MXPA05004712A

MXPA05004712A - Anticuerpos anti-cd33 y metodo para tratamiento de leucemia mieloide aguda utilizando los mismos.

Info

Publication number: MXPA05004712A
Application number: MXPA05004712A
Authority: MX
Inventors: J Lutz Robert
Original assignee: Immunogen Inc
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2003-11-05
Publication date: 2005-11-23
Also published as: EP1578446A4; US10000566B2; HUE026914T2; IL168295A; KR20050059332A; AU2003285878A1; DK1578446T3; CR7853A; HK1091132A1; US20060177455A1; US8337855B2; NZ539395A; EA010570B1; NO20052693L; PT1578446E; US20110008840A1; CY1116406T1; WO2004043344A3; AU2003285878B2; US20160362490A1

Abstract

La presente invencion se refiere a anticuerpos que enlazan CD33. De manera mas particular, la invencion se refiere a anticuerpos anti-CD33, fragmentos y homologos de dichos anticuerpos, versiones humanizadas y recubiertas de dichos anticuerpos, equivalentes funcionales y versiones mejoradas de dichos anticuerpos, inmunoconjugados y composiciones que comprenden dichos anticuerpos y el uso de los mismos en el diagnostico, investigacion y aplicaciones terapeuticas. La invencion se refiere tambien a un polinucleotido que codifica los anticuerpos, vectores que comprenden los polinucleotidos, celulas huesped trasnformadas con polinucleotidos y metodos para producir los anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CD33 Y MÉTODO PARA TRATAMIENTO DE LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA UTILIZANDO LOS MISMOS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional No. 60/424,332 presentada el 7 de noviembre de 2002, la descripción de la cual está incorporada a la presente mediante referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos que enlazan CD33. De manera más particular, la invención se refiere a anticuerpos anti-CD33, fragmentos y homólogos de dichos anticuerpos, ' versiones humanizadas y recubiertas de dichos anticuerpos, equivalentes funcionales y versiones mejoradas de dichos anticuerpos, inmunoconjugados y composiciones que comprenden dichos anticuerpos, y los usos de los mismos en el diagnóstico, investigación y aplicaciones terapéuticas. En otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido que conjuga los anticuerpos, vectores que comprenden los polinucleótidos, células huésped transformadas con polinucleótidos y métodos de producción de los anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El antígeno de diferenciación de leucocito CD33 es una glicoproteína de transmembrana de aminoácido 364 con homología de secuencia a membranas de la familia de sialoadhesina, incluyendo glicoproteína asociada con mielina y CD22, así como la sialoadhesina misma (S. Peiper, 2002, Leuocyte Typing VII, White Cell Diferentiation, Antigens, Proceedings of Seventh Internacional Workshop and Conference, Oxford University Press, p. 777). La expresión de CD33 parece ser altamente específica para el compartimiento hematopoiético, con fuerte expresión por células precursoras mieloides (S. Peipe, 2002). Es expresada por células progenitoras mieloides tales como CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G y BFU-E, monolitos/macrófagos, precursores de granulocito tales como promielocitos y mielocitos aunque con expresión reducida a la maduración y diferenciación, y granulocitos maduros aunque con un bajo nivel de expresión (S. Peiper, 2002). En contraste, las células de cepa hematopoiéticas pluripotentes que dan origen a una "ráfaga de colonias" in vitro (Leary, A. G. et al., 1987, Blood 69:953) y que inducen cultivos de médula a largo plazo hematopoiéticos (Andrews R.G. et al., 1989, J. Exp. Med. 169:1721; Sutherland, H. J. et al., 1989, Blood 74:1563) parece carecer de expresión de CD33. En tanto que la función específica de CD33 es desconocida, su homología a la sialoadhesina sugirió un rol en la característica de enlace de carbohidrato de la familia de lectina, un rol confirmado posteriormente. De manera importante, los anticuerpos monoclonales anti-CD33 han mostrado que CD33 es expresado por células de leucemia mielogénica aguda, clonogénicas (AML) en más del 80% de los casos en seres humanos (Larissa, V.F. et al., 1992, Exp. Hemtol. 20:442-448). Debido a la expresión selectiva de CD33, los inmunoconjugados que combinan fármacos citotóxicos con anticuerpos monoclonales que reconocen de manera específica y enlazan CD33 han sido propuestos para uso en el reconocimiento selectivo de células AML. Se espera que dichas terapias no afecten las células de cepa y los progenitores hematopioéticos primitivos. Los inmunoconjugados que utilizan anticuerpos anti-CD33 incluyen inmunoconjugados anti-CD33-ricina que han demostrado ser ligeramente letales para las células AML (Roy, D.C. et al., 1991 , Blood 77:2404; Lambert, J.M. et al., 1991, Biochemistry 30:3234), aunque evitan las células de cepa que soportan la reconstitución de hematopoyesis y hematopoiética normales (Larissa, V. F. et al., 1922, Exp. Hematol. 20:442-448). Estudios adicionales que utilizan inmunoconjugados han demostrado rápido reconocimiento de anticuerpos anti-CD33 radioactivos para células de la ráfaga leucémicas en sangre periférica y médula cuando son administrados por vía intravenosa (Scheinberg, D. A. et al., 1991, J. Clin. Oncol. 9:478-490; Schwartz, M. A. et al., 1993, J. Clin. Oncol. 11:294-303). La rápida internalización del anticuerpo por medio de la célula de la blanco se observó también en estudios in vitro (Tanimot, M. et al., 1989; Leucemia 3:339-348; Divgi, C.R. et al., 1989, Cáncer Res. Suppl.

Vol. 30:404a). La evaluación del anticuerpo anti-CD33 humanizados conjugados para la caliqueamicina antibiótica antitumoral potente en (ozogamicina de Gemtuzumab) en estudios pre-clínicos demostraron eliminación específica de células de leucemia en cultivos de célula HL-60, xenoinjertos de tumor HL-60 en ratones, y muestras de médula a partir de pacientes AML (Hamann, P.R. et al., 2002, Bioconjugate Chem. 13:47-58). Con base en los resultados positivos de esos estudios pre-clínicos, se evaluó la ozogamicina de Gemtuzumab en estudios clínicos de fase I y II. En los estudios de Fase I, la mayor toxicidad observada fue la mielosupresión debida a la expresión de CD33 en las células progenitoras mieloides (Sievers, E.L. et al., 1999, Blood 93:3678-3684; Sievers E.L. et al., 2001, J. Clin. Oncol. 19:3244-3254) los estudios de Fase II con una dosis de 9 mg/m2 intravenosa durante 4 horas, repetida después de 14 días, produjo un índice de respuesta de 30%. La aprobación de comercialización de la ozogamicina de Gemtuzumab fue concedida por la FDA en mayo de 2000 con indicación para el tratamiento de pacientes con AML positiva CD33 en primera recaída con una edad de 60 años o mayores que no son considerados candidatos para quimioterapia citotóxica. Los reportes post-comercialización han indicado el potencial de toxicidad significativa, especialmente enfermedad veno-oclusiva (VOD), lo cual ha condücido a revisiones de etiquetado e iniciación de un programa de supervisión del paciente. Gran parte de esta toxicidad puede estar relacionada con la caliqueamicina componente de fármaco, la cual demostró ocasionar hepatotoxicidad en modelos pre-clínicos, y por lo tanto no puede ser un resultado directo de reconocimiento CD33. En tanto que los resultados antes descritos sugirieron que los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-CD33 y un fármaco citotóxico pueden ser utilizados de manera exitosa en el tratamiento de AML, existe una necesidad de inmunoconjugados que sean seguros y efectivos. La presente invención está dirigida a estos y otros importantes fines.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En consecuencia, es un objeto de la presente invención el proporcionar anticuerpos que enlacen de manera específica a CD33, y que puedan ser utilizados en el tratamiento de AML. Por lo tanto, en una primera modalidad, se proporciona un anticuerpo, o fragmento de enlace epítope del mismo, que tiene la habilidad de enlazar CD33. En una segunda modalidad, se proporciona el anticuerpo murina My9-6, el cual está completamente caracterizado en la presente con respecto a las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables de cadena ligera y pesada, las secuencias cADN de los genes para las regiones variables de cadena ligera y pesada, la identificación de sus CDRs (regiones de determinación complementarias), la identificación sobre sus aminoácidos de superficie, y medios para su expresión en forma recombinante. En una tercera modalidad, se proporcionan versiones humanizadas o recubiertas del anticuerpo My9-6 en donde los residuos expuestos en superficie del anticuerpo My9-6 o fragmentos de enlace de epítope del mismo en ambas cadenas ligera y pesada para asemejar más estrechamente las superficies de anticuerpo humano. Dichos anticuerpos humanizados pueden tener utilidad incrementada, en comparación con la murina My9-6, como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Las versiones humanizadas del anticuerpo My9-6 están también totalmente caracterizadas en la presente con respecto a sus secuencias de aminoácidos respectivas de regiones variables de cadena ligera y pesada, las secuencias AND de los genes para las regiones variables de cadena ligera y pesada, la identificación de los CDRs, la identificación de sus aminoácidos de superficie, y la descripción de medios para su expresión en forma recombinante. En una modalidad adicional, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de enlace de epítope de los mismos que comprende por lo menos una región de determinación complementaria que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que comprende SEC ID NOs: 1-6: SYYIH (SEC ID NO: 1), VIYPGNDDISYNQKFXG (SEC ID NO: 2), en donde X es K o Q, EVRLRYFDV (SEC ID NO: 3), KSSQSVFFSSSQKNYLA (SEC ID NO: 4), WASTRES (SEC ID NO: 5), HQYLSSRT (SEC ID NO : 6), y que tiene la habilidad para enlazar CD33. En una modalidad adicional, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de enlace de epítope de los mismos que comprenden por lo menos una región variable de cadena pesada y por lo menos una región variable de cadena ligera, en donde dicha región variable de cadena pesada comprende tres regiones de determinación complementaria que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 1-3, respectivamente, SYYIH (SEC ID NO: 1), VIYPGNDDISYNQKFXG (SEC ID NO: 2), en donde X es K o Q, EVRLRYFD V (SEC ID NO: 3), y en donde la región variable de cadena ligera comprende tres regiones de determinación complementaria que tienen secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID NOs: 4-6, respectivamente, KSSQSVFFSSSQKNYLA (SEC ID NO: 4), WASTRES (SEC ID NO: 5), HQYLSSRT (SEC ID NO: 6).

En una modalidad adicional, se proporcionan anticuerpos que tienen una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido que comparte por lo menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido representada por SEC ID NO: 7: QVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIH Wl KQTPGQGLEW VG I YPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYY CAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS, de manera más preferible 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 7, de manera más preferible 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 7. De manera similar, se proporcionan anticuerpos que tienen una región variable de cadena aligera que tiene una secuencia de aminoácido que comparte por lo menos el 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido representada por SEC ID NO: 8: NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQ SPKLLI YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAI YYCHQY LSSRTFGGGTKLEIKR, de manera más preferible 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 8, de manera más preferible del 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 8. En una modalidad adicional, se proporcionan anticuerpos que tienen una región variable de cadena pesada humanizados o recubiertos que comparte por lo menos el 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido representada por SEC ID NO: 9: QVQLQQPGAE VVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYI HW IKQTPGQGLEW VGVI YPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYY CAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS, de manera más preferible del 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 9, de manera más preferible del 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 9. De manera similar, se proporcionan anticuerpos que tienen una región variable de cadena ligera humanizados o recubiertos que comparte por lo menos el 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido que corresponde a SEC ID NO: 10: EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKN YLAWYQQIPGQS PRLLI YWASTRESG VPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAI YYCHQYLS SRTFGQGTKLEIKR, de manera más preferible del 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 10, de manera más preferible del 100% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 10. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona inmunoconjugados que comprenden un fármaco o profármaco unido de manera covalente, directamente o por medio de un enlazador divisible o no divisble, para un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de la presente invención. En modalidades preferidas, el fármaco o profármaco es un fármaco o profármaco citotóxico tal como un maitansinoide, un taxoide, CC-1065, un análogo CC-1065, dolastatina y un análogo de dolastatina. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de epítope del mismo de la presente invención y un fármaco o profármaco. En una modalidad adicional, la presente invención comprende composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, fragmento de enlace de epítope del mismo o inmunoconjugado de la presente invención, ya sea solo o en combinación con un fármaco o profármaco u otro agente terapéutico, en presencia de uno o más agentes farmacéuticamente aceptados. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo que está etiquetado para uso en aplicaciones de investigación o diagnóstico. En modalidades preferidas, la etiqueta es una etiqueta de biotina, una etiqueta de enzima, una radio-etiqueta, un fluoroforo, un cromoformo, un agente de formación de imagen o un ión metálico.

En una modalidad adicional, la presente invención proporciona métodos para inhibir el crecimiento de una célula que expresa CD33 a través del uso de un anticuerpo, fragmento de enlace de epítope del mismo o inmunoconjugado de la presente invención, ya sea solo o en combinación con un fármaco o profármaco u otro agente terapéutico, ya sea solo o en presencia de uno o más agentes farmacéuticamente aceptados. En una modalidad adicional, la invención proporciona métodos para el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad en donde se expresa CD33 que comprende la administración de un anticuerpo, un fragmento de enlace de epítope del mismo o inmunoconjugado de la presente invención, ya sea solo o en combinación con otro fármaco o profármaco u otro agente terapéutico, ya sea solo o en presencia de uno o más agentes farmacéuticamente aceptados. La enfermedad puede ser una o más de, por ejemplo, síndrome mielodisplástico (MDS), leucemia mleloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML) y leucemia pro-mielocítica (PML), u otra enfermedad por ser determinada en la cual se expresa CD33. Los métodos de tratamiento incluyen aplicación in vivo, ex vivo e in vitro de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo e inmunoconjugados de la presente invención, ya sea solo o en combinación con un fármaco o profármaco u otro agente terapéutico, ya sea solo o en presencia de uno o más agentes farmacéuticamente aceptados. En una modalidad adicional, se proporciona un método para determinar si una muestra biológica contiene o no una célula cancerígena mielogénica en donde una muestra biológica se pone en contacto con un reactivo de diagnóstico, tal como un anticuerpo etiquetado o fragmento de enlace de epítope del mismo de la presente invención, y se detecta la distribución del reactivo dentro la muestra. Este método puede ser utilizado para diagnosticar un cáncer tal como una leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML) y leucemia pro-mielocítica (PML). En una modalidad adicional, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de enlace de epítope de los mismos de la presente invención que tienen propiedades mejoradas. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de enlace de epítope de los mismos que tienen afinidad mejorada para CD33 pueden ser preparados por las técnicas estándar de inmunización animal, formación de hibridoma y selección de anticuerpos con características específicas. También se pueden preparar anticuerpos mejorados por medio de maduración de afinidad de un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de la presente invención a través de, por ejemplo, mutagénesis dirigida de sitio mediada por oligonucléotido, mutagénesis de cásete, redistribución PCR, ADN susceptible a error y uso de cepas de mutador de E. coli. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona polinucleótldo que codifican los anticuerpos o fragmentos de enlace de epítope de los mismos de la presente invención, vectores recombinantes que comprenden los polínucleótidos, células huésped transformadas con los vectores recombinantes y métodos para producir dichos anticuerpos y fragmentos de enlace de epítope de los mismos por medio del cultivo de dichas células huésped. En una modalidad final, la presente invención proporciona un método para obtener CD33 a partir de material biológico utilizando un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los resultados de un experimento de enlace de competencia en el cual se ensayo el enlace del anticuerpo 125l-etiquetado My9-6 (3 x 10-9 M) a las células U-937 CD33-positivas en presencia de concentraciones crecientes ya sea de anticuerpo My9 o My9-6. La Figura 2 muestra la cartilla degenerada My9-6 para la secuencia de señal de cadena ligera. La Figura 3 muestra los nombres de archive de las estructuras de anticuerpo 127 a partir de la base de datos Brookhaven que se utilizaron para pronosticar la superficie de la región variable muMy9-6. La Figura 4 muestra la cartilla PCR utilizada para construir las versiones 16 recubiertas My9-6 así como anticuerpo My9-6 quiméricos. La Figura 5 muestra los plásmidos utilizados para construir y expresar los anticuerpos humanizados. (A): el plásmido de clonación de cadena ligera. (B): el plásmido de clonación de cadena pesada. (C): el plásmido de expresión de anticuerpo de mamífero. La Figura 6A muestra los resultados de secuenciamiento Edman comparados con la secuencia de aminoácido derivada a partir de clones generados de ADN complementario RT-PCR para cadena ligera muMy9-6. La Figura 6B muestra los resultados a partir del análisis de secuencia MS-MS de los fragmentos péptido 1319 Da y 1122 Da que contienen secuencias CDR1 y CDR2 respectivamente. Las secuencias CDR están en negrillas. La Figura 7 muestra los resultados a partir del análisis de secuencia MS-MS del péptido 1788 Da y la secuencia correspondiente derivada a partir de dos clones cADN. La Figura 8A muestra la secuencia cADN y la secuencia de aminoácido deducida de la región variable de cadena ligera para el anticuerpo para el anticuerpo My9-6 murina. Los tres CDRs están subrayados. La Figura 8B muestra la secuencia cADN y la secuencia de aminoácido deducida de la región variable de cadena pesada para el anticuerpo My9-6 murina. Los tres CDRs están subrayados. La Figura 9 muestra los CDRs de cadena ligera y pesada como se determina por medio de las definiciones Kabat. La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácido de cadena ligera y pesada para el anticuerpo My9-6 murina alineada con las secuencias germLine para los genes 8-27 y V102. Los puntos (.) indican la identidad de secuencia. Las Figuras 11A & B muestran las diez secuencias de anticuerpo de cadena ligera (A) y de cadena pesada (B) más homologas a las secuencias muMy9-6 que tienen archivos solucionados en la base de datos Brookhaven. Las secuencias están alineadas en orden de mayor a menor homología. Las Figuras 12A & B muestran la accesibilidad promedio para cada posición Kabat de las cadenas ligera (A) y pesada (B) del anticuerpo muMy9-6. Las accesibilidades relativas para cada posición Kabat de las diez secuencias de cadena ligera y pesada más homologas se promediaron y se presentan a lo largo del eje x.

La Figura 13A muestra las accesibilidades de solvente de residuo para las diez estructuras de cadena ligera más homologas, calculadas con el software MC, y muestra los promedios para cada posición Kabat, tabulados con Excel. Esta tabla presenta los datos para posiciones non-CDR con accesibilidades de solvente promedio mayores al 25%. Un residuo de superficie está definido como un residuo con más de un 30% de accesibilidad de solvente promedio. Las posiciones con 25%-35% de accesibilidades promedio fueron analizadas adicionalmente por medio del cálculo de accesibilidades promedio de estructuras solamente con residuos idénticos en esa posición así como en las dos posiciones de lado en cualquier lado. NA se refiere a posiciones de lado idénticas no disponibles. Las posiciones 15 y 70 requirieron de cálculos adicionales para llegar a los pronósticos de superficie finales dadas en la última columna. La Figura 13B muestra las accesibilidades de solvente de. residuo para las diez estructuras de cadena pesada más homologas, calculadas con el software MC, y muestra los promedios para cada posición Kabat, tabulados con Excel. Esta tabla presenta los datos para posiciones no-CDR con accesibilidades de solvente promedio mayores del 25%. ün residuo de superficie está definido como un residuo con más de un 30% de accesibilidad de solvente promedio. Las posiciones con 25%-35% de accesibilidades promedio fueron analizadas de manera adicional por medio del cálculo de accesibilidades promedio de estructuras solamente con residuos idénticos en esa posición así como en las dos posiciones de flanco en cualquier lado. NA se refiere a posiciones de flanco idénticas no disponibles. La Figura 14 muestra los residuos de superficie de estructura My9-6 que quedan dentro de 5 A de un residuo CDR. La Figura 15 muestra las cinco secuencias humanas superiores extraídas a partir de la base de datos Kabat. Las alineaciones se generaron por medio de SR (Pedersen, 1993). Los residuos muMy9-6 que quedan dentro de 5 A de un CDR están subrayados. Las Figuras 16A & B muestran las 16 secuencias de región variable de cadena ligera My9-6 humanizadas (A) y las 16 secuencias de región variable de cadena pesada My9-6 humanizadas (B) alineadas con murina My9-6. Los puntos (.) representan identidad de secuencia con la versión humanizada 1.0. Los residuos de superficie que difieren en My9-6 murina y humano están subrayados.

La Figura 17 muestra los valores My9-6 Ko calculados por ensayo de enlace directo en membranas HL-60 y células enteras HL-60, así como ensayo de enlace competitivo en membranas HL-60. N = 3 excepto para * en donde N = 2. La Figura 18 muestra las curves de enlace para huMy9-6V1. 0. (A): enlace directo sobre membranas HL-60 (B): enlace directo en células enteras HL-60. (C): enlace competitivo en membranas HL-60.

La Figura 19 muestra una comparación de enlace de My9-6-DM1 con anticuerpo My9-6 en células HL-60. La Figura 20 muestra la citotoxicidad in vitro de My9-6-DM1 hacia células tumorales humanas que expresan CD33. La Figura 21 muestra los resultados de los experimentos de eficacia de My9-6-DM1 en ratones SCID que tienen xenoinjertos HL-60. Se evaluó el efecto de My9-6-DM 1 (A) y anticuerpo My9-6 no modificado (C) en el crecimiento de los tumores HL-60. El peso corporal del ratón fue monitoreado como una indicación de citotoxicidad (B, D). La Figura 22 muestra una comparación de la eficacia de My9-6-DM1 con la medicina libre maitansina en ratones SCID que tienen xenoinjertos HL-60 (A). El peso corporal del ratón fue monitoreado como una indicación de toxicidad (B). Los tumores recurrentes en dos ratones tratados fueron tratados con un Segundo curso de My9-6-DM1. Las Figuras 23 A & B muestran una comparación de la eficacia anti-tumoral de My9-6-DM1 con quimioterapia estándar en ratones SCID que tienen xenoinjertos HL-60 grandes (A). El peso corporal del ratón fue monitoreado como una indicación de toxicidad (B). Los tumores recaídos en dos ratones tratados fueron tratados nuevamente con un segundo curso de My9-6-DM1. Las Figuras 24A & B muestran la eficacia anti-tumoral de My9-6-DM1 en comparación con ozogamicina Gentuzumab y quimioterapia estándar en un modelo HL-60 subsistente. Las células HL-60 fueron inyectadas por vía intravenosa dentro de los ratones SCID. Los tratamientos indicados se iniciaron 11 días después de la inyección de las células. Los tratamientos fueron por vía intravenosa diariamente x 5 excepto para la ozogamicina Gentuzumab (Q4Dx3).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un anticuerpo murina anti-CD33 novedoso y versiones humanizadas de este anticuerpo. Se proporcionan además anticuerpos que comprenden uno o más de los CDRs del anticuerpo de murina anti-CD33 o versión humanizada del mismo que reconoce de manera específica y se enlaza a CD33.

Anticuerpo de Murina My9-6 El anticuerpo murina anti-CD33 de la presente invención, designado de manera variada en la presente como "My9-6", "murina My9-6" y "muMy9-6", está completamente caracterizado con respecto a la secuencia de aminoácido germline putativa de ambas regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada (Figura 10), secuencias de aminoácido de ambas regiones variables de cadena ligera y pesada (Figuras 8A & B), la identificación de los CDRs (Figure 9), la identificación de aminoácidos de superficie (Figuras 13A & B), y medios para su expresión en forma recombinante. Además el anticuerpo My9-6 ha sido caracterizado funcionalmente y mostró enlace con alta afinidad a CD33 en la superficie de células U-937 CD33-positivas (Figura 1). My9-6 etiquetado-121 I se enlaza a células U-937 y compitiendo con las células por medio de My9-6 no etiquetado y el anticuerpo My9 anti-CD33 caracterizado previamente (BioGenex, cat. no. 267M). El término "región variable" se utiliza en la présente para describir ciertas porciones de las cadenas pesadas y de las cadenas ligeras del anticuerpo que difieren en secuencia entre los anticuerpos y que cooperan en el enlace y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno. Usualmente la variabilidad no está distribuida de manera uniforme a través de las regiones variables del anticuerpo. De manera común está concentrada dentro de tres segmentos de una región variable llamada regiones de determinación complementaria (CDRs) o regiones hipervariables, tanto en las regiones variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de las regiones variables reciben el nombre de regiones de estructura. Las regiones variables de cadenas pesada y ligera comprenden cuatro regiones de estructura, que adoptan en gran medida una configuración de hoja beta, con cada región de estructura conectada por las tres CDRs, las cuales forman ciclos que conectan la estructura de hoja beta, y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja beta. Las CDRs en cada cadena son sostenidas en estrecha proximidad por las regiones de estructuras y con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitito de enlace de antígeno de loa anticuerpos (E. A. Kabat et al. Secuences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 1991, NIH). The región "constante" no está involucrada directamente en el enlace de un anticuerpo a un antigeno, aunque exhibe varias funciones del determinante, tal como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

Anticuerpo My9-6 Humanizado Se han preparado también las versiones humanizadas de My9-6, designadas de manera variada en la presente como "huMy9-6", y "My9-6 humanizado". El objetivo de la humanización es una reducción en la inmunogenicidad de un anticuerpo xenogénico, tal como el anticuerpo de murina, para la introducción en un ser humano, en tanto que mantiene la afinidad de enlace de antígeno completa y la especificidad del anticuerpo. Los anticuerpos humanizados pueden ser producidos utilizando varias tecnologías tales como recubrimiento e injerto de CDR. Como se utiliza en la presente, la tecnología de recubrimiento emplea una combinación de modelado molecular, análisis estadístico y mutagenesis para alterar las superficies no-CDR de las regiones variables del anticuerpo para asemejarse a las superficies de anticuerpos conocidos del huésped meta. Las estrategias y métodos para el recubrimiento de anticuerpos y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos dentro de un huésped diferente, se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,639, 641 (Pedersen et al.), la cual está incorporada a la presente en su totalidad mediante referencia. En pocas palabras, en un método preferido, (1) se generan alineaciones de posición de un depósito de regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpo para proporcionar un conjunto de posiciones expuestas de superficie de estructura de región variable de cadena pesada y ligera en donde las posiciones de alineación para todas las regiones variables son por lo menos aproximadamente 98% idénticas; (2) se define un conjunto de residuos de aminoácido expuestos de superficie de estructura de región variable para un anticuerpo de roedor (o fragmento del mismo); (3) se identifica un conjunto de residuos de aminoácido expuestos de superficie de estructura de región variable de cadena pesada y ligera que son más estrechamente idénticos al conjunto de residuos de aminoácido expuestos de superficie de roedor; (4) el conjunto de residuos de aminoácido expuestos de superficie de estructura de región variable de cadena pesada y ligera definidos en la etapa (2) es sustituido con el conjunto de residuos de aminoácido expuestos de superficie de estructura de región variable de cadena pesada y ligera identificados en la etapa (3), excepto para aquellos residuos de aminoácido que están dentro de 5A de cualquier átomo de cualquier residuo de las regiones de determinación complementarias del anticuerpo de roedor; y (5) se produce el anticuerpo de roedor humanizado que tiene especificad de enlace. Los anticuerpos pueden ser humanizados utilizando una variedad de otras técnicas incluyendo injerto CDR (EP 0 239 400; WO 91/09967; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5,530, 101; y 5,585, 089), revestimiento o recubrimiento (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991, Molecular Imnunology 28 (4/5): 489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7 (6): 805-814; Roguska M. A. et al., 1994, PNAS 91: 969-973), y redistribución de cadena (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,565, 332). Los anticuerpos humanos pueden ser generados a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de despliegue de fago. Véanse también las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 4,444, 887,4, 716,111, 5,545, 806, y 5,814, 318; y los números de publicación de solicitud de patente internacional WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741 (dichas referencias incorporadas a la presente mediante referencia en su totalidad). Como se describe de manera adicional en la presente, las CDRs de My9-6 fueron identificadas por medio de modelado y se pronosticaron sus estructuras moleculares. Los anticuerpos My9-6 humanizados fueron preparados después y han sido completamente caracterizados. Las secuencias de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de un número de anticuerpos huMy9-6 se muestran en la Figura 16A y 16B. Los valores de enlace comparatives para anticuerpos de murina y My9-6 humanizados se proporcionan en la Figura 17. Las curvas de enlace se muestran en la Figura 18.

Fragmentos de Enlace de Epítope de los Anticuerpos My9-6 Aunque los fragmentos de enlace de epítope del anticuerpo My9-6 de murina y los anticuerpos My9-6 humanizados se describen en la presente por separado del anticuerpo My9-6 de murina y las versiones humanizadas del mismo, se comprende que el término "anticuerpo" o "anticuerpos" de la presente invención pueden incluir tanto los anticuerpos muMy9-6 de longitud completa como los huMy9-6 así como los fragmentos de enlace de epítope de esos anticuerpos.

Como se utilizan en la presente, "fragmentos de anticuerpo" incluyen cualquier porción de un anticuerpo que retiene la habilidad enlazarse a CD33, denominados de manera general como "fragmentos de enlace de epítope." Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen de manera preferible, pero sin limitarse a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs (scFv) de cadena simple, anticuerpos de cadena simple, Fvs (sdFv) enlazados con disulfuro y fragmentos que comprenden ya sea un dominio VL o VH. Loa fragmentos de enlace de epítope, que incluyen anticuerpos de cadena simple, pueden comprender la(s) región(es) variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad o una porción de la siguiente: región de articulación, dominios CH1, CH2, y CH3. Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. De manera preferible, los fragmentos de anticuerpo contiene las seis CDRs del anticuerpo completo, aunque los fragmentos que contienen menos de dichas regiones, por ejemplo tres, cuatro o cinco CDRs, también son funcionales. Además, los equivalentes funcionales pueden ser o pueden combinar miembros de una de las siguientes clases de ¡nmunoglobulina: IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE, y las subclases de las mismas. Los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden ser producidos por medio de división fotovoltáica, utilizando enzimas tales como papaina (fragmentos Fab) o pepsina (fragmentos F(ab')2). Los fragmentos FVs (scFvs) de cadena simple son fragmentos de enlace de epítope que contienen por lo menos un fragmento de una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) enlazada a por lo menos un fragmento de una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL). El enlazador puede ser un péptido flexible corto seleccionado para asegurar que el doblamiento tridimensional adecuado de las regiones (VL) y (VH) ocurra una vez que están enlazados a fin de mantener la especificidad de enlace de la molécula de objetivo del anticuerpo completo a partir del cual se deriva el fragmento de anticuerpo de cadena simple. El término carboxilo de la secuencia (VL) o (VH) puede ser enlazado en forma covalente por un enlazador al término aminoácido de una secuencia complementaria (VL) y (VH). Los fragmentos de anticuerpo de cadena simple pueden ser generados por medio de clonación molecular, biblioteca de despliegue de fago del anticuerpo o técnicas similares bien conocidas por el técnico experimentado. Esas proteínas pueden ser producidas por ejemplo, en células eucarióticas o células procarióticas, incluyendo bacteria. Los fragmentos de enlace de epítope de la presente invención pueden generarse utilizando varios métodos de despliegue de fago conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue de fago, los dominios de anticuerpo funcional son exhibidos en la superficie de las partículas de fago que portan las secuencias de polinucleótido que las codifican. En particular, dicho fago puede ser utilizado para exhibir los dominios de enlace de epítope expresados a partir de una biblioteca de anticuerpo de combinación o repertorio (e. g., humano o murina). El fago que expresa un dominio de enlace de epítope que enlaza el antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con antígeno, por ejemplo, utilizando CD33 etiquetado o CD33 enlazado o capturado por una superficie o lecho sólido. El fago usado en esos métodos es típicamente el fago filamentoso que incluye dominios de enlace fd y M13 expresados a partir del fago con dominios de anticuerpo Fab, Fv o FV estabilizados con disulfuro fusionados de manera recombinante al gen de fago III o proteína VIII de fago. Ejemplos de métodos de despliegue de fago que se pueden utilizar para formar los fragmentos de enlace de epítope de la presente invención incluyen aquellos descritos en Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182: 41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184: 177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J; Immunol. 24: 952-958; Persic et al., 1997, Gene 187: 9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: 191-280; solicitud PCT No. PCT/GB91/01134; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; W095/15982; WO 95/20401; y Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica. Nos. 5,698, 426; 5,223, 409; 5,403, 484; 5,580, 717; 5,427, 908; 5,750, 753; 5,821, 047; 5,571, 698; 5,427, 908; 5,516, 637; 5,780, 225; 5,658, 727; 5,733, 743 y 5,969, 108; cada una de las cuales está incorporada en la presente mediante referencia en su totalidad. Después de la selección de fago, las regiones de la codificación de fago los fragmentos pueden ser aislados y utilizados para generar los fragmentos de enlace de epítope a través de la expresión en un huésped seleccionado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levadura, y bacteria, utilizando tecnología ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en detalle a continuación. Por ejemplo, las técnicas para producir de manera recombinante los Fab, Fab' y F(ab')2 también se pueden emplear usando métodos conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en la publicación PCT WO T2/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12 (6): 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34: 26-34; and Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043; dichas referencias incorporadas mediante referencia en su totalidad. Los ejemplos de técnicas que se pueden utilizar para producir Fvs de cadena simple y anticuerpos incluyen aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 4,946, 778 y 5,258, 498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203: 46-88; Shu et al., 1993, PNAS 90 : 7995-7999;Skerra et al., 1988, Science240: 1038-1040.

Equivalentes Funcionales Incluidos también dentro del alcance de la invención están los equivalentes funcionales del anticuerpo My9-6 y los anticuerpos My9-6 humanizados. El término "equivalentes funcionales" incluye anticuerpos con secuencias homologas, anticuerpos quiméricos, anticuerpo modificado y anticuerpos artificiales, por ejemplo, en donde cada equivalente funcional está definido por su habilidad para enlazarse a CD33. El técnico experimentado comprenderá que hay un traslape en el grupo de moléculas de nominadas "fragmentos de anticuerpo" y el grupo denominado "equivalentes funcionales". Los anticuerpos con secuencias homologas son aquellos anticuerpos con secuencias de aminoácido que tienen identidad u homología de secuencia con secuencias de aminoácido de los anticuerpos de murina My9-6 y y9-6 humanizados de la presente invención. Preferentemente la identidad está con la secuencia de aminoácido de las regiones variables de los anticuerpos de murina My9-6 y My9-6 humanizados de la presente invención. "Identidad de secuencia" y "homología de secuencia" como se aplican para una secuencia de aminoácido en la presente está definida como una secuencia con por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, o 94% de identidad de secuencia, y de manera más preferible por lo menos de aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia para otra secuencia de aminoácido, como se determinó, por ejemplo, por medio del método de búsqueda FASTA de acuerdo con Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988). Como se utiliza en la presente, un anticuerpo quimérico es aquel en el cual diferentes porciones de un anticuerpo se derivan de diferentes especies animales. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una variación de región derivada de un anticuerpo monoclonal de murina se aparea con una región constante de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos están identificados en la literatura existente. Ver, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gilíes et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. Nos. 5,807,715; 4,816,567; y 4,816,397, que están incorporadas a la presente mediante referencia en su totalidad.

Los anticuerpos artificiales incluyen fragmentos de scFV, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y mru (ver revisiones hechas por Winter, G. y Milstein, C, 1991, Naturaleza 349: 293-299; Hudson, P. J., 1999, Current Opinión in Immunology 11: 548-557), cada una de las cuales tienen una habilidad de enlace antigen. En el fragmento Fv de cadena simple (scFv), los dominios VH y VL de un anticuerpo están unidos por un péptido flexible. Por lo regular, este péptido de unión tiene una longitud de 15 residuos de aminoácidos. Si la unión es más pequeña, por ejemplo de 5 aminoácidos, se forman diacuerpos, que son reductores bivalentes de scFV. Si la unión se reduce a menos de tres residuos aminoácidos, se forman las estructuras trimérica y tetratrimérica que entonces se llaman triacuerpos y tetracuerpos respectivamente. La unidad de enlace más pequeña de un anticuerpo es una CDR, por lo regular CDR2 de la cadena pesada, el cual tiene el suficiente reconocimiento específico y el enlace que pueden ser utilizados por separado. Dicho fragmento se llama unidad de reconocimiento molecular o mru. Varios de esos mrus pueden unirse con pequeños péptidos de unión, y así formar una proteína de enlace artificial con mayor fuerza que un mru sencillo. Los equivalentes funcionales de la presente solicitud también incluyen los anticuerpos modificados, por ejemplo, los anticuerpos modificados por el anexo covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos modificados incluyen anticuerpos que han sido modificados; es decir, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, descomposición proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. La unión covalente no previene al anticuerpo de regenerar una respuesta anti-idiotípica. Estas modificaciones pueden llevarse a cabo por medio de conocidas técnicas, incluyendo, más no siendo las únicas, la descomposición química específica, la acetilación, la formilación, la síntesis metabólica de la tunicamicina, etc. Además, los anticuerpos modificados pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos. Los equivalentes funcionales pueden ser producidos al intercambiar diferentes CDR's producidos por diferentes cadenas dentro de diferentes estructuras. Asimismo, por ejemplo, es posible que existan diferentes clases de anticuerpos para un determinado grupo de CDR's en sustitución de diferentes clases de cadenas pesadas, donde, por ejemplo, se pueden producir isotipos y tipos de anticuerpos IgGI 4, lgM.lgAi-2, IgD, IgE. De igual manera, los anticuerpos artificiales dentro del alcance de la invención se pueden producir incrustando un grupo dado de CDR's dentro de una estructura completamente sintética. Los equivalentes funcionales están listos para producirse por mutación, eliminación y/o inserción dentro de las secuencias de región constante y/o variable que flanquean una serie particular de CDRs, utilizando una gran variedad de métodos conocidos en el medio. Los fragmentos de anticuerpos y los equivalentes funcionales de la presente invención incluyen esas moléculas con grado detectable de enlace a CD33, cuando se compara con el anticuerpo My9-6 de murina. Un grado detectable de enlace incluye todos los valores en un rango de por lo menos 10-100%, de preferencia de por lo menos de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, de la habilidad de enlace del anticuerpo My9-6 de murina para CD33.

Anticuerpos Mejorados Las CDRs tienen una importancia primaria para el reconocimiento del epítope y el enlace del anticuerpo. Sin embargo, los cambios pueden hacerse a los residuos que incluyen los CDRs sin interferir con la habilidad del anticuerpo para reconocer y enlazar su epítope cognado. Por ejemplo, se pueden hacer los cambios que no afectan el reconocimiento del epítope, sino que aumentan la afinidad de protección del anticuerpo para el epítope. Por lo tanto, existen versiones mejoradas tanto de la murina como de los anticuerpos humanizados también incluidas en el alcance de la presente invención, las cuales también reconocen específicamente y protegen al CD33, preferentemente con una afinidad incrementada. Numerosos estudios han investigado los efectos de introducir uno o más cambios de aminoácidos en varias posiciones en una secuencia de un anticuerpo, basándose en el conocimiento de la secuencia primaria de anticuerpos y su propiedades tal como su enlace y nivel de expresión (Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol. B i oí . , 254,392-403; Rader, C. et al., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95,8910-8915; Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16,535-539). En estos estudios, las equivalencias de los anticuerpos primarios han sido generados al cambiar las secuencias de la cadena de genes ligera y pesada en las CDR1, CDR2, CDR3, o regiones delimitadas, utilizando métodos como la mutagenesis dirigida-mediada por sitio-de oligonucléotido, mutagenesis de cásete, PCR propenso a error, redistribución de ADN, o cepas mutantes de E. coli (Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16,535-539;: Adey, N. B. et al., 1996, Capítulo 16, pp. 277-291, en "Phage Display of Peptides and Proteins", Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press). Estos métodos utilizados para cambiar la secuencia del anticuerpo primario han dado como resultado afinidades mejoradas de los anticuerpos secundarios (Gram, H. et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89,3576-3580; Boder, E. T. et al., 2000, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 97,10701-10705; Davies, J. and Riechmann, L., 1996, Itninunotechnolgy, 2,169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol.Biol., 256,77-88; Short, M. K. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277,16365-16370 Furukawa, K. et al., 2001, J Biol. ChenZ., 276,27622-27628). Por medio de una estrategia dirigida similar al cambiar uno o más residuos de aminoácidos del anticuerpo, las secuencias del anticuerpo descritas aquí pueden utilizarse para desarrollar anticuerpos anti-CD33 con funciones mejoradas, incluyendo una afinidad mejorada para el CD33. Los anticuerpos mejorados también incluyen a aquellos anticuerpos que han mejorado características que son preparadas por técnicas estándares de inmunización animal, formación de hibridoma y selección para anticuerpos con características específicas.

Inmunoconjugados La presente invención también está dirigida a los inmunoconjugados, incluyendo los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, equivalencias funcionales, anticuerpos mejorados y sus análogos como se describen aquí, enlazados a un fármaco o profármaco. Los fármacos o profármacos preferidos son los agentes citotóxicos e incluyen, por ejemplo, los maitansinoides y maitansinoides análogos, taxoides, CC-1065 y CC-1065 análogos, dolastatina y análogos de dolastatina. Los inmunoconjugados se pueden preparar con métodos in vitro. Para poder unir un fármaco o profármaco a un anticuerpo, se utiliza un grupo de unión. Los grupos de enlace adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen los grupos disulfuros, grupos tioéter, grupos lábiles de ácido, grupos foto lábiles, grupos hábiles de peptidasa y grupos esterasa lábiles. Los grupos de enlace preferidos son los grupos disulfuros y los grupos tioéter. Por ejemplo, los conjugados se pueden construir utilizando una reacción de cambio de disulfuro o formando una unión entre el anticuerpo y el fármaco o profármaco. Los maitansinoides y los maitansinoides análogos se encuentran entre los agentes citotóxicos recomendados. Algunos ejemplos de maitansinoides recomendados incluyen el maitansinol y el maitansinol análogo. Los maitansinoides recomendados se encuentran descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 4,424, 219; 4,256, 746; 4,294, 757; 4,307, 016; 4,313, 946; 4,315, 929; 4,331 ,598;4, 361 ,650;4, 362, 663; 4,364, 866; 4,450, 254; 4,322, 348; 4,371 ,533;6, 333, 410;5, 475, 092;5, 585, 499; y 5,846, 545. Con respecto a los maitansinoides, el grupo de enlace puede comprender un grupo químico reactivo. En la realización de la invención recomendada, el grupo del reactivo químico puede estar covalentemente unido al maitansinoide por medio de una mitad de enlace de disulfuro. Los grupos químicos reactivos recomendados en particular son el éter de N-succinimidilo y el éter de N-sulfosuccinimidilo. Los maitansinoides recomendados en particular que comprenden un grupo de enlace que contiene un grupo químico reactivo son los éteres C-3 de maitansinol y sus análogos donde la porción de enlace contiene un enlace de disulfuro y el grupo químico reactivo incluye un éter de N-succinimidilo o un éter de N-sulfosuccinimidilo.

Muchas posiciones en los maitansinoides pueden servir como la posición para llevar a cabo el enlace químicamente de una porción de enlace. Por ejemplo, se espera que tanto la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con hidroxi como la posición C-20 que tiene un grupo hidroxi sean útiles. Sin embargo, se recomiendan especialmente tanto la posición C-3 como la posición C-3 del maitansinol. Otros enlaces químicos incluyen los enlaces de ácidos lábiles, enlaces fotolabiles, enlaces péptidos lábiles y enlaces de esterase lábiles. La descripción de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,208, 020, anexa, muestra la producción de maitansinoides que tienen dichos enlaces. Como se describe con detalle más adelante, el ¡nmunoconjugado My9-6-DM1 utiliza maitansinoide que contiene tiol (DM1). El DM1 está representado por la siguiente fórmula estructural Los taxanos son agentes citotóxicos recomendados. Los taxanos adecuados para utilizarse en la presente invención están divulgados en las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 6,372, 738 y 6,340, 701. Los conjugados de los taxanos de la invención y un agente protector de célula se pueden formar utilizando cualquiera de las técnicas conocidas hasta ahora o desarrolladas más adelante. En USP 5,416, 064 y USP 5,475, 092 se enseñan numerosos métodos de conjugación. El CC-1065 y sus análogos son fármacos citotóxicos recomendados para uso en la presente invención. CC-1065 y sus análogos se encuentran descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6,372, 738; 6,340, 701; 5,846, 545; y 5,585, 499. CC-1065 es un potente antibiótico anti-tumoral aislado del caldo de cultivo del Streptomyces zelensis. CC-1065 es aproximadamente 1000-veces más potente in vitro que los fármacos anti-cancerígenos usados comúnmente, como la doxorubicina, metotrexato y virícristina (B.K. Bhuyan et al, Cáncer Res., 2, 3532-3537(1982)). También los fármacos como el metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, caliqueamicina, dolastatina y análogos de dolastatina son apropiados para la preparación de conjugados Las moléculas de los fármacos también pueden unirse a las moléculas de los anticuerpos a través de una molécula de acarreo intermediaria como el suero de albúmina. 7 Inhibición del crecimiento de células que expresan CD-33 En la presente invención también se incluyen métodos para inhibir el crecimiento de las células que expresan CD33. Estos métodos utilizan los anticuerpos o inmunoconjugados de la presente invención, así como los anticuerpos o inmunoconjugados de la presente invención en conjunto con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos apropiados incluyen a aquellos que inhiben directa o indirectamente el crecimiento de la célula de expresión CD33. Como se utilizan en la presente los términos "inhibir" e "inhibición se deberá entender que incluyen cualquier efecto inhibidor en el crecimiento de la célula incluyendo la muerte de la célula. Los efectos inhibidores incluyen efectos secundarios, efectos sostenidos y efectos permanentes Aplicaciones Terapéuticas La presente invención también incluye las aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos o inmunoconjugados de la presente invención donde los anticuerpos o inmunoconjugados pueden ser administrados a un sujeto, en una dosis farmacéuticamente aceptable. Pueden ser administradas vía intravenosa como un bolo o mediante una infusión continua por un período, vía intramuscular, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, topical, o por rutas de inhalación. También pueden administrarse por ruta intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos locales asi como efectos terapéuticos sistémicos. Una dosis farmacéuticamente aceptable generalmente incluiría un agente farmacéuticamente aceptable como un portador, un diluente y un excipiente. Estos agentes son bien conocidos y el agente más apropiado lo determinarán aquellos expertos en la materia conforme la situación clínica lo garantice. Algunos ejemplos de portadores, diluentes y/o excipientes adecuados incluyen: (1) El PBS (solución salina regulada con fosfato de Dubelcco), pH - 7.4 aproximadamente, que contiene aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml suero de albúmina humana, (2) 0.9% solución salina (0.9% w/v NaCI), y (3) 5% (w/v) dextrosa. En otras aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención son co-administrados con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos son aquellos agentes que buscar matar o limitar el crecimiento de las células cancerígenas haciendo el mínimo daño posible al huésped. De este modo, dichos agentes pueden aprovecharse de cualquier diferencia en las propiedades de las células cancerígenas (por ejemplo, metabolismo, vascularización, presentación antigen con superficie celular) en contraste con las células sanas del huésped. Las diferencias en la morfología del tumor son situaciones potenciales para una intervención. Por ejemplo, el agente terapéutico puede ser un anticuerpo como un anticuerpo anti-VEGF que es útil para retardar la vascularización del interior de un tumor sólido, por lo que disminuye su rangó de crecimiento. Los agentes terapéuticos adecuados incluyen, más no están limitados a otros, agentes citotóxicos o citoestáticos. El Taxol es un agente terapéutico preferido que también es un agente citotóxico. Otros agentes terapéuticos incluyen, más no están limitados a otros, adjuntos como el granisetron HCL, inhibidores androgenos como el acetato de leuprolida, antibióticos como doxorubicina, antiestrógenos como el tamoxifen, antimetabolitos como el interferon alfa-2a, inhibidores de enzimas como el inhibidor de ras farnesil-transferasa, inmunomoduladores como aldesleuquina, y derivados de mostaza del nitrógeno como el melfala'n HCI, y otros similares. Cuando se presenta en una forma de dosis acuosa, en vez de liofilizada, el anticuerpo por lo regular se formula en una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a 100 mg/ml, aunque se permite amplia variación fuera de ios rangos. Para el tratamiento de la enfermedad, la dosis de anticuerpo o conjugado apropiada dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se definió anteriormente, la gravedad y curso de la enfermedad, ya sea que los anticuerpos sean administrados con fines preventivos o terapéuticos, el curso de la terapia previa, la historia clínica del paciente y su respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo es susceptible de administrarse al paciente de una sola vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, la dosis a administrar como inicial al paciente será de aproximadamente 0.015 a 15 mg. de anticuerpo/kg . del peso del paciente, ya sea, por. ejemplo, en una o más administraciones por separado, o por infusión continua. Para administraciones repetidas durante varios días o prolongadas, dependiendo de la condición, el tratamiento se repite hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, no se excluye poder utilizar otras dosis útiles para el tratamiento. Las aplicaciones terapéuticas de la presente invención incluyen métodos para tratar un sujeto con una enfermedad. Las enfermedades que se tratan con los métodos de la presente invención son aquellas que se caracterizan por la expresión de CD33. Dichas enfermedades incluyen síndromes mielodisplásticos (MDS) y cánceres como la. leucemia mieloide aguda (AML), la leucemia mieloide crónica (CML), y la leucemia pro-mielocítica (PML). Los expertos entenderán que los métodos de la presente invención también pueden ser utilizados para tratar otras enfermedades que se describen más adelante caracterizadas por la expresión de CD33. Las aplicaciones terapéuticas de la presente invención también pueden practicarse in vitro y ex vivo Algunos ejemplos de los usos in vitro incluyen la purificación de poblaciones de células contaminadas con células CD33 positivas como lo son las de la línea mieloide. El método consiste en cultivar las poblaciones de células en presencia de un inmunoconjugado citotóxico My9-6 y después quitar las células CD33 positivas muertas. Las condiciones para utilizar un in vitro no clínico son bien conocidas (ver, e. g., Uckun et al, 1986, JExp. Med. 163,347-368; Uckun et al., 1985, J; Immunol. 134, 3504-3515; Ramakrishnan et al., 1985, J Itnrnuiaol. 3616-3622). Ejemplos del uso clínico ex vivo incluye el tratamiento de la médula ósea autóloga antes de aplicar la infusión en el mismo paciente para eliminar las células mieloides malignas o enfermas (Roy D. C. et al., 1995, J. Clin. Immunol. 15, 51-57).

Aplicaciones del Diagnóstico e Investigación Además de los usos terapéuticos de los anticuerpos discutidos aquí, los anticuerpos de la presente invención se pueden emplear en muchos diagnósticos conocidos y aplicaciones de investigación. Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse, por ejemplo, en la purificación, detección, y señalamiento del CD33, incluido tanto en el método de diagnóstico in vitro como in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden utilizar en inmuno ensayos para medir los niveles cuantitativos y cualitativos del CD33 expresado por las células en muestras biológicas. (Ver, por ejemplo., Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988), incorporada aquí mediante referencia en su totalidad. Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo, en ensayos de enlaces competitivos, ensayos de intercalación directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987). Los anticuerpos de la invención también son útiles para la formación de imagen in vivo, en donde un anticuerpo etiquetado con una mitad detectable como un agente radio-opaco o radio isótopo es administrado a un sujeto, de preferencia dentro del torrente sanguínea, y se ensaye la presencia y localización del anticuerpo etiquetado en el huésped. Esta técnica de formación de imagen es útil en las etapas y el tratamiento de las enfermedades. El anticuerpo puede etiquetarse con una porción que es detectable en el huésped, ya sea por medio de resonancia magnética nuclear, radiología, u otros medios de detección conocidos en el medio. La etiqueta puede ser cualquier porción detectable que sea capaz de producir, tanto directa como indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la etiqueta puede ser una etiqueta de biotina, una clasificación de enzimas (e. g., luciferasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y peroxidasa de rábano), una radio-clasificación (e. g., 3H, 14C, 32p, 35S, y 1251), un fluoroforo como el del compuesto fluorescente o quimioluminicente (e. g., fluorescino isotiocianato, rodamina), un agente de formación de imagen (e. g. , Tc-m99 y indio (1 t tln)) y un ion metálico (e. g., galio and europio).

Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo para la etiqueta, incluyendo aquellos métodos descritos por Hunter, et al., 1962, Nature 144: 945; David et al., 1974, Biochemistry 13: 1014; Pain et al., 1981, J. Immunol. Meth. 40:219; Nygren, J., 1982, Histochem. and Cytochem. 30:407. Los anticuerpos de la invención también son útiles como agentes de purificación de afinidad. En este proceso, los anticuerpos son inmovilizados en un soporte adecuado, como una resina Sefadex o papel filtro, utilizando métodos bien conocidos en el medio. Por lo tanto, el CD33 puede aislarse y purificarse a partir de una muestra biológica.

Polinucleótidos, Vectores, Células Huésped y Métodos para crear Anticuerpos La presente invención proporciona además polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleotido que codifica un anticuerpo de la invención o fragmentos de enlace de epítope. La presente invención también abarca polinucleótidos que codifican polipéptidos que pueden enlazar CD33 y que hibridicen bajo condiciones de híbridización rigurosa a los polinucleótidos que codifican un anticuerpo de la presente invención, en donde las mencionadas condiciones de híbridización rigurosa incluyen: pre-hibridización por 2 horas a 60°C en 6x SSC, 0.5% SDS, 5x solución de Denhardt, y 100 mg/ml de ADN del esperma de salmón desnaturalizado por calor; híbridización por 18 horas a 60°C, lavado dos veces en 4x SSC, 0.5% SDS, 0.1% de pirofosfato de sodio, por 30 min. A 60°C y dos veces en 2x SSC, 0.1% SDS por 30 min. a 60°C. Los polinucleótidos se pueden obtener, y determinar la secuencia nucleotide de los polinucleótidos, con cualquier método conocido en el medio. Por ejemplo, si se conoce la secuencia nucleotide del anticuerpo, un polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede ensamblar desde oligonucleótidos químicamente sintetizados (es decir, como se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17: 242) lo cual, brevemente, involucra la síntesis de oligonucleótidos traslapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica al anticuerpo, recocido y ligación de esos oligonucleótidos, y la amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR. Los métodos para la construcción de vectores recombinantes que contienen secuencias que codifican anticuerpos y señales de control transcripcional y translacional apropiadas son bien conocidos en el medio. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Por lo tanto la invención, proporciona vectores reproducibles que incluyen una secuencia de nucleótido que codifica una molécula de anticuerpo de la presente invención, o un dominio variable de una cadena ligera o pesada, o un fragmento de enlace de epítope de cualquiera de estas, operablemente enlazada a un promotor. El vector recombinante se transfiere a una célula huésped con técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan entonces con técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención. Por lo tanto, la invención incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención, o un fragmento de enlace de epítope, operablemente enlazado a un promotor heterólogo. En modalidades preferidas, los vectores que codifican tanto las cadenas pesadas como ligeras pueden ser co-expresados en la célula huésped por la expresión de una molécula de inmunoglobulina entera. Se pueden utilizar una variedad de vectores de expresión del huésped para expresar las moléculas del anticuerpo de la invención. Dichos sistemas de expresión de huésped representan vehículos por los que se pueden producir secuencias de codificación de interés y subsecuentemente purificadas, pero también representa células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de codificación de nucleótido apropiadas, expresar una molécula anticuerpo de la invención in situ. Esto incluye, más no se limita, a los microorganismos como las bacterias (e.g. E. coli, B. subtilis) transformadas con un bacteriófago recombinante ADN, vectores de expresión de ADN plásmido o ADN cósmido que contienen secuencias de codificación de anticuerpo; levadura (e. g., Saccharomyces , Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contiene secuencias de codificación de anticuerpo; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (e. g., baculovirus) que contiene secuencias de codificación de anticuerpo; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (e. g. , virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plásmida recombinante (e. g., Ti plásmida) que contienen secuencias de codificación de anticuerpo; o sistemas de células de mamífero (e.g., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) albergando construcciones de expresión recombinante que contiene promotores derivados del genoma de las células de mamífero (e. g., promotor de metalotioneina) o a partir de virus de mamífero (e. g., el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia). Preferentemente, las células bacteriales como la Esqueriquia coli, y preferentemente mejor, las células eucarióticas, en especial de la expresión de toda la molécula del anticuerpo recombinante, se utilizan para la expresión de una molécula del anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero como las células de los ovarios del cobayo chino (CHO), junto con un vector como el principal elemento promotor del gen temprano intermediario del citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para los anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2). Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, Se pueden diseñar líneas de células que expresen establemente la molécula de anticuerpo. En vez de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes virales de reproducción, las células huésped se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de expresión adecuados (e.g. promotor, mejorador, secuencias, terminales de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador selecciónatele. Siguiendo con la introducción del ADN extraño, se puede permitir que las células diseñadas crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido, y después sean cambiadas a un medio selectivo. El marcador selecciónatele en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células se integren de manera estable al plásmido dentro de sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden ser clonados y expandidos en las líneas de células. Este método puede ser utilizado de manera ventajosa para diseñar líneas de células que expresen la molécula del anticuerpo. Dichas líneas de células diseñadas pueden ser particularmente útiles en el tamizado y evaluación de los compuestos que interactúan directa o indirectamente con la molécula del anticuerpo. Una vez que la molécula del anticuerpo ha sido expresada recombinantemente, puede ser purificada por un método conocido en la técnica de purificación de una molécula de hemoglobina, por ejemplo, por cromatografía (e.g. intercambio de iones, afinidad, particularmente por afinidad con el antigen específico después de la Proteína A y cromatografía de columna de dimensionamiento) centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier técnica estándar para la purificación de proteínas.

EJEMPLOS La invención se describe ahora mediante referencia a los siguientes ejemplos, que son únicamente ilustrativos, y no pretenden limitar la presente invención.

Ejemplo 1. Anticuerpo de murina y9-6 En este primer ejemplo, se muestra la estructura completa de aminoácido primaria y la secuencia cADN del anticuerpo My9-6 de murina, junto con sus propiedades de enlace y medios de expresión en forma recombinante. Por consiguiente, se proporciona una descripción completa de un anticuerpo de la invención y su preparación, tal como un experto en las técnicas inmunológicas podría preparar dicho anticuerpo sin experimentación indebida. 1.1. Generación, Producción y Caracterización del Anticuerpo My9-6 Se utilizó una línea de célula de fibroblasto de murina A 3T3 transfectada con el antigen CD33 para la inmunización Los ratones hembra BALB/c, de 5 meses de edad, fueron inmunizados intraperitonealmente en el día 0 con la línea de células de fibroblasto de murina 3T3 transfectada (2.5 x 106 células, suspendidas en 0.2 mL PBS). Los animales fueron estimulados con 0.2 ml_ de suspensión de células como sigue: día 13, 5 x 10a células; día 21, 5 x 106 células. En el día 24, un ratón fue sacrificado y se le extirpo el bazo. El bazo se colocó entre dos placas de vidrio congeladas para obtener una suspensión celular simple, que fue lavada con penicilina conteniendo medio RPMI libre de suero y estreptomicina. La pella de célula de bazo fue suspendida nuevamente en 10 mL de 0.83% (p/v) solución de cloruro de amonio en agua por 10 minutos sobre hielo para lisar las células de glóbulos rojos, y después fue lavada con un medio libre de suero (SFM). Las células del bazo (1.6 x 108) fueron depositadas con células de mieloma (5.4 x 107) a partir de la línea de células de mieloma del ratón no secretor P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville, MD; cat. no. CRL1580) en un tubo, y lavadas con el medio sin suero RPMI-1640 (SFM). El sobrenadante se removió y la pella de célula se diluyó a 2 x 1 O7 células/mL. Las células fueron puestas en placas de 2 x107 células/placa sobre placas de cultivo de tejido que están cubiertas con 15 mg/mL de concanavalina A. Las placas fueron incubadas durante una hora a 37°C. El sobrenadante fue removido cuidadosamente desde las placas. Se le agregó por goteo lentamente un mi. de solución de polietilen glicol (40% PEG p/v). Las placas fueron giradas e incubadas por 30 segundos. Se removió el PEG y se desechó. Las placas se lavaron dos veces agregando lentamente 5 mi de SFM y después se desecha la solución. Después del lavado final, se agregaron 5 mi de SFM complementado con 5% de Suero Fetal Bovino (FBS) Las placas se dejaron incubando por la noche a 37°C. Después de la incubación, las células fueron raspadas desde las placas con un raspador de células y depositadas. Las placas fueron enjuagadas y depositadas con las células. Las células fueron formadas en pella por centrifugación y suspendidas nuevamente en un medio de crecimiento RPMI-1640 adicionado con FBS al 5%, penicilina-estreptomicina e hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT). Las células fueron acomodadas en placas en 2 x105 células/pozo en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos conteniendo una capa alimentadora de macrófagoa. Las condiciones generales utilizadas para la inmunización y producción de hibridoma son como las describen J. Langone and H. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Vol. 121, "Immunochemical Techniques, Partí"; 1986; Academic Press, Florida) y E. Harlow y D. Lañe ("Antibodies: A Laboratory Manual"; 1988; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Otras técnicas de inmunización y producción de hibridoma también pueden utilizarse como lo saben aquellos con experiencia en la técnica. Los cultivos sobrenadantes de clones de hibridoma fueron tamizados mediante enlace con células transfectadas con el ántígeno CD33 y la línea de células linfoma histiocítico humano, U-937 (ATCC CRL-1953.2) y por falta de enlace a una línea de célula de fibroblasto de ratón. Estos clones fueron expandidos y subclonados. Los cultivos de sobrenadantes de los subclones fueron tamizados adicionalmente por medio de los ensayos de enlace antes mencionados. Por este procedimiento, el subclon 3E7-H2-3D8 (My9-6) fue seleccionado, y la cadena pesada y ligera de genes fue clonada y secuenciada como se describe más adelante. El tamizado de los sobrenadantes de hibridoma para enlaces específicos para el antigen CD33 se lleva a cabo utilizando ELISA en las líneas de células que expresan este antigen y en una línea de células negativa para este antigen. Las células se cultivan por separado a partir de los matraces de cultivo de tejido, suspendidas en un medio de crecimiento que contiene 10% de FBS, formadas en pella por centrifugación, y lavados con PBS. Las células lavadas (100 uL de aproximadamente 1-3 x 106 células/mL) se agregan a los pozos de una placa lmmulon-2HB cubierta con fitohemaglutinlna (100 uL de 20 ug/mL PHA), centrifugada y permitiendo que se adhiera a los pozos recubiertos con PHA durante 10 min. La placa con células fue sacudida para remover el PBS y después secada durante la noche a 37°C. Los pozos fueron bloqueados con una solución BSA de 5mg/ml en PBS por 1 hora a 37°C y después lavada cuidadosamente con PBS. Alícuotas de los sobrenadantes a partir de los clones de hibridoma (100 uL; diluido en regulador de bloqueo) se agregaron después a los pozos que contenían células que expresan el antigen CD33 y a células que no expresan CD33, y fueron incubadas a temperatura ambiente por 1 hora. Los pozos fueron lavados con PBS, incubados con un conjugado de cabra-anti-ratón-lgG-anticuerpo-peróxidasa de rábano (100 uL; en regulador de bloqueo) por 1 hora, seguido por lavados y después se detectaron enlaces usando un sustrato de ABTS/H202. Un sobrenadante común de un subclon de hibridoma 3E7 a la incubación con células de antigen CD33 produjo una señal de 0.50 unidades de absorbancia, en contraste con un valor de 0.10 unidades de absorbencia obtenida a la incubación con células negativas para el antigen CD33. El hibridoma fue cultivado en ascitos en ratones BALB/c. Se diluyó un frasco de células hibridomas congeladas y las células se expandieron en matraces de cultivo de tejido para obtener el número necesario de células por producción de ascitos. Los ratones BALB/c preparados (los ratones habían sido inyectados i.p. con 0.5 mL de pristano 10-14 días antes) fueron inyectados con 1 x 106 células en 0.5 mL solución salina regulada con fosfato (PBS). Doce a 18 días después de la inyección de las células, el fluido de ascitos fue retirado de la cavidad peritoneal de los ratones con una jeringa. El fluido de ascitos depositados fue centrifugado a 1000 rpm durante 5 min, entonces el sobrenadante fue sujeto a la centrifugación a 12,000 rpm durante 30 minutos. El anticuerpo fue purificado desde el sobrenadante claro como sigue: Paso 1: precipitación de sulfato de amonio. El sobrenadante sobre hielo fue diluido con dos volúmenes de PBS frío, agitado y después tratado lentamente con un volumen de solución de sulfato amonio saturado (100%) fría. Se dejó reposar la solución sobre hielo durante 5 horas aproximadamente, cuando el precipitado fue recolectado por centrifugación. La pella se disolvió en una pequeña cantidad de PBS y la solución resultante se dializó dentro del regulador de pH para la etapa de purificación de afinidad con proteína A. Etapa 2: Purificación de afinidad en la Proteína-Sefarosa A. El isotipo de My9-6 de murina es IgGI con una cadena ligera kappa. Por lo tanto, la columna de afinidad estaba equilibrada en regulador de pH 0.1 M tris.HCI que contiene 3M de NaCI, pH 8.0. La solución de anticuerpo en el mismo regulador pH fue pasada a través de la columna, la columna se lavó bien con el regulador de equilibrio y después eluida con 0.1 M de ácido acético que contiene 0.15 M de NaCI. Se ensayaron las fracciones midiendo la absorción de UV a 280 nm. Se combinaron y neutralizaron las fracciones que contenían el anticuerpo con 1 M tris y después dializadas en PBS para su uso y almacenamiento. El anticuerpo purificado se caracterizó ¡nicialmente por enlazarse a las células de expresión CD33, como la línea de célula de fibroblasto 3T3 de murina transfectada y la línea de célula humana U-937 y la ausencia de enlace a las líneas de célula de antigen-negativo como se describió anteriormente para el tamizado de los sobrenadantes de hibridoma. Para asegurarse de su especificidad de enlace al antigen CD33, se lleva a cabo un experimento de enlace de competencia entre muMy9-6 etiquetado y el anticuerpo My9 anti-CD33 comercialmente disponible. El experimento de enlace se llevó a cabo utilizando el método descrito por Goldmacher et al. (1989, J.Cell.Physiol. 141, 222-234). El anticuerpo My9-6 de murina fue radioetiquetado utilizando la técnica de lodo-gen (Fraker, P. J. and Speck, J. C, 1978, Biochem.Biophys. Res. Commun. 80, 849-857).

Una cantidad constante (3 x10'9 M) de muMy9-6 125l-etiquetado fue mezclada con concentraciones crecientes de anticuerpos no-radioactivos, tanto el muMy9 no etiquetado como el My9 no etiquetado, y las mezclas fueron incubadas con células (1 x 106 células por muestra) a 4°C durante 30 min. Estas incubaciones fueron hechas en 60 ul de un regulador de pH que se compone de un Medio Esencial Mínimo Modificado para Cultivos de Suspensión (SMEM) adicionado con suero humano al 2.5%. Después las células fueron separadas del medio que contiene material no enlazado por centrifugación a través de una mezcla de aceite de silicona (Aldrich) y aceite de parafina (Baker) con una densidad de 1.009 g/ml. La pella celular fue removida por corte de los tubos de centrifugado en la interfaz de aceite y fue utilizada para medir la radioactividad asociada a la célula en un contador-gamma (modelo RIA gamma 1274 de LKB). La radioactividad asociada a la célula medida es teñida contra las concentraciones de anticuerpos competentes no etiquetados. Los resultados se muestran en la Figura 1: ambos anticuerpos, My9 and My9-6, dan curvas de enlace de competencia muy similares. Esto demuestra que My9 and My9-6 enlazados al mismo antigen y más aun que ambos anticuerpos tienen requerimientos de enlace muy similares. Ya que el My9 es un estándar anti-CD33 publicado y aceptado se concluye que My9-6 es un anticuerpo anti-CD33. El anticuerpo My9 está disponible comercialmente en BioGenex (San Ramón, Ca 94583; no. de cat. AM267-5M). 1.2. Clonación de cadenas pesadas y ligeras de Genes de Anticuerpos My9-6 La totalidad del ARN se purificó de un matraz confluente T175 de My9-6 células de hibridoma como se describe en Protocolos Moleculares (NB1455-p173). La integridad del ARN fue verificada en un gel al 1% MOPS y las concentraciones fueron determinadas por espectrometría de rayos ultravioletas. Las reacciones RT se realizaron con un rango de 4-5 µg en total de ARN utilizando el paquete Gibco Superscript II asi como iniciadores oligo dT o de hexámero aleatorio. Las reacciones PCR fueron efectuadas ambas utilizando el método RACE descrito en Co et al. (1992, J.lrnmunol. 148 (4): 1149-54) y utilizando iniciadores degenerado descritos en Wang ef al. (2000.J Inanaurtol. Methods. 233: 167-177). El RACE PCr requiere un paso intermedio para añadir una cola multi dG en los extremos 3' de la primera cepa cADNs. Las reacciones RT fueron purificadas con columnas de Qianeasy (Qiagen) y eluidas con 50 µ? 1 x NEB regulador 4. La reacción terminal de dG se efectuó con 0.25 mM CoCI2, 1 mM dGTP, y 5 unidades de transferasa terminal (NEB), en 1 x NEB regulador 4. La mezcla fue incubada a 37C por 30 minutos y después 1/5 de la mezcla de reacción (10 µ?) se agregó de manera directa a una mezcla de reacción para que funcionara como el ADN modelo.

Las reacciones RACE y de PCR degenerado fueron idénticas excepto por diferencias en iniciadores y modelo. Como se mencionó antes, la mezcla de reacción de transferasa terminal fue utilizada directamente para el modelo RACE PCR, mientras que la mezcla de reacción RT fue utilizada directamente para degenerar las reacciones PRC. En ambos casos se establece el mismo iniciador de cadena ligera 3', HingKL: TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC (NO. ID. SEC: 11) y la cadena primaria pesada 3', B g 121 g G I : GGAAGATCTATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC (NO. ID. SEC. NO:12) fueron utilizadas. En RACE PCR, un iniciador poli dC 5' fue utilizado tanto para cadenas pesadas como para las ligeras, EcoPolidC: TATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC (NO. ID. SEC. NO : 13), mientras que los iniciadores PCR de extremo 5' PCR degenerados fueron SacIMK: GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (NO. ID. SEC: 14) para la cadena ligera y una mezcla igual de EcoRIMHI: CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (NO. ID. SEC: 15) y EcoRIMH2: CTTCCGG AATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (NO. ID. SEC: 16) para las cadenas pesadas (bases mezcladas: H = A+T + C, S = G + C, Y = C + T, K = G + T, M = A + C, R = A+G, W = A+T, V = A+C + G, N = A + T + G + C).

Las reacciones PCR se llevaron a cabo en un termociclador de investigación MJ usando un programa adaptado de Wang et al. (2000, J. Immunol. Methods. 233: 167-177): 1 ) 94 C, 3 min; 2) 94°C, 15 seg ; 3) 45°C, 1 min; 4) 72°C, 2 min; 5) el ciclo regresa al paso #2 29 veces; 6) termina con una etapa de extensión final a 72°C durante 10 min. Los productos PCR fueron clonados en de pBluescript II SK+ (Estratagen) usando enzimas de restricción creadas por los iniciadores PCR. Las cadenas ligeras y pesadas de clones fueron secuenciadas por los servicios de secuenciamiento Lark Technologies o Seqwright. La RACE PCR nunca tuvo éxito por la cadena ligera My9-6. Por lo tanto para poder confirmar las secuencias de cADN de extremo 5, se efectuaron clonaciones y PCR degenerados adicionales. La secuencia de cadena ligera cADN My9-6, determinada a partir de los clones PCR degenerados, fue introducida en el sitio web de búsqueda NCBI's Blast (ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/) y se guardaron las cinco secuencias de anticuerpos de murina principales con secuencia de señal presentada. Los iniciadores PCR degenerados fueron diseñados a partir de estos péptidos de señal usando el software de web Codehop (blocks. fhcrc. org/codehop. html). Se agregaron los sitios de restricción EcoRI a tres de los iniciadores degenerados (Figura 2) y estos fueron utilizados en reacciones RT-PCR como se describió anteriormente. 1.3. Preparación y Muestras de Secuencia de Cadenas Ligeras y Pesadas Las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo muMy9-6 fueron separadas por SDS-PAGE bajo condiciones reducidas. El anticuerpo reducido y desnaturalizado fue sometido a electroforesis en un 12% de gel Tri-glicina (Novex, San Diego, CA). Después de la electroforesis, los geles fueron teñidos en una membrana ImmobilonPSq usando regulador CAPS/MeOH . Después de transferirlas, las membranas estaban teñidas con Ponseau S. Las bandas correspondientes a las cadenas ligera y pesada fueron activadas para el secuenciamiento de proteína. La cadena ligera del anticuerpo fue secuenciada directamente a partir de la membrana por química de degradación Edman automatizada en un secuenciador ABI 494 Procise. El N-término de la cadena pesada fue bloqueado, por lo que la proteína fue digerida, in situ, con tripsina de acuerdo a Gharahdaghi, er al. (1996). Entonces la mezcla digestiva fue analizada por espectrometría de masa MALDI-TOF en un instrumento Kratos Kompact SEQ. Los péptidos seleccionados fueron sujetos a MS/MS para determinar sus secuencias.

Ejemplo 2. Humanización de la Región Variable del Anticuerpo por Recubrimiento El recubrimiento del anticuerpo My9-6 para proporcionar versiones humanizadas adecuadas como agentes terapéuticos o de diagnóstico generalmente proceden de acuerdo a los principios y métodos publicados en las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,639, 641, y como sigue. 2.1. Predicción de la superficie La accesibilidad del solvente de los residuos de la región variable para un conjunto de anticuerpos con estructuras resueltas se usan para pronosticar los residuos de la superficie para la región variable del anticuerpo My9-6 de murina. La accesibilidad del solvente de aminoácido para un conjunto de archivos de estructura de anticuerpo único 127. (Figura 3) fue calculada con el paquete de software MC (Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235 (3): 959-973). Las diez secuencias de aminoácido de de cadena ligera y cadena pesada más similares fueron determinadas utilizando el software de alineamiento de secuencias en el sitio web NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/). El promedio de accesibilidad del solvente para cada residuo de la región variable de estas diez regiones variables de anticuerpos fue calculado con una hoja de cálculo de Excel y las posiciones con un promedio de accesibilidad mayor al 30% fueron considerados residuos de superficie. Las posiciones con promedio de accesibilidad de entre 25% y 35% fueron así consideradas al calcular la accesibilidad de residuo individual sólo para aquellas estructuras con dos residuos idénticos que flanquean de cada lado. 2.2. Modelado Molecular Se generó un modelo molecular de la región variable My9-6 de murina utilizando el paquete de software AbM de Oxford Molecular. La estructura del anticuerpo fue construida con los archivos de estructuras de los anticuerpos con las secuencias de aminoácidos más similares (1sbs para la cedan ligera y 1 bbj para la cadena pesada) y los CDRs no canónicos se construyeron al buscar una estructura de base de datos C-a que contiene estructuras resueltas no-redundantes. Los modelos fueron observados con el GlaxoSmithKHne Swiss-Pdb Viewer y se determinaron los residuos que quedan dentro de 5? de un CDR. 2.3. Selección de Anticuerpos Humanos.

Las posiciones de superficie de la región variable de M 9-6 de murina fueron comparadas con las posiciones correspondientes en las secuencias de anticuerpos humanos en la base de datos Kabat (Johnson and Wu, 2001, Nucleic Acids Res. 29 (1): 205-6). El software de administración de base, de datos de anticuerpos SR (Searle, 1998) fue utilizado para extraer y alinear los residuos de superficie de los pares de anticuerpos humanos naturales de cadena ligera y cadena pesada. La superficie de la región variable de anticuerpo humano que contiene los residuos de superficie, más parecidos con especial consideración dada a las posiciones que quedan dentro de 5? de un CDR, fue seleccionada para reemplazar a los residuos de superficie de la región variable del anticuerpo My9-6 de murina. 2.4. Construcción del Gen de Anticuerpo Humanizado por mutagenesis PCR.

Se ejecuto la mutagenesis PCR mutagenesis en los clones cADN de región variable del My9-6 de murina para cambiar primero las secuencias de extreme 5' para igualar la secuencia de péptido, y después construir el gen My9-6 humano recubierto. Los conjuntos de iniciador fueron diseñados para crear los residuos de murina originalmente no secuenciados en los clones PGR degenerados iniciales (posiciones de cadena ligera N1, M3, L4, y S7, y posiciones de cadena pesada Q3 y P7). Los conjuntos de iniciador de humanización fueron diseñados para hacer los 6 cambios de amino ácido requeridos para todas las versiones de huMy9-6 e iniciadores adicionales para cambiar de manera alternativa los cuatro residuos 5? (Figura 4). Las reacciones PCR fueron ejecutadas en un termociclador MJ Research con el siguiente programa: 1) 94 C, 1 min; 2) 94 C, 15 seg; 3) 55 C, 1 min; 4) 72 C, 1' min; 5) el ciclo regresa a la etapa #2 29 veces; 6) terminar con una etapa de extensión final a 72°C durante 4 min. Los productos PCR fueron diseñados con sus enzimas de restricción correspondientes y clonados en los vectores de clonación pBluescript. Los clones fueron secuenciados para confirmar los cambios de amino ácido. 2. 5. Vector de Expresión para Anticuerpos Humanizados Las secuencias apareadas de cadena ligera y pesada fueron clonadas en un solo vector de expresión de mamífero. Los iniciadores PCR par alas secuencias variables humanas crearon sitios de restricción que permitieron que la secuencia de señal humana fuera agregada en el vector de clonación pBI uescriptl I. Las secuencias variables pudieron entonces ser clonadas en el plásmido de expresión de mamífero con EcoRI y BsiWI o Hindlll y Apal para la cadena ligera o pesada respectivamente (Figura 5). Las secuencias variables de cadena ligera fueron clonadas en-estructura sobre la región constante IgKappa humana y las secuencias variables de cadena pesada fueron clonadas en la secuencia de región constante IgGammal humana. En los plásmidos de expresión finales, los promotores CMV humanos promueven la expresión de secuencias cADN de cadena ligera y pesada. 2.6. Expresión Transitoria de Anticuerpos Humanizados Se cultivaron células 293T en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, BioWhittaker, 12-614F), suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (Hyclone, SH30071. 03), 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, 17-604E), y mezcla de penicilina/estreptomicina al 1% (BioWhittaker, 17-603E) en 6% C02 en un incubador a 37°C. Las células fueron separadas tres veces por semana en una dilución 1:10 manteniendo una población sub-confluente. 24 antes de la transfectación, las células fueron tripsinizadas (BioWhittaker, 17-161E); las células vivas fueron contadas por medio del método de exclusión de azul tripano y colocadas en placas sobre placas tratadas de cultivo de tejido de 10 cm, (Corning, 430167) a una densidad de 2 x 106 células por placa. Inmediatamente antes de la transfectación, las células fueron lavadas cuidadosamente con solución salina regulada con fosfato (PBS, diluida a partir de BioWhittaker 10 x PBS, 17-517Q) y las células fueron sobrepuestas con 7 ml_ de Hibridoma SFM (InvitroGen, 12045-076) que incluye 1% Ultra Low IgG Serum (Gibco BRL, 16250-078). Los métodos de transfectación transitoria fueron adaptados a partir del protocolo, estándar Qiagen Polyfect. Para que una placa de 10 cm sea transfectada, 8 u.g de CsCI grado ADN se combinaron con 300 uL Hibridoma SFM y reactivo de transfectación 80 uL Polyfect (Qiagen, 301107). La mezcla de transfectación fue sometida a turbulencia durante aproximadamente 5 segundos a baja velocidad e incubada durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, 1 ml_ of Híbridoma SFM, 1% Ultra Low IgG Serum se agregaron a la mezcla de transfectacion y se combinaron por medio de pipeteo ascedente y descendente aproximadamente cinco veces. La mezcla de transfectacion fue agregada después a los 7 ml_ de Hybridoma SFM que cubren las células y las placas fueron agitadas suavemente para asegurar la distribución uniforme. Las reacciones de transfectacion fueron incubadas durante la noche, por lo general durante 16 horas, en un incubador de cultivo de tejido. Los medios de transfectacion fueron retirados cuidadosamente desde las células y reemplazados con 20 mL de Hibridoma SFM, 1% Ultra Low IgG. Las células transfectadas fueron devueltas después al incubador durante 72 horas, después de las cuales los sobrenadantes fueron recolectados y la producción de anticuerpo cuantificada por medio de ELISA. El sobrenadante recolectado fue almacenado a 4°C hasta la purificación. 2.7. Purificación de Anticuerpos Humanizados El sobrenadante fue preparado para cromatografía de afinidad de Proteína A por medio de la adición de 1/10 volumen de regulador 1 M Tris/HCI, pH 8.0. El sobrenadante ajustado en pH fue filtrado a través de una membrana de filtro de 0.22 um y cargado sobre una columna de Sefarosa de Proteína A (HiTrap Protein A HP, 1 mL, Amersham Biosciences) equilibrada con regulador de enlace (PBS, pH 7.3). Una pre-columna de Sefarosa-Q (10 mL) fue conectada corriente arriba de la columna de Proteína A durante la carga de muestra para reducir la contaminación a partir del material celular como el ADN. Después de la carga de muestra, la pre-columna fue retirada y se invirtió la orientación de la columna de Proteica A para lavado y elución. La columna fue lavada con regulador de enlace hasta que se obtuvo una linea de base estable sin absorbancia a 280 nm. El anticuerpo fue eluido con 0.1 M regulador de ácido acético que contiene 0.15 MNaCI, pH 2.8, utilizando una velocidad de flujo de 0.5 mL/min. Fracciones de aproximadamente 0.25 ml_ fueron recolectadas y neutralizadas mediante la adición de 1/10 volumen de 1 Tris/HCI, pH8. 0. La(s) fracción(es) pico fue(ron) dialisada(s) durante la noche contra PBS, pH 7.3. La cantidad de anticuerpo se cuantifico al medir la absorbancia a 280 nm y se calculó la concentración de anticuerpo asumiendo que E2800 1 % = 1. 4. El análisis de espectros de absorbancia y SDS-PAGE se ejecutaron sobre fracciones de anticuerpo para verificar su pureza.

Ejemplo 3. Prueba de Anticuerpos Humanizados 3.1. Crecimiento de Células para Análisis de Enlace Se obtuvieron células HL-60 a partir de la American Type Culture Collection (ATCC&num; CCL-240). Fueron mantenidas en una atmósfera de C02 al 5%, 37°C incubador con camisa de agua ( apeo Scientific Co., Tualitan, Oregon). Las células crecieron en medio RPMI complementado con L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD) que contiene suero fetal bovino al 10% (Hyclone, Logan, Utah), más 50 ug/mL de sulfato de gentamicina (Life Technologies, Grand • Island, NY). 3.2. Ensayo de Enlace Directo en Células HL-60 Se recolectaron células HL-60 a partir de matraces T75 (NUNCLONTM, cat. no. 153732), y centrifugadas a aproximadamente 300 x g durante cinco minutos en un centrifugador de mesa Omnifuge RT (Haereus Separations, Germany), a 4°C. Las células fueron suspendidas nuevamente a una densidad de 3x 106 células por mL en regulador FACS, que comprendió 2% v/v) suero de cabra (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) en Medio MEM Alpha, complementado con L-glutamina (Life Technologies, Grand Island, NY). Utilizando un soporte de la pipeta multicanal, se añadieron células 3 x 105 a las placas de fondo redondeado de 96-pozos (cat. no. 3077) y posteriormente colocándolas en hielo. Al utilizar una placa de análisis Falcon de 96-pozos (cat. no. 353911), se prepararon once vez diluciones seriales por duplicado en cada prueba o articulo de control por duplicado en el regulador intermediario FACS, desde una concentración inicial de 2 x10'8M. Posteriormente, 100µ I . de cada prueba o articulo de control se mezcló con las células. Los pozos de control recibieron únicamente al regulador FACS. La placa se incubó en hielo por una hora y después se centrifugó por cinco minutos a 300 x g, en un centrifugador refrigerado. Se extrajeron los reactivos de la placa de los pozos por medio de una inversión rápida sobre un cubo de desechos que contiene 10% de lejía. Se resuspendieron las células por medio de sometimiento a turbulencia suave, se colaron una vez con el regulador FACS, se centrifugaron y después se resuspendieron con un sometimiento a turbulencia suave. Se diluyó el IgG cabra-anti-humano etiquetado FITC (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, cat. no. 109-096-003) y el IgG cabra-anti-ratón etiquetado FIAC (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, cat. no. 109-095-088) 1:100 en un regulador FACS, y se añadieron 100 µ I a los pozos apropiados en la placa de análisis. La placa se incubó posteriormente, en hielo durante una hora, resguardada del la luz. El anticuerpo secundario no enlazado fue lavado desde de los pozos de la misma manera en que se describió anteriormente. Se resuspendieron las células a través de turbulencia suave y después se fijaron al añadir 120 µ?/???? de 1% de formaldehído en solución salina regulada con fosfato (PBS, 10 mM fosfato de potasio, 150 mM cloruro de sodio, pH 7.2). Se analizó la placa de análisis en el citómetro de flujo FACScan en interfaz con un dispositivo de muestreo automatizado de 96-pozos (Becton Dickinson, Mountain View, CA). 3.3. Preparación de las Membranas de Plasma Las membranas de plasma se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito en Vater et al. (1995). En resumen, las células HL-60 crecieron en una densidad de 1 x 106 células/mL en RPMI, complementado con glutamina L, conteniendo 10% de suero fetal vacuno y 50 pg/mL de sulfato de gentamicina. Cuando se obtiene un total de 1 x 109 células, se cultivan células, se giran a aproximadamente 300 x g en un centrifugador Omnifuge RT, se cuelan con una solución salina balanceada de Hanks (Life Technologies, cat. no. 14175-095), y se combinan en un tubo cónico centrifugador de 50 ml_. La pella fue congelada después -80°C por lo menos 24 horas para facilitar la lisis celular y la homogenización. Para preparar membranas de plasma, la pella se derritió rápidamente a 37°C y después se almacenó en hielo; todos los pasos subsiguientes se llevaron a cabo a una temperatura de 4°C. Se resuspendió la pella de la célula HL-60 en 8mL del regulador de Tris 10 mM HC1, pH de 7.0, conteniendo 1 mM EDTA, 0.25 M sacarosa y 1 mM floruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). La pella de la célula se trasladó a 15 mL de amoladoras del tejido fino Dounce (Wheaton, Millville, NJ) para una disrupción celular (20 golpes con un mortero de cristal de borosilicato). El homogenato fue centrifugado en un centrifugadora refrigerada de supervelocidad SorvalRC-5B, utilizando un rotor SS-34 (Wilmington, DE) a 6000 rpm por diez minutos y se extrajo cuidadosamente el sobrenadante de la pella. Se coló la pella por un tiempo extra con 8mL del regulador y se procesó como se describe anteriormente. Los sobrenadantes combinados ,se dispusieron en capas sobre 1mL de un regulador de amortiguador de sacarosa a 37% en 0 mMTris-HCI, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, pH 7.0, y procesado posteriormente en una ultracentrif ugadora preenfriada Beckman L8-M con un rotor SW55ti (Beckman Instruments, Palo Alto, CA), a 33,000 rpm por 70 minutos. Se extrajo la capa de la membrana opalescente de cada tubo, situada justo encima del amortiguador de sacarosa y se diluyó con cuatro volúmenes de 10mMTris-HCI, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH 7.0. Está solución se centrifugó a continuación por 30 minutos más a 18,000 rpm en la ultracentrifugadora. Se extrajo cuidadosamente el sobrenadante, y las pellas resultantes se resuspendieron en 10 mMTris-HCI, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7.0. La preparación de la membrana HL-60 se colocó en porción alícuota en tubos Eppendorf estériles con tapa de rosca de 1.5 mL, se congelaron en nitrógeno líquido y después se almacenaron a -80°C para su uso. La concentración de proteína total fue determinada al utilizar el Análisis Pierce TM BCA (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, cat. no. 23235). 3.4. Análisis de Enlace Directo en Membranas HL-60 Las membranas HL-60, preparadas como se ya se describió se pusieron a secar a una concentración inicial de 10 g/mL en agua desionizada en una superficie de poliestireno en placas de análisis 96-pozos de Immulon 2 (Dynex Laboratories, Chantilly, VA), al utilizar un desecador del vacío Labconco (Labconco, Corp, Kansas City, MO), durante la noche a temperatura ambiente. La placa ELISA se bloqueo con una fracción V de 1% de albúmina del suero vacuno (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, cat. no. A-3294), 0.05% Tween-20 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, cat. no. P-2287) solución en el regulador de Tris salino (50 mM Tris-HCI, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7.5, TBS), 300 L por pozo, a una temperatura de 37"C por un lapso de una hora. Después de esta etapa de bloqueo, se vació el regulador de bloqueo y se puso a secar en toallas de papel. Se prepararon diluciones seriales de prueba o reactivos de control en el regulador de bloqueo, por cuadriplicado, comenzando con 3.13 x 10"9 M titulada abajo hasta 5.29 x 10~14 M en una placa de análisis flexible de 96-pozos. Los pozos de control negativo contenían únicamente regulador de bloqueo. Se transfirieron 50 uL de cada dilución para designar pozos en las placas de análisis de membrana cubierta que después fueron incubadas durante la noche a una temperatura de 4°C. El contendido del pozo fue aspirado posteriormente y colocado en un frasco inútil que contenía 10% (v/v) de lejía y la placa fue colada a 3x con TBS que contenía 0.1% (v/v) Tween-20 (regulador de colada) y puesto a secar en toallas de papel. Se detectó la cantidad de anticuerpo ant¡-My9-6 que delimita ya sea con cabra-anti-ratón IgG-HRP o burro-anti-humano IgG-HRP diluido a 1:1000 con regulador de bloqueo en los pozos apropiados. Estos anticuerpos secundarios se incubaron en una placa de análisis por una hora a temperatura ambiente, resguardados de la luz. La placa se coló y se secó como antes. La placa se reveló utilizando TMB (BioFX Laboratories, Randallstown , MD, cat. no. TMBW-0100-01 ), después se inmovilizó con una solución Stop (BioFX Laboratories, Randallstown, MD, cat. no. STPR-0100-01 ). La placa de análisis se leyó en A450nm utilizando un Titertek (lector de placas D Multiskan Plus MK II Huntsville, AL). 3.5. Análisis de Enlace Competitivo en Membranas HL-60 Las membranas HL-60, preparadas como ya se describió, se pusieron a secar desde un punto de concentración de 10 pg/mL en agua desionizada en la superficie de poliestireno de las placas de análisis de 96-pozos Immulon 2 (Dynex Laboratories, Chantilly, VA), utilizando un desecador del vacío Labconco desecador del vacío (Labconco, Corp, Kansas City, MO), por la noche a temperatura ambiente. La placa ELISA fue bloqueada con 1% fracción V de albúmina del suero vacuno (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, cat. no. A-3294), 0.05% Tween-20 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, cat. no. P-2287) solución en regulador de Tris salino (50 mM tris, 150 mM cloruro de sodio, pH 7.5, TBS), 300 gl por pozo, a 37°C por una hora. Después de este paso de bloque, la placa se vació del regulador de bloqueo se puso a secar en toallas de papel. Se prepararon las diluciones de prueba o reactivos de control dobles y triples en el regulador de bloqueo, por cuadruplicado, comenzando a 1.25 x 1 o -8 M tituló abajo a 2.44 x10"11 M (2x la concentración final necesitada) en una placa de análisis flexible de 96-pozos. Estos reactivos competentes sin nombre se mezclaron después con un volumen igual 2.5 x 10"1 M anti-My9-6 murina biotinilada (ImmunoGen, Inc., Cambridge, MA); El control positivo no contenía reactivo competente, mientras que el control negativo contenía únicamente regulador de bloqueo. Se trasfirió 50 µ?. de estas mezclas a los pozos designados en la placa de análisis de membrana cubierta que posteriormente fueron incubados durante la noche a temperatura de 4°C. El contenido del pozo fue aspirado y trasferido a un frasco inútil que contenga 10% (v/v) de lejía y la placa colada 3 x con TBS que contenga 0.1 % (v/v) Tween-20 (regulador de colada). Se secó la placa en toallas de papel y la cantidad de murina anti-My9-6 biotinilada que delimita fue detectada con 100pL por pozo de fosfatasa alcalina estreptavidina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, cat. no. 016-050-084) diluido a 1:5, 000 en el regulador de bloqueo. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente y resguardado de la luz, el reactivo de anticuerpo secundario no enlazado no enlazado se cuela de los pozos y la placa se revela utilizando TMB (BioFX Laboratories, Randallstown, MD, cat. no. TMBW-0100-01 ) deteniéndolo con una solución Stop (BioFX Laboratories, Randallstown, MD, cat. no. STPR-0100-01 ). La placa de análisis se leyó a A450nm utilizando un lector de placas Titertek&commat; Multiskan Plus MK II (Huntsville, AL). 3.6. Clonación de Regiones Variables de Anticuerpo My9-6 de Murina Las regiones variables del anticuerpo My9-6 de anticuerpo de murina fueron clonadas a través de los métodos RT-PCR ya descritos. A varios de los clones individuales de cadena ligera y pesada se les siguió la secuencia para así identificar y evitar posibles errores de secuencia generados de polimerasa. Únicamente se obtuvo una secuencia para la cadena ligera, pero se extrajeron dos secuencias por separado de la cadena pesada de clones RT-PCR. Para confirmar la secuencia real de la región variable de cadena ligera de y9-6 de murina, se analizaron secuencias del péptido por medio de la degradación Edman, Ionización por medio de Desabsorción Láser asistida por la Matriz (MALDI) y Espectrometría de Masa Tándem (MS-MS). Se secuenciaron los 22 residuos en la terminal amino de la cadena ligera de My9-6 por medio de la degradación Edman y están señalados en la Figura 6A. La secuencia inicial de cADN complementario derivada de clones degenerados RT-PCR corresponde a todos menos cuatro residuos que fueron generados posiblemente por los iniciadores degenerados. La secuencia de péptido determinada por la degradación de Edman fue confirmada más tarde por los colones RT-PCR generados por los iniciadores degenerados de la secuencia de péptido de señal de extremo 5'. El análisis MS-MS de los fragmentos de la digestión de la tripsina también confirman la secuencia de la cadena ligera CDRs 1 y 2 (Figura 6B). En conjunto estos análisis del péptido confirman la secuencia de de aminoácido de cadena ligera de My9-6 de murina derivada a partir de los clones de ADN generados por RT-PCR. Como es común con secuencias de cadena pesada, la terminal amino de cadena pesada muMy9-6 fue bloqueada por un residuo de piroglutimina y por lo tanto no se puede seguir la secuencia por la degradación Edman N-terminal. En vez de eso se genera la información de la secuencia por medio de la digestión de la tripsina y el análisis por medio de la Ionización de Desabsorción Láser asistida por la Matriz (MALDI) y la Espectrometría de Masa Tándem (MS-MS). Se identificó un fragmento Dalton 1788 con una secuencia pronosticada idéntica a una porción del ADN complementario del clon 2 (Figura 7). Esta secuencia incluye cinco residuos de CDR3 para el ADN complementario del clon 2 y de este modo existe un péptido ideal para poder realizar una identificación positiva para la cadena pesada muMy9-6. También confirmaron esta secuencia del péptido clones múltiples RACE PCR que producen solamente la secuencia que se obtiene originalmente del clon 2 degenerado RT-PCR. Los resultados acumulativos de varios clones cADN y el análisis de secuencia del péptido proporcionaron las secuencias de cadena ligera y pesada de My9-6 de murina finales que se muestran en la Figura 8. Al utilizar las definiciones de Kabat y AbM, se identificaron tres cadenas ligeras y una pesada CDRs (Figuras 8 y 9). La búsqueda de la base de datos de NCBI IgRáfaga indica que la región variable de cadena ligera de anticuerpo muMy9-6 deriva probablemente del gen de ratón IgV Germline 8-27, mientras que la región variable de cadena pesada se deriva principalmente del gen Germline IgVh V102 (Figura 10). 3.7 Determinación de los Residuos de Superficie de Región Variable del Anticuerpo My9-6 Las técnicas de recubrimiento descritas por Pedersen et al. (1994, JMol. Biol. 235: 959-973) y Roguska et al. (1996, Protein Eng. 9: 895-904) comienzan por pronosticar los residuos de superficie en las secuencias variables del anticuerpo murina. Un residuo de superficie se define como un aminoácido que tiene por lo menos el 30% de su superficie total accesible a una molécula de agua. Cuando no existe una estructura solucionada para encontrar los residuos de superficie de muMy9-6, se alinearon los diez anticuerpos con las secuencias más homólogas con el conjunto de 127 archivos de estructura de anticuerpos (Figura 11A y B). La accesibilidad solvente para cada posición de Kabat fue calculada para estas secuencias alineadas y la distribución de esta accesibilidad relativa para cada residuo se muestra en la Figura 12. Varias posiciones de superficie tienen un promedio de accesibilidad de entre 25% y 35%. Éstas se observaron con mayor detenimiento al promediar únicamente los anticuerpos con dos residuos idénticos que flaquean cada lado (Figuras 13A y B). Los 25 residuos de superficie pronosticados para el muMy9-6 de cadena pesada permanecieron igual después del análisis adicional, pero las posiciones de Kabat 5 y 70 de la cadena ligera requirieron de más consideraciones. La alanina en la posición 15 de cadena ligera tuvo un promedio de accesibilidad de 34.4% en sus diez estructuras, pero una sola estructura, 1mcp, tuvo residuos que flaquean idénticos a aquellos en muMy9-6. En esta estructura, Ala15 tuvo accesibilidad relativa con sólo 18.2%, debido a que en esta estructura sencilla Ala15 fue menos accesible que el residuo promedio para la posición 15. Las tres estructuras con una sola diferencia en el residuo que flaquea, (Iap2, Ifrg, y1 hil) se promediaron en conjunto. La accesibilidad promedio para estas tres estructuras fue otra vez de 33.3%, haciendo Ala 15 un residuo de superficie predictivo. Finalmente, el recubrimiento de anti-B4, C242 y la patente de recubrimiento predicen que la posición 15 de la cadena ligera es un residuo de superficie. Tomando estos dos, el enfoque conservador es asumir que la posición 15 de la cadena ligera muMy9-6 es un residuo de superficie. La posición 70 de la cadena ligera My9-6 también requiere de consideraciones especiales que resulten finalmente en una predicción conservadora y determine ser un residuo de superficie. La predicción de superficie inicial funciona para la cadena ligera que fue hecha con la información MC las cinco estructuras de cadena ligeras más homologas y en este Asp70 fue un residuo de superficie de predicción. Posteriormente, con las cinco estructuras más homologas, se encontró que la posición 70 tenía un promedio de accesibilidad de 29.1% como se muestra en la Figure 13A. Además, nueve de las diez estructuras tenían residuos de flanqueo idénticos y el promedio de este conjunto fue de 29.2% de accesibilidad. Debido a que este residuo aparece muy cerca del 30% del corte y la patente de recubrimiento señala la posición 70 de la posición de la superficie, la información de accesibilidad tuvo que ser nuevamente examinada. La posición 70 para la estructura 11ve tiene una accesibilidad relativa del 22.5%, la cual tiene cinco por ciento puntos menos que la siguiente más baja con accesibilidad relativa de 27.2%. Ya que 11ve es la octava estructura más homologa y tiene un bajo valor atípico, se tomo un promedio para ocho estructuras con residuos de flanqueo idénticos además de 11ve y este conjunto tuvo un promedio de accesibilidad de 30.1%. Esto, junto con el hecho de que el análisis inicial de la cadena ligera muMy9-6 y la patente de recubrimiento señala la posición 70 de cadena ligera que nos lleva a la predicción conservadora que la cadena ligera muMy9-6 Asp70 es un residuo de superficie. 3.8. Modelado Molecular para Determinar que Residuo queda Dentro del 5 A de CDR El modelo molecular, generado con un paquete de software AbM fue analizado para determinar que residuo de superficie muMy9-6 viene dentro de 5Á de CDR. Para recubrir el anticuerpo, todos los residuos de superficie fuera del CDR deberán ser cambiados a su homólogo humano, pero los residuos que vengan dentro de 5A de CDR también contribuyen a la unión y especificidad del antígeno. Por lo tanto, estos residuos 5 A deben ser identificados y considerados a lo largo del proceso de humanización. Las definiciones CDR que se utilizan para recubrimiento combinan la definición AbM para cadena pesada CDR2 y las definiciones de Kabat para los cinco CDRs restantes (Figura 9). Se analizó el modelo murina con el programa Swiss Viewer y la Figura 14 muestra los residuos que se encuentran dentro de 5A de cualquier residuo CDR ya sea en una cadena ligera o pesada. 3.9. Selección de la Superficie Humana Más Homologa Las superficies de anticuerpos humanos candidatos para recubrir muMy9-6 se extrajeron de la base de datos de secuencias de anticuerpo de Kabat utilizando el programa SR. Este programa proporciona una interfaz para buscar una posición específicamente contra la base de datos de anticuerpos. Para conservar los pares naturales, se compararon los residuos de superficies de ambas cadenas, ligeras y pesadas. Las superficies humanas más homologas de la base de datos de Kabat fueron alineadas de acuerdo con el rango de secuencia de identidad. Las cinco mejores superficies fueron alineadas con el programa SR de la base de datos de Kabat y se muestran en la Figura 15. Las superficies se compararon entonces para identificar cuáles superficies humanas podrían requerir el menor número de cambios posibles dentro de 5 A de CDR. El anticuerpo del virus de la anti-hepatitis C, LC3bPB (Ivanovski M. et al., 1998, Blood 91 (7): 2433-42), requiere del menor número de cambios en los residuos de superficie (10 en total) y sólo cuatro de estos residuos vienen dentro de 5 A del CDR. La secuencia completa de región variable para muMy9-6 también se alineó contra la base de datos de anticuerpo humano de Kabat con SR y LC3bPB se identificó como la 14va secuencia humana de región variable más parecida (no se muestra la información). Ya que el anticuerpo LC3bPB proporciona la superficie más homologa y requiere de un número mínimo de cambios de residuos 5 Á, es el mejor candidato para recubrir muMy9-6. 3.10. Construcción de los Genes My9-6 para Humanizar los anticuerpos My9-6 Los diez cambios de residuos de superficie para huMy9-6 se hicieron utilizando técnicas de mutagénesis PCR como ya se ha descrito. Ya que seis de los residuos de superficies para LC3bPB fueron más de 5 Á de CDR, estos residuos fueron cambiados de murina a humano en todas las versiones para humanizar el My9-6 (Figuras 16A y B). El cuarto residuo de superficie que cayó dentro de 5 A de CDR, posiciones de Kabat de cadena ligera 1,3 y 45 y de cadena pesada posición 64, fueron cambiados a humano o se retenidos como murina para hacer las 16 versiones humanizadas de My9-6. De estos, la versión más humana es 1.0 ya que contiene los diez residuos de superficie humanos. La versión 1.1 es la más conservadora en lo que se refiere a asegurar una afinidad de enlace máximo, la cual retiene los cuatro residuos de superficie de murina que se encuentran en 5A de CDR. Cada uno de los genes anticuerpo humanizados My9-6 fueron clonados en el plásmido de expresión de anticuerpo (Figura 5) para transfecciones pasajeras y estables. 3.11. Información de Enlace La fortaleza clave para la humanización es que al retener los residuos de estructura de murina sin superficie, la My9-6 humanizada debe continuar para enlazar el CD33 sin cambiar la afinidad. Sin embargo, los cuatro residuos de superficie que vienen en 5 Á de CDR pueden contribuir al enlace del antígeno y por lo tanto, al cambiar estos residuos puede haber un efecto negativo en el enlace. Para tratar esta preocupación, las 16 versiones del My9-6 humanizado incluyen todas las combinaciones de residuos humanos o de murina en cada una de las cuatro posiciones de residuo 5 Á. Esta gama que va desde la versión más óptima o humana 1.0 con residuos humanos en cada posición de superficie no CDR hasta la versión más conservadora 1.1 la cual retiene los residuos de murina en cada uno de las cuatro posiciones de superficie 5Á y, por lo tanto, deberá retener un enlace de tipo silvestre. Al comparar la afinidad de enlace de la versión My9-6 humanizada con la versión de murina My9-6, la versión más humana que retiene el enlace de tipo silvestre puede ser seleccionado como My9-6 humanizado recubierto.

Se llevaron a cabo experimentos de enlace directos y competitivos con las versiones humanizadas de murina My9-6 y con muMy9-6 en el CD33 exponiendo una línea de células de leucemia human HL-60. Se probaron las tres versiones más humanas (V1. 0, V1. 3, V1. 6) asi como la versión más conservadora (V 1. 1) en las membranas HL-60 o en células enteras. La figura 17 da los valores KD para cada condición y la figura 18 muestra ejemplos de curvas de enlace para huMy9-6, V1.0, versus muMy9-6. Los valores KD calculados para la versión humanizada My9-6 incluyendo la más humana, 1.0, caen dentro del error experimental del valor de KD de la murina My9-6. Los resultados de enlaces competitivos también demuestran que los anticuerpos huMy9-6 pueden competir de igual manera por el enlace CD33 como el muMy9-6. Con esta información demostrando las afinidades de enlace cercanas al tipo silvestre para el My9-6 completamente humanizado, VI.0, en las membranas y células enteras HL-60, no hay necesidad, de probar versiones adicionales ya que la versión 1.0 es el anticuerpo humanizado óptimo My9-6. El anticuerpo My9-6 de murina fue humanizado por completo sin perder su actividad de enlace. Ninguno de los residuos de superficie cambio de ratón a humano tuvo como resultado la pérdida de la afinidad de enlace, aunque cuatro de estos residuos de superficie fueron dentro de 5 A del CDR. Los residuos de 5 Á de CDR fueron pensado para hacer contactos críticos potenciales de van der Waal que puedan afectar la estructura de estos CDRs.

Los resultados de la humanización My9-6 sugieren que mientras los números de anticuerpos recubiertos crecen, el análisis a fondo de posición de los residuos basado en la información real de enlace, puede ser un modo más efectivo de reconocimiento de residuos cuestionable que solamente observar cualquier residuos de 5 A de CDR. El My9-6 VI.0 humanizado (huMy9-6) es el cuarto anticuerpo que fue humanizado utilizando el procedimiento aquí descrito. La humanización al recubrir la región variable del marco del anticuerpo de murina fue . desarrollado como una mejoría de los métodos estándares de humanización, incluyendo injertos CDR, que requieren un extenso desarrollo y reingeniería para mantener la actividad de enlace. Esto se ve contrastado por el anticuerpo huMy9-6 recubierto, el cual implica cambiar solamente diez residuos de superficie para poder crear un anticuerpo a completamente activo con una superficie completamente humana.

Ejemplo 4. Inmunoconjugado My9-6-DM1 Se llevaron a cabo estudios de eficacia preclinicos con tejido para injerto de tumor humano en ratones utilizando el anticuerpo My9-6 conjugado con el fármaco maitansinoide DM1. Como se tratara a continuación, el My9-6-DM1 mantuvo la especificidad y la afinidad de enlace de un anticuerpo CD33 sin modificación y mostró citotoxicidad específica antigen potente hacia las células positivas del tumor CD33 in vitro. El tratamiento de ratones SCID que tienen xenoinjertos de tumor HL-60 subcutáneos establecidos con My9-6-DM1 da como resultado una completa erradicación de los tumores con dosis (20mg anticuerpo conjugado/kg/día i. v. x 5 días) que no muestran toxicidad y se encontraban por debajo de la dosis máxima tolerada. En contraste, el tratamiento con solo el anticuerpo My9-6 no surtió éfecto en el crecimiento del tumor HL-60 comparado con el control del vehículo. Se observó eficacia curativa similar empleando My9-6-DM1 sobre el tratamiento de ratones que tienen xenoinjertos THP-1 subcutáneos. 4.1. Reactivos El anticuerpo fue anticuerpo monoclonal My9-6 de murina dirigido contra el CD33 humano descrito anteriormente. El agente modificador de anticuerpo fue N-succinimidil-4-(2-pirinidil) pentanoato (SPP): SPP El fármaco citotóxico fue maitansina análoga, DM1 , la cual se sintetiza a partir del producto de la fermentación microbiana, Ansamitocina P3. El DM1 es un inhibidor potente de la polimerización tubulina.

DM1 4.2. Preparación de My9-6-DM1 El My9-6-DM1 se preparó al modificar el anticuerpo My9-6 con SPP para introducir 3-5 grupos de piridildito por molécula del anticuerpo. El intercambio de disulfuro entre sustituto de tiol en el DM1 y la funcionalidad disulfuro activa en el anticuerpo dio el DM1 que contiene anticuerpo conjugado. (n puede ser cualquier entero) 4.3. Análisis del anticuerpo y conjugado de anticuerpo que enlaza por citometría de flujo Las células HL-60 se incubaron con varias concentraciones del anticuerpo My9-6 o del My9-6-DM1. Las células fueron coladas e incubadas con el anticuerpo secundario FITC nombrado anti-murina IgG. Después del colado adicional, las células se fijaron con 2% de formaldehído y la fluorescencia asociada a la célula fue cuantificada utilizando un citómetro de flujo BD FACScan. El My9-6-DM1 mantiene enlace específico CD33 comparable al anticuerpo sin modificación (Figura 19). 4.4. Ensayo de citotoxicidad in vitro La citotoxicidad de My9-6-DM 1 fue medida utilizando CD33 reflejando la célula THP-1 y la línea celular negativa CD33 Namalwa. Las células fueron colocadas en placas de 96-pozos en un medio que contenía el conjugado y el incubado a 37°C hasta que se formaron colonias (2-3 semanas). Se obtuvieron las colonias y las fracciones sobrevivientes se determinaron utilizando distribución de Poisson en los cálculos. 4.5. Estudios de xenoinjerto de tumor de ratón in vivo El modelo de tumor subcutáneo HL-60 células de leucemia promielocítica humana (5 x106 células en 0.1 mL) fueron inoculadas subcutáneamente en el flanco derecho de los ratones hembras SCID.

A los ratones se les trató por medio de una inyección en una vena lateral de la cola comenzando cuando los tumores alcanzaban de tamaño 100mm3 (400mm3 en modelos de tumores grandes). El tamaño del tumor y el peso del cuerpo del ratón fueron medidos dos veces por semana. El modelo sobreviviente de células HL-60 (5x106 células en 0.1mL) fue inyectado intravenosamente en la vena lateral de la cola de los ratones hembras SCID. Once días después de la inyección de células del tumor empezó el tratamiento. Los ratones se revisaban todos los días para ver la condición para masa tumoral moribunda., o muerta. El peso corporal era medido dos veces por semana. 4.6. Especificidad y eficacia del My9-6-DM1 In vitro Se probó la citotoxicidad del My9-6-DM 1 hacia las células que expresan CD33 (THP-1) comparado con la línea de célula CD33-negativa (Namalwa) utilizando un análisis clonogénico, donde la actividad de matar células era determinada por la cuantificación del número de colonias que podía crecer al seguir el tratamiento. El My9-6-DM1 muestra una actividad potente para matar células hacia células tumorales humanas CD33-positivo in vitro (Figura 20). No se observó toxicidad importante en las células CD33-negativo, indicando que la citotoxicidad CD33-dependiente fue gracias a un reconocimiento específico del anticuerpo ant¡-CD33, My9-6. 4.7. Eficacia del My9-6-DM1 contra xenoinjertos de tumor humano en ratones La eficacia del My9-6-DM1 in vivo fue determinada al utilizar ratones SCID que tienen xenoinjertos de célula tumoral HL-60. Las células HL-60 fueron inyectadas subcutáneamente y los tumores crecieron hasta un promedio de 100mm3. El My9-6-DM1 conjugado se aplicaba i.v. una vez al día por 5 días con las dosis indicadas en la figura 21. La dosis se expresa como mg anticuerpo en el conjugado, el cual corresponde a una dosis DM1 de aproximadamente 15pg DM1 por mg del anticuerpo. El volumen del tumor se midió1 como indicación del tratamiento de eficacia y el peso del ratón fue monitoreado para indicar la toxicidad a consecuencia del tratamiento. El My9-6-DM1 induce curaciones a largo plazo en ratones que toleran las células del tejido de injerto humano HL-60 con dosis que causan muy poca toxicidad (Figura 21). En las dos dosis más altas probadas (19 y 26 mg/kg), se observo una regresión completa de los tumores con una pérdida de peso máximo de menos del 10% (Figuras 21A y B). Inclusive en la dosis más baja probada (13 mg/kg), 2 de cada 5 ratones mostraron curaciones completas, mientras que los otros tres mostraron regresión del tumor con un retraso en el crecimiento del tumor de aproximadamente 20 días. Se observaron resultados similares al utilizar las línea de célula THP-1 donde el My9-6-DM1 ocasionó curaciones a largo plazo en ratones que toleran las células del tejido de injerto humano HL-60 (no se muestra la información).

Estos resultados ocasionan un contraste agudo en comparación con aquellos obtenidos con el tratamiento de solamente el anticuerpo My9-6. El anticuerpo por sí sólo no tuvo efecto en le crecimiento de las células tumorales inclusive en dosis de 50 mg/kg (Figura 21C). Se comparó la actividad del My9-6-DM 1 con el anti-CD33 anticuerpo-caliqueamicina aprobado conjugando Ozogamicina de Gemtuzumab. La ozogamicina de Gemtuzumab fue administrada cada 4 días con tres dosis. Un experimento preliminar demostró que la ozogamicina de Gemtuzumab en el MTD publicado para ratones (0.3 mg/kg) era muy tóxico para los ratones SCID (no se muestra la información). También se observó toxicidad importante en las dosis 100 y 200pg/kg en este experimento (Figura 21F). La ozogamicina de Gemtuzumab mostró una regresión modesta del tumor y un retraso en el crecimiento en este modelo (25 días) en la dosis máxima tolerada (100ug/kg) (Figura 21E). En un experimento separado, se comparó la actividad anti-tumoral del My9-6-DM1 conjugado con la actividad del fármaco predecesor sin conjugar maitansina. Los ratones que tienen xenoinjertos de tumor HL-60 fueron tratados diariamente por 5 días con conjugado de 23 mg anticuerpo/kg o 350pg DM1/kg; fármaco sin conjugar a 350pg/kg; o el anticuerpo sin conjugar a 23 mg/kg. Tres de los seis ratones tratados con maitansina únicamente, murieron dos días después del tratamiento indicando que este nivel del fármaco es muy tóxico. No obstante, el fármaco mostró un impacto importante en el crecimiento del tumor en los tres ratones restantes, con un retraso en el crecimiento del aproximadamente de 10 días (Figura 22). El anticuerpo My9-6 sólo, no tiene efecto en el crecimiento del tumor, mientras que el My9-6-DM1 conjugado causa una regresión completa de los tumores. El efecto del tratamiento conjugado en el peso del ratón (disminución del 12%) fue un poco mayor que en el experimento anterior y puede reflejar variaciones de un lote a otro en la síntesis conjugada. Se observó que los tumores volvieron a crecer en dos de los seis ratones tratados conjugados, comenzando el 70. Estos animales fueron sujetos a un segundo tratamiento de My9-6-DM1 idéntico al primero. El segundo tratamiento tuvo como resultado una regresión completa de los tumores "recurrentes" sin observarse ninguna toxicidad adversa; por lo que se sugiere que la reaparición del tumor no se debió al crecimiento de células resistentes-conjugadas. La potente eficacia del My9-6-DM1 en este modelo de tejido de injerto sugiere que el conjugar puede ser efectivo inclusive contra tumores HL-60 grandes. Se les permitió a los tumores crecer hasta un volumen >400 mm3 antes de iniciar el tratamiento. Además se hizo una comparación de la actividad del My9-6-DM1 con los fármacos estándares de quimioterapia. El My9-6-DM 1 causó una regresión completa de los tumores grandes en ratones SCID (Figuras 23A y B). Otra vez, los tumores recurrentes (2 de cada 6 ratones) son sensibles a un segundo tratamiento con My9-6-DM 1. El tratamiento con agentes quimio terapéuticos estándares (Ara-C e idarubicina) tienen muy poco efecto en el crecimiento del tumor. Las dosis altas del fármaco fueron muy tóxicas para los ratones (no mostrado). 4.8. Eficacia del My9-6-DM1 en células HL-60 del modelo de supervivencia en ratón Mientras que la eficacia del My9-6-DM 1 en el modelo de xenoinjerto de tumor es impactante, también es interesante observar la actividad del conjugado en un modelo de supervivencia de ratón, donde se inyectan directamente las células HL-60 en la vena de la cola del ratón. En este modelo, los ratones controlados morían entre 30 y 50 días posteriores a la inyección de la célula. Los ratones tratados con My9-6-DM1 comenzando 11 días después de la inyección de célula mostraron un aumento dramático de supervivencia, con 7 de cada 8 ratones vivos a los 70 días (Figura 24A). Aplicando maitansina únicamente también mostró un impacto importante en este modelo, aunque 2 de los 8 ratones murieron poco después de haber comenzado el tratamiento indicando la toxicidad del fármaco La relativa eficacia de la maitansina en este modelo comparado con el modelo de xenoinjerto subcutáneo sugiere que los tumores HL-60 pudieran ser más sensibles a la acción del fármaco en estas condiciones. Si añadimos un retraso al comenzar el tratamiento se pudiera demostrar una diferencia aguda entre el fármaco dirigido y el no dirigido. Sin embargo, inclusive en este modelo, la quimioterapia estándar no proporcionó ninguna mejora significativa (Figura 24B). La combinación más alta de dosis mostró una toxicidad aparente importante del fármaco. Ambos, el anticuerpo My9-6 y la ozogamicina de Gemtuzumab mostraron un aumento moderado en la supervivencia.

Estado del Depósito El hibridoma que hace que los anticuerpos My9-6 de murina fueran depositados con la Colección de Cultivo Tipo Estadounidense, PO Box 1549, Manassas, VA 20108, el 7 de noviembre de 2002, bajo los Términos del Tratado de Budapest y fue asignado como el depósito número PTA-4786. Se ha hecho referencia a ciertas patentes y publicaciones en la presente descripción, las enseñanzas de cada una de las cuales están incorporadas aquí en su totalidad mediante referencia. En tanto que se ha descrito la invención a detalle y con referencias a modalidades específicas de la misma, sería evidente para alguien con experiencia en la técnica que se pueden hacer varios cambios y modificaciones a la presente sin apartarse del espíritu y alcance de la misma.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de epítope del mismo, que comprende por lo menos una región de determinación complementaria, que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en NOs. ID. SEC.:1-6:

SYYIH (NO. ID. SEC. I), VIYPGNDDISYNQKFXG (NO. ID. SEC.:2), en donde X es K o Q, EVRLRYFDV (NO. ID. SEC.:3), KSSQSVFFSSSQKNYLA (NO. ID. SEC.:4), WASTRES (NO. ID. SEC.:5), HQYLSSRT (NO. ID. SEC.:6), y que tiene la habilidad para enlazar D33. 2. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo, que comprende por lo menos una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en el que dicha región variable de cadena pesada incluye tres regiones de determinación complementarias que tienen secuencias de aminoácidos representadas NO. ID. SECs. :1-3, respectivamente,

SYYIH (NO. ID. SEC.:1), VIYPGNDDISYNQKFXG (NO. ID. SEC: 2), en donde X es K o Q, EVRLRYFDV (NO. ID. SEC: 3), y en el que dicha región variable de cadena ligera incluye tres regiones de determinación complementarias que tienen secuencias de aminoácidos representadas por NO. ID. SEC.s: 4-6, respectivamente, KSSQSVFFSSSQKNYLA (NO. ID. SEC: 4), WASTRES (NO. ID. SEC.:5), HQYLSSRT (NO. ID. SEC. : 6). 3. Un anticuerpo o un fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena pesada tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 7: QVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVG VI YPGNDSYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVR LRYFDVWGAGT TVTVSS.

4. Un anticuerpo o un fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena pesada tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a dicha secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC.:7: QVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASG YTFTSYYIHW IKQTPGQGLEWVG VI YPG D ISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREV RLRYFDVWGAGT TVTVSS.

5. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido representada por NO. ID. SEC: 7: QVQLQQPGAE VVKPGASVKMSCKASG YTFTSYYIHWI KQTPGQGLEWV GVI YPGNDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARE VRLRYFDVWGAGT TVTVSS.

6. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena ligera tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a dicha secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 8: NIMLTQSPSSLA VSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKN YLAWYQQI PGQS PKLLI YWASRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAI YYCHQYLSS RTFGGGTKLEIKR.

7. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena ligera tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a dicha secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 8: NIMLTQSPSSLA VSAGE VTMSCKSSQSVFFSSSQKN YLAWYQQI PGQS PKLLI YWASRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAI YYCHQYLSS RTFGGGTKLEIKR.

8. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 8: N IMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQK YLAWYQQI PGQS PKLLIYWASRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSS RTFGGGTKLEIKR.

9. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena pesada tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a dicha secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 9: QVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYI H WIKQTPGQGLEWVG VI YPG DSYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREV RLRYFDVWGQGT TVTVSS. '

10. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena pesada tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a dicha secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 9: QVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIH WIKQTPGQGLEWVG VI YPGNDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREV RLRYFDVWGQGT TVTVSS.

11. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 9: QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASG YTFTSYYIH WIKQTPGQGLEWV GVI YPGNDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARE VRLRYFDVWGQGT TVTVSS.

12. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena ligera tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a dicha secuencia de aminoácidos representada por NO- ID. SEC: 10: EIVLTQSPGSLAVSPGERVT SCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQS PRLLI YWASRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISS VQPEDLAIYYCHQYLSS RTFGQGTKLEIKR.

13. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena ligera tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a dicha secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC. : 10: EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKN YLAWYQQIPGQS PRLLI YWASRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDL Al YYCHQYLSS RTFGQGTKLEIKR.

14. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicha región variable de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 10: EIVLTQSRGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKN YLAWYQQIPGQS PRLLIYWASESG VPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSR TFGQGTKLEIKR.

15. Un anticuerpo purificado o fragmento de enlace de epítope del mismo que se enlaza específicamente a CD33, caracterizado porque la porción de región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo o fragmento de enlace de epítope tiene una secuencia de aminoácido representada por NO. ID. SEC: 7: QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWV G VI YPGNDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARE VRLRYFDVWGAGT TVTVSS, y en el que la porción de la región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento de enlace de epítope tiene una secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 8: NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQS PKLLI YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTI SSVQSEDLAI YYCHQYLS SRTFGGGTKLEIKR.

16. Un anticuerpo humanizado o recubierto o un fragmento de enlace de epítope del mismo, que se enlaza específicamente CD33, caracterizado porque la porción de la región de cadena pesada de dicho anticuerpo o fragmento de enlace de epítope tiene una secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 9: QVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYI HWI KQTPGQGLEWVG VI YPGNDD ISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARE VRLRYFDVWGQGT TVTVSS, y en el que la porción de la región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento de enlace de epítope tiene una secuencia de aminoácidos representada por NO. ID. SEC: 10: EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQS PRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAI YYCHQYLS SRTFGQGTKLEIKR.

17. Un ¡nmunoconjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo, de conformidad con la reivindicación 1, enlazado a un fármaco o profármaco.

18. Un ¡nmunoconjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo, de conformidad con la reivindicación 2, relacionado a un fármaco o profármaco.

19. El ¡nmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque dicho fármaco o profármaco es seleccionado del grupo que consiste de un maitansinoide, un taxoide, CC-1065, un CC-1065 análogo, dolastatina, dolastatina análoga, metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, caliqueamicina y derivados del mismo.

20. El ¡nmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque dicho fármaco o profármaco es seleccionado del grupo que consiste de un maitansinoide, un taxoide, CC-1065, un CC-1065 análogo, dolastatina, dolastatina análoga, metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, caliqueamicina y derivados del mismo.

21. Una composición que consta del anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 1 y un fármaco o profármaco.

22. Una composición que consta del anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2 y un fármaco o profármaco.

23. Una composición farmacéutica que consta del anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 1 y un agente farmacéuticamente aceptable.

24. Una composición farmacéutica que consta del anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 2 y un agente farmacéuticamente aceptable.

25. Una composición farmacéutica que consta del inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 17 y un agente farmacéuticamente aceptable.

26. Una composición farmacéutica que consta del inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 18 y un agente farmacéuticamente aceptable.

27. Una composición farmacéutica que consta de la composición de conformidad con la reivindicación 21 y un agente farmacéuticamente aceptable.

28. Una composición farmacéutica que consta de la composición de conformidad con la reivindicación 22 y un agente farmacéuticamente aceptable.

29. Un reactivo de diagnóstico que consta del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está etiquetado.

30. Un reactivo de diagnóstico que consta del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está etiquetado.

31. El reactivo diagnóstico de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque dicha etiqueta fue seleccionada del grupo que consta de una etiqueta de biotina, una etiqueta de enzima, una radio etiqueta, fluoroforo, cromóforo, un agente de imagen y un ion metálico.

32. El reactivo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la etiqueta se selecciona a partir del grupo que comprende una etiqueta de biotina, una etiqueta de enzima, una radio-etiqueta, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de formación de imagen y un ión metálico.

33. Un método de inhibición del crecimiento de un CD33 de expresión celular que comprende poner en contacto dicha célula con el anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o 2.

34. Un método de inhibición del crecimiento de un CD33 de expresión celular que comprende poner en contacto dicha célula con el inmunoconjugado de la reivindicación 17 o 18.

35. Un método de inhibición del crecimiento de un CD33 de expresión celular que comprende poner en contacto dicha célula con la composición de la reivindicación 21 o 22.

36. Un método de inhibición del crecimiento de un CD33 de expresión celular que comprende poner en contacto dicha célula con una composición farmacéutica seleccionada a partir de una de las reivindicaciones 23, 24, 25, 26, 27 o 28.

37. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad en donde CD33 es expresado, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de la reivindicación 1 o 2.

38. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad en donde CD33 es expresado, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del inmunoconjugado de la reivindicación 17 o 18.

39. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad en donde CD33 es expresado, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 21 o 22.

40. Un método para tratar a un sujeto que tiene uña enfermedad en donde CD33 es expresado, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 23 o 24.

41. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad en donde CD33 es expresado, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 25 o 26.

42. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad en donde CD33 es expresado, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 27 o 28.

43. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad en donde CD33 es expresado, que comprende poner en contacto una o más células de dicho sujeto ex vivo con una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento de enlace de epitope del mismo de la reivindicación 1 o 2.

44. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad en donde CD33 es expresado, que comprende poner en contacto una o más células de dicho sujeto ex vivo con una cantidad efectiva de un inmunoconjugado de la reivindicación 17 o 18.

45. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad en donde CD33 es expresado, que comprende poner en contacto una o más células de dicho sujeto ex vivo con una cantidad efectiva de una composición de la reivindicación 21 o 22.

46. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad en donde CD33 es expresado, que comprende poner en contacto una o más células de dicho sujeto ex vivo con una cantidad efectiva de una composición farmacéutica seleccionada a partir de una de las reivindicaciones 23, 24, 25, 26, 27 o 28.

47. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la enfermedad es una enfermedad seleccionada a partir del grupo que comprende síndrome mielodisplástico (MDS), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), y leucemia pro-mielocítica (PML).

48. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la enfermedad es una enfermedad seleccionada a partir del grupo que comprende síndrome mielodisplástico ( DS), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (C L), y leucemia pro-mielocítica (PML).

49. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad seleccionada del grupo que consta del síndrome de mielodisplasia (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia promielocítica (LMP).

50. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad seleccionada del grupo que consta del síndrome de mielodisplasia (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia promielocítica (LMP).

51. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad seleccionada del grupo que consta del síndrome de mielodisplasia (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia promielocítica (LMP).

52. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad seleccionada del grupo que consta del síndrome de mielodisplasia (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia promielocítica (LMP).

53. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad seleccionada del grupo que consta del síndrome de mielodisplasia (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia promielocítica (LMP).

54. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad seleccionada del grupo que consta del síndrome de mielodisplasia (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia promielocítica (LMP).

55. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad seleccionada del grupo que consta del síndrome de mielodisplasia (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia promielocítica (LMP).

56. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad seleccionada del grupo que consta del síndrome de mielodisplasia (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia promielocítica (LMP).

57. Un método para determinar si una muestra biológica contiene una célula cancerígena mieloginosa que comprende: (a) poner en contacto dicha muestra con el reactivo de diagnóstico de la reivindicación 29 o 30 y (b) detectar la distribución de dicho reactivo contenido en la muestra.

58. El método de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque dicho cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consta de leucemia mielode aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia promielocítica (LMP).

59. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epitope del mismo mejorado que se enlaza específicamente a CD33, dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo mejorado preparado por: (a) proporcionar ADN que codifique el anticuerpo o fragmento de enlace de epitope del mismo que consta de por lo menos uno de la NO. ID. SEC: 7 y NO. ID. SEC: 8 (b) introducir por lo menos una mutación, supresión, inserción o adición de nucleótido a dicho ADN de tal forma que se cambie la secuencia del aminoácido de dicho o anticuerpo o fragmento de enlace de epitope que codifica dicho ADN; (c) expresar dicho anticuerpo o fragmento de enlace de epitope; (d) dicha revisión que expresa el anticuerpo o fragmento de enlace de epitope para dicha mejoría, de ese modo preparando un anticuerpo o fragmento de enlace de epitope del mismo mejorado.

60. Un anticuerpo o fragmento de enlace de epitope del mismo mejorado que se enlaza específicamente con CD33, dicho anticuerpo o fragmento de enlace de epitope mejorado preparado por: (a) proporcionar ADN que codifique el anticuerpo o fragmento de enlace de epitope del mismo que consta de por lo menos uno del NO. ID. SEC: 9 y NO. ID. SEC: 10. (b) introducir por lo menos una mutación, supresión, inserción o adición de nucleótido a dicho ADN de tal forma que se cambie la secuencia del aminoácido de dicho o anticuerpo o fragmento de enlace de epítope codificador dicho ADN; (c) expresar dicho anticuerpo o fragmento de enlace de epítope; (d) tamizar el anticuerpo expresado o fragmento de enlace de epítope para dicha mejoría, preparando de ese modo un anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo mejorado.

61. El anticuerpo o fragmento epítope mejorado de conformidad la reivindicación 59 o 60, caracterizado porque dicha mejoría es un aumento en la afinidad del CD33.

62. El anticuerpo o fragmento epítope mejorado de conformidad con la reivindicación 59 o 60, caracterizado porque por lo menos se realiza una mutación, supresión, inserción o adición del nucleótido por medio de un método seleccionado del grupo que consiste de mutagenesis dirigida de sitio mediada por oligonucleótido, mutagénesis de cásete, PCR propenso al error, redistribución de ADN y uso de las cepas de mutación de E. coli.

63. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o 2.

64. Un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera o pesada del anticuerpo o fragmento de enlace de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o 2.

65. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 63.

66. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 64.

67. Una célula huésped transformada con el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 65.

68. Una célula huésped transformada con el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 66.

69. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de enlace de epitope del mismo con la habilidad de enlazarse a CD33, dicho método consta de (a) cultivar una célula huésped de conformidad con la reivindicación 67 bajo ciertas condiciones tales que dicha célula huésped exprese el anticuerpo o un fragmento de enlace de epitope, y (b) tomar el anticuerpo o un fragmento de enlace de epitope ahí expresado.

70. Un método para producir un anticuerpo o un fragmento de enlace de epitope del mismo con la habilidad de enlazarse a CD33, dicho método consta de (a) cultivar una célula huésped de conformidad con la reivindicación 68 bajo condiciones tales que dicha célula huésped exprese el anticuerpo o un fragmento de enlace de epitope, y (b) recolectar el anticuerpo o un fragmento de enlace de epitope así expresado.

71. Un método para obtener CD33 a partir del material biológico, dicho método consta de: (a) poner en contacto el material biológico con el anticuerpo o fragmento de enlace de epitope del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o 2, (b) permitir que el anticuerpo o fragmento de enlace de epítope de la reivindicación 1 o 2 se enlace con CD33 en dicho material biológico, y (c) aislar el anticuerpo o fragmento de enlace de epítope que delimita el CD33 del material biológico, de ese modo se obtiene CD33 de un material biológico.