg/kg)。在某些实施例中，肿瘤或癌症选自由以下各者组成的群组：结肠癌、卵巢癌、乳癌、黑色素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤和白血病。
在一些实施例中，本发明提供使用经工程改造形式的IL-10(例如聚乙二醇化IL-10)来治疗癌症的方法。在本发明的另一个实施例中，聚乙二醇化IL-10多肽的血清半衰期比非聚乙二醇化IL-10多肽长。在本发明的另一个实施例中，聚乙二醇化IL-10多肽的血清半衰期比野生型IL-10多肽长。在另一个实施例中，本发明的IL-10多肽提高肿瘤杀伤活性。在本发明的另一个实施例中，当与非聚乙二醇化相比时，本发明的IL-10多肽增加肿瘤位点处CD8+T细胞的数量。在本发明的另一个实施例中，当与野生型IL-10相比时，本发明的IL-10多肽增加肿瘤位点处CD8+T细胞的数量。动物模型表明IL-10可以剂量依赖性方式诱导NK-细胞活化并且促使目标细胞破坏(参见例如郑(Zheng)等人(1996)实验医学杂志184:579-584；高彦(Kundu)等人(1996)国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)88:536-541)。进一步研究指示IL-10在肿瘤微环境中的存在与患者生存期较好相关(参见例如卢(Lu)等人(2004)临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)22:4575-4583)。
本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物中急性白血病的方法，其包含向所述哺乳动物投与治疗有效量的本发明IL-10多肽。本发明还一种用于抑制急性白血病母细胞增殖的方法，其包含向罹患急性白血病的哺乳动物投与治疗有效剂量的本发明IL-10。
本发明还提供一种用于治疗哺乳动物中急性白血病的方法，其包含向所述哺乳动物投与治疗有效量的本发明IL-10，其中所述IL-10对急性白血病母细胞的抗增殖作用在投与白细胞介素-10停止之后仍持续。
根据本发明的方法，待治疗的急性白血病可能是骨髓细胞白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))或B细胞白血病(例如急性淋巴球性白血病(ALL))。待投与的IL-10可以选自由病毒白细胞介素-10和人类白细胞介素-10组成的群组。
在本发明的一个实施例中，具有一或多个非天然编码氨基酸的IL-10多肽结合于细胞毒性剂上。特定来说，合适的细胞毒性剂可以是例如奥瑞他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA小沟烷基化剂、烯二炔、莱希菌素(lexitropsin)、倍癌霉素(duocarmycin)、紫杉烷(taxane)、嘌呤霉素(puromycin)、海兔毒素(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)和长春花(vinca)生物碱。在特定实施例中，细胞毒性剂是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奥瑞他汀E、紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、CC-1065、SN-38、拓朴替康(topotecan)、吗啉基-多柔比星、根霉素、氰基吗啉基-多柔比星、海兔毒素-10、棘霉素(echinomycin)、考布他汀(combretatstatin)、卡里奇霉素(chalicheamicin)、美登素(maytansine)、DM-1或纺锤菌素(netropsin)。其它合适的细胞毒性剂包括抗微管蛋白剂，例如奥瑞他汀、长春花生物碱、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、紫杉烷、巴卡亭(baccatin)衍生物、念珠藻素(cryptophysin)、类美登素、考布他汀或海兔毒素。在特定实施例中，抗微管蛋白剂是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奥瑞他汀E、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine)、VP-16、喜树碱(camptothecin)、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃坡霉素A(epothilone A)、埃坡霉素B、诺考达唑(nocodazole)、秋水仙碱(colchicines)、秋水酰胺(colcimid)、雌莫司汀(estramustine)、西马多丁(cemadotin)、迪斯德莫来(discodermolide)、美登素、DM-1或艾榴塞洛素(eleutherobin)。结合于细胞毒性剂上的IL-10或结合于细胞毒性剂上的PEG-IL-10可以直接结合。结合于细胞毒性剂上的IL-10或结合于细胞毒性剂上的PEG-IL-10可以通过来自IL-10多肽的非天然编码氨基酸中的至少一者直接结合。结合于细胞毒性剂上的IL-10或结合于细胞毒性剂上的PEG-IL-10可以通过连接基团间接结合。结合于细胞毒性剂上的IL-10或结合于细胞毒性剂上的PEG-IL-10可以通过可裂解连接基团间接结合。结合于细胞毒性剂上的IL-10或结合于细胞毒性剂上的PEG-IL-10可以通过不可裂解连接基团间接结合。可裂解连接基团通常对胞内条件下的裂解敏感。合适的可裂解连接基团包括例如可由胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)裂解的肽连接基团。在例示性实施例中，连接基团可以是二肽连接基团，例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)连接基团。其它合适的连接基团包括可以在小于5.5的pH值下水解的连接基团，例如腙连接基团。其它合适的可裂解连接基团包括二硫连接基团。
在一些实施例中，本发明的IL-10多肽用于癌症的过继性免疫疗法。本发明还包括包含用于过继性免疫疗法的白细胞介素-10的医药组合物。本发明部分地基于以下发现：IL-10可以预防或减少细胞因子产生，所述细胞因子被认为是造成目前过继性免疫疗法中遇到的许多有害副作用的原因。本文中所用的术语“过继性免疫疗法”意味着涉及将对抗功能性癌症的免疫细胞转移到患者中的疗法。优选地，对抗癌症的免疫细胞包含源自患者本身的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。广义上，本发明的方法包含以下步骤：(i)在存在IL-2和IL-10的情况下培养TIL，(ii)向患者投与经培养的TIL，和(iii)在投与TIL之后向患者投与IL-2和IL-10。这些化学物质和方法描述于贝尔托齐(Bertozzi)申请案美国公开案第20090068738号，其以全文引用的方式并入本文中。
在本发明的一些实施例中，IL-10多肽用于抑制移植组织的排斥反应。本发明还包括包含白细胞介素-10的医药组合物。
在一些实施例中，投与本发明的IL-10多肽抑制肿瘤诱导的血管生成且/或增强肿瘤毒性分子[例如氧化氮(NO)]的产生，其在一或多种临床前模型中导致肿瘤消退。
本发明提供一种用于治疗哺乳动物中癌症的方法，其通过投与有效量的IL-10来进行，所述哺乳动物例如包括(但不限于)具有以下病状中一或多者的那些哺乳动物：结肠癌、卵巢癌、乳癌、黑色素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤和白血病。
本文中所用的白细胞介素10或IL-10被定义为满足以下的蛋白质：(a)氨基酸序列实质上与如本申请SEQ ID No:1-4中所揭示的成熟(亦即缺少分泌性前导序列)IL-10的已知序列一致并且(b)至少一种生物活性是原生IL-10中常见的。出于本发明的目的，糖基化(例如在例如酵母或CHO细胞的真核细胞中产生)和未糖基化(例如以化学方式合成或在大肠杆菌中产生)的IL-10是等效物并且可以互换使用。还包括突变蛋白质和其它类似物，包括病毒IL-10，其保持IL-10的生物活性。
由杰弗逊(Jefferson)基梅尔癌症中心(Kimmel Cancer Center)在2010 ASCO芝加哥年会呈递的数据(摘要#8588)显示肿瘤细胞中的白细胞介素-10产生可以用作用自体黑色素瘤细胞疫苗治疗的患有晚期黑色素瘤的患者中的预测因子。从黑色素瘤组织中提取肿瘤细胞并保存以供用于疫苗生产。在疫苗生产之前，研究人员从组织中分离一小部分黑色素瘤细胞。随后培养这些小部分以用于产生IL-10。肿瘤样本在用称为二硝基苯基(DNP)的化学品修饰之后用于自体癌细胞疫苗，所述修饰使肿瘤细胞与宿主免疫系统更加无关。肿瘤细胞中的IL-10与患者接受疫苗之后的较坏预后相关，因为T细胞因肿瘤微环境中的较高IL-10含量而下调，可能降低疫苗的有效性。因此，本发明的另一个实施例是待在投与自体癌症疫苗之前、同时或之后共投与的IL-10拮抗剂。
优选地，本发明的白细胞介素-10选自由用以下氨基酸序列界定的开放式阅读框的成熟多肽组成的群组：Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly ValArg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu ProAsn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys AspGln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly CysGln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln AspPro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu ArgArg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala PheAsn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr IleGlu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn(SEQ ID NO:l),and Met Glu Arg Arg Leu Val ValThr Leu Gln Cys Leu Val Leu Leu Tyr Leu Ala Pro Glu Cys Gly Gly Thr Asp Gln Cys AspAsn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe GlnThr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly TyrLeu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala GluAsn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu ArgLeu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln IleLys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp He PheIle Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg(SEQ ID NO:2)，其中标准三字母缩写用于从N端开始指示L-氨基酸。这两种形式的IL-10有时分别被称为人类IL-10(或人类细胞因子合成抑制性因子(“CSIF”))和病毒IL-10(或BCRF1)，例如穆尔(Moore)等人,科学248:1230-1234(1990)；维埃拉(Vieira)等人,国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci)88:1172-1176(1991)；菲奥伦蒂诺等人,实验医学杂志170:2081-2095(1989)；和许(Hsu)等人,科学250:830-832(1990)。还已经描述马疱疹病毒类型2的同系物(罗(Roe)等人,病毒基因(Virus Genes)7:111-116(1993))。以及来自各种物种的大量对应物。更优选地，用于本发明方法的成熟IL-10选自由以下各者组成的群组：Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro GlyAsn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe GlnMet Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly TyrLeu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala GluAsn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg LeuArg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val LysAsn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe IleAsn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn(SEQ ID NO:3)和Thr Asp Gln CysAsp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe PheGln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys GlyTyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln AlaGlu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr LeuArg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val GluGln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe AspIle Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg(SEQ ID NO:4)。
因此，在特定实施例中，本发明提供一种减少或抑制哺乳动物骨髓转移中移植对宿主疾病的方法，其包含向所述哺乳动物投与有效量的白细胞介素-10。其还提供一种抑制免疫系统对后续出现的所述抗原的抗原特异性响应的方法，其包含向所述免疫系统投与有效量的外源性白细胞介素-10和所述抗原。在优选实施例中，免疫响应由巨噬细胞、APC、兰格汉氏细胞(langerhans cell)或树突状细胞介导；所述方法进一步抑制CD4.sup.+宿主反应性T细胞克隆的增殖性响应；或所述抑制持续至少约21天。在其它优选实施例中，有效量足以减少响应者T细胞活化；或可以进一步包含降低外周血液单核细胞、树突状细胞、单核细胞和/或正常B细胞的刺激能力。
在另一个实施例中，本发明提供一种实质上纯的抗原特异性无变应性(anergic)T细胞，其特征在于在较低IL-2；较低IL-4；较低IL-5；中间物IFN-γ；较低GM-CSF；和较高IL-10再刺激后产生；以及通过向所述T细胞的前驱体投与外源性IL-10和抗原的组合来制得种群。在优选实施例中，前驱体是CD4.sup.+T细胞；所述细胞进一步产生较高TNF-α；所述细胞诱导对抗原的无变应性响应；所投与的IL-10是人类IL-10；投与IL-10保持至少约7天；且/或无变应性病状持续至少约21天。抗原特异性可以是对选自以下各者的抗原的特异性：蛋白质抗原；颗粒性抗原；同种异体抗原；或自体抗原。
另一个实施例是一种实质上纯的抗原特异性无变应性T细胞，其特征在于在较低IL-2、较低IL-5；中间物IFN-γ；较低GM-CSF；和较高IL-10的再刺激后产生。通常，细胞因子的产生含量对IL-2小于约500pg/ml；对IL-5介于约300与3000pg/ml之间；对IFN-γ至少约1000pg/ml；对GM-CSF介于约300-3000pg ml之间；且对IL-10至少约3000pg/mL，优选地，在用抗CD3再刺激后的IL-10含量是Th1细胞的至少约5倍。
本发明还包涵一种实质上纯的T细胞，其展现对抗原的抗原特异性无变应性，包括例如其中所述抗原是同种异体抗原或自身抗原；其在用至少约3000pg/ml的抗CD3再刺激后产生IL-10；或其展现抗原特异性无变应性，保持至少约21天。
在另一个实施例中，本发明提供一种抑制T细胞对抗原的响应的方法，其通过向含有所述细胞的免疫系统中投与外源性IL-10与抗原或抗CD3抗体的组合。优选地，抗原是同种异体抗原或自身抗原；但通常受MHC分子限制。在其它实施例中，所述方法体内进行；或进一步抑制对后续刺激的响应，例如伴随例如器官或骨髓移植的组织移植的响应。通常，T细胞来自所述组织移植的接受者而抗原来自供体MHC。常常当响应伴随组织移植时，投与在组织移植之前；向接受者引入T细胞；或在移植之前向待移植的组织(例如向供体和/或在转运期间)投与IL-10。在其它实施例中，抗原造成自体免疫疾病。
在其它实施例中，本发明还提供一种抑制T细胞对抗原的后续响应的方法，其通过向免疫系统中投与外源性IL-10；与抗原或抗CD3抗体的组合。优选地，IL-10投与保持至少约7天。
本发明进一步提供一种诱导T细胞对MHC抗原无变应性的方法，其通过向T细胞中投与前驱体，外源性IL-10和抗原；或外源性IL-10与抗CD3抗体。优选地，IL-10投与保持至少约7天。
由本发明包涵的另一个实施例是一种包含IL-10和抗原的组合物。组合物可以是包含IL-10和医药学上可接受载剂的医药组合物；所述IL-10可以是人类IL-10；或抗原可以是同种异体抗原；自身抗原；蛋白质抗原或颗粒性抗原。
本发明提供包含一或多个非天然编码氨基酸的白细胞介素10(IL-10)多肽。本发明还提供IL-10多肽的单体和二聚物。本发明还提供IL-10多肽的三聚物。本发明提供IL-10多肽的多聚物。本发明还提供包含一或多个非天然编码氨基酸的IL-10二聚物。本发明提供包含一或多个非天然编码氨基酸的IL-10多聚物。
在一些实施例中，IL-10多肽包含一或多个翻译后修饰。在一些实施例中，IL-10多肽与连接基团、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，形成包括锌的IL-10三聚物。在一些实施例中，IL-10单体是均质的。在一些实施例中，IL-10二聚物是均质的。在一些实施例中，IL-10多聚物结合于一种水溶性聚合物上。在一些实施例中，IL-10多聚物结合于两种水溶性聚合物。在一些实施例中，IL-10多聚物结合于三种水溶性聚合物。在一些实施例中，IL-10多聚物结合于三种以上水溶性聚合物上。在一些实施例中，其中IL-10多肽与长度足够允许形成二聚物的连接基团连接。在一些实施例中，其中IL-10多肽与长度足以允许形成三聚物的连接基团连接。在一些实施例中，其中IL-10多肽与长度足以允许形成多聚物的连接基团连接。在一些实施例中，IL-10多肽与双官能聚合物、双官能连接基团或至少一个其它IL-10多肽连接。在一些实施例中，IL-10多肽包含一或多个翻译后修饰。在一些实施例中，IL-10多肽与连接基团、聚合物或生物活性分子连接。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)(PEG)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸通过连接基团与水溶性聚合物连接或与水溶性聚合物键接。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是一种双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽是IL-10。
在一些实施例中，IL-10或其变异体包含至少两个与包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。
在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在IL-10或其变异体中以下位置中的一或多者中：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1、2、4中的相应氨基酸)。
在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在IL-10或其变异体中以下位置中的一或多者中：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在如下的对应于IL-10或其变异体二级结构的以下区域中一或多者中的任何位置中：螺旋L侧；疏水性相互作用位点处；N端最初43个氨基酸内；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4的氨基酸位置44-160内。在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在IL-10或其变异体的以下位置中的一或多者中：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4的位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和其任何组合。在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在IL-10或其变异体的以下位置中的一或多者中：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合。
在一些实施例中，在IL-10或其变异体中的这些位置中的一或多者处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID No:1、2、4中的相应氨基酸或任何IL-10序列中的相应氨基酸)。
在一些实施例中，在IL-10或其变异体中的这些位置中的一或多者处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或其任何组合。
在一些实施例中，在IL-10或其变异体中的这些位置中的一或多者处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合。
在一些实施例中，IL-10或其变异体包含调节所述IL-10对另一个IL-10或其变异体的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IL-10或其变异体包含调节IL-10或其变异体对IL-10受体或结合搭配物的亲和力的取代、添加缺失缺失，所述受体或结合搭配物包括(但不限于)蛋白质、多肽、脂质、脂肪酸、小分子或核酸。在一些实施例中，IL-10或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10的稳定性相比较时调节所述IL-10稳定性的取代、添加或缺失。稳定性和/或溶解性可以使用所属领域的普通技术人员已知的多种不同分析来测量。所述分析包括(但不限于)SE-HPLC和RP-HPLC。在一些实施例中，IL-10或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10的免疫原性相比较时调节所述IL-10免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IL-10包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10的血清半衰期或循环时间相比较时调节所述IL-10血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，IL-10或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变异体的水溶性相比较时提高所述IL-10水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IL-10或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变异体的溶解性相比较时提高宿主细胞中所产生IL-10或其变异体溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IL-10或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变异体的表达或合成相比较时提高IL-10在宿主细胞中的表达或增加体外合成的取代、添加或缺失。包含此取代的IL-10或其变异体保持激动剂活性并且保持或改良在宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中，IL-10或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变异体的蛋白酶抗性相比较时提高所述IL-10或其变异体蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IL-10或其变异体包含在与受体对不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变异体相互作用的活性相比较时调节所述IL-10受体的信号转导活性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IL-10或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10的结合相比较时调节所述IL-10与另一个分子的结合的取代、添加或缺失。
PEG-IL-10可以调配成医药组合物，所述医药组合物包含治疗有效量的IL-10和医药载剂。“治疗有效量”是足以提供所需治疗结果的量。优选地，所述量负性副作用最少。经投与以治疗可用IL-10治疗的病状的PEG-IL-10量是基于所结合蛋白质的IL-10活性，所述活性可以通过此项技术中已知的IL-10活性分析来加以测定。对需要所述治疗的特定患者的治疗有效量可以通过考虑各种因素来确定，例如所治疗的病状、患者的总体健康状况、投药方法、副作用严重性等。在肿瘤的情形下，合适的IL-10活性将是例如浸润到肿瘤位点中的CD8T细胞，来自这些浸润性细胞的发炎性细胞因子(例如IFN.γ.、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-L)的表达，生物样品中TNF-α或IFN-γ的含量增加。
聚乙二醇化IL-10的治疗有效量可以在每天每千克体重约0.01到约100μg蛋白质的范围内。优选地，聚乙二醇化IL-10的量在每天每千克体重约0.1到20μg蛋白质，更优选地每天每千克体重约0.5到10μg蛋白质，并且最优选地每天每千克体重约1到4μg蛋白质的范围内。使用本发明的PEG-IL-10可以采用较不频繁的投药安排，因为此结合形式的作用比IL-10长。聚乙二醇化IL-10调配成经纯化的形式，并且实质上不含聚集体和其它蛋白质。优选地，通过连续输注投与PEG-IL-10，以使得每天递送介于约50到800μg蛋白质范围内的量(亦即每天每千克体重约1到16μg蛋白质PEG-IL-10)。每日输注速率可以基于副作用监测和血液细胞计数而变化。
为制备含有单-PEG-IL-10的医药组合物，将治疗有效量的PEG-IL-10与医药学上可接受的载剂或赋形剂混合。载剂或赋形剂优选地是惰性的。医药载剂可以是任何适合于向患者递送本发明IL-10组合物的相容的无毒物质。合适载剂的实例包括标准生理食盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和汉克氏溶液(Hank'ssolution)。也可以使用非水性载剂，例如不挥发性油和油酸乙酯。优选的载剂是5％右旋糖/盐水。载剂可以含有少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲剂和防腐剂，参见例如雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)和美国药典：国内处方集(U.S.Pharmacopeia:National Formulary),马克出版公司(MackPublishing Company),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.)(1984)。治疗剂和诊断剂的调配物可以通过与生理学上可接受的呈例如冻干粉末、浆料、水溶液或悬浮液形式的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备(参见例如哈德曼(Hardman)等人(2001)古德曼和吉尔曼治疗剂药理学基础(Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics),麦格劳-希尔集团(McGraw-Hill),纽约州纽约(New York,N.Y.)；杰纳罗(Gennaro)(2000)雷明顿：医药科学和实践(Remington:The Science and Practiceof Pharmacy),利平科特、威廉姆斯和威尔金斯公司(Lippincott,Williams,andWilkrns),纽约州纽约；阿维斯(Avis)等人(编)(1993)医药剂型：非经肠药物治疗(Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications),马塞尔·德克公司(MarcelDekker),纽约州；利伯曼(Lieberman)等人(编)(1990)医药剂型：锭剂(Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets),马塞尔·德克公司,纽约州；利伯曼等人(编)(1990)医药剂型：分散系统(Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems),马塞尔·德克公司,纽约州；韦纳(Weiner)和科考斯基(Kotkoskie)(2000)赋形剂毒性和安全性(Excipient Toxicity and Safety),马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约州纽约。
本发明的组合物可以经口投与或注射到身体中。用于经口使用的调配物还可以包括进一步保护IL-10不受胃肠道中蛋白酶影响的化合物。注射通常是肌肉内、皮下、皮内或静脉内的。或者，在适当情况下可以使用关节内注射或其它途径。
当非经肠投与时，聚乙二醇化IL-10优选地以单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)与医药载剂联合调配。参见例如阿维斯等人,编,医药剂型：非经肠药物治疗,德克公司(Dekker),纽约州(1993)；利伯曼等人,编,医药剂型：锭剂,德克公司,纽约州(1990)；和利伯曼等人,编,医药剂型：分散系统,德克公司,纽约州(1990)。或者，本发明的组合物可以通过可植入或可注射药物递送系统引入患者身体中，例如厄克特(Urquhart)等人药理学和毒理学年鉴(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)24:199-236,(1984)；路易斯(Lewis)编,农药和医药的受控释放(ControlledRelease of Pesticides and Pharmaceuticals)普雷纳姆出版社(Plenum Press),纽约(1981)美国专利第3,773,919号；第3,270,960号；等。聚乙二醇化IL-10可以在存在或不存在各种添加剂和/或稀释剂的情况下在例如水、盐水或缓冲媒剂的水性媒剂中投与。
特定患者的有效量可以取决于例如以下各者的因素而变化：所治疗的病状、患者的总体健康状况、投药的方法途径和剂量、和副作用的严重性(参见例如梅纳德(Maynard)等人(1996)良好临床实践SOP手册(A Handbook of SOPs for GoodClinical Practice),国际药物出版社(Interpharm Press),佛罗里达州波卡拉顿(BocaRaton,Fla.)；登特(Dent)(2001)良好实验室和良好临床实践(Good Laboratory andGood Clinical Practice),厄奇出版社(Urch Publ.),英国伦敦)。
典型兽医学、实验或研究个体包括猴、犬、猫、大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、马和人类。
由临床医生例如使用此项技术中已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素来确定适当剂量。一般来说，剂量以在某种程度上小于最佳剂量的量开始，并且其随后以较小增量增加，直到相对于任何负性副作用实现所需或最佳效果。重要诊断测量包括例如炎症症状或所产生发炎性细胞因子含量的那些测量。优选地，将使用的生物来源于与治疗所针对的动物相同物种，由此将对试剂的体液响应减到最少。
用第二治疗剂(例如细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或辐射)共投与或治疗的方法是此项技术中众所周知的(参见例如哈德曼等人(编)(2001)古德曼和吉尔曼治疗剂药理学基础,第10补充版,麦格劳-希尔集团,纽约州纽约；普尔(Poole)和彼得森(Peterson)(编)(2001)高阶实践的药物治疗学：实用方法(Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach),利平科特、威廉姆斯和威尔金斯公司,宾夕法尼亚州费城(Phila.,PA)；钱伯纳(Chabner)和隆戈(Longo)(编)(2001)癌症化学疗法和生物疗法(Cancer Chemotherapy andBiotherapy),利平科特、威廉姆斯和威尔金斯公司,宾夕法尼亚州费城)。有效量的治疗剂将减少症状(例如肿瘤大小)或抑制肿瘤增长，通常至少10％；通常至少20％；优选地至少约30％；更优选地至少40％，并且最优选地至少50％。
本发明提供治疗增生性病状或病症的方法，例如以下各者的癌症：子宫、子宫颈、乳房、前列腺、睪丸、阴茎、胃肠道(例如食道、口咽、胃、小肠或大肠、结肠、或直肠)、肾脏、肾细胞、膀胱、骨、骨髓、皮肤、头部或颈部、皮肤、肝脏、胆囊、心、肺、胰腺、唾液腺、肾上腺、甲状腺、大脑(例如神经胶质瘤)、神经节、中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)和免疫系统(例如脾脏或胸腺)。本发明提供治疗例如以下各者的方法：免疫原性肿瘤、非免疫原性肿瘤、休眠肿瘤、病毒诱导癌症(例如上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌、乳突状瘤病毒、腺癌、淋巴瘤)、癌瘤、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化学诱导癌症、癌转移和血管生成。本发明还涵盖例如通过调节调控性T细胞(Treg)和或CD8T细胞的活性来降低对肿瘤细胞或癌细胞抗原的耐受性(参见例如拉米雷兹-蒙太古(Ramirez-Montagut)等人(2003)癌基因(Oncogene)22:3180-3187；萨瓦亚(Sawaya)等人(2003)新英格兰医学杂志349:1501-1509；法勒(Farrar)等人(1999)免疫学杂志162:2842-2849；勒(Le)等人(2001)免疫学杂志167:6765-6772；卡尼斯塔(Cannistra)和尼洛夫(Niloff)(1996)新英格兰医学杂志334:1030-1038；奥斯本(Osborne)(1998)新英格兰医学杂志339:1609-1618；林奇(Lynch)和沙佩勒(Chapelle)(2003)新英格兰医学杂志348:919-932；恩辛格(Enzinger)和梅尔(Mayer)(2003)新英格兰医学杂志349:2241-2252；福雷斯蒂耶雷(Forastiere)等人(2001)新英格兰医学杂志345:1890-1900；伊兹比克(Izbicki)等人(1997)新英格兰医学杂志337:1188-1194；霍兰德(Holland)等人(编)(1996)癌症的癌症药物百科全书(Cancer Medicine Encyclopedia of Cancer),第4补充版,学术出版社,加利福尼亚州圣地亚哥)。
在一些实施例中，本发明提供用于用PEG-IL-10和至少一种其它治疗剂或诊断剂来治疗增生性病状、癌症、肿瘤或癌变前病状(例如非典型增生)的方法。其它治疗剂可以是例如细胞因子或细胞因子拮抗剂(例如IL-12、干扰素-α或抗表皮生长因子受体)、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、抗叶酸(例如甲胺喋呤(methotrexate)或氟尿嘧啶)、伊立替康(irinotecan)、环磷酰胺、放射线疗法、激素或抗激素疗法(例如雄激素、雌激素、抗雌激素、氟他胺(flutamide)或二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol))、手术、他莫昔芬(tamoxifen)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二溴卫矛醇(mitolactol)、烷基化剂(例如美法仑(melphalan)或顺铂)、依托泊苷(etoposide)、长春瑞宾、长春碱、长春地辛、糖皮质激素(glucocorticoid)、组胺受体拮抗剂、血管生成抑制剂、辐射、辐射敏化剂、蒽环霉素(anthracycline)、长春花生物碱、紫杉烷(例如紫杉醇和多烯紫杉醇)、细胞周期抑制剂(例如细胞周期调节蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitor))、针对另一种肿瘤抗原的单克隆抗体、单克隆抗体与毒素的复合物、T细胞佐剂、骨髓移植、或抗原呈递细胞(例如树突状细胞疗法)。疫苗可以可溶性蛋白质形式或以编码所述蛋白质的核酸形式提供(参见例如勒等人,同前文献；格列柯(Greco)和泽尔夫斯基(Zellefsky)(编)(2000)前列腺癌的放射线疗法(Radiotherapy of Prostate Cancer),哈伍德学术出版社(HarwoodAcademic),阿姆斯特丹(Amsterdam)；夏皮罗(Shapiro)和雷希特(Recht)(2001)新英格兰医学杂志344:1997-2008；霍托巴基(Hortobagyi)(1998)新英格兰医学杂志339:974-984；卡特罗纳(Catalona)(1994)新英格兰医学杂志331:996-1004；内勒(Naylor)和哈登(Hadden)(2003)国际免疫药理学(Int.Immunopharmacol.)3:1205-1215；国际辅助肺癌研究合作组(The Int.Adjuvant Lung Cancer Trial CollaborativeGroup)(2004)新英格兰医学杂志350:351-360；斯拉蒙(Slamon)等人(2001)新英格兰医学杂志344:783-792；库德卡(Kudelka)等人(1998)新英格兰医学杂志338:991-992；范·内登(van Netten)等人(1996)新英格兰医学杂志334:920-921)。
还提供治疗癌症髓外造血(EMH)的方法。描述EMH(参见例如拉奥(Rao)等人(2003)白血病和淋巴瘤(Leuk.Lymphoma)44:715-718；雷恩(Lane)等人(2002)皮肤病理学杂志(J.Cutan.Pathol.)29:608-612)。
在一些实施例中，IL-10或其变异体包含与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10的脂质结合活性相比较调节所述IL-10脂质结合的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IL-10或其变异体包含与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变异体的脂质代谢活性相比较增强所述IL-10与代谢脂质相关活性的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，IL-10或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应野生型IL-10的相容性相比较时提高所述IL-10或其变异体与医药防腐剂(例如间甲酚、苯酚、苯甲醇)相容性的取代、添加或缺失。此提高的相容性将使保存的医药调配物制剂能够在存储期间保持蛋白质的物理化学特性(physiochemical property)和生物活性。
在一些实施例中，利用一或多个非天然氨基酸产生一或多个经工程改造的键。分子内键可以多种方式产生，包括(但不限于)在合适条件下，蛋白质中的两个氨基酸之间发生反应(一个或两个氨基酸可以是非天然氨基酸)；在合适条件下，两个氨基酸与连接基团、聚合物或其它分子发生反应，这两个氨基酸各自可以是天然编码或非天然编码的，等。
在一些实施例中，IL-10或其变异体中的一或多个氨基酸取代可以用一或多个天然存在或非天然存在的氨基酸进行。在一些实施例中，IL-10或其变异体中的氨基酸取代可以用天然存在或非天然存在的氨基酸进行，其限制条件为至少一个取代用非天然编码氨基酸进行。在一些实施例中，IL-10或其变异体中的一或多个氨基酸取代可以用一或多个天然存在的氨基酸进行，并且另外至少一个取代用非天然编码氨基酸进行。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2是H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；并且R3是H、氨基酸、多肽，或氨基端修饰基团；并且R4是H、氨基酸、多肽，或羧基端修饰基团。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0到10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X是O、N、S或不存在；m是0到10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在一些实施例中，多肽是IL-10激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，IL-10激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，IL-10激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含非天然编码氨基酸和一或多个翻译后修饰、连接基团、聚合物或生物活性分子。
本发明还提供包含编码SEQ ID No:1、2、3、4多肽的多核苷酸的分离核酸，并且本发明提供其包含在严格条件下与编码SEQ ID No:1、2、3、4多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸的分离核酸，。本发明还提供包含编码如SEQ ID No:3、4所示的多肽的多核苷酸的分离核酸，其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。本发明还提供包含编码如SEQ ID NO:1、2、3、4所示的多肽的多核苷酸的分离核酸。本发明还提供包含编码如SEQ ID NO:1、2、3、4所示具有一或多个非天然编码氨基酸的多肽的多核苷酸的分离核酸。所属领域的普通技术人员易于了解，多种不同的多核苷酸可以编码本发明的任何多肽。
在一些实施例中，选择密码子选自由以下密码子组成的群组：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。
本发明还提供制造与水溶性聚合物连接的IL-10或其变异体的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的经分离IL-10或其变异体与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入IL-10或其变异体到中中的非天然编码氨基酸对另外对20种常见氨基酸中的任一者均不具反应性的水溶性聚合物具有反应性。在一些实施例中，并入IL-10中的非天然编码氨基酸对另外对20种常见氨基酸中的任一者均不具反应性的连接基团、聚合物或生物学活性分子具有反应性。
在一些实施例中，与水溶性聚合物连接的IL-10或其变异体通过使包含含羰基氨基酸的IL-10或其变异体与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应来制得。在一些实施例中，氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基通过酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。在一些实施例中，氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基通过氨基甲酸酯键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中，与水溶性聚合物连接的IL-10或其变异体通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制得。
在一些实施例中，与水溶性聚合物连接的IL-10或其变异体通过使包含含炔烃氨基酸的IL-10与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应来制得。在一些实施例中，叠氮基或炔基通过酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中，与水溶性聚合物连接的IL-10或其变异体通过使包含含叠氮基氨基酸的IL-10或其变异体与包含炔烃部分的聚(乙二醇)分子反应来制得。在一些实施例中，叠氮基或炔基通过酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子的分子量介于约0.1kDa与约100kDa之间。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子的分子量介于约0.1kDa与约50kDa之间。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是分支聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)分支聚合物中各个分支的分子量介于1kDa与100kDa之间，或介于1kDa与50kDa之间。
在一些实施例中，与IL-10或其变异体连接的水溶性聚合物包含聚亚烷基二醇部分。在一些实施例中，并入IL-10中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、酰肼、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入IL-10或其变异体中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分，并且水溶性聚合物包含氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中，并入IL-10或其变异体中的非天然编码氨基酸包含炔烃部分，并且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中，并入IL-10或其变异体中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，并且水溶性聚合物包含炔烃部分。
本发明还提供包含含非天然编码氨基酸的IL-10或其变异体和药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
本发明还提供包含编码IL-10或其IL-10变异体的包含选择密码子的多核苷酸的细胞。在一些实施例中，所述细胞包含用于将非天然编码氨基酸取代到IL-10中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本发明还提供包含编码IL-10或其变异体的包含选择密码子的多核苷酸的细胞。在一些实施例中，所述细胞包含将非天然编码氨基酸取代到IL-10或其变异体中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本发明还提供制造包含非天然编码氨基酸的IL-10或其任何变异体的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许IL-10或其变异体表达的条件下培养包含编码IL-10的一或多个多核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞；并且从所述细胞和/或培养基中纯化所述IL-10或其变异体。
本发明还提供延长IL-10或其变异体的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明还提供调节IL-10或其变异体免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码氨基酸取代天然存在的IL-10或其变异体中的任何一或多个氨基酸和/或使IL-10或其变异体与连接基团、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。在本发明的一个实施例中，连接基团长到足以允许柔性和允许二聚物形成。在本发明的一个实施例中，连接基团的长度至少是3个氨基酸或18个原子，以允许二聚物形成。
本发明还提供用有效量的本发明IL-10或IL-10变异体分子治疗需要所述治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含向患者投与治疗有效量的包含含非天然编码氨基酸的IL-10或IL-10变异体分子和医药学上可接受的载剂的药物组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，IL-10经糖基化。在一些实施例中，IL-10未经糖基化。
本发明还提供包含SEQ ID NO:1、2、3、4中所示的序列或任何其它IL-10序列的IL-10，不同之处在于至少一个氨基酸由非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
本发明还提供医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和包含SEQ ID NO:1、2、3、4中所示的序列或任何其它IL-10序列的白细胞介素10或其天然变异体，其中至少一个氨基酸由非天然编码氨基酸取代。本发明还提供医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和包含SEQ ID NO:1、2、3、4中所示的序列的白细胞介素10或其天然变异体。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物通过糖部分与白细胞介素10或其天然变异体连接。在一些实施例中，连接基团、聚合物或生物活性分子通过糖部分与白细胞介素10或其天然变异体连接。
本发明还提供一种白细胞介素10或其天然变异体，其包含通过共价键在单个氨基酸处与IL-10连接的水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，与水溶性聚合物共价连接的氨基酸是多肽中存在的非天然编码氨基酸。
本发明提供一种包含至少一个连接基团、聚合物或生物活性分子的IL-10或其变异体，其中所述连接基团、聚合物或生物活性分子通过以核糖体方式并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能团连接到多肽上。在一些实施例中，IL-10或其变异体经单聚乙二醇化。本发明还提供一种包含连接到一或多个非天然编码氨基酸上的连接基团、聚合物或生物活性分子的IL-10或其变异体，其中所述非天然编码氨基酸在预先选择的位点处以核糖体方式并入所述多肽中。
包括在本发明范围内的是IL-10或其变异体中与IL-10编码区域接合的前导序列或信号序列，以及与IL-10编码区域接合的异源信号序列。所选异源前导序列或信号序列应是例如由宿主细胞分泌系统识别和加工而分泌且可能由宿主细胞信号肽酶裂解的序列。一种用本发明IL-10治疗病状或病症的方法打算暗示在存在或不存在信号肽或前导肽的情况下用IL-10或其变异体治疗。
在另一个实施例中，包含一或多个非天然存在氨基酸的IL-10或其变异体与另一个分子(包括(但不限于)PEG)的结合提供实质上经纯化的IL-10，归因于用于与非天然氨基酸结合的独特化学反应。包含一或多个非天然编码氨基酸的IL-10或其变异体与另一个分子(例如PEG)的结合可以用在结合步骤之前或之后所进行的其它纯化技术来进行，以提供实质上纯的IL-10或其变异体。
附图说明
图1：显示标记有潜在激动剂位点的IL-10多肽的视图的模型。
图2：显示标记有潜在激动剂位点的IL-10多肽的替代性视图的模型。
图3：显示标记有潜在拮抗剂位点的IL-10多肽的另一个替代性视图的模型。
具体实施方式
定义
应了解，本发明不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂，并且因此可变化。还应理解，本文中所用的术语只是出于描述特定实施例的目的，而不打算限制本发明的范围，本发明的范围应仅受随附权利要求书限制。
除非上下文另外明确指示，否则如本文和随附权利要求书中所使用，单数形式“一”和“所述”包括多个提及物。因此，举例来说，提及“IL-10”、“可溶性IL-10”、“白细胞介素10”和各种大写字母形式、带连字符形式和不带连字符形式是提及一或多种此类蛋白质并且包括所属领域的普通技术人员已知的其等效物等。
除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。尽管可以使用与本文中所述相似或相同的任何方法、装置和材料来实践或测试本发明，但现仅描述优选方法、装置和材料。
出于所有目的，包括描述和揭示例如可以与现在所描述的发明联合使用的公开案中所描述的构建体和方法的目的，本文中所提到的所有出版物和专利以引用的方式并入本文中。提供本文中所讨论的公开案仅仅是因为其揭示内容在本申请案的申请日期之前。本文决不应解释为承认本发明者无权由于先前发明或任何其它原因而使所述揭示案的日期提前。
术语“实质上纯化”是指IL-10或其变异体可以实质上或基本上不含其天然存在环境中所存在的蛋白质通常所伴随的组分或与所述蛋白质相互作用的组分，所述环境即天然细胞，或在重组产生IL-10的情况下为宿主细胞。可以实质上不含细胞物质的IL-10包括污染性蛋白质小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、或小于约1％(按干重计)的蛋白质制剂。当IL-10或其变异体由宿主细胞重组产生时，所述蛋白质可以按细胞干重计约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、或约1％或1％以下存在。当IL-10或其变异体由宿主细胞重组产生时，所述蛋白质可以以细胞干重计按约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L、或约1mg/L或1mg/L以下存在于培养基中。因此，如通过适当方法(例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳)所测定的，由本发明方法产生的“实质上经纯化”的IL-10的纯度水平可以是至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％，尤其纯度水平是至少约75％、80％、85％，并且更尤其纯度水平是至少约90％、纯度水平是至少约95％、纯度水平是至少约99％或99％以上。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源多核苷酸的细胞，不管用于插入的方法如何，例如直接摄取、转导、f配对，或此项技术中已知用于产生重组宿主细胞的其它方法。外源多核苷酸可以保持为非整合载体(例如质粒)的形式，或者可被整合到宿主基因组中。
本文中所用的术语“培养基(medium/media)”包括任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物，其可支撑或含有任何宿主细胞，包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核生物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核生物宿主细胞、大肠杆菌或假单胞菌属(Pseudomonas)宿主细胞和细胞内容物。因此，所述术语可以涵盖其中宿主细胞已经生长的培养基，例如其中已经分泌有IL-10的培养基，包括增殖步骤之前或之后的培养基。所述术语还可以涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲剂或试剂，例如在其中IL-10在细胞内产生并且使宿主细胞溶解或破碎以释放IL-10的情况下。
本文中提到蛋白质再折叠时使用的“还原剂”定义为使硫氢基保持还原态，并且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或材料。合适的还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。所属领域技术人员易于了解，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。
本文中提到蛋白质再折叠时使用的“氧化剂”定义为能够从所氧化的化合物中去除电子的任何化合物或材料。合适的氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤藓醇和氧气。所属领域技术人员易于了解，多种氧化剂适用于本发明的方法中。
本文中所用的“变性剂(denaturing agent/denaturant)”定义为会使蛋白质可逆展开的任何化合物或材料。变性剂的强度将由特定变性剂的特性和浓度决定。合适的变性剂可以是离液剂(chaotrope)、清洁剂、有机溶剂、水可混溶溶剂、磷脂或两种或两种以上所述试剂的组合。合适的离液剂包括(但不限于)脲、胍和硫代氰酸钠。有用的清洁剂可以包括(但不限于)强清洁剂，例如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如，吐温(Tween)或曲通(Triton)清洁剂)、月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)；温和的非离子型清洁剂(例如，毛地黄皂苷)；温和的阳离子型清洁剂，例如N→2,3-(二油酰基氧基)-丙基-N,N,N-三甲基铵；温和的离子型清洁剂(例如，胆酸钠或去氧胆酸钠)；或两性离子型清洁剂，包括(但不限于)硫代甜菜碱(两性离子清洁剂(Zwittergent))、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲铵基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-胆酰胺基丙基)二甲铵基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。可以使用水可混溶的有机溶剂作为变性剂，例如乙腈、低碳数烷醇(尤其是C2-C4烷醇，例如乙醇或异丙醇)，或低碳数烷二醇(尤其是C2-C4烷二醇，例如乙二醇)。适用于本发明的磷脂可以是天然存在的磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成的磷脂衍生物或变化形式，例如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。
本文中所用的“再折叠”描述将含有二硫键的多肽从关于二硫键未适当折叠或展开状态转变成天然或适当折叠的构象的任何过程、反应或方法。
本文中所用的“共折叠”特定来说是指使用至少两个多肽的再折叠过程、反应或方法，所述多肽彼此相互作用，并且使展开或不恰当折叠的多肽转变成天然的适当折叠的多肽。
本文中所用的“白细胞介素-10”、“IL-10”和其带连字符和不带连字符的形式将包括具有IL-10至少一种生物活性的那些多肽和蛋白质，以及其IL-10类似物、IL-10同工型、IL-10模拟物、IL-10片段、混合型IL-10蛋白质、融合蛋白、低聚物和多聚物、同系物、糖基化模式变异体、变异体、剪接变异体和突变蛋白质，不论其相同生物活性并且也不论其合成或制造方法，所述方法包括(但不限于)通过核酸分子微注射、合成、转基因和基因活化方法的重组(不论从cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它核酸形式产生)、体外、体内。术语“白细胞介素10”、“IL-10”、“IL-10变异体”和“IL-10多肽”涵盖包含一或多个氨基酸取代、添加或缺失的白细胞介素10。
IL-10突变体论述于美国专利公开案第20090035256号中，用于伤口愈合的IL-10肽片段和IL-10变异体序列论述于美国专利公开案第20080139478号中，在由疱疹病毒科病毒潜在感染阶段期间表达的IL-10同系物论述于美国专利公开案第20090214463号中，并且聚乙二醇化IL-10论述于美国专利公开案第20090214471号中，其中每一者都以全文引用的方式并入本文中。
缺乏前导序列的IL-10序列参见本文中SEQ ID NO:3。具有前导序列的IL-10序列参见SEQ ID NO:1。在一些实施例中，本发明的IL-10或其变异体实质上与SEQ IDNo:1、2、3、4或IL-10的任何其它序列一致。编码IL-10(包括突变体IL-10和其它变异体)的核酸分子以及表达和纯化这些多肽的方法是此项技术中众所周知的。
术语“白细胞介素10”还包括天然存在的IL-10的药学上可接受的盐和前药、以及盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂合物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在的IL-10和其多肽融合体的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体。
多个参考文献揭示了通过聚合物结合或糖基化来修饰多肽。术语“白细胞介素10”包括结合于例如PEG的聚合物上的多肽，并且可以由一或多个另外的半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的衍生化组成。另外，IL-10可以包含连接基团或聚合物，其中所述连接基团或聚合物所结合的氨基酸可以是本发明的非天然氨基酸，或所述氨基酸可以利用此项技术中已知的技术结合于天然编码氨基酸上，例如与赖氨酸或半胱氨酸偶合。
术语“IL-10多肽”还包括糖基化IL-10，例如(但不限于)在任何氨基酸位置处糖基化的多肽、所述多肽的N-连接或邻-连接糖基化形式。含有单一核苷酸变化的变异体也被视为IL-10多肽的生物活性变异体。此外，还包括剪接变异体。
术语“白细胞介素10”还包括由化学手段连接或表现为融合蛋白的任何一或多个IL-10或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接基团、配体或任何类型的其它生物活性分子的IL-10异质二聚物、同型二聚物、异质多聚物或同型多聚物，以及含有例如特异性缺失或其它修饰但维持生物活性得多肽类似物。
本文中所用的“白细胞介素-10”或“IL-10”不论是结合于聚乙二醇上还是呈非结合形式都是包含两个非共价接合以形成同型二聚物的亚单位的蛋白质。如本文中所使用，除非另外指示，否则“白细胞介素-10”和“IL-10”可以指人类或小鼠IL-10(基因库寄存编号：NP.sub.-000563；M37897；或美国专利第6,217,857号)，其也称为“hIL-10”或“mIL-10”。
术语“聚乙二醇化IL-10(pegylated IL-10/PEGylated IL-10)”或“PEG-IL-10”是具有通过连接基团共价连接到一或多个IL-10蛋白质氨基酸残基上以使得连接稳定的一或多个聚乙二醇分子的IL-10分子。术语“单聚乙二醇化IL-10”和“单-PEG-IL-10”意味着一个聚乙二醇分子通过连接基团共价连接到IL-10二聚物一个亚单位上的单个氨基酸残基上。PEG部分的平均分子量优选地介于约5,000与约50,000道尔顿之间。PEG与IL-10连接的方法或位点不是关键的，但优选地，聚乙二醇化不改变或仅最低限度地改变生物活性分子的活性。优选地，半衰期的延长大于生物活性的任何降低。对于PEG-IL-10，如美国专利第7,052,686号中所述，生物活性通常通过评估个体血清中用细菌抗原(脂多醣，LPS)刺激并用PEG-IL-10处理的发炎性细胞因子(例如TNF.α，IFN.γ)的含量来测量。
除非另外说明(即当陈述比较是基于SEQ ID NO:1、2、4或其它IL-10时)，否则对本文所述的IL-10中氨基酸位置的所有参考是基于SEQ ID NO:3中的位置。举例来说，SEQ ID NO:2位置24处的氨基酸是苏氨酸，并且相应苏氨酸位于SEQ ID NO:4位置1处。所属领域的技术人员将了解对应于SEQ ID NO:2中位置的氨基酸位置可以容易地在例如SEQ ID NO:4得任何其它IL-10中加以鉴别。所属领域的技术人员将了解，对应于SEQ ID NO:1、2、3、4或任何其它IL-10序列中位置的氨基酸位置可以在例如IL-10融合体、变异体、片段等的任何其它IL-10分子中容易地加以鉴别。举例来说，可以使用例如BLAST等序列比对程序来比对并且鉴别蛋白质中对应于SEQ IDNO:1、2、3、4或其它IL-10序列中的位置的特定位置。本文中关于SEQ ID NO:1、2、3、4或其它IL-10序列所述的氨基酸的取代、缺失或添加也打算是指在本文中所述的或此项技术中已知的IL-10融合体、变异体、片段等中相应位置中的取代、缺失或添加并且明确地涵盖在本发明内。
白细胞介素10(IL10)：此项技术中已知的任何形式的IL10可以用于本文中所述的组合物中。对于实验工作，小鼠形式得IL10是尤其适用的。这已经充分描述和定序(参见穆尔等人,科学248:1230-1234(1990)；和美国专利第5,231,012号)。然而，用于临床使用的最优选IL10形式是人类形式，其也已经充分描述并且其序列提供于许多地方，包括美国专利第5,231,012号。序列还出现在美国专利第6,018,036号和美国专利第6,319,493号中。所属领域的技术人员将认识到IL10中的一些氨基酸残基可以在不影响其活性的情况下改变，并且这些经修饰得IL10形式还可以与载剂接合并用于本文中所述的方法中。术语“白细胞介素10”或“IL-10”涵盖包含一或多个氨基酸取代、添加或缺失的白细胞介素10。本发明的IL-10可以由一或多个天然氨基酸的修饰与一或多个非天然氨基酸修饰结合组成。已经描述天然存在IL-10多肽中多个氨基酸位置中的例示性取代，包括(但不限于)调节医药稳定性、调节IL-10多肽一或多种生物活性(例如(但不限于)提高激动剂活性、提高多肽溶解性、降低蛋白酶易感性、将多肽转化成拮抗剂等)的取代，并且所述取代由术语“IL-10多肽”涵盖。在一些实施例中，IL-10拮抗剂包含存在于IL-10分子受体结合区中的与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。
在一些实施例中，IL-10或其变异体进一步包含调节所述IL-10或变异体多肽的生物活性的添加、取代或缺失。在一些实施例中，IL-10或变异体进一步包含调节已知并通过研究证实的IL-10性状(例如消炎活性)的添加、取代或缺失。在一些实施例中，IL-10或其变异体进一步包含增强所述IL-10或变异体心脏保护活性的添加、取代或缺失。举例来说，添加、取代或缺失可以调节IL-10或其变异体的一或多种特性或活性。举例来说，添加、取代或缺失可调节对IL-10受体的亲和力，调节循环半衰期，调节治疗半衰期，调节多肽的稳定性，调节由蛋白酶进行的裂解，调节剂量，调节释放或生物可用性，促进纯化，或改良或改变特定投药途径。类似地，IL-10或其变异体可以包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或改良多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它性状的连接分子(包括(但不限于)生物素)。
术语“IL-10多肽”也涵盖所连接的同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物和异质多聚物，包括(但不限于)通过非天然编码氨基酸侧链与相同或不同的非天然编码氨基酸侧链、与天然编码氨基酸侧链直接连接或通过连接基团间接连接的那些多肽。例示性连接基团包括(但不限于)小有机化合物；各种长度的水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)或聚葡聚糖；或各种长度的多肽。
“非天然编码氨基酸”是指不属于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸。可以使用的其它与术语“非天然编码氨基酸”同义的术语是“非天然氨基酸”、“非天然存在氨基酸”以及其各种带连字符和不带连字符的型式。术语“非天然编码氨基酸”也包括(但不限于)通过修饰(例如，翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸，或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而产生，但本身未通过翻译复合物天然地并入正在生长的多肽链中的氨基酸中。所述非天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰基葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖氨基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
“氨基端修饰基团”是指可与多肽的氨基端连接的任何分子。类似地，“羧基端修饰基团”是指可与多肽的羧基端连接的任何分子。末端修饰基团包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(例如血清白蛋白)，或者延长肽的血清半衰期的其它部分。
此项技术中和本文中所用的术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应位点”、“化学反应性基团”和“化学反应性部分”是指分子中截然不同、可定义的部分或单元。这些术语在某种程度上与在化学技术中的含义同义，并且在本文中用于指示分子中执行某种功能或活性并与其它分子反应的部分。
本文中所用的术语“键”或“连接基团”是指通常由化学反应形成并且通常为共价键的基团或键结。水解稳定性键是指，这些键在水中实质上稳定，并且在有用的pH值下(包括(但不限于)在生理条件下)可以在一段较长时间内(可能甚至无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解性键意味着这些键可以在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解性键意味着这些键可经一或多种酶降解。此项技术中应理解，PEG和相关聚合物可以在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一或多个末端官能团之间的连接基团中包括可降解的键。举例来说，由PEG羧酸或经活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应而形成的酯键一般会在生理条件下水解，释放出所述试剂。其它水解可降解的键包括(但不限于)碳酸酯键；由胺与醛反应产生的亚胺键；通过醇与磷酸根反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸根与醇的反应产物的原酸酯键；由(包括(但不限于))聚合物(例如PEG)末端处的胺基与肽的羧基形成的肽键；以及由(包括(但不限于))聚合物末端的亚磷酰胺(phosphoramidite)基与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。
在本文中使用时，术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”意味着可影响与生物体有关的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或生物化学特性的任何物质，所述生物体包括(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类。具体来说，本文中所用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防人类或其它动物的疾病，或以其它方式增强人类或动物的身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、疫苗、免疫原、硬药(hard drug)、软药、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、类毒素、毒素、原核生物和真核生物细胞、病毒、多糖、核酸和其得自或来源于病毒、细菌、昆虫、动物或任何其它细胞或细胞类型的部分，脂质体、微粒以及胶束。适合与本发明一起使用的生物活性剂的类别包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、胆酸树脂、烟酸和/或他汀类(statin)、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、微生物来源的毒素等。生物活性剂还包括酰胺类化合物，例如在山森(Yamamori)等人,专利申请公开案第20080221112号中描述的那些酰胺类化合物，其可以在本发明的IL-10多肽之前、之后投与和/或与本发明的IL-10多肽共投与。
“双官能聚合物”是指包含两个个别官能团的聚合物，所述两个官能团能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应，形成共价或非共价键。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团以及另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能连接基团，可以用于形成一种结合物，所述结合物包括第一生物活性组分、双官能连接基团和第二生物活性组分。已知许多用于将各种化合物与肽连接的程序和连接分子。参见例如欧洲专利申请案第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号；第4,680,338号；和第4,569,789号，其以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”是指包含两个或两个以上个别官能团的聚合物，所述官能团能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应，形成共价或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可以是任何所需长度或分子量，并且可以经选择以在与IL-10连接的一或多个分子与其受体或IL-10之间提供特定所需间距或构象。
当用从左向右书写的常规化学式说明取代基时，这些取代基同样涵盖由从右向左书写结构所得到的化学上一致的取代基，例如，结构-CH2O-与结构-OCH2-相同。
术语“取代基”包括(但不限于)“非干扰性取代基”。“非干扰性取代基”是得到稳定化合物的那些基团。合适的非干扰性取代基或基团包括(但不限于)卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C10芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯甲酰基、二甲苯酚基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、其中m是1到8的--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、--NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫代烷基、--C(O)O--(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、＝S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)--CF3、-C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、--C(O)--(C1-C10芳基)、其中各m是1到8的--(CH2)m--O--(--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)、--C(O)NR2、--C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2、其盐等。本文中所用的每一个R是H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
除非另外说明，否则单独或作为另一个取代基的部分的术语“烷基”意味着具有指定数量碳原子(即C1-C10意味着一到十个碳)的直链或分支链或环状烃基，或其组合，其可以是完全饱和单元或多元不饱和的，并且可以包括二价和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)例如以下基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等。不饱和烷基是具有一或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基(crotyl)、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另外指出，否则术语“烷基”还打算包括以下更详细定义的那些烷基衍生物，例如“杂烷基”。局限于烃基的烷基称为“同系烷基(homoalkyl)”。
单独或作为另一个取代基的部分的术语“亚烷基”意味着衍生自烷烃的二价基团，例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，并且进一步包括下文描述为“亚杂烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)将具有1到24个碳原子，其中具有10个或少于10个碳原子的那些基团是本文所述方法和组合物的特定实施例。“低碳数烷基”或“低碳数亚烷基”是一般具有8个或少于8个碳原子的短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫烷氧基)以其常规含义使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子连接到分子其余部分上的那些烷基。
除非另外规定，否则单独或与另一个术语组合的术语“杂烷基”是指稳定的直链或分支链或者环状烃基，或其组合，其由规定数量的碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选经氧化，并且氮杂原子可任选经季铵化。杂原子O、N以及S和Si可位于杂烷基的任一内部位置处或在烷基与分子其余部分连接的位置处。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2,-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3及-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，单独或作为另一个取代基的部分的术语“亚杂烷基”意味着衍生自杂烷基的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基，相同或不同杂原子也可占据任一个或两个链末端(包括(但不限于)亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等)。此外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，连接基团的化学式的书写方向并不表示连接基团的定向。举例来说，式-C(O)2R'-表示-C(O)2R'-和-R'C(O)2-。
除非另外规定，否则单独或与其它术语组合时术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状型式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和、部分不饱和与完全不饱和的环键。此外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外，这一术语还涵盖双环和三环结构。类似地，单独或作为另一个取代基的部分的术语“亚杂环烷基”是指衍生自杂环烷基的二价基团，并且单独或作为另一个取代基的部分的术语“亚环烷基”是指衍生自环烷基的二价基团。
本文中所用的术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂的任何聚合物。水溶性聚合物与白细胞介素10的连接可产生改变，包括(但不限于)相对于未经修饰的形式，血清半衰期延长或经调节，或者治疗半衰期延长或经调节；免疫原性经调节；物理缔合特征(例如聚集和多聚物形成)经调节；受体结合改变；与一或多种结合搭配物的结合改变；和受体二聚化或多聚化改变。水溶性聚合物可以或可以不具有其自身的生物活性，并且可以用作用于将IL-10连接到其它物质上的连接基团，包括(但不限于)一或多个IL-10或一或多个生物活性分子。合适的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，其以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇和其衍生物、聚亚烷基二醇共聚物和其衍生物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。
本文中所用的术语“聚烷二醇”或“聚(烷二醇)”是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚烷二醇”涵盖直链与分支聚合物，并且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。其它例示性实施例列于例如商业供应商目录中，例如肖尔沃特公司(Shearwater)的目录“生物医学用聚乙二醇和衍生物(PolyethyleneGlycol and Derivatives for Biomedical Applications)”(2001)。
除非另外规定，否则术语“芳基”意味着可为单环或者为稠合在一起或共价连接的多个环(包括(但不限于)1到3个环)的多不饱和、芳香烃取代基。术语“杂芳基”是指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选经氧化，并且氮原子任选经季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述每一芳基和杂芳基环系统的取代基都选自下文所述的可接受取代基的群组。
为简洁起见，术语“芳基”当与其它术语(包括(但不限于)芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)组合使用时，将包括上文所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”打算包括芳基连接到烷基上的那些基团(包括(但不限于)苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括其中碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已经被例如氧原子置换的烷基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
上述每一术语(包括(但不限于)“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)都打算包括所述基团的经取代和未经取代形式。下文将提供各类基团的例示性取代基。
烷基和杂烷基(包括常常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自包括(但不限于)以下各基团的多个基团中的一或多个基团：数量在零到(2m'+l)范围内的-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R″R″'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R'")＝NR″″、-NR-C(NR'R")＝NR'"、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN和-NO2，其中m'是所述基团中碳原子的总数。R'、R"、R'"和R""各自独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)1到3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基，或芳基烷基。举例来说，当本发明化合物包括一个以上R基团时，每一个R基团是如每一个R'、R"、R'"和R""基团在存在一个以上的这些基团时那样独立地选择。当R'与R"连接到同一氮原子上时，其可以与所述氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。所属领域的技术人员从上文有关取代基的论述将了解到，术语“烷基”打算包括包括碳原子与除氢基外的基团结合的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与针对烷基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基可变化且选自(但不限于)：数量在零到芳族环系统上开放价数总数范围内的卤素、-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R'"、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R'"、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R"')＝NR""、-NR-C(NR'R")＝NR"'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN和-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基；并且其中R'、R"、R'"和R""独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说，当本发明化合物包括一个以上R基团时，每一个R基团如每一个R'、R"、R'"和R""基团在存在一个以上的这些基团时那样独立地选择。
本文中所用的术语“经调节的血清半衰期”意味着经修饰的IL-10相对于其未经修饰形式的循环半衰期的正性或负性变化。血清半衰期通过在投与IL-10之后的各个时间点时取得血液样品并且测定所述分子在各样品中的浓度来测量。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。血清半衰期理想的是延长至少约两倍，但例如在其延长可获得令人满意的给药方案或避免有毒作用的情况下，较少的延长也是有用的。在一些实施例中，所述延长为至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。
本文中所用的术语“经调节的治疗半衰期”意味着治疗有效量的IL-10相对于其未经修饰形式的半衰期的正性或负性变化。治疗半衰期通过测量投药之后的各个时间点时的药物动力学和/或药效特性来测量。治疗半衰期延长理想的是得到特别有益的给药方案、特别有益的总剂量，或避免不合需要的作用。在一些实施例中，治疗半衰期延长是由效力增加、经修饰分子与其目标的结合增加或减少、酶(例如蛋白酶)对所述分子分解的增加或减少，或未经修饰的分子的另一参数或作用机制的增加或减少，或者所述分子的受体介导的清除增加或减少所引起的。
当用于核酸或蛋白质时，术语“经分离”表示，所述核酸或蛋白质不含至少某些与其天然状态缔合的细胞组分，或者已将所述核酸或蛋白质浓缩到大于其在体内或体外产生时的浓度的程度。其可以是均质态。经分离的物质可以是干燥或半干燥状态；或在溶液，包括(但不限于)水溶液。其可以是医药组合物的一种组分，所述医药组合物还包含医药学上可接受的载剂和/或赋形剂。纯度和均质性通常使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法测定。蛋白质，作为一种在制剂中存在的主要物质，是实质上经纯化的。具体来说，经分离基因与侧接所述基因且编码除相关基因外的蛋白质的开放式阅读框分离。术语“经纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中实质上产生一条谱带。具体说来，这一术语意味着所述核酸或蛋白质为至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％或99％以上纯的。
术语“核酸”是指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸，以及其聚合物。除非特别限制，否则这一术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸的结合特性与参考核酸类似，并且代谢方式也与天然存在的核苷酸类似。除非另外明确限制，否则所述术语还指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽基核酸(peptidonucleic acid))、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另外指示，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。特定来说，简并密码子取代可以通过产生其中一或多个所选择的(或所有)密码子的第三位置经混合基及/或脱氧肌核苷残基取代的序列来达成(巴策尔(Batzer)等人,核酸研究(NucleicAcid Res.)19:5081(1991)；大冢(Ohtsuka)等人,生物化学杂志(J.Biol Chem.)260:2605-2608(1985)；及罗塞利尼(Rossolini)等人,分子细胞探针(Mol.Cell.Probes)8:91-98,(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述，反之亦然。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及一或多个氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。本文中所用的这些术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基是通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在氨基酸，以及作用方式与天然存在氨基酸类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基础化学结构(即与氢、羧基、氨基以及R基团结合的一个α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但仍保留与天然存在氨基酸相同的基础化学结构。提到的氨基酸包括例如天然存在的成蛋白质性L-氨基酸；D-氨基酸，经化学修饰的氨基酸，例如氨基酸变异体和衍生物；天然存在的非成蛋白质性氨基酸，例如β-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有此项技术中已知为氨基酸特征的特性的化学合成化合物。非天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸)、侧链中具有其它亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)，以及侧链中的羧酸官能团经磺酸基置换的氨基酸(例如磺基丙氨酸)。宜以多种方式将非天然氨基酸(包括合成非天然氨基酸、经取代氨基酸，或者一或多种D-氨基酸)并入本发明蛋白质中。含D-氨基酸的肽等在体外或体内展现出比含L-氨基酸的对应物高的稳定性。因此，构造肽等，并入D-氨基酸在需要或必需较大胞内稳定性时可以是尤其适用。更特定来说，D-肽等对内源性肽酶和蛋白酶具抗性，由此在需要所述特性时提供改良的分子生物可用性并且延长体内寿命。另外，D-肽等不能被有效加工，以便II类主要组织相容性复合物限制性呈递到辅助T细胞，因此，其不太可能诱导整个生物体的体液免疫响应。
氨基酸在本文中可以由其通常已知三字母符号或由IUPAC-1UB生物化学命名法委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸也可以利用其普遍认可的单字母代码提及。
“保守修饰变异体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，“保守修饰变异体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上一致的序列。由于遗传密码具有简并性，使得大量功能一致的核酸可以编码任何指定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定丙氨酸的每一位置，所述密码子可变成任一所述的相应密码子，而不改变所编码的多肽。所述核酸变异为“沉默变异(silentvariation)”，是保守修饰变异的一种。本文中编码一种多肽的每一核酸序列也描述所述核酸的每一可能的沉默变异。所属领域的普通技术人员将认识到，核酸中的每一密码子(通常为甲硫氨酸唯一密码子的AUG，和通常为色氨酸唯一密码子的TGG除外)可经修饰而得到功能一致的分子。因此，编码多肽的核酸的各个沉默变异暗含于每一所述序列中。
对于氨基酸序列，所属领域的普通技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中的单一氨基酸或小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守修饰变异体”，其中所述改变引起氨基酸的缺失、氨基酸的添加或者化学上类似的氨基酸对某一氨基酸的取代。提供功能类似氨基酸的保守取代表是所属领域的普通技术人员已知的。所述经保守修饰的变异体另外为且不排除本发明的多晶型变异体、种间同系物和对偶基因。
提供功能类似氨基酸的保守取代表是所属领域的普通技术人员已知的。以下八组各自含有彼此保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见例如克莱顿(Creighton),蛋白质：结构和分子特性(Proteins:Structuresand Molecular Properties)(弗里曼出版公司(W H Freeman&Co.)；第2版(1993年12月))。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或“一致性”百分比是指两个或两个以上序列或子序列相同。当使用以下序列比较算法(或所属领域的普通技术人员可用的其它算法)之一或通过手工比对和目测来测量，在比较窗或指定区域上比较和比对最大对应性时，如果各序列具有一定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域内约60％一致、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％一致)，那么所述序列“实质上一致”。此定义也指测试序列的互补性。一致性可存在于长至少约50个氨基酸或核苷酸的区域，或长75到100个氨基酸或核苷酸的区域，或者(未指定时)跨越整个多核苷酸或多肽序列。可通过包含以下步骤的方法获得编码本发明多肽(包括来自除人外的物种的同系物)的多核苷酸：在严格杂交条件下，用具有本发明多核苷酸序列或其片段的经标记探针筛选文库，以及分离含有所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆体。所述杂交技术是所属领域的技术人员众所周知的。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，供与测试序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机内，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可指定替代参数。随后序列比较算法基于所述程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
本文中所用的“比较窗”包括具有选自由20到600，通常约50到约200，更通常约100到约150组成的群组的相邻位置数量中的任一者的区段，其中在最佳比对两个序列后，序列可与相邻位置数量相同的参考序列相比较。比对序列以用于比较的方法是所属领域的普通技术人员已知的。用于比较的最佳序列比对可以通过以下方法来进行，包括(但不限于)通过史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)(1970)应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2:482c的局部同源算法，通过尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch),分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443,1970的同源比对算法，通过皮尔逊(Pearson)和利普曼(Lipman),美国国家科学院院刊85:2444,1988的关于类似性方法的探索，通过这些算法(威斯康星遗传软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,遗传学计算机组(Genetics ComputerGroup),科学大道575号(575Science Dr.),威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))的电脑化实施，或通过手动比对及目测(参见例如，奥斯贝(Ausubel)等人,现行分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology),(1995年副刊))进行。
适用于测定序列一致性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST及BLAST 2.0算法，其分别描述于奥特查尔(Altschul)等人(1997)核酸研究(Nuc.Acids Res.)25:3389-3402和奥特查尔等人(1990)分子生物学杂志215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件是可公开获得的，可通过美国国家生物技术信息中心(美国国家生物技术信息中心)在万维网ncbi.nlm.nih.gov获得。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(W)是11，期望值(E)是10，M＝5，N＝-4，和双股的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用如下默认参数：字长是3且期望值(E)是10，和BLOSUM62计分矩阵(参见赫尼霍夫(Henikoff)和赫尼霍夫(1992)美国国家科学院院刊89:10915)，比对值(B)是50，期望值(E)是10，M＝5，N＝-4，和双股的比较。在进行BLAST算法时通常关闭“低复杂度”过滤器。
BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见例如卡尔琳(Karlin)和奥特查尔(1993)美国国家科学院院刊90:5873-5787)。BLAST算法所提供的一种相似性测量值是最小和概率(smallest sum probability，P(N))，其可指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然出现的匹配的概率。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总和概率小于约0.2，或小于约0.01，或小于约0.001，那么认为所述核酸与参考序列类似。
短语“与……选择性(或特异性)杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(包括(但不限于)全细胞或者DNA或RNA文库)中时，分子只与所述序列在严格杂交条件下结合、形成双链体或杂交。
短语“严格杂交条件”是指DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列在如此项技术中已知的低离子强度和高温条件下杂交。通常，在严格条件下，探针将与其在核酸复杂混合物中的目标子序列(包括(但不限于)全细胞或者DNA或RNA文库)杂交但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件与序列相关，并且会随环境不同而不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的详尽指导可见于迪杰森(Tijssen),生物化学和分子生物学实验技术--核酸探针杂交(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes),“杂交原理和核酸分析策略综述(Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid assays)”(1993)中。一般来说，在指定离子强度pH值下，所选择的严格条件比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃-10℃。Tm是与目标互补的探针的50％与目标序列杂交处于平衡(因为目标序列过量存在，在Tm下，在平衡时占据50％的探针)时的温度(在指定离子强度、pH值以及核酸浓度下)。严格条件可以是其中在pH值7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子，通常是约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)为至少约30℃而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)为至少约60℃的那些条件。严格条件也可以用添加去稳定化剂(例如甲酰胺)来达成。对于选择性或特异性杂交，正信号可以是背景的至少两倍，任选地是背景杂交的10倍。例示性严格杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培育，或5×SSC，1％SDS，在65℃下培育，其中在65℃下以0.2×SSC和0.1％SDS洗涤。所述洗涤可以进行5、15、30、60、120分钟或120分钟以上。
本文中所用的术语“真核生物”是指属于系统发生域真核生物(Eucarya)的生物体，例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬虫、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
本文中所用的术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说，非真核生物体可属于真细菌系统发生域，包括(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、极端嗜热细菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluoresceins)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等；或古菌系统发生域，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、嗜盐菌(Halobacterium)(例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)和嗜盐菌属NRC-1(Halobacterium species NRC-1))、超嗜热古菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈嗜热球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等)。
本文中所用的术语“个体”是指作为治疗、观测或实验的对象的动物，在一些实施例中为哺乳动物，而在其它实施例中为人。动物可以是伴侣动物(例如狗、猫等)、家畜(例如奶牛、绵羊、猪、马等)或实验动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
本文中所用的术语“有效量”是指所投与的经修饰非天然氨基酸多肽的量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病、病状或病症的一或多种症状。可投与含有本文中所述的经修饰非天然氨基酸多肽的组合物，以实现预防、增强和/或治疗性治疗。
术语“增强”是指增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此，就增强治疗剂的作用来说，术语“增强”是指增加或延长其它治疗剂对系统的作用效力或持续时间的能力。本文中所用的“增强有效量”是指足以增强所需系统中另一种治疗剂作用的量。用于患者时，对此用途有效的量将取决于疾病、病症或病状的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状态和对药物的响应，以及治疗医师的判断。
本文中所用的术语“经修饰”是指对指定多肽进行的任何改变，例如多肽长度、氨基酸序列、化学结构的改变；多肽的共翻译修饰或翻译后修饰。“(经修饰)”形式的术语意味着所讨论的多肽任选经修饰，也就是说，所讨论的多肽可经修饰或不经修饰。
术语“翻译后修饰”是指天然或非天然氨基酸在并入多肽链后发生的对所述氨基酸的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(例如在不含细胞的翻译系统中)、翻译后体内修饰以及翻译后体外修饰。
在预防应用中，向易于感染特定疾病、病症或病状或另外具有其风险的患者投与含有IL-10的组合物。所述量定义为“预防有效量”。在这一用途中，精确量也取决于患者的健康状况、体重等。普遍认为，所属领域的技术人员将能够通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述预防有效量。
术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的“保护基”或部分。保护基将取决于所保护的化学反应性基团的类型而变化。举例来说，如果化学反应性基团是胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团是硫氢基，那么保护基可以是邻二硫吡啶(orthopyridyldisulfide)。如果化学反应性基团是羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可以是苯甲基或烷基(例如甲基、乙基或叔丁基)。此项技术中已知的其它保护基也可以用于本文中所述的方法和组合物中或与其一起使用，包括光不稳定基团，例如Nvoc和MeNvoc。此项技术中已知的其它保护基也可以用于本文中所述的方法和组合物中。
仅举例来说，封端/保护基团可选自：
其它保护基描述于格里尼(Greene)和伍兹(Wuts),有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis),第3版,约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons),纽约州纽约(New York,NY),1999中，所述文献的以全文引用的方式并入本文中。
在治疗应用中，向已罹患疾病、病状或病症的患者投与足以治愈或至少部分抑制所述疾病、病症或病状的症状的量的含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物。所述量定义为“治疗有效量”，并且将取决于以下因素：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的响应以及主治医师的判断。普遍认为，所属领域的技术人员将能够通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述治疗有效量。
术语“治疗”用于指预防和/或治疗性治疗。
本文中提供的非天然编码氨基酸多肽可以包括经同位素标记的化合物，在这些化合物中，一或多个原子经原子质量或质量数与自然界常见的原子质量或质量数不同的原子置换。可并入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分别例如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。某些本文中所述的经同位素标记的化合物(例如其中并入有例如3H及14C的放射性同位素的那些化合物)可能适用于药物和/或底物组织分布分析。此外，用例如氘(即2H)的同位素取代可以得到某些由更大代谢稳定性产生之治疗优势，例如体内半衰期延长或剂量需求降低。
所有异构体，包括(但不限于)非对映异构体、对映异构体和其混合物，都可视为本文中所述的组合物的一部分。在另外或其它实施例中，在向有需要的生物体投与非天然编码氨基酸多肽后，这些多肽代谢产生代谢物，所述代谢物随后用于产生所需作用，包括所需治疗作用。在其它或另外实施例中是非天然编码氨基酸多肽的活性代谢物。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸多肽可以互变异构体的形式存在。另外，本文中所述的非天然编码氨基酸多肽可以未溶剂化形式以及与医药学上可接受的溶剂(例如水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。也认为本文中揭示所述溶剂化形式。所属领域的普通技术人员将认识到，本文中的一些化合物可以数种互变异构体形式存在。所有这些互变异构形式都可视为本文中所述组合物的一部分。
除非另外指示，否则在此项技术的技术领域内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法都可以使用。
I.引言
在本发明中提供包含至少一个非天然氨基酸IL-10分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的IL-10包括至少一个翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一个翻译后修饰包含利用所属领域的普通技术人员已知的适合于特定反应性基团的化学方法学使包含第二反应性基团的分子连接到包含第一反应性基团的至少一个非天然氨基酸上，所述分子包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素、细胞毒性化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；并入有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子捕获剂；或上述物质的任何组合或任何其它所需的化合物或物质。举例来说，第一反应性基团是炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中，其中所述炔丙基有时也称为乙炔部分)，并且第二反应性基团是叠氮基部分，并利用[3+2]环加成化学方法。在另一个实例中，第一反应性基团是叠氮基部分(包括(但不限于)如在本说明书内有时提及的，在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸或pAZ中)，并且第二反应性基团是炔基部分。在本发明的经修饰IL-10的某些实施例中，使用至少一个包含至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮官能团的非天然氨基酸)，其中所述至少一个翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，翻译后修饰在真核细胞或非真核细胞中体内进行。连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子可以将所述分子连接到多肽上。在另一个实施例中，连接到IL-10上的连接基团的长度足以允许形成二聚物。分子也可以直接与多肽连接。
在某些实施例中，IL-10蛋白质包括至少一个由一种宿主细胞体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由另一种宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由真核细胞在体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不是由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等。
在一些实施例中，IL-10包含一或多个用于使多肽糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，IL-10包含一或多个用于使多肽糖基化的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，IL-10包含一或多个用于使多肽糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化或糖脂键修饰的天然编码氨基酸。在一些实施例中，IL-10包含一或多个用于使多肽糖基化的天然编码氨基酸。
在一些实施例中，IL-10包含一或多个增强多肽糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中，IL-10包含一或多个增强多肽糖基化的缺失。在一些实施例中，IL-10包含一或多个增强多肽中不同氨基酸处糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中，IL-10包含一或多个增强多肽中不同氨基酸处糖基化的缺失。在一些实施例中，IL-10包含一或多个增强多肽中非天然编码氨基酸处糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中，IL-10包含一或多个增强多肽中天然编码氨基酸处糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中，IL-10包含一或多个增强多肽中不同氨基酸处糖基化的天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中，IL-10包含一或多个增强多肽中天然编码氨基酸处糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中，IL-10包含一或多个增强多肽中非天然编码氨基酸处糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。
在一个实施例中，翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键将寡糖与天冬酰胺连接在一起(包括(但不限于)其中所述寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等的情形)。在另一个实施例中，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键将寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接在一起。在某些实施例中，本发明蛋白质或多肽可以包含分泌或定位序列、表位标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。分泌信号序列的实例包括(但不限于)原核分泌信号序列、真核分泌信号序列、经5'-优化以用于细菌表达的真核分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)STII(原核)、Fd GIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和来源于转座子的信号序列bla。任何所述序列都可进行修饰以使多肽具有所需的结果，包括(但不限于)用一个信号序列取代不同信号序列；用一个前导序列取代不同的前导序列等。
所关注的蛋白质或多肽可以含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然氨基酸。这些非天然氨基酸可相同或不同，例如，蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同位点可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同的非天然氨基酸。在某些实施例中，天然存在的蛋白质型式中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代。
本发明提供基于包含至少一个非天然编码氨基酸的IL-10的方法和组合物。将至少一个非天然编码氨基酸引入IL-10中可允许应用涉及特定化学反应(包括(但不限于)与一或多个非天然编码氨基酸反应而不与通常存在的20种氨基酸反应)的结合化学。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的IL-10通过非天然编码氨基酸的侧链与水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供一种利用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法，其涉及响应于选择密码子，将非基因编码氨基酸(包括(但不限于)含有未见于20种天然并入的氨基酸中的官能团或取代基的那些氨基酸，所述官能团或取代基包括(但不限于)酮、叠氮或乙炔部分)选择性并入蛋白质中，随后利用适当的反应性PEG衍生物修饰所述氨基酸。一旦并入后，随后可利用所属领域的普通技术人员已知适合于非天然编码氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰氨基酸侧链。多种已知的化学方法都适用于在本发明中将水溶性聚合物并入蛋白质中。所述方法包括(但不限于)分别与(包括(但不限于))乙炔或叠氮化物衍生物进行胡伊斯根[3+2]环加成反应(Huisgen[3+2]cycloaddition reaction)(参见例如派德沃A.(Padwa,A.)综合有机合成(Comprehensive Organic Synthesis),第4卷,(1991)特罗斯特B.M.(Trost,B.M.)编,培格曼出版社(Pergamon),牛津(Oxford),第1069-1109页；以及胡伊斯根R.(Huisgen,R.)1,3-偶极环加成化学(1,3-Dipolar  Cycloaddition Chemistry),(1984)派德沃A.编,威立出版公司(Wiley),纽约,第1-176页)。
因为胡伊斯根[3+2]环加成方法涉及环加成而非亲核取代反应，所以可以极高的选择性修饰蛋白质。所述反应可以在室温下，于水性条件中，通过将催化量的亚铜盐添加到反应混合物中而以优良的区位选择性(1,4>1,5)进行。参见例如托尔诺(Tornoe)等人,(2002)有机化学杂志(J.Org.Chem)67:3057-3064；和罗斯托夫采夫(Rostovtsev)等人,(2002)应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)41:2596-2599；和WO 03/101972。可以通过[3+2]环加成而加成到本发明蛋白质上的分子包括几乎任何具有合适官能团或取代基的分子，包括(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物。这些分子可分别加成到具有乙炔基(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)或叠氮基(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)的非天然氨基酸中。
由胡伊斯根[3+2]环加成反应产生的5元环在还原环境中通常是不可逆的，并且可以在水性环境中长时间对水解稳定。因此，可以在苛求的水性条件下，用本发明的活性PEG衍生物改变多种物质的物理和化学特征。甚至更重要的是，因为叠氮和乙炔部分彼此具特异性(且例如不会与20种常见的基因编码氨基酸中的任一者反应)，所以可以在一或多个特定位点中以极高的选择性修饰蛋白质。
本发明还提供PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物以及具有一或多个乙炔或叠氮部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物以极高选择性与响应于选择密码子而选择性引入蛋白质中的叠氮部分偶合。类似地，含有叠氮部分的PEG聚合物衍生物对于与响应于选择密码子而选择性引入蛋白质中的乙炔部分偶合具有高度选择性。
更特定来说，叠氮部分包含(但不限于)烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可以包括其它取代基，只要保持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包含烷基和芳基乙炔，以及各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可以包括其它取代基，只要保持叠氮基特异性反应性即可。
本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的结合物，所述其它物质包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；并入有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子俘获剂；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。本发明还包括具有叠氮或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的结合物。举例来说，含有叠氮部分的PEG聚合物可与生物活性分子在此蛋白质中含有带乙炔官能团的非基因编码氨基酸的位置处偶合。使PEG与生物活性分子偶合的键包括(但不限于)胡伊斯根[3+2]环加成产物。
此项技术中充分确定，可以使用PEG来修饰生物材料的表面(参见例如美国专利6,610,281；米赫瓦R.(Mehvar,R.),药学与药理学杂志(J.Pharm Pharm Sci.),3(1):125-136(2000)，其以引用的方式并入本文中)。本发明还包括包含具有一或多个反应性叠氮基或乙炔位点的表面的生物材料，和通过胡伊斯根[3+2]环加成键与所述表面偶合的一或多种本发明的含叠氮或含乙炔聚合物。生物材料和其它物质也可通过除叠氮基或乙炔键以外的其它键(例如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键)与经叠氮或经乙炔活化的聚合物衍生物偶合，由此留下叠氮或乙炔部分用于后续反应。
本发明包括一种合成本发明的含叠氮基和含乙炔聚合物的方法。在含叠氮基PEG衍生物的情况下，叠氮基可与聚合物的碳原子直接键接。或者，可以将在一端具有叠氮部分的连接剂与经常规活化聚合物连接，从而使所得聚合物在其一端具有叠氮部分，以此来制备含叠氮基的PEG衍生物。在含乙炔PEG衍生物的情况下，乙炔可与聚合物碳原子直接键接。或者，可以将一端具有乙炔部分的连接剂与经常规活化聚合物连接，从而使所得聚合物在其一端具有乙炔部分，以此制备含乙炔的PEG衍生物。
更特定来说，在含叠氮基PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物发生反应，产生具有更强反应性部分(例如甲磺酸酯基、三氟乙磺酸酯基、甲苯磺酸酯基或卤素离去基团)的经取代聚合物。含有磺酰卤、卤素原子和其它离去基团的PEG衍生物的制备和使用是所属领域的普通技术人员已知的。所得经取代聚合物随后经历反应以在聚合物末端用叠氮部分取代具有更强反应性部分。或者，具有至少一个活性亲核部分或亲电子部分的水溶性聚合物可与一端具有叠氮基的连接剂发生反应，由此在PEG聚合物与所述连接剂之间形成共价键，并且所述叠氮部分位于聚合物的一端。亲核部分和亲电子部分是所属领域的普通技术人员已知的，包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等。
更特定来说，在含乙炔PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物可发生反应，以代替含有乙炔部分的前体中的卤素或其它经活化的离去基团。或者，具有至少一个活性亲核部分或亲电子部分的水溶性聚合物可与一端具有乙炔的连接剂发生反应，由此在PEG聚合物与所述连接剂之间形成共价键，并且所述乙炔部分位于聚合物的一端。卤素部分、经活化的离去基团、亲核和亲电子部分在有机合成中的使用以及PEG衍生物的制备和使用已经得到了此项技术中的从业人员的充分确认。
本发明也提供一种用于选择性修饰蛋白质以将其它物质添加到经修饰蛋白质中的方法，所述其它物质包括(但不限于)水溶性聚合物，例如PEG和含有叠氮或乙炔部分的PEG衍生物。可以使用含叠氮基和含乙炔的PEG衍生物来改变表面和分子的特性(其中生物相容性、稳定性、溶解性和免疫原性缺乏是重要的)，同时提供一种选择性高于此项技术中先前已知者的将PEG衍生物与蛋白质连接的手段。
II.本发明中使用的一般重组核酸方法
在许多本发明实施例中，将分离、克隆并且常常使用重组方法改变编码相关IL-10的核酸。所述实施例是用于(包括(但不限于))蛋白质表达或用于源自IL-10的变异体、衍生物、表达盒或其它序列的产生期间。在一些实施例中，编码本发明多肽的序列可操作地与异源启动子连接。
编码包含非天然编码氨基酸的IL-10的核苷酸核序列可以基于包括(但不限于)具有SEQ ID NO:1、2、3、4中所示的氨基酸序列的母体多肽的氨基酸序列，并且随后改变核苷酸序列以便实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)或去除(即，缺失或取代)来合成。宜根据常规方法，通过定点诱变来修饰核苷酸序列。或者，可以通过化学合成来制备核苷酸序列，所述化学合成包括(但不限于)使用寡核苷酸合成仪(其中寡核苷酸是基于所需多肽的氨基酸序列来设计)，并且优选选择将产生重组多肽的宿主细胞偏好的那些密码子。举例来说，可通过PCR、接合或接合链式反应来合成和组装编码所需多肽的部分的数个小寡核苷酸。参见例如巴拉尼(Barany)等人,国家科学院院刊88:189-193(1991)；美国专利6,521,427，其以引用的方式并入本文中。
本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。揭示本发明中使用的一般方法的基础文章包括萨姆布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆实验指南(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)(第3版，2001)；克里格勒(Kriegler),基因转移与表达实验指南(Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual)(1990)；和现行分子生物学方案(奥斯贝等人编，1994))。
描述分子生物技术的一般文章包括伯杰(Berger)和基梅尔(Kimmel),分子克隆 技术导言(Guide to Molecular Cloning Techniques),酶学方法(Methods in  Enzymology),第152卷,学术出版社公司(Academic Press,Inc.),加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA)(伯杰)；萨姆布鲁克等人,分子克隆实验指南(Molecular  Cloning-A Laboratory Manual)(第2版),第1-3卷,冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory),纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,New York),1989(“萨姆布鲁克”)以及现行分子生物学方案,F.M.奥斯贝等人编,现行方案(Current Protocols),格林出版联合公司(Greene Publishing Associates,Inc.)与约翰威立父子出版公司的合资企业,(1999年全年增补)(“奥斯贝”)。这些文章描述诱变、载体的使用、启动子和许多其它相关的课题，所述相关课题涉及(包括(但不限于))包括用于产生包括非天然氨基酸的蛋白质的选择密码子、正交tRNA、正交合成酶和其对的基因或多核苷酸的产生。
在本发明中使用多类诱变来实现多种目的，包括(但不限于)产生新颖合成酶或tRNA、使tRNA分子突变、使编码合成酶的多核苷酸突变、产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、插入编码相关蛋白质或多肽中的非天然氨基酸的选择密码子。所述诱变方法包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰DNA诱变、使用带缺口双螺旋DNA等的诱变，PCT介导的诱变，或其任何组合。其它合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过总基因合成诱变、双股断裂修复等。本发明中还包括(包括(但不限于))涉及嵌合构建体的诱变。在一个实施例中，可以通过有关天然存在的分子或者改变或突变的天然存在的分子的已知信息，包括(但不限于)序列、序列比较、物理特性、二级、三级或四级结构、晶体结构等，来指导诱变。
本文中可见的文章和实例描述这些程序。其它信息可见于以下出版物和其中引用的参考文献中：凌(Ling)等人,DNA诱变方法综述(Approaches to DNA mutagenesis:an overview),分析生物化学(Anal Biochem.)254(2):157-178(1997)；黛尔(Dale)等人,使用硫代磷酸酯方法进行寡核苷酸定向随机诱变(Oligonucleotide-directedrandom mutagenesis using the phosphorothioate method),分子生物学方法(Methods  Mol.Biol.)57:369-374(1996)；史密斯(Smith),体外诱变(In vitro mutagenesis),遗 传学年鉴(Ann.Rev.Genet.)19:423-462(1985)；博特斯坦(Botstein)和肖特勒(Shortle),体外诱变的策略和应用(Strategies and applications of in vitromutagenesis),科学(Science)229:1193-1201(1985)；卡特(Carter),定点诱变(Site-directed mutagenesis),生物化学杂志(J.Biol.Chem.)237:1-7(1986)；孔克尔,寡核苷酸定向诱变效率(The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis),核酸和分子生 物学(Nucleic Acids&Molecular Biology)(埃克斯坦,F.(Eckstein,F.)和利利,D.M.J.(Lilley,D.M.J.)编,施普林格出版社(Springer Verlag),柏林)(1987)；孔克尔,在无表型选择的情况下快速并且有效的位点特异性诱变(Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection),美国国家科学院院刊82:488-492(1985)；孔克尔等人,在无表型选择的情况下快速并且有效的位点特异性诱变,酶学方法(Methods  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通常根据比乌凯奇(Beaucage)和卡拉瑟斯(Caruthers),四面体快报(Tetrahedron Letts.)22(20):1859-1862,(1981)中所述的固相亚磷酰胺三酯法，例如使用尼德尔曼-范德瓦特(Needham-VanDevanter)等人,核酸研究,12:6159-6168(1984)中所述的自动合成仪，以化学方式合成寡核苷酸，例如用于本发明的诱变过程中，例如使合成酶文库突变，或改变tRNA的寡核苷酸。
本发明还涉及通过正交tRNA/RS对在体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。利用本发明的多核苷酸或包括本发明多核苷酸的构建体，包括(但不限于)本发明的载体(其可为例如克隆载体或表达载体)，对宿主细胞进行基因工程改造(包括(但不限于)转化、转导或转染)。举例来说，将正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生化的蛋白质的编码区可操作性地与在所需宿主细胞中起作用的基因表达控制元件连接。载体可以是例如质粒、柯斯质粒、噬菌体、细菌、病毒、裸多核苷酸或经结合多核苷酸的形式。通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔(弗洛姆(Fromm)等人,美国国家科学院院刊82,5824(1985))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上用具有核酸的小粒子高速弹道穿透(科莱恩(Klein)等人,自然327,70-73(1987))等。适合于将核酸体外转移到细胞中的技术包括使用脂质体、微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀方法等。体内基因转移技术包括(但不限于)用病毒(通常反转录病毒)载体进行的转染和病毒鞘蛋白-脂质体介导的转染[曹(Dzau)等人,生物技术趋势(Trends in Biotechnology)11:205-210(1993)]。在一些情形中，可能需要用以目标细胞为目标的药剂提供核酸源，例如对细胞表面膜蛋白质或目标细胞具有特异性的抗体、目标细胞上受体的配位体等。在其中采用脂质体的情况下，结合于与内饮作用相关的细胞表面膜蛋白质的蛋白质可用于靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型具有向性的被囊体蛋白质或其片段、在循环中进行内化的蛋白质的抗体、以胞内定位和增强胞内半衰期为目标的蛋白质。
可以在经修饰而适用于例如筛选步骤、活化启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养经工程改造的宿主细胞。这些细胞可任选培养入转基因生物体中。包括(但不限于)关于细胞分离和培养(例如，关于后续核酸分离)的其它有用的参考文献包括弗瑞旭尼(Freshney)(1994)动物细胞的培养：基础技术手册(Culture of  Animal Cells,a Manual of Basic Technique),第三版,威立-利斯(Wiley-Liss),纽约和其中所引用的参考文献；派恩(Payne)等人(1992)液体系统中的植物细胞和组织 培养(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems)约翰·威立父子公司纽约州纽约；冈堡(Gamborg)和菲利浦(Phillips)(编)(1995)植物细胞、组织和器官培养 (Plant Cell,Tissue and Organ Culture)；基本方法施普林格实验指南(FundamentalMethods Springer Lab Manual),施普林格出版社(柏林海德尔堡纽约)和阿特拉斯(Atlas)和帕克斯(Parks)(编)微生物培养基手册(The Handbook of Microbiological  Media)(1993)CRC出版社(CRC出版社),佛罗里达州波卡拉顿(Boca Raton,FL)。
将目标核酸引入到细胞中的若干众所周知的方法是可获得的，其中任何一种都可以用于本发明中。这些方法包括：将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、弹轰击和用病毒载体(下文进一步讨论)感染等。可以使用细菌细胞来扩增含有本发明DNA构建体的质粒的数量。使细菌生长到对数生长期，并且可利用此项技术中已知的多种方法来分离细菌中的质粒(参见例如萨姆布鲁克)。另外，可以在市面上购买试剂盒来从细菌中纯化质粒(参见例如都来自法玛西亚生物技术公司(PharmaciaBiotech)的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；来自赛特杰公司(Stratagene)的StrataCleanTM；和来自凯杰公司(Qiagen)的QIAprepTM)。随后进一步操作经分离和纯化的质粒以产生其它质粒，来用于转染细胞，或并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定目标核酸表达的启动子。载体任选包含普通表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许所述盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括(但不限于)穿梭载体)，以及用于原核系统与真核系统的选择标记物。载体适合于在原核细胞、真核细胞或两者中复制和整合。参见吉勒姆(Gillam)和史密斯,基因8:81(1979)；罗伯茨(Roberts)等人,自然328:731(1987)；施奈德E.(Schneider,E.)等人,蛋白质表达与纯化(Protein Expr. Purif.)6(1):10-14(1995)；奥斯贝、萨姆布鲁克、伯杰(所有同前文献)。例如由ATCC，例如通过ATCC，例如由ATCC出版的吉尔尼(Gherna)等人(编)的ATCC细 菌与噬菌体目录(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage)(1992)，提供了适用于克隆的细菌和噬菌体的目录。用于测序、克隆和分子生物学其它方面的其它基础程序以及基础理论讨论也见于沃森(Watson)等人(1992)重组DNA(Recombinant  DNA)第二版,科学美国人书籍(Scientific American Books),纽约州。另外，基本上任何核酸(以及几乎任何经标记核酸，无论标准或非标准)都可以从多种商业来源中的任一种定制或标准定购，这些商业来源例如米德兰认证试剂公司(Midland CertifiedReagent Company)(德克萨斯州米德兰(Midland,TX)，可在万维网mcrc.com上获得)、伟大的美国基因公司(The Great American Gene Company)(加利福尼亚州拉蒙纳(Ramona,CA)，可在万维网genco.com上获得)、艾克斯普锐斯津公司(ExpressGenInc.)(伊利诺伊州芝加哥(Chicago,IL)，可在万维网expressgen.com上获得)、操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.)(加利福尼亚州阿拉米达(Alameda,CA))以及许多其它来源。
选择密码子
本发明的选择密码子扩充蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特的三碱基密码子；无义密码子(例如终止密码子，包括(但不限于)琥珀密码子(UAG)、赭石密码子或蛋白石密码子(UGA))；非天然密码子；四个或四个以上碱基的密码子；稀有密码子等。所属领域的普通技术人员易于了解，在编码白细胞介素10的至少一部分的单一多核苷酸中，可以引入所需基因或多核苷酸中的选择密码子的数目范围很广，包括(但不限于)一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上选择密码子。
在一个实施例中，所述方法涉及使用作为终止密码子的选择密码子在体内并入一或多个非天然氨基酸。举例来说，产生识别终止密码子(包括(但不限于)UAG)的O-tRNA，并通过带有所需非天然氨基酸的O-RS使其氨酰基化。天然存在的宿主氨酰基-tRNA合成酶不识别此O-tRNA。可以使用常规定点诱变在相关多肽中的相关位点引入终止密码子，包括(但不限于)TAG。参见例如塞耶斯,J.R.等人,(1988),基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向诱变中的5'-3'核酸外切酶(5'-3'Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis).核酸研究16:791-802。当O-RS、O-tRNA和编码相关多肽的核酸在体内组合时，响应于UAG密码子并入非天然氨基酸，从而得到在指定位置含有非天然氨基酸的多肽。
可以在不显著干扰真核宿主细胞的情况下进行非天然氨基酸的体内并入。举例来说，因为对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制子tRNA)与真核释放因子(包括(但不限于)eRF)(其结合于终止密码子并启动核糖体释放生长肽)之间的竞争，所以可以通过(包括(但不限于))提高O-tRNA和/或抑制子tRNA的表达水平来调节抑制效率。
也可以用稀有密码子编码非天然氨基酸。举例来说，已证实当降低体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度时，稀有精氨酸密码子AGG可以有效地通过用经丙氨酸酰基化的合成tRNA插入Ala。参见例如马(Ma)等人,生物化学(Biochemistry),32:7939(1993)。在此情况下，合成tRNA与天然存在tRNAArg竞争，所述tRNAArg作为次要物种存在于大肠杆菌中。一些生物体不使用所有三联体密码子。已经利用藤黄微球菌(Micrococcus luteus)中的未指定密码子AGA在体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。参见例如科瓦尔(Kowal)和奥利佛(Oliver),核酸研究(Nucl.Acid.Res.),25:4685(1997)。可以产生本发明的组分以在体内使用这些稀有密码子。
选择密码子还包含延长的密码子，其包括(但不限于)四个或四个以上碱基的密码子，例如，四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的一个特征包括使用基于移码抑制的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子可以将(包括(但不限于))一个或多个非天然氨基酸插入同一个蛋白质中。举例来说，在存在突变O-tRNA((包括(但不限于))具有反密码子环(例如，具有至少8-10nt反密码子环)的特定移码抑制子tRNA)的情况下，将四个或四个以上碱基的密码子当作单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可以解码(包括(但不限于))至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基的密码子。由于存在256个可能的四碱基密码子，故可以在同一细胞中使用四个或四个以上碱基的密码子编码多个非天然氨基酸。参见安德森(Anderson)等人,(2002)探究密码子和反密码子大小的极限(Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size),化学和生物学 (Chemistry and Biology.),9:237-244；玛格丽瑞(Magliery),(2001)扩充遗传代码：用文库方法在大肠杆菌中选择四碱基密码子的有效抑制子并且鉴定“变化的”四碱基密码子(Expanding the Genetic Code:Selection of Efficient Suppressors of Four-baseCodons and Identification of“Shifty”Four-base Codons with a Library Approach inEscherichia coli),分子生物学杂志307:755-769。
举例来说，已使用四碱基密码子,使用体外生物合成方法将非天然氨基酸并入蛋白质中。参见例如马等人,(1993)生物化学,32:7939；和郝萨卡(Hohsaka)等人,(1999)美国化学会志121:34。用两种化学酰化移码抑制子tRNA，使用CGGG和AGGU将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时体外并入链霉亲和素中。参见例如郝萨卡等人,(1999)美国化学会志,121:12194。在体内研究中，穆尔(Moore)等人检查了具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可以是U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA可以由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％到26％的效率解码，其中在0或-1框中解码极少。参见穆尔等人,(2000)分子生物学杂志,298:195。在一个实施例中，可以在本发明中使用基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子，其可以减少其它不希望位点的错义连读和移码抑制。
对于给定系统，选择密码子也可以包括天然三碱基密码子中的一种，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子任选包括非天然碱基对。这些非天然碱基对可以进一步扩充现有的遗传密码。一个额外碱基对使三联体密码子的数量从64增加到125。第三位碱基对的特性包括稳定并且选择性碱基配对，通过聚合酶以高保真度将酶有效并入DNA中，和在合成新生非天然碱基对之后有效的继续引物延长。可以适用于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括例如平尾(Hirao)等人,(2002)用于将氨基酸类似物并入蛋白质中的非天然碱基对(An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues intoprotein),自然·生物技术,20:177-182。还参见吴Y.(Wu,Y.)等人,(2002)美国化学会志124:14626-14630。其它相关出版物列举如下。
对于体内使用，非天然核苷可透过膜，并且经磷酸化形成相应的三磷酸酯。此外，增加的遗传信息也很稳定，并且不会被细胞酶破坏。本纳(Benner)和其它人先前的尝试利用了不同于标准沃森-克里克(Watson-Crick)对的氢键模式，其中最值得关注的实例是iso-C:iso-G对。参见例如斯威策(Switzer)等人,(1989)美国化学会志,111:8322；和皮奇里利(Piccirilli)等人,(1990)自然.343:33；库尔(Kool),(2000)化 学生物学新见(Curr.Opin.Chem.Biol.),4:602。这些碱基一般来说在一定程度上与天然碱基错配并且不能以酶促方式复制。库尔和合作者证实，碱基之间的疏水堆积相互作用可以代替氢键来驱动碱基对的形成。参见库尔,(2000)化学生物学新见,4:602；和古基安(Guckian)和库尔,(1998)应用化学国际英文版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.),36,2825。在努力开发满足所有以上要求的非天然碱基对的过程中，舒尔茨(Schultz)、罗姆斯伯格(Romesberg)和合作者已经系统地合成并研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身对(self-pair)比天然碱基对稳定，并且可以通过大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenow fragment；KF)有效地并入DNA中。参见例如麦克明(McMinn)等人,(1999)美国化学会志121:11585-6；和小川(Ogawa)等人,(2000)美国化学会志122:3274。3MN:3MN自身对可以通过KF以对生物功能来说足够的效率和选择性合成。参见例如小川等人,(2000)美国化学会志,122:8803。然而，两个碱基充当进一步复制的链终止剂。近来已开发出可以用于复制PICS自身对的突变DNA聚合酶。此外，还可以复制7AI自身对。参见例如达(Tae)等人,(2001)美国化学 会志,123:7439。也已经开发出了新颖金属碱基对Dipic:Py，其在结合Cu(II)之后形成稳定对。参见梅格斯(Meggers)等人,(2000)美国化学会志,122:10714。因为延长的密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本发明方法可以利用这种特性来产生针对其的正交tRNA。
翻译旁路系统(translational bypassing system)也可以用于在所需多肽中并入非天然氨基酸。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并不翻译成蛋白质。所述序列含有的结构充当诱导核糖体越过所述序列并继续在插入序列下游翻译的提示(cue)。
在某些实施例中，本发明方法和/或组合物中的相关蛋白质或多肽(或其部分)由核酸编码。通常，核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或更多个选择密码子。
编码相关蛋白质或多肽的基因可以使用所属领域的普通技术人员已知的和本文中所述的方法进行诱变，从而包括例如一或多个用于并入非天然氨基酸的选择密码子。举例来说，诱变相关蛋白质的核酸，以使其包括一或多个选择密码子，从而并入一或多个非天然氨基酸。本发明包括例如包括至少一个非天然氨基酸的任何蛋白质的任何此种变异体(包括(但不限于)突变体)型式。类似地，本发明还包括相应核酸，即，具有一或多个编码一或多个非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。
编码例如IL-10的相关蛋白质的核酸分子可以容易地突变以在所述多肽的任何理想位置引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入相关蛋白质上。适合于将半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法是所属领域的普通技术人员已知的，例如描述于美国专利第6,608,183号(其以引用的方式并入本文中)中的那些方法，和标准诱变技术。
III.非天然编码氨基酸
很多种非天然编码氨基酸适用于本发明中。可以将任何数目的非天然编码氨基酸引入IL-10中。一般说来，引入的非天然编码氨基酸对20种常见基因编码氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)实质上呈化学惰性。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括与未见于20种常见氨基酸中的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮、醛和氨氧基)有效且选择性反应形成稳定结合物的侧链官能团。举例来说，包括含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的IL-10可以与聚合物(包括(但不限于)聚(乙二醇)或者含有炔部分的第二多肽)反应，以形成由于叠氮与炔官能团选择性反应形成胡伊斯根[3+2]环加成产物而产生的稳定结合物。
α-氨基酸的一般结构如下所示(式I)：
非天然编码氨基酸通常为具有上文所列式的任何结构，其中R基团是除20种天然氨基酸中所用外的任何取代基，并且都可适用于本发明中。因为本发明非天然编码氨基酸通常仅侧链结构不同于天然氨基酸，所以非天然编码氨基酸与其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然编码氨基酸)形成酰胺键的方式与其在天然存在多肽中形成的方式相同。然而，非天然编码氨基酸的侧链基团使其与天然氨基酸相区别。举例来说，R任选地包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基(borate)、硼酸酯基(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或其任何组合。可能适用于本发明中的其它相关的非天然存在氨基酸包括(但不限于)包含可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼蔽和/或可光异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(例如糖取代的丝氨酸)、其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解氨基酸、侧链比天然氨基酸长的氨基酸(包括(但不限于)聚醚或长链烃，包括(但不限于)大于约5个或大于约10个碳)、含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和包含一或多个有毒部分的氨基酸。
可能适用于本发明中并且适用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码氨基酸包括(但不限于)具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮和炔反应性基团的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-天冬酰胺和O-甘露糖氨基-L-丝氨酸。所述氨基酸的实例还包括氨基酸与糖之间的天然存在的N键或O键由自然界中不常见的共价键(包括(但不限于)烯烃、肟、硫醚、酰胺等)置换的实例。所述氨基酸的实例还包括天然存在的蛋白质中不常见的糖，例如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
本文中提供的许多非天然编码氨基酸在市面上有售，例如购自西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))、诺瓦生物科技公司(Novabiochem)(EMD生物科技公司(EMD Biosciences)的分公司,德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany))或派普科技公司(Peptech)(美国马萨诸塞州伯灵顿(Burlington,MA,USA))。不可商购的那些任选地如本文中提供的那般或使用所属领域的普通技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，参见例如费森登(Fessendon)和费森登的有机化学(Organic Chemistry),(1982,第二版,威拉德格兰特出版社(Willard Grant Press),马塞诸塞州波士顿(Boston Mass.)；马彻(March)的高级有机化学(Advanced Organic Chemistry)(第三版,1985,威立父子公司,纽约)；以及凯里(Carey)和桑德伯格(Sundberg)的高级有机化学(Advanced Organic  Chemistry)(第三版,部分A和B,1990,普雷纳姆出版社(Plenum Press),纽约)。还参见美国专利第7,045,337号和第7,083,970号，其以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸外，可能适用于本发明中的非天然氨基酸还任选包含经修饰的主链结构，包括(但不限于)如式II和III的结构所示：
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R'或S-R'；X和Y可以相同或不同，通常包含S或O；并且R和R'任选相同或不同，通常选自与上文关于具有式I的非天然氨基酸所述的R基团相同的组分清单以及氢。举例来说，如式II和III所示，本发明的非天然氨基酸任选在氨基或羧基中包含取代。此类非天然氨基酸包括(但不限于)α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯，包括(但不限于)具有与常见20种天然氨基酸对应的侧链或非天然侧链。此外，α-碳的取代任选包括(但不限于)L、D或α-α-双取代氨基酸，例如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸，例如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物；β和γ氨基酸，例如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
许多非天然氨基酸都是基于天然氨基酸，例如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等，并且都适用于本发明中。酪氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸以及间位取代的酪氨酸，其中经取代酪氨酸包含(包括(但不限于))酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或分支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等。此外，也涵盖多取代的芳基环。可能适用于本发明中的谷氨酰胺类似物包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ-取代的衍生物、环状衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可能适用于本发明中的苯丙氨酸类似物的实例包括(但不限于)对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中所述取代基包含(包括(但不限于))羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可能适用于本发明中的非天然氨基酸的特定实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸以及对炔丙基氧基-苯丙氨酸等。可能适用于本发明中的多种非天然氨基酸的结构实例提供于例如名称为“体内并入非天然氨基酸(In vivo incorporation of unnatural amino acids)”的WO 2002/085923中。关于其它甲硫氨酸类似物，还参见柯克(Kiick)等人,(2002)通过施陶丁格尔接合将叠氮化物并入重组蛋白质中以用于进行化学选择性修饰(Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by theStaudinger ligation),美国国家科学院院刊99:19-24，其以引用的方式并入本文中。名称为“含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途(Compositions Containing,Methods Involving,and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides)”的国际申请案第PCT/US06/47822号(其以引用的方式并入本文中)描述芳香族胺部分(包括(但不限于)对氨基-苯丙氨酸)的还原烷基化，以及还原胺化。
在本发明的另一个实施例中，具有一个或一个以上非天然编码氨基酸的IL-10多肽经共价修饰。与生物系统的不同官能基正交的选择性化学反应视为化学生物学中的重要工具。作为合成化学抗体库的相对新成员，这些生物正交反应引入新的化合物文库合成、蛋白质工程改造、功能性蛋白质组研究和细胞表面的化学重构的策略。叠氮基保持作为用于生物结合的独特化学处理的重要作用。施陶丁格尔接合(Staudingerligation)已经与膦一起用于标记以代谢方式引入细胞糖结合物中的叠氮基糖。施陶丁格尔接合可以在活动物中进行而不造成生理损害；尽管如此，施陶丁格反应并非无不利性。必要的膦对空气氧化敏感并且已证实对于其水溶性改良和反应速率提高的优化具有合成挑战性。
叠氮基具有生物正交反应性的替代性模式：由胡伊斯根描述的用炔烃进行[3+2]环加成。在其典型形式中，这一反应由于需要高温(或压力)获得合理反应速率而在生物系统中可应用性受限。夏普利斯(Sharpless)和合作者开发铜(I)催化型式而克服这一障碍，称为“点击化学(click chemistry)”，其可以在生理温度下并且在充分功能化生物环境中容易地进行。这一发现使得能够从复杂组织溶解产物中选择性修饰病毒粒子、核酸和蛋白质。不幸的是，必选的铜催化剂对细菌和哺乳动物细胞均具有毒性，因此无法应用于细胞必须保持存活的情况。已经报导通过吸电子取代基活化的炔烃的无催化剂型胡伊斯根环加成在环境温度下进行。但是，这些化合物与生物亲核试剂一起进行迈克尔反应(Michael reaction)。
在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸(例如对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的IL-10的组合物。还提供包含对-(炔丙氧基)-苯丙氨酸和(包括(但不限于))蛋白质和/或细胞的各种组合物。在一个方面中，包括对-(炔丙氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可以与正交tRNA键接(包括(但不限于)共价)，包括(但不限于)，通过氨酰基键与正交tRNA共价键接、与正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH共价键接等。
可以通过非天然氨基酸并入蛋白质中的化学部分将为蛋白质提供多种益处和操作。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许在体外和体内利用多种含肼或含羟胺试剂中的任一种选择性修饰蛋白质。重原子非天然氨基酸例如可以用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸位点特异性地引入重原子还为选择重原子的位置提供选择性和灵活性。光反应性非天然氨基酸(包括(但不限于)具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括(但不限于)苯基叠氮化物)侧链的氨基酸)例如允许在体内和体外有效地光交联蛋白质。光反应性非天然氨基酸的实例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后可以通过提供光反应性基团的时间控制激发使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中，非天然氨基酸的甲基可经作为局部结构和动力学探针(包括(但不限于)使用核磁共振和振动光谱)的同位素标记(包括(但不限于))甲基取代。举例来说，炔基或叠氮基官能团允许利用分子通过[3+2]环加成反应选择性修饰蛋白质。
并入多肽的氨基端中的非天然氨基酸可以由R基团和不同于α-氨基酸(参见式I)中通常存在的NH2基团的第二反应性基团构成，所述R基团是除20种天然氨基酸中所用的取代基以外的任何取代基。类似的非天然氨基酸可以与不同于α-氨基酸(参见式I)中通常存在的COOH基团的第二反应性基团一起在羧基端并入。
本发明的非天然氨基酸可经选择或设计，从而提供在20种天然氨基酸中不可得到的其它特征。举例来说，可以任选对非天然氨基酸进行设计或选择，从而改变例如并有所述非天然氨基酸的蛋白质的生物特性。举例来说，以下性质可以通过将非天然氨基酸掺杂到蛋白质中来任选地修改：毒性、生物分布、溶解性、稳定性(例如热、水解、氧化、对酶促降解的抗性等)、纯化和加工便利性、结构特性、光谱特性、化学和/或光化特性、催化活性、氧化还原电位、半衰期、与其它分子(例如共价或非共价地)反应的能力等。
非天然氨基酸的结构和合成：羰基、类羰基、经遮蔽羰基、经保护羰基和羟胺基
在一些实施例中，本发明提供通过肟键与水溶性聚合物(例如PEG)连接的IL-10。
许多类型的非天然编码氨基酸适合于形成肟键。这些氨基酸包括(但不限于)含有羰基、二羰基或羟胺基的非天然编码氨基酸。所述氨基酸描述于以下专利文献中：美国专利公开案第2006/0194256号、第2006/0217532号和第2006/0217289号，以及名称为“含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途(Compositions containing,methods involving,and uses of non-natural amino acids and polypeptides)”的WO 2006/069246，这些专利文献的全文都以引用的方式并入本文中。非天然编码氨基酸也描述于美国专利第7,083,970号和美国专利第7,045,337号中，这些专利的全文都以引用的方式并入本文中。
本发明的一些实施例利用在一个或一个以上位置经对乙酰基苯丙氨酸氨基酸取代的IL-10多肽。对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于张Z.(Zhang,Z.)等人,生物化学42:6735-6746(2003)中，其以引用的方式并入本文中。其它含羰基或含二羰基的氨基酸可由所属领域的普通技术人员类似地制备。另外，本文中所包括的非天然氨基酸的非限制性例示性合成呈示于美国专利第7,083,970号的图4、24-34和36-39中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
具有亲电反应性基团的氨基酸允许通过亲核加成反应等连接分子的各种反应。所述亲电反应性基团包括羰基(包括酮基和二羰基)、类羰基(其具有与羰基(包括酮基和二羰基)类似的反应性并且结构上与羰基类似)、经遮蔽羰基(其可以容易地转化成羰基(包括酮基和二羰基))、或经保护羰基(其在脱除保护基后的反应性与羰基(包括酮基和二羰基)类似)。所述氨基酸包括具有式(IV)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是任选的，并且当存在时是选自由以下各基团组成的群组的连接基团：低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、低碳数亚杂烷基、经取代低碳数亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；
J是
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
每一个R"独立地是H、烷基、经取代烷基或保护基，或者当存在一个以上R"基团时，两个R"任选形成杂环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3和R4中的每一者独立地是H、卤素、低碳数烷基或经取代低碳数烷基，或R3和R4或两个R3基团任选地形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团在一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经遮蔽羰基(包括经遮蔽二羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经遮蔽羰基(包括经遮蔽二羰基)的单环或双环环烷基或杂环烷基；
其限制条件是当A是亚苯基并且每一个R3是H时，B存在；和当A是-(CH2)4-并且每一个R3是H时，B不是-(O)(CH2CH2)-；和当A和B不存在并且每一个R3是H时，不是甲基。
此外，还包括具有式(V)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是任选的，并且当存在时是选自由以下各基团组成的群组的连接基团：低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、低碳数亚杂烷基、经取代低碳数亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
其限制条件是当A是亚苯基时，B存在；和当A是-CH2)4-时，B不是-NHC(O)(CH2CH2)-；和当A和B不存在时，R不是甲基。
另外，包括具有式(VI)结构的氨基酸：
其中：
B是选自由以下各基团组成的群组的连接基团：低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、低碳数亚杂烷基、经取代低碳数亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
每一个Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基。
另外，还包括以下氨基酸：
其中所述化合物任选地是氨基经保护的基团、羧基经保护，或是其盐。另外，以下非天然氨基酸中的任一者都可以并入非天然氨基酸多肽中。
此外，还包括以下具有式(VII)结构的氨基酸：
其中
B是任选的，并且当存在时是选自由以下各基团组成的群组的连接基团：低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、低碳数亚杂烷基、经取代低碳数亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
每一个Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；并且n是0到8；
其限制条件是当A是-(CH2)4-时，B不是-NHC(O)(CH2CH2)-。
另外，还包括以下氨基酸：
其中所述化合物任选地氨基经保护，任选地羧基经保护，任选地氨基经保护和羧基经保护，或是其盐。另外，这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可以并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括以下具有式(VIII)结构的氨基酸：
其中A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是任选的，并且当存在时是选自由以下各基团组成的群组的连接基团：低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、低碳数亚杂烷基、经取代低碳数亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括下列具有式(IX)结构的氨基酸：
B是任选的，并且当存在时是选自由以下各基团组成的群组的连接基团：低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、低碳数亚杂烷基、经取代低碳数亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
其中每一个Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基。
另外，还包括以下氨基酸：
其中所述化合物任选地氨基经保护，任选地羧基经保护，任选地氨基经保护和羧基经保护，或是其盐。另外，这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可以并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括以下具有式(X)结构的氨基酸：
其中B是任选的，并且当存在时是选自由以下各基团组成的群组的连接基团：低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、低碳数亚杂烷基、经取代低碳数亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
每一个Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；并且n是0到8。
另外，还包括以下氨基酸：
其中所述化合物任选地氨基经保护，任选地羧基经保护，任选地氨基经保护和羧基经保护，或是其盐。另外，这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可以并入非天然氨基酸多肽中。
除单羰基结构外，本文中所述的非天然氨基酸也可以包括例如二羰基、类二羰基基团、经遮蔽二羰基和经保护二羰基等基团。
举例来说，包括以下具有式(XI)结构的氨基酸：
其中A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是任选的，并且当存在时是选自由以下各基团组成的群组的连接基团：低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、低碳数亚杂烷基、经取代低碳数亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括以下具有式(XII)结构的氨基酸：
B是任选的，并且当存在时是选自由以下各基团组成的群组的连接基团：低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、低碳数亚杂烷基、经取代低碳数亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
其中每一个Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基。
另外，还包括以下氨基酸：
其中所述化合物任选地氨基经保护，任选地羧基经保护，任选地氨基经保护和羧基经保护，或是其盐。另外，这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可以并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括以下具有式(XIII)结构的氨基酸：
其中B是任选的，并且当存在时是选自由以下各基团组成的群组的连接基团：低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、低碳数亚杂烷基、经取代低碳数亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-,-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
每一个Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基；并且n是0到8。
另外，还包括以下氨基酸：
其中所述化合物任选地氨基经保护，任选地羧基经保护，任选地氨基经保护和羧基经保护，或是其盐。另外，这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可以并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括以下具有式(XIV)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1是C、S或S(O)；并且L是亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XIV-A)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L是亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XIV-B)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L是亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XV)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1是C、S或S(O)；并且n是0、1、2、3、4或5；并且每一个CR8R9基团上的每一个R8和R9独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷氧基、烷基氨基、卤素、烷基、芳基，或任何R8和R9可以在一起形成＝O或环烷基，或与R8相邻的任何基团可以在一起形成环烷基。
另外，包括以下具有式(XV-A)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
n是0、1、2、3、4或5；并且每一个CR8R9基团上的每一个R8和R9独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷氧基、烷基氨基、卤素、烷基、芳基，或任何R8和R9可以在一起形成＝O或环烷基，或与R8相邻的任何基团可以在一起形成环烷基。
另外，包括以下具有式(XV-B)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
n是0、1、2、3、4或5；并且每一个CR8R9基团上的每一个R8和R9独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷氧基、烷基氨基、卤素、烷基、芳基，或任何R8和R9可以在一起形成＝O或环烷基，或与R8相邻的任何基团可以在一起形成环烷基。
另外，包括以下具有式(XVI)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1是C、S或S(O)；并且L是亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XVI-A)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L是亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括下列具有式(XVI-B)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L是亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'是H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括具有式(XVII)结构的氨基酸：
其中：
A是任选的，并且当存在时是低碳数亚烷基、经取代低碳数亚烷基、低碳数亚环烷基、经取代低碳数亚环烷基、低碳数亚烯基、经取代低碳数亚烯基、亚炔基、低碳数亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳数亚杂环烷基、经取代低碳数亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
M是-C(R3)-、 其中(a)指示与A基团的键接，并且(b)指示与相应羰基的键接，R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团任选形成环烷基或杂环烷基；
R是H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3是键结、C(R)(R)、O或S，并且R是H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括具有式(XVIII)结构的氨基酸：
其中：
M是-C(R3)-、 其中(a)指示与A基团的键接，并且(b)指示与相应羰基的键接，R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团任选形成环烷基或杂环烷基；
R是H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3是键结、C(R)(R)、O或S，并且R是H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是任选的，并且当存在时是H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时是OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
每一个Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中每一个R'独立地是H、烷基或经取代烷基。
另外，包括具有式(XIX)结构的氨基酸：
其中：
R是H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；并且
T3是O或S。
另外，包括具有式(XX)结构的氨基酸：
其中：
R是H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XXI)结构的氨基酸：
在一些实施例中，对包含非天然氨基酸的多肽进行化学修饰以产生反应性羰基或二羰基官能团。举例来说，可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生适用于结合反应(conjugation reaction)的醛官能团。举例来说，当其中生物活性分子是多肽时，可以使用N端丝氨酸或苏氨酸(其可能正常存在或可能通过化学或酶消化而暴露)，在使用高碘酸盐的温和氧化裂解条件下产生醛官能团。参见例如盖特纳(Gaertner)等人,生物结合化学(Bioconjug.Chem.)3:262-268(1992)；盖根K.(Geoghegan,K.)和斯特罗J.(Stroh,J.),生物结合化学3:138-146(1992)；盖特纳等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269:7224-7230(1994)。然而，此项技术中已知的方法局限于在肽或蛋白质N端的氨基酸。
在本发明中，可以将带有相邻羟基和氨基的非天然氨基酸以“经遮蔽”醛官能团的形式并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸在邻近ε胺处带有羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔数过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽内的其它位点发生氧化。氧化反应的pH值通常是约7.0。典型反应涉及向多肽缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，随后在暗处培育约10分钟。参见例如美国专利第6,423,685号。
在温和条件下，羰基或二羰基官能团可以与含羟胺试剂在水溶液中选择性反应，以形成在生理条件下稳定的相应肟键。参见例如詹克斯W.P.(Jencks,W.P.),美国化学会志81,475-481(1959)；邵J.(Shao,J.)和达恩J.P.(Tarn,J.P.),美国化学会志117:3893-3899(1995)。此外，羰基或二羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。参见例如科尼什V.W.(Cornish,V.W.)等人,美国化学会志118:8150-8151(1996)；盖根K.F.和斯特罗J.G.,生物结合化学3:138-146(1992)；马哈尔L.K.(Mahal,L.K.)等人,科学276:1125-1128(1997)。
非天然氨基酸的结构和合成：含羟胺氨基酸
美国临时专利申请案第60/638,418号以全文引用的方式并入本文中。因此，美国临时专利申请案第60/638,418号中第V节(名称为“非天然氨基酸(Non-naturalAmino Acids)”)第B部分(名称为“非天然氨基酸的结构和合成：含羟胺氨基酸(Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids:Hydroxylamine-Containing AminoAcids”)中所提供的揭示内容完全适用于制备、纯化、表征和使用本文中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物(包括式I-XXXV)、技术和策略，其应用程度就如同所述揭示内容完全呈现于本文中。美国专利公开案第2006/0194256号、第2006/0217532号和第2006/0217289号以及名称为“含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途(Compositions containing,methods involving,and uses of non-natural aminoacid s and polypeptides)”的WO 2006/069246也以全文引用的方式并入本文中。
非天然氨基酸的化学合成
适用于本发明中的许多非天然氨基酸在市面上有售，例如购自西格玛公司(Sigma)(美国)或阿尔德里奇公司(Aldrich)(美国威斯康辛州密尔沃基(Milwaukee,WI,USA))。不可商购的那些任选地如本文中所提供般或如各种出版物中所提供般或使用所属领域的普通技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，参见例如费森登和费森登的有机化学，(1982，第二版，威拉德格兰特出版社，马塞诸塞州波士顿)；马彻的高等有机化学(第三版，1985，威立父子公司，纽约)；以及凯里和桑德伯格的高等有机化学(第三版，第A部分和第B部分，1990，普雷纳姆出版社，纽约)。描述非天然氨基酸的合成的其它出版物包括例如名称为“非天然氨基酸的体内并入(In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids)”的WO 2002/085923；马楚卡斯(Matsoukas)等人,(1995)医药化学杂志(J.Med.Chem.),38,4660-4669；金F.E.(King,F.E.)和基德D.A.A.(Kidd,D.A.A.)(1949)从邻苯二甲酰化中间物合成谷氨酰胺和谷氨酸的γ-二肽的新方法(A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides ofGlutamic Acid from Phthylated Intermediates).化学学会杂志(J.Chem.Soc),3315-3319；弗里德曼O.M.(Friedman,O.M.)和查特吉R.(Chatterrji,R.)(1959)合成谷氨酰胺衍生物作为抗肿瘤剂的模型底物(Synthesis of Derivatives of Glutamine as ModelSubstrates for Anti-Tumor Agents).美国化学学会杂志81,3750-3752；克雷格J.C.(Craig,J.C.)等人(1988)7-氯-4[[4-(二乙基氨基)-1-甲基丁基]氨基]喹啉(氯奎)的对映异构体的绝对构型(Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine)).有机化学杂志(J.Org. Chem),53,1167-1170；阿祖莱M.(Azoulay,M.)、维尔蒙特M.(Vilmont,M.)和弗拉皮耶F.(Frappier,F.)(1991)谷氨酰胺类似物作为潜在抗疟疾药(Glutamine analoguesas Potential Antimalarials).欧洲医药化学杂志(Eur.J.Med.Chem.)26,201-5；科斯基宁A.M.P.(Koskinen,A.M.P.)和拉波波特H.(Rapoport,H.)(1989)合成4-取代的脯氨酸作为构型限制的氨基酸类似物(Synthesis of 4-Substituted Prolines as ConformationallyConstrained Amino Acid Analogues).有机化学杂志54,1859-1866；克里斯蒂B.D.(Christie,B.D.)和拉波波特H.(1985)从L-天冬酰胺合成光学纯甲基哌啶：通过氨基酸脱羰和亚铵离子环化全合成(+)-阿扑长春胺的应用(Synthesis of Optically PurePipecolates from L-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincaminethrough Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization).有机化学杂志50:1239-1246；巴顿(Barton)等人,(1987)使用自由基化学合成新颖的α-氨基酸和衍生物：合成L-α-氨基己二酸和D-α-氨基己二酸、L-α-氨基庚二酸和适当的不饱和衍生物(Synthesis of Novelα-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis ofL-and D-α-Amino-Adipic Acids,L-α-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives).四面体(Tetrahedron)43:4297-4308；以及苏巴辛哈(Subasinghe)等人,(1992)使君子氨酸类似物：合成β-杂环2-氨基丙酸衍生物和其在新颖使君子氨酸酯敏化位点的活性(Quisqualic acid analogues:synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site).医药化学杂志35:4602-7。还参见名称为“蛋白质阵列”的美国专利公开案第US2004/0198637号，其以引用的方式并入本文中。
A.羰基反应性基团
具有羰基反应性基团的氨基酸能够进行多种反应，尤其通过亲核加成或醛醇缩合反应等连接分子(包括(但不限于)PEG或其它水溶性分子)。
例示性含羰基的氨基酸可如下表示：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2是H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；并且R3是H、氨基酸、多肽，或氨基端修饰基团；并且R4是H、氨基酸、多肽，或羧基端修饰基团。在一些实施例中，n是1，R1是苯基并且R2是简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n是1，R1是苯基并且R2是简单烷基(即甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的间位。
对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于张Z.(Zhang,Z.)等人,生物化学42:6735-6746(2003)中，其以引用的方式并入本文中。其它含羰基的氨基酸可由所属领域的普通技术人员类似地制备。
在一些实施例中，对包含非天然编码氨基酸的多肽进行化学修饰以产生反应性羰基官能团。举例来说，可以从具有相邻氨基和羟基的官能团产生适用于结合反应的醛官能团。举例来说，当其中生物活性分子是多肽时，可以使用N端丝氨酸或苏氨酸(其可能正常存在或可能通过化学或酶消化而暴露)，在使用高碘酸盐的温和氧化裂解条件下产生醛官能团。参见例如盖特纳等人,生物结合化学3:262-268(1992)；盖根K.和斯特罗J.,生物结合化学3:138-146(1992)；盖特纳等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269:7224-7230(1994)。然而，此项技术中已知的方法局限于在肽或蛋白质N端的氨基酸。
在本发明中，可以将带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸以“经遮蔽”醛官能团的形式并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸在邻近ε胺处带有羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔数过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽内的其它位点发生氧化。氧化反应的pH值通常是约7.0。典型反应涉及向多肽缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，随后在暗处培育约10分钟。参见例如美国专利第6,423,685号，其以引用的方式并入本文中。
在温和条件下，羰基官能团可与含肼、含酰肼、含羟胺或含氨基脲的试剂在水溶液中选择性反应，从而分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或缩氨基脲键。参见例如詹克斯W.P.,美国化学会志81,475-481(1959)；邵J.和达恩J.P.,美国化学会志117:3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。参见例如科尼什V.W.等人,美国化学会志118:8150-8151(1996)；盖根K.F.和斯特罗J.G.,生物结合化学3:138-146(1992)；马哈尔L.K.等人,科学276:1125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有亲核基团(例如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码氨基酸允许与各种亲电基团反应形成结合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物形成结合物)。
例示性含肼、含酰肼或含氨基脲的氨基酸可如下所示：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在一些实施例中，n是4，R1不存在，并且X是N。在一些实施例中，n是2，R1不存在，并且X不存在。在一些实施例中，n是1，R1是苯基，X是O，并且氧原子位于芳环上脂肪族基团的对位。
含酰肼、含肼和含氨基脲的氨基酸可从商业来源获得。举例来说，L-谷氨酸-γ-酰肼可购自西格玛化学品公司(Sigma Chemical)(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))。其它不可商购的氨基酸可以由所属领域的普通技术人员制备。参见例如美国专利第6,281,211号，其以引用的方式并入本文中。
含有带酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可以与多个含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子有效且选择性反应。参见例如邵J.和达恩J.,美国化学会志117:3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括(但不限于)丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基以及N端)相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮和其它亲电基团的反应性显著更强。
C.含氨氧基的氨基酸
含有氨氧基(也称为羟胺)的非天然编码氨基酸允许与各种亲电基团反应，形成结合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物的结合物)。与肼、酰肼和氨基脲类似，增强氨氧基的亲核性使其能够与多个含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子有效且选择性反应。参见例如邵J.和达恩J.,美国化学会志117:3893-3899(1995)；H.汉格(H.Hang)和C.贝尔托西(C.Bertozzi),化学研究述评(Acc.Chem.Res.)34:727-736(2001)。与肼基反应得到相应腙，而肟一般由氨氧基与含羰基基团(例如酮)反应得到。
例示性含氨氧基的氨基酸可如下所示：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基，或不存在；X是O、N、S，或不存在；m是0到10；Y是＝C(O)，或不存在；R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中，n是1，R1是苯基，X是O，m是1并且Y存在。在一些实施例中，n是2，R1和X不存在，m是0并且Y不存在。
含氨氧基的氨基酸可以由容易得到的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备。参见例如M.卡拉斯科(M.Carrasco)和R.布朗(R.Brown),有机化学杂志68:8853-8858(2003)。已经从天然来源中分离出某些含氨氧基的氨基酸，例如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸(罗森塔尔G.(Rosenthal,G.),生命科学(Life Sci.)60:1635-1641(1997))。其它含氨氧基的氨基酸可以由所属领域的普通技术人员制备。
D.叠氮和炔反应性基团
叠氮和炔官能团的独特反应性使其特别适用于选择性修饰多肽和其它生物分子。有机叠氮化物，尤其是脂肪族叠氮化物，以及炔一般对常用化学反应条件稳定。具体来说，叠氮和炔官能团均对见于天然存在多肽中的20种常见氨基酸的侧链(即，R基团)呈惰性。但当紧密接近时，会呈现叠氮基和炔基的“弹簧加压(spring-loaded)”性，并且其通过胡伊斯根[3+2]环加成反应有效且选择性反应，产生相应的三唑。参见例如秦J.等人,科学301:964-7(2003)；王Q.等人,美国化学会志125,3192-3193(2003)；秦J.W.等人,美国化学会志124:9026-9027(2002)。
因为胡伊斯根环加成反应涉及选择性环加成反应(参见例如派德沃A.,综合有机合成,第4卷,(特罗斯特B.M.编,1991),第1069-1109页；胡伊斯根R.1,3-偶极环加成化学,(派德沃A.编,1984),第1-176页)而不是亲核取代，所以并入具有含叠氮和含炔的侧链的非天然编码氨基酸使得所得多肽在非天然编码氨基酸的位置处经选择性修饰。涉及含叠氮或含炔的IL-10的环加成反应可以在室温下，于水性条件下，通过在存在用于将Cu(II)还原成Cu(I)的还原剂的情况下，添加催化量的Cu(II)(包括(但不限于)催化量CuSO4的形式)当场进行。参见例如王Q.等人,美国化学会志125,3192-3193(2003)；托尔诺C.W.(Tornoe,C.W.)等人,有机化学杂志67:3057-3064(2002)；罗斯托夫采夫等人,应用化学国际版41:2596-2599(2002)。例示性还原剂包括(包括(但不限于))抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+和所施加的电位。
在其中需要叠氮与炔之间发生胡伊斯根[3+2]环加成反应的一些情况下，IL-10包含包括炔部分的非天然编码氨基酸，并且欲与所述氨基酸连接的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者，还可以进行逆反应(即，氨基酸上的叠氮部分与水溶性聚合物上存在的炔部分反应)。
叠氮官能团也可以与含有芳基酯且经芳基膦部分适当官能化从而产生酰胺键的水溶性聚合物选择性反应。芳基膦基在原位还原叠氮基，随后所得胺与邻近的酯键有效反应，产生相应酰胺。例如参见E.萨龙(E.Saxon)和C.贝尔托西,科学287,2007-2010(2000)。含叠氮的氨基酸可以是烷基叠氮化物(包括(但不限于)2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。
含有芳基酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示：
其中X可以是O、N、S，或不存在，Ph是苯基，W是水溶性聚合物，并且R可以是H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN和-NO2。R'、R"、R'"和R""各自独立地指氢、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基，或芳烷基。当本发明化合物包括一个以上R基团时，例如，每一个R基团是如每一个R'、R"、R'"和R""基团在存在这些基团中的一者以上时那样独立地选择。当R'与R"连接到同一氮原子上时，其可以与所述氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。所属领域的技术人员从上文有关取代基的论述将了解到，术语“烷基”打算包括包括碳原子与除氢基外的基团结合的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
叠氮官能团还可以与含有硫酯且经芳基膦部分适当官能化从而产生酰胺键的水溶性聚合物选择性反应。芳基膦基在原位还原叠氮基，随后所得胺与硫酯键有效反应，产生相应酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下所示：
其中n是1到10；X可以是O、N、S，或不存在，Ph是苯基，并且W是水溶性聚合物。
例示性含炔氨基酸可如下所示：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基，或不存在；X是O、N、S，或不存在；m是0到10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中，n是1，R1是苯基，X不存在，m是0，并且乙炔部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n是1，R1是苯基，X是O，m是1，并且炔丙氧基位于烷基侧链的对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n是1，R1和X不存在，并且m是0(即，炔丙基甘氨酸)。
含炔氨基酸在市面上有售。举例来说，炔丙基甘氨酸可购自派普科技公司(马萨诸塞州伯灵顿)。或者，可以根据标准方法制备含炔氨基酸。举例来说，可以例如如戴特斯A.(Deiters,A.)等人,美国化学会志125:11782-11783(2003)中所述合成对炔丙基氧基苯丙氨酸，并且可以如凯塞B.(Kayser,B.)等人,四面体(Tetrahedron)53(7):2475-2484(1997)中所述合成4-炔基-L-苯丙氨酸。其它含炔氨基酸可以由所属领域的普通技术人员制备。
例示性含叠氮的氨基酸可如下表示：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0到10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中，n是1，R1是苯基，X不存在，m是0并且叠氮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n是0到4并且R1和X不存在，并且m＝0。在一些实施例中，n是1，R1是苯基，X是O，m是2并且β-叠氮基乙氧基部分位于烷基侧链的对位。
含叠氮的氨基酸可从商业来源得到。举例来说，4-叠氮基苯丙氨酸可从凯姆英派国际公司(Chem-Impex International,Inc.)(伊利诺伊州伍德戴尔(Wood Dale,IL))获得。对于那些不可商购的含叠氮的氨基酸，可以使用所属领域的普通技术人员已知的标准方法，包括(但不限于)通过置换适当离去基团(包括(但不限于)卤基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基)或通过使适当保护的内酯开环，相对容易地制备出叠氮基。参见例如马彻的高等有机化学(第三版，1985，威立父子公司，纽约)。
E.氨基硫醇反应性基团
β-取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使其特别适用于通过形成噻唑烷来选择性修饰多肽和其它含有醛基的生物分子。参见例如J.邵和J.达恩,美国化学会志1995,117(14)3893-3899。在一些实施例中，可以将β-取代的氨基硫醇氨基酸并入白细胞介素10多肽中并且随后使其与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，水溶性聚合物、药物结合物或其它有效负载可以通过形成噻唑烷而与包含β-取代的氨基硫醇氨基酸的IL-10偶合。
F.其它反应性基团
可以并入本发明IL-10多肽中的其它反应性基团和非天然编码氨基酸(包括(但不限于)对氨基-苯丙氨酸)描述于以下专利申请案中(其全部以全文引用的方式并入本文中)：美国专利公开案第2006/0194256号、美国专利公开案第2006/0217532号、美国专利公开案第2006/0217289号、美国临时专利第60/755,338号；美国临时专利第60/755,711号；美国临时专利第60/755,018号；国际专利申请案第PCT/US06/49397号；WO 2006/069246；美国临时专利第60/743,041号；美国临时专利第60/743,040号；国际专利申请案第PCT/US06/47822号；美国临时专利第60/882,819号；美国临时专利第60/882,500号；和美国临时专利第60/870,594号。这些申请案还论述可能存在于PEG或其它聚合物上的用于结合的反应性基团(包括(但不限于)羟胺基(氨氧基))。
非天然氨基酸的细胞摄取
细胞对非天然氨基酸的摄取是在设计和选择(包括(但不限于))并入蛋白质中的非天然氨基酸时常常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度表明，这些化合物不太可能渗透细胞。天然氨基酸通过一系列基于蛋白质的转运系统吸收到真核细胞中。可以进行快速筛选来评估哪些非天然氨基酸(如果存在)被细胞吸收。参见例如毒性分析，例如在名称为“蛋白质阵列”的美国专利公开案第US 2004/0198637号(其以引用的方式并入本文中)；和刘D.R.(Liu,D.R.)和舒尔茨P.G.(1999)关于具有经扩充遗传代码的生物体的进化的进展(Progress toward the evolution of an organism withan expanded genetic code)美国国家科学院院刊(PNAS United States)96:4780-4785中。尽管通过各种分析容易地分析摄取，但设计适用于细胞摄取路径的非天然氨基酸的替代方案是为了提供在体内产生氨基酸的生物合成路径。
非天然氨基酸的生物合成
细胞中已经存在许多生物合成路径来产生氨基酸和其它化合物。虽然特定非天然氨基酸的生物合成方法可能不存在于自然界(包括(但不限于)细胞)中，但是本发明提供了此类方法。举例来说，在宿主细胞中，通过添加新的酶，或改变现存的宿主细胞路径，来任选产生非天然氨基酸的生物合成路径。其它新的酶任选地是天然存在酶或人工开发酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如名称为“体内并入非天然氨基酸(In vivo incorporation of unnatural amino acids)”的WO 2002/085923中的实例所提供)依赖于添加来自其它生物体的已知酶组合。可以通过用包含这些酶的基因的质粒转化细胞来将所述基因引入真核细胞中。当在细胞中表达时，这些基因提供合成所需化合物的酶促路径。任选添加的酶类型的实例提供于下文的实例中。其它酶序列可见于例如基因库(Genbank)中。也任选以相同方式将人工开发酶添加到细胞中。以此方式，利用细胞机器和细胞资源产生非天然氨基酸。
多种方法可用来产生用于生物合成路径中或用于发展现存路径中的新颖酶。举例来说，任选地使用包括(但不限于)如马克津公司(Maxygen,Inc.)所开发的递归重组(recursive recombination)(可在万维网maxygen.com上获得)来开发新颖酶和途径。参见例如施特默尔(1994),通过DNA改组使蛋白质快速体外进化(Rapid evolutionof a protein in vitro by DNA shuffling),自然370(4):389-391；和施特默尔,(1994),通过随机碎裂和重新组装进行DNA改组：分子进化的体外重组(DNA shuffling by randomfragmentation and reassembly:In vitro recombination for molecular evolution),美国国家 科学院院刊,91:10747-10751。类似地，任选地使用由杰能科(Genencor)开发的DesignPathTM(可在万维网genencor.com上获得)进行代谢路径工程改造，包括(但不限于)工程改造出在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的路径。这项技术使用新基因(包括(但不限于)通过功能性基因组学以及分子进化和设计所鉴别的那些基因)的组合在宿主生物体中重建现存路径。迪文萨公司(Diversa Corporation)(可在万维网diversa.com上获得)也提供有关迅速筛选基因和基因路径文库的技术(包括(但不限于)来建立新路径。
通常，利用本发明的工程改造的生物合成路径所产生的非天然氨基酸的浓度足以进行有效蛋白质生物合成(包括(但不限于)天然细胞量)，但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度。以此方式体内产生的典型浓度是约10mM到约0.05mM。一旦用包含用于产生特异性路径所需酶的基因的质粒转化细胞并且产生非天然氨基酸后，任选使用体内选择来针对核糖体蛋白质合成和细胞生长两者进一步优化非天然氨基酸的产生。
具有非天然氨基酸的多肽
并入非天然氨基酸可以实现多个目的，包括(但不限于)定制蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶目标位点的可接近性；靶向某一部分(包括(但不限于)用于蛋白质阵列)、添加生物活性分子、连接聚合物、连接放射性核种、调节血清半衰期、调节组织穿透率(例如肿瘤)、调节活性转运、调节组织、细胞或器官特异性或分布、调节免疫原性、调节蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白质可以具有增强的或甚至全新的催化或生物物理特性。举例来说，任选通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改变以下特性：毒性、生物分布、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应(包括(但不限于)共价或非共价)的能力等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物适用于(包括(但不限于))新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白质(包括(但不限于)抗体)以及(包括(但不限于))蛋白质结构和功能研究。参见例如多尔蒂(Dougherty),(2000)非天然氨基酸作为蛋白质结构和功能的探针(Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure andFunction),化学生物学新见(Current Opinion in Chemical Biology),4:645-652。
在本发明的一方面，组合物包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上)非天然氨基酸的蛋白质。这些非天然氨基酸可以相同或不同，包括(但不限于)在蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同位点可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同的非天然氨基酸。在另一方面，组合物包括所述蛋白质中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上非天然氨基酸的指定蛋白质，非天然氨基酸可以相同或不同(包括(但不限于)，所述蛋白质可以包括两种或两种以上不同类型的非天然氨基酸，或可以包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的指定蛋白质，非天然氨基酸可相同、不同，或为多个相同种类的非天然氨基酸与至少一个不同非天然氨基酸的组合。
具有至少一个非天然氨基酸的相关蛋白质或多肽是本发明的特征。本发明还包括使用本发明组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包括(但不限于)医药学上可接受的赋形剂)也可以与蛋白质一起存在。
通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的相关蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常将包括真核翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰不是由原核细胞进行的。举例来说，翻译后修饰包括(包括(但不限于))乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等。在一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键使寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))与天冬酰胺连接。参见表1，其列出了真核蛋白质的N连接寡糖的一些实例(也可存在其它未显示的残基)。在另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键或者GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。
表1：通过GlcNAc键连接的寡糖的实例
在另一方面，翻译后修饰包括前体(包括(但不限于)降血钙素前体、降血钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原(preproparathyroid hormone)、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工，组装成多亚单位蛋白或大分子组装物，翻译到细胞中的另一位点中(包括(但不限于)翻译到例如内质网、高尔基体(Golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等细胞器中，或通过分泌路径)。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、多组氨酸标签、GST融合体等。
非天然氨基酸的一个优点在于，其提供可以用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可以在真核或非真核细胞体内进行或在体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可以通过亲核-亲电反应进行。当前用于选择性修饰蛋白质的大部分反应涉及亲核与亲电反应搭配物之间的共价键形成，包括(但不限于)α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况中，选择性是由蛋白质中亲核残基的数量和可接近性决定。在本发明的蛋白质中，可以使用其它选择性更强的反应，例如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的体外和体内反应。参见例如科尼什等人,(1996)美国化学会志,118:8150-8151；马哈尔等人,(1997)科学,276:1125-1128；王等人,(2001)科学292:498-500；秦等人,(2002)美国化学 会志124:9026-9027；秦等人,(2002)国家科学院院刊99:11020-11024；王等人,(2003)国家科学院院刊100:56-61；张等人,(2003)生物化学42:6735-6746；和秦等人,(2003)科学301:964-7，其全部以引用的方式并入本文中。这使得能够用包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子在内的多种试剂选择性标记几乎任何蛋白质。还参见名称为“糖蛋白的合成(Glycoprotein synthesis)”的美国专利第6,927,042号，其以引用的方式并入本文中。翻译后修饰(包括(但不限于)通过叠氮基氨基酸修饰)也可以通过施陶丁格尔接合(Staudinger ligation)(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。参见例如柯克等人,(2002)通过施陶丁格尔接合将叠氮并入重组蛋白中以进行化学选择性修饰(Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselectivemodification by the Staudinger ligation),国家科学院院刊99:19-24。
本发明提供另一种选择性修饰蛋白质的高效方法，其涉及响应于选择密码子而将(包括(但不限于))含叠氮或炔部分的非天然氨基酸以遗传方式并入蛋白质中。可以，可以通过包括(但不限于)胡伊斯根[3+2]环加成反应(例如参见派德沃A.,综合有 机合成,第4卷,(1991)特罗斯特B.M.编,培格曼出版社,牛津,第1069-1109页；和胡伊斯根R.,1.3-偶极环加成化学,(1984)派德沃A.编,威立出版社,纽约,第1-176页)分别用包括(但不限于)炔基或叠氮衍生物来修饰这些氨基酸侧链。因为此方法涉及环加成而非亲核取代，所以可以极高的选择性修饰蛋白质。所述反应可以在室温下，于水性条件中，通过将催化量的Cu(I)盐添加到反应混合物中以优良的区位选择性(1,4>1,5)进行。参见例如托尔诺等人,(2002)有机化学杂志67:3057-3064；和罗斯托夫采夫等人,(2002)应用化学国际版41:2596-2599。可以使用的另一种方法是用四半胱氨酸基元交换双砷化合物上的配体，参见例如格里芬(Griffin)等人,(1998)科学281:269-272。
可以通过[3+2]环加成反应添加到本发明蛋白质中的分子包括具有叠氮基或炔基衍生物的几乎任何分子。分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇衍生物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、多核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。这些分子可以分别添加到具有炔基(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)或叠氮基(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)的非天然氨基酸中。
IV.体内产生包含非基因编码氨基酸的白细胞介素10
本发明的IL-10多肽可以使用经修饰的tRNA和tRNA合成酶添加到或取代不在天然存在系统中编码的氨基酸来体内产生。
使用不在天然存在系统中编码的氨基酸的产生tRNA和tRNA合成酶的方法描述于例如美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中，其以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生一种使内源性合成酶和tRNA独立于翻译系统起作用(因此有时称为“正交”)的翻译机器。通常，翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS优先使翻译系统中具有至少一个非天然存在氨基酸的O-tRNA氨酰基化，并且O-tRNA识别至少一个不被所述系统中其它tRNA识别的选择密码子。因此，翻译系统响应于所编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入所述系统中产生的蛋白质中，由此将氨基酸“取代”入所编码多肽的某一位置中。
此项技术中已经描述多种用于将特定合成氨基酸插入多肽中的正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，并且其一般都适用于本发明中。举例来说，酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶描述于王L.(Wang,L)等人,美国国家科学院院刊100:56-61(2003)和张Z.(Zhang,Z.)等人,生物化学42(22):6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分由多核苷酸序列编码，并且包括揭示于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号(各自以引用的方式并入本文中)中的氨基酸序列。用于与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中，其以引用的方式并入本文中。O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶对的其它实例描述于WO 2005/007870、WO2005/007624和WO 2005/019415中。
叠氮化物特异性O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶系统的实例描述于秦J.W.等人,美国化学会志124:9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的例示性O-RS序列包括(但不限于)如美国专利第7,083,970号(其以引用的方式并入本文中)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO:46-48和61-64。适用于本发明中的例示性O-tRNA序列包括(但不限于)如美国专利第7,083,970号(其以引用的方式并入本文中)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:1-3。对特定非天然编码氨基酸具有特异性的O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶对的其它实例描述于美国专利第7,045,337号中，其以引用的方式并入本文中。在酿酒酵母中并入含酮基氨基酸与含叠氮基氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于秦J.W.等人,科学301:964-967(2003)中。
已报导若干种其它正交对。已经描述来源于酿酒酵母tRNA的和合成酶的麸酰胺酰基(参见例如刘D.R.和舒尔茨P.G.(1999)美国国家科学院院刊96:4780-4785)、天冬氨酰基(参见例如帕斯纳克M.(Pastrnak,M.)等人,(2000)瑞士化学学报 (Helv.Chim.Acta)83:2277-2286)和酪氨酰基(参见例如奥诺S.(Ohno S.)等人,(1998)生物化学杂志(日本东京)(J.Biochem.(Tokyo.Jpn.))124:1065-1068；和科瓦尔A.K等人,(2001)美国国家科学院院刊98:2268-2273)系统以用于将非天然氨基酸潜在并入大肠杆菌中。已经描述来源于大肠杆菌麸酰胺酰基(参见例如科瓦尔A.K.等人,(2001)美国 国家科学院院刊98:2268-2273)和酪氨酰基(参见例如爱德华兹H.(Edwards,H.)和舒密尔P.(Schimmel,P.)(1990)分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)10:1633-1641)合成酶的系统以用于酿酒酵母中。大肠杆菌酪氨酰基系统已经用于将3-碘-L-酪氨酸体内并入哺乳动物细胞中。参见坂本K.(Sakamoto,K.)等人,(2002)核酸研究30:4692-4699。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然编码氨基酸的特定密码子。尽管可以使用任何密码子，但通常需要选择在表达O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中很少或从未使用的密码子。举例来说，例示性密码子包括无义密码子，例如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石)；四个或四个以上碱基的密码子；和很少或未使用过的其它天然三碱基密码子。
可以使用此项技术中已知的诱变方法(包括(但不限于)位点特异性诱变、盒式诱变、限制选择诱变等)将特定的选择密码子引入IL-10编码序列的适当位置中。
产生可以用于并入非天然编码氨基酸的蛋白质生物合成机器的组分(例如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于王L.(Wang,L.)等人,科学292:498-500(2001)；秦J.W.等人,美国化学会志124:9026-9027(2002)；张Z.等人,生物化学42:6735-6746(2003)中。用于体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利第7,045,337号中，其以引用的方式并入本文中。用于选择用于生物体的体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中，其以引用的方式并入本文中。PCT公开案第W0 04/035743号，名为“酮基氨基酸位点特异性并入蛋白质中(Site Specific Incorporation of Keto Amino Acidsinto Proteins)”(以全文引用的方式并入本文中)，描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。名称为“扩充真核遗传密码(Expanding the Eukaryotic Genetic Code)”的PCT公开案第WO 04/094593号(其以全文引用的方式并入本文中)描述用于将非天然编码氨基酸并入真核宿主细胞中的正交RS和tRNA对。
产生至少一个重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含：(a)从第一生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(任选突变)RS文库，所述第一生物体包括(但不限于)原核生物体，例如詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等；或真核生物体；(b)在RS(任选地突变RS)文库中选择(和/或筛选)在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的成员，从而提供活性(任选突变)RS集合；和/或(c)在集合中选择(任选地通过阴性选择)在不存在非天然编码氨基酸情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(包括(但不限于)突变RS)，从而得到至少一种重组O-RS；其中所述至少一种重组O-RS在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化。
在一个实施例中，RS是无活性RS。可以通过使活性RS突变来产生无活性RS。举例来说，可以通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上氨基酸突变成不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生无活性RS。
可以使用此项技术中已知的各种技术产生突变RS文库，所述技术包括(但不限于)基于蛋白质三维RS结构的合理设计，或在随机或合理设计技术中RS核苷酸的诱变。举例来说，可以通过位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构建体、合理设计以及本文中所述或此项技术中已知的其它方法产生突变RS。
在一个实施例中，在RS(任选地突变RS)文库中选择(和/或筛选)活性成员(包括(但不限于)在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的成员)包括：将阳性选择或筛选标记物(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(任选突变)RS文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛选标记物包含至少一个选择密码子，包括(但不限于)琥珀、赭石或蛋白石密码子；使多个细胞在存在选择剂的情况下生长；鉴别在存在选择剂和/或筛选剂的情况下通过抑制阳性选择或筛选标记物中的至少一个选择密码子而存活(或显示特异性反应)的细胞，从而得到含有活性(任选突变)RS集合的经阳性选择的细胞子组。任选地可以改变选择剂和/或筛选剂的浓度。
在一方面，阳性选择标记物是氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicolacetyltransferase；CAT)基因，并且在CAT基因中，选择密码子是琥珀终止密码子。阳性选择标记物任选地是β-内酰胺酶基因，并且在β-内酰胺酶基因中，选择密码子是琥珀终止密码子。在另一方面，阳性筛选标记物包含荧光或发光筛选标记物，或基于亲和力的筛选标记物(包括(但不限于)细胞表面标记物)。
在一个实施例中，在集合中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(任选突变)包括：将具有来自阳性选择或筛选的活性(任选突变)RS集合的阴性选择或筛选标记物引入第二生物体的多个细胞中，其中所述阴性选择或筛选标记物包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，包括(但不限于)氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因)；和鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛选剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛选响应，但在未补充有非天然编码氨基酸和选择剂或筛选剂的第二培养基中不能存活或不显示特异性响应的细胞，从而得到具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选细胞。举例来说，在测定适当O-RS重组体时，CAT鉴别方案任选充当阳性选择和/或阴性筛选。举例来说，在存在或不存在一或多个非天然编码氨基酸的情况下，任选在含有CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆集合。因此，仅在含有非天然编码氨基酸的板上生长的集落被认为含有重组O-RS。在一方面，改变选择(和/或筛选)剂的浓度。在一些方面中，第一生物体与第二生物体不同。因此，第一和/或第二生物体任选地包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛选标记物包含荧光或发光筛选标记物或基于亲和力的筛选标记物。
在另一个实施例中，在集合中筛选或选择(包括(但不限于)阴性选择)活性(任选突变)RS包括：从阳性选择步骤(b)分离活性突变RS的集合；将阴性选择或筛选标记物和活性(任选地突变)RS的集合引入第二生物体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记物包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)包含至少一个选择密码子的毒性标记基因，其包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因)；和鉴别在未补充有非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛选响应、但在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中不能存活或不显示特异性筛选响应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选细胞，其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码氨基酸具特异性。在一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。所述实施例任选可以包括：其中所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子的情形，和其中第一与第二生物体不同(包括(但不限于)，每一个生物体任选是(包括(但不限于))原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)的情形。另外，一些方面包括其中阴性选择标记物包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情形。其它方面包括其中筛选标记物任选包含荧光或发光筛选标记物或基于亲和力的筛选标记物的情形。在本文中的实施例中，筛选和/或选择任选包括筛选和/或选择严格度的变化。
在一个实施例中，产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可以进一步包含：(d)分离所述至少一种重组O-RS；(e)产生来源于所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS(任选突变)；和(f)重复步骤(b)和(c)直到获得包含优先使O-tRNA氨酰基化的能力的突变O-RS为止。任选重复步骤(d)到(f)，包括(但不限于)至少约两次。在一方面，可以通过诱变(包括(但不限于)随机诱变、位点特异性诱变、重组或其组合)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。
在上述方法中，选择/筛选步骤(包括(但不限于)阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)两者)的严格度任选包括改变选择/筛选严格度。在另一个实施例中，阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)两者包含使用报告基因，其中所述报告基因通过荧光活化细胞分选法(FACS)检测，或其中所述报告基因通过发光检测。报告基因任选展示于细胞表面上、噬菌体展示上等，并且是根据涉及非天然编码氨基酸或其类似物的亲和力或催化活性来选择。在一个实施例中，突变合成酶展示于细胞表面上、噬菌体展示上等。
用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括：(a)从第一生物体产生来源于至少一种tRNA(包括(但不限于)抑制子tRNA)的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下，通过来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(任选突变)tRNA，从而得到tRNA(任选突变)的集合；和(c)在tRNA(任选突变)集合中选择或筛选通过所引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而得到至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子，并且不由来自第二生物体的RS有效识别，并且由O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA是抑制子tRNA，和/或包含具有天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或是无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA的正交性得到改良。应了解，在一些实施例中，无需修饰即可任选将O-tRNA从第二生物体引入第一生物体中。在各种实施例中，第一生物体与第二生物体相同或不同，并且任选选自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA任选经非天然编码氨基酸氨酰基化，其中所述非天然编码氨基酸是在体内天然生物合成的，或是通过基因操作生物合成的。任选将非天然编码氨基酸添加到至少第一或第二生物体的生长培养基中。
一方面，在文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选通过氨酰基-tRNA合成酶氨酰基化的(任选突变)tRNA(步骤(b))包括：将毒性标记基因和(任选突变)tRNA文库引入第二生物体的多个细胞中，其中毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(static agent)的基因，或生物体必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子)；和选择存活细胞，其中所述存活细胞含有包含至少一个正交tRNA或非功能性tRNA的(任选突变)tRNA的集合。举例来说，可以使用比较比率细胞密度分析(comparison ratio cell density assay)来选择存活细胞。
在另一方面，毒性标记基因可以包括两个或两个以上选择密码子。在所述方法的另一个实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因任选可以包括两个或两个以上琥珀密码子。
在一个实施例中，在(任选突变)tRNA的集合中选择或筛选通过所引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员可以包括：将阳性选择或筛选标记基因以及O-RS和(任选突变)tRNA的集合引入第二生物体的多个细胞中，其中阳性标记基因包含抗药性基因(包括(但不限于)β-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，例如至少一个琥珀终止密码子)或生物体必需的基因，或导致毒性剂解毒的基因；和鉴别在存在选择剂或筛选剂(包括(但不限于)抗生素)的情况下生长的存活或经筛选细胞，从而得到具有至少一种重组tRNA的细胞集合，其中所述至少一种重组tRNA通过O-RS氨酰基化并且响应于至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，选择剂和/或筛选剂的浓度不同。
提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。所述方法包括：(a)由第一生物体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中阴性选择或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下通过来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(任选突变)tRNA，从而提供(任选突变)tRNA集合；(c)在(任选突变)tRNA集合中选择或筛选通过所引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子，不由第二生物体的RS有效识别，并由O-RS优先氨酰基化。所述方法还包括(d)从第三生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(任选突变)RS的文库；(e)在所述突变RS文库中选择或筛选在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下优先使至少一种重组O-tRNA氨酰基化的成员，从而得到活性(任选突变)RS的集合；和(f)在所述集合中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使至少一种重组O-tRNA氨酰基化的活性(任选突变)RS，从而得到至少一个特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一个特异性O-tRNA/O-RS对包含对所述非天然编码氨基酸具有特异性的至少一种重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可以包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS对，例如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等。另外，所述方法包括其中第一生物体与第三生物体相同(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌)的情形。
本发明中还包括选择用于第二生物体的体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。所述方法包括：将标记基因、tRNA和从第一生物体分离或获得的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入第二生物体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入第二生物体的复制细胞组(duplicate cell set)中；和选择在复制细胞组中不能存活而在第一组中存活的细胞，或筛选显示特异性筛选响应但在复制细胞组中不能提供所述响应的细胞，其中所述第一组与复制细胞组都是选择剂或筛选剂存在下生长，其中存活或经筛选细胞包含用于第二生物体的体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括体内互补分析。选择剂或筛选剂的浓度可以变化。
本发明的生物体包含多种生物体和多种组合。举例来说，本发明方法中的第一生物体与第二生物体可以相同或不同。在一个实施例中，生物体任选是原核生物体，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者，生物体任选包含真核生物体，包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物，例如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。在另一个实施例中，第二生物体是原核生物体，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、嗜盐菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者，第二生物体可以是真核生物体，包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等。在各个实施例中，第一生物体与第二生物体不同。
V.白细胞介素10中非天然存在氨基酸的位置
本发明涵盖将一或多个非天然存在氨基酸并入IL-10中。一或多个非天然存在氨基酸可以并入不破坏多肽活性的特定位置。这可以通过进行“保守”取代实现，包括(但不限于)用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸；用大体积氨基酸取代大体积氨基酸；用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸，和/或将非天然存在氨基酸插入非活性所需的位置中。
多种生物化学和结构方法可以用于选择在IL-10内所需的用非天然编码氨基酸取代的位点。所属领域的普通技术人员易于了解，多肽链中的任何位置都适合于选择用于并入非天然编码氨基酸，并且选择可以建立在合理设计的基础上或者通过随机选择以实现任何或非特别的所需目的。所需位点的选择可以用于产生具有任何所需性质或活性的IL-10分子(包括(但不限于)激动剂、超激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂)、二聚物或多聚物形成、与天然分子相比活性或性质无改变，或操纵多肽的任何物理或化学性质(例如溶解性、聚集或稳定性)。举例来说，可以使用此项技术中已知的点突变分析、丙氨酸扫描、生物活性的饱和诱变和筛选、或同源物扫描方法鉴别出多肽中关于IL-10的生物活性所需的位置。可以用于鉴别用于IL-10修饰的残基的其它方法包括(但不限于)序列分析(鲍威(Bowie)和艾森伯格(Eisenberg),科学253(5016):164-70,(1991))、旋转异构体文库选择(达希亚特(Dahiyat)和梅奥(Mayo),蛋白质科学(Protein Sci)5(5):895-903(1996)；达希亚特和梅奥,科学278(5335):82-7(1997)；戴佳雷(Desjarlais)和汉德尔(Handel),蛋白质科学(Protein Science)4:2006-2018(1995)；哈伯里(Harbury)等人,美国国家科学院院刊(PNAS USA)92(18):8408-8412(1995)；科诺(Kono)等人,蛋白质：结构，功能和遗传(Proteins:Structure,Function and Genetics)19:244-255(1994)；海林伽(Hellinga)和理查兹(Richards),美国国家科学院院刊91:5803-5807(1994))；和残基对电位(琼斯(Jones),蛋白质科学3:567-574,(1994))，和使用蛋白质设计技术的合理设计。(参见美国专利第6,188,965号、第6,269,312号、第6,403,312号；WO98/47089，其都以引用的方式并入本文中)。取决于期望寻求的多肽活性，除经丙氨酸或同系物扫描诱变鉴别为对生物活性至关重要的残基外的残基可以成为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。或者，再次取决于期望寻求的多肽活性，鉴别为对生物活性至关重要的位点也可以成为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。另一种替代方法是，用非天然编码氨基酸在多肽链上的各个位置中简单地进行连续取代，并观测对多肽活性的影响。所属领域的普通技术人员易于了解，选择任何多肽中供非天然氨基酸取代的位置的任何方式、技术或方法都适用于本发明中。
也可以检查含有缺失的IL-10多肽突变体的结构和活性，以确定有可能耐受用非天然编码氨基酸进行的取代的蛋白质区域。以类似方式，可以使用蛋白酶消化和单克隆抗体来鉴别IL-10中负责结合IL-10受体的区域。一旦去除了可能无法耐受非天然编码氨基酸取代的残基后，就可以检查所建议的取代在各剩余位置处的影响。模型可以从其它白细胞介素家族成员和白细胞介素受体的三维晶体结构产生。蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB；可以在万维网rcsb.org上获得)是一个含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的集中式数据库。如果无法得到三维结构数据，那么可建立研究多肽二级结构和三级结构的模型。因此，所属领域的普通技术人员可以容易地鉴别出可经非天然编码氨基酸取代的氨基酸位置。
对IL-10、IL-10变异体或IL-10家族成员的晶体结构和其与IL-10受体的相互作用的检查可以指示哪些氨基酸残基具有溶剂可完全或部分进入的侧链。这些位置的非天然编码氨基酸的侧链可以远离蛋白质表面向外伸入溶剂中。
表2
(介面)
#1J7V蛋白质数据库(pdb)链L
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
SER 11 L 0.000000 0.000000 0.000000
CYS 12 L 0.000000 0.000000 0.000000
THR 13 L 0.000000 0.000000 0.000000
HIS 14 L 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 15 L 0.007518 0.020673 0.000000
PRO 16 L 0.093803 0.164155 0.000000
GLY 17 L 0.353119 0.353119 0.000000
ASN 18 L 0.139966 0.251896 0.028036
LEU 19 L 0.169402 0.245428 0.093376
PRO 20 L 0.799050 0.684111 0.952303
ASN 21 L 0.501696 0.488087 0.515306
MET 22 L 0.116340 0.186363 0.046317
LEU 23 L 0.451851 0.380874 0.522828
ARG 24 L 1.470070 0.519160 2.013448
ASP 25 L 0.195835 0.197055 0.194614
LEU 26 L 0.091460 0.135631 0.047290
ARG 27 L 0.920474 0.334936 1.255067
ASP 28 L 0.387152 0.230737 0.543567
ALA 29 L 0.037002 0.041801 0.017806
PHE 30 L 0.182468 0.063702 0.250334
SER 31 L 0.304936 0.217443 0.479924
ARG 32 L 0.014793 0.020245 0.011678
VAL 33 L 0.036990 0.064732 0.000000
LYS 34 L 0.864692 0.373456 1.257681
THR 35 L 0.618925 0.508963 0,765541
PHE 36 L 0.112351 0.279861 0.016631
PHE 37 L 0.155295 0.367533 0.034017
GLN 38 L 0.971352 0.761795 1.138998
MET 39 L 0.969231 0.831176 1.107285
LYS 40 L 0.232340 0.455062 0.054162
ASP 41 L 0.659397 0.749895 0.568899
GLN 42 L 1.292422 1.154134 1.403052
LEU 43 L 1.225729 1.527391 0.924068
ASP 44 L 2.763318 2.442149 3.084486
ASN 45 L 1.453248 1.613277 1.293220
LEU 46 L 1.314566 1.296454 1.332678
LEU 47 L 0.414936 0.598988 0.230884
LEU 48 L 0.367214 0.469920 0.264509
LYS 49 L 0.453718 0.235033 0.628665
GLU 50 L 0.319103 0.161101 0.445505
SER 51 L 0.011671 0.017507 0.000000
LEU 52 L 0.005643 0.004508 0.006777
LEU 53 L 0.095962 0.022255 0.169669
GLU 54 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASP 55 L 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 56 L 0.000000 0.000000 0.000000
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
LYS 57 L 0.048560 0.000000 0.087408
GLY 58 L 0.000000 0.000000 0.000000
TYR 59 L 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 60 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLY 61 L 0.000000 0.000000 0.000000
CYS 62 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 63 L 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 64 L 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 65 L 0.000000 0.000000 0.000000
SER 66 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 67 L 0.000000 0.000000 0.000000
MET 68 L 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 69 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 70 L 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 71 L 0.000000 0.000000 0.000000
TYR 72 L 0.007091 0.000000 0.010636
LEU 73 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 74 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 75 L 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 76 L 0.000000 0.000000 0.000000
MET 77 L 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 78 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 79 L 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 80 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 81 L 0.000000 0.000000 0,000000
ASN 82 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 83 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASP 84 L 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 85 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASP 86 L 0.000000 0.000000 0.000000
TLE 87 L 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 88 L 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 89 L 0.000000 0.000000 0.000000
HIS 90 L 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 91 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASN 92 L 0.000000 0.000000 0.000000
SER 93 L 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 94 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLY 95 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 96 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASN 97 L 0.001106 0.000000 0.002211
LEU 98 L 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 99 L 0.000000 0,000000 0.000000
THR 100 L 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 101 L 0.002789 0.000000 0.005579
ARG 102 L 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 103 L 0.000000 0.000000 0.000000
ARG 104 L 0.000000 0.000000 0.000000
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
LEU 105 L 0.000000 0.000000 0.000000
ARG 106 L 0.000000 0.000000 0.000000
ARG 107 L 0.000000 0.000000 0.000000
CYS 108 L 0.000000 0.000000 0.000000
HIS 109 L 0.000000 0.000000 0.000000
ARG 110 L 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 111 L 0.012293 0.000000 0.019317
LEU 112 L 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 113 L 0.000000 0.000000 0.000000
CYS 114 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 115 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASN 116 L 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 117 L 0.000000 0.000000 0.000000
SER 118 L 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 119 L 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 120 L 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 121 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 122 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 123 L 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 124 L 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 125 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASN 126 L 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 127 L 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 128 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASN 129 L 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 130 L 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 131 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 132 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 133 L 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 134 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLY 135 L 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 136 L 0.000000 0.000000 0.000000
TYR 137 L 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 138 L 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 139 L 0.000000 0.000000 0.000000
MET 140 L 0.000000 0.000000 0.000000
SER 141 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 142 L 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 143 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASP 144 L 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 145 L 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 146 L 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 147 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASN 148 L 0.000000 0.000000 0.000000
TYR 149 L 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 150 L 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 151 L 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 152 L 0.000000 0,000000 0.000000
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
TYR 153 L 0.000000 0.000000 0.000000
MET 154 L 0.000000 0.000000 0.000000
THR 155 L 0.000000 0.000000 0.000000
MET 156 L 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 157 L 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 158 L 0.000000 0.000000 0.000000
ARG 159 L 0.000000 0.000000 0.000000
ASN 160 L 0.000000 0.000000 0.000000
#1J7V蛋白质数据库(pdb)链R
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
GLY 2 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 3 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 4 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 5 R 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 6 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 7 R 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 8 R 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 9 R 0.004921 0.008612 0.000000
SER 10 R 0.008383 0.000000 0.025149
VAL 11 R 0.003845 0.006729 0.000000
TRP 12 R 0.000733 0.000000 0.001026
PHE 13 R 0.000467 0.000000 0.000733
GLU 14 R 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 15 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 16 R 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 17 R 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 18 R 0.000000 0.000000 0.000000
HIS 19 R 0.000000 0.000000 0.000000
HIS 20 R 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 21 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 22 R 0.000000 0.000000 0.000000
HIS 23 R 0.000000 0.000000 0.000000
TRP 24 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 25 R 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 26 R 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 27 R 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 28 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 29 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 30 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 31 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 32 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 33 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 34 R 0.000000 0.000000 0.000000
CYS 35 R 0.000000 0.000000 0.000000
TYR 36 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 37 R 0.000000 0.000000 0.000000
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
VAL 38 R 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 39 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 40 R 0.008974 0.017948 0.000000
LEU 41 R 0.118100 0.055922 0.180279
ARG 42 R 0.105825 0.150116 0.080515
TYR 43 R 0.694558 0.337044 0.873315
GLY 44 R 0.910751 0.910751 0.000000
ILE 45 R 0.627233 0.584169 0.670298
GLU 46 R 1.146964 0.685855 1.515851
SER 47 R 0.198234 0.210561 0.173579
TRP 48 R 0.107046 0.063506 0.124462
ASN 49 R 0.001578 0.003155 0.000000
SER 50 R 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 51 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 52 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 53 R 0.000000 0.000000 0.000000
CYS 54 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 55 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 56 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 57 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 58 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 59 R 0.000000 0.000000 0.000000
TYR 60 R 0.000000 0.000000 0.000000
ASP 61 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 62 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 63 R 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 64 R 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 65 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 66 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 67 R 0.000000 0.000000 0.000000
ASP 68 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 69 R 0.000642 0.000000 0.001283
TYR 70 R 0.000000 0.000000 0.000000
HIS 71 R 0.061682 0.111998 0.028138
SER 72 R 0.091447 0.121715 0.030911
ASN 73 R 0.544865 0.191960 0.897769
GLY 74 R 0.083881 0.083881 0.000000
TYR 75 R 0.026164 0.074789 0.001851
ARG 76 R 0.393388 0.044664 0.509630
ALA 77 R 0.010303 0.012878 0.000000
ARG 78 R 0,016650 0.000000 0.026164
VAL 79 R 0.000000 0.000000 0.000000
ARG 80 R 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 81 R 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 82 R 0.000000 0.000000 0.000000
ASP 83 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLY 84 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 85 R 0.000000 0.000000 0.000000
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
ARG 86 R 0.000000 0.000000 0.000000
HIS 87 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 88 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 89 R 0.000000 0.000000 0.000000
TRP 90 R 0.007398 0.021200 0.001877
THR 91 R 0.009151 0.014066 0.002599
VAL 92 R 0.173257 0.119284 0.245221
THR 93 R 0.185077 0.249417 0.099290
ASN 94 R 0.833185 0.790255 0.876114
THR 95 R 0.617999 0.535192 0.728410
ARG 96 R 0.496707 0.315257 0.600393
PHE 97 R 0.024619 0.058425 0.005302
SER 98 R 0.091515 0.054492 0.165562
VAL 99 R 0.061438 0.065295 0.056296
ASP 100 R 0.399041 0.210186 0.587896
GLU 101 R 0.124865 0.047342 0.186884
VAL 102 R 0.006070 0.007978 0.003526
THR 103 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 104 R 0.008256 0.000000 0.016512
THR 105 R 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 106 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLY 107 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 108 R 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 109 R 0.000000 0.000000 0.000000
ASN 110 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 111 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 112 R 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 113 R 0.000000 0.000000 0.000000
HIS 114 R 0.000000 0.000000 0.000000
ASN 115 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLY 116 R 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 117 R 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 118 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 119 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLY 120 R 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 121 R 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 122 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 123 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 124 R 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 125 R 0.000000 0.000000 0.000000
ARG 126 R 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 127 R 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 128 R 0.000000 0.000000 0.000000
MET 129 R 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 130 R 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 131 R 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 132 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 133 R 0.000000 0.000000 0.000000
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
ASP 134 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 135 R 0.000000 0.000000 0.000000
TYR 136 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 137 R 0.000000 0.000000 0,000000
SER 138 R 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 139 R 0.002621 0.005241 0.000000
PHE 140 R 0.009849 0.002155 0.014245
SER 141 R 0.004149 0.000000 0.012446
HIS 142 R 0.105874 0.085034 0.119768
PHE 143 R 0.690724 0.164059 0.991676
ARG 144 R 0.010641 0.029262 0.000000
GLU 145 R 0.127290 0.023191 0.210569
TYR 146 R 0.002674 0.008021 0.000000
GLU 147 R 0.018077 0.001692 0.031185
ILE 148 R 0.000000 0.000000 0.000000
ALA 149 R 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 150 R 0.000000 0.000000 0.000000
ARG 151 R 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 152 R 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 153 R 0.000000 0.000000 0.000000
PRO 154 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLY 155 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 156 R 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 157 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 158 R 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 159 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 160 R 0.000000 0.000000 0.000000
HIS 161 R 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 162 R 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 163 R 0.030200 0.000000 0.054359
VAL 164 R 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 165 R 0.063331 0.000000 0.113996
HIS 166 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 167 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 168 R 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 169 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 170 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 171 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 172 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 173 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 174 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLY 175 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 176 R 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 177 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLY 178 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 179 R 0.000000 0.000000 0.000000
PHE 180 R 0.000000 0.000000 0.000000
CYS 181 R 0.000000 0.000000 0.000000
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
VAL 182 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLN 183 R 0.000000 0.000000 0.000000
VAL 184 R 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 185 R 0.024713 0.007881 0.038180
PRO 186 R 0.010581 0.018517 0.000000
SER 187 R 0.045593 0.039401 0.057978
VAL 188 R 0.234056 0.293482 0.154821
ALA 189 R 0.862562 0.861122 0.868323
SER 190 R 1.130095 1.201888 0.986511
ARG 191 R 0.483602 0.792993 0.306807
SER 192 R 1.086477 0.833400 1.592632
ASN 193 R 0.239389 0.270317 0.208461
LYS 194 R 0.054360 0.086540 0.028615
GLY 195 R 0.026168 0.026168 0.000000
MET 196 R 0.000000 0.000000 0.000000
TRP 197 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 198 R 0.000000 0.000000 0.000000
LYS 199 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 200 R 0.000000 0.000000 0.000000
GLU 201 R 0.000000 0.000000 0.000000
CYS 202 R 0.000000 0.000000 0.000000
ILE 203 R 0.000000 0.000000 0.000000
SER 204 R 0.000000 0.000000 0.000000
LEU 205 R 0.000000 0.000000 0.000000
THR 206 R 0.000000 0.000000 0.000000
(配体)
#1J7V蛋白质数据库(pdb)链L
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
SER 11 2.668819 2.135076 3.736307
CYS 12 1.286793 1.480967 0.898445
THR 13 1.463421 1.393887 1.556134
HIS 14 1.796586 1.172110 2.212904
PHE 15 0.578452 0.950056 0.366107
PRO 16 1.517905 1.510672 1.527550
GLY 17 1.532155 1.532155 0.000000
ASN 18 1.079419 1.056339 1.102498
LEU 19 0.586440 0.706408 0.466472
PRO 20 1.313813 1.134772 1.552534
ASN 21 1.220440 0.973003 1.467876
MET 22 0.466395 0.488861 0.443929
LEU 23 0.888898 0.698772 1.079024
ARG 24 1.922777 0.922908 2.494131
ASP 25 0.717002 0.552445 0.881559
LEU 26 0.383487 0.395023 0.371951
ARG 27 1.383998 0.711420 1.768328
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
ASP 28 0.990740 0.751796 1.229684
ALA 29 0.453599 0.474240 0.371036
PHE 30 0.628779 0.460106 0.725163
SER 31 1.011292 0.865535 1.302805
ARG 32 0.806794 0.650812 0.895927
VAL 33 0.422460 0.522164 0.289522
LYS 34 1.305123 0.838478 1.678439
THR 35 1.311713 1.095135 1.600484
PHE 36 0.755051 0.918567 0.661613
PHE 37 0.556478 0.930516 0.342741
GLN 38 1.280885 1.142496 1.391597
MET 39 1.798439 1.485713 2.111165
LYS 40 1.340953 1.475402 1.233395
ASP 41 1.431879 1.501008 1.362749
GLN 42 2.476802 2.366161 2.565315
LEU 43 2.585281 2.302930 2.867632
ASP 44 3.185470 2.936398 3.434541
ASN 45 2.482035 2.351421 2.612649
LEU 46 2.157026 2.257803 2.056250
LEU 47 1.932883 1.909029 1.956737
LEU 48 1.388941 1.465104 1.312777
LYS 49 1.904916 1.356933 2.343302
GLU 50 1.808126 1.293311 2.219978
SER 51 1.261530 1.133966 1.516658
LEU 52 0.693897 0.803492 0.584302
LEU 53 1.272105 1.016377 1.527833
GLU 54 1.496030 1.127321 1.790997
ASP 55 0.810308 0.801294 0.819322
PHE 56 0.664902 0.822943 0.574593
LYS 57 1.695733 1.273692 2.033365
GLY 58 1.255539 1.255539 0.000000
TYR 59 3.297314 1.878561 4.006690
LEU 60 1.447981 1.073555 1.822407
GLY 61 0.575645 0.575645 0.000000
CYS 62 0.517097 0.497869 0.555552
GLN 63 0.991195 0.628450 1.281391
ALA 64 0.528680 0.516157 0.578769
LEU 65 0.383710 0.367759 0.399661
SER 66 0.422077 0.410970 0.444290
GLU 67 0.919259 0.539171 1.223329
MET 68 0.517117 0.455812 0.578421
ILE 69 0.280298 0.330676 0.229920
GLN 70 0.735589 0.545053 0.888017
PHE 71 0.817494 0.682048 0.894892
TYR 72 0.599632 0.433456 0.682720
LEU 73 0.348970 0.426877 0.271063
GLU 74 1.227542 0.909559 1.481928
GLU 75 1.197304 0.939799 1.403308
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
VAL 76 0.733566 0.710232 0.764679
MET 77 0.267866 0.340267 0.195464
PRO 78 0.666386 0.680271 0.647872
GLN 79 1.262792 0.975861 1.492337
ALA 80 0.550799 0.588838 0.398641
GLU 81 0.515543 0.625769 0.427363
ASN 82 1.477584 1.173918 1.781250
GLN 83 1.549593 1.293584 1.754401
ASP 84 1.074848 0.926409 1.223287
PRO 85 1.338091 1.107253 1.645875
ASP 86 1.532618 1.141797 1.923440
ILE 87 0.484680 0.545719 0.423642
LYS 88 0.817550 0.598544 0.992754
ALA 89 0.940420 0.840139 1.341545
HIS 90 0.801894 0.504257 1.000319
VAL 91 0,196489 0.231498 0.149810
ASN 92 0.734418 0.476959 0.991877
SER 93 0.603292 0.505603 0.798669
LEU 94 0.219376 0.243439 0.195313
GLY 95 0.381244 0.381244 0.000000
GLU 96 1.160643 0.650123 1.569060
ASN 91 0.398939 0.402673 0.395204
LEU 98 0.260997 0.291390 0.230605
LYS 99 0.670299 0.492604 0.812455
THR 100 0.540123 0.434446 0.681025
LEU 101 0.223611 0.197023 0.250200
ARG 102 0.337929 0.244442 0.391350
LEU 103 0.683045 0.466061 0.900029
ARG 104 0.447657 0.284263 0.541025
LEU 105 0.224932 0.227766 0.222098
ARG 106 0.517791 0.359866 0.608034
ARG 107 0.797381 0.417117 1.014675
CYS 108 0.446720 0.444386 0.451390
HIS 109 1.143877 0.768567 1.394084
ARG 110 2.504159 0.891020 .3.425953
PHE 111 0.627657 0.434453 0.738059
LEU 112 0.313853 0.418984 0.208722
PRO 113 0.916024 0.925051 0.903988
CYS 114 0.880226 0.913273 0.814133
GLU 115 0.681217 1.039564 0.394540
ASN 116 1.126650 1.377720 0.875581
LYS 117 1.994428 1.600937 2.309221
SER 118 1.681392 1.621871 1.800435
LYS 119 2.814510 1.710193 3.697964
ALA 120 1.801667 1.724482 2.110410
VAL 121 1.544942 1.394954 1.744925
GLU 122 1.372615 1.217179 1.496964
GLN 123 1.666986 1.224612 2.020885
残基名称 残基编号 链 残基平均 主链平均 侧链平均
VAL 124 1.065509 1.019784 1.126476
LYS 125 1.290462 1.068905 1.467709
ASN 126 1.343160 1.194498 1.491822
ALA 127 1.051965 1.049121 1.063342
PHE 128 0.795256 0.794821 0.795505
ASN 129 1.228182 1.176872 1.279491
LYS 130 1.822402 1.443620 2.125427
LEU 131 1.031854 1.175720 0.887988
GLN 132 1.606392 1.102850 2.009226
GLU 133 2.062129 1.328741 2.648839
LYS 134 1.512778 1.017659 1.908874
GLY 135 0.683936 0.683936 0.000000
ILE 136 1.143970 0.984781 1.303160
TYR 137 1.777285 1.112277 2.109789
LYS 138 1.276147 0.962995 1.526669
ALA 139 0.782288 0.811065 0.667180
MET 140 1.412957 1.100599 1.725316
SER 141 1.437082 1.400217 1.510813
GLU 142 1.133228 1.018419 1.225075
PHE 143 1.409717 1.018879 1.633053
ASP 144 1.335780 1.079832 1.591728
ILE 145 1.174950 1.033776 1.316125
PHE 146 1.148547 0.961593 1.255377
ILE 147 1.180673 0.999599 1.361746
ASN 148 1.217923 1.043309 1.392537
TYR 149 1.332311 1.000363 1.498286
ILE 150 1.059025 0.975554 1.142496
GLU 151 1.411160 1.028525 1.717268
ALA 152 1.057735 1.023754 1.193658
TYR 153 1.798078 1.163861 2.115187
MET 154 1.359534 1.248505 1.470563
THR 155 1.286670 1.268193 1.311307
MET 156 1.742522 1.540742 1.944302
LYS 157 1.938715 1.777143 2.067973
ILE 158 2.043393 2.150795 1.935991
ARG 159 3.317688 2.224832 3.942177
ASN 160 3.402167 2.792181 3.890157
在一些实施例中，本发明的IL-10包含一或多个位于蛋白质中不破坏多肽结构的区域中的非天然存在氨基酸。在一些实施例中，本发明的IL-10多肽是拮抗剂并且包含在R1结合区内进行的氨基酸取代。在一些实施例中，本发明的IL-10多肽是拮抗剂并且包含一个以上氨基酸取代，其中至少一个取代在R1结合区内进行。在一些实施例中，本发明的IL-10多肽激动剂包含在如表2中所指示的1级或2级激动剂位置中进行的氨基酸取代。在一些实施例中，本发明的IL-10多肽激动剂包含一个以上氨基酸取代，其中至少一个取代在如表2中所指示的1级或2级激动剂位置中进行。
非天然编码氨基酸并入的例示性残基可以是从潜在受体结合区域中排除的那些残基，可能完全或部分溶剂暴露，与附近残基的氢键相互作用最小或没有，可以最低限度地暴露于附近反应性残基中，可以在一或多个暴露面上，可以是与第二IL-10或其它分子或其片段并列的一或多个位点，可以在高度柔性或结构上刚性的区域(如由IL-10的三维二级、三级或四级结构所预测)中、与其受体结合或非结合、或与另一个生物活性分子偶合或不偶合，或可以通过按需要改变完整结构的柔性或刚性来调节IL-10本身或包含一或多个IL-10的二聚物或多聚物的构象。
所属领域的普通技术人员识别到所述IL-10分析使得能够确定，与埋在蛋白质三级结构内的氨基酸残基相比较，哪些氨基酸残基是表面暴露的。因此，本发明的一个实施例是用非天然编码氨基酸取代作为表面暴露残基的氨基酸。
在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在IL-10中以下位置中的一或多者中：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1、2、4中的相应氨基酸)。
在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在如下的对应于IL-10或其变异体二级结构的以下区域中一或多者中的任何位置中：螺旋L侧；疏水性相互作用位点处；全长序列(SEQ ID NO:1)的最初18个氨基酸内；SEQ ID NO:3的氨基酸位置11-156或SEQ ID No:1、2、4中的相应氨基酸内。在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在IL-10或IL-10变异体的以下位置中的一或多者中：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1、2、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在IL-10或IL-10变异体的以下位置中的一或多者中：44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1、2、4中的相应氨基酸)。
在一些实施例中，在这些位置中的一或多者处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ IDNo:1、2、4中的相应氨基酸或任何IL-10序列中的相应氨基酸)。
在一些实施例中，IL-10多肽是激动剂，并且这些区域中的一或多者中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，所述区域包括(但不限于)：14、59、110、130、132、79、83、119、123、133、137。在一些实施例中，IL-10多肽是激动剂，并且这些区域中的一或多者中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，所述区域包括(但不限于)：14、59、110、130、132。在一些实施例中，IL-10多肽是激动剂，并且这些区域中的一或多者中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，所述区域包括(但不限于)：79、83、119、123、133、137。在一些实施例中，IL-10多肽是拮抗剂，并且这些区域中的一或多者中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，所述区域包括(但不限于)：21、31、32、90、92、93、96。在一些实施例中，IL-10多肽是拮抗剂，并且这些区域中的一或多者中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，所述区域包括(但不限于)：32、90、93、96。在一些实施例中，IL-10多肽是拮抗剂，并且这些区域中的一或多者中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，所述区域包括(但不限于)：21、31、92。在其它实施例中，这些区域中的一或多者中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，所述区域包括(但不限于)IL-10或其IL-10变异体的残基1-43或44-160(SEQ ID NO:3或来自SEQ ID No:1、2、4的相应氨基酸)。在其它实施例中，这些区域中的一或多者中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，所述区域包括(但不限于)残基1-43或44-160(SEQ ID NO:3或来自SEQ ID No:1、2、4的相应氨基酸)。多种非天然编码氨基酸可以用于取代或并入到IL-10中的既定位置中。一般来说，基于以下来选择用于并入的特定非天然编码氨基酸：检查IL-10多肽或其它IL-10家族成员与其受体的三维晶体结构，优选保守取代(即，基于芳基的非天然编码氨基酸，例如用对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸取代Phe、Tyr或Trp)，以及需要引入IL-10中的特异性结合化学(例如，如果想要实现与带有炔部分的水溶性聚合物的胡伊斯根[3+2]环加成或与带有芳基酯的水溶性聚合物形成酰胺键(所述水溶性聚合物随后又并入有膦部分)，那么引入4-叠氮基苯丙氨酸)。
在一个实施例中，所述方法进一步包括将非天然氨基酸并入蛋白质中，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；和使所述蛋白质与包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素、细胞毒性化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；合并有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子捕获剂；或上述物质的任何组合或任何其它所需的化合物或物质)接触。第一反应性基团与第二反应性基团发生[3+2]环加成反应，以将所述分子连接到非天然氨基酸上。在一个实施例中，第一反应性基团是炔基或叠氮基部分，而第二反应性基团是叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团是炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中)，而第二反应性基团是叠氮基部分。在另一个实例中，第一反应性基团是叠氮基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，而第二反应性基团是炔基部分。
在一些情况下，非天然编码氨基酸取代将与IL-10内的其它添加、取代或缺失组合，以影响IL-10多肽的其它生物学性状。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可以提高IL-10的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解降解的抗性或提高IL-10对其受体的亲和力。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可以提高白细胞介素10的医药稳定性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可以增强IL-10用于肿瘤抑制和/或肿瘤减小的活性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可以提高IL-10或变异体的溶解性(包括(但不限于)当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，添加、取代或缺失可以在于大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后提高IL-10溶解性。在一些实施例中，除并入非天然氨基酸的位点外还选择另一个位点以供天然编码或非天然氨基酸取代，这使得在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后多肽溶解性提高。在一些实施例中，白细胞介素10多肽包含调节IL-10受体、结合蛋白或相关配体的亲和力，调节与IL-10受体结合之后的信号转导，调节循环半衰期，调节释放或生物可用性，促进纯化，或改良或改变特定投药途径的另一个添加、取代或缺失。在一些实施例中，白细胞介素10多肽包含提高IL-10变异体对其受体亲和力的添加、取代或缺失。在一些实施例中，白细胞介素10包含提高IL-10变异体对IL-10-R1和/或IL-10-R2亲和力的添加、取代或缺失。类似地，白细胞介素10多肽可以包含改良多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化、通过组织或细胞膜的转运、前药释放或活化、IL-10尺寸减小或其它性状的化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或连接分子(包括(但不限于)生物素)。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸的取代产生IL-10拮抗剂。在一些实施例中，将非天然编码氨基酸取代或添加到受体结合所涉及的区域中。在一些实施例中，IL-10拮抗剂包含至少一个使IL-10充当拮抗剂的取代。在一些实施例中，IL-10拮抗剂包含存在于IL-10分子受体结合区中的与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。
在一些情况下，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上氨基酸经一或多个非天然编码氨基酸取代。在一些情况下，白细胞介素10进一步包括用一或多个非天然编码氨基酸取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上天然存在氨基酸。举例来说，在一些实施例中，IL-10中的一或多个残基经一或多个非天然编码氨基酸取代。在一些情况下，一或多个非天然编码残基与一或多种分子量较低的直链或分支PEG连接，由此得到相比于与单一较高分子量的PEG连接的物质有所增强的结合亲和力和与之相当的血清半衰期。
在一些实施例中，IL-10以下残基中的至多两个经一或多个非天然编码氨基酸取代。位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID No:1、2、4中的相应氨基酸或另一个IL-10序列中的相应氨基酸)。
VI.非真核细胞和真核细胞中的表达
为了获得克隆IL-10多核苷酸的高水平表达，通常将编码本发明白细胞介素10多肽的多核苷酸亚克隆到含有用于指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(如果针对编码蛋白质的核酸)用于翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。合适的细菌启动子是所属领域的普通技术人员已知的并且描述在例如萨姆布鲁克等人和奥斯贝等人中。
用于表达本发明IL-10的细菌表达系统可以在以下各者中获得：包括(但不限于)大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、荧光假单胞菌、绿脓假单胞菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌(Salmonella)(帕尔瓦(Palva)等人,基因(Gene)22:229-235(1983)；莫斯巴赫等人,自然(Nature)302:543-545(1983))。这些表达系统的试剂盒在市面上有售。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是所属领域的普通技术人员已知的，并且在市面上也有售。在其中使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(上文所述)表达本发明IL-10多肽的情况中，用于表达的宿主细胞是基于其使用正交组分的能力来选择的。例示性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(包括(但不限于)短小芽孢杆菌(B.brevis)、枯草杆菌(B.subtilis)或链霉菌(Streptomyces))和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌)，以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述，可以使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞能够合成较大有效量的包含非天然氨基酸的蛋白质。一方面，组合物任选包括(包括(但不限于))至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上包含非天然氨基酸的蛋白质，或者利用体内蛋白质产生方法可以达到的量(关于重组蛋白产生和纯化的细节如本文中所提供)。另一方面，组合物中存在的蛋白质在(包括(但不限于))细胞溶解产物、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括(但不限于)体积(包括(但不限于))在约1nl到约100L间的任何体积或更高体积)中的浓度任选是(包括(但不限于))每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质，或每升至少10毫克蛋白质或更高。本发明的一个特征是，在真核细胞中产生大量(包括(但不限于)大于用其它方法(包括(但不限于)体外翻译)通常可能获得的量)包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞能够生物合成较大有效量的包含非天然氨基酸的蛋白质。举例来说，可以在细胞提取物、细胞溶解产物、培养基、缓冲液等中产生蛋白质浓度为(包括(但不限于))至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的包含非天然氨基酸的蛋白质。
多种适合于表达IL-10的载体在市面上有售。适用于真核宿主的表达载体包括(但不限于)包含来自SV40的表达控制序列的载体、牛乳头瘤病毒、腺病毒和细胞肥大病毒。所述载体包括pCDNA3.1(+)\Hyg(英杰公司(Invitroge)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,Calif.,USA))和pCI-neo(赛特杰公司，美国加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla,Calif.,USA))。可以使用细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒(包括pBR322、pET3a和pET12a)、较宽宿主范围质粒(例如RP4)；噬菌体DNA，例如噬菌体λ(例如NM989)和其它DNA噬菌体(例如M13和丝状单股DNA噬菌体)的多种衍生物。2μ质粒和其衍生物、POT1载体(美国专利第4,931,373号，其以引用的方式并入)、描述于(奥克尔斯(Okkels)纽约科学院年鉴(Ann.New York Aced.Sci.)782,202207,1996)中的pJS037载体、和pPICZ A、B或C(英杰公司)可以与酵母宿主细胞一起使用。对于昆虫细胞，载体包括(但不限于)pVL941、pBG311(凯特(Cate)等人,“分离牛和人类基因以用于缪勒抑制物质和人类基因在动物细胞中的表达(Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance AndExpression of the Human Gene In Animal Cells)”,细胞(Cell),45,第685页98(1986))、pBluebac 4.5和pMelbac(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))。
编码IL-10或其变异体的核苷酸序列可以或可以不也包括编码信号肽的序列。当多肽是由表达其的细胞分泌时，存在信号肽。所述信号肽可以是任何序列。信号肽可以是原核或真核的。科洛马M(Coloma,M)(1992)免疫法杂志(J.Imm.Methods)152:89104)描述用于哺乳动物细胞的信号肽(鼠类Igκ轻链信号肽)。其它信号肽包括(但不限于)来自酿酒酵母的α因子信号肽(美国专利第4,870,008号，其以引用的方式并入本文中)、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(海根布彻(O.Hagenbuchle)等人,自然289,1981,第643-646页)、经修饰的羧基肽酶信号肽(L.A.瓦利斯(L.A.Vails)等人,细胞48,1987,第887-897页)、酵母BAR1信号肽(WO 87/02670，其以引用的方式并入本文中)和酵母天冬胺酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参看M.伊格尔-三谷(M.Egel-Mitani)等人,酵母(Yeast)6,1990,第127-137页)。
合适的哺乳动物宿主细胞的实例是所属领域的普通技术人员已知的。所述宿主细胞可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO-K1；ATCC CCL-61)、绿猴细胞(COS)(例如COS 1(ATCC-1650)、COS 7(ATCC CRL-1651))；小鼠细胞(例如NS/O)、幼小仓鼠肾脏(BHK)细胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人类细胞(例如HEK 293(ATCC CRL-1573))以及组织培养物中的植物细胞。这些细胞系等可以从公共仓库中获得，例如美国典型菌种保藏中心(American Type CultureCollection),马里兰州罗克维尔(Rockville,Md)。为了提供改良的IL-10多肽糖基化，哺乳动物宿主细胞可以经修饰以表达唾液酸转移酶(例如1,6-唾液酸转移酶)，例如美国专利第5,047,335号中所描述的，其以引用的方式并入本文中。
用于将外源性DNA引入哺乳动物宿主细胞中的方法包括(但不限于)磷酸钙介导的转染、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、由生命技术有限公司(Ltd),英国佩斯利(Paisley,UK)使用脂质体转染胺(Lipofectamin)2000描述和由罗氏诊断公司(Roche Diagnostics Corporation),美国印第安纳波利斯(Indianapolis,USA)使用FuGENE 6描述的病毒载体和转染方法。这些方法是此项技术中众所周知的并且由奥斯贝(Ausbel)等人(编),1996,现行分子生物学方案,约翰威立父子出版公司,美国纽约描述。哺乳动物细胞的培养可根据(例如)如(动物细胞生物技术，方法和方案(Animal Cell Biotechnology,Methods and Protocols),奈杰尔·詹金斯(NigelJenkins)编,1999,人类出版社公司(Human Press Inc.)美国新泽西州特图瓦(Totowa,N.J.,USA)；以及马斯·哈里森(Harrison Mass.)和瑞伊IF(Rae IF),细胞培养一般技术(General Techniques of Cell Culture),剑桥大学出版社(Cambridge UniversityPress)1997)中所揭示的确定方法来进行。
I.表达系统、培养和分离
IL-10多肽可以在任何数量的合适表达系统中表达，包括例如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌。下文将描述例示性表达系统。
酵母本文中所用的术语“酵母”包括能够表达编码IL-10多肽的基因的各种酵母中的任一者。所述酵母包括(但不限于)产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌(Fungiimperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。产子囊酵母分为两个科：蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者由四个亚科组成：裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母菌属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、线黑粉酵母属(Filobasidium)和香灰拟锁担菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科：掷孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如，掷孢酵母属(Sporoholomyces)和布勒掷孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母属(Candida))。
尤其受关注的供本发明使用的物种是毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属内的物种，所述物种包括(但不限于)巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克鲁维酵母(S.kluyveri)、诺本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白色念珠菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和汉森酵母(H.polymorpha)。
用于表达IL-10多肽的合适酵母的选择在所属领域的普通技术人员的技能内。在选择用于表达的酵母宿主过程中，合适的宿主可以包括显示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好可溶性蛋白质产生和整体稳固性的那些宿主。酵母通常可从多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Yeast Genetic Stock Center,Department ofBiophysics and Medical Physics,University of California(Berkeley,CA))和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯)(American Type Culture Collection("ATCC")(Manassas,VA))。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的酵母。这一术语包括已接收重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于意外或故意突变，单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。与将要以例如存在编码IL-10多肽的核苷酸序列的相关性质为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。
已经开发出包括染色体外复制子或整合载体在内的表达和转化载体，用于转化到许多酵母宿主中。举例来说，已经开发出以下各者的表达载体：酿酒酵母(西科尔斯基(Sikorski)等人,遗传学(GENETICS)(1989)112:19；伊藤(Ito)等人,细菌学杂志(J.BACTERIOL.)(1983)153:163；希嫩(Hinnen)等人,美国国家科学院院刊(1978)75:1929)；白色念珠菌(库尔茨(Kurtz)等人,分子与细胞生物学(MOL.CELL.BIOL.)(1986)6:142)；麦芽糖假丝酵母(孔泽(Kunze)等人,基础微生物学杂志(J.BASIC MICROBIOL.)(1985)25:141)；汉森酵母(格利森(Gleeson)等人,普通微生物学杂志(J.GEN.MICROBIOL.)(1986)132:3459；罗根坎波(Roggenkamp)等人,分子遗传学与基因组学(MOL.GENETICS AND GENOMICS)(1986)202:302)；脆壁克鲁维酵母(达斯(Das)等人,细菌学杂志(1984)158:1165)；乳酸克鲁维酵母(德·卢旺库尔(DeLouvencourt)等人,细菌学杂志(1983)154:737；范登博格(Van den Berg)等人,生物技术(BIOTECHNOLOGY)(纽约)(1990)8:135)；谷勒氏酵母(孔泽等人,基础微生物学杂志(1985)25:141)；巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324,639号；第4,929,555号；和第4,837,148号；格瑞(Cregg)等人,分子与细胞生物学(1985)5:3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(比奇(Beach)等人,自然(1982)300:706)；和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)；构巢曲霉(A.nidulans)(巴兰斯(Ballance)等人,生物化学与生物物理研究通讯(BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.)(1983)112:284-89；蒂尔伯恩(Tilburn)等人,基因(GENE)(1983)26:205-221；和耶尔顿(Yelton)等人,美国国家科学院院刊(1984)81:1470-74)；黑曲霉(A.niger)(凯莉(Kelly)和海因斯(Hynes),欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)(1985)4:475-479)；木霉(T.reesia)(EP0 244 234)；以及丝状真菌，例如红霉菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉菌(Tolypocladium)(WO 91/00357)，每一者都以引用的方式并入本文中。
用于酵母载体的控制序列是所属领域的普通技术人员已知的，并且包括(但不限于)以下基因的启动子区：例如醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284 044)；烯醇化酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可提供有用的启动子序列(宫之原(Miyanohara)等人,美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)(1983)80:1)。适用于酵母宿主的其它启动子序列可以包括3-磷酸甘油酸激酶(海泽曼(Hitzeman)等人,生物化学杂志(J.BIOL.CHEM)(1980)255:12073)；和其它糖解酶(例如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(霍兰德(Holland)等人,生物化学(1978)17:4900；海斯(Hess)等人,酶调控进展杂志(J.ADV.ENZYME REG.)(1969)7:149))的启动子。具有受生长条件控制的转录的额外优点的诱导性酵母启动子可以包括醇脱氢酶2；异细胞色素C；酸性磷酸酶；金属硫蛋白；甘油醛-3-磷酸脱氢酶；与氮代谢相关的降解酶；以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达中的载体和启动子进一步描述于EP 0 073 657中。
酵母增强子也可以与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可以充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游活化序列(upstream activating sequence，UAS)可以与另一个酵母启动子的转录活化区连接，产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区连接的ADH调控序列。参见美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列与糖解酶基因(例如GAP或PyK)的转录活化区组合所组成的启动子。参见EP 0 164 556.。此外，酵母启动子可以包括非酵母来源的具有结合酵母RNA聚合酶并且引发转录的能力的天然存在启动子。
可以构成酵母表达载体一部分的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(霍兰德等人,生物化学杂志(J.BIOL.CHEM.)(1981)256:1385)。另外，来自2μ质粒源的复制源适用于酵母。适用于酵母中的选择基因是酵母质粒中存在的trp1基因。参见蒂谢姆普(Tschemper)等人,基因(1980)10:157；金仕曼(Kingsman)等人,基因(1979)7:141。trp1基因提供用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株的选择标记物。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)由带有Leu2基因的已知质粒补充。
将外源DNA引入酵母宿主中的方法是所属领域的普通技术人员众所周知的，并且通常包括(但不限于)转化原生质球状体或转化经碱金属阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，酵母的转化可以根据在肖(Hsiao)等人,美国国家科学院院刊(1979)76:3829和范·索林根(Van Solingen)等人,细菌学杂志(J.BACT.)(1977)130:946中所述的方法来进行。然而，如萨姆布鲁克等人,分子克隆实验指南(2001)中大致所述，还可以使用将DNA引入细胞中的其它方法，例如通过注核、电穿孔或原生质体融合。随后，可以使用所属领域的普通技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。
在酵母宿主细胞中表达异源蛋白质的其它方法是所属领域的普通技术人员已知的。一般参见美国专利公开案第20020055169号；美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号和第5,089,398号；美国复审专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO 99/07862；WO 98/37208；和WO 98/26080；欧洲专利申请案EP 0946736；EP 0732403；EP 0480480；WO 90/10277；EP 0 340986；EP 0 329 203；EP 0 324 274；和EP 0 164556。还参见吉利森(Gellissen)等人,安东尼·范·列文虎克(ANTONIE VAN LEEUWENHOEK)(1992)62(l-2):79-93；罗曼诺斯(Romanos)等人,酵母(1992)8(6):423-488；戈德尔(Goeddel),酶学方法(1990)185:3-7，每一者都以引用的方式并入本文中。
在使用所属领域的普通技术人员已知的标准进料分批发酵方法进行的扩增阶段期间，可使酵母宿主菌株在发酵罐中生长。发酵方法可经调适以考虑特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式的差异。举例来说，酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复合氮源(例如，酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相比之下，甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和微量矿物进料，而只需要简单铵(氮)盐以达最佳生长和表达。参见例如美国专利第5,324,639号；埃利奥特(Elliott)等人,蛋白质化学杂志(J.PROTEIN CHEM.)(1990)9:95；和菲什科(Fieschko)等人,生物技术与生物工程(BIOTECH.BIOENG.)(1987)29:1113，其以引用的方式并入本文中。
然而，这些发酵方法可能具有某些与所用酵母宿主菌株无关的常见特征。举例来说，在扩增期间，可以将限制生长的养分(通常为碳)添加到发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵方法一般使用的发酵培养基被设计成含有足量碳、氮、基本盐、磷和其它微量养分(维生素、微量矿物和盐等)。适合与毕赤酵母一起使用的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其以引用的方式并入本文中。
感染杆状病毒的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的昆虫。这一术语包括经过转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于意外或故意突变，单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。与将要以例如存在编码IL-10多肽的核苷酸序列的相关性质为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。表达IL-10多肽的非限制性实例描述于美国专利公开案第20090214471号，其以引用的方式并入本文中。
适用于表达IL-10多肽的昆虫细胞的选择是所属领域的普通技术人员已知的。在此项技术中充分描述了若干昆虫物种，并且所述物种在市面上有售，包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择供表达的昆虫宿主时，合适的宿主可以包括显示(尤其)良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。昆虫一般可从多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Insect Genetic Stock Center,Department of Biophysics and Medical Physics,University of California(Berkeley,CA))；和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯))。
一般来说，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包括：转移载体，通常是细菌质粒，其含有杆状病毒基因组的片段和供插入欲表达的异源基因的便利限制性位点；序列与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的野生型杆状病毒(此使得异源基因能同源重组到杆状病毒基因组中)；以及适当昆虫宿主细胞，和生长培养基。此项技术中已知用于构建载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术，并且可以使用描述这些技术的手册。
在将异源基因插入转移载体中后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，在宿主细胞中，载体和病毒基因组重组。表达经包装的重组病毒，并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如英杰公司(Invitrogen Corp.)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。这些技术一般是所属领域的普通技术人员已知的，并且充分描述于萨姆斯(SUMMERS)和史密斯,德克萨斯农业实验站会刊(TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN)第1555期(1987)中，此文献以引用的方式并入本文中。还参见理查森(RICHARDSON),39分子生物学方法：杆状病毒表达方案(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY:BACULOVIRUS EXPRESSIONPROTOCOLS)(1995)；奥斯贝等人,现行分子生物学方案16.9-16.11(1994)；金(KING)和迫塞(POSSEE),杆状病毒系统实验指导(THE BACULOVIRUS SYSTEM:ALABORATORY GUIDE)(1992)；和奥莱利(O'REILLY)等人,杆状病毒表达载体实验指南(BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL)(1992)。
实际上，使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统产生各种异源蛋白质是所属领域的普通技术人员已知的。参见例如美国专利第6,368,825号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号；第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032WO 99/51721；WO 99/45130；WO99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400；WO96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO92/02628；WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO90/02186；WO 90/01556；WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，其以引用的方式并入本文中。
此项技术中已知适用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体，并且其包括例如来源于杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)的昆虫表达和转移载体，这是一种不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。来源于此系统的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子来驱动异源基因的表达。一般参见奥莱利(O'Reilly)等人,杆状病毒表达载体实验指南(1992)。
在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包含启动子、前导序列(必要时)、相关编码序列和转录终止序列的上述组件组装到中间错位构建体(intermediatetransplacement construct)(转移载体)中。中间错位构建体常常保持在能够稳定保持在宿主(例如细菌)中的复制子(例如染色体外元件，例如质粒)中。复制子将具有复制系统，由此使其能保持在适用于克隆和扩增的宿主中。更特定来说，质粒可以含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(米勒(Miller),微生物学年鉴(ANN.REV.MICROBIOL.)(1988)42:177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨苄青霉素抗性(ampicillin-resistance；amp)基因和复制起点。
一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体是pAc373。也已经设计出所属领域技术人员已知的许多其它载体，包括例如pVL985，其中将多角体蛋白的起始密码子由ATG变为ATT，并将BamHI克隆位点引入ATT下游32个碱基对处。参见鲁克诺(Luckow)和萨姆斯,病毒学(VIROLOGY)170:31(1989)。其它市售载体包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)。
在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。将异源DNA引入杆状病毒的所需位点中的方法是此项技术中已知的。参见萨姆斯和史密斯,德克萨斯农业实验站会刊第1555期(1987)；史密斯等人,分子与细胞生物学(1983)3:2156；鲁克诺和萨姆斯,病毒学(VIROLOGY)(1989)170:31。举例来说，插入可以是通过同源双重交叉重组插入到基因(例如多角体蛋白基因)中；插入也可以是插入到经工程改造成所需的杆状病毒基因的限制酶位点中。参见米勒等人,BIOESSAYS(1989)11(4):91。
可以通过电穿孔法来实现转染。参见托特(TROTTER)和伍德(WOOD),39分子生物学方法(1995)；曼和金,普通病毒学杂志(J.GEN.VIROL.)(1989)70:3501。或者，可以使用脂质体用重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。参见例如利布曼(Liebman)等人,生物技术(BIOTECHNIQUES)(1999)26(1):36；格拉夫(Graves)等人,生物化学(1998)37:6050；野村(Nomura)等人,生物化学杂志(1998)273(22):13570；施密特(Schmidt)等人,蛋白质表达和纯化(PROTEIN EXPRESSION ANDPURIFICATION)(1998)12:323；薛福德(Siffert)等人,自然·遗传学(NATUREGENETICS)(1998)18:45；迪金(TILKINS)等人,细胞生物学实验手册(CELL BIOLOGY:A LABORATORY HANDBOOK)145-154(1998)；采(Cai)等人,蛋白质表达和纯化(1997)10:263；多尔芬(Dolphin)等人,自然·遗传学(1997)17:491；科斯特(Kost)等人,基因(1997)190:139；雅各布松(Jakobsson),生物化学杂志(1996)271:22203；罗尔斯(Rowles)等人,生物化学杂志(1996)271(37):22376；瑞韦里(Reverey)等人,生物化学杂志(1996)271(39):23607-10；史坦利(Stanley)等人,生物化学杂志(1995)270:4121；西斯克(Sisk)等人,病毒学杂志(J.VIROL.)(1994)68(2):766；以及彭(Peng)等人,生物技术(BIOTECHNIQUES)(1993)14(2):274。市售脂质体包括例如和(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。另外，也可以使用磷酸钙转染。参见托特和伍德,39分子生物学方法(1995)；基茨(Kitts),NAR(1990)18(19):5667；以及曼和金,普通病毒学杂志(J.GEN.VIROL.)(1989)70:3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够结合杆状病毒RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区，其通常接近编码序列的5'端。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可以具有称作增强子的第二结构域，当存在时，其通常在结构基因的末梢。此外，表达可以是受调控或组成性的。
在感染周期末期大量转录的结构基因将提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于编码病毒多面体蛋白的基因(弗雷森(FRIESEN)等人,杆状病毒基因表达的调控(The Regulation of Baculovirus Gene Expression),杆状病毒分子生物学(THEMOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES)(1986)；EP 0 127 839和0 155 476)和编码p10蛋白的基因(沃拉克(Vlak)等人,普通病毒学杂志(1988)69:765)的序列。
将新形成的杆状病毒表达载体包装到传染性重组杆状病毒中并且随后可以通过所属领域的普通技术人员已知的技术纯化生长斑块。参见米勒等人,生物分析(1989)11(4):91；萨姆斯和史密斯,德克萨斯农业实验站会刊第1555期(1987)。
已经开发出重组杆状病毒表达载体用于感染到若干昆虫细胞中。举例来说，已经开发出尤其用于埃及伊蚊(ATCC编号CCL-125)、家蚕(ATCC编号CRL-8910)、黑腹果蝇(ATCC编号1963)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参见赖特(Wright),自然(1986)321:718；卡博内尔(Carbonell)等人,病毒学杂志(1985)56:153；史密斯等人,分子与细胞生物学(1983)3:2156。一般参见弗雷泽(Fraser)等人,体外细胞与发育生物学(IN VITRO CELL.DEV,BIOL),(1989)25:225。更特定来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC编号CRL-1711)、Sf21(草地贪夜蛾)(英杰公司，目录编号11497-013(加利福尼亚州卡尔斯巴德))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。
用于在杆状病毒/表达中直接和融合表达异源多肽的细胞和培养基在市面上有售，并且细胞培养技术是所属领域的普通技术人员一般已知。
大肠杆菌、假单胞菌和其它原核生物细菌表达技术是所属领域的普通技术人员已知的。各种载体可供用于在细菌宿主中使用。这些载体可以是单拷贝或者低或高多拷贝载体。载体可以用于克隆和/或表达。考虑到有关载体，许多载体的商业可获得性并且甚至是描述载体和其限制性图谱与特征的手册的大量文献，在此不需要进行大量论述。众所周知，载体通常涉及允许选择的标记物，所述标记物可以提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。常常会存在多个标记物，其提供不同的特征。
细菌启动子是能够结合细菌RNA聚合酶并且起始编码序列(例如结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区，其通常接近编码序列的5'端。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可以具有称作操纵基因的第二结构域，其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵基因允许负调控(诱导性)转录，这是因为基因阻遏蛋白可以结合操纵基因，并由此抑制特定基因的转录。在不存在负调控元件(例如操纵基因)的情况下，可以发生组成性表达。另外，通过基因活化蛋白结合序列可以实现正调控，当存在这一序列时，其通常接近RNA聚合酶结合序列的(5')。基因活化蛋白的实例是代谢物活化蛋白(catabolite activator protein，CAP)，其有助于起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[雷波德(Raibaud)等人,遗传学年鉴(ANNU.REV.GENET.)(1984)18:173]。因此，表达的调控可以是正调控或负调控，由此增强或减弱转录。
编码代谢路径酶的序列提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于糖代谢酶(例如半乳糖、乳糖(lac)[常(Chang)等人,自然(NATURE)(1977)198:1056]和麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括来源于生物合成酶(例如色氨酸(trp))的启动子序列[戈德尔等人,核酸研究(1980)8:4057；耶尔弗顿(Yelverton)等人,核酸研究(1981)9:731；美国专利第4,738,921号；欧洲专利公开案第036776号和第121775号，其以引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[魏斯曼(Weissmann)(1981)“干扰素的克隆和其它错误(The cloning of interferon and othermistakes)”.干扰素3(Interferon 3)(I.格雷塞尔(I.Gresser)编)]、噬菌体λPL[下竹(Shimatake)等人,自然(1981)292:128]和T5[美国专利第4,689,406号](所述文献以引用的方式并入本文中)启动子系统还提供适用的启动子序列。优选的本发明方法利用强启动子(例如T7启动子)以高水平诱导IL-10多肽。所述载体的实例是所属领域的普通技术人员已知的，并且包括来自诺杰公司(Novagen)的pET29系列，以及WO99/05297(其以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。所述表达系统在宿主中产生高水平的IL-10多肽，并且不损害宿主细胞活力或生长参数。pET19(诺杰公司)是此项技术中已知的另一个载体。
另外，自然界中不存在的合成启动子也可以充当细菌启动子。举例来说，可以将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，从而产生合成的杂合启动子[美国专利第4,551,433号，以引用的方式并入本文中]。举例来说，tac启动子是由trp启动子与lac操纵子序列组成的杂合trp-lac启动子，其受lac阻遏子调控[阿曼恩(Amann)等人,基因(1983)25:167；德·波尔(deBoer)等人,国家科学院院刊(1983)80:21]。此外，细菌启动子可以包括非细菌来源的天然存在启动子，其能够与细菌RNA聚合酶结合并起始转录。也可以将非细菌来源的天然存在启动子与相容性RNA聚合酶偶合以便在原核生物中高水平表达一些基因。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统是偶合启动子系统的一个实例[斯蒂尔(Studier)等人,分子生物学杂志(1986)189:113；塔波(Tabor)等人,美国国家科学院院刊(1985)82:1074]。另外，杂合启动子也可由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区组成(欧洲专利公开案第267851号)。
除功能性启动子序列之外，有效核糖体结合位点也可以用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称作沙恩-达尔加诺(Shine-Dalgarno，SD)序列，并且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的3-9个核苷酸长的序列[沙恩(Shine)等人,自然(1975)254:34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3'之间的碱基配对促进了mRNA与核糖体的结合[施泰茨(Steitz)等人“信使RNA中的遗传信号和核苷酸序列(Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA)”,生物调控与发展：基因表达(Biological Regulation andDevelopment:Gene Expression)(R.F.戈尔德贝格尔(R.F.Goldberger)编,1979)]。从而用弱核糖体-结合位点表达真核基因和原核基因[萨姆布鲁克等人“克隆基因在大肠杆菌中的表达(Expression of cloned genes in Escherichia coli)”,分子克隆实验指南,1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的细菌。这一术语包括经过转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于意外或故意突变，单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。与将要以例如存在编码IL-10多肽的核苷酸序列的相关性质为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。
适用于表达IL-10多肽的宿主细菌的选择是所属领域的普通技术人员已知的。在选择用于表达的细菌宿主时，合适的宿主可以包括显示尤其具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性和整体稳固性的宿主。细菌宿主一般可从多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Bacterial Genetic Stock Center,Department of Biophysics and Medical Physics,University of California(Berkeley,CA))和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯))。工业/医药发酵一般使用来源于K菌株(例如W3110)的细菌或来源于B菌株(例如BL21)的细菌。这些菌株因其生长参数众所周知且稳定而特别有用。另外，这些菌株是非病原性的，而出于安全性和环境原因，其在商业上相当重要。合适的大肠杆菌宿主的其它实例包括(但不限于)菌株BL21、DH10B或其衍生物。在本发明方法的另一个实施例中，大肠杆菌宿主是缺乏蛋白酶的菌株(proteaseminus strain)，包括(但不限于)OMP-和LON-。宿主细胞株可以是假单胞菌属物种，包括(但不限于)荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。已知指定为菌株MB101的荧光假单胞菌生物变种1适用于重组产生并且可以用于治疗性蛋白质生产工艺中。假单胞菌表达系统的实例包括从陶氏化学公司(Dow Chemical Company)以宿主菌株形式得到的系统(密歇根州米德兰(Midland,MI)，可见于万维网dow.com上)。
一旦形成重组宿主细胞菌株(即，已将表达构建体引入宿主细胞中并且分离出具有合适表达构建体的宿主细胞)后，在适于产生IL-10多肽的条件下培养重组宿主细胞菌株。所属领域技术人员将易于了解，培养重组宿主细胞菌株的方法将取决于所用表达构建体的性质和宿主细胞的身份。重组宿主病毒株通常使用所属领域的普通技术人员已知的方法来加以培养。通常在液体培养基中培养重组宿主细胞，所述液体培养基含有可吸收的碳源、氮源和无机盐，并且任选地含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域的普通技术人员已知的的其它蛋白质培养补充剂。用于培养宿主细胞的液体培养基可以任选地含有抗生素或抗真菌剂以防止非所需微生物和/或包括(但不限于)抗生素等化合物的生长，从而选择含有表达载体的宿主细胞。
重组宿主细胞可以分批或连续模式培养，其中细胞采集(在其中IL-10多肽积聚于细胞内的情况下)或培养物上清液的采集为分批或连续模式。对于在原核宿主细胞中制备，优选分批培养和细胞采集。
本发明的IL-10多肽通常在重组系统中表达之后加以纯化。可以通过此项技术已知的多种方法从宿主细胞纯化IL-10多肽。在细菌宿主细胞中产生的IL-10多肽可能是难溶性或不溶性的(呈包涵体形式)。在本发明的一个实施例中，可以使用本文中所揭示的方法以及所属领域中已知的那些方法，在IL-10多肽中容易地进行经选择以便提高重组产生的蛋白质的可溶性的氨基酸取代。在不溶性蛋白质的情况下，可以通过离心从宿主细胞溶解产物收集蛋白质并且可以接着进一步使细胞均质化。在难溶性蛋白质的情况下，可以添加包括(但不限于)聚乙烯亚胺(polyethylene imine，PEI)的化合物以诱导部分可溶蛋白质的沉淀。随后宜通过离心收集沉淀蛋白质。可以使用所属领域的普通技术人员已知的多种方法使重组宿主细胞破碎或均质化以从细胞内释放包涵体。宿主细胞破碎或均质化可以使用众所周知的技术进行，包括(但不限于)酶促细胞破碎、声处理、杜恩斯均质化(dounce homogenization)或高压释放破碎。在本发明方法的一个实施例中，使用高压释放技术来使大肠杆菌宿主细胞破碎，从而释放出IL-10多肽的包涵体。当处理IL-10多肽的包涵体时，由于例如溶解、机械剪切或蛋白质水解等因素，可能宜使重复均质化时间降到最低以便使包涵体的产率达到最大而不造成损失。
随后可以使用此项技术已知的多种合适的溶解剂中的任一者来溶解不溶性或沉淀IL-10多肽。优选用尿素或盐酸胍来溶解IL-10多肽。应该使所溶解的IL-10多肽的体积降到最低以使得可以使用可方便管理的批次尺寸产生大批次。在重组宿主可按数千升体积的批次生长的大规模商业环境中，这个因素相当重要。另外，当在大规模商业装置中制造IL-10多肽时，特别是对于人类医药用途来说，如果可能的话，应避免可损害机器和容器的苛刻化学品或其蛋白质产物。本发明的方法中已显示，可以使用较温和的变性剂尿素代替较苛刻的变性剂盐酸胍来溶解IL-10多肽包涵体。尿素的使用显著降低了对在IL-10多肽的制造和纯化工艺中所采用的不锈钢设备的损害的风险同时有效地溶解了IL-10多肽包涵体。
在可溶性IL-10蛋白质的情况下，IL-10可以分泌到周质间隙或培养基中。另外，可溶性IL-10可以存在于宿主细胞的细胞质中。可能需要在进行纯化步骤之前浓缩可溶性IL-10。所属领域的普通技术人员已知的标准技术可以用于从例如细胞溶解产物或培养基中浓缩可溶性IL-10。另外，所属领域的普通技术人员已知的标准技术可以用于使宿主细胞破碎并从宿主细胞的细胞质或周质间隙中释放可溶性IL-10。
当以融合蛋白形式产生IL-10多肽时，可以去除融合序列。可以通过酶促裂解或化学裂解来去除融合序列。融合序列的酶促去除可以使用所属领域的普通技术人员已知的方法来实现。所属领域的普通技术人员将易于了解，对用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的身份决定，并且反应条件将通过酶的选择指定。化学裂解可以使用所属领域的普通技术人员已知的试剂来实现，包括(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂。通过所属领域的普通技术人员已知的方法来从所裂解的融合序列中纯化所裂解的IL-10多肽。如所属领域的普通技术人员将易于了解，所述方法将由融合序列和IL-10多肽的身份和特性决定。纯化方法可以包括(但不限于)尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。
也优选地纯化IL-10多肽以从蛋白质溶液中去除DNA。可以通过例如沉淀或离子交换色谱法的此项技术中已知的任何适当方法来去除DNA，但也可以通过用核酸沉淀剂(例如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除DNA。可以使用包括(但不限于)离心或过滤等众所周知的标准方法使IL-10多肽与沉淀DNA分离。在将使用IL-10多肽来治疗人类的背景中，宿主核酸分子的去除是重要因素，并且本发明的方法使宿主细胞DNA降到医药学上可接受的水平。
小规模或大规模发酵方法也可以用于蛋白质表达中，这些方法包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可通过分批、分批进料或连续模式过程进行。
本发明的人类IL-10多肽一般可以使用此项技术中的标准方法来回收。举例来说，可以对培养基或细胞溶解产物进行离心或过滤，以去除细胞碎片。可以浓缩上清液或将其稀释到所希望的体积或透滤到合适的缓冲液中，为进一步纯化做准备。本发明IL-10多肽的进一步纯化包括使所述IL-10多肽变异体的脱去酰胺基和剪切形式与完整形式分离。
可以采用以下例示性程序中的任一者来纯化本发明的IL-10多肽：亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用包括(但不限于)DEAE SEPHAROSE)；二氧化硅色谱；高效液相色谱法(HPLC)；逆相HPLC；凝胶过滤(使用包括(但不限于)塞法戴克斯(SEPHADEX)G-75)；疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱焦聚；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦)；差异溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)；SDS-PAGE或萃取。
根据所属领域的技术人员已知和使用的标准程序，本发明的蛋白质(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的肽、对包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、用于包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等)可以被纯化成部分或实质上均质。因此，可以通过所属领域的普通技术人员已知的多种方法中的任一者来回收和纯化本发明的多肽：包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳等。必要时，在制备正确折叠的成熟蛋白质时，可以使用蛋白质再折叠步骤。可以将高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它合适的方法用于需要高纯度的最终纯化步骤中。在一个实施例中，将所制得的针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质或肽)的抗体用作纯化试剂，包括(但不限于)用以基于亲和力来纯化包含一或多个非天然氨基酸的蛋白质或肽。必要时，一旦部分纯化或达到均质后，任选将多肽用于多种应用，包括(但不限于)作为分析组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或作为产生抗体的免疫原。可以使用常规方案，通过向动物，优选非人类动物投与多肽或带有表位的片段，来获得针对本发明多肽产生的抗体。所属领域一的般技术人员可以使用多种已知技术来产生抗体。另外，也可以使用转基因小鼠或其它生物体(包括其它哺乳动物)来表达人类化抗体。上述抗体可用来分离或鉴别表达多肽的克隆，或者用于纯化多肽。针对本发明多肽的抗体也可以用于治疗疾病。
本发明的多肽和多核苷酸也可以用作疫苗。因此，另一方面，本发明涉及一种诱导哺乳动物的免疫响应的方法，其包含用适于产生抗体和/或T细胞(包括例如产生细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞)免疫响应的本发明多肽接种所述哺乳动物，以保护所述动物免受疾病影响，不管这种疾病是否已经在个体体内确立。诱导哺乳动物免疫响应的方法也包含通过载体递送本发明多肽，引导在体内表达多核苷酸和编码多肽，以便诱导所述免疫响应，从而产生抗体，保护所述动物免受本发明疾病的影响。一种投与载体的方式是将载体以粒子上的涂层或其它形式投与以加快使其进入所需细胞中。所述核酸载体可以包含DNA、RNA、经修饰的核酸或DNA/RNA杂合体。对于用作疫苗，多肽或核酸载体通常以疫苗调配物(组合物)的形式提供。所述调配物可以进一步包含合适的载剂。由于多肽可能会在胃中降解，使得可以非经肠(例如皮下、肌肉内、静脉内或皮内注射)投与所述多肽。适合于非经肠投与的调配物包括水性和非水性无菌注射液，这些注射液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，和使调配物与接受者血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液(其可以包括悬浮剂或增稠剂)。疫苗调配物还可以包括所属领域的普通技术人员已知用于增强调配物免疫原性的佐剂系统。剂量将取决于疫苗的比活性，并且可以容易地通过常规实验测定。
除本文中指出的其它参考文献之外，多种纯化/蛋白质折叠方法是所属领域的普通技术人员已知，包括(但不限于)在以下各者中阐述的那些方法：R.斯科普斯(R.Scopes),蛋白质纯化(Protein Purification),施普林格出版社(Springer-Verlag),纽约州(1982)；多伊彻(Deutscher),酶学方法第182卷:蛋白质纯化指导(Guide to  Protein Purification),学术出版社公司(Academic Press,Inc.)纽约州(1990)；桑德纳(Sandana),(1997)蛋白质的生物分离(Bioseparation of Proteins).学术出版社公司；博拉格(Bollag)等人(1996)蛋白质方法(Protein Methods),第2版威立-利斯出版社(Wiley-Liss),纽约州；沃克(Walker),(1996)蛋白质方案手册(The Protein  Protocols Handbook)胡马纳出版社(Humana Press),新泽西州；哈里斯(Harris)和安格尔(Angal),(1990)蛋白质纯化应用：实用方法(Protein Purification Applications: A Practical Approach)牛津IRL出版社(IRL Press at Oxford),英国牛津(Oxford,England)；哈里斯和安格尔,蛋白质纯化应用：实用方法牛津IRL出版社,英国牛津；斯科普斯(Scopes),(1993)蛋白质纯化：原理和实践(Protein Purification:Principles  and Practice)第3版施普林格出版社,纽约州；詹森(Janson)和赖登(Ryden),(1998)蛋白质纯化：原理，高分辨率方法和应用(Protein Purification:Principles,High  Resolution Methods and Applications),第二版威立-VCH出版社(Wiley-VCH),纽约州；和沃克(1998),蛋白质方案CD-ROM(Protein Protocols on CD-ROM)胡马纳出版社,新泽西州；和其中引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生具有非天然氨基酸的相关蛋白质或多肽的一个优点在于，蛋白质或多肽通常折叠成其天然构象。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域的技术人员将认识到，在合成、表达和/或纯化之后，蛋白质或肽可以具有与相关多肽的所需构象不同的构象。在本发明一个方面中，表达的蛋白质或多肽任选变性，随后复性。这可利用此项技术中已知的方法来实现，所述方法包括(但不限于)将伴侣蛋白(chaperonin)添加到相关蛋白质或多肽中；将蛋白质溶解于例如盐酸胍的离液剂中；利用蛋白质二硫化物异构酶等。
一般来说，有时候需要使表达的多肽变性和还原，随后使所述多肽再折叠成优选的构象。举例来说，可以将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白添加到相关翻译产物中。还原、变性和复性蛋白质的方法是所属领域的普通技术人员已知的(参见以上参考文献和德宾斯基(Debinski)等人(1993)生物化学杂志(J.BIOL. CHEM.)268:14065-14070；克赖特曼(Kreitman)和帕斯坦(Pastan)(1993)生物结合 物化学,4:581-585；和毕希纳(Buchner)等人,(1992)分析生物化学(Anal. Biochem.),205:263-270)。举例来说，德宾斯基等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。这些蛋白质可以在含有(包括(但不限于))氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中再折叠。再折叠试剂可流动或以其它方式移动，以便与一或多种多肽或其它表达产物接触，或者反之亦然。
在原核产生IL-10多肽的情况下，因此产生的IL-10多肽可能错误折叠并因此缺乏生物活性或生物活性降低。可通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。一般来说，错误折叠的IL-10多肽通过使用例如一或多种离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇，DTT或2-巯基乙醇，2-ME)使多肽链增溶(其中所属IL-10多肽还是不溶性的)、伸展和还原来再折叠。随后在中等浓度的离液剂下，添加氧化剂(例如氧、胱氨酸或胱胺)，以便再形成二硫键。IL-10多肽可以使用此项技术中已知的标准方法再折叠，例如描述于美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中的那些方法，其以引用的方式并入本文中。IL-10多肽也可以与其它蛋白质共折叠以形成异质二聚物或异质多聚物。
在再折叠之后，IL-10可经进一步纯化。可以使用所属领域的普通技术人员已知的多种技术实现IL-10的纯化，所述技术包括疏水性相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱等或其任何组合。其它纯化还可以包括干燥或沉淀经纯化蛋白质的步骤。
在纯化之后，可以将IL-10交换到不同缓冲液中和/或通过此项技术中已知的多种方法中的任一者(包括(但不限于)透滤和透析)来浓缩。以单一经纯化蛋白质的形式提供的IL-10可以经历聚集和沉淀。
经纯化IL-10可以是至少90％纯(如由逆相高效液相色谱，RP-HPLC或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE所测量的)或至少95％纯、或至少96％纯、或至少97％纯、或至少98％纯、或至少99％或99％以上纯的。不论IL-10纯度的准确数值如何，IL-10纯到足以用作医药产品或用于进一步加工，例如与水溶性聚合物(例如PEG)结合。
在不存在其它活性成分或蛋白质(除赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白等之外)的情况下，某些IL-10分子可以用作治疗剂，或其可与另一种蛋白质或聚合物复合。
一般纯化方法可以对包含IL-10多肽的细胞溶解产物、提取物、培养基、包涵体、宿主细胞周质间隙、宿主细胞细胞质或其它材料或对由任何分离步骤产生的任何IL-10多肽进行多种分离步骤中的任一种，包括(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱法(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复和任何适当次序。
用于进行本文中所述技术的设备和其它必要材料在市面上都有售。泵、馏分收集器、监测器、记录器和整个系统都可从例如应用生物系统公司(Applied Biosystems)(加利福尼亚州福斯特城(Foster City,CA))、拜耳雷德实验公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)(加利福尼亚州埃库莱斯(Hercules,CA))和安玛西亚生物科技公司(AmershamBiosciences,Inc.)(新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,NJ))获得。包括(但不限于)交换基质材料、培养基和缓冲液的色谱材料也可从这些公司获得。
可以使用专用设备(例如泵)更快速地实现平衡，以及本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤，例如洗涤和洗脱。市售的泵包括(但不限于)泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences)，位于新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,NJ))。
馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及馏分收集器(安玛西亚生物科技公司，位于新泽西州皮斯卡塔韦)。混合器也可以用于形成pH值和线性浓度的梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1和管道混合器(安玛西亚生物科技公司，位于新泽西州皮斯卡塔韦)。
可以使用任何市售监测器来监测色谱过程。所述监测器可以用于收集如UV、pH值和传导率等信息。检测器的实例包括监测器UV-1、S II、监测器UV-MII、监测器UV-900、监测器UPC-900、监测器pH/C-900和传导率监测器(安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦)。实际上，整个系统在市面上都有售，包括来自安玛西亚生物科技公司(新泽西州皮斯卡塔韦)的各种系统。
在本发明的一个实施例中，举例来说，可以通过首先使所得经纯化的IL-10多肽在尿素中变性，接着在合适的pH值下在含有还原剂(例如DTT)的TRIS缓冲液中稀释来使所述IL-10多肽还原和变性。在另一个实施例中，使IL-10多肽在浓度范围为约2M到约9M的尿素中变性，接着在约5.0到约8.0范围内的pH值下在TRIS缓冲液中稀释。随后可以培育此实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，将再折叠混合物在室温下培育4到24小时。随后可以进一步分离或纯化经还原和变性的IL-10多肽混合物。
如本文中所陈述，可以在进行任何后续分离步骤之前调整第一IL-10多肽混合物的pH值。另外，第一IL-10多肽混合物或其任何后续混合物可以使用此项技术中已知的技术来加以浓缩。此外，可以使用所属领域的普通技术人员已知的技术将包含第一IL-10多肽混合物或其任何后续混合物的洗脱缓冲液交换成适合于后续分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱在一个实施例中，并且作为任选地另外步骤，可以对第一IL-10多肽混合物进行离子交换色谱。一般参见离子交换色谱：原理和方法(ION EXCHANGECHROMATOGRAPHY:PRINCIPLES AND METHODS)(目录编号18-1114-21，安玛西亚生物科技公司(新泽西州皮斯卡塔韦))。市售离子交换柱包括和柱(安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦)。所述管柱利用强阴离子交换剂，例如Q快速流、Q高效和Q强阳离子交换剂，例如SP高效、SP快速流和SP弱阴离子交换剂，例如DEAE快速流；和弱阳离子交换剂，例如CM SEPHAROSE快速流(安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦)。可以在纯化过程的任何阶段对IL-10多肽进行阴离子或阳离子交换柱色谱，以分离实质上经纯化的IL-10多肽。可以使用任何合适的阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。适用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。所述阳离子交换基质材料包括(但不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述材料的复合物。
阳离子交换基质可以是任何适当的阳离子交换剂，包括强和弱阳离子交换剂。强阳离子交换剂可以在宽pH值范围内保持电离，并且因此能够在宽pH值范围内结合IL-10。然而，弱阳离子交换剂可随pH值变化而失去离子化。举例来说，弱阳离子交换剂在pH值下降到约pH值4或pH值5以下时可能失去电荷。合适的强阳离子交换剂包括(但不限于)例如磺丙基(SP)、甲基磺酸根(S)或磺乙基(SE)的带电荷官能团。阳离子交换基质可以是IL-10结合pH值范围优选地为约2.5到约6.0的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂的IL-10结合pH值范围可以是约pH值2.5到约pH值5.5。阳离子交换基质可以是IL-10结合pH值为约3.0的强阳离子交换剂。或者，阳离子交换基质可以是IL-10结合pH值范围优选地为约6.0到约8.0的阳离子交换剂。阳离子交换基质可以是IL-10结合pH值范围优选地为约8.0到约12.5的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂的IL-10结合pH值范围可以是约pH值8.0到约pH值12.0。
在装载IL-10之前，可以平衡阳离子交换基质，例如使用若干柱体积的稀弱酸，例如四个柱体积的20mM乙酸，pH值3。在平衡后，可以添加IL-10，并且可以洗涤柱一次到若干次，随后也使用弱酸溶液(例如弱乙酸或磷酸溶液)洗脱实质上经纯化的IL-10。举例来说，可以使用约2-4个柱体积的20mM乙酸(pH 3)洗涤柱。也可以使用其它洗涤液，例如使用2-4个柱体积的0.05M乙酸钠(pH 5.5)，或者0.05M乙酸钠与0.1M氯化钠的混合物(pH 5.5)。或者，使用此项技术中已知的方法，使用数个柱体积的稀弱碱来平衡阳离子交换基质。
或者，可以通过使阳离子交换剂基质与pH值足够低或离子强度足以从所述基质中置换IL-10的缓冲液接触来洗脱实质上经纯化的IL-10。洗脱缓冲液的pH值可以在约pH 2.5到约pH 6.0的范围内。更特定来说，洗脱缓冲液的pH值可以在约pH 2.5到约pH 5.5、约pH 2.5到约pH 5.0的范围内。洗脱缓冲液的pH值可以是约3.0。此外，洗脱缓冲液的量可变化极大，并且一般在约2到约10个柱体积的范围内。
在将IL-10多肽吸附到阳离子交换剂基质上后，可以通过使基质与pH值足够高或离子强度足以从所述基质中置换IL-10多肽的缓冲液接触来洗脱实质上经纯化的IL-10多肽。适用于实质上经纯化的IL-10多肽的高pH值洗脱的缓冲液可以包括(但不限于)浓度在至少约5mM到至少约100mM范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。
反相色谱可遵循所属领域的普通技术人员已知的合适方案进行RP-HPLC以纯化蛋白质。参见例如皮尔逊等人,分析生物化学(1982)124:217-230(1982)；里维耶(Rivier)等人,色谱杂志(J.CHROM.)(1983)268:112-119；国谷(Kunitani)等人,色谱杂志(1986)359:391-402。可以对IL-10多肽进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的IL-10多肽。关于这一点，可以使用含有具有多种长度(包括(但不限于)至少约C3到至少约C30、至少约C3到至少约C20或至少约C3到至少约C18树脂)的烷基官能团的二氧化硅衍生的树脂。或者，可以使用聚合性树脂。举例来说，可以使用托索哈斯(TosoHaas)琥珀色谱(Amberchrome)CG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可以使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合性树脂。此外，可用例如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC柱。源(Source)RP柱为RP-HPLC柱的另一实例。
含有离子配对剂和有机调节剂(例如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的合适洗脱缓冲液可以用于从RP-HPLC柱中洗脱IL-10多肽。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵和乙酸三乙基铵。可以使用一或多种梯度或等度条件来进行洗脱，其中优选减少分离时间并降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。适用于本文中的洗脱缓冲液的实例可以包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。
疏水相互作用色谱纯化技术可以对IL-10多肽进行疏水相互作用色谱(HIC)。一般参见疏水相互作用色谱手册：原理和方法(HYDROPHOBIC INTERACTIONCHROMATOGRAPHY HANDBOOK:PRINCIPLES AND METHODS)(目录编号18-1020-90，安玛西亚生物科技公司(新泽西州皮斯卡塔韦))，其以引用的方式并入本文中。合适的HIC基质可以包括(但不限于)经烷基或芳基取代的基质，例如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，所述基质包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶(sepharose)、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂(包括但不限于，聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水相互作用柱色谱的市售来源包括(但不限于)和柱(安玛西亚生物科技公司，新泽西州皮斯卡塔韦)。
简单地说，在装载之前，可以使用所属领域的普通技术人员已知的标准缓冲液(例如乙酸/氯化钠溶液，或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。可以将硫酸铵用作缓冲液来装载HIC柱。在装载IL-10多肽之后，随后可以使用标准缓冲剂和条件洗涤柱以去除非所需材料但保持所述IL-10多肽在HIC柱上。可用约3到约10个柱体积的标准缓冲液(例如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液)来洗脱IL-10多肽。使用磷酸钾梯度的降低线性盐梯度也可以用于洗脱IL-10分子。随后可例如通过过滤(例如透滤或超滤)来浓缩洗脱液。透滤可以用于去除用于洗脱IL-10多肽的盐。
其它纯化技术可对第一IL-10多肽混合物或其任何后续混合物进行使用例如以下各者的又另一种分离步骤：凝胶过滤(凝胶过滤的原理和方法(GEL FILTRATION:PRINCIPLES AND METHODS)(目录编号18-1022-18，安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦)，其以引用的方式并入本文中)、羟磷灰石色谱(合适的基质包括(但不限于)高分辨率HA-Ultrogel(卡尔生物化学公司)、CHT陶瓷羟基磷灰石(拜耳雷德公司(BioRad))、生物凝胶(Bio-Gel)HTP羟基磷灰石(拜耳雷德公司))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等，以去除任何过量盐并且将缓冲液置换成适用于随后分离步骤或甚至最终药品调配的缓冲液。
IL-10多肽(包括实质上经纯化的IL-10多肽)的产率可以在本文中所述的各步骤处使用所属领域的普通技术人员已知的技术来监测。所述技术也可以用于评估最后一个分离步骤后实质上经纯化的IL-10多肽的产率。举例来说，可以使用以下各者中的任一者来监测IL-10多肽的产率，若干具有多种烷基链长度的逆相高压液相色谱柱，例如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC；以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC。
在本发明的特定实施例中。各纯化步骤之后的IL-10产率可以是用于各纯化步骤的起始物质中IL-10的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约99.99％。
纯度可以使用标准技术(例如SDS-PAGE)或通过使用蛋白质印迹和ELISA分析测量IL-10多肽来测定。举例来说，可产生针对由阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收而分离的蛋白质的多克隆抗体。这些抗体也可以用于探查污染性宿主细胞蛋白质的存在。
RP-HPLC材料维达科(Vydac)C4(维达科公司(Vydac))由硅胶粒子组成，所述硅胶粒子表面带有C4-烷基链。IL-10多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水性相互作用强度的差异。用稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗脱。使用不锈钢柱(填充有2.8到3.2升维达科(Vydac)C4硅胶)进行制备型HPLC。通过添加三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogel洗出液，并将其装载到维达科(Vydac)C4柱上。使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度来进行洗涤和洗脱。收集各洗脱份，并立即用磷酸盐缓冲液中和。汇集处于IPC极限内的IL-10多肽洗脱份。
DEAE Sepharose(法玛西亚公司(Pharmacia))材料由与Sepharose珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。IL-10多肽与DEAE基团的结合由离子相互作用介导。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在洗掉这些物质之后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来去除微量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱，并且用离子强度增加的缓冲液洗脱IL-10多肽。用DEAE Sepharose快速流(DEAE Sepharosefast flow)填充柱。调整柱体积以确保IL-10多肽负载量在3-10毫克IL-10多肽/毫升凝胶范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/磷酸钾)洗涤柱。装载HPLC洗出液的汇集洗脱份，并用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，用洗脱缓冲液(氯化钠，磷酸钠/磷酸钾)从柱中洗脱IL-10多肽，并且根据主洗脱特征收集在单一洗脱份中。将DEAE Sepharose柱的洗出液调整到指定传导率。将所得药物物质无菌过滤到铁氟隆(Teflon)瓶中，并在-70℃下储存。
可以使用的其它方法包括(但不限于)去除内毒素的步骤。内毒素是位于革兰氏阴性宿主细胞(例如大肠杆菌)的外侧膜上的脂多糖(LPS)。用于降低内毒素含量的方法是所属领域的普通技术人员已知的，并且所述方法包括(但不限于)使用二氧化硅支撑物、玻璃粉或羟基磷灰石的纯化技术；反相色谱；亲和色谱；尺寸排阻色谱；阴离子交换色谱；疏水性相互作用色谱；这些方法的组合等。可能需要修改或其它方法以从相关多肽中去除污染物，例如共迁移蛋白质。用于测量内毒素含量的方法是所属领域的普通技术人员已知的，并且这些方法包括(但不限于)鲎变形细胞溶解物(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)分析。EndosafeTM-PTS分析是利用预装载有LAL试剂、发色底物和对照标准内毒素的料筒以及手持式分光光度计的比色、单管系统。其它方法包括(但不限于)动力学LAL法，其为比浊度分析法并使用96孔形式。
可以使用多种方法和程序来分析包含一或多个非天然编码氨基酸的IL-10蛋白质的产率和纯度，所述方法包括(但不限于)布拉德福德分析(Bradford assay)、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯(coomassie)染色SDS-PAGE、质谱(包括(但不限于)MALDI-TOF)以及所属领域的普通技术人员已知的用于表征蛋白质的其它方法。
其它方法包括(但不限于)：与蛋白质染色法偶合的SDS-PAGE、免疫印迹法、基质辅助激光解吸附/离子化质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱焦聚和圆二色谱。
VIII.替代系统中的表达
已使用数种策略在非重组宿主细胞、诱变的宿主细胞或无细胞系统中将非天然氨基酸引入蛋白质中。这些系统还适用于制造本发明的IL-10多肽。具有反应性侧链的氨基酸(例如Lys、Cys和Tyr)的衍生化会使得赖氨酸转化为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也是一种并入非天然氨基酸的直截了当的方法。随着近来肽片段的酶促接合和天然化学接合的发展，有可能制造出更大的蛋白质。参见例如P.E.道森(P.E.Dawson)和S.B.H.肯特(S.B.H.Kent),生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem),69:923(2000)。化学肽接合和天然化学接合描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO 02/098902和WO03/042235中，这些专利都以引用的方式并入本文中。已使用其中将利用所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制性tRNA加到能够支持蛋白质生物合成的体外提取物中的一般体外生物合成方法，将超过100个非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。参见例如V.W.科尼什(V.W.Cornish),D.孟德尔(D.Mendel)和P.G.舒尔茨,应用化学国际英文版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.),1995,34:621(1995)；C.J.诺伦(C.J.Noren),S.J.安东尼-卡希尔(S.J.Anthony-Cahill),M.C.格里菲斯(M.C.Griffith),P.G.舒尔茨,用于将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中的一般方法(Ageneral method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins),科 学244:182-188(1989)；和J.D.贝恩(J.D.Bain),C.G.格雷布(C.G.Glabe),T.A.迪克斯(T.A.Dix),A.R.张伯伦(A.R.Chamberlin),E.S.迪亚拉(E.S.Diala),将非天然氨基酸生物合成性位点特异性地并入多肽中(Biosynthetic site-specific incorporation of anon-natural amino acid into a polypeptide),美国化学会志111:8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机制和信号转导的研究。
已开发出一种称作选择性压力并入(selective pressure incorporation)的体内方法，来研究野生型合成酶的杂乱性(promiscuity)。参见例如N.布迪萨(N.Budisa),C.明克斯(C.Minks),S.阿尔费尔德(S.Alefelder),W.威戈(W.Wenger),F.M.董(F.M.Dong),L.莫洛德尔(L.Moroder)和R.胡贝尔(R.Huber),美国实验生物学联合会会 志(FASEB J.),13:41(1999)。使其中向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株生长于含有有限浓度天然氨基酸的基本培养基中，而目标基因的转录受到阻遏。在稳定生长期开始时，天然氨基酸被耗尽，并且被非天然氨基酸类似物置换。诱导重组蛋白表达将使含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，使用此策略，已经将邻、间和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，并且在UV光谱中展现两个可易于鉴别的特征肩峰，参见例如C.明克斯,R.胡贝尔,L.莫洛德尔和N.布迪萨,分析生物化学 (Anal.Bio chem.).284:29(2000)；已经使用三氟甲硫氨酸置换噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通过19F NMR研究其与壳寡糖配体的相互作用，参见例如H.杜维尔(H.Duewel),E.多布(E.Daub),V.罗宾逊(V.Robinson)和J.F.霍尼克(J.F.Honek),生 物化学,36:3404(1997)；以及将三氟亮氨酸并入亮氨酸的位置处，使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性提高。参见例如Y.唐(Y.Tang),G.吉兰达(G.Ghirlanda),W.A.)佩特卡(W.A.Petka),T.中岛(T.Nakajima),W.F.德格拉多(W.F.DeGrado)和D.A.蒂雷尔(D.A.Tirrell),应用化学国际英文版,40:1494(2001)。此外，将硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各种重组蛋白质中以促进X射线结晶学中的相溶解。参见例如W.A.亨德里克森(W.A.Hendrickson),J.R.荷顿(J.R.Horton)和D.M.勒马斯特(D.M.Lemaster),欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.),9:1665(1990)；J.O.博尔斯(J.O.Boles),K.雷文斯基(K.Lewinski),M.孔克尔(M.Kunkle),J.D.奥多姆(J.D.Odom),B.邓拉普(B.Dunlap),L.莱贝达(L.Lebioda)和M.畑田(M.Hatada),自 然结构与分子生物学(Nat.Struct.Biol.).1:283(1994)；N.布迪萨,B.斯特皮(B.Steipe),P.德芒热(P.Demange),C.埃克斯科恩(C.Eckerskorn),J.凯勒曼(J.Kellermann)和R.胡贝尔,欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.),230:788(1995)；和N.布迪萨,W.卡恩布洛克(W.Karnbrock),S.施泰因巴赫(S.Steinbacher),A.胡姆(A.Humm),L.布雷德(L.Prade),T.纽斐因德(T.Neuefeind),L.莫洛德尔和R.胡贝尔,分子生物学杂志,270:616(1997)。也已有效地并入具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物，由此允许借助化学方式对蛋白质进行其它修饰。参见例如J.C.范·赫斯特(J.C.van Hest)和D.A.蒂雷尔,欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.),428:68(1998)；J.C.范·赫斯特,K.L.基克(K.L.Kiick)和D.A.蒂雷尔,美国化学会志122:1282(2000)；和K.L.基克和D.A.蒂雷尔,四面体(Tetrahedron),56:9487(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案2002/0042097，其以引用的方式并入本文中。
这种方法的成功取决于氨酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，而这种合成酶一般来说需要高选择性来确保蛋白质翻译的保真度。一种扩展这种方法范围的方式是放宽氨酰基-tRNA合成酶的底物特异性，这已在少数情况下实现。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中用Gly置换Ala增加底物结合袋的尺寸，并且使tRNAPhe由对氯-苯丙氨酸(p-Cl-Phe)酰化。参见M.伊巴(M.Ibba),P.卡斯特(P.Kast)和H.亨内克(H.Hennecke),生物化学,33:7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯-苯丙氨酸或对溴-苯丙氨酸来替代苯丙氨酸。参见例如M.伊巴和H.亨内克,欧洲生化学会联合会快报,364:272(1995)；和N.沙玛(N.Sharma),R.弗特(R.Furter),P.卡斯特和D.A.蒂雷尔,欧洲生化学会联合会快报.467:37(2000)。类似地，显示接近大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phe130Ser使重氮酪氨酸比酪氨酸高效地并入。参见F.浜野-高久(F.Hamano-Takaku),T.岩间(T.Iwama),S.齐藤-矢野(S.Saito-Yano),K.高久(K.Takaku),Y.门田(Y.Monden),M.北畠(M.Kitabatake),D.索伊尔(D.Soil)和S.西村(S.Nishimura),生物化学杂志(J.BIOL.CHEM),275:40324(2000)。
在体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略为修饰具有校对机制(proofreading mechanism)的合成酶。这些合成酶不能区分结构与同源天然氨基酸类似的氨基酸，并因此将其活化。此错误在单独位点上得到校正，使得来自tRNA的错配(mischarged)氨基酸去酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能，并被并入。近来已利用缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证实了这种方法。参见V.多林(V.Doring),H.D.莫兹(H.D.Mootz),L.A.南格尔(L.A.Nangle),T.L.亨德里克森(T.L.Hendrickson),V.德·克雷西-拉加德(V.de Crecy-Lagard),P.舒密尔(P.Schimmel)和P.马里埃尔(P.Marliere),科学,292:501(2001)。ValRS可使带有Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)的tRNAVal错误氨酰基化；随后通过编辑结构域水解这些非同源氨基酸。在大肠杆菌染色体的随机诱变之后，选择在ValRS编辑位点中具有突变的突变体大肠杆菌菌株。此编辑缺陷ValRS不正确地向tRNAVal中载入Cys。因为Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团经Abu中的-CH3置换)，所以当这种突变大肠杆菌菌株在Abu存在下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示，在天然蛋白质的各缬氨酸位置处约24％的缬氨酸经Abu置换。
固相合成和半合成方法也已能够合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说，参见以下出版物和其中引用的参考文献，所述出版物和参考文献如下：克里克F.H.C.(Crick,F.H.C.),巴雷特L.(Barrett,L.),勃伦那S.(Brenner,S.),瓦茨-托宾R.(Watts-Tobin,R.)蛋白质遗传编码的一般性质(General nature of the genetic code forproteins).自然,192:1227-1232(1961)；霍夫曼K.(Hofmann,K.),博恩H.(Bohn,H.)多肽研究.XXXVI.吡唑-咪唑置换对S-肽片段的S-蛋白质活化效力的作用(Studies onpolypeptides.XXXVI.The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-proteinactivating potency of an S-peptide fragment),美国化学杂志(J.Am Chem),88(24):5914-5919(1966)；凯泽E.T.(Kaiser,E.T.)包括酶的生物活性肽和蛋白质的合成方法(Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins includingenyzmes),化学研究述评(Acc Chem Res),22:47-54(1989)；中冢T.(Nakatsuka,T.),佐佐木T.(Sasaki,T).,凯泽E.T.通过半合成酶枯草杆菌蛋白酶催化的肽区段偶合(Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin),美国化学 会志109:3808-3810(1987)；施诺泽M.(Schnolzer,M.),肯特S B H(Kent,S B H.)通过接合无保护合成肽来构建蛋白质：主链经工程改造的HIV蛋白酶(Constructingproteins by dovetailing unprotected synthetic peptides:backbone-engineered HIVprotease),科学,256(5054):221-225(1992)；柴肯I.M.(Chaiken,I.M.)半合成肽和蛋白质(Semisynthetic peptides and proteins),CRC生物化学评论(CRC Crit Rev  Biochem.)11(3):255-301(1981)；奥弗德R.E.(Offord,R.E.)通过化学手段的蛋白质改造？(Protein engineering by chemical means？)蛋白质工程(Protein Eng.),1(3):151-157(1987)；和杰克逊D.Y.(Jackson,D.Y.),邦米尔J.(Bumier,J.),权C(Quan,C),斯坦利M.(Stanley,M.),汤姆J.(Tom,J.),威尔斯J.A.(Wells,J.A.)用于全合成具有非天然催化性残基的核糖核酸酶A的经设计肽连接酶(A Designed Peptide Ligase forTotal Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues),科学,266(5183):243(1994)。
已使用化学修饰在体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸在内的多种非天然侧链引入蛋白质中。参见例如科里D.R.(Corey,D.R.),舒尔茨P.G.混合型序列特异性单股脱氧核糖核酸酶的产生(Generation of a hybrid sequence-specific single-strandeddeoxyribonuclease),科学.238(4832):1401-1403(1987)；凯泽E.T.,劳伦斯D.S.(Lawrence D.S.),罗基塔S.E.(Rokita,S.E.)酶特异性的化学修改(The chemicalmodification of enzymatic specificity),生物化学年鉴,54:565-595(1985)；凯泽E.T.,劳伦斯D.S.酶活性位点的化学突变(Chemical mutation of enyzme active sites),科学,226(4674):505-511(1984)；尼特K.E.(Neet,K.E.),南奇A(Nanci A),科什兰D.E.(Koshland,D.E).硫氢基-枯草杆菌蛋白酶的特性(Properties of thiol-subtilisin),生物 化学杂志(J.BIOL.CHEM),243(24):6392-6401(1968)；波加L.(Polgar,L.)和M.L.本德(M.L.Bender.)含有以合成方式形成的活性位点的新酶.硫氢基-枯草杆菌蛋白酶(Anew enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin).美国化学会志,88:3153-3154(1966)；和波拉克S.J.(Pollack,S.J.),中山G.(Nakayama,G.),舒尔茨P.G.亲核基团和光谱探针在抗体组合位点中的引入(Introduction of nucleophiles andspectroscopic probes into antibody combining sites),科学.242(4881):1038-1040(1988)：
或者，也已经使用采用化学修饰氨酰基-tRNA的生物合成方法来将数种生物物理探针并入体外合成的蛋白质中。参见以下出版物和其中引用的参考文献：布伦纳J.(Brunner,J.)新光学标记和交联方法(New Photolabeling and crosslinking methods),生 物化学年鉴,62:483-514(1993)；和克里格U.C.(Krieg,U.C.),沃尔特P.(Walter,P.),约翰逊A.E.(Hohnson,A.E.)信号识别粒子的54,000道尔顿多肽的新生预催乳激素信号序列的光交联(Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle),国家科学院院刊,83(22):8604-8608(1986)。
先前已证实，在体外通过将以化学方式氨酰基化的抑制子tRNA添加到经含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中，可以将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，可以使用对于特定氨基酸来说为营养缺陷型的菌株，用密切结构同源物取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。参见例如诺伦C.J.(Noren,C.J.),安东尼-卡希尔,格里菲斯M.C.(Griffith,M.C.),舒尔茨P.G.用于将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中的一般方法,科学,244:182-188(1989)；M.W.诺瓦克(M.W.Nowak)等人,科学268:439-42(1995)；贝恩J.D.(Bain,J.D.),格雷布C.G.(Glabe,C.G.),迪克斯T.A.(Dix,T.A.),张伯伦A.R.(Chamberlin,A.R.),迪亚拉E.S.(Diala,E.S.)将非天然氨基酸生物合成性位点特异性地并入多肽中,美国化学会志,111:8013-8014(1989)；N.布迪萨等人,美国实验生物学联 合会会志13:41-51(1999)；埃尔曼J.A.(Ellman,J.A.),孟德尔D.(Mendel,D.),安东尼-卡希尔S.(Anthony-Cahill,S.),诺伦C.J.,舒尔茨P.G,用于将非天然氨基酸位点特异性地引入蛋白质中的生物合成方法(Biosynthetic method for introducing unnaturalamino acids site-specifically into proteins).酶学方法(Methods in Enz.),第202卷,301-336(1992)；和孟德尔D.,科尼什V.W.和舒尔茨P.G.使用扩展遗传编码的定点诱变(Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code),生物物理学与生物分子结构 年鉴(Annu Rev Biophys.Biomol Struct.)24,435-62(1995)。
举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制子tRNA，并用非天然氨基酸以化学方式氨酰基化。使用常规定点诱变在蛋白质基因中的相关位点处引入终止密码子TAG。参见例如塞耶斯J.R.,施密特W.(Schmidt,W.),埃克斯坦F.在基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向诱变中的5'-3'核酸外切酶(5'-3'Exonucleases in phosphorothioate-basedolignoucleotide-directed mutagensis),核酸研究,16(3):791-802(1988)。当将酰基化抑制子tRNA和突变基因在体外转录/翻译系统中组合时，响应于UAG密码子而并入非天然氨基酸，得到在指定位置含有所述氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验以及使用？羟基酸的实验证实，在由UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且此氨基酸未在蛋白质中的任何其它位点处并入。参见例如诺伦(Noren)等人,同前文献；小林(Kobayashi)等人,(2003)自然结构生物学(Nature Structural Biology)10(6):425-432；和埃尔曼J.A.,孟德尔D.,舒尔茨P.G.将新颖主链结构位点特异性地并入蛋白质中(Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins),科学,255(5041):197-200(1992)。
可以通过任何方法或技术(包括(但不限于)化学或酶促氨酰基化)利用所需氨基酸将tRNA氨酰基化。
氨酰基化可以通过氨酰基tRNA合成酶或其它酶分子(包括(但不限于)核糖酶)实现。术语“核糖酶”可与“催化性RNA”互换。切赫(Cech)和同事(切赫,1987,科学,236:1532-1539；麦考科克(McCorkle)等人,1987,生物化学概念(ConceptsBiochem.)64:221-226)证实可以充当催化剂的天然存在RNA(核酶)的存在。然而，尽管仅显示这些天然RNA催化剂对核糖核酸底物作用而实现裂解和剪接，但近来核糖酶人为进化的发展已将催化谱系扩充到各种化学反应。研究已鉴别出可催化自身(2')3'-末端的氨酰基RNA键的RNA分子(艾兰加克凯尔(Illangakekare)等人,1995科学267:643-647)，以及可以将氨基酸从一个RNA分子转移到另一个RNA分子的RNA分子(洛斯(Lohse)等人,1996,自然381:442-444)。
美国专利申请公开案2003/0228593(其以引用的方式并入本文中)描述了构建核糖酶的方法和其在利用天然编码和非天然编码氨基酸将tRNA氨酰基化中的用途。可使tRNA氨酰基化的酶分子(包括(但不限于)核糖酶)的底物固定形式(Substrate-immobilized forms)能够有效亲和纯化氨酰基化的产物。合适底物的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。用于氨酰基化的底物固定形式核糖酶的制备和用途描述于化学与 生物学2003,10:1077-1084和美国专利申请公开案2003/0228593中，其以引用的方式并入本文中。
化学氨酰化方法包括(但不限于)由赫克特(Hecht)和同事(赫克特S.M.(Hecht,S.M.)化学研究述评1992,25,545；赫克勒T.G.(Heckler,T.G.)；罗塞尔J.R.(Roesser,J.R.)；徐C(Xu,C)；常P.(Chang,P.)；赫克特S.M.生物化学1988,27,7254；赫克特S.M.；奥尔福德B.L.(Alford,B.L.)；黑田Y.(Kuroda,Y.)；北野S.(Kitano,S.)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1978,253,4517)和由舒尔茨(Schultz)、张伯伦(Chamberlin)、多尔蒂(Dougherty)等(科尼什V.W.；孟德尔D.；舒尔茨P.G.应用化学国际英文版1995,34,621；罗伯森S.A.(Robertson,S.A.)；埃尔曼J.A.；舒尔茨P.G.美国化学会志1991,113,2722；诺伦C.J.；安东尼-卡希尔S.J.(Anthony-Cahill,S.J.)；格里菲斯M.C；舒尔茨P.G.科学1989,244,182；贝恩J.D.；格雷布C.G.；迪克斯T.A.；张伯伦A.R.美国化学会志1989,111,8013；贝恩J.D.等人自然1992,356,537；加利文J.P.(Gallivan,J.P.)；莱斯特H.A.(Lester,H.A.)；多尔蒂D.A.(Dougherty,D.A.)化学与生物学(Chem.Biol.)1997,4,740；图卡迪(Turcatti)等人生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1996,271,19991；诺瓦克M.W.(Nowak,M.W.)等人科学,1995,268,439；萨克斯M.E.(Saks,M.E.)等人生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1996,271,23169；郝萨卡T.(Hohsaka,T.)等人美国化学会志1999,121,34)介绍的那些方法以避免在氨酰化中使用合成酶，所述文献以引用的方式并入本文中。所述方法或其它化学氨酰基化方法可以用于使tRNA分子氨酰基化。
产生催化性RNA的方法可涉及产生随机核糖酶序列的单独集合；对所述集合进行定向演化；针对所需氨酰基化活性筛选所述集合；和选择展现所需氨酰基化活性的核糖酶序列。
核酶可以包含促进酰化活性的基序和/或区域，例如GGU基序和富U区域。举例来说，已报导富集U的区域可促进氨基酸底物的识别，而GGU基序可与tRNA的3'端形成碱基对。GGU基序与富集U区域的组合将促进同时识别氨基酸与tRNA，并因此促进tRNA 3'端的氨酰基化。
可通过使用与tRNAAsn CCCG结合的部分随机化r24mini进行体外选择，随后系统地工程改造活性克隆体中所见的共有序列，来产生核糖酶。通过此方法获得的例示性核糖酶称为“Fx3核糖酶”，并且描述于美国公开申请案第2003/0228593号(其内容以引用的方式并入本文中)中，所述核糖酶充当用于合成载有同源非天然氨基酸的各种氨酰基-tRNA的通用催化剂。
在底物上固定可以用于促成氨酰基化tRNA的有效亲和纯化。合适底物的实例包括(但不限于)琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。可利用RNA的化学结构将核糖酶固定于树脂上，例如，RNA核糖上的3'-顺-二醇可经高碘酸盐氧化得到相应的二醛，从而促使将RNA固定于树脂上。可以使用各种类型的树脂，包括廉价的酰肼树脂，其中还原胺化使得所述树脂与核糖酶之间相互作用形成不可逆的键。通过此种柱上氨酰基化技术(on-column aminoacylation technique)可显著促进氨酰基-tRNA的合成。库洛克里斯(Kourouklis)等人方法(Methods)2005；36:239-4描述基于柱的氨酰化系统。
氨酰基化tRNA的分离可以用多种方式实现。一种合适的方法是用缓冲液从柱中洗脱氨酰基化tRNA，所述缓冲液例如具有10mM EDTA的乙酸钠溶液、含有50mM N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl(pH 7.0)、10mM EDTA的缓冲液或简单经EDTA缓冲的水(pH 7.0)。
可以将氨酰基化tRNA添加到翻译反应中，以便将使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻译反应所产生的多肽中的所选位置中。可以使用本发明的氨酰基化tRNA的翻译系统的实例包括(但不限于)细胞溶解产物。细胞溶解产物提供由输入mRNA体外翻译多肽必需的反应组件。所述反应组件的实例包括(但不限于)核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始因子和延伸因子以及其它与翻译有关的因子。另外，翻译系统可以是分批翻译或分区翻译。分批翻译系统在单个区室中组合反应组件，而分区翻译系统将翻译反应组件与可能抑制翻译效率的反应产物分离。这些翻译系统在市面上都有销售。
此外，可以使用偶合的转录/翻译系统。偶合的转录/翻译系统允许将输入DNA转录成相应的mRNA，而所述mRNA接着又由反应组件翻译。市售的偶合转录/翻译的实例为快速翻译系统(Rapid Translation System，RTS，罗氏公司(Roche Inc.))。这一系统包括含有大肠杆菌溶解产物的混合物，用于提供例如核糖体和翻译因子等翻译组件。另外，还包括RNA聚合酶，用于将输入DNA转录成mRNA模板以供翻译使用。RTS可借助于插入反应区室(包括供料/废料区室和转录/翻译区室)之间的膜来将反应组件区室化。
可利用包括(但不限于)转移酶、聚合酶、催化性抗体、多功能蛋白等的其它试剂来将tRNA氨酰基化。
斯蒂芬(Stephan)在科学家(Scientist),2005年10月10日；第30-33页中描述将非天然编码氨基酸并入蛋白质中的其它方法。卢等人在分子细胞(Mol Cell).2001年10月；8(4):759-69中描述一种其中蛋白质以化学方式与含有非天然氨基酸的合成肽接合的方法(经表达蛋白质接合)。
也已使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。参见例如M.W.诺瓦克,P.C.科尔尼(P.C.Kearney),J.R.桑普森(J.R.Sampson),M.E.萨克斯(M.E.Saks),C.G.拉瓦尔卡(C.G.Labarca),S.K.西尔弗曼(S.K.Silverman),W.G.钟(W.G.Zhong),J.索尔森(J.Thorson),J.N.阿贝尔森(J.N.Abelson),N.戴维森(N.Davidson),P.G.舒尔茨,D.A.多尔蒂(D.A.Dougherty)和H.A.莱斯特(H.A.Lester),科学.268:439(1995)；和D.A.多尔蒂,化学生物学新见(Curr.Opin.Chem.Biol.),4:645(2000)。将非洲爪蟾属(Xenopus)卵母细胞与体外制得的两种RNA物质共注射：编码在相关氨基酸位置处具有UAG终止密码子的目标蛋白的mRNA和用所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制子tRNA。随后，卵母细胞的翻译机器在UAG指定的位置插入非天然氨基酸。这种方法允许进行一般不适用于体外表达系统的整合膜蛋白的体内结构-功能研究。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量传递法测量距离，参见例如G.图卡迪(G.Turcatti),K.奈米斯(K.Nemeth),M D.埃杰顿(M D.Edgerton),U.梅塞思(U.Meseth),F.塔拉波(F.Talabot),M.佩施(M.Peitsch),J.诺尔斯(J.Knowles),H.沃格尔(H.Vogel)和A.肖莱(A.Chollet),生物化学杂志(J. BIOL.CHEM),271:19991(1996)；并入生物素化氨基酸以识别离子通道中的表面暴露残基，参见例如J.P.加利文(J.P.Gallivan),H.A.莱斯特(H.A,Lester)和D.A多尔蒂,化学与生物学,4:739(1997)；使用笼状酪氨酸类似物来实时监测离子通道中的构象变化，参见例如J.C.米勒(J.C.Miller),S.K.西尔弗曼,P.M.英格兰(P.M.England),D.A多尔蒂和H.A.莱斯特,神经元(Neuron),20:619(1998)；和使用α羟基氨基酸来改变离子通道主链以探查其选通机制。参见例如P.M.英格兰,Y.张(Y.Zhang),D.A多尔蒂和H.A.莱斯特,细胞,96:89(1999)；和T.卢(T.Lu),A.Y.廷(A.Y.Ting),J.梅因兰(J.Mainland),L.Y.简(L.Y.Jan),P.G.舒尔茨和J.杨(J.Yang),自然神经科学(Nat. Neurosci.),4:239(2001)。
在体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力具有多种益处，包括(但不限于)突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活生物体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白用于治疗性治疗和诊断应用的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它特性的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展合理且系统地操纵蛋白质结构的能力，从而探查蛋白质功能，并产生具有新颖特性的新蛋白质或生物体。论述IL-10和其治疗用途，例如在“IL-10/IL-10：凋亡信号传导、生物学和用于癌症疗法的潜能”阿尔梅桑A(Almasan A),阿什肯纳齐A(Ashkenazi A.)；细胞因子生长因子综述(Cytokine Growth Factor Rev.)2003年6月-8月；14(3-4):337-48.综述.中。其以引用之方式併入本文中。
在位点特异性地并入对F-Phe的一次尝试中，在p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中使用酵母琥珀抑制子tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对。参见例如R.弗特,蛋白质科学(Protein Sci.),7:419(1998)。
也有可能使用无细胞(体外)翻译系统获得本发明IL-10多核苷酸的表达。翻译系统可以是细胞翻译系统或无细胞翻译系统，并且可以是原核或真核翻译系统。细胞翻译系统包括(但不限于)全细胞制剂，例如其中可以将所需核酸序列转录成mRNA并且翻译所述mRNA的渗透细胞或细胞培养物。无细胞翻译系统在市面上有售，并且许多不同类型和系统是众所周知的。无细胞系统的实例包括(但不限于)原核细胞溶解产物，例如大肠杆菌溶解产物；和真核细胞溶解产物，例如麦胚提取物、昆虫细胞溶解产物、兔网织红细胞溶解产物、兔卵母细胞溶解产物和人细胞溶解产物。当将所得蛋白质经糖基化、磷酸化，或以其它方式进行修饰时，因为许多所述修饰只可能在真核系统中发生，所以优选真核提取物或溶解产物。这些提取物和溶解产物中有一些在市面上有售(普洛麦格公司(Promega),威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.)；赛特杰公司,加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla,Calif.)；安玛西亚公司(Amersham),伊利诺伊州阿灵顿海茨(Arlington Heights,Ill.)；GIBCO/BRL公司,纽约州格兰德岛(GrandIsland,N.Y.))。也有膜提取物(例如含有微粒体膜的犬胰腺提取物)可用，其适用于翻译分泌蛋白质。在这些可以包括mRNA作为模板(体外翻译)或DNA作为模板(组合的体外转录与翻译)的系统中，体外合成是由核糖体所引导的。曾进行过相当多的尝试来开发无细胞蛋白质表达系统。参见例如金姆D.M.(Kim,D.M.)和J.R.斯沃茨(J.R.Swartz),生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering),74:309-316(2001)；金姆D.M.和J.R.斯沃茨,生物技术快报(Biotechnology Letters),22,1537-1542,(2000)；金姆D.M.和J.R.斯沃茨,生物技术进展(Biotechnology Progress),16,385-390,(2000)；金姆D.M.和J.R.斯沃茨,生物技术与生物工程,66,180-188,(1999)；和帕特奈克R.(Patnaik,R.)和J.R.斯沃茨,生物技术(Biotechniques)24,862-868,(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO00/55353；WO 90/05785，其以引用的方式并入本文中。另一种可以应用于表达包含非天然编码氨基酸的IL-10多肽的方法包括mRNA-肽融合技术。参见例如R.罗伯茨(R.Roberts)和J.绍斯塔克(J.Szostak),美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.(USA))94:12297-12302(1997)；A.弗兰克尔(A.Frankel)等人,化学与生物学(Chemistry&Biology)10:1043-1050(2003)。在此方法中，在核糖体上将连接嘌呤霉素(puromycin)的mRNA模板翻译成肽。如果已对一或多个tRNA分子进行修饰，那么也可以将非天然氨基酸并入所述肽中。在读取了最后一个mRNA密码子后，嘌呤霉素捕获肽的C端。如果发现所得mRNA-肽结合物在体外分析中具有引人关注的特性，那么可以容易地由mRNA序列揭示其身份。以此方式，可以筛选包含一或多个非天然编码氨基酸的IL-10多肽的文库以识别具有所需特性的多肽。最近，已报导利用经纯化组分进行的体外核糖体翻译，其允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。参见例如A.福斯特(A.Forster)等人,美国国家科学院院刊100:6353(2003)。
还可以使用重构的翻译系统。已成功地使用经纯化翻译因子的混合物以及溶解产物或补充有经纯化翻译因子(例如，起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延长因子T(EF-Tu)或终止因子)的溶解产物的组合将mRNA翻译成蛋白质。无细胞系统也可以是偶合的转录/翻译系统，其中如现行分子生物学方案(F.M.奥斯贝(F.M.Ausubel)等人编辑,威立出版公司(Wiley Interscience),1993)(以引用的方式清楚地并入本文中)中所述，将DNA引入所述系统中，转录成mRNA并翻译mRNA。在真核转录系统中转录的RNA可以呈异核RNA(hnRNA)或者5'-端封端(7-甲基鸟苷)且3'-端加多聚腺苷酸(A)尾的成熟mRNA形式，这在某些翻译系统中可以是有利条件。举例来说，在网织红细胞溶解产物系统中，以高效率翻译封端的mRNA。
IX.与IL-10多肽偶合的大分子聚合物
可以使用本文中所述的组合物、方法、技术和策略对本文中所述的非天然氨基酸多肽进行各种修饰。这些修饰包括将其它官能团并入多肽的非天然氨基酸组分上，所述官能团包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；并入有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子俘获剂；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。作为本文中所述的组合物、方法、技术和策略的一个说明性非限制性实例，以下描述将集中于将大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽上，同时理解对其所述的的组合物、方法、技术和策略(必要时进行适当修改并且所属领域的技术人员可以用本文所揭示内容进行所述修改)还可适用于添加其它官能团，包括(但不限于)上文所列的那些官能团。
多种大分子聚合物和其它分子可以与本发明的IL-10多肽连接，以调节所述IL-10多肽的生物学特性和/或为所述IL-10分子提供新生物学特性。这些大分子聚合物可以通过天然编码氨基酸、通过非天然编码氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或添加到天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能团与IL-10多肽连接。聚合物的分子量可以在广泛范围内，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da之间或为更高。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
本发明提供实质上均质的聚合物:蛋白质结合物制剂。本文中所用的“实质上均质”意味着观测到聚合物:蛋白质结合物分子大于总蛋白质的一半。聚合物:蛋白质结合物具有生物活性，并且本文中提供的本发明“实质上均质”聚乙二醇化IL-10多肽制剂是均质到足以显示均质制剂优势(例如在临床应用中易于预测批次之间的药物动力学)的那些制剂。
也可以选择制备聚合物:蛋白质结合物分子的混合物，并且本文中提供的优点在于可选择包括在所述混合物中的单聚物:蛋白质结合物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与各种数量的连接聚合物部分(即，二聚物、三聚物、四聚物等)的混合物，并将所述结合物与使用本发明方法制备的单聚物:蛋白质结合物组合，得到具有预定的单聚物:蛋白质结合物比例的混合物。
所选聚合物可以是水溶性聚合物，以致其连接的蛋白质不会在水性环境(例如生理环境)中沉淀。聚合物可以是分支或未分支聚合物。对治疗性使用最终产品制剂来说，聚合物应是医药学上可接受的。
聚合物的实例包括(但不限于)聚烷基醚和其经烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)、聚氧乙二醇/丙二醇以及其经甲氧基或乙氧基封端的类似物，尤其聚氧乙二醇，后者也被称作聚乙二醇(polyethyleneglycol)或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺(例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚丙烯酸羟基烷基酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；聚糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如，羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如，羧甲基纤维素、羟基烷基纤维素；几丁质和其衍生物，例如，壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基几丁质、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如，聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，例如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；以及上述物质的衍生物。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将变化，二者在反应混合物中的浓度也将变化。一般来说，最佳比率(就反应效率来说，因为存在极少量过量的未反应的蛋白质或聚合物)可通过所选聚乙二醇的分子量和可用反应性基团的可用数量来确定。对于分子量，通常聚合物的分子量越高，则可与蛋白质连接的聚合物分子的数量就越少。类似地，在优化这些参数时应考虑聚合物的分支。一般来说，分子量越高(或分支越多)，则聚合物:蛋白质的比率就越高。
本文中使用并考虑PEG:IL-10多肽结合物时的术语“治疗有效量”是指向患者提供所需益处的量。所述量将随个体差异而不同，并且取决于多种因素，包括患者的总体身体状况和待治疗病状的潜在病因。用于疗法的IL-10多肽的量在有利的含量下提供可接受的变化率并维持所需响应。所属领域的普通技术人员使用公开可用的材料和程序可容易地确定本发明组合物的治疗有效量。
水溶性聚合物可以是任何结构形式，包括(但不限于)直链、叉状或分支形式。通常，水溶性聚合物为聚(烷二醇)，例如聚(乙二醇)(PEG)，但也可以使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG描述本发明的某些实施例。
PEG是一种众所周知的水溶性聚合物，其为市售产品，或者可根据所属领域的普通技术人员已知的方法，通过使乙二醇开环聚合来制备(萨德勒(Sandler)和卡罗(Karo),聚合物合成(Polymer Synthesis),学术出版社,纽约,第3卷,第138-161页)。术语“PEG”广泛地用于涵盖任何聚乙二醇分子，而不考虑大小或在PEG末端的修饰，并且可以由下式表示为与IL-10多肽连接：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
其中n是2到10,000并且X是H或末端修饰，包括(但不限于)C1-4烷基、保护基或末端官能团。
在一些情况下，本发明中使用的PEG的一个末端以羟基或甲氧基封端，即，X是H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以用反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型的反应性基团可以包括常用于与以下官能团反应的那些反应性基团：见于20种常见氨基酸中的官能团(包括(但不限于)马来酰亚胺基、经活化碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯酯)、经活化酯(包括(但不限于)N-羟基丁二酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)，以及对所述20种常见氨基酸呈惰性但与存在于非天然编码氨基酸中的互补官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)叠氮基、炔基)。应注意，PEG的另一端(在上式中由Y表示)将直接或通过天然存在或非天然编码氨基酸间接与IL-10多肽连接。举例来说，Y可以是与多肽胺基(包括(但不限于)赖氨酸的ε胺或N端)形成的酰胺、氨基甲酸酯或脲键。或者，Y可以是与硫醇基(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基)形成的马来酰亚胺键。或者，Y可以是与通常不可通过20种常见氨基酸得到的残基形成的键。举例来说，PEG上的叠氮基可以与IL-10多肽上的炔基反应以形成胡伊斯根[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与非天然编码氨基酸中存在的叠氮基反应形成类似产物。在一些实施例中，强亲核基团(包括(但不限于)肼、酰肼、羟胺、氨基脲)适当时可与非天然编码氨基酸中存在的醛或酮反应形成腙、肟或缩氨基脲，其在一些情况下可通过用适当的还原剂处理进一步还原。或者，强亲核基团可以通过非天然编码氨基酸而并入IL-10多肽中，并且用于优先与存在于水溶性聚合物中的酮或醛基反应。
PEG的任何分子质量可视实际需要使用，包括(但不限于)约100Da到100,000Da，或必要时更高(包括(但不限于)有时是0.1到50kDa或10到40kDa)。PEG的分子量可以在广泛范围内，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da之间或为更高。PEG可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，PEG介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约10,000Da与约40,000Da之间。还可以使用支链PEG，包括(但不限于)各链的MW在1到100kDa(包括(但不限于)1到50kDa或5到20kDa)范围内的PEG分子。支链PEG各链的分子量可(包括(但不限于))介于约1,000Da与约100,000Da之间或为更高。支链PEG的各链的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da以及1,000Da。在一些实施例中，支链PEG各链的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG各链的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG各链的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG各链的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。多种PEG分子描述于(包括(但不限于))肖尔沃特聚合物公司(Shearwater Polymers,Inc.)目录、奈克塔治疗品公司(Nektar Therapeutics)目录中，二者都以引用方式并入本文中。
一般来说，PEG分子的至少一个末端可以用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说，可以使用带有供与氨基酸侧链反应的炔和叠氮部分的PEG衍生物来将PEG连接到本文中所述的非天然编码氨基酸上。如果非天然编码氨基酸包含叠氮基，那么PEG通常将含有炔部分以形成[3+2]环加成产物，或者将含有含膦基的经活化PEG物质(即，酯、碳酸酯)以形成酰胺键。或者，如果非天然编码氨基酸包含炔，那么PEG通常将含有叠氮部分以形成[3+2]胡伊斯根环加成产物。如果非天然编码氨基酸包含羰基，那么PEG通常将包含有效的亲核基团(包括(但不限于)酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)，以便分别形成相应腙、肟和缩氨基脲键。在其它替代性实例中，可以将上述反应性基团的方向反过来，即，非天然编码氨基酸中的叠氮部分可与含有炔的PEG衍生物反应。
在一些实施例中，具有PEG衍生物的IL-10多肽变异体含有具有与非天然编码氨基酸侧链上存在的化学官能团的反应性的化学官能团。
在一些实施例中，本发明提供含叠氮基和含乙炔的聚合物衍生物，其包含平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)。然而，应理解，多种水溶性聚合物，包括(但不限于)聚(乙二醇)和其它相关聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇))，也适用于实践本发明，并且术语PEG和聚(乙二醇)的使用意涵盖并包括所有所述分子。术语PEG包括(但不限于)任何形式的聚(乙二醇)，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、叉状PEG、分支PEG、侧接PEG(即，有一或多个官能团侧接到聚合物主链的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解键的PEG。
PEG通常透明，无色，无臭，可溶于水，对热稳定，对许多化学剂呈惰性，不水解或变质，并且一般无毒。聚(乙二醇)被认为是生物相容的，也就是说，PEG能够与活组织或生物体共存而不引起危害。更特定来说，PEG实质上为非免疫原性的，也就是说，PEG不倾向于在体内产生免疫响应。当连接到在体内具有某种所需功能的分子(例如生物活性剂)上时，PEG倾向于遮蔽这种试剂，并且可减少或消除任何免疫响应，从而使生物体能够容忍所述试剂的存在。PEG结合物不倾向于产生实质免疫响应，或者引起凝血(clotting)或其它不合需要的作用。具有式--CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2--(其中n是约3到约4000，通常约20到约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，分子量为约800Da到约100,000Da的PEG尤其适用作聚合物主链。PEG的分子量可以在广泛范围内，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da之间或为更高。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da以及100Da。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
聚合物主链可以是直链或分支的。分支聚合物主链一般来说是此项技术中已知的。通常，分支聚合物具有中央分支核心部分和与中央分支核心连接的多个直链聚合物链。常用的PEG是分支形式，可通过将环氧乙烷与各种多元醇(例如甘油、甘油低聚物、季戊四醇和山梨糖醇)加成来制备。中央分支部分也可从数种氨基酸(例如赖氨酸)衍生得到。分支聚(乙二醇)可以通式R(-PEG-OH)m表示，其中R衍生自核心部分，例如甘油、甘油低聚物或季戊四醇，并且m表示臂的数量。多臂PEG分子(例如美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596、WO 96/21469和WO 93/21259中所述的分子，各专利以全文引用的方式并入本文中)也可以用作聚合物主链。
分支PEG也可呈由PEG(--YCHZ2)n(其中Y为连接基团并且Z为通过规定长度的原子链与CH连接的经活化末端基团)表示的叉状PEG形式。
又另一种分支形式(侧接PEG)具有沿PEG主链而不是在PEG链末端的反应性基团，例如羧基。
除这些形式的PEG外，聚合物还可制备成在主链中具有弱键或可降解键。举例来说，PEG可以制备成在聚合物主链中具有经受水解的酯键。如下文所示，此水解使得聚合物裂解成具有更低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-
所属领域的普通技术人员应理解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括此项技术中已知的所有形式，包括(但不限于)本文中揭示的形式。
许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用于本发明中。合适聚合物的实例包括(但不限于)其它聚(亚烷基二醇)，例如聚(丙二醇)(“PPG”)、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等。尽管聚合物主链各链的分子量可变化，但通常在约800Da到约100,000Da、常常约6,000Da到约80,000Da的范围内。聚合物各链的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da以及100Da。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
所属领域的普通技术人员将认识到，实质上水溶性主链的上述清单并非穷尽性的而仅为说明性的，并且预期具有上述品质的所有聚合物材料都适用于本发明中。
在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为“多官能的”，意味着聚合物主链有至少两个末端且可能多达约300个末端经官能团官能化或活化。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的直链聚合物，各末端与相同或不同官能团键接。
在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X—A—POLY—B—N＝N＝N
其中：
N＝N＝N是叠氮部分；
B为连接部分，其可能存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原性聚合物；
A为连接部分，其可能存在或不存在，并且可与B相同或不同；并且
X是第二官能团。
连接部分A和B的实例包括(但不限于)含有至多18个且可以含有介于1到10个之间的碳原子的多官能烷基。烷基链中可以包括杂原子，例如氮、氧或硫。烷基链还可以在杂原子处分支。连接部分A和B的其它实例包括(但不限于)含有至多10个且可以含有5到6个碳原子的多官能芳基。芳基可经一或多个碳原子、氮、氧或硫原子取代。合适的连接基团的其它实例包括描述于美国专利第5,932,462号、第5,643,575号以及美国专利申请公开案2003/0143596中的连接基团，所述专利各自以引用的方式并入本文中。所属领域的普通技术人员将认识到，连接部分的上述清单并非穷尽性的而仅为说明性的，并且预期具有上述品质的所有连接部分都适用于本发明中。
适用作X的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基丁二酰亚胺酯和1-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(例如碳酸N-羟基丁二酰亚胺酯和碳酸1-苯并三唑酯)、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫氢基、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。如所属领域的普通技术人员所理解的，所选X部分应与叠氮基相容，以使得与叠氮基的反应不发生。含叠氮基的聚合物衍生物可以是同双官能性(homobifunctional)的，意味着第二官能团(即，X)也为叠氮部分；或异双官能性的(heterobifunctional)，意味着第二官能团为不同官能团。
术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的保护基或部分。保护基将取决于所保护的化学反应性基团的类型而变化。举例来说，如果化学反应性基团是胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团是硫氢基，那么保护基可以是邻二硫吡啶。如果化学反应性基团是羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可以是苯甲基或烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。此项技术中已知的其它保护基也可以用于本发明。
文献中末端官能团的特定实例包括(但不限于)碳酸N-丁二酰亚胺酯(参见例如美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(参见例如巴克曼(Buckmann)等人大分子化学(Makromol.Chem.)182:1379(1981)，塞里普斯基(Zalipsky)等人欧洲聚合物杂志(Eur.Polym.J.)19:1177(1983))、酰肼(参见例如安德烈斯(Andresz)等人大分子化学179:301(1978))、丙酸丁二酰亚胺酯和丁酸丁二酰亚胺酯(参见例如奥尔森(Olson)等人在聚(乙二醇)化学和生物学应用(Poly(ethylene glycol)Chemistry&Biological Applications),第170-181页,哈里斯(Harris)和塞里普斯基编,ACS,华盛顿哥伦比亚特区(Washington,D.C.),1997中；还参见美国专利第5,672,662号)、丁二酸丁二酰亚胺酯(参见例如阿布丘夫斯基(Abuchowski)等人癌生物化学和生物物理(Cancer Biochem.Biophys.)7:175(1984)和约皮希(Joppich)等人大分子化学180:1381(1979))、丁二酰亚胺酯(参见例如美国专利第4,670,417号)、碳酸苯并三唑酯(参见例如美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(参见例如皮塔(Pitha)等人欧洲生物化学杂志(Eur.J Biochem),94:11(1979)，埃林(Elling)等人,生物技术与应用生物化学(Biotech.Appl.Biochem.)13:354(1991))、氧基羰基咪唑(参见例如比彻姆(Beauchamp)等人,分析生物化学,131:25(1983)，通代利(Tondelli)等人控制释放期刊(J.Controlled Release)1:251(1985))、碳酸对硝基苯酯(参见例如韦罗内塞(Veronese)等人,应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotech.),11:141(1985)；和萨托尼(Sartore)等人,应用生物化学与生物技术,27:45(1991))、醛(参见例如哈里斯等人聚合物科学杂志(J.Polym.Sci.Chem.Ed.)22:341(1984)美国专利第5,824,784号，美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(参见例如古德森(Goodson)等人生物技术(NY)8:343(1990)，罗马尼(Romani)等人在肽和蛋白质化学(Chemistry of Peptides and Proteins)2:29(1984)中，和科根(Kogan),合成通讯(Synthetic Comm.)22:2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(参见例如沃依伦(Woghiren)等人,生物结合物化学(Bioconj.Chem.)4:314(1993))、丙烯酰醇(参见例如索尼(Sawhney)等人,大分子(Macromolecules),26:581(1993))、乙烯基砜(参见例如美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。
在本发明的某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X—CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N＝N＝N
其中：
X是如上文所述的官能团；并且
n是约20到约4000。
在另一个实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X—CH2CH2O-(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-W-N＝N＝N
其中：
W为包含1到10个碳原子的脂肪族或芳香族连接部分；
n是约20到约4000；并且
X是如上文所述的官能团；m介于1与10之间。
可通过此项技术中已知和/或本文中揭示的多种方法制备本发明的含叠氮基PEG衍生物。在下文所示的一种方法中，平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链的第一末端与第一官能团键接且第二末端与适当离去基团键接)与叠氮阴离子(其可与多种合适的平衡离子中的任一种配对，包括钠、钾、叔丁基铵等等)反应。离去基团经历亲核置换且经叠氮部分置换，从而提供所需含叠氮基的PEG聚合物。
X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3
如所示，适用于本发明中的聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG是聚(乙二醇)，X是不与叠氮基反应的官能团，并且L为适当的离去基团。合适的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶，以及酮。合适离去基团的实例包括(但不限于)氯基、溴基、碘基、甲磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基和甲苯磺酸酯基。
在制备本发明含叠氮基聚合物衍生物的另一种方法中，使带有叠氮基官能团的连接剂与平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链接触，其中所述连接剂带有会与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应形成含叠氮基聚合物衍生物产物的化学官能团，其中所述叠氮基通过连接基团与聚合物主链分开。
例示性反应方案显示如下：
X-PEG-M+N-连接基团-N＝N＝N→PG-X-PEG-连接基团-N＝N＝N
其中：
PEG是聚(乙二醇)，并且X是封端基团，例如烷氧基或如上文所述的官能团；并且
M是不与叠氮官能团反应但与N官能团有效选择性反应的官能团。
合适官能团的实例包括(但不限于)：如果N是胺，那么M是羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N是酰肼或氨氧基部分，那么M是酮；如果N是亲核基团，那么M是离去基团。
可利用已知方法纯化粗产物，所述方法包括(但不限于)沉淀产物，随后视需要进行色谱分离。
更特定实例展示于下文中，在PEG二胺的情况下，其中一个胺经例如叔丁基-Boc的保护基保护，并且所得单保护PEG二胺与带有叠氮基官能团的连接部分反应：
BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N＝N＝N
在此情况下，可以使用多种活化剂(例如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑)来将胺基与羧酸基偶合，从而在单胺PEG衍生物与带有叠氮基的连接部分之间产生酰胺键。在成功形成酰胺键后，可以直接使用所得含N-叔丁基-Boc保护的叠氮基的衍生物修饰生物活性分子，或者可以进一步精细设计以安装其它有用官能团。举例来说，可通过用强酸处理来水解N-t-Boc基团，产生ω-氨基-PEG-叠氮化物。所得胺可以用作合成手柄(handle)来安装其它有用官能团，例如马来酰亚胺基、经活化二硫化物、经活化酯等等，以便产生有价值的异双官能试剂。
异双官能衍生物在需要将不同分子连接到聚合物的各末端上时尤其适用。举例来说，ω-N-胺基-N-叠氮基PEG将使具有经活化亲电基团(例如醛、酮、活性酯、经活化碳酸酯等等)的分子连接到PEG的一个末端上，并且具有炔基的分子连接到PEG的另一个末端上。
在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X—A—POLY—B—C≡C-R
其中：
R可以是H或烷基、烯烃、烷氧基，或者芳基或经取代芳基；
B为连接部分，其可能存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原性聚合物；
A为连接部分，其可能存在或不存在，并且可与B相同或不同；并且
X是第二官能团。
连接部分A和B的实例包括(但不限于)含有至多18个且可以含有介于1到10个之间的碳原子的多官能烷基。烷基链中可以包括杂原子，例如氮、氧或硫。烷基链还可以在杂原子处分支。连接部分A和B的其它实例包括(但不限于)含有至多10个且可以含有5到6个碳原子的多官能芳基。芳基可经一或多个碳原子、氮、氧或硫原子取代。合适的连接基团的其它实例包括描述于美国专利第5,932,462号和第5,643,575号以及美国专利申请公开案2003/0143596中的连接基团，所述专利各自以引用的方式并入本文中。所属领域的普通技术人员将认识到，连接部分的上述清单并非穷尽性的而仅为说明性的，并且预期具有上述品质的多种连接部分都适用于本发明中。
适用作X的官能团的实例包括：羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(例如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸1-苯并三唑酯)、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟甲磺酸酯、烯烃、酮和乙炔。如所理解的，所选X部分应与炔基相容，以使得与炔基的反应不发生。含乙炔的聚合物衍生物可以是同双官能性的，意味着第二官能团(即，X)也为乙炔部分；或异双官能性的，意味着第二官能团为不同官能团。
在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X—CH2CH2O--(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-OCH
其中：
X是如上文所述的官能团；
n是约20到约4000；并且
m介于1与10之间。
各异双官能PEG聚合物的特定实例显示于下文中。
可以使用所属领域的普通技术人员已知和/或本文中揭示的方法制备本发明的含乙炔PEG衍生物。在一种方法中，平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链的第一末端与第一官能团键接且第二末端与适当亲核基团键接)与带有乙炔官能团和适合于与PEG上的亲核基团反应的离去基团的化合物反应。当将带有亲核部分的PEG聚合物与带有离去基团的分子组合时，所述离去基团经历亲核置换且经亲核部分置换，从而得到所需含乙炔的聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C＝CR'
如所示，用于所述反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu，其中PEG是聚(乙二醇)，Nu为亲核部分且X是不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。
Nu的实例包括(但不限于)将主要通过SN2类机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯基、酰肼基、氨氧基。Nu基团的其它实例包括主要通过亲核加成反应来反应的那些官能团。L基团的实例包括氯基、溴基、碘基、甲磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基和甲苯磺酸酯基，和预期会经历亲核置换的其它基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-不饱和羰基、碳酸酯基，和预期会经历亲核试剂加成的其它亲电基团。
在本发明的另一个实施例中，A为具有介于1到10个之间碳原子的脂肪族连接基团或具有介于6到14个之间碳原子的经取代芳环。X是不与叠氮基反应的官能团，并且L为适当的离去基团。
在制备本发明含乙炔聚合物衍生物的另一种方法中，使平均分子量为约800Da到约100,000Da且在一个末端带有经保护官能团或封端剂以及在另一个末端带有适当离去基团的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。
例示性反应方案显示如下：
X-PEG-L+-C≡CR'→X-PEG-C≡CR'
其中：
PEG是聚(乙二醇)，并且X是封端基团，例如烷氧基或如上文所述的官能团；并且
R'是H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或者经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。
在上述实例中，离去基团L应具有足够的反应性以在与足够浓度的乙炔阴离子接触时发生SN2型置换。实现乙炔阴离子对离去基团的SN2置换所需的反应条件是所属领域的普通技术人员已知的。
可通过此项技术中已知的方法纯化粗产物，所述方法包括(但不限于)沉淀产物，随后视需要进行色谱分离。
水溶性聚合物可与本发明的IL-10多肽连接。水溶性聚合物可通过并入IL-10多肽中的非天然编码氨基酸、或非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基、或添加到非天然编码或天然编码氨基酸中的任何官能团或取代基连接。或者，水溶性聚合物通过天然存在氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、赖氨酸或N端残基的胺基)与并入有非天然编码氨基酸的IL-10多肽连接。在一些情况下，本发明的IL-10多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸，其中一或多个非天然编码氨基酸与水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或寡糖)连接。在一些情况下，本发明的IL-10多肽进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上与水溶性聚合物连接的天然编码氨基酸。在一些情况下，本发明的IL-10多肽包含一或多个与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸和一或多个与水溶性聚合物连接的天然存在氨基酸。在一些实施例中，相对于未结合形式，用于本发明的水溶性聚合物增强IL-10多肽的血清半衰期。
与本发明的IL-10多肽连接的水溶性聚合物的数量(即聚乙二醇化或糖基化的程度)可以经调节以提供改变(包括(但不限于)增加或减少)的药理学、药物动力学或药效学特征，例如体内半衰期。在一些实施例中，IL-10的半衰期比未经修饰的多肽延长至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、延长到2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少约100倍。
含有强亲核基团(即，酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物
在本发明的一个实施例中，用含有直接与PEG主链连接的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的IL-10多肽。
在一些实施例中，以羟胺为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，并且n是100到1,000(即，平均分子量介于5到40kDa之间)。
在一些实施例中，含肼或含酰肼的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10并且n是100到1,000，并且X任选地为可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，并且n是100到1,000。
在本发明的另一个实施例中，用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的IL-10多肽。
在一些实施例中，以羟胺为末端的PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，并且n是100到1,000(即，平均分子量介于5到40kDa之间)。
在一些实施例中，含肼或含酰肼的PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，n是100到1,000，并且X任选地是可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，并且n是100到1,000。
在本发明的另一个实施例中，用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分支PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的IL-10多肽，其中所述分支PEG的各链的MW在10到40kDa范围内并且可以是5到20kDa。
在本发明的另一个实施例中，用具有分支结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码氨基酸的IL-10多肽。举例来说，在一些实施例中，以肼或以酰肼为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10并且n是100到1,000，并且X任选是存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含有氨基脲基的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X任选是NH、O、S、C(O)，或不存在，m是2到10，并且n是100到1,000。
在一些实施例中，含有羟胺基的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X任选是NH、O、S、C(O)，或不存在，m是2到10，并且n是100到1,000。
水溶性聚合物与IL-10多肽连接的角度和位点可以调节IL-10多肽与IL-10受体的结合。在一些实施例中，如由平衡结合分析(例如在斯潘塞(Spencer)等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.),263:7862-7867(1988)中所描述的分析)所测量的，所述键经配置以使得IL-10多肽与IL-10受体结合的Kd是约400nM或400nM以下，Kd是150nM或150nM以下，并且在一些情况下，Kd是100nM或100nM以下。
用于使聚合物活化以及用于结合肽的方法和化学描述于文献中并且是此项技术中已知的。常用的使聚合物活化的方法包括(但不限于)用溴化氰、过碘酸盐、戊二醛、双环氧化合物、表氯醇、二乙烯砜、碳化二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等活化官能团(参见R.F.泰勒(R.F.Taylor),(1991),蛋白质固定.基础与应用(PROTEINIMMOBILISATION.FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS),马塞尔·德克公司,纽约州；S.S.王(S.S.Wong),(1992),蛋白质结合与交联化学(CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATIONAND CROSSLINKING),CRC出版社,波卡拉顿；G.T.赫曼森(G.T.Hermanson)等人,(1993),固定亲和力配体技术(IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES),学术出版社,纽约州；邓恩R.L.(Dunn,R.L.)等人,编聚合性药物和药物递送系统(POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS),ACS会议系列(ACSSymposium Series)第469卷,美国化学学会(American Chemical Society),华盛顿哥伦比亚特区1991)。
可获得关于PEG的官能化和结合的若干评论和专论。参见例如哈里斯,大分子化学和物理学(Macromol.Chem.Phys.)C25:325-373(1985)；斯考滕(Scouten),酶学方法135:30-65(1987)；王(Wong)等人,酶与微生物技术(Enzyme Microb.Technol),14:866-874(1992)；德尔加多(Delgado)等人,治疗药物载剂系统关键评论(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)9:249-304(1992)；塞里普斯基,生物结合物化学(Bioconjugate Chem.)6:150-165(1995)。
使聚合物活化的方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利第5,281,698号和WO 93/15189中，并且使经活化聚合物与酶之间结合的方法可见于以下对应不同酶的参考文献中，所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(韦罗内塞等人,应用生物化学与生物技术11:141-52(1985))。引用的所有参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。
含有非天然编码氨基酸的IL-10多肽(例如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的聚乙二醇化(即添加任何水溶性聚合物)通过任何便利方法来进行。举例来说，用以炔封端的mPEG衍生物来使IL-10多肽聚乙二醇化。简单地说，在搅拌下，在室温下向含对叠氮基-L-Phe的IL-10多肽水溶液中添加过量的固体mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH。通常，水溶液用pKa接近待进行反应的pH值的缓冲液缓冲(一般来说约pH值4到10)。举例来说，适用于pH值7.5下聚乙二醇化的缓冲液的实例包括(但不限于)HEPES、磷酸、硼酸盐、TRIS-HC1、EPPS和TES。持续监测pH值，并视需要加以调节。反应通常持续约1到48小时。
随后使反应产物经历疏水性相互作用色谱以使聚乙二醇化IL-10多肽变异体与游离mPEG(5000)-O-CH2-OCH和可能在分子的两个末端处活化未封端PEG时形成的聚乙二醇化IL-10多肽的任何高分子量复合物分离，进而使IL-10多肽变异体分子交联。在疏水性相互作用色谱期间的条件使得游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流动穿过柱，同时任何交联聚乙二醇化IL-10多肽变异体复合物在所需形式之后洗脱，所述复合物含有一个与一或多个PEG基团结合的IL-10多肽变异体分子。合适的条件取决于交联复合物对比所需结合物的相对尺寸而变化，并且容易由所属领域的普通技术人员确定。通过超滤来浓缩含有所需结合物的洗脱液，并且通过透滤来脱盐。
如由适当方法(例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳)所测定的，实质上经纯化的PEG-IL-10可以使用上文概述的洗脱方法来产生，其中所产生PEG-IL-10的纯度水平是至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％，尤其纯度水平是至少约75％、80％、85％，并且更尤其纯度水平是至少约90％、纯度水平是至少约95％、纯度水平是至少约99％或99％以上。必要时，可通过所属领域的普通技术人员已知的一或多种程序进一步纯化获自疏水性色谱的聚乙二醇化IL-10多肽，所述程序包括(但不限于)亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括(但不限于))DEAESEPHAROSE)；硅胶色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包括(但不限于))塞法戴克斯G-75)；疏水性相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦)；差异溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)；或萃取。表观分子量可以用GPC通过与球状蛋白质标准样品比较来估计(普利内塔AZ(Preneta,AZ)在蛋白质纯化方法，实用方法(PROTEIN PURIFICATION METHODS,A PRACTICAL APPROACH)(哈里斯和安格尔编)IRL出版社1989,293-306中)。IL-10-PEG结合物的纯度可以通过蛋白水解降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解)之后进行质谱分析来评估。佩平斯基RB(Pepinsky RB)等人,药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmcol.&Exp.Ther.)297(3):1059-66(2001)。
与本发明IL-10多肽的氨基酸连接的水溶性聚合物可以不受限制地进一步经衍生或取代。
含叠氮PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中，用含有将与非天然编码氨基酸侧链上存在的炔部分反应的叠氮部分的PEG衍生物修饰IL-10多肽。一般来说，PEG衍生物的平均分子量将在1到100kDa范围内，并且在一些实施例中，在10到40kDa范围内。
在一些实施例中，以叠氮基为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，并且n是100到1,000(即，平均分子量介于5到40kDa之间)。
在另一个实施例中，以叠氮基为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，p是2到10，并且n是100到1,000(即，平均分子量介于5到40kDa之间)。
在本发明的另一个实施例中，用含有末端叠氮部分的分支PEG衍生物修饰包含含炔氨基酸的IL-10多肽，其中分支PEG的各链的MW在10到40kDa的范围内并且可以是5到20kDa。举例来说，在一些实施例中，以叠氮基为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，p是2到10，并且n是100到1,000，并且X任选地是O、N、S或羰基(C＝O)，在各情况下，X都可存在或不存在。
含炔PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中，用含有将与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应的炔部分的PEG衍生物修饰IL-10多肽。
在一些实施例中，以炔为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，并且n是100到1,000(即，平均分子量介于5到40kDa之间)。
在本发明的另一个实施例中，用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端叠氮或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔的非天然编码氨基酸的IL-10多肽。
在一些实施例中，以炔为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，p是2到10，并且n是100到1,000。
在本发明的另一个实施例中，用含有末端炔部分的分支PEG衍生物修饰包含含叠氮基氨基酸的IL-10多肽，其中分支PEG的各链的MW在10到40kDa的范围内并且可以是5到20kDa。举例来说，在一些实施例中，以炔为末端的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH
其中R是简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2到10，p是2到10且n是100到1,000，并且X任选是O、N、S或羰基(C＝O)，或不存在。
含膦的PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中，用含有经活化官能团(包括(但不限于)酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰IL-10多肽，所述经活化官能团进一步包含将与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应的芳基膦基团。一般来说，PEG衍生物的平均分子量将在1到100kDa范围内，并且在一些实施例中，在10到40kDa范围内。
在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构：
其中n是1到10；X可以是O、N、S，或不存在，Ph是苯基，并且W是水溶性聚合物。
在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构：
其中X可以是O、N、S，或不存在，Ph是苯基，W是水溶性聚合物，并且R可以是H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN以及-NO2。R'、R"、R'"和R""各自独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)1到3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基，或芳基烷基。举例来说，当本发明化合物包括一个以上R基团时，每一个R基团是如每一个R'、R"、R'"和R""基团在存在一个以上的这些基团时那样独立地选择。当R'与R"连接到同一氮原子上时，其可以与所述氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。所属领域的技术人员从上文有关取代基的论述将了解到，术语“烷基”打算包括包括碳原子与除氢基外的基团结合的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
其它PEG衍生物和一般聚乙二醇化技术
可与IL-10多肽连接的其它例示性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括(但不限于)描述于例如以下文献中的分子和方法：美国专利公开案第2004/0001838号；第2002/0052009号；第2003/0162949号；第2004/0013637号；第2003/0228274号；第2003/0220447号；第2003/0158333号；第2003/0143596号；第2003/0114647号；第2003/0105275号；第2003/0105224号；第2003/0023023号；第2002/0156047号；第2002/0099133号；第2002/0086939号；第2002/0082345号；第2002/0072573号；第2002/0052430号；第2002/0040076号；第2002/0037949号；第2002/0002250号；第2001/0056171号；第2001/0044526号；第2001/0021763号；美国专利第6,646,110号；第5,824,778号；第5,476,653号；第5,219,564号；第5,629,384号；第5,736,625号；第4,902,502号；第5,281,698号；第5,122,614号；第5,473,034号；第5,516,673号；第5,382,657号；第6,552,167号；第6,610,281号；第6,515,100号；第6,461,603号；第6,436,386号；第6,214,966号；第5,990,237号；第5,900,461号；第5,739,208号；第5,672,662号；第5,446,090号；第5,808,096号；第5,612,460号；第5,324,844号；第5,252,714号；第6,420,339号；第6,201,072号；第6,451,346号；第6,306,821号；第5,559,213号；第5,747,646号；第5,834,594号；第5,849,860号；第5,980,948号；第6,004,573号；第6,129,912号；WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、WO92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO 95/13090、WO 95/33490、WO96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、WO 98/05363、EP 809996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605 963、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503和EP 154 316，其是以引用的方式并入本文中。本文中所述的任何PEG分子都可以任何形式使用，包括(但不限于)单链、分支链、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。
其它聚合物和PEG衍生物(包括(但不限于)羟胺(氨氧基)PEG衍生物)描述于以下专利申请案中，其全部以全文引用的方式并入本文中：美国专利公开案第2006/0194256号、美国专利公开案第2006/0217532号、美国专利公开案第2006/0217289号、美国专利公开案第60/755,338号；美国临时专利第60/755,711号；美国临时专利第60/755,018号；国际专利申请案第PCT/US06/49397号；WO2006/069246；美国临时专利第60/743,041号；美国临时专利第60/743,040号；国际专利申请案第PCT/US06/47822号；美国临时专利第60/882,819号；美国临时专利第60/882,500号；和美国临时专利第60/870,594号.
异源Fc融合蛋白
上述IL-10化合物可以直接或通过肽连接基团与免疫球蛋白的Fc部分融合。免疫球蛋白是含有利用二硫键保持在一起的多肽链的分子，通常具有两条轻链和两条重链。在各链中，取决于分子的抗体特异性，一个结构域(V)具有可变氨基酸序列。其它结构域(C)具有同类分子共有的相当恒定的序列。
本文中所用的免疫球蛋白Fc部分的含义与所述术语在免疫学领域中的常用含义相同。特定来说，此术语是指通过去除抗体中的两个抗原结合区(Fab片段)得到的抗体片段。一种去除Fab片段的方式是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白。因此，Fc部分由来自两条重链的恒定区的尺寸大致相等的片段形成，这两个片段通过非共价相互作用和二硫键缔合。Fc部分可以包括铰链区，并延伸穿过CH2和CH3结构域到达抗体C端。人类和小鼠免疫球蛋白的代表性铰链区可见于抗体工程，实用方法(AntibodyEngineering,A Practical Guide),波尔贝克C.A.K.(Borrebaeck,C.A.K.)编,弗里曼出版公司,1992中，其教示以引用的方式并入本文中。Fc部分可以进一步包括一或多个糖基化位点。含有铰链区、CH2和CH3结构域以及一个N-糖基化位点的多种代表性Fc蛋白质的氨基酸序列是此项技术中众所周知的。
存在具有不同效应功能和药物动力学特性的五种类型的人类免疫球蛋白Fc区：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。IgG是血清中含量最丰富的免疫球蛋白。IgG在血清任何免疫球蛋白中半衰期也最长(23天)。与其它免疫球蛋白不同，IgG在结合于Fc受体上后会有效再循环。IgG具有4个亚类：G1、G2、G3和G4，每一类具有不同的效应功能。G1、G2和G3可以结合C1q并固定补体，而G4不能。尽管与G1相比，G3能够更有效地结合C1q，但在介导补体引导的细胞溶解方面，G1更有效。G2固定补体的效率极低。IgG中的C1q结合位点位于CH2结构域的羧基端区。
所有IgG子类都能够结合于Fc受体(CD 16、CD32、CD64)上，其中G1和G3比G2和G4有效。IgG的Fc受体结合区是位于CH2结构域的铰链区和羧基端区中的残基形成。
IgA可以单体形式以及通过J链保持在一起的二聚物形式存在。IgA是血清中含量第二丰富的免疫球蛋白，但其半衰期只有6天。IgA具有3种效应功能。其结合于巨噬细胞和嗜酸性细胞上的IgA特异性受体上，从而分别驱动胞噬作用和细胞脱粒。其也可以通过未知的替代性路径固定补体。
IgM表示为五聚物或六聚物，二者都通过J链保持在一起。IgM的血清半衰期是5天。其通过位于其CH3结构域中的结合位点较弱地结合于C1q上。IgD的血清半衰期是3天。何种效应功能是由此种Ig引起尚不明了。IgE是单体免疫球蛋白，并且血清半衰期是2.5天。IgE结合于两个Fc受体上，以驱动细胞脱粒，并引起促发炎因子的释放。
取决于所需体内效应，本发明的异源融合蛋白可以含有上述任一同种型，或者可以含有突变的Fc区，其中补体和/或Fc受体结合功能已经改变。因此，本发明的异源融合蛋白可以含有与IL-10或IL-10变异体多肽融合的免疫球蛋白的全部Fc部分、免疫球蛋白Fc部分的片段或其类似物。
本发明的融合蛋白可由单链蛋白组成或呈多链多肽的形式。可以产生两个或两个以上Fc融合蛋白，以使其通过Fc区之间天然形成的二硫键相互作用。这些多聚物就IL-10化合物而言可以是均质的，或其可以含有在融合蛋白Fc部分的N端融合的不同IL-10化合物。
不论融合蛋白的最终结构如何，Fc或Fc类区域可供用于延长在N端融合的IL-10或IL-10变异体化合物的体内血浆半衰期。另外，融合蛋白化合物的IL-10组分应保持IL-10的至少一种生物活性。治疗或循环半衰期的延长可以使用本文中所述或此项技术中已知的方法来证实，其中融合蛋白的半衰期与单独IL-10化合物的半衰期相比较。生物活性可以通过此项技术中已知的体外和体内方法来测定。
因为由蛋白水解所产生的IgG的Fc区具有与完整IgG分子相同的体内半衰期且Fab片段快速降解，所以认为用于延长半衰期的相关序列驻留在CH2和/或CH3结构域中。此外，文献中已经显示，不结合高亲和力Fc受体或C1q的IgG变异体的代谢速率与亲代野生型抗体的清除速率难以区别，表明代谢位点不同于Fc受体或C1q结合所涉及的位点。[沃辛扎克(Wawrzynczak)等人,(1992)分子免疫学(MolecularImmunology)29:221]。使用鼠类IgG1 Fc区进行的定点诱变研究表明，IgG1 Fc区中控制代谢速率的位点位于CH2-CH3结构域介面处。可以修饰Fc区的代谢位点，以优化融合蛋白的半衰期。用于本发明融合蛋白中的Fc区可以来源于IgG1或IgG4Fc区，并且可以含有包括铰链区的CH2和CH3区域两者。
异源白蛋白融合蛋白
本文中所述的的IL-10或IL-10变异体可以直接或通过肽连接基团、水溶性聚合物或前药连接基团与白蛋白或其类似物、片段或衍生物融合。一般来说，作为本发明融合蛋白的一部分的白蛋白可来源于从包括人类在内的任何物种克隆得到的白蛋白。人类血清白蛋白(HSA)由具有585个氨基酸且式分子量为66,500的单个非糖基化多肽链组成。人类HSA的氨基酸序列是已知的[参见梅劳恩(Meloun)等人(1975)欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)58:136；贝伦斯(Behrens)等人(1975)美国实验生物学联合会会报(Fed.Proc.)34:591；朗(Lawn)等人(1981)核酸研究(NucleicAcids Research)9:6102-6114；明格蒂(Minghetti)等人(1986)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)261:6747，其中每一者都以引用的方式并入本文中]。已经描述白蛋白的多种多形变异体以及类似物和片段。[参见维特坎普(Weitkamp)等人,(1973)人类遗传学年报(Ann.Hum.Genet.)37:219]。举例来说，在EP 322,094中，各种较短形式的HSA。揭示这些HSA片段中的一些，包括HSA(1-373)、HSA(1-388)、HSA(1-389)、HSA(1-369)和HSA(1-419)和介于1-369与1-419之间的片段。EP 399,666揭示包括HSA(1-177)和HSA(1-200)和介于HSA(1-177)与HSA(1-200)之间片段的白蛋白片段。
应理解本发明的异源融合蛋白包括与任何白蛋白(包括片段、类似物和衍生物)偶合的IL-10和IL-10变异体化合物，其中所述融合蛋白是生物活性的并且其血浆半衰期比单独的IL-10化合物长。因此，融合蛋白中的白蛋白部分的血浆半衰期不必与天然人白蛋白相当。已知或可以产生半衰期更长或半衰期在原生人类白蛋白半衰期与所关注IL-10化合物半衰期中间的片段、类似物和衍生物。
本发明的异源融合蛋白涵盖在IL-10化合物中和/或在融合蛋白的Fc或白蛋白部分中具有保守氨基酸取代的蛋白质。“保守取代”是利用另一个具有相同净电荷以及大致相同尺寸和形状的氨基酸置换某一氨基酸。当侧链中碳总数和杂原子差异不超过约4个时，具有脂肪族或经取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有大致相同的尺寸。当侧链中分支的数量差异不超过1个时，其具有大致相同的形状。侧链中具有苯基或经取代苯基的氨基酸被认为具有几乎相同的尺寸和形状。除本文中另外明确提供者外，优选利用天然存在的氨基酸进行保守取代。
野生型白蛋白和免疫球蛋白可以从多种来源获得。举例来说，可以由以可检测的水平表达相关mRNA的组织或细胞制得的cDNA文库得到这些蛋白质。可以用使用公开的DNA或相关特定蛋白质的蛋白质序列设计的探针筛选文库。举例来说，免疫球蛋白轻链或重链恒定区描述于亚当斯(Adams)等人(1980)生物化学19:2711-2719；戈特(Goughet)等人(1980)生物化学19:2702-2710；杜比(Dolby)等人(1980)美国国家科学院院刊77:6027-6031；莱斯(Rice)等人(1982)美国国家科学院院刊79:7862-7862；福克纳(Falkner)等人(1982)自然298:286-288；和莫里森(Morrison)等人(1984)免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)2:239-256中。揭示白蛋白和DNA序列的一些参考文献包括梅劳恩等人(1975)欧洲生化学会联合会快报58:136；贝伦斯等人(1975)美国实验生物学联合会会报34:591；朗等人(1981)核酸研究9:6102-6114；和明格蒂等人(1986)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)261:6747。
本发明异源融合蛋白的表征
多种方法可以用于表征本发明的融合蛋白。这些方法中有一些包括(但不限于)：与蛋白质染色法偶合的SDS-PAGE或使用抗IgG或抗HAS抗体的免疫印迹法。其它方法包括例如基质辅助激光解吸附/离子化质谱(matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry，MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。
增强对血清白蛋白的亲和力
各种分子也可以与本发明的IL-10多肽融合以调节IL-10多肽在血清中的半衰期。在一些实施例中，分子与本发明的IL-10多肽连接或融合以增强对动物中内源性血清白蛋白的亲和力。
举例来说，在一些情况下，进行IL-10多肽与白蛋白结合序列的重组融合。例示性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(参见例如马克里德斯(Makrides)等人,药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)277:534-542(1996)和索兰德(Sjolander)等人,免疫法杂志(J.Immunol Methods)201:115-123(1997))或例如描述于例如丹尼斯(Dennis)等人,生物化学杂志(J.BiolChem.)277:35035-35043(2002)中那些的白蛋白结合肽。
在其它实施例中，用脂肪酸酰化本发明的IL-10多肽。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。参见例如卡兹霍尔(Kurtzhals)等人,生物化学杂志(Biochem.J.)312:725-731(1995)。
在其它实施例中，本发明的IL-10多肽与血清白蛋白(包括(但不限于)人类血清白蛋白)直接融合。所属领域的技术人员将识别到多种其它分子也可以与本发明中的IL-10连接以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。
X.IL-10多肽的糖基化
本发明包括并入有一或多个带糖残基的非天然编码氨基酸的IL-10多肽。糖残基可以是天然的(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然的(包括(但不限于)3-氟半乳糖)。可通过N或O连接糖苷键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)肟或者相应的C或S连接糖苷)将糖与非天然编码氨基酸连接。
糖(包括(但不限于)糖基)部分可以体内或体外加成到IL-10多肽上。在本发明的一些实施例中，用衍生有氨氧基的糖修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的IL-10多肽，以产生通过肟键连接的相应糖基化多肽。一旦连接到非天然编码氨基酸上后，糖可以进一步通过用糖基转移酶和其它酶处理来加工，以产生结合于IL-10多肽上的寡糖。参见例如H.刘(H.Liu)等人美国化学会志125:1702-1703(2003)。
在本发明的一些实施例中，包含含羰基的非天然编码氨基酸的IL-10多肽经制备为氨氧基衍生物的具有既定结构的聚糖直接修饰。所属领域的普通技术人员将认识到，可以使用其它官能团，包括叠氮基、炔、酰肼、肼和氨基脲来将糖与非天然编码氨基酸连接。
在本发明的一些实施例中，包含含叠氮基或炔基的非天然编码氨基酸的IL-10多肽随后可以通过分别与包括(但不限于)炔基或叠氮基衍生物进行包括(但不限于)胡伊斯根[3+2]环加成反应来修饰。这种方法允许以极高选择性修饰蛋白质。
XI.IL-10二聚物和多聚物
本发明还提供IL-10和IL-10类似物组合，例如同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物(即三聚物、四聚物等)，其中含有一或多个非天然编码氨基酸的IL-10与另一个IL-10其变异体或并非IL-10其变异体的任何其它多肽直接(到多肽主链上)或通过连接基团结合。归因于其与单体相比较增加的分子量，IL-10二聚物或多聚物结合物可以相对于单体IL-10展现新的或所需的特性，包括(但不限于)不同药理学、药物动力学、药效性、经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本发明的IL-10二聚物将调节IL-10受体的信号转导。在其它实施例中，本发明的IL-10二聚物或多聚物将充当IL-10受体拮抗剂、激动剂或调节剂。
在一些实施例中，存在于含有IL-10的二聚物或多聚物中的IL-10分子中的一或多者包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。
在一些实施例中，IL-10多肽直接连接，包括(但不限于)通过Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键。在一些实施例中，IL-10多肽和/或所连接的非IL-10分子将包含不同非天然编码氨基酸以促使二聚化，包括(但不限于)第一IL-10多肽的一个非天然编码氨基酸中的炔烃和第二分子的第二非天然编码氨基酸中的叠氮化物将通过胡伊斯根[3+2]环加成结合。或者，包含含酮的非天然编码氨基酸的IL-10和/或所连接的非IL-10分子可以与包含含羟胺的非天然编码氨基酸的第二多肽结合，并且所述多肽通过形成相应肟而反应。
或者，两个IL-10多肽和/或所连接的非IL-10分子通过连接基团连接。任何异质或同型双官能连接基团可以用于连接两个分子和/或所连接的非IL-10分子，所述分子可以具有相同或不同的一级序列。在一些情况下，用于将IL-10和/或所连接的非IL-10分子系在一起的连接基团可以是双官能PEG试剂。连接基团可以具有多种分子量或分子长度。较大或较小分子量的连接基团可以用于在IL-10与所连接的实体之间或在IL-10与其受体之间或在所连接的实体与其结合搭配物(若存在)之间提供所需空间关系或构象。分子长度较长或较短的连接基团也可以用于在IL-10与所连接的实体之间或在所连接的实体与其结合搭配物(若存在)之间提供所需间距或柔性。
在一些实施例中，本发明提供水溶性双官能连接基团，其具有包括以下各者的哑铃结构：a)处于聚合物主链的至少一个第一端的含有叠氮基、炔烃、肼、酰肼、羟胺或羰基的部分；和b)处于所述聚合物主链第二端的至少一个第二官能团。第二官能团可以与第一官能团相同或不同。在一些实施例中，第二官能团不具有与第一官能团的反应性。在一些实施例中，本发明提供包含分支分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，分支分子结构可以是树枝状的。
在一些实施例中，本发明提供包含一或多个IL-10多肽的多聚物，其通过与具有以下结构的水溶性经活化聚合物反应来形成：
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X
其中n是约5到3,000，m是2-10，X可以是含有叠氮基、炔烃、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或羰基的部分，并且R是可与X相同或不同的封端基团、官能团或离去基团。R可以是例如选自由以下各者组成的群组的官能团：羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基丁二酰亚胺酯、1-苯并三唑酯、碳酸N-羟基丁二酰亚胺酯、碳酸1-苯并三唑酯、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫氢基、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃和酮。
XII.测量IL-10多肽活性和IL-10多肽对IL-10受体的亲和力
IL-10多肽活性可以使用标准或已知的体外或体内分析来测定。可以通过此项技术中已知的合适方法来分析IL-10多肽的生物活性。如米格尔(Meager),免疫法杂志(J.Immunol.Meth.),261:21-36(2002)中所述，所述分析包括(但不限于)IL-10响应性基因的活化、受体结合分析、抗病毒活性分析、细胞病变效应抑制分析(法米勒第(Familletti)等人酶学方法(Meth.Enzymol.)78:387-394)、抗增殖性分析(艾博索德(Aebersold)和桑泼(Sample),酶学方法119:579-582)、免疫调节分析(美国专利第4,914,033号；第4,753,795号，和监测MHC分子诱导的和(例如霍克兰(Hokland)等人,酶学方法119:688-693)。
可以分析IL-10多肽活化IL-10敏感性信号转导路径的能力。一个实例是干扰素刺激的反应元件(ISRE)分析。用ISRE-荧光素酶载体(pISRE-luc，克隆技术公司(Clontech))短暂转染构成性表达IL-10受体的细胞。在转染之后，用IL-10多肽处理细胞。测试多个例如0.0001-10ng/mL的蛋白质浓度以产生剂量-反应曲线。如果IL-10多肽结合并活化IL-10受体，那么所得信号转导级联诱导荧光素酶表达。可用多种方法测量发光，例如通过使用TopCountTM或FusionTM微板读取器和Steady-GloR荧光素酶分析系统(普洛麦格公司)。
可以分析IL-10多肽与IL-10受体结合的能力。对于非聚乙二醇化或聚乙二醇化的包含非天然氨基酸的IL-10多肽，IL-10对其受体的亲和力可以使用BIAcoreTM生物传感器(法玛西亚公司)来测量。合适的结合分析包括(但不限于)BIAcore分析(皮尔斯(Pearce)等人,生物化学38:81-89(1999))和AlphaScreenTM分析(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))。AlphaScreenTM是一种基于珠粒的非放射性发光近距离分析(non-radioactive luminescent proximity assay)，其中供者珠粒在680nm激光激发下，释放出单线态氧。单线态氧扩散并与受者珠粒表面上的二甲基噻吩衍生物反应，从而在约600nm下发出荧光。只有在供者与受者珠粒各自分别与配体和受体连接时发生分子相互作用，从而使二者紧密靠近的情况下才会发射荧光。可以使用受体结合变异体竞争消除此配体-受体相互作用，同时非结合变异体不会竞争。
不论使用何种方法来产生本发明IL-10多肽，使类似物经历生物活性分析。可以进行氚化胸苷分析来确定细胞分裂的程度。但也可以使用其它生物分析来确定所需活性。可以分析IL-10和IL-10多肽诱导以下各种中凋亡的能力：白血病、AML、NHL、非小细胞肺癌、结肠癌、乳癌、胰腺癌瘤、淋巴瘤和/或黑色素瘤以及其它。也可以使用所属领域的普通技术人员已知的分析来评估本发明IL-10多肽的生物活性和潜在副作用。
不论使用何种方法来产生IL-10多肽，使IL-10多肽经历生物活性分析。一般来说，生物活性测试应对所需结果提供分析，例如生物活性增加或减少(如与经修饰IL-10相比较)、生物活性不同(如与经修饰IL-10相比较)、受体或结合搭配物亲和力分析、IL-10本身或其受体的构象或结构变化(如与经修饰IL-10相比较)或血清半衰期分析。
上述有关分析方法的参考文献的汇编并非穷尽性的，并且所属领域的普通技术人员将认识到适用于测试所需最终结果的其它分析。对所述分析的改变是所属领域的普通技术人员已知的。
测量多肽的抗体形成和免疫原性临床前测试
测量和评估抗体形成的分析包括(但不限于)生物分析和结合分析。生物分析包括(但不限于)使用动物个体或患者的血清来检测中和抗体的分析。测量血清中和外源分子的生物活性的能力。基于细胞的生物分析例如可测量增殖、细胞毒性、信号传导或细胞因子释放。检测中和抗体与非中和抗体的结合分析测量血清结合外源蛋白的能力。用于测量所述抗体的方法包括(但不限于)ELISA。这两种抗体存在的重要性论述于谢莱肯斯H(Schellekens,H)等人临床治疗剂学(Clinical Therapeutics)2002；24(11):1720-1740中，以引用的方式并入本文中。
以全文引用的方式并入本文中的谢莱肯斯H等人临床治疗剂学2002；24(11):1720-1740还论述在表达内源性人类蛋白质的非人类灵长类动物中和在转基因小鼠模型中的动物测试以及体外测试方法。怀特利(Whiteley)等人在以引用的方式并入本文中的临床研究杂志(J.Clin.Invest.)1989；84:1550-1554中论述转基因小鼠在使用人类胰岛素的免疫原性研究中的用途。以引用的方式并入本文中的瓦德瓦M.(Wadhwa,M.)等人免疫法杂志(J of Immunol Methods)2003；278:1-17论述多种用于检测和测量免疫原性的技术，例如表面等离子共振(SPR；Biacore)放射免疫沉淀分析(RIPA)、免疫分析和免疫印迹法，所述免疫分析例如固相结合免疫分析、桥接和竞争性ELISA。其它技术包括(但不限于)电化学发光(ECL)。
以引用的方式并入本文中的奇里诺(Chirino)等人DDT 2004；9(2):82-90描述用于研究蛋白质治疗剂免疫原性的离体T细胞活化分析。监测抗原呈递细胞对野生型和变异体IL-10蛋白质的摄取。可以使用离体T细胞激活分析在实验上为免疫原性定量。在这种方法中，用相关肽或整个蛋白质激发抗原呈递细胞和匹配供体的天然T细胞一或多次。随后，可以使用若干方法检测T细胞激活，例如通过监测细胞因子的产生或测量氚化胸腺嘧啶的摄取。其它合适的T细胞分析包括揭示于以下各者中的那些分析：迈登鲍尔(Meidenbauer)等人前列腺(Prostate)43,88-100(2000)；舒尔特斯B.C(Schultes,B.C)和怀特赛德T.L.(Whiteside,T.L.),免疫法杂志(J.Immunol.Methods)279,1-15(2003)；和斯蒂克勒(Stickler)等人,免疫疗法杂志(J.Immunotherapy),23,654-660(2000)。可以在转基因小鼠系统中测量免疫原性。免疫原性可以通过向一或多种动物(包括啮齿动物和灵长类动物)投与IL-10变异体并且监测抗体形成来测试。评估本发明多肽的其它方法是所属领域的普通技术人员已知的。
XIII.测量效价、功能性体内半衰期和药物动力学参数
本发明的一个重要方面是通过在存在或不存在多肽与水溶性聚合物部分的结合的情况下构造IL-10多肽来获得的生物学半衰期延长。IL-10多肽血清浓度在投药后的快速减少已经使其对评估对使用经结合和未经结合的IL-10多肽和其变异体来治疗的生物学响应至关重要。本发明的经结合和未经结合的IL-10多肽和其变异体可以通过例如皮下或静脉内投药在投药之后也具有延长的血清半衰期，使其可能通过例如ELISA方法或通过初步筛选分析来测量。可以使用商业来源的ELISA或RIA试剂盒，例如来自英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。如本文中所述获得体内生物学半衰期的测量值。
包含非天然编码氨基酸的IL-10多肽的效力和功能性体内半衰期可以根据所属领域的普通技术人员已知的方案来测定。
包含非天然编码氨基酸的IL-10多肽的药物动力学参数可以在正常史泊格-多利(Sprague-Dawley)雄性大鼠中进行评估(每治疗组N＝5只动物)。动物将接受静脉内25微克/大鼠或皮下50微克/大鼠的单一剂量，并且根据预定时间过程取得大致5-7的血液样品，一般来说对未与水溶性聚合物结合的包含非天然编码氨基酸的IL-10多肽覆盖约6小时，并且对包含非天然编码氨基酸且与水溶性聚合物结合的IL-10多肽是约4天。不具有非天然编码氨基酸的IL-10的药物动力学数据可以与包含非天然编码氨基酸的IL-10多肽所获得的数据直接比较。
巴苏(Basu)等人在生物结合物化学(2006)17:618-630中描述IL-10多肽在小鼠和大鼠中的药物动力学和免疫原性研究。也可以在灵长类动物(例如，食蟹猴)中评估药物动力学参数。通常，皮下或静脉内投与单次注射，并且随时间监测血清IL-10含量。
根据本发明的IL-10多肽的比活性可以通过此项技术中已知的各种分析来测定。根据本发明获得和纯化的IL-10多肽突变蛋白质或其片段的生物活性可以通过本文中所描述或所提及的方法或所属领域的普通技术人员已知的方法来测试。
可以在治疗疾病的动物模型(例如用于多发性硬化症的小鼠或大鼠EAE模型)中分析IL-10多肽的功效。可以使用例如常用实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis：EAE)模型的动物模型来确定本发明多肽的功效。在EAE模型中，用髓鞘或源自髓鞘的蛋白质进行免疫从而引发模拟人类多发性硬化的大多数发炎和神经特征的疾病。EAE已经用于小鼠、大鼠、兔和狨猴中(坎内拉(Cannella)等人美国国家科学院院刊,95,10100 5,1998，扎普里亚诺娃(Zaprianova)等人,112,258,1997，哈苏纳(Hassouna)等人泌尿学杂志(J.Urology),130,80610,1983，吉奈因(Genain)和豪泽(Hauser)分子医学杂志(J.Mol.Med.)75,18797,1997)。其它模型包括泰勒鼠类脑脊髓炎病毒(Theiler's murineencephalomyelitis virus；TMEV)模型(莫雷(Murray)等人神经科学杂志(J.Neurosci.)18,7306 14,1998)，可以用于确定IL-10多肽的功效。
XIV.投药和医药组合物
本发明的多肽或蛋白质(包括(但不限于)包含一或多个非天然氨基酸的IL-10、合成酶、蛋白质等)任选地(包括但不限于)与合适的医药载剂组合用于治疗用途。所述组合物例如包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。调配物被制备成与投药模式相适应。一般来说，所属领域的普通技术人员已知投与蛋白质的方法，并且这些方法适用于投与本发明的多肽。组合物可呈水溶性形式，例如以医药学上可接受的盐形式存在，其中打算包括酸和碱加成盐。
根据所属领域的普通技术人员已知的方法，包含一或多种本发明多肽的治疗组合物任选地在一或多种适当体外和/或体内疾病动物模型中进行测试以确认功效、组织代谢并估计剂量。具体来说，最初可以通过本文中非天然氨基酸与天然氨基酸同系物的活性、稳定性或其它合适测量值(包括(但不限于)比较经修饰以包括一或多个非天然氨基酸的IL-10多肽与天然氨基酸IL-10多肽和比较经修饰以包括一或多个非天然氨基酸的IL-10多肽与目前可用的IL-10治疗)，亦即在相关分析中测定剂量。
投药通过常用于引入分子最终使其与血液或组织细胞接触的任何途径进行。本发明的非天然氨基酸多肽以任何合适的方式任选地与一或多种医药学上可接受的载剂一起投与。向患者投与本发明上下文中所述的这些多肽的合适方法都可供使用，而且，尽管可以使用一种以上途径投与特定组合物，但某种特定途径常常可以提供比另一种途径快捷和有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂在部分程度上由所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法决定。因此，存在本发明医药组合物的多种适当调配物。
本发明的IL-10多肽可以通过适合于蛋白质或肽的任何常规途径来投与，所述途径包括(但不限于)肠外，例如(包括但不限于)皮下或静脉内注射或任何其它形式的注射或输液。多肽组合物可通过多种途径投与，包括(但不限于)经口、静脉内、腹膜内、肌肉内、透皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。还可通过脂质体投与包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物。所述投药途径和适当调配物一般是所属领域的技术人员已知的。IL-10多肽可以单独使用或与例如医药载剂的其它合适组分组合使用。IL-10多肽可以与其它药剂或治疗剂组合使用。
单独或与其它合适组分组合的包含非天然氨基酸的IL-10多肽还可以制成待通过吸入投与的气溶胶调配物(亦即其可以被“喷雾”)。气雾剂调配物可以被放置在例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等的可接受加压推进剂中。
适合于非经肠投与(例如，通过关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径投与)的调配物包括水性与非水性等渗无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预定接受者的血液等渗的溶质；以及水性与非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。IL-10调配物可以提供于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中。
非经肠投药和静脉内投药是优选的投药方法。具体来说，已用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径(包括(但不限于)通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN(例如IL-10)、白细胞介素、抗体、FGF和/或任何其它医药学上递送蛋白的投药途径)与目前使用的调配物一起提供本发明多肽的优选投药途径和调配物。
在本发明的上下文中，取决于应用，投与患者的剂量足以随时间在患者体内产生有益的治疗响应，或其它适当活性。所述剂量由特定载体或调配物的功效和所用非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期，和患者的病状，以及待治疗患者的体重或表面积决定。剂量大小还由在特定患者体内伴随投与特定载体、调配物等的任何不利副作用的存在、性质和程度等决定。
在确定待在治疗或预防疾病(包括(但不限于)特征在于类型1细胞因子模式主导地位的慢性炎性病症、牛皮癣、例如克罗恩氏疾病的发炎性肠病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、移植排斥反应和过敏性接触性皮炎等；或用于治疗或调节肿瘤病状，包括(但不限于)肿瘤增长)中投与的载体或调配物的有效量中，医生评估循环血浆含量、调配物毒性、疾病进程和/或(在相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
举例来说，投与70千克患者的剂量通常在相当于当前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内，可针对相关组合物的活性或血清半衰期的改变而调整。本发明的载体或医药调配物可通过任何已知的常规疗法，包括抗体投药、疫苗投药、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物响应调节剂的投药等来补充治疗条件。
关于投药，本发明的调配物是以由相关调配物的LD-50或ED-50和/或对各种浓度的非天然氨基酸多肽的任何副作用(包括(但不限于)当关系到患者的体重和整体健康时)的观测结果所确定的速率投与。投药可以通过单次或分次剂量来实现。
如果输注调配物的患者出现发烧、寒战或肌肉疼痛，那么其可以接受适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)或其它疼痛/发烧控制药物。经历如发烧、肌肉疼痛和寒战等输注反应的患者，在将进行输注之前30分钟，预先给予阿司匹林、对乙酰氨基酚或包括(但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)。哌替啶(Meperidine)可以用于不能对退热剂和抗组织胺快速响应的较为严重的寒战和肌肉疼痛。取决于反应的严重性，减慢或中断细胞输注。
本发明的人类IL-10多肽可以直接向哺乳动物个体投与。投药通过常用于向个体引入IL-10多肽的任何途径进行。根据本发明实施例的IL-10多肽组合物包括适合于经口、经直肠、局部、吸入(包括(但不限于)通过气溶胶)、颊内(包括(但不限于)舌下)、经阴道、非经肠(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、大脑内、动脉内或静脉内)局部(亦即皮肤和粘膜表面两者，包括气道表面)、肺、眼内、鼻内和透皮投药的那些组合物，尽管在任何给定情况下最合适的途径将取决于待治疗病状的性质和严重性。投药可以是局部或全身性的。化合物调配物可提供于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中。本发明的IL-10多肽可以制备成单位剂量可注射形式(包括(但不限于)溶液悬浮液或乳液)与医药学上可接受的载剂的混合物。本发明IL-10多肽还可以通过连续输注(使用包括(但不限于)微型泵，例如渗透泵)、单一推注或缓慢释放贮存调配物投与。
适合于投药的调配物包括可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等渗的溶质的水性与非水性溶液、等渗无菌溶液，以及可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性与非水性无菌悬浮液。溶液和悬浮液可由前文所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备得到。
冷冻干燥是常用于提供用以从所关注的蛋白质制剂中去除水的蛋白质的技术。冷冻干燥或冻干法是一种首先将待干燥的材料冷冻并且随后通过在真空环境中升华去除冰或冷冻溶剂的方法。预先冻干的调配物中可以包括赋形剂，以在冷冻干燥过程中增强稳定性和/或改进储存时冻干产物的稳定性。皮卡尔M.(Pikal,M.),生物医药(Biopharm.)3(9)26-30(1990)，和荒川(Arakawa)等人,医药研究(Pharm.Res.)8(3):285-291(1991)。
医药的喷雾干燥也是所属领域的普通技术人员已知的。举例来说，参见布罗德黑德J.(Broadhead,J.)等人,“医药喷雾干燥(The Spray Drying of Pharmaceuticals)”,在药物开发与工业制药学(Drug Dev.Ind.Pharm),18(11和12),1169-1206(1992)中。除小分子医药之外，已经喷雾干燥多种生物学材料，并且这些材料包括：酶、血清、血浆、微生物和酵母。喷雾干燥是一项有用的技术，这是因为其可以在单步骤过程中将液体医药制剂转化成精细、无尘的或成团的粉末。基本技术包括以下四个步骤：a)使进料溶液雾化成喷雾；b)喷雾-空气接触；c)干燥喷雾；和d)使干燥产物与干燥空气分离。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号(其以引用的方式并入本文中)描述通过喷雾干燥制备重组型促红细胞生成素。
本发明的医药组合物和调配物可以包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂在部分程度上由所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法决定。相应地，存在本发明医药组合物(包括任选使用的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的多种合适调配物(参见例如雷氏药学大全(Remington'sPharmaceutical Sciences),第17版,1985)。
合适的载剂包括(但不限于)含有丁二酸盐、磷酸、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其它有机酸的缓冲剂；抗氧化剂，包括(但不限于)抗坏血酸；低分子量多肽，包括(但不限于)少于约10个残基的那些多肽；蛋白质，包括(但不限于)血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括(但不限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷氨酸盐或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包括(但不限于)EDTA和依地酸二钠；二价金属离子，包括(但不限于)锌、钴或铜；糖醇，包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的平衡离子，包括(但不限于)钠和氯化钠；填充剂，例如微观结晶纤维素、乳糖、玉米和其它淀粉；黏合剂；甜味剂和其它调味剂；着色剂；和/或非离子表面活性剂，包括(但不限于)TweenTM(包括(但不限于)吐温80(聚山梨醇酯80)和吐温20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM和其它普朗尼克酸(包括(但不限于)普朗尼克酸F68(泊洛沙姆(poloxamer)188))或PEG。合适的表面活性剂包括例如(但不限于)基于聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)，亦即(PEO-PPO-PEO)或聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)，亦即(PPO-PEO-PPO)或其组合的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO在市面上以商品名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(巴斯夫怀恩多特公司(BASF Wyandotte Corp.),密歇根州怀恩多特(Wyandotte,Mich.))销售，并且进一步描述于美国专利第4,820,352号中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可以是合适的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可以用于使聚乙二醇化的IL-10针对一或多种压力(包括(但不限于)由搅拌产生的压力)稳定。一些以上表面活性剂可被称为“结块剂”。一些也可被称为“张力改性剂”。还可以应用抗微生物防腐剂以提供产品稳定性和抗微生物有效性；合适的防腐剂包括(但不限于)苯甲醇、苯扎氯铵、间甲酚、对羟基苯甲酸甲/丙酯、甲酚和苯酚、或其组合。美国专利第7,144,574号(其以引用的方式并入本文中)描述可能适合于本发明医药组合物和调配物和其它递送制剂的其它材料。
本发明的IL-10多肽(包括与例如PEG的水溶性聚合物连接的那些多肽)还可以通过持续释放系统或作为其一部分投与。持续释放组合物包括(包括(但不限于))呈包括(但不限于)膜或微胶囊的成形物件形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包括生物相容性材料，例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(兰格(Langer)等人,生物医学材料研究杂志(J.Biomed,Mater.Res.),15:267-277(1981)；兰格,化学技术(Chem.Tech.),12:98-105(1982))、乙烯基乙酸亚乙酯(兰格等人,同前文献)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚丙交脂(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酸酐、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物(希德曼(Sidman)等人,生物聚合物(Biopolymers),22,547-556(1983))、聚(原)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持续释放组合物还包括脂质体包埋的化合物。含有化合物的脂质体通过本身已知的方法制备：DE3,218,121；爱泼斯坦(Eppstein)等人,美国国家科学院院刊,82:3688-3692(1985)；黄(Hwang)等人,美国国家科学院院刊,77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美国专利第4,619,794号；EP 143,949；美国专利第5,021,234号；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；EP 102,324。引用的所有参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。
脂质体包埋的IL-10多肽通过以下各者中所述的方法制备：DE 3,218,121；爱泼斯坦(Eppstein)等人,美国国家科学院院刊,82:3688-3692(1985)；黄(Hwang)等人,美国国家科学院院刊,77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美国专利第4,619,794号；EP 143,949；美国专利第5,021,234号；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；EP 102,324。脂质体的组成和尺寸是所属领域的技术人员众所周知的或能够容易地由其凭经验测定。脂质体的一些实例如以下各者中所述，例如帕克JW(Park JW)等人,美国国家科学院院刊92:1327-1331(1995)；拉西克D(Lasic D)和帕帕哈乔泡洛斯D(Papahadjopoulos D)(编):脂质体医学应用(MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES)(1998)；德拉蒙德DC(Drummond DC)等人,癌症疗法的脂质体药物递送系统(Liposomal drug delivery systems for cancer therapy),在泰彻B(Teicher B)(编):癌症药物发现与发展(CANCER DRUG DISCOVERY ANDDEVELOPMENT)(2002)中；帕克JW等人,临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)8:1172-1181(2002)；尼尔森UB(Nielsen UB)等人,生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)1591(1-3):109-118(2002)；马莫特C(Mamot C)等人,癌症研究(Cancer Res.)63:3154-3161(2003)。引用的所有参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。
在本发明的上下文中，投与患者的剂量应足以随时间在个体体内引起有益的反应。一般来说，尽管其受制于治疗判断，但每剂量非经肠投与的本发明IL-10多肽的总计医药学上有效量在每天每千克患者体重约0.01μg到约100μg，或约0.05mg到约1mg的范围内。给药频率也受制于治疗判断，并且可以比市售的核准用于人类的IL-10多肽产品频繁或不频繁。一般来说，本发明的聚乙二醇化IL-10多肽可以通过上述投药途径中的任一者来投与。
XV.本发明IL-10多肽的治疗用途
本发明的IL-10多肽适用于治疗多种多样的病症。
本发明的IL-10多肽可以向具有与以下各者相关病症的个人投与，包括(但不限于)特征在于类型1细胞因子模式主导地位的慢性炎性病症、牛皮癣、例如克罗恩氏疾病的发炎性肠病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、移植排斥反应和过敏性接触性皮炎等；或用于治疗或调节肿瘤病状，包括(但不限于)肿瘤增长。IL-10可以自身单独投与或以激动剂形式投与，并且其可以用于治疗炎症或癌症，IL-10调配物可以与目前使用中的任何一或多种佐剂或共疗法一起投与。
本发明的IL-10多肽可以用于治疗发炎病状。本发明的IL-10多肽可以用于治疗慢性和/或神经痛。发炎性疾病和/或病状的非独占性列表包括(但不限于)以下各者：急性胰脏炎；ALS；阿尔茨海默氏病；恶病体质/厌食症；哮喘；动脉粥样硬化；慢性疲劳综合征、发烧；糖尿病(例如胰岛素糖尿病)；丝球体肾炎；移植对抗宿主排斥反应；出血性休克；痛觉过敏、发炎性肠病；关节发炎病状，包括骨关节炎、牛皮癣性关节炎和类风湿性关节炎；局部缺血损伤，包括脑局部缺血(例如由于外伤、癫痫症、出血或中风的大脑损伤，其中的每一者都可能导致神经退化)；肺病(例如ARDS)；多发性骨髓瘤；多发性硬化症；骨髓性白血病(例如AML和CML)和其它白血病；肌病(例如肌肉蛋白质代谢，尤其在败血症中)；骨质疏松；帕金森氏病；疼痛；早产；牛皮癣；再灌注损伤；败血性休克；放射疗法副作用、颞下颌关节疾病、肿瘤癌转移；或由扭伤、挫伤、软骨损坏、外伤、矫形外科、手术、感染或其它疾病过程产生的发炎病状。
关节发炎病状是使世界范围内数百万人不同程度痛苦和致残的慢性关节疾病。类风湿性关节炎是其中软骨和骨由来源于滑液膜的称为关节翳的增殖性侵入性结缔组织缓慢侵蚀分离的关节疾病。疾病可能涉及关节周围结构，例如滑囊、腱鞘和肌腱以及关节外组织，例如皮下组织、心血管系统、肺、脾脏、淋巴结、骨胳肌肉、神经系统(中枢和外周)和眼睛(西尔博伯格(Silberberg)(1985),安德森病理学(Anderson'sPathology),凯撒恩(编),II:1828)。骨关节炎是常见关节疾病，其特征在于关节软骨的退化性变化以及骨和围绕关节的软骨的反应性增生。骨关节炎是细胞介导的活性过程，其可以由软骨细胞对分解和合成代谢刺激的不适当响应产生。据报导，关节软骨的一些基质分子的变化在早期骨关节炎中发生(索尔(Thonar)等人(1993),北美风湿病诊所(Rheumatic disease clinics of North America),莫斯科维茨(Moskowitz)(编),19:635-657和新明(Shinmei)等人(1992),关节炎与风湿病(Arthritis Rheum.),35:1304-1308)。
人们相信类风湿性关节炎由向免疫遗传学敏感宿主提供相关抗原而产生。可能潜在地引发导致类风湿性关节炎的免疫响应的抗原可以是内源性或外源性的。可能内源性抗原包括胶原蛋白、粘多糖类和类风湿性因子。外源性抗原包括菌质、分枝桿菌、螺旋菌和病毒。免疫响应的副产物使滑膜发炎(亦即前列腺素和氧自由基)并且触发破坏性关节变化(亦即胶原蛋白酶)。
存在较宽范围的疾病严重性，但出现间歇复发和缓解的病程，其总体模式为缓慢进行性关节破坏和变形。临床表现可以包括外周关节的对称多发性关节炎，以及疼痛、压痛、肿胀和感染关节功能损失、晨起关节僵硬、和持续性炎症后的软骨损失、骨质侵蚀和关节半脱位。关节外表现包括类风湿性结节、类风湿性血管炎、胸膜肺炎症、巩膜炎、干燥综合征、费耳蒂氏综合征(Felty's syndrome)(脾肿大和嗜中性白血球减少症)、骨质疏松和重量损失(卡茨(Katz)(1985),美国医学杂志(Am.J.Med.),79:24和克拉内(Krane)和西蒙(Simon)(1986),风湿病学进展(Advances inRheumatology),辛德曼(Synderman)(编),70(2):263-284)临床表现导致高度致病率，其导致干扰患者日常生活。
另外，本发明包括一种治疗具有针对IL-10的循环抗体的哺乳动物的方法。所述方法涉及投与有效量的与所述抗体反应减小或没有反应的IL-10多肽。待治疗的哺乳动物可能罹患上文所列疾病或其中IL-10为适用治疗的任何病状中的任一者。本发明中还包括一种制造医药产品的方法，所述医药产品用于治疗具有针对IL-10的循环抗体的哺乳动物。
本发明还包括一种治疗具有响应于IL-10、CD8+T细胞刺激和/或IL-10调配物的癌症风险、将患有所述癌症和/或已患有所述癌症的哺乳动物的方法。投与IL-10多肽可能导致短期效果，即对所观测的若干临床参数的立即有益效果并且这可以在投药后12或24小时时出现，并且另一方面，其还可以导致长期效果，肿瘤增长进程的有益减缓、肿瘤大小减少和/或循环CD8+T细胞含量增加，并且本发明的IL-10多肽可以用所属领域的技术人员已知的任何手段来投与，并且可以有利地以足以获得所需药理学效果的剂量通过输注，例如通过动脉、腹膜内或静脉内注射和/或输注来投与。
IL-10多肽剂量可以在每次治疗每千克体重10-200mg或40-80mg IL-10多肽的范围内。举例来说，所投与的IL-10多肽的剂量可以是以快速注射形式和/或以输注形式保持临床上必需时间段(例如保持介于几分钟到几小时范围内的时间段，例如至多24小时)给予的每千克体重约20-100mg IL-10多肽。必要时，可以重复IL-10多肽投药一次或若干次。IL-10多肽的投与可以与其它药剂(例如化学治疗剂)的投与组合。此外，本发明涉及一种用于预防和/或治疗癌症的方法，其包含向对其有需要的个体投与有效量的IL-10多肽。
IL-10的平均量可以变化，并且具体来说应基于合格医生的建议和处方。IL-10的准确量是对例如所治疗病状的准确类型、所治疗患者的病状以及组合物中的其它成分的因素的优先问题。本发明也投与治疗有效量的另一种活性剂。待给予的量容易由所属领域的普通技术人员基于用IL-10的疗法来确定。
本发明的医药组合物可以用常规方式制备。
实例
提供以下实例以说明，而非限制所主张的发明。
实例1
8升发酵
此实例描述用于包含非天然氨基酸的IL-10多肽的表达方法。使用用于正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和编码来自SEQ ID NO:3或SEQ ID No:1、2、4的IL-10多肽的多核苷酸(其包含选择密码子)的构建体来转变宿主细胞。
制备
制备无菌基质5.5M碳酸钾(0.5L)，并且通过蒸汽或过滤来灭菌。制备无菌25％v/v聚亚烷基消泡剂，例如斯特鲁克托尔(Struktol)J673(0.1L)，并且藉由蒸汽来灭菌。制备浓缩培养基(4L，已界定)，并且过滤灭菌进入无菌进料槽或生物过程袋中。
设定发酵器。用3.91L基质盐溶液使其灭菌。使发酵器达到以下条件：温度＝37℃，pH值＝6.9，1VVM空气。向发酵器中添加0.092L浓缩培养基。添加4mL 50mg/mL卡那霉素(kanamycin)。
制备甘油和阿拉伯糖(任选地酵母提取物)以及以下试剂的溶液：
痕量金属(蒸汽灭菌或过滤灭菌)
维生素(过滤灭菌)
葡萄糖(蒸汽灭菌或过滤灭菌)
1M MgSO4(蒸汽灭菌或过滤灭菌)
硫酸铵，400g/l(蒸汽灭菌或过滤灭菌)
5.5M K2CO3(蒸汽灭菌或过滤灭菌)
1M L-亮氨酸(过滤灭菌)
1M L-异亮氨酸(过滤灭菌)
基质盐，1×
(蒸汽灭菌或过滤灭菌)
浓进料
批次培养基
过程
如表3中所指示描述所进行的过程。
可以在诱导步骤(步骤IV)和收集步骤(步骤V)时完成对此方案的修改。在培养物OD600达到约100到约120之后，a)在诱导之前1.5小时时递送甘油推注；b)在诱导之前1小时时添加pAF并且进行酵母提取物/甘油进料的切换；3)在诱导之前0小时时添加阿拉伯糖；4)诱导保持8小时完成。
实例2
IL-10纯化、聚乙二醇化和IL-10二聚物-PEG纯化过程
从大肠杆菌制备细胞质
1.细胞裂解和IL-10的氧化
将850克细菌细胞小球再悬浮在2550ml(3体积)的20mM TRIS，pH 8.5裂解缓冲液中，以获得25固体％的混合物。发酵液中大致四升培养物将得到这850克细菌小球。将混合物在室温下搅拌30-60分钟，并且在冷却下在15,000psi下使悬浮液穿过微流化床加工器两次。在JA10旋转器中在4℃下将溶解产物在13,500×g下离心45分钟，并且收集上清液。可以添加新鲜制备的0.1M GSSG(FW 612.6)，获得大致16的GSSG与IL-10摩尔比。使组合充分搅拌混合，并且用1M NaOH将pH值调到7.2-7.4。在将混合物在4℃下搅拌隔夜之后，可以用水对其进行稀释，直到其导电性达到1.6-1.9mS/cm。此时，将样品标记为APQFF负载物，并且记录批号，
2.柱1-Q Sepharose FF色谱
柱尺寸可以是：INdEX100/500，100mmI.D.×21.5cm＝1688ml。APQFF缓冲液A由导电性为0.5mS/cm的10mM Bis-TRIS，pH值6.5组成，而APQFF缓冲液B由导电性为90mS/cm的10mM Bis-TRIS，1M NaCl，pH值6.5组成。加工样品的流动速率是90ml/min，而清洗是40ml/min。
AKTA系统是去热源的。为使QFF柱去热源(depyrogenate)并平衡(equilibrate)，使用“QFF depy equi”程序：用2个柱体积的超纯水、2个柱体积的1M NaOH/1M NaCl洗涤柱，培育30分钟，用3个柱体积的APQFF缓冲液B洗涤，随后用4个柱体积的APQFF缓冲液A平衡。
将样品APQFF负载物装载到阴离子交换柱上。用5个柱体积的APQFF缓冲液A洗涤柱，并且用4个柱体积的6％APQFF缓冲液B/A洗脱。收集主要峰。在大致0.85mS/和166mAU处开始收集样品，并且在大致220mAU处结束。将所收集的洗出液表示为APQFF汇集物与批号。将汇集物在4℃下储存隔夜。3个批次的平均步骤产率是84.7％。
用2-3个柱体积的APQFF缓冲液B洗涤柱。泵送入2个柱体积的1NaOH/1MNaCl，并且将柱培育1-6天。如果未在6天内使用柱，那么用1个柱体积的1NaOH/1M NaCl、3个柱体积的缓冲液B、2个柱体积的超纯水和2.5个柱体积的20％EtOH冲洗柱。
每3-5个循环进行一次柱的深入清洗。在1M NaOH/1M NaCl培育后，进行以下各者：用2.5个柱体积的Q柱清洗缓冲液向上流动洗涤，培育60-80小时，用1.5个柱体积的超纯水、1个柱体积的0％到70％EtOH、5个柱体积的70％EtOH，2.5个柱体积的20％EtOH洗涤。Q柱清洗缓冲液由0.5％曲通X-100、0.1M乙酸组成。
3.UF/DF(超滤/透滤)I
以下过滤器用于此程序：赛多利斯(Sartorius)赛多康片(Sartocon Slice)10K海德赛多(Hydrosart)膜包，1000cm2。将APQFF汇集物样品浓缩到约450ml(或在滞留物烧瓶中约200ml)。随后用2.7L(6体积)的GHCHT缓冲液A对其进行透滤，所述GHCHT缓冲液A由10mM Bis-TRIS、1mM MgCl2，pH值6.3组成。在收集滞留物之后，用300ml缓冲液冲洗系统，并且将冲洗溶液与滞留物组合。将滞留物在4,000rpm(2,862×g)下离心5分钟，并且收集上清液。将上清液表示为APQHT负载物与批号。在2小时内加工此样品或在4℃下储存隔夜。
4.柱2-陶瓷羟磷灰石(CHT)色谱(类型I CHT，40μm)
柱尺寸如下：INdEX100/500，100mmI.D.×10.5cm＝824ml。APQHT缓冲液A由导电性为0.94mS/cm的10mM Bis-TRIS，1mM MgCl2，pH值6.3组成。APQHT缓冲液B由导电性为80.5mS/cm的10mM Bis-TRIS，0.5M MgCl2，pH值6.3组成。加工的流动速率是90ml/min，而清洗是40ml/min。
AKTA系统是去热源的。为使CHT柱去热源(depyrogenate)并平衡(equilibrate)，执行“CHT depy equi”程序：用2个柱体积的超纯水、2个柱体积的1M NaOH/1M NaCl洗涤CHT柱，培育30分钟，用3个柱体积的0.5M NaPO4/pH值7.0洗涤，随后用4个柱体积的GHCITT缓冲液A平衡。随后将APQHT负载物样品装载到柱上。用5个柱体积的APQHT缓冲液A洗涤柱。
用经5个柱体积0％-40％APQHT缓冲液B的线性梯度、经在上方柱体积的40％APQHT缓冲液B的阶段梯度来进行洗脱，并且用经2个柱体积的100％APQHT缓冲液B洗涤。收集主要峰。在大致26mAU，20mS/cm，28％APQHT缓冲液B处开始收集，并且在大致86mAU，34mS/cm，40％APQHT缓冲液B处结束。所收集的洗出液表示为APQHT汇集物与批号。将汇集物在4℃下储存隔夜。3个批次的平均步骤产率是96.3％。
用3个柱体积的0.5M NaPO4/pH值7.0洗涤CHT柱。将柱留在此磷酸盐缓冲液中，或进行以下各者：用2个柱体积的1M NaOH/1NaCl、3个柱体积的0.5NaPO4/pH值7.0、2.5个柱体积的超纯水和2.5个柱体积的20％EtOH向上流动洗涤柱。
5.柱3-苯基琼脂糖凝胶(Phenyl Sepharose)HP色谱
柱尺寸如下：INdEX100/500，100mmI.D.×9.7cm＝761ml。IL-10-Phe缓冲液A由导电性为163mS/cm的20mM NaPO4，2M NaCl，pH值7.0组成，而IL-10-Phe缓冲液B由导电性为3.2mS/cm的20mM NaPO4，pH值7.0组成。加工的流动速率是90ml/min，而清洗是40ml/min。
AKTA系统是去热源的。为使Phe柱去热源(depyrogenate)并平衡(equilibrate)，执行“PheHP depy equi”程序：用2个柱体积的超纯水、2个柱体积的1M NaOH/1M NaCl洗涤柱，培育30分钟，随后用4个柱体积的IL-10-Phe缓冲液A平衡。
向IL-10-HT汇集物中添加固体NaCl到2M。将混合物在室温下搅拌1-2小时到溶解，并且将溶液升温到大致20℃。为计算所需NaCl的量(Z g)：(V+Z/4000)×2×58.44＝Z，或Z＝116.88V/(1-116.88/4000)，其中V是以升为单位的GHCHT汇集物的体积。
将IL-10-HT汇集物+NaCl混合物装载到柱上。用3个柱体积的IL-10-Phe缓冲液A洗涤柱。用以下复杂梯度来进行洗脱：经3个柱体积IL-10-Phe缓冲液B的10％阶段，经7个柱体积10％-80％IL-10-Phe缓冲液B梯度，经2个柱体积80％IL-10-Phe缓冲液B阶段，和经3个柱体积100％IL-10-Phe缓冲液B阶段。收集主要峰。在大致17.3mAU，111mS/cm，46.7％IL-10-Phe缓冲液B处开始收集，并且在大致43mAU，54mS/cm，80％IL-10-Phe缓冲液B处结束。所收集的洗出液表示为ApoPhe汇集物与批号。在2小时内进行后一步骤，或将汇集物在4℃下储存隔夜。来自3个批次的平均步骤产率是94.6％。
用2个柱体积的1M NaOH向上流动洗涤Phe柱，培育30分钟，用3个柱体积的GHPhe缓冲液A、3个柱体积的超纯水和2.5个柱体积的20％EtOH洗涤。在3-5个循环之后，用2个柱体积的1NaOH向上流动洗涤Phe柱，培育30分钟，用3个柱体积的IL-10-Phe缓冲液A、3个柱体积的超纯水、经1个柱体积的0％-70％EtOH、3个柱体积的70％EtOH洗涤，并且储存在20％EtOH中。
6.UF/DF(超滤/透滤)II
以下过滤器用于此程序：赛多利斯(Sartorius)赛多康片(Sartocon Slice)10K海德赛多(Hydrosart)膜包，1000cm2。将ApoPhe汇集物浓缩到约450ml(或在滞留物烧瓶中约200ml)。随后用2.7L(6倍体积)的GH调配物缓冲液对其进行透滤，所述GH调配物缓冲液由20mM柠檬酸钠、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇，pH值6.0组成。将样品浓缩到约360ml。收集滞留物。用300ml的IL-10调配物缓冲液冲洗系统，并且将冲洗溶液与滞留物组合。将滞留物在4,000rpm(2,862×g)下离心5分钟，并且收集上清液。将上清液表示为ApoAF-cBx，并且也被称为“过程中块体”。等分过程中块体并且在-80℃下储存。
7.UF/DF(超滤/透滤)IIa
将以下浓缩器/过滤器用于此程序：具有YM10膜(63.5mm)的阿米康(Amicon)搅拌池(200ml)。反应缓冲液由20mM乙酸钠、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇、1mM EDTA，pH值4.0组成。使用来自步骤6的一部分过程中块体，例如250mg的IL-10pAF，并且通过添加10％-12％(v/v)的10％乙酸来将pH值调到大致4。将样品浓缩到25-50ml，并且添加反应缓冲液到大致180ml。重复所述过程，直到实现总共>500倍的缓冲液交换。将样品浓缩到大致25ml。收集滞留物，并且在2,000×g下离心3分钟以去除任何沉淀。将上清液表示为ApoAF-cBx/pH4与日期。
IL-10-AF-cBx/pH4的蛋白质浓度通过使用A276 1mg/ml＝0.818测量稀释20倍的样品的A276来测定。通过用反应缓冲液稀释来将IL-10-AF-cBx/pH4的浓度调到8mg/ml。
8.聚乙二醇化反应
所需30K MPEG-氧基胺的量使用IL-10-二聚物-AF-pAF摩尔比来计算为＝10。称重PEG粉末并且在室温下将其缓慢添加到IL-10-二聚物-AF-pAF溶液中，并且在各自添加之后用刮勺混合。将反应混合物在28℃下在温和振荡的情况下放置18-48小时。通过进行SDS凝胶来确认聚乙二醇化(例如图2中所示的较小规模实验的结果)。反应在IL-10三聚物与PEG之间形成肟键。
9.柱4-源Q(SourceQ)色谱(30μm)
柱尺寸如下：XK26/20，26mmI.D.×17cm＝90ml。源Q缓冲液A由导电性为0.9mS/cm的10mM TRIS，pH值7.0组成。源Q缓冲液B由导电性为93mS/cm的10mM TRIS，1M，pH值7.0组成。流动速率是6ml/min。
AKTA系统是去热源的。为使源Q柱去热源(depyrogenate)并平衡(equilibrate)，执行“源Q depy equi”程序：：用2个柱体积的超纯水、2个柱体积的1M NaOH/1M NaCl洗涤源Q柱，培育30分钟，用5个柱体积的源Q缓冲液B洗涤，随后用5个柱体积的源Q缓冲液A平衡。
向来自步骤8的反应混合物中添加20％(v/v)的0.5M TRIS基质。用9体积的源Q缓冲液A和10体积的超纯水进行20倍稀释。随后将混合物装载到柱上。用5个柱体积的源Q缓冲液A洗涤柱。洗脱用经20个柱体积的0％-10％源Q缓冲液B的线性梯度来进行。收集第一主要峰。将所收集的洗出液表示为源Q汇集物与批号。将汇集物在4℃下储存隔夜。
10.UF/DF(超滤/透滤)III
以下浓缩器/过滤器用于此程序：具有YM10膜(63.5mm)的阿米康搅拌池(200ml)。WHO缓冲液由2.5g/L NaHCO3、20g/L甘氨酸、2g/L甘露糖醇、2g/L乳糖，pH值7.3组成。
将源Q汇集物浓缩到20-30ml，并且添加WHO缓冲液到大致180ml。重复所述过程，直到实现总共>600倍的缓冲液交换。随后将样品浓缩到2mg/ml或所需浓度。收集滞留物，并且在通风橱中用0.2μm膜过滤灭菌。无菌样品表示为PEG30-IL-10残余物#pAF与批号。
PEG30-IL-10-二聚物-AF-pAF的当量hGH浓度通过使用A276 lmg/ml＝0.818来测量经稀释样品的A276用一式三份稀释液和测量值来测定。步骤7的总产率大致是20％。基于HPLC和SDS-PAGE分析，PEG-ApoAF-pAF纯度>90％。
存在许多用于选择将非天然编码氨基酸併入IL-10中的位点的潜在准则集合。
在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在IL-10中以下位置中的一或多者中：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1、2、4中的相应氨基酸)。
在一些实施例中，这些位置中一或多者处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)位置：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1、2、4中的相应氨基酸)。
全长IL-10的核苷酸序列显示为SEQ ID NO:1。IL-10的氨基酸序列显示为SEQ IDNO:2，并且IL-10的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:3或因其由用于表达的质粒编码而显示为SEQ ID NO:4。
实例3
此实例详述大肠杆菌中包括非天然编码氨基酸的IL-10的克隆和表达。此实例还描述评估经修饰IL-10的生物活性的方法。
克隆IL-10的方法是所属领域的普通技术人员已知的。用于IL-10的多肽和多核苷酸序列和将这些多肽克隆到宿主细胞中以及IL-10的纯化是此项技术中已知的，并且还详述于戈德尔等人,核酸研究,8,4057(1980)中，其以全文引用的方式并入本文中。
不具有前导序列或信号序列的编码IL-10的氨基酸显示为SEQ ID NO:3。所引入的包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统用于表达含有非天然编码氨基酸的IL-10。O-RS优先用非天然编码氨基酸将O-tRNA氨酰基化。随后，翻译系统响应于所编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入IL-10或IL-10变异体中。合适的O-RS和O-tRNA序列描述于名称为“氨酰基-tRNA合成酶的组合物和其用途与E9的D286R突变体(Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetaseand Uses Thereof&D286R mutant of E9)”的WO 2006/068802和名称为“tRNA组合物和其用途(F13)(Compositions of tRNA and Uses Thereof(F13))”的WO 2007/021297中，其以全文引用的方式并入本文中。
用含有经修饰IL-10变异体多核苷酸序列和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对的质粒(对所需非天然编码氨基酸具有特异性)转变大肠杆菌使非天然编码氨基酸位点特异性地并入IL-10多肽中。IL-10变异体多肽的表达在T7启动子的控制下。
用对乙酰基-苯丙氨酸(pAF)抑制
通过具有所属领域经验者已知的方法来产生表达构建体，并且各构建体具有将产生具有非天然编码氨基酸的IL-10或IL-10变异体多肽的琥珀终止密码子。
将用于表达IL-10多肽的质粒转变到BL21DE3大肠杆菌细胞中。向细胞中添加对乙酰基-苯丙氨酸(pAF)，并且诱导蛋白质表达。进行IL-10多肽表达的SDS PAGE分析，并且用箭头标记IL-10多肽。对原始野生型IL-10多肽；并对经pAF取代的IL-10多肽(在特定氨基酸残基处具有对乙酰基苯丙氨酸取代的IL-10)之间的比较进行条带分析。
T7聚合酶的表达在阿拉伯糖诱导性启动子的控制下。向细胞中添加对乙酰基-苯丙氨酸(pAF)，并且通过添加阿拉伯糖(最终0.2％)来诱导蛋白质表达。将培养物在37℃下培育5小时。
其它构建体
用IL-10多核苷酸序列和用于非天然氨基酸取代的选择密码子产生表达构建体。对用这些构建体产生的IL-10多肽进行分离和聚乙二醇化。
包涵体的制备溶解
通过混合以最终10固体％将细胞浆再悬浮于4℃包涵体(inclusion body；IB)缓冲液I(50mM Tris pH值8.0；100mM NaCl；1mM；1％曲通X-100；4℃)中。通过使再悬浮的材料通过微流化床总共两次来溶解细胞。离心样品(14,000g；15分钟；4℃)，并且倾析上清液。通过再悬浮于另一体积的IB缓冲液I(50mM Tris pH值8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1％曲通X-100；4℃)中来洗涤包涵体小球，并且使再悬浮的材料穿过微流化床总共两次。随后离心样品(14,000g；15分钟；4℃)，并且倾析上清液。将包涵体小球各自再悬浮于一个体积的缓冲液II(50mM Tris pH值8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；4℃)中。离心样品(14,000g；15分钟；4℃)，并且倾析上清液。将包涵体小球再悬浮于1/2体积的缓冲液II(50mM Tris pH值8.0；100mMNaCl；1mM EDTA；4℃)中。随后将包涵体等分入适当容器中。离心样品(14,000g；15分钟；4℃)，并且倾析上清液。溶解包涵体或在-80℃下储存直到进一步使用。
包涵体溶解
将包涵体溶解于溶解缓冲液(20mM Tris，pH值8.0；8M胍；10mMβ-ME)中达到介于10-15mg/mL之间的最终浓度。随后将所溶解的包涵体在室温下在恒定混合下培育1小时或直到完全溶解。随后离心样品(10,000g；20分钟；4℃)以去除任何未溶解的材料。随后，如果蛋白质浓度较高，那么通过用另外的溶解缓冲液稀释来调整各样品的蛋白质浓度。
再折叠
通过在20mM Tris，pH值8.0；60％蔗糖；4℃中将样品稀释到最终蛋白质浓度0.5mg/mL来进行再折叠。在4℃进行再折叠，保持5天。
纯化
用超纯H2O 1:1稀释再折叠的材料。经0.22μm PES过滤器过滤材料，并且装载到用20mM Tris，pH值8.0；0.15M NaCl(缓冲液A)平衡的蓝色琼脂糖凝胶(BlueSepharose)FF柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上。以向上流动的方式用5个柱体积的30％缓冲液B(20mM Tris，pH值8.0；2M NaCl；50％乙二醇)洗涤柱。通过用10个柱体积的100％缓冲液B洗涤柱来洗脱IL-10多肽。
聚乙二醇化和纯化
取出IL-10汇集物并且用超纯水稀释10×。用50％冰醋酸将各样品的pH值调到4.0。将样品浓缩到约1.0mg/mL。向各样品中添加1:12莫耳过量的经活化PEG(羟胺PEG)。随后将样品在27℃下培育48-72小时。取出样品并用水(<8m/S)稀释8-10倍并且装载到用缓冲液A(50mM NaAc，pH 6.0；50mM NaCl；0.05％两性洗涤剂(Zwittergent)3-14)平衡的SP HP柱(通用电气医疗集团)上。用5个柱体积的缓冲液B(50mM NaAc，pH值6.0；500mM NaCl；；0.05％两性洗涤剂3-14)洗脱IL-10多肽。汇集IL-10洗脱份，并且穿过用IL-10储存缓冲液(20mM NaAc，pH值5.0；150mM NaCl；0.05％两性洗涤剂3-14)平衡的休珀代克斯(Superdex)200尺寸分级柱。收集经聚乙二醇化的材料，并且在4℃下储存。
经聚乙二醇化的分子在为pAF所显示的位置处结合。
实例4
本实例详述含羰基氨基酸的引入和与含氨氧基PEG的后续反应。
此实例展示一种用于产生并入有含酮非天然编码氨基酸的IL-10的方法，所述非天然编码氨基酸随后与MW大致5,000的含氨氧基PEG反应。位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合中的残基中的每一者(SEQ ID NO:3或SEQID No:1、2、4中的相应氨基酸)单独地经具有以下结构的非天然编码氨基酸取代：
用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性地并入IL-10中的序列是SEQ ID NO:3(成熟长度IL-10)和SEQ ID No:1、2、4。
一经修饰后，包含含羰基氨基酸的IL-10变异体与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应：
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
其中R是甲基，n是3且N是约5,000MW。使以10mg/mL溶解于25mM MES(西格玛化学品公司(Sigma Chemical),密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))pH值6.0，25mM Hepes(西格玛化学品公司,密苏里州圣路易斯)pH值7.0或10mM乙酸钠(西格玛化学品公司,密苏里州圣路易斯)pH值4.5中的经纯化含对乙酰基苯丙氨酸的IL-10与过量10到100倍的含氨氧基PEG反应，并且随后在室温下搅拌10-16小时(詹克斯W.美国化学会志1959,81,第475页)。随后将PEG-IL-10稀释到适当缓冲液中以供立即纯化和分析。
实例5
与由羟胺基通过酰胺键与PEG连接组成的PEG的结合。
使用实例3中所述的程序将具有以下结构的PEG试剂与含酮非天然编码氨基酸偶合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
其中R＝甲基，n＝4且N是约20,000MW。反应条件、纯化条件和分析条件如实例3中所述。
实例6
此实例详述将两个相异的非天然编码氨基酸引入IL-10多肽中。
此实例展示一种用于产生并入有一或多个非天然编码氨基酸的IL-10的方法，所述非天然编码氨基酸在以下残基中的两个位置处包含酮官能基：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、1.19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID No:1、24中的相应氨基酸)。除了在核酸内的两个相异位点处引入选择密码子之外，如实例1和2中所述制备IL-10。
实例7
此实例详述将本发明的IL-10多肽结合于含酰肼PEG上并且后续当场还原。
根据实例2和3中所述的程序制备并入有含羰基氨基酸的IL-10多肽。一经修饰后，将具有以下结构的含酰肼PEG结合于IL-10多肽上：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
其中R＝甲基，n＝2且N＝10,000MW，并且X是羰基(C＝O)。将经纯化的含对乙酰基苯丙氨酸的IL-10以介于0.1-10mg/mL之间溶解在25mM MES(西格玛化学品公司,密苏里州圣路易斯)pH值6.0、25mM Hepes(西格玛化学品公司,密苏里州圣路易斯)pH值7.0或10mM乙酸钠(西格玛化学品公司,密苏里州圣路易斯)pH值4.5中，与过量1到100倍的含酰肼PEG反应，并且通过添加溶解于H2O中的储备液1MNaCNBH3(西格玛化学品公司,密苏里州圣路易斯)达到10-50mM的最终浓度来当场还原相应腙。反应在黑暗中在4℃到室温下进行18-24小时。通过添加约pH 7.6的1MTris(西格玛化学品公司,密苏里州圣路易斯)达到50mM的最终Tris浓度来终止反应，或者稀释于适当缓冲液中以供立即纯化。
实例8
此实例详述将含炔烃氨基酸引入IL-10多肽中并且用mPEG-叠氮基衍生化。
以下残基：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID No:1、2、4中的相应氨基酸)各自经以下非天然编码氨基酸取代：
用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性地并入IL-10中的序列是SEQ ID NO:3(成熟长度IL-10)和SEQ ID No:1、2、4。含有炔丙基酪氨酸的IL-10多肽在大肠杆菌中表达，并且使用在以上实例中所述的条件来加以纯化。
将经纯化的含炔丙基酪氨酸的IL-10以介于0.1-10mg/mL之间溶解在PB缓冲液(100mM磷酸钠、0.15M NaCl，pH值＝8)中，并且向反应混合物中添加过量10到1000倍的含叠氮基PEG。随后将催化量的CuSO4和Cu线添加到反应混合物中。在培育混合物(包括(但不限于)在室温或37℃下约4小时，或者在4℃下隔夜)之后，添加H2O并经透析膜过滤混合物。通过(包括(但不限于))以上实例中所述的类似程序分析样品的加成反应。
在此实例中，PEG将具有以下结构：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
其中R是甲基，n是4且N是10,000MW。
实例9
此实例详述较大疏水性氨基酸在本发明IL-10多肽中的取代。
在IL-10以下区域之一内存在的Phe、Trp或Tyr残基：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1、2、4中的相应氨基酸)经如以上实例中所述的以下非天然编码氨基酸取代：
一经修饰后，PEG连接到包含含炔烃氨基酸的IL-10变异体上。PEG将具有以下结构：
Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3
并且偶合程序将遵循实例7中的那些程序。这将产生包含与天然产生较大疏水性氨基酸之一大致等比容的非天然编码氨基酸并且在多肽内相异位点处经PEG衍生物修饰的IL-10变异体。
实例10
此实例详述由一或多个PEG连接基团分隔的IL-10多肽同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物的产生。
使实例7中产生的含炔烃IL-10多肽变异体与以下形式的双官能PEG衍生物反应：
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3
其中n是4并且PEG的平均MW为大致5,000，以产生其中两个IL-10分子由PEG物理分隔的相应IL-10多肽同型二聚物。以类似的方式，IL-10多肽可以与一或多种其它多肽偶合以形成异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物。将如在以上实例中进行偶合、纯化和分析。
实例11
此实例详述糖部分与IL-10多肽或变异体多肽的偶合。
使以下各者中的一个残基经下文非天然编码氨基酸取代：如以上实例中所述经取代的位置1之前(亦即在N端)、1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160或添加到蛋白质羧基端上(SEQ IDNO:3或SEQ ID No:1、2、4中的相应氨基酸)。
一经修饰后，包含含羰基氨基酸的IL-10多肽或变异体多肽与N-乙酰葡糖胺β连接氨氧基类似物(GlcNAc)反应。在100mM乙酸钠水性缓冲液(pH值5.5)中混合IL-10多肽(10mg/mL)和氨氧基糖(21)，并且在37℃下培育7到26小时。通过在环境温度下将经糖结合的IL-10变异体(5mg/mL)与UDP-半乳糖(16mM)和β-1,4-半乳糖基转移酶(0.4单位/毫升)一起在150mM HEPES缓冲液(pH值7.4)培育48小时来使第二糖与第一糖以酶促方式偶合(肖恩巴彻(Schanbacher)等人生物化学杂志(J.Biol Chem.)1970,245,5057-5061)。
实例12
此实例详述聚乙二醇化IL-10多肽拮抗剂的产生。
包括(但不限于)涉及IL-10受体结合的那些残基的残基如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代。
一经修饰后，包含含羰基氨基酸的IL-10多肽将与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应：
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
其中R是甲基，n是4且N是20,000MW，以产生包含非天然编码氨基酸的IL-10多肽拮抗剂，所述非天然编码氨基酸在多肽内的单个位点处经PEG衍生物修饰。如在以上实例中进行偶合、纯化和分析。
实例13
IL-10多肽或变异体多肽、其中直接连接IL-10多肽的同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物的产生
包含含炔烃氨基酸的IL-10多肽变异体可以与包含含叠氮基氨基酸的另一个IL-10多肽变异体直接偶合。以类似方式，IL-10多肽可以与一或多个其它多肽偶合以形成异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物。如在以上实例中进行偶合、纯化和分析。
实例14
使聚亚烷基二醇(P-OH)与烷基卤化物(A)反应，形成醚(B)。在这些化合物中，n是0到9的整数，并且R'可以是直链或分支链、饱和或不饱和的C1到C20烷基或杂烷基。R'也可以为C3到C7饱和或不饱和环烷基或环杂烷基、经取代或未经取代的芳基或杂芳基，或经取代或未经取代的烷芳基(烷基为C1到C20饱和或不饱和烷基)或杂烷芳基。通常，PEG-OH是分子量为800到40,000道尔顿(Da)的聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例15
mPEG-OH+Br-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C≡CH
用含NaH(12mg，0.5mmol)的THF(35mL)处理分子量为20,000Da的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol；新日生物技术公司(Sunbio))。随后将溶解于二甲苯中成为80重量％溶液的炔丙基溴溶液(0.56mL，5mmol，50当量，阿尔德里奇公司(Aldrich))和催化量的KI添加到溶液中，并将所得混合物加热到回流2小时。接着添加水(1mL)，并在真空下去除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2(25mL)，并分离有机层，经无水Na2SO4干燥，并将体积减少到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。收集得到的沉淀，用数份冷乙醚洗涤，并干燥，得到炔丙基-O-PEG。
实例16
mPEG-OH+Br-(CH2)3-C≡CH→mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
用含NaH(12mg，0.5mmol)的THF(35mL)处理分子量为20,000Da的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol；新日生物技术公司)。随后，向混合物中添加50当量的5-溴-1-戊炔(0.53mL，5mmol，Aldrich)和催化量的KI。将所得混合物加热到回流，保持16小时。随后添加水(1mL)，并且在真空下去除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2(25mL)，并且分离有机层，经无水Na2SO4干燥，并且将体积减少到大致2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。收集得到的沉淀，用数份冷乙醚洗涤，并干燥，得到相应的炔。在类似反应中可以使用5-氯-1-戊炔。
实例17
(1)m-HOCH2C6H4OH+NaOH+Br-CH2-C≡CH→m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(2)m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+MsCl+N(Et)3→m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(3)m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+LiBr→m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH
(4)mPEG-OH+m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C≡CH
向3-羟基苯甲醇(2.4g，20mmol)于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中首先添加粉末状氢氧化钠(1.5g，37.5mmol)，随后添加溶解于二甲苯中成为80重量％溶液的炔丙基溴溶液(3.36mL，30mmol)。将反应混合物在回流下加热6小时。向混合物中添加10％柠檬酸(2.5mL)，并在真空下去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤经合并的有机层，经MgSO4干燥，并浓缩，得到3-炔丙氧基苯甲醇。
在0℃下，向化合物3(2.0g，11.0mmol)于CH2C12中的溶液中添加甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)，并将反应物放入冰箱中，保持16小时。常规处理后，得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将此油状物(2.4g，9.2mmol)溶解于THF(20mL)中，并添加LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热到回流，保持1小时，随后冷却到室温。向混合物中添加水(2.5mL)，并在真空下去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤经合并的有机层，经无水Na2SO4干燥，并浓缩，得到所需溴化物。
将mPEG-OH 20kDa(1.0g，0.05mmol，新日生物技术公司)溶解于THF(20mL)中，并在冰浴中冷却溶液。在剧烈搅拌下，经数分钟添加NaH(6mg，0.25mmol)，随后添加由上述获得的溴化物(2.55g，11.4mmol)和催化量的KI。去除冷却浴，并将所得混合物加热到回流，保持12小时。向混合物中添加水(1.0mL)，并在真空下去除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2(25mL)，并且分离有机层，经无水Na2SO4干燥，并且将体积减少到大致2mL。逐滴添加到乙醚溶液(150mL)中，得到白色沉淀，收集沉淀，得到PEG衍生物。
实例18
mPEG-NH2+X-C(O)-(CH2)n-C≡CR'→mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR'
也可通过使含末端官能团的聚(乙二醇)聚合物与上文所示的含有炔官能团的反应性分子偶合，获得含末端炔的聚(乙二醇)聚合物。n介于1与10之间。R'可以是H或C1到C4小烷基。
实例19
(1)HO2C-(CH2)2-C≡CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH
(2)mPEG-NH2+NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C≡CH
将4-戊炔酸(2.943g，3.0mmol)溶解于CH2Cl2(25mL)中。添加N-羟基琥珀酰亚胺(3.80g，3.3mmol)和DCC(4.66g，3.0mmol)，并在室温下搅拌溶液隔夜。所得粗NHS酯7不经进一步纯化即用于下一反应中。
将分子量为5,000Da的mPEG-NH2(mPEG-NH2，1g，新日生物技术公司)溶解于THF(50mL)中，并将混合物冷却到4℃。在剧烈搅拌下逐份添加NITS酯7(400mg，0.4mmol)。将混合物搅拌3小时，同时升温到室温。接着添加水(2mL)，并在真空下去除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2(50mL)，并分离有机层，经无水Na2SO4干燥，并且将体积减少到大致2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。收集所得沉淀，并在真空中干燥。
实例20
本实例描述聚(乙二醇)甲烷磺酰基酯(也可称为甲烷磺酸酯或甲磺酸酯)的制备。可以用类似程序制备相应的甲苯磺酸酯和卤化物。
mPEG-OH+CH3SO2C1+N(Et)3→mPEG-O-SO2CH3→mPEG-N3
在氮气下，将mPEG-OH(MW＝3,400，25g，10mmol)在150mL甲苯中共沸蒸馏2小时，并将溶液冷却到室温。将40mL无水CH2Cl2和2.1mL无水三乙胺(15mmol)添加到溶液中。在冰浴中冷却溶液，并逐滴添加1.2mL蒸馏过的甲烷磺酰氯(15mmol)。在室温下，在氮气下搅拌溶液隔夜，并通过添加2mL无水乙醇淬灭反应。在真空下蒸发混合物以去除溶剂(主要是除甲苯外的溶剂)，过滤，再次在真空下浓缩，随后沉淀到100mL乙醚中。用数份冷乙醚洗涤滤液，并在真空中干燥，得到甲磺酸酯。
将甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解于75ml THF中，并将溶液冷却到4℃。向经冷却的溶液中添加叠氮化钠(1.56g，24mmol)。在氮气下，将反应物加热到回流，保持2小时。随后蒸发溶剂，并用CH2Cl2(50mL)稀释残余物。用NaCl溶液洗涤有机部分，并经无水MgSO4干燥。将体积减少到20ml，并通过添加到150ml冷无水乙醚来沉淀产物。
实例21
(1)N3-C6H4-CO2H→N3-C6H4CH2OH
(2)N3-C6H4CH2OH→Br-CH2-C6H4-N3
(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3→mPEG-O-CH2-C6H4-N3
使用美国专利5,998,595中所述的方法来产生4-叠氮基苯甲醇，其以引用的方式并入本文中，在0℃下向4-叠氮基苯甲醇(1.75g，11.0mmol)于CH2Cl2中的溶液中添加甲磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)，并将反应物放入冰箱中，保持16小时。常规处理后，得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将此油状物(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中，并添加LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热到回流，保持1小时，随后冷却到室温。向混合物中添加水(2.5mL)，并在真空下去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤经合并的有机层，经无水Na2SO4干燥，并浓缩，得到所需溴化物。
用含NaH(12mg，0.5mmol)的THF(35mL)处理mPEG-OH 20kDa(2.0g，0.1mmol，新日生物技术公司)，并向混合物中添加将溴化物(3.32g，15mmol)与催化量的KI。将所得混合物加热到回流，保持12小时。向混合物中添加水(1.0mL)，并在真空下去除溶剂。向残余物中添加CH2Cl2(25mL)，并且分离有机层，经无水Na2SO4干燥，并且将体积减少到大致2mL。逐滴添加到醚溶液(150mL)中，使得沉淀，收集所述沉淀，得到mPEG-O-CH2-C6H4-N3。
实例22
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H+N3-CH2CH2CO2-NHS→N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
将NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H(MW 3,400Da，2.0g)溶解于NaHCO3饱和水溶液(10mL)中，并将溶液冷却到0℃。在剧烈搅拌下添加3-叠氮基-L-N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯(5当量)。3小时后，添加20mL H2O，并在室温下再搅拌混合物45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调到3，并且添加NaCl直到浓度是约15重量％。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物，经Na2SO4干燥，并浓缩。用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物，并在真空下干燥，得到ω-羧基-叠氮基PEG衍生物。
实例23
mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H
在剧烈搅拌下，向如此项技术中已知制备并冷却到-78℃的乙炔锂(4当量)于THF中的溶液中逐滴添加mPEG-OMs溶解于THF中的溶液。在3小时之后，使反应物升温到室温，并通过添加1mL丁醇淬灭反应。随后添加20mL H2O，并在室温下再搅拌混合物45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调到3，并且添加NaCl直到浓度是约15重量％。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物，经Na2SO4干燥，并浓缩。用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物，并在真空下干燥，得到1-(丁-3-炔基氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例24
可以使用在L.王等人,(2001),科学292:498-500，J.秦等人,科学301:964-7(2003)，J.W.秦(J.W.Chin)等人,(2002),美国化学会志124:9026-9027；J.W.秦和P.G.舒尔茨,(2002),化学生物化学3(11):1135-1137；J.W.秦等人,(2002),美国国家科学院院刊99:11020-11024；和L.王和P.G.舒尔茨,(2002),化学通讯,1:1-11中所述的方法来将含叠氮基和含乙炔的氨基酸位点选择性地并入蛋白质中。一旦并入有氨基酸后，在存在2mM PEG衍生物、1mM CuSO4和约1mg Cu线的情况下，用磷酸盐缓冲液(PB)，pH值8中的0.01mM蛋白质在37℃下进行环加成反应，保持4小时。
实例25
此实例描述对乙酰基-D,L-苯丙氨酸(pAF)和m-PEG-羟胺衍生物的合成。
使用先前在张Z.,史密斯B.A.G(Smith,B.A.G),王L.,布洛克A.(Brock,A.),周C.(Cho,C.)和舒尔茨P.G.生物化学,(2003)42,6735-6746中所述的程序来合成外消旋pAF。为了合成m-PEG-羟胺衍生物，完成以下程序。在室温(RT)下，搅拌(N-t-Boc-氨氧基)乙酸(0.382g，2.0mmol)和1,3-二异丙基碳化二亚胺(0.16mL，1.0mmol)于二氯甲烷(DCM，70mL)中的溶液1小时，向其中添加甲氧基-聚乙二醇胺(m-PEG-NH2，7.5g，0.25mmol，Mt.30K，来自拜耳维特公司(BioVectra))和二异丙基乙胺(0.1mL，0.5mmol)。将反应物在室温下搅拌48小时，随后浓缩到约100mL。将混合物逐滴添加到冷乙醚(800mL)中。经t-Boc保护的产物沉淀析出，并通过过滤收集，用乙醚洗涤3次，每次100mL。通过将其再溶解于DCM(100mL)中，并沉淀于乙醚(800mL)中2次，来进行进一步纯化。真空干燥产物，得到7.2g(96％)，通过NMR和茚三酮测试确定。
上文获得的经保护产物(7.0g)的Boc脱除是在0℃下在50％TFA/DCM(40mL)中进行1小时并且接着在室温下进行1.5小时。真空中去除大部分TFA后，通过向残余物中添加HCl在二噁烷中的4N溶液(1mL)，将羟胺衍生物的TFA盐转化成HCl盐。将沉淀溶解于DCM(50mL)中，并且在醚(800mL)中再沉淀。通过过滤收集最终产物(6.8g，97％)，用醚3×100mL洗涤，在真空中干燥，在氮气下储存。使用相同程序合成其它PEG(5K,20K)羟胺衍生物。
实例26
此实例描述使用基于细胞的分析来检测IL-10活性。在增殖分析中，以适当浓度接种对IL-10敏感的癌细胞。使细胞附着。随后与可变浓度的IL-10、IL-10二聚物、PEG-IL-10、PEG-IL-10二聚物一起培育细胞，并且通过比色分析测定细胞存活性。随后通过细胞表型的变化来评估凋亡诱导，并且可以通过检测经活化半胱天冬酶3来确认。
实例27
此实例描述评估本发明的IL-10多肽的临床前模型。
在用本发明的IL-10三聚物处理之后，证实在裸小鼠中异种移植肿瘤增长将减少。在裸小鼠中与核准CTX一起进行组合疗法。
实例28
给定一个剂量后，在24、48和72小时时收集血液和肿瘤。测量血液化合物含量。测量均匀化的提取的肿瘤中的经活化半胱天冬酶3和经活化半胱天冬酶8。
野生型IL-10：10mg/kg×0.025千克/小鼠＝250μg/小鼠。
0.25毫克/小鼠×1次投药×3小鼠/时间点×3时间点×1.4损耗＝__3.2__mg-PK/PD(带有肿瘤的小鼠)。
应理解，本文中所述的实例和实施例仅出于说明目的，并且将对所属领域的普通技术人员提出根据所述实例和实施例的各种修改或改变，并且所述修改和改变都将包括在本申请案的精神和范围以及随附权利要求书的范围内。本申请案中引用的所有出版物、专利、专利申请案和/或其它文献都出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，引用的程度就如同出于所有目的将各个别出版物、专利、专利申请案和/或其它文献个别地以引用的方式并入本文中一样。

Claims (53)

1.一种白细胞介素10(IL-10)多肽，其包含一或多个非天然编码氨基酸。
2.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:390％同源。
3.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:3至少90％同源。
4.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:3至少95％同源。
5.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:3至少98％同源。
6.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:3至少99％同源。
7.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10结合于一或多种水溶性聚合物上。
8.根据权利要求3所述的IL-10，其中所述水溶性聚合物中的至少一者与非天然编码氨基酸中的至少一者连接。
9.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10的形式是单体。
10.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10的形式是二聚物。
11.根据权利要求9所述的IL-10，其中所述IL-10三聚物结合于至少一种水溶性聚合物上。
12.根据权利要求10所述的IL-10，其中所述IL-10三聚物结合于至少一种水溶性聚合物上。
13.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代：位置1之前(亦即在N端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或添加到蛋白质羧基端上和其任何组合。
14.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10包含一或多个调节所述IL-10多肽对IL-10受体亲和力的氨基酸取代、添加或缺失。
15.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10包含一或多个提高所述IL-10稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
16.根据权利要求1所述的脂蛋白元，其中所述IL-10包含一或多个提高所述IL-10多肽在重组宿主细胞中的表达或体外合成的氨基酸取代、添加或缺失。
17.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10包含一或多个提高所述IL-10的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
18.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸对连接基团、聚合物或生物活性分子具有反应性，而所述连接基团、聚合物或生物活性分子另外对所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一者均不具反应性。
19.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
20.根据权利要求19所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
21.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2是H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；并且R3是H、氨基酸、多肽，或氨基端修饰基团；并且R4是H、氨基酸、多肽，或羧基端修饰基团。
22.根据权利要求19所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
23.根据权利要求19所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
24.根据权利要求19所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。
25.根据权利要求19所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
26.根据权利要求19所述的IL-10多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮基。
27.根据权利要求21所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0到10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
28.根据权利要求19所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
29.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n是0到10；R1是烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X是O、N、S或不存在；m是0到10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
30.根据权利要求7所述的IL-10，其中所述水溶性聚合物的分子量介于约0.1kDa与约100kDa之间。
31.根据权利要求28所述的IL-10多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于约0.1kDa与约50kDa之间。
32.根据权利要求19所述的IL-10，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基通过酰胺键与所述水溶性聚合物连接。
33.根据权利要求28所述的IL-10，其通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含非天然编码氨基酸的多肽反应来制得，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基。
34.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
35.根据权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽更包含通过所述非天然编码氨基酸与所述多肽连接的连接基团、聚合物或生物活性分子。
36.根据权利要求33所述的IL-10，其中所述IL-10多肽其中所述连接基团、聚合物或生物活性分子通过糖部分与所述多肽连接。
37.一种制造根据权利要求1所述的白细胞介素10的方法，所述方法包含使所分离的包含非天然编码氨基酸的IL-10多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应部分的连接基团、聚合物或生物活性分子接触。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。
39.根据权利要求35所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分，并且所述连接基团、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通过酰胺键与所述连接基团、聚合物或生物活性分子连接。
42.根据权利要求43所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含炔部分，并且所述连接基团、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
43.根据权利要求43所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮部分，并且所述连接基团、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
44.根据权利要求7所述的IL-10多肽，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)部分。
45.根据权利要求42所述的IL-10多肽，其中所述聚(乙二醇)部分是分支或多臂接枝聚合物。
46.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的IL-10和医药学上可接受的载剂。
47.根据权利要求44所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
48.一种治疗患有由白细胞介素10调节的病症的患者的方法，其包含向所述患者投与治疗有效量的根据权利要求44所述的组合物。
49.一种制造包含非天然编码氨基酸的白细胞介素10的方法，所述方法包含在允许包含非天然编码氨基酸的IL-10多肽表达的条件下培养包含编码IL-10多肽的包含选择密码子的一或多个多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及纯化所述多肽。
50.一种调节白细胞介素10多肽血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一或多个非天然编码氨基酸取代所述多肽中的任何一或多个天然存在氨基酸。
51.一种白细胞介素10多肽，其包含一或多个提高重组宿主细胞中所述IL-10多肽的表达的氨基酸取代、添加或缺失。
52.一种白细胞介素10多肽，其包含至少一个连接基团、聚合物或生物活性分子，其中所述连接基团、聚合物或生物活性分子通过以核糖体方式并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能团连接到所述多肽上。
53.一种白细胞介素10多肽，其包含连接到一或多个非天然编码氨基酸上的连接基团、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸在预先选择的位点处以核糖体方式并入所述多肽中。
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