JP2000178274A - 抗腫瘍性物質ｂｅ−５４０１７及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】新しい抗腫瘍剤の提供。 【解決手段】ストレプトミセス属に属する微生物または
その変異株を培養し、その培養物から二次代謝産物を採
取することによって製造した下記の構造式で表される化
合物を用いる。 【効果】マウス白血病細胞及びヒト大腸癌細胞、ヒト肺
癌細胞に対して、試験管内試験において増殖阻害活性を
示した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は医薬の分野で有用で
あり、より具体的には腫瘍細胞の増殖を阻害して抗腫瘍
作用を示す新規化合物、その製造法及びその用途並びに
該化合物を産生する微生物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】癌化学療法の分野においては、既に多く
の化合物が医薬品として実用化されている。しかしなが
らさまざまな種類の腫瘍に対してその効果は必ずしも充
分ではなく、また臨床上これらの薬剤に対する腫瘍細胞
の耐性現象が明らかにされるにつれ、その臨床的応用性
は複雑化している[第47回日本癌学会総会記事、第１２
〜１５頁（１９８８年）参照]。このような状況は依然
として続いており、癌治療の分野においては常に新規抗
腫瘍性物質の開発が求められている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の希求に
応えることのできる新規な抗腫瘍性物質を提供すること
を目的とするものである。即ち、既存の抗腫瘍性物質が
充分に効果を発揮できない種々の腫瘍に対しても抗腫瘍
効果を発揮する化合物を提供することが本発明が解決し
ようとする課題である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく、抗腫瘍活性を有する物質について微生
物二次代謝産物を広くスクリーニングした結果、後記構
造式[Ｉ]で表される化合物が優れた抗腫瘍作用を示すこ
とを見いだして本発明を完成した。

【０００５】即ち、本発明は新規な構造式[Ｉ]

【０００６】

【化２】 で表される化合物、その製造法及び用途並びに該化合物
を産生する能力を有するストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に関するものであ
る。

【０００７】なお、抗腫瘍効果及び生産菌株ストレプト
ミセス エスピー Ａ５４０１７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｓｐ. A５４０１７）に因んで、構造式[Ｉ]で
表される化合物をＢＥ−５４０１７と称する。

【０００８】以下に本発明にかかわる新規な抗腫瘍性物
質ＢＥ−５４０１７の物理化学的な性状を示す。下記に
NMR測定における略号の意味を示す。 s： シングレット d： ダブレット t： トリプレット q： カルテット m： マルチプレット br： ブロード J： カップリング定数 Hz： ヘルツ

【０００９】ＢＥ−５４０１７の物理化学的性状 性状 ; 白色粉末 分子式 ; C₂₃H₁₈N₃O₅Cl 質量分析 ; [HRFAB-MS]m/z 実測値： 451.0971(M+H)⁺ 計算値： 451.0935(C₂₃H₁₉N₃O₅Cl) 比旋光度 ; [α]²⁰ _D - 428 ゜(c 0.5, DMSO) 紫外部吸収スペクトル ; λ_max (MeOH) nm (ε) : 208
(25,500), 255 (24,500), 274 (sh, 6,500), 302 (sh,
6,100), 316 (sh, 9,700), 336 (sh, 15,200), 350 (2
4,500), 380 (24,500) 赤外部吸収スペクトル ; ν_max (KBr) cm^-1 : 3361, 29
45, 1722, 1601, 1446,1344, 1223, 1142, 1101, 1038,
958, 837, 739, 621, 428 核磁気共鳴スペクトル；¹H - NMRスペクトル (500MHz,
acetone-d₆) δ2.96(3H,s), 4.08(3H, s), 4.17(3H,
s), 6.57(2H, brs), 7.15(1H,t, J=7.3Hz), 7.25(2H,
m), 7.51(1H, d, J=8.9Hz), 7.72(1H, d, J=7.3Hz), 8.
10(1H, d, J=2.1Hz), 8.24(1H, d, J=8.5Hz)¹³ C - NMRスペクトル (125MHz, acetone-d₆) δ25.2
(q), 33.9(q), 62.5(q), 75.4(s), 87.5(s), 104.5(s),
112.3(d), 114.6(s), 111.6(d), 118.8(d), 120.8(d),
121.2(d), 123.3(s), 123.6(d), 124.8(d), 126.9(s),
127.1(s), 132.8(s), 137.7(s), 138.0(s), 139.1(s),
171.5(s), 174.5(s) 溶解性；酢酸エチル、アセトン、ジメチルスルホキシド
に溶け易く、エタノール、水に溶けにくい。 酸性、中性、塩基性物質の区別；中性物質 Ｒｆ値；０．６３[メルク社製キーゼルゲル６０Ｆ₂₅₄使
用、展開溶媒：クロロホルム−メタノール（２０：
１）] 呈色反応；硫酸反応 陽性

【００１０】ＢＥ−５４０１７の生物学的活性（抗腫瘍
作用） 抗腫瘍性物質ＢＥ−５４０１７のマウス実験腫瘍細胞に
対する増殖阻害作用を決定するため、試験管内で試験を
行なった。マウス白血病細胞Ｐ３８８に対する抗腫瘍試
験は、ＢＥ−５４０１７をジメチルスルホキシドに溶解
後、逐次ジメチルスルホキシドで希釈し、次に牛胎児血
清１０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地(２０μＭの2-メル
カプトエタノールを含む)で１０倍希釈して検液とし
た。細胞増殖阻害の検定は、１×１０³個の腫瘍細胞を
含む細胞培養培地(牛胎児血清１０％含有ＲＰＭＩ１６
４０培地、２０μＭの２−メルカプトエタノールを含
む)１００μlに対し上記検液５μlを加えた。３７℃で
７２時間、５％ＣＯ₂下で培養後、ＭＴＴ測定法により
対照群と比較した。その結果、ＢＥ−５４０１７は白血
病細胞に対し、強い増殖阻害活性を示し、５０％増殖阻
害濃度は第１表の通りであった。

【００１１】更に、ＢＥ−５４０１７のヒト癌細胞に対
する抗腫瘍活性を試験管内で試験した。細胞はヒト大腸
癌細胞ＤＬＤ−１及びヒト肺癌細胞ＰＣ−１３を使用
し、細胞培養用培地は、全ての癌細胞共に牛胎児血清１
０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。ＢＥ−５４０
１７をジメチルスルホキシドに溶解後、逐次ジメチルス
ルホキシドで希釈し、次に牛胎児血清１０％含有ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で１０倍希釈して検液とした。腫瘍細胞
増殖阻害の検定は、１×１０³個の腫瘍細胞を含む細胞
培養用の培地１００μｌを９６穴マイクロプレートに分
注し、３７℃で２４時間、５％ＣＯ₂下で培養した後、
上記検液５μlを加えた。更に７２時間培養後、５０μl
の５０％トリクロロ酢酸で細胞を固定し、０．４％スル
ホローダミンＢで染色後、１０ｍＭトリス液を用いて細
胞から色素を抽出した。４５０ｎｍを対照波長として５
５０ｎｍに於ける吸光度を測定して対照群と比較した。
その結果、ＢＥ−５４０１７はヒト腫瘍細胞においても
強い増殖阻害活性を示し、その５０％増殖阻害濃度は第
１表の通りであった。

【００１２】

【表１】 上述したようにＢＥ−５４０１７はマウス及びヒトの腫
瘍細胞に対し顕著な増殖阻害作用を示す。従って、本発
明はヒトをはじめとする哺乳動物の抗腫瘍剤として有用
である。

【００１３】次に、ＢＥ−５４０１７の製造法について
説明する。本発明の抗腫瘍性物質ＢＥ−５４０１７の製
造に使用する微生物は、抗腫瘍性物質ＢＥ−５４０１７
を生産するものならばいずれでも良いが、例えば以下の
菌学的性状を有する微生物、即ち、A５４０１７を用い
ることができる。 １．形態 A５４０１７はよく伸長し分岐する基生菌糸と気菌糸を
形成し輪生岐および菌糸の分断は認められない。気菌糸
上には胞子の長い連鎖（２０〜５０個）を作り、その形
態はらせん状である。胞子の表面は平滑で大きさが０．
８〜１．２×０．４〜０．７μｍ位の卵形〜長円形であ
り、胞子のう、鞭毛胞子および菌核等の特殊な器官は観
察されない。

【００１４】２．各種寒天平板培地における培養性状 各種寒天平板培地における培養性状（２８℃、１４日間
培養）は第２表の通りであった。

【表２】

【００１５】３．生育温度 生育温度（イースト・麦芽寒天培地、１４日間培養）は
第３表の通りであった。

【表３】

【００１６】４．生理学的諸性質 生理学的諸性質は第４表の通りであった。

【表４】

【００１７】５．炭素源の利用能 炭素源の利用能は第５表の通りであった。

【表５】

【００１８】6．菌体成分 細胞壁からは、ＬＬージアミノピメリン酸およびグリシ
ンが検出された。 以上の菌学的諸性質によりA５４０１７は放線菌ストレ
プトミセス属に属すると考えられる。したがってA５４
０１７をストレプトミセス エスピー A５４０１７
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ. A５４０１７）と
称することとした。尚、本菌株は通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号は
ＦＥＲＭ Ｐ−１６９５２である。

【００１９】本発明のストレプトミセス エスピー A
５４０１７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ. A５４
０１７）の変異株は、例えばX線もしくは紫外線などの
照射処理、例えばナイトロジェンマスタード、アザセリ
ン、亜硝酸、２−アミノプリンもしくは１−メチル−３
−ニトロ−１−ニトロソグアニジン(ＭＮＮＧ)等の変異
誘起剤による処理、ファージ接触、形質転換、形質導入
又は接合などの通常用いられる菌種変換処理方法により
ストレプトミセス エスピー Ａ５４０１７変異させた
微生物である。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明のＢＥ−５４０１７を製造
するにあたり、ＢＥ−５４０１７の生産菌株を栄養源含
有培地に接種して好気的に発育させることにより、ＢＥ
−５４０１７を含む培養物が得られる。栄養源として
は、放線菌の栄養源として公知のものが使用できる。例
えば、炭素源としては、市販されているブドウ糖、麦芽
糖、デンプン、庶糖、糖密又はデキストリンなどが単独
又は混合物として用いられる。窒素源としては、市販さ
れているソイビーンミール、コーンスティープリカー、
肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、綿実粉、ポリペプト
ン、小麦胚芽、魚粉、ミートミール、脱脂米ヌカ、脱脂
肉骨粉、無機アンモニウム塩又は硝酸ナトリウムなどが
単独又は混合物として用いられる。無機塩としては、市
販されている炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、硫酸マグネシウム、臭化ナトリウム、ホウ酸ナ
トリウム又は各種リン酸塩などを使用することができ
る。その他必要に応じて、鉄、マンガン、亜鉛、コバル
ト、モリブデン酸などの重金属塩を微量添加することも
できる。また、発泡の激しい場合には消泡剤として、例
えば大豆油又は亜麻仁油などの植物油、オクタデカノー
ルなどの高級アルコール類、各種シリコン化合物などを
適宜添加してもよい。これらのもの以外でも、該生産菌
が利用し、ＢＥ−５４０１７の生産に役立つもの例えば
３−(Ｎ−モルホリノ)プロパンスルホン酸、フミン酸又
はホウ酸ナトリウムなどであれば、いずれも使用するこ
とができる。

【００２１】培養方法としては、一般の微生物代謝産物
の生産方法と同様に行なえばよく、固体培養でも液体培
養でもよい。液体培養の場合は、静置培養、攪拌培養、
振盪培養又は通気培養などのいずれを実施してもよい
が、特に振盪培養又は深部通気攪拌培養が望ましい。培
養温度は１４〜３４℃が適当であるが、好ましくは２０
〜２７℃である。好ましい培地のｐＨは４〜８の範囲
で、培養時間は２４〜１６８時間、好ましくは７２〜１
４４時間である。培養物から目的とするＢＥ−５４０１
７を採取するには、微生物の生産する代謝物から採取す
るのに通常使用される分離手段を適宜利用することがで
きる。

【００２２】ＢＥ−５４０１７は菌体中に存在するの
で、菌体より通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオ
ン交換樹脂法又は吸着若しくは分配クロマトグラフィー
法及びゲル濾過法などを単独又は組み合わせて行なうこ
とにより精製できる。

【００２３】好ましい分離精製の例として次の方法が挙
げられる。まず培養液を濾過し、菌体を得る。得られた
菌体をメタノール又はアセトンなどの有機溶媒を用いて
抽出する。得られた粗抽出物について、水−酢酸エチル
で分配を行ない、酢酸エチル層を留去後、得られる残留
物について逆相カラムクロマトグラフィーを行なう。Ｂ
Ｅ−５４０１７を含む画分を減圧下で濃縮し、再度逆相
カラムクロマトグラフィーを行うことにより、ＢＥ−５
４０１７を得ることができる。

【００２４】本発明の化合物ＢＥ−５４０１７は腫瘍細
胞の増殖を阻害し、抗腫瘍効果を発揮するが、本発明化
合物を抗腫瘍剤として使用する際の投与形態としては各
種の形態を選択でき、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、
顆粒剤若しくは液剤などの経口剤、又は例えば溶液若し
くは懸濁液などの殺菌した液状の非経口剤が挙げられ
る。

【００２５】固体の製剤は、そのまま錠剤、カプセル
剤、顆粒剤又は粉末の形態として製造することもできる
が、適当な添加物を使用して製造することもできる。そ
のような添加物としては、例えば乳糖若しくはブドウ糖
などの糖類、例えばトウモロコシ、小麦若しくは米など
のデンプン類、例えばステアリン酸などの脂肪酸、例え
ばメタケイ酸アルミン酸マグネシウム若しくは無水リン
酸カルシウムなどの無機塩、例えばポリビニルピロリド
ン若しくはポリアルキレングリコールなどの合成高分
子、例えばステアリン酸カルシウム若しくはステアリン
酸マグネシウムなどの脂肪酸塩、例えばステアリルアル
コール若しくはベンジルアルコールなどのアルコール
類、例えばメチルセルルース、カルボキシメチルセルロ
ース、エチルセルロース若しくはヒドロキシプロピルメ
チルセルロースなどの合成セルロース誘導体、その他、
水、ゼラチン、タルク、植物油、アラビアゴムなど通常
用いられる添加物が挙げられる。

【００２６】これらの錠剤、カプセル剤、顆粒剤及び粉
末などの固形製剤は一般的には０．１〜１００重量％、
好ましくは５〜１００重量％の有効成分を含む。液状製
剤は、水、アルコール類又は例えば大豆油、ピーナッツ
油若しくはゴマ油などの植物由来の油など液状製剤にお
いて通常用いられる適当な添加剤を使用し、懸濁液、シ
ロップ剤又は注射剤などの形態として製造される。特
に、非経口的に筋肉内注射、静脈注射又は皮下注射で投
与する場合の適当な溶剤としては、例えば注射用蒸留
水、塩酸リドカイン水溶液（筋肉注射用）、生理食塩
水、ブドウ糖水溶液、エタノール、静脈内注射用液体
（例えばクエン酸及びクエン酸ナトリウムなどの水溶
液）若しくは電解質溶液（点滴静注及び静脈内注射用）
など、又はこれらの混合溶液が挙げられる。これらの注
射剤はあらかじめ溶解したもののほか、粉末のままある
いは適当な添加剤を加えたものを用時溶解する形態もと
り得る。これらの注射液は通常、０．１〜１０重量％、
好ましくは１〜５重量％の有効成分を含む。又、経口投
与の懸濁剤又はシロップ剤などの液剤は、０．５〜１０
重量％の有効成分を含む。

【００２７】本発明の化合物の実際に好ましい投与量
は、使用される化合物の種類、配合された組成物の種
類、適用頻度及び治療すべき特定部位、宿主及び腫瘍に
よって変化することに注意すべきである。例えば、１日
あたりの成人の投与量は、経口投与の場合、１０〜５０
０ｍｇであり、非経口投与、好ましくは静脈注射の場
合、１日あたり、１０〜１００ｍｇである。なお、投与
回数は投与方法及び症状によって異なるが、１回ないし
５回である。

【００２８】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。 実施例ＢＥ−５４０１７の製造法 斜面寒天培地に接種した放線菌A５４０１７をグルコー
ス１．０％、デキストリン２．０％、ソイビーンミール
０．２％、小麦胚芽０．６％、ポリペプトン０．５％、
酵母エキス０．３％、フミン酸０．０３％、炭酸カルシ
ウム０．１％からなる培地（ｐＨ７．０)１１０ｍｌを
含む５００ｍｌ容の三角フラスコ3本に接種し、２８℃
で４８時間、回転振盪機（毎分１８０回転）上で培養し
た。この培養液を２ｍｌずつ上記の培地を１１０ｍｌ含
む５００ｍｌ容の三角フラスコ１００本に接種し２８℃
で４日間、回転振盪機（毎分１８０回転）上で培養し
た。

【００２９】上記の培養により得られた培養液（約１０
Ｌ）から濾過により菌体を得た。この菌体にメタノール
（２．５Ｌ）を加え、攪拌後濾過した。この操作をもう
一度繰り返した。これらのメタノール抽出液をあわせて
減圧下で濃縮後、水（１Ｌ）を加え、１Ｌの酢酸エチル
で2回抽出した。酢酸エチル画分を減圧下に濃縮乾固
し、メタノール（０．５Ｌ）に溶解した後、等量のｎ-
ヘキサンで3回洗浄した。このメタノール層を減圧下に
濃縮することにより、ＢＥ−５４０１７を含む粗精製物
を０．９７ｇ得た。これをシリカゲルのカラム（メルク
社製キーゼルゲル６０、φ３．３×６０ｃｍ）に供し、
クロロホルム−メタノール（１００：１）で洗浄後、ク
ロロホルム−メタノール（５０：１）で溶出した。溶出
液を濃縮乾固後、セファデックスＬＨ−２０（ファルマ
シアバイオテク社製、φ３．３×６０ｃｍ）のカラムに
かけメタノールで溶出し、目的の化合物を含む画分を減
圧下濃縮乾固した。次にその乾固物についてＯＤＳカラ
ム（資生堂社製カプセルパックＣ₁₈ ＵＧ−１２０、φ
２．０×２５ｃｍ）を使用して高速液体クロマトグラフ
ィーを行なった。移動相に、水−メタノール（２０：８
０）を用いて、流速１０ｍｌ/分で溶出することにより
ＢＥ−５４０１７（９９．６ｍｇ）を得た。

【００３０】以下に本発明の化合物の製剤例を示すが、
本発明の化合物の製剤は本製剤例に限定されるものでは
ない。 製剤例１ 本物質（ＢＥ−５４０１７）１０部、重質酸化マグネシ
ウム１５部及び乳糖７５部を均一に混合して、５００μ
ｍ以下の粉末状又は細粒状の散剤とする。この散剤をカ
プセル容器に入れカプセル剤とした。 製剤例２ 本物質（ＢＥ−５４０１７）４５部、澱粉１５部、乳糖
１６部、結晶性セルロース２１部、ポリビニルアルコー
ル３部及び蒸留水３０部を均一に混合した後、破砕造粒
して乾燥し、次いで篩別して直径３５５〜１４００μｍ
の大きさの顆粒剤とした。 製剤例３ 製剤例２と同様の方法で顆粒剤を作製した後、この顆粒
剤９６部に対してステアリン酸カルシウム３部を加えて
圧縮成形し直径１０ｍｍの錠剤を作製した。 製剤例４ 製剤例２と同様の方法で得られた顆粒剤９０部に対して
結晶性セルロース１０部及びステアリン酸カルシウム３
部を加えて圧縮成形し、直径８ｍｍの錠剤とした後、こ
れにシロップゼラチン、沈降性炭酸カルシウム混合懸濁
液を加えて糖衣錠を作製した。 製剤例５ 本物質（ＢＥ−５４０１７）０．６部、非イオン系界面
活性剤２．４部、生理的食塩水９７部を加温混合してか
らアンプルに入れ、滅菌を行なって注射剤を作製した。

【００３１】

【発明の効果】本発明に記載するＢＥ−５４０１７は、
マウス及びヒトの癌細胞に対して強い増殖抑制効果を示
すことから、医薬の分野で癌の治療剤として有用であ
る。

【００３２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 近藤 久雄 茨城県つくば市大久保３番地 萬有製薬株 式会社つくば研究所内 (72)発明者 小尻 勝久 東京都中央区日本橋本町２丁目２番３号 萬有製薬株式会社内 (72)発明者 須田 寛之 茨城県つくば市大久保３番地 萬有製薬株 式会社つくば研究所内 Ｆターム(参考） 4B064 AE57 CA03 CC03 CE08 CE10 DA05 4B065 AA50X AC12 BA22 BC03 BC26 BD16 BD18 CA18 CA34 CA44 4C065 AA03 BB04 CC03 DD03 EE04 HH01 JJ05 KK09 LL02 LL03 LL04 PP01 QQ10 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 CB05 NA05 ZB26 ZB27

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】構造式［I］ 【化１】 で表される化合物。
2. 【請求項２】ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
   ｅｓ）属に属し、請求項1記載の構造式[Ｉ]で表される
   化合物を産生する能力を有する微生物を培養し、その培
   養物から該構造式[Ｉ]で表される化合物を採取すること
   を特徴とする、該構造式[Ｉ]で表される化合物の製造
   法。
3. 【請求項３】請求項1記載の構造式[Ｉ]で表される化合
   物を産生する能力を有する微生物が、ストレプトミセス
   エスピー A５４０１７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
   ｓｐ. A５４０１７）又はその変異株である請求項２
   記載の製造法。
4. 【請求項４】請求項1記載の構造式[Ｉ]で表される化合
   物を有効成分とする抗腫瘍剤。
5. 【請求項５】請求項1記載の構造式[Ｉ]で表される化合
   物を産生する能力を有することを特徴とするストレプト
   ミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物
   又はその変異株。
6. 【請求項６】ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
   ｅｓ）属に属する微生物が、ストレプトミセス エスピ
   ー A５４０１７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.
   A５４０１７）又はその変異株である請求項５記載の微
   生物。