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CN1151377C - 诊断及治疗鳞状细胞癌的方法 - Google Patents

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CN1151377C CNB961992484A CN96199248A CN1151377C CN 1151377 C CN1151377 C CN 1151377C CN B961992484 A CNB961992484 A CN B961992484A CN 96199248 A CN96199248 A CN 96199248A CN 1151377 C CN1151377 C CN 1151377C
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Abstract

本发明是关于诊断和治疗鳞状细胞癌的方法，它基于作为分子目标的CD 44基因的变体外显子v6的表达。在优选的实施方案中，为此目的而使用v6-特异性抗体分子，特别是单克隆抗体BIWA-1(VFF-18)。

Description

诊断及治疗鳞状 细胞癌的方法
本发明是关于诊断及治疗鳞状细胞癌的方法，它基于CD 44基因的可变外显子v6的表达，本发明还涉及用于这些方法的制剂，以及其用途。
近期研究表明，表面糖蛋白CD 44的变体的表达，是在大鼠的非-转移性胰腺癌细胞系，以及大鼠的非-转移性纤维肉瘤细胞系中诱发所谓的自发性转移行为的必要和充分条件(Gunthert等人，1991)。然而，最小的CD44-同种型、标准型的CD 44都在包括上皮细胞等的多种不同组织中广泛表达，但是CD 44的某些剪接变体(CD 44v)仅在上皮细胞的亚群中表达。CD 44-同种型是通过另一种剪接方式产生，该方式将CD 44中的10个外显子的序列(v1-v10)完全删除，但在较大的变体中可能发生不同的组合(Screaton等人，1992；Heider等人，1993；Hofmann等人，1991)。变体的差异在于，在蛋白质的细胞外部分的特定位置插入不同的氨基酸序列。这种变体可在不同的人类肿瘤细胞和在人体肿瘤组织中检测到。因此，目前已经在研究CD 44-变体在结直肠致癌中的表达(Heider等人，1993)。在正常人类的结肠上皮中没有CD 44-变体的表达，而在腔穴的增殖细胞中，仅可检测到轻微的表达。在肿瘤进展的后期，例如在腺癌中，所有的恶性变性表达CD 44的变体。此外，目前已经在已激活的淋巴细胞中，以及在非-何杰金(Hodgkin)淋巴瘤中，证实了CD 44-剪接变体的表达(Koopman等人，1993)。
已有多种方法可以利用CD 44-基因的变异外显子在肿瘤和正常组织中的差异表达进行诊断和治疗(WO 94/02633、WO 94/12631、WO 95/00658、WO 95/00851、EP 0531300)。
也已经研究了变异的CD 44-分子在鳞状细胞癌中的表达。Salmi等人(1993)利用v6-特异性抗体Var3.1发现，肿瘤细胞中v6的表达比在正常细胞中降低。利用v6-特异性抗体11.9，Brooks等人(1995)对鼻咽癌实现了异质性染色。仅在2/12个病例中达到强染色，在大部分的病例中通过免疫组织学仅能检测到轻微病灶性v6-表达。
本发明的目的是发展用于诊断和治疗鳞状细胞癌的新颖方法，并提供用于这类方法的制剂。
通过本发明已经完成这个目标。它涉及用于诊断和治疗鳞状细胞癌的方法，该方法是基于作为分子标记或标靶的CD 44基因的变异外显子v6的表达。特别是，本发明是关于以v6在鳞状细胞癌中强有力的均一表达为基础的方法，令人惊讶地发现，这与现有技术中得知的教导相反。具有相应特异性的抗体分子特别适合作为载体用于活体内选择性到达鳞状细胞癌。
优选方法的特征在于，使用识别氨基酸序列QWFGNRWHEGYRQT的抗体分子，更优选识别氨基酸序列WFGNRWHEGYR。特别优选由1994年7月6日，以登记号DSM ACC 2174保藏在DSM-Deutsche Sammlung fhrMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany(WO 95/33771)的杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体BIWA-1(克隆系VFF-18)，以及该抗体的衍生物。
本发明的其他方面是这类抗体分子在本发明方法中的用途，以及实施这些方法的制剂。
已知CD 44-基因的变异外显子v6的核酸和氨基酸序列(Screaton等人，1992，Tolg等人1993)。变性或等位变体的存在，对于本发明的实施不太重要；因此这类变体明显也包含在内。
人类CD 44-基因的外显子v6的序列为：
         Q   A   T   P   S   S   T   T   E   E   T   A
    TC  CAG GCA ACT CCT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT
 T   Q   K   E   Q   W   F   G   N   R   W   H   B   G
ACC CAG AAG GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA
 Y   R   Q   T   P   R   E   D   S   H   S   T   T   Q
TAT CGC CAA ACA CCC AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG
 T   A
ACA GCT G.
本发明可利用特异于外显子v6编码的表位的多克隆或单克隆抗体来进行，所述表位特别是在氨基酸序列QWFGNRWHEGYRQT内的表位，最好是在氨基酸序列WFGNRWHEGYR内的表位。制备针对已知氨基酸序列的抗体，可根据原本已知的方法(Catty，1989)来进行。例如可以合成该序列的肽，并使用该肽在免疫程序中作为抗原。另一方法是制备一种含有所要求的氨基酸序列的融合蛋白，方法是将编码该序列的核酸整合至表达载体内，并在宿主生物中表达该融合蛋白(所述核酸可以合成方式制备，或例如通过聚合酶链反应(PCR)从适当的探针制备)。然后在免疫程序中，使用该融合蛋白(可任选纯化形成)作为抗原然后通过适当方法选择插入-特异性的抗体，或者在单克隆抗体的情况下，选择表达插入-特异性抗体的杂交瘤。这类方法在现有技术中是已知的。Heider等人(1993，1996a)和Koopman等人(1993)描述了针对CD 44变体表位的抗体的制备。
然而，根据本发明方法，也可以使用其他由多-或单克隆抗体衍生的抗体分子，例如免疫球蛋白的Fab-或F(ab′)2-片段、由重组方法制备的单链抗体(scFv)、嵌合型或人源化抗体，以及其他对由外显子v6编码的表位呈特异性结合的分子。Fab-或F(ab′)2-片段或其他片段，例如可从抗体BIWA-1(VFF-18)或其他抗体的完整的免疫球蛋白产生(Kreitman等人，1993)。本领域技术人员也有能力制备重组的v6-特异性抗体分子。尤其是，在分析抗体BIWA-1(VFF-18)的氨基酸序列，和/或使用产生该抗体的杂交瘤细胞系(尤其是其中含有遗传讯息)后，它可以产生具有像BIWA-1(VFF-18)一样的独特型的重组抗体，也就是在抗原结合部位区(互补决定区，CDR)具有像BIWA-1(VFF-18)一样的氨基酸序列的抗体分子。这类方法在现有技术中是已知的。这类重组抗体分子可以是例如人源化抗体(Shin等人，1989；Gussow和Seemann，1991)、双特异性或双功能性抗体(Weiner等人，1993；Goodwin，1989；Featherstone，1996)、单链抗体(scFv，Johnson和Bird，1991)、完整的或片段化的免疫球蛋白(Coloma等人，1992；Nesbit等人，1992；Barbas等人，1992)，或通过链改组(chain shuffling)而产生的抗体(Winter等人，1994)。人源化抗体可通过例如CDR-移殖而制备(EP0239400)。也可以修饰框架区(EP 0519596；WO 9007861)。关于人源化抗体，现在可以使用诸如PCR之类的方法(参见例如EP 0368684；EP0438310；WO 9207075)，或计算机-模拟(参见例如WO 9222653)。也可以制备并使用融合蛋白，例如单链抗体/毒素融合蛋白(Chaudhary等人，1990；Friedman等人，1993)。术语“抗体”和“抗体分子”，不仅是指多克隆和单克隆抗体，还指在本段所讨论的结构上衍生自免疫球蛋白并可用原本已知的方法来制备的所有化合物。
利用对BIWA-1(VFF-18)的表位(参见图1、图4)的了解，来制备具有相同结合特异性的等效抗体，也在普通技术人员的能力范围内。因此这样的抗体也包括在本发明之内。
为了诊断的目的，可将抗体分子，优选是BIWA-1抗体分子、其片段，或具有相同独特型的重组抗体分子，与诸如125I、131I、111In、99mTc之类的放射性同位素相连结，或是与放射性化合物(Larson等人，1991；Thomas等人，1989；Srivastava，1988)，诸如过氧化物酶或碱性磷酸酶之类的酶(Catty和Raykundalia，1989)、和荧光染料(Johnson，1989)或生物素分子(Guesdon等人，1979)相连结。为了治疗之目的，可使v6-特异性抗体分子，优选BIWA-1(VFF-18)-抗体分子或VFF-18-衍生的抗体分子，例如其片段或具有相同独特型的重组抗体分子，与放射性同位素，如90Y、131I、186Re、188Re、153Sm、67Cu、212Bi、213Bi、177Lu(Quadri等人，1993；Lenhard等人，1985；Vriesendrop等人，1991；Wilbur等人，1989；Mara-veyas等人，1995a，Jurcic和Scheinberg，1994)、毒素(Vitetta等人，1991；Vitrtta和Thorpe，1991；Kreitman等人，1993；Theuer等人，1993)、细胞抑制剂(Schrappe等人，1992)、前体药物(Wang等人，1992；Senter等人，1989)、光可激活的物质(Hemming等人，1993)、具有不同特异性的抗体分子或放射性化合物连结。该抗体分子也可连结细胞因子或一些其他的免疫调节多肽，例如与肿瘤坏死因子、淋巴毒素(Reisfeld等人，1996)或白细胞介素-2(Becker等人，1996)连结。也可以对抗体分子进行修饰以用于预瞄准系统，例如利用链霉亲和素或生物素(Goodwin，1995)。
有利的是，本发明的诊断方法可用于研究得自患者的样品，例如得自活组织检查的样品，所述患者是怀疑有鳞状细胞癌，或是已经做出诊断但需要进一步对该肿瘤进行表征者。检测含有由可变外显子v6编码的氨基酸序列的变体CD 44-分子，可在蛋白质水平上利用抗体来进行，或是在核酸水平上使用特异性核酸探针或引物来进行聚合酶链反应(PCR)。因此，本发明也关于适合作为探针或引物用于这类方法的抗体分子和核酸，以及这些抗体和核酸在诊断和分析鳞状细胞癌中的用途。例如，可利用抗体，通过原本已知的方法对组织切片进行免疫组织化学，从而进行检测。也可用其他的免疫学方法，使用抗体来研究得自组织样品的提取物或体液，所述方法如Western印迹法，酶联免疫吸附试验(ELISA，Catty和Raykundalia，1989)、放射免疫分析(RIA、Catty和Murphy，1989)或相关的免疫分析。这些研究可以是定性的、半-定量的或定量的。
除了体外的诊断外，具有本发明特异性的抗体分子亦适用于在活体内诊断鳞状细胞癌。如果该抗体分子带有可检测的标记，则可以为了诊断目的而对该标记进行检测，例如使肿瘤在体内呈像，或是供放射性引导的手术使用。例如，使用与放射性同位素相结合的抗体以进行免疫闪烁照相法(呈像)，作为实施本发明的基础，本领域技术人员可使用许多方法(Siccardi等人，1989；Keenan等人，1987；Perkins和Pimm，1992；Colcher等人，1987；Thompson等人，1984)。
因此，可使用通过检测和/或定量变异的CD 44-表位v6的表达所获得的数据来诊断和预后。将这些数据和其他的预后参数，例如肿瘤的等级相结合是有利的。
具有本发明特异性的抗体分子可(选择与细胞毒制剂混合)，有利于鳞状细胞癌的治疗。它们可全身性或局部施用，例如经由静脉内的途径(如快速浓注(bolus)或连续输液)，或经由腹腔内、肌肉内、皮下或其他注射/输液。投予偶联型或非偶联型抗体(它们为完整的免疫球蛋白、片段、重组人源化分子或其类似物的形式)的方法是现有技术中已知的(Mulshine等人，1991；Larson等人，1991；Vitetta和Thorpe，1991；Vitetta等人，1991；Breitz等人，1992，1995；Press等人，1989；Weiner等人，1989；Chatal等人，1989；Sears等人，1982)。它们可在治疗方面使用，例如，与抗体1.1ASML(Seiter等人，1993)同样的方式。未经修改的单克隆抗体如果本身具有适于细胞毒作用(例如补体-诱发或抗体-诱发的细胞毒性)的内在效应子功能，则可直接用于治疗(Riethmuller等人，1994)。适于这种应用的单克隆抗体，为IgG2a同种型的鼠抗体，或人类IgG1型的抗体。也可施用未改性的抗体，以便经由抗-独特型的机制来诱发患者自己的抗肿瘤反应(Baum等人，1993；Khazaeli等人，1994)。
根据治疗应用的优选的具体实施例，将人源化的v6-特异性免疫球蛋白或其F(ab′)2片段与90Y(Quadri等人，1993；Vriesendrop等人，1995)、131I(Maraveyas等人，1995a，1995b；Juweid等人，1995；Press等人，1995；Thomas等人，在：Catty 1985，第230-239页)、186Re(Breitz等人，1992，1995)或其他适当的放射性同位素连结，并用于鳞状细胞癌的放射性免疫治疗中。例如，可利用螯合连接物，如ITCB-DTPA(异硫氰酰苄基-二亚乙基三胺五乙酸)，将抗体BIWA-1，人源化BIWA-1，或BIWA-1的F(ab′)2片段，或人源化抗体，与90Y连结，达到5-20毫居里/毫克的比活性，优选10毫居里/毫克。然后以0.1到1毫居里/公斤体重的剂量，将该制剂给药于抗原-阳性肿瘤的患者，优选的是0.3到0.5毫居里/公斤体重。如果该抗体分子与131I连结，则投药计划可能为例如，对2毫居里/毫克比活性的情况，以6周的间隔给药2×150毫居里。本领域技术人员可利用原来已知的方法(Maraveyas等人，1995a，1995b)，定出最大剂量。当给药的蛋白质的总量为2到5毫克时，则可通过快速静脉内浓注(bolus)的形式给药。在较大量蛋白质的情况下，注射可能是较适当的投药方法。使用单克隆抗体，可能需要在给药前，将该制剂与过量的(例如十倍摩尔过量)无放射活性的抗体混合；在该情况下，最好是以静脉注射的形式给予该制剂，例如用15分钟的时间给药。这可重复进行。该治疗可与外部的放射性治疗相结合。也可辅以骨髓移殖；在治疗期间，当到达骨髓的剂量超过1.6Gy时，尤其必需这种处理。
根据本发明的抗体分子，也可回体(ex vivo)用于纯化CD 34-阳性的干细胞和前体细胞制品(免疫净化)。也可使用自体骨髓移殖来支持鳞状细胞癌的放疗和化疗。因此必需给予不含肿瘤细胞的造血干细胞和前体细胞的制品。这可通过与本发明抗体分子一起温育来完成，例如抗体-毒素偶联物(Myklebust等人，1994；DE P 196 48 209 7)。
也可将根据本发明的抗体分子，以重组构建体的形式导入T淋巴细胞的T细胞受体中。这类经过重排的T-淋巴细胞可选择性地与表达抗原的肿瘤细胞相结合，并发展出细胞毒活性，因此它们可用于治疗鳞状细胞癌(PCT/欧洲专利9604631号；Altenschmidt等人，1996)。
附图
图1：通过结合人CD44v6序列衍生的合成肽来确定BIWA-1的表位特异性。用抗体1.1ASML来测试得自大鼠CD44v6的相应肽。以ELISA确定结合，在ELISA中肽是固定在微滴板上(参见Heider等人，1996b，图2)。-：无结合，+/-：稍有结合；+：强结合。
图2：用CD44v6-特异性单克隆抗体BIWA-1，来进行喉部鳞状细胞癌(a)和食道癌的肝转移(b)的免疫组织化学分析。在这两种情况下，观察抗体与肿瘤细胞膜的反应。原始放大40x，苏木精复染。
图3：抗原与各种CD44v6-特异性mAb的结合的比较。在细胞ELISA中测定四种不同的CD44v6-特异性mAb和人类SCC A-431-细胞的结合。MAb BIWA-1对肿瘤细胞呈显出比其他MAb更高的亲和力。
图4：mAb BIWA-1的精细表位作图。通过竞争性ELISA，测量BIWA-1对各种重叠合成肽的结合，这些肽跨越CD44v6-编码区的氨基酸18-32。最弱结合的序列(肽v6(19-29))下有画线。
图5：在A-431异种移殖的裸鼠中125I-BIWA-1的生物分布。在注射后的4、24、48、120和168小时，得到的按％ID/克(平均值±标准差)表示的抗体累积。
实施例
实施例1：CD44v6在鳞状细胞癌中的表达
组织
用mAb BIWA-1(克隆VFF-18)，以免疫组织化学法分析总共126例石蜡包埋的肿瘤样品的CD44v6的表达。样品包括31例原发性磷状细胞癌(15例喉部，16例皮肤)，91例淋巴结转移(喉部，n＝38；肺，n＝27；食道，n＝11；口腔，n＝11；扁桃体，n＝4)，以及4例肝转移(食道)。
抗体
通过聚合酶链反应(PCR)从人类角质细胞-cDNA扩增HPKII型CD44v的完整变体区域(Hofmann等人，1991)。使用两种PCR引物：5′-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3′和5′-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3′如同Hofmann所述，前者位于LCLC 97-变体区域的25-52位，后者位于1013-984位，它们含有EcoRI识别位点，用于将PCR产物直接克隆到载体pGEX-2T内(Smith等人，1988)。所得的构建体(pGEX CD44v HPKII，v3-v10)编码大约70kD的融合蛋白，其由得自日本吸血虫(Schistosoma japonicum)的谷胱甘肽-S-转移酶和人类CD 44的外显子v3-v10组成(图1；Heider等人，1993)。在大肠杆菌(E.coli)中表达该融合蛋白，然后在谷胱甘肽-琼脂糖上进行亲和纯化(Smith等人，1988)。
用经过亲和纯化的融合蛋白，根据下列计划，腹腔内免疫接种雌性Balb/c小鼠：
第1次免疫接种           90微克融合蛋白在弗氏(Freund′s)完全佐剂中
第2次和第3次免疫接种    50微克融合蛋白在弗氏不完全佐剂中
以4周间隔免疫接种。在最后一次免疫接种后第14天，连续3天以在PBS中的10微克融合蛋白免疫接种动物。在第二天使用聚乙二醇4000，将得自具有高抗体效价的动物的脾细胞与P3.X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合。然后在微滴板中的HAT-培养基中筛选杂交瘤细胞(Kohler和Milstein，1975；Kearney等人，1979)。
测定在血清中的抗体效价，或筛选杂交瘤上清液，都用ELISA进行。在该试验中，所有微滴板的第一个都用融合蛋白(GST-CD44v3-10)覆盖，或仅用谷胱甘肽-S-转移酶覆盖。然后将其与系列稀释的血清样品或杂交瘤上清液一起温育，并利用偶联过氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的抗体来检测特异性抗体。任何仅与谷胱甘肽-S-转移酶反应的杂交瘤都被弃去。剩下的抗体，首先在ELISA中，用结构域-特异性融合蛋白(外显子v3，外显子v5+v6，外显子v6+v7，外显子v8-v10)进行鉴定(Koopman等人，1993)。在人的皮肤切片上测试其免疫组织化学反应性。
BIWA-1(VFF-18；其制备和特性亦可参见WO 95/33771)仅与含有由外显子v6编码的结构域的融合蛋白结合。为了更进一步限制该抗体的表位，在ELISA结合试验中使用代表v6结构域的不同部分的各种合成肽(图1)。14个氨基酸的肽v6D显示出最强的结合作用。所以，BIWA-1的表位完全或部分落在由外显子v6编码的结构域的序列QWFGNRWHEGYRQT之中。该序列与抗体1.1ASML的结合表位是同源的，后者在治疗性大鼠模型中使用，且其对大鼠CD44 v6是特异性的(图1)。
免疫组织化学
在与第一抗体一起温育前，将在洛提西斯醇(Rotihistol)(Roth，德国)中的石蜡切片(4μm)脱蜡三次，每次10分钟，然后在逐渐提高的酒精系列中再水化。以蒸馏水简单地冲洗切片，然后在0.01M钠-柠檬酸盐缓冲液中，在微波炉(SharpR-6270型)中以600瓦烘烤三次，每次各10分钟。在每次微波温育后，将切片冷却20分钟。在最后一次冷却阶段后，以PBS冲洗载体，并与正常的山羊血清(10％，在PBS中)一起预温育。在PBS中冲洗3次后，将切片与第一抗体(BIWA-1∶5微克/毫升；鼠IgG(同种型-对应的阴性对照组)5微克/毫升，在PBS/1％BSA中)一起温育1小时。用于染色反应的阳性对照组是正常人类皮肤切片，因为角质细胞表达含有v3-v10的CD 44-同种型。利用在PBS中的0.3％H2O2来阻断内源的过氧化物酶，并将切片与生物素化的第二抗体(抗-小鼠IgG-F(ab′)2，DAKO公司)一起温育30分钟。为了显色，将切片与辣根过氧化物酶一起温育30分钟，该酶偶联生物素而以链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物形式存在(DAKO Corp.)。然后在3，3-氨基-9-乙基-咔唑底物(Sigma Immunochemicals)中保温该切片5-10分钟，利用H2O使反应终止，并以苏木精复染。用Zeiss Axioskop光学显微镜来评价染色，并如下定量颜色的强度：+++，强表达；++，中等的表达；+，弱表达；-，不清楚或未检测到表达。只有具有清楚膜染色的肿瘤细胞被评为阳性。粗略地测定在每个切片中阳性肿瘤细胞的百分比，形成两组：局部阳性肿瘤(低于10％的与抗体反应的肿瘤细胞的10％)，阳性肿瘤(10％或10％以上的阳性肿瘤细胞)。如果在与该抗体反应的阳性细胞中，肿瘤细胞少于80％，则指示相对应的百分比。
利用CD44v6-特异性单克隆抗体BIWA-1来分析126例各种来源的鳞状细胞癌。在除了一个样品外的全部样品中，观察到含有CD44v6的同种型的表达。大部分样品显示抗原在80-100％的肿瘤细胞中表达，且染色被限制在肿瘤细胞的膜上。在基质组织、淋巴细胞、肌肉细胞或内皮细胞上未观察到反应。
为了定量CD44v6-分子在这些肿瘤细胞上的表达，将正常人类皮肤的切片，与肿瘤切片并行地染色。正常皮肤角质细胞表达高水平的CD 44-同种型，并且都属于到目前为止已经描述的正常细胞中CD44v6的最强表达子。因此，使用角质细胞的染色作为参考，并在我们的评估系统中将其归类为“强”(+++)。在大部分受检查的肿瘤样品中，肿瘤细胞的染色与皮肤角质细胞的染色相当，或甚至更强，仅有一些病例显示出弱的肿瘤染色(3例淋巴结转移)，或中等的肿瘤染色(2例原发性癌，10例转移)。染色反应在特定的肿瘤切片中是非常均一的，且在切片中大部分的肿瘤细胞具有相同的染色强度。原发性肿瘤与转移灶的CD44v6表达模式未观察到明显的差异。在表1中列出结果的详细概要，而实例示于图2中。
表1：CD44v6在鳞状细胞癌中的表达
样品 肿瘤类型 BIWA-1的反应性
46937 86 原发性 喉部 +++
4687 90 原发性 喉部 +++
8372 90 原发性 喉部 +++
17427 90 原发性 喉部 +++
27298 90 原发性 喉部 +++
46908 90 原发性 喉部 +++
51334 90 原发性 喉部 +++
51402 91 原发性 喉部 +++
60414 91 原发性 喉部 +++
61733 91 原发性 喉部 +++
12280 92 原发性 喉部 +++
23140 92 原发性 喉部 +++
31792 92 原发性 喉部 +++
32214 92 原发性 喉部 +++
10209 95 原发性 喉部 +++
2366 86 原发性 皮肤 +++
2574 86 原发性 皮肤 +++
9916 86 原发性 皮肤 ++/+++
2696 87 原发性 皮肤 +++
8906 87 原发性 皮肤 +++
8191 88 原发性 皮肤 +++
8354 88 原发性 皮肤 ++50％
11963 88 原发性 皮肤 ++
5590 90 原发性 皮肤 ++/+++
530 92 原发性 皮肤 +++
2583 94 原发性 皮肤 +++
11337 94 原发性 皮肤 +++
10901 95 原发性 皮肤 +++
11557 95 原发性 皮肤 +++
11744 95 原发性 皮肤 +++
11917 95 原发性 皮肤 +++
4688 90 I 淋巴结转移 喉部 ++/+++
4688 90 II 淋巴结转移 喉部 -
8374 90 淋巴结转移 喉部 +++
17428 90 淋巴结转移 喉部 +++
27300 90 淋巴结转移 喉部 +++
36942 90 淋巴结转移 喉部 +++
46909 90 淋巴结转移 喉部 ++
51336 90 淋巴结转移 喉部 +++
41108 91 淋巴结转移 喉部 +++
51398 91 淋巴结转移 喉部 +++
60416 91 淋巴结转移 喉部 +++
61734 91 淋巴结转移 喉部 +++
1318 92 I 淋巴结转移 喉部 +++
1318 92 II 淋巴结转移 喉部 +++
1318 92 III 淋巴结转移 喉部 +++
1318 92 IV 淋巴结转移 喉部 +++
2863 92 I 淋巴结转移 喉部 +++
2863 92 II 淋巴结转移 喉部 +++
5745 92 I 淋巴结转移 喉部 +++
5745 92 II 淋巴结转移 喉部 +++
8969 92 I 淋巴结转移 喉部 +++
8969 92 II 淋巴结转移 喉部 +++
8969 92 III 淋巴结转移 喉部 ++
8969 92 IV 淋巴结转移 喉部 +++
8969 92 2/I 淋巴结转移 喉部 +++
8969 92 2/II 淋巴结转移 喉部 +++
8969 92 2/III 淋巴结转移 喉部 ++
8969 92 2/IV 淋巴结转移 喉部 +/++
9366 92 淋巴结转移 喉部 +++
9509 92 淋巴结转移 喉部 +++
9566 92 淋巴结转移 喉部 +++
12283 92 淋巴结转移 喉部 +++
14046 92 淋巴结转移 喉部 +++
31787 92 淋巴结转移 喉部 +++
49228 92 淋巴结转移 喉部 +++50％
29228 93 淋巴结转移 喉部 +++
29829 93 淋巴结转移 喉部 ++
29804 95 淋巴结转移 喉部 ++/+++
15293 91 淋巴结转移 肺 +25％
1667 92 淋巴结转移 肺 +20％
2757 92 I 淋巴结转移 肺 +++
2757 92 II 淋巴结转移 肺 +++
2757 92 III 淋巴结转移 肺 +++
2757 92 IV 淋巴结转移 肺 +++
4790 92 淋巴结转移 肺 +++
6168 92 I 淋巴结转移 肺 ++50％
6168 92 II 淋巴结转移 肺 +++
6168 92 III 淋巴结转移 肺 +++
6168 92 IV 淋巴结转移 肺 +++
7206 92 淋巴结转移 肺 +++
7531 92 I 淋巴结转移 肺 +++
7531 92 II 淋巴结转移 肺 +++
7531 92 III 淋巴结转移 肺 ++/+++
7531 92 IV 淋巴结转移 肺 +++
10324 92 淋巴结转移 肺 +++
10519 92 II 淋巴结转移 肺 +++
10519 92 RM II 淋巴结转移 肺 +++
10958 92 淋巴结转移 肺 +++
11425 92 I 淋巴结转移 肺 +++
11425 92 II 淋巴结转移 肺 +++
13055 92 淋巴结转移 肺 ++/+++
13055 92 II 淋巴结转移 肺 局部的+++
13055 92 III 淋巴结转移 肺 +++
15663 92 淋巴结转移 肺 +++
16713 92 淋巴结转移 肺 +++
14980 91 I 淋巴结转移 食道 +++
14980 91 II 淋巴结转移 食道 +++
16641 91 I 淋巴结转移 食道 +++
16641 91 II 淋巴结转移 食道 +++
16641 91 III 淋巴结转移 食道 +++
1059 92 淋巴结转移 食道 +
1710 92 I 淋巴结转移 食道 +++
1710 92 II 淋巴结转移 食道 +++
1710 92 III 淋巴结转移 食道 +++
11502 92 I 淋巴结转移 食道 +++
11502 92 II 淋巴结转移 食道 ++
202 92 淋巴结转移 口腔 ++60％
6030 92 淋巴结转移 口腔 +/++/+++25％
7335 92 I 淋巴结转移 口腔 +++
7335 92 II 淋巴结转移 口腔 +++
15324 92 II 淋巴结转移 口腔 +++70％
16164 92 I 淋巴结转移 口腔 +++
16164 92 II 淋巴结转移 口腔 +++50％
16164 92 淋巴结转移 口腔 ++/+++
16836 92 I 淋巴结转移 口腔 +++
16836 92 II 淋巴结转移 口腔 +++
16836 92 III 淋巴结转移 口腔 +++
6228 92 I 淋巴结转移 扁桃体 +++
6228 92 II 淋巴结转移 扁桃体 +++
6618 92 淋巴结转移 扁桃体 +++
11840 92 淋巴结转移 扁桃体 ++
14172 91 4 淋巴结转移 食道 +++
14172 91 5 淋巴结转移 食道 +++
4131 94 1 淋巴结转移 食道 +/++
8438 94 淋巴结转移 食道 局部的++/+++
80-100％的肿瘤细胞与BIWA-1呈阳性的反应。在较少肿瘤细胞与该抗体反应的情况下，给出所得的百分比。
实施例2：CD44v6在肾细胞癌、前列腺癌和结肠癌的肝转移灶中的表达组织
分析19例肾细胞癌(12例透明细胞、5例易染细胞、1例难染细胞、1例肾良性瘤)，16例前列腺原发性腺癌和19例前列腺癌的淋巴结转移，以及30例结肠癌的肝转移。
抗体
BIWA-1(参见实施例1)
免疫组织化学
其方法参见实施例1。
与鳞状细胞癌对比，在大部分受试的肾细胞癌和前列腺癌中，未检测到CD44v6-同种型的表达，或仅有局部的表达。在表达程度高于局部表达的前列腺癌中，与正常前列腺上皮的染色相比较，染色主要是弥射性胞质染色并且较弱或不均一。在50％受试的结肠癌肝转移病例中，检测到表达程度高于局部表达的CD44v6同种型。在大部分的情况下，染色是模糊到中等的，但在样品中通常少于100％的肿瘤细胞呈显有BIWA-1的任何染色。其结果概述于表2中。
表2：在前列腺腺癌、肾细胞癌和结直肠癌的肝转移中CD44v6的表达
肿瘤类型     n        BIWA-1的反应性
    阴性   局部阳性     阳性
前列腺腺癌 原发性     16     8   3     5
前列腺腺癌 淋巴结转移     19     15   2     2
肾细胞癌 原发性     19     17   0     2
结直肠癌 肝转移     30     7   8     15
实施例3：CD44v6-特异性抗体的特征
细胞系
从美国典型培养物收集中心(American Type Culture Collec-tion)(Rockwell MD)获得人类SCC细胞系A-431(外阴自发性表皮样癌)，并根据制造商的指南进行培养。通过FACS分析，使用FITC-偶联的mAb BIWA-1，来测定含有同种型的CD44v6的表面表达。
动力学常数的分析
通过表面胞质基因组共振(Surface Plasmon Resonance)(SPR)，使用BIAcore 2000系统(Pharmacia Biocensor)，测定出单克隆抗体CD44v6-相互作用的亲和力和动力学。将含有由外显子v3-v10编码的区域的谷胱甘肽-S-转移酶-CD 44-融合蛋白(GST/CD44v3-v10)固定在CM5传感器芯片(Sensor Chip)上，根据制造商的指南进行氨基偶联法。以5微升/分钟的流速，将在HBS(10mM HEPES pH 7.4，150mM氯化钠，3.4mM EDTA，0.05％BIA核心表面活性剂P20)中之各种浓度的抗体(8-132nM)注射到抗原-特异性的表面上。以SPR信号的变化来记录相互作用。在缓冲液流(HBS)中对抗体的解离观察5分钟。利用15微升30mM HCl的单脉冲，再生该芯片的表面。利用Pharmacia Biocensors BIA评估软件，第2.1版，进行数据分析和动力学常数的计算。
以这种方式比较BIWA-1和其他CD44v6-特异性mAb(VFF4、VFF7、BBA-13(IgG1，R & D Systems，Abingdon，UK))的抗原亲和力。在两个分开的实验中，测定各种抗体的动力学和亲和力常数。表3列出4种mAb的结合速率(Ka)、离解速率(Kd)和离解常数(Kd)的值。所有的mAb都显示有类似的Ka和Kd，BBA-13例外，它具有低3倍的Ka，还有VFF7，与其他mAb相比较，它具有明显较高的离解速率(5倍)。这导致VFF7和BBA-13的结合亲和力低于VFF 4和BIWA-1。BIWA-1在全部所研究抗体中Kd最低。
表3：各种CD44v6-特异性mAb的动力学和亲和力常数
抗体     Ka(M-1S-1)     Kd(S-1)     Kd(M)
VFF4     1.1×105     2.6×10-5     2.4×10-10
VFF7     1.1×105     1.2×10-4     1.1×10-9
BIWA-1     1.3×105     2.2×10-5     1.7×10-10
BBA-13     3.7×104     2.3×10-5     6.2×10-10
使用ELISA分析抗体-蛋白质的相互作用。
在37℃下，以每孔5×104的量，在96-孔培养板(Falcon Microtest III，Bectob Dickinson，Lincoln Park，NJ)中，以带有10％胎牛血清的RPMI 1640来培养表达CD44v6的A-431细胞。用PBS/0.05％吐温20冲洗后，以冰冷的乙醇固定细胞1分钟，接着是冲洗的步骤。在室温下与第一抗体(VFF4、VFF7、BIWA-1、BBA-13，1毫微克/毫升到600毫微克/毫升，均溶于试验缓冲溶液：PBS/0.5％ BSA/0.05％吐温20)一起培养1小时，接着冲洗3次。所使用的第二抗体为兔-抗小鼠-IgG-辣根过氧化物酶偶联的抗体(DAKO Corporation，Copenhagen，Denmerk；以试验缓冲溶液稀释1∶6000)(在室温下1小时)。在3次冲洗步骤后，使用TMB溶液(Kirkegaard and Perry，Gaithersburg，USA)显色。使用Hewlett-Packard ELISA阅读器来测定其消光。
图3表示由BIAcore分析所测定的抗体的相对亲和力反应在与肿瘤细胞的相互作用中，其中BIWA-1清楚地显示最高的结合亲和力。
由CD 44-外显子v6编码的蛋白质结构域，包括45个氨基酸(图4)。为了更正确地定义由BIWA-1识别的表位，在ELISA分析中使用一系列合成肽。预备实验显示它们结合位于中央的14体(氨基酸群18-31；图4，也可参见图1)，但是不结合该区以外的肽。因此合成第二系列肽，并在竞争性ELISA中测试(图4)。结果表明肽19-29(WFGNRWHEGYR)代表高亲和力结合所需的最小结构。删除C-末端的精氨酸基团导致结合作用减弱100倍以上。
实施例4：在有异种移殖物的裸鼠中放射性碘化的CD44v6-抗体的生物分布
A-431-异种移殖模型
将5×106个经过培养的A-431细胞(人类女阴的表皮样癌)，皮下注射到8周龄的雌性BALB/c nu/nu裸鼠(B & K Universal，Renton，WA)左侧中线处。在两周内使用带有A-431肿瘤的异种移殖动物，进行生物分布的实验(肿瘤重量：40-50毫克)。
放射性碘化的BIWA-1
使用异双功能的交联剂琥珀酰亚氨基4-(N-顺丁烯二酰亚氨基-甲基)环己烷-1-羧酸酯将蛋白G-纯化的mAb BIWA-1(鼠IgG1)偶联到抗生蛋白链菌素。将抗生蛋白链菌素-赖氨酰基与二硫苏糖醇预先处理抗体而产生的还原型抗体半胱氨酰基连结。得到1∶1的偶联物(＞90％)，并通过离子交换层析法进一步纯化。在生物分布实验中，用对-碘苯基标记试剂(PIP；NEN Dupont，Wilmington，DE)经由带有125I的赖氨酸的伯胺来标记BIWA-1/SA，接着进行Willbur等人(1989)的方法。以SA或125I标记BIWA-1并不会影响该抗体在小鼠中的免疫反应性或药物动力学。
生物分布实验
经由背侧尾部静脉，对用人类A-431肿瘤异种移殖的裸鼠静脉内注射有5-7微居里125I标记的50微克mAb BIWA-1(比放射性0.1-0.14毫居里/毫克)。在n＝3的动物组中，在注射后4、24、48、120和168小时的时间点进行时间-生物分布的研究。在所选定的时间，称重小鼠，从眼眶后采血，并通过颈椎脱臼法将其杀死。收集九种器官和组织并将其称重：血液、尾巴、肺、肝、脾、胃、肾、小肠和肿瘤。在γ-闪烁计数器(PackardInstrument Company，Meriden，CT)上对该组织的放射性计数，与注射抗体制品的标准品比较，将125I的能量窗设定在25-80keV。计算出每克组织的注射剂量的百分比(％ID/克)。
预实验已表明BIWA-1不会与鼠CD44v6-抗原有交叉-反应。表4和图5表示放射性在肿瘤和正常组织中的吸收作用。碘化的BIWA-1显示迅速的肿瘤吸收(在注射后4小时为7.6％注射剂量/克)，它在48小时后增加到18％ID/克以上，然后在直到120小时时保持不变。在注射后7天(168小时)，肿瘤仍然含有15.3％ID/每克组织。就各个时间段计算出肿瘤：组织之比，并将其示于表4中。在注射后24小时，肿瘤：血液之比为0.48，并在第7天增加到3.16。在正常组织中摄入很少，且最有可能由组织活检中的血库背景所引起。利用125I-标记的BIWA-1选择性体内靶向裸鼠中的人类SCC-异种移殖物，结果表明在SCC患者的诊断和治疗中，该单克隆抗体具有很高的作为靶载体的潜力。
表4：125I-BIWA-1在带有A-431-肿瘤的裸鼠身上，在注射后各种
     时间的肿瘤：组织之比
肿瘤与下列组织之比 4小时 24小时 48小时 120小时 168小时
血液 0.22a 0.48 1.31 2.60 3.16
尾巴 1.18 2.62 7.70 12.28 13.06
肺 0.40 1.03 2.65 7.04 4.82
肝 0.94 1.18 2.28 3.57 3.24
脾 1.40 1.84 4.00 4.86 4.42
胃 3.89 7.37 19.40 25.56 33.96
肾 0.82 1.31 2.72 2.79 2.53
小肠 3.54 6.24 11.94 19.24 27.78
a平均值(n＝3)；SD＜7％
实施例5：CD44v6在大量人类肿瘤中的差异表达
在较广泛的研究中，利用单克隆抗体BIWA-1(克隆VFF-18)经免疫组织化学方法检测总共544个肿瘤样品的CD44v6的表达。样品经手术取出后，立即包埋在石蜡中或冷冻在液氮中，并储存在-70℃直到需要为止。分析下列的肿瘤：基细胞癌(n＝16)，乳房的腺癌(AC)(n＝55)，结肠的AC(n＝83)，头和颈的鳞状细胞癌(SCC)(n＝125)，肺癌(n＝120)，前列腺AC(n＝34)，肾细胞癌(n＝27)，皮肤的SCC(n＝15)和胃的AC(n＝69)。通过常规手术或活检获得组织，获得肿瘤样品的同时获得正常组织。按照实例1来进行免疫组织化学研究。
表5表示用mAb BIWA-1对397个不同类型的肿瘤进行免疫组织化学分析的概要。
表5：CD44v6在人类肿瘤中的表达
类型 总数 阳性案例*
n ％
基细胞癌 原发性肿瘤 16 10 62
乳房AC 原发性肿瘤 17 15 88
淋巴结转移瘤 34 31 91
肝转移瘤 4 4 100
结肠AC 淋巴结转移瘤 51 21 41
肝转移瘤 26 13 50
脑转移瘤 6 6 100
喉部SCC 淋巴结转移瘤 18 18 100
肺AC 原发性肿瘤 35 15 43
肺SCC 原发性肿瘤 9 9 100
食道SCC 原发性肿瘤 20 20 100
前列腺AC 原发性肿瘤 16 5 31
淋巴结转移瘤 18 0 0
RCC 原发性肿瘤 27 5 18
SCLC 原发性肿瘤 31 7 23
胃AC 原发性肿瘤 22 15 68
淋巴结转移瘤 43 16 37
肝转移瘤 4 4 100
总数 397
*：＞10％的肿瘤细胞阳性
AC：腺癌；RCC：肾细胞癌
SCLC：小细胞肺癌；SCC：鳞状细胞癌
在小细胞肺癌、肾细胞癌和前列腺AC中，未观察到反应性或仅有很少的反应性。所有受检的其他类型肿瘤，都不同程度表达含有CD44v6的同种型。在大部分受检的乳房AC中，显示可与BIWA1反应，而受检的SSC(喉部、肺和食道)的全部病例都表达CD44v6。
研究另外185例各种类型和类别的SCC病例与BIWA1的反应性。这些包括67例原发性SCC(喉部，n＝15；口腔，n＝16；口咽，n＝3；皮肤，n＝15)，77例淋巴结转移(喉部，n＝12；肺，n＝27；食道，n＝11；口腔，n＝6；口咽，n＝7；下咽部，n＝10；扁桃体，n＝4)，以及3例肝转移(食道)。表6综述了所有受检的SSC样品的免疫组织化学分析。
表6：CD44v6在鳞状细胞癌中的表达
类型 总数     阴性   局部阳性     阳性
n ％ n ％ n ％
下咽部 LNM 10 0 0 0 0 10 100
口咽 PT 3 0 0 0 0 3 100
LNM 7 0 0 0 0 7 100
喉部 PT 15 0 0 0 0 15 100
LNM 30 1 3 0 0 29 97
肺 PT 18 2 11 0 0 16 89
LNM 27 0 0 1 4 26 96
食道 PT 20 0 0 1 5 19 95
LNM 11 0 0 0 0 11 100
LM 3 0 0 0 0 3 100
口腔 PT 16 0 0 0 0 16 100
LM 6 0 0 0 0 6 100
皮肤 PT 15 0 0 0 0 15 100
扁桃腺 LNM 4 0 0 0 0 4 100
总数 185
局部阳性：＜10％的肿瘤细胞阳性；LNM：淋巴细胞转移；PT：原发性肿瘤；LM：肝转移
发现含有CD44v6的同种型除了3个肿瘤样品(1例喉部，2例肺)外在全部样品中表达。大部分的样品显示，抗原在单一切片的80到100％的肿瘤细胞中表达，且染色主要集中在肿瘤细胞的膜上。在喉部、食道和咽下部的癌中，发现最均匀的染色模式，切片中大部分的肿瘤细胞具有相同强度的染色。
参考文献
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序列一览表
(1)一般数据：
      (i)申请人：
               (A)姓名：Boehrinqer Ingelheim international GmbH
               (B)街：Rheirtstrasse
               (C)市镇：Ingelheim
               (E)国家：Germany
               (F)邮政编码：55216
               (G)电话：+49-(0)-6132-772770
               (H)传真：+49-(0)-6132-774377
               (A)姓名：Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
               (B)街：Postfach 3640
               (C)市镇：Karlsruhe
               (K)国家：Germany
               (F)邮政编码：76021
               (A)姓名：Heider，Karl-Heinz
               (B)街：Hervicusgasse 4/3/21
               (C)市镇：Vienna
               (B)国家：Austria
               (E)邮政编码：1120
               (A)姓名：Adolf，Guenther
               (B)街：Stiftgasse 15-17/10
               (C)市镇：Vienna
               (E)国家：Austria
               (F)邮政编码：1070
               (A)姓名：Ostermann Elinborg
               (B)街：Mauerbachstr.56/6
               (C)市镇：Vienna
               (E)国家：Austria
               (F)邮政编码：1140
               (A)姓名：Patzelt，Eirk
               (B)街：Hans-Buchmueller-Gasse 8
               (C)市镇：Purkersdorf
               (E)国家：Austria
               (F)邮政编码：3002
               (A)姓名：Sprall，Narlies
               (B)街：Schwenkgasse 3
               (C)市镇：Vienna
               (E)国家：Austria
               (F)邮政编码：1120
(ii)发明名称：诊断及治疗鳞状细胞癌的方法
(iii)序列数：16
(iv)计算机可读版本：
(A)数据载体：软盘
(B)电脑：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：专利放弃(Patentln Release)#1.0第1.30版(EPO)
(2)关于序列1的资料：
      (i)序列特征：
            (A)长度：129个碱基对
            (B)性质：核苷酸
            (C)股型：双股
            (D)拓朴学：两种
(ii)分子性质：基因组DNA
(ix)特征：
      (A)名称/关键：外显子
      (B)位置：1..129
      (C)其他资料：/产物＝“CD 44”
             /标记-v6
             /注记-“基因库登记号L05411”
             /文献出处-([1])
(ix)特征：
      (A)名称/关键：CDS
      (B)位置：3..128
(x)出版信息：
      (A)作者：Screaton，GR
               Bell，MV
               Jackson，DG
               Cornelis，FB
               Gerth，U
               Bell，JI，，
      (B)标题：编码淋巴细胞反巢受体CD 44的DNA的基因结构
      显示至少12个交替剪接外显子
      (C)期刊：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
      (D)卷：89
      (F)页数：12160-12164
      (D)日期：1992年12月
      (K)序列1的主要基：自1至129
(x)出版信息：
      (H)文件编号：德国专利195 45 472.3.，
      (I)申请日：1995年12月16日
(x)出版信息：
      (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
      (I)申请日：1996年4月17日
(xi)序列描述：序列1
TC CAG GCA ACT CCT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ACC
CAG AAG 47
Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys
 1                  5               10                  15
GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAA
ACA CCG 95
Glu Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Try Arg Gln Thr Pro
 20                 25                  30
AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT G 129
Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala
 35                 40
(2)关于序列2的数据：
     (i)序列特征：
           (A)长度：42个氨基酸
           (B)性质：氨基酸
           (D)拓朴学：直线
     (ii)分子性质：蛋白质
     (xi)序列描述：序列2：
Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu
 1                  5               10                 15
Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg
             20                     25             30
Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala
         35                 40
(2)关于序列3的数据：
     (i)序列特征：
           (A)长度：14个氨基酸
           (B)性质：氨基酸
           (C)股型：单股
           (D)拓朴学：直线
     (ii)分子性质：肽
     (x)出版信息：
           (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
           (I)申请日：1995年12月6日
     (x)出版信息：
           (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
           (I)申请日：1996年4月17日
     (xi)序列描述：序列3
Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp HIS Glu Gly Tyr Arg Gln Thr
 1                  5               10
(2)关于序列4的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：27个碱基对
         (B)性质：核苷酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：其他核酸
         (A)说明：/desc＝“PCR引物”
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列4
CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG
(2)关于序列5的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：30个碱基对
         (B)性质：核苷酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：其他核酸
         (A)说明：/desc＝“PCR引物”
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列5
TGATAAGGAA CGATTGACAT TAGAGTTGGA
(2)关于序列6的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：11个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：核苷酸
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列6
Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg
 1               5                  10
(2)关于序列7的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：43个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：肽
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列7
Gln Ala Thr Pra Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu
 1                  5                   10               15
Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg
             20                 25                  30
Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala Ala
         35                 40
(2)关于序列8的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：11个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：肽
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列8
Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys
1               5                       10
(2)关于序列9的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：10个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：肽
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列9
Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu Gln Trp
 1              5                   10
(2)关于序列10的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：11个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：肽
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列10
Thr Ala Thr Gln Lys Glu Gln Trp Phe Gly Asn
 1               5                      10
(2)关于序列11的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：14个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：肽
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列11
Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr
 1               5                  10
(2)关于序列12的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：11个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：肽
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列12
Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pra
 1                  5           10
(2)关于序列13的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：11个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：肽
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列13
Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg Glu Asp Ser
 1               5                  10
(2)关于序列14的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：10个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：肽
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列14
Thr Pro Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Gly
 1               5                  10
(2)关于序列15的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：42个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：肽
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列15
Frp Ala Asp Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Ala Ala Thr Gln Lys Glu
 1                   5               10                  15
Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr Pro Ser
             20                  25                  30
Glu Asp Ser His Val Thr Glu Gly Thr Thr
         35                 40
(2)关于序列16的数据：
    (i)序列特征：
         (A)长度：14个氨基酸
         (B)性质：氨基酸
         (C)股型：单股
         (D)拓朴学：直线
    (ii)分子性质：肽
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利195 45 472.3
         (I)申请日：1995年12月6日
    (x)出版信息：
         (H)文件编号：德国专利196 15 074.4
         (I)申请日：1996年4月17日
    (xi)序列描述：序列16
Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr
 1                5                 10

Claims (16)

1.一种体外诊断鳞状细胞癌的方法，该方法是基于抗体分子与由基因CD 44的可变外显子v6编码的表位的结合作用，其特征是，使用识别氨基酸序列WFGNRWHEGYR的抗体分子，所述序列是基于CD44基因可变外显子所编码的结构域序列。
2.根据权利要求1的方法，其特征是，使用单克隆抗体BIWA-1，也称为VFF-18，该抗体由具有登记号DSM ACC2174的杂交瘤细胞系产生。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征是，抗体分子为单克隆抗体，免疫球蛋白的Fab-或F(ab′)2-片段，通过重组方法制备的抗体。
4.根据权利要求3的方法，其中通过重组方法制备的抗体是指通过重组方法制备的嵌合抗体或人源化抗体，双功能抗体或单链抗体。
5.一种抗体分子在根据权利要求1至4之一的方法中的用途，该抗体分子与氨基酸序列WFGNRWHEGYR结合，所述序列是基于CD44基因可变外显子所编码的结构域序列。
6.根据权利要求5的用途，其特征是，该抗体分子是单克隆抗体BIWA-1，也称为VFF-18，该抗体由具有登记号DSM ACC2174的杂交瘤细胞系产生。
7.根据权利要求5或6的用途，其特征是，该抗体分子是单克隆抗体、免疫球蛋白的Fab-或F(ab′)2-片段，通过重组方法制备的抗体。
8.根据权利要求7的用途，其中通过重组方法制备的抗体是指通过重组方法制备的嵌合抗体或人源化抗体，双功能抗体或单链抗体。
9.结合氨基酸序列WFGNRWHEGYR的抗体分子的用途，用于制备治疗鳞状细胞癌用的药物组合物，所述序列是基于CD44基因可变外显子所编码的结构域序列。
10.根据权利要求9的用途，其特征是，该抗体分子是单克隆抗体BIWA-1，也称为VFF-18，该抗体由登记号DSMACC2174的杂交瘤细胞系产生。
11.根据权利要求9或10的用途，其特征是，该抗体分子是单克隆抗体、免疫球蛋白的Fab-或F(ab′)2-片段，通过重组方法制备的抗体。
12.根据权利要求11的用途，其中通过重组方法制备的抗体是指通过重组方法制备的嵌合抗体或人源化抗体，双功能抗体或单链抗体。
13.根据权利要求9或10的用途，其特征是，将该抗体分子与放射性同位素、光可激活的化合物、放射性化合物、酶、荧光染料、生物素分子、毒素、细胞抑制剂、前体药物、具有不同特异性的抗体分子、细胞因子或其他的免疫调节多肽相连结。
14.根据权利要求11的用途，其特征是，将该抗体分子与放射性同位素、光可激活的化合物、放射性化合物、酶、荧光染料、生物素分子、毒素、细胞抑制剂、前体药物、具有不同特异性的抗体分子、细胞因子或其他的免疫调节多肽相连结。
15.根据权利要求12的用途，其特征是，将该抗体分子与放射性同位素、光可激活的化合物、放射性化合物、酶、荧光染料、生物素分子、毒素、细胞抑制剂、前体药物、具有不同特异性的抗体分子、细胞因子或其他的免疫调节多肽相连结。
16.一种用以实施权利要求1至3之一的方法的制剂，其特征是，它是一种结合到氨基酸序列WFGNRWHEGYR的抗体或抗体分子，所述序列是基于CD44基因可变外显子所编码的结构域序列。
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