MXPA99005544A - Molecula de anticuerpo y su empleo para la diagnosis y terapia de linfomas de hodgkin - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para la diagnosis y la terapia de linfomas de Hodgkin (linfogranulomatosis) que se basa en la expresión del exón v10 variante del gen CD44 como marcador o diana molecular. Existe una correlación significativa entre la expresión de v1O y la fase asícomo la prognosis de la enfermedad. En una forma de realización preferida, se utilizan moléculas de anticuerpos específicas de v10 con el fin de medir la expresión del exón en muestras. En otra forma de realización preferida se utilizan anticuerpos específicos de v10 radiomarcados para la terapia de linfomas de Hodgkin.

Description

MOLÉCULA DE ANTICUERPO Y SU EMPLEO PARA LA DIAGNOSIS Y TERAPIA DE LINFOMAS DE HODGKIN Campo de la Invención La presente invención se refiere a procedimientos para la diagnosis y terapia de linfomas de Hodgkin (linfogranulomatosis) que se basan en la expresión del exón variante vio del gen CD44 como diana molecular, a agentes para estos procedimientos^ así como al empleo de estos agentes. La proteína de la superficie celular CD44 muy glucosilada participa en la interacción entre células y la matriz extracelular, tal como la migración y activación de leucocitos en el caso de inflamación y vigilancia inmunológica, formación de precursores de células leucocíticas y mieloides en la médula ósea, como también en el desarrollo de órganos linfoides y en la interacción de células con la matriz extracelular (Lesley et al., 1993. Günthert 1993, País et al., 1993, Mackay et al., 1994). El gen CD44 humano está compuesto por al menos 19 exones, de los que al menos 12, que codifican la región extracelular, son alternativamente cortado_s y empalmados (Screaton et al., 1992). El gen CD44 se transcribe en una serie de tejidos normales y carcinomas (Fox et al., 1994). Mientras REF. : 30411 que la molécula de CD44 estándar (CD44s) se encuentra expresada en forma ubicua en tejidos epiteliales y mesenquimales, las diferentes isoformas, que se crean mediante corte y empalme alternativo de ARN, se encuentran en una distribución muy limitada (Heider et al., 1993). Algunas de las isoformas variantes participan en la activación de linfocitos y se manifiestan en asociación con la formación de metástasis (Mackay et al., 1994, Günthert et al., 1991, Rudy et al., 1993, Koopman et al., 1993) . A pesar de que se demostró un papel biológico directo de la expresión de CD44 variante en la formación de metástasiss en el carcinoma de páncreas de la rata (Günthert et al., 1991, Seiter et al., 1993), su papel en tumores humanos es todavía desconocido.

Antecedentes de la Invención Se publicaron diferentes informes en los que se demostró que determinadas formas de CD44 cortadas y empalmadas de forma alternativa se expresaban en tumores metastásicos humanos (Heider et al., 1993 y 1996, Fox et al., 1994, Friedrichs et al., 1995, Kaufmann et al., 1995, Salles et al., 1993, Stauder_et al., 1995, Koopman et al., 1993, Tanabe et al., 1993). Estudios de la expresión de CD44 en linfomas no de Hodgkin (NHL) se concentraron en el análisis del denominado receptor director de linfocitos CD44H ó CD44s (Horst et al., 1990a, Horst et al., 1990b, Jalkanen et al., 1991, Móller et al., 1992). Mientras que algunos autores (Horst et al., 1990a, Jalkanen et al 1991, Picker et al., 1988, País et al., 1989, Fujiwara et al., 1993) encontraron una correlación entre una expresión incrementada de CD44s y una prognosis desfavorable, otros (Terpe et al., 1994) no pudieron confirmar estos hallazgos. Recientemente, se encontró una elevada regulación de isoformas de CD44v3 y CD44v6 en NHL con un estado patológico desfavorable (Koopman et al., 1993, Terpe et al., 1994, Salles et al., 1993, Stauder et al., 1995), utilizándose anticuerpos monoclonales (acms) de CD44 específicos de variantes (Mackay et al., 1994, Koopman et al., 1993, Fox et al., 1993).

Descripción de la Invención Se han dado a conocer diversos intentos para aprovechar la expresión diferencial de exones variantes del gen CD44 en tumores y en tejidos normales para procesos de diagnosis y terapéuticos ' (documentos WO 94/02633, WO 94/12631, WO 95/00658, WO 95/00851, EP 0531300.

Era misión de la presente invención el desarrollo de nuevos procedimientos para la diagnosis y la terapia de linfornas de Hodgkin (linfogranulomatosis) así como la puesta a disposición de agentes para procedimientos de este tipo. Este problema se pudo resolver con la presente invención. Esta se refiere a procedimientos para la diagnosis y la terapia de linfomas de Hodgkin (linfogranulomatosis) que se basan en la expresión del exon variante vlO del gen CD44 como marcador o diana molecular. Moléculas de anticuerpos con una correspondiente especificidad se adecúan en particular como vehículos con el fin de acceder selectivamente in vivo a linfomas de Hodgkin. En este caso, se prefieren procedimientos que se caracterizan porque en ellos se utiliza una molécula de anticuerpo que se une específicamente a al secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 (véase el protocolo de secuencias) . Otros aspectos de la presente invención son el empleo de moléculas de anticuerpos de este tipo en los procedimientos de acuerdo _con la invención, así como agentes para llevar a cabo estos procedimientos.

La invención se refiere, además, al empleo de una molécula de anticuerpo que es específica para un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos, que es codificada por el exón variable vlO del gen CD44, para la preparación de una composición farmacéutica para la diagnosis y/o terapia de enfermedades tumorales. Preferiblemente, en el caso de la enfermedad tumoral se trata de un linfoma de Hodgkin (linfogranulomatosis) . La invención se refiere, además, a una molécula de anticuerpo que es específica para un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos que es codificada por el exón variable vio del gen CD44, para el empleo farmacéutico. Preferiblemente, una molécula de anticuerpo de este tipo se caracteriza porque se une a la SEQ ID NO. 2 En este caso, se puede tratar en particular de un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab o F(ab')2 de una inmunoglobulina, un anticuerpo producido de forma recombinante, un anticuerpo quimérico o humanizado producido de forma recombinante o un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) . Preferiblemente, una molécula de anticuerpo de este tipo está enlazada con un isótopo radiactivo, un compuesto radiactivo, una enzima, una toxina, un agente citostático, un profármaco, una citoquina u otro polipéptido inmunomodulador.

La secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos del exón variante vlO del gen CD44 es conocida (Screaton et al., 1992, Tdlg et al., 1993). Estas secuencias se encuentran en el protocolo de secuencias (SEQ ID NOS. 1 y 2) . La existencia de variantes degeneradas o alélicas no es de importancia para la realización de la invención; por lo tanto, variantes de este tipo están expresamente incluidas. La invención se puede llevar a cabo con anticuerpos policlonales o monoclonales que son específicos para un epítopo que es codificado por el exón vlO. La preparación de anticuerpos contra secuencias de aminoácidos conocidas puede efectuarse según métodos en sí conocidos (Catty, 1989) . Por ejemplo, un péptido de esta secuencia se puede producir por vía sintética y, en forma de antígeno, emplear en un protocolo de inmunización. Otra vía es la preparación de una proteína de fusión que contiene la secuencia de aminoácidos deseada, integrando un ácido nucleico (que se puede producir por vía sintética o, por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de una muestra adecuada), que codifica esta secuencia, en un vector de expresión, y la proteína de fusión se expresa en un organismo hospedante. La proteína de fusión eventualmente purificada puede emplearse entonces como antígeno en un protocolo de inmunización y seleccionarse, con procedimientos adecuados, anticuerpos específicos de la inserción o, en el caso de anticuerpos monoclonales, hibridomas que expresan anticuerpos específicos de la inserción. Procedimientos de este tipo son estado conocido de la técnica. Heider et al. (1993, 1996) y Koopman et al. (1993) describen la preparación de anticuerpos contra epítopos variantes de CD44. Sin embargo, para el procedimiento de acuerdo con la invención también se pueden utilizar otras moléculas de anticuerpos que se derivan de anticuerpos policlonales o monoclonales, por ejemplo fragmentos Fab o F(ab')2 de inmunoglobulinas, anticuerpos de cadena sencilla (scFv) producidos de forma recombinante, anticuerpos quiméricos o humanizados, así como otras moléculas que se fijan específicamente a epítopos que son codificados por el exón vlO. A partir de una inmunoglobulina completa pueden crearse, por ejemplo, fragmentos Fab o F(ab')2 u otros fragmemtos (Kreitman et al., 1993). El experto en la materia está, además, en condiciones de producir moléculas de anticuerpos recombinantes, específicas de vlO. Procedimientos correspondientes son estado conocido de la técnica. Moléculas de anticuerpos recombinantes de este tipo pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanizados (Shin et al., 1989; Güssow y Seemann, 1991), anticuerpos biespecíficos (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989), anticuerpos de cadena sencilla (ScFv, Johnson y Bird, 1991), inmunoglobulinas completas o fragmentadas (Coloma et al., 1992; Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992) o anticuerpos creados por desordenación de la cadena (Winter et al., 1994), Anticuerpos humanizados pueden producirse, por ejemplo, mediante injerto por CDR (documento EP 0239400) . También pueden modificarse regiones del marco (documento EP 0519596) . Para la humanización de anticuerpos pueden emplearse hoy en día métodos tales como PCR (véanse, por ejemplo los documentos EP 0368684; EP 0438310; WO 9207075) o modelado por ordenador (veáse, por ejemplo el documento WO 9222653) . También pueden producirse y emplearse proteínas de fusión, por ejemplo proteínas de fusión de anticuerpos de cadena sencilla/toxina (Chaudhary et al., 1990; Friedman et al., 1993). Bajo los conceptos generales "anticuerpos" y "moléculas de anticuerpos" se han de incluir, además de anticuerpos policlonales y monoclonales, todos los compuestos discutidos en este párrafo, así como otros compuestos que se pueden derivar estructuralmente de inmunoglobulinas y que se pueden producir con métodos en sí conocidos.

Para procedimiento de diagnosis, moléculas de anticuerpos pueden enlazarse, por ejemplo con isótopos radiactivos tales como 131I,111In,99p?Tc o compuestos radiactivos (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), enzimas tales como peroxidasa o fosfatasa alcalina (Catty y Raykurtdalia, 1989), con colorantes de fluorescencia (Johnson, 1989) o con moléculas de biotina (Guesdon et ~al., 1979). Para aplicaciones terapéuticas, moléculas de anticuerpos específicas de vlO pueden enlazarse con radioisótopos tales como 90Y,?nIn,131I,186Re (Quadri et al., 1993; Lenhard et al., 1985; Vriesendorp et al., 1991; Wilbur et al., 1989), toxinas (Vitetta et al., 1991; Vitetta y Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), agentes citostáticos (Schrappe et al., 1992), profármacos (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989) o compuestos radiactivos. El anticuerpo puede, además, estar enlazado con una citoquina u otro polipéptido inmunomodulador, por ejemplo con el factor de necrosis de tumores o interleuquina-2. De manera ventajosa, con el procedimiento de diagnosis de acuerdo con la invención se pueden examinar muestras de pacientes, por ejemplo de biopsias, en las que existe la sospecha de un linfoma de Hodgkin (linfogranulomatosis), o ya se dispone de la diagnosis, pero el tumor debe ser caracterizado con mayor precisión. La detección de moléculas de CD44 variantes, que contienen una secuencia de aminoácidos que es codificada por el exón variable vlO, puede efectuarse en el plano de las proteínas mediante anticuerpos o en el plano de los ácidos nucleicos mediante sondas específicas de ácidos nucleicos o cebadores para la reacción en cadena de la poli erasa (PCR) . Por consiguiente, la invención- se refiere también a moléculas de anticuerpos y ácidos nucleicos que son adecuados como sondas o cebadores para procedimientos de este tipo, y al empleo de anticuerpos y ácidos nucleicos de este tipo para la diagnosis y el análisis de linfomas de Hodgkin. Por ejemplo, cortes de tejido pueden ser examinados inmunohistoquimicamente con anticuerpos con métodos en sí conocidos. Extractos obtenidos a partir de muestras de tejidos o líquidos corporalea pueden examinarse, además, con otros métodos inmunológicos con empleo de anticuerpos, por ejemplo en transferencias de Western, análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISA, Catty y Raykundalia, 1989), radioinmunoensayos (RÍA, Catty y Murphy, 1989) o inmunoensayos relacionados. Las investigaciones se pueden efectuar de forma cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa. La expresión de la variante de corte y empalme de CD44 viO en la enfermedad de Hodgkin está asociada con un comportamiento agresivo del tumor y un elevado riesgo de recidiva. Está expresión se correlaciona con una frase avanzada y una mala prognosis de NSHD (enfermedad de Hodgkin de esclerosis nodular) . Junto al diagnóstico in vitro, se adecúan también para el diagnóstico in vivo de linfomas de Hodgkin moléculas de anticuerpos con una especificidad de acuerdo con la invención. Si la molécula .de anticuerpo porta un marcador detectable, se puede efectuar una detección del marcador con fines diagnósticos, por ejemplo visualización del tumor un vivo (formación de imágenes) o, por ejemplo, para la cirugía radioapoyada (radioguided surgery) . Para la utilización de anticuerpos conjugados con isótopos radioctivos para el inmunocentelleo (formación de imágenes) existen, por ejemplo, una serie de protocolos, basados en los cuales el experto en la materia puede ejecutar la invención (Siccardi et al., 1989; Keenan et al., 1987; Perkins y Pimm, 1992; Colcher et al., 1987, Thompson et al., 1984). Mediante la detección y/o cuantificación de la expresión del epítopo variante de CD44 vlO, los datos recogidos pueden incorporarse así en al diagnosis y la prognosis. En este caso, puede ser ventajosa la combinación con otros parámetros de prognosis, por ejemplo con el grado del tumor. Moléculas de anticuerpos con la especificidad de acuerdo con la invención y, eventualmente, enlazadas con un agente citotóxico, pueden utilizarse ventajosamente para la terapia de linfomas de Hodgkin (linfogranulomatosis) . En este caso, la aplicación se puede efectuar por vía sistémica o tópica, por ejemplo por inyección/infusión intravenosa (en forma de bolo o infusión permanente), intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, u otras. Protocolos para la administración de anticuerpos conjugados o no conjugados (ya sea como inmunoglobulinas completas, fragmentos, moléculas humanizadas recombinantes o similares) son estado conocido de la técnica (Mulshine et al., 1991; Larson et al., 1991; Vitetta y Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992, 1995; Press et al., 1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982) . Las moléculas de anticuerpos se pueden formular de manera en sí conocida. Por ejemplo, se pueden presentar en solución acuosa que eventualmente asta tamponada con un tampón fisiológicamente compatible. Una solución de este tipo puede caracterizarse por la adición de estabilizadores y coadyuvantes adecuados. Las moléculas de anticuerpos pueden presentarse, sin embargo, también en forma de un preparado liofilizado (liofilizado) que se reconstituye antes de su utilización con un disolvente adecuado, por ejemplo agua. Una forma de realización preferida de una aplicación terapéutica consiste en enlazar una inmunoglobulina específica de vio humanizada o un fragmento F(ab')2 de la misma con 90Y (Quadri et al., 1993; Vriesendorp et al. ,1995), 131I (Juweid et.al., 1995; Press et al., 1995, Thomas et al., en: Catty 1985, págs. 230-239), 186Re (Breitz et al., 1992, 1995) o con otro radioisótopo adecuado y emplearla para la radioinmunoterapia de linfomas de Hodgkin. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo de este tipo puede enlazarse con 90Y con empleo de un enlazador formador de quelatos tal como ITCB-DTPA (pentaacetato de isotiocianatobencil-dietilentriamina) , debiendo alcanzarse una actividad específica de 5-20 mCi/mg, preferiblemente 10 mCi/mg. Este agente puede administrarse entonces a un paciente con un tumor antígeno-positivo en una dosificación de 0,1 a 1 mCi/kg de peso corporal, preferiblemente de 0,3 a 0,5 mCi/kg de peso corporal, de manera particularmente preferida de 0,4 mCi/kg. En el caso de una cantidad de proteínas totales a administrar de 2 a 5 mg, esto puede efectuarse en forma de una rápida inyección de bolo intravenosa. En el caso de anticuerpos monoclonales puede ser necesario mezclar el agente, antes de la administración, con un exceso (por ejemplo un exceso diez veces molar) del anticuerpo no radiactivo; en este caso, la administración se efectúa mejor en forma de una infusión intravenosa, por ejemplo a lo largo de 15 minutos. La aplicación se puede repetir. La terapia puede apoyarse mediante un transplante de médula ósea.

Descripción de las figuras Fig. 1; A. Célula individual HRS (Hodgkin y Reed-Sternberg) de un paciente sin recidiva que reacciona con el acm VFF16 (CD44vlO) . Las puntas de flecha apuntan a células HRS no reactivas. B. >50% de las células HRS de pacientes con recidiva muestran reactividad (ABC, x400) . Fig. 2; Expresión de CD44vlO en células HRS en diferentes grupos de pacientes. Ha de observarse que pacientes con una evolución clínica mala, es decir recidiva o participación de la médula ósea, muestran exclusivamente más de 10% de células HRS positivas, mientras que pacientes sin recidiva tienen menos de 10% de células HRS positivas.

La diferencia entre estos dos grupos es muy estadísticamente significativa. Fig. 3; Análisis por RT-PCR con empleo de cebadores específicos de CD44vlO (mitad de la derecha) : el transcrito principal de aproximadamente 470 pb en todas las muestras y un transcrito más débil de 660 pb en las muestras 2, 3 y 4 confirman isoformas con contenido en CD44vl0 en todos los 5 casos. Una banda dominante de 440 pb en el caso de empleo de cebadores que son específicos para las regiones 5' y 3' constantes la indica la forma estándar de CD44 (mitad de la izquierda) . Ejemplos Ejemplo 1: Preparación de anticuerpos específicos de vlO Toda la región variante del tipo HPKII de CD44v (Hofmann et al., 1991) se amplificó a partir de ADNc de queratinocitos humanos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los cebadores de PCR 5' -CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3' , posiciones 25-52, y 5' -TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3' , posiciones 13-984 de la región variante LCLC97, tal como se describen por Hofmann et al, contenían un lugar de reconocimiento de EcoRI, que se utilizó para clonar el produto de PCR directamente en el vector pGEX-2T (Smith et al., 1988). La construcción resultante (pGEX CD44v HPKII, v3-vl0) codifica una proteína de fusión de - 70 kD, consistente en glutation-S-transferasa de Schistosoma japonicum y los exones v3-vl0 de CD44 humana (Heider et al., 1993). La proteína de fusión se expresó en E. Coli y, a continuación, se purificó por afinidad sobre glutation-agarosa (Smith et al., 1988). Ratones Balb/c hembras se inmunizaron por vía intraperitoneal con la proteína de fusión purificada por afinidad según el siguiente- esquema: Ia inmunización: 90 µg de proteína de fusión en adyuvante de Freund completo 2a y 3a inmunizaciones: 50 µg de proteína de fusión en adyuvante de Freund incompleto. Las inmunizaciones se efectuaron a intervalos de en cada caso 4 semanas. 14 días después de la última inmunización, los animales se inmunizaron todavía durante tres días consecutivos en cada caso con 10 µg de proteína de fusión en PBS. Al día siguiente, células de bazo de un animal con un elevado título de anticuerpos se fusionaron con células de mieloma de ratón P3.X63-Ag8.653 con ayuda de polietilenglicol 4000. Las células de hibridoma se seleccionaron luego en placas de microtitulación en medio HAT (Kóhler y Milstein, 1975; Kearney et al., 1979).

La determinación del título de anticuerpos en el suero o el rastreo de los materiales sobrenadantes de hibridoma se llevó a cabo con ayuda de un ELISA. En este ensayo, se recubrieron primeramente placas de microtitulación con la proteína de fusión (GST-CD44v3-10) o sólo con glutation-S-transferasa. A continuación, se incubó con diluciones en serie de muestras de suero o materiales sobrenadantes de hibridoma y los anticuerpos específicos se detectaron con anticuerpos conjugados - con peroxidasa contra inmunoglobulina de ratón. Se desecharon los hibridomas que sólo reaccionaban con glutation-S-transferasa. Los anticuerpos remanentes se caracterizaron primeramente en un ELISA con proteínas de fusión específicas del dominio (exón v3, exones v5 + v6+, exones v6 + v7, exones v8 - vlO, exón vlO) (Koopman et al., 1993). Su reactividad inmunohistoquímica se sometió a ensayo en tiras de piel humanas. Anticuerpos de los materiales sobrenadantes de los clones de hibridoma VFF-14 y VFF-16 se fijan sólo a proteínas de fusión que contienen un dominio que es codificado por el exón vlO.

Ejemplo 2: Investigación inmunohistoquimica de muestras de tejidos Tejidos y pacientes 37 muestras de ganglios linfáticos embutidas en parafina de 29 pacientes con NSHD (enfermedad de Hodgkin de esclerosis nodular; conforme a la clasificación Rye) se obtuvo de la Colección del Departamento de Patología, Escuela Universitaria para Medicina, Graz, Austria, y se dividió en tres grupos; grupo 1: 11 pacientes con NSHD previamente tratada antes del tratamiento (5 pacientes en la fase I, 6 en la fase II), estaban exentos de recidiva durante más de 6 años; grupo 2: 9 pacientes con NSHD de previamente tratada antes del tratamiento (4 en fase I, 5 en fase II) mostraron una recidiva de la enfermedad en el espacio de uno a tres años. De 7 de estos 9 pacientes se incluyeron dos a tres segmentos de ganglios linfáticos consecutivos de recidivas por NSHD asimismo en este estudio; grupo 3: 9 pacientes con participación de la médula ósea en el instante de la diagnosis original (fase IV) .

Inmunohistoquimica Las muestras de ganglios linfáticos se tiñeron con los siguientes acms: CD44 estándar (s) reconocida por el acm SFF2; CD44v5 detectada por el acm VFF8; CD44v6 detectada por los acms VFF7 y VFF18; CD44 lO detectada por los acms VFF14 y VFF16. El acm SFF2 reconoce un epítopo que es común para todas las isoformas de CD44. Los acms VFF7 y VFF18 reconocen diferentes epítopos, pero solapantes, que son codificados por el exón v6. El acm VFF8 es específico para el exón v6. Los acms VFF14 y VFF16 reaccionan con un epítopo que es codificado por el exón vlO. La inmunohistoquímica se realizó en cortes tratados con microondas (Gerdes et al., 1992), utilizándose el método de complejo de avidina-biotina (ABC) -peroxidasa (Guesdon et al., 1979). Los cortes de parafina se desparafinaron en xileno, se rehidrataron y la peroxidasa endógena se bloqueó con H202 en metanol. Los portaobjetos se colocaron en un soporte de vidrio y se humedecieron en 500 mi de tampón citrato 0,01 M (2,1 g de ácido cítrico en 1 1 de agua desionizada, pH ajustado a 6,0 con NaOH 2N) . El tratamiento por microondas se realizó durante 35 minutos a una ptoencia máxima (600 W) en un microondas (BioRad) . Después del tratamiento por microondas durante 9 minutos, el tampón vaporizado se completó con agua desionizada.

Después de la irradiación por microondas, la solución se enfrió durante 20 minutos. Luego, los portaobjetos se aclararon en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y no se inmunotiñeron mediante desarrollo en diaminobenzidina (DAB) . Con fines comparativos, 10 muestras de ganglios linfáticos congeladas (3 de pacientes del grupo 1, 2 del grupo 2 y 5 de casos sólo recientemente recogidos) se incubaron asimismo con los acms VFF14 (vlO) y VFF16 (vlO), utilizándose el método de fosfatasa alcalina-anti-fosfatasa alcalina (APAAP) (Cordell et al., 1984). Con fines de control, se sometieron a ensayo cortes de epidermis humana normal que es conocida por contener los respectivos antígenos (controles positivos) . El reemplazo del anticuerpo primario por suero normal proporcionó siempre resultados negativos (controles negativos) . Para otros fines de control se repitieron, en cada caso dos veces, tinciones inmunohistoquímicas para la expresión de CD44vl0 y CD44v6. Con el fin de confirmar los hallazgos, los casos se incubaron adicionalmente en otro laboratorio, utilizándose el método APAAP (Cordell et al., El porcentaje de células HRS (Hodgkin y Reed-Sternberg) que se tiñó con los anticuerpos, se clasificó como 0%, menor que 10%, 10-50% y superior al 50%. Se tuvo cuidado de que las células HRS inmunorreactivas fueran claramente células tumorales (por ejemplo, con ayuda de la presencia de detalles característicos del núcleo) , particularmente en los casos en los que menos del 10% de las células HRS expresaban los respectivos antígenos. Todos los casos fueron inspeccionados por separado por 2 de los inventores. La distribución de la tinción, por ejemplo en la membrana, en el citoplasma o en ambos, se registró al igual que la reactividad inmunológica en células que no eran células HRS.

Análisis estadístico Se analizaron modelos de expresión CD44, utilizándose el cálculo chi cuadrado de Pearson y el ensayo de Mantel- Haenszel para la asociación lineal, utilizándose el programa SPSS para Windows. Los valores P eran iguales o menores que 0,05, se consideraron significativos.

Resultados de las tinciones inmunohistoquimicas La Tabla 1 muestra una panorámica de los resultados que se obtuvieron con anticuerpos dirigidos contra CD44s, CD44v5, v6 y vlO en células HRS. La parte principal de la reactividad antigénica de las células HRS estaba en todos los casos sobre la superficie de la célula. Un número variable de células HRS proporiconó una actividad perinuclear citoplésmática y/o similar a puntos con o sin tinción de la superficie que problablemente reproducen la reactividad de moléculas de CD44 en el aparato de Golgi o en el retículo endoplasmático. La expresión de CD44vlO se correlaciona con la fase avanzada y una mala prognosis de NSHD. La expresión de CD44s, CD44v5 (detectada por el acm VFF8) y CD44v6 (detectada por el acm VFF18) en células HRS se encontró en la mayoría de los casos, observándose no obstante una gran variabilidad en el número de las células teñidas (Tabla 1) .

La expresión de CD44v6 (detectada por el acm VFF7) se encontró sólo en unos pocos casos y, cuando estaba presente, entonces se limitaba a una minoría de células HRS (Tabla 1) . En pacientes sin recidiva se encontró la expresión de CD44vlO (detectada por los acms VFF14 y VFF16) sólo en muy pocos casos, y la proporción de células HRS reactivas era <10% (Figs. 1A y 2) . En contraposición a ello, en todos los casos de pacientes con recidiva o participación inicial de la médula ósea se observó la expresión de CD44vlO. En la mayoría de estos casos, existía una clara supraexpresión de CD44vlO con >50% de células HRS reactivas (Figs. IB y 2) . Esta supraexpresión de CD44vlO se encontró también en los cortes de ganglios linfáticos investigados de recidivas (Tabla 2) . Cortes de ganglios - linfáticos congelados de 3 pacientes sin recidiva y de 2 pacientes con recidiva proporcionaron resultados idénticos a los cortes de parafina. Los dos anticuerpos (VFF14 y VFF16) específicos para el exón vlO mostraron resultados idénticos' en la reacción sobre la sueprficie y/o en el citoplasma de las células HRS. Utilizando un ensayo exacto al de Fisher las diferencias de la expresión de isoformas CD44 entre grupos de pacientes con NSHD no agresiva y agresiva proporcionaron los siguientes valores p: CD44s (p = 0,3625), CDD44v5 (p = 0,2415), CD44v6 (detectada con el acm VFF7) (p = 0,2093), CD44v6 (detectada con el acm VFF18) (p = 0,1836), CD44vlO (detectada por los acms VFF14 y VFF16) (p = 0,001). Esto demuestra que los diferentes modelos de expresión de CD44vl0 (detectados por los acms VFF14 y VFF16) dentro de estos grupos de NSHD eran estadísticamente muy significativos. La expresión de la variante CD44 por corte y empalme de vlO en la enfermedad de Hodgkin está asociada con un comportamiento agresivo del tumor y un elevado riesgo de recidiva. Se correlaciona con una fase avanzada y una mala prognosis de NSHD. En contraposición a estudios inmunohistoquímicos anteriores de la expresión de CD44 en relación con una relevancia de prognosis en neoplasias de diferente origen histogenético, que exclusivamente se realizaron en cortes congelados (Koopman et al., 1993, Terpe et al., 1994, Ristamáki et al., 1994, 1995, Stauder et al., 1994, Heider et al., 1993, Horst et al., 1990a,b, Heider et al., 1996, Kaufmann et al., 1995, Mulder et al. 1994), se pudo demostrar con la presente invención que los acms de CD44 también se pueden aplicar a material embutido en parafina cuando se utiliza un tratamiento por microondas. Este procedimiento requiere una fijación constante y un tratamiento por microondas con el fin de proporcionar resultados reproducibles. Para la validación de la reactividad inmune que se obtuvo con material embutido en parafina, el análisis inmunohistoquímico se llevó a cabo paralelamente en muestras congeladas, y se obtuvieron idénticos resultados. Adicionalmente, se confirmaron por RT-PCR los resultados de la expresión de CD44vlO. Para la expresión de CD44v6 se pudo demostrar una correlación con una mala prognosis en NHL (Koopman et al., 1993, Salles et al., 1993, Terpe et al., 1994, Ristamaki et al., 1994, Stauder et al., 1994), cáncer de mama (Kaufmann et al., 1995) y carcinomas de colon (Heider et al., 1993). Sin embargo, en los casos de NSHD investigados por los autores de la invención, sólo algunos pocos casos eran CD44v6-positivos, y no pudieron establecer ninguna correlación con la prognosis, utilizando dos diferentes anticuerpos contra CD44v6. Dado que estos dos acms utilizados contra v6 reconocen diferentes epítopos de la secuencia de aminoácidos codificada por el exón v6, esta carencia de CD44v6 detectable no puede ser explicada en la mayoría de los casos (véase la Tabla 1) por una modificación o un enmascaramiento de epítopos. En contraposicón a la expresión frecuente de CD44v5 en adenocarcinomas gástricos (Heider et al., 1993), los datos concernientes a la expresión de CD44v5 dentro de los tres grupos de NSHD no eran significativamente estadísticos. El exón vlO es - adicionalmente a los exones v3 y v6 -un exón variable que es expresado constitutivamente en linfocitos (Stauder et al., 1994). Hasta ahora, no se analizó sistemáticamente la expresión de CD44vlO en NHLs, y este exón se detectó raramente en carcinomas (Heider et al., 1996). La presente invención demuestra en el ejemplo de dos anticuerpos diferentes contra CD44vlO (VFF14 y VCFF16) una alta regulación estadísticamente significativa de la expresión de CD44vlO en células HRS de NSHD con una mala prognosis (grupos 2 y 3) . En este caso, los dos anticuerpos específicos del exón vlO mostraron resultados idénticos tanto sobre la superficie como también (y/o) en el citoplasma de las células HRS. La detección de la expresión de CD44vlO con 2 acms diferentes es importante ya que, por ejemplo en el caso de carcinoma de mama, se obtuvieron datos divergentes de diferentes autores que utilizaron diferentes acms de la misma especificidad hacia el exón (Friedrichs et al., 1995, Kaufmann et al., 1995). Para la confirmación ulterior de los soprendentes resultados de los autores de la invención, todos los casos se inmunotiñeron indepdndientemente en otro laboratorio (utilizándose otro método de tinción) con idénticos resultados. ' Los resultados para la expresión de CD44vlO en células HRS de NSHD son los primeros datos que muestran una correlación de la expresión _de CD44vlO con la fase y la prognosis de la enfermedad. Los procedimientos de acuerdo con la invención proporcionan por consiguiente al médico valiosas informaciones de diagnosis y prognosis para la enfermedad en el linfoma de Hodgkin. Además de ello, CD44vlO es una diana molecular adecuada para intervenciones terapéuticas en esta enfermedad. Tabla 1: Reactividad de células HRS Grupo 1 Tabla 2 : Reactividad (%) de CD44vlO (VFF14 y VFF16) y CD44v6 (VFF18) en células HRS de pacientes del Grupo 2 (recidiva) Ejemplo 3: Empleo de RT-PCR especifica de vlO para fines diagnósticos Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con transcripción inversa Cinco casos permitieron el aislamiento de ARNm, y se analizaron adicionalmente mediante reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) . Se aisló 1 µg de ARN total y se transcribió inversamente, tal como se describe en la bibliografía (Günthert et al., 1991). 5 µl de ADNc de cadena primera se amplificaron con Taq-polimerasa (Promega, Madison, EE.UU.) en un volumen de 50 µl utilizándose las condiciones del tampón que eran las aconsejadas por el fabricante. La concentración del cebador ascendió a 0,2 mM. Con el fin de someter a ensayo la calidad y periodicidad de la síntesis de ADNc, se llevó a cabo una GAPDH-PCR con oligonucle?tidos que eran homólogos a las posiciones 8-29 y 362-339 de la secuencia de GAPDH-ADNc publicada (Alien et al., 1987). A una incubación* previa durante 5 min. a 95°C siguieron 25 rondas de amplificación (30 s a 95°C, 1,5 min a 62°C) y un ciclo de extensión de 7 min a 72°C. Después, se analizaron 10 µl de la reacción en un gel de agarosa al 2% y el producto de amplificación se visualizó bajo luz UV, una vez que el gel había sido teñido con bromuro de etidio. Para la amplificación de ADNcs con contenido en CD44vlO se utilizaron los cebadores que eran homólogos al extremo 3' del exón vlO (posiciones 986-1013, Hofmann et al., 1991) y a la región 5' -constante de CD44 (posiciones 513-540, Stamenkovic et al., 1989). Para la amplificación de isoformas con contenido en CD44 estándar se utilizó, en lugar del cebador específico a CD44vlO, un cebador de CD44 3' -constante (posiciones 934-958, Stamenkovic et al., 1989) . Después de 40 ciclos de amplificación (94°C durante 30 s, 62°C durante 1,5 min), se analizaron como antes 10 µl de la mezcla de reacción. Con fines de control se empleó en lugar de ARN agua destilada (control negativo) o un plásmido con contenido en CD44v3-vlO (control positivo, Heider et al., 1996).

En los 5 casos en los que fue posible un aislamiento del ARN, el análisis por RT-PCR confirmó la expresión de isoformas de CD44 con contenido en C 44vlO (ya que se trata de muestras sólo recientemente obtenidas, la evolución ulterior de la enfermedad de estos paciente no es todavía conocida) . Los fragmentos amplificados corresponden a transcritos de CD44 que presentan la porción constante de CD44 en combinación con el exón vlO variante (banda de 460 pb) o del exón vlO variante más otro exón variante (banda de 660 pb) (figura 3, mitad de la derecha) . Para fines de control, ADNcs paralelos se amplificaron con cebadores que eran específicos para la región 5' y 3' constante de CD44 (figura 3, mitad de la izquierda), obteniéndose una banda dominante de 440 pb que indica la forma estándar de CD44. Los resultados de genética, molecular se correlacionan con los hallazgos inmunohistoquímicos, en donde en todos los 5 casos una elevada proporción de las células HRS (que constituyen menos del 10% del número total de células en una muestra) expresaban CD44vl0, y la mayoría de las células (HRS más células no tumorales) reaccionaban con el anticuerpo anti-CD44s.

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Vriesendorp H M, Morton J D, Quadri S M. Review of five consecutive studies of radiolabeled immunoglobulin therapy in Hodgkin' s Disease. Cáncer Res. (supl.) 55: 5888s-5892s (1995) .

Wang S-M, Chern J-W, Yeh M-Y, Ng J C, Tung E, Roffler S R. Specific activation of glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzyme conjugates for cáncer therapy. Cáncer Res. 52: 4484-4491 (1992) .

Weiner L M, O' Dwyer J, Kitson J, Comis R L, Frankel A E, Bauer R J, Kopnrad M S, Groves E S. Phase I evaluation of an anti-breast carcinoma _monoclonal antibody 260F9-recombinant ricin A chain immunoconjugate. Cáncer Res. 49: 4062-4067 (1989).

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Weiner L M, Holmes M, Richeson A, Godwin A, Adams G P, HsiehMa S T, Ring D B, Alpaugh R K. Binding and cytotoxicity characteristics of the bispecific murine monoclonal antibody 2B1. J. Immunol. 151 (5): 2877-2886 (1993) .

Wilbur, D. S., Hadley, S. W., Hylarides, M.D., Abrams, P.G., Beaumier, P. A., Morgan, A. C, Reno, J.M., Frtizberg, A. R. Development of a stable radioiodinating agent to label monoclonal antibodies for radiotherapy of cáncer. J. Nucí. Med. 30: 216-226 (1989). Winter, G., Griffith, A. D., Hawkins, R. E., hoogenboom, H.

R. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994).

LISTADO DE SECUENCIAS (1) DATOS GENERALES: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Boehringer Ingelheim International GmbH (B) CALLE: Rheinstrasse (C) LOCALIDAD: Ingelheim (D) PAÍS. Alemania - (E) CÓDIGO POSTAL: 55216 (F) TELEFONO: 06132-77-2770 (G) TELEFAX: 06132-77-4377 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento para la diagnosis y la terapia de linfogranulomatosis (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR: (A) SOPORTE DE DATOS: disco blando (B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) EQUIPO LOGICIAL: Patent In Reléase N° 1.0, Versión N° 1.30 (EPA) (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 204 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE LA CADENA: ambas (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN del genoma (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: exón (B) POSICIÓN: 1 204 (C) DEMÁS DATOS: /producto = "Exón vlO de CD44 humana" /nota = "n° de acceso a la genoteca L05419/ cita = ( [1] ) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 3 203 (x) INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: (A) AUTORES: Screaton, G R Bell, M V Jackson, D G Cornelis, F B Gerth, U Bell, J I (B) TITULO: La estructura genómica de ADN que codifica el receptor director de linfocitos revela al menos 12 exones cortados y empalmados (C) PUBLICACIÓN: Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (D) TOMO: 89 (E) PAGINAS: 12160-12164 ( F) FECHA: Diciembre de 1992 ( G ) RESTOS IMPORTANTES EN SEQ ID NO . 1 : DEL 1 AL 204 ( xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ I D NO : 1 : AT AGG AAT GAT GTC ACÁ GGT GGA AGA AGA GAC CCA AAT CAT TCT GAA 47 Arg Asn Asp Val Thr Gly Gly Arg Arg Asp Pro Asn Hi s Ser Glu 1 5 10 15 GGC TCA ACT ACT TTA CTG GAA GGT TAT ACC TCT CAT TAC CCA CAC AGG 95 Gly Ser Thr Thr Leu Leu Glu Gly Tyr Thr Ser His Tyr Pro His Thr 20 25 30 AAG GAA AGC AGG ACC TTC ATC CCA GTG ACC TCA GCT AAG ACT GGG TCC 143 Lys Glu Ser Arg Thr Phe lie Pro Val Thr Ser Ala Lys Thr Gly Ser 35 40 45 TTT GGA GTT ACT GCA GTT ACT GTT GGA GAT TCC AAC TCT AAT GTC ATT 191 Phe Gly Val Thr Ala Val Thr Val Gly Asp Ser Asn Ser Asn Val Asn 50 55 60 CGT TCC TTA TCA G 204 Arg Ser Leu Ser 65 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 67 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína (ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Arg Asn Asp Val Thr Gly Gly Arg Arg Asp Pro Asn His Ser Glu Gly 1 5 10 15 Ser Thr Thr Leu Leu Glu Gly Tyr Thr Ser His Tyr Pro His Thr Lys 20 25 30 Glu Ser Arg Thr Phe He Pro Val Thr Ser Ala Lys Thr Gly Ser Ph 35 - 40 45 Gly Val Thr Ala Val Thr Val Gly Asp Ser Asn Ser Asn Val Asn Arg 50 55 60 Ser Leu Ser 65 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: cualquier otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG 27 \ 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cualquier otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador de PCR" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: TGATAAGGAA CGATTGACAT TAGAGTTGGA Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito^ la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (16)

1. RE I VI ND I CAC I ONE S 1. Procedimiento para la diagnosis o la terapia de linfomas de Hodgkin (linfogranulomatosis), caracterizado porque este procedimiento se basa en la expresión del exón vlO variante del gen CD44 como marcador molecular.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se basa en la fijación de una molécula de anticuerpo a un epítopo que es codificado por el exón vlO variable del gen CD44.
3. 3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque en este caso se utiliza una molécula de anticuerpo que reconoce la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID NO. 2.
4. 4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la molécula de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab o F(ab')2 de una inmunoglobulina, un anticuerpo producido de forma recombinante, un anticuerpo quimérico humanizado producido de forma recombinante o un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) .
5. 5. Empleo de una molécula de anticuerpo que es específica de un epítopo que es codificado por el exón vlO variante del gen CD44, en un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4.
6. 6. Empleo de una molécula de anticuerpo que es específica para un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos que es codificada por el exón vlO variable del gen CD44 para la terapia de linfomas de Hodgkin (linfogranulomatosis) .
7. 7. Empleo según la reivindicación 6, caracterizado porque la molécula de anticuerpos se fija a la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID NO. 2.
8. 8. Empleo según una de las reivindicaicones 6 ó 7, caracterizado porque la molécula de anticuerpos es un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab o F(ab')2 de una inmunoglobulina, un anticuerpo producido de forma recombinante, un anticuerpo quimérico humanizado producido de forma recombinante o un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) .
9. 9. Empleo según una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la molécula de anticuerpos está enlazada con un isótopo radiactivo, un compuesto radiactivo, una enzima, una toxina, un agente citostático, un profármaco, una citoquina u otro polipéptido in unomodulador .
10. 10. Empleo de una molécula de anticuerpo que es específica para un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos que es codificada por el exón vlO variable del gen CD44, para la preparación de una • composición farmacéutica para la diagnosis y/o terapia de enfermedades tumorales.
11. 11. Empleo según la reivindicación 10, caracterizado porque en el caso de la enfermedad tumoral se trata de un linfoma de Hodgkin (linfogranulomatosis) .
12. 12. Empleo según la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque la molécula de anticuerpo se fija a la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID NO: 2.
13. 13. Molécula de anticuerpo que es específica para un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos, caracterizada porque es codificada por el exón vlO variable del gen CD44, para el empleo farmacéutico.
14. 14. Molécula de anticuerpo según la reivindicación 13, caracterizada porque se fija a la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID NO. 2.
15. 15. Molécula de anticuerpo según la reivindicación 13 o 14, caracterizada porque es un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab o F(ab')2 de una inmunoglobulina, un anticuerpo producido de forma recombinante, un anticuerpo quimérico humanizado producido de forma recombinante o un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) .
16. 16. Molécula de anticuerpo según una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizada porque está enlazada con un isótopo radiactivo, un compuesto radiactivo, una enzima, una toxina, un agente citostático, un profármaco, una citoquina u otro polipéptido inmunomodulador.