NO319903B1 - Anvendelse av et antistoffmolekyl for fremstilling av et farmasoytisk preparat for behandling av plateepitelkarsinom. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører anvendelse av et antistoffmolekyl for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av plateepitelkarsinomer. Det beskrives fremgangsmåter for diagnostisering og behandling av plateepitelkarsinomer som beror på ekspresjonen av CD44-genets variable exon v6, midler for slike fremgangsmåter samt deres anvendelse.

Det er nylig vist at ekspresjonen av varianter av overflate-glykoproteinet CD44 er nødvendig og tilstrekkelig til å utløse såkalte spontane metastatiske forhold både i en ikke-metastaserende pankreas-adenokarsinom-cellelinje hos rotte og en ikke-metastaserende fibrosarkom-cellelinje hos rotte (Gunthert eta!., 1991). Mens den minste CD44-isoform, standardformen CD44s, uttrykkes ubikvitært i en rekke forskjellige vev, herunder epitelceller, uttrykkes bestemte spleisevarianter av CD44 (CD44v) bare i en undergruppe av epitelceller. CD44-isoformene dannes ved alternativ spleising slik at sekvensen på 10 exoner <vl-v10) i CD44s snittes fullstendig ut, men i de større variantene likevel kan forekomme i forskjellige kombinasjoner (Screaton et al., 1992; Heider et al., 1993; Hofmann era/., 1991). Variantene adskiller seg fra hverandre ved at det på bestemte steder av den ekstracellulære del av proteinet er satt inn forskjellige aminosyresekvenser. Slike varianter kan påvises i forskjellige humane tumorceller og i humant tumorvev. Således er ekspresjonen av CD44-varianter i det kolorektale karsinogeneseforløp nylig undersøkt (Heider etat., 1993). Ekspresjonen av CD44-varianter mangler i normalt humant kolon-epitel, og det kan kun påvises en svak ekspresjon i kryptenes prolifererende celler. I senere stadier av tumorutviklingen, f.eks. i adenokarsinomer, uttrykker alle maligne misdannelser varianter av CD44. Dessuten er det nylig påvist ekspresjon avCD44-spleisevarianter i aktiverte lymfocytter, samt i non-Hodgkin-lymfomer (Koopman et ai, 1993).

Det er publisert forskjellige forsøk på å gjøre bruk av ekspresjonsforskjellene av exonvarianter t CD44-genet i svulster og normalvev til diagnostiske og terapeutiske fremgangsmåter (WO 94/02633, WO 94/12631, WO 95/00658,

WO 95/00851, EP 0531300).

Også ekspresjonen av varianter av CD44-molekyler i plateepitelkarsinomer er allerede undersøkt. Salmi et al., (1993) fant således med det v6-spesifikke antistoff Var3.1. en reduksjon i v6-ekspresjonen i tumorceller sammenlignet med normal-celler. Brooks et al., (1995) oppnådde en heterogen (arving av nasofaryngeale karsinomer med det v6-spesifikke antistoff 11.9. Bare i 2 av 12 tilfeller ble det oppnådd en sterk farving, mens det i de fleste av tilfellene immunhistologisk bare kunne påvises en svak fokal v6-ekspresjon.

Foreliggende oppfinnelses oppgave har vært å utvikle nye fremgangsmåter for diagnostisering og terapi av plateepitelkarsinomer, samt tilveiebringelse av midler for slike fremgangsmåter.

Denne oppgave lot seg løse gjennom foreliggende oppfinnelse slik den -er definert i kravene 1-4. Det beskrives fremgangsmåter for diagnostisering og terapi av plateepitelkarsinomer beroende på ekspresjonen av exon-varianten v6 av CD44-genet som hhv. molekylær markør eller mål. Særlig angår foreliggende oppfinnelse anvendelser i forbindelse med den sterke og homogene ekspresjon av v6 i plateepitelkarsinomer og som overraskende nok og i motsetning til hva som tidligere har vært antatt, kunne fastslås. Antistoff-molekyler med tilsvarende spesifisitet egner seg særlig som bærer for selektivt å nå frem til plateepitelkarsinomer in vivo.

Ett aspekt av foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av et antistoffmolekyl som binder seg til aminosyresekvensen WFGNRWHEGYR, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av plateepitelkarsinomer. Særlig foretrukket er en anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse av det monoklonale antistoff BIWA-1 (klon VFF-18) som snittes ut av en hybridomcellelinje som ble deponert 7. juni, 1994, under tilgangsnummeret DSM ACC2174 ved DSM-Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Tyskland (WO 95/33771) eller derivater av dette antistoff.

En annen særlig foretrukket anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse er en anvendelse hvor antistoffmolekylet er et monoklonalt antistoff, et Fab- eller F(ab')2* fragment av et immunglobulin, et antistoff fremstilt ved rekombinante fremgangsmåter, et kimært eller humanisert antistoff fremstilt ved rekombinante fremgangsmåter, et bifunksjonelt eller et enkeltkjedet antistoff (scFv). ;En ytterligere særlig foretrukket anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse er en anvendelse ifølge ett av kravene 1 til 3, hvor antistoffmolekylet er forbundet med en radioaktiv isotop, en fotoaktiverbar forbindelse, en radioaktiv forbindelse, et enzym, et fluorescensfarvestoff, et biotinmolekyl, et toksin, et cytostatikum, et prodrug, et antistoffmolekyl med en annen spesifisitet, et cytokin eller et annet immunmodulatorisk polypeptid. ;Nuklein- og aminosyresekvensen av exonvarianten v6 i CD44-genet er kjent (Screaton et ai, 1992, Tolg et al., 1993). Eksistensen av degenererte varianter eller allelvarianter har ikke betydning for oppfinnelsens utførelse, og slike varianter er således uttrykkelig inkludert. ;Sekvensen av exon v6 i det humane CD44-gen er: ;;Oppfinnelsen kan gjennomføres med polyklonale eller monoklonale antistoffer som er spesifikke for en epitop som kodes av exon v6, spesielt en epitop innenfor aminosyresekvensen WFGNRWHEGYR. Fremstillingen av antistoffer mot kjente aminosyresekvenser kan foretas i henhold til kjente metoder {Catty, 1989). Eksempelvis kan et peptid med denne sekvens fremstilles syntetisk og anvendes som antigen i henhold til en immuniseringsprotokoll. En annen måte er fremstillingen av et fusjonsprotein som inneholder den ønskede aminosyresekvens, hvor en nukleinsyre (som kan fremstilles syntetisk eller ved PCR (polymerasekjedereaksjon) fra en egnet probe) som koder for denne sekvens, integreres i en ekspresjonsvektor, og hvor fusjonsproteinet uttrykkes i en vertsorganisme. Det eventuelt rensede fusjonsprotein kan deretter inngå som antigen i en immuniseringsprotokoll, og innskudds-spesifikke antistoffer, eller når det er tale om monoklonale antistoffer, hybridomer, som uttrykker innskudds-spesifikke antistoffer, selekteres ved hjelp av egnede fremgangsmåter. Slike fremgangsmåter er for tiden kjent. Heider et al., ;(1993), 1996a) og Koopman et al., (1993) beskriver således fremstillingen av antistoffer mot epitopvarianter av CD44. ;For anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan det imidlertid også benyttes antistoffmolekyler som er avledet av poly- eller monoklonale antistoffer, f.eks. "Fab-eller F(ab')2-fragmenter av immunglobuliner, rekombinant fremstillede enkeltkjede-antistoffer (scFv), kimære eller humaniserte antistoffer, samt andre molekyler som spesifikt binder seg til epitoper som kodes av exon v6. Av det fullstendige immunglobulin til antistoffet BIWA-1 (VFF-18) eller andre antistoffer, kan det eksempelvis frembringes Fab- eller F(ab')2-fragmenter eller andre fragmenter (Kreitman et ai, 1993). Fagmannen er dessuten i stand til å fremstille rekombinante v6-spesifikke antistoffmolekyler. Spesielt vil fagmannen etter analyse av aminosyresekvensen av antistoffet BIWA-1 (VFF-18) og/eller under anvendelse av den hybridomcellelinje som produserer dette antistoff, spesielt den genetiske informasjon som denne inneholder, kunne fremstille rekombinante antistoffmolekyler med den samme idiotypi som BIWA-1 (VFF-18), dvs. antistoffmolekyler som i området for antigen-bindingssetet (komplementaritetsbestemmende regioner, CDR) oppviser den samme aminosyresekvens som antistoffet BIWA-1 (VFF-18). Tilsvarende fremgangsmåter er idag kjent. Slike rekombinante antistoffmolekyler kan f.eks. være humaniserte antistoffer (Shin et al., 1989; Gussow et Seemann, 1991), bispesifikke eller bifunksjonelle antistoffer (Weiner et ai, 1993; Goodwin, 1989, Featherstone, 1996), "s/nge/-c/7a/n" antistoffer (scFv, Johnson et Bird, 1991), komplette eller fragmentariske immunglobuliner (Coloma et ai, 1992; Nesbit etat., 1992; Barbas ef ai, 1992) eller antistoffer frembragt ved " chain shuffling<*>(Winter ef ai, 1994. Humaniserte antistoffer kan for eksempel fremstilles ved CDR-grafting

(EP 0239400). Også framework-regioner kan modifiseres (EP 0519596;

WO 9007861). For humanisering av antistoffer kan det idag benyttes metoder som PCR (se f.eks. EP 0368684; EP 0438310; WO 9207075) eller datamaskin-modellering (se f.eks. WO 9222653). Det kan også fremstilles og anvendes fusjonsproteiner, eksempelvis "s/ny/e-cr>a/n"-antistoffAoksin-fusjonsproteiner (Chaudhary et ai, 1990; Friedman et ai, 1993). Under samlebegrepene "antistoff" og "antistoffmolekyler" inngår foruten polyklonale og monoklonale antistoffer, også alle de forbindelser som er diskutert i dette avsnitt, så vel som andre forbindelser -som strukturelt lar seg avlede fra immunglobuliner og som lar seg fremstille etter kjente fremgangsmåter.

Med kjennskap til epitopen (sml. Fig. 1, Fig. 4) av BIWA-1 (VFF-18) ligger det likeledes innenfor fagmannens kunnskapsområde å fremstille likeverdige antistoffer med den samme bindingsspesifisitet som kan benyttes i foreliggende oppfinnelse.

For diagnostiske fremgangsmåter kan antistoffmolekyler, fortrinnsvis BIWA-1 - antistoffmolekyler, fragmenter derav eller rekombinante antistoffmolekyler med samme idiotypi, forbindes for eksempel med radioaktive isotoper som 125l,1311,111ln, <99m>Tc eller radioaktive forbindelser (Larson et ai, 1991; Thomas ef ai, 1989; Srivastava, 1988), med enzymer som peroksydase eller alkalisk fosfatase (Catty ef Raykundalia, 1989), med fluorescensfarvestoffer (Johnson, 1989) eller biotinmolekyler (Guesdon ef ai, 1979). For terapeutiske anvendelser kan v6-spesifikke antistoffmolekyler, fortrinnsvis BIWA-1 (VFF-18) antistoffmolekyler eller VFF-18-avledede antistoffmolekyler, f.eks. fragmenter derav eller rekombinante antistoffmolekyler med samme idiotypi, forbindes med radioisotoper som 90Y,<131>1, <186>Re, 18<8>Re, 1<63>Sm, ^Cu, <212>Bi, <213>Bi, <177>Lu (Quadri ef ai, 1993; Lenhard ef ai, 1985; Vriesendorp ef ai, 1991; Wilbur et ai, 1989, Maraveyas etat., 1995a, Jurcic ef Scheinberg, 1994), toksiner (Vitetta ef ai, 1991, Vitetta efThorpe, 1991; Kreitman ef ai, 1993; Theuer ef ai, 1993), cytostatika (Schrappe et ai, 1992), prodrugs (Wang ef ai, 1992; Senter et ai, 1989), fotoaktiverbare substanser (Hemming et al., 1993), et antistoffmolekyl med en annen spesifisitet eller med radioaktive forbindelser. Antistoffmolekylet kan dessuten være forbundet medet cytokin eller et annet immunmodulerende polypeptid, f.eks. med tumornekrosefaktor, lymfotoksin (Reisfeld, et ai, 1996) eller interleukin-2 (Becker et ai, 1996). Antistoffmolekylene kan for anvendelse i et "pretargeting-system" f.eks. også modifiseres med streptavidin eller biotin (Goodwin, 1995).

Ved hjelp av de diagnostiske fremgangsmåter kan prøver fra pasienter, eksempelvis fra biopsier hvor det foreligger mistanke om plateepitelkarsinom, eller hvor denne diagnose allerede foreligger, men hvor svulsten skal karakteriseres mer nøyaktig, undersøkes. Påvisningen av CD44-molekylvarianter som inneholder en aminosyresekvens som kodes av det variable exon v6, kan skje på proteinplanet ved hjelp av antistoffer, eller på nukleinsyreplanet ved hjelp av spesifikke nukleinsyre-prober eller primere for PCR (polymerasekjedereaksjon). Eksempelvis kan vevssnitt undersøkes immunhistokjemisk med antistoffer ved hjelp av i og for seg kjente metoder. Ekstrakter, utvunnet av vevsprøver, eller kroppsvæsker, kan dessuten undersøkes med andre immunologiske metoder under anvendelse av antistoffer, for eksempel ved Western blott, ELISA (enzyme-bundet immunosorbent testanalyser)

(Catty ef Raykundalia, 1989), radioimmunotestanalyser (RIA, Catty et Murphy, 1989) eller beslektede immunoanalyser. Undersøkelsene kan foretas kvalitativt, semikvantitativt eller kvantitativt.

Ved siden av in vitro diagnostikken er antistoffmolekylene med spesifisitet i henhold til oppfinnelsen, også egnet for in vivo diagnostisering av plateepitelkarsinom. Er antistoffmolekylet bærer av en påvisbar merking, kan det foretas en påvisning av merkingen for diagnostiske formål, f.eks. visualisering av svulsten in vivo (avbildning) eller eksempelvis for radioaktivt støttet kirurgi (radioguided surgery). For anvendelsen av antistoffer som er konjugert med radioaktive isotoper, til immunscintigrafi (avbildning) finnes en rekke protokoller som fagmannen kan gjennomføre oppfinnelsen på grunnlag av (Siccardi et ai, 1989; Keenan et al., 1987; Perkins ef Pimm, 1992; Colcher et al. t 1987; Thompson et a/., 1984).

Data oppnådd ved påvisning og/eller kvantifisering av ekspresjonen av CD44-epitopvarianten v6, kan såtedes inngå i diagnosen og prognosen. Kombinasjonen med andre prognostiske parametere som f.eks. tumorgraden, kan herunder være fordelaktig.

Antistoffmolekyler med spesifisiteten ifølge oppfinnelsen, og eventuelt forbundet med et cytotoksisk agens, kan hensiktsmessig anvendes for behandlingen av plateepitelkarsinom. Påføringen kan herunder skje systemisk eller lokalt, eksempelvis ved intravenøs (som bolus eller vedvarende infusjon), intraperitoneal, intramuskulær, subkutan eller lignende injeksjon/infusjon. Protokoller for administrering av konjugerte eller ikke-konjugerte antistoffer (som fullstendige immunglobuliner, fragmenter, rekombinante humaniserte molekyler eller lignende) er idag kjent teknikk (Mulshine ef a/., 1991; Larson ef a/., 1991; Vitetta ef Thorpe, 1991; Vitetta ef a/., 1991; Breitz et al., 1992,1995; Press ef al., 1989; Weiner ef a/., 1989; Chatal ef al., 1989; Sears et al., 1982). En terapeutisk anvendelse kan eksempelvis skje analogt med anvendelsen av antistoffet 1.1ASML (Seifer et ai., 1993). Ikke-modifiserte monoklonale antistoffer kan benyttes direkte terapeutisk når de oppviser en egnet naturlig effektorf unksjon for en cytotoksisk virkning, for eksempel for komplement-indusert eller antistoff-indusert cellulær cytotoksisitet (Riethmuller ef al., 1994). Egnede monoklonale antistoffer for denne anvendelse er mus-antistoff av isotype lgG2a eller antistoff fra human IgGl type. Ikke-modifiserte antistoffer kan dessuten administreres via en anti-idiotypisk mekanisme for å indusere en pasient-egen anti-tumor-reaksjon (Baum ef ai, 1993; Khazaeli et ai, 1994).

En foretrukket terapeutisk anvendelse består i å forbinde et humanisert v6-spesifikt immunglobulin eller et F(ab')2-fragment av dette med <90>Y (Quadri et ai,

1993; Vriesendorp et ai, 1995).<131>i (Maraveyas et ai, 1995a, 1995b; Juweid ef a/., 1995; Press et a/., 1995; Thomas et ai, i: Catty 1985, s. 230-239), <186>Re (Breitz ef ai 1992,1995) eller en annen egnet radioaktiv isotop og benytte denne til radio-immunterapi av plateepitelkarsinomer. For eksempel kan antistoffet BIWA-1, en humanisert versjon av BIWA-1 eller et F(ab')2-frgament av BIWA-1 eller det humaniserte antistoff, forbindes med "Y under anvendelse av en chelat-dannende linker som ITCB-DTPA (isotiocyanat-benzyl-dietylentriaminpentaacetat), hvorved det skulle kunne oppnås en spesifikk aktivitet på 5-20 mCi/mg, fortrinnsvis 10 mCt/mg. Dette agens kan deretter administreres til en pasient med antigen-positiv tumor i en dosering på 0,1 til 1 mCi/kg legemsvekt, fortrinnsvis 0,3 til 0,5 mCi/kg legemsvekt. Er antistoffmolekylet forbundet med<131>1, kan et mulig doseringsskjema ved en spesifikk aktivitet på 2 mCi/mg, f.eks. være 2 x 150 mCi med 6 ukers mellomrom. Fagmannen kan fastsette den maksimalt mulige dosering ved hjelp av i og for seg kjente meteéér-(Maraveyas et ai, 1995a, 1995b). Ved administrering av en total proteinmengde på 2 til 5 mg, kan denne skje i form av en hurtig intravenøs bolusinjeksjon. Ved større proteinmengder kan en infusjon være en gunstigere administrasjonsform. Ved anvendelse av monoklonale antistoffer kan det før administreringen være nødvendig å blande dette agens med et overskudd (f.eks. med et tidobbelt molart overskudd) av det ikke-radioaktive antistoff. I så fall er det bedre å foreta administreringen i form av en intravenøs infusjon, f.eks. i løpet av 15 minutter. Anvendelsen kan gjentas. Terapien kan kombineres med en ekstern strålebehandling. Den kan dessuten suppleres med benmargstransplantasjon, noe som særlig er nødvendig når det ved terapien oppnås en dose på mer enn 1,6 Gy i benmargen.

Antistoffmolekyler kan også benyttes ex wVo til rensing av CD34-positive

stam- og forløper-cellepreparater (Immunopurging). Stråle-behandlingen eller kjemoterapien av plateepitelkarsinomer kan understøttes gjennom autolog benmargstransplantasjon. Det derved appliserte preparat av hematopoietiske stam-og forløper-cejler må være fritt for tumorceller. Dette kan oppnås ved inkubasjon med antistoffmolekyler, eksempelvis antistoff-toksin-konjugater (Myklebust et ai., 1994; DEP 19648209.7).

Antistoffmolekyler kan dessuten innføres i form av rekombinante konstruksjoner i T-cellereseptoren av T-lymfocytter. Slike reprogrammerte T-lymfocytter binder seg selektivt til de antigen-uttrykkende tumorceller og utøver cytotoksisk virkning slik at de kan anvendes til behandling av plateepitelkarsinomer (PCT/EP9604631; Altenschmidt et al., 1996).

Figurer

Fig. 1: Bestemmelse av epitop-spesifisiteten av BIWA-1 gjennom binding til syntetiske peptider som er avledet av den humane CD44v6-sekvens. Det tilsvarende peptid fra rotte-CD44v6 ble testet med antistoffet 1.1ASML Bindingen ble bestemt i en ELISA, idet peptidene ble immobilisert på mikrotiterplater (sml. Heider et al., 1996b, Fig. 2). -: ingen binding, +/-: svak binding, +: sterk binding. Fig. 2: Immunhistokjemisk analyse av et plateephelkarsinom i larynx (a) og en levermetastase av et øsofaguskarsinom (b) med det CD44v6-spesifikke monoklonale antistoff BIWA-1.

I begge tilfeller kan reaktiviteten av antistoffet med tumorcellens membran sees. Originalforstørrelse 40x, kontrastfarving hematoxylin.

Fig. 3: Sammenligning av antigen-bindingen av forskjellige CD44v6-spesifikke mAbs.

Bindingen av fire forskjellige CD44v6-spesifikke mAbs til humane SCC A-431-celler ble målt i en celte-ELISA. mAb BIWA-1 oppviser en høyere affinitet for tumorcellene enn de andre mAbs.

Fig; 4: Forbedret epitop-kartlegging av mAb BIWA-1.

Bindingen av BIWA-1 til forskjellige overlappende syntetiske peptider som strekker seg fra aminosyrene 18-32 i den region som koder for CD44v6, ble målt i en kompetitiv ELISA. Den minimale bindingssekvens (peptid v6 (19-29)) er understreket.

Fig. 5: Biofordeling av <12>SI-BIWA-1 i A-431 xenotransplanterte nakne mus

Akkumuleringen av antistoffet er angitt som %ID/g (middelverdi ±SEM) ved 4, 24,48,120 og 168 timer etter injeksjon.

Eksempler

Eksempel 1: Ekspresjon av CD44v6 i plateepitelkarsinomer

Vev

Tilsammen 126 parafin-innleirede tumorprøver ble immunhistokjemisk undersøkt på ekspresjon av CD44v6 med mAb BIWA-1 (klon VFF-18). Prøvene omfattet 31 tilfeller av primære plateepitelkarsinomer (15 tilfeller larynx, 16 tilfeller hud), 91 tilfeller av lymfeknutemetastaser (larynx, n=38; lunge, n=27; øsofagus, n=11; munnhule, n=11; tonsiller, n=4) og fire tilfeller av levermetastaser (øsofagus).

Antistoff

Hele den varierende region av HPKII-typen av CD44v (Hofmann et al., 1991) ble amplifisert fra human keratinocytt-cDNA ved PCR. Begge PCR-primeme 5'-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3\ posisjonene 25-52, og 5'-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3\ posisjonene 1013-984, av den LCLC97-varierende region, inneholdt som beskrevet av Hofmann et al., et EcøRI-gjenkjenningssete som ble benyttet for direkte å klone PCR-produktet inn i vektoren pGEX-2T (Smith et al., 1988). Den resulterende konstruksjon (pGEX CD44v HPKII, v3-v10) koder for et fusjonsprotein på -70 kD, som består av glutation-S-transferase av Schistosoma japonicum og exonene v3-v10 av humant CD44 (Fig. 1; Heider ef al., 1993). Fusjonsproteinet ble uttrykt i E. colt og deretter affinitetsrenset over glutation-agarose (Smith ef a/., 1988).

Balb/c-hunnmus ble immunisert intraperitonealt med det affinitetsrensede fusjonsprotein i henhold til følgende skjema:

1. Immunisering: 90 ug fusjonsprotein i Freunds fullstendige adjuvans

2. og 3. Immunisering: 50 ug fusjonsprotein i Freunds ufullstendige adjuvans

Immuniseringene skjedde med 4 ukers mellomrom. 14 dager etter den siste immunisering ble dyrene ytterligere immunisert med 10 ug fusjonsprotein i PBS på tre påfølgende dager. Dagen deretter ble mirtceller fra et dyr med høyt antistofftiter fusjonert med P3.X63-Ag8.653-muse-myeldmceller ved hjelp av polyetylenglykol 4000. Hybridomcellene ble deretter selektert i mikrotiterplater i HAT-medium (Kohler ef Milstein, 1.975; Kearney et al., 1979).

Bestemmelsen av antistofftrteret i serum, resp. screeningen av hybridom-supematanten, ble foretatt ved hjelp av en ELISA. Ved denne test ble mikrotiterplater først belagt med fusjonsprotein (GST-CD44v3-10) eller bare med glutation-S-transferase. Deretter ble disse inkubert med seriefortynninger av serumprøver, resp. hybridom-supernatanter, og de spesifikke antistoff påvist med peroksydase-konjugerte antistoff mot mus-immunglobulin. Hybridomer som bare. reagerte med glutation-S-transferase, ble kassert. Gjenværende antistoffer ble deretter karakterisert med domene-spesifikke fusjonsproteiner (exon v3, exon v5 + v6,

exon v6 + v7, exon v8 - v10) ved hjelp av en ELISA (Koopman ef a/., 1993). Deres immunhistokjemiske reaktivitet ble testet på humane hudsnitt.

BIWA-1 (VFF-18; angående fremstilling og egenskaper, se også

WO 95/33771) bandt seg kun til fusjonsproteiner som inneholdt et domene som ble kodet av exonet v6. For å ytterligere avgrense antistoffets epitop, ble forskjellige syntetiske peptider som representerte deler av v6-domenet, benyttet i en ELISA-bindingstest (Fig. 1). Det 14 aminosyrers peptid v6D oppviste den sterkeste binding. Følgelig ligger epitopen av BIWA-1 helt eller delvis innenfor sekvensen QWFGNRWHEGYRQT, domenet som kodes av exon v6. Denne sekvens er homolog med bindingsepitopen til antistoffet 1.1 AS ML, som ble benyttet i en terapeutisk rottemodell, og som er spesifikk for rotte-CD44v6 (Fig. 1).

Immunhistokjemi

Før inkuberingen med primær-antistoffet ble parafinsnitt (4 um) deparafinert tre ganger å 10 minutter i Rotihistol (Roth, Tyskland) og deretter rehydrert i en stigende alkoholrekke. Snittene ble gitt en kort vask med destillert vann, og deretter kokt i 0,01 M Na-citratbuffer i en mikrobølgeovn (Sharp Model R-6270) tre ganger å 10 minutter ved 600Watt. Etter hver mikrobølge-inkubering ble snittene avkjølt i 20 minutter. Etter det siste avkjølingstrinn ble bærerne vasket i PBS og preinkubert med normalt geiteserum (10% i PBS). Etter tre vaskinger i PBS ble snittene inkubert i 1 time med primær-antistoff (BIWA-1:5 ug/mL; mus-IgG (isotype - tilsvarende negativ kontroll) 5 ug/mL i PBS/1% BSA). Som positiv kontroll f or farvereaksjonen ble det benyttet normale humane hudsnitt, da keratinocytter uttrykker en CD44-isoform som inneholder v3-v10. Endogene peroksydaser ble blokkert med 0,3% H202 i PBS, og snittene ble inkubert med det biotinylerte sekundær-antistoff (anti-mus lgG-F(ab')2, DAKO Corp.) i 30 minutter. For farveutvikling ble snittene inkubert i 30 minutter med pepperrot-peroksydase som var koblet til biotin som streptavidin-biotin-peroksydasekompleks (DAKO Corp.). Snittene ble deretter inkubert i 3,3-amino-9-etyl-karbazol-substrat (Sigma Immunochemicals) i 5-10 minutter, hvoretter reaksjonen ble stanset med H20 og snittene kontrastfar<g>et med hematoxylin. Vurderingen av (arvingene ble foretatt med et Zeiss-Axioskop-lysmikroskop, og farveintensitetene kvantifisert på følgende måte: +++, sterk ekspresjon; ++, moderat ekspresjon; +, svak ekspresjon; -, ikke entydig eller ingen påvisbar ekspresjon. Bare tumorceller med en klar membranfarving ble betraktet som positive. Prosentandelen positive tumorceller i hvert snitt ble grovt anslått og det ble opprettet to grupper: fokalt positive tumorer (mindre enn 10% av tumorcellene reagerte med antistoffet) og positive tumorer (10% eller mer av tumorcellene var positive). Når mindre enn 80% av tumorcellene i de positive cellene reagerte med antistoffet, ble det tilsvarende prosenttall angitt.

126 tilfeller av plateepitelkarsinomer av ulik opprinnelse ble analysert med det CD44v6-spesifikke monoklonale antistoff BIWA-1. Ekspresjon av CD44v6-holdige isoformer ble observert i alle tumorprøver unntatt en. Størsteparten av prøvene oppviste en ekspresjon av antigenet på 80-100% av tumorcellene, og f arvingen var begrenset til tumorcellemembranen. Med stromavev, lymfocytter, muskelceller eller endotel, ble det ikke observert noen reaksjon.

For å kvantifisere ekspresjonen av CD44v6-molekyler på disse tumorcellene ble snitt av normal menneskehud farvet parallelt med tumorsnittene. Normale hudkeratinocytter uttrykker høye CD44-isoformspeil og regnes blant de sterkeste CD44v6-uttrykkende normale celler som hittil er beskrevet. Keratinocyttfarvingen ble derfor valgt som referanse og klassifisert som "sterk" (+++) i vårt vurdeirngssystem. I flesteparten av de undersøkte tumorprøvene var farvingen av tumorcellene sammenlignbar, eller endog sterkere, enn farvingen av hudkeratinocytter, og bare få tilfeller oppviste svak (3 tilfeller av fymfeknutemetastaser) eller moderat (2 primærkarsinomer, 10 metastaser) tumorfarving. Farvereaksjonen innenfor et gitt tumorsnitt var meget homogen, idet de fleste av snittets tumorceller oppviste den samme farvingsintensitet. Det ble ikke observert signifikante forskjeller i CD44v6-ekspresjonsmønsteret mellom primærtumorer og metastaser. En detaljert sammenfatning av resultatene er vist i Tabell 1, og eksempler er vist i Fig. 2.

80-100% av tumorcellene reagerte positivt med BIWA-1.1 de tilfeller hvor færre tumorceller reagerte med antistoffet, er det tilsvarende prosenttall angitt.

Eksempel 2: Ekspresjon av CD44v6 i nyrecellekarsinomer, prostatakarsinomer og levermetastaser av kolonkarsinomer

Vev

Det ble analysert 19 tilfeller av nyrecellekarsinomer (12 tilfeller klare celler, 5 tilfeller kromofile, 1 tilfelle kromofob, 1 onkocytom), 16 primære adenokarsinomer av prostata og 19 tilfeller av lymfeknutemetastaser av prostatakarsinomer, samt 30 tilfeller av levermetastaser av kolonkarsinomer.

Antistoff

BIWA-1 (se Eksempel 1)

Immunhistokjemi

Utførelse, se Eksempel 1.

I motsetning til plateepitelkarsinomene kunne det i flesteparten av de undersøkte nyrecelle- og prostatakarsinomer ikke påvises noen, eller bare en fokal, ekspresjon av CD44v6-isoformer. Ved forekomst av en mer enn fokal ekspresjon av prostatakarsinomene, var farvingen overveiende diffus cytoplasmatisk og svakt eller heterogen sammenlignet med farvingen av normalt prostataepitel. 150% av de undersøkte levermetastaser av kolonkarsinomer ble det påvist en mer enn fokal ekspresjon av CD44v6-tsoformer. Farvingen av flesteparten av tilfellene var svak til middels, idet oftest mindre enn 100% av tumorcellene i en prøve oppviste en farving med BIWA-1. En sammenfatning av resultatene er gjengitt i Tabell 2.

Eksempel 3: karakterisering av CD44v6-spesifikke antistoffer

Cellelinje

Den humane SCC-cellelinje A-431 (spontant epidermoid vulva-karsinom) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (Rockwell MD) og dyrket i henhold til produsentens anvisninger. Overflateekspresjonen av CD44v6-holdigé isoformer ble bestemt ved FACS-analyse, idet en FITC-forbundet mAb BIWA-1 ble benyttet.

Analyse av de kinetiske konstanter

Bestemmelsene av affiniteten og kinetikken av den monoklonale antistoff-CD44v6-vekselvirkning ble foretatt ved SPR (Surface Plasmon Resonance), idet det ble benyttet et BIAcore 2000 system (Pharmacia Biocensor). Et glutation-S-transferase-CD44-fus]onsprotein som inneholdt den region som koder for exonet v3-v10 (GST/CD44v3-vtO) ble immobilisert på en CM5 Sensor-Chip, hvorunder aminkoblingsmetoden ble foretatt i henhold til produsentens angivelser. Antistoffer i forskjellige konsentrasjoner (8-132 nM) i HBS (10 mM Hepes, pH 7,4,150 mM natriumklorid, 3,4 mM EDTA, 0,05% BIAcore overflateaktivt P20) ble injisert over den antigen-spesifikke overflate med en strømningshastighet på 5 pl/min. Vekselvirkningen ble tegnet opp som forandring av SPR-signalet. Dissosiasjonen av antistoffene ble observert i bufferstrøm (HBS) i 5 minutter. Chip-overflaten ble regenerert med en enkelt puls av 15 uL 30 mM HCI. Analysé av dataene og beregning av de kinetiske konstantene ble foretatt med Pharmacia Biosensor BIA Evaluation Software, versjon 2.1.

På denne måte ble antigenaffiniteten av BIWA-1 sammenlignet med andre CD44v6-spesifikke mAbs (VFF4, VFF7, BBA-13 (IgGI, R&D Systems, Abingdon, Storbritannia)). Kinetiske konstanter og affinitetskonstanter for de forskjellige antistoffer ble hver gang bestemt i 2 uavhengige forsøk. Tabell 3 viser verdiene for assosiasjonhastighetene (M. dissosiasjonshastighetene (kd) og dissosiasjonskonstanten (Kd) for de 4 mAbs. Alle mAbs viste lignende ka og kd med unntak av BBA-13, som har en 3 ganger lavere ka. og VFF7 som oppviser en signifikant høyere dissosiasjonshastighet (faktor 5) sammenlignet med de øvrige mAbs. Dette resulterer i en lavere bindingsaffinitet for VFF7 og BBA-13 sammenlignet med VFF4 og BIWA-1. BIWA-1 oppviser den laveste Kd av alle undersøkte antistoffer.

Analyse av antistoff-protein-vekselvirkning ved hjelp av ELISA

CD44v6-uttrykkende A-431 -celler ble dyrket i 96-brønns plater (Falcon Microtest 111, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) i et antall på 5 x 10<4> per brønn i RPM11640 med 10% føtalt kalveserum ved 37°C over natten. Etter en vasking med PBS/0,05% Tween 20 ble cellene fiksert med iskald etanol i 1 minutt, hvoretter det fulgte et vasketrinn. Inkubasjonen med primærantistoffene (VFF4, VFF7, BIWA-1, BBA-13,1 ng/mL til 600 ng/mL, hver gang i bestemmelsesbuffer:PBS/0,5% BSA/0,05%Tween 20) foregikk i 1 time ved romtemperatur og ble etterfulgt av 3 vasketrinn. Som sekundærantistoff ble det benyttet et kanin-antimus-lgG-pepperrot-peroksydase-konjugert antistoff (DAKO Corporation, København, Danmark; fortynning 1:6000 i bestemmelsesbuffer) (1 time/RT). Etter 3 vasketrinn ble larveutviklingen foretatt med TMB-løsning (Kirkegaard + Perry, Gaithersburg, USA). Ekstinksjonen ble målt med en Hewlett-Packard ELISA-Reader.

Figur 3 viser at antistoffenes relative affinitet slik de ble bestemt ved BIAcore-analyse, reflekteres gjennom deres vekselvirkning med tumorcellene, idet BIWA-1 klart oppviser den høyeste bindingsaffinitet.

De protein-domener som kodes av CD44-exon v6, består av 45 aminosyrer (Figur 4). For mer presist å definere den epitop som gjenkjennes av BIWA-1, ble det anvendt en rekke syntetiske peptider i ELISA-bestemmelsér. Forutgående forsøk viste en binding til en sentralt lokalisert 14-mer (aminosyrerestene 18-31; Figur 4; sml. også Figur 1), men ikke til peptider utenfor denne region. Det ble derfor syntetisert en annen serie av peptider som ble testet i kompetitive ELISA-bestemmelser (Figur4). Resultatene viserat peptidet 19-29 (WFGNRWHEGYR) representerer den minimalstruktur som fordres for høyaffinitetsbinding. Elimineringen av den C-terminale argininrest ga en mer enn 100 ganger svakere binding.

Eksempel 4: Biofordeling av radiojodert CD44v6-antistoff i nakne mus som var bærer av xenotransplantat

A-431 -xenotransplantat-modell

Åtte uker gamle Balb/c nu/nu nakne hunnmus (B & K Universal, Renton, W A) ble subkutant injisert i den venstre side i midtlinje 5 x 106 dyrkede A-431-celler (humant epidermoid vulva-karsinom). Xenotransplanterte dyr som var bærere av A-431 -tumorer ble benyttet for biofordelingsforsøkene i løpet av 2 uker (tumorvekt 40-50 mg).

Radiojodering av BIWA-1

Protein G-renset mAb BIWA-1 (murin lgG1) ble koblet til streptavidin, idet den heterobifunksjonelle krysslinker succinimidyl-4-(N^maleimido-metyl)cykloheksan-1 - karboksylat ble benyttet. Streptavidin-lysyl-rester ble forbundet med reduserte antistoff-cysteinyl-rester som var frembragt ved ditiotreitol-forbehandling av antistoffet. Oppnådde 1:1-konjugater (>90%) ble renset ved ionebytter-kromatografi. For biofordelingsforsøkene ble BIWA-1 /SA markert via primære aminer av lysin med <125>l, idet det ble benyttet p-jodfenyl-markeringsreagens (PIP; NEN Dupont, Wilmington, DE), etterfulgt av fremgangsmåten til Wilbur ef al., (1989). Markering av BIWA-1 med SÅ eller <126>l endret ikke antistoffets immunreaktivitet eller farmokinetikk i mus.

Biofordelingsforsøk

Nakne mus som var xenotransplantert med humane A-431-tumorer ble intravenøst (i.v.) injisert 5-7 ji Ci <125>l på 50 ug mAb BIWA-1 (spesifikk aktivitet 0,1-0,14 mCi/mg) gjennom den laterale halevene. Tidsforløps-biofordélingsstudierble foretatt i grupper på n=3 dyr per tidspunkt, 4,24,48,120 og 168 timer etter injeksjon. Til utvalgte tidspunkter ble det fra veide mus tatt ut blodprøver via det retro-orbitale plexus og dyrene avlivet ved cervix-dislokasjon. Ni organer og vev, nemlig blod, hale, lunge, lever, milt, mavesekk, nyre, tarm og tumor, ble uttatt og veid. Radioaktiviteten i vev ble tellet i en gamma-scintillasjonsteller (Packard Instrument Company, Meriden, CT) og sammenlignet med standarder av det injiserte antistoffpreparat, hvorunder energivinduet ble innstillet på 25-80 keV for <125>l. Prosentdelen av injisert dose/g av vevet ble beregnet (% ID/g).

Forutgående forsøk hadde vist at BIWA-1 ikke kryssreagerte med murint CD44v6-antigen. Tabell 4 og Figur 5 viser opptaket av radioaktivitet i tumorer og normalvev. Joderte BIWA-1 viste et hurtig tumoropptak (7,6% injisert dose/g fire timer etter injeksjon) som økte til mer enn 18% ID/g ved 48 timer og deretter forble konstant opptil 120 timer. 7 dager etter injeksjon (168 timer) inneholdt svulsten fremdeles 15,3% ID/g vev. Tumorrvev-fprhold ble beregnet for individuelle tidspunkter og er vist i Tabell 4. Ved tidspunktet 24 timer etter injeksjon var tumonblod-forholdet 0,48 og økte til 3,16 på dag 7. Opptak t normalvev var lavt og

var mest sannsynlig forårsaket av blodforråd-bakgrunn i vevsbiopsiene. Selektiv målretting in vivo av humane SCC-xenotransplantater i nakne mus med <12S>l-merkede BIWA-1 viste at disse monoklonale antistoffene oppviser et høyt potensiale som målsøkende bærer for diagnostisk og terapeutisk anvendelse i SCC-pasienter.

Eksempel 5: Ulik ekspresjon av CD44v6 i et stort antall humantumorer

I en utvidet undersøkelse ble i alt 544 tumorprøver undersøkt immunhistokjemisk med det monoklonale antistoff BIWA-1 (klon VFF-18) på ekspresjonen av CD44v6. Prøvene var enten parafin-innleiret eller ble umiddelbart etter kirurgisk uttak nedfrosset i flytende nitrogen og oppbevart ved -70°C inntil anvendelse. Følgende tumorer ble analysert: basaliomer (n=16), adénokarsinomér (AC) i bryst (n=55), AC i kolon (n=83), plateepitelkarsinom (SCC) i hode og hals (n=125), lungekarsinom (n=120), prostata AC (n=34), nyrecellekarsinom (n=27),

SCC i hud (n=15) og AC av mavesekk (n=69). Vevet ble tatt ved rutinekirurgi eller -biopsi, idet normalvev var det vev som ledsaget tumorprøvene. Den immunhistokjemiske undersøkelse ble utført som i Eksempel 1.

Tabell 5 viser en oversikt over den immunhistokjemiske analyse åv 397 forskjellige tumorprøver med mAb BIWA1.

Ved småcellede lungekarsinomer, nyrecellekarsinomer og AC av prostata ble det ikke observert noen eller kun svak reaktivitet. Alle andre undersøkte tumortyper uttrykte CD44v6-hofdige isoformer i forskjellig grad. De fleste av de undersøkte AC fra bryst oppviste reaktivitet med BIWA 1, og de testede SCC (larynx, lunge og øsofagus) uttrykte CD44v6 i 100% av tilfellene.

Det ble i alt undersøkt 185 tilfeller av SCC av forskjellige typer og klassifikasjon på reaktivitet med BIWA 1. Blant disse var 67 tilfeller av primær SCC (larynx, n«15; munnhule, n=16, orofarynx, n=3; hud, n=15), 77 prøver av lymfeknutemetastaser (larynx, n=12; lunge, n=27; øsofagus, n=11; munnhule, n=6, orofarynx, n=7; hypofarynx, n=10; tonsiller, n=4) og tre prøver av levermetastaser (øsofagus). Tabell 6 viser en oversikt over den immunhistokjemiske analyse av alle undersøkte SCC-prøver.

Fokal pos.: < 10% av tumorcellene positive; LNM: lymfeknutemetastase;

PT: primærtumor; LM: levermetastaser

Ekspresjon av CD44v6-holdige isoformer ble funnet i alle tumorprøver unntatt tre (et larynx-tilfelle, 2 lungelilfeller). De fleste prøvene viste en ekspresjon av antigenet på 80 til 100% av tumorcellene innenfor et enkelt snitt, hvor farvingen hovedsakelig var konsentrert til tumorcellemembranen. Det sterkeste homogene farvingsmønster ble funnet i karsinomer av larynx, øsofagus og hypofarynx, hvorunder de fleste av snittets tumorceller oppviste den samme farvingsintensitet.

Litteratur

Altenschmidt U, Kahl R, Moritz D, Schnierle BS, Gerstmayer B, Wels W, Groner B. Cytoplysis of tumor cells expressing the neu/erbB-2, erbB-3, and erbB-4 receptors by genetically targeted naive T lymphocytes. Clinicat Cancer Res. 2:1001-1008 (1996).

Barbas C F, Bjoding E, Chiodi F, Dunlop N, Cababa Dt Jones T M, Zebedee S L, Persson M A A, Nara P L, Norrby E, Burton D R. Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vhro. Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 89:9339-9343 (1992).

Baum RP, Noujaim AA, Nanci A, Moebus V, Hertel A, Niesen A, Donnerstag B, Sykes T, Boniface G, Hor G. Clinical course of ovarian cancer patients under repeated stimulation of HAMA using MAb OC125 and B43.13. Hybridoma 12( 5) : 583-589(1993).

Becker JC, Varki N, Gillies SD, Furukawa K, Reisfeld RA. An antibody-interleukin 2 fusion protein overcomes tumor heterogeneity by induction of a cellular immune response. Proe. nati. Acad. Sei. USA 53:7826-7831 (1996).

Breitz H B, Weiden P L, Vanderheyden J-L, Appelbaum J W, Bjom M J, Fer M F, Wolf S B, Ratcliff B A, Seiler C A, Foisie D C, Fisher D R, Schroff R W, Fritzberg A R, Abrams P G. Clinical experience with rhenium-186-labeled monoclonal antibodies for radioimmunotherapy: results of phase I trials. J. Nucl. Med. 33:1099-1112

(1992).

Breitz H B, Durham J S, Fisher D R, Weiden P L, DeNardo G L, Goodgold H M, Nelp W B. Phrmacokinetics and normal organ dosimetry following intraperitoneal rhenium-186-labeled monoclonal antibody. J. Nucl. Med 36:754 (1995).

Brooks, L., Niedobitek, G., Agathanggelou, A., Farrell, P.J. The expression of variant CD44 in nasopharyngeal carcinoma is unrelated to expression of LMP-1. Am. J. Pathol. 746Y5>: 1102-12 (1995).

Catty, D (Utg.). Antibodies Vols. I und II. IRL Press Oxford (1989).

Catty, D., Raykundalia, C. ELISA and related immunoassays. i: Catty, D (Utg.). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 97-152, s. S. 105-109.

Catty, D., Murphy, G. Immunoassays using radiolabels. i: Catty, D<Utg.). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 77-96.

Chatal J-F, Saccavini J-C, Gestin J-F, Thédrez P, Curtet C, Kremer M, Guerreau D, Nolibé D, Fumoleau P, Guillard Y. Biodistribution of indium-111-labeledOC 125 monoclonal antibody intraperitoneally injected into patients operated on for ovarian carcinomas. Cancer Res. 49:3087-3094 (1989).

Chaudhary V K, Batra J K, Galdo M G, Willingham M C, Fitzgerald D J, Pastan I. A rapid method of doning functional variable-region antibody genes in Escherichia eoli as single-chain immunotoxins. Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 87:1066 (1990). Colcher 0, Esteban J, Carrasquillo J A, Sugarbaker P, 'Reynolds J C, BryantG, Larson S M, Schlom J. Complementation of intracavrtary and intravenous administration of a monoclonal antibody (B72.3) in patients with carcinoma. Cancer Res. 47:4218-4224 (1987).

Coloma M J, Hastings A, Wims L A, Morrison S L. Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction. J. Immunol. Methods 152:89-104 (1992).

Featherstone C. Bispecific antibodies: the new magic bullets. Lancet 348:536

(1996).

Friedmann P N, McAndrew S J, Gawlak S L, Chace D, Trail P A, Brown J P, Siegall C B. BR96 sFv-PE40, a potent single-chain immunotoxin thatselectively kills carcinoma cells. Cancer Res. 53:334-339 (1993).

Gerretsen M, Visser GWM, Brakenhoff RH, van Walsum M, SnowGB, van Dongen GAMS. Complete ablation of small squamous cell carcinoma xenografts with <186>Re-labeled monoclonal antibody E48. Cell Biophysics 24/ 25:135-141 (1994).

Goodwin D A. A new appoach to the problem of targeting specific monoclonal antibodies to human tumors using anti-hapten chimeric antibodies. J. Nucl. Med. Biol. 16:645 (1989).

Goodwin DA. Tumor pretargeting: almost the bottom line. J. Nucl. Med. 36( 5) : 876-879(1995).

Gunthert, U., Hofmann, M., Rudy, W., Reber, S., Zdller, M., HauBmann, I., Matzku, S., Wenzel, A., Ponta, H., and Herrlich, P. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Celt 65:13-24 (1991).

Guesdon, J. I., Ternynck, T., Avrameas, S. J. Histochem. Cytocheni. 27:1131

(1979).

Gussow D, Seemann G. Humanization of monoclonal antibodies. Methods Enzymol. 203:99-121 (1991): Heider, K.-H., Hofmann, M., Horst, E., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., and Pals, S.T.A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. J. Cell Biol. 120:227-233(1993). Heider, K.-H., Mulder, J.-W. R, Ostermann, E., Susani, S., Patzelt, E., Pals, S.T., Adolf, G.R. Splice variants of the cells surface glycoprotein CD44 associated with metastatic tumor cells are expressed in normal tissues of humans and cynomolgus monkeys. Eur. J. Cancer 3M.2385-2391 (1995).

Heider K H, Ratschek M, Zatloukal K, Adolf G R. Expression of CD44 isoforms in human renal cell carcinomas. Virchows Arch. 428:267-273 (1996a).

Heider KH, Sproll M, Susani S, Patzelt E, Beaumier P, Ostermann E, Ahom H, Adolf GR. Characterization of a high-affinrty monoclonal antibody specific for CD44v6 as candidate for immunotherapy of squamous cell carcinomas. Cancer Immunot. Immunother. : in press. 1996.

Hemming AW, Davis NL, Finley RJ. Photodynamic therapy of squamous cell carcinoma: an evaluation of an anti-EGFR monoclonal antibody-prophyrin conjugate. Society of Surgical Oncoiogy, 46th Annual Cancer Symposium. Maren 18-21,1993, Los Angeles, CA, p. 67

Hofmann, M., Rudy, W., Zoller, M., Tokj, C, Ponta, H, Herrlich P., and Gunthert, U. CD44 splice variants confer metastatic behavior in rats: homologous sequences are expressed in human tumor cell lines. Cancer Res. 51:5292-5297 (1991).

Johnson, G. D. Immunofluorescence. In: Catty, D (Hrsg). Antibodies Vol. II. IRL Press Oxford (1989), 179-200, s. S. 180-189.

Johnson S, Bird R E. Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli. Methods Enzymol. 203:88-98

(1991).

Jurcic JG, Scheinberg DA. Recent Developments in the radioimmunotherapy of cancer. Current Opinion in Immunology 6:715-721 (1994).

Juweid M, Sharkey R M, MarkowHz A, Behr T, Swayne L C, Dunn R, Hansen H J, Shevitz J, Leung S-O, Rubin A D, Herskovic T, Hanley D, Goldenberg D M. Treatment of Non-Hodgkins's lymphoma with radiolabeled murine, chimeric, or humanized LL2, an anti-CD22 monoclonal antibody. Cancer Res. ( Suppl.) 55:5899s-5907s (1995).

Keamey, J.F., Radbruch A., Liesegang B., Rajewski K. A new mouse myeloma cell line that has lost imunoglobulin expression but permits construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J. Immunol. 123:1548 (1979).

Keenan A M, Weinstein J N, Carrasquillo J A, Bunn P A, Reynolds J C, Foon K A ef al. Immunolymphoscintigraphy and the dose dependence of<111> ln-labeled T101 monoclonal antibody in patients with cutaneous T-cell lymphoma. Cancer Res. 47: 6093-6099(1987).

Khazaeli MB, Conry RM, LoBuglio AF. Human immune response to monoclonal antibodies. J. Immunother. 15:42-52 (1994).

Kohler, G., Milstein, C. Continous culture of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Nature 265:495 (1975)

Koopman, G., Heider, K.-H., Horts, E., Adolf,<3. R., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., Pals, S. T. Activated human lymphocytes and aggressive Non-Hodgkin s lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J. Exp. Med. 777:897-904 (1993).

Kreitman R J Hansen H J, Jones A L, FitzGerald D J P, Goldenberg D M, Pastan I. Pseudomonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibody LL2 or LL2-Fab1 induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice. Cancer Res. 53:819-825 (1993).

Larson S M, Cheung N-K V, Leibel S A. Radioisotope Conjugates. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 496-511 (1991).

Lenhard R E, Order S E, Spunberg J J, Asbell S O, Leibel S A. Isotopic immunoglobulin. A new systemic therapy for advanced HodgkitVs Disease. J. Clin.

Oncol. 3:1296-1300 (1985).

Maraveyas A, Myers M, Stafford N, Rowlinson-Busza G, Stewart J S W, Epenetos A A. Radiolabeled antibody combined with extemal radiotherapy for the treatment of head and neck cancer: Reconstruction of a theoretical phantom of the larynx for radiation dose calculation to local tissues. Cancer Res. 55:1020-1027 (1995a).

Maraveyas A, Stafford N, Rowlinson-Busza G, Stewart J S W, Epenetos A A. Pharmacokinetics, biodistribution, and dosimetry of specrfic and control radiolabeled monoclonal antibodies in patients with primary head and neck squamous-cell carcinoma. Cancer Res. 55:1060-1069 (1995b).

Mulshine J L, Magnani J L, Linnoila R I: Applications of monoclonal antibodies in the treatment of solid tumors, In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 563-588 (1991).

Myklebust AT, Godal A, Juell S, Pharo A, Fodstad O. Comparison of two antibody based methods for elimination of breast cancer cells from human bone morrow. Cancer Res. 54.-209-214 (1994).

Nesbit M, Fu Z F, McDonald-Smith J, Steplewski Z, Curtis P J. Production of a functional monoclonal antibody recognizing human colorectal carcinoma cells from a baculovirus expression system. J. Immunol. Methods 757:201-208 (1992).

Perkins A C, Pimm M V. A role for gamma scintigraphy in cancer immunology and immunotherapy. Eur. J. Nucl. Med. 19:1054-1063 (1992).

Press O W, Eary J F, Badger C C, Martin P J, Appelbaum F R, Levy R, Miller R, Brown S, Nelp W B, Krohn K A, Fisher D, DeSantes K, Porter B, Kidd P, Thomas E

D, Bernstein I D. Treatment of refractory Non-Hodgkir<Y>s lymphoma with radiolabeled MB-1 (anti-CD37) antibody. J. Clin. Oncol. 7:1027-1038 (1989).

Press O W, Eary J F, Appelbaum F R .Martin P J, Nelp W B Glenn S, Fisher D J, Porter B, Metthews D C Gooley T, Bernstein I D. Phase II trial of<131>1-B1 (anti-CD20) antibody therapy with autologous stem cell transplantation for relapsed B cell lymphomas. Lancet 346:336-340 (1995).

Quadri S M, Vriesendorp H M, Leichner P K, Williams J R. Evaluation of indium-111 and yttrium-90 labeled linker immunoconjugates in nude mice and dogs. J. Nucl.

Med. 54:938-945 (1993).

Reisfeld RA, Gillies SD, Mendelsohn J, Varki NM, Becker JC. Involvement of B lymphocytes in the growth inhibition of human pulmonary melanoma metastases in athymic nu/nu mice by an antibody-lymphotoxin fusion protein. Cancer res. 56:1707-1712(1996).

Riethmuller G, Schneider-Gådicke E, Schlimok G, Schmiegel W et al. Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma. Lancet 343:1177-1183 (1994).

Salmi, M., Gron-Virta, K., Sointu, P., Grenman, R., Kalimo, H-, Jalkanen S.

Regulated expression of exon v6 containing isoforms of CD44 in man: Downregulation during malignant transformation of tumors of squamocellular origin.

J. Cell Biol. 122:431 -442 (1993).

Sambrook, J., Fritsch E.E., Maniatis I., Molecular doning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).

SchrappeM, BumolTF, ApelgrenLD, BriggsSL,KoppelG A, MarkowitzDD, Mueller B M, Reisfeld R A. Long-term growth suppression of human glioma

xenografts by chemoimmunoconjugates of 4-desacetylvinblastine-3-carboxyhydrazide and monoclonal antibody 9.2.27. Cancer Res. 52:3838-3844

(1992).

Screaton, G.R., Bell, M.V., Jackson, D.G., Comelis, F.B., Gerth, U., and Bell, J. I. Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons. Proe. Natt. Acad. Sei. U. S. A. 69:12160-12164

(1992).

Sears H F, Mattis J, Herlyn D, Håyry P, Atkinson B, Ernst C, Steplewski Z, Koprowski H. Phase-I clinical trial of monoclonal antibody in treatment of gastrointestinal tumours. Lancet 1982 ( 1) : 762-765 (1982).

Seiter, S., Arch, R., Reber, S., Komitowski, D., Hofmann, M., Ponta, H:, Herrlich, P., Matzku, S., Zoller, M. Prevention of tumor metastasis formation by anti-variant CD44. J. Exp. Med. 177:443-455 (1993).

Senter P D, Schreiber G J, Hirschberg D L, Asne S A, Hellstrøm K €, Hellstrøm I. En-hancement of the in vitro and in vivo antitumor activities of phosphorylated mitomycin

C and etoposide derivatives by monoclonal antibody-alkaline phosphatase conjugates. Cancer Res. 49:5789-5792 (1989).

Shin S-U, Morrison S L. Production and properties of chimeric antibody molecules. Methods Enzymol. 178:459-476 (1989).

Siccardi A G, Buraggi G L, Catlegaro L, Colella A C, DeFilippi P G ef al. Immunoscintigraphy of adenocarcinomas by means of radiolabeled F(ab')2 fragments of an anti-carcinoembryonic antigen monoclonal antibody: a multicenter study. Cancer Res. 49:3095-3103 (1989).

Smith, D.B., Johnson, K.S. Single-step purification of potypetides expressed in Escherichia co//as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67:31 (1988).

Srivastava S C (Hrsg). Radiolabeled monoclonal antibodies for imaging and therapy. Life Sciences Series A 152, Plenum New York (1988).

Tolg, C, Hofmann, M., Herrlich, P., and Ponta, H. Splicing choice from ten variant exons establishes CD44 variability. Nucleic Acids. Res. 21:1225-1229 (1993).

Theuer C P, Kreitman R J, FitzGerald D J, Pastan I. Immunotoxins made with a recombinant form of pseudomonas exotoxin A that do not require proteolysis for activity. Cancer Res. 53:340-347 (1993).

Thomas, G. D., Dykes, P. W., Bradwell, A. R. Antibodies for tumour immunodetection and methods for antibody radiolabeling. In: Catty, D. (Hrsg.). Antibodies Vol. It. IRL Press Oxford , 223-244 (1989).

Thompson C H, Stacker S A, Salehi N, Lichtenstein M, Leyden M J, Andrews J T. Immunoscintigraphy for detection of lymph node metastases from breast cancer. Lancet 1984 ( 2) : 1245-1247 (1984).

Vitetta E S, Thorpe P E. Immunotoxins. In: DeVita V T, Hellman S, Rosenberg S A (Hrsg.). Biologic therapy of cancer. J. B. Lippincott Comp., Philadelphia, 482-495

(1991) Vitetta E S, Stone M, Amlot P, Fay J, May R, Till M, Newman J, Clark P, Collins R, Cunningham D, Ghetie V, Uhr J W, Thorpe P E. Phase I immunotoxin trial in patients with B-cell lymphoma. Cancer Res. 57:4052-4058 (1991).

Vriesendorp H M, Herbst J M, Germack M A, Klein J L, Leichner P K, Loudenslager D M, Order S E. Phase l-ll studies of yttrium-labeled antiferritin treatment for end stage HodgkirVs diesease, including Radiation Therapy Oncology Group 87-01. J. Clin Oncol. 9: 918-928 (1991).

Vriesendorp H M, Morton J D, Quadri S M. Review of five consecutive studies of radiolabeled immunoglobulin therapy in Hodgkins's Disease. Cancer Res. ( Suppt.) 55:5888s-5892s (1995). Wang S-M, Chem J-W, Yeh M-Y, Ng J C, Tung E, Roffler S R. Specific activation of glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzyme conjugates for cancer therapy. Cancer Res. 52:4484-4491 (1992). Weiner L M, 0'Dwyer J, Kitson J, Comis R L, Frankel A E, Bauer R J, Kopnrad M S, Groves E S. Phase I evaluation of an anti-breast carcinoma monoclonal antibody 260F9-recombinant ricin A chain immunoconjugate. Cancer Res. 45:4062-4067

(1989).

Wilbur, D. S., Hadley, S. W., Hylandes, M. D., Abrams, P. G., Beaumier, P. A., Morgan, A.C., Reno, J.M., Fritzberg, A.R. Development of a stable radioiodinating agent to label monoclonal antibodies for radiotherapy of cancer. J. Nucl. Med. 30: 216-226(1989).

Winter, G., Griffith, A. D., Hawkins, R. E., Hoogenboom, H. R. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunot. 12,433-455 (1994).

Claims (4)

1. Anvendelse av et antistoffmolekyl som binder seg til aminosyresekvensen WFGNRWHEGYR, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av plateepitelkarsinomer.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor antistoffmolekylet er det monoklonale antistoff BIWA-1 (VFF-18) som dannes av hybridomcellelinjen med tilgangsnummeret DSM ACC2174, eller et derivat av dette antistoff.

3. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2, hvor antistoffmolekylet er et monoklonalt antistoff, et Fab- eller F(ab')2*fragment av et immunglobulin, et antistoff fremstilt ved rekombinante fremgangsmåter, et kimært eller humanisert antistoff fremstilt ved rekombinante fremgangsmåter, et bifunksjonelt eller et enkeltkjedet antistoff (scFv).

4. Anvendelse ifølge et av kravené 1 til 3, hvor antistoffmolekylet er forbundet med en radioaktiv isotop, en fotoaktiverbar forbindelse, en radioaktiv forbindelse, et enzym, et fluorescensfarvestoff, et biotinmolekyl, et toksin, et cytostatikum, et prodrug, et antistoffmolekyl med en annen spesifisitet, et cytokin eller et annet immunmodulatorisk polypeptid.