PL204842B1

PL204842B1 - Pluraflawiny, sposób ich wytwarzania, kompozycja zawierająca pluraflawiny i ich zastosowanie

Info

Publication number: PL204842B1
Application number: PL358297A
Authority: PL
Inventors: Laszlo Vertesy; Klaus Ehrlich; Martin Knauf; Joachim Wink; Francis P. Barbone; Elaine A. Powers; Elizabeth A. Cashman
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2010-02-26
Also published as: US20020028921A1; WO2001060832A2; HUP0204393A3; HUP0204393A2; BR0108128A; DE60101313T2; US6500936B2; DK1259523T3; NO20023845D0; AU2001242404B2; SK286691B6; NO20023845L; MXPA02006919A; EP1125944A1; HU228332B1; AR027436A1; SI1259523T1; HRP20020672B1; ME00179B; YU57602A

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy pluraflawin stanowiących nowe związki o wzorze I

w którym R1, R2, R3, R⁴, R5, R6, R8, R10 i n oznaczają podstawniki jak to okreś lono poniżej. Związki o wzorze I hamują transkryptazę, mają działanie cytostatyczne i są szczególnie użyteczne do leczenia nowotworów. Związki o wzorze I mogą być otrzymywane przez hodowlę szczepów Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931 w ośrodku hodowlanym. Zgodnie z tym, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania związków o wzorze I, zastosowania tych związków do wytwarzania leku do leczenia złośliwych zaburzeń i chorób, które można leczyć za pomocą odwrotnej transkryptazy i preparatów farmaceutycznych zawierających przynajmniej jeden związek o wzorze I.

Rak jest chorobą ludzi i zwierząt, w większości przypadków śmiertelną, która generalnie spowodowana jest niekontrolowanym wzrostem wewnątrzpochodnych komórek. Rak jest określeniem stosowanym w przypadku powstawania nowotworów złośliwych (złośliwość), nowotworów (nowotworów lub raków) lub złośliwej degeneracji i zaburzeń w dojrzewaniu białych ciałek krwi (białaczka). Komórki rakowe lub nowotworowe powstają generalnie przez przekształcenie komórek wewnątrzpochodnych. Złośliwość komórek rakowych wyraża się sama w autonomii wzrostu, tzn. ich zdolności do rozrastania się bez zahamowań i bez integracji z układem narządu i przenikania narządów z destrukcją tkanki. Widomą oznaką złośliwości jest tworzenie przerzutów daleko od nowotworu po krwiogennym lub limfogennym rozprzestrzenieniu się komórek nowotworowych. Rak jest jedną z najczęstszych przyczyn zgonów ludzi, a więc istnieje ogromne zapotrzebowanie na sposoby i środki do leczenia lub traktowania złośliwych degeneracji.

Obok radykalnego zabiegu chirurgicznego usunięcia nowotworu, opcje leczenia nowotworów złośliwych obejmują radioterapię promieniami rentgena, promieniami α, β i γ, immunoterapię i chemioterapię. Jak dotychczas zastosowanie immunoterapii jest ograniczone. Pod pojęciem chemioterapii nowotworów rozumie się leczenie oznaczające podawanie toksyn komórkowych (cytostatyków) do leczenia nowotworów i pozostałych komórek nowotworowych generalnie po zabiegu chirurgicznym lub naświetlaniu. Substancje te w sposób szczególny biorą udział w pewnych procesach dzielenia komórek tak, że tkanki zawierające wysoki udział dzielących się komórek, takie jak szybko rosnąca tkanka nowotworowa, reagują wrażliwie. Stosowane środki to związki alkilujące, takie na przykład, jak cyklofosfamid (Merck Index, wyd. 12, strona 463), antymetabolity, takie jak metotręksat (Merck Index, wyd. 12, strona 1025), alkaloidy, takie jak winkrystyna (Merck Index, wyd. 12, strona 1704), i antybiotyki, takie jak daunomycyna (Merck Index, wyd. 12, strona 479) i adriamycyna (Merck Index, wyd. 12, strony 581-582). Jednak ze względu na ich znaczne ogólne skutki uboczne wszystkie te środki wykazują znaczne wady, tak, że śmierć chorej osoby może być w wielu wypadkach tylko opóźniona lecz nie można jej zapobiec. Ponadto zdegenerowane (rakowe) komórki stają się odporne na stosowane środki; w tym wypadku konwencjonalne środki farmaceutyczne nie wykazują już dłużej działania cytostatycznego, lecz są toksyczne ze względu na ich skutki uboczne. Stwierdzono ponadto, że skojarzone i/lub kolejne zastosowanie cytostatyków zwiększa aktywność stosowania pojedynczego cytostatyku (monoterapia) a wię c jest moż liwe, ż e znaczne skutki uboczne polichemioterapii nie dodają się wzajemnie. Ze wszystkich tych względów potrzebne są pilnie nowe chemioterapeutyki a więc są one badane i opracowywane szeroko w świecie.

Niespodziewanie stwierdzono, że szczep drobnoustroju Actinomypetales HAG 003959, DSM 12931 zdolny jest do wytwarzania bardzo skutecznych nowych cytostatyków, które hamują wzrost komórek nawet w bardzo niskich stężeniach. Poniżej te nowe związki określane są jako pluraflawiny

PL 204 842 B1 i razem z pochodnymi pluraflawin tworzą one część przedmiotu niniejszego wynalazku. Pluraflawiny są antybiotykami, które zawierają p-chinoidowy szkielet pierścieniowy i różne cukrowe bloki, będące elementami budowy. Hamują one transkrypcję przez wstawianie podwójnych nici kwasów nukleinowych i, jeśli to wchodzi w rachubę, przez dodatkowe alkilowanie. Szkielet pierścieniowy opisany został po raz pierwszy przez S. Kondo i innych w Journal of Antibiotics, tom 30, strony 1143-1145, 1977, jako część pluramycyny. Później ten szkielet pierścieniowy został znaleziony w wielu antybiotykach; obok pluramycyny i neopluramycyny, związki takie jak saptomycyny (N. Abe i inni, J. Antibiotics, 46, 1536-1549, 1993), akinomycyna (Y Sato i inni, J. Antibiotics, 42, 149, 1989), kidamycyna N. Kanda i inni,

J. Antibiotics, 24, 599, 1971), hedamycyna (U. Sequin i inni, Tetrahedron, 34, 761, 1978) i altromycyny (G.M. Brill i inni, J. Antibiotics, 43, 229-237, 1990) opisano jako związki pokrewne. Substancje poprzedniego typu często wykazują wady objawiające się niezadawalającą skutecznością, wysoką toksycznością i/lub niepożądanymi skutkami ubocznymi.

Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dotyczy związków o wzorze (I)

w którym

R1 oznacza grupę

OH

I ch₃

R2 oznacza -COOH lub -CH2-O-(R7)m, gdzie R7 oznacza grupę

R3 wybrane jest spośród grup

PL 204 842 B1

R5 oznacza atom wodoru,

R4 i R6 razem stanowią podwójnie związaną grupę -X2 oraz R8 i R10 razem oznaczają podwójnie związaną grupę -X2, przy czym, niezależnie, każdy X2 oznacza atom tlenu, m i n niezależnie, jeden od drugiego oznaczają 1 lub 2, we wszystkich ich postaciach stereochemicznych i mieszaninach tych postaci w dowolnych proporcjach i ich fizjologicznie dopuszczalnych soli.

Korzystnym związkiem jest związek o wzorze (IA)

we wszystkich jego postaciach stereochemicznych i mieszaninach tych postaci w dowolnych proporcjach i jego fizjologicznie dopuszczalne sole, związek o wzorze (IB):

we wszystkich jego postaciach stereochemicznych i mieszaninach tych postaci w dowolnych proporcjach i jego fizjologicznie dopuszczalne sole,

PL 204 842 B1 oraz związek o wzorze (IE)

we wszystkich jego postaciach stereochemicznych i mieszaninach tych postaci w dowolnych proporcjach i jego fizjologicznie dopuszczalne sole.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja, zawierająca przynajmniej jeden związek o wzorze (I), okreś lony powyż ej lub jego fizjologicznie dopuszczana sól i dopuszczalny nośnik, przy czym korzystnie wspomniany dopuszczalny nośnik jest farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania przynajmniej jednego związku o wzorze (I) lub jego fizjologicznie dopuszczalnej soli okreś lonego powyż ej, który obejmuje hodowlę szczepów Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, w odpowiednich warunkach, w ośrodku hodowlanym/pożywce, aż w ośrodku hodowlanym pojawi się przynajmniej jeden ze związków o wzorze (I), z następują cym dalej wyodrębnieniem tego związku.

Wspomniany wyodrębniony związek przekształca się następnie w przynajmniej jeden związek wybrany spośród fizjologicznie dopuszczalnych soli.

W sposobie według wynalazku korzystnie hodowlę prowadzi się w warunkach tlenowych w temperaturze między 18 a 35°C i przy pH w zakresie między 6 a 8.

Związek o wzorze (I) określony powyżej lub jego fizjologicznie dopuszczalna sól są do stosowania w hamowaniu transkrypcji przynajmniej jednego z dwuniciowych kwasów nukleinowych .

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku o wzorze (I) określonego powyżej lub jego fizjologicznie dopuszczalnej soli do wytwarzania cytostatyku, do wytwarzania leku do leczenia nowotworów okrężnicy, do wytwarzania leku do leczenia nowotworów sutka (piersi), do wytwarzania leku do leczenia nowotworów płuc, do wytwarzania leku do leczenia nowotworów prostaty, do wytwarzania leku do leczenia białaczki oraz do wytwarzania leku do leczenia zakażeń bakteryjnych.

Przedmiotem wynalazku są także szczepy Actinomycetales HAG 003959 (DSM 12931).

We wzorze (I) grupa cukrowa jest monocukrem lub dwucukrem, gdzie dwa monocukry połączone są wiązaniem glikozydowym. Monocukier może być heksozą (C6H12O6), na przykład aldoheksozą, taką jak D-(+)-glukoza, D-(+)-mannoza lub D-(+)-galaktoza. Monocukier może być mono-, dilub tripodstawiony, niezależnie od siebie, przez H, OH, NH2, NH(alkil), N(alkil)2, alkil lub alkoksyl, gdzie H i/lub OH z monosacharydu może być ewentualnie zastąpione przez podstawniki.

Określenie cukier obejmuje aminocukry. W jednej z postaci wykonania m wynosi 1.

Związki wybrane są spośród związków o wzorach (IA), (IB) i (IE),

PL 204 842 B1

w których heksoza I oznacza 2,6-dideoksyaldoheksoz ę ; heksoza II oznacza 2,3,6-trideoksy-3-dimetyloaminoheksozę; heksoza III oznacza 2,3,6-trideoksy-3-amino-3-metyloaldoheksozę.

W sposobie wytwarzania wyż ej omówionych związków szczep HAG 003959 DSM 12931, w jednej z postaci wykonania, hodowany jest w roztworze pożywki (powoływanym tu także jako ośrodek hodowlany) zawierającej przynajmniej jedno źródło atomów węgla i przynajmniej jedno źródło atomów azotu

PL 204 842 B1 oraz zwykłe sole nieorganiczne, aż przynajmniej jedna z nowych pluroflawin pojawi się w ośrodku hodowlanym; pluroflawiny można następnie wyodrębnić z ośrodka hodowlanego, i jeśli to potrzebne, rozdzielić na indywidualne składniki czynne.

Hodowla może być prowadzona w warunkach tlenowych. Hodowlę można prowadzić w temperaturze wahającej się od 18 do 35°C i przy pH w zakresie od 6 do 8.

W literaturze opisano wielką ilość reakcji, wykorzystywanych do sporzą dzania pochodnych chinonów. Stosownie do tego, wytwarzanie pochodnych postaci chinonowych obecnych związków może być realizowane z wykorzystaniem reakcji chemicznych znanych same przez się. Redukcja do postaci hydrochinonowej związku może być, na przykład, przeprowadzona za pomocą katalitycznego uwodorniania wodorem lub wodorkiem metalu, takiego jak wodorek glinu lub wodorek boru. Dalszym odpowiednim przykładem jest konwersja chinonu hydroksyloaminą lub jej pochodną do oksymu, który ze swej strony może być także dalej przekształcony.

Wytworzone związki o wzorach (IA), (B) i (IE) mogą być przekształcane w ich korzystne pochodne o wzorach (IVA), (IVB) i (IVE).

h₂n ch₃

PL 204 842 B1

Poniżej wynalazek zostanie opisany szczegółowo, przykładowo w przynajmniej jednej postaci wykonania.

Pluraflawiny według wynalazku wytwarzane są przez szczepy drobnoustroju Actinomycetale, w jednej z postaci wykonania przez szczepy Actinomycetale HAG 003959, DSM 12931.

Szczepy Actinomycetale HAG 003959, DSM 12931 mają beżowo-czerwona grzybnię i mogą być identyfikowane na podstawie zarodników konidialnych, które są typowe dla actinomycetes. Taksonomiczne badanie mikroorganizmu Actinomycetale szczepu HAG 003959, DSM 12931 daje następujące wyniki oznaczenia szczepu:

ważna dla diagnostyki analiza kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej pokazuje wysoki udział:

kwasu tłuszczowego anteizo 15:0, kwasu tłuszczowego izo 16:0 (kwas izopalmowy), kwasu tłuszczowego izo 17:0 (izomargarynowy), kwasu tłuszczowego anteizo 17:0 (kwas anteizomargarynowy) i kwasu tłuszczowego cis [9] 18:1 (kwas oleinowy) obok niskich zawartości innych kwasów tłuszczowych.

Ten profil składu kwasów tłuszczowych umożliwia, że Actinomyceale HAG 003959 (DSM 12931) zaliczone są taksonomicznie do rodzaju Saccharothrix.

Izolat mikroorganizmu został złożony w zbiorze Deutschen Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D 38124, Braunschweig, Niemcy, zgodnie z przepisami Konwencji Budapesztańskiej z 16 lipca 1999 pod następującym oznaczeniem numerycznym; Actinomycetales species HAG 003959, DSM 12931.

Zamiast szczepu Actinomycetales species HAG 003959, DSM 12931 można wykorzystywać także jego mutanty i odmiany, które syntetyzują przynajmniej jeden ze związków spośród pluroflawin według wynalazku. Takie mutanty mogą być wytwarzane w sposób znany jako taki, sposobami fizycznymi, na przykład przez naświetlanie, np., promieniami ultrafioletowymi lub promieniami rentgena, lub za pomocą chemicznych mutagenów, takich na przykład, jak metanosulfonian etylu (EMS), 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon (MOB) lub N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG).

Sposób według wynalazku może być stosowany do fermentacji na skalę laboratoryjną (zakres mililitra do litra) lub na skalę przemysłową (skala w metrach sześciennych). 0 ile inaczej nie wskazano, wszystkie procenty dotyczą procentów wagowych. W przypadku cieczy, proporcje mieszania oparte są na objętości, o ile inaczej nie stwierdzono.

W jednej z postaci wykonania, ź ródł ami atomów w ę gla dla fermentacji tlenowej są przyswajalne węglowodany i alkohole cukrowe, takie jak glukoza, laktoza, sacharoza lub D-mannit oraz produkty naturalne zawierające węglowodan, takie jak, na przykład, ekstrakt słodowy. Odpowiednimi źródłami atomów azotu do hodowli są: aminokwasy, peptydy i białka oraz produkty ich degradacji, takie jak peptony i tryptony, ponadto ekstrakty mięsne, ekstrakty drożdży, mielone ziarna, na przykład, kukurydzy, pszenicy, soi lub bawełny, pozostałości podestylacyjne z wytwarzania alkoholi, mączka mięsna lub ekstrakty drożdży, lecz także sole amonowe i azotany. Sole nieorganiczne zawarte w roztworze pożywki

PL 204 842 B1 mogą być na przykład, chlorkami, węglanami, siarczanami lub fosforanami metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, takich jak żelazo, cynk, kobalt i mangan.

Tworzenie pluroflawin według wynalazku przebiega w ośrodku hodowlanym, który zawiera około 0,1 do 5%, przykładowo 0,3 do 2% glukozy i 0,2 do 5%, przykładowo 0,5 do 3% mączki z soi oraz 0,05 do 2%, przykładowo 0,2 do 1,0 g/l zaprawionego ziarna i 0,05 do 1,0 g/l, przykładowo 0,1 do 0,5% węglanu wapnia i 0,05 do 1,0 g/l, przykładowo 0,1 do 1,0 g/chlorku sodu. Procenty odnoszą się w każdym przypadku do masy całego ośrodka hodowlanego.

W oś rodku hodowlanym szczepy Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931 wytwarzają pluroflawiny. Zależnie od składu ośrodka hodowlanego/pożywki, proporcje poszczególnych pluroflawin według wynalazku mogą się zmieniać. Ponadto, przez skład pożywki, możliwe jest sterowanie syntezą poszczególnej pluroflawiny, tak, że jedna lub nawet więcej pluroflawin może nie być wytwarzana w ogóle przez mikroorganizm lub też wytwarzana w ilości poniżej progu wykrywalności.

W jednej z postaci wykonania hodowla zawiera jedną wykrywalną pluroflawinę . W innej postaci wykonania tworzą się pluroflawiny A, B lub E.

Obok pluroflawin A, B i E (związki odpowiednio o wzorach (IA), (IB) i (IE)), w ośrodku hodowlanym szczepu Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931 tworzą się także inne związki pokrewne, różne od związków o wzorach (IA), (IB) i (IE) tym, że są one różnie glikożylowane. A więc, jako produkt uboczny wykryto dalszą pluroflawinę (pluroflawinę C) o ciężarze cząsteczkowym 974 Da i produkt degradacji pluroflawiny A o ciężarze cząsteczkowym 692, 77 C37H44N2O11. W tym ostatnim związku brak jest heksozy I; w warunkach kwaśnych 2,6-dideoksyaldoheksoza może być odszczepiana hydrolitycznie z pluroflawiny A.

Mikroorganizmy hoduje się w warunkach tlenowych, tzn., na przykład, zatopione z wstrząsaniem lub mieszaniem w kadzi fermentacyjnej lub butlach wstrząsanych, jeśli to potrzebne z doprowadzaniem powietrza lub tlenu. Można to realizować w zakresie temperatur od około 18 do 35'C, takiej jak około 25 do 32°C i włącznie z zakresem od 27 do 30°C. Wartość pH powinna wynosić generalnie w zakresie od 6 do 8, przykł adowo od 6,5 do 7,5. W tych warunkach mikroorganizm hoduje się generalnie w ciągu od 24 do 300 godzin, przykładowo od 36 do 140 godzin.

Hodowlę prowadzi się korzystnie w kilku etapach, tzn. najpierw przygotowuje się przynajmniej jedną hodowlę wstępną w ciekłym ośrodku pożywki, którą następnie przeszczepia się do aktualnego ośrodka produkcyjnego, hodowli głównej, na przykład w proporcji objętościowej 1:10. Hodowlę wstępną otrzymuje się, na przykład, przez zaszczepienie grzybni do roztworu pożywki i umożliwia się jej wzrost przez około 36 do 120 godzin, przykładowo 48 do 96 godzin. Grzybnię można otrzymać, na przykład umożliwiając wzrost szczepu przez około 3 do 40 dni, przykładowo 4 do 10 dni, na stałej lub ciekłej pożywce, na przykład agar-słód z drożdży lub agar-mączka owsiana.

Postęp fermentacji można śledzić na podstawie pH hodowli lub objętości grzybni oraz także meodami chromatograficznymi, takimi jak chromatografia cienkowarstwowa lub wysokosprawna chromatografia cieczowa lub przez badanie aktywności biologicznej. Pluralawiny według wynalazku można znaleźć zarówno w grzybni jak i w przesączu z hodowli. Proces wyodrębniania opisany poniżej służy generalnie do oczyszczania pluroflawin według wynalazku, a więc do oczyszczania pluroflawin A, B i E.

Wyodrębnianie, i/lub oczyszczanie pluroflawin według wynalazku z ośrodka hodowlanego prowadzi się znanymi sposobami, biorąc pod uwagę własności chemiczne, fizyczne i biologiczne produktów naturalnych. Do zbadania stężenia pluroflawin w ośrodku hodowlanym lub w poszczególnych etapach wyodrębniania, możliwe jest stosowanie chromatografii cienkowarstwowej, na przykład na żelu krzemionkowym z zastosowaniem mieszanin chloroform/metanol/lodowaty kwas otowy/woda (na przykład w proporcji 8:1:1:0,2) jako fazy ruchomej lub HPLC/wysoko sprawnej chromatografii cieczowej.

W przypadku rozdzielania metodą chromatografii cienkowarstwowej wykrywanie można prowadzić , na przykład, za pomocą reagentów barwiących, takich jak kwas α-naftol/kwas siarkowy, gdzie ilość wytworzonej substancji jest korzystnie porównywana z roztworem kalibrującym.

Według wynalazku, pluraflawiny można izolować albo z grzybni albo z ośrodka hodowlanego. Generalnie, grzybnię oddziela się najpierw od ośrodka hodowlanego znanymi sposobami a następnie ekstrahuje się pluraflawiny z materiału komórkowego za pomocą rozpuszczalnika organicznego, ewentualnie mieszającego się z wodą. Faza rozpuszczalnika organicznego zawiera pluraflawiny według wynalazku; jeśli to potrzebne mogą być one zatężane pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczane dalej jak to opisano niżej. Jeśli to potrzebne, przesącz z hodowli łączy się z koncentratem ekstraktu z grzybni i ekstrahuje odpowiednim rozpuszczalnikiem organicznym nie mieszającym się z wodą, na przykład, n-butanolem. Oddziela się następnie fazę organiczną i, jeśli to potrzebne, zatęża pod zmniej10

PL 204 842 B1 szonym ciśnieniem. W celu odtłuszczenia wartościowego produktu, koncentrat można rozcieńczyć niepolarnym rozpuszczalnikiem, w którym pluraflawiny według wynalazku są tylko trudno rozpuszczalne, takim jak, na przykład, heksan, eter naftowy, eter dietylowy. Powoduje to strącenie pluroflawin a zanieczyszczenia lipofilowe pozostają w roztworze i usuwa się je zwykłymi metodami rozdzielania ciecz/ciało stałe. Strącony osad, który zawiera pluroflawiny przeznaczone do oddzielenia, rozpuszcza się za pomocą 1/30 początkowej objętości wodą/metanolem. Strącony osad rozpuszcza się kompletnie i suszy przez zamrażanie/liofilizuje. Liofilizat, który jest powoływany dalej jako surowy produkt, zawiera 0,5 do 50% pluroflawiny, stosowany jest do dalszego oczyszczania.

Dalsze oczyszczanie jednej lub więcej pluroflawin według wynalazku prowadzi się przez chromatografię na odpowiednich materiałach, takich jak sita molekularne lub normalnych nośnikach fazowych, takich jak, na przykład, żel krzemionkowy, tlenek glinu lub wymienniki jonowe lub też na żywicach absorbcyjnych i/lub w ośrodkach z odwróconą fazą (RP). Za pomocą tych chromatografii oddziela się pluraflawiny. Chromatografię pluroflawin prowadzi się za pomocą buforowanych roztworów wodnych lub mieszanin rozpuszczalników organicznych z wodą.

Mieszaniny roztworów wodnych lub organicznych należy rozumieć, jako oznaczające wszystkie rozpuszczalniki organiczne mieszające się z wodą, takie jak metanol, propanol i acetonitryl, w stężeniach wahających się od 10 do 80% rozpuszczalnika, na przykład od 40 do 60% rozpuszczalnika lub też wszystkie buforowane roztwory wodne mieszające się z rozpuszczalnikami organicznymi. Bufory, które można stosować, mogą być takimi samymi buforami jakie podano wyżej.

Oddzielanie pluroflawin oparte na ich różnej polarności może być prowadzone za pomocą chromatografii w odwróconym układzie faz, na przykład na MCI® (żywica adsorbcyjna z firmy Mitsubishi, Japonia) lub Amberlite XAD® (TOSOHAAS), na dalszych materiałach hydrofobowych, takich jak, na przykład, RP-8 lub RP-18. Ponadto oddzielanie można realizować za pomocą chromatografii w normalnym układzie faz, na przykład, na żelu krzemionkowym, tlenku glinu lub podobnych.

Chromatografię pluroflawin można prowadzić z zastosowaniem buforowanych lub zakwaszonych roztworów wodnych lub mieszanin roztworów wodnych z alkoholami lub innymi rozpuszczalnikami organicznymi mieszającymi się z wodą. Organicznym rozpuszczalnikiem może być propanol lub acetonitryl.

Buforowane lub zakwaszane roztwory wodne należy rozumieć, jako oznaczające, na przykład, wodę, bufor fosforanowy, octan amonu, bufor cytrynianowy w stężeniach od 1 mmoli do 0,5 mmoli oraz także kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas trifluorooctowy lub też wszystkie kwasy handlowe znane fachowcom, na przykład w stężeniach wahających się od 0,01 do 3%, a więc od 0,1%.

Chromatografię można prowadzić wykorzystując gradient rozpoczynający się od 100% wodnego buforu i kończąc na 100% rozpuszczalnika, na przykład gradient liniowy wahający się od 10 do 50% z zastosowaniem 2-propanolu lub acetonitrylu.

Alternatywnie możliwa jest także chromatografia żelowa lub chromatografia na fazach hydrofobowych.

Chromatografia żelowa może być prowadzona na żelach z poliakryloamidu lub mieszanych żelach polimerowych, takich jak, na przykład, Biogel-P® (Biorad), Fractogel TSK HW 40® (Merck, Niemcy lub Toso Haas, USA) lub na Sephadex® (Pharmacia, Uppsala, Szwecja).

Porządek chromatografii podany wyżej może być odwrócony.

Dalszym bardzo skutecznym etapem oczyszczania pluroflawin jest krystalizacja. Pluraflawiny krystalizują z roztworów w rozpuszczalnikach organicznych i z mieszanin wody z rozpuszczalnikami organicznymi. Krystalizację można prowadzić w sposób znany, na przykład przez zatężanie lub schładzanie nasyconych roztworów pluroflawin.

Pluraflawiny według wynalazku są trwałe w stanie stałym i w roztworach o pH w zakresie wahającym się od 3 do 8, na przykład od 4 do 6 a zatem mogą być wprowadzane do zwykłych preparatów farmaceutycznych.

Pluraflawiny o wzorze (I) i ich pochodne chemiczne mogą być przekształcane sposobami znanymi dla fachowców w ich odpowiednie sole dopuszczalne fizjologicznie.

Fizjologicznie dopuszczalne sole związków o wzorze (I) rozumie się jako sole zarówno organiczne jak i nieorganiczne, takie jakie opisano w publikacji Remington's Pharmaceutical Sciences (wydanie 17, strona 1418 (1985)). W oparciu o trwałość fizyczną i chemiczną oraz rozpuszczalność, sole sodowe, potasowe, wapniowe i amonowe są między innymi możliwymi postaciami wykonania grup kwasowych, sole kwasu chlorowodorowego, kwasu siarkowego, kwasu fosforowego lub kwasów karboksylowych czy sulfonowych, takich jak na przykład, kwas octowy, kwas cytrynowy, kwas benzoesowy, kwas

PL 204 842 B1 maleinowy, kwas fumarowy, kwas winowy i kwas p-toluenosulfonowy, są miedzy innymi postaciami wykonania grup zasadowych.

Wynalazek obejmuje dalej oczywiste chemiczne równoważniki (powoływane tutaj jako „pochodne”) związków o wzorze (I) wykazujące niewielkie różnice chemiczne, tzn. o tej samej aktywności lub, które mogą. być przekształcone w związki według wynalazku w łagodnych warunkach. Wspomniane ekwiwalenty obejmują, na przykład, estry i etery, kompleksy a także produkty redukcji związków według wynalazku.

Pochodne estrowe i eterowe, kompleksy a także produkty redukcji związków według wynalazku mogą być wytwarzane sposobami opisanymi w literaturze, na przykład w ,,Advanced Organic Synthesis”, wyd.: 4, J. March, John Wiley & Sons, 1992. Grupy karboksylowe (wzory IE, IVE) i grupy hydroksylowe związku o wzorze (I) można przekształcić, na przykład, do grup estrowych lub eterowych. Takie estry obejmują na przykład estry (C1-C4)-alkilowe. Etery obejmują, na przykład, acetale i ketale grup hydroksylowych.

Trwałe kompleksy związków o wzorze (I) można wytworzyć z fizjologicznie dopuszczalnym kationem, takim jak np., wapń lub magnez.

Niniejszy wynalazek obejmuje wszystkie postaci stereoizomeryczne związków o wzorze (I). Centra asymetrii związków o wzorach (IA), (IB) i (IE) mogą, niezależnie od siebie, wykazywać konfigurację S lub R. Pierścień oksiranowy grupy zawierającej epoksyd może znajdować się w dowolnym położeniu; na przykład może być oksiranem włączającym atomy węgla 2' i 3'. Wynalazek obejmuje wszystkie możliwe enancjomery i diastereoizomery oraz także mieszaniny przynajmniej dwóch postaci stereoizomerycznych, na przykład mieszaniny enancjomerów i/lub diastereoizomerów w dowolnej proporcji. Tak więc, wynalazek dostarcza enancjomerów w czystej postaci enancjomerycznej, zarówno antypodu lewoskrętnego jak i prawoskrętnego, konfiguracji R i S, w postaci racematów i w postaci mieszanin dwóch enancjomerów w dowolnej proporcji. Jeśli występuje izomeria cis/trans, wynalazek obejmuje zarówno postać cis jak i postać trans oraz ich mieszaniny w dowolnym stosunku.

Ze względu na ich użyteczne własności farmakologiczne, związki według wynalazku nadają się do stosowania jako produkty farmaceutyczne w medycynie ludzkiej i/lub medycynie weterynaryjnej. Wykazują one działanie antybiotyczne i dodatkowo, obok działania antybiotycznego, działanie przeciwgrzybicze, tzn. hamujące rozwój grzybów, włącznie z grzybami patogenicznymi, własności działania przeciw pierwotniakom i przeciwpasożytnicze.

Związki według wynalazku mogą być stosowane w chorobach nowotworowych, na przykład jako chemoterapeutyki. Ze względu na ich własności cytostatyczne, takie jak ich silne działanie przeciwnowotworowe i działanie przeciwbakteryjne, mogą być one stosowane, na przykład, jako cytostatyki w degeneracjach zł oś liwych u ludzi i zwierzą t.

W przypadku komórek nowotworowych, u których rozwinęła się oporność przeciwko konwencjonalnym środkom, tylko nowe środki wykazują odpowiedni skutek leczniczy. Zatem pluraflawiny według wynalazku i ich pochodne o wzorze (I) mają potencjalnie doskonałe działanie nawet przeciwko tym typom problemów z komórkami.

Wynalazek dotyczy także preparatów farmaceutycznych, które zawierają przynajmniej jedną z pluroflawin według wynalazku i/lub ich pochodnych. Pluraflawiny mogą być stosowane w mieszaninie z przynajmniej jednym odpowiednim środkiem pomocniczym lub zaróbką. Zaróbkami stosowanymi dla ludzi mogą być wszystkie farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki i/lub środki pomocnicze.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania preparatu farmaceutycznego według wynalazku, który obejmuje doprowadzenie przynajmniej jednego związku według wynalazku do odpowiedniej postaci stosowania, za pomocą nadającego się farmaceutycznie i dopuszczalnego fizjologicznie środka pomocniczego i jeśli to potrzebne, dalszych substancji czynnych, dodatków i zaróbek.

Preparaty farmaceutyczne według wynalazku podawane są generalnie doustnie, miejscowo lub pozajelitowo, lecz podawanie doodbytnicze jest także możliwe. Odpowiednimi stałymi lub ciekłymi postaciami podawania preparatu farmaceutycznego są, na przykład, granulki, proszki, tabletki, tabletki powlekane (mikro) kapsułki, czopki, syropy, emulsje, zawiesiny, aerozole, krople lub roztwory do zastrzyków w postaci ampułek i preparaty o przedłużonym uwalnianiu substancji czynnej, w przygotowaniu których stosuje się zwykle zaróbki i dodatki i/lub środki pomocnicze, takie jak środki powodujące rozpad, środki wiążące, środki powłokowe, środki powodujące pęcznienie, smary lub środki poślizgowe, środki zapachowe, środki słodzące lub środki wspomagające rozpuszczanie. Często stosowanymi zaróbkami lub środkami pomocniczymi, które można wymienić są, na przykład, węglan magnezu, dwutlenek tytanu, laktoza, mannit i inne cukry, talk, białko z mleka, żelatyna, skrobia, witaminy, celuloza i jej

PL 204 842 B1 pochodne, oleje zwierzęce i roślinne, poli(glikole etylenowe) i rozpuszczalniki, takie jak na przykład, sterylna woda, alkohole, gliceryna i alkohole wielowodorotlenowe.

Jeśli to potrzebne, jednostka dozowania może być mikrozakapsułkowana do podawania doustnego, w celu opóźnienia uwalniania lub do przedłużenia uwalniania w stosunkowo długim okresie czasu, w taki sposób, jak na przykład, przez powleczenie lub zatopienie rozdrobnionego związku czynnego w odpowiednim polimerze, wosku lub podobnej substancji.

Preparaty farmaceutyczne mogą być wytwarzane i podawane w jednostkowych dawkach, przy czym każda dawka zawiera, jako składnik czynny pewną ilość przynajmniej jednego związku pluroflawiny według wynalazku i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej pochodnej. W przypadku stałej postaci dozowania, takiej jak tabletka, kapsułka i czopek, dawka ta może wynosić do około 200 mg, lecz może wynosić około 0,1 do 100 mg, zaś w przypadku roztworów do zastrzyków w postaci ampułki dawka może wynosić do 200 mg, lecz może wynosić około 0,1 do 100 mg na dzień.

Dawka dzienna przeznaczona do podawania zależy od masy ciała, wieku, płci i warunków obiektu poddawanego leczeniu. Mogą być jednak zalecane także i wyższe dawki. Dawka dzienna może być podawana jednorazowo w postaci pojedynczej jednostki dozowania lub w postaci wielu mniejszych dawek jednostkowych, lub też może być podawana w wielu porcjach w określonych odstępach czasu w postaci podzielonych dawek.

Wynalazek zostanie zilustrowany na podstawie przykładów podanych dalej. Procenty oznaczają procenty wagowe. W przypadku cieczy, proporcje mieszania oparte są na objętościach, o ile inaczej nie stwierdzono.

Następujące dalej przykłady są przykładami ilustrującymi niniejszy wynalazek i nie ograniczają jego zakresu.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie glicerynowej hodowli szczepów Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931

100 ml roztworu pożywki (ekstrakt słodowy 2,0%, ekstrakt z drożdży 0,2%, glukoza 1,0%, (NH4)2HPO4 0,05%, pH 6,0) w sterylnej kolbie Erlenmeyera zaszczepiono szczepem Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931 i inkubowano na wytrząsarce obrotowej w 28°C przy 180 obrotach na minutę przez 7 dni. 1,5 ml tej hodowli rozcieńczono 1,5 ml 99,9% gliceryny i przechowywano w -20°C.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie hodowli lub hodowli wstępnej szczepów Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931 w kolbie Erlenmeyera

W sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemnoś ci 300 ml, zawierają cej 100 ml nastę pują cego roztworu pożywki: 15 g glukozy/litr, 15 g mąki sojowej/litr, 5 g zaprawianego ziarna kukurydzy/litr, 2 g CaCO3/litr i 5 g NaCl/litr, pożywkę zaszczepiano zarodkiem hodowli na ukośnej rurce (taki sam roztwór pożywki, lecz zawierający 2% agaru) lub 1 ml hodowli glicerynowej (patrz przykład 1) i inkubowano w wytrzą sarce przy 180 obrotach na minutę i w 30°C. Maksimum wytworzonego przynajmniej jednego związku pluraflawiny według wynalazku uzyskano po około 120 godzinach. Do zaszczepienia kadzi fermentacyjnych o pojemności 10 l i 200 l wystarczała 48-godzinna do 96-godzinna hodowla zanurzeniowa (ilość do zaszczepienia około 10%) takiego samego roztworu pożywki.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie pluroflawin

Kadź fermentacyjna o pojemności 9 l pracowała w następujących warunkach:

Ośrodek hodowlany: 15 g glukozy/l g mąki sojowej/l g zaprawianego ziarna kukurydzy, stał ego/l, g CaCO3/l 5 g NaCl/l pH 7,0 (przed sterylizacją)

Czas trwania procesu: 92 godziny

Temperatura inkubacji: 28°C

Szybkość mieszadła: 300 obrotów na minutę

Napowietrzanie: 5 l min^-1

Przez powtarzalne dodawanie etanolowego roztworu poliolowego możliwe było ograniczenie tworzenia się piany. Maksimum produkcji uzyskano po około 70 do 96 godzin.

PL 204 842 B1

P r z y k ł a d 4

Wyodrębnianie mieszaniny pluroflawin z roztworu hodowlanego szczepów Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931

Po zakończeniu fermentacji szczepów Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, bulion hodowlany z kadzi fermentacyjnej otrzymany według przykładu 3 (90 litrów), poddano sączeniu z dodatkiem około 2% środka wspomagającego sączenie (na przykład Celite®) i materiał komórkowy (0,6 litra) ekstrahowano 3 litrami metanolu. Metanolowy roztwór, zawierający składnik czynny, uwalniano od grzybni przez sączenie i zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem. Koncentrat, razem z przesączem z hodowli (7 litrów) wprowadzono do przygotowanej kolumny CHP20P, 0,4 litra ®MCI Gel. Wymywanie prowadzono z zastosowaniem gradientu 0,1% kwasu octowego w wodzie do 0,1% kwasu octowego w 2-propanolu. Wyciek z kolumny (1,2 litra na godzinę) zbierano w postaci frakcji (0,25 litra każda) i zbierano frakcje zawierają ce pluroflawiny (20 do 23). Zatężanie pod zmniejszonym ciś nieniem i suszenie przez zamrażanie dało 1,4 g brązowego proszku.

P r z y k ł a d 5

Wzbogacanie składników pluroflawinowych metodą chromatografii żelowej

1,4 g produktu otrzymanego zgodnie z przykładem 4 wprowadzono do kolumny o pojemności 3,9 litra (szerokość x wysokość = 10 x 50 cm) wypełnionej substancją Fractogel® TSK HW-40s. Fazę ruchomą woda/acetonitryl (1:1) pompowano przez kolumnę z szybkością przepływu 50 ml na minutę i wyciek z kolumny zbierano we frakcjach (65 ml). Pluroflawiny znajdował y się gł ównie we frakcjach 13 do 16. Zbierano je i uwalniano od rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem. Dało to 130 mg mieszaniny pluroflawin.

P r z y k ł a d 6

Oddzielanie składnika pluroflawinowego w odwróconym układzie faz RP-18

Preparacyjną kolumnę HPLC o pojemności 122 ml (1,25 (średnicy wewnętrznej) x 25 cm (wysokości)) napełniono ®Nucleosil 100-7 C18 HD i wprowadzono 130 mg mieszaniny pluroflawin otrzymanej według przykładu 5. Wymywanie prowadzono za pomocą 10% roztworu acetonitrylu i 0,1 molowego wodnego roztworu octanu amonu. Przepływ przez kolumnę wynosił 50 ml/minutę i zbierano frakcje każdorazowo o pojemności 50 ml. Frakcja 6 zawierała pluraflawinę E, pluraflawina C znajdowała się we frakcjach 12-17, pluraflawina B znajdowała się we frakcjach 26 do 27 a pluraflawina A znajdowała się we frakcjach 35 do 37. Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem i suszeniu przez zamrażanie uzyskano następujące ilości:

pluraflawina A : 22 mg ESI+MS: 823 Da (M+H)⁺, pluraflawina 8 : 18 mg ESI+MS: 841 Da (M+H)⁺, pluraflawina C : 11 mg ESI+MS: 974 Da (M+H)⁺, pluraflawina E : 5 mg ESI+MS: 712 Da (M+H)⁺.

P r z y k ł a d 7

Końcowe oczyszczanie pluraflawiny A i konwersja do postaci soli z kwasem trifluorooctowym

Frakcje 35 do 37 otrzymywane zgodnie z przykładem 6, po suszeniu przez zamrażanie (22 mg) rozpuszczano w roztworze 10% acetonitrylu w wodzie, nastawiono pH na 2,8 za pomocą kwasu trifluorooctowego i podawano na kolumnę 250/10 LiChrospher RP-18e (5 μ)®. Wymywanie prowadzono za pomocą 0,05% roztworu wodnego kwasu trifluorooctowego w 11 do 22% acetonitrylu. Zatężanie pod zmniejszonym ciśnieniem i suszenie przez wymrażanie dało 18 mg soli pluroflawiny z kwasem trfluorooctowym.

P r z y k ł a d 8

Identyfikacja pluroflawiny A

Wygląd: ciemno żółta substancja, rozpuszczalna w polarnych rozpuszczalnikach lecz tylko trudno rozpuszczalna w wodzie. Sole addycyjne z kwasami były rozpuszczalne w wodzie. Związek był trwały w środowisku obojętnym i lekko kwaśnym lecz nietrwały w środowisku alkalicznym i silnie alkalicznym. Maksima w widmie UV: 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm w wodzie/acetonitrylu (8:2), pH 2 i 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh) i 426 nm w wodzie/acetonitrylu (6:4), przy pH 7.

Pasma IR, 3424, 1680, 1600, 1464, 1427, 1300, 1203, 1131, 1066, 1009, 801, 721 cm^-1.

Metodą spektofotometrii masowej o wysokiej rozdzielczości oznaczono następujący ciężar cząsteczkowy dla postaci (M+H)⁺ : 832,370631 Da, co odpowiada wzorowi empirycznemu pluraflawiny A C43H54N2O14. Jonizacja rozproszonymi elektronami (ESI, dodatnia) daje poprzez fragmentalizację MS/MS następujące jony 823, 693, 680, 550, 480, 390, 320, 144 i 131 Da. Sygnały NMR patrz tabela 1.

PL 204 842 B1

T a b e l a 1

Chemiczne przesunięcia ¹H i ¹³H pluraflawiny A w metanolu-d4 i DMSO-d6 w 300°K

	Metanol-d4	DMSO-d6
Pozycja	¹³C; δ (ppm)	¹H δ (ppm)	¹³C; δ (ppm)	¹H δ (ppm)
1	2	3	4	5
2	168.39	-	165.62	-
3	111.95	6.37s	110.39	6.27s
4	180.25	-	177.56	-
4a	126.08	-	124.33	-
5	150.44	-	148.22	-
6	121.34	8.61s	119.05	8.43s
6a	138.34	-	136.28	-
7	182.68	-	181.12	-
7a	133.23	-	131.18	-
8	120.05	7.86d	118.29	7.78d
9	135.63	7.90d	134.41	7.87d
10	137.35	-	135.79	-
11	161.06	-	159.39	-
11-OH	-	-	-	13.38s, brd
11a	118.14	-	116.43	-
12	189.12	-	187.39	-
12a	122.00	-	120.35	-
12b	157.66	-	155.50	-
13	70.83	5.38d, 5.63d	68.48	5.30d, 5.51d
14	61.17	-	59.35	-
15	63.69	3.41q	61.61	3.48q
16	20.24	1.92s	19.32	1.86s
17	13.69	1.27d	12.93	1.22d
1'	98.90	5.04dd	96.57	5.06d, brd
2'	37.24	2.05, 2.12	35.50	1.87, 1.95
3'	58.32	-	56.33	-
3'Me	24.57	1.50s	-	1.35s
3'NH2	-	-	-	8.16s, brd
4'	71.15	3.27 brd	68.65	3.17d
4' -OH	-	-	-	5.47d
5'	70.44	4.00q	68.19	4.01q
6'	17.21	1.34d	16.75	1.18d
1	70.23	5.51t	68.21	5.44brd
2	28.00brd	2.48m, 2.91 m, brd	-	2.35brd, 2.78brd
3	65.19	3.45m brd	62.19	3.43brd

PL 204 842 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5
3NMe	43.24brd, 41.65brd	3.05brd, 3.05brd	42.14, 39.25	2.89, 2.97
3NH+	-	-	-	8.78brd
4	75.13	4.32s, brd	71.88	4.20s, brd
5	72.55	3.97q, brd	70.22	3.75q, brd
6	18.09	1.40d	17.54	1.28d
1'	101.39	5.24m, brd	98.89	5.11 brd
2'	33.40	2.05, 2.10	32.07	1.75, 1.92
3'	66.61	4.12m	64.17	3.96m, brd
3'-OH	-	-	-	4.70s, brd
4'	71.98	3.67	70.13	3.45brd
4'-OH	-	-	-	4.44s brd
5'	69.52	4.16q brd	67.05	4.10q brd
6'	17.51	1.28d	16.94	1.10d

Dla aldoheksozy III obserwowane NOE były zgodne z względną stereochemią SRSS lub RSRR na chiralnych centrach 1', 3', 4', 6' (patrz H-III). Odpowiada to epimerowi C-3 wankozaminy.

Względna stereochemia

H-III Względna stereochemia heksozy III

Efekt NOE obserwowany dla heksozy II sprzyja względnej stereochemii RSSS lub SRRR dla centrów chiralnych 1, 3, 4, 5 (patrz H-II).

Względna stereochemia

H-II Względna stereochemia heksozy II

Taka sama względna stereochemia (RSSS, SRRR) dla asymetrycznych atomów węgla 1', 3', 4', 5' była zgodna z wykrytą NOS dla heksozy I (patrz H-I)

PL 204 842 B1

Względna stereochemia

H-I. Względna stereochemia heksozy I

P r z y k ł a d 9

Identyfikacja Pluroflawiny B

Wygląd: ciemno żółta substancja rozpuszczalna w polarnych rozpuszczalnikach lecz tylko trudno rozpuszczalna w wodzie. Sole addycyjne z kwasami były rozpuszczalne w wodzie. Związek był trwały w środowisku obojętnym i lekko kwaśnym lecz nietrwały w zakresie alkalicznym.

Maksima w widmie UV: 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm w wodzie/acetonitrylu (8:2), pH 2 i 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh) i 426 nm w wodzie/acetonitrylu (6:4), przy pH 7.

Wzór empiryczny pluraflawiny B przedstawia się jak dalej: C43H56N2O15 a ciężar cząsteczkowy wynosi 840, 9 Da.

Sygnały NMR patrz tabela 2.

T a b e l a 2

Chemiczne przesunięcia ¹H i ¹³H pluraflawiny B w metanolu-d4 i DMSO-d6 w 300°K

	Metanol-cU	DMS0-C6
Pozycja	¹³C; δ (ppm)	¹H δ (ppm)	¹³C; δ (ppm)	1H δ (ppm)
1	2	3	4	5
2	176.38	-	168.39	-
3	111.10	6.73s	111.95	6.37s
4	181.26	-	180.25	-
4a	125.96	-	126.08	-
5	150.43	-	150.44	-
6	121.03	8.52s	121.34	8.61s
6a	138.12	-	138.44	-
7	182.66	-	182.68	-
7a	133.12	-	138.34	-
8	120.04	7.81C	120.05	7.86C
9	135.52	7.83C	135.63	7.90C
10	137.44	-	137.35	-
11	161.02	-	161.06	-
11-OH	-	-	-	-
11a	118.01	-	118.14	-
12	189.24	-	189.12	-
12a	121.89	-	122.00	-
12b	157.41	-	157.66	-
13	70.83	5.36C, 5.60C	70.83	5.38C, 5.63C
14	77.67	-	61.17	-

PL 204 842 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5
15	72.61	4.40q	63.69	3.41 q
16	23.90	1.67s	20.24	1.92s
17	17.00	1.35d	13.69	1.27d
1'	98.87	5.05dd	98.90	5.04dd
2'	37.20	2.09m	37.24	2.05, 2.12
3'	58.39	-	58.32	-
3'Me	24.45	1.51s	24.57	1.50s
3'NH2	-	-	-	-
4'	71.08	3.29s, brd	71.15	3.27s, brd
4' -OH	-	-	-	-
5'	70.42	4.01q	70.44	4.00q
6'	17.19	1.33d	17.21	1.34d
1	70.13	5.48t	70.23	5.51t
2	27.74	2.50m, 2.88m	28.00brd	2.48m, 2.91m, brd
3	65.14	3.46m	65.19	3.4 5m, brd
3NMe	43.30, 41.40	3.01s, 3.12s	43.24brd, 41.65brd	3.05brd, 3.05brd
3NH+	-	-	-	-
4	75.02	4.32s, brd	75.13	4.32s, brd
5	72.61	3.97q, brd	72.55	3.97q, brd
6	18.15	1.39d	18.09	1.40d
1'	101.38	5.24m, brd	101.39	5.24m, brd
2'	33.42	2.07m	33.40	2.05, 2.10
3'	66.59	4.13m	66.61	4.12m
3'-OH	-	-	-	-
4'	71.97	3.67brd	71.98	3.67
4'-OH	-	-	-	-
5'	69.52	4.16q, brd	69.52	4.16q, brd
6'	17.49	1.27d	17.51	1.28d

P r z y k ł a d 10

Końcowe oczyszczanie pluraflawiny E

Frakcję 6 otrzymaną zgodnie z przykładem 6, po suszeniu przez zamrażanie (5 mg) rozpuszczano w roztworze 10% acetonitrylu w wodzie, nastawiono pH na 2,8 za pomocą kwasu trifluorooctowego i podawano na kolumnę 250/10 LiChrospher RP-18e (5 μ)®. Wymywanie prowadzono za pomocą 0,05% roztworu kwasu trifluorooctowego w 11 do 22% acetonitrylu. Zatężanie pod zmniejszonym ciśnieniem i suszenie przez wymrażanie dało 2,7 mg soli pluroflawiny z kwasem trifluorooctowym.

P r z y k ł a d 11

Identyfikacja Pluroflawiny E

Wygląd: ciemno żółta substancja rozpuszczalna w polarnych rozpuszczalnikach lecz tylko trudno rozpuszczalna w wodzie. Sole addycyjne z kwasami były rozpuszczalne w wodzie. Związek był trwały w środowisku obojętnym i lekko kwaśnym lecz nietrwały w środowisku alkalicznym i silnie alkalicznym. Maksima w widmie UV: 213, 244, 270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm w wodzie/acetonitrylu (8:2), pH 2 i 213, 244, 270 (Sh), 290 (Sh) i 426 nm w wodzie/acetonitrylu (6:4), przy pH 7. Za pomocą spek18

PL 204 842 B1 trofotometrii masowej (M+H)⁺ znaleziono ciężar cząsteczkowy wynoszący 712 Da, co odpowiada wzorowi empirycznemu pluraflawiny E C36H41NO14.

Sygnały NMR patrz tabela 3.

T a b e l a 3

Chemiczne przesunięcia ¹H i ¹³H pluraflawiny B w metanolu-d4 300°K

Pozycja	¹³C; δ (ppm)	³H δ (ppm)
1	2	3
2	176.48	-
3	110.30	6.69s
4	178.39	-
4a	124.69	-
5	149.56	-
6	121.17	7.92s
6a	138.95	-
7	182.40	-
7a	133.21	-
8	119.82	7.60d
9	135.61	7.74d
10	137.04	-
11	161.33	-
11-OH	-	-
11a	118.04	-
12	189.21	-
12a	121.59	-
12b	156.86	-
13	175.28	-
14	77.69	-
15	72.61	4.35q
16	23.78	1.62s
17	17.09	1.31d
1	70.34	5.46dd
2	27.35	2.86m, 2.44m
3	64.88	3.50m
3NMe	42.5brd	3.08
3NH+	-	-
4	75.22	4.30s, brd
5	72.29	3.87q, brd
6	18.25	1.35d
1'	101.40	5.23m
2'	33.43	2.08m, 2.06m
3'	66.61	4.12m

PL 204 842 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
3'-OH	-	-
4'	72.03	3.67s, brd
4'-OH	-	-
5'	69.50	4.17q, brd
6'	17.52	1.28d

P r z y k ł a d 12 (a) Badanie aktywności cytostatycznej

Do określania aktywności cytostatycznej stosowano komórki wątrobiaka szczurów, otrzymywanego ze zbioru szczepów American Type Culture Collection pod numerem ATCC CRL-1548, Jo Nr 223 i 228. Szczep przechowywano w oś rodku „MEM (EAGLE) with GLUTAMAX/MEM z Glutarnaksem”

[firmy GIBCO BRL Nr 4109-028] z 10% surowicy płodowej cielęcej [GIBCO BRL Nr 10270-106] i 10 μΐ penicyliny-streptomycyny [GIBCO BRL Nr 15140-114]. Stosowano 96 komórkowe mikropłytki do miareczkwania [Greinier, Nr 15140-114]. Do każdego zagłębienia wprowadzano początkowo 140 μl roztworu pożywki hodowlanej i w każdym przypadku zaszczepiano 215000 komórek. Płytki inkubowano następnie w 37°C przy 5% CO2 przez 20-24 godziny. Sporządzano uprzednio serie rozcieńczeń pluraflawin o stężeniach, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625, 0,7813, 0,3906, 0,195, 0,094, 0,047 i 0 μmoli a następnie pipetowano w odpowiedniej kolejności. Po dalszym czasie inkubacji 22 godzin w 37°C w atmosferze 5% CO2 aspirowano ciekły ośrodek. Komórki, które pozostały barwiono za pomocą 100 gl RPMI 1640 [GIBCO BRL Nr 32404-014] na komórkę i 20 μl Cell Triter 96 Aqueous [PROMEGA Nr G5430] na komórkę. Mierzono absorbcję światła przy 590 nm bezpośrednio po dodaniu i po dwóch godzinach inkubacji, jak wyżej. Efekt cytostatyczny obliczano ze zmiany w absorbcji światła.

IC50 dla pluraflawiny A = < 50 nmoli;

IC50 dla pluraflawiny B = < 50 nmoli.

(b) Efekt przeciwrozrostowy pluraflawiny A i flawopirydolu na wybrane linie komórek nowotworowych

MTT, rozpuszczalna w wodzie sól tetrazoliowa, przekształcana jest w nierozpuszczalny purpurowy formazan podczas rozpuszczania z odszczepianiem pierścienia tetrazoliowego przez enzymy dehydrogenazy w aktywnych mitochondriach. Umarłe komórki nie powodują takiej zmiany. Sposób ten stosowano do ilościowego oznaczania rozrostu, w celu określenia aktywności potencjalnych związków chemoterapeutycznych.

Wszystkie komórki utrzymywano w RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), zawierającym 10% cielęcej surowicy płodowej, unieczynnionej działaniem ciepła, penicylinę/streptomycynę i wzbogaconego L-glutaminą. Komórki umieszczano w 96 komórkowych płytkach hodowlanych z następującą gęstością: pierś 2500 komórek/zagłębienie prostata 2500 komórek/zagłębienie okrężnica 2500 komórek/zagłębienie płuco 2500 komórek/zagłębienie.

Komórki pozostawiono do przywarcia przez noc w 37°C przy 5% CO2. Pluraflawinę A rozcieńczano w ośrodku hodowlanym w końcowych stężeniach związku jak niżej 50,0, 16,67, 5,56, 1,85, 0,617, 0,206, 0,069, 0,023 μmoli, zaś flawopirydol rozcieńczano w stężeniach 2,0, 0,667, 0,222, 0,074, 0,025, 0,008, 0,003 i 0,001 μmoli. Oba związki sprawdzano potrójnie we wszystkich stężeniach. Komórki myto świeżym ośrodkiem i dodawano związki do zagłębień z końcową objętością 100 gl. Komórki plus związki pozostawiano do inkubacji w 37°C przy 5% CO2 przez około 72 godziny. W określonym momencie do każdego zagłębienia dodawano 25 gl MTT (10 mg/ml w HBSS). Płytki inkubowano w 37°C przez 2-4 godzin. Usuwano MTT i ośrodek i dodawano 200 gl DMSO na zagłębienie. Odczyt dokonywano przy 570 nm.

Wyniki podane są niżej:

_Komórki_IC50 pluraflawiny A_IC50 flawopirydolu_

Pierś < 23 nmoli 90 nmoli

Prostata 10 nmoli 80 nmoli

Okrężnica 0,35 nmoli 30 nmoli

Płuco 3,0 nmoli 90 nmoli

PL 204 842 B1

Badano działanie pluraflawiny A i flawopirydolu przeciwko komórkom białaczki w doświadczeniu z miękkim agarem. Wyniki IC₅₀ wynosiły: 60 nmoli (pluraflawina A) i 0,5, 0,6 μmola (flawopirydol).

Claims

1. Związek o wzorze (I) w którym:

R1 oznacza grupę

OH

HO- X OH

R2 oznacza -COOH lub -CH2-O-(R7)m gdzie R7 oznacza grupę

R3 wybrane jest spośród grup

R5 oznacza atom wodoru,

R4 i R6 razem stanowią podwójnie związaną grupę -X2 oraz R8 i R10 razem oznaczają podwójnie związaną grupę -X2 przy czym, niezależnie, każdy X2 oznacza atom tlenu, m i n niezależnie, jeden od drugiego oznaczają 1 lub 2, we wszystkich jego postaciach stereochemicznych i mieszaninach tych postaci w dowolnych proporcjach i jego fizjologicznie dopuszczalne sole.

PL 204 842 B1

2. Związek według zastrz. 1, o wzorze (IA) we wszystkich jego postaciach stereochemicznych i mieszaninach tych postaci w dowolnych proporcjach i jego fizjologicznie dopuszczalne sole.

3. Związek według zastrz. 1, o wzorze (IB) we wszystkich jego postaciach stereochemicznych i mieszaninach tych postaci w dowolnych proporcjach i jego fizjologicznie dopuszczalne sole.

4. Związek według zastrz. 1, o wzorze (IE)

PL 204 842 B1 we wszystkich jego postaciach stereochemicznych i mieszaninach tych postaci w dowolnych proporcjach i jego fizjologicznie dopuszczalne sole.

5. Kompozycja, zawierająca przynajmniej jeden związek o wzorze (I), określony w zastrz. 1 - 4 lub jego fizjologicznie dopuszczaną sól i dopuszczalny nośnik.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że wspomniany dopuszczalny nośnik jest farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

7. Sposób wytwarzania przynajmniej jednego związku o wzorze (I) lub jego fizjologicznie dopuszczalnej soli określonego w zastrz. 1 - 4, który obejmuje hodowlę szczepów Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931, w odpowiednich warunkach, w ośrodku hodowlanym/pożywce, aż w ośrodku hodowlanym pojawi się przynajmniej jeden ze związków o wzorze (I), z następującym dalej wyodrębnieniem tego związku.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wspomniany wyodrębniony związek przekształca się następnie w przynajmniej jeden związek wybrany spośród fizjologicznie dopuszczalnych soli.

9. Sposób według zastrz. 7 lub 8, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w warunkach tlenowych w temperaturze między 18 a 35°C i przy pH w zakresie między 6 a 8.

10. Związek o wzorze (I) określony w zastrz. 1 - 4 lub jego fizjologicznie dopuszczalna sól do stosowania w hamowaniu transkrypcji przynajmniej jednego z dwuniciowych kwasów nukleinowych.

11. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1 - 4 lub jego fizjologicznie dopuszczalnej soli do wytwarzania cytostatyku.

12. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1 - 4 lub jego fizjologicznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia nowotworów okrężnicy.

13. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1 - 4 lub jego fizjologicznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia nowotworów sutka (piersi).

14. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1 - 4 lub jego fizjologicznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia nowotworów płuc.

15. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1 - 4 lub jego fizjologicznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia nowotworów prostaty.

16. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1 - 4 lub jego fizjologicznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia białaczki.

17. Zastosowanie związku o wzorze (I) określonego w zastrz. 1 - 4 lub jego fizjologicznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia zakażeń bakteryjnych.

18. Szczepy Actinomycetales HAG 003959 (DSM 12931).