HU228332B1

HU228332B1 - Pluraflavins and derivatives thereof, process for their preparation and use thereof

Info

Publication number: HU228332B1
Application number: HU0204393A
Authority: HU
Inventors: Laszlo Vertesy; Klaus Ehrlich; Martin Knauf; Joachim Wink; Francis P Barbone; Elaine A Powers; Elizabeth A Cashman
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2013-03-28
Also published as: US20020028921A1; WO2001060832A2; HUP0204393A3; HUP0204393A2; BR0108128A; DE60101313T2; US6500936B2; DK1259523T3; NO20023845D0; AU2001242404B2; SK286691B6; NO20023845L; MXPA02006919A; EP1125944A1; PL204842B1; AR027436A1; SI1259523T1; HRP20020672B1; ME00179B; YU57602A

Description

PLUKAELAVINOK ES SZÁRMAZÉKAIK, ELŐÁLLÍTÁSUK ÉS ALKALMAZÁSUK

M¥0MBÁPÉ10ÁN<

A találmány (I) általános képletű új vegyületekre vonatkozik, a képletben R_}, Rj, R.₃,. R₄, R₅, R_ös Rg, R_í0 és n jelentése az alábbiakban megadott. Áz (í) általános képletű vegyületek a transzkriptáz enzimet gátolják, citotoxikus hatással rendelkeznek, és különösen alkalmasak tumor kezelésére.. Az (I) általános képletű vegyületek az Aetinomycetales HÁG 003959, DSM 12931 törzs tenyészetben történő szaporításával állíthatók, elő. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi az (I) általános képletű vegyületek előállítására szolgáló eljárás, a vegyületek alkalmazása rossziudulatü rendel lenességek és a transzkrlptáz gátlással kezelhető betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerek, előállítására, és gyógyászati készítmény, amely legalább egy (I) általános képletű vegyületet tartalmaz.

A rák emberben és állatban előforduló olyan betegség, amely a legtöbb esetben fatális és amelyet általában az endogén sejtek szabályozatlan növekedése okoz. Rák alatt értjük a rosszindulű tumorok képződését, a daganatok (tumorok és kardnómák) képződését vagy a fehérvérsejtek rosszindulatú degenerációját és fejlődési zavarát (leukémia), A rákos vagy tumorsejtek általában az endogén sejtek transzformálásával alakulnak ki.

97252-9449 Sí 'ϊ

A rákos sejt rosszindulatú volta a növekedés

χ « Φ*χ » 9 ♦ *<» »«* » * « χ χ * « »Χ Φ* X* ♦»*

fejeződik ki, azaz abban a képességben, hogy gátoíatlanul és a szervrendszerbe való integrálódás nélkül növekedik, és beszűrődik a szövet elpusztítása közben, A rosszindulatúság biztos jele a metasztázlsok kialakulása messze a tumortól, a tumorsejtek hematogén vagy Hm fogén szétszóródása után, A rák a leggyakoribb halálozási ok emberben, ezért óriási szükség van olyan eljárásokra és gyógyszerekre, amelyek a rosszindulatú elváltozások gyógyítására vagy kezelésére alkalmasak,

A tumor sebészeti eltávolítása, mint. radikális rnee,közelítés mellett a rosszindulatú tumorok terápiájának, egyéb alternatívái közé tartozik a tadkuerápia röntgensugárral, α-, 6- vagy γ-sugarakkal, az immunterápia és a kemoterápia- Ezidáig az immunterápia alkalmazása korlátozott. A tumorok kemoterápiája sejt toxinok (eitosztatikumok) adagolását jelenti a tumorok, és a lokális sebészeti kezelés vagy besugárzás után általában még megmaradó tumoros sejtek kezelése céljából. Ezek az anyagok specifikusan a sejtosztódás bizonyos folyamataiba avatkoznak be úgy, hogy a túlnyomórészt osztódó sejtekkel rendelkező szőpetöans gyorsan növekedő tumorszövet reagál érzékenyen, Áz alkalmazott szerek közé tartoznak az alkilezőveer gyületek,, például a clklofoszfamld (The Merck, index, 12. kiadás, 463. oldal), az antimetabolitok, például a metotrexát (The Merek Index, 12. kiadás, 1025. oldal), az alkaloidok, például a vinkrisztin (The Merck Index, 12. kiadás, 1704. oldal) és az antibiotikumok, például a daunonncin (The Merck Index, 12, kiadás, 479. oldal) és az adriannein (The Merck Index, 12. kiadás, 581-582, oldal). Azonban erős mellékhatásaik miatt a fenti * » szerek mindegyike jelentős hátránnyal bír, így a beteg halála legtöbb esetben -csak késleltethető,, de nem akadályozható meg. Ezenkívül a degenerált (rákos) sejtek rezísztenssé válnak az alkalmazott szerekkel szemben; ebben az esetben a hagyományos gyógyszerek már nem rendelkeznek citosztatikus hatással, viszont mellékhatásaik miatt toxikusak. Ezenkívül kimutatták azt is, hogy a eítosztatíkumok kombinált és/vagy szekvenciális alkalmazása meghaladja az egyes citosztatikumok aktivitását (monoterápia), és ezért lehetséges az, hogy a políkemoterápia esetén a jelentős mellékhatások nem additívak. A fenti okok miatt új kemoterápeutiknmokra van szükség, és így ezeket v i 1 ágsz-erte kutatják.

Meglepő módon azt találtuk, hogy az Actinomycetales species HÁG 003959, DSM 12931 mikroorganizmus törzs nagyon hatékony, új citosztatikumokat képes előállítani, amelyek nagyon alacsony koncentrációkban- gátolják a sejtnövekedést. A. továbbiakban ezeket az új vegyületeket pluraflavinoknak nevezzük, és ezek a pluraflavín-származékokkal együtt a találmány egyik tárgyát képezik, A pluraflavinok antibiotikumok, amelyek egy p-kinoid -gyűrövázat és különféle cukor építőköveket tartalmaznak. Ezek a vegyületek a transzkripciót gátolják azáltal, hogy interkalálódnak a nukleinsav kettős szálai közé. és adott esetben alkileznek is. Á gyürüvázat először S. Kondo és munkatársai írták le [Journal of Antíbiotícs 30, 1143-1145 (1977)] a pluramicin részeként. Később ezt a gyűrűvázat számos antibiotikumban megtalálták; a píuramieínen és a neopluramicinen kívül szerkezetileg rokon vegyi! létként ismertek még a szaptom.iei.nek (N. Abe és munkatársai, J. Antihíoties 46, 1536-1549 (1.993)], micin [Y. Sato és munkatársai, J. Antíbíotícs 42, 149 0989)}, a kídamicin [N, Kanáa és munkatársai, J. Antibioties 24, 599 (1971)], a bedamicin [U, Sequin és munkatársai, Tetrahedron 34, 761 (1 978)] és az altromicinek [G. M, Brill és munkatársai, 3„ AníibÍOtics 43, .229-237 (1990)}, A technika állásáismert anyagok gyakran rendelkeznek hátrányokkal, ami a nem seíegito 'konysag toxicitásban és/vagy a nemkívánatos mellékhatásokban nyilvánul meg.

	Fentieknek nr	‘gfelelően a
kép	letü vegyületek	- a képlet bei
R:	jelentése c	okotcsoport.
R₂	jelentése -	COOH vagy
	cukoré sop	őrt.
Rí	ielentése	epo x id tártál

alkilcsoport vagy 2-6 szénatomos alkenücsoport, ahol a fenti alk ί 1 - és alkenücsoport adott esetben legalább egy OH csoporttal van szubsztituálva,

R_s jelentése H, 1-6 szénatomos alkilcsoport, 2-6 szénatomos alkenücsoport vagy 2-6 szénatomos alkinücsoport,

R₄, R₆, R₈ és Rj₀ jelentése egymástól függetlenül H, 1-6 szénatomos alkilcsoport, 2-6 szénatomos alkenücsoport, 2-6 szénatomos alkinücsoport, -X?.H vagy -X₂R.}₂ általános képletű csoport, vagy

R₄ és R* és/vagy R_s és jelentése együtt. ~X₂,

X₂ jelentése O, MH, -N-(l-6 szénatomos alkil), -N-(2~6 szénatomos alkenii), -N-{2-6 szén atomos alkinü) csoport vagy S,

Rj₂ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, 2-6 szénatomos alkendcsoport, 2-6 szénatomos alkiniksoport, árucsoport vagy acdcsoporí, és m és n értéke egymástól függetlenül 1 vagy 2 -, valamint ezek összes sztereokémiái formája és a fenti formák tetszőleges arányú elegyeí, és ezek fiziológiásán elfogadható sói képe:

Az (I) általános képletben az 1-6 szénatomos alkilesöpört egyenes vagy elágazó láncú, 1-6 szénatomot tartalmazó alkilesoportot, például metd-, etil--, izopropi!-, tere-butü- vagy h e x i 1 c s ο ρ o r t o t j e 1 e n t.

A 2-6 szénatomos alkenllesoport egyenes vagy elágazó láncú, 2-6 szénatomot tartalmazó alkendcsoport, például allil-, krotd- vagy pentendcsoport lehet.

A 2-6 szénatomos alkinilesoport egyenes vagy elágazó láncú, 2-6 szénatomot tartalmazó alkinilesoport, például propinil-, butínií- vagy pentinílesoport lehet.

Az arilcsöpört egy aromás gyurnszerkezetet jelent, például feni!-, benzü- vagy 1- vagy 2-naftiÍ-csoporiot. Az arilcsoport adott esetben szuhsztituálva lehet például halogénatommal, így például klór-, bróm-, fíuorafommal, 1-4 szénatomos alkilcsoporttal, például metilcsoporttal, hldroxdcsoporttal, 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal, például metoxícsöporttal és/vagy trífluormetdcsoporttaL

Az acíksoport alifás vagy aromás aeilcsoport lehet. Az alifás aeílesöpört 1-7 szénatomot, előnyösen 1-4 szénatomot tartalmaz, Ilyen például a forrni!-, acetd-, propioníl·-, butird-, hexánod-, akríloik, krotonod-, propíolodesoport, amely szubszhtuálva. lehet például halogénatommal, így például klór-, ♦ φ bróm-, fluoratommul, aminocsoporttal és/vagy 1.-4 szénatomot tartalmazó alkilamínocsoporttal, például metil- vagy etilaminocsoporttal. Az aromás ae [lesöpört például benzol1- vagy naítoíicsoport lehet, amely szintén szubsztituálva lehet például halogénatommal, így például klór-, bróm-, fiuoratoromai, 1-4 szénatomos aikilesoporttal, például metilcsoporttal, hidroxilcsoporttah amínocsöporttal, például etilamínocsoporttal, vagy 1-7 szénatomos alkoxicsoporttal, például 1-4 szénatomos aik.oxicsoporttal, így például metoxícsoporttal,

A cukor (R|/R₇) egy monoszacharid. (η ~ 1) vagy egy díszacharld (n — 2), ahol a két monoszacharid egység glikozides kötéssel kapcsolódik. A monoszacharid lehet egy hexóz (CftHnOs), például aldohexóz, így például D—(+):-glükóz:» D(A)-mannóz vagy D-(r)~gaíaktőz, A monoszacharid egymástól függetlenül H, OH, NH?, -NH(alkil), -NCalkíí)?, alkíl- és alkoxíesoporttal lehet mono-, di~ vagy triszubsztitulva, ahol a monoszaeharíd H és/vagy OH csoportja lehet adott esetben szubsztituenssel helyettesítve. A fent említett „cukor’ kifejezés magában foglalja az aminocukrokat is, Ámmocukornak nevezzük azt a monoszacharídot vagy dlszacharidot, amely adott esetben a fentiek szerint van szubsztituálva, és amelyben a mono- vagy díszacharid legalább egy OH vagy H csoportját egy aminoesoport, például NHi, N.H(alkíl) vagy M(alkil)2 csoport helyettesíti.

Egyik kiviiorli alakban m értéke 1,

R₇ jelentése lehet (fi) általános képletü am.inocukor-e.so~ port, ahol R_u, R₅₄, R_!6, Rra, &22>· &24> &2β és R_2S jelentése egymástól függetlenül H, OH, NHj, NH(alkit), N(alkil);> vagy alkoxiesoport, ahol az alkíl- és alkoxiesoport 1-4 szénatomot < « tartalmaz,

1-4 szénatomos aikilcsoportra példa a metil-, etil-, propíl-, izobutil- és bütilesoport, főleg metílcsoport, az 1-4 szénatomom alkoxíesoportra példa a metoxi-, etoxi-, izopropoxi- vagy bu~ toxi csoport, külön ősén metox i c söpört,

R? lehet (ÍJA) általános képletű aminoenkor-csoport is.

Rí jelentése szintén lehet aminocukor. Egyik kiviteli alakban n értéke 2,

Rf jelentése lehet (ΠΙ) általános képletű csoport, ahol R_5Ö Ra# jelentése egymástól függetlenül H, OH, NH₂, RH(alkil), N(alkií)₂ vagy O-alkil, ahol alkil jelentése í-4 szénatomos csoport, például metil-, etil-, propíl-, íxohutil- vagy bütilesoport, különösen metílcsoport, és O-alk.il jelentése 1-4 szénatomos alköxicsopori, például metoxi-, etoxi-, izopropoxi- vagy butoxícsoport, főleg metoxicsoport.

Egyik kivitelt alakban Rj jelentése (IIIA) képletű csoport.

R_3; egyik jelentése epoxid-tartalmú csoport lehet. Az epoxid-tartalmú csoport egyenes vagy elágazó szénláncú alkilvagy aikenilcsoport lehet, amely 2-12 szénatomot tartalmaz, például 2-6 szénatomot, amely egy vagy két epoxid-gyűrüt tartalmaz (oxiránok).. Lehetséges példák az (a), (bj és a (c) képiéin csoport.

R₃ jelentése epoxid-tartalmú csoporton kívül lehet egyenes láncú vagy elágazó 1-12 szénatomos alkilcsoport, például 1-6 szénatomos alkilcsoport, így például metil-, etil-, izepropil-, terc-butil-, hexíicsoport, vagy például okt.il- vagy dodeeílcsoport, vagy egyenes láncú vagy elágazó 2-12 szénatomos aikeniicsoport, például 2-6 szénatomos aikenilcsoport, igy például ♦ χ* allil-, krotil-, penteniícsoport és dodeeenílesöpört is. ahol a fenti alkil- vagy aikenilesoportok például hídroxilcsoporttal lehetnek mono- vagy poliszubsztituálva, így például di- vagy triszubsztítuálva.

Ennek megfelelően a találmány tárgyát az (ÍA) képletű pluraflavin A, az (IB) képletű pluraflavin B és a?: (1E) képletű pluraflavin E képezi, ahol hexóz I jelentése 2-6 szénatomos didezoxialdohexóz, hexóz H jelentése 2,3,ó-tridezoxi-3-dimetiIaminohexóz és hexóz ΙΠ jelentése 2,3,6-tridezoxi~3~amino--3~ metiiaidohexóz, valamint ezek összes sztereokémiái formája és a fenti formák tetszőleges arányú elegyei, továbbá fiziológiailag elfogadható sói.

Egyik kiviteli alakban a vegyületeket olyan (ΙΑ), (IB) és (LE) képletű vegyületek közül választjuk, amelyekben hexóz 1 jelentése ollóz, hexóz II jelentése rodozamin és hexóz III jelentése 3 ~ep 1 - vankozam in.

talál mán v értelmében az (I) ál talános ké vegy eteket az Actlnomyeetales HÁG 0()3959, D'SM 12931 vagy ennek variánsai vagy mutánsai tenyésztőközegben megfelelő körülmények közötti tenyésztésével, például fermentálással állíthatjuk elő, amíg az (IA), (IB) és/vagy (1E) képletű pluraflavinok legalább egyike jelen lesz a tenyésztőközegben. Ezt követően a plnraflavinokat a tenyésztőközegbol izolálhatjuk, és adott esetben tisztíthatjuk, kémiai származékokká alakíthatjuk át, és/vagy fiziológiásán elfogadható sókká alakíthatjuk.

A találmány tárgyát képezi tehát egy eljárás (1) általános képletű vegyületek előállítására, oly módon, hogy az Actlnomyeetales HÁG 003959, DSM 12931 törzset vagy annak variánsál vagy mutánsát tenyésztőközegben megfelelő körülmények, között tenyésztjük, például fermentálással, amíg az (ΙΑ), (IB) és/vagy (l'E) képietű pluraílavinok legalább egyike jelen lesz a tenyésztőközegben, a pluraílavinok legalább egyikét a tenyésztőközegböl izoláljuk, és adott esetben kémiai származékká és/vagy fiziológiásán elfogadható sóvá alakítjuk, át.

Egyik kiviteli mód szerint a HÁG 003959, DSM 12931 törzset vagy annak mutánsait vagy variánsait legalább egy szén forrást, legalább egy nitrogénforrást és szokásos szervetlen sókat tartalmazó tápoldatban (amelyet tenyésztőközegnek is nevezünk) tenyésztjük addig, amíg az új pl ura fi a vinok legalább egyike jelen lesz a tenyésztőközegben; ezt követően a pluraílavinokat a tenyésztőközegbői izolálhatjuk és adott esetben az egyes aktív komponenseket elkülönítjük.

Á tenyésztést aerőb körülmények között végezhetjük. A tenyésztést 18 °C és 35 ®C közötti hőmérsékleten, és pH 6 és 8 közötti tartományban végezhetjük.

A szakirodalomból számos reakció Ismert kinőnek kémiai deriváljzálására. Ennek megfelelően a letek kínon formáinak derivaiizálását reakciók alkalmazásával végezhetjük, formává történő redukálását például találmány szerinti vegyüÖnmagában ismert kémiai A vegyüietek hidrokinon katalitikusán végezheti ük hidrogénnel, vagy fém-hídridekkel, például aluminium-hidriddel vagy bőr-hidriddel. A további példa a kinonok átalakítása htdroxiiaminnal vagy annak származékaival oximokká, amelyeket azután kémiailag tovább alakíthatunk.

Ennek megfelelően a lános képietö vegyüietek találmány tárgyát képezik a (IV) álta- a képletben Rj, R.₃, R_?í és n jelentése

Χ*9

Λ «X 9**

X 9 * ♦*« a fent megadott valamint összes sztereokémiái formáik és az ilyen formák tetszőleges arányú elegyek és fiziológiásán elfogadható sóik.

A (JVA), (IVB) és (ÍVE) képietö plnraflavin-származékok iaz

ÍA), (IS), elve (JE) pluraflav inokból származnak, ezefc szintén a találmány részét képezik,

A találmány tehát (IVA) képietö vegyületre, (IVB) képiéin vegyületre, (IVE) képietű vegyületre, valamint ezek Összes sztereokémiái formájára és az ilyen formák tetszőleges arányú elegyeire, valamint ezek fiziológiásán elfogadható sóira is vonatkozik.

Az alábbiakban a találmányt részletesen ismertetjük, például legalább egy kiviteli alakban.

A találmány szerinti pluraílavinokat Aetinomycetales fajok termelik, egyik kiviteli mód szerint az Aetinomycetales spec. HÁG 003959, DSM 12931 törzs. Az Aetinomycetales spec. H.AG ÖÖ39S9, DSM 12931 bézs - vörös színű micéliummal rendelkezik, és az aetinomyeetes-ekre jellemző konidioforok alapján lehet azonosítani.

Az Aetinomycetales spec HÁG 003959, DSM 12931 mikroorganizmus taxonómiai vizsgálatával a törzs meghatározása az alábbi eredményeket adta.

A diagnosztikailag fontos zsírsavak gázkromatográfiás analízisével az alábbi zsírsavakat mutattuk ki nagy arányban:

anteizo 15:0 zsírsav, ízo lö:0 zsírsav (izopalmitinsav), izo 17:0 zsírsav Gzomargarinsav), anteizo 17:0 zsírsav (anteizomargarínsav) és ♦ *

- II eísz[9j 18:1 zsírsav (olajsav), egyéb zsírsavak alacsony koncentrác ióI me I lett,

A fenti zsírsav-összetétel alapján az Actínomyeetales HÁG 003959 (DSM 12931) taxonómíail&g a Saeeharothrix genus~ba sorolható.

A mikroorganizmus izolátornál a. Deutschen Sammlunu von Mikroorganismen und Zellkuhuren GmbH, .Mascheroder Weg EB, D 38124 Braunsebwelg, Németország, törzsgyűjteményéhen helyeztük letétbe a Budapesti Egyezmény (1999. július 16.) szabályai szerint az alábbi szám alatt; Actinomycetales species HÁG 003959, DSM 12931.

Az Actinomveetaies species HÁG 003959, DSM 12931 törzs helyett annak mutánsait vagy variánsait is alkalmazhatjuk, amelyek a találmány szerinti pluraílavinok legalább egyikét szintetizálják. Az ilyen mutánsokat önmagában ismert módon állíthatjuk elő fizikai eszközökkel, például besugárzással, így például ultraibolya vagy röntgensugarakkal, vagy kémiai mutagénekkel, például etíl-metánszulfonáttal (EMS), 2-hídroxÍ-4-metoxibenzofenonnal (MOB) vagy N-metil-N’ -nitro-N-nitrozoguaniűmí v—·

A találmány szerinti eljárás alkalmazható laboratóriumi méretekben (milliliter - liter) vagy ipari méretekben (köbméter) történő fermentálásra. Hacsak egyébként nem jelezzük, az összes százalék íömegszázalékot jelent. A folyadékok esetében a keverési arányok térfogatarányokra vonatkoznak, hacsak egyébként nem jelezzük.

Egyik kiviteli mód szerint az aerób fermentáláshoz a szénatomok forrásai asszimilálható szénhidrátok és cukor-alkoholok.

*♦ « * « « _ν * < » ír « » * * * *» * t· „ s? _. » »» »» ·* ·· például glükóz, laktőz, szacharóz vagy D-mann.it, és szénhidrát-tartalmú természetes termékek, például malátaextraktum. A tenyésztéshez nítrogénforrásként megfelelnek az aminosavak, peptldek és proteinek, és ezek degradáciős termékei, például peptonok és triptonok, továbbá a húsextraktumok, élesztő extraktumok, őrölt magvak, például kukorica, búza, szója, bab vagy gyapot, alkohoígyártás desztillációs maradékai, hüslisztek vagy élesztőextraktumok, azonban megfelelnek az ammőniumsók és nitrátok is. A tápoldatban lévő szervetlen sók. lehetnek például alkálifémek vagy alkáliföldfémek, vas, cink, kobalt és mangán kloridjai, karbonátjai, szulfátjai vagy foszfátjai.

A találmány szerinti pluraflavinok képződése olyan tenyésztőközegben megy végbe, amely körülbelül 0,1 - 5%, például 0,3 ·- 2% glükózt; 0,2 - 5%, például 0,5 - 3% szójalisztet; 0,05 - 2%, például 0,2 - 1,0 g/l kukoricalekvárt; 0,05 - 1,0 g/1, például 0,1. - 0,5% kalcium-karbonátot, és 0,05 - 1,0 g/1, például 0,1 - 1,0 g/1 nátrium-klorídot tartalmaz. A százalékok minden esetben a tenvésztőközeg tömegére vonatkoznak.

A tenyésziöközegben az Actinomycetales species HÁG 003959, DSM 12931 a pluraflavinok elegyet termeli. A tenyésztőközeg összetételétől függően a találmány szerinti piuraflavinok legalább egyikének aránya változhat. Ezenkívül a tenyésztőközeg összetételén keresztül szabályozhatjuk az egyes pluraflavinok szintézisét, oly módon, hogy a mikroorganizmus egyáltalán ne termeljen egy vagy akár több piurailavint vagy csak olyan mennyiségben, ami a kimutatási határ alatt van.

Egyik kiviteli mód szerint a tenyészet egyetlen kimutatható piurailavint tartalmaz. Másik kiviteli mód szerint pluraflavin A, φ* #

k*** és Ε keletkezik.

A pluraflavin Á~n, B-n és E-n [(ΙΑ), (I.B), illetve (IE) tetű vegyületen] kívül egyéb hasonló vegyüietek ís képződhetnek az Aetinornyeetales species HÁG 003959, DSM 12931 tenyésztőközegében, amelyek annyiban különböznek az (IA), (IB) és (IE) képietű vegyületektőí, hogy eltérően vannak glikozüezve, így kimutattunk melléktermékként egy további plurafíavint (pluraflavin C), amelynek móltömege 974 Da és a pluraflavin A degradáelós termékét, amelynek móltömege 692,77 (C37H44N2ÖÍ {). Az utóbbi vegyületböl a hexóz J hiányzik; savas körülmények között a 2,6-didezöxialdohexóz bidroiitikusan lehasadhat a pluraflavin A-ból.

A mikroorganizmust aerób körülmények között tenyésztjük, azaz például merített tenyészetben, rázatás vagy keverés közben egy rázó lombikban vagy fermentorban, adott esetben levegő vagv oxi-gén bevezetése közben. A tenyésztést körülbelül 18 és 35 °C közötti hőmérséklettartományban, például körülbelül 25 - 32 °C~on, közelebbről 27 - 30 ®C-on végezhetjük. A pH általában ő és 8 között változik, például. 6,5 - 7,5 lehet. A fenti körülmények között a mikroorganizmust általában 24 - 301) órán, például 36 - 140 órán keresztül tenyésztjük.

A tenyésztést előnyösen több lépésben hajtjuk végre, azaz először legalább egy előteny észetet készítünk, egy folyékony közegben, amelyet azután a tényleges termelő közegbe, a fő tenyészetbe oltunk le, például Iríö térfogatarányban. Az előtenyészetet például úgy állítjuk elő, hogy egy micéiiumot egy tápotdatba oltunk, és .körülbelül 36 - 120 órán keresztül, például 48 - 96 órán keresztül hagyjuk szaporodni. A micéiiumot pél14 « «♦ y * ·* * « β * ♦ » * * « ♦ «»* * » *·»♦ ♦ » * * Κ X * * >♦ ** *·* ♦** dául úgy állíthatjuk elő, hogy a törzset körülbelül. 3 - 40 így például 4 - 10 napon keresztül szilárd vagy folyékony tápközegben, például maláta-élesztő agarom vagy zabliszt agaron tenyésztjük.

A fermentáció lefolyását a tenyészet pH~jának vagy a micéliumtérfogatnak ellenőrzésével követhetjük nyomon, de végezhetjük kromatográfiás módszerekkel, például vékonyréteg-kromatográfiával vagy nagynyomású folyadékkromatográííával, vagy a biológiai aktivitás vizsgálatával is. A találmány szerinti pluraflavinok megtalálhatok mind a micéiíumban, mind a tenyészet szörletében. Az alábbiakban ismertetett izolálást eljárás általánosságban alkalmas a találmány szerinti pluraflavinok tisztítására, például a plurafíavin A, δ és B tisztítására.

A találmány szerinti pluraflavinok izolálását és/vagy tisztítását a tenyésztöközeghől ismert módszerekkel hajtjuk végre, a természetes termékek kémiai, fizikai és biológiai tulajdonságainak. figyelembevételével, A plurafíavínkoncentráeió vizsgálatára a tenyésztőközegben vagy az egyes ízolálásí lépésekben alkalmazhatunk vékonyréteg-kramatögráfiát, például szilíkagélen, kloroform/.metanol/jégeeet/v.íz elegyek alkalmazásával (például 8:1:1:0,2 arányban) mobil fázisként, vagy HPLC-vel, Vékonyréteg-kromatográfíás elválasztásnál a detektálást például festő reagensekkel, például a-naftol/kénsavval végezhetjük, ahol a képződött anyag mennyiségét célszerűen egy kalibrációs oldathoz hasonlítjuk,

A találmány értelmében a pluraflavinokat vagy a micéliumhól, vagy tenyésztőközegből izolálhatjuk. Általánosságban a mieéiíumot első lépésben szokásos módszerekkel elválasztjuk a * « 4 *** * *4 *4 *4 :·** teriyésztőközegtöl, majd ezt követően extraháljuk a piuraflavinokat a sejtanyagból, adott esetben vízzel elegyedő szerves oldószer alkalmazásával. A szerves oldószeres fázis tartalmazza a találmány szerinti plurafiavinokat: kívánt esetben ezeket vákuumban koncentrálhatjuk, és tovább tisztíthatjuk az alábbiak szerint.

Kívánt esetben a tenvészet szarletét a mícéliumextrakluni *· koneentrátumával kombinálhatják, és megfelelő, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, például n-butanollal extrahálhatjuk. A szerves fázist ezután elválasztjuk, és kívánt esetben vákuumban koncentráljuk. Az értékes termék zsírmentesítésére a koncen.trátumot egy apoláros oldószerrel, például hexánnal, petroléterrel vagy dietii-éterrel hígíthatjuk, amelyben a találmány szerinti pluraflavínok csak kis mértékben oldódnak. Ezzel a plurafíavinokat kicsapjuk, míg a lipofíl szennyeződések oldatban maradnak, és szokásos szilárd-folyadék fázis szétválasztással eltávoliíhatók. A csapadékot, amely az. összes izolálandó pluraflavint tartalmazza, a víz/metanol eredeti térfogatának l/30~ad mennyiségében oldjuk. A csapadékot teljesen feloldjuk és líofíiízáljuk. A iiofílizátum, amelyet a továbbiakban nyersterméknek nevezünk, 0,5 - 50% pluraflavmt tartalmaz, és ezt alkalmazzuk a további izoláláshoz,

A találmány szerinti egv vagy több pluraflavin további tisz~ títását kromatográfiásan hajtjuk végre megfelelő anyagokon, például molekídaszürőn; normál fázisú hordozókon, például sziÜkaaélen. alumíníum-oxidon; ioncserélőkön vagy ad szőrben s gyantákon és/vagy fordított fázisú közegeken (RP). A fenti kromatográfia segítségével, a piuraflavínokat szétválasztjuk. A píu► χ* » « « ♦«·* α * *»* ♦·.* ♦**Φ ♦ * « & * * * «« *ί ♦$ κ·*-# raflavinok kromatografálását puffereit vizes oldatokkal vagy vizes és szerves oldatok elegyeivel végezzük.

A vizes vagy szerves oldatok elegye! alatt vízzel elegyedő szerves oldószereket, például metanolt, propánok és acélon itrilí értünk lö - 30% oldószer koncentrációban, például 40 - 60% oldószer koncentrációban, vagy puff erőit vizes oldatokat, amelyek szerves oldószerekkel elegyednek. Az alkalmazandó pufferek ugyanazok lehetnek, mint amelyeket fent említettünk.

A pluraflavinok szétválasztását eltérő polaritásuk alapján fordított fázisú kromatográfía segítségével hajthatjuk végre, például MCI® (adszorbens gyanta, gyártja a Mitsubishi, Japán) vagy Amberíite XAD® (TOSOHAÁS) vagy egyéb hidrofób anyagok, például RP-8 vagy RP-18 fázisok alkalmazásával. Ezenkívül a szétválasztást végrehajthatjuk normái fázisú kromatográfíával is, például szilikagéiem aíumínium-oxidon vagy hasonlón.

Á pluraflavinok kromatografálását pufféról! vagy savas vizes oldatokkal, vagy vizes oldatok alkoholokkal vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószerekkel alkotott elegyeivel végezhetjük. Szerves oldószerként alkalmazhatunk például propano.lt és acélon itrilt.

Puffero.lt vagy savas vizes oldatok alatt például vizet, foszfát puffért, ammőnium-aeetátot, cílrát puffért értünk 1 mM - 0,5 M konentrációban, továbbá hangyasavat, ecetsavat, tníluorceefsavat vagy bármely szokásos savat 0,01 - 3%, például 0,1% koncentrációban.

A kromatográfíát végezhetjük gradiens alkalmazásával is, 100% vizes pufféiból kiindulva és 100% oldószerrel befejezve;

χ* φ* ΛΛ.

.7 ♦ ♦ X i ♦>$ * * * például lineáris gradienssel, amely 10%·· töl 50%~ig változik, 2~propanol vagy aeetonltrd alkalmazásával.

Alternatív módon geikromatográfíát vagy hidrofób fázisokon végzett kromatográfiai is alkalmazhatunk,

A gélkromatográfíát poiiakril am időn vagy vegyes polimer géleken, például Biogel-P 2^-en (Bio?

Fractogel TSK HW

40^-en

Merő ómetország vagy T'oso Haas, USA) vagy

Sephadex^~en (Pharmaeia, Uppsala, Svédország) hajthatjuk, végA fent említett kromatográfiás műveletek sorrendjét megfordíthatjuk.

A pluraflavinok tisztítására további, nagyon hatékony műveletként kristályosítás alkalmazható. A pluraflavinok szerves oldószerekkel vagy víz és szerves oldószerek elegyeível alkotott oldatokból kristályosodnak. Á kristályosítást önmagában ismert módon végezhetjük, például a telített pluraflavínoldatok. koncentrálásával vagy hűtésével

A találmány szerinti pluraflavinok szilárd halmazállapotban és oldatban pH 3 és 8 közötti értéken, például pH 4 - 6 értéken stabilak, és ezért szokásos gyógyászati készítményekbe beépíthetők.

Az (I) általános képletű pluraflavinok és az azokból származó kémiai származékok szakember számára ismert módszerekkel alakíthatók megfelelő, fiziológiailag elfogadható sókká.

Áz. (1) általános képletü vegyületek fiziológiailag elfogadható sói alatt értjük azok szerves vagy szervetlen sóit, amelyek, például a Remington’s Pharmaceutlcal Sciences [17. kiadás, 1418. oldal (1985)] irodalmi helyről ismertek. Fizikai és kémiai * Kft ** ** β « ♦ '' * • 0 ί*# Φ » «<-« *** * χ ♦ * * * stabilitás és oldhatóság alapján a savas csoportok lehetséges sói a nátrium-, kálium-, kalcium- és ammőniumsók, míg a bázikus csoportok esetén megfelelő sók a sósavval, kénsavvak foszforsavval vagy karbonsavakkal vagy szulfonsavakkal, például ecetsavval, citronisavvak feenzoesavval., maleinsavval, fumársavvak borkősavval és p-toluolszulíonsavval alkotott sók.

A találmány tárgykörébe tartoznak az (!) általános képletű vegyületek kézenfekvő kémiai ekvivalensei (a leírásban ezeket származékoknak is nevezzük) is, amelyek kémiailag csak kis mértékben különböznek, azaz. azonos aktivitással rendelkeznek, vagy enyhe körülmények között találmány szerinti vegyüietté alakíthatók. Az ekvivalensek közé tartoznak például az észterek és éterek, a komplexek, valamint a találmány szerinti vegyületek redukciós termékei is.

Az észter és éterszármazékokat és a redukciós termékeket szakirodalomból ismert eljárásokkal állíthatjuk elő [lásd például „Advanced örganic Synthesis”, 4, kiadás, J. Marcii, John Wiley & Sons (1992)], Az (1) általános képletű vegyületek karboxilcsoportját [(ΊΕ), (IVE) képletű vegyületJ és bídroxilcsoportjaít például észter- vagy éteresoporttá alakíthatjuk. A fenti észterek közé tartoznak például az 1-4 szénatomos alkil-észterek. A fenti éterek közé tartoznak például a hidroxiiesoportok aeetáljai és

Az (I) általános képletű vegyületek stabil komplexeit fiziológiailag elfogadható szervetlen kationokkal, például kalciummal vagy magnéziummal képezhetjük.

A találmány tárgykörébe tartoznak az (I) általános képletű vegyületek. összes sztereoizomer formák Az (ΙΑ), (IB) és (1E) β V# β ν β> ν * -χ * < ν * » £ <*>♦ Φ * * «»»« ♦»»·«· * * » ·φ·» *, *'·.; κ#* képletű vegyületek aszimmetriacentrumai egymástól függetlenül minden esetben lehetnek {S)~konfigurációban vagy (R)-konfigurációban. Az epoxid-tartalmú csoport oxiránjat bármely helyzetben lehetnek; például a 2' és 3’ szénatomokat magukban foglaló oxiránok. A találmány tárgykörébe tartoznak az összes leν’ S.“v?

hetséges enantiomerek és diasztereomerek, és legalább két sztereo izomer forma el egyel, például enantíomerek és/vagy diasztereomerek elegye! is bármely arányban. Tehát a találmány tárgykörébe tartoznak az enantíomerek enantiomeresen tiszta formában, mind a balra forgató, mind a jobbra forgató antipődok, az (R)~ és (S)-konfígoráciők racemátok formájában és a két enantiomer tetszőleges arányú elegyei formájában. Ha van cisz/transz izoméria, a találmány tárgykörébe tartoznak mind a ctsz-izomerek, mind a transz-izomerek, valamint a. fenti forrnák tetszőleges arányú elegyei is,

Hasznos farmakológíai tulajdonságuk következtében a találmány szerinti vegyületek gyógyszerként alkalmazhatók úgy a humán, mind az állatgyógyászatban. Ezek a vegyületek antibiotikus aktivitással rendelkeznek, és antibakteriális hatásuk mellett antimikotikus·, azaz antifungális hatással is rendelkeznek, beleértve a nővénypatogén gombákat is, továbbá proíozoonellenes és parazitaellenes tulajdonságokat mutatnak.

Á találmány szerinti vegyületek rákos betegségek esetén is alkalmazhatók például kemoterápeutíkumként; Citosztatikus tulajdonságaik, például erős tumorellens· aktivitásuk és antimikróbás hatásuk következtében például rosszindulatú degenerációk esetén eitosztatíkumként alkalmazhatók úgy állatokban, mint emberben.

♦ ♦'·♦·«

Olyan tumorsejtek esetében, amelyekben rezisztencia alakult ki a szokásos szerekkel szemben, csak az új. szerek mutatnak terápiásán megfelelő hatást. így a találmány szerinti pluraflavinok és (1) általános képletű származékaik potenciálisan megfelelő akti vitással rendelkeznek még az ilyen problémás sejttípusok esetén is.

A találmány tárgyát képezik gyógyászati készítmények is, amelyek legalább egy találmány szerinti pl ura fia v int és/vagy annak valamely származékát tartalmazzák. A pluraflavinokat alkalmazhatjuk legalább egy megfelelő segédanyaggal vagy hordozóanyaggal alkotott elegy formájában is. A humán gyógyászati célra alkalmazott segédanyagoknak farmakológiaiíag elfogadható segédanyagoknak és/vagy hordozóanyagoknak kell lenniük.

A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás gyógyászati készítmény előállítására, oly módon, hogy legalább egy találmány szerinti vegyületet gyógyászatilag megfelelő és fiziológiásán elfogadható segédanyag és kívánt esetben egyéb megfelelő hatóanyagok, adalékanyagok vagy segédanyagok alkalmazásával megfelelő adagolási, formává alakítunk.

A találmány szerinti gyógyászati készítményeket általában orálisan, topikái.isan vagy parenterálisan adagoljuk, azonban lehetséges a rektális adagolás is. Megfelelő szilárd vagy folyékony gyógyászati készítmény fonnák például a granulák, porok, tabletták, bevonatos tabletták, (mikro)kapszulák, kúpok, szirupok, emulziók, szuszpenziók, aeroszolok, cseppek vagy injektálható oldatok ampulla formában, és a nyújtott hatóanyagfelszabadnlást biztosító készítmények, ezekben a készítményekben különféle hordozóanyagokat, és adalékanyagokat és/vagy segéd21 anyagokat, például deziníegFálászereket, kötőanyagokat, bevonőszereket, duzzasztószereket, csúsztatóanyaaokat vagy kenőanyagokat, ízesítőanyagokat, édesítőszereket vagy szoíubillzálőszereket alkalmazunk szokásos módon.. Gyakran alkalmazott segédanyagok vagy hordozóanyagok például a magnézium-karbonái, tltán-dloxíd, laktóz, manóit és egyéb cukrok, talknm, laktoprotein, zselatin, keményítő, vitaminok, cellulóz és származékai, állati vagy növényi olajok, polietiiénglikolok és oldószerek, például steril víz, alkoholok, glicerin és többértékü alkohoKívánt esetben a dózisegységek míkrokapszulázhatók orális adagolás céljából, hogy a hatóanyag felszabadulását késleltessük vagy viszonylag hosszabb időtartamon keresztül biztosítsuk, például oly módon, hogy az adott hatóanyagot megfelelő polimerekkel, viaszokkal vagy hasonlókkal bevonjuk vagy azokba beépítjük. Á gyógyászati készítményeket dózisegységekben állíthatjuk elő és adagolhatjuk, minden egyes egység hatóanyagként a találmány szerinti pluraílavinok legalább egyikének és/vagy annak kémiai származékának meghatározott adagját tartalmazza. A szilárd dózisegységek, például tabletták, kapszulák és kúpok esetében ez a dózis körülbelül 200 mg, de lehet 0,1 - 1ÖÖ mg is, és injektálható oldatok esetében ampulla formában ez körülbelül 2ÖÖ mg, de lehet körülbelül 0,1 - 100 mg is naponta.

A beadandó napi dózis a kezelendő emlős testtömegétől, életkorától, nemétől és állapotától függ. Azonban a fent említetteknél magasabb vagy alacsonyabb napi dózisra is szükség lehet. A napi dózist naponta adagolhatjuk egyetlen alkalommal «

* * ♦ X «

0?

egyetlen egységdózis formában, vagy többször, kisebb dózisegységekben, de beadhatjuk több alkalommal is, meghatározott időközökben, leosztott dózisokban.

A találmányt közelebbről példákkal kívánjuk szemléltetni. A megadott százalékok tömegszázalékot jelentenek. Folyadékok esetében a keverési arányokat térfogatra vonatkoztatva adjuk meg, ha csak egyébként nem említjük. Az alábbi példákkal a találmányt szemléltetni kívánjuk a korlátozás szándéka nélkül.

DSM 12931 gliceActiaomycetales species rines tenyészetének előállítása

1ÖÖ ml tápoldatot (malátaextraktum 2,0%, élesztőextraktum (),234, glükóz .1,0%, (ΝΗ₄)₂ΗΡΟ4 0,05%, pH 6,0) tartalmazó, steril 300 ral-es Erlenmeyer-lombíkot Áctinomycetales species HÁG 003959, DS.M 12931 törzzsel inokuiálunk, és rotációs rázógépen, 28 °C-on, 180 fordulat/perc mellett 7 napon keresztül inkubáijuk. A tenyészet 1,5 mi-ét ezután 1,5 ml 99% erősségű glicerinnel hígítjuk, és -20 ^l)€-on tároljuk,

3, példa *y etotenyészetének előállítása ErlenmeyerEgy steril, 300 mí-es Erlenmeyer lombikot, amely 100 ml 15 g/1 glükóz, IS g/1 szójaliszt, 5 g/1 kukoríealekvár, 2 g/1 összetételű tápoldatot tartalmaz, ferde >% aaarrai kiegészítve) vagv 1 ml glicerines tény eszeltei (lásd 1. példa) inokuiálunk, és a lombikot rázógépen, 180 fordulat/perc

CaCO.5 és 5 g/1 kémcsőben tenyésztett tenyészettel (ugyanez a tápoldat, 2% * φ »

hoz ugyanezzel a tápoldattal kapott 48 - 96 órás merített tenyészet elegendő volt (az inokuláláshoz alkalmazott mennyiség körülbelül 10%).

3. példa

FluraOavinok előállítása

Egv 9 literes fermentort az alábbi körülmények között működtettünk;

tápközeg: 15 g/1 glukóz;

g/1 szőjaliszt;

g/1 kukorica! ekvár; 2 g/1 CaCOg tenyésztés időtartama: inkubáci0 hőmérséklete keverési sebesség:

levegőztetés;

pH 7,0 (sterilezés előtt) 92 óra 28 ^eC

00 fordulat/perc

1/perc

Etanolos poliololdat ismételt hozzáadásával adott esetben meg tudtuk szüntetni a habképződést. A maximális termelést körülbelül 70 - 96 óra után értük el.

4. példa

Pluraflavia elegy izolálása Aetinomyeetales species HÁG <103959, ÖSM 12931 tenyésztőoldatáfoól

Az Aetinomyeetales species HÁG 003959, .DSM 12931 férχ * e >

Ω,,1 mentái ásónak befejezése után a fermeníorban lévő tenyészlevet, amelyet a 3. példa szerint kaptunk (90 liter) körülbelül 2% szűrési segédanyag (például Celite'^&) hozzáadásával leszűrjük, és a sejtanyagot (0,6 liter) 3 liter metanolul extraháljuk. Az aktív vegyületet tartalmazó metanedos oldatot szűréssel megszabadítjuk a mícélíumtől, és vákuumban koncentráljuk. A koneentrátumot a tenyészet szűrletével együtt (7 liter) 0,4 liter ^MCI GÉL, CHP2ÖP oszlopra visszük fel. Az elválást 0,1% ecetsav/víz. -» 0,1% ecetsav/2-propanol gradiens alkalmazásával végezzük. .Az oszlopon átfolyó anyagot (1,2 1/óra) 0,25 literes frakciókban gyűjtjük, és a piurafíavin-tartalmú frakciókat (20 - 23.) egyesítjük. Vákuumban történő koncentrálás és fagyasztva szárítás után 1,4 g barna port kapunk.

5.

Pluraflavtn komponensek dúsítása gélkromafográfiával

A 4. példa szerint előállított 1,4 g terméket 3,9 liter kapacitású, PraetogeP'TSK. HW-4Ö s töltetű oszlopra visszük fel (szélesség x magasság - 10 cm x 50 cm). A mobil fázist (1/1 arányú viz/acetonitril) 50 ml/min átfolyási sebességgel nyomjuk át az oszlopon, és az oszlopon átfolyó anyagot frakciókba gyűjtjük (65 ml). A plurafluvinok főleg a 13 ~ 16. frakcióban találhatók. Ezeket egyesítjük, és vákuumban oldőszermentesítjük, 130 mg plurafl-avín elegyet kapunk.

6. példa

Phtrnflavm komponensek szétválasztása fordított fázisú RP-18 oszlopon

A 122 ml kapacitású preparatív HPLC oszlopot (1,25 cm belső átmérő x 25 cm magassá

Mucleosíl 100-7 0.8 HD-vel meg, és felvisszük az szerint előállított 130 mg plurafíavin elegyet. Az elúcíót 10% acetooitril és 0,1 M vizes arnmőníum-aeetát oldat alkalmazásával végezzük. Áz oszlop átfolyási sebessége 50 ml/mín, és 50 jsl-es frakciókat gyűjtünk. A 6, frakció tartalmazza a pluraflavin E-t, a pluraflavin. € a 12 - 17. frakciókban, a pluraflavin B a 2.5 - 27. frakciókban, míg a pluraflavin A a 35 - 37. frakciókban van. Vákuumban történő koncentrálás és fagyasztva szárítás után az alábbi menny i ségeket kapjuk:

pluraflavin A: 22 mg, ESD MS: 823 Da (MAH)'\ pluraflavin B: 18 mg, ESD MS: 841 Da (M+H)\ pluraflavin C: 11 mg, ESIv MS: 974 Da <M+H)\ pluraflavin E: 5 mg, ESD· MS: 712 Da (MHTf'.

Plnraflavi» A végső tisztítása és átalakítása triöworaeetát-só formába

A ö. példa szerint előállított 35 - 37. frakciókat fagyasztva szárítjuk, és a kapott anyagot (22 mg) 10% acetonítrilt tartalmazó vízben oldjuk, pH 2,8 értékre állítjuk trifluorecetsavval, és 25Ö/IÖ LiChrospber RP~18e (5 pm)® oszlopra visszük fel. Az eluálást 0,05% vizes í rí fluoré cet savat tartalmazó 11 - 22% acetonifrií gradienssel végezzük. Vákuumban történő koncentrálás ’n.· *·· és fagyasztva szárítás után 18 mg pluraflavin A-trífiuoracetátsót kapunk.

.Fluraflaiö A azonosítása

Megjelenés: sötétsárga anyag, amely poláros, szerves oldószerekben oldódik, azonban vízben csak kis mértékben oldΜ*'«.

ható. A savaddíeiós sók vízoidhatók. A vegyölet semleges és enyhén savas közegben stabil,, azonban instabil lúgos és erősen savas tartományban.

UV-maximumok: 214, 2.43, 270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm, 8/2 arányú víz/aeetonitril elegyben (pH. 2); és 214, 243, 270 (Sb), 290 (Sh) és 426 nm 6/4 arányú víz/acetömtril elegyben (pH 7).

IR-sávok: 3424, 1680, 1600, 1464, 1427, 1300, 1203, 1131,

1066, 1009, 801, 721 cm'A

Nagy féloídású tbmegspektrometriával az alábbi mól tömegeket találtuk <M+H)A 823,370631 Da, ami a pluraflavin A C43H54N2O5ZS összegképletének felel meg. Elektronporlasztásos ionizáiással (ESI, pozitív) MS/MS fragmentációval az alábbi ionokat kaptuk: 823, 693, 680, 550, 480, 390, 320, 144 és .1.31 Da,

NMR-jelek: lásd az 1. táblázatot.

1. táblázat

Plnraflavio A és ⁿC kémiai eltolódásai metanol-d^feea és DMSO-a^ba» 300°K~on £>.!

15	53,SS	3*41 q	,61,61	\|3*48q
16	20*24	1,32 S	j 15,32	11,66 5

13,SS

1,270 >22 d r

^! 38,90 í5,Ö4dd >36*57

5*06 d, brd

2’	I 37,24	12,05,2,12	135,50	Ϊ 1*87,1,35
•J3.Í <3	153,32		156*33
3’Ms	j 24,57 1	j 1,S0s	I	) 1,35 s

3,27 s, brd

188,55

8,16 s, brd

3,17 d

StoMe j 43,24 brd, 41.55 brd

3,47 8

3'W

75,13

72,55

6” ,09 | 33,49

i 66,61

71,98

69,55

4.00 q [63,19

4_SÖ1 q

T,13d

5.51^:

168,21

2,48 m, 2*91 m.brd

3,45 rn,. brd |S2,19 : 3,05 brd, 3,05 brd jj 42,14, 39, í 4,32 s, brd í 3,97 q, brd

5,24 m, brd

2,05, 2,10 í 4,12 m ; 3,67

1 g q, brd

71,

70,22

17,54

198*83 ij 32*07 í|S4*i?

Ϊ 70,13 >57,05 ;i 5

5,44 brd 2*35 brd, 2,78' brd

3,43 brd : 2,89, 2,97 s 8,78 brd j 4*20 s, brd íSJSq, brd : 5,11 brd

1,75,1.92 *96 m, brd

4*70 s, brd

J3_}45brd

4*44 s, brd

4*10 q, brd «,» «« #χ

ΕΟ

;.o Az aldohexőz ΠΙ-ra a megfigyelt ΝΌΕ-k egy relatív SRSS vagy RSRR sztereokémiának feleltek meg az Γ, 3’, 4y 5’ királís centrumokon [a hexóz ΠΙ relatív sztereokémiáját a (H-III) képlet mutatja]. Ez a vankózamin C-3 epimerjének felel meg,

A hexóz Π-re megfigyelt NOÉ hatások az RSSS vagy SRRR relatív sztereokémiát valószínűsítik az 1”, 3”, 4”, 5” királis centrumokon [a hexóz Π relatív sztereokémiáját a (H-Π) képlet mutatja].

Ugyanez a relatív sztereokémia (RSSS, SRRR) az 1”\ 3”\ 4”’, 5”’ aszimmetriás szénatomokra összhangban volt a hexóz I~re detektált NOÉ hatásokkal [a hexóz I relatív sztereokémiáját a (H-I) képlet mutatja].

la

Pl a r a f la vi s R azonosítása

Megjelenés; sötétsárga anyag, amely poláros szerves oldószerekben oldható, azonban rosszul oldódik vízben, A savadéiciós sók vízoldhatók, A vegyület semleges és enyhén savas közegben stabil, azonban instabil lúgos tartományban.

UV-maximumok; 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm 8/2 arányú viz/acetonítrii elegyhen (pH 2); és 214, 243, 270 (Sh), 290 (Sh) és 426 nm, 6/4 arányú víz/aeetonitril elegyhen (pH 7).

A pluraflavin B összegképlete C^sHs^NjOis, móltömege 840,9 Da.

NMR-jelek: lásd a 2, táblázatot.

« « * X

17	182,68	Γ	1182,68	I * í
7s	133.16	-	1133,23
S	120,04	7.81 d l *	\|W⁵	7,36 d

Φ »* *Λ *ΦΦ»

Φ ♦ « X Φ Φ Φ φ JÍ **# Φ φ »φ» φτφφ ♦ ΦΦ* X Φ Φ Φ » « φ ♦♦ ** »♦

	j Piursftevin 8 (m	uanabdí)	!tf^Íewowco»WMuuuÍjoüüocuüüÍaooooÍ«<w«w^'.'-r.·_CTHHnroow^_rrmi[lli^_rirlnri..^ \|Piurafíavin A‘(metanol-dó
Helyzet	J	PH	r³c	\| 'H
	l δ (ppm}	\| δ (ppm}	lő (ppm) jí........ .	Ő (ppm) i
5*	j?SZ2	14,01 q	j 70,44	4,00 q j
, θ’	jnps	/l,33d	j 17,21	j 1_f34 d
Γ	78.13 i	5,48 t .................................	70,23	; 5,51 f
·?>> 2.	‘27,74	2,50 m, 2/8 m	128,88 ferő	2/8 m_? 2,31 m, brd
3”	: 8SJ4	3,48 m	\|8S_?19	: 3,45.0;, brd
3”NMe	43,30, 41 yo	3,81 s. 3,12. s	43,24 brd, 41,85 brd	'3,05 brd, 3,05 brd i
3%%		-	h
4”	75.02 í	4.32 s, brd $	f?5,13	4,32 s, brd
5	72,81	3,37 q. brd	'72,55	3,87 q, brd
6-	18,15	1,39 d	mos >	1,40 d
1”* :	191,38	5,24 m, brd	101,33	S,24 m, brd
	33.42	2,0? m	33,40	2,05. 2/8
3^M> §	88,53	4,13 m	88,61	4,12 m
[3”’-OH \|	-			-
4“* 3	71/7	3,8? brd j	71,98	3,5?
4'%H I í	-	ί		*
5^:” 5 j	89 52 s	4,18 q,_: brd i	89/2 S	4,16 q, brd
6'“ \|	17,49	1,.27 d 1	17/1	1,28 d *.......................... i

Η).

rlur&ílavm .& végső Α 6. példa szerint előállított 6. frakciók fagyasztva szárítjuk, és a kapott anyagot (5 mg) 10% acetoni trí it tartalmazó vízben oldjuk, pH 2,8 értekre állítjuk trifluorecetsavvak és 250/10 LiChrospber RP~lSe (5 pm)® oszlopra visszük fel. Az eluálást 0,05% vizes trífluoreeetsavat tartalmazó 11 - 22% acetonitni gradienssel végezzük. Vákuumban történő koncentrálás és fagyasztva szárítás után 2,7 mg plurafíavin E-trifluoracetáí-sói kapunk.

< ·{

-dl ♦ * Xt « Φ » Φ ♦ » Jt X X X φ « « * Φ »e

1.1. példa

Plnraflavin E azonosítása

Megjelenés; sötétsárga anyag,, amely poláros, szerves olrzerekben oldódik, azonban vízben csak kis mértékben oldható, A savaddíciós sók vízoldhatők., A vegyül el stabil semleges és enyhén savas közegben, azonban instabil lúgos és erősen savas tartományban,

UV~.maximumok: 213, 244, 270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm, 8/2 arányú viz/acetonitríl elegyben (pH 2); és 213, 244, 270 (Sh), 290- (Sh) és 426 nm, 6/4 arányú viz/acetonitríl elegyben (pH 7).

Tömegspektrometriával kapott möiíomeg; (M+H)’; 71.2 Da, ami C3.gH4i.NO14 összegképletnek felel meg a pluraflavin B-re.

NMR-jelek: lásd a 3. táblázatot.

3, azat

Pluraflavin E *.H és ^I5C kémiai eltolódásai metanolben és DMSO-d^ban 3IMR.&~on

O-:

·?3Γ* i ^c l

j S (ppm)

Helyzet

H <

I δ [ppm)

1 2 \| 176,48 I :	} ' ...............j
\|3 i 1-10*30 (SpSs j
1⁴	178,39	I
1 4a	124,69
I 5	149,56	i
í 6	121,17	7,82 s \|
j 8S	138,95	I
í / 1	182*40	1
1 7a	133,21	A j
1 ⁸	119,82	7,60 d j
9 \| 135,,61.	7_S74 d j
10 i 137/44	1
11 I 161,33 £ ..... ..... ......... ..............	‘...... t
í 11-OH \| -	1

♦ ** *4 «'«».<

» 4 4

Χ«4 *44

Helyzet

Ida i -³C •S (ppri!) | 11 8,07

I 189,21

12a

12b

121,59

156,86

175,28

77,69

72,61

4,36 c

23,78 s

,31 d

17,ÖS

70,34

5,46 dd

2” 27,30	2,86 m, 2,44 m
3” \| 64,88 ; í	3,50 rn j
3N.Me \| 42,6 brd	3,08
3NH*	1
4 j 75,22 14,33 s, brd \|
gr Γ?2,29 j' 3,87q, bsd j
6” j 18,25	1₅35 d
1“ 101,40	5,2 3 m
2“ 33,43 < 1 ’	2,08 m, 2,06 m
pF Γ§ξδ1 I I *	4*12 m
ί F-OH ] -	“ l·
i 4“ 72,03 f .................I........................................................	3,67 s. brO i
> 4^!X-OH i -	-
\| 89,50	4,17 q, brd
6” j 17,52	1j28 d 1

χ £4 *4 *4 « » «4 « « 4 » 44« » 4 *4 9 «««

4♦ 8 « » > 4 4 »

X 44 «« «*α

..IN ss aktivitás vizs^.

A citosztatikus aktivitás meghatározására patkány hepatoma sejteket alkalmaztunk, amelyeket az American Type Culture Collcction törzsgyűjteményből kaptunk (ATCC CR.L-I548, Jo No, 223 és 228). A törzset 10% magzati borjúszérum mai [GJBCO BRL No. 10270-106] és 1Ö μΐ/ml penicBIin-streptomicinnel [GÍBCO RBL No. 15140-114] kiegészített „MÉM (EAGLE) with Gluíamax közegben [GÍBCO BRL No. 4102~Ö28] tartottuk fenn. 96-rezervoáros mikrofitráló lemezeket alkalmaztunk [Greiner, No. 15140-114], Az egyes rezervoárokba először bemértünk 140 μΐ tenyésztő tápoldatot, és minden egyes esetben 215000 sejttel mokuláhuk. A lemezeket ezután 37 °C-on és 5% CO2 jelenlétében 20-24 órán keresztül inkubáituk. A pluraflavinokból előzetesen sorozathígítást készítettünk 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1.5625, 0,7813, 0,3906, 0,195, (

0,047 és 0 μΜ koncentrációban, és ezeket a megfelelő sorrendben pipettáztuk, 37 °C-on, 5% CO₂ atmoszférában végzett további 22 óra inkuhálás után a folyékony közeget leszívtuk. A visszamaradó sejteket megfestettük 100 μΐ/rezervoár RPMÍ 1640-nel [GÍBCO BRL No. 32404-014] és 20 μΐ/rezervoár CeH liter 96 Aqueous [PROMEGA No, G543Ö] alkalmazásával, A fényabszorpciót 590 nm-en mértük közvetlenül a beadagolás után, és 2 órás inkuhálás után, A citosztatikus hatást a fényabszorpcíó változásából számítottuk ki.

IC50 pluraflavin A~ra ~ < 50 nM:

IC.50 pluraflavin B-re ^:-·· < 50 o'M.

* ** ** <ιΧ * ? V « » * * * $ «Φ* Φ » ΦΦΦ Φ«* **»* » * Φ * ♦ » <6 »φ ®*ν

FI uraflavin A és flavi sraeios sa tumor

Egy vízoldható tetrazóliumso, az MTT oldhatatlan bíborszínű formazánná alakul át, ha a tetrazólíum-gynrűi az aktív niHokondnnmokban működő dehidrogenáz enzimek hasítják. A halott sejtekben ez a változás nem megy végbe. Ezt az eljárást alkalmaztok a proliferácíő számszerű meghatározására, hogy a potenciális kemoterápiás vegyületek. aktivitását meghatározzuk.

Áz összes sejtet RPMI 1.640 (Life Technologies, Gaithersbnrg, MD) tápközegben tartottuk fenn, amely 10% ho-inaktivált magzati borjúszérumot; penrcíhint/streptomicínt tartalmazott és L-glutamínnal volt kiegészítve. A sejteket 9ó~rezervoáros szövettenyésztő lemezekre oltottuk le az alábbi sűrűségben:

mell prosztata vastagbél

2500 sejt/rezervoár 2500 sejt/rezervoár 1000 sejt/rezervoár 1000 sejt/rezervoár.

A sejteket egy éjszakán át 37 ^öC-on, 5% CO2 atmoszférában hagytuk megtapadni. A pl uraflavin A-t a tenyésztőközeggel az alábbi végkoncentrációkra hígítottuk: 50,0, 16,67, 5,56, 1,85, 0,617, 0,206, 0,069, 0,023 pM. A flavopíridoit az alábbi koncentrációkra hígítottuk: 2,0, 0,667, 0,222, 0,074, 0,025, 0,008, 0,003, 0,001 pM. Mindkét vegyületet tríplikátban vizsgáltuk az Összes koncentrációban. A sejteket friss tápközeggel mostuk, és a vegyüieteket 100 pl végtérfogat bán adtuk a sejtekhez. A sejteket a vegyül eltel együtt 47 ^öC-on, 5% CO2 jelenlétében körülbelül 72 órán keresztül inkubáltuk. A kívánt időpontban 25 pl MTT-t (10 fflg/ml HBSS-ben) adtunk minden egyes rezervoárba.

.· <·* « φ \ Λ * * * * ΐ :*·**· Κ· « *'»φ «Φ« *Λ«Φ < * * * '♦ ' * φΦ -xjí φφ «*»

A lemezeket 37 °C-on 2-4 órán keresztül inkubáltnk, Az MTT-t és a közeget eltávolitottuk, és rezervoáronként bemértünk 200 μΙ DMSO-í, A leolvasásokat 570 nm~en végeztük. Az alábbi e re d m é n y e k e t k a p t u k.

Sejt típus	Plurafíavin Á íC«o	Flavopiridol ÍC_5e
Mell	<23 nM	90 nM
Prosztata	10 nM	80 nM
Vastagbél	0,35 nM	30 nM
Tüdő	3,0 nM	90 nM

Lágy agaros vizsgálatban a plurafl-avin A és flavopiridol hatását lenkémiasejteken vizsgáltuk. Az alábbi IC50 értékeket kaptuk: 60 bM (plurafíavin A) és 0,5, 0,6 μΜ (flavopiridol).

Claims

1. (I) általános képletű vegyü letek - a képletben

R_s jelentése eukorcsoport,

R₂ jelentése -COOH vagy ahol R? jelentése cukoré- söpört,

Rj jelentése epoxid-tartaknú csoport, 1-6 szénatomos alki lesöpört vagy 2-6 szénatornos alkeniicsoport, ahol a fenti alkil- és alkeniicsoport adott esetben legalább egy OH csoporttal van szubsztituálva,

R₅ jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport,

2-6 szénatomos alkeniicsoport vagy 2-6 szénatomos alkinlicsoport,

R-4, R._ö, Rg és R_Je jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-6 szénatemos alkilcsoport, 2-6 szénatomos aikenilesoport, 2-6 szénatomos alklnlicsoport, -X₂.H általános képletű csoport, ahol H közvetlenül az X₂ csoport első atomjához kapcsolódik, vagy -X₂R₃₂ általános képletű csoport, ahol Rn közvetlenül az X₂ csoport első atomjához kapcsolódik, vagy adott esetben R₄ és R₆ együtt kettős kötéssel kapcsolódó X₂ csoportot jelent, vagy adott esetben R§ és R_lö. együtt kettős kötéssel kapcsolódó X? csoportot jelent,

X₂ jelentése oxigénatom, NH csoport, szénatomos alkil) csoport, -N~(2~6 szénatemos aikenil) csoport, -N~(2-6 szénatomos aikinii) csoport vagy kénatom,

R_!2 jelentése 1-6 szénatornos alkilcsoport, 2-6 szénatomos alkeniicsoport, 2-6 szénatemos aíkínílcsoport, arllcso* «· port vagy acíksoport, és m és n értéke egymástól függetlenül 1 vagy 2 valamint ezek összes sztereokémiái formája és a fenti formák tetszőleges arányú elegyek és sói.

2. Az k igénypont szerinti vegyület, ahol R_? jelentése a.mí no cukor.

3. Az k vagy 2. igénypont szerinti vegyület, ahol R₇ jelentése (HA) képletű csoport.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, ahol n értéke 2.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, ahol Rí jelentése aminocnkor,

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, ahol Rj jelentése (ΠΙΑ) képletű csoport.

7. Az 1-6. igénypontok, bármelyike szerinti vegyület, ahol R₃ jelentése (a) vagy (d) képletű csoport.

8. Az 1. Igénypont szerinti (JA) képletű vegyület, és Összes sztereokémiái formál és a fenti formák tetszőleges arányú elegye!, valamint fiziológiásán elfogadható sói és származékai.

9. Az 1. igénypont szerinti (IB) képletű vegyület, és összes sztereokémiái formál és a fenti formák tetszőleges arányú elefiziológiásán el fogadható gyek va nt fiziológiásán elfogat tó sói es szarmazefcm

K). Az k igénypont szerinti (I.E) képletű vegyület, és összes sztereokémiái formái és a fenti formák tetszőleges arányú elegyei, valamint fiziológiásán elfogadható sói és származékai.

i k Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti (I) általános χ* *«««

- 38 képletü vegyület, amely Actinomycetales species HÁG 003959, ÖSM 12931, vagy annak variánsai vagy mutánsai tenyésztőközegben, megfelelő körülmények között az (I) általános képletü vegyületek legalább egyikének megjelenéséig történő tenyésztésével, maid a vegyület izolálásával állítható elő.

12. A ll. igénypont szerinti vegyület, ahol az izolált vegyület egy származékká vagy fiziológiásán elfogadható sóvá van átalakítva.

13. Készítmény, amely legalább egy, az 1 -10. igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képletü vegyületet vagy annak fiziológiásán elfogadható sóját vagy származó es egy élte gadható vivoanyagot tartalmaz.

14. A 13. igénypont szerinti készítmény, amelyben az elfogadható vivóanyag egy gyógyászatiig elfogadható vivőanyag.

15. Eljárás az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti legalább egy (I) általános képletü vegyület vagy annak, fiziológiásán elfogadható sója előállítására, azzal jellemezve, hogy az Actinomycetales· species HÁG 003959, DSM 12931 mikroorganizmust vagy annak egy variánsát vagy mutánsát megfelelő körülmények között tenyésztőközegben tenyésztjük, amíg legalább egy (Γ) általános képletü vegyület jelen lesz a tenyésztőközeghen, majd a vegyületet izoláljuk.

ló. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izolált vegyületet valamely származékká vagy fiziológiásán elfogadható sóvá alakítjuk át,

17. A 15. vagy 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést aeróh körülmények között, 18 - 35 °C hőmérsékleten és pH 6 - 8 értéken végezzük.

18, A 15 - 17, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (1) általános képietű vegyületet .redukálószer alkalmazásával alakítjuk át valamely származékká,

19-. Az 1. - 12. igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képietű vegyüiet, vagy annak fiziológiásán elfogadható sója vagy származéka, legalább egy kettős szálú nukleinsav transzkrípeiőjának gátlására történő alkalmazásra,

20. Az 1 - 12, igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képietö vegyüiet vagy annak fiziológiásán elfogadható sója vagv származéka alkalmazása eitosztatlkum előállítására.

21. Az 1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képietű vegyüiet vagy annak fiziológiásán elfogadható sója vagy szar ma alkalmazása vastagbél tumorok kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására,

22, Az 1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti (1) általános képietű vegyüiet vagy annak fiziológiásán elfogadható sója vagy származéka alkalmazása emlő (mell) tumorok kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására,

23, Az 1 - 12, igénypontok bármelyike szerinti (1) általános képietű vegyüiet vagy annak fiziológiásán elfogadható sója vagy származéka alkalmazása tüdő tumorok kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.

24, Az 1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képietű vegyidet vagy annak fiziológiásán elfogadható sója vagy származéka alkalmazása prosztata tumorok kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.

25, Az .1 - 12, igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képietű vegyüiet vagy annak fiziológiásán elfogadható sója vagy származéka alkalmazása leukémia kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.

26. Az. 1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képletű vegyüiet vagy annak fiziológiásán elfogadható sója vagy alkalmas gyógyszer előállítására.

27. Aetinom.ycetales species HÁG ÖÖ3959 (DSM 12931).

származéka alkalmazasa mrkróhás fertőzések kezelésére