PL184521B1

PL184521B1 - Zastosowanie cząsteczki przeciwciała swoistego wobec epitopu kodowanego przez zmienny egzon v genu CD do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka łuskowatokomórkowego

Info

Publication number: PL184521B1
Application number: PL96327066A
Authority: PL
Inventors: Heider@Karl@Heinz; Gunther@Adolf; Ostermann@Elinborg; Patzelt@Erik; Sproll@Marlies
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int; Karlsruhe Forschzent
Priority date: 1995-12-06
Filing date: 1996-12-05
Publication date: 2002-11-29
Also published as: BG62985B1; TR199801027T2; EP0865609A1; CO4520233A1; JP2000502067A; MX9804459A; AU1177397A; SK73698A3; PL327066A1; CN1151377C; AU726704B2; ES2190484T3; HK1011560A1; CZ174198A3; BG102513A; EE03783B1; AR004360A1; NO982588D0; EP0865609B1; DK0865609T3

Abstract

1. Zastosowanie czasteczki przeciwciala swoistego wobec epitopu kodowanego przez zmienny egzon v6 genu CD44 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka luskowato- komórkowego. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy zastosowania cząsteczki przeciwciała swoistego wobec epitopu kodowanego przez zmienny egzon v6 genu CD44 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka łuskowatokomórkowego.

Ostatnio wykazano, że ekspresja odmian glikoproteiny powierzchniowej jest niezbędna i wystarczająca do wyzwolenia tzw. spontanicznego zachowania przerzutowego w linii komórkowej nie przerzutowego gruczolakoraka trzustki szczura, jak również linii nie przerzutowego mięsaka włóknistego szczura (Gunthert i in., 1991). Podczas gdy najmniejsza izoforma CD44, standardowa postać CD44, ulega powszechnej ekspresji w szeregu różnych tkanek, w tym tkanek nabłonkowych, pewne odmiany składania DC44 (CD44v) ulegają ekspresji wyłącznie w podgrupie komórek nabłonkowych. Izoformy CD44 wytwarzane są przez alternatywne składanie w taki sposób, że sekwencj e 10 egzonów (v 1-v 10) CD44 są wycinane całkowicie, ale mogą występować w różnych kombinacjach w większych odmianach (Screaton i in., 1992; Heider i in., 1993; Hofmann i in., 1991). Odmiany różnią się tym, że różne sekwencje aminokwasowe są wprowadzone w konkretne miejsca zewnątrzkomórkowej części białka. Takie odmiany można wykrywać w różnych ludzkich komórkach nowotworowych i tkankach. Tak więc, badano ekspresję odmian CD44 w trakcie kancerogenezy okrężnicy i odbytnicy (Heider i in., 1993). Nie występowała ekspresja odmian CD44 w normalnym nabłonku ludzkiej okrężnicy i jedynie nieznaczną ekspresję obserwuje się w proliferujących komórkach krypt. W późniejszych stadiach progresji nowotworu, np. w gruczolakorakach, wszystkie zmiany złośliwe wyrażały odmiany CD44. Ponadto, ostatnio wykazano ekspresję odmian składania CD44 w aktywowanych limfocytach i chłoniakach nie-Hodgkin'owskich (Koopman i in., 1993).

Zastosowano różne podejścia wykorzystujące różnicową ekspresję zmiennych egzonów genu CD44 w tkankach nowotworowych i normalnych, w celach diagnostycznych i terapeutycznych (WO 94/02633, WO 94/12631, WO 95/00658, WO 95/00851, EP 0531300).

Badano również ekspresję odmian cząsteczek CD44 w rakach łuskowatokomórkowych. Salmi i in., (1993) odkryli przy użyciu przeciwciała Var3.1 przeciwko v6, że w porównaniu z komórkami normalnymi ekspresja v6 zmniejszała się na komórkach nowotworowych. Przy użyciu przeciwciał 11.9, swoistych wobec v6, Brooks i in. (1995) stwierdzili heterogenne znakowanie się raków nosogardzieli. Silne znakowanie uzyskano jedynie w 2 na 12 przypadków, podczas gdy większość przypadków wykazywała jedynie ogniskową, ekspresję v6 wykrywaną immunohistologicznie.

Celem niniejszego wynalazku było opracowanie nowych sposobów diagnozowania i leczenia raków łuskowatokomórkowych i dostarczenie środków do takich sposobów

Cel ten osiągnięto dzięki niniejszemu wynalazkowi. Dotyczy on zastosowania do diagnozowania i leczenia raków łuskowatokomórkowych, cząsteczki przeciwciała skierowanego przeciwko zmiennemu egzonowi v6 genu CD44 jako znacznikowi cząsteczkowemu. Konkretnie, wynalazek dotyczy sposobów opartych na silnej, homogennej ekspresji v6 w rakach łuskowatokomórkowych, którąnieoczekiwanie stwierdzono, w przeciwieństwie do heterogennej ekspresji w gruczolakorakach (np. okrężnicy albo sutka).

184 521

Sposobami stosowanymi sątakie, w których stosuje się cząsteczkę przeciwciała, które rozpoznaje sekwencję aminokwasową QWFGNRWHEGYRQT. Przeciwciało monoklonalne BIWA-1 (klon vFF-18) wydzielane przez linię komórkową hybrydoma, którą zdeponowano 7.06.1994 roku pod numerem DSM ACC2174 w DSM -Deutsche Sammlung fUr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Brunszwik, Niemcy, i pochodne tego przeciwciała są szczególnie korzystne.

Sposoby diagnozowania można przeprowadzić na próbkach poza organizmem ludzkim albo zwierzęcym, np. w celach diagnostycznych, albo in vivo.

Sposób można zastosować w celu badania próbek od pacjentów podejrzewanych o to, że mają raka łuskowatokomórkowego albo u których już przeprowadzono diagnozę, ale nowotwór wymaga bardziej precyzyjnego scharakteryzowania.

Wykrywanie odmiany cząsteczek CD44, które zawierają sekwencję aminokwasową kodowaną przez egzon zmienny v6 można przeprowadzić na poziomie białka, stosując przeciwciała albo na poziomie kwasu nukleinowego stosuj ąc swoiste sondy kwasu nukleinowego albo startery do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Wynalazek dotyczy również cząsteczek przeciwciał i kwasów nukleinowych, które są przydatne jako sondy do tych celów i zastosowanie tych przeciwciał i kwasów nukleinowych do diagnozowania i badania raka łuskowatokomórkowego.

W celu diagnostyki in vivo, cząsteczki przeciwciała swoistego wobec CD44V można sprzęgać, przykładowo, z izotopem promieniotwórczym i wstrzykiwać do układu krążenia pacjenta. Po wybiórczym wiązaniu przeciwciała z nowotworem można go obrazować stosując odpowiedni układ wykrywający. Procedury do celów immunogiagnostycznych tego rodzaju in vivo są znane w stanie techniki (Thomas i in., 1989).

Cząsteczki przeciwciał posiadających odpowiednią swoistość można korzystnie stosować do leczenia raka łuskowatokomórkowego. Możnaje zastosować terapeutycznie, przykładowo, w ten sam sposób co przeciwciało 1.1ASML (Seiter i in., 1993). Mogą być one podawane układowo albo miejscowo, np. drogą dożylną (jako bolus albo we wlewie ciągłym) albo drogą wstrzyknięć/infuzji dootrzewnowych, domięśniowych, podskórnych albo inaczej. Możliwe jest również perfundowanie poszczególnych narządów albo kończyn. Procedury podawania przeciwciał sprzęgniętych albo niesprzęgniętych (w postaci kompletnych immunoglobulin, fragmentów, rekombinowanych cząsteczek himerycznych itp.) są znane w stanie techniki (Mulshine i in., 1991;Larsoniin., 1991; Vitetta i Thorpe, 1991; Viteetaiin., 1991; Breitzi in., 1992; Press i in., 1989; Weiner i in., 1989; Chatal i in., 1989; Sears i in., 1982).

Sekwencje aminokwasowe i nukleinowe zmiennego egzonu v6 genu CD44 są znane (Hofman i in., 1991; Screaton i in., 1992; Tolg i in., 1993). Istnienie odmian zdegenerowanych albo allelicznych nie ma znaczenia dla zastosowania wynalazku; stąd takie odmiany są nim również objęte.

Sekwencja egzonu v6 ludzkiego genu CD44 ma postać:

Q

A

T

P

S

s T

T

E

T

A

T Q

TC

CAG

GCA ACT

CCT AGT

AGT ACA ACG

GAA

GAA ACA

GCT

ACC CAG

K

E

Q

W

F G

N

R

W

H

E

G

Y

R Q

AAG GAA CAG TGG

TTT GGC AAC

AGA

TGG CAT GAG

GGA TAT CGC CAA

T

P

R

E

D S

H

S

T

G

T

A

ACA CCC AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT G

184 521

Przeciwciała monoklonalne, które są swoiste wobec epitopu kodowanego przez egzon v3 są szczególnie korzystne. Jednakże, dla sposobów według wynalazku możliwe jest również zastosowanie innych cząsteczek przeciwciał, np. fragmentów Fab albo F(ab')2 przeciwciał, przeciwciał jednołańcuchowych (scFv) wytworzonych metodami rekombinacji, przeciwciał chimerycznych albo humanizowanych i innych cząsteczek, które wiążą się swoiście z epitopami kodowanymi przez egzon v6, a zwłaszcza epitopami w sekwencji aminokwasowej QWFGNRWHEGYRQT. Przeciwciała przeciwko znanym sekwencjom aminokwasowym można wytworzyć, przykładowo znanymi sposobami (Catty, 1989). Przykładowo, peptyd o tej sekwencji można wytworzyć syntetycznie i zastosować jako antygen w procedurze immunizacji. Innym sposobem jest wytworzenie białka fuzyjnego, które zawiera pożądaną sekwencję aminokwasową, przez włączenie kwasu nukleinowego (który można wytworzyć syntetycznie albo, przykładowo, reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) z odpowiedniej sondy), który koduje tę sekwencję, do wektora ekspresyjnego i poddanie ekspresji białka fuzyjnego w organizmie gospodarza. Ewentualnie oczyszczone białko fuzyjne można zastosować jako antygen w procedurze immunizacji i wyselekcjonować odpowiednimi sposobami przeciwciała swoiste wobec wstawki, albo, w przypadku przeciwciał monoklonalnych, hybrydoma, które wyrażają przeciwciała swoiste wobec wstawki. Sposoby te znane są w stanie techniki. Heider i in. (1993) i Koopman i in. (1993) opisująwytwarzanie przeciwciał przeciwko zmiennym epitopom CD44.

Oprócz korzystnego przeciwciała BIWA-1 (VFF-18), można zastosować w ten sam sposób pochodne tego albo innych przeciwciał. Przykładowo, specjalista wychodząc z analizy sekwencj i przeciwciała BIWA-1 (VFF -18) i/lub linii komórkowej hybrydoma, która wytwarza to przeciwciało, może wytworzyć rekombinowaną cząsteczkę przeciwciała o tym samym idiotypie, tj. cząsteczkę przeciwciała o tej samej sekwencji aminokwasowej co przeciwciało BIWA-1 (VFF-18) w miejscu wiążącym antygen (region określający komplementarność - CDR). Te pochodne i cząsteczki rekombinowane są włączone do wynalazku.

Fragmenty Fab albo F(ab')2 albo inne fragmenty można wytworzyć, przykładowo, z kompletnych immunoglobulin BIWA-1 (VFF-18) albo innych przeciwciał (Kreitman i in., 1993). W sposobach diagnostycznych, cząsteczki przeciwciała BIWA-1, jego fragmenty albo cząsteczki rekombinowane o tym samym idiotypie można łączyć, przykładowo, z izotopem radioaktywnym takimjak ^BlI,¹ “In, ^mTc albo związkami radioaktywnymi (Larson i in., 1991; Thomas i in., 1989; Srivastava, 1988), enzymami takimi jak peroksydaza albo fosfataza alkaliczna (Catty i Raykundalia, 1989), barwnikami fluorescencyjnymi (Johnson, 1989) albo cząsteczkami biotyny (Guedson i in., 1979). W zastosowaniach terapeutycznych, BIWA-1 (VFF-18) albo cząsteczki przeciwciała pochodzące z VFF-18 można połączyć z toksynami (Vitetta i in., 1991; Vitetta i Thorpe, 1991; Kreitsman i in., 1993; Theuer i in., 1993), cytostatykami (schrappe i in., 1992), prolekami (wang i in., 1992; Senter i in., 1989) albo substancjami radioaktywnymi. Przeciwciało można również połączyć z cytokinąalbo innym peptydem immuno-modulującym, np. czynnikiem martwicy nowotworu albo interleukiną-2.

Specjalista jest również w stanie, po analizie sekwencji aminokwasowej przeciwciała BIWA-1 (VFF-18) i/lub zastosowanie linii hybrydoma, która wytwarza te przeciwciała, szczególnie zawartej w niej informacji genetycznej, wytworzyć rekombinowaną cząsteczkę przeciwciała o tym samym idiotypie co BIWA-1 (VFF-18). Sposoby takie znane są w stanie techniki. Rekombinowane cząsteczki przeciwciał tego rodzaju mogą być, przykładowo, przeciwciałami humanizowanymi (Shin i in., 1989; Gussow i Seemann, 1991), przeciwciałami o podwójnej swoistości (weiner i in., 1993; Goodwin, 1989), Przeciwciała jednołańcuchowe (csFv, Johnson i Bird, 1991)immunoglobuliny kompletne albo ich fragmenty (Coloma i in., 1992; Nesbit i in., 1992; Barbas i in., 1992) albo przeciwciała wytworzone przez mieszanie łańcuchów (Winter i in., 1994). Przeciwciała humanizowane można wytworzyć, przykładowo, przez „przeszczepianie” CDR (EP 0239400). Regiony zrębowe można również modyfikować (EP 0519596). W przypadku przeciwciał humanizowanych, można stosować obecnie sposoby takie jak PCR (patrz przykładowo EP0368684; EP 0438310; WO 9207075) albo modelowanie komputerowe (patrz, przykładowo WO 9222653). Możliwe jest również wytworzenie białek fuzyjnych,

184 521 np. białek fuzyjnych przeciwciała jednołańcuchowego/toksyny (Chaudhary i in., 1990; Friedman i in., 1993). Zastosowanie cząsteczek przeciwciał tego rodzaju jest więc również włączone do wynalazku.

W zakresie możliwości przeciętnego specjalisty leży również określenie dokładnego epitopu BIWA-1 (VFF-18) i dzięki tej wiedzy wytworzenie równoważnych przeciwciał o tej samej swoistości wiązania. Można tego dokonać, przykładowo, przy użyciu badań nad wiązaniem peptydów, jak w przykładzie 2, np. przez zmienianie peptydu Hul. Przeciwciała tego rodzaju sąwięc również włączone do wynalazku.

Sposób diagnozowania i/lub analizowania raka łuskowatokomórkowego można odpowiednio przeprowadzić przez badanie próbek pobranych z organizmu, np. biopsji. Korzystne jest zastosowanie czynników według wynalazku.

Przykładowo, skrawki tkanek można badać immunohistochemicznie przy użyciu przeciwciał sposobami znanymi. Ekstrakty pobrane z próbek tkanek albo płyny ustrojowe można również badać innymi sposobami immunologicznymi stosując przeciwciała, np. badaniem metodą Western blot, enzymatycznym testem immunosorpcyjnym (ELISA, Catty i Raykundalia, 1989), testem radioimmunologicznym (RIA, Catty i Murphy, 1989) albo pokrewnymi testami immunologicznymi.

Dane uzyskane przez wykrywanie i/lub obliczanie ilościowe ekspresji zmiennego epitopu CD44 v6 można więc zastosować do diagnostyki i prognozowania. Może być korzystne skojarzenie tych danych z innymi parametrami prognostycznymi, np. stopniem zaawansowania nowotworu.

Oprócz diagnostyki in vitro, cząsteczki przeciwciała o swoistości według wynalazku są również przydatne do diagnostyki in vivo raka łuskowatokomórkowego. Jeżeli przeciwciało niesie znacznik umożliwiający wykrycie, znacznik można wykrywać w celach diagnostycznych, np. w celu obrazowania nowotworu in vivo albo w chirurgii kierowanej radioaktywnie. Dla stosowania przeciwciał sprzęgniętych z izotopem promieniotwórczym do immunoscyntygrafii (obrazowanie), istnieją liczne sposoby, które można wykorzystać jako podstawę do wykonywania wynalazku (Siccardi i in., 1989; Keenan i in., 1987; Perkins i Pimm, 1992; Coiner i in., 1987; Thompson i in., 1984).

Figury

Figura 1: Oznaczanie swoistości epitopowej BIWA-1 przez wiązanie z syntetycznymi peptydami pochodzącymi z sekwencji ludzkiego CD44v6. Odpowiednie peptydy ze szczurzego CD44v6 badano przeciwciałem 1.1ASML. Wiązanie określano w EliSa, w którym peptydy unieruchamiano na płytce do mikromiareczkowania.

-: brak wiązania, +/-: nieznaczne wiązanie, +: silne wiązanie.

Figura 2: Analiza immunohistochemiczna raka łuskowatokomórkowego krtani (a) i przerzutów do wątroby raka przełyku (b) przy użyciu przeciwciała swoistego wobec CD44v6, BIWA-1. W obu przypadkach obserwowano reakcję przeciwciała z błoną komórkową komórek nowotworowych. Powiększenie 40x, podbarwiane hematoksyliną.

Figura 3: Porównanie wiązania antygenu przez różne mAb swoiste wobec CD44v6. Wiązanie czterech różnych mAb swoistych wobec CD44v6 z ludzkimi komórkami SCC A-431 mierzono w komórkowym ELISA. mAb BIWA-1 wykazuje wyższe powinowactwo wiązania z komórkami nowotworowymi niż inne mAb.

Figura 4: Szczegółowe mapowanie epitopu mAb BIWA-1. Wiązanie BIWA-1 z różnymi nakładającymi się peptydami syntetycznymi, które obejmują aminokwasy 18-32 regionu kodowanego przez CD44v6 mierzono w kompetycyjnym ELISA. Podkreślono minimalną sekwencję wiążącą (peptyd v6 (19-29)).

Figura 5: Biodystrybucja ¹²⁵I-BIWA-1 u myszy nagich z przeszczepem ksenogenicznym A-431. Gromadzenie przeciwciała podano jako % iD/g (Średnia ± SEM) w 4,24,48,120 i 168 godzin po wstrzyknięciu.

184 521

Przykłady

Przykład 1. Ekspresja CD44v6 w raku łuskowatokomórkowym

Tkanki

Ogółem 126 przypadków nowotworu w postaci próbek zatopionych w parafinie analizowano immunohistochemicznie przeciwciałem BIWA-1 (klon VFF-18) w kierunku ekspresji CD44v6. Próbki obejmowały 31 przypadków pierwotnego raka łuskowatokomórkowego (15 przypadków raka krtani i 16 skóry), 91 przypadków przerzutów w węzłach chłonnych (krtań,n = 38; płuca, n = 27; przełyk, n= 11; jama ustna,n= 11; migdałki, n = 4) i4przypadki przerzutów w wątrobie (przełyk).

Przeciwciała

Cały region zmienny typu HPKII CD44v (Hoffmann i in., 1991) amplifikowano z cDNA ludzkich keratynocytów reakcją łańcuchową polimerazy (PCR). Zastosowano dwa startery PCR 5'- CAGGCTGGGAGCC AAATGAAGAAAATG-3', pozycja 25-52, oraz 5' - TG ATA AGG AACGATTG AC ATTAGAGTTGGA-3 ', pozycja 1013-984 regionu zmiennego LCLC97, jak opisany w Hoffmann i in., zawierający miejsce EcoRI, które zastosowano do klonowania produktu PCR bezpośrednio do wektora pGEX-2T (Smith i in., 1988). Powstały konstrukt (pGEX CD44v HpKiI, v3-v10) kodował białko fuzyjne wielkości około 70 kDa, obejmujące transferazę glutationu S z Schistosoma japonicum oraz egzony v3-v10 ludzkiej CD44 (Fig. 1; Heider i in., 1993). Białko fuzyjne poddano ekspresji w E. coli, a następnie poddano oczyszczaniu przez powinowactwo na agarozie-glutation (Smith i in., 1988).

Samice myszy Balb/cimmunizowano dootrzewnowo wysokooczyszczonym białkiem według następującego schematu:

immunizacja: 90 pg białka w kompletnym adiuwancie Freunda i 3 imniunizacja: 50 pg białka w niekompletnym adiuwancie Freunda

Immunizacje podawano w odstępach 4 tygodni. 14 dni po ostatniej immunizacji zwierzęta immunizowano przez trzy kolejne dni 10 pg białka fuzyjnego w PBS. Następnego dnia, splenocyty od zwierząt o wysokim mianie przeciwciał poddano fuzji z komórkami szpiczaka mysiego P3.X63-Ag8.653 stosując poliglikol etylenowy 4000. Komórki hybrydoma selekcjonowano na płytkach do mikromiareczkowania w pożywce HAT (Kohler i Milstein, 1975;Kearney i in., 1979).

Pomiar miana przeciwciał w surowicy albo przesiewanie nadsączy hybrydoma przeprowadzono stosując płytki ELISA. W tym teście, płytki do mikromiareczkowania pokryto białkiem fuzyjnym (GST-CD44v3-10) albo tylko transferiaząS glutationu. Następnie, inkubowano je z kolejnymi rozcieńczeniami próbek surowicy albo nadsączy hybrydoma i wykrywano przeciwciała swoiste przy użyciu przeciwciał przeciwko mysim immunoglobulinom, sprzęgniętych z peroksydazą. Usunięto hybrydoma, które reagowały jedynie z transferazą S glutationu. Pozostałe przeciwciała scharakteryzowano w ELISA z białkiem fuzyjnym swoistym wobec domen (egzon v3, egzon v5 + v6, egzon v6 + v7, egzon v8 - v10) (Koopman i in., 1993). Ich reaktywność immunohistochemicz.ną badano na skrawkach skóry lud:ddiy .

BIWA-1 (VFF-18) wiązało jedynie białka fńzyjne, które zawierały domenę kodowaną przez egzon v6. W celu dalszego ograniczenia epitopu przeciwciała, różne peptydy syntetyczne, które stanowiły części domeny v6 zastosowano w teście wiązania ELISA (fig. 1).

14-aminokwasowy peptyd v6D wykazywał najsilniejsze wiązanie. W konsekwencji, epitop BIWA-1 jest w całości albo częściowo w obrębie sekwencji QWFGNRWHEGYRQT domeny kodowanej przez egzon v6. Sekwencja ta jest homologiczna do epitopu wiążącego przeciwciał 1.1ASML, który zastosowano w terapeutycznym modelu szczurzym i który jest swoisty dla szczurzego CD44v6 (fig. 1).

Immunohistochemia

Przed inkubacją z przeciwciałami pierwotnymi, skrawki parafinowe (4 pm) w Rotihistol (Roth, Niemcy) odparafinowano 3-krotnie po 10 minut i uwodniono w szeregu alkoholi. Następnie, skrawki krótko przepłukano wodą destylowaną i gotowano w piecu mikrofalowym

184 521 (Sharp, model R-6270) 3-krotnie po 10 minut przy 600 watach w buforze 0,01 M cytrynianu sodu. Po każdej inkubacji mikrofalowej, skrawki schładzano przez 20 minut. Po ostatnim etapie schładzania szkiełka przepłukano w PBS i inkubowano z normalną surowicą kozią (10% w PBS). Po trzech płukaniach w PBS skrawki inkubowano z przeciwciałem pierwotnym (BIWA-1: 5 pg/ml; mysim IgG (izotyp odpowiadający kontroli negatywnej) 5 pg/ml w PBS/1% BSA) przez godzinę. Kontrolę pozytywną zastosowano do znakowania skrawków normalnej skóry ludzkiej, ponieważ keratynocyty wyrażjąizoformy CD44, które zawierają v3-v10. Endogenną peroksydazę zablokowano 0,3% H₂O₂ w PBS, po czym skrawki inkubowano przez 30 minut z biotynowanym przeciwciałem wtórnym (przeciw-mysie IgG-F(ab')₂, DAKO Corp.). W celu wywołania barwienia, skrawki inkubowano przez 30 minut z peroksydazą chrzanową, sprzęgniętą z biotyną jako kompleks streptawidyna-biotyna-peroksydaza (DAKO Corp.). Następnie skrawki inkubowano przez 5-10 minut w substracie 3,3-amino-9-etylo-karbazolu (Sigma Immunochemicals), reakcję zatrzymano przez dodanie H2O, a następnie skrawki podbarwiono hematoksyliną. Barwienie oceniano stosując mikroskop świetlny Zeiss Axioskop, zaś intensywność zabarwienia oceniano jako: +++, silna ekspresja; ++, umiarkowana ekspresja; +, słaba ekspresja; -, niejasne albo brak ekspresji. Wyłącznie komórki nowotworowe o wyraźnie zabarwionej błonie oceniano jako pozytywne. Procent komórek nowotworowych pozytywnych w każdym skrawku oceniano z grubsza i określono dwie grupy: nowotwory pozytywne ogniskowo (poniżej 10% komórek nowotworowych reagujących z przeciwciałem) i nowotwory pozytywne (10 albo więcej % komórek nowotworowych pozytywnych). Jeżeli mniej niż 80% komórek nowotworowych reagowało z przeciwciałem wskazywano odpowiedni procent.

Analizowano 126 przypadków raków łuskowatokomórkowych różnego pochodzenia, stosując przeciwciało monoklonalne BIWA-1, swoiste dla CD44v6. Ekspresję izoform zawierających CD44v6 obserwowano we wszystkich próbkach nowotworu z wyjątkiem jednej. Większość próbek wykazywała ekspresję antygenu w 80-100% komórek nowotworowych, zaś znakowanie ograniczone było do błony komórkowej. Nie obserwowano reakcji z tkanką zrębu, limfocytami, komórkami mięśniowymi albo śródbłonkiem.

W celu oceny ilościowej ekspresji cząsteczek CD44v6 na tych komórkach nowotworowych, skrawki normalnej skóry ludzkiej znakowano równolegle ze skrawkami nowotworu. Normalne keratynocyty skóry wyrażały wysoki poziom izoform CD44 i były jednymi z najsilniej wyrażających je komórek normalnych opisanych do tej pory. W konsekwencji, znakowanie keratynocytów zastosowano jako odniesienie i sklasyfikowano jako „silne” (+++) w niniej szym systemie oceny. W większości badanych próbek nowotworu, znakowanie komórek nowotworowych było porównywalne albo większe niż znakowanie keratynocytów, i tylko w nielicznych przypadkach wykazywało słabe znakowanie (3 przypadki przerzutów do węzłów chłonnych) albo umiarkowane (2 raki pierwotne, 10 przerzutów). Reakcje znakowania były bardzo homogenne w danych skrawkach nowotworów, z większością komórek nowotworowych w skrawku wykazujących identyczną intensywność barwienia. Nie obserwowano różnic we wzorcu ekspresji CD44v6 pomiędzy nowotworami pierwotnymi i przerzutami. Szczegółowe podsumowanie wyników pokazano na tabeli 1 z przykładami pokazanymi na fig. 2.

Tabela 1

Ekspresja CD44v6 w komórkach raków łuskowatokomórkowych

Próbka	Rodzaj nowotworu	Reaktywność z BIWA-1
1	2	3	4	5	6
46937	86		Pierwotny	Krtań	+++*
4687	90		Pierwotny	Krtań	+++
8372	90		Pierwotny	Krtań	+++
17427	90		Pierwotny	Krtań	+++

184 521

Tabela 1 - ciąg dalszy

1	2	3	4	5	6
27298	90		Pierwotny	Krtań
46908	90		Pierwotny	Krtań	+++
51334	90		Pierwotny	Krtań	+++
51402	91		Pierwotny	Krtań	+++
60414	91		Pierwotny	Krtań	+++
61733	91		Pierwotny	Krtań	+++
12280	92		Pierwotny	Krtań	+++
23140	92		Pierwotny	Krtań	+++
31792	92		Pierwotny	Krtań	+++
32214	92		Pierwotny	Krtań	+++
10209	95		Pierwotny	Krtań	+++
2366	86		Pierwotny	Skin	+++
2574	86		Pierwotny	Skóra	+++
9916	86		Pierwotny	Skóra	++/+++
2696	87		Pierwotny	Skóra	+++
8906	87		Pierwotny	Skóra	+++
8191	88		Pierwotny	Skóra	+++
8354	88		Pierwotny	Skóra	++50%
11963	88		Pierwotny	Skóra	++
5590	90		Pierwotny	Skóra	++/+++
530	92		Pierwotny	Skóra	+++
2583	94		Pierwotny	Skóra	+++
11337	94		Pierwotny	Skóra	+++
10901	95		Pierwotny	Skóra	+++
11557	95		Pierwotny	Skóra	+++
11744	95		Pierwotny	Skóra	+++
11917	95		Pierwotny	Skóra	+++
4688	90	I	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	++/+++
4688	90	II	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	-
8374	90		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
17428	90		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
27300	90		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
36942	90		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
46909	90		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	++
51336	90		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
41108	91		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
51398	91		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++

184 521

Tabela 1 - ciąg dalszy

1	2	3	4	5	6
60416	91		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+-H-
61734	91		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
1318	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
1318	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
1318	92	III	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
1318	92	IV	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
2863	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
2863	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
5745	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
5745	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
8969	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
8969	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
8969	92	III	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	++
8969	92	IV	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
8969	92	2/1	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
8969	92	2/II	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
8969	92	2/m	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	++
8969	92	2/IV	Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+/++
9366	92		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
9509	92		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
9566	92		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+-H-
12283	92		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
14046	92		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
31787	92		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
49228	92		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++ 50%
29228	93		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	+++
29829	93		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	++
29804	95		Przerzut do węzła chłonnego	Krtań	++/+++
15293	91		Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+ 25%
1667	92		Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+ 20%
2757	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
2757	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
2757	92	III	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
2757	92	IV	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	-H-+
4790	92		Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
6168	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	++ 50%
6168	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++

184 521

Tabela 1 - ciąg dalszy

1	2	3	4	5	6
6168	92	III	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
6168	92	IV	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
7206	92		Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
7531	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
7531	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
7531	92	III	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	++/+++
7531	92	IV	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
10324	92		Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
10519	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
10519	92	RMII	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
10958	92		Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
11425	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
11425	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
13055	92		Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	++/+++
13055	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	focal +++
13055	92	III	Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
15663	92		Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
16713	92		Przerzut do węzła chłonnego	Płuco	+++
14980	91	I	Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	+++
14980	91	II	Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	+++
16641	91	I	Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	+++
16641	91	II	Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	+++
16641	91	III	Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	+++
1059	92		Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	+
1710	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	-H-+
1710	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	+++
1710	92	III	Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	+++
11502	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	4-4-4
11502	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Przełyk	++
202	92		Przerzut do węzła chłonnego	Jama ustna	++60%
6030	92		Przerzut do węzła chłonnego	Jama ustna	+/++/+++25%
7335	92	I	Przerzut do węzła chłonneeo	Jama ustna	+++
7335	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Jama ustna	+ + +
15324	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Jama ustna	+++ 70%
16164	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Jama ustna	+++
16164	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Jama ustna	+++ 50%
16412	92		Przerzut do węzła chłonnego	Jama ustna	++/+++

184 521

Tabela 1 - ciąg dalszy

1	2	3	4	5	6
16836	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Jama ustna	+++
16836	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Jama ustna	+++
16836	92	III	Przerzut do węzła chłonnego	Oral cavity	+++
6228	92	I	Przerzut do węzła chłonnego	Migdałek	+++
6228	92	II	Przerzut do węzła chłonnego	Migdałek	+++
6618	92		Przerzut do węzła chłonnego	Migdałek	+++
11840	92		Przerzut do węzła chłonnego	Migdałek	++
14172	91	4	Przerzut do wątroby	Przełyk	+++
14172	91	5	Przerzut do wątroby	Przełyk	+++
4131	94	1	Przerzut do wątroby	Przełyk	+/++
8438	94		Przerzut do wątroby	Przełyk	focal ++/+++

80-100% komórek nowotworowych reagowało pozytywnie z BIWA-1. W przypadkach gdy mniej komórek nowotworowych reagowało z przeciwciałem podano ich procent.

Przykład 2. Ekspresja CD44v6 w komórkach raków nerki, raków stercza i przerzutach raków okrężnicy do wątroby

Tkanki

Analizowano 19 przypadków komórek raków nerki (12 przypadków raka jasnokomórkowego, 5 przypadków chromofilowego, 1 przypadek chromofobowego i 1 onkocytomy), 16 pierwotnych gruczolakoraków stercza i 19 przypadków przerzutów raka stercza do węzłów chłonnych, oraz 30 przypadków przerzutów raka okrężnicy do wątroby.

Przeciwciało

BIWA-1 (patrz, przykład 1).

Immunohistochemia

Metody, patrz, przykład 1.

W przeciwieństwie do raków łuskowatokomórkowych, nie wykrywano albo wykrywano jedynie ogniskową ekspresję izoform CD44v6 w większości badanych raków nerki i stercza. W przypadku ekspresji większej niż ogniskowa w rakach stercza, znakowanie było rozsiane głównie w cytoplazmie i słabe albo heterogenne, w porównaniu ze znakowaniem normalnego nabłonka stercza. W 50% badanych przypadków przerzutów raka okrężnicy do wątroby stwierdzono ekspresję CD44v6 większą niż ogniskowa. Znakowanie w większości przypadków było od słabego do umiarkowanego, ale generalnie mniej niż 100% komórek nowotworowych w próbce wykazywało jakiekolwiek znakowanie BIWA-1. Wyniki podsumowano w tabeli 2.

Tabela 2

Ekspresja CD44v6 w komórkach raków nerki, raków sterczą i przerzutach raków okrężnicy do wątroby

Rodzaj nowotworu	n	Reaktywność z BIWA-1
			Negatywny	Pozytywny ogniskowo	Pozytywny
Gruczolakorak stercza	pierwotny	16	8	3	5
Gruczolakorak stercza	przerzuty do węzłów chłonnych	19	15	2	2
Rak nerki	pierwotny	19	17	0	2
Rak okrężnicy	przerzuty do wątroby	30	7	8	15

184 521

Przykład3. Charakterystyka przeciwciał swoistych wobec CD44v6

Linia komórkowa

Ludzką linię komórkową SCC, A-431 (spontaniczny rak nabłonkowaty sromu) uzyskano z American Type Culture Collection (Rockville, MD) i hodowano zgodnie z zaleceniami. Ekspresję powierzchniowąizoform zawierających CD44v6 oznaczano analiząFACS, stosując mAb BIWA-1 sprzęgnięte z FITC.

Analiza stałych kinetycznych

Powinowactwo i kinetykę oddziaływań pomiędzy przeciwciałem monoklonalnym i CD44v6 określano przez powierzchniowy rezonans plazmowy (SPR) stosując układ BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor). Białko fhzyjne transferazy S glutationu i CD44, które zawierało region kodowany przez egzony v3-v10 (GST/CD44 v3-v10) unieruchamiano na układzie scalonym sensora CM5, przeprowadzając proces metodą sprzęgania aminy zgodnie z instrukcją producenta. Przeciwciała w różnych stężeniach (8-132 nM) w HBS (10 mM HEPES pH 7,4,150 mM chlorek sodu, 3,4 mM EDTA, 0,05% surfaktant BIA corę P20) wstrzyknięto nad powierzchnie swoistą wobec antygenu z prędkością 5 pl/min. Oddziaływanie rejestrowano jako zmianę sygnału SPR. Dysocjację przeciwciała obserwowano przez 5 minut przy przepływie bufora (HBS). Powierzchnię sensora regenerowano pojedynczym pulsem 15 pl 30 mM HCl. Analizę danych i obliczenie stałych kinetycznych przeprowadzono stosując oprogramowanie Pharmacia Biosensor BIA Evaluation Software, wersja 2.1.

W ten sposób, powinowactwo antygenu BIWA-1 porównano z innymi przeciwciałami swoistymi wobec CD44 (VFF4, VFF7, BBA-13 (IgGl, R&D Systems, Abingdon, UK)). Stałe kinetyczne i powinowactwa różnych przeciwciał oznaczono w dwóch niezależnych doświadczeniach. Tabela 3 pokazuje wartości szybkości asocjacji (k_a), szybkości dysocjacji (k_d) i stałych dysocjacji (K_d) dla 4 mAb. Wszystkie mAb wykazywały podobne k_a i kdz wyjątkiem BBA-13, które miało 3-krotnie niższą ka i VFF7, które miało znacznie wyższą szybkość dysocjacji (5-krotnie) w porównaniu z innymi mAb. Wynik niższego powinowactwa wiązania VFF7 i BBA-13 w porównaniu z VFF4 i BIWA-1. BIWA-1 wykazuje najniższą Kd ze wszystkich badanych przeciwciał.

Tabela 3

Stałe kinetyczne i powinowactwa różnych mAb swoistych dla CD44v6

Przeciwciało	ka CM s'¹)	kd (s'¹)	Kd (M)
VFF4	1,1 x 105	2,6x10’⁵	2^10-°
VFF7	1,1x105	1,2x10*4	1,1x10·⁹
BIWA-1	1,3x1()5	2,2x10’5	1^10-°
BBA-13	3,7x104	2,3x10'5	6,2x10'¹°

Analiza oddziaływania przeciwciała z antygenem przy użyciu ELISA

Komórki A-431 wyrażające CD44v6 hodowano w płytkach 96-studzienkowych (Falcon

Microtest III, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) w gęstości 5x10⁴ na studzienkę w RPMI1640 z 10% płodową surowicą cielęcą przez noc w 37°C. Po płukaniu PBS/0,05% Tween 20, komórki utrwalono przez minutę w lodowatym etanolu, a następnie wypłukano. Inkubację z przeciwciałami pierwotnymi (VFF4, VFf7, BIWA-1, BBA-13, 1 ng/ml do 600 ng/ml, w buforze: PBS/0,5% BSA/0,05% Tween 20) przeprowadzano przez godzinę w temperaturze otoczenia, a następnie płukano 3-krotnie. Zastosowanym przeciwciałem wtórnym był koniugat króliczego przeciwciała przeciwko mysim IgG z peroksydazą chrzanową (DAKO Corp., Kopenhaga, Dania; rozcieńczenie 1:6000 w buforze testowym) (1 godzinę w temperaturze pokojowej). Po trzech płukaniach wywoływano reakcję barwną stosując roztwór TMB (Kirkgaard i Peny, Gaithersburg, USA). Ekstynkcję mierzono stosując czytnik ELISA Hewlett-Packard.

184 521

Figura 3 pokazuje, że względne powinowactwa przeciwciał określone analizą BIAcore odzwierciedlają ich oddziaływanie z komórkami nowotworowymi, przy czym BIWA-1 wykazuje najwyższe powinowactwo wiązania.

Domena białkowa kodowana przez egzon v6 CD44 składa się z 45 aminokwasów (fig. 4). W celu dokładniejszego określenia epitopu rozpoznawanego przez BIWA-1, w testach ELISA zastosowano szereg peptydów syntetycznych. Początkowe doświadczenia pokazały wiązanie z centralnie położonym 14-merem (reszty aminokwasowe 18-31; fig. 4; por. fig. 1) ale nie z peptydami poza tym regionem. Syntetyzowano więc drugi szereg peptydów i badano w kompetycyjnym teście ELISA (fig. 4). Wyniki pokazują, że peptyd 19-29 (WFGNRWHEGYR) stanowi minimalną strukturę wymaganą do wiązania z wysokim powinowactwem. Eliminacja arginin końca C spowodowała ponad 100-krotnie słabsze wiązanie.

Przykład 4. Biodystrybucja przeciwciał przeciwko CD44v6 znakowanych jodem radioaktywnym u myszy nagich z przeszczepem ksenogenicznym

Model przeszczepu ksenogenicznego A-431

8-tygodniowym samicom myszy Balb/c nu/nu (B&K Universal, Rentonm WA) wstrzyknięto podskórnie w lewej linii przypośrodkowej 5x106 hodowanych komórek A-431 (ludzki rak nabłonkowaty sromu). Zwierzęta z przeszczepem ksenogenicznym nowotworu A-431 zastosowano do badania biodystrybucji w ciągu 2 tygodni (ciężar nowotworu 40-50 mg).

Znakowanie BIWA-1 jodem radioaktywnym

W połączeniu z wstępnym ukierunkowaniem, oczyszczone na białku G mAb BIWA-1 (mysie IgGl) sprzęgnięto ze streptawidyną, stosując łącznik heterobifunkcjonalny, sukcynimidylo-4-(N-maleimido-metylo)cykloheksano-1-karboksylan. Grupy lizylowe streptawidyny sprzęgnięto ze zredukowanymi grupami cysteinylowymi przeciwciała, wytworzonymi przez uprzednie traktowanie przeciwciała ditiotreitolem. Uzyskany koniugat 1: 1 (>90%) dalej oczyszczano przez chromatografię jonowymienną. Do doświadczeń nad biodystrybucją, BIWA-1/SĄ znakowano przez aminy pierwszorzędowe lizyny przy użyciu ¹²⁵I, stosując reagent p-jodofenylowy do znakowania (PIP, NEN DuPont, Wilmington, DE), a następnie proces Willbur i in., (1989). Znakowanie BIWA-1 przy użyciu SA albo ¹²⁵I nie wpływało na reaktywność immunologiczną albo farmakokinetykę przeciwciała u myszy.

Doświadczenia nad biodystrybucją

Myszom nagim z przeszczepem ksenogenicznym ludzkiego nowotworu A-431 wstrzyknięto dożylnie przez żyłę boczną ogona 5-7 pCi ¹²⁵I w postaci 50 pg mAb BIWA-1 (aktywność właściwa 0,1-0,14 mCi/mg). Badanie biodystrybucji w zależności od czasu przeprowadzono w grupach po n=3 zwierząt na każdy punkt czasowy w 4,24,48,120 i 168 godzin po wstrzyknięciu. W wyznaczonym czasie, myszy ważono, pobierano im krew ze splotu zagałkowego i zabijanoje przez przerwanie rdzenia szyjnego. Pobierano następujące narządy i tkanki, które później ważono: krew, ogon, płuca, wątroba, śledziona, żołądek, nerki, jelita i nowotwór. Radioaktywność tkanek badano w liczniku scyntylacyjnym gamma (Packard Instruments Company, Meriden, CT) przez porównanie ze standardami wstrzykniętego preparatu przeciwciał, przy ustawieniu okienka energii na 25-80 keV dla ^,25L Obliczono procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki (% ID/g).

Wstępne doświadczenia wykazały, że BIWA-1 nie reaguje krzyżowo z mysim antygenem CD44v6. Tabela 4 i fig. 5 pokazuje absorpcję radioaktywności w nowotworze i tkankach normalnych. Jodowane BIWA-1 wykazuje gwałtowną absorpcję w guzie (7,6% wstrzykniętej dawki/g po 4 godzinach po wstrzyknięciu), która zwiększała się do ponad 18%o ID/g po 48 godzinach i pozostawała stała przez ponad 120 godzin. Siedem dni po wstrzyknięciu (168 godzin) nowotwór wciąż zawierał 15,3% ID/g tkanki. Stosunek nowotwór: tkanki okrężnicy obliczono dla poszczególnych czasów i pokazano na tabeli 4. W 24 godziny po wstrzyknięciu stosunek nowotwór: krew wynosił 0,48 i zwiększał się do 3,16 w 7 dniu. Wychwyt w tkankach normalnych był niski i najprawdopodobniej spowodowany tłem krwi zgromadzonej w biopsji tkanki. Wybiórcze ukierunkowanie in vivo znakowanych ¹²⁵I przeciwciał BIWA-1 na ludzki przeszczep ksenogeniczny SSC u myszy nagich pokazuje, że to przeciwciało monoklonalne ma wysoki potencjał jako nośnik ukierunkowujący do zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych u pacjentów z SCC.

184 521

Tabela 4

Stosunek nowotwór: tkanka l2⁵I-BIWA-1 u myszy nagich niosących nowotwór A-431 w różnych okresach czasu po wstrzyknięciu

Stosunek nowotworu do	4h	24h	48h	120h	168h
Krew	0,22”	0,48	1,31	2,60	3,16
Ogon	1,18	2,62	7,70	12,28	13,06
Płuco	0,40	1,03	2,65	7,04	4,82
Wątroba	0,94	1,18	2,28	3,57	3,24
Śledziona	1,40	1,84	4,00	4,86	4,42
Żołądek	3,89	7,37	19,40	25,56	33,96
Nerki	0,82	1,31	2,72	2,79	2,53
Jelito	3,54	6,24	11,94	19,24	27,78

^a Średnia wartość (n=3); SD <7 %

Przykład 5. Różnicowa ekspresja CD44v6 w wielokomórkowych nowotworach ludzkich.

W rozszerzonym badaniu testowano immunohistochemicznie na ekspresję CD44v6 około 544 póbki nowotworów przy użyciu przeciwciała BIWA-1 (VFF-18). Próbki były zatopione w parafinie albo zamrożone bezpośrednio po pobraniu w ciekłym azocie i przechowywane w -70°C. Analizowano następujące nowotwory: rak podstawnokomórkowy (n=16), gruczolakorak (AC) sutka (n=55), AC okrężnicy (n=83), rak łuskowatokomórkowy (SCC) głowy i szyi (n=125), rak płuc (n=120), AC stercza (n=34), rak nerki (n=27), SCC skóry (n=15) i AC żołądka (n=69). Tkanki pobrano rutynową chirurgią albo biopsją, tkanki normalne pobrano równocześnie z nowotworem. Badanie immunohistochemiczne wykonano według przykładu 1.

Tabela 5 pokazuje analizę immunohistochemiczną 397 różnych próbek nowotworu przy użyciu przeciwciała BIWA-1.

W przypadku raka drobno komórkowego, raka nerki i AC stercza nie obserwowano żadnej albo słabą reaktywność. Wszystkie inne badane rodzaje nowotworu wyrażały izoformy zawierające CD44v6 w wyraźnym stopniu. Najczęstrzy badany AC sutka wykazywał w większości przypadków reaktywność z BIWA-1, zaś badane SCC (krtań, płuco i przełyk) wyrażały CD44v6 w 100% przypadków

Tabela 5

Ekspresja CD44v6 w nowotworach ludzkich

Rodzaj	Ogółem	Przypadków pozytywnych
n	%
1	2	3	4	5
Podstawnokomórkowy	Pierwotny	16	10	62
AC sutka	Pierwotny	17	15	88
	Przerzut do węzła chłonnego	34	31	91
	Przerzut do wątroby	4	4	100
AC okrężnicy	Przerzut do węzła chłonnego	51	21	41
	Przerzut do wątroby	26	13	50
	Przerzut do mózgu	6	6	100
SCC krtani	Pierwotny	18	18	100

184 521

Tabela 5 - ciąg dalszy

1	2	3	4	5
AC płuc	Pierwotny	35	15	43
SCC płuc	Pierwotny	9	9	100
SCC przełyku	Pierwotny	20	20	100
AC stercza	Pierwotny	16	5	31
	Przerzut do węzła chłonnego	18	0	0
RCC	Pierwotny	27	5	18
SCLC	Pierwotny	31	7	23
AC żołądka	Pierwotny	22	15	68
	Przerzut do węzła chłonnego	43	16	37
	Przerzut do wątroby	4	4	100
	OGÓŁEM	397

Ogółem zbadano na reaktywność z BIWA-1185 przypadków SCC różnych rodzajów i klasyfikacji. Wśród nich było 67 przypadków pierwotnego SCC (krtań, n=15; jama ustna, n=16; gardziel, n=3; skóra, n=15), 77 próbek przerzutów do węzłów chłonnych (krtań, n=12; płuca, n=27; przełyk, n=11; jama ustna, n=6; gardziel, n=7; podgłośnia, n=10; migdałek, n=4) i 3 przerzuty do wątroby (przełyk). Przegląd badania immunohistochemicznego wszystkich badanych próbek SCC pokazano w tabeli 6.

Tabela 6

Ekspresja CD44v6 w rakach łuskowatokomórkowych

Rodzaj	Ogółem	Negatywne	Ogniskowe pozytywne	Pozytywne
	n	%	n	%	n	%
Podgłośnia	LNM	10	0	0	0	0	10	100
Gardziel	PT	3	0	0	0	0	3	100
	LNM	7	0	0	0	0	7	100
Krtań	PT	15	0	0	0	0	15	100
	LNM	30	1	3	0	0	29	97
Płuca	PT	18	2	11	0	0	16	89
	LNM	27	0	0	1	4	26	96
Przełyk	PT	20	0	0	1	5	19	95
	LNM	11	0	0	0	0	11	100
	LM	3	0	0	0	0	3	100
Jama ustna	PT	16	0	0	0	0	16	100
	LM	6	0	0	0	0	6	100
Skóra	PT	15	0	0	0	0	15	100
Migdałek	LNM	4	0	0	0	0	4	100
OGÓŁEM	185

Ogniskowe dodatnie: <10 % komórek nowotworowych pozytywnych; LNM: przerzuty do węzłów chłonnych;

PT, guz pierwotny;

LM: przerzuty do wątroby.

184 521

Ekspresja izoform zawierających CD44v6 stwierdzono we wszystkich przypadkach z wyjątkiem trzech próbek (krtań i 2 przypadki płuc). Większość próbek wykazywała ekspresję antygenu na 80-100% komórek nowotworowych na powierzchni przekroju, przy czym znakowanie występowało głównie w błonach komórkowych. Najsilniejsze znakowanie występowało w przypadkach raka krtani, przełyku i podgłośni, przy czym większość przekrojów wykazywała równomierne znakowanie.

Literatura

Barbas C F, Bjorling E, Chiodi F, DuniopN, Cababa D, Jones T M, Zebedee S L, Persson M A A, Nara P L, Norrby E, Burton D R. Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vitro. Proc. Nail. Acad. Sci. U.S.A. 89: 9339-9343 (1992).

Breitz H B, Weiden P L, Yanderheyden J-L, Appelbaum J W, Bjorn M J, Fer M F, Wolf S B„Ratcliff B A, Seiler C A, Foisie D C, Fisher D R, Schroff R W, Fritzberg A R, Abrams P G. Clinical experience with rhenium-186-labeled monoclonal antibodies for radioimmunotherapy: results of phase I trials. J. Nuci. Med 33: 1099-1112 (1992).

Brooks, L., Niedobitek, G., Agathanggelou, A., Farrell, PJ. The expression of variant CD44 in nasopharyngeal carcinoma is unrelated to expression of LMP-1. Am. J. Pathol. 146(5): 1102-12(1995).

Catty, D (Ed.). Antibodies Vols. Iand II. IRL Press Oxford (1989).

Catty, D., Raykundalia, C. ELISA and related immunoassays. In: Catty, D (Ed.). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 97-152, s. p. 105-109.

Catty, D., Murphy, G. Immunoassays using radiolabels. In: Catty, D (Ed.). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 77-96.

Chatal J-F, Saccavini J-C, Gestin J-F, Thedrez P, Curtet C, Kremer M, Guerreau D, Nolibe D, Fumoleau P, Guillard Y. Biodistribution of indium-111-labeled OC 125 monoclonal antibody intraperitoneally injected into patients operated on for ovarian carcinomas. Cancer Res. 49: 3087-3094(1989).

Chaudhary V K, Batra J K, Galdo M G, Willingham M C, Fitzgerald D J, Pastan I. A rapid method of cloning functional variable-region antibody genes in Escherichia coli as single-chain immunotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 1066 (1990).

Colcher D, Esteban J, Cairasquillo J A, Sugarbaker P, Reynolds J C, Bryant G, Larson S M, Schlom J. Complementation of intracavitary and intravenous administration of a monoclonal antibody (B72.3) in patients with carcinoma. Cancer Res. 47: 4218-4224 (1987).

Coloma M J, Hastings A, Wims L A, Morrison S L. Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction. J. Immunol. Methods 152: 89-104 (1992).

Friedmann P N, MeAndrew S J, Gawlak S L, Chace D, Trail P A, Brown J P, Sięgali C B. BR96 sFv-PE40, a potent single-chain immunotoxin that selectively kills carcinoma cells. Cancer Res. 53: 334-339(1993).

Goodwin D A. A new appoach to the problem of targeting specific monoclonal antibodies to human tumors using anti-hapten chimeric antibodies. J Nucl. Med. Biol. 16: 645 (1989).

Gunthert, U., Hofmann, M., Rudy, W., Reber, S., Zoller, M., HauPmann, I., Matzku, S., Wenzel, A., Ponta, H., and Herrlich, P. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell 65: 13-24 (1991).

184 521

Guesdon, J. I., Temynck, T., Avrameas, S. J. Histochem. Cytochem. 27: 1131 (1979).

Gussow D, Seemann G. Humanization of monoclonal antibodies. Methods Enzymol. 203: 99-121 (1991).

Heider, K.-H., Hofmann, M., Horst, E., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., and Pals, S.T.A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. J Cell Biol. 120: 227-233 (1993).

Heider, K.-H., Mulder, J.-W. R., Ostermann, E., Susani, S., Patzelt, E., Pals, S.T., Adolf, G.R. Splice variants of the cells surface glycoprotein CD44 associated with metastatic tumor cells are expressed in normal tissues of humans and cynomolgus monkeys. Ew. J. Cancer 31A/2385-2391 (1995).

Hofmann, M., Rudy, W., Zoller, M., Tolg, C., Ponta, H., Herrlich P., and Gunthert, U. CD44 splice variants confer metastatic behavior in rats: homologous sequences are expressed in human tumor cell lines. Cancer Res. 51: 5292-5297 (1991).

Johnson, G. D. Immunofluorescence. In: Catty, D (Ed.). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 179-200, s. p. 180-189.

Johnson S, Bird R E. Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli. Methods Enzymol. 203: 88-98 (1991).

Kearney, J.F., Radbruch A., Liesegang B., Rajewski K. A new mouse myeloma cell line that has lost imunoglobulin expression but permits construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J. Immunol. 123: 1548 (1979).

Keenan A M, Weinstein J N, Cairasquillo J A, Bunn P A, Reynolds J C, Foon K A et al. Immunolymphoscintigraphy and the dose dependence of ^1HIn-labeled T101 monoclonal antibody in patients with cutaneous T-cell lymphoma. Cancer Res. 47: 6093-6099 (1987).

Kohler, G., Milstein, C. Continous culture of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Nature 265: 495 (1975).

Koopman, G., Heider, K.-H., Horts, E., Adolf, G. R., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., Pals, S. T. Activated human lymphocytes and aggressive Non-Hodgkin’s lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J. Exp. Med. 177: 897-904(1993).

Kreitman R J Hansen H J, Jones A L, FitzGerald D J P, Goldenberg D M, Pastan I. Pseudomonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibody LL2 or LL2-Fab' induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma m mice. Cancer Res. 53: 819-825 (1993).

Larson S M, Cheung N-K V, Leibel S A. Radioisotope Conjugates. In: DeVita V T, Heilman S, Rosenberg S A (Ed.). Biologie therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 496-511 (1991).

Mulshine J L, Magnani J L, Linnoila R I: Applications of monoclonal antibodies in the treatment of solid tumors. In: DeVita V T, Heilman S, Rosenberg S A (Ed.). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 563-588 (1991).

Nesbit M, Fu Z F, McDonald-Smith J, Steplewski Z, Curtis P J. Production of a functional monoclonal antibody recognizing human colorectal carcinoma cells from a baculovirus expression system. J. Immunol. Methods 151: 201-208 (1992).

Perkins A C, Pimm M V. A role for gamma scintigraphy in cancer immunology and immunotherapy. Eur. J Nuci. Med. 19: 1054-1063 (1992).

184 521

Press O W, Bary J F, Badger C C, Martin P J, Appelbaum F R, Levy R, Miller R, Brown S Nelp W B, Krohn K A, Fisher D, DeSantes K, Porter B, Kidd P, Thomas E D, Bemstein ID. Treatment of refractory Non-Hodgkin's lymphoma with radiolabeled MB-1 (anti-CD37) antibody.

J. Clin. Oncol. 7: 1027-1038 (1989).

Salmi, M., Gron-Virta, K., Sointu, P., Grenman, R., Kalimo, H., Jalkanen S. Regulated expression of exon v6 containing isoforms of CD44 in man: Downregulation during malignant transformation of tumors of squamocellular origin. J. Cell Biol. 122: 431-442 (1993).

Sambrook, J., Fritsch E.E., Maniatis I., Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).

Schrappe M, Bumol T F, Apelgren L D, Briggs S L, Koppel G A, Markowitz D D, Mueller B M, Reisfeid R A. Long-term growth suppression of human glioma xenografts by chemoimmunoconjugates of 4-desacetylvinblastine-3-carboxyhydrazide and monoclonal antibody 9.2.27. Cancer Res. 52: 3838-3844 (1992).

Screaton, G.R., Bell, M. V., Jackson, D.G., Comelis, F.B., Gerth, U., and Bell, J. I. Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 89: 12160-12164 (1992).

Sears H F, Mattis J, Herłyn D, H ayry P, Atkinson B, Ernst C, Steplewski Z, Koprowski H. Phase-I clinical trial of monoclonal antibody in treatment of gastromtestinal tumours. Lancet 1982 (1): 762-765 (1982).

Seiter, S., Arch, R, Reber, S., Komitowski, D., Hofmann, M., Ponta, H:, Herrlich, P., Matzku, S., Zoller, M. Prevention of tumor metastasis formation by anti-variant CD44. J. Exp. Med. 177: 443-455 (1993).

Senter P D, Schreiber G J, Hirschberg D L, Ashe S A, Hellstrom K E, Hellstrom I. Enhancement of the in vitro and in vivo antitumor activities of phosphorylated mitomycin C and etoposide derivatives by monoclonal antibody-alkaline phosphatase conjugates. Cancer Res. 49: 5789-5792(1989).

Shin S-U, Morrison S L. Production and properties of chimeric antibody molecules. Me-thods Enzymol. 178: 459-476 (1989).

Siccardi A G, Buraggi G L, Callegaro L, Colella A C, DeFilippi P G et al. Immunoscintigraphy of adenocarcinomas by means of radiolabeled F(ab')₂ fragments of an anti-carcinoembryonic antigen monoclonal antibody: a multicenter study. Cancer Res. 49:3095-3103 (1989).

Smith, D.B., Johnson, K.S. Single-step purification of polypetides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67: 31 (1988).

Srivastava S C (Hrsg). Radiolabeled monoclonal antibodies for imaging and therapy. Life Sciences Series A 152, Plenum New York (1 988).

Tolg, C., Hofmann, M., Herlich, P., and Ponta, H. Splicing choice from ten variant exons establishes CD44 variability. Nucleic Acids. Res. 21: 1225-1229 (1993).

Theuer C P, Kreitman R J, FitzGerald D J, Pastan I. Immunotoxins made with a recombi-nant form of pseudomonas exotoxin A that do not require proteolysis for activity. Ccmcer Res. 53: 340-347 (1993).

Thomas, G. D., Dykes, P. W., Bradwell, A. R. Antibodies for tumour immunodetection and methods for antibody radiolabeling. In: Catty, D. (Ed.). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford , 223-244(1989).

184 521

Thompson C H, Stacker S A, Salehi N, Lichtenstein M, Leyden M J, Andrews J T. Immunoscintigraphy for detection of lymph node metastases from breast cancer. Lancet 1984 (2): 1245-1247(1984).

Vitetta E S, Thorpe P E. Immunotoxins. In: DeVita V T, Heilman S, Rosenberg S A (Ed.). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 482-495 (1991).

Vitetta E S, Stone M, Amlot P, Fay J, May R, Till M, Newman J, Clark P, Collins R, Cunningham D, Ghetie V, Uhr J W, Thorpe P E. Phase I immunotoxin trial in patients with B-cell lymphoma. Cancer Res. 51: 4052-4058 (1991).

Wang S-M, Chem J-W, Yeh M-Y, Ng J C, Tung E, Roffler S R. Specific activation of glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzyme conjugates for cancer therapy. Cancer Res. 52: 4484-4491 (1992).

Weiner L M, O'Dwyer J, Kitson J, Comis R L, Frankel A E, Bauer R J, Kopnrad M S, Groves E S. Phase I evaluation of an anti-breast carcinoma monoclonal antibody 260F9-recombinant ricin A chain immunoconjugate. Cancer Res. 49: 4062-4067 (1989).

Wilbur, D. S., Hadley, S. W., Hylarides, M. D., Abrams, P. G., Beaumier, P. A., Morgan, A.C., Reno, J.M., Fritzberg, A.R. Development of a stable radioiodinating agent to label monoclonal antibodies for radiotherapy of cancer. J. Nucl. Med. 30: 216-226 (1989).

Winter. G., Griffith, A. D., Hawkins, R. E., Hoogenboom, H. R. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994).

184 521

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Boehringer Ingelheim International GmbH (b) ULICA: Rheinstrasse (C) MIASTO: Ingelheim, (e) KRAJ: Niemcy (F) KOD: 55216 (G) TELEFON: +49 -(0)- 6132-772770 (H) TELEFAX: +49 -(0)- 6132-774377 (A) NAZWA: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH (B) ULICA: Postfach 3640 (C) MIASTO: Karlsruhe (E) KRAJ: Niemcy (F) KOD: 76021 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Sposób diagnozowania i leczenia raków łuskowatokomórkowych (iii) LICZBA SEKWENCJI: 16 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPUTER: IBM PC compatible (C) SYSTEM OPERACYJNY:: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patent In Release #1.0, Yersion #1.30 (EPA) (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 129 par zasad (b) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚC: obie (D) TOPOLOGIA: obie (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: genomowy DNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ : egzon (B) POŁOŻENIE: 1..129 (C) INNE DANE: / produkt = “CD44” / znacznik = v6 /uwaga = „baza danych Genbank nr dostępu L05411 ” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ : CDS (B) POŁOŻENIE: 3..128

184 521 (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(A) AUTORZY: Scr<^^t^ox^, GR

Bell, MV Jackson, DG Comelis, FB Gerth, U Bell, JI (B) TYTUŁ: Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons.

(C) CZASOPISMO: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

(D) TOM: 89 (F) STRONY: 12160-12164 (G) DATA: grudzień - 1992 (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 195 45 472.3 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 06-grudzień-1995 (x) INFORMACJA O PUBLIKACH:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:

TC CAG GCA ACT CCT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ACC CAG AAG 47 Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys

10 15

GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAA ACA CCC 95

Glu	Gln	Trp Phe Gly	Asn	Arg	Trp His Glu	Gly	Tyr Arg Gln	Thr Pro
		20			25			30
AGA	GAA GAC TCC	CAT	TCG	ACA ACA	GGG	ACA GCT G	129
Arg	Glu	Asp Ser	His	Ser	Thr Thr	Gly	Thr Ala

40 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 42 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA:: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCH: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2:

Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu 1 5 10 15

184 521

Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg 20 25 30

Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala 35 40 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3 (i) CHARAKTERYSTYKA. SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 195 45 472.3 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 06-grudzień-1995 (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3:

Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJ :

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (b) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚC: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (A) OPIS: /desc = „PCR primer” (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4: CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG

184 521 (2) INRMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (b) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚC: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne kwasy nukleinowe (A) OPIS: /desc = „PCR primer” (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 195 45 472.3 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 06-grudz.ień-1995 (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5: tgataaggaa cgattgacat TAGAGTTGGA 30 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJ :

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (b) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecćeń-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6:

Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:7 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 43 aminokwasy (b) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

184 521 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7:

Gln

Ala

Thr

Pro

Ser

Thr

Glu

Thr

Ala

Thr

Gln

Lys

Glu

1

5

10

15

Gln

Trp

Phe

Gly

Asn

Arg

Trp

His

Glu

Gly

Tyr

Arg

Gln

Thr

Pro

Arg

20

25

30

Glu

Asp

Ser

His

Ser

Thr

Gly

Thr

Ala

35

40

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8:

Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:9;

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCd :

A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (d) TOPOLOGIA: .liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd

184 521 (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9:

Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu Gln Trp 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 10 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10:

Thr Ala Thr Gln Lys Glu Gln Trp Phe Gly Asn 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENC! :

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 195 45 472.3 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 06-grudzień-l 995

184 521 (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 11:

Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 12 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJ :

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 195 45 472.3 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 06-grudaeń-1995 (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 12:

Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJ :

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 195 45 472.3 (I) DATA ZGŁOSZENIA: Oó-girudzień-1995 (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996

184 521 (χΐ) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 13

Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg Glu Asp Ser 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 14 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 14:

Thr Pro Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Gly

5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-kwiecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 15:

Trp Ala Asp Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Ala Ala Thr Gln Lys Glu 15 10 15

184 521

Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp	Gln Gly Lys Asn Pro Pro	Thr Pro Ser
20	25	30

Glu Asp Ser His Val	Thr Glu Gly Thr Thr
35	40

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 16 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCU :

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (b) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd

x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:

(H) NUMER DOKUMENTU: DE 196 15 074.4 (I) DATA ZGŁOSZENIA: 17-k\wecień-1996 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 16:

Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr 1 5 10

Claims

1. Zastosowanie cząsteczki przeciwciała swoistego wobec epitopu kodowanego przez zmienny egzon v6 genu CD44 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka łuskowatokomórkowego.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cząsteczka przeciwciała wiąże epitop o sekwencji aminokwasowej QWFGNRWHEGYRQT.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cząsteczka przeciwciała wiąże epitop o sekwencji aminokwasowej WFGNRWHEGYR.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się przeciwciało monoklonalne BIWA-1 (VFF-18), wytwarzane przez linię komórkową hybrydoma o numerze dostępu DSM ACC2177, albo pochodną tego przeciwciała.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cząsteczką przeciwciała jest przeciwciało monoklonalne BIWA-1 (VFF-18), wytwarzane przez linię komórkową hybrydoma o numerze dostępu DSM ACC2177, albo pochodną tego przeciwciała, przy czym cząsteczka przeciwciała wiąże epitop o sekwencji aminokwasowej QWFGNRWHeGyRQT albo WFGNRWHEGYR.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cząsteczką przeciwciała jest przeciwciało monoklonalne, fragment Fab albo F(ab')2 immunoglobuliny, przeciwciało wytworzone metodami rekombinacyjnymi, przeciwciało jednołańcuchowe (scFv) wytworzone metodami rekombinacyjnymi albo przeciwciało chimeryczne albo humanizowane.

7. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że cząsteczką przeciwciała jest przeciwciało monoklonalne, fragment Fab albo F(ab')2 immunoglobuliny, przeciwciało wytworzone metodami rekombinacyjnymi, przeciwciało jednołańcuchowe (scFv) wytworzone metodami rekombinacyjnymi albo przeciwciało chimeryczne albo humanizowane.

8. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że cząsteczką przeciwciała jest przeciwciało monoklonalne, fragment Fab albo F(ab')2 immunoglobuliny, przeciwciało wytworzone metodami rekombinacyjnymi, przeciwciało jednołańcuchowe (scFv) wytworzone metodami rekombinacyjnymi albo przeciwciało chimeryczne albo humanizowane.

9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cząsteczka przeciwciała jest połączona z izotopem promieniotwórczym, związkiem radioaktywnym, enzymem, barwnikiem fluorescencyjnym, cząsteczką biotyny, toksyną, cytostatykiem, prolekiem, cytokinąalbo innym polipeptydem immunomodulacyjnym.

10. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że cząsteczka przeciwciała jest połączona z izotopem promieniotwórczym, związkiem radioaktywnym, enzymem, barwnikiem fluorescencyjnym, cząsteczką biotyny, toksyna^ cytostatykiem, prolekiem, cytokinąalbo innym polipeptydem immunomodulacyjnym.

11. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że cząsteczka przeciwciała jest połączona z izotopem promieniotwórczym, związkiem radioaktywnym, enzymem, barwnikiem fluorescencyjnym, cząsteczką biotyny, toksyną, cytostatykiem, prolekiem, cytokinąalbo innym polipeptydem immunomodulacyjnym.

12. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że cząsteczka przeciwciała jest połączona z izotopem promieniotwórczym, związkiem radioaktywnym, enzymem, barwnikiem

184 521 fluorescencyjnym, cząsteczką biotyny, toksyną, cytostatykiem, prolekiem, cytokinąalbo innym polipeptydem immunomodulacyjnym.

13. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że cząsteczka przeciwciała jest połączona z izotopem promieniotwórczym, związkiem radioaktywnym, enzymem, barwnikiem fluorescencyjnym, cząsteczką biotyny, toksyną, cytostatykiem, prolekiem, cytokinąalbo innym polipeptydem immunomodulacyjnym.

14. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że cząsteczka przeciwciała jest połączona z izotopem promieniotwórczym, związkiem radioaktywnym, enzymem, barwnikiem fluorescencyjnym, cząsteczką biotyny, toksyną, cytostatykiem, prolekiem, cytokinąalbo innym polipeptydem immunomodulacyjnym.