CN1207811A

CN1207811A - 诊断及治疗鳞状细胞癌的方法

Info

Publication number: CN1207811A
Application number: CN96199248A
Authority: CN
Inventors: 卡尔-海因茨·海德; 冈瑟·阿道夫; 埃林伯格·奥斯特曼; 埃里克·帕特泽尔特; 马利斯·斯普罗尔
Original assignee: Karlsruhe Research Center; Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Karlsruhe Research Center; Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1995-12-06
Filing date: 1996-12-05
Publication date: 1999-02-10
Anticipated expiration: 2016-12-05
Also published as: BG62985B1; TR199801027T2; EP0865609A1; CO4520233A1; JP2000502067A; MX9804459A; AU1177397A; SK73698A3; PL327066A1; CN1151377C; AU726704B2; ES2190484T3; HK1011560A1; CZ174198A3; BG102513A; EE03783B1; AR004360A1; NO982588D0; EP0865609B1; DK0865609T3

Abstract

本发明是关于诊断和治疗鳞状细胞癌的方法,它基于作为分子目标的CD44基因的变体外显子v6的表达。在优选的实施方案中,为此目的而使用v6－特异性抗体分子,特别是单克隆抗体BIWA－1(VFF－18)。

Description

诊断及治疗鳞状细胞癌的方法

本发明是关于诊断及治疗鳞状细胞癌的方法，它基于CD44基因的可变外显子v6的表达，用于这些方法的制剂，以及其用途。

目前已经表示表面糖蛋白CD44的变体的表达，对于在大鼠的非-转移性胰腺癌细胞系，以及大鼠的非-转移性纤维肉瘤细胞系两者，为足以诱发所谓的自发性转移行为，是必要的(Gunthert等人，1991)。然而，最小的CD44-同种型、标准型的CD44，在许多包括上皮细胞的不同组织中，普遍都有表达，但是某些CD44的剪接变体(CD44v)仅在上皮细胞的亚群中表达。CD44-同种型是通过另一种剪接方式产生，该方式要将在CD44中的10个外显子的序列(v1-v10)完全删除，但在较大的变体中可能发生不同的组合(Screaton等人，1992；Heider等人，1993；Hofmann等人，1991)。变体的差异在于在蛋白质的细胞外部分的特定位置，插入不同的氨基酸序列。这种变体可在不同的人类肿瘤细胞和在人体肿瘤组织中检测到。因此，目前已经在研究CD44-变体在结直肠致癌作用中的表达(Heider等人，1993)。在正常人类的结肠上皮中没有CD44-变体的表达，而在腔穴的增殖细胞中，仅可检测到轻微的表达。在肿瘤进行的后期，例如在腺癌中，所有的恶性变性表达CD44的变体。此外，目前已经在已激活的淋巴细胞中，以及在非-何杰金(Hodgkin)的淋巴瘤中，证实了CD44-剪接变体的表达(Koopman等人，1993)。

已经采用各种途径，使CD44-基因的变体外显子在肿瘤和正常组织中的不同表达，以用于诊断和治疗的目的上(WO 94/02633、WO 94/12631、WO 95/00658、WO 95/00851、EP 0531300)。

也已经研究了变体CD44-分子在鳞状细胞癌中的表达。Salmi等人(1993)发现，具有v6-特异性抗体变体(Var)3.1，在肿瘤细胞中比在正常细胞中，有降低的v6-表达。利用v6特异性抗体11.9,Brooks等人(1995)获得一种异源性染色的鼻咽癌。仅在2/12个病例中达到强染色，同时通过免疫组织学，在大部分的病例中仅能检测到轻微病灶的v6-表达。

本发明的目的是发展用于诊断和治疗鳞状细胞癌的新颖方法，并提供这类方法的制剂。

通过本发明已经完成这个目标。它涉及用于诊断和治疗鳞状细胞癌的方法，该方法是基于作为分子标记或标靶的CD44基因的变体外显子v6的表达。特别是，本发明是关于以v6在鳞状细胞癌中强有力的同型性表达为基础的方法，令人惊讶地发现，这与现有技术中得知的教导相反。具有相应特异性的抗体分子，特别适用于活体内作为选择到达鳞状细胞癌的载体。

优选的方法是其特征在于使用识别氨基酸序列QWFGNRWHEGYRQT的抗体分子，更优选的是氨基酸序列WFGNRWHEGYR。由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体BIWA-1(克隆系VFF-18)，以及该抗体的衍生物是特佳的，它在1994年7月6日，以登记号DSMACC 2174，储存在DSM-DeutscheSammlung fhr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig,Germany(WO 95/33771)。

本发明的其他方面是这类抗体分子在根据本发明方法中的用途，以及进行这些方法的制剂。

已知CD44-基因的变体外显子v6的核酸和氨基酸序列(Screaton等人，1992,Tolg等人1993)。变性或等位变体的存在，对于本发明的实施不太重要；因此这类变体明显也包含在内。

人类CD44-基因的外显子v6的序列为：

Q A T P S S T T E E T A

TC CAGGCAACTCCTAGTAGTACAACGGAAGAAACAGCTT Q K E Q W F G N R W H B GACCCAGAAGGAACAGTGGTTTGGCAACAGATGGCATGAGGGAY R Q T P R E D S H S T T QTATCGCCAAACACCCAGAGAAGACTCCCATTCGACAACAGGGT AACAGCTG.

本发明可利用对由外显子编码的抗原决定基有特异性的多克隆或单克隆抗体来进行，特别是在氨基酸序列QWFGNRWHEGYRQT内的抗原决定基，最好是在氨基酸序列WFGNRWHEGYR内的抗原决定基。制备对已知氨基酸序列的抗体，可根据原本已知的方法(Catty,1989)来进行。例如可以合成方式来制备该序列的肽，并使用该肽在免疫程序中作为抗原。其他的方法是制备一种含有所要求的氨基酸序列的融合蛋白质，其中通过整合一种核酸，该核酸编码该序列进入表达载体内，并在宿主生物中表达该融合蛋白质(可以合成方式制备，或例如通过聚合酶连锁反应(PCR)从适当的探针制备)。然后在免疫程序中，使用必要时纯化的融合蛋白质作为抗原，插入-特异性的抗体，或者在单克隆抗体的情况下，表达插入-特异性抗体的杂化瘤，可通过适当方法进行选择。这类方法在现有技术中已知的。Heider等人(1993,1996a)和Koopman等人(1993)，描述了对CD44变体抗原决定基的抗体的制备。

然而，根据本发明方法，也可以使用其他的抗体分子，它由多-或单克隆抗体产生，例如免疫球蛋白的Fab或F(ab＇)₂-片段、由重组方法制备的单链抗体(scFv)、嵌合型或人类化的抗体，以及其他对由外显子v6编码的抗原决定基呈特异性结合的分子。Fab或F(ab＇)₂-片段或其他片段，例如可从抗体BIWA-1(VFF-18)或其他抗体的完整的免疫球蛋白产生(Kreitman等人，1993)。本领域技术人员也可在适当位置产生重组的v6-特异性抗体分子。尤其是，在分析抗体BIWA-1(VFF-18)的氨基酸序列，和/或使用产自该抗体的杂化瘤细胞株后，尤其是其中含有遗传讯息的，它可以产生具有像BIWA-1(VFF-18)一样的个体基因型的重组抗体，也就是在抗原结合部位区(互补性-决定区，CDR)具有像BIWA-1(VFF-18)一样的氨基酸序列的抗体分子。这类方法在现有技术中是已知的。这类的重组抗体分子可以是例如人类化的抗体(Shin等人，1989；Gussow和Seemann,1991)、两种特异性或两种功能性的抗体(Weiner等人，1993；Goodwin,1989；Featherstone,1996)、单-链的抗体(scFv,Johnson和Bird,1991)、完整的或片段的免疫球蛋白(Coloma等人，1992；Nesbit等人，1992；Barbas等人，1992)，或通过链变动(chain shuffling)而产生的抗体(Winter等人，1994)。人类化的抗体可通过例如CDR移殖而制备(EP 0239400)。也可以修改骨架(EP0519596；WO 9007861)。关于人类化的抗体，现在可以使用诸如PCR之类的方法(参见例如EP 0368684；EP 0438310；WO 9207075)，或计算机-模拟(参见例如WO 9222653)。也可以制备并使用融合蛋白质，例如单-链抗体/毒素的融合蛋白质(Chaudhary等人，1990；Friedman等人，1993)。术语“抗体”和“抗体分子”，覆盖的不仅是多克隆和单克隆抗体，还有在本段所讨论的所有产自免疫球蛋白并可用原本已知的方法来制备的所有化合物。

利用BIWA-1(VFF-18)的抗原决定基(参见图1、图4)的知识，来制备具有相同结合特异性的相当抗体，也在普通技术人员的能力范围内。因此这样的抗体也包括在本发明之内。

为了诊断的目的，可将抗体分子，优选是BIWA-1抗体分子、其片段，或具有相同个体基因型的重组的抗体分子，可以和例如诸如¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、^99mTc之类的放射性同位素相连结，或是和放射性化合物(Larson等人，1991；Thomas等人，1989；Srivastava,1988)，诸如过氧化酶或碱性磷酸酶之类的酶(Catty和Raykundalia,1989)、和荧光染料(Johnson,1989)或生物素分子(Guesdon等人，1979)相连结。为了治疗之目的，可使v6-特异性抗体分子，优选的是BIWA-1(VFF-18)-抗体分子或VFF-18-衍生的抗体分子，例如其片段或具有相同个体基因型的重组抗体分子和放射性同位素，如⁹⁰Y、¹³1I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、²¹²Bi、²¹³Bi、¹⁷⁷Lu(Quadri等人，1993；Lenhard等人，1985；Vriesendrop等人，1991；Wilbur等人，1989；Mara-veyas等人，1995a,Jurcic和Scheinberg,1994)、毒素(Vitetta等人，1991；Vitrtta和Thorpe,1991；Kreitman等人，1993；Theuer等人，1993)、细胞抑止剂(Schrappe等人，1992)、药物前驱物(Wang等人，1992；Senter等人，1989)、光可激活的物质(Hemming等人，1993)、具有不同特异性的抗体分子或放射性化合物连结。该抗体分子也可连结到细胞分裂素或一些其他的免疫调节多肽，例如与肿瘤坏死因子、淋巴细胞毒素(Reisfeld等人，1996)或介白细胞素-2(Becker等人，1996)。抗体分子也可改性以用于预告瞄准的系统，例如利用抗生蛋白链菌素或生物素(Goodwin,1995)。

有利的是，本发明的诊断方法可用于研究得自患者的试样，例如得自活组织检查，它是在怀疑有鳞状细胞癌，或是已经做出诊断但需要进一步表征时。检测含有由可变外显子v6编码的氨基酸序列的变体CD44-分子，可在蛋白质层面利用抗体来进行，或是在核酸层面使用用于聚合酶连锁反应(PCR)的特异性核酸探针或引物来进行。因此，本发明也关于用于这类方法的、适合作为探针或引物的抗体分子和核酸，以及这些抗体和核酸在诊断和分析鳞状细胞癌中的用途。例如，通过原本已知的方法，可利用抗体以免疫组织化学的方式来检测组织切片。也可用其他的免疫学方法，使用抗体来研究得自组织试样的萃取物或体液，例如在Western印迹法，酵素-连结的免疫吸附分析法(ELISA,Catty和Raykundalia,1989)、放射性免疫测试法(RIA、Catty和Murphy,1989)或相关的免疫测试法。这些研究可以是定性的、半-定量的或定量的。

除了体外的诊断外，根据本发明的具有特异性的抗体分子，亦适用于在活体内诊断鳞状细胞癌。如果该抗体分子带有可检测的标记，则可检测该标记用于诊断目的，例如使肿瘤在体内呈像，或是供放射性引导的手术使用。例如，使用与放射性同位素相结合的抗体以用于免疫闪烁照相法(呈像)，作为实施本发明的基础，本领域技术人员可使用许多程序(Siccardi等人,1989；Keenan等人，1987；Perkins和Pimm,1992；Colcher等人，1987；Thompson等人，1984)。

因此，可使用通过检测和/或定量变体CD44-抗原决定基v6表达所获得的数据来诊断和预后。将这些数据和其他的预后参数相结合是有利的，例如肿瘤的等级。

根据本发明具有特异性的抗体分子，必要时可与细胞毒性制剂混合，有利于鳞状细胞癌的治疗。可全身性或局部施用，例如经由静脉内的途径(如以团块或连续输液)，或经由腹腔内、肌肉内、皮下或其他注射/输液。投予结合或未-结合抗体(它们是以完整的免疫球蛋白、片段、重组人类化的分子或其类似物的形式)的程序是现有技术中已知的(Mulshine等人，1991；Larson等人，1991；Vitetta和Thorpe,1991；Vitetta等人，1991；Breitz等人，1992,1995；Press等人，1989；Weiner等人，1989；Chatal等人，1989；Sears等人，1982)。它们可在治疗方面使用，例如，以抗体1.1ASML的同样方式(Seiter等人，1993)。如果未经修改的单克隆抗体本身具有适于细胞毒性作用的内在效应子功能，例如补体-诱发或抗体-诱发的细胞毒性，则为了治疗目的可直接使用未改性的抗体(Riethmuller等人，1994)。适于这种应用的单克隆抗体，为同型物IgG2a的老鼠抗体，或人类IgG1-型的抗体。也可施用未改性的抗体，以便经由抗-个体基因型的机制来诱发患者自己的抗肿瘤反应(Baum等人，1993；Khazaeli等人，1994)。

根据治疗应用的优选的具体实施例，将人类化的v6-特异性免疫球蛋白或其F(ab＇)₂片段与⁹⁰Y(Quadri等人，1993；Vriesendrop等人，1995)、¹³¹I(Maraveyas等人，1995a,1995b；Juweid等人，1995；Press等人，1995；Thomas等人，在：Catty 1985，第230-239页)、¹⁸⁶Re(Breitz等人，1992,1995)或其他适当的放射性同位素连结，并用于鳞状细胞癌的放射性免疫治疗中。例如，可利用螯合衍接物，如ITCB-DTPA(异硫氰酰苄基-二亚乙基三胺五乙酸)，将抗体BIWA-1,BIWA-1的人类化的译本，或BIWA-1之F(ab＇)₂片段，或人类化的抗体，与⁹⁰Y连结，达到5-20毫居里/毫克的特定放射性，较佳的是10毫居里/毫克。然后以0.1到1毫居里/公斤体重的剂量，将该制剂给药于抗原-阳性肿瘤的患者，优选的是0.3到0.5毫居里/公斤体重。如果该抗体分子与¹³¹I连结，则投药计划可能为例如，对2毫居里/毫克的特定活性，以6周的间隔给药2×150毫居里。本领域技术人员可利用原来已知的方法(Maraveyas等人，1995a,1995b)，定出可能的剂量。当给药的蛋白质的总量为2到5毫克时，则可通过快速静脉内的团块注射的形式给药。在较大量蛋白质的情况下，注射可能是较适当的投药方法。使用单克隆抗体，可能需要在给药前，将该制剂与过量的(例如十倍摩尔过量)无放射活性的抗体混合；在该情况下，最好是以静脉注射的形式给予该制剂，例如在15分钟之内。这可重复进行。该治疗可与外部的放射性治疗相结合。也可通过骨髓移殖来支持；这在治疗期间，当到达骨髓的剂量超过1.6Gy时是特别需要的。

根据本发明的抗体分子，也可在体外使用，以纯化CD34-阳性的干细胞和前体细胞制品(免疫清除)使用。也可使用自体骨髓移殖来支持鳞状细胞癌的放射治疗和化学治疗。因此必需给予不含肿瘤细胞的造血干细胞和前体细胞的制品。这可通过与本发明抗体分子一起培养来完成，例如抗体-毒素共轭物(Myklebust等人，1994；DEP 196482097)。

也可将根据本发明抗体分子，以重组结构的形式导入T-淋巴细胞的T-细胞受体中。这类经过重编程序的T-淋巴细胞可选择性地与表达抗原的肿瘤细胞相结合，并发展出细胞毒性的活性，导致可使它们用于治疗鳞状细胞癌(PCT/欧洲专利9604631号；Altenschmidt等人，1996)。

附图

图1：通过结合到由人类CD44v6序列衍生的合成肽，决定BIWA-1的抗原决定基特异性。用抗体1.1ASML来测试得自大鼠CD44v6的相应肽。以ELlSA决定结合使用，其中肽是固定在微滴盘上(参见Heider等人，1996b,图2)。-：无结合，+/-：稍有结合；+：强结合。

图2：用CD44v6-特异性单克隆抗体BIWA-1，来进行喉头的鳞状细胞癌(a)和食道癌的肝转移(b)的免疫组织化学分析。在这两种情况下，观察抗体与肿瘤细胞膜的反应性。原始放大40x，计数染色苏木精。

图3：抗原与各种CD44v6-特异性mAb的结合作用的比较。在细胞ELISA中测定四种不同的CD44v6-特异性mAb和人类SCCA-431-细胞的结合作用。MAb BIWA-1对肿瘤细胞呈显出比其他MAb更高的亲和力。

图4：mAb BIWA-1的精细的抗原决定基图。通过竞争性ELISA，测量BIWA-1对各种重叠合成的肽的结合作用，它跨越CD44v6-编码区的氨基酸18-32。其最低结合的序列(肽v6(19-29))下有画线。

图5：在A-431异种移殖的裸鼠中¹²⁵I-BIWA-1的生物分布。在注射4、24、48、120和168小时后，得到的按％ID/克(平均值±标准差)表示的抗体累积。

实施例实施例1：CD44v6在鳞状细胞癌中的表达组织

用mAb BIWA-1(克隆VFF-18)，以免疫组织化学法分析总共126个以石蜡包埋的肿瘤试样的CD44v6的表达。试样包括31个原发性磷状细胞癌(15例喉头，16例皮肤)，91例淋巴结转移瘤(喉头，n=38；肺，n=27；食道，n=11；口腔，n=11；扁桃体，n=4)，以及4例肝转移瘤(食道)。抗体

通过聚合酶链反应(PCR)从人类角化细胞-cDNA，放大CD44v6的HPKII型的全部的变体区域(Hofmann等人，1991)。使用两个PCR引物：5＇-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3＇和5＇-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3＇如同Hofmann所述，前者位于LCLC97-变体区域的25-52处，后者位于1013-984处，它含有EcoRⅠ识别位点，它用于将PCR产物直接克隆到载体pGEX-2T内(Smith等人，1988)。所得的构体(pGEX CD44v6 HPKⅡ,v3-v10)编码大约70kD的融合蛋白质，包括得自日本吸血虫(Schistosomajaponicum)的谷胱甘肽-S-转移酶，和人类CD44的外显子v3-v10(图1；Heider等人，1993)。在大肠杆菌(E.coli)中表达该融合蛋白质，然后在谷胱甘肽-琼脂糖上使其进行亲和纯化作用(Smith等人，1988)。

用经过亲和纯化的融合蛋白质，根据下列的计划，以腹腔内的方式免疫接种雌性的Balb/c老鼠：第1次免疫接种 90微克融合蛋白质在弗氏(Freund＇s)完全助剂中第2次和第3次免疫接种 50微克融合蛋白质在弗氏不完全助剂中

间隔4周给予免疫接种。在最后一次免疫接种后第14天，连续3天以在PBS中的10微克融合蛋白质免疫接种动物。在第二天使用聚乙二醇4000，将得自动物具有高抗体效价的脾细胞与P3.X63-Ag8.653老鼠骨髓瘤细胞融合。然后在微滴盘中，在HAT-培养基中选择杂交瘤细胞(Kohler和Milstein,1975；Keamey等人，1979)。

测定在血清中的抗体效价，或筛选杂交瘤上清液，都使用ELISA进行。在该试验中，所有微滴盘的第一个都用融合蛋白质(GST-CD44v3-10)覆盖，或仅用谷胱甘肽-S-转移酶覆盖。然后将其与系列稀释的血清试样或杂交瘤上清液一起培养，并利用连结抗老鼠免疫球蛋白的抗体的过氧化酶来检测特异性抗体。任何仅与谷胱甘肽-S-转移酶反应的杂交瘤都弃去。剩下的抗体，首先在ELISA中，用结构域-特异性融合蛋白质(外显子v3，外显子v5+v6，外显子v6+v7，外显子v8-v10)进行表征(Koopman等人，1993)。在人类的皮肤切片上测试其免疫组织化学的反应性。

BIWA-1(VFF-18；其制备和特性亦可参见WO 95/33771)仅与含有由外显子v6编码的结构域的融合蛋白质结合。为了更进一步限制该抗体的抗原决定基，在ELISA结合试验中使用代表部分v6结构域的各种合成肽(图1)。14个氨基酸肽v6D，显示出最强的结合作用。所以，BIWA-1的抗原决定基，是完全或部分在由外显子v6编码的结构域的序列QWFGNRWHEGYRQT之中。该序列与抗体1.1ASML的结合抗原决定基是同源的，它可用于治疗的大鼠模式，且其对大鼠CD44v6是特异性的(图1)。免疫组织化学

在与原抗体一起培养前，将在洛提西斯醇(Rotihistol)(Roth，德国)中的石蜡切片(4μm)脱蜡三次，每次10分钟，然后在逐渐提高的酒精系列中再水化。以蒸馏水简单地中洗切片，然后在0.01M钠柠檬酸盐缓冲液中，在微波炉(SharpR-6270型)中以600瓦烘烤三次，每次各10分钟。在每次微波培养后，将切片冷却20分钟。在最后一次冷却阶段后，以PBS冲洗载体，并与正常的山羊血清(10％在PBS)一起预培养。在PBS中冲洗3次后，将该切片与原抗体(BIWA-1:5微克/毫升；老鼠的IgG(同型物-相当于阴性对照组)5微克/毫升，在PBS/1％BSA中)一起培养1小时。用于染色反应的阳性对照组是用正常人类皮肤切片，因为角化细胞表达CD44-同种型，它含有v3-v10。利用在PBS中的0.3％H₂O₂来阻断内源的过氧化酶，并将切片与生物素基化的二级抗体(抗-老鼠IgG-F(ab＇)₂,DAKO公司.)一起培养30分钟。为了展开染色，将该切片与辣根过氧化物酶一起培养30分钟，该酶偶联到生物素而以抗生蛋白链菌素-生物素-过氧化酶复合物形式存在(DAKO Corp.)。然后在3,3-氨基-9-乙基-咔唑底物(SigmaImmunochemicals)中培养该切片5-10分钟，利用H₂O使反应中止，并以苏木精反染色。用Zeiss Axioskop光学微镜来评价染色，并如下定量颜色的强度：+++，强表达；++，中等的表达；+，弱表达；-，不清楚或未检测到表达。只有具有清楚膜染色的肿瘤细胞被评为阳性。粗略地测定在每个切片中阳性肿瘤细胞的百分比，并形成两组：局部阳性的肿瘤(低于10％的与抗体反应的肿瘤细胞)，和阳性的肿瘤(10％或10％以上的阳性肿瘤细胞)。如果在与该抗体反应的阳性细胞中，肿瘤细胞少于80％，则指示相对应的百分比。

利用CD44v6-特异性单克隆抗体BIWA-1来分析126例的各种来源的鳞状细胞癌。在除了一个试样外的全部试样中，观察到含有CD44v6的同种型的表达。大部分试样显示抗原在80-100％的肿瘤细胞中表达，且染色被限制在肿瘤细胞的膜上。在基质组织、淋巴细胞、肌肉细胞或内皮细胞上未观察到反应。

为了定量CD44v6-分子在这些肿瘤细胞上的表达，将正常人类皮肤的切片，与肿瘤切片并行地染色。正常皮肤角化细胞表达高量的CD44-同种型，并且是在到目前为止已经描述的正常细胞CD44v6的最强表达子中。因此，使用角化细胞的染色作为参考值，并在我们的评估系统中分类为“强”(+++)。在大部分受检查的肿瘤试样中，肿瘤细胞的染色可与皮肤角化细胞的染色相比较，或甚至超过，而仅有一些病例显示出弱的肿瘤染色(3例淋巴结转移瘤)，或中等的肿瘤染色(2例原发性癌，10例转移瘤)。染色反应在特定的肿瘤切片中是非常均一的，且在切片中大部分的肿瘤细胞具有相同的染色强度。在原发性肿瘤和转移瘤之间，在CD44v6-表现模式中未观察到明显的差异。在表1中列出结果的详细概要，而实例示于图2中。表1：CD44v6在鳞状细胞癌中的表达

试样		肿瘤类型		BIWA-1的反应性
试样		肿瘤类型		BIWA-1的反应性	46937	86	原发性	喉头	+++
4687	90	原发性	喉头	+++	46937	86	原发性	喉头	+++
4687	90	原发性	喉头	+++	8372	90	原发性	喉头	+++
17427	90	原发性	喉头	+++	8372	90	原发性	喉头	+++
17427	90	原发性	喉头	+++	27298	90	原发性	喉头	+++
46908	90	原发性	喉头	+++	27298	90	原发性	喉头	+++
46908	90	原发性	喉头	+++	51334	90	原发性	喉头	+++
51402	91	原发性	喉头	+++	51334	90	原发性	喉头	+++
51402	91	原发性	喉头	+++	60414	91	原发性	喉头	+++
61733	91	原发性	喉头	+++	60414	91	原发性	喉头	+++
61733	91	原发性	喉头	+++	12280	92	原发性	喉头	+++
23140	92	原发性	喉头	+++	12280	92	原发性	喉头	+++
23140	92	原发性	喉头	+++	31792	92	原发性	喉头	+++
32214	92	原发性	喉头	+++	31792	92	原发性	喉头	+++
32214	92	原发性	喉头	+++	10209	95	原发性	喉头	+++
2366	86	原发性	皮肤	+++	10209	95	原发性	喉头	+++
2366	86	原发性	皮肤	+++	2574	86	原发性	皮肤	+++
9916	86	原发性	皮肤	++/+++	2574	86	原发性	皮肤	+++
9916	86	原发性	皮肤	++/+++	2696	87	原发性	皮肤	+++
8906	87	原发性	皮肤	+++	2696	87	原发性	皮肤	+++
8906	87	原发性	皮肤	+++	8191	88	原发性	皮肤	+++
8354	88	原发性	皮肤	++50％	8191	88	原发性	皮肤	+++
8354	88	原发性	皮肤	++50％	11963	88	原发性	皮肤	++
5590	90	原发性	皮肤	++/+++	11963	88	原发性	皮肤	++
5590	90	原发性	皮肤	++/+++	530	92	原发性	皮肤	+++
2583	94	原发性	皮肤	+++	530	92	原发性	皮肤	+++

11337	94		原发性	皮肤	+++
11337	94		原发性	皮肤	+++	10901	95		原发性	皮肤	+++
11557	95		原发性	皮肤	+++	10901	95		原发性	皮肤	+++
11557	95		原发性	皮肤	+++	11744	95		原发性	皮肤	+++
11917	95		原发性	皮肤	+++	11744	95		原发性	皮肤	+++
11917	95		原发性	皮肤	+++	4688	90	Ⅰ	淋巴结转移	喉头	++/+++
4688	90	Ⅱ	淋巴结转移	喉头	-	4688	90	Ⅰ	淋巴结转移	喉头	++/+++
4688	90	Ⅱ	淋巴结转移	喉头	-	8374	90		淋巴结转移	喉头	+++
17428	90		淋巴结转移	喉头	+++	8374	90		淋巴结转移	喉头	+++
17428	90		淋巴结转移	喉头	+++	27300	90		淋巴结转移	喉头	+++
36942	90		淋巴结转移	喉头	+++	27300	90		淋巴结转移	喉头	+++
36942	90		淋巴结转移	喉头	+++	46909	90		淋巴结转移	喉头	++
51336	90		淋巴结转移	喉头	+++	46909	90		淋巴结转移	喉头	++
51336	90		淋巴结转移	喉头	+++	41108	91		淋巴结转移	喉头	+++
51398	91		淋巴结转移	喉头	+++	41108	91		淋巴结转移	喉头	+++
51398	91		淋巴结转移	喉头	+++	60416	91		淋巴结转移	喉头	+++
61734	91		淋巴结转移	喉头	+++	60416	91		淋巴结转移	喉头	+++
61734	91		淋巴结转移	喉头	+++	1318	92		淋巴结转移	喉头	+++
1318	92	Ⅱ	淋巴结转移	喉头	+++	1318	92		淋巴结转移	喉头	+++
1318	92	Ⅱ	淋巴结转移	喉头	+++	1318	92	Ⅲ	淋巴结转移	喉头	+++
1318	92	Ⅳ	淋巴结转移	喉头	+++	1318	92	Ⅲ	淋巴结转移	喉头	+++
1318	92	Ⅳ	淋巴结转移	喉头	+++	2863	92	Ⅰ	淋巴结转移	喉头	+++
2863	92	Ⅱ	淋巴结转移	喉头	+++	2863	92	Ⅰ	淋巴结转移	喉头	+++
2863	92	Ⅱ	淋巴结转移	喉头	+++	5745	92	Ⅰ	淋巴结转移	喉头	+++
5745	92	Ⅱ	淋巴结转移	喉头	+++	5745	92	Ⅰ	淋巴结转移	喉头	+++
5745	92	Ⅱ	淋巴结转移	喉头	+++	8969	92	Ⅰ	淋巴结转移	喉头	+++
8969	92	Ⅱ	淋巴结转移	喉头	+++	8969	92	Ⅰ	淋巴结转移	喉头	+++
8969	92	Ⅱ	淋巴结转移	喉头	+++	8969	92	Ⅲ	淋巴结转移	喉头	++
8969	92	Ⅳ	淋巴结转移	喉头	+++	8969	92	Ⅲ	淋巴结转移	喉头	++
8969	92	Ⅳ	淋巴结转移	喉头	+++	8969	92	2/Ⅰ	淋巴结转移	喉头	+++

8969	92	2/Ⅱ	淋巴结转移	喉头	+++
8969	92	2/Ⅱ	淋巴结转移	喉头	+++	8969	92	2/Ⅲ	淋巴结转移	喉头	++
8969	92	2/Ⅳ	淋巴结转移	喉头	+/++	8969	92	2/Ⅲ	淋巴结转移	喉头	++
8969	92	2/Ⅳ	淋巴结转移	喉头	+/++	9366	92		淋巴结转移	喉头	+++
9509	92		淋巴结转移	喉头	+++	9366	92		淋巴结转移	喉头	+++
9509	92		淋巴结转移	喉头	+++	9566	92		淋巴结转移	喉头	+++
12283	92		淋巴结转移	喉头	+++	9566	92		淋巴结转移	喉头	+++
12283	92		淋巴结转移	喉头	+++	14046	92		淋巴结转移	喉头	+++
31787	92		淋巴结转移	喉头	+++	14046	92		淋巴结转移	喉头	+++
31787	92		淋巴结转移	喉头	+++	49228	92		淋巴结转移	喉头	+++50％
29228	93		淋巴结转移	喉头	+++	49228	92		淋巴结转移	喉头	+++50％
29228	93		淋巴结转移	喉头	+++	29829	93		淋巴结转移	喉头	++
29804	95		淋巴结转移	喉头	++/+++	29829	93		淋巴结转移	喉头	++
29804	95		淋巴结转移	喉头	++/+++	15293	91		淋巴结转移	肺	+25％
1667	92		淋巴结转移	肺	+20％	15293	91		淋巴结转移	肺	+25％
1667	92		淋巴结转移	肺	+20％	2757	92	Ⅰ	淋巴结转移	肺	+++
2757	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	+++	2757	92	Ⅰ	淋巴结转移	肺	+++
2757	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	+++	2757	92	Ⅲ	淋巴结转移	肺	+++
2757	92	Ⅳ	淋巴结转移	肺	+++	2757	92	Ⅲ	淋巴结转移	肺	+++
2757	92	Ⅳ	淋巴结转移	肺	+++	4790	92		淋巴结转移	肺	+++
6168	92	Ⅰ	淋巴结转移	肺	++50％	4790	92		淋巴结转移	肺	+++
6168	92	Ⅰ	淋巴结转移	肺	++50％	6168	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	+++
6168	92	Ⅲ	淋巴结转移	肺	+++	6168	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	+++
6168	92	Ⅲ	淋巴结转移	肺	+++	6168	92	Ⅳ	淋巴结转移	肺	+++
7206	92		淋巴结转移	肺	+++	6168	92	Ⅳ	淋巴结转移	肺	+++
7206	92		淋巴结转移	肺	+++	7531	92	Ⅰ	淋巴结转移	肺	+++
7531	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	+++	7531	92	Ⅰ	淋巴结转移	肺	+++
7531	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	+++	7531	92	Ⅲ	淋巴结转移	肺	++/+++
7531	92	Ⅳ	淋巴结转移	肺	+++	7531	92	Ⅲ	淋巴结转移	肺	++/+++
7531	92	Ⅳ	淋巴结转移	肺	+++	10324	92		淋巴结转移	肺	+++

10519	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	+++
10519	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	+++	10519	92	RMⅡ	淋巴结转移	肺	+++
10958	92		淋巴结转移	肺	+++	10519	92	RMⅡ	淋巴结转移	肺	+++
10958	92		淋巴结转移	肺	+++	11425	92	Ⅰ	淋巴结转移	肺	+++
11425	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	+++	11425	92	Ⅰ	淋巴结转移	肺	+++
11425	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	+++	13055	92		淋巴结转移	肺	++/+++
13055	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	局部的+++	13055	92		淋巴结转移	肺	++/+++
13055	92	Ⅱ	淋巴结转移	肺	局部的+++	13055	92	Ⅲ	淋巴结转移	肺	+++
15663	92		淋巴结转移	肺	+++	13055	92	Ⅲ	淋巴结转移	肺	+++
15663	92		淋巴结转移	肺	+++	16713	92		淋巴结转移	肺	+++
14980	91	Ⅰ	淋巴结转移	食道	+++	16713	92		淋巴结转移	肺	+++
14980	91	Ⅰ	淋巴结转移	食道	+++	14980	91	Ⅱ	淋巴结转移	食道	+++
16641	91	Ⅰ	淋巴结转移	食道	+++	14980	91	Ⅱ	淋巴结转移	食道	+++
16641	91	Ⅰ	淋巴结转移	食道	+++	16641	91	Ⅱ	淋巴结转移	食道	+++
16641	91	Ⅲ	淋巴结转移	食道	+++	16641	91	Ⅱ	淋巴结转移	食道	+++
16641	91	Ⅲ	淋巴结转移	食道	+++	1059	92		淋巴结转移	食道	+
1710	92	Ⅰ	淋巴结转移	食道	+++	1059	92		淋巴结转移	食道	+
1710	92	Ⅰ	淋巴结转移	食道	+++	1710	92	Ⅱ	淋巴结转移	食道	+++
1710	92	Ⅲ	淋巴结转移	食道	+++	1710	92	Ⅱ	淋巴结转移	食道	+++
1710	92	Ⅲ	淋巴结转移	食道	+++	11502	92	Ⅰ	淋巴结转移	食道	+++
11502	92	Ⅱ	淋巴结转移	食道	++	11502	92	Ⅰ	淋巴结转移	食道	+++
11502	92	Ⅱ	淋巴结转移	食道	++	202	92		淋巴结转移	口腔	++60％
6030	92		淋巴结转移	口腔	+/++/+++25％	202	92		淋巴结转移	口腔	++60％
6030	92		淋巴结转移	口腔	+/++/+++25％	7335	92	Ⅰ	淋巴结转移	口腔	+++
7335	92	Ⅱ	淋巴结转移	口腔	+++	7335	92	Ⅰ	淋巴结转移	口腔	+++
7335	92	Ⅱ	淋巴结转移	口腔	+++	15324	92	Ⅱ	淋巴结转移	口腔	+++70％
16164	92	Ⅰ	淋巴结转移	口腔	+++	15324	92	Ⅱ	淋巴结转移	口腔	+++70％
16164	92	Ⅰ	淋巴结转移	口腔	+++	16164	92	Ⅱ	淋巴结转移	口腔	+++50％
16164	92		淋巴结转移	口腔	++/+++	16164	92	Ⅱ	淋巴结转移	口腔	+++50％
16164	92		淋巴结转移	口腔	++/+++	16836	92	Ⅰ	淋巴结转移	口腔	+++

16836	92	Ⅱ	淋巴结转移	口腔	+++
16836	92	Ⅱ	淋巴结转移	口腔	+++	16836	92	Ⅲ	淋巴结转移	口腔	+++
6228	92	Ⅰ	淋巴结转移	扁桃体	+++	16836	92	Ⅲ	淋巴结转移	口腔	+++
6228	92	Ⅰ	淋巴结转移	扁桃体	+++	6228	92	Ⅱ	淋巴结转移	扁桃体	+++
6618	92		淋巴结转移	扁桃体	+++	6228	92	Ⅱ	淋巴结转移	扁桃体	+++
6618	92		淋巴结转移	扁桃体	+++	11840	92		淋巴结转移	扁桃体	++
14172	91	4	淋巴结转移	食道	+++	11840	92		淋巴结转移	扁桃体	++
14172	91	4	淋巴结转移	食道	+++	14172	91	5	淋巴结转移	食道	+++
4131	94	1	淋巴结转移	食道	+/++	14172	91	5	淋巴结转移	食道	+++
4131	94	1	淋巴结转移	食道	+/++	8438	94		淋巴结转移	食道	局部的++/+++

80-100％的肿瘤细胞与BIWA-1呈阳性的反应。在较少肿瘤细胞与该抗体反应的情况下，给出所得的百分比。实施例2：CD44v6在肾细胞癌、前列腺癌和结肠癌的肝转移瘤中的表达组织

分析19例肾细胞癌(12例透明细胞、5例易染细胞、1例难染细胞、1例大嗜酸粒细胞瘤)，16例前列腺原发性腺癌和19例前列腺癌的淋巴结转移瘤，以及30例结肠癌的肝转移瘤。抗体

BIWA-1(参见实施例1)免疫组织化学

其方法参见实施例1。

与鳞状细胞癌对比，在大部分受试的肾细胞和前列腺癌中，未检测到CD44v6-同种型的表达，或仅有局部的表达。在前列腺癌中在高于局部表达的病例中，与正常前列腺上皮的染色相比较，染色主要是散射胞质性的并且是弱的和异质性的。在50％受试的结肠癌的肝转移瘤中，检测到高于局部表达的CD44v6同种型。在大部分的情况下，染色是模糊到中等的，但在试样中通常少于100％的肿瘤细胞呈显有BIWA-1的任何染色。其结果概述于表2中。表2：在前列腺腺癌、肾细胞癌和结直肠癌的肝转移瘤中CD44v6的表达

肿瘤类型		n	BIWA-1的反应性
肿瘤类型		n	BIWA-1的反应性						阴性	局部阳性	阳性
前列腺腺癌	原发性	16	8	3	5				阴性	局部阳性	阳性
前列腺腺癌	原发性	16	8	3	5	前列腺腺癌	淋巴结转移	19	15	2	2
肾细胞癌	原发性	19	17	0	2	前列腺腺癌	淋巴结转移	19	15	2	2
肾细胞癌	原发性	19	17	0	2	结直肠癌	肝转移	30	7	8	15

实施例3：CD44v6-特异性抗体的特征细胞株

从美国典型培养物收集中心(American Type Culture Collec-tion)(Rockwell MD)获得人类SCC细胞株A-431(女阴的自发性表皮样癌)，并根据制造商的指南进行培养。通过FACS分析，使用FITC-连结的mAbBIWA-1，来测定含有同种型的CD44v6的表面表达。动力学常数的分析

通过表面胞质基因组共振(Surface Plasmon Resonance)(SPR)，使用BIAcore 2000系统(Pharmacia Biocensor)，测定出单克隆抗体CD44v6-相互作用的亲和性和动力学。将含有由外显子v3-v10编码的区域的谷胱甘肽-S-转移酶-CD44-融合蛋白质(GST/CD44v3-v10)固定在CM5传感器片(Sensor Chip)上，根据制造商的指南进行氨基偶联法。以5微升/分钟的流速，将在HBS(10mM HEPES pH 7.4,150mM氯化钠，3.4mM EDTA,0.05％BIA核心表面活性剂P20)中之各种浓度的抗体(8-132nM)注射到抗原-特异性的表面上。以SPR信号的变化来记录相互作用。在缓冲溶液流动(HBS)中观察抗体的分离5分钟。利用15微升30mM HCl的单脉冲，再生该薄片的表面。利用Pharmacia Biocensors BIA评估软件，第2.1版，进行数据分析和动力学常数的计算。

以这种方式比较BIWA-1和其他CD44v6-特异性mAb(VFF4、VFF7、BBA-13(IgGl,R & D Systems,Abingdon,UK))的抗原亲和性。在两个分开的实验中，测定各种抗体的动力学和亲和性常数。表3列出4种mAb的缔合速率(Ka)、离解速率(Kd)和离解常数(Kd)的值。所有的mAb都表示有类似的Ka和Kd，除了BBA-13以外，它具有低3-倍的Ka，还有VFF7，与其他mAb相比较，它具有明显较高的离解速率(因子5)。VFF7和BBA-13，与VFF4和BIWA-1相比较，其结果有较低的结合亲和性。BIWA-1表明在全部所研究抗体中Kd最低。表3：各种CD44v6-特异性mAb的动力学和亲和性常数

抗体	Ka(M^-1S¹)	Kd(S^-1)	Kd(M)
抗体	Ka(M^-1S¹)	Kd(S^-1)	Kd(M)	VFF4	1.1×10⁵	2.6×10^-5	2.4×10^-10
VFF7	1.1×10⁵	1.2×10^-4	1.1×10^-9	VFF4	1.1×10⁵	2.6×10^-5	2.4×10^-10
VFF7	1.1×10⁵	1.2×10^-4	1.1×10^-9	BIWA	1.3×10⁵	2.2×10^-5	1.7×10^-10
BBA-13	3.7×10⁴	2.3×10^-5	6.2×10^-10	BIWA	1.3×10⁵	2.2×10^-5	1.7×10^-10

使用ELISA分析抗体-蛋白质的相互作用。

在37℃下，以每孔5×10⁴的量，在96-孔培养盘(Falcon MicrotestⅢ,Bectob Dickinson,Lincoln Park,NJ)中，以带有10％胎牛血清的PRMI 1640来培养表达CD44v6的A-431细胞。用PBS/0.05％吐温20冲洗后，以冰冷的乙醇固定细胞1分钟，接着是冲洗的步骤。在室温下与初级抗体(VFF4、VFF7、BIWA-1、BBA-13,1毫微克/毫升到600毫微克/毫升，每例都在试验缓冲溶液中：PBS/0.5％BSA/0.05％吐温20)一起培养1小时，接着冲洗3次。所使用的二级抗体为兔-抗鼠-IgG-辣根过氧化物酶连接的抗体(DAKO Corporation,Copenhagen,Denmerk；以试验缓冲溶液稀释1∶6000)(在室温下1小时)。在3次冲洗步骤后，使用TMB溶液(Kirkegaard andPerry,Gaithersburg,USA)展开颜色。使用Hewlett-Packard ELISA阅读器来测定其消光。

图3表示由BIA核心分析所测定的，反映其与肿瘤细胞相互作用的抗体的相关亲和性，BIWA-1清楚地表示最高的结合亲和性。

由CD44-外显子v6编码的蛋白质结构域，包括45个氨基酸(图4)。为了更正确地定义由BIWA-1识别的抗原决定基，在ELISA分析中使用一系列合成肽。预备实验表示结合到位于中央的14-部分(氨基酸群18-31；图4，也可参见图1)，但是没有结合到该区外的肽上。因此合成第二系列肽，并以竞争性ELISA测试(图4)。结果表明肽19-29(WFGNRWHEGYR)代表高亲和性结合所需的最小结构。删除C-终端的精氨酸基团导致结合作用减弱100倍以上。实施例4：在有异源移殖的裸鼠中放射性碘化的CD44v6-抗体的生物分布A-431-异源移殖模式

将5×10⁶个经过培养的A-431细胞(人类女阴的表皮样癌)，在左侧中线处皮下注射到8周龄的雌性BALB/cnu/nu裸鼠(B & K Universal,Renton,WA)。在两周内使用带有A-431肿瘤的异源移殖的动物，进行生物分布的实验(肿瘤重量：40-50毫克)。放射性碘化的BIWA-1

使用异双功能的交联剂琥珀酰亚胺基4-(N-顺丁烯二酰亚胺-甲基)环己烷-1-羧酸盐将蛋白质G-纯化的mAb BIWA-1(鼠的IgG1)偶联到抗生蛋白链菌素。将抗生蛋白链菌素-赖氨酰基与通过用二硫苏糖醇预先处理抗体而产生的还原抗体半胱氨酰基连结。得到1∶1的共轭物(＞90％)，并通过离子交换层析法进一步纯化。关于生物分布的实验，通过带有¹²⁵I的赖氨酸的伯胺，用对-碘苯基标记试剂(PIP；NEN Dupont,Wilmington,DE)来标记BIWA-1/SA，接着进行Willbur等人(1989)的方法。以SA或¹²⁵I标记BIWA-1并不会影响该抗体在鼠中的免疫反应性或药物动力学。生物分布的实验

经由侧面的尾部静脉，对用人类A-431肿瘤异种移殖的裸鼠静脉内注射有5-7微居里¹²⁵I的50微克mAb BIWA-1(比放射性0.1-0.14毫居里/毫克)。在n=3的动物组中，在注射后4、24、48、120和168小时处进行时间-生物分布的研究。在所选定的时间，称重老鼠，从眼后眶采血，并通过颈椎脱臼法将其杀死。收集九个器官和组织并将其称重：血液、尾巴、肺、肝、脾、胃、肾、小肠和肿瘤。通过与注射抗体制品的标准比较，在γ-闪烁计数器(Packard Instrument Company,Meriden,CT)上对该组织的放射性计数，将¹²⁵1的能量窗设定在25-80keV。计算出每克组织的注射剂量的百分比(％ID/克)。

预实验已表明BIWA-1不会与鼠CD44v6-抗原有交叉-反应。表4和图5表示放射性在肿瘤和正常组织中的吸收作用。碘化的BIWA-1表示迅速的肿瘤吸收(在注射后4小时为7.6％注射剂量/克)，它在48小时后增加到18％ ID/克以上，然后在高达120小时时保持不变。在注射后7天(168小时)，肿瘤仍然含有15.3％ ID/每克组织。就各个时间段计算出肿瘤：组织之比，并将其示于表4中。在注射后24小时，肿瘤：血液之比为0.48，并在第7天增加到3.16。在正常组织中摄入很少，且最有可能在组织活检时由血库背景所引起。在裸鼠中利用125I-标记的BIWA-1选择人类SCC-异种移殖的活体靶，表明在用于SCC患者的诊断和治疗上，作为靶载体该单克隆抗体具有很高的潜力。表4:¹²⁵I-BIWA-1在带有A-431-肿瘤的裸鼠身上，在注射后各种时间的肿瘤：组织之比

肿瘤与下列组织之比	4小时	24小时	48小时	120小时	168小时
肿瘤与下列组织之比	4小时	24小时	48小时	120小时	168小时	血液	0.22^a	0.48	1.31	2.60	3.16
尾巴	1.18	2.62	7.70	12.28	13.06	血液	0.22^a	0.48	1.31	2.60	3.16
尾巴	1.18	2.62	7.70	12.28	13.06	肺	0.40	1.03	2.65	7.04	4.82
肝	0.94	1.18	2.28	3.57	3.24	肺	0.40	1.03	2.65	7.04	4.82
肝	0.94	1.18	2.28	3.57	3.24	脾	1.40	1.84	4.00	4.86	4.42
胃	3.89	7.37	19.40	25.56	33.96	脾	1.40	1.84	4.00	4.86	4.42
胃	3.89	7.37	19.40	25.56	33.96	肾	0.82	1.31	2.72	2.79	2.53
小肠	3.54	6.24	11.94	19.24	27.78	肾	0.82	1.31	2.72	2.79	2.53

a平均值(n=3)；SD＜7％实施例5：CD44v6在大量人类肿瘤中的不同表达

在较广泛的研究中，利用单克隆抗体BIWA-1(克隆VFF-18)，以免疫组织化学的方式检测总共544个肿瘤试样的CD44v6的表达。在用手术移出后，将试样立即包埋在石蜡中或冷冻在液态氮中，并储存在-70℃直到需要为止。分析下列的肿瘤：基细胞癌(n=16)，乳房的腺癌(AC)(n=55)，结肠的AC(n=83)，头和颈的鳞状细胞癌(SCC)(n=125)，肺癌(n=120)，前列腺AC(n=34)，肾细胞癌(n=27)，皮肤的SCC(n=15)和胃的AC(n=69)。通过例行的手术或生检获得组织，并伴随着肿瘤试样一起获得正常组织。按照实例1来进行免疫组织化学研究。

表5表示用mAb BIWA-1对397个不同类型的肿瘤进行免疫组织化学分析的概要。表5：CD44v6在人类肿瘤中的表达

类型		总数	阳性案例^*
类型		总数	阳性案例^*					n	％
基细胞癌	原发性肿瘤	16	10	62				n	％
基细胞癌	原发性肿瘤	16	10	62	乳房AC	原发性肿瘤	17	15	88
淋巴结转移瘤	34	31	91			原发性肿瘤	17	15	88
淋巴结转移瘤	34	31	91	肝转移瘤		4	4	100
结肠AC	淋巴结转移瘤	51	21	肝转移瘤		4	4	100	41
	淋巴结转移瘤	51	21	肝转移瘤	26	13	50		41
	脑转移瘤	6	6	肝转移瘤	26	13	50	100
	脑转移瘤	6	6	喉头SCC	淋巴结转移瘤	18	18	100	100
肺AC	原发性肿瘤	35	15	喉头SCC	淋巴结转移瘤	18	18	43	100
肺AC	原发性肿瘤	35	15	肺SCC	原发性肿瘤	9	9	43	100
食道SCC	原发性肿瘤	20	20	肺SCC	原发性肿瘤	9	9	100	100
食道SCC	原发性肿瘤	20	20	前列腺AC	原发性肿瘤	16	5	100	31
淋巴结转移瘤	18	0	0		原发性肿瘤	16	5		31
淋巴结转移瘤	18	0	0		RCC	原发性肿瘤	27	5	18
SCLC	原发性肿瘤	31	7	23	RCC	原发性肿瘤	27	5	18
SCLC	原发性肿瘤	31	7	23	胃AC	原发性肿瘤	22	15	68
淋巴结转移瘤	43	16	37			原发性肿瘤	22	15	68
淋巴结转移瘤	43	16	37	肝转移瘤		4	4	100
	总数	397		肝转移瘤		4	4	100
	总数	397		^*:＞10％的肿瘤细胞阳性
AC：腺癌；RCC：肾细胞癌
AC：腺癌；RCC：肾细胞癌					SCLC：小细胞肺癌；SCC鳞状细胞癌

在小细胞肺癌、肾细胞癌和前列腺AC中，未观察到反应性或仅有很少的反应性。所有受检的其他类型肿瘤，以各种程度表达含有CD44v6的同种型。在大部分受检的乳房AC中，表示与BIWA1的反应性，而受检的SSC(喉头、肺和食道)，以全部病例的100％来表达CD44v6。

对185例各种类型和类别的各种SCC病例，研究它与BIWA1的反应性。这些包括67例原发性SCC(喉头，n=15；口腔，n=16；口咽，n=3；皮肤，n=15)，77例淋巴结转移瘤(喉头，n=12；肺，n=27；食道，n=11；口腔，n=6；口咽，n=7；下咽部，n=10；扁桃体，n=4)，以及3例肝转移瘤(食道)。表6综述了所有受检的SSC试样的免疫组织化学分析。

表6：CD44v6在鳞状细胞癌中的表达

类型		总数	阴性		局部阳性		阳性
类型		总数	阴性		局部阳性		阳性					n	％	n	％	n	％
下咽部	LNM	10	0	0	0	0	10	100				n	％	n	％	n	％
下咽部	LNM	10	0	0	0	0	10	100	口咽	PT	3	0	0	0	0	3	100
LNM	7	0	0	0	0	7	100			PT	3	0	0	0	0	3	100
LNM	7	0	0	0	0	7	100	喉头		PT	15	0	0	0	0	15	100
LNM	30	1	3	0	0	29	97			PT	15	0	0	0	0	15	100
LNM	30	1	3	0	0	29	97		肺	PT	18	2	11	0	0	16	89
LNM	27	0	0	1	4	26	96			PT	18	2	11	0	0	16	89
LNM	27	0	0	1	4	26	96	食道		PT	20	0	0	1	5	19	95
LNM	11	0	0	0	0	11	100			PT	20	0	0	1	5	19	95
LNM	11	0	0	0	0	11	100		LM	3	0	0	0	0	3	100
口腔	PT	16	0	0	0	0	16		LM	3	0	0	0	0	3	100	100
	PT	16	0	0	0	0	16	LM	6	0	0	0	0	6	100		100
	皮肤	PT	15	0	0	0	0	LM	6	0	0	0	0	6	100	15	100
扁桃腺	皮肤	PT	15	0	0	0	0	LNM	4	0	0	0	0	4	100	15	100
扁桃腺	总数		185					LNM	4	0	0	0	0	4	100
局部阳性：＜10％的肿瘤细胞阳性；LNM：淋巴细胞转移瘤；PT：原发性肿瘤；LM：肝转移瘤

发现含有CD44v6的同种型除了3个肿瘤试样外在全部试样中表达(1例喉头，2例肺)。大部分的试样表示，抗原在单一切片的80到100％的肿瘤细胞中表达，且染色主要浓缩在肿瘤细胞的膜上。在喉头、食道和咽下部的癌中，发现最均匀的染色模式，而在切片中大部分的肿瘤细胞具有相同强度的染色。

参考文献Alteoschmidt U,Kahl R,Moritz D,Schnierle BS,Gerstmayer B,Wels W,GronerB，通过基因工程定向幼稚稚T-淋巴细胞而细胞溶解表达neu/erb B-2,erbB-3和erbB-4受体的肿瘤细胞，临床癌症研究(Clinical CancerRes.)2:1001-1008(1996)。Barbas Cf,Bjorling E,Chiodi F,Dunlop N,Cababa D,Jones TM,Zebedee SL.Persson MAA,Nara PL,Norrby E,Burton DR，重组人Fab片段中和体内的人-I型免疫缺失病毒，自然科学研究院进展，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:9339-9343(1992)。Baum RP,Noujaim AA,NaBci A,Moebus V.Hertel A,Nieson A,Donnerstag B,Sykes T, Boniface G,Hor G.用MAbOC125和B43.13重复刺激HAMA下的卵巢癌患者的临床进程，杂交瘤(Hybridoma)12(5):583-589(1993)。Becker JC,Varki N,Gillies SD,Furukawa K,Reisfeld RA，通过诱导细胞免疫应答，使抗体白细胞介素2融合蛋白克服肿瘤不均一性，自然科学研究院进展USA93:7826-7831(1996)。Breitz HB,Weiden PL,Vanderheyden J-L,Appelbaum JW,Bjorin MJ,FerMF.Wolf SB,Ratcliff BA,Sciler CA,Foisie DC,Fisher DR,Schroff RW,FritzbergAR,Abrams PG.用铼-186-标记的单克隆抗体对放射免疫治疗的临床经验：Ⅰ期试验结果，核医学(J.Nucl.Med)33::1099-1112(1992)。Breitz HB,Durham JS,Fisher DR,Weiden PL.DeNardo GL,Goodgold HM,Nelp 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序列一览表(1)一般数据：

(ⅰ)申请人：

(A)姓名：Boehrinqer Ingelheim intemational GmbH

(B)街：Rheirtstrasse

(C)市镇：Ingelheim

(E)国家：Germany

(F)邮政编码：55216

(G)电话：+49-(0)-6132-772770

(H)传真：+49(0)-6132-774377

(A)姓名：Forschungszentrum Karlsruhe GmbH

(B)街：Postfach 3640

(C)市镇：Karlsruhe

(K)国家：Germany

(F)邮政编码：76021

(A)姓名：Heider,Karl-Heinz

(B)街：Hervicusgasse4/3/21

(C)市镇：Vienna

(B)国家：Austria

(E)邮政编码：1120

(A)姓名：Adolf,Guenther

(B)街：Stiftgasse 15-17/10

(C)市镇：Vienna

(E)国家：Austria

(F)邮政编码：1070

(A)姓名：Ostermann Elinborg

(B)街：Mauerbachstr.56/6

(C)市镇：Vienna

(E)国家：Austria

(F)邮政编码：1140

(A)姓名：Patzelt,Eirk

(B)街：Hans-Buchmueller-Gasse8

(C)市镇：Purkersdorf

(E)国家：Austria

(F)邮政编码：3002

(A)姓名：Sprall,Narlies

(B)街：Schwenkgasse3

(C)市镇：Vienna

(E)国家：Austria

(F)邮政编码：1120(ⅱ)发明名称：诊断及治疗鳞状细胞癌的方法(ⅲ)序列数：16(ⅳ)计算机可读版本：(A)数据载体：软盘(B)电脑：IBM PC兼容(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：专利放弃(Patentln Release)#1.0第1.30版(EPO)(2)关于序列1的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：129个碱基对

(B)性质：核苷酸

(C)股型：双股

(D)拓朴学：两种(ⅱ)分子性质：基因组DNA(ⅸ)特征：

(A)名称/关键：外显子

(B)位置：1..129

(C)其他资料：/产物=“CD44”

/标记-v6

/注记-“基因库登记号L05411”

/文献出处([1])(ⅸ)特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：3..128(ⅹ)出版信息：

(A)作者：Screaton,GR

Bell,MV

Jackson,DG

Comelis,FB

Gerth,U

Bell,JI,,

(B)标题：编码淋巴细胞反巢受体CD44的DNA的基因结构

显示至少12个交替剪接外显子

(C)期刊：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.

(D)卷：89

(F)页数：12160-12164

(D)日期：1992年12月

(K)序列1的主要基：自1至129(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3.,

(I)申请日：1995年12月16日(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述：序列lTCCAGGCAACTCCTAGTAGTACAACGGAAGAAACAGCTACCCAGAAG47Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys1 5 10 15GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAAACA CCG 95Glu Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Try Arg Gln Thr Pro20 25 30AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT G 129Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala35 40(2)关于序列2的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：42个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：序列2：Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu1 5 10 15Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg

20 25 30Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala

35 40(2)关于序列3的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：肽

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日

(ⅹⅰ)序列描述：序列3Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp HIS Glu Gly Tyr Arg Gln Thr1 5 10(2)关于序列4的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)性质：核苷酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：其他核酸

(A)说明：/desc=“PCR引物”

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日

(ⅹⅰ)序列描述：序列4CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG(2)关于序列5的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)性质：核苷酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：其他核酸

(A)说明：/desc=“PCR引物”

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述：序列5TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA(2)关于序列6的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：11个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：核苷酸

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日

(ⅹⅰ)序列描述：序列6Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg1 5 10(2)关于序列7的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：43个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：肽

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述：序列7Gln Ala Thr Pra Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu1 5 10 15Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg

20 25 30Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala Ala

35 40(2)关于序列8的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：11个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：肽

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日

(ⅹⅰ)序列描述：序列8Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys1 5 10(2)关于序列9的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：肽(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述：序列9Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu Gln Trp1 5 10(2)关于序列10的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：11个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：肽

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日

(ⅹⅰ)序列描述：序列10Thr Ala Thr Gln Lys Glu Gln Trp Phe Gly Asn1 5 10(2)关于序列11的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线(ⅱ)分子性质：肽(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述：序列11Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr1 5 10(2)关于序列12的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：11个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：肽

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日

(ⅹⅰ)序列描述：序列12Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pra1 5 10(2)关于序列13的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：11个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线(ⅱ)分子性质：肽(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月l7日(ⅹⅰ)序列描述：序列13Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg Glu Asp Ser1 5 10(2)关于序列14的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：肽

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日

(ⅹⅰ)序列描述：序列14Thr Pro Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Gly1 5 10(2)关于序列15的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：42个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线(ⅱ)分子性质：肽(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日(ⅹⅰ)序列描述：序列15Frp Ala Asp Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Ala Ala Thr Gln Lys Glu1 5 10 15Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr Pro Ser

20 25 30Glu Asp Ser His Val Thr Glu Gly Thr Thr

35 40(2)关于序列16的数据：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)性质：氨基酸

(C)股型：单股

(D)拓朴学：直线

(ⅱ)分子性质：肽

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19545472.3

(I)申请日：1995年12月6日

(ⅹ)出版信息：

(H)文件编号：德国专利19615074.4

(I)申请日：1996年4月17日

(ⅹⅰ)序列描述：序列16Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr1 5 10

Claims

1．一种诊断或治疗鳞状细胞癌的方法，其特征是，该方法是基于作为分子标记的基因CD44的可变外显子v6的表达。

2．根据权利要求1的方法，其特征是，该方法是基于抗体分子与由基因CD44的可变外显子v6编码的抗原决定基的结合作用。

3．根据权利要求2的方法，其特征是，使用识别氨基酸序列WFGNRWHEGYR的抗体分子。

4．根据权利要求3的方法，其特征是，使用单克隆抗体BIWA-1(VFF-18)，或该抗体的衍生物，抗体是由具有登记号DSM ACC2174的杂交瘤细胞系形成。

5．根据权利要求1至4中之一的方法，其特征是，抗体分子为单克隆抗体，免疫球蛋白的Fab-或F(ab＇)₂-片段，通过重组方法制备的抗体，通过重组方法制备的嵌段型或人源化的抗体，双功能或单链的抗体(scFv)。

6．一种抗体分子在根据权利要求1至4中之一的方法中的用途，该抗体分子对于由CD44-基因的变体外显子v6编码的抗原决定基有特异性。

7．根据权利要求6的用途，其特征是，该抗体分子与氨基酸序列WFGNRWHEGYR结合。

8．根据权利要求6或7的用途，其特征是，该抗体分子是单克隆抗体BIWA-1(VFF-18)或该抗体的衍生物，它是由具有登记号DSM ACC2174的杂交瘤细胞系形成。

9．根据权利要求6至8中之一的用途，其特征是，该抗体分子是单克隆抗体、免疫球蛋白的Fab-或F(ab＇)₂片段，通过重组方法制备的抗体，通过重组方法制备的嵌合型或人源化的抗体，双功能或单链的抗体(scFv)。

10．一种抗体分子在治疗鳞状细胞癌上的用途，该抗体分子对于在由CD44-基因的可变表现序列v6编码的氨基酸序列内的抗原决定基有特异性。

11．根据权利要求10的用途，其特征是，该抗体分子与氨基酸序列WFGNRWHEGYR结合。

12．根据权利要求10或11的用途，其特征是，该抗体分子是单克隆抗体BIWA-1(VFF-18)或该抗体的衍生物，它是由登记号DSM ACC2174的杂交瘤细胞系形成。

13．根据权利要求10至12中之一的用途，其特征是，该抗体分子是单克隆抗体、免疫球蛋白的Fab-或F(ab＇)₂-片段，通过重组方法制备的抗体，通过重组方法制备的嵌合型或人源化的抗体，双功能或单链的抗体(scFv)。

14．根据权利要求10至13中之一的用途，其特征是，将该抗体分子与放射性同位素、光可激活的化合物、放射性化合物、酶、荧光染料、生物素分子、毒素、细胞静止素、药物前驱物、具有不同特异性的抗体分子、细胞因子或其他的免疫调节多肽相连结。

15．一种用以实施权利要求1至5中之一的方法的制剂，其特征是，它是对由CD44-基因的外显子v6编码的抗原决定基有特异性的抗体或抗体分子。

16．一种抗体分子在制备用于诊断和/或治疗鳞状细胞癌的药物组合物中的用途，该抗体分子对于在由CD44基因的可变外显子v6编码的氨基酸序列内的抗原决定基有特异性。