NO338498B1 - Anti-CD33-antistoffer og fremgangsmåter for behandling av akutt myeloid leukemi ved anvendelse av disse. - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse vedrører antistoffer som binder CD33. Mer spesifikt, vedrører oppfinnelsen anti-CD33-antistoffer, fragmenter og homologer av nevnte antistoffer, humaniserte og overflateendrede versjoner av nevnte antistoffer, funksjonelle, ekvivalente og forbedrede versjoner av nevnte antistoffer, immunkonjugater og preparater som omfatter nevnte antistoffer og anvendelsene av de samme i diagnostiske applikasjoner, forskningsmessige applikasjoner og terapeutiske applikasjoner.

I et annet aspekt vedrører oppfinnelsen et polynukleotid som koder for antistoffene, vektorer som omfatter polynukleotidene, vertceller som er transformert med polynukleotider og fremgangsmåter for fremstilling av antistoffene.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Leukocyttdifferensieringsantigenet CD33 er et transmembranglykoprotein på 364 aminosyrer med sekvenshomologi med medlemmer av sialoadhesinfamilien, inkludert myelinassosiert glykoprotein og CD22, i tillegg til sialoadhesin selv (S. Peiper, 2002, Leucocyte Typing VII, White Cell Differentiation, Antigens, Proceedings of the Seventh International Workshop and Conference, Oxford University Press, side 777).

Ekspresjon av CD33 ser ut til å være svært spesifikk for den hematopoietiske avdelingen, med sterk ekspresjon av myeloide forløperceller (S. Peiper, 2002). Det blir uttrykt av myeloide opphavsceller slik som CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G og BFU-E, monocytter/- makrofager, granulocyttforløpere, slik som promyelocytter og myelocytter, selv om det skjer med minsket ekspresjon ved modning og differensiering, og modne granulocytter, selv om det skjer med et lavt nivå av ekspresjon (S. Peiper, 2002).

I motsetning til dette, ser det ut til at pluripotente, hematopoietiske stamceller som gir opphav til "blastkolonier" in vitro (Leary, A.G. et al., 1987, Blood 69:953) og som induserer hematopoietiske langtids margkulturer (Andrews R. G. et al., 1989, J. Exp. Med. 169:1721, Sutherland, H.J. et al., 1989, Blood 74:1563) mangler ekspresjon av CD33.

Selv om den spesifikke funksjonen til CD33 er ukjent, tyder dets homologi med sialoadhesin på en rolle i karbohydratbinding, noe som er karakteristisk for lektinmfamilien, en rolle som senere er bekreftet (S. Peiper, 2002).

Viktig er det at anti-CD33-monoklonale antistoffer har vist at CD33 blir uttrykt av klonogene, akuttmyelogene leukemi (AML)-celler i mer enn 80 % av tilfeller i mennesker

(LaRussa, V.F. et al., 1992, Exp. Hematol. 20:442-448)

På grunn av den selektive ekspresjonen av CD33 har immunkonjugater som kombinerer cytotoksiske legemidler med monoklonale antistoffer som spesifikt gjenkjenner og binder CD33 blitt foreslått anvendt i selektiv målsøking av AML-celler. Slike terapier er forventet å etterlate stamceller og primitive hematopoietiske opphavsceller upåvirket. Immunkonjugater som benytter anti-CD33-antistoffer inkluderer anti-CD33-ricinimmun- konjugater som er blitt vist å være svært dødelige for AML-celler (Roy, D.C. et al., 1991, Blood 77:2404, Lambert, J.M. et al., 1991, Biochemistry 30:3234), mens de sparer stamcellene som støtter normal hematopoiese og hematopoietisk rekonstitusjon (LaRussa, V.F. et al., 1992, Exp. Hematol. 20:442-448).

Ytterligere studier som har benyttet immunkonjugater, har vist rask målsøking av radiomerket anti-CD33-antistoffer mot leukemiske blastceller i perifert blod og marg når de blir administrert i.v. (Scheinberg, D.A. et al., 1991, J. Clin. Oncol. 9: 478-490, Schwartz, M.A. et al., 1993, J. Clin. Oncol. 11:294-303). Rask internalisering av antistoffet av målcellen ble også observert i in Wtro-undersøkelser (Tanimot, M. et al., 1989, Leukemia 3:339-348, Divgi, CR. et al., 1989, Cancer Res. Suppl. bind 30, 404a). Evaluering av et humanisert anti-CD33-antistoff konjugert med det sterke antitumorantibiotikumet calicheamicin (Gemtuzumab-ozogamicin) i prekliniske studier viste spesifikk dreping av leukemiceller i HL-60-cellekulturer, HL-60-tumorxenopodinger i mus og margprøver fra AML-pasienter (Hamann, P.R. et al., 2002, Bioconjugate Chem. 13:47-58). LUTZ et al. "Eradication of acute myeloid leukemia tumour xenograft by an anti CD33-DM1 immunoconjugate". Proceedings of the annual meeting of the american association for cancer research. 2002, vol. 43, side 912 beskriver at det murine My9-6-antistoffet konjugert til maytansinoid legemidlet DM1 (My9-6-DMl) viser potent antigenspesifikk toksisitet not myeloid lekemi tumor xenopodinger.

Basert på de positive resultatene fra disse prekliniske studiene ble Gemtuzumab-ozogamicin evaluert i fase-I- og fase-II-kliniske studier. I fase-I-studier var hovedtoksisiteten som ble observert myelosuppresjon som skyldes ekspresjon av CD33 på myeloide forløperceller (Sievers, E.L 1999, Blood 93: 3678-3684; Sievers E.L. et al. 2001, J. Clin. Oncol, 19: 3244-3254). Fase II-studier med en dose på 9 mg/m<2>i.v. over 4 timer, gjentatt etter 14 dager, gav en respons på 30 %. Markedsføringsgodkjenning av Gemtuzumab-ozogamicin ble gitt av FDA i mai 2000 med indikasjon for behandlingen av pasienter med CD33-positive AML i første tilbakefall som er 60 år gamle eller eldre og som ikke er ansett som kandidater til cytotoksisk kjemoterapi. Post-markedsførings rapporter har indikert potensiale for signifikant toksisitet, spesielt veneokklusiv sykdom (VOD) som har ført til revidert merking og igangsettelse av et pasientovervåkningsprogram. Mye av denne toksisiteten kan være relatert til legemiddel-komponenten calicheamicin, som ble vist å forårsake hepatotoksisitet i prekliniske modeller, og er derfor kanskje ikke et direkte resultat av målsøking av CD33.

Mens resultatene som er diskutert ovenfor antyder at immunkonjugater som omfatter et anti-CD33-antistoff og et cytotoksisk legemiddel kan bli vellykket anvendt ved behandlingen av AML, er det et behov for immunkonjugater som er både trygge og effektive. Foreliggende oppfinnelse er rettet mot disse og andre viktige mål.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I overensstemmelse med dette er det et mål for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe antistoffer som spesifikt binder til CD33 og som kan bli benyttet i behandlingen av AML, som definert i de foreliggende krav.

I en første utførelsesform blir det dermed tilveiebrakt et antistoff, eller epitopbindende fragment derav, som har evnen til å binde CD33 som definert i de foreliggende krav.

Beskrivelsen omtaler også til det murine antistoffet My9-6, som er fullt utkarakteriserther med hensyn på aminosyresekvensene til både dets lettkjede og tungkjede variable regioner, cDNA-sekvensene til genene for lettkjeden- og tungkjedens variable regioner, identifiseringen av dens CDRer (komplementaritetsbestemmende regioner), identifiseringen av dets overflateaminosyrer og måter for å få til dets ekspresjon i rekombinant form.

I en tredje utførelsesform blir humaniserte eller overflateendrede versjoner av My9-6-antistoffet tilveiebrakt der overflateeksponerte rester av My9-6-antistoffet, eller epitopbindende fragmenter derav, er erstattet i både tunge og lette kjeder for å ligne mer på kjente, humane antistoffoverflater som definert i de foreliggende krav. Slike humaniserte antistoffer kan ha økt anvendbarhet sammenlignet med murin My9-6 som terapeutiske eller diagnostiske midler. Humaniserte versjoner av antistoff My9-6 er også fullt ut karakteriserte her med hensyn på deres respektive aminosyresekvenser til både lettkjede- og tungkjede variable regioner, DNA-sekvensen til genene for lettkjede og tungkjede variable regioner, identifiseringen av CDRene, identifiseringen av deres overflateaminosyrer og tilkjennegivelsen av en måte å få til deres utrykking i rekombinant form.

I en ytterligere utførelsesform blir det tilveiebrakt antistoffer eller epitopbindende fragmenter derav som definert i de foreliggende krav som omfatter minst én komplementaritetsbestemmende region som har en aminosyresekvens som er valgt fra gruppen som består av SEKV. ID. NR.: 1-6:

og som har evnen til å binde CD33.

I en ytterligere utførelsesform blir det tilveiebrakt antistoffer, eller epitopbindende fragmenter derav som definert i de foreliggende krav, som omfatter minst én tungkjede variabel region og minst én lettkjede variabel region, der nevnte tunkjede variabel region omfatter tre komplementaritetsbestemmende regioner som har aminosyresekvensene som henholdsvis er vist i SEKV. ID. NR.: 1-3, og der nevnte lettkjede variable region omfatter tre komplementaritetsbestemmende regioner som har aminosyresekvensene som er gitt i henholdsvis SEKV. ID. NR.: 4-6.

I en ytterligere utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse immunkonjugater som omfatter et legemiddel eller prolegemiddel som er kovalent bundet, direkte eller via en kløyvbar eller ikke-kløyvbar linker, til et antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge foreliggende oppfinnelse. I foretrukne utførelsesformer er legemiddelet eller prolegemiddelet et cytotoksisk legemiddel eller prolegemiddel, slik som et maytansinoid, et taksoid, CC-1065, en CC-1065-analog, dolastatin og en dolastatinanalog.

I en ytterligere utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et preparat som omfatter et antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge foreliggende oppfinnelse og et legemiddel eller prolegemiddel.

I en ytterligere utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse farmasøytiske preparater som omfatter et antistoff, epitopbindende fragment derav eller immunkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse, enten alene eller i kombinasjon med et legemiddel eller prolegemiddel eller annet terapeutisk middel, i nærvær av et eller flere farmasøytisk akseptable midler.

I en ytterligere utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antistoff eller epitopbindende fragment derav som er merket for anvendelse i forskningsapplikasjoner eller diagnostiske applikasjoner. I foretrukne utførelsesformer er merket et biotinmerke, et enzymmerke, et radiomerke, en fluorofor, en kromofor, et synliggjørende middel eller et metallion.

I en ytterligere utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for inhibering av vekst av en celle som uttrykker CD33 via anvendelsen av et antistoff, epitopbindende fragment derav eller immunkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse, enten alene eller i kombinasjon med et legemiddel eller prolegemiddel eller annet terapeutisk middel, ytterligere alene eller i nærvær av ett eller flere farmasøytisk akseptable midler.

I en ytterligere utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse ved behandlingen av et individ som har en sykdom der CD33 blir uttrykt, og som omfatter administrering av et antistoff, et epitopbindende fragment derav eller immunkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse, enten alene eller i kombinasjon med et annet legemiddel eller prolegemiddel eller et annet terapeutisk middel, ytterligere alene eller i nærvær av ett eller flere farmasøytisk akseptable midler. Sykdommen kan være én eller flere, for eksempel myelodysplastisk syndrom (MDS), akutt myeloid leukemi (AML), kronisk myeloid leukemi (CML) og promyelocyttisk leukemi (PML) eller annen sykdom som ennå ikke er bestemt der CD33 blir uttrykt.

Anvendelsen ved behandling inkluderer in vivo-, ex vivo- og in Wfro-anvendelse av antistoffene, antistoff-fragmentene og immunkonjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse, enten alene eller i kombinasjon med et legemiddel eller prolegemiddel eller annet terapeutisk middel, ytterligere alene eller i nærvær av ett eller flere farmasøytisk akseptable midler.

Også beskrevet er en fremgangsmåte for bestemmelse av hvorvidt en biologisk prøve inneholder en myelogen kreftcelle tilveiebrakt, der en biologisk prøve blir kontaktet med et diagnostisk reagens, slik at et merket antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge oppfinnelsen, og distribusjonen av reagenset inne i prøven, blir påvist. Denne fremgangsmåten kan bli benyttet til å diagnostisere en kreftform, slik som akutt myeloid leukemi (AML), kronisk myeloid leukemi (CML) og pro-myelocyttisk leukemi (PML).

I en ytterligere utførelsesform blir antistoffet eller epitopbindende fragmenter derav ifølge oppfinnelsen tilveiebrakt som har forbedrede egenskaper. For eksempel kan antistoffer eller epitopbindende fragmenter derav, som har forbedret affinitet for CD33, bli fremstilt ved hjelp av standardteknikkene som gjelder dyreimmunisering, hybridomdannelse og seleksjon av antistoffer med spesifikke karakteristika.

Forbedrede antistoffer kan også bli fremstilt ved hjelp av affinitetsmodning av et antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge oppfinnelsen via for eksempel oligonukleotidmediert seterettet mutagenese, kasettmutagenese, feilutsatt PCR, DNA-omstokking og anvendelse av mutatorstammer av E. coli.

I en ytterligere utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polynukleotider som koder for antistoffene eller de epitopbindende fragmentene derav ifølge foreliggende oppfinnelse, rekombinante vektorer som omfatter polynukleotidene, vertceller som er transformert med de rekombinante vektorene og fremgangsmåter for å fremstille nevnte antistoffer og epitopbindende fragmenter derav ved å dyrke nevnte vertceller.

I en siste utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å oppnå CD33 fra et biologisk materiale ved å benytte et antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge foreliggende oppfinnelse.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 viser resultatene av et konkurransebindingseksperiment der binding av øl-merket My9-6-antistoff (3 x IO<9>M) til CD33-positive U-97-celler ble analysert i nærvær av økende konsentrasjoner av enten My9 eller My9-6-antistoff.

Figur 2 viser de degenererte Ny9-6 primere for lettkjedesignalsekvensen.

Figur 3 viser filnavnene for de 127 antistoffstrukturene fra Brookhaven-databasen som ble benyttet til å forutse overflaten på muMy9-6-variabelregionen. Figur 4 viser PCR-primerne som er benyttet for å lage de 16 overflateendrede My9-6-versjonene i tillegg til kimært My9-6-antistoff. Figur 5 viser plasmidene som er benyttet for å lage og uttrykke de humaniserte antistoffene. (A): lettkjede kloningsplasmid. (B): tungkjede kloningsplasmid (C): pattedyra ntistoff ekspresjonsplasmid. Figur 6A viser resultatene fra Edman-sekvensering, sammenlignet med aminosyresekvens avledet fra RT-PCR-genererte cDNA-kloner for muMy9-6-lettkjede. Figur 6B viser resultatene fra MS-MS-sekvensanalysen av 1319 Da- og 1122 Da-peptidf rag mentene inneholdende henholdsvis CDR1- og CDR2-sekvensene. CDR-sekvenser er i fet skrift. Figur 7 viser resultatene fra MS-MS-sekvensanalysen av 1788 Da-peptidet og den tilsvarende sekvensen avledet fra to cDNA-kloner. Figur 8A viser cDNA-sekvensen og den utledede aminosyresekvensen (SEKV.ID.NR.:95) for lettkjede variabel regionen for det murine My9-6-antistoffet. De tre CDRene er understreket. Figur 8B viser cDNA-sekvensen og den utledede aminosyresekvensen (SEKV.ID.NR.:96) for tungkjede variabel regionen for det murine My9-6 antistoffet. De tre CDRene er understreket. Figur 9 viser lettkjede- og tungkjede-CDRene som bestemt ved Kabat-definisjonene. Figur 10 viser lettkjede- og tungkjede aminosyresekvensene for det murine My9-6-antistoffet sammenlignet med kimcellelinjesekvensene for 8-27- og V102-genene. Punkter (.) indikerer sekvensidentitet. Figurene 11A og B viser de ti lettkjede-(A)- og tungkjede-(B)-antistoffsekvensene som er mest homologe med muMy9-6-sekvensene som har utledede filer i Brookhaven-databasen. Sekvenser er satt opp mot hverandre fra mest til minst homologi. Figurene 12A og B viser den gjennomsnittlige tilgjengeligheten for hver Kabat-posisjon til de lette (A) og tunge (B) kjedene for muMy9-6-antistoff. De relative løsemiddel-tilgjengelighetene for hver Kabat-posisjon for de ti mest homologe lett- og tungkjedesekvensene ble benyttet til å utarbeide et gjennomsnitt og er presentert langs x-aksen. Figur 13A viser restløsemiddel-tilgjengelighetene for de ti mest homologe lettkjede strukturene, beregnet med MC-programvaren, og viser gjennomsnittene for hver Kabat-posisjon, tabulert med Excel. Denne tabellen presenterer dataene for ikke-CDR-posisjoner med gjennomsnittlige løsemiddel tilgjengeligheter som er større enn 25 %. En overflaterest er definert som en rest med større enn 30 % gjennomsnittlig løsemiddel tilgjengelighet. Posisjoner med 25 % - 35 % gjennomsnittlige tilgjengeligheter ble ytterligere analysert ved å beregne gjennomsnittlige tilgjengeligheter for strukturer som bare har identiske rester på posisjonen i tillegg til i de to flankeringsposisjoner på hver side. NA refererer til identiske flankeposisjoner som er ikke er tilgjengelige. Posisjonene 15 og 70 krevde ytterligere beregninger for å komme frem til de endelige overflateantagelsene som er gitt i den siste kolonnen. Figur 13B viser restløsemiddel tilgjengelighetene for de ti mest homologe tunkjedestrukturene, beregnet med MC-programvaren, og viser gjennomsnittene for hver Kabat-posisjon, tabulert med Excel. Denne tabellen presenterer dataene for ikke-CDR-posisjoner med gjennomsnittlige løsemiddel tilgjengeligheter som er større en 25 %. En overflaterest er definert som en rest med større enn 30 % gjennomsnittlig løsemiddel tilgjengelighet. Posisjoner med 25 - 35 % gjennomsnittlige tilgjengeligheter ble ytterligere analysert ved å beregne gjennomsnittlige tilgjengeligheter for strukturer som bare hadde identiske rester på denne posisjonen i tillegg til i de to flankeposisjonene på hver side. NA refererer til identiske flankeposisjoner som ikke er tilgjengelige. Figur 14 viser My9-6-rammeverksoverflaterester som faller innenfor 5 Å fra en CDR-rest. Figur 15 viser de øverste fem humane sekvensene som er ekstrahert fra Kabat-databasen. Sammenligninger ble generert ved hjelp av SR (Pedersen, 1993). muMy9-6-restene som havner innenfor 5 Å fra en CDR er understreket. Figurene 16A og B viser de 16 humaniserte My9-6-lettkjedevariabelregionsekvensene (A) og de 16 humaniserte My9-6-tungkjedevariabelregionsekvensene (B) sammenstilt mot murin My9-6. Punktene (.) representerer sekvensidentitet med humanisert versjon 1.0.

Overflaterestene som er forskjellige i murin og human My9-6 er understreket.

Figur 17 viser My9-6-KD- verdiene som er beregnet ved hjelp av direkte bindingsanalyse på HL-60-membraner og HL-60-helceller, i tillegg til konkurrerende bindingsanalyser på HL-60-membraner. N = 3, bortsett fra for<*>der N = 2. Figur 18 viser bindingskurver for huMy9-6 VI.0. (A): direkte binding på HL-60-membraner. (B): direkte binding på HL-60-helceller. (C): konkurrerende binding på HL-60-membraner. Figur 19 viseren sammenligning av binding av My9-6-DMl med My9-6-antistoff på HL-60-celler. Figur 20 viser in Wfro-cytotoksisitet av My9-6-DMl mot CD33-uttrykkende humane tumorceller. Figur 21 viser resultatene av effektivitetseksperimenter med My9-6-DMl i SCID-mus med HL-60-transplantater. Effekten av My9-6-DMl (A) og umodifisert My9-6-antistoff (C) på veksten av HL-60-tumorer ble vurdert. Musekroppsvekt ble overvåket som en indikasjon på toksisitet (B, D). Figur 22 viser en sammenligning av effektiviteten av My9-6-DMl med det frie legemiddelet maytansin i SCID-mus med HL-60-transplantater (A). Musekroppsvekt ble overvåket som en indikasjon på toksisitet (B). Gjenoppståtte tumorer i to behandlede mus ble behandlet med en andre runde med My9-6-DMl. Figurene 23A og B viser en sammenligning av antitumoreffektivitet av My9-6-DMl med standard kjemoterapi i SCID-mus med store HL-60-transplantater (A). Musekroppsvekt

ble overvåket som en indikasjon på toksisitet (B). Gjenoppståtte tumorer i to behandlede mus ble behandlet på nytt med en andre runde med My9-6-DMl.

Figurene 24A og B viser antitumoreffektivitet av My9-6-DMl sammenlignet med Gentuzumabozogamicin og standard kjemoterapi i en HL-60-overlevelsesmodell. HL-60-celler ble intravenøst injisert i SCID-mus. Indikerte behandlinger ble satt i gang 11 dager etter injeksjon av celler. Behandlinger var i.v. daglig x 5 bortsett fra for Gentuzumabozogamicin (Q4Dx3).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et nytt, murint anti-CD33-antistoff og humaniserte versjoner av dette antistoffet som definert i de foreliggende krav. Ytterligere tilveiebrakt er antistoffer som omfatter én eller flere av CDRene til det murine-anti-CD33-antistoffet eller humaniserte versjoner derav som spesifikt gjenkjenner og binder CD33 som definert i de foreliggende krav.

Murint My9-6-antistoff

Det murine anti-CD33-antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse, som her om hverandre er betegnet som "My9-6", "murint My9-6" og "muMy9-6", er fullt utkarakterisertmed hensyn på den antatte kimcellelinjeaminosyresekvensen til både lettkjede og tungkjede variabel region (figur 10), aminosyresekvensene til både lettkjede og tungkjede variabel region (figur 8A og B), identifiseringen av CDRene (figur 9), identifiseringen av overflateaminosyrer (figurene 13A og B) og måter å få til dets ekspresjon i rekombinant form.

My9-6-antistoffet har ytterligere blitt funksjoneltkarakterisertog vist å binde med høy affinitet til CD33 på overflaten av CD33-positive U-937-celler (figur 1).<125>I-merket My9-6 binder til U-937-celler, og det blir konkurrert vekk fra cellene av umerket My9-6 og det tidligere karakteriserte anti-CD33-antistoffet My9 (BioGenex, kat. nr. 267M).

Uttykket "variabel region" er benyttet her for å beskrive visse deler av lette og tunge kjeder i antistoffer som er forskjellige i sekvens blant antistoffer og som samarbeider i bindingen og spesifisiteten for hvert spesielle antistoff for dets antigen. Variabilitet er vanligvis ikke jevnt fordelt utover de variable antistoffregionene. Den er typisk konsentrert innenfor tre segmenter i en variabelregion kalt komplementaritetsbestemmende regioner (CDRer) eller hypervariable regioner, der begge ligger i lettkjede og tungkjede variabel regionene. De mer konserverte delene av de variable regionene er kalt rammeverksregionene. De Variable regionene til tunge og lette kjeder omfatter fire rammeverksregioner, der de i stor grad inntar en betaflatekonfigurasjon, med hver rammeverksregion knyttet sammen av de tre CDRene som danner løkker som binder sammen beta-overflatestrukturen, og noen tilfeller danner de en del av beta-flatestrukturen. CDRene i hver kjede blir holdt nært inntil hverandre ved hjelp av rammeverksregionene og, med CDRene fra den andre kjeden, bidrar de til dannelsen av det antigenbindende setet til antistoffer. (E.A. Kabat et al. Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 1991, NIH).

Den "konstante" regionen er ikke direkte involvert i bindingen av et antistoff til et antigen, men oppviser ulike effektorfunksjoner, slik som antistoffets deltakelse i antistoffavhengig cellulær toksisitet.

Humanisert My9-6-antistoff

Humaniserte versjoner av My9-6, som her om hverandre blir betegnet som "huMy9-6" og "humanisert My9-6", har også blitt fremstilt.

Målet med humanisering er en reduksjon i immunogenisiteten til et xenogent antistoff, slik som et murint antistoff, for introduksjon til et menneske, mens den fulle antigenbindings-affiniteten og spesifisiteten til antistoffet blir opprettholdt.

Humaniserte antistoffer kan bli fremstilt ved å benytte flere teknologier, slik som overflateendring og CDR-transplantering. Slik som den blir benyttet her, benytter overflate-endringsteknologien en kombinasjon av molekylær modellering, statistisk analyse og mutagenese for å endre ikke-CDR-overflaten til antistoff variable regioner for å ligne overflatene til kjente antistoffer hos målverten.

Strategier for fremgangsmåter for overflateendringen av antistoffer, og andre fremgangsmåter for å redusere immunogenisitet for antistoffer i en annen vert, er tilkjennegitt i U.S. patentskrift nr. 5 639 641 (Pedersen et al.). Kort fortalt, i en foretrukket fremgangsmåte blir (1) posisjonssammenligninger av en samling av tungkjede og lettkjede variable antistoff-regioner generert for å gi et sett av tungkjede og lettkjede variabel region rammeverksoverflateeksponerte posisjoner, der sammenligningsposisjoner for alle variable regioner er minst omtrent 98 % identiske, (2) et sett med tungkjede og lettkjede variabel region-rammeverksoverflateeksponerte aminosyrerester definert for et gnagerantistoff (eller fragment derav), (3) et sett med tungkjede og lettkjede variabel region-rammeverksoverflateeksponerte aminosyrerester som er nærmest identiske med settet av gnageroverflateeksponerte aminosyrerester identifisert, (4) settet med tungkjede og lettkjede variabel region-rammeverksoverflateeksponerte aminosyrerester definert i trinn (2) blir substituert med settet av tungkjede og lettkjede variabel region-rammeverksoverflateeksponerte aminosyrerester som er identifisert i trinn (3), bortsett fra de aminosyrerestene som ligger innenfor 5 Å fra ethvert atom på enhver rest i de komplementaritetsbestemmende regionene i gnagerantistoffet, og (5) det humaniserte gnagerantistoffet som har bindingsspesifisitet blir fremstilt.

Antistoffer kan bli humaniserte ved å benytte en mengde andre teknikker, inkludert CDR-transplantering (EP 0 239 400, WO 91/09967, U.S. patentskrifter nr. 5 530 101 og

5 585 089), finering eller overflateendring (EP 0 592 106, EP 0 519 596, Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498, Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814, Roguska M.A. et al., 1994, PNAS 91:969-973) og kjedeomstokking (U.S. patentskrift nr. 5 565 332). Humaniserte antistoffer kan bli fremstilt ved hjelp av en mengde fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, inkludert phage-display-fremgangsmåter. Se også U.S. patentskrifter nr. 4 444 887, 4 716 111, 5 545 806 og 5 814 318 og internasjonale patentsøknadspublikasjoner nr. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 og WO 91/10741.

Slik som det ytterligere er beskrevet her, ble CDRene til My9-6 identifisert ved modellering, og deres molekylstrukturer ble beregnet. Humaniserte My9-6-antistoffer ble deretter fremstilt og har blitt fullt utkarakterisert. Aminosyresekvensene til de lette og tunge kjedene i et antall huMy9-6-antistoffer er vist i figur 16A og 16B. Sammenlignbare bindingsverdier for murine og humaniserte My9-6-antistoffer er tilveiebrakt i figur 17. Bindingskurver for antistoffene er vist i figur 18.

Epitopbindende fragmenter av My9-6-antistoffene

Selv om epitopbindende fragmenter av det murine My9-6-antistoffet og de humaniserte My9-6-antistoffene er diskutert her, separat fra det murine My9-6-antistoffet og de humaniserte versjonene derav, er det underforstått at uttrykket "antistoff" eller "antistoffer" ifølge foreliggende oppfinnelse kan inkludere både fullengde-muMy9-6- og huMy9-6-antistoffer i tillegg til epitopbindende fragmenter av disse antistoffene.

Som benyttet her, inkluderer antistoff-fragmenter en hvilken som helst del av et antistoff som opprettholder evnen til å binde CD33, generelt betegnet epitopbindende fragmenter. Eksempler på antistoff-fragmenter inkluderer Fab, Fab' og F(ab')2, Fd, enkeltkjede-Fvs (scFv), enkeltkjedeantistoffer, disulfidbundne Fvs (sdFv) og fragmenter som omfatter enten et VL- eller VH-domene. Epitopbindende fragmenter, inkludert enkeltkjedeantistoffer, kan omfatte den variable regionen/regionene alene eller i kombinasjon med hele, eller en del av, det følgende: hengselregion, CHI-, CH2- og CH3-domener.

Slike fragmenter kan inneholde ett eller flere Fab-fragmenter eller F(ab')2-fragmentet. Foretrukket inneholder antistoff-fragmentene alle seks CDRer til det fullstendige antistoffet, selv om fragmenter som inneholder færre enn alle slike regioner, slik som tre, fire eller fem CDRer, også er funksjonelle. Videre kan de funksjonelle ekvivalentene være, eller kan kombinere, medlemmer av enhver av de følgende immunoglobulin klassene: IgG, IgM, IgA, IgD eller IgE og underklassene derav.

Fab- og F(ab')2-rfagmentene kan bli fremstilt ved protolytisk kløyving ved å benytte enzymer slik som papain (Fab-fragmenter) eller pepsin (F(ab)2-fragmenter).

Enkeltkjede-FVs-(scFvs)-fragmentene er epitopbindende fragmenter som inneholder minst ett fragment av en tungkjede variabel region (VH) fra et antistoff bundet til minst ett fragment av en lettkjede variabel region (VL) fra et antistoff. Linkeren kan være et kort, fleksibelt peptid som er valgt for å sikre at den hensiktsmessige, tredimensjonale foldingen av (VL)- og (VH)-regionene skjer med én gang de blir bundet sammen for å opprettholde målmolekyl-bindingsspesifisiteten til hele antistoffet fra hvilket enkeltkjede-antistoff-fragmentet er avledet. Karboksylenden til (VL)- eller (VH)-sekvensen kan være kovalent bundet med en linker til aminosyreterminalen på en komplementær (VL)- og (VH)-sekvens. Enkeltkjede-antistoff-fragmentet kan bli fremstilt ved hjelp av molekylær kloning, antistoff-phage-display-bibliotek eller tilsvarende teknikker som er velkjente for en fagperson på området. Disse proteinene kan bli fremstilt for eksempel i eukaryote celler eller prokaryote celler, inkludert bakterier.

De epitopbindende fragmentene ifølge oppfinnelsen kan også bli fremstilt ved å benytte ulike phage-display-fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. I phage-display-fremgangsmåter blir funksjonelle antistoffdomener fremvist på overflaten av fagpartikler som bærer polynukleotidsekvensene som koder for dem. Spesielt kan slike fag bli benyttet for å fremvise epitopbindende domener uttrykt fra et repertoar eller kombinatorisk antistoffbibliotek (for eksempel humant eller murint). Fag som uttrykker et epitopbindende domene som binder antigenet av interesse, kan bli valgt eller identifisert med antigen, for eksempel ved å benytte merket CD33 eller CD33 bundet eller fanget på en fast overflate eller kule. Fag som blir benyttet i disse fremgangsmåtene er typisk filamentøse fag inkludert fd- og M13-bindende domener uttrykt fra fag med Fab-, Fv- eller disulfidstabiliserte Fv-antistoffdomener rekombinant fusjonert med enten proteinet fra fag-genet III eller VIII.

Eksempler på phage-display-fremgangsmåter som kan bli benyttet for å fremstille de epitopbindende fragmentene ifølge oppfinnelsen, inkluderer de som er tilkjennegitt i Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50, Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186, Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958, Persic et al., 1997, Gene 187:9-18, Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280, PCT-søknad nr. PCT/GB91/01134, PCT-søknad WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 og U.S. patentskrifter nr. 5 698 426, 5 223 409, 5 403 484, 5 580 717, 5 427 908, 5 750 753, 5 821 047, 5 571 698, 5 427 908, 5 516 637, 5 780 225, 5 658 727, 5 733 343 og 5 969 108.

Etter fagseleksjon kan regionene i faget som koder for fragmentene, bli isolert og benyttet for å generere de epitopbindende fragmentene via ekspresjon i en valgt vert, inkludert pattedyrceller, insektceller, planteceller, gjær og bakterier, ved å benytte rekombinant DNA-teknologi, foreksempel som beskrevet i detalj nedenfor. Foreksempel kan teknikker for rekombinant å fremstille Fab-, Fab'- og F(ab')2-fragmenter også bli benyttet ved å benytte fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, slik som de som er tilkjennegitt i PCT-publikasjon WO 92/22324, Mullinax et al., 1992, Bio Techniques 12(6):854-869, Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34, og Better et al., 1988, Science 240:1041-1043. Eksempler på teknikker som kan bli benyttet for å fremstille enkeltkjede-Fvs og antistoffer, inkluderer de som er beskrevet i U.S. patentskrifter nr. 4 946 778 og 5 258 498, Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203: 46-88, Shu et al., 1993, PNAS 90-7995-7999, Skerra et al., 1988, Science 240-1038-1040.

Funksjonelle ekvivalenter

Også inkludert i omfanget av oppfinnelsen er funksjonelle ekvivalenter av My9-6-antistoffet og de humaniserte My9-6-antistoffene. Uttrykket "funksjonelle ekvivalenter" inkluderer antistoffer med homologe sekvenser, kimere antistoffer, modifisert antistoff og kunstige antistoffer, for eksempel der hver funksjonelle ekvivalent er definert ved sin evne til å binde til CD33. Den erfarne fagperson vil forstå at det er et overlapp i gruppen av molekyler som er betegnet antistoff-fragmenter og gruppen som er betegnet funksjonelle ekvivalenter.

Antistoffet med homologe sekvenser er de antistoffene med aminosyresekvenser som har sekvensidentitet eller -homologi med aminosyresekvensen til de murine My9-6- og humaniserte My9-6-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse. Foretrukket foreligger identitet med aminosyresekvensen til de variable regionene til de murine My9-6- og de humaniserte My9-6-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse. Sekvensidentitet og sekvenshomologi, slik som benyttet på en aminosyresekvens her, er definert som en sekvens med minst omtrent 90 %, 91 %, 92 %, 93 % eller 94 % sekvensidentitet, og mer foretrukket, minst omtrent 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med en annen aminosyresekvens, som for eksempel bestemt ved hjelp av FASTA-søkfremgangsmåten i overensstemmelse med Pearson og Lipman, Proe. Nati. Acad. Sei, USA 85, 2444-2448 (1988).

Som benyttet her er et kimært antistoff ett der ulike deler av et antistoff er avledet fra ulike dyrearter. For eksempel et antistoff som har en variabel region avledet fra et murint, monoklonalt antistoff satt sammen med en human immunoglobulin-konstant region. Fremgangsmåter for å fremstille kimere antistoffer er kjent på fagområdet. Se for eksempel Morrison, 1985, Science 229:1202, Oi et al. 1986, BioTechniques 4:214, Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202, U.S. patentskrifter nr. 5 807 715, 4 816 567 og 4 816 397.

Kunstige antistoffer inkluderer scFv-fragmenter, dialegemer, trialegemer, tetralegemer og mru (se gjennomgang av Winter, G. og Milstein, C, 1991, Nature 349:293-299, Hudson, P.J., 1999, Current Opinion in Immunology 11: 548-557), der hver av disse har antigenbindende evne. I enkeltkjede-Fv-fragmentet (scFv) er VH- og VL-domenene til et antistoff bundet sammen med et fleksibelt peptid. Typisk er dette linkerpeptidet omtrent 15 aminosyrerester langt. Hvis linkeren er mye mindre, for eksempel 5 aminosyrer, blir dialegemer dannet, som er bivalente scFv-dimerer. Hvis linkeren blir redusert til mindre enn tre aminosyrerester, blir trimere og tetramere strukturer dannet, som blir kalt trialegemer og tetralegemer. Den minste bindingsenheten i et antistoffer en CDR, typisk CDR2 i den tunge kjeden som har tilstrekkelig spesifikk gjenkjenning og binding til at den kan bli benyttet separat. Et slikt fragment blir kalt en molekylær gjenkjenningsenhet eller mru. Flere slike mruer kan bli bundet sammen med korte linkerpeptider og dermed danne et kunstig bindingsprotein med høyere aviditet enn en enkelt mru.

De funksjonelle ekvivalentene i foreliggende søknad inkluderer også modifiserte antistoffer, for eksempel antistoffer som er modifisert ved den kovalente tilkoblingen av enhver type av molekyler til antistoffet. For eksempel inkluderer modifiserte antistoffer antistoffer som er blitt modifisert, for eksempel ved glykosylering, acetylering, pegylering, fosforylering, amidering, derivatisering, ved hjelp av kjente, beskyttende/blokkerende grupper, proteolytisk kløyving, binding til en cellulær ligand eller annet protein osv. Den kovalente bindingen forhindrer ikke antistoffet fra å fremkalle en antiidiotypisk respons. Disse modifikasjonene kan bli utført ved hjelp av kjente teknikker inkludert, men ikke begrenset til, spesifikk kjemisk kløyving, acetylering, formylering, metabolsk syntese av tunikamycin osv. Ytterligere kan de modifiserte antistoffene inneholde én eller flere ikke-klassiske aminosyrer.

Funksjonelle ekvivalenter kan bli fremstilt ved å bytte om på ulike CDRer på ulike kjeder innenfor ulike rammeverk. Dermed er for eksempel ulike klasser av antistoff mulige for et gitt sett av CDRer ved substitusjon av ulike tungkjeder, hvorved for eksempel IgGi_4-, IgM-, IgAi-2-, IgD-, IgE-antistofftyper og -isotyper kan bli fremstilt. Likeledes kan kunstige antistoffer innenfor omfanget av oppfinnelsen bli fremstilt ved å sette inn et gitt sett av CDRer i et helt, syntetisk rammeverk.

Funksjonelle ekvivalenter kan med letthet bli fremstilt ved hjelp av mutasjon, delesjon og/eller innsetting innenfor variabel og/eller konstant region sekvensene som flankerer et spesielt sett med CDRer ved å benytte et bredt utvalg av fremgangsmåter som er kjent på fagområdet.

Antistoff-fragmentene og de funksjonelle ekvivalentene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter de molekylene med en påvisbar grad av binding til CD33 når de sammenlignes med det murine My9-6-antistoffet. En påvisbar grad av binding inkluderer alle verdier i området fra minst 10-100 %, foretrukket mint 50 %, 60 % eller 70 %, mer foretrukket, minst 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % eller 99 % av bindingsevnen til det murine My9-6-antistoffet til CD33.

Forbedrede antistoffer

CDRene er av primær viktighet for epitopgjenkjenning og antistoffbinding. Likevel kan endringer bli gjort med restene som omfatter CDRene uten å røre ved antistoffets evne til å gjenkjenne og binde sin tilhørende epitop. For eksempel kan endringer som ikke påvirker epitopgjenkjenning, og som til og med øker bindingsaffiniteten for antistoffet for epitopen, bli gjort.

Også inkludert i omfanget av foreliggende oppfinnelse er dermed også forbedrede versjoner av både de murine og de humaniserte antistoffene, som også spesifikt gjenkjenner og binder CD33, fortrinnsvis med økt affinitet.

Flere studier har kartlagt effektene av å introdusere én eller flere aminosyreendringer på ulike posisjoner i sekvensen til et antistoff basert på kjennskapen til den primære antistoffsekvensen og på dens egenskaper, slik som binding og nivå av ekspresjon (Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol. Biol, 254, 392-403, Rader, Ce. et al. 1998, Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 95, 8910-8915, Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotchnology, 16, 535-359).

I disse studiene har ekvivalenter av det primære antistoffet blitt fremstilt ved å endre sekvensen i tungkjede og lettkjede genene i CDR1, CDR2, CDR3 eller rammeverksregioner ved å benytte fremgangsmåter slik som oligonukleotidmediert, seterettet mutagenese, kassett-mutagenese, feilutsatt PCR, DNA-omstokking eller muterende stammer av E. coli (Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539, Adey, N. B. et al., 1996, Chapter 16, s. 277-291, i "Phage Display of Peptides and Proteins", red. Kay, B. K. et al., Academic Press). Disse fremgangsmåtene for å endre sekvensen til det primære antistoffet har ført til forbedrede affiniteter for de sekundære antistoffene (Gram, H. et al., 19992, Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 89, 3576-3580, Boder, E.T. et al., 2000, Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 97, 10701-10705, Davies, J. and Riechmann, L, 1996, Immunotechnology, 2, 169-179, Thompson, J. et al., 1996, J. Mol. Biol., 256, 77-88, Short, M. K. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277, 16365-16370, Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276, 27622-27628).

Ved hjelp av en lignende rettet strategi for å endre én eller flere aminosyrerester i antistoffet, kan antistoffsekvensene som er beskrevet her, bli benyttet til å utvikle anti-CD33-antistoffer med forbedrede funksjoner, inkludert forbedret affinitet for CD33.

Forbedrede antistoffer inkluderer også de antistoffene som har forbedrede karakteristika som blir fremstilt ved hjelp av standardteknikkene med dyreimmunisering, hybridomdannelse og seleksjon av antistoffer med spesifikke karakteristika.

Immunkonjugater

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot immunkonjugater som omfatter antistoffene, antistoff-fragmentene, de funksjonelle ekvivalentene, forbedrede antistoffer og deres analoger som beskrevet her, bundet til et legemiddel eller prolegemiddel. Foretrukne legemidler eller prolegemidler er cytotoksiske midler og inkluderer for eksempel maytansinoider og maytansinoidanaloger, taksoider, CC-1065 og CC-1065-analoger, dolastatin og dolastatinanaloger.

Immunkonjugatene kan bli fremstilt ved hjelp av in Wfro-fremgangsmåter. For å kunne binde et legemiddel eller prolegemiddel til antistoffet, blir en forbindelsesgruppe benyttet. Passende forbindelsesgrupper er velkjent på fagområdet og inkluderer disulfidgrupper, tioetergrupper, syrelabile grupper, fotolabile grupper, peptidaselabile grupper og esteraselabile grupper. Foretrukne forbindelsesgrupper er disulfidgrupper og tioetergrupper. For eksempel kan konjugater bli konstruert ved å benytte en disulfidutbyttingsreaksjon eller ved å danne en tioeterbinding mellom antistoffet og legemiddelet eller prolegemiddelet.

Maytansinoider og maytansinoidanaloger er blant de foretrukne cytotoksiske midlene. Eksempler på passende maytansinoider inkluderer maytansinol og maytansinolanaloger. Passende maytansinoider er tilkjennegitt i U.S. patentskrifter nr. 4 424 219, 4 256 746, 4 294 757, 4 307 016, 4 313 946, 4 315 929, 4 331 598, 4 361 650, 4 362 663, 4 364 866, 4 450 254, 4 322 348, 4 371 533, 6 333 410, 5 475 092, 5 585 499 og 5 846 545.

Med hensyn på maytansinoider kan forbindelsesgruppen omfatte en reaktiv, kjemisk gruppe. I en foretrukket utførelsesform kan den reaktive, kjemiske gruppen bli kovalent bundet til maytansinoidet via en disulfidbindingskoblende enhet.

Spesielt foretrukne reaktive, kjemiske grupperer N-suksinimidylestere og N-sulfo-suksinimidylestere.

Spesielt foretrukne maytansinoider omfatter en forbindelsesgruppe som innholder en reaktiv, kjemisk gruppe, er C-3-estere av maytansinol og dens analoger der forbindelses-enheten inneholder en disulfidbinding, og den kjemisk reaktive gruppen omfatter en N-suksinimidyl- eller N-sulfosuksinimidylester.

Mange posisjoner på maytansinoider kan tjene som posisjonen på hvilken forbindelses-enheten blir kjemisk bundet. Foreksempel erC-3-posisjonen som haren hydroksylgruppe, C-14-posisjonen som er modifisert med hydroksymetyl, C-15-posisjonen som er modifisert med hydoksy og C-20-posisjonen som har en hydroksygruppe, alle forventet å være nyttige. Likevel er C-3-posisjonen foretrukket, og C-3-posisjonen til maytansinol er spesielt foretrukket.

Andre kjemiske bindinger inkluderer syrelabile bindinger, fotolabile bindinger, peptidaselabile bindinger og esteraselabile bindinger. Innholdet som er beskrevet i U.S. patent nr. 5 208 020, beskriver fremstillingen av maytansinoider som haren slik binding.

Som beskrevet i detalj nedenfor, benytter immunkonjugatet My9-6DM1 tiolinneholdende maytansinoid (DM1). DM1 er representert ved den følgende strukturformelen

(I):

Taksaner er også foretrukne, cytotoksiske midler. Taksaner som er nyttige for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse er tilkjennegitt i U.S. patentskrifter nr. 6 372 738 og 6 340 701. Konjugater av taksanene ifølge oppfinnelsen og et cellebindende middel kan bli dannet ved å benytte enhver teknikk som per i dag er kjent eller senere utviklet. Mange fremgangsmåter for konjugering er beskrevet i USP 5 416 064 og USP 5 475 092. CC-1065 og dens analoger er også foretrukne cytotoksiske legmidler til anvendelse i foreliggende oppfinnelse. CC-1065 og dens analoger er tilkjennegitt i U.S. patentskrifter nr. 6 372 738, 6 340 701, 5 846 545 og 5 585 499. CC-1065 er et sterkt antitumorantibiotikum som er isolert fra kulturmedium der Streptomyces zelensis er dyrket. CC-1065 er omtrent 1 000 ganger sterkere in vitro enn vanlig benyttede antikreftlegemidler, slik som doksorubisin, metotreksat og vinkristin (B. K. Bhuyan et al., Cancer Res. 42, 3532-3537 (1982).)

Legemidler, slik som metotreksat, daunorubusin, doksorubisin, vinkristin, vinblastin, melfalan, mitomysin-C, klorambucil, calicheamicin, dolastatin og dolastatinanaloger er også passende for fremstillingen av konjugater ifølge foreliggende oppfinnelse. Legemiddel-molekylene kan også bli bundet til antistoffmolekylene via et intermediært bærermolekyl, slik som serumalbumin.

Inhibering av veksten av CD33-uttrykkende celler

Også inkludert i foreliggende oppfinnelse er fremgangsmåter for inhibering av veksten av celler som uttrykker CD33. Disse fremgangsmåtene gjør bruk av antistoffene eller immunkonjogatene ifølge foreliggende oppfinnelse i tillegg til antistoffene eller immunkonjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse sammen med ett eller flere ytterligere terapeutiske midler. Passende terapeutiske midler inkluderer de som inhiberer veksten av en celle som uttrykker CD33 direkte eller indirekte.

Som benyttet her, skal uttrykkene "inhibere" og "inhiberer" bli forstått å inkludere enhver inhibitorisk effekt på cellevekst, inkludert celledød. De inhibitoriske effektene inkluderer forbigående effekter, opprettholdte effekter og permanente effekter.

Terapeutiske applikasjoner

Foreliggende oppfinnelse inkluderer også terapeutiske applikasjoner av antistoffene eller immunkonjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse der antistoffene eller immunkonjugatene kan bli administrert til et individ i en farmasøytisk akseptabel doseringsform. De kan bli administrert intravenøst som en bolus, eller med kontinuerlig infusjon over en tidsperiode, eller de kan bli administrert intramuskulært, subkutant, intraartikulært, intrasynovialt, intratekalt, oralt, topisk eller ved inhalering. De kan også bli administrert intratumoralt, peritumoralt, intralesjonalt eller perilesjonalt for å utøve lokale, i tillegg til systemisk terapeutiske effekter.

En farmasøytisk akseptabel doseringsform vil generelt inkludere et farmasøytisk akseptabelt middel, slik som en bærer, et fortynningsmiddel og en eksipiens. Disse midlene er velkjente, og det mest hensiktmessige middelet kan bli bestemt av fagfolk på området i forhold til hva som er påkrevd av den kliniske situasjonen. Eksempler på passende bærere, fortynningsmidler og/eller eksipienser inkluderer: (1) Dulbeccos fosfatbufrede saltløsning, pH~7,4, innholdende omtrent 1 mg/ml til 25 mg/ml humant serumalbumin, (2) 0,9 % saltoppløsning (0,9 % vekt/volum NaCI) og (3) 5 % (vekt/volum) dekstrose.

I andre terapeutiske applikasjoner blir antistoffene eller immunkonjugatene ifølge oppfinnelsen koadministrert med ett eller flere ytterligere terapeutiske midler. Terapeutiske midler er de midlene som søker å drepe eller begrense veksten av kreftceller, mens de gjør minimal skade på verten. Dermed kan slike midler utnytte enhver forskjell i kreftcelle- egenskaper (for eksempel metabolisme, vaskularisering eller celleoverflateantigenpresentering) i forhold til friske vertceller. Forskjeller i tumormorfologi er potensielle angrepspunkter for intervenering. For eksempel kan det terapeutiske middelet være et antistoff, slik som et anti-VEGF-antistoff som er nyttig til å bremse vaskulariseringen av innsiden av en fast tumor, for derved å senke dens veksthastighet.

Egnede terapeutiske midler inkluderer cytotoksiske eller cytostatiske midler. Taksol er et foretrukket terapeutisk middel som også er et cytotoksisk middel. Andre terapeutiske midler inkluderer supplementer, slik som granisetron-HCL, androgene inhibitorer, slik som leuprolid-acetat, antibiotika, slik som doksorubisin, antiøstrogener, slik som tamoksifen, antimetabolitter, slik som interferon alfa-2a, enzyminhibitorer, slik som ras-farnesyltransferaseinhibitor, immunmodulatorer, slik som aldesleukin og nitrogensennepderivater, slik som melfalan-HCI og lignende.

Når det foreligger i en vandig doseringsform, heller enn å være lyofilisert, vil antistoffet typisk være formulert ved en konsentrasjon på omtrent 0,1 mg/ml til 100 mg/ml, selv om en stor variasjon på utsiden av disse begrensningene er lovlig. Til behandlingen av sykdom vil den hensiktsmessige doseringen av antistoff eller konjugat være avhengig av sykdomstypen som skal bli behandlet, som definert ovenfor, alvorligheten og utviklingen av sykdommen, hvorvidt antistoffene blir administrert preventivt eller terapeutisk, utviklingen av tidligere terapi, pasientens kliniske historie og respons overfor antistoffet, og skjønnet som er utøvd av ansvarlig lege. Antistoffet blir hensiktsmessig administrert til pasienten på ett tidspunkt eller over en serie med behandlinger.

Avhengig av typen og alvorligheten av sykdommen er omtrent 0,015 til 15 mg antistoff/kg av pasientens vekt en utgangsdosering for administrering til pasienten, hvorvidt det skjer ved for eksempel én eller flere separate administreringer eller ved en kontinuerlig infusjon. For gjentatte administreringer over flere dager eller lenger, avhengig av tilstanden, blir behandlingen gjentatt inntil en ønsket undertrykking av sykdomssymptomer fremkommer. Likevel kan andre doseringsregimer være nyttige og er ikke ekskludert.

De terapeutiske applikasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer anvendelse ved behandling av et individ som har en sykdom. Sykdommene som blir behandlet med anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, er de som erkarakterisert vedekspresjonen av CD33. Slike sykdommer inkluderer myelodysplastiske syndromer (MDS) og kreftformer, slik som akutt myeloid leukemi (AML), kronisk myeloid leukemi (CML) og promyelocyttisk leukemi (PML). Den erfarne fagperson vil forstå at anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse også kan bli benyttet ved behandling av andre sykdommer som ennå ikke er beskrevet, men som er kjennetegnet ved ekspresjonen av CD33.

De terapeutiske applikasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli praktisert in vitro og ex vivo.

Eksempler på in Wtro-anvendelser inkluderer rensingen av cellepopulasjoner som er kontaminert med CD33-positive celler, slik som celler av myeloid avstamming. Fremgangs måtene omfatter å dyrke cellepopulasjoner i nærvær av et cytotoksisk My9-6-immunkonjugat og deretter fjerne døde CD33-positive celler. Betingelsene for ikke-klinisk in wfro-anvendelse er velkjent. (Se for eksempel Uckun, et al., 1986, J. Exp. Med. 163, 347-368, Uckun et al., 1985, J. Immunol. 134, 3504-3515, Ramakrishnan et al., 1985, J. Immunol, 3616-3622).

Eksempler på klinisk ex wVo-anvendelse inkluderer behandling av autolog benmarg før innsetting av denne inn i den samme pasienten for å drepe sykdomsrammede eller maligne celler av myeloid avstamming (Roy D.C. et al.. 1995, J. Clin. Immunol. 15, 51-57).

Diagnostiske og forskningsmessige applikasjoner

I tillegg til de terapeutiske anvendelsene av antistoffene som er diskutert her, kan antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse bli benyttet i mange kjente diagnostiske og forsknings applikasjoner. Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet, for eksempel i rensingen, påvisningen og målsøkingen av CD33, inkludert i både in vitro- og in wVo-diagnostiske fremgangsmåter. For eksempel kan antistoffene bli benyttet ved immun-analyser for kvalitativ og kvantitativ måling av nivåer av CD33 som uttrykkes av celler i biologiske prøver. Se for eksempel Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2. utg. 19988).

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet i for eksempel konkurrerende bindingsanalyser, direkte og indirekte sandwich-analyser og immun-presipiterings-analyser (Zola, Monoclonal Antibodies, A. Manual of Techniques, s. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)).

Antistoffene ifølge oppfinnelsen er også nyttige i in wVo-synliggjøring, der et antistoff merket med en påvisbar enhet, slik som et radiopakt middel, eller radioisotop, blir administrert til et individ, foretrukket inn i blodstrømmen, og tilstedeværelsen og lokaliseringen av det merkede antistoffet i verten blir analysert. Denne synliggjøringsteknikken er nyttig ved oppsetningen og behandlingen av maligniteter. Antistoffet kan være merket med en hvilken som helst enhet som er påvisbar i en vert, enten ved nukleær magnetisk resonans, radiologi eller andre påvisningsmåter som er kjent på fagområdet.

Merket kan være enhver påvisbar enhet som er i stand til å frembringe, enten direkte eller indirekte, et påvisbart signal. For eksempel kan merket være et biotinmerke, et enzymmerke (for eksempel luciferase, alkalisk fosfatase, betagalaktosidase og pepperrotperoksidase), et radiomerke (for eksempel 3H, 14C,32P,35S og<125>I), en fluorofor, slik som en fluorescerende eller kjemiluminiscerende forbindelse (for eksempel fluoresceinisotiocyanat, rhodamin), et synliggjørende middel (for eksempel Tc-m99 og indium (<m>In)) og et metallion (foreksempel gallium eller europium).

Enhver fremgangsmåte som er kjent på fagområdet for å konjugere antistoffet med merket, kan bli benyttet, inkludert fremgangsmåtene som er beskrevet i Hunter, et al., 1962, Nature 144:945, David et al., 1974, Biochemistry 13:1014, Pain et al, 1981, J. Immunol, Meth. 40:219, Nygren, J., 1982, Histochem og Cytochem. 30:407.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen er også nyttige som affinitetsrensemidler. I denne prosessen blir antistoffene immobilisert på en passende bærer, slik som et Sephadex-resin eller filterpapir, ved å benytte fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet. Dermed kan CD33 bli isolert og renset fra en biologisk prøve.

Polynukleotider, vektorer, vertceller og fremgangsmåter for fremstilling av antistoff

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ytterligere polynukleotider som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et antistoff ifølge oppfinnelsen eller epitopbindende fragmenter derav som definert i de foreliggende krav.

Også beskrevet er polynukleotider som koder for et polypeptid som kan binde CD33 og som under stringente hybridiseringsbetingelser hybridiserer med polynukleotider som koder for et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, der nevnte, stringente hybridiseringsbetingelser inkluderer: prehybridisering i 2 timer ved 60 °C i 6x SSC, 0,5 % SDS, 5x Denharts løsning og 100^g/ml varmedenaturert laksesperma-DNA, hybridisering i 18 timer ved 60 °C, to ganger vasking i 4x SSC, 0,5 % SDS, 0,1 % natriumpyrofosfat i 30 minutter ved 60 °C og to ganger i 2x SSC, 0,1 % SDS i 30 minutter ved 60 °C.

Polynukleotidene kan bli fremskaffet, og nukleotidsekvensen til polynukleotidene kan bli bestemt ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er kjent på fagområdet. For eksempel, hvis nukleotidsekvensen til antistoffet er kjent, kan et polynukleotid som koder for antistoffet bli sammensatt fra kjemisk syntetiserte oligonukleotider (for eksempel som beskrevet i Kutmeier et al., 1994, Bio Techniques 17:242) som kort fortalt involverer syntesen av overlappende oligonukleotider inneholdende deler av sekvensen som koder for antistoffet, annealing og ligering av disse oligonukleotidene og deretter amplifisering av de ligerte oligonukleotidene ved hjelp av PCR.

Fremgangsmåter for konstrueringen av rekombinante vektorer inneholdende antistoffkodende sekvenser og hensiktsmessige transkripsjonene og translasjonene kontrollsignaler er velkjente på fagområdet. Disse fremgangsmåtene inkluderer for eksempel in vitro-rekombinante DNA, syntetiske teknikker og in wVo-genetisk rekombinasjon. Oppfinnelsen tilveiebringer dermed replikerbare vektorer som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et antistoffmolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse, eller en tung- eller lettkjede derav, eller et tung- eller lettkjede variabelt domene, eller et epitopbindende fragment av en hvilken som helst av disse, opererbart bundet til en promoter.

Den rekombinante vektoren blir overført til en vertcelle ved hjelp av konvensjonelle teknikker, og de transfekterte cellene blir deretter dyrket ved hjelp av konvensjonelle teknikker for å produsere et antistoff ifølge oppfinnelsen. Dermed inkluderer oppfinnelsen vertceller som inneholder et polynukleotid som koder for et antistoff ifølge oppfinnelsen, eller et epitop bindende fragment derav, opererbart bundet til en heterolog promoter. I foretrukne utførelsesformer kan vektorer som koder for både de tunge og lette kjedene bli ko-uttrykt i vertcellen for ekspresjon av et fullstendig immunoglobulin molekyl.

En mengde vertsekspresjonsvektorsystemer kan bli benyttet for å uttrykke antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen. Slike vertsekspresjonssystemer representerer vehikler ved hvilke de kodende sekvensene av interesse kan bli produsert og deretter renset, men representerer også celler som kan, når de er transformerte eller transfekterte med de hensiktsmessige nukleotidkodende sekvensene, uttrykke et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen in situ. Disse inkluderer mikroorganismer, slik som bakterier (for eksempel E. coli, B. subtilis) transformert med rekombinante bakteriofag-DNA-, plasmid-DNA- eller kosmid-DNA-ekspresjonsvektorer, inneholdende antistoffkodende sekvenser, gjær (for eksempel Saccharomyces, Pichia) transformert med rekombinante gjærekspresjonsvektorer inneholdende antistoffkodende sekvenser, insektcellesystemer som er infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (for eksempel baculovirus) inneholdende antistoffkodende sekvenser, plantecellesystemer som er infisert med rekombinante virusuttrykkende vektorer (foreksempel blomkålmosaikkvirus, CaMV, tobakkmosaikkvirus, TMV) eller transformert med rekombinante plasmidekspresjonsvektorer (for eksempel Ti-plasmid) inneholdende antistoffkodende sekvenser, eller pattedyrcellesystemer (for eksempel COS-, CHO-, BHK-, 293-, 3T3-celler) som inneholder rekombinante ekspresjonskonstruksjoner som inneholder promotorer som er avledet fra genomet til pattedyrceller (for eksempel metallotionein promotor) eller fra pattedyrvirus (foreksempel den sene adenoviruspromotoren, vaksiniavirus-7,5K-promoteren).

Spesielt blir bakterieceller, slik som Escherichia coli, og mer foretrukket, eukaryote celler, spesielt for ekspresjon av et helt rekombinant antistoffmolekyl, benyttet til ekspresjonen av et rekombinant antistoffmolekyl. For eksempel er pattedyrceller, slik som kinesisk hamster ovarieceller (CHO) i sammenheng med en vektor, slik som det store, intermediære, tidlige genpromotorelementet fra humant cytomegalovirus, et effektivt ekspresjonssystem for antistoffer (Foecking et al., 1986, Gene 45:101: Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).

For langtidsproduksjon med høyt utbytte av rekombinante proteiner er stabil ekspresjon foretrukket. For eksempel kan cellelinjer som stabilt uttrykker antistoffmolekylet bli fremstilt. Heller enn å benytte ekspresjonsvektorer som inneholder replikasjonsorigi fra virus, kan vertceller bli transformert med DNA som er kontrollert av hensiktsmessige ekspresjons-kontrollelementer (for eksempel promotor-, enhancersekvenser, transkripsjonsterminatorer, polyadenyleringsseter, osv.) og en selekterbar markør. Etter introduksjonen av det fremmede DNA kan fremstilte celler bli tillatt å vokse i 1-2 dager i et anriket medium, og deretter byttet over til et selektivt medium. Den selekterbare markøren i det rekombinante plasmidet overfører resistens til utvalget og tillater cellene å stabilt integrere plasmidet inn i deres kromosomer og vokse for å danne fokuspunkter som i sin tur kan bli klonet og utviklet til cellelinjer. Denne fremgangsmåten kan fordelaktig bli anvendt til å fremstille cellelinjer som uttrykker antistoffmolekylet. Slike fremstilte cellelinjer kan være spesielt nyttige ved screening og evaluering av forbindelser som interagerer direkte eller indirekte med antistoffmolekylet.

Med en gang et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen er blitt uttrykt rekombinant, kan det bli renset ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er kjent på fagområdet for rensing av et immunoglobulin molekyl, for eksempel ved hjelp av kromatografi (for eksempel ionebytter-kromatografi, affinitetskromatografi, spesielt ved affinitet for det spesifikke antigen etter protein-A, og størrelseskolonnekromatografi), sentrifugering, differensiell løselighet eller ved hjelp av enhver annen standardteknikk for rensingen av proteiner.

EKSEMPLER

Oppfinnelsen blir nå beskrevet med referanse til de påfølgende eksemplene.

Eksempel 1. Murint My9-6-antistoff

I dette første eksempelet blir den komplette, primære aminosyrestrukturen og cDNA-sekvensen til det murine My9-6-antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse fremlagt, sammen med dets bindingsegenskaper og måter for å uttrykke det i rekombinant form. Likeledes blir det tilveiebrakt en full og komplett beskrivelse av et antistoff ifølge oppfinnelsen og dets fremstilling, slik at en fagmann på området for immunologi kan bli i stand til å fremstille nevnte antistoff uten unødvendig eksperimentering.

1.1. Fremstilling, produksjon og karakterisering av My9-6-antistoff

En murin 3T3-fibroblastcellelinje som var transfektert med CD33-antigenet ble benyttet til immunisering.

BALB/c-hunnmus, som var 5 måneder gamle, ble immunisert intraperitonalt på dag 0 med den murine, transfekterte 3T3-fibroblastcellelinjen (2,5 x IO<6>celler, suspendert i 0,2 ml PBS). Dyret ble gitt 0,2 ml cellesuspensjon på følgende måte: dag 13, 5 x 10<6->celler, dag 21,

5 x 10<6->celler. På dag 24 ble en mus avlivet og dens milt fjernet.

Milten ble malt opp mellom to mattslipte glass-slides for å oppnå en enkel cellesuspensjon som ble vasket med serumfritt RPMl-medium inneholdende penicillin og streptomycin (SFM). Miltcellepelleten ble resuspendert i 10 ml 0,83 % (vekt/volum) ammoniumklorid-løsning i vann i 10 minutter på is for å lysere de røde blodcellene og ble deretter vasket med serumfritt medium (SFM). Miltceller (1,6 x IO<8>) ble slått sammen med myelomceller (5,4 x 10<7>) fra den ikke-utskillende musemyelomcellelinjen P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville, MD, katalog nr CRL1580) i et rør, og vasket med det serumfrie RPMI-1640-mediet (SFM). Supernatanten ble fjernet og cellepelleten ble fortynnet til 2 x 10<7>celler/ml. Cellene ble sådd ut ved 2 x IO<7>celler/plate på vevskulturplater som var belagt med 15 mg/ml konkanavalin A. Platen ble inkubert i én time ved 37 °C. Supernatanten ble forsiktig fjernet fra platene. Én ml polyetylen-glykolløsning (40 % PEG vekt/volum) ble sakte tilsatt dråpevis. Platene ble virvlet forsiktig og inkubert i 30 sekunder. PEG ble fjernet og kassert. Platene ble vasket to ganger ved å sakte tilsette 5 ml SFM og deretter kassering. Etter den siste vasken ble 5 ml SFM supplementert med 5 % føtalt bovint serum (FBS) tilsatt. Plater ble inkubert over natt ved 37 °C. Etter inkuberingen ble celler skrapet av platene med en celleskraper og slått sammen. Platene ble skylt, og dette ble slått sammen med cellene. Celler ble spunnet ned til en pellet ved sentrifugering og resuspendert i RPMI-1640-vekstmedium supplementert med 5 % FBS, penicillin-streptomycin og hypoksantin/aminopterin/tymidin (HAT). Celler ble sådd ut ved 2 x IO<5>celler/brønn på 96-brønners flatbunnede vevskulturplater inneholdende et makrofagfeeder-lag. De generelle betingelser som ble benyttet til immunisering og hybridomproduksjon var som beskrevet av J. Langone og H. Vunakis (utg. Methods in Enzymology, bind 121, "Immunochemical Techniques, Part I", 1986, Academic Press, Florida) og E. Harlow og D. Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Andre teknikker for immunisering og hybridomproduksjon kan også bli benyttet, noe som er velkjent for fagpersoner på området.

Kultursupernatanter fra hybridomkloner ble screenet for binding til celler som var transfektert med CD33-antigenet og den humane histiocyttiske lymfomcellelinjen, U-937 (ATCC CRL-1953.2) og for en mangel på binding til en musefibroblastcellelinje. Disse klonene ble ekspandert og subklonet. Kultursupernatantene fra subklonene ble ytterligere screenet med bindingsanalysene ovenfor. Ved hjelp av denne prosedyren ble subklon 3E7-H2-3D8 (My9-6) valgt, og tungkjede- og lettkjedegenene ble klonet og sekvensert som beskrevet nedenfor.

Screening av hybridomsupernatanter for spesifikk binding til CD33-antigenet ble utført ved å benytte ELISA på cellelinjer som uttykte dette antigenet, og på en cellelinje som var negativ for dette antigenet. Celler ble høstet separat fra vevskulturflasker, suspendert i vekstmedium inneholdende 10 % FBS, pelletert ved sentrifugering og vasket med PBS. De vaskede cellene (100 ul med omtrent 1-3 x IO<6>celler/ml ble tilsatt til brønner på en immulon-2HB-plate belagt med fytohemagglutinin (100 ul med 20^g/ml PHA), sentrifugert og tillatt å festes til PHA-belagte brønner i 10 minutter. Platen med celler ble svippet rundt for å fjerne PBS og ble deretter tørket over natt ved 37 °C. Brønnene ble blokkert med 5 mg/ml BSA-løsning i PBS i 1 time ved 37 °C og ble deretter vasket forsiktig med PBS. Alikvoter av supernatantene fra hybridomkloner (100 ul, fortynnet i blokkeringsbuffer) ble deretter tilsatt til brønner inneholdende CD33-antigenuttrykkende celler og til celler som ikke uttrykte CD33, og ble inkubert ved omgivelsestemperatur i 1 time. Brønnene ble vasket med PBS, inkubert med geit-anti-mus-IgG-antistoff-pepperrot-peroksidasekonjugat (100 ul i blokkeringsbuffer) i 1 time, etterfulgt av vaskinger og deretter ble binding påvist ved å benytte et ABTS/H202-substrat. En typisk supernatant fra en 3E7-hybridomsubklon ga ved inkubasjon med celler som overuttrykte CD33-antigen et signal på 0,50 absorbansenheter, i motsetning til en verdi på 0,10 absorbansenheter som ble oppnådd ved inkubering med celler som var negative for CD33-antigenet.

Hybridomet ble dyrket i ascites i BALB/c-mus. En ampulle med frosne hybridomceller ble tint, og cellene ble ekspandert i vevskulturflasker for å oppnå det nødvendige antall celler til ascitesproduksjon. Forbehandlede BALB/c-mus (mus hadde blitt injisert i.p. med 0,5 ml pristan 10-14 dager på forhånd) ble injisert i.p. med 1 x 10<6->celler i 0,5 ml fosfatbufret saltløsning (PBS). 12 til 18 dager etter injeksjon av cellene ble ascitesvæsken sugd ut fra det peritoneale hulrommet i musen med en sprøyte. Den sammenslåtte ascitesvæsken ble sentrifugert ved 1 000 rpm i 5 minutter, supernatanten ble deretter underkastet sentrifugering ved 12 000 rpm i 30 minutter. Antistoffet ble renset fra den klare supernatanten som følger: trinn 1: ammoniumsulfatpresipitering. Supernatanten på is ble fortynnet med to volumer av kald PBS, rørt og deretter behandlet sakte med et volum med kald, mettet (100 %) ammoniumsulfat-løsning. Løsningen ble hensatt på is i omtrent 5 timer, hvorpå presipitatet ble høstet ved sentrifugering. Pelleten ble løst i en liten mengde PBS, og den resulterende løsningen ble dialysert i bufferen for affinitetsrensetrinnet med protein-A. Trinn 2: Affinitetsrensing på Sepharose-protein-A. Isotypen for murint My9-6 er IgGl med en kappalettkjede. Derfor ble affinitetskolonnen balansert i 0,1 M tris-HCI-buffer inneholdende 3 M NaCI, pH 8,0. Antistoffløsningen i den samme bufferen ble passert gjennom kolonnen, kolonnen ble vasket godt med ekvilibreringsbufferen og så eluert med 0,1 M eddiksyre inneholdende 0,15 M NaCI. Fraksjoner ble analysert ved å måle UV-absorpsjonen ved 280 nm. Fraksjoner inneholdende antistoffet ble slått sammen, nøytralisert med 1 M tris og deretter dialysert i PBS for anvendelse og lagring.

Renset antistoff ble førstkarakterisertfor binding til CD33-uttrykkende celler, slik som den transfekterte, murine 3T3-fibroblastcellelinjen og den humane U-937-cellelinjen, og fravær av binding til antigen-negative cellelinjer som beskrevet ovenfor for screeningen av hybridomsupernatanter.

For ytterligere å bekrefte dets spesifisitet for binding til CD33-antigenet, ble et konkurrerende bindingseksperiment utført mellom merket muMy9-6 og det kommersielt tilgjengelige anti-CD33-antistoffet My9-6. Bindingseksperimentet ble utført ved å benytte fremgangsmåten som er beskrevet av Goldmacher et al. (1989, J. Cell. Physiol. 141, 222-234). Murint My9-6-antistoff ble radiomerket med<125>I ved å benytte Iodo-genteknikken (Fraker, P. J. og Speck, J.C., 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849-857). En konstant mengde (3 x IO<9>M) med<125>I-merket muMy9-6 ble blandet med økende konsentrasjoner av ikke-radioaktivt antistoff, enten umerket muMy9-6 eller umerket My9, og blandingene ble inkubert med celler (1 x IO<6>celler per prøve) ved 4 °C i 30 minutter. Disse inkuberingene ble utført i 60 ul med en buffer bestående av Minimum Essensielt Medium Modifisert for Suspensjonskulturer (SMEM), tilsatt 2,5 % humant serum. Cellene ble deretter separert fra mediet som inneholdt ikke-bundet materiale ved sentrifugering gjennom en blanding av silikonolje (Aldrich) og parafinolje (Baker) med en tetthet på 1,009 g/ml. Cellepelleten ble deretter fjernet ved å klippe over sentrifugerørene ved oljesjiktgrensen og ble benyttet til å måle den celleassosierte radioaktiviteten på en gammateller (modell RIAgamma 1274 fra LKB). Den celleassosierte radioaktiviteten som ble målt ble plottet mot konsentrasjonene til de umerkede, konkurrerende antistoffene. Resultatene er vist i figur 1: begge antistoffer, My9 og My9-6 gir svært like konkurransebindingskurver. Dette viser at My9 og My9-6 binder til det samme antigen, og videre, at begge antistoffer har svært lignende bindingsaviditeter. Siden My9 er en publisert og akseptert anti-CD33-standard, ble det konkludert med at My9-6 er et anti-CD33-antistoff. My9-antistoff er kommersielt tilgjengelig fra BioGenex (San Ramon, Ca 94583, kat. nr. AM267-5M).

1.2. Kloning av tungkjede- og lettkjede-gener for My9-6-antistoff

Totalt RNA ble renset fra en konfluent T175-flaske med My9-6-hybridomceller som beskrevet i Molecular Protocols (NB1455-pl73). RNA-integritet ble sjekket på en 1 % MOPS-gel, og konsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av UV-spektrofotometri. RT-reaksjoner ble utført med 4-5^g totalt RNA ved å benytte Gibco-Superscript II-settet og enten oligo-dT eller tilfeldige heksamerprimere.

PCR-reaksjoner ble utført både ved å benytte en RACE-fremgangsmåte som beskrevet i Co et al. (1992, J. Immunol. 148(4): 1149-54) og ved å benytte degenererte primere som beskrevet i Wang et al. (2000, J. Immunol. Methods. 233-167-177). RACE-PCRen var avhengig av et mellomtrinn for å legge til en poly-dG-hale på de 3'-endene på førstetråds-cDNAene. RT-reaksjoner ble renset med Qianeasy (Qiagen)-kolonner og eluert i 50 ul 1 x NEB-buffer-4. En dG-halereaksjon ble utført på eluatet med 0,25 mM CoCI2, 1 mM dGTP og 5 enheter terminal transferase (NEB) i 1 x NEB-buffer-4. Blandingen ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter, og deretter ble 1/5 av reaksjonsblandingen (10 ul) tilsatt direkte til en PCR-reaksjonsblanding for å virke som templat-DNA.

RACE- og de degenererte PCR-reaksjonene var identiske, bortsett fra forskjeller i primere og templat. Som nevnt ovenfor, ble terminaltransferase-reaksjonsblandingen benyttet direkte for RACE-PCR-templatet, mens RT-reaksjonsblandingen ble benyttet direkte for degenererte PCR-reaksjoner. I begge reaksjonssett ble den samme 3' lettkjedeprimeren, HindKL:

TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC (SEKV. ID. NR.: 11)

og den 3'tungkjedeprimeren, Bgl2IgGl:

GGAAGATCTATAGACAGATGGGGGTCGTCGTTTTGGC (SEKV. ID. NR.: 12)

benyttet.

I RACE-PCR-reaksjonen ble én poly-dC 5'-primer benyttet for både den tunge og lette kjeden, EcoPolydC TATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC (SEKV. ID. NR.: 13), mens de degenererte 5'-ende PCR-primerne var SaclMK: GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEKV. ID. NR.: 14) forden lette kjeden og en tilsvarende blanding av EcoRlMHl: CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEKV. ID. NR.: 15) og EcoRlMH2: CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (SEKV. ID. NR.: 16) for den tunge kjeden (blandede baser: H = A+T+C, S = G+C, Y = C+T, K = G+T, M = A+C, R = A+G, W = A+T, V

= A+C+G, N = A+T+G+C).

PCR-reaksjonene ble utført på en MJ-forskningstermosykler ved å benytte et

program tilpasset fra Wang et al. (2000, J. Immunol. Methods. 233:167-177): 1) 94 °C,

3 minutter, 2) 94 °C, 15 sekunder, 3) 45 °C, 1 minutt, 4) 72 °C, 2 minutter, 5) sykling tilbake til trinn 2, 29 ganger, 6) avslutning med et siste forlengningstrinn ved 72 °C i 10 minutter. PCR-produktene ble klonet inn i pBluescript II SK+ (Stratagene) ved å benytte restriksjonsenzymer dannet av PCR-primerne. Tungkjede- og lettkjedekloner ble sekvensert av Lark Technologies eller Seqwright sekvenseringsservice.

RACE-PCRen var aldri vellykket for My9-6-lettkjeden. For å kunne bekrefte 5'-ende cDNA-sekvensene, ble dermed ytterligere degenerert PCR og kloning utført. My9-6-lettkjede-cDNA-sekvensen som ble bestemt fra de degenererte PCR-klonene, ble lastet inn på websiden NCBIs BLAST-søk (ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) og de øverste fem murine antistoffsekvensene med signalsekvens som var lagt inn ble tatt vare på. Degenererte PCR-primere ble designet fra disse signalpeptidene ved å benytte programvaren på Codehop-websiden (blocks.fhcrc.fhcrc.org/codehop.html). EcoRI-restriksjonsseter ble tilsatt til tre av de degenererte Codehop-primerne (figur 2) og disse ble benyttet i RT-PCR-reaksjoner som beskrevet ovenfor.

1.3. Fremstilling og sekvensering av tungkjede- og lettkjedeprøver

De tunge og lette kjedene til My9-6 antistoff ble separert ved hjelp av SDS-PAGE under reduserende betingelser. Det reduserte og denaturerte antistoffet ble utsatt for elektroforese på en 12 % tris-glysin-gel (Novex, San Diego, CA). Etter elektroforese ble gelene blotet på en ImmobilonP^-membran ved å benytte CAPS/MeOH-buffer. Etter overføring ble membranene farget med Ponseau S. Båndene som tilsvarte de lette og tunge kjedene, ble skåret ut for proteinsekvensering.

Den lette kjeden på antistoffet ble sekvensert direkte fra membranen ved hjelp av automatisert Edman-degraderingskjemi på en ABI 494 Procise sequencer.

Den N-terminale enden på den tunge kjeden ble blokkert, og slik ble proteinet fordøyd in situ med trypsin i henhold til Gharahdaghi et al., (1996). Fordøyingsblandingen ble deretter analysert ved hjelp av MALDI-TOF-massespektrometri på et Kratos Kompact SEQ-instrument. Valgte peptider ble underkastet MS/MS for å bestemme deres sekvens.

Eksempel 2. Humanisering av variabelregion for antistoff ved overflateendring.

Overflateendring av My9-6-antistoffet for å tilveiebringe humaniserte versjoner som er egnede som terapeutiske eller diagnostiske midler, foregår generelt i henhold til prinsippene og fremgangsmåtene som er beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5 639 641 og som følger.

2.1. Forutsi gel se a v overfl ate

Løsemiddel tilgjengeligheten på variabel-regionrestene foret sett med antistoffer med bekreftede strukturer ble benyttet til å forutsi overflate-restene på variabel regionen til det murine My9-6-antistoffet. Aminosyreløsemiddel tilgjengeligheten for et sett med 127 unike a nt istoffst ru ktu rf i le r (figur 3) ble beregnet ved hjelp av MC-programvarepakken (Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235(3):959-973). De ti mest lignende lettkjede og tungkjede aminosyresekvensene fra dette settet med 127 strukturer ble bestemt ved å benytte sekvens-sammenligningsprogramvaren som er tilgjengelig på NCBI-websiden ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Den gjennomsnittlige løsemiddel tilgjengeligheten for hver variabel regionreste på disse to antistoffvariabelregionene ble beregnet med et excel-ark, og posisjoner med større enn 30 % gjennomsnittlig tilgjengelighet ble ansett for å være overflate reste r. Posisjoner med gjennomsnittlige tilgjengeligheter på mellom 25 % og 35 % ble ytterligere vurdert ved å beregne den individuelle restetilgjengeligheten for kun de strukturene med to identiske rester flankerende på hver side.

2.2. Molekylær modellering

En molekylær modell av den variable regionen til murint My9-6 ble generert ved å benytte Oxford Molecular-programvarepakken AbM. Antistoff rammeverket ble bygget fra strukturfiler for antistoffene med de mest lignende aminosyresekvensene (1 sbs for den lette kjeden og lbbj for den tunge kjeden) og de ikke-kjente CDRene ble bygget ved å søke i en C-a-strukturdatabase inneholdende ikke-overflødige, løste strukturer. Modeller ble sett på med GlaxoSmithKline-Swiss-Pdb-Viewer, og rester som ligger innenfor 5 Å fra en CDR ble bestemt.

2.3. Seleksjon av humant antistoff

Overflateposisjonene til det murine My9-6 variable region ble sammenlignet med de tilsvarende posisjonene i humane antistoffsekvenser i Kabat-databasen (Johnson og Wu, 2001, Nucleic Acid Res. 29(l):205-6). Behandlingsprogramvaren SR (Searle, 1998) for antistoffdatabasen ble benyttet til å ekstrahere og sammenligne overflaterestene fra naturlige, humane tungkjede- og lettkjedepar. Overflaten til den variable regionen av det humane antistoffet med de mest identiske overflaterestene, med spesiell vekt lagt på posisjoner som ligger innenfor 5 Å fra en CDR, ble valgt for å erstatte variabelregionoverflaterestene til det murine My9-6-antistoffet.

2.4. Fremstilling av et humanisert antistoffgen ved PCR-mutagenese

PCR-mutagenese ble utført på variabelregion-cDNA-klonene til det murine My9-6 for først å endre de 5'-endesekvensene for å matche peptidsekvensen, og deretter for å bygge opp det overflateendrede, humane My9-6-genet. Primersett ble designet for å lage de murine restene som ikke opprinnelig var sekvensert i de opprinnelige, degenererte PCR-klonene (lettkjedeposisjoner NI, M3, L4 og S7, og tungkjedeposisjoner Q3 og P7).

Humaniseringsprimersett ble designet for å gjøre de 6 aminosyreendringene som var nødvendige for alle versjoner av huMy9-6, og ytterligere primere ble designet for alternativt å endre de fire 5 Å restene (figur 4). PCR-reaksjoner ble utført på en MJ-Research-termosykler med det følgende programmet: 1) 94 °C, 1 minutt, 2) 94 °C, 15 sekunder, 3) 55 °C, 1 minutt, 4) 72 °C, 1 minutt, 5) sykling tilbake til trinn 2, 29 ganger, 6) avslutning med et siste forlengelsestrinn ved 72 °C i 4 minutter. PCR-produktene ble fordøyd med deres tilsvarende restriksjonsenzymer og klonet inn i pBluescript-kloningsvektorer. Kloner ble sekvensert for å bekrefte aminosyreendringene.

2.5. Ekspresjonsvektor for humaniserte antistoffer

De parede lettkjede- og tungkjedesekvensene ble klonet inn i en enkelt mammalsk ekspresjonsvektor. PCR-primerne for de humane, variable sekvensene dannet restriksjonsseter som tillot den humane signalsekvensen å bli lagt til i pBluescriptll-kloningsvektoren. De variable sekvensene kunne så bli klonet inn i det mammalske ekspresjonsplasmidet med EcoRI og BsiWI eller Hindlll og Apal for henholdsvis den lette kjeden eller den tunge kjeden (figur 5). Lettkjede variabelsekvensene ble klonet i ramme på den humane IgKappa-konstantregionen, og tungkjede variabelsekvensene ble klonet inn i den humane IgGamma 1-konstantregion-sekvensen. I de endelige ekspresjonsplasmidene driver humane CMV-promotorer ekspresjonen av både lettkjede- og tungkjede-cDNA-sekvensene.

2.6. Transient ekspresjon av humaniserte antistoffer

293T-celler ble dyrket i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, BioWhittaker, 12-614F), 10 % varmeinaktivert, føtalt bovint serum (Hyclone, SH30071.03), 4 mM L-glutamin (BioWhittaker, 17-604E) og 1 % penicillin/streptomycinblanding (BioWhittaker, 17-603E) under 6 % C02i en 37 °C-inkubator. Cellene ble splittet tre ganger per uke ved en l:10-fortynning for å opprettholde en subkonfluent populasjon. 24 timer før transfeksjon ble celler trypsinert (BioWhittaker, 17-161E), levende celler ble telt ved hjelp av trypanblått-eksklusjons-fremgangsmåte og sådd ut på 10 cm vevskulturbehandlede plater (Corning, 430167) ved en tetthet på 2 x 10<6->celler per plate. Rett før transfeksjon ble celler vasket forsiktig med fosfatbufret saltløsning (PBS, fortynnet fra BioWhittaker 10 x PBS, 17-517Q) og celler ble dekket med 7 ml hybridom-SFM (InvitroGen, 12045-076) inkludert 1 % Ultra Low IgG-serum (Gibco BRL, 16250-078).

Transienttransfeksjonsfremgangsmåtene ble tilpasset fra standard Qiagen Polyfect-protokollen. For å transfektere en plate på 10 cm, ble 8^g CsCI-grad DNA kombinert med 300 ul Hybridoma SFM og 80 ul Polyfect transfeksjonsreagens (Qiagen, 301107). Transfeksjonsblandingen ble virvlet i omtrent 5 sekunder på lav hastighet og inkubert i 5 minutter ved omgivelsestemperatur. Etter inkubering ble 1 ml Hybridoma SFM, 1 % Ultra Low IgG-serum tilsatt til transfeksjonsblandingen og blandet ved å pipettere opp og ned omtrent fem ganger. Transfeksjonsblanding ble deretter tilsatt til de 7 ml med Hybridoma SFM som lå over cellene, og platene ble virvlet forsiktig for å sikre jevn fordeling. Transfeksjonsreaksjonene ble inkubert over natt, vanligvis 16 timer, i en vevskulturinkubator. Transfeksjonsmediet ble deretter forsiktig fjernet fra cellene og erstattet med 20 ml Hybridoma SMF, 1 % Ultra Low IgG. De transfekterte cellene ble deretter satt tilbake i inkubatoren i 72 timer, og etter dette ble supernatantene høstet, og antistoffproduksjon ble kvantitert ved hjelp av ELISA. Høstet supernatant ble lagret ved 4 °C frem til rensing.

2.7. Rensing av humaniserte antistoffer

Supernatant ble klargjort for protein-A-affinitetskromatografi ved tilsetningen av 1/10 volum med 1 M tris/HCI-buffer, pH 8,0. Den pH-justerte supernatanten ble filtrert gjennom en 0,22 um-filtermembran og satt på en protein-A-sepharosekolonne (HiTrap Protein A HP, 1 ml, Amersham Biosciences) ekvilibrert med bindingsbuffer (PBS, pH 7,3). En Q-sepharose-forkolonne (10 ml) ble koblet oppstrøm på protein-A-kolonnen ved prøvepåsetting for å redusere kontaminering fra cellulært materiale, slik som DNA. Etter prøvepåsetting ble forkolonnen fjernet og orienteringen av protein-A-kolonnen ble reversert for vasking og eluering. Kolonnen ble vasket med bindingsbuffer inntil en stabil baselinje ble oppnådd med ingen absorbans ved 280 nm. Antistoff ble eluert med 0,1 M eddiksyrebuffer inneholdende 0,15 M NaCI, pH 2,8, ved å benytte en strømningshastighet på 0,5 ml/min. Fraksjoner på omtrent 0,25 ml ble samlet og nøytralisert ved tilsettingen av 1/10 volum med 1 M tris/HCI, pH 8,0. Toppfraksjonen(e) ble dialysert over natt mot PBS, pH 7,3. Mengden av antistoff ble kvantifisert ved å måle absorbans ved 280 nm, og antistoffkonsentrasjonen ble beregnet ved å anta at E28o°'<1%>= 1,4. Absorbansspekter analyse og SDS-PAGE ble utført på antistoff-fraksjoner for å verifisere deres renhet.

Eksempel 3. Testing av humanisert antistoffer

3.1. Vekst av celler for bindingsanalyser

HL-60-celler ble fremskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC# CCL-240). De ble holdt i en 5 % C02-atmosfære, 37 °C vannkappeinkubator (Napco Scientific Co., Tualitan, Oregon). Cellene ble dyrket i RPMI-medium tilsatt L-glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD) inneholdende 10 % føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, Utah) plus 50 \ ig/ m\ med gentamicinsulfat (Life Technologies, Grand Island, NY).

3.2. Direkte bindingsanalyse på HL-60-celler

HL-60-celler ble høstet fra T75-flasker (NUNCLONTM, kat. nr. 153732) og sentrifugert ved omtrent 300 x g i fem minutter i en Omnifuge-RT-bordsentrifuge (Haereus Separations, Tyskland) ved 4 °C. Cellene ble resuspendert til en tetthet på 3 x 10<6->celler per ml i FACS-buffer, sammensatt av 2 % (volum/volum) geiteserum (Sigma Chemical Co., St Lois, MO) i MEM-alfa-medium, tilsatt L-glutamin (Life Technologies, Grand Island, NY). Ved å benytte en multikanalpipette ble 3 x 10<5->celler tilsatt til brønner på en Falcon-96-brønners rundbunnet plate (kat. nr. 3077) og deretter plassert på is. Ved å benytte en Falcon-96-brønners fleksibel analyseplate (katalog nr 353911) ble elleve to-gangers seriefortynninger av hver test eller kontrollartikkel klargjort i duplikat i FACS-buffer, fra en utgangskonsentrasjon på 2 x 10<8>M. Deretter ble 100 ul med enten test- eller kontrollartikkel blandet med cellene. Kontrollbrønner ble kun tilsatt FACS-buffer. Platen ble inkubert på is i én time og deretter sentrifugert i fem minutter ved 300 x g i en avkjølt sentrifuge. Reagenser ble fjernet fra platebrønnene ved å snu platen raskt opp-ned over et avfallsbeger inneholdende 10 % blekemiddel. Cellene ble resuspendert ved å vortekse forsiktig, vasket én gang med kald FACS-buffer, sentrifugert og deretter resuspendert med forsiktig vorteksing. FITC-merket geit-anti-human-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, kat. nr. 109-096-003) og FITC-merket geit-anti-mus-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, kat. nr. 109-095-088) ble fortynnet 1:100 i FACS-buffer, og 100 ul ble tilsatt til egnede brønner på analyseplaten. Platene ble deretter inkubert i ytterligere én time på is, beskyttet fra lys. Ubundet, sekundært antistoff ble vasket vekk fra brønnene på samme måte som beskrevet ovenfor. Cellene ble resuspendert ved forsiktig vorteksing og deretter fiksert ved å tilsette 120 ul/brønn med 1 % formaldehyd i fosfatbufret saltløsning (PBS, 10 mM kaliumfosfat, 150 mM natriumklorid, pH 7,2). Analyseplaten ble deretter analysert på et FACScan-flow-cytometer koblet opp med en automatisert 96-brønners prøvetakingsinnretning (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

3.3. Fremstilling av plasmamembraner

Plasmamembraner ble fremstilt i henhold til prosedyren som er beskrevet i Vater et al.

(1995). Kort fortalt ble HL-60 celler dyrket til en tetthet på 1 x 10<6->celler/ml i RPMI tilsatt L-glutamin, inneholdende 10 % føtalt bovint serum og 50 \ ig/ m\ gentamicinsulfat. Når et

totalantall på 1 x 10<9->celler ble oppnådd, ble cellene høstet, spunnet ned ved omtrent 300 x g i en Omifuge-RT-sentrifuge, vasket med Hanks balanserte saltløsning (Life Technologies, kat. nr. 14175-095) og kombinert i et 50 ml konisk sentrifugerør. Pelleten ble deretter frosset ned ved -80 °C i minst 24 timer for å fremme cellelysering og homogenisering. For å fremstille plasmamembraner ble pelleten raskt tint ved 37 °C og deretter lagret på is, og alle påfølgende trinn ble utført ved 4 °C. HL-60-cellepelleten ble resuspendert i 8 ml 10 mM tris-HCI-buffer,

pH 7,0, inneholdende 1 mM EDTA, 0,25 M sukrose og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). Pelleten ble deretter overført til en 15 ml Dounce-vevskvern (Wheaton, Millville, NJ) for celleknusing (20 slag med en tett, passende borsilikatglass-støter). Homogenatet ble sentrifugert i en Sorvall-RC-5B-avkjølt superspeedsentrifuge ved å benytte en SS-34-rotor (Wilmington, DE) ved 6 000 rpm i ti minutter, og supernatanten ble forsiktig fjernet fra pelleten. Pelleten ble vasket en ytterligere gang med 8 ml buffer og prosessert som beskrevet ovenfor. De kombinerte supernatantene ble lagt over en 1 ml 37 % sukroseputebuffer i 10 mM tris-HCI, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, pH 7,0, og ytterligere prosessert i en forhåndsavkjølt Beckman L8-M-ultrasentrifuge med en SW55ti-rotor (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) ved 33 000 rpm i 70 minutter. Det opalescerende membranlaget, som ligger rett over sukrose-puten, ble fjernet fra hvert rør og fortynnet med fire volumer med 10 mM tris-HCI, 1 mM EDTA,

1 mM PMSF, pH 7,0. Denne løsningen ble deretter sentrifugert i ytterligere 30 minutter ved

18 000 rpm i ultrasentrifugen. Supernatanten ble forsiktig sugd av, og de gjenværende pelletene ble resuspendert i 10 mM tris-HCI, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,0. HL-60-membran-preparatet ble alikvotert i 1,5 ml sterile skrukork Eppendorfrør, frosset i flytende nitrogen og så lagret ved -80 °C til anvendelse. Den totale proteinkonsentrasjonen i sluttpreparatet ble bestemt ved å benytte PierceTM BCA-analyse (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, kat. nr. 23235).

3.4. Direkte bindingsanalyse på HL-60-membraner

HL-60-membraner som var fremstilt som beskrevet ovenfor, ble tørket ved en utgangskonsentrasjon på 10 \ ig/ m\ i deionisert vann på polystyrenoverflaten av Immulon-2 96-brønners analyseplater (Dynex Laboratories, Chantilly, VA), ved å benytte en Labconco-vakuumtørker (Labconco, Corp. Kansas City, MO) over natt ved omgivelsestemperatur. ELISA-platen ble deretter blokkert med en 1 %-fraksjon V-bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich, Inc. St. Louis, MO, kat. nr. A-3294), 0,05 % tween 20-løsning (Sigma-Aldrich, Inc. St. Louis, MO, kat. nr. P2287) i tris-bufret saltoppløsning (50 mM tris-HCI, 150 mM natriumklorid, pH 7,5, TBS), 300^g per brønn ved 37 °C i 1 time. Etter dette blokkeringstrinnet ble platen tømt for blokkeringsbuffer og blottet på papirhåndlklær. To tre-gangers seriefortynninger av test- eller kontrollreagenser ble klargjort i blokkeringsbuffer i kvadruplikat, ved å starte ved 3,13 x IO<9>M titrert ned til 5,29 x 10<14>M på en fleksibel 96-brønners analyseplate. Brønnene med negativ kontroll inneholdt blokkeringsbuffer alene. 50 ul av hver fortynning ble overført til angitte brønner på den membranbelagte analyseflaten som så ble inkubert over natt ved 4 °C. Innholdet i brønnene ble deretter aspirert inn i en avfallsflaske inneholdende 10 %

(volum/volum) med blekemiddel, og platen ble vasket 3 ganger med TBS inneholdende 0,1 %

(volum/volum) Tween-20 (vaskebuffer) og blottet på papirhåndklær. Mengden av bundet anti-My9-6-antistoff ble påvist med enten geit-anti-mus-IgG-HRP eller esel-anti-human-IgG-HRP fortynnet 1:1 000 med blokkeringsbuffer i den hensiktsmessige brønnen. Disse sekundære antistoffene ble inkubert på analyseplaten i én time ved romtemperatur, beskyttet fra lys. Platen ble vasket og blottet som tidligere. Platen ble utviklet ved å benytte TMB (BioFX Laboratories, Randallstown, MD, kat. nr. TMBW-0100-01), og deretter quenchet med stoppløsning (BioFX Laboratories, Randallstown, MD, STPR-0100-01). Analyseplaten ble avlest ved A450 nm ved å benytte en TITERTEK-Multiskan-Plus-MK-II-plateavleser (Huntsville, AL).

3.5. Konkurrerende bindingsanalyse på HL-60-membraner

HL-60-membraner, som var klargjort som beskrevet ovenfor, ble tørket ned fra en utgangskonsentrasjon på 10 \ ig/ m\ i deionisert vann på polystyrenoverflaten av Immulon-2 96-brønners analyseplater (Dynex Laboratories, Chantilly VA), ved å benytte en Labconco-vakuumtørker (Labconco, Corp, Kansas City, MO), over natt ved romtemperatur. ELISA-platen ble deretter blokkert med en 1 %-fraksjon V bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, kat. nr. A-3294), 0,05 % Tween-20-løsning (Sigma-Aldrich, Inc. St. Louis, MO, kat. nr. P-2287) i tris-bufret saltløsning (50 mM tris, 15 mM natriumklorid, pH 7,5, TBS), 300 ul per brønn ved 37 °C i 1 time. Etter dette blokkeringstrinnet ble platen tømt for blokkeringsbuffer og blottet på papirhånklær. To to-gangers seriefortynninger av test- eller kontrollreagens ble klargjort i blokkeringsbuffer, i kvadruplikat, ved å starte på 1,25 x IO 8 M titrert ned til 2,44 x 10<11>M (2 x sluttkonsentrasjonen som er nødvendig) på en fleksibel 96-brønns analyseplate. Disse umerkede, konkurrerende reagensene ble deretter blandet med et tilsvarende volum med 2,5 x 10<10>M biotinylert murint anti-My9-6 (ImmunoGen Inc., Cambridge, MA), den positive kontrollen inneholdt ikke noe konkurrerende reagens, mens den negative kontrollen inneholdt blokkeringsbuffer alene. 50 ul av disse blandingene ble overført til angitte brønner på den membranbelagte analyseplaten som deretter ble inkubert over natt ved 4 °C. Brønn-innholdet ble deretter aspirert inn i en avfallsflaske inneholdende 10 % (volum/volum) blekemiddel, og platen ble vasket 3 ganger med TBS inneholdende 0,1 % (volum/volum) Tween-20 (vaskebuffer). Platen ble blottet på papirhåndklær og mengden av bundet biotinylert, murint anti-My9-6 ble påvist med 100 ul per brønn med streptavidin-alkalisk fosfatase (Jackson ImmonoReseach Laboratories, West Grove, PA. kat. nr. 016-050-084), fortynnet 1:5 000 i blokkeringsbuffer. Etter én times inkubering ved romtemperatur og beskyttet fra lys, ble det ubundne, sekundære antistoffreagenset vasket vekk fra brønnene, og platen ble utviklet ved å benytte TMB (BioFX Laboratories, Randallstown, MD, kat. nr. TMBW-0100-01) quenchet med stoppløsning (BioFX Laboratories, Randallstown, MD, kat. nr. STPR-0100-01). Analyseplaten ble avlest ved A450 nm ved å benytte et Titertek-Multiskan-Plus-MK-II-plateavleser (Huntsville,

AL).

3.6. Kloning av variable regioner for det murine antistoffet My9-6

De variable regionene for det murine antistoffet My9-6 ble klonet ved hjelp av RT-PCR-fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor. Flere individuelle lettkjede- og tungkjedekloner ble sekvensert for å identifisere og unngå mulige polymerasegenererte sekvensfeil. Kun en enkel sekvens ble oppnådd for lettkjeden, men to separate sekvenser ble trukket ut av tungkjede-RT-PCR-klonene.

For å bekrefte den faktiske sekvensen til lettkjedens variabel regionen til det murine My9-6, ble peptidsekvenser analysert ved hjelp av Edman-degradering, Matriksassistert laserdesorpsjonsionisering (MALDI) og tandem-massespektrometri (MS-MS). De 2 restene på aminoenden på lettkjeden til My9-6 ble sekvensert ved hjelp av Edman-degradering og er gitt i figur 6A. Den opprinnelige cDNA-sekvensen som er avledet fra degenererte RT-PCR-kloner matchet alle bortsett fra fire rester som sannsynligvis ble generert ved hjelp av de degenererte primerne. Peptidsekvensen som ble bestemt ved hjelp av Edman-degradering ble senere bekreftet ved hjelp av RT-PCR-kloner som var generert ved hjelp av degenererte primere på signalpeptidsekvensen i den 5' enden. MS-MS-analyse av trypsinfordøyde fragmenter bekreftet også sekvensen til lettkjede-CDRene 1 og 2 (figur 6B). Sammen bekrefter disse peptid- analysene den forutsette lettkjede aminosyresekvensen for murint My9-6 som er avledet fra de RT-PCR-genererte cDNA-klonene.

Slik som det vanligvis er tilfellet med tungkjede sekvenser, var tungkjede aminoenden til muMy9-6 blokkert av en pyroglutaminrest og kunne derfor ikke bli sekvensert med N-terminal-Edman-degradering. Isteden ble interne sekvensdata generert ved hjelp av trypsinfordøyinger og analyse ved hjelp av matriksassistert laserdesorpsjonsionisering (MALDI) og tandem-massespektrometri (MS-MS). Et fragment på 1788 dalton ble identifisert med en antatt sekvens som var identisk med en del av cDNA-klon 2 (figur 7). Denne sekvensen inkluderer fem rester fra CDR3 for cDNA-klon 2 og er derfor et ideelt peptid til å gjøre en positiv identifikasjon av muMy9-6-tungkjede. Multiple RACE-PCR-kloner som kun produserer sekvensen som opprinnelig ble fremskaffet fra den degenererte RT-PCR-klon 2, bekreftet også denne peptidsekvensen.

De kumulative resultatene fra de ulike cDNA-klonene og peptidsekvensanalysene tilveiebrakte de endelige lettkjede- og tungkjedesekvensene for murint My9-6 som er vist figur 8. Ved å benytte Kabat- og AbM-definisjoner, ble de tre lettkjede- og tungkjede-CDRene identifisert (figur 8 og 9). Et søk i NCBI-IgBlast-databaser indikerer at lettkjedevariabelregionen til muMy9-6-antistoffet mest sannsynlig stammer fra muse-IgVK- 8-27-kimcellelinjegenet, mens tungkjederegionen mest sannsynlig stammer fra IgVh-V102-kimcellelinjegenet (figur 10).

3.7. Bestemmelse av variabelregion-overflaterestene til My9-6-antistoff

Teknikkene for ovrflateendringer av antistoff som er beskrevet av Pedersen et al.

(1994, J. Mol. Biol. 235:959-973) og Roguska et al. (1996, Protein Eng. 9:895-904) begynner med å beregne overflaterestene i variabelsekvensene til det murine antistoffet. En overflaterest er definert som en aminosyre som har minst 30 % av sitt totale overflateareal tilgjengelig for et vannmolekyl. I fravær av en kjent struktur for å finne overflaterestene for muMy9-6, ble de ti antistoffene med de mest homologe sekvensene i settet av 127 antistoffstruktur-filer sammenlignet med hverandre (figur 11A og B). Løsemiddel tilgjengeligheten for hver Kabat-posisjon ble gjort om til et gjennomsnitt for disse sammenlignede sekvensene, og fordelingen av de relative tilgjengelighetene for hver rest er vist i figur 12.

Flere overflateposisjoner hadde gjennomsnittlig tilgjengeligheter på mellom 25 % og 35 %. Disse ble undersøkt nærmere ved å lage et gjennomsnitt fra kun de antistoffene med to identiske rester flankerende på hver side (figurene 13A og B). De 25 beregnede overflate-restene for muMy9-6-tungkjeden var uendrede etter den ytterligere analysen, men Kabat-posisjoner 15 og 70 i den lette kjeden krevde ytterligere overveielse. Alaninet på lettkjedeposisjon 15 hadde en gjennomsnittlig tilgjengelighet på 34,4 % i alle ti strukturer, men kun én enkelt struktur, 1 mcp, hadde identiske flankerester med de i muMy9-6. I denne strukturen hadde Alal5 en relativ tilgjengelighet på kun 18,2 %. Fordi Alal5 var dramatisk mindre tilgjengelig enn den gjennomsnittlige resten for posisjon 15 i denne enkeltstrukturen, ble de tre strukturene med kun én enkelt forskjell i flankerestene (lap2, lfrg og lhil) også laget et gjennomsnitt av sammen. Den gjennomsnittlige tilgjengeligheten for disse tre strukturene var igjen 33,3 %, noe som gjør Alal5 til en antatt overflaterest. Til slutt forutser overflateendret anti-B4, C242 og overflateendringspatentet selv at lettkjedeposisjon 15 er en overflaterest. Når alt dette tas sammen, er den konservative tilnærmingen å anta at lettkjedeposisjon 15 på muMy9-6 er en overflaterest.

Lettkjedeposisjon 70 på muMy9-6 krevde også spesielle overveielser som til slutt resulterte i en konservativ antagelse av at den er en overflaterest. Det opprinnelige overflateforutsigelsen for den lette kjeden ble gjort med MC-data fra kun de fem mest homologe lettkjedestrukturene, og i denne gruppen var Asp70 en antatt overflaterest. Senere, med de ytterligere fem mest homologe strukturene, ble posisjon 70 funnet å ha en gjennomsnittlig tilgjengelighet på 29,1 % som vist figur 13A. I tillegg hadde ni av de ti strukturene de identiske flankerestene, og gjennomsnittet av dette settet var 29,2 % tilgjengelig. Fordi denne resten så ut til å være så nær 30 %-grensen, og overflateendringspatentet kaller posisjon 70 for en overflateposisjon, ble tilgjengelighetsdataene ytterligere gransket. Posisjon 70 for strukturen live har en relativ tilgjengelighet på 22,5 %, som er fem prosentpoeng mindre enn den nest laveste relative tilgjengeligheten på 27,2 %. Siden live er den åttende mest homologe strukturen, og siden den var et lavt avvik, ble et gjennomsnitt tatt for de åtte strukturene med identiske flankerester i tillegg til live, og dette settet hadde en 30,1 % gjennomsnittlig tilgjengelighet. Dette, sammen med det faktum at den opprinnelige muMy9-6-lettkjedeanalysen og overflateendringspatentet kaller lettkjedeposisjon 70 en overflateposisjon, førte til den konservative antagelsen av at muMy9-6-lettkjede Asp70 er en overflaterest.

3.8. Molekylær modellering for å bestemme hvilke rester som ligger innenfor 5 P fra en CDR

Den molekylære modellen som var generert med AbM-programvarepakken, ble analysert for å bestemme hvilke muMy9-6-overflaterester som kommer innenfor 5 Å av en CDR. For å kunne overflateendre antistoffet, må alle overflaterester på utsiden av en CDR bli endret til sine humane motparter, men rester som kommer innenfor 5 Å av en CDR, kan også bidra til antigenbinding og spesifisitet. Derfor må disse 5 Å-restene bli identifisert og vurdert i hele humaniseringsprosessen. CDR-definisjonene som blir benyttet ved overflateendring, kombinerer AbM-definisjonen for tungkjede-CDR2 og Kabat-definisjonene for de gjenværende fem CDRene (figur 9). Den murine modellen ble analysert med Swiss-Viewer-programvaren og figur 14 viser restene som ligger innenfor 5 Å fra enhver CDR-rest i enten lettkjede- eller tungkjedesekvensen.

3.9. Seleksjon av den mest homologe, humane overflate

Kandidatoverflater for humane antistoffer for å overflateendre muMy9-6 ble trukket ut fra Kabat-antistoffsekvensdatabasen ved å benytte SR-programvare. Denne programvaren tilveiebringer et grensesnitt for kun å søke etter spesifiserte restposisjoner mot antistoff databasen. For å bevare de naturlige parene, ble overflaterestene på både lette og tunge kjeder sammenlignet sammen. De mest homologe, humane overflatene fra Kabat-databasen ble sammenlignet i henhold til rangering av sekvensidentitet. De beste fem overflatene, slik som de ble sammenlignet ved hjelp av SR-Kabat-databaseprogramvaren, er gitt i figur 15. Overflatene ble deretter sammenlignet for å identifisere hvilke humane overflater som ville kreve de minste endringene innefor 5 Å fra en CDR. anti-hepatitt-C-virusantistoffet, LC3bPB (Ivanovski M. et al., 1998, Blood 91 (7):2433-42), krever det minste antallet av overflaterest-endringer (10 totalt) og kun fire av disse restene ligger innfor 5 Å fra en CDR. Fullengdevariabelregionsekvensen for muMy9-6 ble også sammenlignet mot Kabat-humanantistoffdatabasen med SR, og LC3bPB ble identifisert som den 14. mest lignende humane variabelregionsekvensen (data er ikke vist). Siden LC3bPB-antistoffet tilveiebringer den mest homologe overflaten og krever det minste antallet med 5 Å restendringer, er den beste kandidaten for å overflateendre muMy9-6.

3.10. Fremstilling av My9-6-genet for humaniserte My9-6-antistoffer

De ti overflaterestendringene for huMy9-6 ble gjort ved å benytte PCR-mutagenese-teknikker som beskrevet ovenfor. Siden seks av overflaterestene for LC3pPB ikke var mer enn 5 Å fra en CDR, ble disse restene endret fra murine til humane i alle versjoner for humanisert My9-6 (figurene 16A og B). De fire overflaterestene som lå innenfor 5 Å fra en CDR, Kabat-lettkjedeposisjon 1, 3 og 45 og tungkjedeposisjon 64, ble enten endret til human, eller beholdt som murin, for å utgjøre de 16 humaniserte versjonene av My9-6. Av disse er den mest humane versjonen 1.0 siden den har alle ti humane overflaterester. Den mest konservative versjonen når det gjelder å sikre maksimal bindingsaffinitet, er versjon 1.1 som opprettholder de fire murine overflaterestene som ligger innenfor 5 Å fra en CDR. Hvert av de humaniserte My9-6-antistoffgenene ble klonet inn i antistoffekspresjonsplasmidet (figur 5) for transiente og stabile transfeksjoner.

3.11. Bindingsdata

Hovedstyrken med humanisering ved å overflateendre er at ved å opprettholde de ikke-overflatemurine rammeverksrestene, bør humanisert My9-6 fortsette å binde CD33 med uendret affinitet. Likevel kan de fire overflaterestene som faller innenfor 5 Å fra en CDR bidra til antigenbinding og derfor kan endring av disse restene ha negativ effekt på binding. For å møte denne utfordringen inneholder de 16 versjonene av humanisert My9-6, alle kombinasjoner av enten de humane eller murine restene på hver av de fire 5 Å-restposisjonene. Disse strekker seg fra den optimale eller mest humane versjonen, 1.0, med humane rester på hver ikke-CDR-overflateposisjon, til den mest konservative versjonen, 1.1, som opprettholder de murine restene i hver av de fire 5 Å-overflateposisjonene og som derfor bør opprettholde villtypebinding. Ved å sammenligne bindingsaffiniteten for de humanisert My9-6-versjonene med murin My9-6, kan den mest humane versjonen som opprettholder villtypebinding bli valgt som den overflateendrede, humaniserte My9-6.

Direkte og konkurrerende bindingseksperimenter med de humaniserte versjonene av murin My9-6 og med muMy9-6 ble utført på den CD33-uttrykkende, humane leukemi-cellelinjen, HL-60. De tre mest humane versjonene (VI.0, VI.3, VI.6) i tillegg til den mest konservative versjonen (VI.1) ble testet på enten HL-60-membraner eller hele celler. Figur 17 gir KD-verdiene for hver betingelse, og figur 18 viser eksempelbindingskurver for huMy9-6, VI.0, i forhold til muMy9-6. KD-verdiene som er beregnet for de humaniserte My9-6-versjonene, inkludert den mest humane, versjon 1.0, faller innenfor den eksperimentelle feilen for KD-verdien til murin My9-6. De konkurrerende bindingsresultatene viser også at huMy9-6-antistoffer kan konkurrere like godt for CD33-binding som muMy9-6 selv. Siden disse dataene viser nær villtypebindingsaffiniteter for de fullt humaniserte My9-6, VI.0, på HL-60-membraner og hele celler, er det ikke nødvendig å teste ytterligere versjoner siden versjon 1.0 er det optimalt humaniserte My9-6-antistoffet.

Det murine My9-6-antistoffet er blitt fullt humanisert uten tap av bindingsaktivitet. Ingen av overflaterestendringene fra mus til humant førte til et tap av bindingsaffinitet, selv om fire av disse overflaterestene lå innenfor 5 Å fra en CDR. Rester innenfor 5 Å fra en CDR er antatt å ha potensielt kritiske van der Waal-kontakter som kan påvirke strukturene av disse CDRene.

Resultatene av My9-6-humaniseringen tyder på at når antallet med overflateendrede antistoffer øker, kan en grundig restposisjonsanalyse basert på faktiske bindingsdata bli en mer effektiv måte for å finne uvisse rester enn kun å se etter enhver rest som ligger innenfor 5 Å fra en CDR.

Humanisert My9-6 VI.0 (huMy9-6) er det fjerde antistoffet som ble humanisert ved å benytte prosedyren som er beskrevet her. Humanisering ved overflateendring av variabel-regionrammeverket til et murint antistoff ble utviklet som en forbedring av standard humaniseringsfremgangsmåter, inkludert CDR-transplantering, som kan fordre omfattende utvikling og rearrangering for å opprettholde bindingsaktivitet. Dette i motsetning til det overflateendrede huMy9-6-antistoffet som involverte endring av kun ti overflaterester for å danne et fullt aktivt antistoff med en fullstendig human overflate.

Eksempel 4. My9-6-DMl-immunkonjugat

Prekliniske effektstudier med humane tumorxenopodinger i mus ved anvendelse av My9-6-antistoffet konjugert med maytansinoid-legemiddelet DM1 ble utført.

Som diskutert nedenfor, opprettholdt My9-6-DMl spesifisiteten og bindingsaffiniteten til det umodifiserte antistoffet for CD33 og viste potent antigenspesifikk cytotoksisitet mot CD33-positive tumorceller in vitro. Behandling av SCID-mus med etablerte subkutane HL-60-tumorxenopodinger med My9-6-DMl, førte til fullstendig eradikering av tumorene ved doser (20 mg konjugert antistoff/kg/dag i.v. x 5 dager) som ikke viste noen toksisitet og som lå godt under den maksimalt tolererte dosen. I motsetning til dette hadde behandling med My9-6-antistoff alene ingen effekt på HL-60-tumorvekst sammenlignet med vehikkelkontroll. Liknende kureringseffekt ble observert med My9-6-DMl ved behandling av mus som hadde subkutane THP-l-xenopodinger.

4.1. Reagenser

Antistoffet var det murine, monoklonale My9-6-antistoffet rettet mot human CD33 beskrevet ovenfor.

Antistoffmodifiseringsmiddelet var N-suksinimidyl 4-(2-pyridylditio)pentanoat (SPP):

Det cytotoksiske legemiddelet var maytansinanalogen DM1 som blir syntetisert fra et mikrobielt fermenteringsprodukt, Ansamitocin P3. DM1 er en potent inhibitor av tubulin-polymerisering.

4.2. Fremstilling av My9-6-DMl

My9-6-DMl ble fremstilt ved å modifisere My9-6-antistoffet med SPP for å introdusere 3-5 pyridylditiogrupper per molekyl av antistoff. Disulfidutveksling mellom tiolsubstituenten på DM1 og den aktive disulfidfunksjonaliteten på antistoffet tilveiebrakte det DMl-inneholdende antistoffkonjugatet.

4.3. Analyse av antistoffbinding og antistoffkonjugatbinding ved hjelp av flowcytometri

HL-60-celler ble inkubert med ulike konsentrasjoner av enten My9-6-antistoff eller My9-6-DMl. Cellene ble deretter vasket og inkubert med et sekundært FITC-merket anti-murin-IgG-antistoff. Etter en ytterligere vask ble celler fiksert med 2 % formaldehyd, og celleassosiert fluorescens ble kvantifisert ved anvendelse av et BD FACScan flowcytometer. My9-6-DMl opprettholder spesifikk CD33-binding som er sammenlignbar med det umodifiserte antistoffet (figur 19).

4.4. In Wtrø-cytotoksisitetsanalyse

Cytotoksisiteten til My9-6-DMl ble målt ved å benytte den CD33-uttrykkende THP-1-cellelinjen og den CD33-negative cellelinjen Namalwa. Celler ble platet i 96-brønners plater i medium inneholdende konjugatet og inkubert ved 37 °C inntil kolonier ble dannet (2-3 uker). Kolonier ble så tilordnet verdi, og overlevelsesfraksjoner ble bestemt ved å benytte Poisson-fordeling i beregningene.

4.5. In wVo-musetumorxenopodingsundersøkelser

Subkutane tumormodell-HL-60-humane promyelocyttiske leukemiceller (5 x IO<6>celler

i 0,1 ml) ble subkutant inokulert inn i den høyre flanken på SCID-hunnmus. Mus ble behandlet med intravenøs injeksjon inn i en lateral halevene med oppstart når tumorer nådde en størrelse på 100 mm<3>(400 mm<3>i stor tumormodell). Tumorstørrelse og musekroppsvekt ble målt to ganger per uke. Overlevelsesmodell-HL-60-celler (5 x IO<6>celler i 0,1 ml) ble intravenøst injisert inn i den laterale halevenen til SCID-hunnmus. Elleve dager etter tumorcelleinjeksjon ble behandling startet. Mus ble sjekket hver dag for om de var døende, tumormasse eller død. Kroppsvekt ble målt to ganger per uke.

4.6. In vftro-spesifisitet og -effektivitet for My9-6-DMl

Cytotoksisiteten til My9-6-DMl mot CD33-uttrykkende celler (THP-1) sammenlignet med en CD33-negativ cellelinje (Namalwa) ble testet ved å benytte en klonogen analyse der celledrepingsaktivitet ble bestemt ved å kvantifisere antallet kolonier som kan vokse etter behandling. My9-6-DMl oppviser sterk celledrepingsaktivitet mot CD33-positive, humane tumorceller in vitro (figur 20). Ingen signifikant toksisitet mot CD33-negative celler ble observert, noe som tyder på at den CD33-avhengige cytotoksisiteten skyltes spesifikk målsøking ved anti-CD33-antistoffet My9-6.

4.7. Effektivitet av My9-6-DM1 mot humane tumorxenopodinger i mus

Effektiviteten til My9-6-DMl in vivo ble bestemt ved å benytte SCID-mus med humane HL-60-tumorcellexenopodinger. HL-60-celler ble injisert subkutant, og tumorer ble tillatt å vokse til en gjennomsnittlig størrelse på 100 mm<3>. My9-6-DMl-konjugat ble avlevert i.v. én gang om dagen i 5 dager med dosen som er vist i figur 21. Dosering er uttrykt som mg antistoff i konjugatet, noe som tilsvarer en DMl-dose på omtrent 15^g DM1 per mg antistoff. Tumorvolum ble målt som en indikasjon på behandlingseffektivitet, og musekroppsvekt ble overvåket for å indikere toksisitet som skyldes behandling. My9-6-DMl induserer langtidskurering av mus som har humane HL-60-cellexenopodinger ved doser som forårsaker liten toksisitet (figur 21). Ved de to høyeste dosene som ble testet (19 og 26 mg/kg ble fullstendig tilbakedannelse av tumor observert med et maksimalt kroppsvekttap på mindre enn 10 %

(figurene 21A og B). Selv ved den laveste dosen som ble testet (13 mg/kg) viste 2 av 5 mus fullstendig kurering, mens de andre 3 musene viste tumortilbakedannelse med tumorvekst forsinket med omtrent 20 dager. Tilsvarende resultater ble også observert ved å benytte THP-1-leukemicellelinjen der My9-6-DMl induserte langtidskurering av mus som hadde humane THP-l-tumorxenografter (data ikke vist).

Disse resultatene står i skarp kontrast til de som ble oppnådd ved behandling med My9-6-antistoff alene. Antistoff alene har ingen effekt på tumorcellevekst selv ved 50 mg/kg (figur 21C).

Aktiviteten til My9-6-DMl ble sammenlignet med det godkjente anti-CD33-antistoff-calicheamicin-konjugatet Gemtuzumab-ozogamicin. Gemtuzumab-ozogamicin ble administrert hver 4. dag med 3 doser. Et utgangseksperiment viste Gemtuzumab-ozogamicin ble administrert hver 4. dag med 3 doser. Et utgangseksperiment viste at Gemtuzumab-ozogamicin med den publiserte MTD for nakenmus (0,3 mg/kg) var for toksisk for SCID-mus (data ikke vist). Signifikant toksisitet ble også observert ved 100 og 200^g/kg-dosen i dette eksperimentet (figur 21F). Gemtuzumab-ozogamicin viste kun moderat tumortilbakegang og vekstforsinking i denne modellen (omtrent 25 dager) ved den maksimalt tolererte dose (100^g/kg) (figur 21E).

I et separat eksperiment ble anti-tumoraktiviteten til My9-6-DMl-konjugatet sammenlignet med aktiviteten til det ukonjugerte morlegemiddelet, maytansin. Mus med HL-60-tumorxenopodinger ble behandlet daglig i 5 dager med konjugat med 23 mg antistoff per mg/kg eller 350 DMl/^g/kg, ukonjugert legemiddel ved 350^g/kg eller ukonjugert antistoff ved 23 mg/kg. Tre av 6 mus som ble behandlet med maytansin alene døde to dager etter behandling, noe som tyder på at dette nivået av legemiddel er ganske toksisk. Likevel viste legemiddelet en signifikant innvirkning på tumorvekst i de gjenværende 3 musene med en forsinkelse i vekst på omtrent 10 dager (figur 22).

My9-6-antistoff alene hadde ingen effekt på tumorvekst, mens My9-6-DMl-konjugat forårsaket fullstendig tilbakegang av tumorene. Effekten av konjugatbehandling på musekroppsvekt (12 % minskning) var noe større enn i det forrige eksperimentet og kan skyldes parti-variasjoner ved konjugatsyntese. Gjenvekst av tumor i to av de seks konjugatbehandlede musene ble observert og begynte ved dag 70. Disse dyrene ble utsatt for en andre behandling med My9-6-DMl som var identisk med den første behandlingen. Den andre behandlingen førte til en komplett tilbakegang av «tilbakefalls-»tumorene uten at noen skadelig toksisitet ble observert, noe som tyder på at gjenveksten av tumor skyldtes veksten av konjugatresistente celler.

Den potente effektiviteten til My9-6-DMl i denne xenograftmodellen tydet på at konjugatet kunne være effektivt selv mot store HL-60-tumorer. Tumorer ble tillatt å vokse til et tumorvolum på >400 mm<3>før oppstarten av behandling. I tillegg ble sammenligning av aktiviteten av My9-6-DMl med standard kjemoterapeutiske legemidler utført. My9-6-DMl forårsaket fullstendig tilbakedannelse av store tumorer i SCID-mus (figurene 23A og B). Igjen var tilbakefalte tumorer (2 av 6 mus) sensitive for en andre behandling av My9-6-DMl. Behandling med standard kjemoterapeutiske midler (Ara-C og idarubicin) hadde liten effekt på tumorvekst. Høyere legemiddeldoser var svært toksiske for musene (ikke vist).

4.8. Effektivitet av My9-6-DM1 i HL-60-celle-muse-overlevelsesmodell

Mens effektiviteten til My9-6-DMl i tumorxenopodingsmodellen er slående, er det også av interesse å se på aktiviteten til konjugatet i en museoverlevelsesmodell der HL-60-celler blir injisert direkte inn i en halevene hos en mus. I denne modellen dør kontrollmus mellom 30 og 50 dager etter celleinjeksjon. Mus behandlet med My9-6-DMl som starter 11 dager etter celleinjeksjon, viste en dramatisk økning i overlevelse med 7 av 8 mus i live ved 70 dager (figur 24A). Maytansin alene viste signifikant påvirkning på museoverlevelse i denne modellen, selv om 2 av 8 mus døde kort etter starten på behandlingen, noe som tyder på legemiddeltoksisitet. Den relative effektiviteten til maytansin i denne modellen sammenlignet med den subkutane xenopodingsmodellen tyder på at HL-60-tumorer kan være mer sensitive overfor virkningen av legemiddelet i denne settingen. En ytterligere forsinkelse i starten på behandling kan vise en skarpere forskjell mellom målrettet og ikke-målrettet legemiddel. Selv i denne modellen tilveiebrakte standard kjemoterapi ingen signifikant overlevelsesforbedring (figur 24B). Den høyeste kombinasjonsdosen viste signifikant synlig legemiddeltoksisitet. Både My9-6-antistoff alene og Gemtuzumab-ozogamicin viste en moderat økning i overlevelse.

Redegjørelse for deponering

Hybridomet som produserer murine My9-6-antistoffer ble deponert hos the American Type Culture Collection, PO Box 1549, Manassas, VA 20108, 7. november 2002 under retningslinjene som er gitt i Budapestavtalen, og ble tilordnet deponeringsnummer PTA-4786.

Claims (16)

1. CD33 spesifikt antistoffkarakterisert vedat det omfatter

i. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: ii. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: iii. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: iv. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: v. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: vi. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: vii. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: viii. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: ix. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: x. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: xi. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: xii. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: xiii. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved: xiv. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

eller xv. tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

og en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

2. CD33 spesifikt antistoff ifølge krav 1, som omfatter en tungkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

en lettkjede variabelregion som omfatter en aminosyresekvens som er representert ved:

3. Immunkonjugat, karakterisert vedat det omfatter antistoffet ifølge krav 1 eller 2 bundet til et legemiddel eller prolegemiddel.

4. Immunkonjugat ifølge krav 3, karakterisert vedat nevnte legemiddel eller prolegemiddel er valgt fra gruppen som består av et maytansinoid, et taksoid, CC-1065, en CC-1065-analog, dolastatin, en dolastatinanalog, metotreksat, daunorubisin, doksorubisin, vinkristin, vinblastin, melfalan, mitomycin-C, klorambusil, calicheamicin og derivater derav.

5. Preparat, karakterisert vedat det omfatter antistoffet ifølge krav leller 2 og et legemiddel eller prolegemiddel.

6. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert vedat det antistoffet ifølge krav 1 eller 2, immunkonjugatet ifølge krav 3 eller 4, sammensetningen ifølge krav 5 eller den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 6 og et farmasøytisk akseptabelt middel.

7. In vitro fremgangsmåte for å inhibere veksten av en celle som uttrykker CD33,karakterisert vedat den omfatter å kontakte cellen med antistoffet ifølge krav 1 eller 2, immunkonjugatet ifølge krav 3 eller 4, sammensetningen ifølge krav 5 eller den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 6.

8. Antistoffet ifølge krav 1 eller 2, immunkonjugatet ifølge krav 3 eller 4, sammensetningen ifølge krav 5 eller den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 6, for anvendelse som et medikament.

9. Anvendelse av antistoffet ifølge krav 1 eller 2, immunkonjugatet ifølge krav 3 eller 4, sammensetningen ifølge krav 5 eller den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 6, for fremstilling av et medikament til behandling av kreft.

10. Antistoffet ifølge krav 1 eller 2, immunkonjugatet ifølge krav 3 eller 4, sammensetningen ifølge krav 5 eller den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 6, for anvendelse ved behandling av kreft.

11. Anvendelse av antistoff, immunkonjugat, sammensetning eller farmasøytisk sammensetning til bruk som angitt i krav 9 eller 10, hvor kreften er valgt fra gruppen som består av akutt myeloid leukemi (AML), kronisk myeloid leukemi (CML) og pro-myelocyttisk leukemi (PML).

12. Isolert polynukleotid, karakterisert vedat det koder for antistoffet ifølge krav 1 eller 2.

13. Isolert polynukleotid, karakterisert vedat det koder for en lett og en tung kjede for antistoffet ifølge krav 1 eller 2.

14. Rekombinant vektor, karakterisert vedat den omfatter polynukleotidet ifølge krav 12 eller 13.

15. Vertcelle, karakterisert vedat den er transformert med den rekombinante vektoren ifølge krav 14.

16. Fremgangsmåte for å fremstille et CD33 spesifikt antistoff, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter å (a) dyrke en vertcelle ifølge krav 15 ved betingelser slik at vertcellen uttrykker antistoffet, og (b) høste antistoffet som på det viset blir uttrykt.