NO20150064L

NO20150064L - Antagonistiske antistoffer

Info

Publication number: NO20150064L
Application number: NO20150064A
Authority: NO
Inventors: Hermann Gram; Franco E Di Padova; Hans Hofstetter; Margit Jeschke; Jean-Michel Rondeau; Wim Van Den Berg
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2015-01-13
Publication date: 2007-03-30
Also published as: DK1776142T3; HRP20110758T4; LU92768I2; US20190270804A1; AU2005268857B8; NL300749I2; MA28982B1; BRPI0513078B8; CY1115444T1; HUE038187T2; ATE517924T1; MY144925A; PT1776142E; LTPA2018515I1; BRPI0513078C1; DK2366405T3; LTPA2015029I1; HUS1800040I1; GB0417487D0; TWI359153B

Abstract

Et IL-17 bindende molekyl, spesielt et antistoff til humant IL-17, mer foretrukket et humant antistoff til IL-17 er tilveiebrakt, hvor de hypervariable regionene av de tunge og lette kjedene har aminosyresekvenser som definert, for anvendelse i behandlingen av en IL-17 mediert sykdom eller lidelse, f.eks. reumatoid artritt.

Description

Denne oppfinnelsen er relatert til et IL-17 bindende molekyl, nærmere bestemt et antistoff til humant IL-17, mer foretrukket et humant antistoff til humant IL-17 (også kalt IL-17A) og til anvendelsen av slike antistoffer i behandlingen av IL-17 medierte sykdommer og lidelser.

IL-17, en T-celle derivert cytokin til stede f.eks. reumatoid artritt (RA), virker som et pro-inflammatorisk cytokin, spesielt i forbindelse med IL-1 og TNF-a (Chabaud M & Miossec P (1999), Arthritis Rheu 42. 963-970; Awane M et al (1999) J. Immunol 162, 5337-5344). IL-17 induserer MMP produksjon og nedregulerer TIMP (Jovanovic DV et al (2001) J: Rheumatol. 28, 712-718), og blokkering av IL-1 og IL-17 har en synergistisk effekt på inflammasjon og bendestruksjon in vivo (Chabaud M & Miossec

(2001) Arthritis Rheum 44, 1493-1303). Uhensiktsmessig eller overskridende produksjon av IL-17 er assosiert med patologien av ulike sykdommer og lidelser, slik som reumatoid artritt (Witowski et al., 2004 Cell Mol Lifre Sei 61:567-579), osteoartritt, tap av benimplantater, akutt transplantasjonsfrastøtning (Antonysamy et al,m 1999, J Immunol 162, 577-584; van Kooten et al., 1998, J Am Soc Nephrol 9, 1526-1534) septikimi, septisk eller endotoksisk sjokk, allergier, astma (Molet et al., 2001, J. Allergy Clin Immunol 108, 430-438, bentap psoriasis (Teunissen et al., 1998, J. Invest Dermatol 111,645-649, iskemi, systemisk sklerose (Kurasawa et al., 2000, Arthritis Rheum 43, 2455-2463), slag og andre inflammatoriske lidelser. Antistoffer til IL-17 har blitt foreslått for anvendelse i behandlingen av IL-17 medierte sykdommer og lidelser; se f.eks. WO 95/18826 og diskusjonen i introduksjonen derav.

Vi har nå fremstilt forbedrede antistoffer til humant IL-17 egnet for anvendelse i behandlingen av IL-17 neduerte sykdommer og lidelser.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen et IL-17 bindende molekyl som omfatter et antigenbindende sete som omfatter minst et immunglobulin tung kjede variabel domene (Vrsom omfatter i sekvens hybervariable regioner CDR1, CRD2 og CDR3, nevnte CRD1 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 1 (N-Y-W-M-N) nevnte CR2 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. (A-I-N-Q-D-G-S-E-K-Y-Y-V-G-S-V-K-G) og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. (D-Y-Y-D-I-L-T-D-Y-Y-H-Y.W-Y-F-D-L); eller direkte CDR ekvivalenter derav.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen også et IL-17 bindende molekyl som omfatter minst et immunglobulin lett kjedevariabelt domene (Vl) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1', CDR2' og CDR3', nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 4 (R-A-S-Q-S-V-S-S-S-Y-L-A) nevnte CDR2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5 (G-A-S-S-R-A-T) og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEG ID nr. 6 (Q-Q-Y-G-S-S-P-C-T) eller direkte CDR' ekvivalenter derav.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringer oppfinnelsen et IL-17 bindende molekyl som omfatter et antigenbindende sete som omfatter minst et immunglobulin tung kjede varial domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDRl-x, CDR2-X og CDR3-X, nevnte CDRl-x har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 11 (G-F-T-F-S-N-Y-W-M-N), nevnte CDR2-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 12 (A-I-N-Q-D-G-S-Y-Y), og nevnte CDR3-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 13 (C-V-R-D-Y-Y-D-I-L-T-D-Y-Y-I-H-Y-W-Y-F-D-L-W-G) eller direkte CDR-x ekvivalenter derav.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen også et IL-17 bindende molekyl som omfatter både tung (VH) og lett kjede (Vl) variable domener; nevnte IL-17 bindende molekyl omfatter minst et antigen bindende sete som omfatter: a) et immunglonelin tung kjede variabel domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1, CDR2 og CDR3, nevnte CDR1 har aminosyresekvensen

SEQ ID nr.: 1, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 2 og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 3 eller direkte CDR ekvivalenter derav; og

b) et immunglobulin lett kjede variabel domene (Vl) som omfatter i sekvems hypervariable regioner CDR1', CDR2' og CDR3', nevnte CDR1' har

aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 4, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5, og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 6 eller direkte CDR' ekvivalenter derav.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen også et IL-17 bindende molekyl som omfatter både tung (VH) og lett kjede (Vl) variable domener; nevnte IL-17 bindende molekyl omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter: a) et immunglobulin tung kjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDRl-x, CDR2-X og CDR3-X, nevnte CDRl-x har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 11, nevnte CDR2-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 12, og nevnte CDR3xx har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 13 eller direkte CDR-x ekvivalenter derav; og b) et immunglobulin lett kjede variabelt domene (Vl) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1', CSR2' og CDR3', nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 4, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5 og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 6, eller direkte CDR' ekvivalenter derav.

Med mindre enn på annen måte indikert er enhver polypeptidkjede her beskrevet som å ha en aminosyresekvens som starter med den N-terminale ekstremiteten og slutter ved den C-terminale ekstremiteten. Når det antigenbindende setet omfatter både Vh og Vldomenene kan disse være lokalisert på det samme polypeptidmolekylet, eller hvert domene kan fortrinnsvis være på en forskjellig kjede, hvor Vh domenet blir del av en immunglobulin tung kjede eller fragment derav og Vlblir del av en immunglobulin lett kjede eller fragement derav.

Ved "IL-17 bindende molekyl" menes det ethvert molekyl i stand til å binde til IL-17 antigenet enten alene eller assosiert med andre molekyler. Bindingsreaksjonen kan bli vist ved standard fremgangsmåter (kvalitative tester) som for eksempel inkluderer en bindingstest, komkurrerende test eller bioassay for å bestemme inhiberingen av IL-17 binding til dets reseptor eller enhver type av bindingstester, med referanse til en negativ kontrolltest hvor et antistoff av ikke-relatert spesifisert, men av den samme isotypen, f.eks. et anti-CD25 antistoff, er benyttet (se også eksempel 1).

Eksempler på antigenbindende molekyler inkluderer antistoffer som produsert ved B-celler eller hybridomer og kimærer,CDR-graftede eller humane antistoffer eller ethvert fragment derav, f.eks. F(ab')2og Fab fragmenter, så vel som enkelkjede eller enkeldomene antistoffer.

Et enkelkjede antistoff består av de variable domene av de tunge og lette kjedene av et antistoff kovalent bundet ved en peptidlinker vanligvis bestående av fra 10 til 30 aminosyrer, fortrinnsvis fra 15 til 25 aminosyrer. En slik struktur inkluderer derfor ikke den konstante delen av de tunge og lette kjedene og det er trodd at den lille peptidspaceren burde være mindre antigenisk enn en hel konstant del. Ved "kimært antistoff' menes et antistoff hvor de konstante regionene av tunge og lette kjeder begge er av human opprinnelse, mens de variable domene av både tunge og lette kjeder er av ikke-human (f.eks. murin) opprinnelse av human opprinnelse, men derivert fra et forskjellig humant antistoff. Ved "CDR-graftet antistoff' menes et antistoff hvor de hypervariable regionene (CDR) er derivert fra et donorantistoff, slik som et ikke-humant (f.eks. murint) antistoff eller et forskjellig humant antistoff, mens alle eller hovedsakelig alle de andre delene av immunglobulinet, f.eks. de konstante regionene og de sterkt konserverte delene av de variable domenene, dvs. rammeverksregionene, er derivert fra et akseptorantistoff, for eksempel et antistoff av human opprinnelse, Et CDR-graftet antistoff kan imidlertid inneholde noen få aminosyrer av donorsekvensen i rammeverksregjonene, for eksempel i delene av rammeverksregionene tilstøtende de hypervariable regionene. Ved "humant antistoff' menes det et antistoff hvor de konstante og variable regionene av både de tunge og lette kjedene alle er av human opprinnelse, eller hovedsakelig identiske til sekvenser av human opprinnelse, ikke nødvendigvis fra det samme antistoffet og inkluderer antistoffer produsert ved mus hvor de murine immunglobulin variable og konstant delgenene har blitt erstattet med deres humane motstykker, f.eks. som genrelt beskrevet i EP 0546073 Blm USP 5545806, USP 5569825, USP 5625126, USP 5633425, ISP 5661016, USP 5770429, EP 0 438474 Bl og EP 0 463151 Bl.

Spesielt foretrukket IL-17 bindende molekyler av oppfinnelsen er humane antistoffer, spesielt AIN457 antistoffet som heretter beskrevet i eksempel 1 og 2.

De foretrukkede kimære antistoffer er derfor de variable domenene av både tunge og lette kjeder av human opprinnelse, for eksempel dem av ATN457 antistoffet som er vist i SEQ ID nr.: 10 (= variabelt domene av lett kjede, dvs. aminosyre 1 til 109 av SEQ ID nr.: 10) og SEQ ID nr. 8 (= variabelt domene av tung kjede, dvs. aminosyre 1 til 127 av SEQ ID nr. 8). Konstant region domene omfatter også fortrinnsvis egnede humane konstant region domener, f.eks. som beskrevet i "Sequences of Proteins of Immunologi cal Interest", Kabat E.A. et al, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health.

Hypervariable regioner kan være assosiert med enhver type av rammeverksregioner, selv om human opprinnelse er foretrukket. Egnede rammeverksregioner er beskrevet i Kabat E.A. et al, ibid. Foretrukkede tung kjede rammeverk er et humant tung kjede rammeverk, f.eks. det av AIN 457 antistoffet. Det består i sekvens av f.eks. FRI (aminosyre 1 til 30 av SEQ ID nr.: 8), FR2 (aminosyre 36 til 49 av SEQ ID nr.: 8), FR3 (aminosyre 76 til 98 av SEQ ID nr.: 8) og FR4 (aminosyre 117 til 127 av SEQ ID nr.: 8) regioner. Tatt i betraktning de bestemte hypervariable regionene av AIN457 ved røntgenanalyse,, består et annet foretrukket tung kjede rammeverk i sekvens av FRI-x (aminosyre 1 til 25 av SEQ ID nr.: 8), FR2-x (aminosyre 36 til 49 av SEQ ID nr.: 8), FR3-x (aminosyre 61 til 95 av SEQ ID nr.: 8) og FR4 (aminosyre 119 til 127 av SEQ ID nr.: 8) regioner. På en lignende måte består lett kjede rammeverket i sekvens av FRI'

(aminosyre 1 til 23 av SEQ ID nr.: 10), FR2' (aminosyre 36 til 50 av SEQ ID nr.: 10),

FR3' (aminosyre 58 til 89 av SEQ ID nr.: 10) og FR4' (aminosyre 99 til 109 av SEQ ID nr.: 10) regioner.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen også et IL-17 bindende molekyl som omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter enten et første domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig identisk til den vist i SEQ ID nr.: 8 som starter med aminosyren ved posisjon 1 og slutter med aminosyren ved posisjon 127 eller et første domene som beskrevet ovenfor og et andre domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig identisk til den vist i SEQ ID nr.: 10, som starter med aminosyren ved posisjon 1 og slutter med aminosyren ved posisjon 109.

Monoklonale antistoffer reist mot et protein naturlig funnet i alle mennesker er vanligvis utviklet ved et ikke-humant system, f.eks. i mus, og er derfor vanligvis ikke-humane proteiner. Som en direkte konsekvens av dette, fremkaller et xenogent antistoff som produsert ved en hybridom, når administrert til et menneske, en uønsket immun respons som hovedsakelig er mediert ved den konstante delen av det xenogene immunglobulinet. Dette begrenser klart anvendelsen av slike antistoffer ettersom det ikke kan bli administrert over en forlenget tidsperiode. Derfor er det spesielt foretrukket å benytte enkelkjede, enkeldomene, kimære, CDR-graftede eller spesielt humane antistoffer som trolig ikke fremkaller en vesentlig allogen respons når administrert til mennesker.

I lyset av det foregående er et mer foretrukket IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen valgt fra et humant anti IL-17 antistoff som omfatter minst

a) en immunglobulin tung kjede eller fragment derav som omfatter (i) et variabelt domene som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1, CDR2 og CDR3

eller direkte CDR ekvivalenter derav (ii) en konstant del eller fragment derav av en human tung kjede; nevnte CDR1 har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 1, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 2, og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 3; og b) en immunglobulin lette kjedet ellerl fragment derav som omfatter (i) et variabelt domene som omfatter i sekvens de hypervariable regionene og eventuelt også CDR1'.

CDR2' og CDR3' hypervariable regioner eller direkte CDR' ekvivalenter derav, og (ii) de konstante delen eller fragment derav av en human lett kjede, nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 4, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 5 og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 6.

Alternativt kan et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen bli valgt fra et enkel kjede bindende molekyl som omfatter et antigenbindende sete som omfatter

a) et førte domene som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1, CDR2 og CDR3 eller direkte CDR ekvivalenter derav, nevnte CDR1 har aminosyresekvensen

SEQ ID nr.: 1, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 2, og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen SEQ ID nr.: 3; og

b) et andre domene som omfatter hypervariable regioner CDR1', CDR2' og CDR3' eller direkte CDR' ekvivalenter derav, nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID

nr. 4, nevnte CDR 2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5 og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 6; og

c) en peptidlinker som er bundet til den n-terminale ekstremiteten av det førte domene og til den C-terminale ekstremiteten av det andre domene eller til den C-terminale

ekstremiteten av det første domene og den N-terminale ekstremiteten av det andre domene.

Som er godt kjent kan mindre endringer i en aminosyresekvens slik som delesjon, tilføying eller substitusjon av en, noen fa eller til og med flere aminosyrer føre til en allelisk form av det opprinnelige proteinet som har vesentlig identiske egenskaper.

Med betegnelsen "direkte CDR ekvivalenter derav" menes det derfor IL-17 bindende molekyler som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1;, CDR2; og CDR3; (i stedet for CDR1, CDR2 og CDR3, hvor

(i) den hypervariable regionene CDRli er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR1 som vist i SEQ ID nr. 1; og (ii) den hypervariable regionen CDR2; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionene CDR2 som vist i SEQ ID nr. 2; og (iii) den hypervariable regionen CDR3; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR 3 som vist i SEQ ID nr. 3; og (iv) et slikt molekyl som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1;,

CDR2;og CDR3;er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM, (= 30 ng/ml) humant IL-17 ved en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

På liknende måte menes det ved betegnelse "direkte CDR-x ekvivalenter derav" IL-17 bindende molekyler som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDRl;-x, CDR2;-x og CDR3i-x (i stedet for CDRl-x. CDR2-X og CDR3-x), hvor

(v) den hypervariable regionen CDRi-x er forskjellig ved 2, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDRl-x som

vist i SEQ ID nr. 11; og

(vi) den hypervariable regionene CDR2;-x er forskjellig fra 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR2-X som vist i SEQ ID nr. 12; og

vii) den hypervariable regionen CDR3;-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR3-X som vist SEQ ID nr. 13; og

viii) et slikt molekyl som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDRl;-x,

CDR2;-x og CDR3;-x er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 ng/ml) humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 med mer, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i

humane dermale fibroblaster.

På liknende måte menes det med betegnelsen "direkte CDR' ekvialenter derav" et domene som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1';, CDR2'; og CDR3'i, hvor

(i) den hypervariable regjoenen CDR1'; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR1' som vist i SEQ ID nr. 4; og (ii) den hypervariable regionen CDR2'; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen CDR2' som vist i SEQ ID nr. 5; og (iii) den hypervariable regionen CDR3'; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionene CDR3' som vist i SEQ ID nr: 6; og (iv) et slikt molekyl som omfatter i sekvens de hyperavariable regionene CDR1

CDR2'iog CDR3'ier i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 mg/ml) humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

Alternativt kan et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen være et IL-17 bindende molekyl som omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter minst en immunglobylin tungt kjede variabelt domene (Vh), som omfatter i sekvens a) hypervariable regioner CDR1 (SEQ ID nr. 1), CDR2 (SEQ ID nr. 2) og CDR3 (SEQ ID nr. 3); eller b) hypervariable regioner CDR1;, CDR2;, CDR3;, nevnte hypervariable region CDR1; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR1 som vist i SEQ ID nr. 1, nevnte hypervariable region CDR2;, er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR2 som vist i SEQ ID nr. 2, og nevnte hypervariable region CDR3; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR3 som vist i SEQ ID nr. 3; og

nevnte bindende IL-17 molekyl som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1X, CDR2Xog CDR3Xer i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 mg/ml humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivtet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

På likenende måte kan et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen være et IL-17 bindende molekyl som omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter minst et immunglobulin tung kjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvens

a) hybervariable region CDRl-x (SEQ ID nr. 11), CDR2-X (SEQ ID nr. 12) og CDR3-X (SEQ ID nr. 13); eller

Hypervariable regioner CDRl;-x, CDR2;-x, CDR3;-x, nevnte hypervariable region CDR 1 i-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDRl-x som vist i SEQ ID nr. 11, nevnte hypervariable region CDR2;-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR2-X som visti SEQ ID nr. 12; og nevnte hybervariable region CDR3-X er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR3-X som vist i SEQ ID nr. 13; og nevnte bindende IL-17 molekyl som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDRli-x, CDR2i-x og CDR3i-x er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 mg/ml) humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

På liknende måte kan et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen være et IL-17 binende molekyl som omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter minst et immunglobuling lett kjede variabelt domene (VL) som omfatter i sekvens a) hypervariable regioner CDR'l (SEQ ID nr. 5), CDR'2 (SEQ ID nr. 5) og CDR'3 (SEQ ID nr. 6); eller b) hypervariable regioner CDR' 1;, CDR'2;, CDR'3;, nevnte hypervariable region CDR'1; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR' 1 som vist i SEQ ID nr. 4, nevnte hypervariable region CDR'2; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regjoenen av CDR'2 som vist i SEQID nr. 5; og nevnte hypervariable region CDR'3; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fera den hypervariable regionen av CDR'3 som vist i SEQ ID nr. 6; og nevnte bindende IL-17 molekyl som omfatter i sekvens de hypervariabler regionene CDR' 1;, CDR'2; og CDR'3; er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 mg/ml) humant IL-17 ved en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

Alternativt kan et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen være et IL-17 bindende molekyl som omfatter både tung (Vh) og lett kjede (Vl) variable domener og nevnte IL-17 bindende molekyl omfatter minst et antigenbinende sete som omfatter: a) et immunglobulin tung kjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1 (SEQ ID nr. 1), CDR2 (SEQ ID nr. 2) og CDR3 (SEQ ID

nr. 3); og

et immunglobulin lett kjede variabelt domene (Vl) som omfatter i sekvens hypervariablet regioner CDR1'(SEQ ID nr. 4), CDR2' (SEQ ID nr. 5), og CDR3' (SEQ ID nr. 6); eller

b) et immunglobulin tung kjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1;, CDR2; og CDR3;, nevnte hypervariable region CDR1; er

forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable

regionene av CDR1 som vist i SEQ ID nr. 1, nevnte hypervariable region CDR2; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR2 som vist i SEQ ID nr. 2; og nevnte hypervariable region CDR3; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionene av CDR3 som vist i SEQ ID nr. 3; og

høyt immunglobulin, lett kjede variabelt domene (Vl) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1';, CDR2';, CDR3';, nevnte hypervariable region CDR' 1; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra de hypervariable regionen av CDR' 1 som vist i SEQ ID nr. 4, nevnte hypervariable region CDR'2; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyer(r) fra den hypervariable regionen av CDR'2 som vist i SEQ ID nr. 5; og nevnte hypervariable region CDR'3; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR'3 som vist i SEQ ID nr. 6; og

nevnte bindende IL-17 molekyl definert i b) som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1;, CDR2i, CDR3;, CDR'l;, CDR'2; og CDR'3; er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 mg/ml) humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet ble målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

Alternativt kan et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen være et IL-17 bindende molekyl som omfatter både tung (Vh) og lett kjede (VL) variable domener og nevnte IL-17 bindende molekyl omfatter et antigenbindende sete som omfatter: a) et immunglobulin tung kjede variabel domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDRl-x (SEQ ID nr. 11), CDR2-X (SEQ ID nr. 12) og CDR3-X

(SEQ ID nr. 13); og

et immunglobulin, lett kjede, variabelt domene (Vl) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1' (SEQ ID nr. 4), CDR2'(SEQ ID nr. 5), og CDR3' (SEQ ID nr. 6; eller

b) et immunglobulin tung kjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDRl;-x, CDRl;-x og CDR3;-x, nevnte hypervariable region

CDR 1 ;-x er forskjellig ved 3, fortrinsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDRl-x som vist i SEQ ID nr. 11, nevnte hypervariable region CDR2;-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 amniosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR2-X som vist i SEQ ID nr. 12; og nevnte hypervariable regjone CDR3;-x er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(er) fra den hypervariable regionen av CDR3-X som vist i SEQ ID nr. 13; og et immunglobulin lett kjede variabelt domen (Vl) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1';, CDR2';, CDR3';, nevnte hypervariable region CDR'l; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR' 1 som vist i SEQ ID nr. 4, nevnte hypervariable region CDR'2; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR'2 som vist i SEQ ID nr 5; og nevnte hypervariable region CDR'3; er forskjellig ved 3, fortrinnsvis 2, mer foretrukket 1 aminosyre(r) fra den hypervariable regionen av CDR'3 som vist i S>EQ ID nr. 6; og

nevnte bindende IL-17 molekyl definert i b) som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1;, CDR2;, CDR3;, CDR' 1;, CDR'2; og CDR'3; er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (=30 ng/ml) humant IL-17 ved en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale hydroblaster.

Inhiberingen av bindingen av IL-17 til dets reseptor kan bli konvensjonelt testet i ulike tester som inkluderer slike tester som er beskrevet senere i teksten. Betegnelsen "i den samme utstrekning" menes det at referansen og de ekvivalente molekylene viser, på et statistisk grunnlag, hovedsakelig identisk IL-17 inhibitorisk aktivitet i en av testene referert til her (se eksempel 1). For eksempel har IL-17 bindende molekyler av oppfinnelsen vanligvis IC50for inhiberingen av humant IL-17 på IL-6 produksjon indusert ved et humant IL-17 i humane dermale fibroblaster som er innenfor +/-x5, dvs. under 10 nM,mer foretrukket 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 eller 2 nM av den av, fortrinnsvis hovedsakelig den samme som, IC50av det korresponderende referansemolekylet når testet som beskrevet i eksempel 1.

Alternativt kan testen benyttet være en test for konkurrerende inhibering av binding av IL-17 ved løselige IL-17 reseptorer (f.eks. de humane IL-17 R/Fc konstruksjonene av eksempel 1) og de IL-17 bindende molekylene av oppfinnelsen.

Mest foretrukket omfatter det humane IL-17 antistoffet minst

a) en tung kjede som omfatter et variabelt domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig identisk til den vist i SEQ ID nr. 8 som starter med aminosyren ved

posisjon 1 og slutter med aminosyren ved posisjon 127 og den konstante delen av en human tung kjede; og

b) en lett kjede som omfatter et variabelt domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig identisk til den vist i SEQ ID nr. 10 som starter med aminosyren ved posisjon 1 og slutter med aminosyren ved posisjon 109 og den konstante delen av en human lett kjede.

Den konstante delen av en human tung kjede kan være yi,72,73,74, u, ai, a2, 8 eller8typen, fortrinnsvis av y typen, mer foretrukket av yi typen, imens den konstante delen av en human lett kjede kan være av%eller X typen, (som inkluderer Xu X2og X3subtypene), men er fortrinnsvis av x typen. Aminosyresekvensene av alle disse konstante delene er gitt i Kabat et al (supra).

Konjugater av bindingsmolekylene av oppfinnelsen, f.eks. enzym eller toksin eller radioisotopkonjugater, er også inkludert innenfor rekkevidden av oppfinnelsen.

"Polypeptid", om ikke på annen måte spesifisert her, inkluderer ethvert peptid eller protein som omfatter aminosyrer sammenføyet til hverandre ved peptidbindinger, som har en aminosyresekvens som starter ved den N-terminale ekstremiteten og slutter ved den C-terminale ekstremiteten. Fortrinnsvis er polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen en monoklonalt antistoff, mer foretrukket er det et kimært (også kalt V-graftet) eller humanisert (også kalt CDR-graftet) monoklonalt antistoff, mest foretrukket et fullstendig humant antistoff oppnåelig f.eks. ved teknologien eksemplisert i eksempel 1. Det humaniseret (CDR-graftede) eller fullstendige humane monoklonale antistoffet kan eller kan ikke inkluderer ytterligere mutasjoner introdusert i rammeverks (FR) frekvensene av akseptoranti stoffet.

Et funksjonelt derivat av et polypeptid som benyttet her inkluderer et molekyl som har en kvalitativ biologisk aktivitet til felles med et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, dvs. har evnen til å binde til humant IL-17. Et funksjonelt derivat inkluderer fragmenter og peptidanaloger av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Fragmenter omfatter regioner innenfor sekvensen av et polypeptid i henhold til den forliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens. Betegnelsen "derivat" er benyttet for å definere aminosyresekvensvarianter, og kovalente modifikasjoner av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens. De funksjonelle derivatene av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens, f.eks. av den hypervariable regionen av den lette og tunge kjeden, har fortrinnsvis minst omkring 65%, mer foretrukket minst omtrent 75%, ennå mer foretrukket minst omkring 85%, mest foretrukket minst omkring 95, 96, 97, 98, 99% total sekvenshomologi med aminosyresekvensen av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, for eksempel av en spesifisert sekvens, og behodler hovedsakelig evnen til å binde humant IL-17 eller f.eks. nøytralisere IL-6 produksjon av IL-17 induserte humane dermale fibroblaster.

Betegnelsen "kovalent modifikasjon" inkluderer modifikasjoner av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens; eller et fragment derav med et organisk proteinøst eller ikke-proteinøst derivatiserende middel, fusjoner til heterologe polypeptidfrekvenser, og post-translasjonelle modifikasjoner. Kovalent modifiserte polypeptider, f.eks. av en spesifisert sekvens, har fortsatt evnen til å binde humant IL-17 eller f.eks. nøytralisere IL-6 produksjon av IL-17 induserte humane dermale hydroblaster ved kryssforbinding. Kovalente modifikasjoner er tradisjonelt introdusert ved å reagere målrettende aminosyreresiduer med et organisk derivatiserende middel som er i stand til å reagere med valgte sider eller terminale residuer eller ved å utnytte mekanismer av post-translasjonelle modifikasjoner som virker i valgte rekombinante vertsceller. Enkelte post-translasjonelle modifikasjoner er resultatet av virkningen av rekombinante vertsceller på det uttrykte polypeptidet. Glutaminyl og asparaginyl residuer er hyppig post-translasjonelt deamiert til de kroresponderende glutamyl og aspartyl residuene. Alternativt er disse residuene deaminert under mildt sure forholdt. Andre post-translasjonelle modifikasjoner inkluderer hydroksylering av prolin og lysubm fosforylering av hydroksylgrupper av seryl, tyrosin eler treonyl residuer, medylering av a-aminogruppene av lysin, arginin og histidin sidekjeder, se f.eks. T. E: Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, side 79-96 (1983). Kovalente modifikasjoner inkluderer f.eks. fusjonsproteiner som omfatter et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesfisert sekvens og deres aminosyre sekvensvarianter, slik som immunoadhesiner og N-terminale fusjoner til heterologe signal sekvenser.

"Homologi" med hensyn på et naturig polypeptid og dets funksjonelle derivat er definert her som prosentandelen av aminosyre residuer i kandidatsekvensen som re identiske med residuene av et korresponderende naturlig polypeptid, etter oppstilling av sekvensene og ved å introdusere åpninger, om nødvendig, for å oppnå den maksimale prosentandelen homologi, og ved å ikke betrakte noen konservative substitusjoner som del av sekvensidentiteten. Verken N- eller C-terminale forlengelser eller innsettinger skal bli opfattet til å redusere identitet eller homologi. Fremgangsmåter computerprogrammer for oppsitllingen er godt kjent.

"Aminosyre(er)" refererer til alle naturlig forekomne L-a-aminosyrer, som f.eks. inkluderer D-aminosyrer. Aminosyrene er identifisert ved enten de godt kjente enkel - bokstav eller tre-bokstav betegnelsene.

Betegnelsen "aminosyresekvensvariant" refererer til molekyler med noen forskjeller i deres aminosyresekvenser sammenliknet med et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens. Aminosyresekvensvarianter av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens, har fortsatt evnen til å binde humant IL-17 eller f.eks. nøytralisere IL-6 produksjon av IL-17 induserte humane dermale fibroblaster. Substitusjonelle varianter er dem som har minst en aminosyreresidue fjernet og en forskjellig aminosyre satt inn ved dens plass med den samme posisjonen i et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens. Disse substitusjonene kan være enkle, hvor bare en aminosyre i molekylet har blitt substituert, eller de kan være multiple, hvor to eller flere aminosyrer har blitt substituert i det samme molekylet. Innsettingsvarienter er dem med en eller flere aminosyrer satt inn øyeblikkelig tilstøtende til en aminosyre ved en bestemt posisjon i et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens. Øyeblikkelig tilstøtende til en aminosyre betyr forbundet til enten den a-karboksy eller a-aminofunksjonelle gruppen av aminosyren. Delesjonsvarianter er dem med en eller flere aminosyrer i et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, f.eks. av en spesifisert sekvens, fjernet. Ordinært delesjonsvarianter ha en eller to aminosyrer deletert i en bestemt region av molekylet.

Et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen har blitt produsert ved rekombinante DNA teknikker. I lys av dette må ett eller flere DNA molekyler som koder for bindingsmolekylet bli konstruert, plassert under hensiktsmessige kontrollsekvenser og overført inn i en egnet vertsorganisme for ekspresjon.

På en veldig generell måte er det følgelig tilveiebrakt

(i) DNA molekyler som kode for et enkelt domene IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen, et enkel kjede IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen, et IL-17 bindende molekyl som omfatter en tung og lett kjede som definert her, eller fragmenter av et IL-17 binende molekyl av oppfinnelsen; og (ii) anvendelsen av DNA molekylene av oppfinnelsen for produksjon av et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen ved rekombinante midler.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen et DNA molekyl som kode for et IL-17 bindende molekyl som beskrevet ovenfor.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen en DNA konstruksjon som omfatter et DNA molekyl som er hovedsakelig homolog til SEQ ID nr. 7 eller SEQ ID nr. 9.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen en DNA konstruksjon som omfatter to DNA molekyler hvor et er hovedsakelig homolog til SEQ ID nr. 7 eller er en direkte DNAHekvivalent derav og den andre hovedsakelig homolog til SEQ ID nr. 9, eller er en direkte DNALekvivalent derav.

Foreliggende status av fagfeltet er slik at den øvede arbeideren i fagfeltet er i stand til å syntetisere DNA molekylene av oppfinnelsen gitt i informasjonen tilveiebrakt her, dvs. aminosyresekvensene av de hypervariable regionene og DNA sekvensene som koder for dem. En fremgangsmåte for å konstruere et variabelt domenegen er for eksempel beskrevet i EPA 239 400 og kan i korthet bli oppsummert som følger: Et gen som koder for et variabelt domene av et MAb av hvilken som helst spesifisitet er klonet. DNA segmentene som koder for rammeverksregioner og hypervariable regioner er bestemt og DNA segmentene som koder for de hypervariable regjoene er fjernet slik at DNA segmentene som koder for rammeverksregionene er fusjonert sammen med egnede restrikssjonsseter ved forbindelsene. Restriksjonssetene kan bli generert ved de hensiktsmessige posisjonene ved mutagenese av DNA molekylet ved standard prosedyrer. Dobbeltrådede syntetiske CDR kassetter er preparert ved DNA synetse i henhold til sekvensene som koder for SEQ ID nr. 1 (CDR1), SEQ ID nr. 2 (CDR2), SEQ ID nr. 3 (CDR3), SEQ ID nr, 4 (CDR1'), SEQ ID nr. 5 (CDR2'). SEQ ID nr. 6 (CDR6'), SEQ ID nr. 11 (CDRl-x), SEQ ID r. 12 (CDR2-x), SEQ ID nr. 13 (CDR3-x). Disse kassettene er tilveiebrakt med kleblige ender slik at de kan bli ligert ved forbindelsepunktene av rammeverket.

Videre er det ikke nødvendig å ha adgang til mRNA fra en produserende hybridom cellelinje for å oppnå en DNA konstruksjon som kode for de IL-17 bindende molekylene av oppfinnelsen. PCT søknad WO 90/07861 gir på denne måte fullstendige instruksjoner for produksjonen av et antistoff ved rekombinante DNA teknikker gitt bare skrevet informasjon om nukleotidsekvensen av genet. Fremgangsmåten omfatter synetsen av et antall oligonukleotider, deres amplifisering med PCR metoden, og deres spleising for å gi den ønskede DNA sekvensen.

Ekspresjonsvektorer som omfatter en egnet promoter eller gener som kode for tung og rett kjede konstante deler er offentlieg tilgjengelige. Med en gang et DNA molekyl av oppfinnelsen er preparert kan derfor bli bekvemmelig overført i en hensiktspessig ekspresjonsvektor. DNA molekyler som koder for enkelt kjede antistoffer kan også bli preparert ved standard fremgangsmåter, for eksempel som beskrevet i WO 88/1649.

I analogi med tilfellet for CDR ekvivalenter, betyr betegnelsen "direkte DNAHog ekvivalenter derav" en første DNA konstruksjon som kode for en tung kjede eller fragment derav et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen og omfatter: a) en første del asom kode for et variabelt domene som omfatter alternative rammeverk og hypervariable regioner, nevnte hypervariable regioner er i sekvens CDR1;, CDR2; og CDR3;, der CDR1; er minst 50% homolog, fortrinnsvis minst 60, 70, 80, 85 eller 95% homolog, mer foretrukket minst 95% homolog til den hybervariable regionen CDR1 som vist i SEQ ID nr. 1, nevnte CDR2; er minst 50% homolog, fortrinnsvis minst 60, 70, 80, 85 eller 90% homolog, mer foretrukket minst 95% homolog til den hypervariable regionen CDR2 som vist i SEQ ID nr. 2, og CDR3; er minst 50% homolog, fortrinnsvis minst 60, 70, 80, 85 eller 90% homolog, mer foretrukket minst 95% homolog til den hypervariable regionen CDR3 som vist i SEQ ID nr. 3; denne første delen starter med et codon som kode for den første aminosyren av det variable domene, og slutter med et codon som koder for den siste aminosyren av det variable domene; og b) en andre del som koder for en tung kjede konstant del eller fragment derav som starter med et codon som koder for den førte aminosyren av den konstante delen av den tunge kjeden og slutter med et codon som kode for den siste aminosyren av den konstante deen eller fragment derav, etterfulgt med et stopp codon; og c) nevnte DNA koder for et polypeptid som er i stand til å enten alene eller i kombinasjon med et annet polypeptid å inhibitere aktiviteten av 1 nM (=30 ng/mg) humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50am, nevnte ihibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane fibroblaster. På lignende måte betyr betegnelsen "direkte DNAH-x ekvivalenter derav" en første alternativ DNA konstruksjon som koder for en tung kjede eller fragment derav av et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen og omfatter a) en første dels om koder for et variabelt domene som omfatter alternative rammeverk og hypervariable regioner, nevnte hypervariable regioner er en sekvens CDRl;-x,

CDR2;-x og CDR3;-x, nevnte CDRl;-x er minsyt 50% homolog, fortrinnsvis minst 60, 70, 80, 85 eller 90% homolog, mer fortrukket minst 95% homolog til den hypervariable regionen CDR1 som vist i SEQ ID nr. 11, nevnte CDR2;-x er minst 50% homolog, fortrinnsvis minst 60, 70, 80, 85 eller 95% homolog, mer foretrukket minst 35% homolog til den hypervariable regionene CDR2 som vist i SEQ ID nr. 12, og CDR3;-x er minst 50% homolog, fortrinnsvis minst 60, 70, 80, 85 eller 90% homolog, mer foretrukket minst 95% homolog til den hypervariable regionene CDR3 som vist i SEQ ID nr. 13; denne første delen starter med et codon som kode for den første aminosyren av det variable domene og slutter med et codon som koder for den siste aminosyren av det variable domene; og

b) en andre del som koder for en tung kjede konstant del eller fragment derav, som starter med et codon som koder for den første aminosyren av den konstante delen av den

tunge kjeden og slutter med et codon som kode for den siste aminosyren av den konstanten delen eller fragmentet derav, etterfulgt av et stopp codon; og

c) nevnte DNA konstruksjon koder for et polypeptid som er i stand til enten alene eller i kominasjon med et annet polypeptid og inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 ng/ml)

humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produsjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

Fortrinnsvis koder disse DNA konstruksjonene for et variablet domene som omfatter alternativt rammeverks og hypervariable regioner, nevnte hypervariable regioner er i sekvens CDR1, CDR2 og CDR3, nevnte CDR1 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 1, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 2, og nevnte CDR3 har aminosyrefrekvesen SEQ ID nr. 3. Mer foretrukket koder disse DNA konstruksjonene for et variabelt domene som omfatter alternativt rammeverk og hypervariable regioner, nevnte hypervariante regioner er i sekvensCDRl-x, CDR2-X og CDR3-X, nevnte CDRl-x har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 11, nevnte CDR2-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 12 og nevnte CDR3-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 13. Mer foretrukket koder denne første delen for et variabelt domene som har aminosyrefrekvensen hovedsakelig identisk til aminosyresekvensen som vist i SEQ ID nr. 8 som starter med aminosyren ved posisjon 1 og slutter ved aminosyren ved posisjon 127. Mer foretrukket har denne første delen nukleotidseskvensen som vist i SEQ ID nr. 7 som starter med nukleotide posisjon 1 og slutter med nukleotide ved posisjon 381. Også foretrukket koder den andre delen for en den konstante delen av en human tung kjede, mer foretrukket til den konstante delen av den humane yl kjeden. Den andre delen kan være et DNA fragment av genomisk opprinnelse (som omfatter introner) eller et cDNA fragment (uten introner).

På liknende måte betyr betegnelsen "direkte DNALekvivalenter derav" en andre DNA konstruksjon som koder for en lettkjede eller fragment derav av et IL-17 bindende molekyl av oppfinnelsen og omfatter: a) en første del som koder for variabelt domene som omfatter alternativt rammeverk og hypervariable regioner; nevnte hylervariable regioner er CDR3;' og eventuelt CDR1;' og CDR2;', nevnte CDR1;' er minst 50% homolog, fortrinnsvis minst 60, 70, 80, 85 eller 90% homolog, mer foretrukket minst 95% homolog til den hypervariable regionen CDR1' som vist i SEQ ID nr. 4, nevnte CDR2;' er minst 50% homolog, fortrinnsvis minst 60, 70, 80, 85 eller 90% homolog, mer foretrukket minst 95% homolog til den hypervariable regionen CDR2' som vist i SEQ ID nr. 5, nevnte CDR3;' er minst 50% homolog, fortrinnsvis minst 60, 70, 80, 85 eller 90% homolog, mer foretrukket minst 95% homolog til den hypervariable regionen CDR3' som vist i SEQ ID nr. 6; denne første delen starter med et codon som koder for den første aminosyren av det variable domene og slutter med et codon som koder for den siste aminosyren av det variable domene; og

b) en andre del som koder for en lett kjede konstant del eller fragment derav som starter med codon som koder for den første aminosyren av den konstante delen av den lette

kjeden og slutter med et codon som koder den siste aminosyren av den konstante delen eller fragment derav etterfulgt ved stopp codon; og

c) nevnte DNA konstruksjon koder for et polypeptid som er i stand til enten alene eller i kombinasjon med et annet polypeptid å inhibere aktiviteten av 1 nM (=30 ng/ml)

humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, nevnet inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster.

Fortrinnsvis koder denne andre DNA konstruksjonen for et variabelt domene som omfatter alternativt rammeverk og hypervariable regioner, nevnte hypervariable regioner er i sekvens CDR1', CDR2' og CDR3', nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 4, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5, og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEQ ID nr 6. Mer foretrukket koder denne første delen av den andre DNA konstruksjonen for et variabelt domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig identisk til aminosyresekvensen som vist i SEQ ID nr. 10 som starter med aminosyren ved posisjon 1 og slutter ved aminosyren ved posisjon 109. Mer foretrukket har den første delen nukleotidsekvense som vist i SEQ ID nr. 9 som starter med nukleotidet ved posisjon 1 og slutter med nukleotidet ved posisjon 327. Også foretrukket koder dne andre delen for den konstante delen av en human lett kjede, mer foretrukket den konstante delen av human%.

Fortrinnsvis vil den første og andre delen av konstruksjonen bli benyttet sammen, men kan også bli benyttet separat.

Oppfinnelsen inkluderer også IL-17 bindende molekyler hvor en eller flere aminosyreresiduer av CDR1, CDR2, CDR3, CDRl-x, CDR2-X, CDR3-X, CDR1', CDR2' eller CDR 3' eller rammeverkene, vanligvis bare noen få (f.eks. 1-4), er endret; for eksempel ved mutasjon, f.eks. seterettet mutagenese av de korresponderende DNA sekvensene. Oppfinnelsen inkluderer DNA sekvensene som koder for slike endrede IL-17 bindende molekyler. Spesielt inkluderer oppfinnelsen IL-17 bindende molekyler hvor en eller flere residuer av CDR1' eller CDR2' har blitt endret fra residuene vist i SEQ ID nr. 4 (for CDR1') og SEQ ID nr. 5 (for CDR2').

I de første og andre DNA konstruksjonene kan de første og andre delene være separert ved en intron, og en enhancer kan bekvemmelig bli lokalisert i intronet mellom de første og andre delene. Tilstedeværelsen av en slik enhancer som er transkribert, men ikke translantert, kan assistere i effektiv transkripsjon. I bestemet utførelsesformer omfatter de første og andre DNA konstruksjonen enhanceren av et tung kjede gen fordelaktig av human opprinnelse.

Hver av DNA konstruksjonene er plassert under kontrollen av egnede kontroll sekvenser, spesielt under kontrollen av en egnet promoter. Enhver type promoter kan bli benyttet, tilveiebrakt at den er tilpasset til vertsorganismen hvori DNA konstruksjonene vil bli overført for ekspedisjon.

Det ønskede antistoffet kan bli produsert i en cellekultur eller i et transgent dyr. Et egnet transgent dyr kan bil oppnådd i henhold til standard fremgangsmåter som inkluderer mikroinjeksen inn i egg av de første og andre DNA konstruksjonene plassert under egnede kontrollsekvenser ved å oveføre de slik preparerte eggene inn i hensiktsmessige pseudogravide hunner og selektere en etterkommer som uttrykker det ønskede antistoffet.

Når antistoffkjedene er produsert i en cellekultur må DNA konstruksjonene først bli satt inn i enten en enkel ekspresjonsvektor eller inn i to separate, men kompatible ekspresjonsvektorer, når den sistnevnte muligheten er foretrukket.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen også en ekspresjonsvektor i stand til å replikere i en prokaryot eller eukaryot cellelinje som omfatter minst en av DNA konstruksjonene beskrevet ovenfor.

Hver ekspresjonsvektor inneholdene en DNA konstruksjon er så overført til en egnet vertsorganisme. Når DNA konstruksjonene er separat satt inn i to ekspresjonsvektorer kan de bli overført separat, dvs. en type av vektor per celle, eller ko-overført, hvor den sistnevnte muligheten er foretrukket. En egnet vertsorganisme kan være en bakterie, en gjær eller en mammalsk cellelinje, hvor den sistnevnte er foretrukket. Mer foretruket er den mammalske cellelinjen av lyymfoid opprinnelse, f.eks. e muelom, hybridom eller en normal immortalisert B-celle, som bekvemmlig ikke uttrykker noen endogen antistoff tung eller lett kjede.

For ekspresjon i mammalske celler er det foretrukket at det IL-17 bindende molekylet som koder for sekvensen er integrert i vertscelle DNA i en locus som tillater eller favoriseres ekspresjon i høyt nivå av det IL-17 bindende molekylet. Celler hvor den kodende sekvens for IL-17 bindende molekyl er integrert i slik gunsti loci kan bli identifisert og selektert på basisen av nivåene av det IL-17 bindende molekylet som blir uttrykket. Enhver egnet selekterbar markør kan bli benyttet for fremstilling av vertsceller som inneholder den IL-17 bindende molekyl kodende sekvensen; for eksempel kan et dhfr gen/netotreksat eller ekvivalent seleksjonssystem bli benyttet. Alternative systemer for ekspresjon av de IL-17 bindende molekylene av oppfinnelsen inkluderer GS-baserte amplifisering/seleksjonssystemer, slik om dem beskrevet i EP 0256055 B, EP 0323997 B og europeisk patentsøknad 89303964.4.

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for produksjonen av et IL-17 bindende molekyl som omfatter (i) å dyrke en organisme som er transformert med en ekspresjonsvektor som definert ovenfor og (ii) utvinne det IL-17 bindende molekylet fra kulturen.

For formålene av den foreliggende beskrivelsen er et antistoff "i stand til å inhibere bindingen av IL-17 som AIN457" om antistoffet er i stand til å inhibere bindingen av IL-17 til et reseptor hovedsakelig i den samme utstrekningen som AIN457 antistoffet, hvor "i den samme utstrekningen" har betydning som definert ovenfor.

ATN457 antistoffet har bindingsaffinitet for IL-17 som er høyere enn affiniteter tidligere rapportert for anti IL-17 antistoffer, spesielt til alle anti humane IL-17 antistoffer. Derfor har AIN457 en dissosiasjon likevektskonstant KDfor binding til IL-17 på omkring 0,188 ± 0,036 nM (bestemt ved BIAcore, f.eks. som vist i eksempel 2). Denne høye bindingsaffiniteten gjør AIN457 antistoffet spesielt egnet for terapeutiske anvendelser.

I den foreliggende beskrivelsen omstlutter frasen "IL-17 mediert sykdom" alle sykdommer og medisinske tilstander hvor IL-17 spiller en rolle, enten direkte eller indirekte, i sykdommen eller den medisinske tilstanden, som inkluderer forårsaking, utvikling, progresjon, medholdenhet eller patologi av sykdommen eller tilstanden.

I den foreligende beskrivelsen refererer betegnelsene "behandling" eller "behandle" til både profylaktisk eller forebyggende behandling så vel som kurerende eller sykdomsmodifiserende behandling, som inkluderer behandling av pasient ved risiko for å pådra seg sykdommen eller mistenkt for å ha pådratt seg sykdommen så vel som pasienter som er syke eller som har blitt diagnostisert til å lide av en sykdom eller medisinsk tilstand, og inkluderer undertrykkelse av klinisk tilbakefall. IL-17 bindende molekyler som definert ovenfor som har bindingsspesifisitet for humant IL-17, spesielt antistoffer som er i stand til å inhibere bindingen av IL-17 til dets reseptor; og antistoffer til IL-17 som er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM (= 30 ng/ml) humant IL-17 med en konsentrasjon på 50 nM, fortrinnsvis 20 nM, mer foretrukket 10 nM, mer foretrukket 5 nM av nevnte molekyl ved 50%, for nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster, er her referert til som antistoffer av oppfinnelsne.

Fortrinnsvis er antistoffene av oppfinnelsen humane antistoffer, mest foretrukket ATN457 antistoffer eller direkte ekvivalenter derav.

Antistofftene av oppfinnelsen blokkerer effektene av IL-17 på dets målceller og er derfor indikart for anvendelse i behandlingen i IL-17 medierte sykdommer og lidelser. Disse og andre farmakologiske aktiviteter av antistoffene av oppfinnelsen kan bli demonstrert i standard testmetoder, f.eks. som bekrevet nedenfor: Nøytralisering av IL-17 avhengig produksjon av interleukin-6 ved primære humane fibroblaster: Produksjonen av IL-6 i primære humane (dermale) fibroblaster er avhengig av IL-17 (Hwang SY et al., (2004) Arthritis Res Ther; 6:rl20-128.

I korthet er humane dermale fibroblaster stimulert med rekombinant IL-17 i nærværet av ulike konsentrasjoner av antistoff av oppfinnelsen eller human IL-17 reseptor med Fc de. Det kimære anti-CD25 antistoffet Sumulect® (basiliksimab) er benyttet som en negativ kontroll. Supernatant er tatt etter 16 timers stimulering og testet for IL-6 ved ELISA. Antistoffer av oppfinnelsen har vanligvis IC50for inhibering av IL-6 i produksjon (i nærvar av 1 nM humant IL-17) på omkring 50 nM eller mindre (f.eks. fra omkring 0,01 til omkring 50 nM) når testet som ovenfor, dvs. nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humane dermale fibroblaster. Fortrinnsvis har antistoffet av oppfinnelsen en IC50for inhibering av IL-6 produksjon som definert ovenfor på omkring 20 nM eller mindre, mer foretrukket omkring 10 nM eller mindre, mer foretrukket omkring 5 nM eller mindre, mer foretrukket omkring 2 nM eller mindre, mer foretrukket omkring 1 nM eller mindre.

Som indikert i testen ovenfor blokkerer antistoffer av oppfinnelsen feltene av IL-17. Følgelig har antistoffene av oppfinnelsen farmasøytisk utnyttelse som følger: Antistoffer av oppfinnelsen er nyttige for profylaksen og behandlingen av IL-17 medierte sykdommer eller medisinske tilstander, f.eks. i inflammatoriske tilstander, allergier og allergiske tilstander, hypersentitivitetsreaksjoenr, autoimmune sykdommer, kraftige infeksjoner, og frastøting av organ eller vevstransplantater.

For eksempel kan antistoffene av oppfinnelsen bli benyttet for behandlingen av mottakere av hjerte, lunger, kombinert hjerte-lunge, lever, nyre, pankreas, hud eller hornhinnetransplantater, som inkluderer frastøtning av allografa eller xenograft, og for forebyggingen av graft-versus-vertsykdom, slik som etter benmargstransplantasjon, og organtransplantasjon assosiert arteriosklerose.

Antistoffer av oppfinnelsen er spesielt nyttig for behandlingen, forebyggingen eller forbedringen av autoimmun sykdom og av inflammatoriske tilstander, spesielt inflammatoriske tilstander med en etiologi som inkluderer en autoimmun komponent slik som artritt (for eksempel reumatoid artritt, artritisk kronika progrediente og artritisk deformans) og reumatiske sykdommer, som inkluderer inflammatoriske tilstander og reumatiske sykdommer som involverer bentap, inflammatorisk smerte, spondyloaropatier som inkluderer ankoliserende spondylitt, Reiter syndrom, reaktiv artritt, psoriasis artritt og entrofatis artritt, hypersensetivitet (som inkluderer både luftveishypersensitivitet og dermal hypersensivitet) og allergier. Spesifikke autoimmune sykdommer hvor antistoffer av oppfinnelsen kan bli benyttet inkluderer autoimmune hematologiske sykdommer (som inkluderer hemolytisk anemi, aplastisk anemi, ren rød celleanemi og idopatisk trombocytopeni), systemisk lupus erytematose, inflammatoriske muskellidelser, polykondrittm skleroderm, Wegener granulomatose, dermatomyositt, kronisk aktiv hepatitt, myastenia gravis, psoriasis, Steven-Johnson syndrom, ideopatisk kl oe, autoimmun inflammatorisk tarmsykdom (som inkluderer ulcerativ kolitt, Crohns sykdom, og irritabelt tarmsyndrom), endokrine oftalmopati, Graves sykdom, sarkoidose, multiple sklerose, primær bilær cirrose, juvenil diabetes (diabetes mellitus type I), uveititt (fremre og bakre) keratokonjunktivititt sicca og vernal keratokonjungtivititt, interstitiell lungefibrose, psoriatosk artritt og glomeruloneptitt (med og uten nefrotisk syndrom, som f.eks. inkluderer idiopatisk nefrotisk syndrom eller minimal endring nefropati) tumorer, multiple sklerose, inflammatorisk sykdom av hud og hornhinne, myositt, tap av benimplantater, metabolske lidelser slik som atherosklerose, diabetes og dislipidemi.

Antistoffer av oppfinnelsen er også nyttige for behandlingen, forebyggingen eller forbedringen av astma, bronkitt, pneumokoniose, pulmonal emfysem og andre obstruktive eller inflammatoriske sykdommer luftveiene.

Antistoffene av oppfinnelsen er nyttige for å behandle uønskede akutte og hyperakutte inflammatoriske reasksjoner som er mediert ved IL-17 eller involverer IL-17 produksjon, eller fremmingen av TNF frigjøring ved IL-17, f.eks. akutte infeksjoner, f.eks. septisk sjokk (f.eks. endotoksisk sjokk og erspiratorisk lidelsessyndrom hos voksne), meningitt, pneumoni; og kraftige brannskader; og for behandlingen av kakesi eller tærende syndrom assosiert med morbid TNF frigjøring, etter infeksjon, kreft eller organdisfusjon, spesielt AIDS-relatert kakesi, f.eks. assosiert med eller følgende HIV infeksjon.

Antistoffer av oppfinnelsen er spesielt nyttig for å behandle sykdommer av benmetabolisme som inkluderer osteoartritt, osteoporose og andre inflammatoriske aitritter, og bentap generelt, som inkluderer aldersrelatert bentap og spesielt periodontal sykdom.

For disse indikasjonene vil selvfølgelig den hensiktsmessige doseringen variere avhengig av for eksempel det bestemte antistoffet av oppfinnelsen som skal bli benyttet, verten, måten av administrasjon og egenskapen og kraftigheten av tilstanden som skal bli behandlet. I profylaktisk anvendelse er imidlertid tilfredsstillende resultater generelt indikert til å bli oppnådd ved doseringer fra omkring 0,05 til omkring 10 mg per kilogram kroppsvekt, mer vanlig fra omkring 0,1 mg til omkring 5 mg per kilogram kroppsvekt. Hyppigheten av dosering for profylaktisk anvendelse vil normalt være i området fra omkring en gang per uke opptil omkring hver 3 måned, mer vanlig i området fra omkring en gang hver 2 uke opptil omkring en gang hver 10 uke, f.eks. en gang hver 4 til 8 uke. Antistoff av oppfinnelsen er bekvemmelig administrert pareneralt, interavenøst, f.eks. inn i antecubital elller annen periferal vene, intramuskulært eller subkutant. En profylaktisk behandling omfatter vanligvis å administrere antistoffet av oppfinnelsen en gang per måned til omkring hver 2 til 3 måned, eller mindre hyppig.

Antistoffene av oppfinnelsen kan bli administrert som den eneste aktive ingrediensen eller sammen med, f.eks. som en adjuvant til eller i kombinasjon med, andre medikamenter, f.eks. immunundertrykkende eller immunmodulerende midler eller andre anti-inflammatoriske midler, f.eks. for behanndlingen eller forebyggingen av sykdommer nevnt ovenfor. For eksempel kan antistoffene av oppfinnelsen bli benyttet i kombinasjon medDMARD, f.eks. gullsalter, supfasalazin, antimalariamedisiner, metotrexat, D-penicillamin, azatioprin, mycofenolsyre, syklosporin A, tacrolimus, sirolimus, minocylclin, leflunomid, gloccorticoider, en calcineurin inhibitor, f.eks. Syklosporin A eller FK 506; en modulator av lymfocytt resirkulering, f.eks. FTY720 og FTY720 analogisk; en mTOR inhibitor, f.eks. rapamycin, 40-O-(2-hydroksyetyl).rapamycin, CCI779, ABT578, AP23573, eller TAFA-93; en ascomycin har immunundetrrykkende egenskaper, f.eks. ABT-281, ASM981, osv.; kortikostereoider, syklo-fos-famid; azatiopren; metotrexat; leflunomid; mizoribin; mykofenolsyre; myko-feno-late-mofetil; 15-eoksyspergualin eller en immunundetrrykkende homolog, analog eller derivat derav; immunundetrrykkende monoklonale antistoffer, f.eks. monoklonale antistoffer til leukocytt reseptorer, f.eks. MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 eller deres ligander; andre immunmodulerende forbindelser, f.eks. et rekombinant bindingsmolekyl som har minst en del av det ekstracellulære domene av CTLA4 eller en mutant derav, f.eks. minst en ekstracellulær del av CTLA4 eller en muntant derav sammenføyd til en ikke-CTLA4 proteinsekvens, f.eks. CTLA4Ig (f.eks. betegnet ATCC 68629) eller en mutant derav, f.eks. LEA29Y; adhesjonsmolekyl inhibitorer, f.eks. LFA-1 antagonister, ICAM-1 eller 3 antagonister, VCAM-4 antagonister eller VLA-4 antagonister; eller et kemoterapeutisk middel, for eksempel paclitaxel, gemcitabin, cisplatinum, doxorubicin eller 5-fluoruracil; anti TNF midler, f.eks. monoklonale antistoffer til TNF, f.eks. infliciman, adalimumab, CDP870 eller reseptorkonstruksjoner til TNF-RI eller TNF-RII, f.eks. etanercept, PEG-TNF-RI; blokkere av proinflammatoriske cytokiner, IL-1 blokkere, f.eks. anakinra eler IL-1 felle, AAL160, ACZ 885, IL-6 blokkere; kemokinblokkere, f.eks. inhibitorer eller aktivatorer av proteaser, f.eks. metalloproteaser, antil-IL-15 antistoffer, anti-IL-6 antistoffer, anti-CD20 antistoffer, NSATDs, slik som aspirin eller et anti-infeksiøst middel (liste ikke begrenset til midlene nevnt).

I overensstemmelse med foregående tilveiebringe den foreliggende oppfinnelsen i et ytterligere aspekt: En fremgangsmåte som definert ovenfor som omfatter ko-administrasjon, f.eks. samtidig eller i sekvens, av en terapeutisk effektiv mengde av et IL-17 bindende molekyl, f.eks. et antistoff av oppfinnelsen, og minst en annen medikamentsubstans, nevnte andre medikamentsubstans er et immunundetrrykkende/immunmodulerende, anti-inflammatorisk kemoterapeutisk eller anit-infeksiøst medikament, f.eks. som indikert ovenfor.

Eller en terapeutisk kombinasjon, f.eks. et kit, som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av a) et IL-17 bindende molekyl, f.eks. et antistoff av oppfinnelsen og b)minst en andre substans valgt fra et immunundetrrykkende/immunmodulerende, anti-inflammatorisk kemoterapeutisk eller anti-infeksiøst medikament, f.eks. som indikert ovenfor. Kitet kan omfatte instruksjoner for dets administrasjon.

Hvor antistoffene av oppfinnelsen er administrert sammen med annen immunundetrrykkende/immunmodulerende, anti-inflammatorisk kemoterapeutisk eller anti-infeksiøs terapi, vil doseringer av den ko-admini streite kombinasjonsforbindelsne selvfølgelig variere avhengig av typen av ko-medikament benyttet, f.eks. hvorvidt det er en DMARD, anti-TNF, IL-1 blokker eller andre, av det spesifikke medikamentet benyttet, av tilstanden tilstanden som skal bli behandlet osv.

Farmasøytiske sammensetninger av oppfinnelsen kan bli fremstilt på konvensjonell måte. En sammensetning i henhold til oppfinnelsen er fortrinnsvis tilveiebrakt i lyofilisert form. For øyeblikkelig administrasjon er den løst opp i en egnet vannholdig bærer, f.eks. sterilt vann for injeksjon eller steril bufret fysiologisk saltoppløsning. Om det er betraktet ønskelig å lage opp en løsning av større volum for administrasjon ved infusjon i stedet for en bolusinjeksjon, er det fordelaktig å inkorporere humant serum albumin eller pasientens eget heparinserte blod i saltoppløsningen ved tidspunktet av formulering. Alternativt er formuleringen i et subkutan. Tilstedeværelsen av et overskudd av slikt fysiologisk inert protein forebygger tap av antistoff av adsorpsjon til veggene av beholderen og slanger benyttet med infusjonsløsningen. Om albumin er benyttet er en egnet konsentrasjon fra 0,5 til 4,5% ved vekt av saltløsningen. Andre formuleringer omfatter flytende eller lyofilisert formulering.

Oppfinnnelsen er videre beskrevet ved illustrasjon i de følgende eksemplene.

EKSEMPLER

Transgene mus konstruert til å uttrykke det humane IgG/x, repertoaret i stedet for det murine immunglobulinreportoaret (Fishwild et al., 1996, NatBiotechnol., 14, 845-851) er brukt for å generere antistoffer til humant IL-17. B-celler fra disse musene er immortalisert ved standard hybridomteknologj og murine hybridomceller er oppnådd som skiller ut det humane IgG/x, antistoffet AIN547.

Eksempel 1: Generering av hybridomen, rensing av antistoffene, seleksjon av AIN457 antistoff

Produksjon av rekombinant humant IL-17 (huIL-17); Rekombinant huIL-17 er enten produsert i E.coli i inklusjonsbodier og refoldet ved konvensjonelle teknikker (produsert på stedet bærerfritt) (E.coli: Novartis Pharma, batch BM-E3141/98) eller kjøpt (bærerfri, E.colo; R&D Systems #317-IL/CF)) eller som skilt ut og delvis glykosylert protein i HEK.EBNA (rekombinant huIL-17, bærerfritt (IL-17 APP-C6 fra transfekterte HEK/EBNA celler; Novartid Pharma, batch EN.E-338/82; 0,28 mg/ml; rekombinant huIL-17, bærerfritt (IL-17 APP-C4 fra transferterte HEK/EBNA celler; Novartid Pharma, batch EN.E-3382/93; 0,29 mg/ml )). Den sistenevnte formen viser en C-terminal 4 aminosyreforl engel se for rask rensing fra dyrkningssupernatanter ved immunaffinitets kromatorgrafi. I dette tilfellet er dyrkningsupernatanter lastet på en kolonne av hensiktsmessig størrelse av et spesifikt immobilisert anti-tag antistoff koblet til CNBr aktivert sefarose 4B ved en tetthet på 10 mg/ml resin ved å følge produsentens instruksjoner (Pharmacia). Etter basal vasking med PBS, er bundet huIL-17 eluert med 100 mM glysin, pH 2,7 og øyeblikkelig nøytralisert med fortynnet NaOH.

Kobling av huIL-17 til Keyhole Limpet Hempcyanin (KLH); HuIL-17 produsert i enten E.coli eller HEK.EBNA er koblet til KLH på forhånd aktivert med et overskudd av den homobifunksjonelle kryssforbinderen disuksinimidyl suberat (DSS). I korthet er 20 mg lyofilisert Imject® Mariculture KLH (Pierce # 77600) rekondisjonert med 2 ml H20 doe å få en 10 mg/ml lødninh inneholdende fosfatbufret saltoppløsning (PBS), pH 7,2. Til denne løsningen er 400 ul av 250 mM DSS i dimetyl sulfoksid (DMSO) tilsatt og blanding omrørt i omkring 1 time ved romtemperatur (ikke all reagens oppløst og noe presipitat dannet). Etter en kort sentrifugering og filtrering (0,45 um) er løsningen så avsaltet på sephadex G25 fin (Pharmacia) i PBS (strømningshastighet 2 ml/min.) som gir omkring 11 mg aktivert KLH ved 1,5 mg/ml (Bradford). 1 ml av aktivert KLH (1,5 mg) er blandet med 1 ml av en 9 mg/ml løsning i vann av lyofiliser E.coli derivert huIL-17 (batch BM-E3141/98). Løsningen forblir klar og er inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Konsentrasjonen av det resulterende kompelset er 1,4 mg/ml (målt ved Badford). 1 ml av aktivert KLH (1,5 mg) er blandet med 1 ml av HEK-EBNA og huIL-17 (omkring 3 mg i vann; batch En.E-3382/83). Løsningen forplir klar og er inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Konsentrasjon (Bradford) er 2,9 mg/ml.

Immunisering: Den genetisk konstruerte musen 27340 (hunn; MEDAREX Inc, Annandale, NJ) hvor de murine immunglobulin variabel og konstant del gene er funksjonelt erstattet ved deres humane motstykke (Genotype Tg kode 221100-TgH (CDM)++; TgN(Hco7)11952+; TgH(JKD)++; TgN(KC05)9572+ (se også Sherie L. Morrison 1994, Nature, årgang 368, side 812.813; Nils Lonberg et al., 1994, Nature, årgang 368, side 856-859) er immunisert ved å følge skjema rapportert i tabell 1.

Serumprøver er oppnådd 35 og 99 dager etter starten av immuniseringsprotokollen, for å måle nivåer av anti-huIL-17 antistoff ved enzymforbundet immunosorbent test

(ELISA).

Generering av hybridomer: På dag 120 er mus 27340 avlivet ved CO2inhalering. Totale miltceller (1 x IO8) er fusjonert med PAI-0 celler (5 x IO7 celler) ved å benytte PEG 4000. Fusjonerte celler er platet ut i 720 brønner (1 ml/brønn), inneholdende et feederlag av museperitoniale celler (Balb/c mus) i HAT medum (PRMI1640 inneholdende 2 g/g natriumbikarbonat, 5 x 10"<5>M P-merkaptoetanol, IO"<4>hyposantin, 1,6 x 10"<5>M tymidin 4 x IO"<7>M aminopterin, 10% varmeinaktivert FCS og 50 ug/ml gentamycin). Ved dag 14 er HAT medium byttet med HT medium, dvs. HAT medium uten aminopterin. Screening starter på dag 10 og varer i 2 uker. Av de intielle 720 brønnene platet er 684 brønner (95%) positive for hybdrom vekst. Supernatanter er samlet og screenet for huIL-17 reaktivt MAb i ELISA ved å benytte både E.coli og HEK/EBNA derivert huIL-17. Femtito primære brønner scoret positive for nærværet av anit-huIL-17 antistoffer. Tjueåtte hybridomer er kloent og de gjenværende er frosset. Kloning er gjort i 4 x 96 brønners mikrotiterplater i HT medium og et feederlag av museperitonale celler. Hybridomer er platet ved 0,5 celler/100 ul per brønner. Brønner er screenet mikroskopisk for vekst og positive er gitt 100 ul av HT medium. Den påfølgende dagen er supernatanter testet for anti stoffproduksjon i en huIL-17 spesifikk ELISA. Ved kloning beholder hovedandelen av de klonede hybridomene kapasiteten til å skille ut anti-huIL-17 spesifikt monoklonalt antistoff (MAb).

Produksjon og rensing av antistoff: De selekterte klonene er overført til serumfritt medium (5 ml) i 25 cm<2>TC (TC: celledyrkning) flasker. Hybridomer er progressivt ekspandert i serumfritt medium 75 cm<2>TC flasker og rulleflasker. Alle de forskjellige anit-huIL-17 MAb som inkluderer NVP-AIN457-NX (340-110-28 dvs. musenummer-hybridomnummer-klonnummer) er renset ved protein A affinitetskromatografi. Dyrkningssupernatanter er juster til pH 7,3 og lastet på en kolonne av hensiktsmessig størrelse av protein A sefarose 4 fast flow (Pharmacia). Etter basal vasking med 100 mM fosfatbuffer, pH 7,3 er bundede antistoffer eluert med 50 mM sitrat, pH 2,7, 140 mM NaCl. Den eluerte fraksjonen er øyeblikkelig nøytralisert (pH 7,0) og sterilfiltrert. Proteinkonsentrasjon er bestemt ved absorpsjon ved 280 nm ved å benytte en faktor på 1,35 absorpsjonsenhet (AU)/mg.

Inhibitorisk aktivitet av anti-huIL-17 Mab på IL-6 produksjon indusert ved huIL-17 i humane dermale fibroblaster: Humane dermale fibroblaster er dyrket i FBM supplementert med 2% FCS, insulin (5 ug/ml) huFGF-basisk (0,1 ug/ml) og gentamycin (50 ug/ml). Fibroblastene er løsnet fra plastikken ved å benytte en trypsin/EDTA løsnng. Fibroblaster er distribuert til 96-brønner mikrotiterplater med en tetthet på 1 x IO4 celler/brønn i FBM supplementert med 1% FSC. Fibroblaster er tillatt å feste seg til platene over natt. Den neste morgenen er medium fjernet og frist FBM supplementert med 1% FCS, hulIL-17 (forskjellige konsentrasjoner varierende fra 30 til 500 ng/ml) og hybridomsupernatanter (1/5 endelig fortynning) eller rensede antistoffer er tilsatt til et endelig volum på 200 ul. Dyrningssupernatanter er samlet etter en inkubering på 24 timer og huIL-6 produksjon er målt ved ELISA.

Elisa for deteksjon av anti-huIL-17 antistoffer: ELISA mikrotiterplater er belagt med rekombinant huIL-17 (100 ul/brønn ved 3 ug/ml: batch BM-E3141/98 eller En.E-3382/82) i PBS med 0,02% NaN3og inkubert over natt ved romtemperatur. Den påfølgende dagen er mikrotiterplater blokkert med en 300 ul av PBS/2% BSA/0,02% NaN3i 2 timer ved 37°C. Plater er så vasket 4 ganger med PBS/0,05% Tween20/0,2% NaN3. Serumfortynninger av muse 27340 (endelig fortyningsområde ved dag 35: 1/100 til 1/3.200; endelig fortynningsområde ved dag 99: 1/200 til 1/1.2.800; 100 ul/brønn) eller dyrkningssupernatanter av hybridomer (endelig fortynning 1;3; 100 ul/brønn) er tilsatt. Etter en overnatts inkubering ved romtemperatur er plater vasket 4 ganger med PBS/0,0,05% Tween 20/ 0,02% NaN3. Et biotinkonjugert must anti-hu-IgG, Fc fragment spesifikt antistoff er tilsatt ved en endelig fortynning av 1/20.000 (100 ul/brønn). Prøver er latt reagere i 4 timer ved romtemperatur. Etter vaskingen (4 ganger) er alkalisk fosfatasekonjugert stretavidin tilsatt ved en endelig fortynning av 1/8.000 ( 100 ul/brønn). Etter 40 min. ved romtemperatur er plater vasket igjen 4 ganger og substratet (p-nitrofenylfosfat i dietylaminobuffer pj 9,8; 150 ul/brønn) er tilsatt. Plater er lest etter 30 eller 45 min. avhengig av utviklingen av reaksjonen i en mikrotiterleser (Bio-Rad) ved å benytte filtret på 405 og 490 nm.

ELISA for deteksjon av antistoff isotype: For å avsløre isotypen av MaB, er dyrkningssupernatanter (100 ul; endelig fortynning 1/5) tilsatt til brønnene av mikrotiterplater belagt med huIL-17 (se ovenfor) og inkubert over natt ved romtemperatur. Etter vasking (4 ganger9 er 100 ul/brønn av biotinkonjugerte muse MAb anti-human igGl (endelig fortynning 1/1.000), IgG2 (endelig fortynning 1/1.000) IgG3 (endelig fortynnin 1/1.000), IgG4 (endelig fortynning 1/2.000) eller antihuman%lett kjede (endelig fortynning 1/1.000) tilsatt i 4 timer ved romtemperatur. Som en kontroll er et biotinkonjugert rotte anti-mus XI og X2 lett kjede spesifikt MAb benyttet (endelig fortynning 1/1.000). Dette er fullt som tidligere beskrevet ved vasking og tilsetting av alalisk fosfatasekonjugert streptavidin (100 ul; endelig fortynning 1/8.000). Etter vasking (4 ganger) er substratet (p-nitrofenyfosfat i dietylaminobuffer; 100 ul) tilsatt. Plater er lest etter 30 eller 45 min. avhengig av utvikling av reaksjon i en mikrotiterleser (Bio-Rad) ved å benytte filtre på 405 og 490 mm.

ELISA for deteksjon av huIL-6 produksjon: ELISA mikrotiterplater er belagt med anti-huIL-6 muse MAb (MAB 206 fra R&D system; 100 ul/brønn ved 4 ug/ml) i PBS med 0,02% NaN3og inkubert over natt ved romtemperatur. Den påfølgende dagen ble mikrotiterplater blokkert med 300 ul av PBS/ 2% BSA/ 0,02% NaN3i 3 timer ved 37°C. Plater ble så vasket 4 ganger med PBS/ 0,05% Tween 20/ 0,02% NaN3. Dyrkningssupernatanter av humane dermale fibroblaster (endelig fortynning 1:3; 100 ul/brønn) ble tilsatt. For å etablere en titreringskurve er huIL6 (100 ul/brønn) titrert fra 400 pg/ml til 3,1 pg/ml i 1:2 fortynningstrinn. Etter en over natts inkubering ved romtemperatur er plater vasket 4 ganger med PBS/ 0,05% Tween 20/ 0,02% NaN3. et biotinkonjugert geit anti-huIL-6 antistoff (BAP206; R&D Systems) er tilsatt (25 ng/ml; 100 ul/brønn) . Prøver er latt reagere i 4 timer ved romtempertur. Etter vasking (4 ganger) er alkalisk fofatasekonjugert streptavidin tilsatt ved en endelig fortynning av 1/8.000 (100 ul/brønn). Etter 40 min. ved romtemperatur er plater vasket igjen 4 ganger og substratet (p-nitrofenylfosfat i dietylaminobufffer pH 9,8; 150 ul/brønn) er tilsatt. Plater er lest etter 30 min. i en mikrotiterleser (Bio-Rad) ved å benytte filtre på 405 og 490 nM.

Kalkulasjoner: Verdier er rapportert som opprinnelige O.D. verdier eller som % inhibering kalkulert ved hjelp av duplikate verdier. Ytterligere data er rapportert som middelverdier ± SEM. En huIL-6 standardkurve ble benyttet for å måle huIL-6 konsentrasjon av dyrkningssupernatanter ved å benytte en kubikk kurvetilpasning.

Resultater

Serumtitere fra mus 27340:

Serumet fra mus 27340 er analysert i et ELISA for nærværet av anti-huIL-17 antistoffer på dager 35 og 99 på to forskjellige preparater av huIL-17 (tabell 2). Resultater viser at serumtitere av must 27340 øker omkring fire ganger mellom dag 35 og dag 99 og at begge huIL-17 preparater er gjenkjent.

Binding i ELISA av hybridomsupernatanter: 684 supernatanter er testet i ELISA for nærværet av anti-huIL-17 antistoffer, ved å benytte to preparater av rekombinant huIL-17, den første fra E.coli (BM-E3141/98) og den sistnevnte fra HEK/EBNA celler (EN.E-3382/82). Femtito supernatanter scoret positive for nærværet av anti-huIL-17 antistoffer (tabell 3). Preferensiell binding til det ene eller det andre preparatet av huIL-17 er observert i noen få tilfeller. De 28 hybridomene som deretter er klonet er understreket.

Binding i ELISA av dyrkningssupernatanter av hybridomklonene: Reaktiviteten i ELISA av supernatantene av klonene fra de 11 hybridomene, som beholdt den beste produksjonen av anti-huIL-17 MAb, er vist i tabell 4. Klonene, understreket i uthevet tekst, er valgt for å produsere tilnærmet 1 liter av supernatant i rulleflasker for rensing og analyse av antistoffene. Med unntak av klonene derivert fra hybridomen nr. 5, som produserte et huIgG3x antistoff, produserte alle de andre klonene huIgGlx MAb, som fastsatt ved isotypespesifikke monoklonale antistoffer.

Mikrotiterplater er belagt med rekombinant huIL-17 (3 ug/ml) fra HEK/EBNA celler (En.E-3382/82)-

Nøytraliserende aktivitet av dyrkningsupernantanter: Dyrkningssupernatanter er testet for inhibering av huIL-6 produksjon ved humane dermale fibroblaster stimulert med rekombinant huIL-17. Som vist i tabell 5 viser flesteparten av dyrkningssupernatantene inhibitorisk aktivitet.

Nøytraliserende aktivitet av AIN45: Valg av klon 110-28 for produksjonen av utviklingskandidat AIN457 (foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen) er basert på nøytraliserende aktivitet og affinitetsmåling på BIACORE 2000 av de rensede antistoffer (se eksempel 2 nedenfor)

Eksempel 2: AIN457 binder med veldig høy affinitet til rekombinant humant IL-17 (huIL-17); KDer 122 ± 22 pM (BIAcore) og nøytraliserer humant IL-6 produksjon indusert ved huIL-17 i humane dermale fibroblaster; IC50er 2,1 ± 0,1 nM ved en konsentrasjon på 1,87 nM huIL-17.

a) Fremgangsmåter

Reagenser: Generelle laboratoriereagenser er innkjøpt fra Merck eller Sigma og er av

den høyeste renhetsgraden tilgjengelig; kildene av spesielle regenser er detaljert beskrevet nedenfor.

Proteiner: Monoklonale antistoffer er generert ved å immunisere MEDAREX transgene mus med rekombinant humant IL-17, og så følge standard prosedyren for å produsere cellelinjer, hvorfra det utskilte materialet kan bli renset ved protein A sefarose kromatografi (hovedsakelig som beskrevet i eksempel 1). ATN 457 er lagret som en sterilfiltrert løsning i 50 mM Na-citrat, pH 7,0 140 mM NaCl ved 4°C. Rekombinant humant ATN 457 (batch KB03303A) er oppnådd i steril stamløsning av enten 20 mM NA-citrat/40 mM fosfatbuffer, pH 7, 150 mM NaCl eller 20 mM eddiksyre pH 5,0 justert med IM Tris-base. Konsentrasjoner er vanligvis i området av 2 mg/ml og fortynnet til en endelig konsentrasjon på 5 ug/ml i BIA buffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 med mer NaCl, 0,05 volum-% Tween 20) for Biacore eksperimentene. Rekombinant humant IL-17 er produsert på stedet; batch EN/E 3882/83; 0,29 mg/ml.

BIAcore målinger

Bestemmelse av kinetiske bindingsparametere og nivåer av kryssreaktivitet er gjort ved overflate plasmonresonansmålinger ved å benytte den optiske biosensoren BIAcore 2000 (BIAcore AB, Upsala, Sverige, se Lit. HS 1,2 for detaljer). Denne teknologien tillater for den merkings-fire bestemmelsen av de mikroskopiske hastighetskonstantene for binding (kon) og dissosiasjon (koff) av en ligant til en reseptor. Den er derfor spesielt egnet for å karakterisere antistoff/antigen intraksj onene. Denne teknologien kompiementerer og er på mange måter overlegen i forhold til ELISA målinger (Van Regenmortel, Dev Biol (Basel). 2003;112:141-51). Bindingsstudier av rekombinant IL-17 til IL-17 antistoffet AIN457 er utført på to måter. I standardprotokollen er AIN457 fanget ved et anti-humant Fcy antistoff (Jackson Immunochemicals; katalognr. 109-005-098) som tidligere er immbobilisert på en CM-5 BIAcore sensor chip (forskningsgrad). Kovalent binding av Fcy fangende antistoff er gjort med "aminkoblingskitet" tilveiebrakt ved BIAcore (BIAcore, kat.nr. BR-1000-50). Vanligvis er 3000 RU av fangende antistoff festet til den aktiverte dekstranoverflaten med en 30 ug/ml anti Fcy antistoffløsning i 10 mM Ac buffer, pH 4,5 ved en strømningshastighet på 5 ml/min. som fører til omtrentlig 250 RU av ATN 547 immobilisering. Som en retningslinje korresponderer 1.000 RU til en masseoverføring på 1 ng/mm<2>. Alternativt er IL-17 (avsnitt 3,2; tabell 4), ATN 457 antistoff koblet direkte til chip overflaten uten fangende antistoff. Resultatene er sammenlinket med protokollen beskrevet i tabell 9 (se nedenfor).

b) Resultater

Bindingskinetikk for IL-17/AIN457 komplekset

Likevektsdissosiasjonskonstanten KDtillater noen bedømmelse omkring stabiliteten av komplekser, med en gang dannet in vivo. Vi har derfor bestemt kinetiske konstanter for bindingen av humant IL-17 til det immobiliserte ATN458 antistoffet, og har derivert KDfor prosessen fra disse dataene. Tabell 3 viser oppsummeringen av data oppnådd når kurvene av to eksperimenter er tilpasset Langmur modellen ved å benytte BIAevaluation 3.0 programvaren. Selv om antistoffet selvfølgelig er bivalent, kan bindingen bli behandlet som en 1:1 begivenhet, med individuelle antistoffbindende seter presentert ved overflaten som blir okkupert ved monomere IL-17 molekyler. Dette eksperimentet viser både den ekstremt raske assosiasjonskinetikken så vel som den veldig sakte disassosiasjonskinetikken av antistoff-kjemokinkomplekset. Den beste datatilpasningen er oppnådd når sensogrammene er behandlet individuelt (i stedet for globalt, som er antydet i BIAevaluation), Etter kombinering av titreringsseriene oppnådde vi på denne måten gjennomsnittlige verdier fra 12 sensorgrammer av kon =

(4,1 ± 0,1) xlO<5>l/M s; koff = (3,8 ± 0,5) xlO"4 l/s; og for KD0 122 ± 22 pM.

Middelverdi KDkalkulert fra individuelle noteringer (vertikalt), i stedet for å benytte ligningen KD=koff/kon-

For AIN457 produsert i rekombinante celler (KB03303A) er affinitetsmålinger utført for IL-17 cytokinene fra henholdsvis menneske, silkeape, rhesus og cynomolog ape. Eksperimentelle detaljer av Biacore målingene er de samme som beskrevet ovenfor for MABl 10-28 antistoff. To uavhengige kjøringer som tester 6 IL-17 konsentrasjoner i hver kjøring er utført. Konsentrasjoner av humant IL-17 er 2, 4, 8, 12, 16, 20 nM og 10, 20, 30, 40, 50, 60 nM for alle andre arter. Fullstendig dataanalyse gir n = 12 individuelle målinger for hver IL-17 art. KDså vel som SEM er rapportert

Et fullstendig sett av data for BIAcore analysen for antistoff KB03303A med kon, koff og KDog de respektive IL-17 artene er gitt nedenfor i tabeller 5 til 8.

Deretter er inhibitorisk aktivitet av renset AIN457 (Batch EN/E-10333/53; 0,54 mg/ml) på huIL-17 evaluert. IC50verdier er vist i tabell 6.1 disse eksperimentene er huIL-17 R/Fc og et mus anti-huIL-17 MAb inkludert som positive kontroller og Simulect som negativ kontroll.

Middelverdier og SEM er kalkulert fra tre forskjellige og uavhengige eksperimenter.

I konklusjon opphever ATN457 den IL-17 avhengige sekresjonen av huIL-6 ved humane dermale fibroblaster. Kraften er sammenliknbar med den av huIL-17R/Fc og overlegen i forhold til den av kommersielt tilgjengelig mus anti-huIL-17 MAb. Det er interessant å notere at en mer fullstendig inhibering er observert ved ATN457 enn med IL-17R/Fc.

Eksempel 3: Renhet og partielle aminosyresekvenser av tung og lett kjede aminosyresekventering

Amino-terminale aminosyresekvenser av Vl og Vh regioner: De første 48 aminosyreresiduene av den tunge og lette kjeden fro to anti-IL-17A antistoffer, klon 110-7 (se tabell 4) og 110-28 (se tabell 4), er bestemt ved Edmand degradering. Aminosyresekvensen er identisk for begge klonene. GeneBank er søkt ved blastanalyse og den mest homologe DNA sekvensen funnet er benyttet for å designe kl oningsprimerne.

Molekylær kloning av Vlog Vh regionene: Total RNA er preparert fra 2 x IO<7>hybridomceller (klon 110-7, klon 110-28) med RNeasy Midi Kit i henhold til

produsentens protokoll (Quagen Hilden Tyskland). Total RNA er eluert i 200 ul RNase-fritt vann og lagret ved -80°C. Første tråd cDNA syntesen er utført med M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI), oligo dT-primer, PCR nukleotidmiks (dNTP) og RNAsin inhibitor (Roche, Mannheim). Fem ug av total RNA er blandet med 1 ul oligo-dT primer (0,5 ug/ul), og RNase-frittvann er tilsatt til et endeliv volum på 36 ul. Blandingen er inkubert ved 70°C i 10 min. og så lagret på is. Mens på is er følgende reagensene tilsatt: 10 ul 5 x RT buffer, 2 ul dNTP (lOmM hver)2 ul RNasin og 1 ul M-MLV reverst transkriptase. Reaksjonen er utført ved 42°C i 1 time.

PCR reaksjonen er samlet ved å benytte 4 ul av cDNA templat, 2 ul av hver primer ved 10 uM hver, (se nedenfor og tabeller 10 og 11 for oversikt), 20 ul av 2 x Qiamix (inneholdende buffer, dNTP TAQpolymerase) og 1 ul av Pwo DNA polymerase i et totalt volum på 40 ul. PCR forholdene er satt til 35 sykluser av 94°C i 15 sek., 55°C i 20 sek. og 72°C i 30 sek. PCR produktet er subklonet inn i pCR4-TOPO-Zero (Stragagene, La jolla Ca.) kloningsvektoren. Flere kloner er plukket fra hver reaksjon og nukleotidsekvensen bestemt ved Solvias AG (Basel), ved å benytte primerne MV432 (SEQ ID nr: 21), MV433 (SEQ ID nr. 22), MV434 (SEQ ID nr: 23), MV435 (SEQ ID nr. 14) og standard primere i vektor DNA.

cDNA kodende for den tunge kjeden er amplifisert ved å benytte primerparene MV416 (SEQ ID nr. 15)/#265 (SEQ ID nr. 16) og MV413 (SEQ ID nr. 17)/#265 (SEQ ID nr 16).

Primerne dekker nukleotidsekvensene som korresponderer til de følgende aminosyreposisjonene av den tunge kjeden: MV416 posisjon -19/-13 (signalpeptid); MV418 posisjon +1/+7; #265 posisjon +253/+259. Posisjon +1 er den første aminosyren av det modne proteinet.

cDNA som koder for den lette kejden er amplifisert ved å benytte primerparene MV417 (SEQ ID nr. 18)/#223 (SEQ ID nr. 19) og MV419 (SEQ ID nr. 20)/#223 (SEQ ID nr. 19). Primerne dekker nukleotidssekvensene som korresponderer til de følgende aminosyreposi sjonene av den lette kjeden: MV417 posisjon -20/-14 (signalpeptid); MV419 posisjon +1/+7; #223 posisjon +210/+215. Denen fremgangsmåten tillater å lage to uavhengige PCR amplifiseringer for hver immunglobulinkjede, som resultereri to uavhengig etablerte DNA sekvenser.

Resultater og diskusjon

De klonede PCR produktene som kode fro den tunge og lette kjeden fra to hybridomer (110-7 og 110-28, se tabell 4 ovenfor) erkarakterisert vedDNA sekventering. Fem av seks uavhengige sekvenser er benyttet for å samle lett og tung kjedesekvensene. Lett kjede cDNA er alle identiske og deker den fullstendige kodende sekvensen (aminosyreposisjon -20 til +215). Tung kjede cDNA har to forskjellige feiltilpasninger i et cDNA hver. Disse er ekskludert fra den endelige sekvensen, som strekker seg fra startcdoene til slutten av henglseregionen etter det konstante domene 1 (aminosyreposisjon -19 til +238). Sekvensene for begge hybridomene er identiske. cDNA oppnådd fra hybridom 110-28 er valgt og brukt i det videre. SEQ ID nr. 7 (cDNA av høy kjede av AIN457), SEQ ID nr. 8 (aminosyresekvens av tung jkede av ATN457), SEQ ID nr. 9 (cDNA av lett kjede av AIN457) og SEQ ID nr. 10 (aminosyresekvens av AIN457) viser DNA sekvensen som kode for den lette og tunge kjeden av ATN457, sammen med proteinsekvensen og posisjonen av primerne benyttet for PCR amplifitering og DNA sekvensering. DNA sekvensene har blitt registrert i PlasNova, adgangsnr. NPL003689 for den tunge kjeden og adgangsnr NPL003690 for den lette kjeden.

Aminosyresekvensen funnet ved cDNA kloning er identisk til den tidligere oppnådd ved Edman degradering av de rensede immunglobulin tunge og lette kjedene, som indikerer at det korrekte cDNA har blitt klonet.

Eksempel 4: Tredimensjonal struktur av Fab fragmentet av det antihumane IL-17A monoklonale antistoffet AIN 457

Fore å bestemme konformasjonen av de kompiementaritet-bestemmende regionene (CDR) og strukturen av det antigen-bindende sete av ATN457, er Fab fragmentet generert, krystallisert og dets røntgenstruktur er bestemt ved protein krystallografi.

Fremgangsmåte: Fab fragmentet av NVP-AIN457 er produsert ved papinkløving fra det fullstendige antistoffet og renset ved protein A kromatografi etterfulgt med størrelses-eksklusjons kromatografi Det rensede materialet er så konsentrert ved ultrafiltrering til 20 mg/ml i 10 mM Tris-HCl pH 7,24, 25 mM NaCl, 5 mM TCEP. Krystallet er dyrket ved teknikken av dampdiffusjon i hengende dråper ved 19°C, fra 2,0 M ammoniumsulfat, 5% PEG 400, 0,2 M Na MES pH 6,5. Det er i romgruppe P2i2i2imed enhet celledimensjoner a=90,3Å, b=106,7Å, c=131,4Å og 2 Fab molekyler per assymetriske enhet. Før samling av røntgendata er en enkel krystall av ATN457 Fab kryssforbundet med glutaraldehyd ved å benytte fremgangsmåten til Lusty (J. Appl. Cryst. (1999) 32, 106-112) og så overført til en løsning inneholdende 2,0M Li2S04,2%PEG 400 og 0,1 M Na Mes pH 6,5. Krystallet er deretter montert i en cryo-sløyfe og raskt frosset fro samling av data ved 95M. 180 diffraksjonsbilder korresponderende til l,0deg oscillasjon hver er registrert. Diffraksjonsdataene er prosessert med HKL programpakken. Strukturen er bestemt til 2,5Å oppløsning ved molekylær erstatning. Strukturen er så forfinet ved torsjonsvinj el dynamikk og energiminimalisering ved å benytte programmet CNX.

Resultater: To AIN457 Fab molekyler er presentert i den assymetriske enheten av krystaller, med H-CDR3 sløyfen ved begge Fab molekyler involvert i protein-protein kontakter til H-CDR3 sløyfen av symmetri-relaterte Fab. De to Fab molekylene viser forskjellige albuevinkler, men har ellers hovedsakelig identiske CDR sløyfekonformasjoner (se tabell 12 for aminosyresekvens av CDR sløyfene). H.CDR1 sløyfen adopterer den forventede Hl:l kanoniske strukturen, mens konformasjonen av H-CDR2 sløyfen matcher den av kanonisk struktur H2:3 A. H-CDR3 sløyfen av ATN457 antistoffet er eksepsjonelt lang, som omfatter 18 residuer mellom Kabat posisjon 94 (Arg H98) og 101 (Asp Hl 15). Det viser den typiske utbulede torsostrukturen stabilisert ved en saltbro mellom Arg sidekjeden i posisjon 94 (ArgH98) og Asp karboksylatgruppen i posisjon Hl01 (Asp Hl 15), og ved en H-bundet interaksjon mellom sidekjeden av Trp Hl 17 og hovedkjede karbonylgrupen av Phe Hl 14. Hodet av H-CDR3 sløyfen har strukturen av en lang, tvunnet beta-hårnål med en andre beta-bulk ved dens base og en type F beta-dreining ved dens toppunkt. En påfallende egenskap av ATN457 H-CDR3 sløyfen er dens veldig høye innhold i aromatiske residuer: 6 tyrosiner, 2 tryptofaner, 1 fenylalanuin. Siden alle andre CDR sløyfer bidrar til 1 mer tyrosin hver, har det antigen-kombinerende setet av ATN457 11 tyrosiner totalt. Konformasjonene av L-CDR1 og L-CDR2 sløyfene korresponderer til henholdsvis kanoniske strukturer LI :6 og L2:1.1 motsetning til H-CDR3 er L-CDR3 sløyfen kort (6 residuer) og viser at den alminnelige observerte kanoniske strukturen L3:l med en cis-prolin ved dens tupp (Pro L96), en glutamin ved Kabat posisjon 90 (Gin L91) og en treonin ved Kabat posisjon 97(Thr L98). Imidlertid er et veldig uvanlig moment av AEST457 L-CDR3 sløyfen nærværet av cysteinresididue etter cis-prolinet (Cys L97). Sidekjeden av Cys L97 er ved bunnen av en grunn fordypning lokaliset ved Vl-Vrgrenseflaten og kledd ved residuet Trp H 112, Trp H47 og TY L92.

Tabell 1: Aminosyresekvenser av de hypervariable regionene av ArN457 monoklonale antistoffene, basert på Kabat definisjonen og som bestemt ved røntgenanalyse, ved å benytte fremgangsmåten til Chotia og medarbeidere. Aminosyre er del av CDR sløyfene, mens dem vist i vanlig type er del av antistoff rammeverket.

Claims

1. IL-17 bindende molekyl, karakterisert ved at det er i stand til å inhibere aktiviteten av 1 nM humant IL-17 ved en konsentrasjon på mindre enn 5 nM ved 50%, nevnte inhibitoriske aktivitet er målt på IL-6 produksjon indusert ved hu-IL-17 i humande dermale fibroblaster.

2. IL-17 bindende molekyl, som omfatter både tung (Vh ) og lett kjede (Vl ) variable domener; karakterisert ved at nevnte IL-17 bindende molekyl omfatter minst et antigen-bindende sete som omfatter: a) et immunglobulin tung jkede variabelt domene (Vh ) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1, CDR2 og CDR3, nevnte CDR1 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 1, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 2, og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen SEG ID nr. 3 deiler direkte CDR ekvivalenter derav; og b) et immunglobulin lettkjede variabelt domene (Vl ) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1', CDR2' og CDR3', nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 4, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5 og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 6 eller direkte CDR'ekvivalenter derav.

3. IL-17 bindende molekyl som omfatter både tung (Vh ) og lett kjede (Vl ) variable domener; karakterisert ved at nevnte IL-17 bindende molekyl omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter: a) et immunglobulin tung kjede variabelt domene (Vh ) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDRl-x, CDR2-X og CDR3-X, nevnte CDRl-x har aminosyresekvensen SEG ID nr. 11, nevnte CDR2-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 12 og nevnte CDR3-X har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 13 eller direkte CDR-x ekvivalenter derav; og b) et immunglobulin lett kjede variabelt domene (Vl ) som omfatter i sekvens hypervariable regioner CDR1', CDR2' og CDR3', nevnte CDR1' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 4, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 5 og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen SEQ ID nr. 6 el eir direkte CDR1' ekvivalenter derav.

4. IL-17 bindende molekylet i henhold til krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at det er et humant antistoff.

5. IL-17 bindende molekyl karakterisert ved at det omfatter minst et antigenbindende sete som omfatter enten et første domene som har en aminosyresekvens hovedsakelig homolog til den vist i SEQ ID nr. 8 som starter med aminosyre ved posisjon 1 og slutter med aminosyre ved posisjon 127 eller et første domene som beskrevet ovenfor og et andre domene som har en aminosyresekvens hovedsakelige homolog til den vist i SEQ ID nr. 10, som starter med aminosyre ved posisjon 1 og slutter med aminosyre ved posisjon 109.

6. DNA konstruksjon, karakterisert ved at den koder for et IL-17 bindende molekyl i henhold til ethver av kravene 1 til 5.

7. DNA konstruksjon, karakterisert ved at den omfatter et DNA molekyl som er hovedsakelig homolog til enten SEQ ID nr. 7 eller en direkte DNAH ekvivalent derav eller SEQ ID nr. 9 eller en direkte DNAL ekvivalent derav.

8. DNA konstruksjon, karakterisert ved at den omfatter to DNA molekyler hvor et er hovedsakelige homolog til SEQ ID nr. 7 eller en direkte DNAH ekvivalent derav og den andre hovedsakelig homolog til SEQ ID nr. 9 eller en direkte DNAL ekvivalent derav.

9. Ekspresjonsvektor i stand til å replikere i en prokaryot eller eukaryot cellelinje, karakterisert ved at den omfatter minst en DNA konstruksjon i henhold til krav 6, 7 eller 8.

10. Fremgangsmåte for produksjonen av et IL-17 bindende molekyl, karakterisert ved at den omfatter (i) dyrke en organisme som er transformert med en ekspresjonsvektor i henhold til krav 9 og (ii) utvinne IL-17 bindende molekylet fra kulturen.

11. Anvendelsen av et IL-17 bindende molekyl i henhold til krav 1 til 5 for fremstillingen av et medikament.

12. Anvendelsen av et IL-17 bindende molekyl i henhold til krav 1 til 5, for fremstillingen av medikament for behandlingen av en IL-17 mediert sykdom eller lidelse.

13. Anvendelsen av et IL-17 bindende molekyl i henhold til krav 1 til 5, for behandlingen av osteoartritt, reumatoid artritt osteoporose og andre inflammatoriske artritter.

14. Fremgangsmåte for behandlingen av en IL-17 mediert sykdom eller lidelse i en pasient med behov derav, karakterisert ved at den omfatter å administrere til pasienten en effektiv mengde av et IL-17 bindende molekyl i henhold til krav 1 til 5.

15. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et antistoff til IL-17 i henhold til krav 1 til 5, i kombinasjon med et farmasøytisk akseptabelt bindemiddel fortynningsmiddel eller bærer.