JP2023542301A - 抗ｂ７ｈ４抗体薬物コンジュゲート療法のためのスコア化方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、癌患者が抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）療法にどのように応答することになるかを予測するための方法であって、各癌細胞に関する単一細胞ＡＤＣスコアに基づく予測的応答スコアをコンピューター処理することを含む方法に関する。各癌細胞に関して、単一細胞ＡＤＣスコアは、癌細胞の膜及び／若しくは細胞質並びに隣接癌細胞の膜及び細胞質における色素の染色強度に基づいてコンピューター処理される。本発明はまた、統計操作を使用して組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによってＡＤＣ療法に対する癌患者の応答を予測すること、その後の関連する抗体薬物コンジュゲートによる癌の治療に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０７７，６０７号の優先権利益を主張する。上で列挙された出願の各々は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出されたコンピューター可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、以下のとおりに特定される：２０２１年９月２日に作成された「Ｂ７Ｈ４－４００－ＷＯ－ＰＣＴ＿ｓｅｑ－ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と命名された１つの１４，３５１バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。

本発明は、癌患者がどのように抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲートを使用する療法に応答することになるかを示すスコアをコンピューター処理するための方法に関する。

所与の治療に対する癌患者の応答可能性を評価することは、癌患者の治療レジメンを決定する際の必須の工程である。そのような評価は、癌患者からの組織試料の組織学的分析に基づく場合が多く、標準的な等級分けスキームを使用して癌を同定すること及び分類することを含む。免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を使用して、タンパク質を発現しないマーカー陰性細胞から特定のタンパク質を発現するマーカー陽性細胞を識別することができる。ＩＨＣ染色は通常、タンパク質特異的抗体に連結された１つ以上の色素を含む複数の色素及び対比染色である別の色素を含む。一般的な対比染色は、ＤＮＡを標識し、したがって、核を染色するヘマトキシリンである。

タンパク質特異的染色又はバイオマーカーを使用して、予め規定された療法に対して応答を示す可能性が高い癌患者の組織の領域を同定することができる。例えば、上皮細胞を染色するバイオマーカーは、疑わしい腫瘍領域を同定するのを助けることができる。次に、他のタンパク質特異的バイオマーカーを使用して、癌性組織内の細胞を特徴付ける。特定のバイオマーカーによって染色される細胞を同定し、定量化することができ、その後陽性染色された細胞及び陰性染色された細胞の数を示すスコアが、病理学者によって視覚的に推定され得る。次に、このスコアは同じ方法で計算された他の癌患者のスコアと比較され得る。所与の癌治療に対するこれらの他の患者の応答が知られる場合、病理学者は、癌患者のために計算されたスコアの他の患者のスコアとの比較に基づいて、癌患者が所与の治療に対してどの程度応答するかを予測することができる。しかしながら、病理学者による視覚的評価は、ばらつき及び主観が入る傾向がある。

１つの有望な癌治療は、抗体にコンジュゲートされた細胞傷害性を有する薬物を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含み、その抗原は癌細胞の表面上で発現される。ＡＤＣは、抗原に結合し、薬物を癌細胞に選択的に送達し、且つそれらの癌細胞内に薬物を蓄積し、それらを死滅させるために細胞内部移行を起こす。コンピューターに基づく方法は、治療用Ｂ７－Ｈ４抗体薬物コンジュゲートを含む治療に対する癌患者の応答を示す再現性があり且つ客観的なスコアを生成するために探求される。

癌患者が抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む療法にどのように応答することになるかを予測するための方法は、各癌細胞に関する単一細胞ＡＤＣスコアに基づく応答スコアをコンピューター処理することを含む。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、各癌細胞上のタンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含む。組織試料は、組織試料において癌細胞上のタンパク質に結合する診断用抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色される。組織試料のデジタル画像が取得される。画像分析をデジタル画像上で実施して、たたみ込みニューラルネットワークを使用して癌細胞を検出する。各癌細胞に関して、単一細胞ＡＤＣスコアは、癌細胞の膜及び／若しくは細胞質並びに／又はその癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における色素の染色強度に基づいてコンピューター処理される。統計操作を使用して組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによってＡＤＣ療法に対する癌患者の応答を予測する応答スコアが生成される。予め規定された閾値より高い応答スコアを有する患者が、ＡＤＣを含む療法に関して推奨される。

一実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）で治療された癌患者の生存可能性を示すスコアを生成する方法は、単一細胞ＡＤＣスコアをコンピューター処理することを含む。癌患者の組織試料は、診断用抗体に連結された色素を使用して、免疫組織化学的に染色される。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと癌細胞上のＢ７－Ｈ４タンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含む。診断用抗体は、組織試料中の癌細胞上のＢ７－Ｈ４タンパク質に結合する。組織試料のデジタル画像を取得し、デジタル画像中の癌細胞を、画像分析を使用して検出する。各癌細胞に関して、単一細胞ＡＤＣスコアを、膜における色素の染色強度に基づいてコンピューター処理する。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、任意選択により、癌細胞の細胞質における色素の染色強度、並びにその癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における色素の染色強度に基づき得る。得られた定量的連続スコア（ＱＣＳ）は、癌患者の生存可能性を示し、統計操作を使用して組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによって生成される。全ての単一細胞ＡＤＣスコアの集約は、平均値を決定すること、中央値を決定すること、又は既定のパーセンテージを有する変位値を決定することによって実施される。別の態様では、全ての単一細胞ＡＤＣスコアの集約は、既定の閾値を使用する閾値操作を含む。既定の閾値より大きい単一細胞ＡＤＣスコアを有する全ての細胞が、標識された単一細胞ＡＤＣ陽性である。集約は、全ての癌細胞の数によって割られた単一細胞ＡＤＣ陽性細胞の数を決定することによって実施される。

一実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に対する癌患者の応答を予測する方法は、癌細胞を検出すること及び各癌細胞に関する単一細胞ＡＤＣスコアをコンピューター処理することを含む。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと癌細胞上のタンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含む。タンパク質は、Ｂ７－Ｈ４である。組織試料は、診断用抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色される。診断用抗体は、組織試料中の癌細胞上のタンパク質に結合する。組織試料のデジタル画像が取得され、癌細胞がデジタル画像中で検出される。各癌細胞に関して、単一細胞ＡＤＣスコアを、膜における色素の染色強度に基づいてコンピューター処理する。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、任意選択により、癌細胞の細胞質における色素の染色強度、並びにその癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における色素の染色強度に基づき得る。各膜の染色強度は、膜の画素中の褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理され、各細胞質の染色強度は、細胞質の画素中の褐色ＤＡＢシグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理される。ＡＤＣに対する癌患者の応答は、統計操作を使用して組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアの集約に基づいて予測される。

いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が５以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が６以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が７以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が８以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が９以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が１０以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が１５以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が２０以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が２５以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。

いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも５０％が、５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも５０％が８以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも６０％が、５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも６０％が８以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも７０％が、５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも７０％が８以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも８０％が、５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも８０％が８以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が、５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９０％が８以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９５％が、５以上、８以上、又は２５以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、腫瘍細胞の少なくとも９５％が８以上の膜光学密度を有する場合、スコア陽性である。

いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、５００細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、１０００細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、１２５０細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、１５００細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、１６００細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、１６７０細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、１７００細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、１８００細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、１９００細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、２０００細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも８の膜光学密度を有する腫瘍細胞の密度が、３０００細胞／ｍｍ２以上である場合、スコア陽性である。

いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９０以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９１以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９２以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９３以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９４以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９５以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９６以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９７以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９８以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９９以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９９．５以上である場合、スコア陽性である。いくつかの実施形態では、患者は、空間近接性スコアが９９．８以上である場合、スコア陽性である。上の実施形態では、空間近接性スコアは、以下のとおりに計算される：空間近接性スコア＝（［ＯＤ＞８を有する腫瘍細胞の数］＋［ＯＤ＞８を有する少なくとも１つの腫瘍細胞の２５ｕｍ近傍にあるＯＤ＜＝８を有する腫瘍細胞の数］）／［全ての腫瘍細胞の数］。

別の実施形態では、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に対して予め規定された応答を示すことになる癌患者を同定する方法は、応答スコアを生成することを含む。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含む。癌患者の組織試料は、組織試料において癌細胞上のタンパク質に結合する診断用抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色される。組織試料のデジタル画像を取得し、デジタル画像中の癌細胞を、たたみ込みニューラルネットワークを使用して検出する。各癌細胞に関して、単一細胞ＡＤＣスコアを、膜における色素の染色強度に基づいてコンピューター処理する。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、任意選択により、癌細胞の細胞質における色素の染色強度、並びに単一細胞スコアがコンピューター処理される癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における色素の染色強度に基づき得る。ＱＣＳスコアは、統計操作を使用して組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによって生成される応答スコアである。癌患者は、ＱＣＳスコアが閾値を超えるかどうかに基づいてＡＤＣに対する予め規定された応答を示すことになるものとして同定される。閾値より大きいＱＣＳスコアを示す患者は、ＱＣＳスコア陽性とみなされ、全ての他の患者は、ＱＣＳスコア陰性とみなされる。予め規定された応答は、平均腫瘍サイズの縮小である。別の態様では、ＱＣＳスコアと閾値の間の差は、癌患者がＡＤＣに対して予め規定された応答を示すことになるものとして正確に同定される可能性を示す。小さい差は、癌患者が正確に同定される可能性が低いことを示す一方で、大きい差は、可能性が高いことを示す。

一実施形態では、癌患者を抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）で治療する方法は、治療スコアの形式でＱＣＳスコアを生成することを含む。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含む。タンパク質は、Ｂ７－Ｈ４である。癌患者の組織試料は、組織試料において癌細胞上のタンパク質に結合する診断用抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色される。組織試料のデジタル画像が取得され、デジタル画像中の癌細胞が検出される。各癌細胞に関して、単一細胞ＡＤＣスコアを、膜における色素の染色強度に基づいて計算する。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、任意選択により、癌細胞の細胞質における色素の染色強度、並びにその癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における色素の染色強度に基づき得る。治療スコアは、統計操作を使用して組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによって生成される。ＡＤＣを含む療法は、治療スコアが予め規定された閾値を超える場合、癌患者に施される。

別の実施形態では、癌患者を抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）で治療する方法は、療法を施す臨床医によって実施される。ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のタンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含む。タンパク質は、Ｂ７－Ｈ４である。ＡＤＣを含む療法は、応答スコアが予め規定された閾値を超える場合、癌患者に施される。ＱＣＳ応答スコアは、統計操作を使用して癌患者の組織試料の単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによって生成された。各単一細胞ＡＤＣスコアは、膜における色素の染色強度に基づいて各癌細胞に関してコンピューター処理された。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、任意選択により、各癌細胞の細胞質における色素の染色強度、並びにまた単一細胞ＡＤＣスコアがコンピューター処理される各癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における色素の染色強度に基づき得る。癌細胞は、癌患者の組織試料のデジタル画像中で検出された。組織試料は、組織試料において癌細胞上のタンパク質に結合する診断用抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色された。

他の実施形態及び利点は、以下の詳細な説明において記載される。この概要は、本発明を定義するものではない。本発明は、特許請求の範囲によって定義される。

添付の図面は、同様の数字が同様の構成要素を示す場合、本発明の実施形態を示す。

ヒトＢ７－Ｈ４をコードする完全なヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。 ヒトＢ７－Ｈ４のためのヌクレオチドコード配列（配列番号２）を示す。 ヒトＢ７－Ｈ４のポリペプチド配列（配列番号３）を示す。 抗Ｂ７Ｈ４抗体の重鎖ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。 抗Ｂ７Ｈ４抗体の重鎖ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。 抗Ｂ７Ｈ４抗体の重鎖ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。 抗Ｂ７Ｈ４抗体の軽鎖ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号７）を示す。 抗Ｂ７Ｈ４抗体の軽鎖ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。 抗Ｂ７Ｈ４抗体の軽鎖ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。 抗Ｂ７Ｈ４抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。 抗Ｂ７Ｈ４抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。 抗Ｂ７Ｈ４抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。 抗Ｂ７Ｈ４抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。 分析システムが癌患者からの組織のデジタル画像を分析し、癌患者が抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲートを含む療法にどのように応答する可能性が高いかを予測する工程のフローチャートである。 図１４の工程２の画像分析プロセスを示すデジタル画像を示す。 癌細胞の核対象が検出される画像分析工程を示す。 核対象を使用して膜を検出する画像分析工程を示す。 癌細胞の膜対象が検出される画像分析工程を示す。 画像分析ソフトウェア環境における画像分析工程の結果のスクリーンショットである。 画像分析区分のために使用されるスクリプト及びそのスクリプトを使用して得られる細胞対象測定値を示す。 膜及び細胞質画素の灰色値を使用する画像分析からの染色強度の試料定量的結果を示す。 図２１の画像の膜上及び細胞質中の染色の例示的な定量的量を列挙する。 抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法が癌細胞を死滅させる機構を示す。 ＡＤＣペイロードの隣接細胞への取り込みを反映する細胞分離に基づいて図２２において示される３つの細胞の各々に関する単一細胞ＡＤＣスコアの計算を示す。 単一細胞スコアが計算される式を示す。 ＰＤＸ乳房試験の１５個の試料の実際のアウトカムと応答分類によって列挙される手作業のＨスコアの間の相関を示す。 手作業の比率スコアを平均Ｈスコアに対して比較するグラフである。 手作業の比率スコアをＢ７Ｈ４膜染色の光学密度に関する中央値ＱＣＳスコアに対して比較するグラフである。 手作業の強度スコアを平均Ｈスコアに対して比較するグラフである。 手作業の強度スコアをＢ７Ｈ４膜染色の光学密度に関する中央値ＱＣＳスコアに対して比較するグラフである。 ３種の応答分類ＰＤ、Ｒ及びＳＤ内にあるＰＤＸ乳房試験の試料の平均Ｈスコアを示す。 ３種の応答分類ＰＤ、Ｒ及びＳＤ内にあるＰＤＸ乳房試験の試料の中央値ＱＣＳスコアを示す。 応答分類Ｒ、ＳＤ及びＰＤに関する試料の手作業のＨスコアの箱ひげ図分布を示す。 応答分類Ｒ、ＳＤ及びＰＤに関する試料の中央値膜光学密度によって定義されるとおりのＱＣＳスコアの箱ひげ図分布を示す。 腫瘍増殖パーセントとＱＣＳスコア（試料中の全ての腫瘍細胞の膜光学密度の中央値／５０％変位値）の間の関連性を示す。 相関線とともに腫瘍増殖パーセントと加えられたＱＣＳスコアの間の関連性を示す。 抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣの薬物動態及び薬力学を試験するために異種移植マウスモデルが画像分析及び定量的連続スコアとともに使用された方法を示す。 図３８Ａは、全ての上皮細胞にわたるＡＤＣ－ＩｇＧに関して染色された上皮細胞の細胞比を示すグラフであり、標的細胞に結合するＡＤＣの濃度依存性及び動態を実証する。図３８Ｂは、ｇＨ２ＡＸ陽性上皮細胞パーセントを示すグラフであり、ＡＤＣ治療後、及び異なるＡＤＣ濃度での経時的なＤＮＡ損傷の増加を実証する。図３８Ｃは、切断されたカスパーゼ－３（ＣＣ－３）陽性腫瘍面積のパーセントに基づくＡＤＣ治療後の経時的なＤＮＡ損傷の増加を示すグラフである。図３８Ｄは、全ての上皮細胞の細胞密度の低減に基づくＡＤＣ治療後の経時的な腫瘍細胞死の増加を示すグラフである。 図３９Ａは、マウスに移植することによってクローン化された２８個の乳癌患者由来の腫瘍組織の膜染色の中央値光学密度を示す。図３９Ｂは、診断用抗体Ｄ１１による膜染色が、診断用抗体Ａ５７．１及びＣａｌ６３による染色よりはるかに少なかった図３９Ａからの試料＃２１の染色された組織を示す。図３９Ｃは、診断用抗体Ａ５７．１による膜染色が、診断用抗体Ｄ１１及びＣａｌ６３による染色より著しく大きかった図３９Ａからの試料＃２８の染色された組織を示す。 図４０Ａは、診断用抗体Ｃａｌ６３を使用して染色された図３９Ａからの試料＃２６のデジタル画像である。図４０Ｂは、診断用抗体Ｃａｌ６３を使用して染色された図３９Ａからの試料＃４のデジタル画像である。 図４１Ａは、様々な濃度のペイロードを有しないＡＤＣによる治療の前及び後の試料＃２６に関する細胞毎の膜染色の分布を示す。図４１Ｂは、ＡＤＣ Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２による治療の前及び後の試料＃４に関する細胞毎の膜染色の分布を示す。 図４２Ａは、試料＃２６に関するＡＤＣ治療の前及び後の結合されたＩｇＧの細胞毎の分布を示す。図４２Ｂは、試料＃４に関するＡＤＣ治療の前及び後の結合されたＩｇＧの細胞毎の分布を示す。 図４２Ｃは、ＡＤＣ Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の様々な投与量レベルでの結合されたＩｇＧの最大膜光学密度のグラフである。図４２Ｄは、ＡＤＣ Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の様々な投与量レベルでの試料＃２６に関する切断されたカスパーゼ－３（ＣＣ－３）陽性腫瘍のパーセントを示す。 図４３Ａは、様々な投与量のＡＤＣによる治療後の様々な時点でのクローン試料＃２６及び＃４に関するＩｇＧの膜光学密度を示すグラフである。図４３Ｂは、７ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２による治療後の様々な時点での試料＃２６の中央値光学密度を示す。 図４４Ａは、試料＃２６に関して、ＡＤＣによる治療後の様々な時点での染色された上皮細胞の密度及び切断されたカスパーゼ－３（ＣＣ－３）陽性腫瘍細胞のパーセントに基づくＡＤＣ治療後の経時的なＤＮＡ損傷の増加を示す。図４４Ｂは、試料＃４に関して、ＡＤＣ治療後の様々な時点での染色された上皮細胞の密度及びＣＣ－３陽性腫瘍細胞のパーセントに基づくＡＤＣ治療後の経時的なＤＮＡ損傷の増加を示す。 図４５Ａは、試料＃２６に関するＡＤＣ治療後の様々な時点での膜光学密度に対する二元空間近接性の関連性を示す。図４５Ｂは、試料＃４に関するＡＤＣ治療後の様々な時点での膜光学密度に対する二元空間近接性の関連性を示す。 図４６Ａは、試料＃２６に関するＡＤＣ治療後の様々な時点での膜光学密度に対する連続的空間近接性の関連性を示す。図４６Ｂは、試料＃４に関するＡＤＣ治療後の様々な時点での膜光学密度に対する連続的空間近接性の関連性を示す。 図４７Ａは、試料＃２６に関するＡＤＣ治療後の様々な時点での上皮細胞密度に対する連続的空間近接性の関連性を示す。図４７Ｂは、試料＃４に関するＡＤＣ治療後の様々な時点での上皮細胞密度に対する連続的空間近接性の関連性を示す。

本発明は、癌患者がどのようにＢ７－Ｈ４抗体薬物コンジュゲートを使用する療法に応答することになるかを示すスコアをコンピューター処理するための新規の方法を提供する。本発明の別の態様は、ＡＤＣで治療された癌患者の生存可能性を示す癌患者のためのスコアをコンピューター処理するための方法に関する。本発明の別の態様は、ＡＤＣに対する癌患者の応答を予測するための方法に関する。本発明の別の態様は、ＡＤＣに対して予め規定された応答を示すことになる癌患者を同定することに関する。本発明のさらに別の態様は、治療スコアが予め規定された閾値を超える場合、ＡＤＣを含む療法を施すことによって癌患者を治療する方法に関する。

Ｉ．定義
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語及び語句が以下に定義される。用語「癌」は、用語「腫瘍」と同じ意味を有するように使用される。

本発明において、「Ｂ７－Ｈ４」は、ＶＴＣＮ１遺伝子によってコードされるＶ－セットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１と同義である。Ｂ７－Ｈ４は、共刺激性タンパク質のＢ７ファミリーの膜貫通ポリペプチドである。Ｂ７－Ｈ４は、Ｔ－リンパ球などの免疫細胞のリガンドとの相互作用のために抗原提示細胞の表面上に発現されると理解され、ＣＤ２８が潜在的なリガンドである。Ｂ７－Ｈ４が様々な癌型の細胞上に高度に発現されるという観察は、この分子が腫瘍関連抗原であることを示唆する。Ｂ７－Ｈ４発現は、特定の癌型に限定されず、むしろ広範囲の癌型を治療するための標的抗原となるものである。Ｂ７－Ｈ４タンパク質の発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）などの当業者によく知られる方法を使用して検出され得る。

Ｂ７－Ｈ４のＲＮＡ、ＤＮＡ、及びアミノ酸配列は当業者に知られており、多くのデータベース、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）及びＵｎｉＰｒｏｔのデータベースにおいて見出され得る。ＵｎｉＰｒｏｔで見出されるこれらの配列の例は、ヒトＢ７－Ｈ４に関してＱ７Ｚ７Ｄ３（ＶＴＣＮ１＿ＨＵＭＡＮ）；及びマウスＢ７－Ｈ４に関してＱ７ＴＳＰ５（ＶＴＣＮ１＿ＭＯＵＳＥ）である。ヒトＢ７－Ｈ４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１（図１）又はより好ましくは配列番号２（図２）であり得る。ヒトＢ７－Ｈ４のポリペプチド配列は、好ましくは、配列番号３（図３）である。

本発明において、「抗Ｂ７Ｈ４抗体」は、好ましくはＢ７－Ｈ４に結合する活性を有し、それによりＢ７－Ｈ４発現細胞に内部移行される、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する抗体を意味する。言い換えると、「抗Ｂ７Ｈ４抗体」は、Ｂ７－Ｈ４に結合する活性を有し、その後Ｂ７－Ｈ４発現細胞中に移動する抗体を意味する。

抗Ｂ７Ｈ４抗体は、配列番号４（図４）のアミノ酸配列を有する重鎖ＨＣＤＲ１、配列番号５（図５）のアミノ酸配列を有する重鎖ＨＣＤＲ２、配列番号６（図６）のアミノ酸配列を有する重鎖ＨＣＤＲ３、配列番号７（図７）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＬＣＤＲ１、配列番号８（図８）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＬＣＤＲ２、及び配列番号９（図９）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＬＣＤＲ３を含む。抗Ｂ７Ｈ４抗体は、配列番号１０（図１０）のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１（図１１）のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。抗Ｂ７Ｈ４抗体は、配列番号１２（図１２）のアミノ酸配列を含む重鎖（例えば、ＶＨ及び定常重鎖を含む）及び配列番号１３（図１３）のアミノ酸配列を含む軽鎖（例えば、ＶＬ及び定常軽鎖を含む）を含む。

「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書では哺乳動物対象を指すために互換的に使用される。一実施形態では、「対象」は、ヒト、飼育動物、家畜、スポーツ動物、及び動物園の動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシなどである。一実施形態では、対象は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）である。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。本発明の方法において、患者は、以前に癌を有すると診断されていなくてもよい。或いは、患者は、以前に癌を有すると診断されていてもよい。患者はまた、疾患リスク因子を示す者、又は癌に関して無症状である者であってもよい。患者はまた、癌に罹患しているか又は癌を発症するリスクがある者であってもよい。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、患者において癌の存在を確認するために使用され得る。例えば、患者は、以前に代替的な手段によって癌を有すると診断されていてもよい。一実施形態では、患者は、癌療法を以前に施されたことがある。

本発明において、用語「ＱＣＳ陽性」は、抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法に対する応答を示す可能性が高い癌を指す。用語「ＱＣＳ陰性」は、抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法に対する応答を示す可能性が低い癌を指す。頭字語ＱＣＳは、定量的連続スコアを意味する。本発明の新規の予測方法の結果は一般に、定量的連続スコアとして参照され、応答スコア又は予測された生存期間の指標であり得る。

ＩＩ．抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲート。
本発明において使用される抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲートは、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ツブリシン誘導体、ピロロベンゾジアゼピン、又はその組み合わせから選択される１つ以上の細胞毒にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体又は抗原結合断片を含む。例えば、抗体又はその抗原結合断片は、トポイソメラーゼＩ阻害剤ＳＧ３９３２、ＳＧ４０１０、ＳＧ４０５７又はＳＧ４０５２（下で提供される構造）；ツブリシンＡＺ１５０８、ピロロベンゾジアゼピンＳＧ３３１５、ピロロベンゾジアゼピンＳＧ３２４９、又はその組み合わせからなる群から選択される１つ以上の細胞毒にコンジュゲートされる。

抗体又はその抗原結合断片は、トポイソメラーゼＩ阻害剤にコンジュゲートされることが好ましい。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ（トポイソメラーゼＩ及びＩＩ）の作用を遮断する化合物であり、これは、正常な細胞周期中のＤＮＡ鎖のリン酸ジエステル骨格の切断及び再結合を触媒することによって、ＤＮＡ構造の変化を制御する酵素の一種である。

好適なトポイソメラーゼＩ阻害剤の一般的な例は、以下の化合物によって表される：
［式１］

上で示される化合物は、Ａ＊として表示され、本明細書で「薬物単位」と称され得る。化合物Ａ＊は、好ましくは、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片（「リガンド単位」として称され得る）に連結する（好ましくは、コンジュゲートする）ためのリンカーを伴って提供される。好適には、リンカーは、開裂可能な様式で、アミノ残基、例えば、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のアミノ酸に結合される（例えば、コンジュゲートされる）。

より具体的には、好適なトポイソメラーゼＩ阻害剤の例は、「Ｉ」として表示される以下の化合物によって表される：
［式２］

化合物Ｉは、塩及びその溶媒和物を含み、式中、Ｒ^Ｌは、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）への連結のためのリンカーであり、前記リンカー「Ｉａ」は、好ましくは、
［式３］
から選択され、
Ｑは、
［式４］
であり、式中、Ｑ^Ｘは、Ｑがアミノ酸残基、ジペプチド残基、トリペプチド残基又はテトラペプチド残基であるようなものであり、式３におけるＸは、
［式５］
であり、式中、ａ＝０～５、ｂ１＝０～１６、ｂ２＝０～１６、ｃ１＝０又は１、ｃ２＝０又は１、ｄ＝０～５であり、ここで少なくともｂ１又はｂ２＝０（すなわち、ｂ１及びｂ２の一方だけが、０でない場合がある）であり、少なくともｃ１又はｃ２＝０（すなわち、ｃ１及びｃ２の一方だけが、０でない場合がある）である。式３におけるＧ^Ｌは、本明細書に記載されるとおりの抗体又はその抗原結合断片に連結するためのリンカーである。或いは、式３におけるＧ^Ｌは、「Ｉｂ」として表示される化合物：
［式６］
であり、式中、Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２は、独立して、Ｈ及びメチルから選択されるか、又はそれらが結合される炭素原子と合わせて、シクロプロピレン又はシクロブチレン基を形成する。式６において、ｅは、０又は１である。

前記薬剤（例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤）の２つ以上が、抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされ得ることが当業者によって理解されることになる。例えば、本発明のコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲート）は、一般式Ｌ－（Ｄ^Ｌ）_ｐ又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物のものであってもよく、Ｌは、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）であり、ｐは、１～２０の整数であり、Ｄ^Ｌは、以下の式によって表されるリンカー（例えば、薬物リンカー単位）を有するトポイソメラーゼＩ阻害剤である：
［式７］

式７において、Ｒ^ＬＬは、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）に連結されたリンカーであり、リンカーは、好ましくは、「Ｉａ’」又は「Ｉｂ’」から選択され：
［式８］
式中、Ｑ及びＸは、上で定義されるとおりであり、且つＧ^ＬＬは、本明細書に記載されるとおりの抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）に連結されたリンカーである。Ｉｂ’は、式：
［式９］
によって表され、
式中、Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２は、上で定義されるとおりである。抗体薬物コンジュゲートのための式Ｌ－（Ｄ^Ｌ）_ｐにおける「ｐ」は、薬物負荷量を表し、抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）当たりのトポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、薬物単位）の数である。薬物負荷量は、リガンド単位当たり１～２０個の薬物単位（ＤＬ）の範囲である。各薬物リンカー単位は、抗Ｂ７Ｈ４抗体にコンジュゲートされる。組成物の場合、「ｐ」は、組成物中のコンジュゲートの平均薬物負荷量を表し、「ｐ」は、１～２０の範囲である。「ｐ」の意味は、いわゆるコンジュゲートされた薬物分子の平均数（薬物対抗体比ＤＡＲ）の意味と同じであり、１つの抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物－リンカーの単位の平均数を示す。

したがって、本明細書に記載される抗体薬物コンジュゲートは、少なくとも１つのトポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、上で示されるＡ＊などの薬物単位）に共有結合的に連結された本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）を含むコンジュゲートを包含する。前記阻害剤は、好ましくは、Ｒ^Ｌ及び／又はＲ^ＬＬとしての上記のリンカーなどのリンカー（例えば、リンカー単位）によって抗体又はその抗原結合断片に連結される。言い換えると、本明細書に記載される抗体薬物コンジュゲートは、好ましくはリンカー（例えば、薬物リンカー単位）を介して結合された１つ以上のトポイソメラーゼＩ阻害剤を有する本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）を包含する。上でより十分に記載される抗体又はその抗原結合断片（リガンド単位を表す）は、標的部分に結合する標的化薬剤である。より具体的には、リガンド単位は、例えば、標的細胞上のＢ７－Ｈ４タンパク質に特異的に結合し、それにより薬物単位が送達される。したがって、本発明はまた、例えば、様々な癌及び他の障害（例えば、細胞、好ましくは、Ｂ７－Ｈ４を発現する癌性細胞の存在と関連する癌／障害）のＡＤＣによる治療のための方法を提供する。

癌細胞への細胞内部移行を経た後、本発明において使用される抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲートは、リンカー単位で切断され、薬物単位を癌細胞中に放出する。本発明において使用される抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲートはまた、抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲートが、標的タンパク質Ｂ７－Ｈ４を発現する癌細胞中に内部移行され、続いて薬物単位はまた、標的タンパク質Ｂ７－Ｈ４を発現しない隣接している癌細胞に対する抗腫瘍効果を発揮するバイスタンダー効果を有する。

ＩＩＩ．好ましい実施形態のさらなる優先事項。
以下の優先事項は、上述の本発明の全ての態様に適用されてもよく、又は、単一の態様に関していてもよい。優先事項は、任意の組み合わせで一緒に組み合わされてもよい。この節におけるある特定の用語に関係する様々な定義は、下記の見出し「さらなる化学的定義」の下で提供される。

上記のトポイソメラーゼＩ阻害剤のある特定の特徴が特に好ましく、下でより詳細に定義される。一例として、式４のリンカーの特徴Ｑ^Ｘの好ましい実施形態が概説される。一実施形態では、Ｑはアミノ酸残基である。アミノ酸は、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸であってもよい。例えば、Ｑは、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｃｉｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、及びＴｒｐから選択されてもよく、ここで、Ｃｉｔはシトルリンである。一実施形態では、Ｑはジペプチド残基を含む。ジペプチド中のアミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の任意の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、ジペプチドは天然アミノ酸を含む。リンカーが、カテプシンに不安定なリンカーである場合、ジペプチドは、カテプシン媒介開裂の作用部位である。その場合、ジペプチドはカテプシンの認識部位である。

一実施形態では、Ｑは：
^ＮＨ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｖａｌ－Ａｌａ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｐｈｅ－Ｃｉｔ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｌｅｕ－Ｃｉｔ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｉｌｅ－Ｃｉｔ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｔｒｐ－Ｃｉｔ－^Ｃ＝Ｏ、及び
^ＮＨ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－^Ｃ＝Ｏから選択され；
式中、Ｃｉｔは、シトルリンである。好ましくは、Ｑは：
^ＮＨ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｖａｌ－Ａｌａ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－^Ｃ＝Ｏ、及び
^ＮＨ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－^Ｃ＝Ｏから選択される。

より好ましくは、Ｑは、^ＮＨ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－^Ｃ＝Ｏ、^ＮＨ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－^Ｃ＝Ｏ又は^ＮＨ－Ｖａｌ－Ａｌａ－^Ｃ＝Ｏから選択される。他の好適なジペプチドの組み合わせは、
^ＮＨ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－^Ｃ＝Ｏ、及び
^ＮＨ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－^Ｃ＝Ｏを含む。

参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１３，８５５－８６９に記載されるものを含む他のジペプチドの組み合わせを使用してもよい。

いくつかの実施形態では、Ｑは、トリペプチド残基である。トリペプチド中のアミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の任意の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、トリペプチドは天然アミノ酸を含む。リンカーが、カテプシンに不安定なリンカーである場合、トリペプチドは、カテプシン媒介開裂の作用部位である。その場合、トリペプチドはカテプシンの認識部位である。特に興味深いトリペプチドリンカーは：
^ＮＨ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ａｌａ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－^Ｃ＝Ｏ、
^ＮＨ－αＧｌｕ－Ｖａｌ－Ａｌａ－^Ｃ＝Ｏ、及び
^ＮＨ－αＧｌｕ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－^Ｃ＝Ｏである。

いくつかの実施形態では、Ｑは、テトラペプチド残基である。テトラペプチド中のアミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の任意の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、テトラペプチドは天然アミノ酸を含む。リンカーが、カテプシンに不安定なリンカーである場合、テトラペプチドは、カテプシン媒介開裂の作用部位である。その場合、テトラペプチドはカテプシンの認識部位である。特に興味深いテトラペプチドリンカーは：
^ＮＨ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ^Ｃ＝Ｏ；及び
^ＮＨ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ^Ｃ＝Ｏである。

いくつかの実施形態において、テトラペプチドは：
^ＮＨ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ^Ｃ＝Ｏである。

ペプチド残基の上記表現において、^ＮＨ－は、残基のＮ－末端を表し、－^Ｃ＝Ｏは、残基のＣ－末端を表す。Ｃ末端は、式１に示される化合物Ａ＊のＮＨに結合する。Ｇｌｕは、グルタミン酸残基、すなわち：
［式１０］
を表す。

αＧｌｕは、α鎖を介して結合した場合のグルタミン酸残基、すなわち：
［式１１］
を表す。

一実施形態では、適切な場合、アミノ酸側鎖が化学的に保護されている。側鎖保護基は、上述のとおりの基であってもよい。保護されたアミノ酸配列は、酵素によって開裂可能である。例えば、Ｂｏｃ側鎖保護Ｌｙｓ残基を含むジペプチド配列は、カテプシンによって開裂可能である。

アミノ酸の側鎖のための保護基は、当該技術分野においてよく知られており、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ及び上で記載される。

式３のリンカーのＧ^Ｌは、以下から選択され得る。

式中、Ａｒは、Ｃ_５～６アリーレン基、例えば、フェニレンを表し、Ｘは、Ｃ_１～４アルキルを表す。

いくつかの実施形態では、Ｇ^Ｌは、Ｇ^Ｌ１－１及びＧ^Ｌ１－２から選択される。これらの実施形態のいくつかでは、Ｇ^Ｌは、Ｇ^Ｌ１－１である。Ｇ^ＬＬは、以下から選択され得る。

式中、Ａｒは、Ｃ_５～６アリーレン基、例えば、フェニレンを表し、Ｘは、Ｃ_１～４アルキルを表す。いくつかの実施形態では、Ｇ^ＬＬは、Ｇ^{ＬＬ１－１}及びＧ^{ＬＬ１－２}から選択される。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｇ^ＬＬは、Ｇ^{ＬＬ１－１}である。

Ｘは、好ましくは、
［式１２］
であり、式中、ａ＝０～５、ｂ１＝０～１６、ｂ２＝０～１６、ｃ＝０又は１、ｄ＝０～５であり、ここで少なくともｂ１又はｂ２＝０、少なくともｃ１又はｃ２＝０である。

「ａ」は、０、１、２、３、４又は５であってもよい。いくつかの実施形態では、ａは、０～３である。これらの実施形態のいくつかでは、ａは、０又は１である。さらなる実施形態では、ａは、０である。

「ｂ１」は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６であってもよい。いくつかの実施形態では、「ｂ１」は、０～１２である。これらの実施形態のいくつかでは、「ｂ１」は、０～８であり、０、２、３、４、５又は８であってもよい。

「ｂ２」は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６であってもよい。いくつかの実施形態では、「ｂ２」は、０～１２である。これらの実施形態のいくつかでは、「ｂ２」は、０～８であり、０、２、３、４、５又は８であってもよい。好ましくは、ｂ１及びｂ２の一方だけが、０でない場合がある。

「ｃ１」は、０又は１であってもよい。「ｃ２」は、０又は１であってもよい。好ましくは、「ｃ１」又は「ｃ２」の一方だけが、０でない場合がある。

「ｄ」は、０、１、２、３、４又は５であってもよい。いくつかの実施形態では、「ｄ」は、０～３である。これらの実施形態のいくつかでは、「ｄ」は、１又は２である。さらなる実施形態では、「ｄ」は、２である。さらなる実施形態では、「ｄ」は、５である。

Ｘのいくつかの実施形態では、ａは０であり、ｂ１は０であり、ｃ１は１であり、ｃ２は０であり、ｄは２であり、ｂ２は０～８であってもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ｂ２は、０、２、３、４、５、又は８である。Ｘのいくつかの実施形態では、ａは１であり、ｂ２は０であり、ｃ１は０であり、ｃ２は０であり、ｄは０であり、ｂ１は０～８であってもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ｂ１は、０、２、３、４、５、又は８である。Ｘのいくつかの実施形態では、ａは０であり、ｂ１は０であり、ｃ１は０であり、ｃ２は０であり、ｄは１であり、ｂ２は０～８であってもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ｂ２は、０、２、３、４、５、又は８である。Ｘのいくつかの実施形態では、ｂ１は０であり、ｂ２は０であり、ｃ１は０であり、ｃ２は０であり、ａ及びｄのうちの一方は０である。ａ及びｄのうちの他方は１～５である。これらの実施形態のいくつかでは、ａ及びｄのうちの他方は１である。これらの実施形態のその他では、ａ及びｄのうちの他方は５である。Ｘのいくつかの実施形態では、ａは１であり、ｂ２は０であり、ｃ１は０であり、ｃ２は１であり、ｄは２であり、ｂ１は０～８であってもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ｂ２は、０、２、３、４、５又は８である。

いくつかの実施形態では、Ｒ^Ｌは、式６のＩｂである。いくつかの実施形態では、Ｒ^ＬＬは、式９の基Ｉｂ’である。Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２は、Ｈ及びメチルから独立して選択され得るか、又はそれらが結合される炭素原子と合わせて、シクロプロピレン又はシクロブチレン基を形成する。

いくつかの実施形態では、Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２の両方が、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ^Ｌ１は、Ｈであり、且つＲ^Ｌ２は、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２の両方が、メチルである。

いくつかの実施形態では、Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２は、それらが結合される炭素原子と合わせて、シクロプロピレン基を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２は、それらが結合される炭素原子と合わせて、シクロブチレン基を形成する。

式６の基Ｉｂにおいて、いくつかの実施形態では、ｅは、０である。他の実施形態では、ｅは、１であり、ニトロ基は、環の任意の利用可能な位置にあってもよい。これらの実施形態のいくつかでは、それは、オルト位にある。これらの実施形態の他のものにおいて、それは、パラ位にある。

本明細書に記載される化合物が、単一の鏡像異性体又は片方の鏡像異性体に富んだ形態で提供されるいくつかの実施形態では、片方の鏡像異性体に富んだ形態は、６０：４０超、７０：３０超；８０：２０超又は９０：１０超の鏡像異性体比を有する。さらなる実施形態では、鏡像異性体比は、９５：５超、９７：３超又は９９：１超である。

いくつかの実施形態では、式２のＲ^Ｌは、以下から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｒ^ＬＬは、上記のＲ^Ｌ基から誘導される基である。

上の前記優先事項を概説した後、ある特定の好ましいトポイソメラーゼＩリンカー式（例えば、薬物リンカー単位のもの）がここで記載される。いくつかの実施形態では、式２の化合物Ｉは、化合物Ｉ^Ｐ：
［式１３］
並びにその塩及び溶媒和物である。Ｒ^ＬＰは、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片に対する連結のためのリンカーであり、前記リンカーは、基Ｉａ又はＩｂから選択される。基Ｉａは、式：
［式１４］
によって表され、式中、Ｑ^Ｐは、
（式中、Ｑ^ＸＰは、Ｑ^Ｐが、アミノ酸残基、ジペプチド残基又はトリペプチド残基であるようなものである）であり；式１４におけるＸ^Ｐは、
［式１５］
であり、式中、ａＰ＝０～５、ｂＰ＝０～１６、ｃＰ＝０又は１、及びｄＰ＝０～５である。式１４におけるＧ^Ｌは、抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）に連結するためのリンカーである。ａＰは、０、１、２、３、４、又は５であってもよい。いくつかの実施形態では、ａＰは、０～３である。これらの実施形態のいくつかでは、ａＰは、０又は１である。さらなる実施形態では、ａＰは、０である。ｂＰは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６であってもよい。いくつかの実施形態では、ｂは、０～１２である。これらの実施形態のいくつかでは、ｂＰは、０～８であり、０、２、４、又は８であってもよい。ｃＰは、０又は１であってもよい。ｄＰは、０、１、２、３、４、又は５であってもよい。いくつかの実施形態では、ｄＰは、０～３である。これらの実施形態のいくつかでは、ｄＰは、１又は２である。さらなる実施形態では、ｄＰは、２である。

基Ｉｂは、式：
［式１６］
によって表され、Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２は、Ｈ及びメチルから独立して選択されるか、又はそれらが結合される炭素原子と合わせて、シクロプロピレン又はシクロブチレン基を形成する。式１６における「ｅ」は、０又は１である。

式１４のＸ^Ｐのいくつかの実施形態では、ａＰは、０であり、ｃＰは、１であり且つｄＰは、２であり、ｂＰは、０～８であってもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ｂＰは０、４又は８である。

化合物Ｉに関する式４のＱ^Ｘの優先事項は、式１４のＱ^ＸＰに適用され得る。式２の化合物Ｉに関する上のＧ^Ｌ、Ｒ^Ｌ１、Ｒ^Ｌ２及びｅに関する優先事項は、式１３の化合物Ｉ^Ｐに適用され得る。

いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲートＬ－（Ｄ^Ｌ）_ｐのコンジュゲートは、Ｌ－（Ｄ^ＬＰ）_ｐ又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物であり、Ｌは、抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）であり、Ｄ^ＬＰは、化合物ＩＩＩ^Ｐ：
［式１７］
であるトポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、薬物リンカー単位）であり、
Ｒ^ＬＬＰは、抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）に連結されたリンカーであり、前記リンカーは、基Ｉａ’又はＩｂ’から選択される。基Ｉａ’は、式：
［式１８］
によって表され、式中、Ｑ^Ｐ及びＸ^Ｐは、上で定義されるとおりであり、且つＧ^ＬＬは、抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）に連結されたリンカーである。基Ｉｂ’は、式：
［式１９］
によって表され、式中、Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２は、上で定義されるとおりであり；且つｐは、１～２０の整数である。

いくつかの実施形態では、式２の化合物Ｉは、化合物Ｉ^Ｐ２：
［式２０］
並びにその塩及び溶媒和物である。Ｒ^ＬＰ２は、抗体又はその抗原結合断片に対する連結のためのリンカーであり、前記リンカーは、基Ｉａ又はＩｂから選択される。基Ｉａは、式：
［式２１］
によって表され、Ｑは：
であり、式中、Ｑ^Ｘは、Ｑがアミノ酸残基、ジペプチド残基、トリペプチド残基又はテトラペプチド残基であるようなものである。Ｘ^Ｐ２は：
であり、式中、ａＰ２＝０～５、ｂ１Ｐ２＝０～１６、ｂ２Ｐ２＝０～１６、ｃＰ２＝０又は１、ｄＰ２＝０～５であり、ここで、少なくともｂ１Ｐ２又はｂ２Ｐ２＝０（すなわち、ｂ１及びｂ２の一方だけが、０でない場合がある）である。式２１のＧ^Ｌは、抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）に連結するためのリンカーである。

ａＰ２は、０、１、２、３、４又は５であってもよい。いくつかの実施形態では、ａＰ２は、０～３である。これらの実施形態のいくつかでは、ａＰ２は、０又は１である。さらなる実施形態では、ａＰ２は、０である。ｂ１Ｐ２は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６であってもよい。いくつかの実施形態では、ｂ１Ｐ２は、０～１２である。これらの実施形態のいくつかでは、ｂ１Ｐ２は、０～８であり、０、２、３、４、５又は８であってもよい。ｂ２Ｐ２は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６であってもよい。いくつかの実施形態では、ｂ２Ｐ２は、０～１２である。これらの実施形態のいくつかでは、ｂ２Ｐ２は０～８であり、０、２、３、４、５、又は８であってもよい。好ましくは、ｂ１Ｐ２及びｂ２Ｐ２の一方だけが、０でない場合がある。ｃＰ２は、０又は１であってもよい。ｄＰ２は、０、１、２、３、４又は５であってもよい。いくつかの実施形態では、ｄＰ２は、０～３である。これらの実施形態のいくつかにおいて、ｄＰ２は、１又は２である。さらなる実施形態では、ｄＰ２は、２である。さらなる実施形態では、ｄＰ２は、５である。

基Ｉｂは、式：
［式２２］
によって表され、式中、Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２は、独立して、Ｈ及びメチルから選択されるか、又はそれらが結合される炭素原子と合わせて、シクロプロピレン又はシクロブチレン基を形成し；且つｅは、０又は１である。

式２１のＸ^Ｐ２のいくつかの実施形態では、ａＰ２は０であり、ｂ１Ｐ２は０であり、ｃＰ２は１であり且つｄＰ２は２であり、且つｂ２Ｐ２は、０～８であってもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ｂ２Ｐ２は、０、２、３、４、５又は８である。Ｘ^Ｐ２のいくつかの実施形態では、ａＰ２は１であり、ｂ２Ｐ２は０であり、ｃＰ２は０であり且つｄＰ２は０であり、且つｂ１Ｐ２は０～８であってもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ｂ１Ｐ２は、０、２、３、４、５又は８である。Ｘ^Ｐ２のいくつかの実施形態では、ａＰ２は０であり、ｂ１Ｐ２は０であり、ｃＰ２は０であり且つｄＰ２は１であり、且つｂ２Ｐ２は０～８であってもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ｂ２Ｐ２は、０、２、３、４、５又は８である。Ｘ^Ｐ２のいくつかの実施形態では、ｂ１Ｐ２は０であり、ｂ２Ｐ２は０であり、ｃＰ２は０であり、且つａＰ２及びｄＰ２のうちの一方は、０である。ａＰ２及びｄのうちの他方は、１～５である。これらの実施形態のいくつかでは、ａＰ２及びｄのうちの他方は、１である。これらの実施形態のその他では、ａＰ２及びｄＰ２のうちの他方は、５である。

式２の化合物Ｉに関する上のＱ^Ｘに関する優先事項は、式２１の基Ｉａ^Ｐ２におけるＱ^Ｘに適用され得る。式２の化合物Ｉに関する上のＧ^Ｌ、Ｒ^Ｌ１、Ｒ^Ｌ２及びｅに関する優先事項は、式２１の化合物Ｉａ^Ｐ２に適用され得る。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートＬ－（Ｄ^Ｌ）_ｐのコンジュゲートは、化合物Ｌ－（Ｄ^ＬＰ２）_ｐ又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物であり、Ｌは、抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）であり、Ｄ^ＬＰ２は、化合物ＩＩＩ^Ｐ２：
［式２３］
であるトポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、薬物リンカー単位）であり、Ｒ^ＬＬＰ２は、抗体又はその抗原結合断片（例えば、リガンド単位）に連結されたリンカーであり、前記リンカーは、基Ｉａ’又はＩｂ’から選択される。基Ｉａ’は、式：
［式２４］
によって表され、式中、Ｑ及びＸ^Ｐ２は、上で定義されるとおりであり、且つＧ^ＬＬは、抗体又はその抗原結合断片に連結されたリンカーである。

基Ｉｂ’は、式：
［式２５］
によって表され、式中、Ｒ^Ｌ１及びＲ^Ｌ２は、上で定義されるとおりであり；且つｐは、１～２０の整数である。

特に好適なトポイソメラーゼＩ阻害性は、以下の式を有するものを含む：
［式２６］
［式２７］
［式２８］
［式２９］
及び／又は
［式３０］

阻害剤ＳＧ３９３２が特に好ましい。したがって、好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＳＧ３９３２の以下の式を有するトポイソメラーゼＩ阻害剤にコンジュゲートされる：
［式２６］

誤解を避けるために記すと、式２６における数字「８」は、角括弧内の構造が８回繰り返されることを指定する。したがって、ＳＧ３９３２の別の表現は、
［式３１］
である。

ＳＧ４０１０の別の表現は、
［式３２］
である。

ＳＧ４０５７の別の表現は、
［式３３］
である。

ＳＧ４０５２の別の表現は、
［式３４］
である。

本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、前記トポイソメラーゼＩ阻害剤の１つ以上にコンジュゲートされ得る。

ＩＶ．さらなる化学的定義。
以下の定義は、特に、上のトポイソメラーゼＩ阻害剤の説明に属し、さらにより具体的には、「好ましい実施形態のさらなる優先事項」という表題の節に属する場合がある。

Ｃ_５～６アリーレン：用語「Ｃ_５～６アリーレン」は、本明細書で使用する場合、芳香族化合物の芳香族環原子から２個の水素原子を除去することによって得られる二価部分に関する。

これに関連して、接頭語（例えば、Ｃ_５～６）は、炭素原子又はヘテロ原子にかかわらず、環原子数又は環原子数の範囲を示す。「カルボアリーレン基」のように、環原子は全て炭素原子であってもよく、その場合、基はフェニレン（Ｃ_６）である。或いは、環原子は、「ヘテロアリーレン基」のように、１個以上のヘテロ原子を含んでもよい。ヘテロアリーレン基の例としては、以下に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない：
Ｎ_１：ピロール（アゾール）（Ｃ_５）、ピリジン（アジン）（Ｃ_６）；
Ｏ_１：フラン（オキソール）（Ｃ_５）；
Ｓ_１：チオフェン（チオール）（Ｃ_５）；
Ｎ_１Ｏ_１：オキサゾール（Ｃ_５）、イソオキサゾール（Ｃ_５）、イソキサジン（Ｃ_６）；
Ｎ_２Ｏ_１：オキサジアゾール（フラザン）（Ｃ_５）；
Ｎ_３Ｏ_１：オキサトリアゾール（Ｃ_５）；
Ｎ_１Ｓ_１：チアゾール（Ｃ_５）、イソチアゾール（Ｃ_５）；
Ｎ_２：イミダゾール（１，３－ジアゾール）（Ｃ_５）、ピラゾール（１，２－ジアゾール）（Ｃ_５）、ピリダジン（１，２－ジアジン）（Ｃ_６）、ピリミジン（１，３－ジアジン）（Ｃ_６）（例えば、シトシン、チミン、ウラシル）、ピラジン（１，４－ジアジン）（Ｃ_６）；及び
Ｎ_３：トリアゾール（Ｃ_５）、トリアジン（Ｃ_６）。

Ｃ_１～４アルキル：用語「Ｃ_１～４アルキル」は、本明細書で使用する場合、脂肪族でも脂環式でもよく、また、飽和でも不飽和（例えば、部分不飽和、完全不飽和）でもよい、１～４個の炭素原子を有する炭化水素化合物の１つの炭素原子から１つの水素原子を除去して得られる一価部分に関する。用語「Ｃ_１～ｎアルキル」は、本明細書で使用する場合、脂肪族でも脂環式でもよく、また、飽和でも不飽和（例えば、部分不飽和、完全不飽和）でもよい、１～ｎ個の炭素原子を有する炭化水素化合物の１つの炭素原子から１つの水素原子を除去して得られる一価部分に関する。したがって、用語「アルキル」は、以下に論じられる、サブクラスのアルケニル、アルキニル、シクロアルキルなどを含む。

飽和アルキル基の例としては、メチル（Ｃ_１）、エチル（Ｃ_２）、プロピル（Ｃ_３）、及びブチル（Ｃ_４）が挙げられるが、これらに限定されない。飽和直鎖アルキル基の例としては、メチル（Ｃ_１）、エチル（Ｃ_２）、ｎ－プロピル（Ｃ_３）、及びｎ－ブチル（Ｃ_４）が挙げられるが、これらに限定されない。飽和分枝鎖アルキル基の例としては、イソ－プロピル（Ｃ_３）、イソ－ブチル（Ｃ_４）、ｓｅｃ－ブチル（Ｃ_４）及びｔｅｒｔ－ブチル（Ｃ_４）が挙げられる。

Ｃ_２～４アルケニル：用語「Ｃ_２～４アルケニル」は、本明細書で使用する場合、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有するアルキル基に関する。不飽和アルケニル基の例としては、エテニル（ビニル、－ＣＨ＝ＣＨ_２）、１－プロペニル（－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ_３）、２－プロペニル（アリル、－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ_２）、イソプロペニル（１－メチルビニル、－Ｃ（ＣＨ_３）＝ＣＨ_２）、及びブテニル（Ｃ_４）が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｃ_２～４アルキニル：用語「Ｃ_２～４アルキニル」は、本明細書で使用する場合、１つ以上の炭素－炭素三重結合を有するアルキル基に関する。不飽和アルキニル基の例としては、エチニル（－Ｃ≡ＣＨ）及び２－プロピニル（プロパルギル、－ＣＨ_２－Ｃ≡ＣＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｃ_３～４シクロアルキル：用語「Ｃ_３～４シクロアルキル」は、本明細書で使用する場合、環式炭化水素（炭素環式）化合物の１個の脂環式環原子から１個の水素原子を除去して得られる一価部分であって、３～７個の環原子を含めた３～７個の炭素原子を有する、上記部分であり、シクリル基でもあるアルキル基に関する。シクロアルキル基の例として、以下に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない：シクロプロパン（Ｃ_３）及びシクロブタン（Ｃ_４）などの飽和単環式炭化水素化合物；並びにシクロプロペン（Ｃ_３）及びシクロブテン（Ｃ_４）などの不飽和単環式炭化水素化合物。

接続標識：下の式３５において、上付きの標識^{Ｃ（＝Ｏ）}及び^ＮＨは、原子が結合している基を示す。
［式３５］

例えば、ＮＨ基は、カルボニル（図示された部分の一部ではない）に結合しているように示され、カルボニルは、ＮＨ基（図示された部分の一部ではない）に結合しているように示される。

Ｖ．トポイソメラーゼＩ阻害剤の合成。
式２の化合物Ｉ（式中、Ｒ^Ｌは、式３の基Ｉａである）は、式３６：
［式３６］
（式中、Ｒ^Ｌ＊は－ＱＨである）の化合物から、式３７：
［式３７］
の化合物又はその活性化型を連結することによって合成され得る。このような反応は、アミドカップリング条件下で実施され得る。式３６の化合物は、式３８：
［式３８］
（式中、Ｒ^{Ｌ＊ｐｒｏｔ}は、Ｑ－Ｐｒｏｔ^Ｎ（式中、Ｐｒｏｔ^Ｎは、アミン保護基である）である）の化合物の脱保護により合成され得る。式３８の化合物は、フリードランダー（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ）反応を使用して、式３９：
［式３９］
の化合物と、化合物Ａ３とのカップリングにより合成され得る。化合物Ａ３は、（Ｓ）－４－エチル－４－ヒドロキシ－７，８－ジヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３，４－ｆ］インドリジン－３，６，１０（４Ｈ）－トリオンである。式３９の化合物は、式４０：
［式４０］
の化合物から、トリフルオロアセトアミド保護基を除去することにより合成され得る。式４０の化合物は、化合物Ｉ７とのカップリング：Ｒ^{Ｌ＊ｐｒｏｔ}－ＯＨにより合成され得る。化合物Ｉ７は、Ｎ－（４－アミノ－８－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロナフタレン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミドである。式２の化合物Ｉ（式中、Ｒ^Ｌは、式３の基Ｉａ又は式６の基Ｉｂである）は、化合物Ｉ１１から、化合物Ｒ^Ｌ－ＯＨ、又はその活性化形態をカップリングすることにより合成され得る。化合物Ｉ１１は、（Ｓ）－４－アミノ－９－エチル－９－ヒドロキシ－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［デ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオンである。

アミン保護基は、当業者によく知られている。特に、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００７（ＩＳＢＮ ９７８－０－４７１－６９７５４－１）、６９６－８７１頁において好適な保護基の開示に対して参照がなされる。

ＶＩ．抗Ｂ７Ｈ４抗体。
用語「抗体」は、モノクローナル抗体及びその断片（例えば、所望の生物活性を示す）を包含する。好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗体は、モノクローナル抗体である。より好ましい実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。一実施形態では、本発明の方法は、ポリクローナル抗体を利用してもよい。

特に、抗体は、少なくとも１つ又は２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書でＶＨＣと略記される）、及び少なくとも１つ又は２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書でＶＬＣと略記される）を含むタンパク質である。ＶＨＣ領域及びＶＬＣ領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができ、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が点在している。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、厳密に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１、及びＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７を参照のこと）。

好ましくは、各ＶＨＣ及びＶＬＣは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されており、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。抗体のＶＨＣ又はＶＬＣ鎖はさらに、重又は軽鎖定常領域の全て又は一部を含み得る。一実施形態では、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。

用語「抗体」は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（並びにその亜型）のインタクトな免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ型又はラムダ型のものであり得る。抗体という用語は、本明細書で使用する場合、上述のマーカーの１つに結合する抗体、例えば、１つ以上の免疫グロブリン鎖が完全長ではないが、マーカーに結合する分子の一部も指す。抗体という用語に包含される結合部分の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬＣ、ＶＨＣ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨＣ及びＣＨ１ドメインからなるＦｃ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬＣ及びＶＨＣドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨＣドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９）；及び（ｖｉ）結合するのに十分なフレームワークを有する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、可変領域の抗原結合部分が挙げられる。軽鎖可変領域の抗原結合部分及び重鎖可変領域の抗原結合部分、例えば、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬＣ及びＶＨＣは、組換え方法を用いて、それらが単一タンパク質鎖（ＶＬＣ及びＶＨＣ領域が対を為して一価分子を形成する）として作製されることを可能にする合成リンカーにより連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ｌＡｌ－ＡＴｉ－Ａｌβ；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照のこと）。そのような一本鎖抗体もまた、抗体という用語に包含される。これらは当業者に知られる従来の技術を使用して得られてもよく、これらの部分は、インタクトな抗体と同じ方法で、有用性に関してスクリーニングされる。

一実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、又はその組み合わせから選択される１つ以上である。

一実施形態では、抗原結合断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｄｓＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｃ（Ｆｖ）２断片、又はその組み合わせから選択される１つ以上である。

好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｍＡｂ）は、ｓｃＦＶである。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、種を越えてＢ７－Ｈ４分子に結合することができ、例えば、抗体又は断片は、マウスＢ７－Ｈ４、ラットＢ７－Ｈ４、ウサギ、ヒトＢ７－Ｈ４及び／又はカニクイザルＢ７－Ｈ４に結合することができる。一実施形態では、抗体又は断片は、ヒトＢ７－Ｈ４及びカニクイザルＢ７－Ｈ４に結合することができる。一実施形態では、抗体又は抗原結合断片はまた、マウスＢ７－Ｈ４に結合することができる。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ７－Ｈ４、例えば、ヒトＢ７－Ｈ４及びカニクイザルＢ７－Ｈ４に特異的に結合することができるが、ヒトＢ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、及び／又はＢ７－Ｈ３に特異的に結合しない。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬに加えて、重鎖定常領域又はその断片を含んでもよい。一実施形態では、重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域である。一実施形態では（好ましくは、抗体又はその抗原結合断片が、細胞傷害性薬物などの薬剤にコンジュゲートされる場合）、システイン残基が、ＩｇＧ１のＣＨ２領域のアミノ酸Ｓ２３９とＶ２４０の間に挿入される。このシステインは「２３９挿入」又は「２３９ｉ」と称される。

ＶＩＩ．抗Ｂ７Ｈ４抗体の調製。
本明細書に記載される抗体は、当業者に知られる従来の手法を使用して得ることができ、それらの有用性は、従来の結合試験によって確認することができる。例として、簡便な結合アッセイは、抗原を発現する細胞を抗体とともにインキュベートするものである。抗体がフルオロフォアでタグ付けされる場合、抗原への抗体の結合は、ＦＡＣＳ分析により検出され得る。

本明細書に記載される抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、サル又はウマを含む様々な動物において産生され得る。抗体は、個々の莢膜多糖、又は複数の莢膜多糖による免疫後に産生され得る。これらの動物から単離された血液は、ポリクローナル抗体（同じ抗原に結合する複数の抗体）を含有する。抗原はまた、卵黄中でポリクローナル抗体を産生させるためにニワトリに注射され得る。抗原の単一エピトープに特異的なモノクローナル抗体を得るために、抗体分泌リンパ球を動物から単離し、それらを癌細胞株と融合させることによって不死化させる。融合細胞はハイブリドーマと呼ばれ、培養物中で連続的に増殖し、抗体を分泌することになる。単一のハイブリドーマ細胞は、希釈クローニングによって単離され、全てが同じ抗体を産生する細胞クローンを生成する。これらの抗体はモノクローナル抗体と呼ばれる。モノクローナル抗体を生成するための方法は、当業者に知られる従来の手法である（例えば、Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．ＧＣ Ｈｏｗａｒｄ．ＣＲＣ Ｂｏｏｋｓ．２００６．ＩＳＢＮ ０８４９３３５２８０を参照されたい）。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、プロテインＡ／Ｇ又は抗原アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製されることが多い。

本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、モノクローナル抗Ｂ７Ｈ４抗体として調製されてもよく、これは、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって記載される方法）を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法を使用すると、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物が上記のとおりに免疫され、免疫抗原に特異的に結合することになる抗体のリンパ球による産生が誘発される。リンパ球はまた、インビトロで免疫され得る。免疫後、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを使用して好適な骨髄腫細胞株と融合することによりハイブリドーマ細胞を形成させ、次にそこから未融合のリンパ球及び骨髄腫細胞を選択除去することができる。次に、免疫沈降、免疫ブロット法によるか、又はインビトロ結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される場合に選択された抗原に対して特異的に向けられるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準的な方法を使用するインビトロ培養（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）又は動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。次に、モノクローナル抗体は、既知の方法を使用して培地又は腹水から精製され得る。

或いは、抗体又はその抗原結合断片（例えば、モノクローナル抗体として）はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるとおりの組換えＤＮＡ法を使用して作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲなどにより成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から単離し、従来の手順を使用してそれらの配列を決定する。

次に、重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを好適な発現ベクター中にクローニングし、これを、通常であれば免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすると、モノクローナル抗体が宿主細胞により産生される。また、所望の種の組換えモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されるとおりに所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリーから単離され得る。

本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを組換えＤＮＡ技術を使用するいくつかの異なる方法でさらに修飾して、代替的な抗体を作製することができる。いくつかの実施形態では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインが、（１）例えばヒト抗体のそれらの領域に置換されてキメラ抗体が作製され得るか、又は（２）非免疫グロブリンポリペプチドに置換されて融合抗体が作製され得る。いくつかの実施形態では、定常領域がトランケートされるか、又は除去されて、モノクローナル抗体の所望の抗体断片が作製される。可変領域の部位特異的変異誘発又は高密度変異誘発を用いてモノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られる様々な手法を使用して直接的に調製され得る。インビトロで免疫されたか、又は標的抗原に対する抗体を産生する免疫された個体から単離された、不死化ヒトＢリンパ球を作製することができる。例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６－９５（１９９１）；米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ファージライブラリーから選択することができ、そのファージライブラリーは、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９－３１４（１９９６）；Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６１５７－６１６２（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）、及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）に記載されるとおりにヒト抗体を発現する。抗体ファージライブラリーの作製及び使用のための手法は、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、同第６，１７２，１９７号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，３００，０６４号明細書；同第６，６５３，０６８号明細書；同第６，７０６，４８４号明細書；及び同第７，２６４，９６３号明細書；並びにＲｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３７６：１１８２－１２００（２００８）（これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる）にも記載されている。

親和性成熟戦略及び鎖シャッフリング戦略が、当該技術において知られており、高親和性ヒト抗体又はその抗原結合断片を作製するために利用され得る。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片（例えば、モノクローナル抗体）は、ヒト化抗体であり得る。非ヒト又はヒト抗体を操作する、ヒト化する、又はリサーフェシングする方法も使用することができ、これらは当該技術分野においてよく知られている。ヒト化抗体、リサーフェシング抗体、又は同様に操作された抗体は、非ヒト、例えば、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、又は他の哺乳動物である供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「移入」残基と呼ばれる残基によって置換されており、これらの残基は通常、既知のヒト配列の「移入」可変ドメイン、定常ドメイン、又は他のドメインから取得される。このような移入された配列を用いて、免疫原性を低減させるか、又は結合性、親和性、ｏｎ速度、ｏｆｆ速度、結合活性、特異性、半減期、若しくは当該技術分野において知られる他の任意の好適な特性を低減させるか、増強させるか、若しくは変更することができる。好適には、ＣＤＲ残基は、Ｂ７－Ｈ４結合への影響に直接的且つ最も実質的に関与し得る。したがって、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全てを維持することが好ましい一方で、可変領域及び定常領域の非ヒト配列はヒト又は他のアミノ酸に置き換えることができる。

抗体はまた、任意選択により、ヒト化されるか、リサーフェシングされるか、操作されるか、又はヒト抗体が操作されて、抗原Ｂ７－Ｈ４に対する高い親和性及び他の有利な生物学的特性が保持され得る。この目標を達成するために、任意選択により、ヒト化（又はヒト）又は操作された抗Ｂ７Ｈ４抗体及びリサーフェシング抗体を、親配列、操作された配列、及びヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列及び様々な概念的ヒト化産物及び操作された産物の分析プロセスによって調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体配座構造を図示して表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の見込まれる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがＢ７－Ｈ４などのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＷ残基をコンセンサス配列及び移入配列から選択して組み合わせることができ、これにより所望の抗体特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が実現される。

本発明の抗Ｂ７Ｈ４抗体又はその抗原結合断片のヒト化、リサーフェシング又は操作は、任意の既知の方法、例えば、限定されるものではないが、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）；Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）；米国特許第５，６３９，６４１号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，９７６，８６２号明細書；同第５，８２４，５１４号明細書；同第５，８１７，４８３号明細書；同第５，８１４，４７６号明細書；同第５，７６３，１９２号明細書；同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，７６６，８８６号明細書；同第５，７１４，３５２号明細書；同第６，２０４，０２３号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書、同第７，５５７，１８９号明細書；同第７，５３８，１９５号明細書；及び同第７，３４２，１１０号明細書；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８９７８号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９６３０号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３９号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３４号明細書；同第ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１３３４号明細書；同第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号明細書；同第ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；同第９０／１４４２４号パンフレット；同第９０／１４４３０号パンフレット、並びに欧州特許第２２９２４６号明細書（これらの各々は、その中に引用されている参照文献も含めて、参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用して実施され得る。

抗Ｂ７Ｈ４ヒト化抗体及びその抗原結合断片はまた、免疫時に内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全レパートリーを産生する能力を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいても作製することができる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；及び同第５，６６１，０１６号明細書に記載されている。

一実施形態では、抗体（例えば、抗Ｂ７Ｈ４抗体）の断片（例えば、抗体断片）が提供される。様々な手法が、抗体断片の生成のために知られている。従来、これらの断片は、例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．２４：１０７－１１７（１９９３）及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）によって記載されるとおり、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して得られる。一実施形態では、抗Ｂ７Ｈ４抗体断片は、組換えにより生成される。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はその他の宿主細胞中で発現させてそこから分泌させることができ、これにより、これらの断片を大量に生成することができる。そのような抗Ｂ７－Ｈ４抗体断片はまた、上で論じられた抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗Ｂ７－Ｈ４抗体断片はまた、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されるとおりの線状抗体であってもよい。抗体断片を生成するための他の手法は、当業者にとって明らかであろう。

本発明によれば、手法は、Ｂ７－Ｈ４に特異的な一本鎖抗体の生成のために適合させることができる。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照されたい。加えて、方法は、Ｂ７－Ｈ４に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片、又はその誘導体、断片、類似体若しくは相同体の迅速且つ有効な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリーの構築のために適合させることができる。例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１（１９８９）を参照されたい。抗体断片は、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元によって生成されるＦａｂ断片；抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することによって生成されるＦａｂ断片；又はＦｖ断片を含むが、これらに限定されない当該技術分野で知られる手法によって生成され得る。

一実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、その血清半減期を増加させるために修飾され得る。これは、例えば、抗体若しくは抗体断片における適切な領域の変異による、抗体若しくは抗体断片へのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、続いてこれを抗体若しくは抗体断片にいずれかの末端若しくは中央で（例えば、ＤＮＡ若しくはペプチド合成により）融合させることにより、或いはＹＴＥ変異により、達成することができる。抗体又はその抗原結合断片の血清半減期を増加させる他の方法、例えば、ＰＥＧなどの異種分子とのコンジュゲーションが、当該技術分野において知られている。

本明細書で提供されるとおりの修飾抗体又はその抗原結合断片は、抗体又はポリペプチドとＢ７－Ｈ４との会合をもたらす任意の型の可変領域を含み得る。これに関して、可変領域は、所望の抗原に対する体液性応答を開始して免疫グロブリンを産生するように誘導することができる任意のタイプの哺乳動物のものを含み得るか、又はそれに由来し得る。そのため、抗Ｂ７Ｈ４抗体又はその抗原結合断片の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカクなど）又はオオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）起源のものであり得る。一実施形態では、修飾抗体又はその抗原結合断片の可変領域及び定常領域の両方は、ヒトである。一実施形態では、適合抗体（通常、非ヒト供給源に由来する）の可変領域は、分子の結合特性が向上するように又は免疫原性が低減するように操作され得るか、又は特異的に調整され得る。これに関して、本発明において有用な可変領域は、移入されたアミノ酸配列を含めることによってヒト化され得るか、又は他の形で改変され得る。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインは、１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、及び／又は部分的なフレームワーク領域の置換及び配列変更によって改変される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラス又はさらには同じサブクラスの抗体に由来し得るが、異なるクラスの抗体に、またある特定の実施形態では異なる種の抗体に、ＣＤＲが由来することが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移すために、全てのＣＤＲをドナー可変領域の完全なＣＤＲに置換する必要はない。むしろ、抗原結合部位の活性の維持に必要な残基を移しさえすれば十分である。米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、及び同第５，６９３，７６２号明細書に記載される説明を考慮すれば、免疫原性が低減した機能的抗体を得るために通例の実験を実施することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。

可変領域の改変にもかかわらず、当業者は、本明細書に記載される修飾抗体又はその抗原結合断片が、天然の又は改変されていない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した場合に、腫瘍局在の増加又は血清半減期の低減などの所望の生化学的特性がもたらされるように定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部分が欠失されているか、又は別途改変されている抗体（例えば、完全長抗体又はその抗原結合断片）を含むことになることを理解するであろう。一実施形態では、修飾抗体の定常領域はヒト定常領域を含むことになる。本発明と適合する定常領域に対する修飾は、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換を含む。すなわち、本明細書に開示される修飾抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３）のうちの１つ以上及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する改変又は修飾を含み得る。一実施形態では、１つ以上のドメインが部分的に又は完全に欠失している修飾定常領域が企図される。一実施形態では、修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が取り除かれたドメイン欠失コンストラクト又はバリアント（ΔＣＨ２コンストラクト）を含むことになる。一実施形態では、除かれた定常領域ドメインを、通常はその欠けた定常領域によって付与されるある程度の分子柔軟性をもたらす、短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）に置き換えることができる。

それらの構成に加えて、当該技術分野では、定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することが知られている。例えば、抗体は、Ｆｃ領域を介して細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（エータ受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、異なる抗体クラスに特異的ないくつかのＦｃ受容体が存在する。抗体が細胞表面上のＦｃ受容体に結合すると、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、又はＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過及び免疫グロブリン産生の制御を含むいくつかの重要且つ多様な生物学的反応が惹起される。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、結果として投与された抗体又はその抗原結合断片の生物学的プロファイルに影響を及ぼす改変されたエフェクター機能をもたらす。例えば、定常領域ドメインを（点変異又は他の手段によって）欠失又は不活性化させると、循環中の修飾抗体のＦｃ受容体結合が低下し得る。他の場合、定常領域を修飾すると、本発明と一致して、補体結合が調節され、したがって、コンジュゲートした細胞毒の血清半減期及び非特異的な会合が低下し得る。定常領域のさらなる他の修飾を使用して、抗原特異性又は抗体可動性の増加による局在化の増進を可能にするジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を除去することができる。同様に、本発明による定常領域に対する修飾は、十分に当業者の範囲内にあるよく知られた生化学的又は分子工学的手法を使用して容易に作製することができる。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上のエフェクター機能を有しない。例えば、一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有しない。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃ受容体及び／又は補体因子に結合しない。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、エフェクター機能を有しない。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、それぞれの修飾抗体又はその断片のＣＨ３ドメインがヒンジ領域に直接的に融合するように操作され得る。他のコンストラクトでは、ヒンジ領域と修飾ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインとの間にペプチドスペーサーを挿入することができる。例えば、適合性コンストラクトを発現させることができ、ここではＣＨ２ドメインが欠失しており、且つ残りのＣＨ３ドメイン（修飾又は非修飾）が５～２０アミノ酸のスペーサーでヒンジ領域に結合している。このようなスペーサーを付加することにより、例えば、定常ドメインの調節エレメントが遊離且つ接触可能なままであること、又はヒンジ領域がフレキシブルなままであることを確実にすることができる。ある場合には、アミノ酸スペーサーが免疫原性で、且つコンストラクトに対する望ましくない免疫応答を誘導すると分かる。一実施形態では、修飾抗体の所望の生化学的品質を維持するために、コンストラクトに加えられる任意のスペーサーは比較的免疫原性が低いか、又はさらには完全に省かれてもよい。

全定常領域ドメインの欠失に加えて、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片は、定常領域における数個又はさらには単一のアミノ酸の部分欠失又は置換によって修飾することができる。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された範囲にある単一のアミノ酸の変異が、Ｆｃ結合を実質的に低下させて、それにより腫瘍局在を増加させるのに十分であり得る。同様に、エフェクター機能（例えば、補体Ｃ１Ｑ結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインを、完全に又は部分的に欠失させることができる。定常領域のそのような部分欠失は、対象となる定常領域ドメインに付随する他の望ましい機能はそのままにしておきながら、抗体又はその抗原結合断片の選択された特性（例えば、血清半減期）を改善することができる。さらに、抗体及びその抗原結合断片の定常領域は、得られるコンストラクトのプロファイルを増強させる１つ以上のアミノ酸の変異又は置換によって修飾することができる。これに関して、修飾抗体又はその抗原結合断片の配置及び免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によりもたらされる活性を妨害することが可能である。一実施形態では、エフェクター機能の低下若しくは増加などの望ましい特性を増強するために、又はより多くの細胞毒素若しくは炭水化物の結合を提供するために、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加が存在し得る。一実施形態では、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入又は複製することが望ましい場合もある。

本明細書に記載される抗体及び抗体結合断片はさらに、本明細書に具体的に記載される抗体又は抗原結合断片（例えば、マウス、キメラ、ヒト化若しくはヒト抗体、又はその抗原結合断片）と実質的に相同であるバリアント及び均等物を包含する。これらは、例えば、保存的置換変異、すなわち、１つ以上のアミノ酸の、同様のアミノ酸による置換を含有し得る。例えば、保存的置換は、アミノ酸を同じ一般クラス内の別のアミノ酸で置換すること、例えば、ある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換すること、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換すること、又はある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸によって置換することなどを指す。保存的アミノ酸置換によって意図されるものは、当該技術分野においてよく知られている。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、通常はそのタンパク質の一部ではない追加的な化学的部分を含むようにさらに修飾することができる。それらの誘導体化された部分は、タンパク質の溶解度、生物学的半減期、又は吸収を向上させることができる。これらの部分はまた、タンパク質の任意の望ましい副作用などを低減又は消失させることもできる。それらの部分についての概要は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ ｅｄ．Ｌｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．（２０１２）において見出され得る。

ＶＩＩＩ．抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲートの使用。
好ましくは、コンジュゲートを使用して、増殖性疾患を治療することができる。用語「増殖性疾患」は、過剰細胞又は異常細胞の望ましくない又は制御されない細胞増殖に関係し、そのような増殖は、インビトロ又はインビボにおける、望ましくない、例えば、腫瘍形成又は過形成性の増殖である。用語「増殖性疾患」は、代替的に「癌」と称されてもよい。

好適な増殖性疾患（例えば、癌）は、好ましくは、Ｂ７－Ｈ４を発現する癌性細胞の存在によって特徴付けられることになる。

増殖性状態の例としては、良性、前悪性、及び悪性の細胞増殖が挙げられるが、これらに限定されず、そのような細胞増殖として、新生物及び腫瘍（例えば、組織球腫、神経膠腫、星状細胞腫、骨腫）、癌（例えば、肺癌、小細胞肺癌、胃腸癌、腸癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、脳癌、肉腫、骨肉腫、カポジ肉腫、黒色腫）、白血病、乾癬、骨疾患、線維増殖性障害（例えば、結合組織のもの）、及び粥状動脈硬化が挙げられるが、これらに限定されない。対象となる他の癌として、白血病などの血液学的；悪性腫瘍、及び非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、並びにサブタイプ、例えばＤＬＢＣＬ、辺縁帯、外套帯、及び濾胞、ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、及びＢ又はＴ細胞由来の他の癌が挙げられるが、これらに限定されない。肺、胃腸（例えば、腸、大腸を含む）、乳（乳房）、卵巣、前立腺、肝（肝臓）、腎（腎臓）、膀胱、膵臓、脳、及び皮膚が挙げられるがこれらに限定されないあらゆるタイプの細胞を治療することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体薬物コンジュゲートを使用して、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管細胞癌、肺癌、膵臓癌、及び胃癌を含むリストから選択される癌を治療する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体薬物コンジュゲートを使用して、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、及び胆管細胞癌を含むリストから選択される癌を治療する。いくつかの実施形態では、乳癌は、ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）乳癌である。いくつかの実施形態では、乳癌は、ヒト上皮増殖因子受容体２陽性（ＨＥＲ２＋）乳癌である。他の実施形態では、乳癌は、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）である。いくつかの実施形態では、肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、扁平上皮癌である。他の実施形態では、ＮＳＣＬＣは、腺癌である。

本発明の抗体薬物コンジュゲートは、癌細胞増殖を遅延させ、その増殖を抑制し、さらに癌細胞を破壊することができる。これらの作用は、癌によって引き起こされる症状からの解放、癌患者の生活の質（ＱＯＬ）の改善を実現することができ、癌患者の生命を維持し、それにより治療効果を達成する。癌細胞の破壊に至らない場合でさえ、癌細胞の増殖を抑制又は制御することによって、癌患者の長期生存を達成し且つＱＯＬの向上を実現することができる。

本発明の抗Ｈ７Ｂ４ ＡＤＣは、全身療法として患者に適用することにより、且つ加えて癌組織に局所適用することにより、治療効果を発揮することが期待され得る。

抗Ｈ７Ｂ４ ＡＤＣは、含有される１つ以上の薬学的に適合性の構成成分とともに医薬組成物として投与され得る。薬学的に適合性の構成成分は、抗Ｈ７Ｂ４ ＡＤＣの投与量、投与濃度などを鑑みて、当該技術分野で一般的に使用される製剤添加剤などから適切に選択され得る。例えば、本発明において使用される抗Ｈ７Ｂ４ ＡＤＣは、ヒスチジン緩衝剤などの緩衝剤、スクロースなどの賦形剤、及びポリソルベート８０などの界面活性剤を含有する医薬組成物として投与され得る。本発明において使用される抗Ｈ７Ｂ４ ＡＤＣを含有する医薬組成物は、注射剤、水性注射剤又は凍結乾燥注射剤、或いは凍結乾燥注射剤として使用され得る。

本発明において使用される抗Ｈ７Ｂ４ ＡＤＣを含有する医薬組成物が水性注射剤である場合、それは好適な希釈剤で希釈され、続いて静脈内注入として与えられ得る。希釈剤の例は、デキストロース溶液及び生理食塩水を含み得る。

本発明において使用される抗Ｈ７Ｂ４抗体薬物コンジュゲートを含有する医薬組成物が、凍結乾燥注射剤である場合、それは、注射等級水で溶解され、続いて好適な希釈剤により必要な量のために希釈され、続いて静脈内注入として与えられ得る。希釈剤の例としては、デキストロース溶液及び生理食塩水が挙げられる。

本明細書に記載される医薬組成物を投与するために使用される可能性のある投与経路の例としては、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、及び腹腔内経路を挙げることができる。

ＩＸ．抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲートに対する患者応答を予測する方法。
図１４は、分析システムが癌患者からの組織のデジタル画像を分析し、癌患者が抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む療法にどのように応答する可能性が高いかを予測する方法７の工程１～６のフローチャートである。一実施形態では、方法は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管細胞癌、肺癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される癌を有する患者のＡＤＣに対する応答を予測する。一実施形態では、方法は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、及び胆管細胞癌からなる群から選択される癌を有する患者のＡＤＣに対する応答を予測する。一実施形態では、方法は、乳癌を有する患者のＡＤＣに対する応答を予測する。一実施形態では、方法は、卵巣癌を有する患者のＡＤＣに対する応答を予測する。一実施形態では、方法は、子宮内膜癌を有する患者のＡＤＣ応答を予測する。

第１の工程１において、高解像度デジタル画像は、１つ以上のバイオマーカー又は染色を使用して染色されている癌患者からの組織切片から取得される。

ＡＤＣ療法の有効性を予測するために、ＡＤＣ療法によって標的化されるものと同じタンパク質を標的化する結合された色素を有する診断用バイオマーカーが使用される。一実施形態では、スコア化の対象となる抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法は、トポイソメラーゼＩ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体である。一実施形態では、抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣは、
から選択されるトポイソメラーゼＩ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体を含む。

一実施形態では、抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣは、下の構造：
によって表されるトポイソメラーゼ阻害剤ＳＧ３９３２にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体を含む。

したがって、実施形態では、診断用バイオマーカーはまた、Ｂ７－Ｈ４タンパク質を標的化する。

工程２において、事前に訓練されたたたみ込みニューラルネットワークは、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）などの色素に連結された診断用抗体で染色された癌患者の組織のデジタル画像を処理する。癌細胞の膜における色素の染色強度は、対応する区分化された膜対象と関連する全ての画素の色素の平均染色強度に基づいて決定される。さらに、単一画素における色素の染色強度は、画素の赤、緑及び青色成分に基づいてコンピューター処理される。画像分析処理の結果は、デジタル画像における各画素に関して、画素が細胞核に属する可能性及び画素が細胞膜に属する可能性を表す２つの後方の画像レイヤーである。

工程２の別の実施形態では、２つの事前に訓練されたたたみ込みネットワークは、組織のデジタル画像を処理する。第１のネットワークによる処理の結果は、デジタル画像における各画素に関して、画素が細胞核に属する可能性を表す後方の画像レイヤーである。第２のネットワークによる処理の結果は、デジタル画像における各画素に関して、画素が細胞膜に属する可能性を表す後方の画像レイヤーである。

工程３において、個々の癌細胞は、核及び膜に関する後方のレイヤーのヒューリスティックな画像分析に基づいて検出される。細胞膜対象及び任意選択により細胞細胞質対象も含む癌細胞対象が生成される。

工程４において、単一細胞ＡＤＣスコアは、各癌細胞に関して決定される。単一細胞ＡＤＣスコアは、（１）細胞膜におけるＤＡＢの量、及び（２）ＡＤＣペイロード取り込みの量に基づく。ＤＡＢの量は、膜の画素における褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づく各膜の染色強度によって決定される。ＡＤＣペイロード取り込みの量は、細胞膜及びまた任意選択により細胞細胞質におけるＤＡＢの量、並びにさらにまた任意選択によりスコアが決定される細胞に対する隣接細胞の膜及び細胞質におけるＤＡＢの量に基づいて推定される。細胞細胞質におけるＤＡＢの量は、細胞質の画素における褐色ＤＡＢシグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理される各細胞質の染色強度によって決定される。隣接細胞におけるＤＡＢの量は、スコアが決定されている細胞の既定の距離内のそれらの癌細胞に関して決定される。

工程５において、患者スコアは、デジタル画像における全ての癌細胞の単一細胞ＡＤＣスコアに対する統計操作に基づいて組織のデジタル画像に関してコンピューター処理される。患者スコアは、癌患者が抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣを含む療法にどのように応答することになるかを示す。工程４における単一細胞ＡＤＣスコアのパラメーター及び工程５における統計操作の型は、ＡＤＣ療法に対する既知の応答を有する患者の訓練コホートを使用して最適化される。最適化の目標は、訓練コホートにおけるスコア陰性患者に対するスコア陽性の群のカプラン・マイヤー分析における低いｐ値である。

工程６において、抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣを含む療法は、スコアが予め規定された閾値より大きい場合、スコア陽性患者に推奨される。

Ｘ．予測及びスコア化方法の例。
Ａ．染色された組織の画像分析。
図１４の方法はここで、染色された癌組織の特定の画像に関連して記載される。

工程１において、組織試料は、組織試料において癌細胞上の関連タンパク質に結合する診断用抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色される。図１５（左上の画像）は、工程１において取得された染色された組織の一部のデジタル画像８である。画像８は、色素に連結された抗Ｂ７Ｈ４診断用抗体で免疫組織化学的に染色された癌患者由来の組織を示す。この例において、診断用抗体は、マウス抗ヒトＢ７Ｈ４ ＩｇＧ１クローンとして再フォーマットされた抗Ｂ７Ｈ４生成クローン（Ｂ７Ｈ４ ＩＨＣツールＡｂと表される）である。ＩｇＧ１は、抗Ｂ７Ｈ４抗体のアイソタイプを示す。染色プロトコルは、Ｄａｋｏ自動染色装置プラットフォームを使用して開発された。抗Ｂ７Ｈ４抗体は、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色が組織試料におけるタンパク質Ｂ７－Ｈ４の位置を示すように膜タンパク質Ｂ７－Ｈ４に結合する。

工程２において、画像分析は、たたみ込みニューラルネットワークを使用して癌細胞核及び膜の後方の画像レイヤーを生成するためにデジタル画像８に対して実施される。画像分析を使用して、核、膜及び細胞質などの癌細胞及びそれらの構成成分を検出する。図１５は、工程２の画像分析プロセスを示す。たたみ込みニューラルネットワークは、デジタル画像８の各画素に関して、各画素が細胞の核（図１５の右上の画像）又は膜（図１５の左下の画像）のいずれかに属する可能性を示す後方のレイヤー（灰色値画像）を生成する。高い可能性は黒で示され、低い可能性は白で示される。

一実施形態では、たたみ込みニューラルネットワークは、非常に小さい空間サイズ（１～１６画素）を有するボトルネックのレイヤーに向けられる入力画像８からの一連のたたみ込みレイヤー、及び入力画像８と同じサイズを有する後方のレイヤーに向けられる一連の逆たたみ込みレイヤーを含む。このネットワーク構造は、Ｕ－Ｎｅｔと呼ばれる。たたみ込みニューラルネットワークの加重の訓練は、複数の訓練画像における核及び膜に関して手動のアノテーションレイヤーを生成し、続いて生成された後方のレイヤーが手動で生成されたアノテーションレイヤーに最も類似するようにネットワークの加重の最適化アルゴリズムによって調整することによって実施される。

別の実施形態では、核及び膜のアノテーションレイヤーは、複数の訓練画像において自動で生成され、手動で補正される。上皮領域及び核中心は、それぞれ領域及び点として手動でアノテートされる。それぞれの訓練画像に関して、膜区分は、アノテートされた核中心によって因子を供給され且つアノテートされた上皮領域の範囲によって制限された領域成長様アルゴリズム（例えば、流域区分）を適用することによって自動的に生成される。訓練画像を考慮に入れると、核区分は、ブロブ検出アルゴリズム（例えば、最大安定極値領域ＭＳＥＲアルゴリズムによる）を適用すること及び核としてアノテートされた核中心を含有する検出されたブロブのみを選択することによって自動的に生成される。自動的に生成された膜及び核区分は、視覚的に再検討され、必要があれば手作業で補正される。補正工程は、以下の方法の１つを含む：不正確に区分化された膜又は核を棄却すること、正確にアノテートされた膜又は核を明示的に承認すること、又は膜又は核の形状を洗練すること。アノテートされた膜又は核を有する各画像に関して、アノテーションレイヤーが生成される。一実施形態では、アノテーションレイヤーの各画素は、それがアノテートされた対象（膜又は核）に属する場合、「１」に割り当てられ；そうでなければ、「０」に割り当てられる。別の実施形態では、アノテーションレイヤーの画素は、最近接のアノテートされた対象に対する距離を表す。ネットワークの加重は、生成された後方のレイヤーが、自動的に生成された膜及び核アノテーションレイヤーと最も類似するように最適化アルゴリズムによって調整される。

図１６は、各々が細胞膜及び細胞細胞質を含む個々の癌細胞対象が検出される工程３を示す。ヒューリスティックな画像分析プロセスは、流域区分を使用して、たたみ込みニューラルネットワークによって生成される核の後方のレイヤーを使用して細胞核を区分化する。区分は、核対象を生成する。それぞれの核対象は、固有の識別子（ＵＩＤ）に割り当てられる。個別に同定された核は、図１６において濃い対象として示される（右下の画像）。検出された核はまた、入力画像８（左上の画像）並びに核（右上の画像）及び膜（左下の画像）に関する後方のレイヤーにおいてオーバーレイとして表示される。

一実施形態では、流域区分は、既定の第１のサイズ閾値を有する核の後方のレイヤーの二値化処理を含む。第１のサイズ閾値を超える全ての単一の連結された画素が、核対象に属するとみなされる。１６ｕｍ＾２より小さい面積を有する核対象は棄却される。ＵＩＤは、それぞれの核対象に割り当てられる。その後の工程において、核対象は、追加された核の後方の画素が第２の既定の閾値より大きい必要があるより小さい核の後方部に向けて成長する。

図１７は、核対象を使用して、膜の区分を検出し、改善するさらなる区分工程を示す。領域成長アルゴリズムは、シードとして検出された核対象を使用して、膜の後方のレイヤーにおいて膜の隆線まで成長させる（細胞境界を近似する）。検出された膜（右下の画像）は、入力画像８（左上の画像）並びに核（右上の画像）及び膜（左下の画像）に関する後方のレイヤーにおいてオーバーレイとして示される。

図１８は、膜の可能性のあるレイヤーの外側に及び既定の膜レイヤーの後方の閾値に検出された細胞の境界画素の領域を成長させることによって区分化される膜対象の検出及び区分を示す。より濃い境界領域が膜対象になる。それぞれの膜対象は、関連する核対象のものと同じＵＩＤに割り当てられる。

膜と核の間の空間は、核のＵＩＤを使用して細胞質に割り当てられる。それぞれの膜（図１８左上の画像を参照のこと）及び細胞質（図１８左上の画像を参照のこと）に関して、ＤＡＢ染色の平均光学密度は、ＵＩＤと合わせてハードドライブ上のファイルにエクスポートされる。それぞれの細胞（核、細胞質及び膜を含む場合に定義される）に関して、スライドガラス内の細胞の重心位置（ｘ，ｙ）もまたエクスポートされる。ファイルは、コンピューターシステムにおけるハードディスク、ソリッドステートディスク又は専用ＲＡＭの一部に存在し得る。

図１９は、画像分析ソフトウェア環境における画像分析の結果を示す。図１９（左上の画像）は、染色された組織のデジタル画像上のオーバーレイとしての核対象及び膜対象の区分を示す。図１９（左下の画像）は、デジタル画像の光学密度表示上のオーバーレイとしての核対象の区分を示す。濃い光学密度画素は、多量のＤＡＢを伴い、明るい光学密度画素は、少量のＤＡＢを伴う。それぞれの画像画素のＤＡＢ光学密度は、褐色ＤＡＢ成分が独立した色になるような赤－緑－青色空間の変換、及び褐色成分の対数を取ることによって画像画素の赤－緑－青表示からコンピューター処理される。図１９（右上の画像）及び図２０（上段）は、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ＸＤプラットフォーム内で区分化された画像を生成するために使用される画像分析スクリプトを示す。図１９（右下の画像）及び図２０（下段）は、画像８における全ての細胞膜対象及び細胞質対象に関するエクスポートされた測定値を示す。

Ｂ．予測的ＡＤＣスコアの計算。
膜対象及び任意選択により細胞質対象内のＤＡＢ染色の光学密度に基づいて、単一細胞ＡＤＣスコアが、デジタル画像８における各癌細胞に関してコンピューター処理される。単一細胞ＡＤＣスコアはまた、任意選択により、単一細胞ＡＤＣスコアがコンピューター処理されている癌細胞に対する既定の距離より近い隣接癌細胞の膜対象及び細胞質対象におけるＤＡＢ色素の染色強度にも基づく。単一細胞ＡＤＣスコアの集約は、抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法に対する癌患者の応答の予測になる。

図２１は、膜及び細胞質画素の灰色値を使用して模式図における工程２～３の画像分析からの染色の光学密度の例示的な定量結果を示す。図１５～２０において示されるヒューリスティックな画像分析の工程を使用して、図２１の細胞核、細胞膜及び細胞細胞質への例示的区分を得る。図２１における明るい灰色値は、高いＤＡＢ光学密度と関連し、したがって、診断用抗体によって標的化された多量のタンパク質と関連する。濃い灰色値は、低いＤＡＢ光学密度と関連する。画素が明るいほど、高いＤＡＢ光学密度に対応する。

図２２は、図２１の画像の膜上及び細胞質中の染色の例示的な定量的量を列挙し、図２２において部分的に再現される。第１、第２及び第３の細胞の膜からの褐色ＤＡＢシグナルの光学密度は、それぞれ０．９４９、０．３６９及び０．４９８である。第１、第２及び第３の細胞の細胞質からの褐色ＤＡＢシグナルの光学密度は、それぞれ０．７９６、０．５３３及び０．３６９である。図２２の模式的な画像において、第１の癌細胞９は、多量の標的タンパク質Ｂ７－Ｈ４を発現し、ＡＤＣ抗体に連結された細胞に入るＡＤＣペイロードによって死滅させられる可能性が非常に高いであろう（図２３における結果１）。第２の癌細胞１０及び第３の癌細胞１１は、抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣによって直接的に死滅させるのに十分な量の標的タンパク質Ｂ７－Ｈ４を発現しない。しかしながら、第１の癌細胞９に対して第２の癌細胞１０が近傍にあることに起因して、第１の癌細胞から放出される毒性ペイロードは、第２の癌細胞１０も死滅させるであろう（図２３における結果３）。第３の癌細胞１１は、活動的なままであり、薬剤耐性機構の起点である可能性があり、最終的に患者に死をもたらす可能性がある。

図２３は、抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法が癌細胞を死滅させる機構を示す。第１の段階において、ＡＤＣ抗体は、標的タンパク質Ｂ７－Ｈ４に結合し、細胞死をもたらし得る標的タンパク質の天然の機能を阻害する。第２の段階において、ペイロード（例えば、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤）は、細胞中に内部移行され、ペイロードの毒性によって細胞を死滅させる。このペイロードの取り込みは、膜上の標的タンパク質の量、並びに膜上及び細胞質における標的タンパク質の量の差に依存する。取り込み後、ペイロードは、細胞から周囲の組織に放出され得る。第３の段階において、ペイロードは近傍の細胞に入り、それらも死滅させる可能性がある。組織中のペイロードの空間分布は、受動拡散によって拡散される。

従来のＩＨＣスコア化は、ＡＤＣ結合に起因する標的タンパク質の阻害の効果、及びＡＤＣ抗体とともに癌細胞に入る細胞傷害性ペイロードの効果の両方を反映している。したがって、ＡＤＣ療法に関する従来のスコア化は、細胞質における標的タンパク質の存在の重要性及び第１の死滅した癌細胞から放出された後に組織に拡散する細胞傷害性ペイロードの効果を反映しない。比較して、新規の予測的ＡＤＣスコアは、隣接癌細胞上の細胞傷害性ペイロードの放出の効果を測定する。

図１４の方法の工程４において、単一細胞ＡＤＣスコアは、各癌細胞に関して決定される。図２４は、ＡＤＣペイロードの隣接細胞への取り込みを反映する細胞分離に基づいて図２２において示される３つの細胞の各々に関する単一細胞ＡＤＣスコアの計算を示し、指数関数重み係数を組み込んでいる。単一細胞スコアは、図２５に示される式又は請求項４において列挙される式に基づいて計算され得る。細胞膜（０．９４９、０．３６９及び０．４９８）及び細胞質（０．７９６、０．５３３及び０．３６９）からのＤＡＢシグナルに関して図２２に列挙される光学密度は、図２４に示される計算への入力である。第１、第２及び第３の細胞９～１１は、それぞれ０．１４５、０．０１２及び０．０６４の単一細胞スコアを有する。

したがって、単一細胞ＡＤＣスコアは、ＤＡＢ光学密度及び任意選択によりＡＤＣペイロード取り込みの量の推定を使用して細胞膜上の標的タンパク質の量の測定を組み込む。図２３に示されるとおり、第１の細胞に関するＡＤＣペイロードの取り込みは、その膜及びその細胞質における色素の量、並びに第１の細胞の近傍にある第２の細胞の膜及び細胞質における色素の量の両方に依存する。より具体的には、その近傍は、第１の癌細胞の周囲にある既定の半径を有する円板であってもよい。一実施形態では、第１の癌細胞に関する単一細胞ＡＤＣスコアは、関連する癌細胞の中心が、既定の距離より第１の癌細胞の中心に近い膜及び細胞質対象のＤＡＢ光学密度のいくつかのべき乗の距離加重合計によって決定される。一実施形態では、既定の距離は、図２４の計算において使用されるとおり、５０ｕｍである。別の実施形態では、距離は、２０ｕｍである。さらに別の実施形態では、距離の重み付けは、合計において第１の癌細胞の中心から他の癌細胞の中心までの調整された負のユークリッド距離の指数関数をコンピューター処理することを含む。別の実施形態では、合計におけるべき乗は、０、１、及び２（定数、線形項、二乗）に限定される。

図２５は、単一細胞ＡＤＣスコアを計算するための式の一実施形態を示す。式中の関数ａ_ｋｌは、細胞ｊから細胞ｉまでの距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存する。ＯＤＭ_ｊは、細胞ｊの膜のＤＡＢ光学密度であり、ＯＤＣ_ｊは、細胞ｊの細胞質のＤＡＢ光学密度である。定数Ａ＿ｉｊ、ｒ＿ｎｏｒｍ及びｄは、癌の全ての型に関して同じである。しかしながら、患者がＡＤＣ療法に適格であるかを決定するためのスコアに関する閾値は、異なる型の癌に関して同じではない。

特定の癌患者がどのようにＡＤＣ療法に応答することになるかを示すための方法の工程５において、応答スコアは、そのスコアが癌患者がどのように抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法に応答することになるかを示すように標的タンパク質Ｂ７－Ｈ４の染色に基づいて癌患者からの組織のデジタル画像８に関してコンピューター処理される。応答スコアは、統計操作を使用して組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによって生成される。したがって、スコアは、デジタル画像において検出される全ての癌細胞に関する単一細胞ＡＤＣスコアの統計値に基づいてコンピューター処理される。一実施形態では、統計値は、画像８の全ての癌細胞のＡＤＣペイロード取り込み推定値の既定の変位値である。

別の実施形態では、単一細胞ＡＤＣスコアを計算するための式は、各癌細胞の染色された膜の光学密度のみを考慮しており、細胞質の染色又は他の癌細胞が、単一細胞ＡＤＣスコアが計算されている癌細胞の予め規定された距離内に位置しているかどうかを考慮していない。

方法の工程６において、抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法は、応答スコアが予め規定された閾値より大きい場合、癌患者に推奨される。工程６における予め規定された閾値及び工程５における変位値は、既知の単一細胞ＡＤＣスコア及び療法応答パラメーターを有する患者のコホートを使用して、陽性予測値、陰性予測値、及び陽性勧告の有症率を最適化することによって決定される。

工程５における応答スコアのコンピューター処理の別の例において、癌患者の組織試料のデジタル画像が取得され、診断用抗体（ｄＡＢ）で染色される。画像分析を、デジタル画像上で実施して、Ｎの癌細胞（ｃ_ｉ）_{０≦ｉ＜Ｎ}を検出する。細胞ｃ_ｉの区分化された膜における光学密度は、
として表され、区分化された細胞質における光学密度は、
として表される。デジタル画像と関連する応答スコアＳ^ｓは、癌患者が抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法に応答することになる可能性を示す。ＡＤＣは、診断用抗体と同じＢ７－Ｈ４タンパク質に特異的に結合する。応答スコアＳ^ｓは、
［式４１］
Ｓ^ｓ＝∧_{０≦ｉ＜Ｎ}［ｐ（ｃ_ｉ）］
として表すことができ、∧は、デジタル画像において検出される細胞のセットに対する集約演算子である。集約演算は、検出された細胞と関連する陽性値ｐ（ｃ_ｉ）を表す単一の数値である。一例において、集約演算は、算術平均である。別の例において、集約演算は、調和平均又は幾何平均などのいくつかの種類の平均値の１つである。別の例において、集約演算は、検出された細胞の亜群の度数である。別の例において、集約演算は、合計である。一実施形態では、集約演算は、細胞のサブセットのいくつかの種類の平均値の１つである。さらに別の例において、集約演算は、変位値である。

用語ｐ（）は、各細胞に関して抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法に応答するその可能性を表す陽性関数を意味する。ある細胞に関する陽性関数は、その細胞の隣接細胞と関連するｄＡＢ陽性の集約に関して正である。細胞ｃ_ｉと関連する陽性値ｐ（ｃ_ｉ）は、
［式４２］
として表され、π_ｉは、細胞ｃ_ｉの近傍にある隣接癌細胞のセットであり、細胞ｃ_ｉまでの距離が既定の定数より小さい癌細胞として定義される細胞ｃ_ｉを含む。一例において、ｃ_ｉとｃ_ｊの間の距離は、２つの細胞中心間のユークリッド距離である。別の例において、距離は、ｃ_ｉとｃ_ｊの膜の間の最小距離である。式４２において、ｐ^ｄＡＢ（ｃ_ｊ）は、膜におけるその光学密度及びその細胞質におけるその光学密度に基づく細胞ｃ_ｊと関連する陽性値である。一例において、ｐ^ｄＡＢ（ｃ_ｊ）は、
［式４３］
である細胞に１を関連付け、そうでない場合０を関連付ける関数として定義される。式４３において、α_１、α_２、α_３、γ_１、γ_２、γ_３及びＴ_ｐは、既定の定数であり、ｈ（ ）は、
の間の差を測定する関数である。既定の定数は、抗Ｂ７Ｈ４ ＡＤＣ療法に対して既知の治療応答を有する癌患者のコホートの統計分析によって決定される。別の例において、ｐ^ｄＡＢ（ｃ_ｊ）は、
［式４４］
として表される。

一例において、関数ｈ（ ）は、
の間の差に等しく、
として表される。別の例において、関数ｈ（ ）は、
の間の正の差のみを考慮し、
として表される。さらに別の例において、関数ｈ（ ）は、
の間の定数に等しく、
として表される。

式４２において、∨は、隣接癌細胞のセットに対する集約演算子である。集約演算は、隣接細胞と関連するｄＡＢ陽性値を表す単一の数値である。一例において、集約演算は、ｄＡＢ陽性の加重算術平均であり、
［式４５］
として表され、
は、細胞ｃ_ｉが隣接細胞ｃ_ｊによって影響されている可能性をコンピューター処理する加重関数を意味する。別の例において、集約演算は、その隣接細胞のｄＡＢ陽性値の合計が、任意の実数定数Ｔ_ｎを超える場合細胞に１を関連付け、そうでない場合０を関連付ける。別の例において、集約演算は、変位値、度数尺度、又は調和平均又は幾何平均などのいくつかの種類の平均値の１つである。一例において、加重関数
は、細胞ｃ_ｉと細胞ｃ_ｊの間の空間距離ｄ（ｃ_ｉ，ｃ_ｊ）のガウス関数であり、
［式４６］
として表され、σ及びαは、既定の定数である。別の例において、加重関数は、空間距離のシグモイド：
［式４７］
であり、σ、α及びβは、既定の定数である。別の例において、加重関数は、細胞ｃ_ｉと細胞ｃ_ｊの間のユークリッド距離の減少関数である。さらに別の例において、加重関数は、距離が既定の定数Ｔ_ｄより小さい場合１に関連付け、そうでない場合０に関連付ける細胞ｃ_ｉと細胞ｃ_ｊの間の距離のヘビサイド関数である。

陽性関数ｐ（ｃ_ｉ）の１つの特定の例は、
［式４８］
である細胞ｃ_ｉに１を関連付け、そうでない場合０を関連付ける。

Ｃ．予測の方法の検証。
図１４の方法に従って生成される新規の予測的ＡＤＣスコアの正確度は、手作業の「Ｈスコア」によって示されるとおりの変動するＢ７－Ｈ４発現レベルを有する１５名の患者の患者由来異種移植片（ＰＤＸ）試験に基づいて検証された。簡潔には、腫瘍組織断片を、６～８週齢の雌胸腺欠損ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が、適切な腫瘍体積範囲（典型的には１５０～３００ｍｍ）に達したとき、動物を治療及び対照群に無作為化し、Ｂ７Ｈ４－ＳＧ３９３２ ＡＤＣによる投与を開始した。担腫瘍マウスに、静脈内注射を介して単一用量のＢ７Ｈ４－ＳＧ３９３２ ＡＤＣを投与した。動物を毎日観察し、腫瘍寸法及び体重を、週２回測定し、記録した。腫瘍体積をデジタルキャリパーにより計測し、以下の式を使用して腫瘍の体積を計算した：腫瘍体積＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２×０．５２］（式中、長さ及び幅は、それぞれ腫瘍の最長及び最短の直径である）。

図２６は、ＰＤＸ乳房試験の１５名の患者の実際のアウトカムと応答分類によって列挙される手作業のＨスコアの間の相関を示す。応答分類は、進行性疾患に関してＰＤ、安定な疾患に関してＳＤ及び応答に関してＲである。図２６において分析される組織は、１５名のヒト癌患者からの腫瘍細胞を担持するマウスのものであった。

図２７～２８は、手作業で評価されたＨスコアとＱＣＳスコアの間の比率スコアの結果の相関を示す。図２７は、平均Ｈスコアに対して手作業の比率スコアを比較する。図２８は、手作業の比率スコアをＢ７Ｈ４膜染色の光学密度に関する中央値ＱＣＳスコア（ｑ５０）に対して比較する。比率スコアに関して、ＱＣＳスコア（ｑ５０）と手作業で評価されたＨスコアの間に強力な相関が存在する。

図２９～３０は、手作業で評価されたＨスコアとＱＣＳスコアの間の強度スコアの結果の相関を示す。図２９は、手作業の強度スコアを平均Ｈスコアに対して比較する。図３０は、手作業の強度スコアをＢ７Ｈ４膜染色の光学密度に関する中央値ＱＣＳスコアに対して比較する。強度スコアに関して、ＱＣＳスコアと手作業で評価されたＨスコアの間に弱い相関が存在する。

図３１～３２は、中央値ＱＣＳスコア（ｑ５０）の関数としての患者の実際の応答分類と比較した平均Ｈスコアの関数としての各患者の実際の応答分類の相関を示す。図３１は、３つの応答分類ＰＤ（進行性疾患）、Ｒ（応答）及びＳＤ（安定な疾患）の各々において患者の平均Ｈスコアを示す。図３２は、３つの応答分類ＰＤ、Ｒ及びＳＤの各々において患者の中央値ＱＣＳスコア（ｑ５０）を示す。平均Ｈスコアは、ＰＤ及びＲ応答分類において患者を最適に区別するものではなかったが、より低いＱＣＳスコアは進行性疾患と関連し、より高いＱＣＳスコアは、抗Ｈ７Ｂ４ ＡＤＣに対する応答と関連する傾向があった。

図３３～３４は、ＰＤとＲ応答分類の間のベースラインでのＢ７－Ｈ４のレベルにおける差が、ＱＣＳスコア及びＨスコアの両方を使用して著しいことを示す。図３３は、患者試料のＰＤ（進行性疾患）とＲ（応答）群の間のＴ検定のｐ値が、Ｈスコアを使用して０．０１９であったことを示す。図３４は、患者試料のＰＤとＲ群の間のＴ検定のｐ値が、ＱＣＳスコアを使用して０．０１１であったことを示す。

図３５は、腫瘍増殖パーセントとＱＣＳスコア（試料中の全ての腫瘍細胞の膜光学密度の中央値／５０％変位値）の間の関連性を示す。０より大きいＸ軸値は、腫瘍が観察中にサイズが増大したことを意味し、０未満の値は、腫瘍サイズが観察中に縮小したことを意味する。

各患者試料に関するＱＣＳ ｑ５０スコアは、患者試料から取得されるＢ７Ｈ４染色されたデジタル組織画像において全ての腫瘍細胞の中央値膜光学密度を決定することによってコンピューター処理される。

図３６は、ＱＣＳスコアと腫瘍増殖の間の相関を示す。ＱＣＳスコアを使用して評価されるベースラインＢ７－Ｈ４光学密度染色レベルと治療後の腫瘍サイズ変化の間に負の相関が存在した。図３６のグラフにおいて、スピアマンｒｈｏは、－０．６５であり、ｐは、０．０１１に等しい。したがって、Ｂ７－Ｈ４染色の光学密度が高いほど、腫瘍サイズの縮小が大きかった。

Ｄ．診断用抗体染色からより高いＱＣＳスコアを示す例は、ＡＤＣによる治療後の腫瘍細胞密度の低減に相関する。
定量的連続スコア（ＱＣＳ）の適用を示す例は、抗Ｈ７Ｂ４ ＡＤＣ Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）を評価するためのスコア及び関連する画像分析を使用することを含んだ。図３７は、ＰＫ及びＰＤ試験が実施された方法を示す。異種移植マウスモデルを使用して、ＡＤＣがどのようにヒト乳癌組織の腫瘍増殖を低減したかを試験した。２８名の乳癌患者からのヒト腫瘍細胞を、マウスに移植し、クローン化した。ＡＤＣ Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の抗体と関連する画像分析及び染色された診断用抗体を使用して、移植された腫瘍細胞の増殖を経時的に追跡した。

図３８Ａ～Ｄは、ＰＫ及びＰＤ結果を要約するグラフである。腫瘍試料を、単一用量のＡＤＣによる治療後の異なる時点で収集し、続いて免疫組織化学によって染色した。ディープラーニングに基づくＱＣＳアルゴリズムを使用して、ＡＤＣを定量化し、注文に応じて作成されたＨＡＬＯソリューションは、腫瘍細胞におけるｇＨ２ＡＸ及び切断されたカスパーゼ３の広まりを決定した。

図３８Ａは、全ての上皮細胞に対するＡＤＣ－ＩｇＧ（ヒト免疫グロブリンＧ１）に関する膜染色による上皮細胞の細胞比に基づいて上皮細胞におけるＡＤＣの結合及び取り込みを示す。細胞は、それらが対照において観察される最大値を超える染色を示した場合のみ、染色されたものとして計数された。図３８Ａは、ＡＤＣ取り込みが、ＡＤＣ治療の９６時間後までに経時的に増加し、より多い投与量のＡＤＣでより増加したことを示す。

図３８Ｂは、ＡＤＣ治療後の経時的なＤＮＡ損傷（ｇＨ２ＡＸ）の増加を示す。ＤＮＡ損傷は、ｇＨ２ＡＸアッセイにおいて病巣で陽性になった上皮細胞の割合によって表される。スライドガラスを、市販の画像分析システムＨａｌｏ（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ、Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＵＳＡ）で分析して、γＨ２ＡＸの広まりを決定した。図３８Ｂは、ＤＮＡ損傷がＡＤＣ治療の約１６８時間後にピークになったことを示す。

図３８Ｃは、切断されたカスパーゼ－３陽性腫瘍細胞のパーセントに基づくＡＤＣ治療後の経時的なＤＮＡ損傷の増加を示す。スライドガラスを、ＨＡＬＯ画像分析システムを使用して分析した。

図３８Ｄは、全ての上皮細胞の細胞密度の低減に基づくＡＤＣ治療後の経時的な腫瘍細胞死の増加を示す。Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２による治療は、アイソタイプＡＤＣによる治療と比較して細胞数の減少をもたらし、細胞死を示している。

画像分析が染色された組織に対して実施される前に、ＡＤＣ Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の抗体と密接に関連する診断用抗体が最初に選択された。次に、診断用抗体が染色のために使用された。最初に、異種移植モデルを使用して、３つの診断用抗体Ｄ１１、Ａ５７．１及びＣａｌ６３に連結された色素による腫瘍細胞の膜染色が、３つの間で高く相関したことを確認した。図３９Ａは、マウスに移植することによってクローン化された２８個の乳癌患者由来の腫瘍組織の膜染色の中央値光学密度を示す。３つの診断用抗体から得られる２８個の別個の腫瘍試料の染色の高度の相関は、腫瘍進行の程度が、診断用抗体によって一貫して測定されたことを実証している。２８個の腫瘍試料のうちの２個のみにおいて、診断用抗体の１つが、他の２つの診断用抗体のものと著しく異なる染色レベルをもたらす。

図３９Ｂは、腫瘍クローン試料＃２１に関して、診断用抗体Ｄ１１による膜染色が、診断用抗体Ａ５７．１及びＣａｌ６３による染色よりはるかに少なかったことを示す。図３９Ｃは、腫瘍試料＃２８に関して、診断用抗体Ａ５７．１による膜染色が、診断用抗体Ｄ１１及びＣａｌ６３による染色より著しく多かったことを示す。したがって、診断用抗体Ｃａｌ６３は、腫瘍試料の最も一貫した膜染色をもたらし、ＰＫ及びＰＤ試験のために使用された。

図４０Ａ～Ｂは、色素に連結された診断用抗体Ｃａｌ６３を使用して染色されたクローン試料＃２６及び＃４のデジタル画像を示す。画像分析及びＱＣＳ法を使用して、膜染色に基づく単一細胞スコアが、デジタル画像において各腫瘍細胞に関して決定された。次に、同様に染色された細胞の分布が決定された。ＱＣＳスコアを使用して、ＡＤＣ Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）を試験した。

図４１Ａ～Ｂは、様々な投与量のＥ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２又は細胞傷害性ペイロードを有しないＡＤＣによる治療後に抗Ｂ７Ｈ４診断用抗体Ｃａｌ６３を使用して染色された試料の膜光学密度の分布を示す。図４１Ａ～Ｂのグラフは、ＡＤＣ治療が標的発現レベルを増大させ、試験されたレベルでＡＤＣ濃度に依存しなかったことを示す。

図４１Ａは、様々な濃度のペイロードを有しないＡＤＣによる治療の前及び後のクローン試料＃２６に関する細胞毎の膜染色（膜光学密度）の分布を示す。上段のグラフは、ゼロ時であり、下段のグラフは、治療後の１６８時間目である。アイソタイプ対照は、ゼロ時の未処理の細胞とほぼ同じ染色分布である。治療後の１６８時間目に、より高いレベルの膜染色を有する細胞の数が増加した。増加した染色は、ＡＤＣ濃度に相対的に依存しない。ＡＤＣ治療後の増加した染色は、ＡＤＣが上皮細胞膜において高い標的レベルのＢ７Ｈ４抗体を誘発したことを実証している。

図４１Ｂは、ＡＤＣ Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２による治療の前及び後のクローン試料＃４に関する細胞毎の膜染色の分布を示す。上段のグラフは、ゼロ時であり、下段のグラフは、治療後の１６８時間目である。上段のグラフは、ゼロ時でのクローン試料＃４の膜染色の中央値光学密度が、図４１Ａにおいてクローン試料＃２６のものの約６０％であることを示す。治療後の１６８時間目に、より高いレベルの膜染色を有する細胞の数が増加した。腫瘍細胞の膜染色のこの低い広まりを起点としても、ＡＤＣ治療は、高い標的レベルを誘発した。

図４２Ａ～Ｂは、クローン試料＃２６及び＃４に関するＡＤＣ治療の前及び後の結合されたＩｇＧの細胞毎の分布を示す。図４２Ａ～Ｂの上段のグラフは、試料＃２６が投与試料＃４より高い結合されたＩｇＧのベースライン分布を有することを示す。図４２Ａ～Ｂの下段のグラフは、ＡＤＣ治療後の結合されたＩｇＧの分布を示し、より高いベースライン標的レベルの試料＃２６が、試料＃４と比較してより高いＡＤＣ結合をもたらしたことを実証する。したがって、標的細胞に対するＡＤＣ結合は、標的発現に依存する。

図４２Ｃは、Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の様々な投与量レベルでの結合されたＩｇＧの最大膜光学密度のグラフである。図４２Ｃは、ペイロードを有しないＡＤＣの増加した投与量レベルにより、結合されたＩｇＧの膜光学密度の分布の平均値が上昇したことを示す。

図４２Ｄは、１～７ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の投与量レベルでのクローン試料＃２６に関する切断されたカスパーゼ－３陽性腫瘍のパーセントを示す。図４２Ｄは、７ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで、陽性腫瘍値のパーセントが、クローン＃４に関するものよりクローン＃２６に関して高いことを示す。

図４３Ａ～Ｂは、様々な投与量でのＥ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）に対する標的発現の効果を示すグラフである。

図４３Ａは、Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の膜結合動態を示す。図４３Ａは、様々な投与量のペイロードを有しないＡＤＣによる治療後の様々な時点でのクローン＃２６及び＃４に関するＩｇＧの中央値膜光学密度を記録している。中央値膜光学密度は、治療以来時間経過により増大し、治療の約９６時間後に最大値に達した。

図４３Ｂは、細胞質ゾルに対して膜におけるＡＤＣ存在の動態を示す。図４３Ｂのグラフは、７ｍｇ／ｋｇのＥ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２による治療後の様々な時点でのクローン＃２６の中央値光学密度を示す。光学密度は、標的発現の指標である。図４３Ｂのグラフは、膜及び細胞質ゾルにおける光学密度を示す。治療からの約２４時間後、膜における標的発現は、細胞質ゾルにおける標的発現よりも速い速度で増加する。したがって、ＡＤＣ結合は、投与量及び標的発現の両方に依存する。

図４４Ａ～Ｂは、様々な投与量でのＥ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２のＰＫ及びＰＤに対する標的発現の効果を示すグラフである。図４４Ａ～Ｂは、ＡＤＣもまた低い標的発現細胞株に対して効果的であることを示す。図４４Ａは、クローン＃２６に関し、図４４Ｂは、クローン＃４に関する。

図４４Ａ～Ｂの上段のグラフは、ペイロードを有しないＡＤＣによる治療後の様々な時点での染色された上皮細胞の密度を示す。図４４Ａの上段のグラフは、上皮細胞密度が、アイソタイプ対照による治療と比較して、７ｍｇ／ｋｇのペイロードを有しないＡＤＣによるクローン＃２６の治療の２８８時間後までに５１．２％減少したことを示す。図４４Ｂの上段のグラフは、上皮細胞密度が、アイソタイプ対照による治療と比較して、７ｍｇ／ｋｇのペイロードを有しないＡＤＣによるクローン＃４の治療の２８８時間後までに４４．７％減少したことを示す。

図４４Ａ～Ｂの下段のグラフは、切断されたカスパーゼ－３（ＣＣ－３）陽性腫瘍細胞のパーセントに基づくＡＤＣ治療後の経時的なＤＮＡ損傷の増加を示す。スライドガラスの画像分析は、注文に応じて作成されたＨＡＬＯソリューションを使用して実施された。図４４Ａの下段のグラフは、クローン＃２６の損傷された腫瘍細胞のＣＣ－３陽性面積が、治療から９６時間後に著しく増加したことを示す。ＣＣ－３陽性組織の面積は、より高い投与量のペイロードを有しないＡＤＣに関してより広い。図４４Ｂの下段のグラフは、クローン＃４の損傷された腫瘍細胞のＣＣ－３陽性面積が、より高い投与量の７ｍｇ／ｋｇのペイロードを有しないＡＤＣでさえ、治療から約４８時間後に中程度にしか増加し始めなかったことを示す。また、ＣＣ－３陽性組織における増加は、アイソタイプＡＤＣに関する増加とほとんど同じであった。

図４５Ａ～Ｂ、４６Ａ～Ｂ及び４７Ａ～Ｂは、Ｅ０２－ＧＬ－ＳＧ３９３２の薬物動態（ＰＫ）に対する染色された上皮細胞の空間近接性の効果を示す。染色された腫瘍細胞が空間的に近接することにより、標的タンパク質発現を有する癌細胞に結合するＡＤＣの毒性ペイロードは、標的タンパク質を発現しない近傍にある細胞も死滅させることができる。したがって、染色された上皮細胞が近接している領域において、細胞死の割合が高く、そのため、標的タンパク質の発現量がより高い。

図４５Ａ～Ｂは、最大３１２時間のＡＤＣによる治療後の様々な時点での膜光学密度に対する二元空間近接性（２５ｕｍでのＳＰＳ）の関連性を示す。クローン試料＃２６に関して、図４５Ａは、二元ＳＰＳと中央値膜光学密度の間の関連性において、その関連性が経時的に変化するにつれて、大きい線形相関が存在することを示す。相関係数ｒは、図４５Ａの散布図に関して０．９１４に等しい。図４５Ｂは、二元ＳＰＳと膜光学密度の間の関連性において、その関連性が経時的に変化するにつれて、クローン＃４に関してさらに大きい線形相関が存在することを示す。相関係数ｒは、図４５Ｂの散布図に関して０．９２５に等しい。

図４６Ａ～Ｂは、ＡＤＣによる治療後の様々な時点での膜光学密度に対する連続的空間近接性（２５ｕｍでの連続的ＳＰＳ）の関連性を示す。クローン試料＃２６に関して、図４６Ａは、連続的ＳＰＳと中央値膜光学密度の間の関連性において、その関連性が経時的に変化するにつれて、不十分な線形相関が存在することを示す。図４６Ａは実際に、治療の約１６８時間後に染色の高い膜光学密度を有するクローン＃２６に関して、光学密度が、連続的空間近接性が減少するにつれて増大することを示す。これは、散布図を２つの異なる群に分割する。したがって、より高いレベルの標的発現によるクローン＃２６に関して、より低い連続的空間近接性の腫瘍領域において治療後に経時的に標的発現が増加した。

しかしながら、より低いレベルの標的発現を有するクローン＃４に関して、図４６Ｂは、治療後により長い期間経過した後、散布図において第２の別個の群が生じることを示さない。代わりに、連続的ＳＰＳと膜光学密度の間の関連性において、その関連性が経時的に変化するにつれて、中程度の線形相関が残っている。相関係数ｒは、図４６Ｂの散布図に関して０．６１７に等しい。

図４７Ａ～Ｂは、最大３１２時間のＡＤＣによる治療後の様々な時点での上皮細胞密度に対する連続的空間近接性（２５ｕｍでの連続的ＳＰＳ）の関連性を示す。クローン試料＃２６に関して、図４７Ａは、連続的ＳＰＳと上皮密度の間の関連性において、その関連性が経時的に変化するにつれて、中程度の線形相関が存在することを示す。相関係数ｒは、図４７Ａの散布図に関して０．７９８に等しい。図４７Ｂは、連続的ＳＰＳと上皮細胞密度の間の関連性において、その関連性が経時的に変化するにつれて、クローン＃４に関してより不十分な線形相関が存在することを示す。相関係数ｒは、図４７Ｂの散布図に関して０．６８６に等しい。図４７Ａ～Ｂは、ＡＤＣ治療後の時間経過により、染色された腫瘍細胞間でより近い連続的空間近接性の領域においてより高い割合の細胞死（したがって、より低い細胞密度）が存在することを示す。染色された上皮細胞がより近傍にあり、したがって、標的タンパク質の発現がより高い領域における観察された細胞死の高い割合は、ＡＤＣによって標的化された細胞の近傍の非発現癌細胞もまたＡＤＣの毒性ペイロードによって死滅させられるという図２３に示される提案された第３の効果を裏付けている。さらに、これは、ＡＤＣペイロードの隣接細胞への取り込みを反映する細胞分離を説明する図２４～２５に示される単一細胞ＡＤＣスコアに関する式における指数関数重み係数の包含を裏付けている。

本発明は、教示的目的のためのある特定の実施形態と関連して記載されているが、本発明はそれらに限定されない。記載される実施形態の様々な変更形態、改作、及び様々な特徴の組み合わせは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく実践され得る。

Claims (116)

1. ＡＤＣペイロードと癌細胞上のタンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に対する癌患者の応答を予測する応答スコアを生成する方法であって、前記タンパク質が、Ｂ７－Ｈ４であり、
   組織試料を診断用抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色することであって、前記診断用抗体は、前記組織試料中の前記癌細胞上の前記タンパク質に結合する、染色すること；
   前記組織試料のデジタル画像を取得すること；
   前記デジタル画像において癌細胞を検出すること；
   各癌細胞に関して、前記癌細胞の膜及び細胞質における前記色素の染色強度に基づいて、及び前記癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいて単一細胞ＡＤＣスコアをコンピューター処理すること；並びに
   統計操作を使用して前記組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによって前記応答スコアを生成することを含む、方法。
2. 癌細胞の前記検出が、各癌細胞に関して、前記膜に属する画素及び前記細胞質に属する画素を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 各膜の前記染色強度が、前記膜の画素中の褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理され、各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質の画素中の褐色ＤＡＢシグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 細胞ｉに関する前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
   ｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜＜ｄ｛ａ_２０（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ ^２＋ａ_１１（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ×ＯＤＣ_ｊ＋ａ_０２（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＣ_ｊ ^２＋ａ_００（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）｝により全ての細胞ｊの合計として計算され、
   関数ａ_ｋｌが、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存し、ＯＤＭ_ｊが、細胞ｊの前記膜における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣ_ｊが、細胞ｊの前記細胞質における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 関数ａ_ｋｌが、関連：既定の定数係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２によるａ_ｋｌ（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）＝Ａ_ｋｌ×ｅｘｐ（－｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜／ｒ_ｎｏｒｍ）において前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存する、請求項４に記載の方法。
6. 前記係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２、ｄ及びｒ_ｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの療法応答と前記応答スコアの相関を最適化することによって決定される、請求項５に記載の方法。
7. 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集約が、平均値を決定すること、中央値を決定すること、及び既定のパーセンテージを有する変位値を決定することからなる群から取得される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又はその機能的バリアントを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖及びＶＬ鎖、又はその機能的バリアントを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記ＡＤＣ抗体が、
    配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖；及び
    配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項９に記載の方法。
11. 予め規定された閾値より高い応答スコアを有する患者が、前記ＡＤＣを含む療法に関して推奨される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ＡＤＣ抗体が、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記ＡＤＣペイロードが、トポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記色素が、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管細胞癌、肺癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される癌を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、及び胆管細胞癌からなる群から選択される癌を有する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ＡＤＣが、薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式：
    によって表され、Ｒ^ＬＬが、前記抗Ｂ７Ｈ４抗体に連結されるリンカーを表す、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
    から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
    である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
20. 抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）で治療された癌患者の生存可能性を示すスコアを生成する方法であって、
    診断用抗体に連結された色素を使用して前記癌患者の組織試料を免疫組織化学的に染色することであって、前記ＡＤＣは、ＡＤＣペイロードと、癌細胞上のＢ７－Ｈ４タンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含み、前記診断用抗体が、前記組織試料において癌細胞上の前記Ｂ７－Ｈ４タンパク質に結合する、染色すること；
    前記組織試料のデジタル画像を取得すること；
    前記デジタル画像において癌細胞を検出すること；
    各癌細胞に関して、前記癌細胞の膜及び細胞質における前記色素の染色強度に基づいて、及び前記癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいて、単一細胞ＡＤＣスコアをコンピューター処理すること；並びに
    統計操作を使用して前記組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによって前記癌患者の前記生存可能性を示す前記スコアを生成することを含む、方法。
21. 癌細胞の前記検出が、各癌細胞に関して、前記膜に属する画素及び前記細胞質に属する画素を検出することを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 各膜の前記染色強度が、前記膜の画素中の褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理され、各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質の画素中の褐色ＤＡＢシグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理される、請求項２０又は請求項２１に記載の方法。
23. 細胞ｉに関する前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
    ｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜＜ｄ｛ａ_２０（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ ^２＋ａ_１１（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ×ＯＤＣ_ｊ＋ａ_０２（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＣ_ｊ ^２＋ａ_００（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）｝により全ての細胞ｊの合計として計算され、
    関数ａ_ｋｌが、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存し、ＯＤＭ_ｊが、細胞ｊの前記膜における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣ_ｊが、細胞ｊの前記細胞質における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、請求項２２に記載の方法。
24. 関数ａ_ｋｌが、関連：既定の定数係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２によるａ_ｋｌ（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）＝Ａ_ｋｌ×ｅｘｐ（－｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜／ｒ_ｎｏｒｍ）において前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの前記距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存する、請求項２３に記載の方法。
25. 前記係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２、ｄ及びｒ_ｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの療法応答と前記応答スコアの相関を最適化することによって決定される、請求項２４に記載の方法。
26. 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集約が、平均値を決定すること、中央値を決定すること、及び既定のパーセンテージを有する変位値を決定することからなる群から取得される、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記スコアが、前記癌患者の前記生存可能性が予め規定された閾値を超えることを示す場合、前記ＡＤＣを含む療法が前記癌患者に関して推奨される、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記ＡＤＣ抗体が、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又はその機能的バリアントを含む、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖及びＶＬ鎖、又はその機能的バリアントを含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記ＡＤＣ抗体が、
    配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖；及び
    配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ＡＤＣペイロードが、トポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記色素が、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管細胞癌、肺癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される癌を有する、請求項２０～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、及び胆管細胞癌からなる群から選択される癌を有する、請求項３４に記載の方法。
36. 前記ＡＤＣが、薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式：
    によって表され、Ｒ^ＬＬが、前記抗Ｂ７Ｈ４抗体に連結されるリンカーを表す、請求項２０～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
    から選択される、請求項２０～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
    である、請求項２０～３６のいずれか一項に記載の方法。
39. ＡＤＣ抗体とＡＤＣペイロードとを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に対する癌患者の応答を予測する方法であって、そのＡＤＣ抗体が、癌細胞上のタンパク質を標的化し、
    組織試料を診断用抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色することであって、前記診断用抗体は、前記組織試料中の前記癌細胞上の前記タンパク質に結合し、前記タンパク質は、Ｂ７－Ｈ４である、染色すること；
    前記組織試料のデジタル画像を取得すること；
    前記デジタル画像において癌細胞を検出すること；
    各癌細胞に関して、単一細胞ＡＤＣスコアを、膜における前記色素の染色強度に基づいてコンピューター処理すること；及び
    統計操作を使用して前記組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアの集約に基づいて前記ＡＤＣに対する前記癌患者の前記応答を予測することを含む、方法。
40. 各癌細胞に関する前記単一細胞ＡＤＣスコアがまた、細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいて、及び前記癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいてコンピューター処理される、請求項３９に記載の方法。
41. 癌細胞の前記検出が、各癌細胞に関して、前記膜に属する画素及び前記細胞質に属する画素を検出することを含む、請求項３９又は請求項４０に記載の方法。
42. 各膜の前記染色強度が、前記膜の画素中の褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理され、各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質の画素中の褐色ＤＡＢシグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理される、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 細胞ｉに関する前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
    ｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜＜ｄ｛ａ_２０（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ ^２＋ａ_１１（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ×ＯＤＣ_ｊ＋ａ_０２（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＣ_ｊ ^２＋ａ_００（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）｝により全ての細胞ｊの合計として計算され、
    関数ａ_ｋｌが、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存し、ＯＤＭ_ｊが、細胞ｊの前記膜における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣ_ｊが、細胞ｊの前記細胞質における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 関数ａ_ｋｌが、関連：既定の定数係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２によるａ_ｋｌ（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）＝Ａ_ｋｌ×ｅｘｐ（－｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜／ｒ_ｎｏｒｍ）において前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存する、請求項４３に記載の方法。
45. 前記係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２、ｄ及びｒ_ｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの療法応答と前記応答スコアの相関を最適化することによって決定される、請求項４４に記載の方法。
46. 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集約が、平均値を決定すること、中央値を決定すること、及び既定のパーセンテージを有する変位値を決定することからなる群から取得される操作によって実施される、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又はその機能的バリアントを含む、請求項３９～４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖及びＶＬ鎖、又はその機能的バリアントを含む、請求項４７に記載の方法。
49. 前記ＡＤＣ抗体が、
    配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖；及び
    配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項４８に記載の方法。
50. 前記スコアが、前記癌患者の前記生存可能性が予め規定された閾値を超えることを示す場合、前記ＡＤＣを含む療法が前記癌患者に関して推奨される、請求項３９～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記ＡＤＣ抗体が、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である、請求項３９～５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記ＡＤＣペイロードが、トポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項３９～５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記色素が、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項３９～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管細胞癌、肺癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される癌を有する、請求項３９～５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、及び胆管細胞癌からなる群から選択される癌を有する、請求項５４に記載の方法。
56. 前記ＡＤＣが、薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式：
    によって表され、Ｒ^ＬＬが、前記抗Ｂ７Ｈ４抗体に連結されるリンカーを表す、請求項３９～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
    から選択される、請求項３９～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
    である、請求項３９～５６のいずれか一項に記載の方法。
59. ＡＤＣペイロードと癌細胞上のタンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含む抗Ｂ７Ｈ４抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）による治療のために癌患者を同定する方法であって、
    前記癌患者の組織試料を診断用抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色することであって、前記診断用抗体は、前記組織試料中の前記癌細胞上の前記タンパク質に結合し、前記タンパク質が、Ｂ７－Ｈ４である、染色すること；
    前記組織試料のデジタル画像を取得すること；
    前記デジタル画像において癌細胞を検出すること；
    各癌細胞に関して、単一細胞ＡＤＣスコアを、膜における前記色素の染色強度に基づいてコンピューター処理すること；
    統計操作を使用して前記組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによって応答スコアを生成すること；及び
    前記応答スコアが閾値を超える場合に前記ＡＤＣの投与から利益を得る可能性が高くなるものとして前記癌患者を同定することを含む、方法。
60. 起こり得る利益が、平均腫瘍サイズの縮小である、請求項５９に記載の方法。
61. 各癌細胞に関する前記単一細胞ＡＤＣスコアがまた、細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいて、及び前記癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいてコンピューター処理される、請求項５９又は請求項６０に記載の方法。
62. 癌細胞の前記検出が、各癌細胞に関して、前記膜に属する画素及び前記細胞質に属する画素を検出することを含む、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 各膜の前記染色強度が、前記膜の画素中の褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理され、各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質の画素中の褐色ＤＡＢシグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理される、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 細胞ｉに関する前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
    ｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜＜ｄ｛ａ_２０（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ ^２＋ａ_１１（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ×ＯＤＣ_ｊ＋ａ_０２（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＣ_ｊ ^２＋ａ_００（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）｝により全ての細胞ｊの合計として計算され、
    関数ａ_ｋｌが、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存し、ＯＤＭ_ｊが、細胞ｊの前記膜における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣ_ｊが、細胞ｊの前記細胞質における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 関数ａ_ｋｌが、関連：既定の定数係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２によるａ_ｋｌ（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）＝Ａ_ｋｌ×ｅｘｐ（－｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜／ｒ_ｎｏｒｍ）において前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存する、請求項６４に記載の方法。
66. 前記係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２、ｄ及びｒ_ｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの療法応答と前記応答スコアの相関を最適化することによって決定される、請求項６５に記載の方法。
67. 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集約が、平均値を決定すること、中央値を決定すること、及び既定のパーセンテージを有する変位値を決定することからなる群から取得される、請求項５９～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又はその機能的バリアントを含む、請求項５９～６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖及びＶＬ鎖、又はその機能的バリアントを含む、請求項６８に記載の方法。
70. 前記ＡＤＣ抗体が、
    配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖；及び
    配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項６９に記載の方法。
71. 予め規定された閾値より高い応答スコアを有する患者が、前記ＡＤＣを含む療法に関して推奨される、請求項５９～７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記ＡＤＣ抗体が、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である、請求項５９～７１のいずれか一項に記載の方法。
73. 前記ＡＤＣペイロードが、トポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項５９～７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記色素が、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項５９～７３のいずれか一項に記載の方法。
75. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管細胞癌、肺癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される癌を有する、請求項５９～７４のいずれか一項に記載の方法。
76. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、及び胆管細胞癌からなる群から選択される癌を有する、請求項７５に記載の方法。
77. 前記ＡＤＣが、薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式：
    によって表され、Ｒ^ＬＬが、前記抗Ｂ７Ｈ４抗体に連結されるリンカーを表す、請求項５９～７６のいずれか一項に記載の方法。
78. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
    から選択される、請求項５９～７７のいずれか一項に記載の方法。
79. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
    である、請求項５９～７７のいずれか一項に記載の方法。
80. ＡＤＣペイロードと癌細胞上のタンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を癌患者に投与することを含む癌を治療する方法であって、前記タンパク質が、Ｂ７－Ｈ４であり、前記方法は、
    前記癌患者組織試料を診断用抗体に連結された色素を使用して免疫組織化学的に染色することであって、前記診断用抗体は、前記組織試料中の前記癌細胞上の前記タンパク質に結合する、染色すること；
    前記組織試料のデジタル画像を取得すること；
    前記デジタル画像において癌細胞を検出すること；
    各癌細胞に関して、単一細胞ＡＤＣスコアを、膜における前記色素の染色強度に基づいてコンピューター処理すること；
    統計操作を使用して前記組織試料の全ての単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによって治療スコアを生成すること；及び
    前記治療スコアが予め規定された閾値を超える場合、前記ＡＤＣを含む療法を前記癌患者に施すことを含む、方法。
81. 各癌細胞に関する前記単一細胞ＡＤＣスコアがまた、細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいて、及び前記癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいてコンピューター処理される、請求項８０に記載の方法。
82. 癌細胞の前記検出が、各癌細胞に関して、前記膜に属する画素及び前記細胞質に属する画素を検出することを含む、請求項８０又は請求項８１に記載の方法。
83. 各膜の前記染色強度が、前記膜の画素中の褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理され、各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質の画素中の褐色ＤＡＢシグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理される、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。
84. 細胞ｉに関する前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
    ｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜＜ｄ｛ａ_２０（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ ^２＋ａ_１１（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ×ＯＤＣ_ｊ＋ａ_０２（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＣ_ｊ ^２＋ａ_００（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）｝により全ての細胞ｊの合計として計算され、
    関数ａ_ｋｌが、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存し、ＯＤＭ_ｊが、細胞ｊの前記膜における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣ_ｊが、細胞ｊの前記細胞質における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、請求項８０～８３のいずれか一項に記載の方法。
85. 関数ａ_ｋｌが、関連：既定の定数係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２によるａ_ｋｌ（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）＝Ａ_ｋｌ×ｅｘｐ（－｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜／ｒ_ｎｏｒｍ）において前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に依存する、請求項８４に記載の方法。
86. 前記係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２、ｄ及びｒ_ｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの療法応答と前記応答スコアの相関を最適化することによって決定される、請求項８５に記載の方法。
87. 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集約が、平均値を決定すること、中央値を決定すること、及び既定のパーセンテージを有する変位値を決定することからなる群から取得される、請求項８０～８６のいずれか一項に記載の方法。
88. 前記ＡＤＣ抗体が、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である、請求項８０～８７のいずれか一項に記載の方法。
89. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又はその機能的バリアントを含む、請求項８０～８８のいずれか一項に記載の方法。
90. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖及びＶＬ鎖、又はその機能的バリアントを含む、請求項８９に記載の方法。
91. 前記ＡＤＣ抗体が、
    配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖；及び
    配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項９０に記載の方法。
92. 前記ＡＤＣペイロードが、トポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項８０～９１のいずれか一項に記載の方法。
93. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
    から選択される、請求項８０～９２のいずれか一項に記載の方法。
94. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
    である、請求項８０～９２のいずれか一項に記載の方法。
95. 前記色素が、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項８０～９４のいずれか一項に記載の方法。
96. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管細胞癌、肺癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される癌を有する、請求項８０～９５のいずれか一項に記載の方法。
97. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、及び胆管細胞癌からなる群から選択される癌を有する、請求項９６に記載の方法。
98. ＡＤＣペイロードと癌細胞上のタンパク質を標的化するＡＤＣ抗体とを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を癌患者に投与することを含む癌を治療する方法であって、前記タンパク質が、Ｂ７Ｈ４であり、前記方法は、
    応答スコアが予め規定された閾値を超える場合、前記癌患者に前記ＡＤＣを含む療法を施すことを含み、前記応答スコアが、統計操作を使用して前記癌患者の組織試料の単一細胞ＡＤＣスコアを集約することによって生成され、それぞれの単一細胞ＡＤＣスコアが、膜における色素の染色強度に基づいて各癌細胞に関してコンピューター処理され、前記癌細胞が、前記癌患者の前記組織試料のデジタル画像中で検出され、前記組織試料が、診断用抗体に連結された前記色素を使用して免疫組織化学的に染色され、前記診断用抗体が、前記組織試料において前記癌細胞上の前記タンパク質に結合する、方法。
99. 各癌細胞に関する前記単一細胞ＡＤＣスコアがまた、細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいて、及び前記癌細胞までの既定の距離より近い他の癌細胞の膜及び細胞質における前記色素の前記染色強度に基づいてコンピューター処理された、請求項９８に記載の方法。
100. 癌細胞の前記検出が、各癌細胞に関して、前記膜に属する画素及び前記細胞質に属する画素を検出することを含んだ、請求項９８又は請求項９９に記載の方法。
101. 各膜の前記染色強度が、前記膜の画素中の褐色ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）シグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理され、各細胞質の前記染色強度が、前記細胞質の画素中の褐色ＤＡＢシグナルの平均光学密度に基づいてコンピューター処理される、請求項９８～１００のいずれか一項に記載の方法。
102. 細胞ｉに関する前記単一細胞ＡＤＣスコアが、
     ｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜＜ｄ｛ａ_２０（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ ^２＋ａ_１１（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＭ_ｊ×ＯＤＣ_ｊ＋ａ_０２（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）×ＯＤＣ_ｊ ^２＋ａ_００（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）｝により全ての細胞ｊの合計として計算され、
     関数ａ_ｋｌが、各細胞ｉに対する各細胞ｊの距離｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜に依存し、ＯＤＭ_ｊが、細胞ｊの前記膜における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度であり、ＯＤＣ_ｊが、細胞ｊの前記細胞質における前記褐色ＤＡＢシグナルの光学密度である、請求項９８～１０１のいずれか一項に記載の方法。
103. 関数ａ_ｋｌが、関連：既定の定数係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２によるａ_ｋｌ（｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜）＝Ａ_ｋｌ×ｅｘｐ（－｜ｒ_ｊ－ｒ_ｉ｜／ｒ_ｎｏｒｍ）において前記細胞ｉに対する前記細胞ｊの距離｜ｒｊ－ｒｉ｜に依存する、請求項１０２に記載の方法。
104. 前記係数Ａ_ｏｏ、Ａ_１ｏ、Ａ_ｏ１、Ａ_１１、Ａ_２０、Ａ_ｏ２、ｄ及びｒ_ｎｏｒｍが、訓練患者のコホートの療法応答と前記応答スコアの相関を最適化することによって決定される、請求項１０３に記載の方法。
105. 全ての単一細胞ＡＤＣスコアの前記集約が、平均値を決定すること、中央値を決定すること、及び既定のパーセンテージを有する変位値を決定することからなる群から取得される、請求項９８～１０４のいずれか一項に記載の方法。
106. 前記ＡＤＣ抗体が、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である、請求項９８～１０５のいずれか一項に記載の方法。
107. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又はその機能的バリアントを含む、請求項９８～１０６のいずれか一項に記載の方法。
108. 前記ＡＤＣ抗体が、それぞれ配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖及びＶＬ鎖、又はその機能的バリアントを含む、請求項１０７に記載の方法。
109. 前記ＡＤＣ抗体が、
     配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖；及び
     配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖
     を含む、請求項１０８に記載の方法。
110. 前記ＡＤＣペイロードが、トポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項９８～１０９のいずれか一項に記載の方法。
111. 前記色素が、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である、請求項９８～１１０のいずれか一項に記載の方法。
112. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆管細胞癌、肺癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される癌を有する、請求項９８～１１１のいずれか一項に記載の方法。
113. 前記癌患者が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、及び胆管細胞癌からなる群から選択される癌を有する、請求項１１２に記載の方法。
114. 前記ＡＤＣが、薬物－リンカーにコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記薬物－リンカーが、以下の式：
     によって表され、Ｒ^ＬＬが、前記抗Ｂ７Ｈ４抗体に連結されるリンカーを表す、請求項９８～１１３のいずれか一項に記載の方法。
115. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
     から選択される、請求項９８～１１４のいずれか一項に記載の方法。
116. 前記ＡＤＣが、トポイソメラーゼ阻害剤にコンジュゲートされた抗Ｂ７Ｈ４抗体であり、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、
     である、請求項９８～１１４のいずれか一項に記載の方法。

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