SK11802002A3

SK11802002A3 - Pluraflavíny a ich deriváty, spôsob ich prípravy a ich použitie

Info

Publication number: SK11802002A3
Application number: SK1180-2002A
Authority: SK
Inventors: Laszlo Vertesy; Klaus Ehrlich; Martin Knauf; Joachim Wink; Francis P. Barbone; Elaine A. Powers; Elizabeth A. Cashman
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2003-02-04
Also published as: KR20020086539A; JP2003523346A; AU2001242404B2; EE200200438A; JP4801307B2; KR100743380B1; AU4240401A; WO2001060832A3; EP1125944A1; HK1052709A1; DE60101313T2; HU228332B1; IL151216A; HK1052709B; WO2001060832A2; ATE255120T1; MXPA02006919A; CN1404484A; PT1259523E; EE05137B1

Description

Pluraflavíny a ich deriváty, spôsob ich prípravy a ich použitie

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových zlúčenín všeobecného vzorca I,

O v ktorom R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁸, R¹⁰ a n majú význam uvedený ďalej. Zlúčeniny všeobecného vzorca I inhibujú transkŕiptázu, majú cytostatické účinky a sú najmä vhodné na liečenie nádorov. Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa môžu získať rastom Actinomycetales druhov HAG 003959, DSM 12931, v živnom médiu. Vynález sa teda taktiež týka spôsobu prípravy zlúčenín všeobecného vzorca I, použitia zlúčenín na prípravu farmaceutických prostriedkov na liečenie malígnych porúch a ochorení, ktoré sa môžu liečiť inhibíciou transkriptázy a farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú aspoň jednu zlúčeninu všeobecného vzorca I.

Doterajší stav techniky

Rakovina je ochorenie ľudí a zvierat, ktoré je v prevažnej časti smrteľné a ktoré je všeobecne spôsobené nekontrolovateľným rastom endogénnych buniek. Rakovina je výraz používaný pre tvorbu malígnych nádorov (zhubné nádory), novotvarov (nádory alebo zhubné nádory) alebo pre zhubnú degeneráciu a nezrelosť bielych krvných buniek (leukémia). Rakovinové alebo nádorové bunky sa všeobecne tvoria transformáciou endogénnych buniek. Zhubnosť nádorových buniek sa sama vyjadruje v autonómnom raste, to je v ich schopnosti neviazaného rastu a bez integrácie do systému orgánov a infiltrácii spolu s deštrukciou tkanív. Istý znak zhubného nádoru je tvorba metastáz ďaleko od nádoru po hematogénnom alebo lymfogénnom rozšírení nádorových buniek. Rakovina je jedna z najčastejších príčin úmrtia u ľudí a preto je stále veľký dopyt po metódach a látkach na liečenie alebo ošetrovanie zhubných nádorových degenerácií.

Okrem radikálneho chirurgického prístupu odstránením nádoru, sú ďalšími možnosťami na liečenie zhubných nádorov rádioterapia s použitím X-lúčov, α-, β-, γ-žiarenia, ímunoterapia a chemoterapia. Až doteraz je použitie imunoterapie obmedzené. Pod pojmom chemoterapia sa rozumie podávanie bunkových toxínov (cytostatík) na liečenie nádorov a zvyšných nádorových buniek, obvykle po lokálnom chirurgickom zákroku alebo ožarovaní. Tieto látky špecificky zasahujú v určitých procesoch bunkového delenia tak, že tkanivá, ktoré majú vysoký pomer deliacich sa buniek, ako sú rýchlejšie rastúce nádorové tkanivá, reagujú citlivejšie. Takýmito látkami sú alkylačné zlúčeniny, ako sú napríklad, cyklofosfamid (The Merck Index, 12^ch Ed. strana 463), antimetabolity, ako je metotrexát (The Merck Index, 12^th Ed. strana 1025), alkaloidy, ako je vinkristín (The Merck Index, 12^:n Ed. strana 1704) a antibiotiká, ako je daunomycín (The Merck Index, 12^th Ed. strana 479) a adriamycín (The Merck Index, 12'ⁿ Ed. strany 581-582). Avšak tieto látky majú značné vedľajšie .účinky a všetky majú nevýhodu v tom, že úmrtie chorých je možné v mnohých prípadoch iba oddialiť a nie je možné mu preventívne zabrániť. Ďalej, degenerované (rakovinové) bunky sa stávajú rezistentnými na používané látky; a v tomto prípade bežné farmaceutické prostriedky nemajú ďalej cytostatický účinok, ale sú toxické a majú vedľajšie účinky. Naviac sa zistilo, že kombinované a/alebo postupné používanie cytostatík prevyšuje aktivity jednotlivých cytostatických látok (monoterapia), a je preto možné, že značné vedľajšie účinky pri polychemoterapii nie sú aditívne. Z týchto všetkých dôvodov sú nové chemoterapeutiká naliehavo potrebné a preto sa celosvetovo stále hľadajú.

Neočakávane sa zistilo, že kmeň mikroorganizmu Actinomycetales druh HAG 003959, DSM 12931, je schopný produkovať vysoko účinné cytostatikum, ktoré inhibuje bunkový rast aj vo veľmi nízkych koncentráciách. Ďalej sú tu nové zlúčeniny uvádzané ako pluraflavíny a' tvoria spolu s derivátmi pluraflavínu časť podstaty vynálezu. Pluraflavíny sú antibiotiká, ktoré obsahujú p-chinoidný kruhový skelet a rôzne cukorné stavebné bloky. Inhibujú transkripciu interkaláciou dvoj vláknových reťazcov nukleových kyselín a prípadnou ďalšou alkyláciou. Kruhový skelet bol prvý krát opísaný v práci S. Kondo ai. v Journal of Antibiotics, vol. 30, strany 1143-1145, 1977, ako súčasť pluramycínu. Neskôr bol tento cyklický skelet nájdený v rade antibiotík; naviac boli nájdené štruktúrne príbuzné látky k pluramycínu a neopluramycínu v zlúčeninách saptomycínoch (N. Abe ai. J. Antibiotics, 46, 1536-1549, 1993), ankinomycíne (Y. Sato ai. J. Antibiotics, 42, 149,· 1989), kidamycíne (N. Kanda ai.

J. Antibiotics, 24, 599, 1971), hedamycíne (U. Sequin ai. Tetrahedron, 34, 761, 1978) a altromycínoch (G. M. Brill ai. J. Antibiotics, 43, 229-237, 1990). V predchádzajúcom stave techniky sú tieto zlúčeniny uvádzané ako nevýhodné pre ich nedostatočný účinok, vysokú toxicitu a/alebo pre ich nežiaduce vedľajšie účinky.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka zlúčenín všeobecného vzorca I,

O (D v ktorom je zvyšok cukru,

R² je karboxylová skupina alebo skupina -CH2-O- (R⁷)m, v ktorej R⁷ je zvyšok cukru,

R³ je substituent vybraný zo skupiny zahŕňajúcej skupiny obsahujúce epoxidový zvyšok, alkylová skupiny s 1 až 6 atómmi uhlíka, alkenylovú skupiny s 2 až 6 atómmi uhlíka, kde tieto alkylová skupiny a alkenylovú skupiny sú prípadne substituované aspoň jednou hydroxylovou skupinou,

R je substituent vybraný zo skupiny zahŕňajúcej atóm vodíka, alkylovú skupinu s 1 až 6 atómmi uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómmi uhlíka a alkinylovú skupinu s 2 až 6 atómmi uhlíka,

R⁴, R⁶, R³ a R¹⁰ sú substituenty nezávisle od seba vybrané zo skupiny zahŕňajúcej atóm vodíka, alkylovú skupinu s 1 až 6 atómmi uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómmi uhlíka, alkinylovú' skupinu s 2 až 6 atómmi uhlíka, skupinu -X²H a skupinu -X²R¹², alebo

R⁴ a R⁶ spolu a/alebo R⁸ a R¹⁰ spolu tvoria substituent =X²,

X² je atóm kyslíka, skupiny NH, N-alkyl s 1 až 6 atómmi uhlíka, N-alkenyl s 2 .až 6 atómmi uhlíka, N-alkinyl s 2 až 6 atómmi uhlíka alebo atóm síry,

R¹² je alkylová skupina s 1 až 6 atómmi uhlíka, alkenylová skupina s 2 až 6 atómmi uhlíka, alkinylová skupina s 2 až 6 atómmi uhlíka, arylová skupina alebo acylová skupina a m a n sú od seba nezávisle 1 alebo 2, vo všetkých ich stereoizomérnych formách a v zmesiach týchto foriem v ľubovoľných pomeroch a ich fyziologicky prijateľných solí.

V zlúčeninách všeobecného vzorca I je alkylová skupina s 1 až 6 atómmi uhlíka nerozvetvená alebo rozvetvená alkylová skupina s 1 až 6 atómmi uhlíka, napríklad metylová skupina, etylová skupina, izopropylová skupina, terc5

-butylová skupina a hexylová skupina, alkenylová skupina s 2 až 6 atómmi uhlíka je nerozvetvená alebo rozvetvená alkenylová skupina s 2 až 6 atómmi uhlíka, napríklad alylová skupina, krotylová skupina a pentenylová skupina, a alkinylová skupina s 2 až 6 atómmi uhlíka je nerozvetvená alebo rozvetvená alkinylová skupina s 2 až 6 atómmi uhlíka, napríklad propinylová skupina, butinylová skupina a pentinylová skupina.

Arylová skupina je skupina s aromatickým kruhovým systémom, napríklad fenylová skupina, benzylová skupina alebo 1- alebo 2-naftylová skupina. Arylová skupina môže byť prípadne substituovaná, napríklad atómom halogénu, ako je atóm chlóru, atóm brómu, atóm fluóru, alkylovou skupinou s 1 až 4 atómmi uhlíka, napríklad metylovou skupinou, hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atómmi uhlíka, napríklad metoxyskupinou a/alebo trifluórmetylovou skupinou.

Acylová skupina môže byť alifatická alebo aromatická acylová skupina. Alifatická acylová skupina má 1 až Ί atómov uhlíka, napríklad 1 až 4 atómy uhlíka, ako je formylová skupina, acetylová skupina, propionylová skupina, butyrylová skupina, hexanoylová skupina, akryloylová skupina, krotonoylová skupina, propioloylová skupina, ktoré môžu byť ďalej substituované, napríklad, atómom halogénu, ako je atóm chlóru, atóm brómu, atóm fluóru, aminoskupinou a/alebo alkylaminoskupinou s 1 až 4 atómmi uhlíka, ako je metylaminoskupina alebo etylaminoskupina. Aromatická acylová skupina môže byť napríklad benzoylová skupina alebo naftoylová skupina, ktoré môžu byť ďalej substituované, napríklad atómom halogénu, ako atómom chlóru, atómom brómu, atómom fluóru, alkylom s 1 až 4 atómmi uhlíka, napríklad metylom, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, ako je napríklad etylaminoskupina alebo alkoxylovou skupinou s 1 až 7 atómmi uhlíka, ako s 1 až 4 atómmi uhlíka, napríklad metoxyskupinou.

Cukor (R¹ / R⁷) je monosacharid (n = 1) alebo disacharid (n = 2), v ktorom dve monosacharidové jednotky sú spojené glykozidickou väzbou. Monosacharidom môže byť hexóza (C₆Hi₂O₆) , napríklad aldohexóza, ako je D-(+)-glukóza, D-(+)-manóza alebo D-(+)-galaktóza. Monosacharidy môžu byť mono-, di- alebo tri-substituované, nezávisle od seba atómom vodíka, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, skupinami NH(alkyl), N(alyl)₂, alkylovou skupinou a alkoxylovou skupinou, kde atóm vodíka a/alebo hydroxylová skupina monosacharidu môže byť prípadne nahradená substituentmi. Pod výrazom „cukor, ako sa tu používa, sa taktiež rozumie aminocukor. Aminocukor je monosacharid alebo disacharid, ktorý je prípadne substituovaný ako je to opísané pred týmto, v ktorom aspoň jedna hydroxylová skupina alebo jeden atóm vodíka sú nahradené aminoskupinou, ako je NH₂, NH(alkyl) alebo N(alkyl)₂.

V jednom konkrétnom prípade m = 1,

R⁷ môže byť aminocukor všeobecného vzorca II,

(II) v ktorom

R¹³, R¹⁴, R¹⁶, R¹⁸, R²⁰, R²², R²⁴, R²⁶ a R²⁸, sú od seba nezávisle vybrané zo skupiny zahŕňajúcej atóm vodíka, hydroxylovú skupinu, aminoskupinu, skupiny NH(alkyl), N(alkyl)₂ a alkoxylovú skupinu, kde alkylové skupiny a alkoxylové skupiny majú od 1 do 4 atómov uhlíka.

Príklady alkylových skupín s 1 až 4 atómmi uhlíka sú naprí klad, metylová skupina, etylová skupina, propylová skupina, izobutylová skupina a butylová skupina, najmä metylová skupina a príklady alkoxylových skupín s 1 až 4 atómmi uhlíka sú, napríklad, metoxylová skupina, etoxylová skupina, izopropoxylová skupina alebo butoxylová skupina, najmä metoxylová skupina.

R⁷ môže byť aminocukor vzorca IIA:

(IIA)

R¹ môže taktiež byť aminocukor.

V jednom konkrétnom prípade n - 2.

R¹ môže byť skupina všeobecného vzorca III,

(III) v ktorom

R³⁰ až R⁶⁰ sú od seba nezávisle atómy vodíka, 'hydroxylové skupiny, aminoskupiny, skupiny NH(alkyl), N(alkyl)₂ alebo alkoxylové skupiny, kde alkylové skupiny obsahujú 1 až 4 atómy uhlíka, ako je metylová skupina, etylová skupina, propylová skupina, izobutylová skupina a butylová skupina, najmä metylová skupina, a O-alkyl je alkoxylová skupina s 1 až 4 atómmi uhlíka, napríklad, metoxylová skupina, etoxylová skupina, izopropoxylová skupina alebo butoxylová skupina, najmä metoxylová skupina.

R¹ v jednom konkrétnom prípade má vzorec IIIA:

(ΙΙΙΑ)

R³ môže byť skupinou obsahujúcou epoxid. Skupina obsahujúca epoxid môže byť nerozvetvená alebo rozvetvená alkenylová skupina s 2 až 12 atómmi uhlíka, ako je s 2 až 6 atómmi uhlíka, ktorá obsahuje jeden až dva epoxidové kruhy (oxirány). Možnými príkladmi sú:

Iná ako epoxid obsahujúca skupina R³ môže byť nerozvetvená alebo rozvetvená alkylová skupina s 1 až 12 atómmi uhlíka, ako je alkylová skupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka, napríklad, metylová skupina, etylová skupina, izopropylová skupina, terc-butylová skupina, hexylová skupina, a taktiež, napríklad, oktylová skupina, dodecylová skupina alebo nerozvetvená alebo rozvetvená alkenylová skupina obsahujúca od 2 až do 12 atómov uhlíka, ako je s 2 až 6 atómmi uhlíka, napríklad, alylová skupina, krotylová skupina, pentenylová skupina, a taktiež dodece nylová skupina, kde alkylové skupiny a alkenylové skupiny môžu byť taktiež monosubstituované alebo polysubstituované, napríklad hydroxylovou skupinou.

Vynález sa podlá toho týka pluraflavínu A vzorca IA,

pluraflavínu B vzorca IB

(IB) a pluraflavínu E vzorca IE,

(ΙΕ) v ktorých hexóza I je 2,6-dideoxyaldohexóza;

hexóza II je 2,3,6-trideoxy-3-dimetylaminohexóza a hexóza III je 2,3,6-trideoxy-3-amino-3-metylaldo-hexóza, vo všetkých ich stereochemických formách a v zmesiach týchto foriem v akomkoľvek pomere a ich fyziologicky prijateľných soli.

V jednom konkrétnom uskutočnení sú zlúčeniny vybrané zo vzorcov ΙΑ, IB , v ktorých hexóza I je olióza;

hexóza II je rodozamín a hexóza III je 3-epi-vankozamín.

Podía tohto vynálezu sú zlúčeniny vzorca I pripravitelné kultiváciou, napríklad fermentáciou Actinomycetales druhov HAG 003959, DSM 12931, alebo variantov alebo mutantov, vo vhodných podmienkach v živnom médiu, až. kým sú v živnom médiu prítomné pluraflavíny vzorcov ΙΑ, IB a/alebo IE. Pluraflavíny sa potom zo živného média môžu izolovať, prípadne sa prevedú na deriváty a/alebo fyziologicky prijateľné soli.

Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy zlúčenín vzorca I, ktorý sa vyznačuje tým, že sa kultivujú, napríklad fermentáciou, mikroorganizmy Actinomycetales druhy HAG 003959, DSM 12931, alebo ich varianty alebo mutanty pri vhodných podmienkach v živ11 nom médiu, až kým je prítomný aspoň jeden z pluraflavínov vzorca ΙΑ, IB a/alebo IE, zo živného média sa izoluje aspoň jeden z pluraflavínov a prípadne sa prevedie na deriváty a/alebo fyziologicky prijateľné soli.

Kmeň HG 003959, DSM 12931, jeho mutanty a/alebo varianty sa podľa jedného konkrétneho uskutočnenia kultivujú v živnom roztoku (taktiež uvádzaným ako živné médium), ktorý obsahuje aspoň jeden zo zdrojov atómov uhlíka a aspoň jeden zo zdrojov atómov dusíka a prípadne anorganické soli, až kým je v živnom médiu prítomný aspoň jeden z nových pluraflavínov; pluraflavíny sa potom môžu izolovať zo živného média a prípadne rozdeliť na jednotlivé individuálne zložky.

Kultivácia sa môže uskutočňovať v aeróbnych podmienkach. Kultivácia sa uskutočňuje pri teplotách v rozmedzí od 18 do 35°C a pri pH v rozmedzí od 6 do 8.

V literatúre je opísaný rad reakcií pre chemickú derivatizáciu chinónov. Podľa toho sa derivatizácia týchto zlúčenín môže uskutočňovať s použitím chemických reakcií, ktoré sú známe. Redukcia chinónových zlúčenín na hydrochinóny sa môže napríklad uskutočňovať katalytický vodíkom, alebo hydridmi kovov, ako sú hydridy hliníka alebo hydridy boru.

Ďalším vhodným príkladom je konverzia chinónov s hydroxylaminom alebo s jeho derivátmi na oxímy, ktoré sa môžu ďalej chemicky spracovávať.

Vynález sa teda týka zlúčenín vzorca IV:

(IV) v ktorom R¹, R²,

R³ a n majú význam definovaný pred týmto v akejkoľvek ich stereochemickej forme a zmesí týchto v akomkoľvek pomere a ich fyziologicky prijateľných solí ich derivátov.

Deriváty pluraflavínu vzorcov IVA, IVB a IVE (pozri sú derivátmi pluraflavínov vzorcov ΙΑ, IB a IE respektíve tiež tvoria časť tohto vynálezu.

foriem alebo ďalej) a takVynález sa ďalej týka zlúčeniny vzorca IVA,

(IVA) zlúčeniny vzorca IVB

(IVB) a zlúčeniny vzorca IVE

vo všetkých ich stereochemických formách a zmesiach týchto foriem v akomkoľvek pomere a fyziologicky prijateľných soli alebo ich derivátov.

Vynález je ďalej opísaný podrobnejšie, napríklad v aspoň jednom konkrétnom uskutočnení.

Pluraflavíny podľa tohto vynálezu sa produkujú druhmi Actinomycetales , v jednom konkrétnom uskutočnení kmeňom Actinomycetales druhom HAG 003959, DSM 12931. Actinomycetales druh HAG 003959, DSM 12931, má béžovo červené mycélium a môže sa identifikovať konidioformi, ktoré sú typické pre actinomycetes.

Taxonomické štúdium mikroorganizmu Actinomycetales druh HAG 003959, DSM 12931, poskytlo nasledujúce výsledky determinácie kmeňa: diagnosticky dôležitá analýza mastných kyselín plynovou chromatografiou poskytla hlavné pomery:

Anteizo 15:0 mastná kyselina,

Izo 16:0 mastná kyselina (izopalmitová kyselina),

Izo 17:0 mastná kyselina (izomargarová kyselina),

Anteizo 17:0 mastná kyselina (anteizomargarová kyselina)’ a cis[9] 18:1 mastná kyselina (olejová kyselina), a naviac nízke koncentrácie iných mastných kyselín.

Tento profil zloženia mastných kyselín umožňuje klasifikovať, že Actinomycetales HAG13 003959 (DSM 12931) patrí taxanomicky do rodu Saccharothrix.

Izolát mikroorganizmu bol uložený do Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH, MascheroderWeg 1B, D 38124 Braunschweig, Germany, podlá pravidiel Budapest Convention z júla 16, 1999 pod číslom: Actinomycetales species Hag 003959, DSM 12931.

Namiesto kmeňa Actinomycetales druhu Hag 003959, DSM 12931, sa taktiež môžu použiť jeho mutanty a varianty, ktoré syntetizujú aspoň jednu zo zlúčenín pluraflavínov podlá tohto vynálezu. Tieto mutanty sa môžu pripraviť bežne známymi spôsobmi, napríklad ožarovaním, to je ultrafialovými lúčmi alebo róntgenovým žiarením alebo chemickými mutagénmi, ako napríklad etyl metánsulfonátom (EMS), 2-hydroxy-4-metoxybenzofenónom (MOB) alebo N-metyl-N'-nitro-N-nitrozoquanidinom (MNNG).

Postup podlá vynálezu sa môže uskutočňovať fermentáciou v laboratórnom meradle (v mililitrovom až litrovom rozsahu) alebo v priemyselnom meradle (v meradle kubického metra). Pokial nie je uvedené inak, všetky percentá sa uvádzajú na podklade hmotnostnom. V prípade kvapalín, sa pomery miešaní uvádzajú na podklade objemovom, pokial nie je uvedené inak.

Podlá jedného konkrétneho uskutočnenia sa ako zdroje atómov uhlíka pre aeróbnu fermentáciu používajú asimilovatelné sacharidy a cukorné alkoholy, ako sú glukóza, laktóza, sacharóza alebo D-manitol, a uhľovodíky obsahujúce prírodné produkty, ako je napríklad sladový extrakt. Vhodné zdroje atómov dusíka sú: aminokyseliny, peptidy a proteíny a ich degradačné produkty, ako sú peptóny alebo tryptóny, ďalej extrakty z mäsa, extrakty z kvasníc, rozomleté semená, napríklad kukurice, pšenice, fazule, sóje alebo bavlny, destilačné zvyšky z výroby alkoholov mastných pokrmov, extraktov kvasníc, ale taktiež amónne soli a dusičnany. Anorganické soli obsiahnuté v živnom roztoku môžu byť napríklad: chloridy, uhličitany, sulfáty alebo fosfáty alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín, železa, zinku, kobaltu a mangánu.

Tvorba pluraflavinov podlá tohto vynálezu sa uskutočňuje v živnom médiu, ktoré obsahuje asi 0,1 až 5 %, ako 0,3 až 2 %, glukózy a 0,2 až 5 %, ako 0,5 až 3 %, sójovej múky a 0,05 až 2 %, ako 0,2 až 1,0 g/1, rozmočenej kukurice a 0,05 až 1,0 g/1, ako 0,1 až 0,5 %, uhličitanu vápenatého a 0,05 až 1,0 g/1, ako 0,1 až 1,0 g/1, chloridu sodného. Percentá sa v každom prípade vzťahujú na hmotnosť celého živného média.

V živnom médiu Actinomycetales druh Hag 003959, DSM 12931, produkuje zmes pluraflavinov. V závislosti od zloženia živného média, proporcia aspoň jedného z pluraflavinov podlá vynálezu sa môže meniť. Ďalej zložením média sa môže kontrolovať syntéza individuálnych pluraflavinov tak, že jeden alebo viac' z pluraflavínov sa neprodukuje mikroorganizmami vôbec, alebo v množstve, ktoré je pod detekčným limitom.

Podľa jedného konkrétneho uskutočnenia živné médium obsahuje iba jeden detegovateľný pluraflavín. V ďalšom konkrétnom uskutočnení vznikajú pluraflavíny A, B alebo E.

Naviac k pluraflavínom A, B a E (zlúčeniny vzorcov (IA), (IB) a (IE), respektíve), môžu v živnom médiu Actinomycetales druh Hag 003959, DSM 12931 taktiež vznikať iné príbuzné zlúčeniny, ktoré sa líšia od zlúčenín reprezentovaných vzorcami IA, IB a IE tým, že sú odlišne glykosylované. Tak, ako vedľajší produkt môže vznikať ďalší pluraflavín (pluraflavín C) s molekulovou hmotnosťou 974 Da a taktiež sa detegoval degradačný produkt pluraflavínu A, s molekulovou hmotnosťou 692,77, C37H44N2O11.

V poslednej uvedenej zlúčenine nie je prítomná hexóza I; pri kyslých podmienkach sa 2,6-dideoxyaldohexóza môže hydrolyticky odštepovať z pluraflavínu A.

Mikroorganizmus sa kultivuje aeróbne, to je, napríklad submerzne pri trepaní alebo miešaní v trepacích bankách alebo fermentoroch, prípadne pri zavádzaní vzduchu alebo kyslíka.

Kultivácia sa môže uskutočňovať pri teplotách v rozmedzí od približne 18 do 35°C, ako približne od 25 do 32°C, vrátane od 27 do 30°C. Hodnota pH je všeobecne v rozmedzí od 6 do 8, ako od 6,5 do 7,5. Pri týchto podmienkach sa mikroorganizmus všeobecne kultivuje počas doby v rozmedzí od 24 do 300 hodín, ako od 36 do 140 hodín.

Kultivácia sa výhodne uskutočňuje v niekoľkých stupňoch, to je pripraví sa aspoň jedna predkultúra v kvapalnom živnom médiu, ktorá sa potom očkuje do aktuálneho produkčného média, pričom objemový pomer predkultúry k hlavnej kultúre je napríklad 1 : 10. Predkultúra sa získa, napríklad, naočkovaním mycélia do živného roztoku, a nechá sa rásť približne 36 až 120 hodín, ako 48 až 96 hodín. Mycélium sa môže získať, napríklad tým, že sa kmeň nechá rásť asi 3 až 40 dní, ako 4 až 10 dní, na pevnom alebo kvapalnom živnom médiu, napríklad na sladovom-kvasnicovom agare alebo agare s ovsenou múkou.

Priebeh fermentácie sa môže monitorovať meraním pH kultúr alebo objemom mycélia a taktiež chromatografickými metódami, ako je napríklad chromatografia na tenkej vrstve alebo vysokotlaková kvapalinová chromatografia alebo biologickými testami. Pluraflavíny podľa vynálezu sa môžu nájsť ako v mycéliu, tak vo filtráte kultúry. Izolačný postup opísaný ďalej, slúži všeobecne na čistenie pluraflavínov A, B a E.

Izolácia a/alebo čistenie pluraflavínov podľa vynálezu zo živného média sa môže uskutočňovať známymi metódami, pri ktorých sá berú do úvahy chemické, fyzikálne a biologické vlastnosti prírodných produktov. Na testovanie koncentrácie pluraflavínu v živnom médiu alebo pri jednotlivých izolačných stupňoch sa môže použiť chromatografia na tenkej vrstve, napríklad s použitím zmesi chloroform/metanol/ľadová kyselina octová/voda (napríklad v pomere 8:1:1:0,2) ako mobilná fáza alebo HPLC. Pri delení chromatografiou na tenkej vrstve sa detekcia uskutočňuje napríklad s použitím farbiacich reakčných činidiel, ako je a-naftol/kyselina sírová, pri ktorom sa množstvo látky vhodne porov náva s kalibračným roztokom.

Podľa vynálezu sa pluraflavíny môžu izolovať buď z mycélia alebo z kultivačného média. Všeobecne sa mycélium najskôr oddelí od kultivačného média bežne známymi metódami a pluraflavíny sa potom extrahujú z bunkového materiálu s použitím organického rozpúšťadla, prípadne miešateľného s vodou.

Fázy organického rozpúšťadla obsahujúce pluraflavíny podľa vynálezu sa prípadne zahustia pri zníženom tlaku a čistia sa spôsobom opísaným ďalej.

Prípadne sa kultivačný filtrát spojí s koncentrátom z extraktu mycélia a extrahuje sa vhodným rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou, napríklad n-butanolom. Organická fáza sa potom oddelí a prípadne zahustí pri zníženom tlaku. Na odstránenie tukov sa koncentrát zriedi nepolárnym rozpúšťadlom, v ktorom sú pluraflavíny podľa vynálezu iba málo rozpustné, ako napríklad hexánom, petroléterom, dietyléterom. To spôsobí vyzrážanie pluraflavínov a lipofilné nečistoty zostanú rozpustené a odstránia sa bežnou separáciou pevnej a kvapalnej fázy. Zrazenina, ktorá obsahuje všetky pluraflavíny sa rozpustí v zmesi 1/30 pôvodného, objemu vody a metanolu. Zrazenina sa úplne rozpustí a lyofilizuje sa. Lyofilizát sa potom ďalej uvádza ako surový produkt obsahujúci 0,5 až 50 % pluraflavínu a použije sa na ďalšie izolácie.

Ďalšie čistenie jedného alebo viac pluraflavínov podľa tohto vynálezu sa uskutočňuje chromatografiou na vhodnom materiáli, ako sú molekulárne sitá, na normálnych fázových nosičoch, ako je, napríklad, silikagél, oxid hlinitý na ionomeničoch alebo adsorpčných živiciach a/alebo na médiách s obrátenými fázami (RP) . Pomocou týchto chromatografii sa pluraflavíny rozdelia. Chromatografia pluraflavínov sa uskutočňuje s použitím pufrovaných vodných roztokov alebo zmesí vodných a organických roztokov.

Ako zmesi vodných alebo organických roztokov sa mienia všetky s vodou miešatelné organické rozpúšťadlá, ako je metanol, propanol a acetonitril, v koncentráciách od 10 do 80 % rozpúšťadla, napríklad od 40 do 60 % rozpúšťadla, alebo iné úplne pufrované vodné roztoky, ktoré sú miešatelné s organickými rozpúšťadlami. Pufry sa môžu používať rovnaké, aké boli uvedené pred týmto.

Separácia pluraflavínov, ktorá sa zakladá na ich rôznej polarite, sa môže uskutočňovať chromatografiou na obrátených fázach, napríklad na MCI® (adsorpčná živica od Mitsubishi, Japan) alebo Amberlit XAD® (TOSOHAAS), alebo iných hydrofóbnych materiáloch, ako sú, napríklad, RP-8 alebo RP-18 fáza. Naviac sa separácia môže uskutočňovať chromatografiou na normálnych fázach, napríklad na Silikagéli alebo oxide hlinitom a podobne.

Chromatografia pluraflavínov sa môže uskutočňovať s použitím pufrovaných alebo okyslených vodných roztokov alebo vodných roztokov s alkoholmi alebo inými s vodou miešatelnými alkoholmi alebo inými s vodou miešatelnými organickými rozpúšťadlami. Ako organické rozpúšťadlá sa môžu použiť propanol a acetonitril.

Ako pufrované alebo okyslené vodné roztoky sa mienia napríklad voda, fosfátový pufor, octan amónny, citrátový pufor v koncentráciách od 1 mM do 0,5 M, a taktiež kyselina mravčia, kyselina octová, kyselina trifluóroctová alebo všetky komerčné kyseliny známe odborníkom v odbore, napríklad v koncentráciách od 0,01 do 3 %, ako od 0,1 %.

Chromatografia sa môže uskutočňovať s použitím grandientu vychádzajúc zo 100 % vodného pufra a končiac 100 % rozpúšťadla, napríklad lineárnym gradientom pohybujúcim sa od 10 do 50 % pri použití 2-propanolu alebo acetonitrilu.

Alternatívne sa taktiež môže uskutočňovať gélová chromatografia alebo chromatografia na hydrofilných fázach.

Gélová chromatografia sa môže uskutočňovať na polyakrylamide alebo zmiešaných polymérnych géloch, ako je napríklad Biogel-P 2® (Biorad), Fractogel TSK HW 40® (Merck, Germany alebo Toso Haas, USA) alebo Sephadex® (Pharmacia, Uppsala, Sweden).

Poradie chromatografii uvedených pred týmto môže byť obrátené .

Ďalší vysoko efektívny čistiaci stupeň pre pluraflaviny je kryštalizácia. Pluraflaviny kryštalizujú z roztokov v organických rozpúšťadlách a zo zmesí vody s organickými rozpúšťadlami. Kryštalizácia sa môže uskutočňovať známym spôsobom, ako napríklad zahustením alebo ochladením nasýtených roztokov pluraflavínu.

Pluraflaviny podlá vynálezu sú stabilné v peynom stave a v roztokoch, ktoré majú pH v rozmedzí od 3 do 8, napríklad, pH 4 až 6 a môžu ich preto obsahovať bežné farmaceutické prostriedky.

Pluraflaviny vzorca I a od nich odvodené deriváty sa metódami známymi odborníkom v odbore môžu previesť na zodpovedajúce fyziologicky prijateľné soli.

Ako fyziologicky prijateľné soli zlúčenín vzorca I sa mienia tak organické, ako aj anorganické soli, aké sú opísané v Remington's Pharmaceutical Sciences (17. vydanie, str. 1418 (1985)). Na podklade fyzikálnej a chemickej stability sú sodné, draselné, vápenaté a amónne soli možnými súčasťami kyslých skupín; soli s kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou fosforečnou alebo s karboxylovými kyselinami alebo sulfónovými kyselinami, ako sú napríklad kyselina octová, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina maleínová kyselina fumarová, kyselina vínna a kyselina p-toluénsulfónová, sú možnými súčasťami zásaditých skupín.

Vynález ďalej zahŕňa chemické ekvivalenty, tu označované taktiež ako „deriváty, zlúčenín vzorca I, ktoré majú rovnakú alebo v podstate rovnakú aktivitu, alebo ktoré sa môžu previesť na zlúčeniny podlá vynálezu. Takýmito ekvivalentmi sú napríklad estery a étery, komplexy a taktiež produkty redukcie zlúčenín podlá vynálezu.

Estery a éterické deriváty a produkty redukcie sa môžu pripraviť postupmi opísanými v literatúre, napríklad v „Advanced Organic Synthesis, 4. vydanie, J. March, John Wiley & Sons, 1992. Karboxylová skupina (vzorca IE, IVE) a hydroxylové skupiny zlúčenín vzorca I sa môžu previesť na ester, ako je alkylester s 1 až 4 atómmi uhlíka alebo na éterickú skupinu. Tieto étery zahŕňajú, napríklad acetály a ketály hydroxylových skupín.

Stabilné komplexy zlúčenín vzorca I sa môžu vytvoriť s fyziologicky prijateľnými anorganickými katiónmi, ako sú katióny vápnika alebo horčíka.

Vynález taktiež zahŕňa všetky stereoizomérne formy zlúčenín vzorca I. Centrá asymetrie zlúčenín vzorcov ΙΑ, IB a IE sú od seba nezávislé a môžu mať S-konfiguráciu alebo R-konfiguráciu. Oxirány skupín obsahujúcich epoxid môžu byť v ktorejkoľvek polohe, napríklad oxirány, ktoré zahŕňajú atómy uhlíka 2' a 3'. Vynález taktiež zahŕňa všetky možné enantioméry a diastereoméry a taktiež zmesi aspoň dvoch stereoizomérnych foriem, napríklad zmesi enantiomérov a/alebo diastereomérov, v akomkoľvek pomere. Vynález teda poskytuje enantioméry v énantiomérne čistej forme, ako vo forme ľavotočivých, tak pravotočivých antipodov, R a S konfigurácií, vo forme racemátov a vo forme zmesí dvoch enantiomérov v ľubovoľnom pomere. Ak je v zlúčenine možná cis/trans izoméria, vynález taktiež zahŕňa ako cis formu, tak trans formu a zmesi týchto foriem v ľubovoľnom pomere.

Vzhľadom na užitočné farmakologické vlastnosti sú zlúčeniny podľa vynálezu vhodné na použitie ako liečivá v ľudskej a/alebo veterinárnej medicíne. Majú antibiotický účinok a naviac antibakteriálny účinok, antimykotický účinok, to je inhibičný účinok na pliesne, vrátane fytopatogénnych pliesní, a majú antipro21 tozoálne a antiparazitické vlastnosti.

Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu použiť na rakovinové ochorenia, napríklad ako chemoterapeutiká. Vzhľadom na ich význačné cytostatické účinky a antimikrobiálne účinky sa môžu použiť, napríklad, ako cytostatiká na malígne deformácie u živočíchov a ľudí.

V prípade nádorových buniek, ktoré majú vyvinutú rezistenciu na konvenčné látky, iba nové prostriedky majú terapeuticky adekvátny efekt. Tak, pluraflavíny podľa vynálezu a ich deriváty vzorca I majú potenciálne vynikajúcu aktivitu proti 'týmto problémovým typom buniek.

Vynález sa taktiež týka farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú aspoň jednu zlúčeninu z pluraflavínov podľa vynálezu a/alebo ich derivátov podľa vynálezu. Pluraflavíny sa môžu použiť v zmesi s aspoň jednou pomocnou látkou alebo excipientom. Excipientmi používanými pre ľudí môžu byť všetky farmakologicky prijateľné excipienty a/alebo pomocné látky.

Vynález sa taktiež týka spôsobu prostriedkov podľa vynálezu, ktorý jednej zlúčeniny podľa vynálezu na použitím vhodnej excipientu, a prípadne ďalších pomocných látok.

prípravy farmaceutických zahŕňa prevedenie aspoň vhodnú aplikačnú formu prijateľného prísad alebo fyziologicky a farmaceutický a aktívnych látok, podľa vynálezu parenterálne, je sa všeobecne

Farmaceutické prostriedky podávajú orálne, topický alebo možná rektálna aplikácia. Vhodnými pevnými alebo kvapalnými však taktiež formami farmaceutických prostriedkov sú napríklad granule, prášky, tablety, povlečené tablety, mikrokapsule, čapíky, sirupy, emulzie, suspenzie, aerosóly, kvapky alebo injikovateľné roztoky vo forme ampúl a preparáty, ktoré majú predĺžené uvoľňovanie aktívnej zlúčeniny a v ktorých sa pri ich príprave používajú inertné látky a prísady a/alebo pomocné látky, ako sú dezin tegračné látky, spojovadlá, látky na povlečenie, napučiavacie činidlá, glidanty alebo mazadlá, chuťové prísady, sladidlá alebo solubilizátory.

Často používanými inertnými látkami alebo pomocnými látkami, ktoré možno uviesť, sú napríklad uhličitan horečnatý, oxid titaničitý, laktóza, manitol a iné sacharidy, mastenec, laktoproteín, želatína, škrob, vitamíny, celulóza a jej deriváty, živočíšne alebo rastlinné oleje, polyetylénglykol a rozpúšťadlá, ako je napríklad sterilná voda, alkoholy, glycerol a polyhydroxylové alkoholy.

Prípadne jednotková dávkovacia forma môže byť mikroenkapsulovaná na orálnu aplikáciu, aby sa oddialilo alebo predĺžilo uvoľňovanie účinnej látky počas dlhšej doby, ako napríklad prípravou povlečením alebo vložením čiastočiek aktívnej zlúčeniny do vhodných polymérov, voskov a podobne.

Farmaceutické prostriedky sa môžu pripravovať a aplikovať v jednotkových dávkovacích formách, ktoré obsahujú ako aktívnu látku aspoň jednu zlúčeninu z pluraflavínov podía vynálezu a/alebo ich deriváty. V prípade pevnej jednotkovej dávkovacej formy, ako sú tablety, kapsule a čapiky, táto dávka môže byť až do približne 200 mg, ale môže byť asi 0,1 až 100 mg, a v prípade roztokov na injekcie v ampuliach táto dávka môže byť až do približne 200 mg, ale môže byť asi 0,1 až 100 mg za deň.

Denná dávka sa aplikuje v závislosti od telesnej hmotnosti, veku, pohlavia a stavu cicavca. Môžu sa však taktiež použiť dávky vyššie alebo nižšie. Denná dávka sa môže podávať v jednej dávke alebo v niekoľkých menších jednotkových dávkach alebo vo vhodných časoch vo vopred stanovených intervaloch alebo vo forme rozdelených dávok.

Vynález je bližšie objasnený nasledujúcimi príkladmi. Uvedené percentá sú percentá hmotnostné. V prípade kvapalín, pomery miešania sú na podklade objemovom, pokial nie je uvedené inak.

Nasledujúce príklady sú iba ilustrativne a vynález žiadnym spôsobom neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava glycerolovej kultúry Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931.

100 ml živného roztoku (extrakt sladu 2,0 %, extrakt kvasníc 0,2 %, glukóza 1,0 %, (ΝΗ^ΗΡΟή 0,05 %, pH 6,0) v sterilnej 300 ml Erlenmeyerovej banke sa naočkuje kmeňom Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931, a inkubujé sa v rotačnej trepačke pri 28°C a pri 180 ot./min počas 7 dní. 1,5 ml tejto kultúry sa potom zriedi 1,5 ml 99 % glycerolu a skladuje sa pri -20°C.

Príklad 2

Príprava kultúry alebo predkultúry Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931 v Erlenmeyerovej banke.

Sterilná 300 ml Erlenmeyerová banka obsahujúca 100 ml nasledujúceho živného roztoku: 15 g glukózy, 15 g sójovej múky, 5 g kukuričného výluhu, 2 g CaCO3 a 5 g NaCl na liter sa naočkuje kultúrou pestovanou na šikmom médiu v skúmavke s použitím rovnakého živného roztoku, ale s 2 % agaru) alebo 1 ml glycerolovej kultúry (pozri príklad 1) a inkubujé sa na trepačke so 180 ot./min pri 30°C. Maximálna produkcia aspoň jednej zlúčeniny z pluraflavínov podľa vynálezu sa dosiahne po 120 hodinách. Na naočkovanie 10 a 200 1 fermentorov stačí 48 až 96 hodinová submerzná kultúra (množstvo na inokuláciu 10 %) pri použití rovnakého živného roztoku.

Príklad 3

Príprava pluraflavinov

Fermentor (9 1) pracuje pri nasledujúcich podmienkach:

Živné médium:	15 g glukózy/1; 15 g sójovej múky/1; 5 g kukuričných výluhov pevných/1; 2 g CaCO₃/l; 5 g NaCl/1; pH 7,0 (pred sterilizáciou);
Doba prevádzky:	92 hodín;
Teplota inkubácie:	28°C;
Rýchlosť miešania:	300 ot./min;
Prevzdušňovanie:	5 1/min’¹.

Opakovaným pridávaním etanolického roztoku polyolu možno prípadne potlačiť tvorbu peny. Maximálna produkcia sa dosiahne po asi 70 až 96 hodinách.

Príklad 4

Izolácia zmesi pluraflavinov zo živného roztoku kultúry Äctinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931.

Po skončení fermentácie Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931, sa živná pôda z fermentora, pripravená podľa príkladu 3 (90 1) prefiltruje pri pridaní 2 % pomocného filtračného prostriedku, napríklad Celitu® a bunkový materiál (0,6 litra) sa extrahuje 3 litrami metanolu. Aktívna zlúčenina obsahujúca metanolický roztok sa od mycélia oddelí filtráciou a zahustí sa pri zníženom tlaku. Koncentrát sa spolu s filtrátom z kultúry (7 litrov) nanesie na pripravený 0,4 litrový ®MCI GEL, CHP20P stĺpec. Elúcia sa uskutočňuje s použitím gradientu 0,1 % kyseliny octovej vo vode až 0,1 % kyseliny octovej v 2-propa nole. Prietok stĺpcom je (1,2 litra za hodinu) a odoberajú sa frakcie (po 0,25 1) a frakcie obsahujúce pluraflavin sa spoja (20 až 23). Zahustením pri zníženom tlaku a mrazovou sublimáciou sa získa 1,4 g hnedého prášku.

Príklad 5

Obohatenie pluraflavínových zložiek gélovou chromatografiou.

1,4 g produktu pripraveného podlá príkladu 4 sa nanesie na stĺpec s kapacitou 3,9 litrov (šírka x výška = 10 cm x 50 cm), naplnenou Fractogel® TSK HW-40 s. Mobilná fáza voda/acetonitril (1:1) sa pumpuje stĺpcom rýchlosťou 50 ml za minútu a odoberajú sa frakcie (65 ml). Pluraflavíny sa hlavne eluujú vo frakciách 13 až 16. Spoja sa, rozpúšťadlo sa odparí pri zníženom tlaku a získa sa 130 mg zmesi pluraflavínov.

Príklad 6

Separácia pluraflavínových zložiek· na obrátených fázach RP-18.

Preparatívny HPLC stĺpec s kapacitou 122 ml (1,25 cm vnútorný priemer x 25 cm výška) sa naplní ®Nucleosil 100-7 C18 HD, a nanesie sa na neho 130 mg zmesi pluraflavínov získaných podlá príkladu 5. Elúcia sa uskutočňuje s použitím 10 % acetonitrilu a 0,1 M vodného roztoku octanu amónneho. Prietok stĺpcom je 50 ml/min a odoberajú sa 50 ml frakcie. Frakcia 6 obsahovala pluraflavin E, pluraflavin C bol vo frakciách 12 až 17, pluraflavín B bol vo frakciách 25 až 27 a pluraflavin A bol vo frakciách 35 až 37. Po zahustení pri zníženom tlaku a mrazovej sublimácii sa získali nasledujúce množstvá:

pluraflavin	A:	22	mg,	ESI+MS:	823	Da	(M+H)⁺,
pluraflavin	B:	18	mg,	ESI+MS:	841	Da	(M+H)⁺,
pluraflavin	C:	11	mg,	ESI+MS:	974	Da	(M+H)⁺,
pluraflavin	E:	5	mg,	ESI+MS:	712	Da	(M+H)⁺.

Príklad 7

Konečné čistenie pluraflavínu A a trifluóroctovou.

prevedenie na soľ s kyselinou podlá v 10 príkladu 6, sa % acetonitrile na 2,8 a

Frakcie 35 až 37, pripravené vej sublimácii (22 mg) rozpustia Kyselinou trifluóroctovou sa upraví pH stĺpec 250/10 LiChrospher RP-18e (5 pm)®. Elúcia s použitím 0,05 % vodnej kyseliny trifluóroctovej acetonitrile. Zahustením pri zníženom tlaku a ciou sa získa 18 mg pluraflavínu A vo forme trifluóroctovou.

Priklad 8

Identifikácia pluraflavínu A.

Vzhľad: sýto žltá látka, ktorá je rozpustná nických rozpúšťadlách, ale málo rozpustná vo s kyselinou trálnom a v prostredí a

PO vo mrazol vode.

nanesie sa na sa uskutočňuje v 11 až 22 % mrazovou sublimásoli s kyselinou v polárnych orgavode. Adičná soľ je rozpustná vo vode. Zlúčenina je stabilná v neumierne kyslom prostredí, ale nestabilná v alkalickom v silno kyslom prostredí.

(JV-Maximá: 214, 243, 270 (inflex) , 290 (inflex) ,

426 nm v zmesi voda/acetonitril (8:2), pH 2 a 214, 243, 270 v zmesi voda/acetonitril (6:4),

3424, 1680, 1600,

721 cm^-1

1464, 1427, 1300, 1203,

1131, 1066, 1009, 801,

Hmotnostnou spektrometriou s našla nasledujúca molekulová hmotnosť vysokým rozlíšením sa (M+H): 823,370631 Da, pluraflavin A zodpovedajúca empirickému vzorcu pre

Elektrón sprej ionozácia (ESI, pozitívna) poskytla, MS/MS fragmentácie, nasledujúce ióny: 823, 693, 680,

C43H54N2O14.

s použitím

550, 480,

390, 320, 144 a 131 Da.

NMR signály: pozri Tabuľka 1.

Tabuľka 1 ³H a ¹³C chemické posuny pluraflavínu A v metanole-d4 a DMSO-dg pri 300°K.

	Metanol-d₄	DMSO-de
poloha	¹³C	^XH	ⁱ³C
	δ(ppm)	δ (ppm)	δ(ppm)	δ(ppm)
2	168,39	-	165,62	-
3	111,95	6,37 s	110,39	6,27 s
4	180,25	-	177,56
5	150,44	-	148,22	-
6	121,34	8,61 s	119,05	8,43 s
6a	138,34	-	136,28	-
7	182,68	-	181,12	-
7a	133,23	-	131,18	-
8	120,05	7,86 d	118,29	7,78 d
9	135,63	7,90 d	134,41	7,87 d
10	137,35	-	135,79	-
11	161,06	-	159,39	-
11-OH	-	-	-	13,38 s, š.
11a	118,14	-	116,43	-
12	. 189,12	-	187,39	-
12a	122,00	-	120,35	-
12b	157,66	-	155,50	-
13	70,83	5,38 d,5,63 d	68,48	5,30 d,5,51 d
14	61, 17	-	59,35	-
15	63, 69	3,41 q '	61,61	3,48 q
16	20,24	1,92 s	19,32	1,86 s
17	13,69	1,27 d	12,93	1,22 d
1'	98,90	5,04 dd	96,57	5,06 d, š
2 '	37,24	2,05, 2,12	35,50	1,87, 1,95
3'	58,32	-	56, 33	-
3 'Me	24,57	1,50 s		1,35 s
3'NH₂	-	-	-	8,16 s, š

	Metanol-d<;	DMSO-d₆
poloha	^1JC δ(ppm)	^XH δ(ppm)	^iJC δ(ppm)	δ(ppm)
4 '	71,15	3,27 s, š	68,65	3,17 d
4'-OH	-	-	-	5,47 d
5'	70,44	4,00 q	68,19	4,01 q
6'	17,21	1,34 d	16,75	1, 18 d
2	28,00 š	2,48 m, 2,91 m, š		2,35 š, 2,78 š
3	65, 19	3,45m, š	62,19	3, 43 š

3NMe	43,24 š, 41,65 š	3,05 š, 3,05 š	42,14, 39,25	2,89, 2,97
3NH⁺	-			8, 78 š
4	75,13	4,32 s, š	71,88	4,20 s, š
5	72,55	3,97 q, š	70,22	3,75 q, š
6	18,09	1,40 d	17,54	l,28d
-]_///	101,39	5,24 m, š	98,89	5,11 š
2 f	33, 40	2,05, 2,10	32,07	1,75, 1,92
₃,	66,61	4,12 m	64,17	3,96 m, š
y -oh	-		-	4,70 s, š
4/	71,98	3,67	70,13	3,45 š
4'-OH	-	-	-	4,44 s, š
5'	69, 52	4,16 q. š	67,05	4,10 q, š
6'	17,51	1,28 d	16, 94	1, lOd

Pre aldohexózy .sú pozorované účinky NOE v súhlase s relatívnou SRSS alebo RSRR stereochémiou na chirálnych centrách ľ, 3', 4', 5' (pozri H-III). To zodpovedá C-3 epiméru vankozamínu.

Relatívna stereochémia

H-III Relatívna stereochémia hexózy III

NOE účinky pozorované pre hexózu II uprednostňujú relatívnu stereochémiu RSSS alebo SRRR pre chirálne centrá 1'', 3'', 4'', 5'' (pozri H-II).

Relatívna stereochémia

H-II Relatívna stereochémia hexózy II

Rovnaká relatívna stereochémia (RSSS, SRRR) pre asymetrické atómy uhlíka ľ'', 3''', 4''',

5''' je v súhlase s detegovaným

NOE pre hexózu I (pozri H-I).

H-I Relatívna

Relatívna stereochémia hexózy I

Príklad 9

Identifikácia pluraflavínu B.

Vzhľad: tmavo žltá pevná látka, ktorá je rozpustná v polárnych organických rozpúšťadlách, ale iba málo rozpustná vo vode. Adičná sol s kyselinou je rozpustná vo vode. Zlúčenina je stabilná v neutrálnom prostredí a v slabo ‘kyslom prostredí, ale je nestabilná v alkalickom rozmedzí pH.

UV-Maximá: 214, 243, 270 (inflex) , 290 (inflex), 426 nm v zmesi voda/aceťonitril (8:2), pH 2 a 214, 243, 270 (inflex), 290 (inflex) a 426 nm v zmesi voda/acetonitril (6:4) pH 7.

Pluraflavín B má empirický vzorec C43H56N2O15, molekulovú hmotnosť

840,9 Da.

NMR signály: pozri Tabulka 2.

Tabuľka 2 ³H a ¹³C chemické posuny pluraflavinu B v metanole-d₄ a porovnanie s pluraflavinom A pri teplote 300°K.

	pluraflavín	B (metanol-d₄)	pluraflavín A	(metanol-d₄)
poloha	^1JC		^r^C ,	^XH
	δ(ppm)	δ(ppm)	δ(ppm)	δ(ppm)
2	176,38	-	168,39	-
3	111,10	6,73 s	111,95	6,37 s
4	181,26	-	180,25	-
4a	125,96	-	126,08	-
5	150,43	-	150,44	-
6	121,03	8,52 s	121,34	8,61 s
6a	138,12	-	138,34	-
7a	133,16	-	133,23	-
8	120,04	7,81 d	120,05	7, 86 d
9	135,52	7,83 d	135,63	7,90 d
10	137,44	-	137,35	-
11	161,02	-	161,06	-
11-OH	-	-	-	-
11a	118,01	-	118,14	-
12	189,24	-	189,12	-
12a	121,89	-	122,00	-
12b	157,41	-	157,66	-
13	70, 83	5,36d, 5,60d	70,83	5,38d, 5,63d
14	77, 67	-	61, 17	-
15	72,61	4,40 q	63, 69	3,41 q
16	23,90	1, 67 s	20,24	1,92
17	17,00	1,35 d	13,69	1,27 d
1'	98,87	5,05 dd	98,90	5,04 dd
2'	37,20	2,09 m	37,24	2,05, 2,12
3'	58,39	-	58,32	-
3 ' Me	24,45	1,51 s	24,57	1,50 s
3 'NH₂	-	-	-	-

	pluraflavín	B (metanol-d₄)	pluraflavín A	(metanol-d₄)
poloha		^XH	^iJC	^rH
	δ(ppm)	δ(ppm)	δ(ppm)	δ(ppm)
4 '	71,08	3,29 s, š	71, 15	3,27 s, š
4 ΌΗ	-	-	-	-
5'	70, 42	4,01 q	70,44	4,00 q
6'	17,19	1,33 d	17,21	1,34 d
1	70,13	5,48 t	70,23	5,51 t
2	27,74	2,50m, 2,88	28,00 š	1,48 m, 2,91
		m		m, š
3	65,14	3,46 m	65, 19	3,45m, š

3NH⁺	-	-	-
4	75, 02	4,32 s, š	75, 13	4,32 s, š
5	72,61	3,97 q, š	72,55	3,97 q š
6	18,15	1,39 d	18,09	1,40
ľ	101,38	5,24 m,š	101,39	5,24m, š
2^{/f f}	33,42	2,07	33, 40	2,05, 2,10
3'	66, 59	4,13 m	66,61	4,12 m
3'-OH	-	-	-	-
4'	71,97	3,67 š	71,98	3, 67
4'-OH	-	-	-	-
5'	69,52	4,16 q, š	69,52	4,16 q, š
6'	17,49	1,27. d	17,51	1,28 d

Príklad 10

Konečné čistenie pluraflavínu E.

Frakcia 6, získaná podlá príkladu 6 sa po mrazovej sublimácii (5 mg) rozpustí v 10 % acetonitrile vo vode a kyselinou trifluóroctovou sa upraví pH na 2,8, potom sa naleje na 250/10 LiChrospher RP-18e (5 pm)® stĺpec. Elúcia sa uskutočňuje použitím 0,05 % vodnej kyseliny trifluóroctovej v gradiente od 11 do 22 % acetonitrilu. Zahustením pri zníženom tlaku a mrazovou sublimáciou sa získa 2,7 mg soli pluraflavinu E s trifluóroctovou kyselinou.

Príklad 11

Identifikácia pluraflavinu E.

Vzhlad: tmavo žltá pevná látka, ktorá je rozpustná v polárnych organických rozpúšťadlách, a iba ťažko rozpustná vo vode. Adičná soľ s kyselinou je rozpustná vo vode. Zlúčenina je stabilná v neutrálnom a v slabo kyslom prostredí, ale je nestála v alkalickom prostredí a v silno kyslom prostredí.

UV-Maximá: 213, 244 , 270 (inflex) , 290 (inflex) , 426 nm v zmesi voda/acetonitril (8:2), pH 2 a 213, 244, 270 (inflex), 290 (inflex) a 426 nm v zmesi voda/acetonitril (6:4), pH 7.

Hmotnostnou spektrometriou sa zistila molekulová hmotnosť pre (M+H)⁺: 712 Da, zodpovedajúca empirickému vzorcu C₃₆H₄₁NOi₄ pre pluraflavin E.

NMR signály sú uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 3 ¹H a ¹³C chemické posuny pluraflavinu E v metanole-d₄ pri teplote 300°K.

poloha	¹³C δ (ppm)	δ(ppm)
2	176,48	-
3	110,30	6, 69 s
4	178,39	- .
4a	124,69	-
5	149,56	-
6	121,17	7, 92 s
6a	138,95	-
7	182,40	-
7a	133,21	-

poloha	¹³C δ (ppm)	^ľH δ(ppm)
8	119,82	7,60 d
9	135,61	7,74 d
10	137,04	-
11	161,33	-
11-OH	-
11a	118,04	-
12	189,21	-
12a	121,59	-
12b	156,86	-
13	175,28	-
14	77,69	-
15	72,61	4,35 q
16	23,78	1,62 s
17	17,09	1,31 d
1	70,34	5,46 dd
2	27,35	2,86m, 2,44m
3	64,88	3,50 m
3NMe	42,5 š	3,08
3NH⁺	-	-
4	75,22	4,30 s, š
5	72,29	3,87 q, š
6	18,25	1,35 d
ľ	101,40	5,23 m
2 ľ	33,43	2,08 m, 2,06 m
3'	66, 61	4,12 ml'
3'-OH	-	-
4 >	72,03	3, 67 s, š
M -OH	-	-
5'	69,50	4,17 q, š
6’	17,52	1,28 d

Príklad 12 (a) Štúdium cytostatickej aktivity

Na stanovenie cytostatickej aktivity sa použijú bunky hepatómu potkanov získané z kmeňa zo zbierky Američan Type Culture Collection pod číslom ATCC CRL-1548, Jo No. 223 a 228. Kmeň sa udržiava na médiu „MEM (EAGLE) s Glutamax [GIBCO BRL No. 4109-028] s 10 % teľacím plodovým sérom [GIBCO BRL No. 10270-106] a 10 μΐ zmesi penicilínu a streptomycínu [GIBCO BRL No. 15140-114]/ml. Použijú sa 96-jamkové mikrotitračné platne [Greiner, No. 15140-114]. Každá jamka sa najskôr, naplní 140 μΐ roztoku živného média a v každom prípade sa naočkuje 215 000 bunkami. Platne sa potom inkubujú pri 37 °C a v atmosfére 5 % CO₂ počas 20-24 hodín. Dopredu sa pripraví séria riedení pluraflavínov s koncentráciami 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125,

1,5625, 0,7813, 0,3906, 0,195, 0,094, 0,047 a 0 μΜ, a pipetujú sa v zodpovedajúcom poradí. Po ďalšej inkubácii 22 hodín pri 37°C v atmosfére 5 % CO2, sa kvapalné médium odsaje. Zvyšné bunky sa zafarbia 100 μΐ RPMI 1640 [GIBCO BRL No. 32404-014]/ na jamku a 20 μΐ Celí Titer 96 Aqueous [PROMEGA No. G5430]/ na jamku. Priamo po pridaní sa meria absorpcia svetla pri 590 nm a potom 2 hodiny po inkubácii, ako bolo uvedené pred týmto. Cytostatický účinok sa vypočíta zo zmeny vo svetelnej absorpcii.

IC50 pre pluraflavín A = < 50 nM;

IC50 pre pluraflavín B = < 50 nM.

(b) Antiproliferačné účinky pluraflavínu A a flavopiridolu na vybrané nádorové bunkové línie.

MTT, vo vode rozpustná tetrazóliová soľ, sa prevedie na nerozpustný purpulový formazán pri rozpustení štiepením tetrazóliového kruhu enzýmami dehydrogenáz v aktívnych mitochondriách.

Mŕtve bunky túto zmenu nespôsobia. Táto metóda sa používa na kvantitatívne rozmnožovanie, aby sa stanovila aktivita poten35 ciálnych chemoterapeutických zlúčenín.

Všetky bunky sa udržiavajú v RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, Md) obsahujúcom 10 % teplom deaktivovaného plodového hovädzieho séra penicilín/streptomycín a obohateného L-glu-

tamínom.

Bunky sa nanesú na 96-jamkové platne pre tkanivové

kultúry s nasledujúcimi hustotami:

prsia	2500 buniek/jamka
prostata	2600 buniek/jamka

hrubé črevo 1000 buniek/jamka

pľúca

1000 buniek/jamka

Bunky sa nechajú priľnúť cez noc pri 37°C, 5 % CO₂.

Pluraflavín A sa zriedi v živnom médiu na nasledujúce konečné koncentrácie zlúčeniny: 50,0, 16,67, 5,56, 1,85, 0,617,

0,206, 0,069, 0,023 μΜ. Flavopiridol sa zriedi na koncentrácie:

2,0, 0,222, 0,074, 0,025, 0,008, 0,003, 0,001 μΜ. Obidve zlúčeniny sa testujú v troch opakovaniach vo všetkých koncentráciách. Bunky sa premyjú čerstvým médiom a zlúčeniny sa pridajú k bunkám na konečný objem 100 μΐ. Bunky plus zlúčeniny sa nechajú inkubovať pri 37°C, 5 % CO₂ približne počas 72 hodín.

V určenej dobe sa pridá do každej jamky 25 μΐ MTT (10 mg/ml v HBSS) . Platne sa inkubujú pri 37°C počas 2 až 4 hodín. MTT a médiá sa odstránia a pridá sa 200 μΐ DMSO na jamku. Dáta sa snímajú pri 570 nm a výsledky sú uvedené ďalej:

Bunky	Pluraflavín A IC50	Flavopiridol IC50
prsia	< 23 nM	90 nM
prostata	10 nM	80 nM
hrubé črevo	0,35 nM	30 nM
pľúca	3,0 nM	90 nM

V teste na mäkkom agare sa pluraflavín A flavopiridol testovali na bunky leukémie.

Hodnoty IC50 boli: 60 nM (pluraflavín A) a 0,5, 0,6 μΜ (flavopiridol).

Claims

1. Zlúčenina všeobecného vzorca I v ktorom

R¹ je zvyšok cukru,

R² je karboxylová skupina alebo skupina -CH2-O-(R⁷) m, v ktorej R⁷ je zvyšok cukru,

R³ je substituent vybraný zo skupiny zahŕňajúcej skupiny obsahujúce epoxidový zvyšok, alkylové skupiny s 1 až 6 atómmi uhlíka, alkenylové skupiny s 2 až 6 atómmi uhlíka, kde tieto alkylové skupiny a alkenylové skupiny sú prípadne substituované aspoň jednou hydroxylovou skupinou,

R⁵ je substituent vybraný zo skupiny zahŕňajúcej atóm vodíka, alkylové skupiny s 1 až 6 atómmi uhlíka, alkenylové skupiny s 2 až 6 atómmi uhlíka a alkinylové skupiny s 2 až 6 atómmi uhlíka,

R⁴, R⁶, R⁸ a R¹⁰ sú substituenty nezávisle od seba vybrané zo skupiny zahŕňajúcej a.tóm vodíka, alkylové skupiny s 1 až 6 atómmi uhlíka, alkenylové skupiny s 2 až 6 atómmi uhlíka, alkinylové skupiny s 2 až 6 atómmi uhlíka, skupinu -X²H, kde atóm vodíka sa priamo viaže na prvý atóm z X², a skupinu -X²R¹², kde substituent R¹² sa priamo viaže na prvý atóm z X²a prípadne R⁴ a R⁶ spolu tvoria dvojitou väzbou viazaný substituent -X², prípadne R⁸ a R¹⁰ spolu tvoria dvojitou väzbou viazaný substituent -X², kde každý zo substltuentov X² je nezávisle od seba vybraný zo skupiny zahŕňajúcej atóm kyslíka, skupiny NH, N-alkyl s 1 až 6 atómmi uhlíka, skupiny N-alkenyl s 2 až 6 atómmi uhlíka, skupiny N-alkinyl s 2 až 6 atómmi uhlíka alebo atómy síry, a kde R¹² sú nezávisle od seba vybrané zo skupiny zahŕňajúcej alkylové skupiny s 1 až 6 atómmi uhlíka, alkenylové skupiny s 2 až 6 atómmi uhlíka, alkinylové skupiny s 2 až 6 atómmi uhlíka, arylové skupiny a acylové skupiny a m a n sú od seba nezávisle 1 alebo 2, vo všetkých ich stereoizomérnych formách a v zmesiach týchto foriem v ľubovoľných pomeroch a jej fyziologicky prijateľné soli a deriváty.

2. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorom R^{6 7} je aminocukor.

3. Zlúčenina podľa nároku 1 alebo 2, v ktorom R⁷ je substituent vzorca

OH

4. Zlúčenina podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 3, v ktorom n je 2.

5. Zlúčenina podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 4, v ktorom R¹ je aminocukor.

6. Zlúčenina podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 5, v ktorom R¹ je substituent vzorca

7. Zlúčenina podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, v ktorom substituent R³ je vybraný zo skupín (IA) vo všetkých jej stereoizomérnych formách a v foriem v ľubovoľných pomeroch a jej fyziologicky a deriváty) zmesiach týchto prijateľné soli

9. Zlúčenina podľa nároku 1, vzorca IB (ΙΒ) vo všetkých jej stereoizomérnych formách a v zmesiach týchto foriem v ľubovoľných pomeroch a jej fyziologicky prijateľné soli a deriváty.

10.

Zlúčenina podľa nároku 1, vzorca IE (IE) vo všetkých jej stereoizomérnych formách a v zmesiach týchto foriem v ľubovoľných pomeroch a jej fyziologicky prijateľné soli a deriváty.

11. Zlúčenina všeobecného vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, ziskateľná kultiváciou Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931, alebo jedného z jeho variantov alebo mutantov pri vhodných podmienkach v živnom médiu, až kým je v živnom médiu prítomná aspoň jedna zlúčenina všeobecného vzorca I, a následnou izoláciou zlúčeniny.

12. Zlúčenina podľa nároku 11, kde sa izolovaná zlúčenina ďalej prevedie na aspoň jeden z derivátov a fyziologicky prijateľné soli.

13. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň jednu zlúčeninu všeobecného vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, alebo jej fyziologicky prijateľnú sol alebo derivát a prijateľný nosič.

14. Kompozícia podľa nároku 13, vyznačujúca sa tým, že týmto prijateľným nosičom je farmaceutický prijateľný nosič.

15. Spôsob prípravy aspoň jednej zo zlúčenín všeobecného vzorca I alebo jej fyziologicky prijateľnej soli podľa nároku 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje mikroorganizmus Actinomycetales druh HAG 003959, DSM 12931, alebo jeden z jeho variantov alebo mutantov, pri vhodných podmienkach v živnom médiu, až kým je v živnom médiu prítomná aspoň jedna zo zlúčenín všeobecného vzorca I, potom sa zlúčenina izoluje.

16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že sa izolovaná zlúčenina ďalej prevedie na aspoň jednu zlúčeninu vybranú z derivátov a fyziologicky prijateľných solí.

17. Spôsob podľa nároku 15 alebo 16, vyznačujúci sa tým, že sa kultivácia uskutočňuje v aeróbnych podmienkach pri teplote medzi 18 a 35°C a pri pH medzi 6 a 8.

18. Spôsob podľa nároku 15 až 17, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca I prevedie na jej derivát použitím redukčného činidla.

19. Zlúčenina všeobecného vzorca (I) podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 alebo jej fyziologicky prijateľná soľ alebo derivát na použitie na inhibíciu transkripcie aspoň jednej dvoj vláknovéj nukleovej kyseliny.

20. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 alebo jej fyziologicky prijateľnej soli alebo derivátu na prípravu cytostatika.

21. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 12 alebo jej fyziologicky prijateľnej soli a'lebo derivátu na prípravu liečiva na liečenie tumorov hrubého čreva.

22. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 12 alebo jej fyziologicky prijateľnej soli alebo derivátu na prípravu liečiva na liečenie tumorov prsníka.

23. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 alebo jej fyziologicky prijateľnej soli alebo derivátu na prípravu liečiva na liečenie tumorov pľúc.

24. Použitie aspoň jednej zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 12 alebo jej fyziologicky prijateľnej soli alebo derivátu na prípravu liečiva na liečenie nádorov prostaty.

25. Použitie aspoň jednej zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 alebo jej fyziologicky prijateľnej soli alebo derivátu na prípravu liečiva na liečenie leukémie.

26. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 12 alebo jej fyziologicky prijateľnej soli alebo derivátu na prípravu liečiva na liečenie mikrobiálnych infekcií.

27. Actinomycetales druh HAG 003959, (DSM 12931).