MXPA96006108A - Anticuerpos monoclonales contra cd44v6 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo activo contra un epítope codificado por medio de la variante exon v6 del gene CD44. El anticuerpo en cuestión tiene las características superiores a la de los anticuerpos de acuerdo con la técnica anterior y es adecuado para usarse en la terapia y el diagnóstico.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA CD 44v6 DESCRIPCIÓN PE LA INVENCIÓN La invención concierne a un anticuerpo monoclonal contra un epítope que es codificado por el exón v6 variante del gen CD44, así como a moléculas de anticuerpos derivadas del mismo. Recientemente, se demostró que la expresión de variantes de la glicoproteína superficial CD44 es necesaria y suficiente para desencadenar el denominado comportamiento espontáneo metastásico, tanto en una línea de células de adenocarcinoma de páncreas no metas atizante de ratas como también en una línea de células de fibrosarcoraa no metas atizante de ratas (Günthert et al., 1991). Mientras que la isoforma CD44 más pequeña, la forma estándar CD44s (o CD44std), es expresada de forma ubicua en una serie de diferentes tejidos, entre ellos células del epitelio, determinadas variantes de empalme de CD44 (CD44v, CD44var) sólo se expresan en un subgrupo de las células del epitelio. Las variantes de CD44 se crean mediante empalme alternativo, de modo que las secuencias de 10 exones (vl-vlO) en CD44s se separan por completo por corte, pero pueden presentarse en las variantes mayores en diferentes combinaciones (Screaton et al., 1992; Tólg et al., 1993; Hof ann et al., 1991). Las variantes se diferencian en que en un determinado lugar de la porción extracelular de la proteí- REF: 23602 na están insertadas diferentes secuencias de aminoácidos. Variantes de este tipo pudieron ser detectadas en diferentes células tumorales humanas y en tejido tumoral humano. Así, recientemente, se investigó la expresión de variantes de CD44 en el transcurso de la carcinogénesis colo-rectal (Heider et al., 1993a). La expresión de variantes de CD44 falta en el epitelio del colon humano normal, y sólo se puede detectar una débil expresión en las células proliferantes de las criptas. En fases posteriores de la progresión del tumor, por ejemplo en adenocarcinomas, todas las degeneraciones malignas expresan variantes de CD44. La expresión de tejido de CD44 variante a un elevado nivel pudo también demostrarse en linfomas agresivos no de Hodgkin (Koopman et al., 1993). Un papel particular, en particular en la expansión metastásica, parece jugarlo el exón v6 (Rudy et al., 1993). En el modelo con animales, anticuerpos contra epitopes específicos de v6 podían impedir la acumulación de células metastatizantes y el desarrollo de metástasis (Selter et al., 1993). En carcinomas del colon, la expresión de v6 se correlaciona con la progresión del tumor (Wielenga et al., 1993). En carcinomas del estómago, la expresión de v6 es un marcador diagnóstico importante en la diferenciación entre tumores de tipo intestinal y los de tipo difuso (Heider et al., 1993b). La expresión de v6 se midió en los dos trabajos mencionados en último lugar con ayuda de anticuerpos contra epítopes específicos de^vß. Anticuerpos monoclonales contra epítopes, que son codificados por el exón v6, son conocidos en el estado de la técnica (Hofmann et al., 1991; Wielenga et al., 1993). Debido a la elevada utilidad potencial que pueden tener este tipo de anticuexpos en la diagnosis y la terapia, existe una alta demanda de anticuerpos con propiedades mejoradas. Era misión de la presente invención poner a disposición un anticuerpo que presentara propiedades significativamente mejores con respecto a los anticuerpos específicos de v6 conocidos. Este problema se pudo resolver con la presente invención. Esta concierne a un anticuerpo con la denominación VFF-18. La invención concierne, además, a una linea de células de hibridoma que segrega este anticuerpo y que se depositó, bajo el número de depósito DSM ACC2174, en la DSM Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunsch eig, Alemania. En lo que sigue, por las expresiones anticuerpos o moléculas de anticuerpos se entienden no sólo inmunoglobulinas completas, sino también, en relación con la especificidad y afinidad de unión, sustancias equivalentes tales como los derivados de anticuerpos y moléculas de anticuerpos recombinantes descritos. El anticuerpo de acuerdo con la invención se preparó con un procedimiento de acuerdo con el Ejemplo 1. El anticuerpo puede obtenerse, además, a partir de la línea de células de hibridoma depositada. Está en el conocimiento del experto medio en la materia preparar derivados del anticuerpo de acuerdo con la invención o, partiendo de un análisis de la secuencia de este anticuerpo y/o con el empleo de la linea de células de hibridoma que produce este anticuerpo, crear anticuerpos recombinantes con el mismo idiotipo, es decir moléculas de anticuerpo que en la zona del lugar de unión (regiones determinantes de complementariedad, RDC) del antígeno presentan las mismas secuencias de aminoácidos que el anticuerpo VFF-18. Por lo tanto, derivados y moléculas de anticuerpos recombinantes de este tipo están incluidos expresamente en la invención. A partir de la inmunoglobulina completa del anticuerpo VFF-18 pueden producirse por ejemplo fragmentos Fab ó F(ab' )2 u otros fragmentos (Kreitman et al. , 1993) . Para procedimientos diagnósticos, moléculas de anticuerpos VFF-18, fragmentos de los mismos o moléculas de anticuerpos recombinantes con el mismo idiotipo pueden recombinarse, por ejemplo, con isótopos radiactivos, tales como 13lI, U1ln, ""Te, o compuestos radiactivos (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), enzimas, tales como peroxidasa o fosfatasa alcalina (Catty y Raykundalia, 1989), con colorantes fluorescentes (Johnson, 1989) o moléculas de biotina (Guesdon et al., 1979). Para aplicaciones terapéuticas, VFF-18 o moléculas deanticuerpos derivados de VFF-18 pueden enlazarse con toxinas (Vitetta et al., 1991; Vitetta y Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), citostáticos (Schrappe et al., 1992), profármacos (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989) o sustancias radiactivas. Además, el anticuerpo puede estar enlazado con una citocina u otro polipéptido inmunomo-dulador, por ejemplo con el factor de la necrosis de tumores o interleucina-2. El experto en la materia está, además, en situación, después del análisis de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo VFF-18 y/o empleando la línea de células de hibridoma que produce este anticuerpo, en particular la información genética contenida en él, de preparar moléculas de anticuerpos recombinantes con el mismo idiotipo que VFF-18. Procedimientos correspondientes son estado conocido de la técnica. Moléculas de anticuerpos recombinantes de este tipo pueden ser por ejemplo anticuerpos humanizados (Shin et al., 1989; GUssow y Seemann, 1991), anticuerpos bioespecifieos (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989), anticuerpos de cadena sencilla (scFv, Johnson y Bird, 1991), inmunoglobulinas completas o fragmentarias (Coloma et al., 1992; Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992), anticuerpos creados por arrastre de la cadena (Winter et al., 1994). Anticuerpos humanizados pueden prepararse por ejemplo por injerto de RDC (documento EP 0239400). También pueden modificarse regiones del marco (documento EP 0519596). Para la humanización de anticuerpos pueden emplearse hoy en dia métodos tales como PCR (véanse por ejemplo los documentos EP 0368684; EP 0438310; WO 9207075) o el modelado mediante computadora (véase por ejemplo el documento WO 9222653). También pueden prepararse proteinas de fusión, por ejemplo proteinas de fusión de anticuerpos de cadena sencilla/toxina (Chaudhary et al., 1990; Friedman et al., 1993). Por lo tanto, moléculas de anticuerpos de este tipo están asimismo incluidas en la invención. Asimismo, está en el campo del conocimiento del experto medio en la materia determinar el epitope exacto de VFF-18 y preparar, con su conocimiento, anticuerpos equivalentes con la misma especificidad de unión. Esto puede suceder por ejemplo mediante estudios de fijación de péptidos como en el Ejemplo 2, por ejemplo por variación del péptido Huí. Por lo tanto, anticuerpos de este tipo están incluidos asimismo en la invención. Otro aspecto de la invención es el empleo de VFF-18 o moléculas de anticuerpos derivadas de VFF-18 o equivalentes en la diagnosis y la terapia. Procedimientos diagnósticos pueden ser procedimientos en si conocidos con el empleo de las moléculas de anticuerpo de acuerdo con la invención, por ejemplo inmunoensayos acoplados a enzimas (ELISA, Catty y Raykundalia, 1989), radioinmunoen-sayos (Catty y Murphy, 1989), procedimientos inmunohistoqui-micos (Heider et al., 1993b) o transferencias de Western. Procedimientos de este tipo pueden llevarse a cabo convenientemente con muestras de tejido tomadas del cuerpo o con líquidos corporales, por ejemplo procedentes de biopsias. Las investigaciones pueden realizarse de forma cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa. En este caso pueden emplearse el anticuerpo o las moléculas de anticuerpo, tal como se describió por ejemplo en el estado conocido de la técnica para otros anticuerpos específicos de v6 (documento WO 9500851), significando las propiedades ventajosas del anticuerpo de acuerdo con la invención o de las moléculas de anticuerpo de acuerdo con la invención una mejora significativa de tales procedimientos. Junto a la diagnosis in vitro, las moléculas de anticuerpo de acuerdo con la invención son también adecuadas para la diagnosis in vivo, en especial de tumores. Si la molécula de anticuerpo porta una marca detectable, se puede efectuar una detección de la marca para fines diagnósticos, por ejemplo para la visualización del tumor in vivo ( formación de imágenes) o, por ejemplo, para la cirugía ayudada por radio (cirugía radioguíada) . Para la utilización de anticuerpos conjugados con isótopos radiactivos para la escintigrafia inmunológica (formación de imágenes) existe por ejemplo una serie de protocolos en base a los cuales el experto en la materia puede realizar la invención (Siccardi et al., 1989; Keenan et al., 1987; Perkins y Pimm, 1992; Colcher et al., 1987; Thompson et al., 1984). Una aplicación terapéutica puede realizarse por ejemplo análogamente al empleo del anticuerpo ASML1.1 (Seiter et al. , 1993). En este caso, la aplicación puede realizarse sistémica o tópicamente, por ejemplo por inyección/infusión intravenosa (en forma de bolo o infusión permanente), intraperitoneal, intramuscular, subcutánea u otra. También pueden perfundirse órganos o miembros individuales. Protocolos para la administración de anticuerpos conjugados o no conjugados (ya sea en forma de inmunoglobulinas completas, fragmentos, moléculas quimeras recombinantes o similares) son estado conocido de la técnica (Mulshine et al., 1991; Larson et al., 1991; Vitetta y Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992; Press et al., 1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982). Las propiedades superiores de VFF-18 con respecto a otros anticuerpos anti-DC44v6 las muestran los Ejemplos 2 a 4.

Dibujos Figura 1: representación esquemática de la proteina de fusión GST-CD44(v3-vlO). GST - glutation-S-transferasa de Schistosoma japonicum. v3-vl0 » inserción variante de CD44 de queratinocitos. La flecha marca un lugar de disociación de trombina. Figura 2: Comparación de la secuencia del exón v6 del gen CD44 entre el hombre y la rata. Las secuencias de los péptidos Ral y Huí, a los que se unen los anticuerpos 1.1ASML (CD44v6 anti-rata) y VFF-18 (CD44v6 anti-humano), están resaltadas con negrillas. Aminoácidos idénticos están caracterizados por un asterisco. Figura 3: Unión de anticuerpos específicos de CD44v6 a péptidos sintéticos. La unión de los anticuerpos a los péptidos se determinó en un ELISA en el que se inmovilizaron los péptidos y después se incubaron con soluciones de anticuerpos. Después de las correspondientes etapas de lavado, el anticuerpo fijado se detectó con anticuerpos de IgG anti-ratón conjugados con peroxidasa. (A): En el primer experimento se determinó la unión del anticuerpo l.l.ASML, especifico de CD44v6 de ratas, al péptido Ral (KWFEN EWQGK NPPT). (B): En un segundo ensayo se sintetizó a partir de la secuencia de CD44v6 humana un péptido homólogo a Ral. Diferentes materiales sobrenadantes de hibridoma de CD44v6 anti-humanos se fijaron a este péptldo Huí (QWFGN RWHEG YRQT). En este caso, se demuestra que VFF-18 se une esencialmente mejor al péptido que los restantes anticuerpos empleados. (C): Para una evaluación cuantitativa, este experimento se repitió con diferentes concentraciones de anticuerpos purificados. También aqui se demuestra que VFF-18 presenta una mayor afinidad de unión que los otros anticuer- 5 pos. Figura 4: Unión de anticuerpos radiactivamente marcados a células tumorales. Los tres anticuerpos VFF-7 (anti-v6), VFF-18 (anti-v5) y VFF-18 (anti-v6) se marcaron radiactivamente con N-succinimil[2, 3-3H]propionato y se emplearon para 1S " ensayos de unión a diferentes lineas de células tumorales. En este caso, se utilizaron las siguientes lineas de células: CH0-CD44var: línea recombinante de células de hámster (ovario del hámster chino) , que expresa en la superficie CD44 variante humano (exones v3-vl0); HCT-116, CX-1, HT-29, CaCo, COLÓ i5 206: lineas de carcinoma de colon humanas; A431: linea de carcinoma del epitelio plano humano. Se muestra la unión especifica de los anticuerpos a las diferentes lineas de células. Mientras que la unión de los anticuerpos VFF-7 y VFF-18, específicos de v6, a la linea de células recombinante CHO-CD44var está situada en el mismo orden de magnitud, los anticuerpos muestran un comportamiento de unión muy diferente en las lineas de células tumorales. En algunos casos, se observa sólo una unión de VFF-18 y, en menor medida, una unión de VFF-8 (HT-29, CaCo, COLÓ 205) y en otras lineas de células, VFF-18 se fija esencialmente mejor que VFF-7. Figura 5: Detección de variantes CD44 solubles, que contienen el exón v6, en suero normal humano. En un ELISA de emparedado se emplearon, en calidad de anticuerpos de revestimiento, los tres anticuerpos VFF-4, VFF-7 ó VFF-18 específicos de v6. En los tres casos, se utilizó como anticuerpo de detección un anticuerpo especifico CD44std conjugado con peroxidasa (BU-52, std - estándar). En estos ensayos ( ( (A) y (B) ) se muestra la señal de dos sueros normales humanos diferentes a diferentes diluciones. En ambos casos, con VFF-18 se observa una señal esencialmente más intensa que con los otros dos anticuerpos. Figura 6: Valores de suero de variantes de CD44 con contenido de v6. Con dos ELISAs diferentes se determinó el contenido de CD44var soluble en sueros de 6 donantes sanos. En este ensayo, se utiliza como anticuerpo de revestimiento VFF-7 y en otro, VFF-18; ambos anticuerpos reconocen el exón v6. En calidad de preparado comparativo servia en ambos casos una variante de CD44 soluble recombinante, preparada en células CHO (exones v3-vl0). El ELISA con VFF-18 muestra, en promedio, valores 3,5 veces más elevados que el ELISA con VFF-7. Esto significa que el CD44var soluble que se presenta en el suero es reconocido mejor por VFF-18 que por VFF-7.

Ejemplos Ejemplo 1 : Preparación del anticuerpo monoclonal VFF- 18 Clonación de proteinas de fusión pGEX Toda la región variante del tipo HPKII de CD44v (Hofmann et al., 1991) se amplificó a partir de ADNc de queratinocitos humanos por reacción en cadena de polimerasa ( PCR) . Los dos cebadores de PCR 5 ' -CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3 • , posiciones 25-52, y 5 ' -TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3' , posiciones 1013-984 de la región variante de LCLC97, tal como se describe por Hofmann et al, contenían un lugar de reconocimiento Ir*' de EcoRI que se utilizó para clonar el producto de PCR directamente en el vector pGEX-2T (Smith et al., 1988). La construcción resultante (pGEX CD44v HPKII, v3-vl0) codifica una proteína de fusión de - 70 kD, consistente en glutation-S- -transferasa de Schistosoma japonicum y los exones v3-vl0 de CD44 humana (figura 1; Heider et al., 1993a). La proteina de fusión se expresó en E. coli y a continuación se purificó por afinidad a través de glutation-agarosa (Smith et al., 1988).

Inmunización y evaluación 0 Ratones hembras Balb/c se inmunizaron intraperitonealmente con la proteína de fusión purificada por afinidad según el siguiente esquema: la inmunización: 90 µg de proteina de fusión en coadyuvante de Freund completo 5 2a y 3a inmunizaciones: 50 µg de proteína de fusión en coadyuvante de Freund incompleto.

Las inmunizaciones se realizaron a intervalos de en cada caso 4 semanas. 14 días después de la última inmunización, los animales se inmunizaron todavía en tres días consecutivos en cada caso con 10 µg de proteína de fusión en PBS. Al día siguiente, células del bazo de un animal con un alto titulo de anticuerpos se fusionaron con células de mieloma de ratón P3.X63-Ag8.653 con ayuda de polietilenglicol 4000. Las células de hibridoma se seleccionaron entonces en placas de ?<* microtitulación en medio HAT (Kóhler y Milstein, 1975; Kearney et al., 1979). La determinación del titulo de anticuerpos en el suero o la evaluación de los materiales sobrenadantes de hibridoma se llevó a cabo con ayuda de un ELISA. En este ensayo se 5 revistieron primeramente placas de microtitulación con proteína de fusión (GST-CD44v3-10) o sólo con glutation-S- - ransferasa. A continuación, se incubó con diluciones en serie de muestras de suero o materiales sobrenadantes de hibridoma y los anticuerpos específicos se detectaron con 0 anticuerpos contra inmunoglubulina de ratón conjugados con peroxidasa. Los hibridomas, que sólo reaccionaban con glutation-S-transferasa, se desecharon. Los restantes anticuerpos se caracterizaron primeramente en un ELISA con proteínas de fusión especificas del dominio (exón v3, exón v5 5 + v6, exón v6 + v7, exón vß-vlO) (Koopman et al., 1993). Su reactividad inmunohistoquimica se sometió a ensayo en cortes de la piel humanos. El anticuerpo VFF-18 se identificó luego a través de la unión al péptido sintético Huí (QWFGN RWHEG YRQT ) . La secuencia de Huí es un fragmento del exón v6 de CD44 humana.

Ejemplo 2: Fijación de anticuerpos específicos de CD44v6 a péptidos sintéticos La fijación de anticuerpos específicos de CD44v6 a péptidos sintéticos se determinó en un ELISA.

Soluciones: Tampón de revestimiento: carbonato de sodio 0,05M, pH 9,6 Tampón de ensayo: PBS (solución salina tamponada con fosfato) BSA al 0,5% (albúmina de suero bovino) Tween 20 al 0,05% Solución de sustrato: razón social Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg MD, EE.UU; sustrato de peroxidasa TMB: solución de peroxidasa B (H202) 1:1 Los péptidos (50 µg/ml en tampón de revestimiento) se inmovilizaron durante una noche a 4QC en inmunoplacas NUNC Maxisorp (1.1ASML) o placas Acti-A de la razón social Bio Products (anticuerpos VFF). En el caso de las placas Acti-A, el péptido se une covalentemente a la placa. A continuación, se lavó con PBS/Tween al 0,05%, los lugares de adsorción libres se bloquearon en la superficie de la placa con tampón de ensayo ( 1 hora a temperatura ambiente) y de nuevo se lavaron una vez con PBS/Tweßn 20 al 0,05%. Las placas Acti-A se redujeron después del bloqueo con borohidruro de sodio 10 mM en hidrogenocarbonato de sodio 20 mM, pH 9,0 (sacudir durante 1 hora a temperatura ambiente) y a continuación se lavaron tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05%. Después, se añadieron a los pocilios materiales sobrenadantes de hibridoma o soluciones de anticuerpos en tampón de ensayo en concentraciones entre 0,02 y 10,0 µg/ml y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en un sacudidor de placas. A continuación, se llevaron a cabo tres etapas de lavado con PBS/Tween 20 al 0,05%. Después se añadieron 100 µl/pocilio de anticuerpos IgG anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante en una dilución adecuada en el tampón de ensayo. Después de incubación durante dos horas a temperatura ambiente en el sacudidor de placas, se lavó tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05% y se tiñó con solución de sustrato. Después de un desarrollo durante 10-15 min, se detuvo con ácido sulfúrico 2M y la absorción se midió a 450 nm (referencia 690 mm) en el fotómetro. En un primer experimento, se determinó la unión del anticuerpo 1.1ASML especifico de CD44v6 de ratas al péptido Ral (KWFEN EWQGK NPPT) (Tabla 1, figura 3 (A)).

Tabla 1 En otro ensayo se sintetizó un péptido homólogo de Ral de la secuencia CD44v6 humana (Huí, QWFGN RWHEG YRQT). Diferentes anticuerpos CD44v6 anti-humanos se unieron a Huí. En este caso se demuestra que VFF-18 presenta una afinidad de unión sorprendentemente más elevada que todos los otros anticuerpos empleados (Tabla 2, figura 3, (B)).

Tabla 2 Para la evaluación cuantitativa se fijaron al péptido Huí además anticuerpos CD44v6 anti-humanos purificados en diferentes concentraciones. También aqui se demuestra la afinidad de unión claramente mejorada en comparación con los otros anticuerpos (Tabla 3, figura 3 (C)).

Tabla 3 Ejemplo 3: Fijación de anticuerpos específicos de CD44v6, radiactivamente marcados, a lineas de células tumorales Marcación radiactiva de los anticuerpos N-succinimidil-[2, 3-3H] -propionato 1 mCi ([3H]-NSP, Amersham 1 mCi/ml ) se concentraron por evaporación hasta casi la sequedad en un tubito de muestras siliconizado a OQC en el vacío del chorro de agua. Se añadieron 15 µg de anticuerpo (1 mg/ml en PBS, pH 7,4) y se incubaron durante 48 horas a 4QC. A continuación, se recogió [3H]-NSP en exceso por reacción con 30 µ1 de 1 M Glicina en PBS (20 minutos a temperatura ambiente). La separación del anticuerpo marcado de [ 3H] -glicina se llevó a cabo con una columna de Sefadex-V-25- (volumen de columna 15ml), en donde se usó PBS/BSA al 0.5% como tampón. El anticuerpo marcado [ 5H]- aparece en el volumen de justificación se determinó la cantidad de anticuerpos en una ELISA para detectar inmunoglobulina de ratones y se calculó la actividad específica. Enlace de los anticuerpos marcados en células tumorales. Los tres anticuerpos VFF-7 (anti v6), VFF-8 (anti v5) y VFF-18 (anti v6) se marcaron con N succinimidil-[2,3- 5H] propionato radioactivo y se emplearon en diferentes células tumorales para pruebas de enlace. Allí se utilizaron las siguientes líneas de células CHO-CD44var, línea de células de hámster recombinadas (ovario de hámster chino) que expresa en la superficie la vrariante humana CD44 (Exon v3-v10); HCT-116, CX-1 , HT-29, CaCo, COLÓ 205; Líneas de carcinoma de colon humano; A431 ; línea de carcinoma de epitelio plano humano. Las células se pusieron en placas de cultivo de tejido de 12 agujeros, se incubaron durante la noche a 37°C en una incubadora, en seguida se lavaron una vez con PBS y se fijaron con etanol (1 min a temperatura ambiente). Después, se lavó una vez con medio de cultivo (RPMI 1640/suero de ternero fetal al 10%) y se unió el anticuerpo radiactivo (250.000 dpm/cavidad en el medio de cultivo). Después de una incubación de 25 horas a temperatura ambiente en el sacudidor de placas, se lavó tres veces con PBS/BSA al 0,5%, las células se solubilizaron con NaOH 0,1 M/Triton X- -100 al 1% y se midió la radiactividad en el contador de centelleo. La unión no especifica se determinó en presencia de un exceso de 100 veces de anticuerpo no marcado. La unión se refirió al número de células unitario (400.000 células). Después de la determinación de la actividad específica de los anticuerpos, la cantidad unida de anticuerpos se puede 5 expresar en fmol. La Tabla 4 y la figura 4 muestran la unión especifica de los anticuerpos a las distintas lineas de células. Mientras que la unión de los anticuerpos VFF-7 y VFF-18 específicos de v6 a la linea de células recombinante CH0-CD44var es casi 0 igual, los anticuerpos en. las lineas de células tumorales muestran un comportamiento de fijación muy diferente. En algunos casos, se observa sólo una unión de VFF-18 y, en menor medida, de VFF-8 (HT-29, CaCo, COLÓ 205) y en las otras lineas de células, VFF-18 se une esencialmente mejor que 5 VFF-7.

Tabla 4 Ejemplo 4: ELISA para la determinación en suero de CD44v6 soluble Soluciones: Tampón de revestimiento: carbonato de sodio 0,05 M, pH 9,6 Tampón de ensayo: PBS ( solución salina tamponada con fosfato) BSA al 0,5% (albúmina de suero bovino) Tween 20 al 0,05% Diluyente de la muestra: razón social Bender MedSystems, Viena, Austria Solución de sustrato: : razón social Kierkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg MD, EE.UU; sustrato de peroxidasa TMB: solución B de peroxidasa (H202) 1:1 Placas de microtitulación (Nunc-Immunoplate MaxiSorp F96) se revistieron con 5 µg/ml de uno de los anticuerpos específicos de CD44v6 ( incubación a 4QC durante una noche) . A continuación, se lavó con PBS/Tween al 0,05%, los lugares de adsorción libres se bloquearon en la superficie de las placas con tampón de ensayo (durante 1 hora a temperatura ambiente) y de nuevo se lavaron una vez con PBS/Tween 20 al 0,05%. Las muestras de suero se diluyeron entonces previamente al menos en la relación 1:5 en el diluyente de muestras y se continuaron diluyendo en diluciones en serie de 1:2 en la placa en el diluyente de muestras. A continuación, se añadieron 50 µl/cavidad con anticuerpos anti-CD44std conjugados de peroxidasa de rábano picante (clon BU-52, The Binding Site, Birmingham) en una dilución adecuada (1:3.000 -1:10.000) en el tampón de ensayo. Después de incubación durante tres horas a temperatura ambiente en el sacudidor de placas, se lavó tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05% y se tifió con solución de sustrato. Después del desarrollo durante 10-15 min, se detuvo con ácido sulfúrico 2M y se midió en el fotómetro la absorción a 450 nm (referencia 690 nm). Para la cuantificación, se dispuso una dilución en serie en el tampón de ensayo de un preparado estándar de CD44 soluble paralelamente a las muestras de suero. Este preparado se purificó a partir de un material sobrenadante de células de hámster recombinantes (CHO), que expresan CD44v3-vlO soluble. En el caso de CD44v3-vlO se trata de una variante de CD44 humana que contiene las secuencias de péptidos codificadas por los exones v3 a vlO. La Tabla 5 y la figura 5 muestran la detección de variantes de CD44 solubles, que contienen el exón v6, en suero normal humano. En un ELISA de emparedado, los tres anticuerpos VFF-4, VFF-7 ó VFF-18, específicos de v6, se emplearon como anticuerpos de revestimiento. En los tres casos se utilizó como anticuerpo de detección un anticuerpo específico de CD44std conjugado con peroxidasa (BU-52, std -estándar) . En estos ensayos se muestra la señal de dos sueros normales humanos diferentes a distintas diluciones. En ambos casos ((A) y (B)), con VFF-18 se observa una señal esencialmente más intensa que con los otros dos anticuerpos.

Tabla 5 A Suero 1 Tabla 5 B Suero 2 La Tabla 6 y la figura 6 muestran valores del suero de variantes de CD44 con contenido de v6. Con dos ELISAs diferentes se determinó el contenido de CD44var soluble en sueros de 6 donantes sanos. En este ensayo se utilizó VFF-7 y en el otro VFF-18 como anticuerpos de revestimiento; ambos anticuerpos reconocen al exón v6. Como preparado comparativo servía en ambos casos una variante de CD44 soluble recombinante, preparada en células CHO (exones v3-vl0). El ELISA con VFF-18 muestra en promedio valores 3,5 veces más elevados que el ELISA con VFF-7. Esto significa que el CD44var soluble que se presenta en el suero, en comparación con la proteina recombinante, es reconocido mejor por VFF-18 que por VFF-7.

Tabla 6 Bibliografía Barbas C F, Bjórling E, Chiodi F, Dunlop N, Cababa D, Jones T M, Zebedee S L, Persson M A A, Nara P L, Norrby E, Burton D R. Recombinant human Fab fragments neutralize type 1 immunodeficiency virus in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 9339-9343 (1992). Breitz H B, Weiden P L, Vanderheyden J-L, Appelbaum J W, Bjorn M J, Fer M F, Wolf S B, Ratcliff B A, Seiler C A, Foisie D C, Fisher D R, Schroff R W, Fritzberg A R, Abrams P G. Clinical experience with rhenium-186-labeled monoclonal antibodies for radioimmunotherapy: results of phase I triáis. J. Nucí. Med. 33: 1099-1112 (1992). Catty, D., Raykundalia, C. ELISA and related immunoassays. En: Catty, D (ed.). Antobodies vol. II IRL Press Oxford (1989), 97-152, véanse las págs. 105-109. Catty, D., Murphy, G. Immunoassays using radiolabels. En: Catty, D (ed.). Antobodies vol. II IRL Press Oxford (1989), 77-96. Chatal J-F, Saccavini J-C, Gestin J-F, Thédrez P, Curtet C, Kremer M, Guerreau D, Nolibé D, Fumoleau P, Guillard Y. Biodistribution of indium-111-labeled OC 125 monoclonal antibody intraperitoneally injected into patients operated on for ovarían carcinomas. Cáncer Res. 49: 3087-3094 (1989).

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PROTOCOLO DE SECUENCIA "''!] DATOS GENERALES: , i) SOLICITANTE: .a NOMBRE: Boehnnger Ingelheim International GMBH CB] CALLE: Binger Str. f 1 ] CIUDAD: Ingeiheim [E] FÍ IS: Alemania CF] CÓDIGO POSTAL: 55216 CG] TELEFONO: 06132-772770 CH] T?LEFAX: 06132-774377 [A] NOMBRE: Dr. Günther Adolf CB] CALLE: Stiftgasse 15-17/10 CC] CIUDAD: Viena CS] PAÍS: Austria CF] CÓDIGO POSTAL: A-1Ü7Ü f QÍ CA] NOMBRE: Dr. Erik Patzelt CB] CALLE: Hans-Buchmueller-Gasse 8 CC] CIUDAD: Punkersdorg CE] PAÍS: Austria CF] CÓDIGO POSTAL: A-3002 i ?i) NOMBRE DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos monoclonales contra CD44v6 i iii) NUMERO DE LAS SECUENCIAS: 6 5 (iv) EDICIÓN PARA COMPUTADORA: CA] PORTADOR DE DTAOS: Disco floppy CB] COMPUTADORA: compatibles IBM PC Í C ] SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS/DOS CD] SOFTWARE: PatentIn Reléase tfl.O, Versión #1.30 (EPA) í í ] DATOS SOBRE SEQ ID no. 1: ii) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: C ] LONGITUD: 27 pares de base CB] TIPO: Nucleótidos 0 CC] FORMA DE LA TIRA: Tira simple CD] TOPOLOGÍA: lineal iii) TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos CA] DESCRIPCIÓN: /desc = "Primario PCR" .?i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO: 1: CAJGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG ¿ ¡ DATOS SOBRE LA SEC ID no. 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 CA] LONGITUD: 30 pares de base CB] TIPO: Nucleótidos iC ] FORMA DE LA TIRA: Tira simple CD] TOPOLOGÍA: lineal vil) TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos CA] DESCRIPCIÓN: /desc = "Primario PCR" txu DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO: 2: TGATAAGGA CGATTGACAT TAGAGTTGGA i 2) DATOS SOBRE LA SEC ID no. 3: r' i i) CARACTERÍSTICAS DE LA. SECUENCIA: Í-Aj LONGITUD: 14 aminoácidos [?] TIPO: aminoácidos C FORMA DE LA TIRA: Tira simple [D] TOPOLOGÍA: lineal ??i) TIPO D? MOLÉCULA: peptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO: 3: Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr 1 5 10 .2) DATOS SOBRE LA SEC ID no. 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: CA] LONGITUD: 14 aminoácidos CB] TIPO: aminoácidos CG] FORMA DE LA TIRA: Tira simple CD] TOPOLOGÍA: lineal vil» TIPO DE MOLÉCULA: peptido (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO: 4: Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr 1 5 10 .2) DATOS SOBRE LA SEC ID no. 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: CA] LONGITUD: 42 aminoácidos CB] TIPO: aminoácidos Í ] FORMA DE LA TIRA: Tira simple [D] TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptido ixi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO: 5: Frp rtla Asp Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Ala Ala Thr Gln 1 5 10 Lys Glu Lys Trp Phe Glu Trp Gln Gly Lys Asn Pro Pro Thr 20 25 Pro Thr Pro Ser Glu Asp Ser His Val Thr Glu Gly Thr Thr U 35 ' 40 i ¿ , DATOS SOBRE LA SEC ID no. 6: (i. CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: CH] LONGITUD: 43 aminoácidos CB] TIPO: aminoácidos i l ] FORMA DE LA TIRA: Tira simple CD1 TOPOLOGÍA: lineal .?i, TIPO DE MOLÉCULA: peptido 5 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO: 6: Gin Aia Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Thr Ala Gln 1 5 10 Lys Glu Glu Fen Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln 20 25 Thr Pro arg Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala Ala Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES 1. - Anticuerpos contra un epítope dentro de la secuencia de aminoácidos que es codificada por el exón vd variable del gen CD44, caracterizado porque es el anticuerpo VFF-18 que es formado por la linea de células de hibridoma con el número de depósito DSM ACC2174.
2. 2.- Linea de células de hibridoma con el número de depósito DSM ACC2174.
3. 3.- Molécula de anticuerpo, que se puede obtener por modificación química o enzimática de un anticuerpo según la reivindicación 1.
4. 4.- Molécula de anticuerpo según la reivindicación 3, caracterizada porque es un fragmento de un anticuerpo según la reivindicación 1.
5. 5.- Molécula de anticuerpo según la reivindicación 4, caracterizada porque es un fragmento Fab o un fragmento F(ab' )2.
6. 6.- Molécula de anticuerpo según la reivindicación 3, caracterizada porque el anticuerpo está enlazado con otra molécula.
7. 7.- Molécula de anticuerpo según la reivindicación 6, caracterizada porque la otra molécula es un polipéptido.
8. 8.- Molécula de anticuerpo según una de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizada porque está enlazada con un isótopo radiactivo.
9. 9.- Molécula de anticuerpo recombinante con el idiotipo de un anticuerpo según la reivindicación 1.
10. 10.- Molécula de anticuerpo recombinante según la reivindicación 9, caracterizada porque es una molécula de anticuerpo quimera, humanizada, de cadena sencilla o creada por arrastre de la cadena.
11. 11.- Molécula de anticuerpo recoptbinante según la reivindicación 9 o 10, caracterizada porque está enlazada con otra molécula o con un isótopo radiactivo.
12. 12.- Molécula de anticuerpo que reconoce el mismo epitope que el anticuerpo según la reivindicación 1.
13. 13.- Empleo de un anticuerpo o molécula de anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 o 3 a 12, en procedimientos diagnósticos fuera del cuerpo humano o animal.
14. 14.- Empleo según la reivindicación 13, caracterizado porque el procedimiento es un inmunoensayo acoplado con enzimas o un radioinmunoensayo.
15. 15.- Empleo según la reivindicación 13, caracterizado porque el procedimiento es un procedimiento inmunohistoquími-co.
16. 16.- Anticuerpo o molécula de anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 o 3 a 12 para su empleo farmacéutico.
17. 17.- Empleo de un anticuerpo o una molécula de anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 o 3 a 11 para la preparación de un agente' para la diagnosis in vivo.