[go: up one dir, main page]

SK284378B6 - Použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR, na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek - Google Patents

Použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR, na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek Download PDF

Info

Publication number
SK284378B6
SK284378B6 SK736-98A SK73698A SK284378B6 SK 284378 B6 SK284378 B6 SK 284378B6 SK 73698 A SK73698 A SK 73698A SK 284378 B6 SK284378 B6 SK 284378B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antibody
lymph node
node metastasis
larynx
tumor
Prior art date
Application number
SK736-98A
Other languages
English (en)
Other versions
SK73698A3 (en
Inventor
Karl-Heinz Heider
G�Nther Adolf
Elinborg Ostermann
Erik Patzelt
Marlies Sproll
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19545472A external-priority patent/DE19545472A1/de
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh, Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh
Publication of SK73698A3 publication Critical patent/SK73698A3/sk
Publication of SK284378B6 publication Critical patent/SK284378B6/sk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70585—CD44
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2884—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD44
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Je opísané použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR na výrobu liečiva na liečenie karcinómov dlaždicového epitelu, ktorý je založený na väzbe molekuly protilátky na epitop, ktorý je kódovaný variabilným exónom v6 génu CD44. Vo výhodnom uskutočnení sa v uvedenom spôsobe použije v6-špecifická protilátková molekula, najmä monoklonálna protilátka BIWA-1 (VFF-18).ŕ

Description

Vynález sa týka použitia protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek, ktorý je založený na väzbe molekuly protilátky na epitop, ktorý je kódovaný variabilným exónom V6 génu CD44.
Doterajší stav techniky
Nedávno sa preukázalo, že expresia variantov povrchových glykoproteínov CD44 je potrebná a postačujúca, aby sa vyvolalo takzvané spontánne metastázovanie nielen v nemetastázovanej bunkovej línii adenokarcinómu potkana, ale aj v nemetastázovanej fibrosarkómovej bunkovej línii potkana (Gunthert et al., 1991). Kým najmenšia izoforma CD44, štandardná forma CD44, je všeobecne exprimovaná v rade rozličných tkanív vrátane epitelových buniek, určité štcpnc varianty CD44 (CD44v) sú exprimované iba jednou podskupinou epitelových buniek. Uvedené izoformy CD44 sa vytvoria alternatívnym štepením tak, že sekvencie 10 exónov (vl až vlO) v génoch CD44 sa úplne vystrihnú, jednako však pri vyšších variantoch môžu nastávať rôzne kombinácie (Screaton et al., 1992; Heider et al., 1993; Hofmann et all., 1991). Varianty sa rozlišujú tým, že na určitom mieste mimobunkových častí proteínov sú vložené rozdielne aminokyselinové sekvencie. Také varianty možno dokázať v rôznych ľudských nádorových bunkách a ľudskom nádorovom tkanive. Tak sa nedávno zistila expresia variantov CD44 v priebehu kolorektálnej karcinogenézy (heider et al., 1993). Expresia variantov CD44 chýba v normálnom ľudskom kolónovom epiteli, a dokázateľná je iba slabá expresia v proliferovaných bunkách krýpt. V neskorších štádiách rozvoja nádoru, napríklad v adenokarcinómoch, všetky malígne odrody exprimujú varianty CD44. Ďalej sa nedávno preukázala expresia stepných variantov CD44 v aktivovaných lymfocytoch ako aj v neHodgkinových lymfómoch (Koopman et al., 1993).
Známe sú pokusy o využití rozdielov v expresii variantných exónov génov CD44 v nádoroch a v normálnych tkanivách na diagnostické a terapeutické účely (WO 94/02633, WO 94/12631, WO 95/00658, WO 95/00851, EP 0 531 300).
Expresia variantných CD44-molekúl v karcinómoch dlaždicového epitelu bola tiež už skúmaná. Sami et al. (1993) našiel pomocou v6-špecifickcj protilátky Var3.1 úbytok v6-expresie v nádorových bunkách v porovnaní s normálnymi bunkami. Brooks et a/.(l995) dosiahol pomocou v6-špecifickej protilátky 11.9 heterogénne vyfarbenie nosohltanového karcinómu. Iba v 2/12 prípadov sa dosiahlo silné vyfarbenie, zatiaľ čo vo väčšine prípadov sa mohol dosiahnuť iba slabý fokálny imunohistologický dôkaz.
Úlohou tohto vynálezu preto bol vývoj nového spôsobu diagnózy a terapie karcinómov dlaždicového epitelu, ako aj príprava prostriedkov na uskutočnenie daného spôsobu.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek, ktorý je založený na väzbe molekuly protilátky na epitop, ktorý je kódovaný variabilným exónom V6 génu CD44. Molekuly protilátky so zodpove dajúcou špecifickosťou sú vhodné najmä ako nosič, aby selektívne dosiahli karcinóm dlaždicového epitelu in vivo.
Výhodné sú také použitia, ktoré sa vyznačujú použitím molekuly protilátky, ktorá rozoznáva aminokyselinovú sekvenciu QWFGNRWHEGYRQT, výhodnejšie aminokyselinové sekvencie WFGNRWHEGYR. Výhodná je pritom najmä monoklonová protilátka BIWA-1 (kloň VFF-18), ktorá je odvodená z hybridomovej bunkovej línie, ktorá bola 7. 6. 1994 uložená v DSM (- Deutsche Sammlung flir Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheorder Weg lb, D-38 124 Braunschweig, BRD) pod úložným číslom DSM ACC2174, alebo deriváty tejto protilátky.
Ďalším predmetom vynálezu je aj farmaceutický prostriedok na liečenie uvedených chorôb.
Nukleová a aminokyselinová sekvencia variantných exónov v6 génov CD44 je známa (Screaton et. al., 1992; Tolg et al., 1993). Jestvovanie degenerovaných alebo všetkých variantov nie je z hľadiska uskutočnenia tohto vynálezu podstatné; také varianty sú vo vynáleze preto výslovne zahrnuté.
Sekvencia exónu v6 ľudských génov CD44 je:
ΟΑΤΡδδΤΤΕΕΊ’ΑΊ’Ο
TC CAG GCA ACT CCT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ACC CAG
KEQWFGNRWHEGYRQ
AAG GAA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAA
TPREDSHSTTGTA
ACA CCC AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT G.
Vynález sa môže uskutočniť s polyklonovými alebo s mnoklonovými protilátkami, ktoré sú špecifické pre jeden epitop, kódovaný s exónom v6, najmä pre epitop v rozsahu aminokyselinovej sekvencie QWFGNRWHEGYRQT, najvýhodnejšie v rozsahu aminokyselinovej sekvencie WFGNRWHEGYR. Príprava protilátky proti známym aminokyselinovým sekvenciám sa môže vykonať spôsobmi, ktoré sú známe (Catty, 1989). Peptid s touto sekvenciou sa napríklad môže pripraviť synteticky a môže sa použiť v imunizačnom protokole ako antigén. Iným spôsobom možno prípravu uskutočniť tak, že sa pripraví fúzovaný proteín, ktorý obsahuje vyžadovanú aminokyselinovú sekvenciu, tak, že nukleová kyselina (syntetická alebo pripravená z vhodnej vzorky napríklad polymerázovou-reťazovou rekaciou(PCR)), kódujúca pre uvedenú sekvenciu, sa integruje do vektora expresie a fúzovaný proteín sa exprimuje v hostiteľskom organizme. Podľa potreby čistený, fúzovaný proteín sa potom môže použiť ako antigén alebo ako inzert špecifickej protilátky v imunizačnom protokole, alebo - v prípade monoklortovej protilátky - môže sa hybridom, ktorý včlenenenú špecifickú protilátku exprimuje, môže sa vhodným spôsobom selektovať. Takéto spôsoby sú v rámci doterajšieho stavu techniky známe. Heider et al. (1993, 1996a) a Koopman et al. (1993) opísali prípravu protilátky proti variantnému epitopu z CD44.
V spôsobe podľa tohto vynálezu môžu sa jednako použiť tiež molekuly protilátky, ktoré sú odvodené of poly- alebo monoklonových protilátok, napríklad fragment Fab alebo fragmenty F(ab')2 imunoglobulínu, rekombinantne pripravená jednoreťazová protilátka (scFv), chimérová alebo humanizovaná protilátka, ako aj iné molekuly, ktoré sa špecificky viažu na epitop, ktorý je kódovaný exónom v6. Protilátka BIWA-1 (VFF-18) alebo iné protilátky, napríklad fragmenty Fab alebo F(ab')2 sa môžu získať z úplného imunoglobulínu (Kreitman et al., 1993). Popri uvedenom je odborník v danej oblasti schopný vytvoriť molekuly rekombinantnej v6-špecifickej protilátky. Podľa analýzy a minokyselinovej sekvencie protilátky BIWA-1 (VFF-18) a/alebo s použitím hybridómovej bunkovej línie, ktorá túto protilátku produkuje, najmä ktorá obsahuje genetickú informáciu, môže odborník pripraviť molekuly rekombinantnej protilátky s rovnakým idiotypom, ako je BIWA-1 (VFF18), to znamená molekuly protilátky, ktorá má v oblasti antigénového väzbového miesta (complementaritydetermining regions, CDR) rovnakú aminokyselinovú sekvenciu ako protilátka BIWA-1 (VFF-18). Vhodné spôsoby sú v rámci doterajšieho stavu techniky známe. Uvedené molekuly rekombinatnej protilátky môžu napríklad byť humanizovaná protilátka (Shin et al., 1989; Gussov et Seemann, 1991), bišpecifická alebo bifunkčnú protilátka (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989; Featherstone, 1996), jednoreťazová protilátka (scFv, Johnson et Bird, 1991), úplný alebo fragmentovaný imunoglobulín (Coloma et al., 1992; Nesbiot et al., 1992; Barbas et al., 1992), alebo pomocou “chain shuffling pripravená protilátka (Winter et al., 1994). Humanizovaná protilátka sa môže pripraviť napríklad CDR-štepmi (EP 0 239 400). Môžu sa tiež modifikovať rámcové oblasti (EP 0 519 596; WO 90 07 861). Na humanizovanie protilátok sa dnes používajú spôsoby, ako je PCR (pozri napríklad EP 0 368 684; EP 0 438 310; WO 92 07 075), alebo počítačové modelovanie (pozri napríklad WO 92 22 653). Ďalej sa môžu tiež pripraviť a použiť fúzované proteíny, napríklad jednoreťazovou protilátkou/toxínom fúzovaný proteín (Chaudhary et al., 1990; Friedman et al., 1993). Pod uvádzaný pojem „protilátka” a „molekula protilátky” patria všetky v tejto časti diskutované zlúčeniny bez polyklonových a monoklonových protilátok, ako aj ďalšie zlúčeniny, ktoré možno štruktúrne odvodiť od imunoglobulínu a sú pripraviteľné známymi spôsobmi.
Pri známom epitope (porovnaj obr. 1, obr. 4) protilátky BIWA-1 (VFF-18) je priemerný odborník v danej oblasti schopný rovnako pripraviť ekvivalentnú protilátku s rovnakou väzbovou špecifickosťou. Také protilátky sú preto rovnako zahrnuté v rozsahu tohto vynálezu.
Na diagnostické účely sa môžu molekuly protilátky, výhodne molekuly protilátky BIWA-1, jej fragmenty alebo molekuly rekombinantnej protilátky rovnakého idiotypu viazať s rádioaktívnymi izotopmi, ako je napríklad 125I, l3lI, Ί, 99mTc alebo rádioaktívnymi zlúčeninami (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), enzýmami, ako je napríklad peroxidáza alebo alkalická fosfatáza (Catty a Raykundalia, 1989), s fluorescenčnými farbivami (Johnson, 1989), alebo s molekulami biotínu (Guesdon et al., 1979). Na terapeutické použitie sa môžu molekuly špecifickej v6- protilátky, výhodne molekuly protilátky BIWA-1 (VFF-18), alebo od VFF-18 odvodené molekuly protilátky, napríklad jej fragmenty alebo molekuly rekombinantnej protilátky s rovnakým idiotypom, viazať s rádioizotopmi, ako sú 90Y, 131I, 186Re, l53Sm, 67Cu, 212Bi, 213Bi, 177Lu (Quadri et al., 1993; Lenhard et al., 1985; Vriesendorp et al., 1991; Wilbur et al., 1989; Maraveyas et al., 1995, Jurcic et Scheinberg, 1994), toxínmi (Vitetta et al., 19091; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993;, Theuer et al., 1993), cytostatikmi (Schrappe et al.,
1992) , proliečivami (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989), s fotoaktivovateľnými látkami (Hemming et al.,
1993) , s molekulou protilátky s inou špecifickosťou, alebo s rádioaktívnymi zlúčeninami. Molekula protilátky môže byť ďalej viazaná s cytokínom alebo iným imunomodulujúcim polypeptidom, napríklad s tumorovým nekrotickým faktorom, lymfotoxínom (Reisfeld et al., 1996), alebo s interleukínom-2 (Becker et al., 1996). Molekuly protilátky sa na použitie v systémoch s cieľovaním (“pretargeting systems”) môžu modifikovať tiež napríklad streptavidínom alebo biotinom (Goodwin, 1995).
V diagnostických spôsoboch podľa tohto vynálezu sa môžu výhodne vyšetrovať vzorky odobraté pacientom, napríklad z biopsií, pri ktorých je podozrenie na karcinóm dlaždicového epitelu, alebo už s existujúcou diagnózou, alebo s nádorom, pri ktorých sa vyžaduje bližšie spresnenie. Dôkaz variantných molekúl CD44, obsahujúcich aminokyselinovú sekvenciu, kódovanú variabilným exónom v6, sa môže vykonať pomocou protilátky na proteínovej úrovni, alebo na úrovni nukleových kyselín, pomocou špecifických sond nukleových kyselín, alebo pomocou primárov na polymerázovú - reťazcovú reakciu (PCR).Vynález sa preto týka tiež molekúl protilátok a nukleových kyselín, ktoré sú vhodné na použitie v uvedených spôsoboch ako sondy alebo priméry, a použitia takých protilátok a nukleových kyselín na diagnózu a analýzu karcinómov dlaždicového epitelu. Imunohistochemicky s protilátkami sa napríklad môžu vyšetrovať rezy tkanív pomocou známych spôsobov. Extrakty získané zo vzoriek tkanív, alebo telové tekutiny sa ďalej môžu vyšetrovať ďalšími imunologickými spôsobmi s použitím protilátok, napríklad pijakovanim (westem blots), pri enzýmovej imunoadsorbentovej analýze (ELISA, Catty at Raykundalia, 1989), rádioimunoanalýze (RIA, Catty et Murphy, 1989), alebo v podobných imunoanalytických spôsoboch. Vyšetrovania sa môžu vykonávať kvalitatívne, semikvantitatívne alebo ako kvantitatívne analýzy.
Popri diagnostike in vitro sú molekuly protilátky so špecifickosťou podľa tohto vynálezu vhodné tiež na diagnostiku karcinómov dlaždicového epitelu in vivo. Ak bude molekula protilátky nosičom detegovateľnej značky, potom sa detekcia značky môže využívať na diagnostické účely, napríklad na zviditeľnenie nádoru in vivo (zobrazovanie Imaging), alebo napríklad pri rádiochirurgii (radioguided surgery). Pri použití rádioaktívnymi izotopmi konjugovanej protilátky na imunoscintilografiu sa napríklad získa celý rad záznamov, na základe ktorých odborník môže vyvodiť vyžadované závery (Siccardi et al., 1989; Keenan et al., 1987; Perkins et Pimm, 1992; Colcher et al., 1987; Thompson et al., 1984).
Dôkaz a/alebo kvantifikácia zvýšenej hladiny expresie variantných CD44 epitopov v6 môže vyústiť do diagnózy a prognózy stavu. Výhodne sa môžu pritom využiť kombinácia s ďalšími prognostickými parametrami, napríklad s určením stupňa nádoru (mit dem Tumorgrad).
Molekuly protilátky so špecifickosťou podľa tohto vynálezu, prípadne viazané s cytotoxickým činidlom sa môžu výhodne použiť na terapiu karcinómov dlaždicového epitelu. Použitie môže pritom byť systémové alebo topikálne, napríklad intravenózne (ako bolus alebo infúzia), intraperitoneálne, intramuskuláme, subkutánne a iné injekcie/infúzie. Protokoly podávania konjugovaných alebo nekonjugovaných protilátok (či už ako úplné imunoglobuliny, fragmenty, rekombinantné humanizovanc molekuly alebo iné) sú v súčasnom stave techniky známe (Mulshine et al., 1991; Larson et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992, 1995; Press et al., 1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982). Terapeutické použitie môže byť napríklad obdobné, ako sa používajú protilátky 1.1ASML (Seiter et al., 1993). Nemodifikovaná monoklonová protilátka sa môže terapeuticky použiť priamo, ak je pre cytotoxický účinok vhodná ako efektor, napríklad pre komplementáme-indukovanú alebo protilátkovo-indukovanú bunkovú cytotoxickosť ( Riethmíiller et al., 1994). Vhodnou monoklonovou proti látkou na uvedené použitie sú protilátka izotyp lgG2a myši a protilátka typu IgGl človeka. Nemodifíkované protilátky sa môžu ďalej použiť na indukciu vlastnej protinádorovej reakcie pacienta anti-idiotypovým mechanizmom (Baum et al. 1993; Khazaeli e/ al., 1994).
Výhodná forma uskutočnenia terapeutického použitia záleží od toho, že sa spojí humanizovaný v6-špecifický imunoglobulín alebo jeho fragment F(ab')2 s 90Y (Quadri et al., 1993; Vriesedorp et al., 1995), 131I (Maraveyas et al., 1995a, 1995b; Juweid et al., 1995; Press et al., 1995; Thomas et al., in: Catty 1985, strany 230 až 239), 186Re (Breitz et al., 1992, 1995), alebo s iným vhodným rádioizotopom a použije sa na rádioimunoterapiu karcinómov dlaždicového epitelu. Napríklad sa môže spojiť protilátka B1WA-1, alebo humanizovaná verzia protilátky BIWA-1, alebo fragment F(ab')2 protilátky BIWA-1 alebo humanizovanej protilátky s 90Y s použitím chelátotvomcho linkera ako je ICTB-DTPA (izotiokyanátbenzyl-dietylentriaminopentaacetát), pričom sa má dosiahnuť špecifická aktivita 5 až 20 mCi.mg'1, výhodne 10 mCi.mg'1 Uvedená účinná látka sa potom podáva pacientovi s antigén-pozitívnym nádorom v dávkach od 0,1 do 1 mCi.kg'1 telesnej hmotnosti, výhodne 0,3 až 0,5 Mci.kg’1 telesnej hmotnosti. Ak je molekula protilátky viazaná s 131I, môže sa pri špecifickej aktivite 2 mCi.mg'1 dávkovať napríklad podľa schémy 2 x 150 mCi, s odstupom 6 týždňov. Odborník v tejto oblasti môže pomocou známych spôsobov stanoviť maximálne možné dávkovanie (Maraveyas et al., 1995a, 1995b). Ak sa má podať celkové množstvo proteínu od 2 do 5 mg, môže sa podávať vo forme rýchlej intravenóznej injekcie. Pri väčších množstvách podávaného proteínu môže byť vhodnou formou podávania infúzia. Pri podávaní monoklonových protilátok môže byť nevyhnutné, aby sa účinná látka pred podávaním zmiešala s nadbytkom (napríklad desaťnásobným molovým nadbytkom) nerádioaktívnej protilátky; v tomto prípade sa podávanie uskutoční lepšie vo forme intravenóznej infúzie, napríklad počas 15 minút. Použitie sa môže opakovať. Terapia sa môže kombinovať s terapiou vonkajším ožarovaním. Terapia sa ďalej môže podporiť transplantáciou kostnej drene; táto je potom nevyhnutná najmä vtedy, ak sa pri terapii dosiahla v kostnej dreni dávka 1,6 Gy.
Molekuly protilátky podľa tohto vynálezu sa ďalej môžu použiť tiež ex vivo na čistenie CD34-pozitívnych základných aj priebežných bunkových preparátov (Immunopurging). Terapia ožarovaním a chemoterapia karcinómov dlaždicového epitelu sa môže podporiť autológnou transplantáciou kostnej drene. Pritom použité hematopoietické základné a priebežné bunkové preparáty musia byť bez nádorových buniek. Možno to dosiahnuť inkubáciou s molekulami protilátok z tohto vynálezu, napríklad inkubáciou s konjugátmi protilátka-toxín (Myklebust et al., 1994; DE P 196 48 209.7).
Molekuly protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu ďalej použiť vo forme rekombinantného konštruktu, do ktorého bol vložený bunkový T-receptor T-lymfocytov. Týmto spôsobom reprogramované T-lymfocyty sa selektívne viažu na nádorové bunky, exprimujúce antigén a vyvolávajú cytotoxický účinok; preto ich možno použiť v terapii karcinómov dlaždicového epitelu (PCT/EP 96 04 631; Altenschmidt et al., 1996).
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: Stanovenie epitopovej špecifickosti protilátky BIWA-1 väzbou na syntetický peptid, odvodený z CD44-v6 sekvencie človeka. Zodpovedajúci peptid CD44-v6 potkana bol skúšaný s protilátkou 1.1ASML. Väzba sa určovala pomocou ELISA (enzýmovou imunoadsorbentovou analýzou), pričom sa peptid imobilizoval na mikrotitračnej platni (porovnaj: Heider et al., 1996b, obr. 2; -: nijaká väzba; +/-: slabá väzba; +: silná väzba.
Obr. 2: Imunohistochemická analýza karcinómu dlaždicového epitelu hrtanu (a) a pečeňovej metastázy karcinómu pažeráka (b) s CD44-v6-špecifickou monoklonovou protilátkou BIWA-1. V obidvoch prípadoch možno vidieť reaktivitu protilátky s membránou nádorových buniek. Pôvodné zväčšenie bolo 40x, protivyfarbovanie hematoxylínom.
Obr. 3: Porovnanie väzby antigénu rôznych CD44-VÔšpecifických monoklonových protilátok. Väzba štyroch rôznych CD44-v6-špecifických mAb na ľudské SCC A431-bunky sa merala pomocou ELISA. Monoklonová protilátka BIWA-1 má vyššiu afinitu pre nádorové bunky ako ostatné monoklonové protilátky.
Obr. 4: Podrobnejšie epitopové mapovanie mAb BIWA-1. Kompetitívnym meraním spôsobom ELISA sa merala väzba protilátky BIWA-1 na rôzne prekrývajúce sa syntetické peptidy, ktorých aminokyseliny 18 až 32 CD44v6 kódovanej oblasti sú zmenené. Minimálna väzbová sekvencia (peptid v6(19-29) je podčiarknutá.
Obr. 5: Biodistríbúcia I251-B1WA- 1 v A-431 xenotransplantovaných mláďatách myší. Je znázornená akumulácia ako % ID.g'1 (stredná hodnota + štandardná odchýlka) po 4, 24, 48, 120 a 168 hodinách po injekcii.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Expresia CD44-v6 v karcinómoch dlaždicového epitelu
Tkanivo
Imunohistochemicky sa pomocou mAb BIWA-1 (kloň VFF-18) analyzovalo spolu 126 v parafíne zaliatych vzoriek nádorov na expresiu CD44-v6. Vzorky zahŕňali 31 prípadov primárnych karcinómov dlaždicového epitelu (15 prípadov z hrtanu, 16 prípadov kože), 91 prípadov metastáz lymfatických uzlín (hrtan, n = 38; pľúca, n = 27; pažerák, n = 11; ústna dutina, n = 11; tonzily, n = 4) a 4 prípady metastáz pečene.
Protilátka
Z ľudskej keratínocytovej-cDNA sa polymerázovoureťazcovou reakciou (PCR) z CD44v amplifikovala úplná variantná oblasť typu HPKII (Hofmann et al., 1991). Obidva PCR priméry 5 -CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-ď v polohe 25 až 52, a 5'-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-ď v polohe 1013 až 984 variantnej LCLC97 oblasti, ako opisuje Hofmann et al. obsahujú rozoznávacie miesto ScoRI, ktoré je nevyhnutné na to, aby sa klonoval PCR-produkt priamo do vektora pGEX-2T (Smith et al., 1988). Výsledný konštrukt (pGEX CD44v HPKII, v3-vl0) kóduje pre fúzovaný proteín o približne 70 kD, pozostávajúci z glutation-S-transferázy z Schistosoma japonicum a z exónov v3 až vlO humánnej CD44 (Obr. 1; Heider et al., 1993). Fúzovaný proteín bude exprimovaný v E. coli a následne afinitne čistený cez glutatiónovú agarózu (Smith et al., 1988).
Samičky myši Balb/c sa potom intraperitoneálne imunizovali s afinitne vyščisteným fúzovaným proteínom podľa schémy:
1. imunizácia: 50 pg fúzovaného proteínu v úplnom Freundovom adjuvans;
2. a 3. imunizácia: 50 pg fúzovaného proteínu v neúplnom Freundovom adjuvans.
Imunizácie sa vykonávali vždy s odstupom 4 týždňov. 14 dní po poslednej imunizácii sa zvieratá ešte tri po sebe nasledujúce dni imunizovali s 10 pg fúzovaného proteínu v PBS. Na nasledujúci deň sa bunky sleziny zvieraťa s vysokým titrom protilátky fúzovali s bunkami myelómu myši P3.X63-Ag8.653 pomocou polyetylénglykolu 4000. Hybridómové bunky sa potom vyselektovali na mikrotitračnej platni v prostredí HAT (Kohler et Milstein, 1975; Keamey et al., 1979).
Stanovenie titrov protilátok v sére, prípadne vytriedenie prestarnutých hybridómov sa vykonalo pomocou ELISA. Pri tejto skúške sa na mikrotitračných platniach najprv vytvoril povlak fúzovaného proteínu (GST-CD44v3-vlO), alebo povlak iba z glutatión-S-transferázy. Následne sa inkubovali v sérii zriedení vzorky séra, respektíve vzorky prestarnutých hybridómov a stanovovala sa špecifická protilátka proti myšaciemu imunoglobulínu pomocou peroxidázy, konjugovanej s protilátkou. Hybridómy, ktoré reagujú iba s glutatión-S-transferázou, sa zvrhli. Ostávajúca protilátka sa najprv charakterizovala pomocou ELISA s doméno-špecifickými fúzovanými proteínmi (exon v3, exon v5+v6, exon v6+v7, exon v8-v10) (Koopman et al., 1993). Jej imunohistochemická reaktivita sa skúšala na rezoch ľudskej kože.
BIWA-l (VFF-18; prípravu a vlastnosti pozri tiež v WO 95/33 771) sa viazala iba na fúzované proteíny, ktoré obsahovali domény, kódované exónom v6. Aby sa ďalej ohraničil epitóp protilátky, použili sa pri ELISA rôzne syntetické peptidy, predstavujúce časti vó-domény (obr. 1). Najsilnejšiu väzbu mal 14aminokyselinový peptid v6D. Preto epitóp protilátky BIWA-l leží čiastočne alebo celkom v sekvencii QWFGNRWHEGYROT domény, ktorá je kódovaná exónom v6. Táto sekvencia je homológna k väzbovému epitópu protilátky 1.1ASML, ktorá sa použila v terapeutickom modeli na potkanoch a ktorá je špecifická na CD44v6 potkana (obr. 1).
Imunohistochémia
Pred inkubáciou s primárnou protilátkou sa parafínové rezy (4 μηι) odparafinovali v Rotihistole (Roth, BRD) trikrát vždy po 10 minút a potom v stúpajúcom alkoholovom rade rehydrovali. Potom sa rezy krátko opláchli destilovanou vodou a potom sa trikrát povarili v prostredí 0,01 M tlmivého roztoku Na-citranu, vždy počas dobu 10 minút, v mikrovlnnej rúre (Sharp, Model R-6270) pri 600 W. Po každej mikrovlnnej inkubácii sa rezy nechali 20 minút vychladnúť. Po poslednom povarení sa nosič opláchol v PBS v predinkuboval v normálnom kozom sére (10 %-né v PBS). Po troch premytiach v PBS sa rezy inkubovali s primárnou protilátkou (BIWA-l: 5 pg.mľ'; myšací IgG (izotyp zodpovedajúci negatívnej kontrole) 5 pg.mľ1; v PBS/1 % BSA) počas 1 hodiny. Ako pozitívna kontrola sa pri farebnej reakcii použili normálne ľudské kožné rezy, keďže keratínocyty exprimujú izoformu CD44, obsahujúcu v3vlO. Endogénne peroxidázy sa blokovali 0,3 %-ným roztokom H2O2 v PBS a rezy sa inkubovali s biotinylovanou sekundárnou protilátkou (proti-myšací IgG-F(ab )2, DÁKO Corp.) počas 30 minút. Na vyfarbenie sa rezy inkubovali 30 minút s chrenovou peroxidázou, ktorá bola viazaná na biotín ako streptavidínový-biotínový-peroxidázový komplex.
Rezy sa potom inkubovali v 3,3-amino-9-etylkarbazolovom substráte (Sigma Immunochemicals) počas 5 až 10 minút, reakcia sa zastavila H2O a rezy sa proti vyfarbili hematoxylínom. Vyhodnotenie sfarbenia sa vykonalo sveteľným mikroskopom (Axioskop, Zeiss) a sfarbenie sa vyjadrilo nasledovne: +++, silná expresia; ++, mierna expresia; +, slabá expresia; -, nejednoznačná alebo žiadna detegovateľná expresia. Ako pozitívne sa vyhodnotili iba nádorové bunky s jasným sfarbením membrány. Percentuálny podiel pozitívnych nádorových buniek v každom reze sa určil hrubým odhadom tak, že sa bunky rozdelili do dvoch skupín: fokálne pozitívne nádory (menej ako 10 % nádorových buniek zreagovalo s protilátkou) a pozitívne nádory (10 alebo viac % pozitívnych nádorových buniek). Ak reagovalo s protilátkou menej ako 80 % nádorových buniek z pozitívnych buniek, potom sa vyjadruje zodpovedajúci podiel v percentách.
Pomocou CD44-v6-špecifickej monoklonovej protilátky BIWA-l sa analyzovalo 126 prípadov karcinómov dlaždicového epitelu rôzneho pôvodu. Vo všetkých okrem jednej vzorky nádoru, pozorovali sa izoformy s expresiou CD44-v6. Veľká časť vzoriek vykázala expresiu antigénu v 80 až 100 % nádorových bunkách, vyfarbenie bolo obmedzené na membránu nádorových buniek. V tkanivách stromy, lymfocytov, svalových buniek a endotelu sa nepozorovala žiadna reakcia.
Na kvantifikáciu expresie CD44-v6 molekúl uvedených nádorových buniek sa paralelne s nádorovými rezmi vyfarbovali rezy normálnej ľudskej kože. Normálne kožné keratínocyty exprimujú vysokú hladinu izoforiem CD44 a počítajú sa k nim CD44-v6, najviac exprimujúce normálne bunky, aké boli doteraz opísané. Z toho dôvodu sa keratínocytové vyfarbenie považuje za porovnávacie a v tomto vyhodnocovacom systéme sa označuje ako “silné” (+++)· Vo väčšine skúmaných vzoriek nádorov bolo sfarbenie nádorových buniek porovnateľné alebo aj silnejšie ako sfarbenie kožných keratínocytov; iba v málo prípadoch bolo sfarbenie nádorov slabé (3 prípady metastázovaných lymfatických uzlín), alebo stredné (2 primárne karcinómy, 10 metastáz). Farebná reakcia bola v rezoch daných nádorov veľmi homogénna, pričom väčšina nádorových buniek rezov mala rovnakú intenzitu sfarbenia. Medzi primárnymi nádormi a metastázami neboli v expresii CD44-v6 pozorované nijaké významné rozdiely. Podrobné zhrnutie výsledkov je v tabuľke 1, príklady sú znázornené na obr. 2.
Tabuľka 1 Expresia CD44-v6 v karcinómoch dlaždicového epitelu
Vzorka Typ nádoru BIWA-l reaktivita
46937 86 primárny hrtan -E-H-’
4687 90 primárny hrtan 4-++
8372 90 primárny hrtan -E++
17427 90 primárny hrtan -H-+
27298 90 primárny hrtan +++
46908 90 primárny hrtan +++
51334 90 primárny hrtan +-E+
51402 91 primárny hrtan +Ί-+
60414 91 primárny hrtan +++
61733 91 primárny hrtan
12280 92 primárny hrtan
23140 92 primárny hrtan +++
31792 92 primárny hrtan +++
322 92 primárny hrtan
Vzorka Typ nádoru BIWA-l reaktivita
10209 95 primárny hrtan +++
2366 86 primárny koža +++
2574 86 primárny koža +++
9916 86 primárny koža ++/+++
2696 87 primárny koža +++
8906 87 primárny koža +++
8191 88 primárny koža +++
8354 88 primárny koža ++ 50 %
11963 88 primárny koža ++
5590 90 primárny koža ++/+++
530 92 primárny koža +++
2583 94 primárny koža +++
11337 94 primárny koža +++
10901 95 primárny koža +-+
11557 95 primárny koža +++
11744 95 primárny koža +++
11917 95 primárny koža +++
4688 90 I metastáza lymfatických uzlín hrtan ++/+++
4688 90 II metastáza lymfatických uzlín hrtan
8374 90 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
17428 90 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
27300 90 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
36942 90 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
46909 90 metastáza lymfatických uzlín hrtan ++
51336 90 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
41108 91 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
51398 91 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
60416 91 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
61734 91 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
1318 92 1 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
1318 92 II metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
1318 92 III metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
1318 92 IV metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
2963 92 I metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
2863 92 II metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
5745 92 I metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
5745 92 II metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
8969 92 I metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
8969 92 II metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
8969 92 III metastáza lymfatických uzlín hrtan ++-
8969 92 IV metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
8969 92 2/1 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
8969 92 2/ΙΙ metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
8969 92 2/II1 metastáza lymfatických uzlín hrtan 4-4-
8969 92 2/1V metastáza lymfatických uzlín hrtan +/++
9366 92 metastáza lymfatických uzlín hrtan 4-++
9509 92 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
9566 92 metastáza lymfatických uzlín hrtan +4-4-
12283 92 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
14046 92 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
31787 92 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
49228 92 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++ 50 %
29228 93 metastáza lymfatických uzlín hrtan +++
29829 93 metastáza lymfatických uzlín hrtan ++
298 95 metastáza lymfatických uzlín hrtan ++/-H-+
15293 91 metastáza lymfatických uzlín pľúca + 25 %
1667 92 metastáza lymfatických uzlín pľúca + 20 %
Vzorka Typ nádoru BIWA-l reaktivita
2757 92 1 metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
2757 92 11 metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
2757 92 111 metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
2757 92 IV metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
4790 92 metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
6168 92 I metastáza lymfatických uzlín pľúca ++ 50 %
6168 92 11 metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
6168 92 III metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
6168 92 IV metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
7206 92 metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
7531 92 I metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
7531 92 II metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
7531 92 III metastáza lymfatických uzlín pľúca ++/+++
7531 92 IV metastáza lymfatických uzlín pľúca +Ή-
10324 92 metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
10519 92 II metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
10519 92 RMII metastáza lymfatických uzlín pľúca
10958 92 metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
11425 92 I metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
11425 92 II metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
13055 92 metastáza lymfatických uzlín pľúca ++/+++
13055 92 II metastáza lymfatických uzlín pľúca fokálne, +++
13055 92 III metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
15663 92 metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
16713 92 metastáza lymfatických uzlín pľúca +++
14980 91 I metastáza lymfatických uzlín pažerák +++
14980 91 II metastáza lymfatických uzlín pažerák +++
16641 91 I metastáza lymfatických uzlín pažerák +++
16641 91 II metastáza lymfatických uzlín pažerák +++
16641 91 III metastáza lymfatických uzlín pažerák +++
1059 92 metastáza lymfatických uzlín pažerák +
1710 92 1 metastáza lymfatických uzlín pažerák +4-4-
1710 92 II metastáza lymfatických uzlín pažerák +++
1710 92 III metastáza lymfatických uzlín pazerák +++
11502 92 I metastáza lymfatických uzlín pažerák +++
11502 92 11 metastáza lymfatických uzlín pažerák ++
202 92 metastáza lymfatických uzlín ústna dutina ++ 60 %
6030 92 metastáza lymfatických uzlín ústna dutina +/++/+++ 25%
7335 92 I metastáza lymfatických uzlín ústna dutina +++
7335 92 II metastáza lymfatických uzlín ústna dutina +++
15324 92 II metastáza lymfatických uzlín ústna dutina +++ 70 %
16164 92 I metastáza lymfatických uzlín ústna dutina +++
16164 92 II metastáza lymfatických uzlín ústna dutina +++ 50 %
16412 92 metastáza lymfatických uzlín ústna dutina ++/+++
16836 92 I metastáza lymfatických uzlín ústna dutina +++
16836 92 11 metastáza lymfatických uzlín ústna dutina +++
16836 92 III metastáza lymfatických uzlín ústna dutina +++
Tabuľka 2 Expresia CD44-v6 v adenokarcinóme prostaty, karcinóme obličiek a v pečeňových metastázach kolorektálneho karcinómu
Vzorka Typ nádoru BIWA-1 reaktivita
6228 92 I metastáza lymfatických uzlín man- dle +++
6228 92 11 metastáza lymfatických uzlín man- dle +++
6618 92 metastáza lymfatických uzlín man- dle +++
11840 92 metastáza lymfatických uzlín mandle ++
14172 91 4 metastáza pečene pažerák +++
14172 91 5 metastáza pečene pažerák +4--I-
4131 94 1 metastáza pečene pažerák +/++
8438 94 metastáza pečene pažerák ohniska, ++/-H-+
*80 až 100 % nádorových buniek zreagovaných pozitívne s BIWA-1. V prípadoch, keď zreagovalo s protilátkou menej nádorových buniek, uvádza sa zodpovedajúce percento.
Príklad 2
Expresia CD44-v6 v bunkách karcinómu obličiek, karcinómu prostaty a pečeňových metastáz karcinómu hrubého čreva
Tkanivo
Analyzovalo sa i 9 prípadov buniek karcinómu obličiek (12 prípadov čisto bunkové, 5 prípadov chromofilné, 1 prípad chromofóbne, 1 onkocytový), 16 primárnych adenokarcinómov prostaty a 19 prípadov metastáz lymfatických uzlín od karcinómu prostaty, ako aj 30 prípadov pečeňových metastáz karcinómu hrubého čreva.
Protilátka
BIWA-1 (pozri príklad 1)
Imunohistochémia
Uskutočnenie rovnako ako v príklade 1.
Na rozdiel od karcinómov dlaždicového epitelu sa vo väčšine analyzovaných prípadov buniek karcinómu obličiek a karcinómu prostaty nezaznamenala nijaká alebo iba fokálna expresia izoforiem CD44-v6. V prípade karcinómu prostaty, keď bola expresia pri porovnaní s vyfarbením normálneho epitelu prostaty rozsiahlejšia ako fokálna, bolo sfarbenie prevážne difúzne cytoplazmatické a slabé, prípadne heterogénne. V 50 %-ách hodnotených metastáz pečene karcinómu hrubého čreva sa zistila viac ako fokálna expresia izoforiem CD44-v6. Vo väčšine prípadov bolo sfarbenie slabé až stredné, pričom sfarbenie s BIWA1 najčastejšie malo menej ako 100 % nádorových buniek vzorky. Súhrn výsledkov je uvedený v tabuľke 2.
Typ nádoru n BIWA-1 reaktivita
negatívna fokálne pozitívna pozitívna
Adenokarcinóm prostaty primárny 16 8 3 5
Adenokarcinóm prostaty metastázy lymfatických uzlín 19 15 2 2
Bunky karcinómu obličiek primárny 19 17 0 2
Kolorektálny karcinóm metastázy pečene 30 7 8 15
Príklad 3
Charakterizovanie CD44-V6 špecifických protilátok
Bunková línia
Z americkej zbierky (Američan Type Culture Collection, Rockwell MD, USA) sa prevzala ľudská bunková SCC-línia A431 (spontánny epidermoidný karcinóm vulvy) a pestovala sa podľa návodu výrobcu. Povrchová expresia izoforiem, obsahujúcich CD44-vó bola stanovovaná pomocou FACS-analýzy, pričom sa použil FITC-linker mAb BIWA-1.
Analýza kinetických konštánt
Stanovenie afinity a kinetiky vzájomného pôsobenia monoklonovej protilátky a CD44-v6 sa vykonalo pomocou povrchovej plazmonovej rezonancie (Surface Plasmon Resonance, SPR), pričom sa použil systém BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor). Na senzorový čip CM5 sa imobilizoval glutatión-S-transferáza-CD44-fúzovaný proteín, ktorý obsahuje oblasť kódovanú exónmi v3 až vlO (GST/CD44 v3-vl0), pričom sa použil postup amínového spojenia podľa návodu výrobcu. Protilátka sa v rôznych koncentráciách (8 až 132 nM) v HBS (10 mM Hepes pH 7,4, 150 mM chloridu sodného, 3,4 mM EDTA, 0,05 % BIAcore tenzid P 20) injektovala rýchlosťou 5 pl.min'1 na antigén-špecifický povrch. Vzájomné pôsobenie sa vyjadrilo ako zmena SPR-signálu. Disociácia protilátky sa pozorovala v toku tlmivého roztoku (HBS). Povrch čipu sa regeneroval samostatným pulzom 15 μΐ 30 mM roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Analýza získaných údajov a výpočet kinetických konštánt sa vykonal pomocou programového vybavenia BIA Evaluation Software (verzia 2.1, Pharmacia Biosensor).
Uvedeným spôsobom sa porovnala antigénová afinita protilátky BIWA-1 s ďalšími CD44-v6-špecifickými monoklonovými protilátkami (VFF4, VFF7, BBA-13 (IgGl, R&D Systems, Abingdon, UK). Kinetické a afinitné konštanty rôznych protilátok sa stanovili vždy v dvoch nezávislých pokusoch. V tabuľke 3 sa uvádzajú hodnoty stupňa asociácie (ka), stupňa disociácie (kd) a disociačné konštanty (Kd) pre 3 mAb. Všetky mAb vykázali blízke ka a kd s výnimkou BBA-13, ktorá mala trikrát nižšií ka a VFF7, ktorá mala významne vyšší disociačný stupeň (5-násobok) v porovnaní s hodnotami ostatných mAb. Z toho vyplýva nižšia väzbová aktivita pre VFF7 a BBA-13 v porovnaní s VFF4 a BIWA-1. BIWA-1 mala najnižšie Kd zo všetkých sledovaných protilátok.
Tabuľka 3: Kinetické a afinitné konštanty rôznych CD44v6-špecifických mono-klonových protilátok (mAb)
Protilátka MM4.s4 M s'1 Ko/M
VFF4 1,1 . 10’ 2,2 . 105 2,4. 104
VFF7 1,1 . 105 1,2 . 10’4 1,1 . W’
BIWA-1 1,3 . 105 2,2 . 10’5 1,7. 10'10
BBA-13 3,7 . 104 2,3 . 10’5 6,2 . 10’10
Analýza vzájomného účinku protilátky a proteínu pomocou enzýmovej imunoadsorbentovej analýzy (ELISA)
Bunky A-431, exprimujúce CD44-v6 sa kultivovali v 96 jamkovej platni (Falcon Microtest III, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ, USA) pri počte 5.104 na každú jamku, v prostredí RPMI 1640 s 10 % fetálneho teľacieho séra, cez noc pri teplote 37 °C. Po premytí s PBS/0,05%-ným roztokom Twccnu 20 sa bunky 1 minútu fixovali etanolom, vychladeným ľadom a potom sa preparáty opláchli. Nasledovala inkubácia s primárnymi protilátkami (VFF4, VFF7, BIWA-1, BBA-13, 1 ng.mľ1 až 600 ng.mľ1, vždy v skúšobnom tlmivom roztoku: PBS /0,5 % BSA/ 0,05 % Tween 20) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Po inkubácii nasledoval trojnásobný oplach. Ako sekundárna protilátka sa použila králičia-protimyšacia-IgG-chrenová peroxidázová konjugovaná protilátka (DÁKO Corporation, Kopenhagen, Dánsko; zriedenie 1:6 000 v skúšobnom tlmivom roztoku) (1 hodina pri teplote miestnosti). Po trojnásobnom oplachu sa vyvolalo sfarbenie s TMB-roztokom (Kirkegaard+Perry, Gaithersburg, USA). Absorbancia sa merala pomocou zariadenia ELISA-Reader (Hewlett-Packard).
Obr. 3 ukazuje, že pomerné afinity protilátky tak, ako boli stanovené analýzou BIAcore, reflektujú vzájomný účinok s nádorovými bunkami, pričom BIWA-1 celkom jasne má najvyššiu väzbovú afinitu.
Proteínová doména, ktorá je kódovaná CD44-exónom v6 pozostáva z 45 aminokyselín (obr. 4). Na presnejšie určenie epitopu, ktorý je u BIWA-1 známy, sa pri analýze ELISA použila séria syntetických peptidov. Predbežné pokusy poskytovali väzbu na centrálne umiestnený 14-mér (aminokyselinové zvyšky 18 až 31; obr. 4; porovnaj tiež s obr. 1), ale nie na peptidy mimo tejto oblasti. Preto sa syntetizovala druhá séria peptidov a peptidy sa skúšali kompetitívnou enzýmovou imunoadsorbentovou analýzou ELISA (obr. 4). Výsledky ukazujú, že najmenšiu štruktúru, ktorá je potrebná na vysokoafinitnú väzbu predstavuje peptid 19 až 29 (WFGNRWHEGYR). Eliminácia C-koncového arginínového zvyšku spôsobila viac ako 100- násobne slabšiu väzbu.
Príklad 4
Biodistribúcia rádiojódovanej CD44-v6-protilátky v mlád’atách myší s xenotransplantátmi
A-431 -Xenotransplantátový model
Osem týždňov staré samičky BALB/c nu/nu myší (B & K Universal, Renton, WA, USA) boli subkutánne injketované v ľavobočnej strednej línii kultivovanými 5.106 bunkami A-431 (humánneho epidermoidného karcinómu vulvy). Xenotransplantované zvieratá s A-431 nádormi sa v priebehu 2 týždňov použili na biodistrubučné pokusy (hmotnosť nádorov: 40 - 50 mg).
Rádiojódovanie protilátky BIWA-1
Proteín G-čistenej monoklonovej protilátky BIWA-1 (IgGl myši) sa viazal so streptavidínom, pričom sa použil heterobifunkčný sieťujúci linker sukcinimidyl 4-(Nmaleinimido-metyl)cyklohexan-1 -karboxylát. Streptavidínlysylový zvyšok sa viazal na redukovaný protilátkacysteínylový zvyšok, ktorý sa pripravil vopred spracovaním protilátky s ditiotreitolom. Získaný 1 : 1 konjugát (> 90 %) sa ďalej čistil ionexovou chromatografiou. Na biodistribučné analýzy sa BIWA-l/SA značkoval cez primárny amín lyzínu. Na značenie sa použilo p-jódfenylové značkovacie činidlo (PIP; NEN Dupont, Wilmington, DE, USA) a použil sa spôsob, opísaný Willburom et al. (1989). Značenie protilátky BIWA-1 s SA avi s 125I nezmenilo jej imunoreaktivitu alebo farmakokinetiku protilátky v myšiach.
Biodistribučné pokusy
Mladé myši, ktoré boli xenotransplantované ľudskými nádormi A-431, sa injektovali s 5 až 7 pCi l25I na 50 pg monoklonovej protilátky BIWA-1 (špecifická aktivita 0,1 až 0,14 mCi.mg·') intravenózne do laterálnej žily chvosta. Štúdium časovej závislosti biodistribúcie sa vykonalo v čase 4, 24,48, 120 a 168 hodín po injekcii na skupinách troch zvierat (n = 3 ). Vo zvolenom čase sa myši odvážili, vykrvácali cez retro-orbitálny plexus a dislokáciou krku utratili. Odobralo sa deväť orgánov a tkanív, ktoré sa odvážili: krv, chvost, pľúca, pečeň, slezina, žalúdok, obličky, črevo a nádor. Merala sa rádioaktivita tkanív od injektovaného preparátu protilátky a porovnávala sa so štandardom. Meranie sa vykonávali gama-scintilátorom(Packard Inštrument Company, Meriden, CT, USA), pričom energiové okno sa nastavilo pre l25I na 25 až 80 keV. Vypočítali sa percentá z injektovanej dávky na g tkaniva (% ID.g1).
Predbežné pokusy ukázali, že BIWA-1 nereaguje krížovo s CD44-v6-antigénom myši. Tabuľka 4 a obr. 5 ukazujú záznam rádioaktivity v nádoroch a v normálnom tkanive. Jódovaná BIWA-1 ukazuje na rýchly príjem nádorom (7,6 % injektovanej dávky po 4 hodinách od injekcie), ktorý stúpne na viac ako 18 % ID.g’1 po 48 hodinách a potom do 120 hodín ostáva stály. Sedem dní po injekcii (168 hodín) nádor obsahoval ešte 15,3 % ID.g'1 tkaniva. Pre jednotlivé doby sa vypočítali pomery nádoru ku tkanivu, ktoré sú uvedené v tabuľke 4. Po 24 hodinách po injekcii bol pomer nádor: krv 0,48 a vzrástol na 3,16 v siedmom dni. Príjem v normálnom tkanive bol nízky a najpravdepodobnejšie bol spôsobený krvným pozadím v tkanivových biopreparátoch. Selektívne in vivo cielenie l25I-značenej BIWA-1 do humánnych SCCxenotransplantátov u myší ukazuje, že táto monoklonová protilátka má vysoký potenciál ako cielený nosič na diagnostické a terapeutické použitia u SCC-pacientov.
Tabuľka 4: Pomery 12SI - BIWA-1 v nádore : tkanive u myší s nádorom (A-431) v rôznych časoch po injekcii
Pomer nádoru k 4 hodiny 24 hodín 48 hodín 120 hodín 168 hodín
krvi 0,22’ 0,48 1,31 2,60 3,16
chvostu 1,18 2,62 7,70 12,28 13,06
pľúcam 0,40 1,03 2,65 7,04 4,82
pečeni 0,94 1,18 2,28 3,57 3,24
slezine 1,40 1,84 4,00 4,86 4,42
žalúdku 3,89 7,37 19,40 25,56 33,96
obličkám 0,82 1,31 2,72 2,79 2,53
črevu 3,54 6,24 11,94 19,24 27,78
“stredná hodnota (n = 3); štandardné odchýlky boli < 7 %.
Príklad 5
Rozdielne expresie protilátky CD44-v6 u veľkého počtu ľudských nádorov
V ďalšom vyšetrovaní bolo imunohistochemicky hodnotených spolu 544 vzoriek nádorov na expresiu CD44-v6 s použitím monoklonovej protilátky BIWA-1 (kloň VFF18). Vzorky sa najprv odparafinovali alebo sa ihneď po chirurgickom odobratí zmrazili v kvapalnom dusíku a do ich použitia sa uchovávali pri -70 °C. Analyzovali sa nasledovné nádory: Basalyóm (n = 16), prsný adenokarcinóm (AC) (n = 55), AC čreva (n = 83), karcinóm dlaždicového epitelu (SCC) hlavy a krku ( n = 125), pľúcny karcinóm (n = 120), AC prostaty (n = 34), karcinóm obličkových buniek (n = 27), SCC kože (n = 12) a AC žalúdka (n = 69). Tkanivá sa získali rutinným chirurgickým spôsobom alebo biopsiou, normálne tkanivo bolo dodané spoločne so vzorkou nádoru. Imunohistochemické vyšetrenie sa vykonalo rovnakým spôsobom, aký sa uvádza v príklade 1.
Tabuľka 5 obsahuje prehľad imunohistochemíckých analýz 397 vzoriek rôznych nádorov s použitím monoklonovej protilátky BIWA-1.
AC: adenokarcinóm; RCC: karcinóm buniek obličiek; SCLC: malobunková rakovina pľúc; SCC: karcinóm dlaždicového epitelu.
Pri malobunkových karcinómoch pľúc, karcinómoch buniek obličiek a AC prostaty sa nepozorovala nijaká alebo len obmedzená reaktivita. Všetky ostatné vyšetrované nádorové typy exprimujú izoformy obsahujúce CD44-V6 v rôznej miere. Väčšina vyšetrovaných prsných AC mala reaktivitu s BIWA-1 a hodnotené SCC (hrtan, pľúca a pažerák) exprimujú CD44-v6 v 100 %-tách všetkých prípadov.
Na reaktivitu s protilátkou BIWA-1 sa vyšetrilo spolu 185 prípadov SCC rôzneho typu a klasifikácie. Z toho bolo 67 prípadov primárneho SCC (hrtan, n = 15: ústna dutina, n = 16; ústny hltan, n = 3; koža, n= 15), 77 vzoriek boli metastázy lymfatických uzlín (hrtan, n = 12; pľúca, n = 27; pažerák n = 11; ústna dutina, n = 6; ústny hltan, n = 7; podhltana, n= 10; nosných mandlí, n = 4) a 3 vzorky metastáz v pečeni (z nádoru pažeráka). Prehľad imunohistochemických analýz všetkých vyšetrovaných SCC-vzoriek sa uvádza v tabuľke 6.
Tabuľka 6
Expresia CD44-v6 v karcinómoch dlaždicového epitelu
Tabuľka 5
Expresia CD44-v6 v ľudských nádoroch
Typ Počet spolu n Pozitívne ♦príklady n Pozitívne príklady %
Basalyóm primárny nádor 16 10 62
Prsný AC primárny nádor 17 15 88
Prsný AC metastázy lymfatických uzlín 34 31 91
Prsný AC metastázy pečene 4 4 100
AC čreva metastázy lymfatických uzlín 51 21 41
AC čreva metastázy pečene 26 13 50
AC čreva metastázy v mozku 6 6 100
SCC hrtanu metastázy lymfatických uzlin 18 18 100
Pľúcny AC primárny nádor 35 15 43
Pľúcny SCC primárny nádor 9 9 100
SCC pažeráka primárny nádor 20 20 100
AC prostaty primárny nádor 16 5 31
AC prostaty metastázy lymfatických uzlin 18 0 0
RCC primárny nádor 27 5 18
SCLC primárny nádor 31 7 23
AC žalúdka primárny nádor 22 15 68
AC žalúdka metastázy lymfatických uzlin 43 16 37
AC žalúdka metastázy v obličkách 4 4 100
Spolu n 397
*: 10 % alebo viac pozitívnych nádorových buniek
Typ Spolu n Negatívne Fokálne pozitívne pozitívne
n % n % n %
Podhltan LN M 10 0 0 0 0 10 100
Ústny hltan PT 3 0 0 0 0 3 100
LN M 7 0 0 0 0 7 100
Hrtan PT 15 0 0 0 0 15 100
LN M 30 1 3 0 0 29 97
Pľúca PT 18 2 11 0 0 16 89
LN M 27 0 0 1 4 26 96
Pažerák PT 20 0 0 1 5 19 95
LN M 11 0 0 0 0 11 100
Ústna dutina PT 16 0 0 0 0 16 100
LM 6 0 0 0 0 6 100
Koža PT 15 0 0 0 0 15 100
Mandle LN M 4 0 0 0 0 4 100
Spolu n 185
( Pozn.: fekálne pozitívne: < 10 % nádorových vzoriek pozitívnych; LNM: metastázy lymfatických uzlín; PT: primárny nádor; LM: metastázy pečene.)
Expresia izoforiem obsahujúcich CD44-v6 bola nájdená vo všetkých prípadoch okrem troch (jeden prípad hrtana, 2 prípady pľúc). Väčšina vzoriek mala expresiu antigénu v 80 až 100 % nádorových bunkách v celom reze, pričom sfarbenie bolo skoncentrované najmä na membrány nádorových buniek. Najsilnejší homogénne vyfarbený vzor sa našiel v nádore hrtana, pažeráka a podhltana, pričom väčšina nádorových buniek rezov mala rovnakú intenzitu sfarbenia.
Literatúra
Altenschmidt U, Kahl R, Moritz D, Schnierle BS, Gerstmayer B, Wels W, Groner B. Cytoplysis of tumor cells expressing the neu/erbB-2, erbB-3, and erbB-4 receptors by genetically targeted naive T lymphocytes. Clinical Cancer Res. 2: 1001-1008(1996).
Barbas C F, Bjorling E, Chiodi F, Dunlop N, Cababa D, Jones T M, Zebedee S L, Persson MAA, Nara P L, Norrby E, Burton D R. Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency vírus in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 9339-9343 (1992).
Baum RP, Noujaim AA, Nanci A, Mocbus V, Hertel A, Niesen A, Donnerstag B, Sykes T, Boniface G, Hor G. Clinical course of ovarian cancer patients under repeated stimulation of HAMA using MAb 0025 and B43.13. Hybridoma 12(5): 583-589 (1993).
Becker JC, Varki N, Gillies SD, Furukawa K, Reisfeld RA. An antibody-interleukin 2 fusion proteín overcomes tumor heterogeneity by induction of a cellular immune response. Proc. natl. Acad. Sci. USA 93: 7826-7831 (1996).
Breitz H B, Weiden P L, Vanderheyden J-L, Appelbaum J W, Bjom M J, Fer M F, Wolf S B, RatcliffB A, Seiler C A, Foisie D C, Fisher D R, SchroffR W, Fritzberg A R, Abrams P G. Clinical experience with rhenium-186labeled monoclonal antibodies for radioim-munotherapy: results of phase I trials. J. Nucl. Med. 33: 1099-1112 (1992).
Featherstone C. Bispecific antibodies: the new mágie bullets. Lancet 348. 536(1996).
Friedmann P N, Mc Andrew S J, Gawlak S L, Chace D, Trail P A, Brown J P, Siegall C B. BR96 sFv-PE40, a potení single-chain immunotoxin that selectively kills carcinoma cells. Cancer Res. 53: 334-339 (1993).
Gerretsen M, Visser GWM, Brakenhoff RH, van Walsum M, Snow GB, van Dongen GAMS. Complete ablation of small squamous celí carcinoma xenografts with l86Relabeled monoclonal antibody E48. Celí Biophysics 24/25: 135-141 (1994).
Goodwin D A. A new appoach to the problém of targeting specific monoclonal antibodies to human tumors using antihapten chimeric antibodies. J. Nucl. Med. Biol. 16: 645 (1989).
Goodwin DA. Tumor pretargeting: almost the bottom line. J. Nucl. Med. 36(5): 876-879 (1995).
Gunthert, U., Hofmann, M., Rudy, W., Reber, S., Zoller, M., HauBmann, I., Matzku, S., Wenzel, A., Ponta, H., and Herrlich, P. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. C.e.11 65: 13-24 (1991).
Guesdon, J. I., Temynck, T., Avrameas, S. J. Histochem.
Cytochem. 27: 1131 (1979).
Catty, D., Murphy, G. Immunoassays using radiolabels. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 77-96.
Chatal J-F, Saccavini J-C, Gestin J-F, Thedrez P, Curtet C, Kremer M, Guerreau D, Nolibe D, Fumoleau P, Guillard Y. Biodistribution of indium-Ill-labeled OC 125 monoclonal antibody intraperitoneally injected into patients operated on for ovarian carcinomas. Cancer Res. 49:30873094(1989).
Chaudhary V K, Batra J K, Galdo M G, Willingham M C, Fitzgerald D J, Pastan I. A rapid method of cloning functional variable-region antibody genes in Escherichia coli as single-chain immunotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 1066 (1990).
Colcher D, Esteban J, Carrasquillo J A, Sugarbaker P, Reynolds J C, Bryant G, Larson S M, Schlom J. Complementation of intracavitary and intravenous administration of a monoclonal antibody (B72.3) in patients with carcinoma. Cancer Res. 47: 4218-4224 (1987).
Coloma M J, Hastings A, Wims L A, Morrison S L. Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction. J Immunol. Methods 152: 89-104 (1992).
Giissow D, Seemann G. Humanization of monoclonal antibodies. Methods Enzymol. 203: 99-121(1991):
Heider, K.-H., Hofmann, M., Horst, E., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., and Pals, S.T.A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. J Celí Biol. 120: 227-233 (1993).
Heider, K..-H., Mulder, J.-W. R., Ostermann, E., Susani, S., Patzelt, E., Pals, S.T., Adolf, G.R. Splice variants of the cells surface glycoprotein CD44 associated with metastatic tumor cells are expressed in normál tissues of humans and cynomolgus monkeys. Eur. J. Cancer 31 A :2385-2391 (1995).
Heider K H, Ratschek M, Zatloukal K, Adolf G R. Expression of CD44 isoforms in human renal celí carcinomas. VirchowsArch. 428: 267-273 (1996a).
Heider K.H, Sproll M, Susani S, Patzelt E, Beaumier P, Ostermann E, Ahom H, Adolf GR. Characterization of a high-affinity monoclonal antibody specific for CD44v6 as candidate for immunotherapy of squamous celí carcinomas. Cancer Immunol. Immunother.: in press. 1996.
Hemming AW, Davis NL, Finley RJ. Photodynamic therapy of squamous celí carcinoma: an evaluation of an anti-EGFR monoclonal antibody-prophyrin conjugate. Society of Surgical Oncology, 46th Annual Cancer Symposium. March 18-21,1993, Los Angeles, CA, p. 67
Kreitman R J Hanscn H J, Jones A L, FitzGerald D J P, Goldenberg D M, Pastan I. Pseudomonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibody LL2 or LL2-Fab’ induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice. Cancer Res. 53: 819-825 (1993).
Hofmann, M., Rudy, W., Zoller, M., Tôlg, C, Ponta, H., Herrlich P., and Gunthert, U. CD44 splice variants confer metastatic behavior in rats: homologous scquences are expressed in human tumor celí lines. Cancer Res. 51: 52925297(1991).
Johnson, G. D. Immunofluorescence. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Pol. II. ÍRL Press Oxford (1989), 179-200, s. S. 180-189.
Johnson S, Bird R E. Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coh. Methods Enzymol 203: 88-98 (1991).
Jurcic JG, Scheinberg DA. Recent Developments in the radioimmunotherapy of cancer. Current Opinion in Immunology 6: 715-721 (1994).
Juweid M, Sharkey R M, Markowitz A, Behr T, Swayne L C, Dunn R, Hansen H J, Shevitz J, Leung S-O, Rubín A D, Hcrskovic T, Hanley D, Goldenberg D M. Treatment of Non-Hodgkins’s lymphoma with radiolabeled murine, chimeric, or humanized LL2, an anti-CD22 monoclonal antibody. Cancer Res. (Siippl.) 55: 5899s-5907s (1995).
Keamey, J.F., Radbruch A., Liesegang B., Rajewski K. A new mouse myeloma celí line that has lost imunoglobulin expression but permits construction of antibody-secreting hybrid celí lines. J. Immunol. 123: 1548 (1979).
Keenan A M, Weinstein J N, Carrasquillo J A, Bunn P A, Reynolds J C, Foon K A et al. Immunolymphoscintigraphy and the dose dependence of “'in-labeled.TÍOl monoclonal antibody in patients with cutaneous T-cell lymphoma. Cancer Res. 47: 6093-6099 (1987).
Khazaeli MB, Conry RM, LoBuglio AF. Human immune response to monoclonal antibodies. J. Immunother. 15: 4252(1994).
Kohler, G., Milstein, C. Continous culture of fused cells secreting antibody of predeftned specifity. Náture 265: 495 (1975)
Koopman, G., Heider, K.-H., Horts, E., Adolf, G. R., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., Pals, S. T. Activated human lymphocytes and aggressive Non-Hodgkin's lymphomas express a homologue of the rat metastasisassociated variant of CD44. J. Exp. Med. 177: 897-904 (1993).
Larson S M, Cheung N-K V, Leibel S A. Radioisotope Conjugates. In: DeVita V T, Hell-man S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biológie therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 496-511 (1991).
Lenhard R E, Order S E, Spunberg J J, Asbell S 0, Leibel S A. Isotopic immunoglobulin. A new systemic therapy for advanced Hodgkin’s Disease. J. Clin. Oncol. 3: 12961300 (1985).
Maraveyas A, Myers M, Stafford N, Rowlinson-Busza G, Stewart J S W, Epenetos A A. Radiolabeled antibody combined with extemal radiotherapy for the treatment of head and neck cancer: Reconstruction of a theoretical phantom of the larynx for radiation dose calculation to local tissues. Cancer Res. 55: 1020-1027 (1995a).
Maraveyas A, Stafford N, Rowlinson-Busza G, Stewart J S W, Epenetos A A. Pharmacokinetics, biodistribution, and dosimetry of speciftc and control radiolabeled monoclonal antibodies in patients with primary head and neck squamous celí carcinoma. Cancer Res. 55: 1060-1069 (1995b).
Mulshine J L, Magnani J L, Linnoila R I: Applications of monoclonal antibodies in the treatment of solid tumors. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biológie therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 563-588(1991).
Myklebust AT, Godal A, Juell S, Pharo A, Fodstad O. Comparison of two antibody based methods for elimination of breast cancer cells from human bone morrow. Cancer Res. 54:209-214 (1994).
Nesbit M, Fu Z F, McDonald-Smith J, Steplewski Z, Curtis P J. Production of a funetional monoclonal antibody reeognizing human colorectal carcinoma cells from a baculovirus expression systém. J. Immunol. Methods 151: 201-208 (1992).
Perkins A C, Pimm M V. A role for gamma scintigraphy in cancer immunology and immunotherapy. Eur. J. Nucl. Med. 19: 1054-1063 (1992).
Press O W, Eary J F, Badger C C, Martin P J, Appelbaum F R, Levy R, Miller R, Brown S, Nelp W B, Krohn K A, Fisher D, DeSantes K, Porter B, Kidd P, Thomas E D, Bemstein I D. Treatment of refractory Non-Hodgkin's lymphoma with radiolabeled MB-1 (anti-CD37) antibody. J. Clin. Oncol. 7: 1027-1038 (1989).
Press O W, Eary J F, Appelbaum F R ,Martin P J, Nelp W B Glenn S, Fisher D J, Porter B, Metthews D C Gooley T, Bemstein 1 D. Phase II trial of ,31I-B1 (anti-CD20) antibody the-rapy with autologous stem celí transplantation for relapsed B celí lymphomas. Lancet 346: 336-340(1995).
Quadri S M, Vriesendorp H M, Leichner P K, Williams J R. Evaluation of indium-111 and yttrium-90 labeled linker immunoconjugates in nude mice and dogs. J. Nucl. Med. 34: 938-945(1993).
Reisfeld RA, Gillies SD, Mendelsohn J, Varki NM, Becker JC. Involvement of B lymphocytes in the growth inhibition of human pulmonary melanoma metastases in athymic nu/nu mice by an antibody-lymphotoxin fusion proteín. Cancer res 56: 1707-1712(1996).
Riethmiiller G, Schneider-Gadicke E, Schlimok G, Schmiegel W et al. Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma. Lancet 343: 1177-1183(1994).
Salmi, M., Gron-Virta, K., Sointu, P., Grenman, R., Kalimo, H., Jalkanen S. Regulated expression of exon v6 containing isoforms of CD44 in man: Downregulation during malignant transformation of tumors of squamocellular origin. J. Celí Biol. /22:431-442(1993).
Sambrook, J., Fritsch E.E., Maniatis I., Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Schrappe M, Bumol T F, Apelgren L D, Briggs S L, Koppel G A, Markowitz D D, Mueller B M, Reisfeld R A. Long-term growth suppression of human glioma xenografts by chemo-immunoconjugates of 4-desacetylvinblastine-3-carboxyhydrazide and monoclonal antibody 9.2.27. Cancer Res. 52: 3838-3844(1992).
Screaton, G.R., Beli, M.V., Jackson, D.G., Comells, F.B., Gerth, U., and Beli, J. I. Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 altematively spliced exons. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 89: 12160-12164(1992).
Sears H F, Mattis J, Herlyn D, Hayry P, Atkinson B, Emst C, Steplewski Z, Koprowski H. Phase-I clinical trial of monoclonal antibody in treatment of gastrointestinal tumours. Lancet 1982 (I): 762-765 (1982).
Scitcr, S., Árch, R., Reber, S., Komitowski, D., Hofmann, M., Ponta, H:, Herrlich, P., Matzku, S., Zoller, M. Prevention of tumor metastasis formation by anti-variant CD44. J. Exp. Med. 177: 443-455 (1993). Senter P D, Schreiber G J, Hirschberg D L, Ashe S A, Hellstrom K E, Hellstrom I. Enhancement of the in vitro and in vivo antitumor activities of phosphorylated mitomycin C and etoposide derivatives by monoclonal antibody-alkaline phosphatase conjugates. Cancer Res. 49: 5789-5792 (1989).
Shin S-U, Morrison S L. Production and properties of chimeric antibody molecules. Methods Enzymol. 178: 459476(1989).
Siccardi A G, Buraggi G L, Callegaro L, Colella A C, DeFilippi PGei al. Immunoscinti-graphy of adenocarcinomas by means of radiolabeled F(ab')2 fragments of an anti-carcino-embryonic antigén monoclonal antibody: a multicenter study. Cancer Res. 49: 3095-3103 (1989).
Smith, D.B., Johnson, K.S. Single-step purifícation of polypetides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67: 31 (1988).
Srivastava S C (Hrsg). Radiolabeled monoclonal antibodies for imaging and therapy. Life Sciences Šerieš A 152, Plénum New York (1988).
Tolg, C, Hofmann, M., Herrlich, P., and Ponta, H. Splicing choice from ten variant exons establishes CD44 variability. Nucleic Acids. Res. 21: 1225-1229 (1993).
Theuer C P, Kreitman R J, FitzGerald D J, Pastan I. Immunotoxms made with a recombinant form of pseudomonas exotoxin A that do not require proteolysis for activity. Cancer Res. 53: 340-347 (1993).
Thomas, G. D., Dykes, P. W., Bradwell, A. R. Antibodies for tumour immunodetection and methods for antibody radiolabeling. In: Catty, D. (Hrsg.). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford , 223-244 (1989).
Thompson C H, Stacker S A, Salehi N, Lichtenstein M, Leyden M J, Andrews J T. Immunoscintigraphy for detection of lymph node metastases from breast cancer. Lancet 1984(2): 1245-1247(1984).
Vitetta E S, Thorpe P E. Immunotoxins. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biológie therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 482-495 (1991)
Vitetta E S, Stone M, Amlot P, Fay J, May R, Till M, Newman J, Clark P, Collins R, Cunningham D, Ghetie V, Uhr J W, Thorpe P E. Phase I immunotoxin trial in patients with B-cell lymphoma. Cancer Res. 51:4052-4058 (1991).
Vriesendorp H M, Herbst J M, Germack M A, Klein J L, Leichner P K, Loudenslager D M, Order S E. Phase l-II studies of yttrium-labeled antiferritin treatment for end stage Hodg-kin’s diesease, including Radiation Therapy OncologyGroup 87-01. J. Clin Oncol. 9: 918-928(1991).
Vriesendorp H M, Morton J D, Quadri S M. Review of five consecutive studies of radiolabeled immunoglobulin therapy in Hodgkins's Disease. Cancer Res. (Suppi) 55: 5888s-5892s (1995).
Wang S-M, Chem J-W, Yeh M-Y, Ng J C, Tung E, Roffler S R. Specifíc activation of glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzýme conjugates for cancer therapy. Cancer Res. 52:4484-4491 (1992).
Weiner L M, O'Dwyer J, Kitson J, Comis R L, Frankel A E, Bauer R J, Kopnrad M S, Groves E S. Phase I evaluation of an anti-breast carcinoma monoclonal antibody 260F9-recombinant ricin A chain immunoconjugate. Cancer Res. 49: 4062-4067 (1989).
Wilbur, D. S., Hadley, S. W., Hylarides, M. D., Abrams, P. G., Beaumier, P. A., Morgan, A.C., Reno, J.M., Fritzberg, A.R. Development of a stable radioiodinating agent to label monoclonal antibodies for radiotherapy of cancer. J. Nucl. Med. 30: 216-226 (1989).
Winter, G., Griffith, A. D., Hawkins, R. E., Hoogenboom, H. R. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994).
Breitz H B, Durham J S, Fisher D R, Weiden P L, DeNardo G L, Goodgold H M, Nelp W B. Phrmacokinetics and normál organ dosimetry following intraperitoneal rhenium-186-labeled monoclonal antibody. J. Nucl. Med 36: 754(1995).
Brooks, L., Niedobitck, G., Agathanggelou, A., Farrell, P.J. The expression of variant CD44 in nasopharyngeal carcinoma is unrelated to expression of LMP-1. Am. J. Pathol. 146(5): 1102-12(1995).
Catty, D (Hrsg). Antibodies Vols. lundll. IRL Press Oxford (1989).
Catty, D., Raykundalia, C. ELISA and related immunoassays. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. IL IRL Press Oxford (1989), 97-152, s. S. 105-109.
Sekvenčný protokol
1. Všeobecné údaje (1) Prihlasovateľ:
(A) Meno: Boehringer Ingelheim Intemational GmbH (B) Ulica: Rheinstrasse (C) Miesto: Ingelheim (E) Krajina: Nemecko (F) Poštové smerovacie číslo: 55 216 (G) Telefón: +49 - (0) - 6132 - 772 770 (H) Fax: +49 - (0) - 6132 - 774 377 (A) Meno: Forschungzcntrum Karlsruhe GmbH (B) Ulica: poštová schránka 3 640 (C) Miesto: Karlsruhe (E) Krajina: Nemecko (F) Poštové smerovacie číslo: 76 021 (A) Meno: Heider, Karl-Heinz (B) Ulica: Hervicusgasse 4/3/21 (C) Miesto: Wien (E) Krajina: Rakúsko (F) Poštové smerovacie číslo: 1 120 (A) Meno: Adolf, Guenther (B) Ulica: Stiftgasse 15 -17/10 (C) Miesto:Wien (E) Krajina: Rakúsko (F) Poštové smerovacie číslo: 1 070 (A) Meno: Ostermann, Elinborg (B) Ulica: Mauerbachstrasse 56/6 (C) Miesto: Wien (E) Krajina: Rakúsko (F) Poštové smerovacie číslo: 1 140 (A) Meno:Patzelt, Erik (B) Ulica: Hans-Buchmueller-Gasse 8 (C) Miesto: Purkersdorf (E) Krajina: Rakúsko (F) Poštové smerovacie číslo: 3 002 (A) Meno: Sproll, Marlies (B) Ulica: Schwenkgasse 3 (C) Miesto: Wien (E) Krajina: Rakúsko (F) Poštové smerovacie číslo: 1 120 (ii) Predmet vynálezu: Spôsob diagnózy a terapie karcinómov dlaždicového epitelu (iii) Počet sekvencii: 16 (iv) Počítačom čitateľný rámec:
(A) Nosič údajov: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC - DOS / MS -DOS (D) Softvér: Patentln Release #1.0, Verzia #1.30 (EPA)
2. Údaje o SEQ ID NO 1:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 129 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Tvar závitovky: dvojitý (D) Topológia: dvojitá (ii) Druh molekúl: genomická DNA (ix) Označenie:
(A) Meno/kľúč: exón (B) Rozsah 1 .. 129 (D) Osobitné údaje: /product= “CD44” /label= v6 /note= “GenBank data base accesion No.
L05411) /citation= ([1]) (ix) Označenie:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Rozsah: 3.. 128 (x) Údaje o zverejnení:
(A) Autori: Screaton, GR
Beli, MV
Jakson, DG
Comelis, FB
Gerth, U
Beli, JI (B) Názov: Genómová štruktúra DNA, kódujúca lymfocytový receptor CD44 odhaľuje najmenej 12 alternatívne štepených exónov (angl.).
(C) Časopis: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
(D) Diel: 89 (F) Strany: 12 160-12 164 (G) Dátum: december 1992 (K) Významné zvyšky v SEQ ID NO: 1 : od 1 do 129 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-1996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:
TC GAG GCA ACT CCT AGl AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ACC CAG AA.G Ή
Gin Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys
GAA GAG TGG TTT GGC A?.C AGA TGG CAT GAG GGA TM CGC CAA ACA C.CC 95 Glu Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro
25 30
AGA GAA GAG TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT G
Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala
40
129
2. Údaje o SEQ ID NO 2:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 42 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:
Gin Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu
1 5 10 15
Gin Trp Phe Gly Asn Are Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Arg
20 25 30
Glu Asp Ser Eis Ser Thr Thr Gly Thr Ala
3 5 4 C·
2. Údaje o SEQ ID NO 3:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 14 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-april-1996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:
2. Údaje o SEQ ID NO 4:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 27 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: osobitná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = “PCR primér” (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-1996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:
CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG 27
2. Údaje o SEQ IDNO5:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Druh: nukleotid (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: osobitná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = “PCR primér” (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-l 996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:
TGATAAGGAA CGATTGA CAT TAGAGTTGGA 3 0
2. Údaje o SEQ ID NO 6:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-1996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:
Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg 1 5 10
2. Údaje o SEQ ID NO 7:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 43 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-l 996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 7:
Gin Ala Thr Pre· Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu
1 5 10 15
Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp Hls G1U Gly Tyr Arg Gin Thr Pro A*g
20 25 30
Glu Asp Ser H i. s Ser Thr Thr Gly Thr Ala Ala
35 4(1
2. Údaje o SEQ ID NO 8:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-1996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:
Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys 1 5 10
2. Údaje o SEQ ID NO 9:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 10 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení.
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-1996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:
Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu Gin Trp I 5 10
2. Údaje o SEQ ID NO 10:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-1996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:
Thr Ala Thr Gin Lys Glu Gin Trp Phe Gly Asdn 1 5 10
2. Údaje o SEQ IDNO 11:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 14 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-1996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 11:
Gin Trp Phe Gly Asn Arg Tip His Glu Gly Tyr Arg Gin Ihr 1 5 10
2. Údaje o SEQ ID NO 12:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-deccmber-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-1996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:
Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro 1 5 10
2. Údaje o SEQ IDNO 13:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-l996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 13:
Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Arg Glu Asp Ser 1 5 10
2. Údaje o SEQ IDNO 14:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 10 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-april-1996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 14:
Thr Pro Arg Glu Asp Ser His Ser Thr Gly 1 5 10
2. Údaje o SEQ IDNO 15:
(i) Označenie sekvencie:
(A) Dĺžka: 42 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-l996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 15:
2. Údaje o SEQ IDN0 16:
(i) Označenie sekvencie:
(A) DÍžka: 14 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Tvar závitovky: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: peptid (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 195 45 472.3 (I) Deň podania: 06-december-1995 (x) Údaje o zverejnení:
(H) Číslo spisu: DE 196 15 074.4 (I) Deň podania: 17-apríl-l996 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 16:

Claims (4)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek.
  2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde protilátkovou molekulou je monoklonálna protilátka BIWA-1 (VFF-18), ktorá je vytváraná hybridómovou bunkovou líniou s úložným číslom DSM ACC2174, alebo derivát uvedenej protilátky.
  3. 3. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde protilátkovou molekulou je monoklonálna protilátka, Fab- alebo F(ab'|;fragment imunoglobulínu, protilátka pripravená rekombinantnými metódami, chiméma alebo humanizovaná protilátka pripravená rekombinantnými metódami, bifunkčná alebo jednoreťazová protilátka (scFv).
  4. 4. Použitie podľa nárokov 1 až 3, kde protilátková molekula je viazaná s rádioaktívnym izotopom, fotoaktivovateľnou zlúčeninou, s rádioaktívnou zlúčeninou, enzýmom, fluorescenčným farbivom, biotínovou molekulou, toxínom, cytostatikom, proliečivom, s protilátkovou molekulou s inou špecifickosťou, cytokínom alebo s inými imunomodulačnými polypeptidmi.
SK736-98A 1995-12-06 1996-12-05 Použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR, na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek SK284378B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19545472A DE19545472A1 (de) 1995-12-06 1995-12-06 Verfahren zur Diagnose und Therapie von Plattenepithelkarzinomen
DE19615074 1996-04-17
PCT/EP1996/005448 WO1997021104A1 (de) 1995-12-06 1996-12-05 Verfahren zur diagnose und therapie von plattenepithelkarzinomen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK73698A3 SK73698A3 (en) 1999-01-11
SK284378B6 true SK284378B6 (sk) 2005-02-04

Family

ID=26020988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK736-98A SK284378B6 (sk) 1995-12-06 1996-12-05 Použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR, na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek

Country Status (26)

Country Link
EP (1) EP0865609B1 (sk)
JP (1) JP2000502067A (sk)
KR (1) KR100473824B1 (sk)
CN (1) CN1151377C (sk)
AR (1) AR004360A1 (sk)
AT (1) ATE235056T1 (sk)
AU (1) AU726704B2 (sk)
BG (1) BG62985B1 (sk)
BR (1) BR9611901A (sk)
CA (1) CA2239709A1 (sk)
CO (1) CO4520233A1 (sk)
CZ (1) CZ174198A3 (sk)
DE (1) DE59610248D1 (sk)
DK (1) DK0865609T3 (sk)
EE (1) EE03783B1 (sk)
ES (1) ES2190484T3 (sk)
HK (1) HK1011560A1 (sk)
MX (1) MX9804459A (sk)
NO (1) NO319903B1 (sk)
NZ (1) NZ324314A (sk)
PL (1) PL184521B1 (sk)
PT (1) PT865609E (sk)
SK (1) SK284378B6 (sk)
TR (1) TR199801027T2 (sk)
UY (1) UY24389A1 (sk)
WO (1) WO1997021104A1 (sk)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7189397B2 (en) * 1999-10-08 2007-03-13 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US7947496B2 (en) * 1999-10-08 2011-05-24 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US20050100542A1 (en) * 1999-10-08 2005-05-12 Young David S. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
PE20021098A1 (es) * 2001-05-18 2003-02-11 Boehringer Ingelheim Int ANTICUERPOS ESPECIFICOS DE CD44v6
US20030103985A1 (en) 2001-05-18 2003-06-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates
US6972324B2 (en) 2001-05-18 2005-12-06 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Antibodies specific for CD44v6
EP1258255A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
EP1391213A1 (en) * 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
EP1417974A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-12 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy
RS53327B (en) * 2010-02-04 2014-10-31 University Of Miami Monoclonal antibody to CD44, for use in the treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck
US9218450B2 (en) * 2012-11-29 2015-12-22 Roche Molecular Systems, Inc. Accurate and fast mapping of reads to genome
CN112105643B (zh) * 2018-02-22 2023-09-26 普众发现医药科技(上海)有限公司 治疗性抗体及其应用
AU2023274919A1 (en) 2022-05-25 2024-12-05 Akiram Therapeutics Ab Anti-cd44v6 antibodies and their use to treat cd44v6 overexpressing cancers

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU678487B2 (en) * 1993-06-18 1997-05-29 Oy Biotie Therapies Ltd Compositions and diagnostic methods using monoclonal antibodies against CD44v6
US6010865A (en) * 1993-06-22 2000-01-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Process for detecting a variant CD44 gene product
DE4326573A1 (de) * 1993-08-07 1995-02-23 Boehringer Ingelheim Int Durch Exon v5 des CD44-Gens kodierte Polypeptide als Targets für Immuntherapie und Immunszintigraphie von Tumoren
UA58482C2 (uk) * 1994-06-08 2003-08-15 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Моноклональне антитіло vff-18 проти сd44v6 і його фрагменти

Also Published As

Publication number Publication date
BG62985B1 (bg) 2000-12-29
TR199801027T2 (xx) 1998-10-21
EP0865609A1 (de) 1998-09-23
CO4520233A1 (es) 1997-10-15
JP2000502067A (ja) 2000-02-22
MX9804459A (es) 1998-09-30
AU1177397A (en) 1997-06-27
SK73698A3 (en) 1999-01-11
PL327066A1 (en) 1998-11-23
CN1151377C (zh) 2004-05-26
AU726704B2 (en) 2000-11-16
ES2190484T3 (es) 2003-08-01
HK1011560A1 (en) 1999-07-16
CZ174198A3 (cs) 1999-02-17
BG102513A (en) 1999-02-26
EE03783B1 (et) 2002-06-17
AR004360A1 (es) 1998-11-04
NO982588D0 (no) 1998-06-05
EP0865609B1 (de) 2003-03-19
DK0865609T3 (da) 2003-06-23
BR9611901A (pt) 1999-03-02
KR100473824B1 (ko) 2005-09-30
WO1997021104A1 (de) 1997-06-12
CN1207811A (zh) 1999-02-10
NO982588L (no) 1998-08-05
ATE235056T1 (de) 2003-04-15
UY24389A1 (es) 2001-10-25
NZ324314A (en) 2000-02-28
PL184521B1 (pl) 2002-11-29
CA2239709A1 (en) 1997-06-12
DE59610248D1 (de) 2003-04-24
NO319903B1 (no) 2005-09-26
EE9800164A (et) 1998-12-15
PT865609E (pt) 2003-08-29
KR19990071952A (ko) 1999-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2563735C (en) Antibodies and molecules derived therefrom that bind to steap-1 proteins
EP1648510B1 (en) Rg1 antibodies and uses thereof
US20030018171A1 (en) High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies
KR20050059220A (ko) 인간화된 항-과립구 ｍｎ-3 항체 및 이들의 용도
AU2007218962A1 (en) Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
WO2005032454A2 (en) Anti-muc-1 single chain antibodies for tumor targeting
CZ359196A3 (en) Antibodies, their use and hybridoma cellular line
SK284378B6 (sk) Použitie protilátkovej molekuly, ktorá sa viaže na aminokyselinovú sekvenciu WFGNRWHEGYR, na výrobu liečiva na liečenie karcinómov skvamóznych buniek
BRPI0809351A2 (pt) Anticorpo de anti cd166 humano ligando células tumorais humano
US6372441B1 (en) Method for diagnosis and therapy of Hodgkin&#39;s lymphomas
NZ551627A (en) Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
CA2168988A1 (en) Polypeptides coded by exon v5 of the cd44 gene as targets for immunotherapy and immunoscintigraphy of tumours
AU752494B2 (en) High affinity humanized ANTI-CEA monoclonal antibodies
CA2555306A1 (en) Humanized antibody
BRPI0520902B1 (pt) Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a proteínas psca para diagnóstico de câncer, método para produção dos mesmos, hibridoma, polinucleotídeo, vetor, composição, ensaio para detectar a presença de uma proteína psca e método de detecção de uma proteína psca
RU2193779C2 (ru) Средство и способ лечения плоскоклеточного рака
Tang et al. Evaluation of human major histocompatibility complex class I chain-related A as a potential target for tumor imaging
MXPA99005544A (es) Molecula de anticuerpo y su empleo para la diagnosis y terapia de linfomas de hodgkin