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KR101674784B1 - 인간 tweak 및 인간 il17에 대한 이중특이적 항체 및 이의 용도 - Google Patents

인간 tweak 및 인간 il17에 대한 이중특이적 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR101674784B1
KR101674784B1 KR1020147030954A KR20147030954A KR101674784B1 KR 101674784 B1 KR101674784 B1 KR 101674784B1 KR 1020147030954 A KR1020147030954 A KR 1020147030954A KR 20147030954 A KR20147030954 A KR 20147030954A KR 101674784 B1 KR101674784 B1 KR 101674784B1
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마르틴 바더
젠스 피셔
후버트 케텐베르거
막시밀리안 코에닉
스테판 로렌츠
외르크 몰레켄
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 인간 TWEAK 및 인간 IL17에 대한 이중특이적 항체(이중특이적 TWEAK-IL17 항체), 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

인간 TWEAK 및 인간 IL17에 대한 이중특이적 항체 및 이의 용도{BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST HUMAN TWEAK AND HUMAN IL17 AND USES THEREOF}
본 발명은 인간 TWEAK 및 인간 IL17에 대한 이중특이적 항체(이중특이적 TWEAK-IL17 항체), 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간 TWEAK(유니프롯(UniProt)KB O43508, 세포자멸의 TNF-연관된 약한 유도체; 서열번호 68)는 세포 표면 결합된 유형 II 막횡단 단백질이다. TWEAK는 문헌[Chicheportiche, Y., et al., J. Biol. Chem. 272, 32401-32410 (1997)]; 문헌[Marsters, S.A., et al., Curr. Biol. 8, 525-528 (1998)]; 문헌[Lynch, C.N., et al., J. Biol. Chem. 274, 8455-8459 (1999)]에 기재되어 있다. TWEAK의 활성 형태는 가용성 동형삼량체(homotrimer)이다. 인간 및 뮤린 TWEAK는 수용체 결합 도메인에서 93% 서열 동일성을 나타낸다. TWEAK 수용체 Fn14(섬유아세포 성장 인자 유도성 14 kDa 단백질)는 리간드 결합 도메인 중 하나의 단일 시스테인 풍부 도메인으로 이루어진 129개 아미노산(aa) 유형 I 막횡단 단백질이다(서열번호 98). TWEAK의 신호전달은 NF-KB 경로 활성화를 통해 일어난다. TWEAK mRNA는 다양한 조직에서 발현되며, 심장, 뇌, 골격근 및 췌장과 같은 대부분의 주요 장기, 비장, 림프절 및 흉선과 같은 면역계와 관련된 조직에서 발견된다. Fn14 mRNA는 심장, 뇌, 폐, 태반, 혈관 EC 및 평활근 세포에서 검출되었다. TWEAK-부재 및 Fn14-부재 유전자제거(knockout) 마우스는 생존가능하고 건강하며 번식력이 있고, 더 많은 자연 살해 세포를 가지며, 증대된 선천성 염증 반응을 나타낸다. TWEAK는 세포자멸, 증식, 신생혈관생성, 허혈 음영, 뇌부종, 다발성 경화증에 수반된다.
항-TWEAK 항체는 국제특허출원공개 제 1998/005783 호, 국제특허출원공개 제 2000/042073 호, 국제특허출원공개 제 2003/086311 호, 국제특허출원공개 제 2006/130429 호, 국제특허출원공개 제 2006/130374 호, 국제특허출원공개 제 2006/122187 호, 국제특허출원공개 제 2006/089095 호, 국제특허출원공개 제 2006/088890 호 및 국제특허출원공개 제 2006/052926 호에 언급되어 있다.
인간 IL-17A(CTLA-8, 스위스 프롯(Swiss Prot) Q16552, IL-17 또는 IL17로도 명명됨; 서열번호 70))는 MS의 발병에 연루되어 있는 기억 T 세포(Th17로 불림)의 하위세트에 의해 생성된 전-염증성 사이토카인이다. IL-17A는 다른 염증성 사이토카인, 케모카인 및 접착 분자의 도입에 중요한 역할을 한다. IL-17A 중화 항체를 사용한 동물의 치료는 자가면역 뇌척수염에서 질환 발생률 및 중증도를 감소시킨다(문헌[Komiyama, Y. et al., J. Immunol. 177 (2006) 566-573]). IL-17A는 MS 환자의 뇌척수액에서 과발현된다(문헌[Hellings, P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50]; 문헌[Matusevicius, D. et al., Multiple Sclerosis 5 (1999) 101-104]; 국제특허출원공개 제 2005/051422 호). 게다가, IL-17A 중화 항체는 콜라겐 유도된 관절염의 마우스 RA 모델의 중증도 및 발생률을 감소시키고, 높은 수준의 IL-17A는 RA 환자로부터의 염증 관절의 윤활액에서 검출될 수 있다(문헌[Ziolkowska, M,. et al., J. Immunol. 164 (2000) 2832-2838]; 문헌[Kotake, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 1345-1352]; 문헌[Hellings, P.W., et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50]).
국제특허출원공개 제 96/17939 호, 미국특허 제 5,716,623 호, 국제특허출원공개 제 95/18826 호, 국제특허출원공개 제 97/15320 호, 국제특허출원공개 제 99/35276 호, 국제특허출원공개 제 00/69436 호, 국제특허출원공개 제 95/18826 호, 미국특허 제 6,274,711 호, 미국특허 제 6,274,711 호, 국제특허출원공개 제 97/15320 호, 미국특허 제 6,063,372 호, 국제특허출원공개 제 2006/013107 호 및 국제특허출원공개 제 2008/02115 호는 IL-17A 및 IL-17A에 대한 항체에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제 2010/102251 호는 IL17 결합 단백질에 관한 것이다.
이중특이적 항체
최근에 매우 다양한 재조합 항체 형태, 예를 들면, IgG 항체 형태와 단일쇄 도메인의 융합에 의한 4가 이중특이적 항체가 개발되었다(예를 들면, 문헌[Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163]; 국제특허출원공개 제 2001/077342 호; 및 문헌[Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234] 참조).
또한, 항체 코어 구조(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)가 더 이상 보유되어 있지 않은 여러 다른 새로운 형태, 예컨대, 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 2가 항체, 3가 항체, 4가 항체, 미니바디 및 여러 단일쇄 형태(scFv, Bis-scFv)가 개발되었다(문헌[Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136]; 문헌[Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14]; 문헌[Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74]; 문헌[Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297]).
모든 이러한 형태들은 항체 코어(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)를 추가 결합 단백질(예를 들면, scFv)에 융합시키거나, 또는 예를 들면, 2개의 Fab 단편 또는 scFv를 융합시키기 위해 연결기를 사용한다(문헌[Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14]). 천연적으로 발생하는 항체와의 고도의 유사성을 유지함으로써, Fc 수용체 결합을 통해 매개되는 이펙터(effector) 기능, 예컨대, 보체 의존적 세포독성(CDC) 또는 항체 의존적 세포매개 세포독성(ADCC)을 유지하기를 원할 수 있다는 것을 명심해야 한다.
국제특허출원공개 제 2007/024715 호에는 개조된 다가 다중특이적 결합 단백질로서의 이중 가변 도메인 면역글로불린이 보고되어 있다. 생물학적 활성 항체 이량체의 제조 방법은 미국특허 제 6,897,044 호에 보고되어 있다. 펩티드 연결기를 통해 서로 연결되어 있는 4개 이상의 가변 도메인을 갖는 다가 FV 항체 구축물은 미국특허 제 7,129,330 호에 보고되어 있다. 이량체 항원 결합 구조 및 다량체 항원 결합 구조는 미국특허 제 2005/0079170 호에 보고되어 있다. 연결 구조에 의해 서로 공유결합된 3개 또는 4개의 Fab 단편을 포함하는 3가 또는 4가 단일특이적 항원 결합 단백질(이 단백질은 천연 면역글로불린이 아님)은 미국특허 제 6,511,663 호에 보고되어 있다. 국제특허출원공개 제 2006/020258 호에는 원핵세포 및 진핵세포에서 효율적으로 발현될 수 있고 치료 및 진단 방법에서 유용한 4가 이중특이적 항체가 보고되어 있다. 2종의 폴리펩티드 이량체를 포함하는 혼합물로부터 하나 이상의 쇄간 이황화 연결을 통해 연결되지 않은 이량체로부터 하나 이상의 쇄간 이황화 연결을 통해 연결된 이량체를 분리하거나 우세하게 합성하는 방법은 미국특허 제 2005/0163782 호에 보고되어 있다. 이중특이적 4가 수용체는 미국특허 제 5,959,083 호에 보고되어 있다. 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 개조된 항체는 국제특허출원공개 제 2001/077342 호에 보고되어 있다.
다중특이적 다가 항원 결합 폴리펩티드는 국제특허출원공개 제 1997/001580 호에 보고되어 있다. 국제특허출원공개 제 1992/004053 호에는 전형적으로 동일한 항원성 결정인자에 결합하는 IgG 클래스의 단일클론 항체들로부터 제조된 동종접합체가 합성 가교연결에 의해 공유연결되어 있다고 보고되어 있다. 항원에 대한 높은 결합력을 갖는 올리고머 단일클론 항체는 국제특허출원공개 제 1991/06305 호에 보고되어 있는데, 전형적으로 IgG 클래스의 상기 올리고머는 서로 연결되어 4가 또는 6가 IgG 분자를 형성하는 2개 이상의 면역글로불린 단량체를 갖는 형태로 분비된다. 인터페론 감마 활성이 병원성을 나타내는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는, 양으로부터 유래된 항체 및 개조된 항체 구축물은 미국특허 제 6,350,860 호에 보고되어 있다. 미국특허 제 2005/0100543 호에는 이중특이적 항체의 다가 담체인 표적화가능한 구축물(즉, 표적화가능한 구축물의 각각의 분자가 2개 이상의 이중특이적 항체의 담체로서 사용될 수 있음)이 보고되어 있다. 유전적으로 개조된 이중특이적 4가 항체는 국제특허출원공개 제 1995/009917 호에 보고되어 있다. 국제특허출원공개 제 2007/109254 호에는 안정화된 scFv로 구성되거나 이를 포함하는 안정화된 결합 분자가 보고되어 있다.
국제특허출원공개 제 2008/106131 호는 IL23 및 IL17 또는 TNF에 대한 이중특이적 항체에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제 2007/027761 호는 IL23 및 IL17에 대한 이중특이적 항체에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제 2010/003108 호는 TNFα 길항제 다중표적 결합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 일 양상은 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 실시양태에서, 이중특이적 항체는
(a) 0.2 nM 이하의 IC50 값을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 TWEAK 유도된 증식;
(b) 3.0 nM 이하의 IC50 값을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 IL17 유도된 IL6 사이토카인 자극; 및
(c) 2.0 nM 이하의 IC50 값을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 IL17 유도된 IL8 사이토카인 자극을 억제한다.
본 발명의 일 실시양태에서 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체는 2가 이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 실시양태에서 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체는,
(i) 상기 제 1 항원 결합 부위가,
(a) 서열번호 17의 CDR1H, 서열번호 18의 CDR2H, 서열번호 19의 CDR3H, 및 서열번호 20의 CDR1L, 서열번호 21의 CDR2L, 서열번호 22의 CDR3L;
(b) 서열번호 1의 CDR1H, 서열번호 2의 CDR2H, 서열번호 3의 CDR3H, 및 서열번호 4의 CDR1L, 서열번호 5의 CDR2L, 서열번호 6의 CDR3L; 또는
(c) 서열번호 9의 CDR1H, 서열번호 10의 CDR2H, 서열번호 11의 CDR3H, 및 서열번호 12의 CDR1L, 서열번호 13의 CDR2L, 서열번호 14의 CDR3L을 포함하고,
(ii) 상기 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 47의 CDR1H, 서열번호 48의 CDR2H, 서열번호 49의 CDR3H, 및 서열번호 50의 CDR1L, 서열번호 51의 CDR2L, 서열번호 52의 CDR3L을 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시양태에서 이러한 이중특이적 항체는 키메라 또는 인간화된 변이체이다.
본 발명의 일 실시양태에서 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체는,
(i) 상기 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 35의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 26, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 또는 서열번호 46의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
(ii) 상기 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 55 또는 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 57 또는 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인을 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시양태에서 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체는,
(i) 상기 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
(ii) 상기 제 2 항원 결합 부위가, (a) 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인, 또는 (b) 서열번호 55의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 57의 가변 경쇄 도메인을 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시양태에서 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체는,
(i) 상기 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
(ii) 상기 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인을 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시양태에서 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체는,
(i) 상기 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
(ii) 상기 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 55의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 57의 가변 경쇄 도메인을 포함함을 특징으로 한다.
일 실시양태에서 TWEAK 및 IL17에 결합하고 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편으로 특징되는 이중특이적 항체는 인간 IgG1 이소타입이고, 일 실시양태에서 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖고, 일 실시양태에서 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는다.
일 실시양태에서 TWEAK 및 IL17에 결합하고 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편으로 특징되는 이중특이적 항체는 인간 IgG4 이소타입이고, 일 실시양태에서 돌연변이 S228P 및 L235E를 갖고, 일 실시양태에서 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는다.
본 발명의 추가 실시양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명의 추가 실시양태는 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 용도이다.
본 발명의 추가 실시양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 핵산이다.
본 발명의 추가 실시양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이다.
본 발명은 또한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시킬 수 있는, 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 발현 벡터, 및 상기 항체의 재조합 생산을 위한 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키고 항체를 상기 세포 또는 세포 배양 상등액으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 재조합 키메릭, 인간 또는 인간화된 항체의 제조 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 재조합 방법에 의해 수득될 수 있는 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 TWEAK 및 IL17 표적화 치료를 필요로 하는 환자에게 이점을 나타낸다. 본 발명에 따른 항체는 암 질환, 특히 결장, 폐 또는 췌장암, 또는 염증성 질환, 특히 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상을 앓고 있는 환자에게 이점을 유발하는 신규성 및 진보성을 갖는다.
본 발명의 추가 실시양태는 암, 염증 질환, 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상의 치료, 특히 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체이다.
본 발명의 추가 실시양태는 암, 염증 질환, 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상의 치료용, 특히 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체이다.
본 발명은 또한 암, 특히 대장암, 폐암 또는 췌장암 또는 염증 질환, 특히 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상을 갖는 것으로 진단된(따라서 상기 치료를 필요로 하는) 환자에게 본 발명에 따른 TWEAK 및 IL17에 결합하는 이중특이적 항체의 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 제공한다. 상기 항체는 바람직하게는 약학 조성물로 투여된다.
본 발명은 또한, 선택적으로 약학적 목적으로 항체의 제형에 유용한 완충제 및/또는 보조제와 함께, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체 중에 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 약학 조성물은 제조품 또는 키트에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 TWEAK 및 IL17 표적화 치료를 필요로 하는 인간 환자에 대하여 이점을 나타내고 가치있는 특성을 갖는다.
본 발명에 따른 항체는 상기 질환, 특히 염증 질환, 예컨대, 류마티스성 관절염 또는 루푸스 신염을 앓고 있는 환자에 대한 이점을 야기하는 가치있는 특성을 갖는다. 이러한 가치있는 특성은 상보적 치료 이점을 야기하는 TWEAK 및 IL17 둘다의 동시 억제를 포함한다. 많은 환자들이 병의 차도의 목적을 달성하는데 실패함으로써 RA에서 영구적인 높은 의학적 필요성이 존재한다. TWEAK 및 IL17 둘다의 이중특이적 항체 표적화는 IL-17 및 TWEAK를 억제함으로써 상보적 항-염증성 및 항-혈관형성 활성을 제공하여 개선된 효능을 위한 기회를 제공하고, 골 형성/흡수에 최적의 영향을 끼친다. TWEAK 발현은 RA 및 PsA 환자의 활액 조직(주로 CD55+ 활막세포 및 CD168+ 대식세포)에서 유의하게 증가된다(문헌[Van Kuijk, et al., Ann Rheum Dis 69 (2010) 301-304]). IL-17A는 TNF 반응체에서 낮은 IL-17을 갖고 TNF-비-반응체에서 높은 IL-17을 갖는 염증이 생긴 활액 조직에서 생성된다(문헌[Moran, et al., Arthritis & Rheumatism 11 (2009) R113]). 게다가, 이용가능한 데이타는 혈관 사이 세포, 세뇨관 상피 세포, 내피 세포, 상승된 케모카인, 사이토카인, 호중구 침윤, 및 질환 활성을 갖는 IL-17 및 TWEAK의 정상관(positive correlation)에 영향을 끼치는 신장 염증에서 IL-17 및 TWEAK의 역할을 지지한다. 비뇨기 TWEAK 수준은 신장 SLEDAI 점수와 관련되고, TWEAK는 재발 동안 상승되고 신장 질환에 특이적이다(문헌[Schwartz, et al., J Autoimmunity 27 (2006) 242-25]). 게다가, TWEAK 차단은 급성 신부전(AKI)의 모델에서 신장 염증을 감소시킨다(문헌[Sanz, et al., J Amer Soc Nephrol 19 (2008) 695-703]). 상승된 IL-17은 루푸스 환자의 조직에서 검출되고, IL-17은 SLE 환자의 발병된 신장에서 검출되었다(문헌[Crispin, et al., J Immunol. 181 (2008) 8761-8766]).
응집(>55℃)에 관하여 낮은 점도 및 높은 안정성은 가능한 피하 적용에 대한 고농도 제형에 적합한 이러한 항체를 제조한다(문헌[He, F., et al., J Pharm Sci.100 (2010) 13301-13340]).
일 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 (실시예 4, 10, 11, 16, 17 및 19에서 측정된 바와 같은) 하기 특성 중 하나 이상에 의해 추가로 특징된다:
이중특이적 항체는,
(a) IL17B, IL17C, IL17D, IL17F와 교차 반응성을 나타내지 않는다(이는 IL17B, IL17C, IL17D 및 IL17F에 결합이 IL17A에 결합과 비교하여 0%를 의미하고, 이는 100%로서 설정된다);
(b) 2.0 nM 이하의 IC50 값(예를 들면, 2.0 nM 내지 0.0 nM의 IC50 값)을 갖는 CCD-25SK 세포의 IL17 유도된 IL8 사이토카인 자극을 억제한다;
(c) 5.0 nM 이하의 IC50 값(예를 들면, 5.0 nM 내지 0.0 nM의 IC50 값); 바람직하게는 2.0 nM 이하의 IC50 값을 갖는 CCD-25SK 세포의 IL17 유도된 IL6 사이토카인 자극을 억제한다;
(d) 4.0 [ng/ml] 이하의 IC50 값(예를 들면, 4.0 [ng/ml] 내지 0.0 [ng/ml]의 IC50 값); 바람직하게는 3.0 [ng/ml] 이하의 IC50 값을 갖는 인간 TWEAK/인간 Fn14 상호작용;
(e) 0.1 nM 이하의 결합 친화성의 KD 값을 갖는 인간 TWEAK에 결합하고 0.3 nM 이하의 결합 친화성을 갖는 KD 값을 갖는 인간 IL-17에 결합한다; 및/또는
(f) 인간 <TWEAK> 및 인간 <IL17>에 동시에 결합할 수 있고, 이때 인간 <TWEAK> 및 인간 <IL17>의 1:1 혼합물에 대한 이중특이적 TWEAK/IL17 항체의 결합의 (표면 플라즈몬 공명 분석 중) 신호 강도(단위: RU)는 (a) 인간 <TWEAK> 단독에 대한 이중특이적 TWEAK/IL17 항체의 결합의 신호 강도(단위: RU) 및 (b) 인간 <IL17> 단독에 대한 이중특이적 TWEAK/IL17 항체의 결합의 신호 강도(단위: RU)의 합에 비해 적어도 동일하거나 더 높다.
도 1a 및 1b는 본 발명에 따른 이중특이적 <TWEAK/IL17> 항체에 대한 2개의 예시적인 이중특이적 2가 항체 포맷을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 이중특이적 <TWEAK/IL17> 항체에 대한 1개의 예시적인 이중특이적 4가 항체 포맷을 나타낸다.
본원에 사용된 "항체"는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "결합 부위" 또는 "항원 결합 부위"는 실제로 결합하는 리간드(즉, 항원)에 대한 항체 분자의 영역을 나타낸다. 용어 "항원 결합 부위"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH)및/또는 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 또는 VH/VL의 쌍을 포함하고, 전체 항체 또는 항체 단편, 예컨대, 단일쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab, 또는 (Fab)2로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 각각의 항원 결합 부위는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 바람직하게는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)으로 이루어진 쌍에 의해 형성된다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간화된 항체, 키메라 항체, 또는 본 발명에 따른 특성을 보유하는 한 추가로 유전적으로 조작된 항체이다.
인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위, 특히 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은, (a) 예를 들면, 국제특허출원공개 제 1998/005783 호, 국제특허출원공개 제 2000/042073 호, 국제특허출원공개 제 2003/086311 호, 국제특허출원공개 제 2006/130429 호, 국제특허출원공개 제 2006/130374 호, 국제특허출원공개 제 2006/122187 호, 국제특허출원공개 제 2006/089095 호, 국제특허출원공개 제 2006/088890 호, 국제특허출원공개 제 2006/052926 호, 국제특허출원공개 제 2010/115555 호 또는 PCT특허출원 제 PCT/EP2011/067070 호에 기재된 바와 같이 공지된 항-TWEAK 항체로부터; 또는 (b) 예를 들면, 특히 인간 TWEAK 단백질 또는 핵산 또는 이의 단편을 사용하는 드노보 면역화 방법에 의해, 또는 파지 디스플레이 방법에 의해 수득된 신규한 항-TWEAK 항체로부터 유도될 수 있다.
인간 IL17에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인, 특히 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은, (a) 예를 들면, 국제특허출원공개 제 96/17939 호, 미국특허 제 5,716,623 호, 국제특허출원공개 제 95/18826 호, 국제특허출원공개 제 97/15320 호, 국제특허출원공개 제 99/35276 호, 국제특허출원공개 제 00/69436 호, 국제특허출원공개 제 95/18826 호, 미국특허 제 6,274,711 호, 미국특허 제 6,063,372 호, 국제특허출원공개 제 2006/013107 호, 국제특허출원공개 제 2008/02115 호, 국제특허출원공개 제 2010/102251 호 또는 국제특허출원공개 제 2010/034443 호에 기재된 바와 같은 공지된 항-IL17 항체로부터; 또는 (b) 예를 들면, 인간 IL17 단백질 또는 핵산 또는 이의 단편을 사용하는 드노보 면역화 방법에 의해, 또는 파지 디스플레이 방법에 의해 수득된 신규한 항-IL17 항체로부터 유도될 수 있다.
인간 TWEAK(유니플롯KB O43508, 세포자멸의 TNF-연관된 약한 유도체; 서열번호 68)는 세포 표면 관련 유형 II 막횡단 단백질이다. TWEAK는 문헌[Chicheportiche, Y., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 32401-32410]; 문헌[Marsters, S.A., et al., Curr. Biol. 8 (1998) 525-528]; 문헌[Lynch, C.N., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 8455-8459]에 기재되어 있다. TWEAK의 활성 형태는 가용성 동형삼량체이다. 인간 및 뮤린 TWEAK는 수용체 결합 도메인에서 93% 서열 동일성을 나타낸다. TWEAK 수용체 Fn14(섬유아세포 성장 인자 유도성 14 kDa 단백질)는 리간드 결합 도메인 중 1개의 단일 시스테인 풍부 도메인으로 이루어진 129 aa 유형 I 막횡단 단백질이다(서열번호 98). TWEAK의 신호화는 NF-KB 경로 활성화를 통해 발생한다. TWEAK mRNA는 다양한 조직에서 발현되고 심장, 뇌, 골격근 및 및 췌장과 같은 대부분의 주요한 기관, 비장, 림프절 및 흉선과 같은 면역계에 연관된 조직에서 발견되었다. Fn14 mRNA는 심장, 뇌, 폐, 태반, 관다발 EC 및 평활근 세포에서 검출되어졌다. TWEAK-null 및 Fnl4-null 넉아웃 마우스는 생존가능하고, 건강하고, 생식력이 있고, 더 많은 천연 살해 세포를 가지며, 강화된 선천적인 염증성 반응을 보인다. TWEAK는 세포자멸, 증식, 혈관형성, 허혈 음영, 뇌수종, 다발성 경화증에 수반된다.
인간 IL-17A(CTLA-8, 스위스 프롯 Q16552, 또한 IL-17, IL17로서 명명됨; 서열번호 70)는 MS의 발병에 연루되어 있는 기억 T 세포의 하위세트(Th17로 명명됨)에 의해 생성된 전-염증성 사이토카인이다. IL-17A는 다른 염증성 사이토카인, 케모카인 및 접착 분자의 도입에서 역할을 한다. IL-17A 중화 항체를 사용한 동물의 치료는 자가면역 뇌척수염에서 질환 발생률 및 중증도를 감소시킨다(문헌[Komiyama, Y. et al., J. Immunol. 177 (2006) 566-573]). IL-17A는 MS 환자의 뇌척수액에서 과발현된다(문헌[Hellings, P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50]; 문헌[Matusevicius, D. et al., Multiple Sclerosis 5 (1999) 101-104]; 국제특허출원공개 제 2005/051422 호). 게다가, IL-17A 중화 항체는 콜라겐 유도된 관절염의 마우스 RA 모델의 중증도 및 발생률을 감소시키고, 높은 수준의 IL-17A는 RA 환자로부터 염증이 생긴 관절의 윤활액에서 검출될 수 있다(문헌[Ziolkowska, M. et al., J. Immunol. 164 (2000) 2832-2838]; 문헌[Kotake, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 1345-1352]; 문헌[Hellings, P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50]).
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적인 인식을 지칭한다. 예를 들어, 천연 항체는 단일특이적이다.
본 발명에 따른 "이중특이적 항체"는 2개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 항체가 하나 이상의 특이성을 갖는 경우, 인식된 에피토프는 단일 항원 또는 하나 이상의 항원과 관련될 수 있다. 본 발명의 항체는 2개의 상이한 항원, 즉, 제 1 항원으로서 TWEAK 및 제 2 항원으로서 IL17에 대하여 특이적이다.
본원에 사용된 용어 "단일특이적" 항체는 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 각각의 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "원자가"는 항체 분자 중 명시된 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 상기와 같이, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 항체 분자 중 각각 2개 결합 부위, 4개 결합 부위 및 6개 결합 부위의 존재를 나타낸다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 "2가"이고 "3가" 또는 "다가"(예를 들면, "4가" 또는 "6가")일 수 있다. 일 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2가, 3가 또는 4가이다. 일 실시양태에서 상기 이중특이적 항체는 2가이다. 일 실시양태에서 상기 이중특이적 항체는 3가이다. 일 실시양태에서 상기 이중특이적 항체는 4가이다.
본 발명의 항체는 2개 이상의 결합 부위를 갖고 이중특이적이다. 즉, 항체는 2개 이상의 결합 부위(즉, 항체는 3가 또는 다가이다)가 존재하는 경우 조차도 이중특이적일 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 예를 들면, 다가 단일쇄 항체, 다이아바디 및 트라이아바디, 뿐만 아니라 추가 항원 결합 부위(예를 들면, 단일쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab 또는 Fab2)가 하나 이상의 펩티드-연결기를 통해 연결된 전장 항체의 불변 도메인 구조를 갖는 항체를 포함한다. 항체는 단일 종으로부터의 전장일 수 있거나, 키메라 또는 인간화될 수 있다. 2개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 항체에 대하여, 일부 결합 부위는 단백질이 2개의 상이한 항원에 대한 결합 부위를 갖는 한 동일할 수 있다. 즉, 제 1 결합 부위는 TWEAK에 특이적인 반면, 제 2 결합 부위는 IL17에 대하여 특이적이고, 반대로도 그렇다.
본원에서 사용된 용어 "단클론성 항체" 또는 "단클론성 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성의 항체 분자 제제를 말한다.
용어 "인간화 항체"는 프레임워크(framework) 및/또는 "상보성 결정 영역(CDR)"이 모 면역글로불린과 비교할 때 상이한 종의 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변형된 항체를 말한다. 바람직한 실시양태에서, "인간화 항체"를 제조하기 위해 비-인간(예를 들면, 마우스, 토끼 또는 햄스터) CDR이 인간 항체의 프레임워크 영역 중에 그래프팅(grafting)된다(예를 들면, 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332, 323-327 (1988)]; 및 문헌[Neuberger, M.S., et al., Nature 314, 268-270 (1985)] 참조).
용어 "키메라 항체"는 마우스로부터의 가변 영역, 즉, 결합 부위, 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유도된 불변 영역의 적어도 일부분을 포함하는, 통상적으로 재조합 DNA 기법에 의해 제조된 단클론성 항체를 말한다. 키메라 항체는, 예를 들면, 마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함한다. 상기 마우스/인간 키메라 항체는 래트 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 단편, 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 단편을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 본 발명에 포함되는 "키메라 항체"의 다른 형태는 부류 또는 하위부류가 원래 항체로부터 변형되거나 변화된 것들이다. 상기 "키메라" 항체는 또한 "부류-전환 항체"로도 지칭된다. 키메라 항체의 제조 방법은 현재 당해 분야에 공지되어 있는 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법을 포함한다(예를 들면, 문헌[Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)]; 미국특허 제 5,202,238 호 및 미국특허 제 5,204,244 호 참조).
본원에 사용된 용어 "~에 결합하다", "결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"은 본 발명에 따른 인간 TWEAK 및/또는 인간 IL17을 표적하는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성을 갖는 항원(인간 TWEAK 또는 인간 IL17 중 하나)의 에피토프에 대한 이중특이적 항체의 결합을 지칭한다. 항원(인간 TWEAK 또는 인간 IL17 중 하나)의 에피토프에 대한 이중특이적 항체의 결합을 생체외 분석, 바람직하게는 정제된 야생형 인간 항원(바람직하게는 인간 IL17 항원에 대한 IL17A 호모다이머를 갖는 항원)을 사용하여 플라즈몬 공명 분석(예를 들면, 비아코어(BIAcore), 지이-헬쓰캐어(GE-Healthcare), 스웨덴 웁살라 소재)으로 측정할 수 있다(예를 들면, 실시예 19 참조). 결합 친화성은 용어 ka(항체/항원 착체로부터 항체의 회합에 대한 속도 상수), kd(해리 상수) 및 KD(kd/ka)에 의해 정의된다. 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체는 1.0 x 10-8 M 이하, 예를 들면, 1.0 x 10-8 M 내지 1.0 x 10-13 M(일 실시양태에서 1.0 x 10-9 M 내지 1.0 x 10-13 M)의 결합 친화성(KD)으로 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위, 및 1.0 x 10-8 M 이하, 예를 들면, 1.0 x 10-8 M 내지 1.0 x 10-13 M(일 실시양태에서 1.0 x 10-9 M 내지 1.0 x 10-13 M)의 결합 친화성(KD)으로 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체를 지칭한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 나타낸다. 에피토프는 일반적으로 분자, 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 집단으로 이루어지고 일반적으로 에피토프는 특이적인 3차원 구조 특징, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. 배좌 및 비배좌 에피토프는 전자에 결합하지만 변성 용매의 존재하에 후자를 손실하지 않는 것으로 저명하다.
본 발명의 일 실시양태는,
(a) 제 1 항원 결합 부위가 서열번호 17의 CDR1H, 서열번호 18의 CDR2H, 서열번호 19의 CDR3H, 및 서열번호 20의 CDR1L, 서열번호 21의 CDR2L, 서열번호 22의 CDR3L을 포함하는 항체로서 인간 TWEAK 상에서 동일한 에피토프에 결합하고;
(b) 제 2 항원 결합 부위가 서열번호 47의 CDR1H, 서열번호 48의 CDR2H, 서열번호 49의 CDR3H, 및 서열번호 50의 CDR1L, 서열번호 51의 CDR2L, 서열번호 52의 CDR3L을 포함하는 항체로서 인간 IL17 상에서 동일한 에피토프에 결합하는, 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 실시양태는,
(a) 제 1 항원 결합 부위가 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항체로서 인간 TWEAK 상에서 동일한 에피토프에 결합하고;
(b) 제 2 항원 결합 부위가 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항체로서 인간 IL17 상에서 동일한 에피토프에 결합하는, 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 실시양태는,
(a) 제 1 항원 결합 부위가 서열번호 17의 CDR1H, 서열번호 18의 CDR2H, 서열번호 19의 CDR3H, 및 서열번호 20의 CDR1L, 서열번호 21의 CDR2L, 서열번호 22의 CDR3L을 포함하는 항체로서 인간 TWEAK 상에서 동일한 에피토프에 결합하도록 경쟁하고;
(b) 제 2 항원 결합 부위가 서열번호 47의 CDR1H, 서열번호 48의 CDR2H, 서열번호 49의 CDR3H, 및 서열번호 50의 CDR1L, 서열번호 51의 CDR2L, 서열번호 52의 CDR3L을 포함하는 항체로서 인간 IL17 상에서 동일한 에피토프에 결합하도록 경쟁하는, 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 실시양태는,
(a) 제 1 항원 결합 부위가 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항체로서 인간 TWEAK 상에서 동일한 에피토프에 결합하도록 경쟁하고;
(b) 제 2 항원 결합 부위가 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항체로서 인간 IL17 상에서 동일한 에피토프에 결합하도록 경쟁하는, 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다.
동일한 에피토프에 결합하도록 경쟁하는 항체(및 따라서 동일한 에피토프에 결합할 수 있음)는 예를 들면, 실시예 7에 기재된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명 경쟁 분석에 의해 확인될 수 있다
본원에서 사용된 "가변 도메인"(경쇄의 가변 도메인(VL), 중쇄의 가변 도메인(Vh))은 항체를 항원에 결합시키는데 직접 수반되는 경쇄 및 중쇄 도메인의 쌍 각각을 의미한다. 가변 경쇄 및 중쇄 도메인은 동일한 일반 구조를 가지며, 각각의 도메인은 3개의 "초가변(hypervariable) 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결된, 그 서열이 광범위하게 보존되는 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 프레임워크 영역은 β-시트 형태를 취하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 쇄에서 CDR은 프레임워크 영역에 의해 이의 3차원 구조로 유지되며 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 있어 특히 중요한 역할을 하며, 따라서 본 발명의 추가 목적을 제공한다.
용어 "항체의 항원-결합부"는 본원에서 사용될 때 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 항체의 항원-결합부는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기가 아닌 다른 가변 도메인 영역들이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-말단으로부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 주로 항원 결합에 기여하고 항체의 특징을 결정하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)]의 표준 정의 및/또는 "초가변성 루프"로부터의 상기 잔기들에 따라 결정된다.
용어 "CDR1H"는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 따라 추정된 중쇄 가변 영역의 CDR1 영역을 의미한다. CDR2L, CDR3H 등은 중쇄(H) 또는 경쇄(L)로부터의 각각의 영역을 의미한다. 예를 들면, 서열번호 3의 CDR1H를 포함하는 항원 결합 부위는 상기 항원 결합 부위가 이의 가변 중쇄에 중쇄 가변 CDR1 영역으로서 상기 아미노산 서열을 포함함을 의미한다. 예를 들면, 서열번호 1의 CDR1H, 서열번호 2의 CDR2H, 서열번호 3의 CDR3H를 포함하는 항원 결합 부위는 상기 항원 결합 부위가 이의 중쇄에 CDR1의 서열로서 서열번호 1, CDR2의 서열로서 서열번호 2, 및 CDR3의 서열로서 서열번호 3을 포함함을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.
본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 알라닌(3 문자 코드: ala, 1 문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산의 군을 의미한다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 작용적 관계에 놓일 때 "작용가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작용가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 상기 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작용가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하기 위해 위치하는 경우 암호화 서열에 작용가능하게 연결된다. 일반적으로, "작용가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 동일선상(colinear)에 있으며, 분비 리더의 경우 해독 프레임에 인접하여 상기 프레임내에 존재함을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접되어서는 안된다. 연결은 편리한 제한효소 영역에서 접합에 의해 수행된다. 상기 영역이 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 연결기를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
본원에서 사용된 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 표현은 상호교환적으로 사용되며, 모든 상기 호칭들은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환 세포"란 용어는 1차 대상 세포, 및 전이 수에 관계없이 그로부터 유도된 배양물을 포함한다. 또한 모든 자손은 의도적이거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해 DNA 함량에 있어 정확하게 일치할 필요는 없는 것으로 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
항체의 "Fc 부분"은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 수반되지는 않지만, 다양한 작동인자 기능을 나타낸다. "항체의 Fc 부분"은 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며 항체의 파파인 절단을 근거로 정의된 용어이다. 항체의 Fc 부분의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라서, 항체 또는 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되며, 이들 중 몇몇은 하위부류(이소타입; "이소타입" 또는 "하위부류"라는 표현은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 중쇄 불변 영역에 따라서, 상이한 부류의 면역글로불린들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 항체의 Fc 부분은 보체 활성화, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합에 근거하여 ADCC(항체-의존적 세포-매개된 세포독성, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성) 및 CDC(보체-의존성 세포독성)에 직접 수반된다. 보체 활성화(CDC)는 대부분의 IgG 항체 하위부류의 Fc 부분에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 특정 조건에 따라 달라지지만, C1q에 대한 결합은 Fc 부분내 정의된 결합 부위에 의해 야기된다. 상기 결합 부위는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Boackle, R.J. et al., Nature 282, 742-743 (1979); Lukas, T.J. et al., J. Immunol. 127, 2555-2560 (1981)]; 문헌[Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16, 907-917 (1979)]; 문헌[Burton, D.R. et al., Nature 288, 338-344 (1980); 문헌[Thommesen, J.E. et al., Mol. Immunol. 37, 995-1004 (2000)]; 문헌[Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164, 4178-4184 (2000)]; 문헌[Hezareh, M. et al., J. Virology 75, 12161-12168 (2001)]; 문헌[Morgan, A. et al., Immunology 86, 319-324 (1995)] 및 유럽특허 제 0 307 434 호에 기재되어 있다. 상기 결합부위는, 예를 들면, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329이다(불변 도메인의 넘버링에 사용된 카밧의 EU 지수에 따른 넘버링(문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)])).
하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체들은 통상적으로 보체 활성화, 및 C1q 및 C3 결합을 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화시키지 않으며 C1q 및 C3에 결합하지 않는다.
일 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 불변 쇄가 인간 기원임을 특징으로 한다. 이러한 불변 쇄는 당해 분야에 널리 공지되어 있고 예를 들면, 카밧의 문헌에 기재되어 있다(예를 들면, 문헌[Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 및 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 유용한 인간 중쇄 불변 영역은 예를 들면, 아미노산 서열 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 또는 서열번호 64(인간 IgG1 아형 알로타입(백인 및 아프리카계 미국인) 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G), 서열번호 65, 서열번호 66 또는 서열번호 67(인간 IgG4 아형 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G)을 포함한다. 유용한 인간 경쇄 불변 영역은 예를 들면, 서열번호 59의 카파-경쇄 불변 영역의 아미노산 또는 서열번호 60의 람다-경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 기원으로부터 유도된 Fc 부분, 바람직하게는 인간 불변 영역의 모든 다른 부분을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "인간 기원으로부터 유도된 Fc 부분"은 아형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 Fc 부분, 일 실시양태에서 인간 IgG1 아형으로부터의 Fc 부분, 인간 IgG1 아형으로부터의 돌연변이된(바람직하게는 돌연변이 L234A 및 L235A, 또는 L234A, L235A 및 P329G를 갖는) Fc 부분, 인간 IgG4 아형으로부터의 Fc 부분 또는 인간 IgG4 아형으로부터 돌연변이된(바람직하게는 돌연변이 S228P 및 L235E, 또는 S228P, L235E 및 P329G를 갖는) Fc 부분 중 하나인 Fc 부분을 나타낸다. 일 실시양태에서 이중특이적 항체는 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 또는 서열번호 64(인간 IgG1 아형 알로타입(백인 및 아프리카계 미국인) 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G), 서열번호 65, 서열번호 66 또는 서열번호 67(인간 IgG4 아형 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G)의 인간 중쇄 불변 영역을 포함한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 EU 지수에 따른 넘버링). 이러한 인간 중쇄 불변 영역은 추가의 개질 및/또는 돌연변이(예를 들면, 하기 기재된 바와 같은 크놉스 및 홀(Knobs and Hole) 돌연변이 참조) 또는 헤테로이량체화를 강화하는 다른 개질을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서 이중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나에서 돌연변이 Y349C, T366W 및 2개의 CH3 도메인 중 다른 하나에서 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V가 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 또는 서열번호 64(인간 IgG1 아형 알로타입(백인 및 아프리카계 미국인) 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G), 서열번호 65, 서열번호 66 또는 서열번호 67(인간 IgG4 아형 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G)의 아미노산 서열에서 추가적으로 포함된 2개의 중쇄 불변 영역을 포함한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 EU 지수에 따른 넘버링).
일 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG1 아형의 항체 또는 인간 IgG4 아형의 항체이다. 일 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG1 아형의 항체이다. 일 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG4 아형의 항체이다.
일 실시양태에서 본 발명에 따른 인간 TWEAK 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 예를 들면, 국제특허출원공개 제 2009/080251 호, 국제특허출원공개 제 2009/080252 호, 국제특허출원공개 제 2009/080253 호 또는 문헌[Schaefer, W., et al., PNAS 108 (2011) 11187-92]("크로스맵(CrossMabs)" 또는 "도메인 교환된 항체" - 실시예 14, 및 예시적인 도 1a 참조; 국제특허출원공개 제 2009/080253 호에 기재된 포맷을 갖는 <Tweak-IL-17> #2, <Tweak-IL-17> #24), 국제특허출원공개 제 2011/117330 호("이중특이적 한암 scFab 항체" - 실시예 14; <Tweak-IL-17> #4, <Tweak-IL-17> #20, <Tweak-IL-17> #21, <Tweak-IL-17> #23; 또한 예시적인 도 1a 참조), 문헌[Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621]; 국제특허출원공개 제 96/027011 호; 국제특허출원공개 제 98/050431 호; 문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681]; 문헌[Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35, EP 1 870 459 A1]; 문헌[Muda, M., et al., Protein Engineering, Design & Selection 24 (2011) 447-454]; 국제특허출원공개 제 2010/129304 호, 국제특허출원공개 제 2011/028952 호, 국제특허출원공개 제 2012/009544 호 등(이는 모두 참조로서 혼입됨)에 기재된 바와 같은 2개의 상이한 특이성을 갖는 이중특이적 2가 항체이다.
전형적으로 상기 이중특이적 2가 항체는 종종 Fc 부분을 포함하고 헤테로이량체를 형성하는 2개의 상이한 중쇄 또는 중쇄-유사 펩티드를 포함한다. 이러한 헤테로이량체의 형성을 강화하기 위해(및 호모다이머성 부산물의 형성을 줄이기 위해), CH3(및/또는 CH2) 도메인은 헤테로이량체가 바람직하게 형성되는 방식으로 개질된다. 상이한 개질은 예를 들면, 국제특허출원공개 제 96/027011 호, 문헌[Ridgway, J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621]; 문헌[Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681], 국제특허출원공개 제 96/027011 호, 제 98/050431 호, 미국특허 제 2010/0015133 호, 국제특허출원공개 제 2007/147901 호, 국제특허출원공개 제 2009/089004 호, 국제특허출원공개 제 2010/129304 호 및 문헌[Muda, M., et al., Protein Engineering, Design & Selection 24 (2011) 447-454]에 기재된 바와 같이 헤테로이량체의 상기 형성을 강화하기 위해 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 일 실시양태에서 이중특이적 2가 항체는 인간 기원으로부터 유도된 Fc 부분, 바람직하게는 이중특이적 2가 항체의 CH3(및/또는 CH2) 도메인이 헤테로이량체의 형성을 강화하기 위해 하나 이상의 개질에 의해 변형되는 모든 다른 부분의 인간 불변 영역을 포함한다.
따라서, 본 발명의 일 실시양태는 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
본 발명의 일 실시양태는 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 80, 서열번호 81 및 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
본 발명의 일 실시양태는 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 85, 서열번호 86 및 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
본 발명의 일 실시양태는 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 88, 서열번호 89 및 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
본 발명의 일 실시양태는 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 91, 서열번호 92 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
본 발명의 일 실시양태는 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체로서, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96 및 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 이중특이적 2가 항체이다.
본 발명의 일 실시양태에서 이중특이적 2가 항체의 CH3 도메인은 예를 들면, 국제특허출원공개 제 96/027011 호, 국제특허출원공개 제 98/050431 호, 문헌[Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621] 및 문헌[Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681]에서 여러 예를 통해 상세히 기재되어 있는 "크놉스-대-홀스" 기법에 의해 변경된다. 이 방법에서, 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이들 2개의 CH3 도메인을 함유하는 두 중쇄의 이종이량체화를 증가시키도록 변경된다. (2개의 중쇄의) 상기 2개의 CH3 도메인 각각은 "크놉"일 수 있는 반면, 나머지는 "홀"이다. 이황화 가교의 도입은 상기 이종이량체를 안정화시키고(문헌[Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681]; 문헌[Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35]) 수율을 증가시킨다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 모든 이중특이적 항체는 한 중쇄의 CH3 도메인과 다른 중쇄의 CH3 도메인이 항체 CH3 도메인들 사이의 원래의 계면을 포함하는 계면에서 각각 만나고, 상기 계면이 상기 이중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되어 있는 것을 특징으로 하고, 이때 상기 변경은
(a) 한 중쇄의 CH3 도메인이 원래의 계면 내에서 상기 이중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나고, 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 공동(cavity)에 위치할 수 있는 돌출부(protuberance)가 한 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되도록, 한 중쇄의 CH3 도메인이 변경되고;
(b) 제 2 CH3 도메인이 원래의 계면 내에서 상기 이중특이적 항체 내의 제 1 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나고, 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제 1 CH3 도메인의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 공동이 제 2 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되도록, 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경되는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는
(a)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 도메인 및 (b)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 도메인이 각각 항체 CH3 도메인들 사이의 원래의 계면에서의 변경을 포함하는 계면에서 만나고;
(i) 한 중쇄의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 공동 내에 위치할 수 있는 돌출부가 한 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되고;
(ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제 1 CH3 도메인의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 공동이 제 2 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 쓰레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 두 CH3 도메인들 사이의 이황화 가교가 형성될 수 있도록 각각의 CH3 도메인의 상응하는 위치에서 아미노산으로서 시스테인(C)을 도입함으로써 두 CH3 도메인들을 추가로 변경시킨다.
한 실시양태에서, 이중특이적 2가 항체는 "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366W 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, Y349C 돌연변이를 "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내로 도입하고 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내로 도입함으로써(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 EU 지수에 따른 넘버링), CH3 도메인들 사이의 추가 쇄간 이황화 가교도 사용할 수 있다(문헌[Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681]).
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 2가 항체는 2개의 CH3 도메인들 중 하나의 CH3 도메인 내에 Y349C 및 T366W 돌연변이를 포함하고, 상기 2개의 CH3 도메인 중 다른 CH3 도메인 내에 E356C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인들 중 하나의 CH3 도메인 내에 Y349C 및 T366W 돌연변이를 포함하고, 상기 2개의 CH3 도메인 중 다른 CH3 도메인 내에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다(하나의 CH3 도메인 내의 추가 Y349C 돌연변이와 다른 CH3 도메인 내의 추가 E356C 또는 S354C 돌연변이는 쇄간 이황화 가교를 형성함)(문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 EU 지수에 따른 넘버링). 그러나, 유럽 특허출원 제 1 870 459 A1호에 기재된 다른 크놉스-대-홀스 기법도 대안적으로 또는 추가로 이용될 수 있다. 따라서, 이중특이적 항체에 대한 또 다른 예는 R409D; "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내의 K370E 돌연변이 및 D399K; 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 E357K 돌연변이이다(문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]EU 지수에 따른 넘버링).
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 2가 항체는 "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366W 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하고, R409D; "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내의 K370E 돌연변이 및 D399K; 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 E357K 돌연변이를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 2가 항체는 2개의 CH3 도메인들 중 하나의 CH3 도메인 내의 Y349C 및 T366W 돌연변이, 및 상기 CH3 도메인들 중 다른 CH3 도메인 내의 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 상기 이중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인들 중 하나의 CH3 도메인 내의 Y349C 및 T366W 돌연변이, 및 상기 CH3 도메인들 중 다른 CH3 도메인 내의 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하고, R409D; "크놉스 쇄"의 CH3 도메인 내의 K370E 돌연변이 및 D399K; 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 E357K 돌연변이를 추가로 포함한다. CH3 도메인에서 상기 "크놉" 및 "홀" 돌연변이는 전형적으로 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 또는 서열번호 64(인간 IgG1 아형 알로타입(백인 및 아프리카계 미국인) 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G), 서열번호 65, 서열번호 66 또는 서열번호 67(인간 IgG4 아형 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G)의 인간 중쇄 불변 영역에서 사용된다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 EU 지수에 따른 넘버링).
따라서, 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 CH3 도메인(예를 들면, 2개의 CH3 도메인 중 하나에서 Y349C, T366W 돌연변이 및 2개의 CH3 도메인 중 다른 하나에서 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이)에서 상기 "크놉" 및 "홀" 돌연변이를 추가로 포함하는, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 또는 서열번호 64(인간 IgG1 아형 알로타입(백인 및 아프리카계 미국인) 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G), 서열번호 65, 서열번호 66 또는 서열번호 67 (인간 IgG4 아형 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G)의 인간 중쇄 불변 영역을 포함한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 EU 지수에 따른 넘버링).
본 발명에 따른 인간 TWEAK 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 상기 2가 이중특이적 항체는 특히 가치있는 특성, 예컨대, (높은 응집이 없고 우수한 수율로 생성될 수 있도록) 낮은 점도 및 높은 안정성을 갖는다. 낮은 점도 및 높은 안정성을 갖는 이러한 2가 이중특이적 항체는 예를 들면, 피하 투여에 사용될 수 있는 매우 농축된 제형/조성물에 특히 유용하다.
따라서, 본 발명의 일 실시양태는,
(a) 100 mg/ml에서 점도가 (실시예 18에서 특정된 바와 같이) 4.0 mPa-s 이하(및/또는 70 mg/ml에서 점도가 3.0 mPa-s 이하이고/이거나, 150 mg/ml에서 점도가 8.5 mPa-s 이하임)이고;
(b) 응집 온도가 (실시예 18에서 특정된 바와 같이) 55℃ 이상인, 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 2가 항체이다.
응집 온도는 DLS 응집 개시 온도를 지칭한다(실시예 18 참조).
일 실시양태에서 상기 이중특이적 항체는 예를 들면, 국제특허출원공개 제 2010/112193 호에 기재된 바와 같이 크놉스-대-홀스 기법을 포함하여 2개의 항원 TWEAK 또는 IL17 중 하나에 특이적으로 결합하는 전장 항체에 비해 2개의 항원 TWEAK 또는 IL17 중 다른 것에 특이적으로 결합하는 하나의 중쇄 scFab 단편의 하나의 C-말단에서만 융합된 포맷, 또는 예를 들면, 국제특허출원공개 제 2010/115589 호 또는 국제특허출원공개 제 2011/028952 호에 기재된 바와 같이 크놉스-대-홀스 기법을 포함하여 2개의 항원 TWEAK 또는 IL17 중 하나에 특이적으로 결합하는 전장 항체에 비해 2개의 항원 TWEAK 또는 IL17 중 다른 것이 특이적으로 결합하는 하나의 중쇄 VH 또는 VH-CH1 단편의 하나의 C-말단에서 및 제 2 중쇄 VL 또는 VL-CL 단편의 다른 C-말단에서 융합된 포맷을 사용하는 3가이다.
일 실시양태에서 본 발명에 따른 인간 TWEAK 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 예를 들면, 국제특허출원공개 제 2007/024715 호, 국제특허출원공개 제 2007/109254 호, 국제특허출원공개 제 2010/112193 호, 국제특허출원공개 제 2010/145792 호 또는 국제특허출원공개 제 2010/145793 호에 기재된 바와 같은 2개의 상이한 특이성을 갖는 4가 항체("4개 결합 암")이다(또한 실시예 14; <Tweak-IL-17> #5 참조).
본 발명의 일 실시양태는 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 4가 항체로서, 서열번호 83 및 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 이중특이적 4가 항체이다.
국제특허출원공개 제 2011/117330 호("이중특이적 한암 scFab 항체")의 이중특이적 2가 항체 포맷 및 국제특허출원공개 제 2010/112193 호의 이중특이적 4가 항체 포맷은 Fab 중쇄 및 경쇄 단편이 펩티드 연결기를 통해 연결된 단일쇄 Fab 단편(scFab)을 포함한다(도 1b 및 2, 뿐만 아니라 국제특허출원공개 제 2011/117330 호 및 국제특허출원공개 제 2010/112193 호 참조). 펩티드 연결기는 전형적으로 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고, 바람직하게는 합성 기원이고 30개 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 30 내지 50개 아미노산 길이(일 실시양태에서 32 내지 40개 아미노산 길이)를 갖는다. 일 실시양태에서 상기 연결기는 (GxS)n[이때, G = 글리신, S = 세린(x = 3, n = 8, 9 또는 10, m = 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n = 6, 7 또는 8, m = 0, 1, 2 또는 3)]이다. 일 실시양태에서 상기 펩티드 연결기는 (G4S)6G2이다.
국제특허출원공개 제 2007/024715 호, 국제특허출원공개 제 2007/109254 호, 국제특허출원공개 제 2010/112193 호, 국제특허출원공개 제 2010/145792 호 또는 국제특허출원공개 제 2010/145793 호의 이중특이적 4가 항체 포맷은 전장 항체에 대한 항원 결합 부위를 연결하기 위한 펩티드 커넥터(connector)를 포함한다. 전형적으로 상기 펩티드 커넥터는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고, 이는 바람직하게는 합성 기원이고 5개 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 5 내지 100개의 아미노산 길이(일 실시양태에서 10 내지 50개의 아미노산 길이; 일 실시양태에서 10 내지 50개의 아미노산 길이)를 갖는다. 일 실시양태에서 상기 펩티드 커넥터는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm[이때, G = 글리신, S = 세린, 및 (x = 3, n= 3, 4, 5 또는 6, m = 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n= 2, 3, 4 또는 5, m = 0, 1, 2 또는 3)]이다. 일 실시양태에서 상기 펩티드 커넥터는 (G3S)3 또는 (G4S)2이다.
본 발명의 추가 실시양태는 본 발명에 따른 중쇄를 암호화하는 핵산의 서열 및 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산의 서열이 1개 또는 2개의 발현 벡터내에 삽입되고, 상기 벡터가 진핵 숙주 세포에 삽입되고, 암호화된 항체가 숙주 세포 또는 상청액으로부터 발현되고 회수되는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 제조 방법이다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 재조합 방법에 의해 제조된다. 상기 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현 및 항체 폴리펩티드의 후속 분리 및 통상적으로 약학적으로 허용되는 순도로의 정제를 포함한다. 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산 또는 그의 단편을 표준 방법에 의해 발현 벡터내에 삽입한다. 발현은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예를 들면, CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모 또는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 세포에서 수행되며, 항체는 세포(상등액으로부터 또는 세포 용해 후에)로부터 회수된다.
항체의 재조합 생산은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17, 183-202 (1999)]; 문헌[Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8, 271-282 (1996)]; 문헌[Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16, 151-160 (2000)]; 문헌[Werner, R.G., Arzneimittelforschung (Drug Res.) 48, 870-880 (1998)]의 선행 논문에 기재되어 있다.
항체는 전세포(whole cell) 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 정제는 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들면, 다른 세포성 핵산 또는 단백질을 컬럼 크로마토그래피 및 당해 분야에 공지된 다른 방법을 포함한 표준 기법에 의해 제거하기 위해 수행된다(예를 들면, 문헌[Ausubel, F. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조).
NS0 세포에서의 발현은, 예를 들면, 문헌[Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32, 109-123 (2000)]; 문헌[Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73, 261-270 (2001)]에 기재되어 있다. 일시적 발현은, 예를 들면, 문헌[Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30, E9 (2002)]에 기재되어 있다. 가변 영역의 클로닝은 문헌[Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837 (1989)]; 문헌[Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4258-4289 (1992)]; 문헌[Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204, 77-87 (1997)]에 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템(HEK 293)은 문헌[Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., Cytotechnology 30, 71-83 (1990)]; 및 문헌[Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194, 191-199 (1996)]에 기재되어 있다.
단클론성 항체는, 예를 들면, 단백질 A-세파로스(Sepharose), 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적절히 분리된다. 단클론성 항체를 암호화하는 DNA 및 RNA는 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 분리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA 및 RNA의 공급원으로 작용할 수 있다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터내로 삽입될 수 있으며, 이어서 숙주 세포에서 재조합 단클론성 항체의 합성을 달성하기 위해, 상기 벡터는 HEK293 세포, CHO 세포, 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내로 형질감염된다.
항-TWEAK/항-IL17 이중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 방법에 의해 제조된다. 상기 방법으로는 천연 공급원으로부터의 분리(천연 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 항-TWEAK/항-IL17 이중특이적 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개(또는 부위-지향) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 프로모터, 번역 개시, 불변 영역, 3' 미번역 영역, 폴리아데닐화 및 전사 종료 서열과 조합되어 발현 벡터 구조물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구조물은 단일 벡터내로 조합되고, 숙주 세포내로 동시-형질감염되거나, 순차 형질감염되거나, 또는 별도로 형질감염되고, 이어서 상기 숙주 세포는 융합되어 두 쇄를 모두 발현하는 단일 숙주 세포를 생성한다.
이중특이적 TWEAK/IL17 항체, 특히 이중특이적 2가 항체는 우수한 발달성 및 생산성(예를 들면, 특이적 생성 조건이 필요한 핫스팟이 함유되지 않음), 우수한 역가 및 수율과 같은 가치있는 특성을 갖고, 많은 양으로 생산 가능하고 비교적 낮은 불순물을 갖는다(2차 컬럼(ESI-MS) > 80% 후 추정된 순도를 갖는 단백질 A(SE-HPLC) 후 > 60% 단량체)(실시예 14 및 15 참조).
약학 조성물
본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 TWEAK/IL17 항체의 약학 조성물은 목적 순도를 갖는 상기 항체를 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 제조된다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]). 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 복용량 및 사용된 농도에서 수용체에게 비독성이고, 비제한적으로 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제(예컨대, 옥타데실 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본원의 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 또한 삽입형 약물 확산제, 예컨대, 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대, rhuPH20(하이레넥스(HYLENEX: 등록상표), 백스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 포함한다. sHASEGP 및 rhuPH20을 포함하는 사용 방법의 특정한 예는 미국특허출원 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 기재되어 있다. 일 양상에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나아제, 예컨대, 콘드로이티나아제와 조합된다.
동결건조된 항체 제형의 예는 미국특허 제 6,267,958 호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국특허 제 6,171,586 호 및 국제특허출원공개 제 2006/044908 호에 기재되어 있는 것을 포함하고, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료될 특정 징후에 대한 요건으로서 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 끼치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 인간 TWEAK 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 (특히 이중특이적 2가) 이중특이적 항체는 특히 가치있는 특성, 예컨대, (항체가 높은 응집 없이 우수한 수율로 생성될 수 있도록) 낮은 점도 및 높은 안정성을 갖는다(실시예 18 참조). 항체의 낮은 점도 및 높은 안정성을 갖는 상기 2가 이중특이적 항체는 예를 들면, 피하 투여에 사용될 수 있는 매우 농축된 제형/조성물에 특히 유용하다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 예를 들면, 상기 언급된 질환의 치료 또는 예방을 위해 단독 활성 성분으로 투여될 수 있거나, 다른 약물, 예를 들면, 면역억제제 또는 면역조절제 또는 다른 항-염증제에 대한 어쥬번트 또는 조합하여 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체는 DMARD, 예를 들면, 금염, 설파살라진, 항말라리아제, 메토트렉세이트, D-페니실린아민, 아자티오프린, 마이코페놀산, 사이클로스포린 A, 타크롤리무스, 실로리무스, 미노사이클린, 레플루노미드, 글루코코르티코이드; 칼시뉴린 억제제, 예를 들면, 사이클로스포린 A 또는 FK 506; 림프구 재순환현상의 조절제, 예를 들면, FTY720 및 FTY720 유사체; mTOR 억제제, 예를 들면, 라파마이신, 40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, CCI779, ABT578, AP23573 또는 TAFA-93; 면역 억제 특성을 갖는 아스코마이신, 예를 들면, ABT-281, ASM981 등; 코르티코스테로이드; 사이클로포스파미드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 레플루노미드; 미조리빈; 마이코페놀산; 마이코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린 또는 면역억제 동족체, 유사체 또는 이의 유도체; 면역억제 단클론성 항체, 예를 들면, 백혈구 수용체에 대한 단클론성 항체, 예를 들면, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 또는 이의 리간드; 다른 면역조절 화합물, 예를 들면, CTLA4의 세포외 도메인의 하나 이상의 부분을 갖는 재조합 결합 분자 또는 이의 돌연변이체, 예를 들면, 비-CTLA4 단백질 서열과 연결된 CTLA4의 적어도 세포외 부분 또는 이의 돌연변이체, 예를 들면, CTLA4Ig(예를 들면, ATCC 68629로 지정됨) 또는 이의 돌연변이체, 예를 들면, LEA29Y; 접착 분자 억제제, 예를 들면, LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 ICAM-3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제; 또는 화학치료제, 예를 들면, 파클리탁셀, 젬시타빈, 시스플라티늄, 독소루비신 또는 5-플루오로우라실; 항 TNF제, 예를 들면, TNF에 대한 단클론성 항체, 예를 들면, 인플릭시맙, 아달리무맙, CDP870, 또는 TNF-RI 또는 TNF-RII에 대한 수용체 구조물, 예를 들면, 엔타네르셉트, PEG-TNF-RI; 전염증성 사이토카인의 차단제, IL-1 차단제, 예를 들면, 아나킨라 또는 IL-1 트랩, AAL160, ACZ 885, IL-6 차단제; 케모카인 차단제, 예를 들면, 프로테아제의 억제제 또는 활성화제, 예를 들면, 메탈로프로테아제, 항-IL-15 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-23 항체, 항-CD20 항체, NSAID, 예컨대, 아스피린 또는 항-감염제와 조합하여 사용될 수 있고, 이는 상기 언급된 약제로 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 하기 약제 중 하나 이상과 조합하거나 첨가하여 제공될 수 있다:
- 사이토카인 작용의 길항제(예를 들면, 사이토카인 신호화 경로에서 작용하는 약제, 예컨대, SOCS 시스템의 조절제), 예컨대, α-, β- 및/또는 γ-인터페론; 인슐린-유사 성장 인자 유형 I(IGF-I)의 조절제, 이의 수용체 및 관련된 결합 단백질; 인터류킨(IL), 예를 들면, IL-1 내지 33 중 하나 이상, 및/또는 인터류킨 길항제 또는 억제제, 예컨대, 아나킨라; 인터류킨 패밀리 원의 수용체의 억제제 또는 상기 수용체의 특이적 하위단위의 억제제; 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 억제제, 예컨대, 항-TNF 단클론성 항체(예를 들면, 인플릭시맙, 아달리무맙 및/또는 CDP-870), 및/또는 TNF 수용체 길항제, 예를 들면, 면역글로불린 분자(예컨대, 엔타네르셉트) 및/또는 저분자량제, 예컨대, 펜톡시필린;
- B 세포의 조절제, 예를 들면, 단클론성 항체 표적화 B-림프구(예컨대, CD20(리툭시맙) 또는 MRA-aIL16R) 또는 T-림프구(예를 들면, CTLA4-Ig, HuMax 11-15 또는 아바타셉트);
- 용골세포 활성을 억제하는 조절제, 예를 들면, RANKL에 대한 항체;
- 케모카인 또는 케모카인 수용체 작용의 조절제, 예컨대, CCR1, CCR2, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR1O 및 CCRI1(C-C 패밀리용)의 길항제; CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5 및 CXCR6(C-X-C 패밀리용) 및 CX3CR1(C-X3-C 패밀리용);
- 기질 메틸로프로테아제(MMP)의 억제제, 즉, 하나 이상의 스트로멜리신, 콜라게나아제 및 겔라티나아제, 뿐만 아니라; 특히 콜라게나아제-1(MMP1), 콜라게나아제-2(MMP8), 콜라게나아제-13(MMP13), 스트로멜리신-1(MMP3), 스트로멜리신-2(MMP10), 및/또는 스트로멜리신-3(MMP11) 및/또는 MMP9 및/또는 MMP12, 예를 들면, 약제, 예컨대, 독시사이클린; 류코트리엔 생합성 억제제, 5-리폭시게나아제(5-LO) 억제제 또는 5-리폭시게나아제 활성화 단백질(FLAP) 길항제, 예컨대, 질류톤; ABT-761; 펜류톤; 테폭살린; 아보트(Abbott)-79175; 아보트-85761; N-(5-치환된)-티오펜-2-알킬설폰아미드; 2,6-다이-3급-부틸페놀하이드라존; 메톡시테트라하이드로피란, 예컨대, 제네카(Zeneca) ZD-2138; 화합물 SB-210661; 피리딘일-치환된 2-시아노나프탈렌 화합물, 예컨대, L-739,010; 2-시아노퀴놀린 화합물, 예컨대, L-746,530; 인돌 및/또는 퀴놀린 화합물, 예컨대, MK-591, MK-886, 및/또는 BAYx1005; 페노티아진-3-ls로 이루어진 군으로부터 선택된 류코트리엔(LT) B4, LTC4, LTD4 및 LTE4에 대한 수용체 길항제, 예컨대, L-651,392; 아미디노 화합물, 예컨대, CGS-25019c; 벤즈옥살라민, 예컨대, 온타졸라스트; 벤젠카복스이미다미드, 예컨대, BIIL 284/260; 및 화합물, 예컨대, 자피루카스트, 아브루카스트, 몬테루카스트, 프란루카스트, 베르루카스트(MK-679), RG-12525, Ro-245913, 이라루카스트(CGP 45715A), 및 BAYx7195; 포스포다이에스터라아제(PDE) 억제제, 예컨대, 메틸잔타닌, 예를 들면, 테오필린 및/또는 아미노필린; 및/또는 선택적 PDE 이소효소 억제제, 예를 들면, PDE4 억제제 및/또는 이소폼 PDE4D의 억제제, 및/또는 PDE5의 억제제;
- 히스타민 유형 1 수용체 길항제, 예컨대, 세티리진, 로라타딘, 데스로라타딘, 펙소페나딘, 아크리바스틴, 테르페나딘, 아스테미졸, 아젤라스틴, 레보카바스틴, 클로르페니라민, 프로메타진, 사이클리진, 및/또는 미졸라스틴(일반적으로 경구적으로, 국소적으로 EH는 비경구적으로 적용됨);
- 양성자 펌프 억제제(예컨대, 오메프라졸) 또는 위장보호활성 히스타민 유형 2 수용체 길항제; 히스타민 유형 4 수용체의 길항제; α-l/α-2 아드레날린 수용체 작용제 혈관수축신경 교감신경흥분제, 예컨대, 프로필헥세드린, 페닐에프린, 페닐프로파놀아민, 에페드린, 슈도에페드린, 나파졸린 하이드로클로라이드, 옥시메타졸린 하이드로클로라이드, 테트라하이드로졸린 하이드로클로라이드, 자일로메타졸린 하이드로클로라이드, 트라마졸린 하이드로클로라이드 및 에틸노르에핀프린 하이드로클로라이드; 콜린억제제, 예를 들면, 무스카린 수용체(Ml, M2 및 M3) 길항제, 예컨대, 아트로핀, 하이오신, 글리코피롤레이트, 이프라트로퓸 브로미드, 티오트로퓸 브로미드, 옥시트로퓸 브로미드, 피렌제핀 및 텔렌제핀;
- β-아드레날린 수용체 작용제(β 수용체 하위유형 1 내지 4 포함), 예컨대, 이소프레날린, 살부타몰, 포르모테롤, 살메테롤, 테르부탈린, 오르시프레날린, 비톨테롤 메실레이트 및/또는 피르부테롤, 예를 들면, 이의 키랄 거울상이성질체;
- 크로몬, 예를 들면, 나트륨 크로모글리케이트 및/또는 네도크로밀 나트륨;
- 글루코코르티코이드, 예컨대, 플루니솔리드, 트라이아미시놀론 아세토나이드, 베클로메타손 다이프로피오네이트, 부데소나이드, 프루티카손 프로피오네이트, 시클레소나이드 및/또는 모메타손 푸로에이트; 핵 호르몬 수용체를 조절하는 약제, 예컨대, PPAR;
- 면역글로불린(Ig) 또는 Ig 제조 또는 Ig 작용을 조절하는 길항제 또는 항체, 예컨대, 항-IgE (예를 들면, 오말리주맙);
- 다른 전신적 또는 국소적으로-적용된 항-염증제, 예를 들면, 탈리도미드 또는 이의 유도체, 레티노이드, 다이트라놀 및/또는 칼시포트리올;
- 아미노살리실레이트 및 설파피리딘의 조합, 예컨대, 설파살라진, 메사살라진, 발살라지드 및 올살라진; 및 면역조절제, 예컨대, 티오푸린 및 코르티코스테로이드, 예컨대, 부데소나이드;
- 항미생물제, 예를 들면, 페니실린 유도체, 테트라사이클린, 마클로라이드, β-락탐, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸 및/또는 흡입용 아미노글리코사이드; 및/또는 항바이러스제, 예를 들면, 아시클로비르, 파미시클로비르, 발라시클로비르, 간시클로비르, 시도포비르; 아만타딘, 리만타딘; 리바비린; 자나마비르 및/또는 오셀타마비르; 프로테아제 억제제, 예컨대, 인디나비르, 넬피나비르, 리토나비르 및/또는 사퀴나비르; 뉴클리오시드 역전사효소 억제제, 예컨대, 디다노신, 라미부딘, 스타부딘, 잘시타빈, 지도부딘; 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 예컨대, 네비라핀, 에파비렌즈; 심혈관제, 예컨대, 칼슘 통로 차단제, β-아드레날린 수용체 차단제, 안지오텐신-전환 효소(ACE) 억제제, 안지오텐신-2 수용체 길항제; 지질 저하제, 예컨대, 스타틴 및/또는 피브레이트; 혈액 세포 형태학 조절제, 예컨대, 펜톡시필린; 트로모볼리틱 및/또는 혈액응고 방지제, 예를 들면, 혈소판 응집 억제제;
- CNS제, 예컨대, 항우울제(예컨대, 세르트랄린), 항-파킨슨 약(예컨대, 데프레닐, L-도파, 로피니롤, 프라미펙솔, MAOB 억제제, 예컨대, 셀레긴 및 라사길린, comP 억제제, 예컨대, 타스마르, A-2 억제제, 도파민 재흡수 억제제, NMDA 길항제, 니코틴 작용제, 도파민 작용제 및/또는 뉴로날 질소 산화물 합성효소의 억제제), 및 항-알츠하이머 약, 예컨대, 도네페질, 리바스티그민, 타크린, COX-2 억제제, 프로펜토필린 또는 메트리포네이트; 급성 및 만선 통증의 치료제, 예를 들면, 중심적으로 또는 말초적으로 작용하는 진통제, 예컨대, 오피오이드 유사체 또는 유도체, 카밤제핀, 페니토인, 나트륨 발프로에이트, 아미트립틸린 또는 다른 항우울제, 파라세타몰 또는 비스테로이드성 항-염증제; 비경구적으로 또는 국소적으로 적용된(흡입을 포함하는) 국소 마취제, 예컨대, 리그노카인 또는 이의 유사체; 항-골다공증제, 예를 들면, 호르몬제 예컨대, 라록시펜 또는 바이포스포네이트, 예컨대, 알렌드로네이트;
(i) 트립타아제 억제제; (ii) 혈소판 활성화 인자(PAF) 길항제; (iii) 인터류킨 전환 효소(ICE) 억제제; (iv) IMPDH 억제제; (v) VLA-4 길항제를 포함하는 접착 분자 억제제; (vi) 카텝신; (vii) 키나아제 억제제, 예를 들면, 티로신 키나아제의 억제제(예컨대, Btk, Itk, Jak3 MAP, 억제제의 예는 게피티닙, 이마티닙 메실레이트를 포함할 수 있음), 세린/트레오닌 키나아제(예를 들면, MAP 키나아제의 억제제, 예컨대, p38, JNK, 단백질 키나아제 A, B 및 C, 및 IKK), 또는 세포 주기 조절에 포함된 키나아제(예를 들면, 실린 의존성 키나아제); (viii) 글루코스-6 포스페이트 탈수소효소 억제제; (ix) 키닌-B-서브1- 및/또는 B-서브2-수용체 길항제; (x) 항-통풍제, 예를 들면, 콜치신; (xi) 잔틴 산화효소 억제제, 예를 들면, 알로푸리놀; (xii) 요산뇨증제, 예를 들면, 프로베네시드, 설핀피라존 및/또는 벤즈브로마론; (xiii) 성장 호르몬 분비촉진제; (xiv) 형질전환 성장 인자(TGF-β); (xv) 혈소판-유도된 성장 인자(PDGF); (xvi) 섬유아세포 성장 인자, 예를 들면, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF); (xvii) 과립성 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF); (xviii) 캡사이신 크림; (xix) 타치키닌 NK-서브1- 및/또는 NK-서브3-수용체 길항제, 예컨대 NKP-608C, SB-233412(탈네탄트) 및/또는 D-4418; (xx) 엘라스타아제 억제제, 예를 들면, UT-77 및/또는 ZD-0892; (xxi) TNF-α 전환 효소 억제제(TACE); (xxii) 유도된 질소 산화물 합성효소(iNOS) 억제제; (xxiii) 화학주성인자 수용체 - TH2 세포에서 발현된 상동 분자(예컨대, CRTH2 길항제); (xxiv) P38의 억제제, (xxv) 톨-유사 수용체(TLR)의 작용을 조절하는 약제, (xxvi) 퓨린 작동성 수용체의 활성을 조절하는 약제, 예컨대, P2X7; 및 (xxvii) 전사 인자 활성화의 억제제, 예컨대, NFkB, API, 및/또는 STATS.
억제제는 특이적일 수 있거나, 혼합된 억제제, 예를 들면, 하나 이상의 분자(예를 들면, 수용체) 또는 상기 언급된 분자 부류의 표적화 억제제일 수 있다.
또한, 이중특이적 항체는 화학치료제 또는 다른 티로신 키나아제 억제제와 회합하여 공투여 또는 면역접합의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체의 단편은 재조합 기작에 의해 또는 생화학적 커플링한 후 상기 기재된 항체의 특이성과 IL-17이 관련된 활성에 포함된 또 다른 분자를 인식할 수 있는 다른 항체의 특이성을 회합함으로써 수득된 이중특이적 항체에 사용될 수 있다. 염증성 질환의 치료를 위해, 본 발명의 이중특이적 항체는 하기 중 하나 이상의 약제와 조합될 수 있다: 예컨대, 국소적으로 또는 전신적으로 적용된 비선택적 사이클로-산소화효소(COX)-I/COX-2 억제제를 포함하는 비스테로이드성 항-염증제(이하 NSAID)(예컨대, 피록시캄, 다이클로페낙, 프로피온산, 예컨대, 나프록센, 플루르비프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜 및 이부프로펜, 페나메이트, 예컨대, 메페남산, 인도메타신, 설린닥, 아자프로파존, 피라졸론, 예컨대, 페닐부타존, 살리실레이트, 예컨대, 아스피린); 선택적 COX-2 억제제(예컨대, 멜록시캄, 셀레콕십, 로페콕십, 발데콕십, 루마로콕십, 파레콕십 및 에토리콕십); 사이클로-산소화효소 억제 질소 산화물 공여체(CINOD); 글루코코르티코스테로이드(국소적, 경구적, 근육내, 정맥내, 또는 관절 내 경로로 투여되는 경우); 메토트렉세이트, 레플루노미드; 하이드록시클로로퀸, d-페니실라민, 아우라노핀, 또는 다른 비경구적 또는 경구적 금 제조; 진통제; 다이아세레인; 관절 내 치료법, 예컨대, 히알루론산 유도체; 및 영양 보충제, 예컨대, 글루코사민.
또한, 본 발명의 이중특이적 항체는 암을 치료하기 위한 종래 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 조합하여 사용하기에 적합한 약제는 다음을 포함한다:
(i) 의료 종양학에 사용된 바와 같은 항증식성/항종양성 약물 및 이의 조합, 예컨대, 알킬화제(예를 들면, 시스-플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판 및 니트로소우레아); 항대사제(예를 들면, 항엽산제, 예컨대, 플루오로피리미딘 유사 5-플루오로우라실 및 테가푸르, 랄티테렉세드, 메토트렉세이트, 사이토신 아라비노시드, 하이드록시우레아, 겜시타빈 및 파클리탁셀; 항종양 항생제(예를 들면, 안트라사이클린 유사 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신 및 미트라마이신); 항세포분열제(예를 들면, 빈카 알칼로이드 유사 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 빈오렐빈, 및 탁소이드 유사 탁솔 및 탁소테레); 및 토포이소머라아제 억제제(예를 들면, 에피포도필로톡신 유사 에토포시드 및 테니포시드, 아마사크린, 토포테칸 및 캄포테신);
(ii) 세포정지제, 예컨대, 항에스트로겐(예를 들면, 타목시펜, 토레미펜, 라록시펜, 드로록시펜 및 요오독시펜), 에스트로겐 수용체 하향 조절제(예를 들면, 풀베스트란트), 항안드로겐(예를 들면, 비카루타미드, 플루타미드, 니루타미드 및 사이프로테론 아세테이트), LHRH 길항제 또는 LHRH 작용제(예를 들면, 고세렐린, 류프로렐린 및 부세렐린), 황체호르몬제(예를 들면, 메게스트롤 아세테이트), 방향화효소 억제제(예를 들면, 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스탄), 및 5-α-환원효소의 억제제, 예컨대, 피나스테리드;
(iii) 암 세포 침입을 억제하는 약제(예를 들면, 메탈로프로테아제 억제제 유사 마리마스타트 및 유로키나아제 플라스미노겐 활성화인자 수용체 작용의 억제제);
(iv) 성장 인자 작용의 억제제, 예를 들면, 성장 인자 항체, 성장 인자 수용체 항체(예를 들면, 항-erbb2 항체 트라투부맙 및 항-erbb1 항체 세툭시맙[C225])를 포함하는 억제제, 파르네실 전이효소 억제제, 티로신 키나아제 억제제 및 세린/트레오닌 키나아제 억제제, 예를 들면, 표피 성장 인자 패밀리의 억제제(예를 들면, EGFR 패밀리 티로신 키나아제 억제제 예컨대, N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(게피티닙, AZD1839), N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민(에를로티닙, OSI-774) 및 6-아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-(3-모폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(CI 1033)), 예를 들면, 혈소판-유도된 성장 인자 패밀리의 억제제 및 예를 들면, 간세포 성장 인자 패밀리의 억제제;
(v) 항혈관형성제, 예컨대, 관다발 내피 성장 인자의 효과를 억제하는 것(예를 들면, 항-관다발 내피 세포 성장 인자 항체 베바시주맙, 예컨대, 국제특허출원공개 제 97/22596 호, 국제특허출원공개 제 97/30035 호, 국제특허출원공개 제 97/32856 호 및 국제특허출원공개 제 98/13354 호에 기재되어 있는 화합물(이들 각각은 이의 전체가 참고로서 본원에 혼입됨)) 및 다른 기작에 의해 작동하는 화합물(예를 들면, 리노미드, 인테그린-α-v-β-3 작용의 억제제 및 안지오스타틴);
(vi) 관다발 손상제, 예컨대, 콤브레타스타틴 A4 및 국제특허출원공개 제 99/02166 호, 국제특허출원공개 제 00/40529 호, 국제특허출원공개 제 00/41669 호, 국제특허출원공개 제 01/92224 호, 국제특허출원공개 제 02/04434 호 및 국제특허출원공개 제 02/08213 호에 기재된 화합물(이들 각각은 이의 전체가 참고로서 본원에 혼입됨);
(vii) 안티센스 치료법, 예를 들면, 상기 나열된 표적에 관한 것, 예컨대, ISIS 2503, 항-라스 안티센스;
(viii) 예를 들면, 비정상 유전자, 예컨대, 비정상 p53 또는 비정상 BRCAl 또는 BRCA2를 대체하기 위한 접근법을 포함하는 유전자 치료 접근법, 예컨대, 사이토신 탈아미노효소, 티미딘 키나아제 또는 세균 질소환원 효소를 사용하는 GDEPT(유전자 유도된 효소 전-약물 치료) 접근법 및 화학치료법 또는 방사선치료법에 대한 환자 저항성을 증가시키기 위한 접근법, 예컨대, 다중-약물 내성 유전자 치료법; 및
(ix) 예를 들면, 종양 환자 세포의 면역성을 증가시키기 위한 생체 외 및 생체 내 접근법, 예컨대, 사이토카인 예컨대, 인터류킨 2, 인터류킨 4 또는 과립성 대식세포 콜로니 자극 인자로의 형질 감염을 포함하는 면역치료 접근법, T 세포 면역성 결핍을 감소시키기 위한 접근법, 형질감염된 면역 세포, 예컨대, 사이토카인 형질감염된 수지상 세포를 사용하는 접근법, 사이토카인 형질감염된 종양 세포주를 사용하는 접근법 및 항-유전자형 항체를 사용하는 접근법.
상기 활성 성분은 의도된 목적에 대하여 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼 중 예를 들면, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스에 의해 제조된 마이크로캡슐 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.
지효성 제제를 제조할 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질을 포함하고, 이때 기질은 성형 제품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체 내 투여를 위해 사용될 수 있는 조성물은 일반적으로 멸균된다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통해 여과함으로써 용이하게 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체, 특히 이중특이적 2가 항체는 하기의 가치있는 생물학적 특성을 갖는다(실시예 3, 4, 10, 11, 16, 17 및 19에 기재된 바와 같은 분석에서 측정됨):
(A) 이중특이적 TWEAK/IL17 항체는,
(a) 0.2 nM 이하의 IC50 값(예를 들면, 0.2 nM 내지 0.0 nM의 IC50 값), 바람직하게는 0.1 nM 이하의 IC50 값(원자가당 IC50으로서 실시예 17에서 측정됨)을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 TWEAK 유도된 증식;
(b) 3.0 nM 이하의 IC50 값(예를 들면, 3.0 nM 내지 0.0 nM의 IC50 값), 바람직하게는 2.0 nM 이하의 IC50 값(실시예 16에서 측정됨)을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 IL17 유도된 IL6 사이토카인 자극; 및
(c) 2.0 nM 이하의 IC50 값(예를 들면, 2.0 nM 내지 0.0 nM의 IC50 값), 바람직하게는 1.5 nM 이하의 IC50 값(실시예 16에서 측정됨)을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 IL17 유도된 IL8 사이토카인 자극
을 억제한다;
(B) 이중특이적 TWEAK/IL17 항체는 인간 <TWEAK> 및 인간 <IL17>에 동시에 결합할 수 있고, 이때 인간 <TWEAK> 및 인간 <IL17>로부터의 1:1 혼합물에 대한 이중특이적 TWEAK/IL17 항체의 결합의 신호 강도(단위: RU)(표면 플라즈몬 공명 분석(실시예 19))는 (a) 인간 <TWEAK> 단독에 대한 이중특이적 TWEAK/IL17 항체의 결합의 신호 강도(단위: RU) 및 (b) 인간 <IL17> 단독에 대한 이중특이적 TWEAK/IL17 항체의 결합의 신호 강도(단위: RU)의 합에 비해 적어도 동일하거나 더 높다(실시예 19에서 측정됨);
(C) 이중특이적 TWEAK/IL17 항체는 IL17B, IL17C, IL17D, IL17F와 교차 반응성을 나타내지 않는다(이는 IL17B, IL17C, IL17D 및 IL17F에 대한 결합이 IL17A에 대한 결합에 비해 0%임을 의미하고, 이는 100%로서 설정된다)(실시예 10에서 측정됨);
(D) 이중특이적 TWEAK/IL17 항체는 2.0 nM 이하의 IC50 값(예를 들면, 2.0 nM 내지 0.0 nM의 IC50 값)을 갖는 CCD-25SK 세포의 IL17 유도된 IL6 사이토카인 자극을 억제한다(실시예 11에서 측정됨);
(E) 이중특이적 TWEAK/IL17 항체는 5.0 nM 이하의 IC50 값(예를 들면, 5.0 nM 내지 0.0 nM의 IC50 값), 바람직하게는 2.0 nM 이하의 IC50 값을 갖는 CCD-25SK 세포의 IL17 유도된 IL8 사이토카인 자극을 억제한다(실시예 11에서 측정됨);
(F) 이중특이적 TWEAK/IL17 항체는 4.0 [ng/ml] 이하의 IC50 값(예를 들면, 4.0 [ng/ml] 내지 0.0 [ng/ml]의 IC50 값), 바람직하게는 3.0 [ng/ml] 이하의 IC50 값을 갖는 인간 TWEAK/인간 Fn14 상호작용을 억제한다(실시예 4에서 측정됨);
(G) 이중특이적 TWEAK/IL17 항체는 0.1 nM 이하의 결합 친화성의 KD 값을 갖는 인간 TWEAK에 결합하고, 0.3 nM 이하의 결합 친화성의 KD 값을 갖는 인간 IL-17에 결합한다(실시예 19에서 측정됨); 및/또는
(H) 이중특이적 TWEAK/IL17 항체는 100 분 이상 동안 25℃에서 비아코어에 의해 측정된 가용성 인간 TWEAK(서열번호 6의 아미노산 99 내지 249)와 항체 사이의 착체의 반감기를 나타낸다(실시예 19에서 측정됨).
용어 "인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)"은 RA 환자(인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA))로부터 수득된 인간 성인 섬유아세포-유사 활막세포, 예를 들면, 셀 어플리캐이션 인코포레이티드(Cell Applications Inc.), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 수득가능한 HFLS-RA(카탈로그 번호 408RA-05a)를 지칭한다. 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스 관절염(HFLSRA)은 류마티스 관절염(RA) 환자로부터 수득된 활액 조직으로부터 단리된다. 이는 두번째 관에서 저온 보존되고 5 이상의 집단 두배 증가로 번식한다. HFLS는 연골 저하에 기여하는 사이토카인 및 메탈로프로테아제를 생성함으로써 관절 파괴에 대한 이들의 역할은 오래도록 공지되었다(문헌[Firestein, G.S., et al., J. Immunol. 149 (1992) 1054]; 문헌[Firestein, G.S., et al., Arthritis and Rheumatism 37(5) (1994) 644]). 전-염증성 사이토카인은 증식, 콜라게나아제 및 아그레카나아제 생성, 및 HFLS 상에서 GM-CSF 분비를 유도한다(문헌[Alvaro, J.M., et al., J. Clin. Immunol. 13(3) (1993) 212]; 문헌[Yamanishi, Y., et al., J. Immunol. 168(3) (2002) 1405]). 또한, 진행중인 관절염 연구는 HFLS가 세포자멸 및 P53 돌연변이를 발현함을 나타낸다(문헌[Firestein, G.S., et al., J. Clin. Invest. 96 (1995) 1631]; 문헌[Firestein, G.S., et al., Am. J. Pathol. 148(6) (1996) 2143]). 본 발명자들은 HFLS-RA와 HFLS-OA 사이의 차이를 연구하기 위한 유용한 세포 모델인 HFLS의 2개 유형, 예컨대, 프로테아제의 발현 및 조절(문헌[Firestein, G.S., et al., Am. J. Pathol. 148(6) (1996) 2143]) 및 인테그린 서브유닛(문헌[Rinaldi, N., et al., Ann. Rheum. Dis. 56(12) (1997) 729])을 제공한다.
"IL17 유도된 IL6 또는 IL8 사이토카인 자극"은 인간 IL17에 의한 인간 IL6 또는 인간 IL8 사이토카인 자극을 지칭한다. 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 TWEAK 유도된 증식 및 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 IL17 유도된 IL6 사이토카인 자극에 대한 IC50 값은 (각각의 항원(실시예 16 중 IL17 및 실시예 17 중 TWEAK)에 대한 결합 암 당)) 원자가 당 IC50 값으로 계산된다. 이는 각 항원에 대하여 1개 결합 암을 갖는(즉, 각 항원에 대하여 1가인) 이중특이적 2가 항체를 의미하고, IC50 값은 (실시예 16 및 17의) 측정된 IC50 값과 동일하다. 각 항원에 대하여 2개 결합 암을 갖는(즉, 각 항원에 대하여 2가인) 이중특이적 4가 항체와 상기 1가 결합을 비교하기 위해, IC50 값을 결합 암의 이중 몰 농도가 IC50을 달성하도록 사용됨으로써, IC50 값이 (결합 암 당 상응하는 50% 억제 농도를 수득하도록) 2배가 되는 가정으로 계산하였다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체의 치료 효과량을 환자에게 투여하는, 상기 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법을 포함한다.
본 발명은 암, 특히 대장암, 폐암 또는 췌장암의 치료용 약제, 또는 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 전신성 홍반성 루푸스 또는 루푸스 신염의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 암 또는 염증 질환, 바람직하게는 대장암, 폐암 또는 췌장암의 치료 또는 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 암 또는 염증 질환, 바람직하게는 전신성 홍반성 루푸스 또는 루푸스 신염의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 본 발명은 암, 특히 대장암, 폐암 또는 췌장암, 또는 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 건선, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상을 앓고 있는 환자의 (치료에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는) 치료를 위한 본 발명에 따른 인간 TWEAK 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 전신성 홍반성 루푸스 또는 루푸스 신염을 앓고 있는 환자의 (치료에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는) 치료를 위한 본 발명에 따른 인간 TWEAK 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 다양한 염증성, 면역성 및 증식성 질환, 예컨대 류마티스성 관절염(RA), 골관절염, 류마티스성 관절염 골다공증, 염증성 섬유증(예를 들면, 경피증, 폐 섬유증 및 간경변), 치은염, 치주염 또는 다른 염증성 치주 질환, 염증성 장 질환(예를 들면, 크론병, 궤양성 대장염 및 염증성 장 질환), 천식(알레르기성 천식 포함), 알러지, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 다발성 경화증, 건선 및 암, 강직성 척추염, 전신성 경화증, 건선성 관절염, 염증성 관절염, 골관절염, 염증성 관절 질환, 자가면역 질환,예컨대 자가면역 맥관염, 다발성 경화증, 루푸스, 당뇨병(예를 들면, 인슐린 당뇨병), 염증성 장 질환, 이식 거부, 이식편대숙주병, 및 압박, 염좌, 연골 손상, 외상, 정형 외과, 감염 또는 다른 질환 과정으로부터 야기된 염증성 상태의 (치료에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는) 치료를 위한 본 발명에 따른 인간 TWEAK 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체의 용도를 포함한다. 면역계의 장애에 의해 영향받은 다른 질환은 비제한적으로 알러지를 포함하는 본 발명의 범주 내에 포괄된다.
본 발명의 이중특이적 항체는 특히 자가면역 질환 및 염증성 상태, 특히 자가면역 성분을 포함하는 병인학을 갖는 염증성 상태, 예컨대, 관절염(예를 들면, 류마티스성 관절염, 관절염 만성 진행 및 관절염 기형) 및 류마티스성 질환, 예컨대, 염증성 상태 및 골 손실을 포함하는 류마티스성 질환, 염증성 통증, 척추관절증, 예컨대, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선성 관절염 및 장질환 관절염, 과민증(기도 과민증 및 표피 과민증 둘다 포함) 및 알러지의 치료, 예방 또는 완화에 유용하다. 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체가 사용될 수 있는 것에 대한 특이적 자가면역 질환은 자가면역 혈액학적 장애(예를 들면, 용혈성 빈혈, 무력성 빈혈, 순수 적혈구성 빈혈 및 특발성 혈소판 감소증 포함), 전신성 홍반성 루푸스, 염증성 근육 질환, 다발연골염, 경피증, 베게너 육아종증, 피부근염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루, 자가면역 염증성 장 질환(예를 들면, 궤양성 대장염, 크론병 및 과민성 장 증후군 포함), 내분비성 눈병증, 그레이브즈병, 유육종증, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경변, 소아 당뇨병(진성 당뇨병 유형 I), 포도막염(전측 및 후측), 건성각결막염 및 아토피성 결막염, 간질성 폐 섬유증, 건선성 관절염 및 사구체신염(신장 증후군이 있거나 없는, 예를 들면, 발성 신장 증후군 또는 미세 변화 신증 포함), 종양, 다발성 경화증, 피부 및 각막의 염증성 질환, 근염, 골 이식의 완화, 대사성 질환, 예컨대, 죽상동맥경화증, 당뇨병, 및 이상지질혈증을 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 천식, 기관지염, 진폐증, 폐기종, 및 기도의 다른 폐쇄성 또는 염증 질환의 치료, 예방 또는 완화에 유용하다.
또한, 본 발명은 상기 질환을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 효과량으로 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법 및 상기 방법을 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 암, 특히 대장암, 폐암 또는 췌장암, 또는 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 약제의, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제조하기 위한 효과량으로 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 자가면역 질환 및 염증성 상태, 특히 자가면역 성분을 포함하는 병인학적 염증성 상태, 예컨대, 관절염(예를 들면, 류마티스성 관절염, 관절염 만성 진행 및 관절염 기형) 및 류마티스성 질환, 예컨대 염증성 상태 및 골 손실을 포함하는 류마니스성 질환, 염증성 통증, 척추관절증, 예컨대 강직성 척추염, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선성 관절염, 및 장질환 관절염, 과민증(기도 과민증 및 표피 과민증 포함) 및 알러지를 앓고 있는 환자의 치료를 위한 약제, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제조하기 위한 효과량으로 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체가 사용될 수 있는 것에 대하여 특이적인 자가면역 질환은 자가면역 혈액학적 장애(예를 들면, 용혈성 빈혈, 무력성 빈혈, 순수 적혈구성 빈혈 및 특발성 혈소판 감소증 포함), 전신성 홍반성 루푸스, 염증성 근육 질환, 다발연골염, 경피증, 베게너 육아종증, 피부근염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루, 자가면역 염증성 장 질환(예를 들면, 궤양성 대장염, 크론병 및 과민성 장 증후군 포함), 내분비성 눈병증, 그레이브즈병, 유육종증, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경변, 소아 당뇨병(진성 당뇨병 유형 I), 포도막염(전측 및 후측), 건성각결막염 및 아토피성 결막염, 간질성 폐 섬유증, 건선성 관절염 및 사구체신염(신장 증후군이 있거나 없는, 예를 들면, 특발성 신장 증후군 또는 미세 변화 신증 포함), 종양, 다발성 경화증, 피부 및 각막의 염증성 질환, 근염, 골 이식의 완화, 대사성 질환, 예컨대, 죽상동맥경화증, 당뇨병, 및 이상지질혈증을 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 천식, 기관지염, 진폐증, 폐기종, 및 기도의 다른 폐색성 또는 염증 질환의 치료, 예방 또는 완화에 유용하다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 치료 방법 중 임의로 사용하기 위한 조성물, 예를 들면, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 TWEAK/IL17 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제 및 항진균제, 등장성 및 흡착/흡수 지연제를 포함하고, 이는 생리학적으로 호환가능하다. 바람직하게는, 담체는 주사 또는 주입에 적합할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 당업자에게 이해될 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적 결과에 따라 다를 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성 물질을 위한 상기 매질 및 약제의 용도는 당해 분야에 공지되어 있다. 물에 첨가하여, 담체는 예를 들면 등장성 완충된 식염수일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 이중특이적 TWEAK/IL17 항체 및 예를 들면, 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료법에서 단독으로 또는 다른 약제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 면역억제제 또는 면역조절제 또는 다른 항-염증제이다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체는 DMARD, 예를 들면, 금염, 설파살라진, 항말라리아제, 메토트렉세이트, D-페니실라민, 아자티오프린, 마이코페놀산, 사이클스포린 A, 타크롤리무스, 시롤리무스, 미노사이클린, 레플루노미드, 글로코코르티코이드; 칼시뉴린 억제제, 예를 들면, 사이클로스포린 A 또는 FK 506; 림프구 재순환 조절제, 예를 들면, FTY720 및 FTY720 유사체; mTOR 억제제, 예를 들면, 라파마이신, 40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, CCI779, ABT578, AP23573 또는 TAFA-93; 면역억제성을 갖는 아스코마이신, 예를 들면, ABT-281, ASM981 등; 코르티코스테로이드; 사이클로포스파미드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 레플루노미드; 미조리빈; 마이코페놀산; 마이코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린 또는 이의 면역억제 동족체, 유사체 또는 유도체; 면역억제 단클론성 항체, 예를 들면, 백혈구 수용체에 대한 단클론성 항체, 예를 들면, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD4, CD45, CD58, CD80, CD86 또는 이의 리간드; 다른 면역조절 화합물, 예를 들면, CTLA4의 세포외 도메인의 적어도 일부 또는 이의 돌연변이체를 갖는 재조합 결합 분자, 예를 들면, 비-CTLA4 단백질 서열에 연결된 CTLA4의 적어도 세포외 부분 또는 이의 돌연변이체, 예를 들면, CTLA4Ig(예를 들면, 지정된 ATCC 68629) 또는 이의 돌연변이체, 예를 들면, LEA29Y; 접착 분자 억제제, 예를 들면, LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 ICAM-3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제; 또는 화학치료제, 예를 들면, 파클리탁셀, 겜시타빈, 시스플라티늄, 독소루비신 또는 5-플루오로우라실; 항-TNF제, 예를 들면, TNF에 대한 단클론성 항체, 예를 들면, 인플릭시맙, 아달리무맙, CDP870, 또는 TNF-RI 또는 TNF-RII에 대한 수용체 구조물, 예를 들면, 에타네르셉트, PEG-TNF-RI; 전염증성 사이토카인의 차단제, IL-1 차단제, 예를 들면, 아나킨라 또는 IL-1 트랩, AAL160, ACZ 885, IL-6 차단제; 케모카인 차단제, 예를 들면, 프로테아제의 억제제 또는 활성화제, 예를 들면, 메탈로프로테아제, 항-IL-15 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-23 항체, 항-CD20 항체, NSAID, 예컨대, 아스피린 또는 항-감염제와 조합하여 사용될 수 있다(상기 목록은 언급된 약제로 제한되지 않음).
상기 언급된 이러한 조합 치료법은 혼합된 투여(이때, 2개 이상의 치료제는 동일하거나 별개의 제형에 포함됨), 및 별개의 투여를 포함하고, 이 경우 본 발명의 항체의 투여는 추가 치료제 및/또는 어쥬번트의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 발생할 수 있다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가 치료제)는 임의의 적합한 방식, 예컨대 비경구적으로, 폐내로 및 비강내로 투여될 수 있고, 국소 치료가 필요한 경우, 병소내 투여될 수 있다. 비경구적 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 투여가 간단하거나 만성인지의 여부에 따라 예를 들면, 주사에 의해, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 임의의 적합한 방식일 수 있다. 다양한 시점상에서 비제한적으로 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄즈 투입을 포함하는 다양한 투여 일정은 본원에 명시되어 있다.
본 발명의 항체는 우수한 의료 실시와 일치하는 방식으로 제형화되고, 복용되고 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자는 치료될 특정 질환, 치료될 특정 포유동물, 개별적인 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료진에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 필요하지 않지만, 임의적으로 논의되는 질환의 예방 또는 치료에 현재 사용되는 하나 이상의 약제로 제형화된다. 이러한 다른 약제의 효과량은 제형에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따른다. 이는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 동일한 투여량 및 투여 경로로, 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 적합하도록 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위하여, (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 함께 사용된 경우) 본 발명의 항체의 적합한 투여량은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정에 따르고, 이때 항체는 예방적 또는 치료적 목적, 선행 치료법, 환자의 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 지시에 따라 투여된다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료로 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.5 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가 예를 들면, 하나 이상의 별개의 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 질환에 따라 여러 날 이상으로 반복 투여하기 위해, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적 억제가 발생할 때까지 지속될 수 있다. 항체 투여량의 한 예는 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이의 임의의 조합) 중 하나 이상이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 투여는 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주 마다(예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 항체를 받도록) 투여될 수 있다. 초기에 높게 적재한 투여량 후 하나 이상의 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 투여 양생법의 예는 투여를 포함한다. 그러나, 다른 투여 양생법이 유용할 수 있다. 이 치료 과정은 통상적인 기법 및 분석으로 용이하게 모니터링된다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 숙련된 전문가에게 공지되어 있는 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화된다.
본 발명의 약학 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준은, 환자에게 독성이 없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 목적하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양(효과량)을 수득하기 위해 달라질 수 있다. 선택된 투여 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스터, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출률, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태, 일반적인 건강상태 및 이전의 병력, 및 의료 분야에서 공지되어 있는 유사 요인들을 포함한 다양한 약동학적 요인들에 따라 달라질 것이다.
제품
본 발명의 또 다른 양상에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 용기 및 라벨 또는 포장 삽입물 또는 용기와 관련된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 그 자체에 의해 또는 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하고, 멸균 주입 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사기 바늘에 의해 관통가능한 스토퍼를 갖는 바이알 일 수 있다). 조성물 중 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 조성물이 나타낸 라벨 또는 포장 삽입물은 질환을 치료하기 위한 선택에 사용된다. 더욱이, 제품은 (a) 이에 함유된 조성물을 갖는 제 1 용기(이때, 조성물은 본 발명의 항체를 포함함); 및 이에 함유된 조성물을 갖는 제 2 용기(이때, 조성물은 추가 세포독성제 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함함)를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서 제품은 조성물이 특정 질환을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 주사용 세균 발육 억제수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는 상업적인 사용자의 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
서열의 설명
Figure 112014105932313-pct00001
Figure 112014105932313-pct00002
하기에서, 본 발명의 실시양태가 나열된다:
1. 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체.
2. 제 1 실시양태에 있어서,
이중특이적 항체가,
(a) 0.2 nM 이하의 IC50 값을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 TWEAK 유도된 증식;
(b) 3.0 nM 이하의 IC50 값을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 IL17 유도된 IL6 사이토카인 자극; 및
(c) 2.0 nM 이하의 IC50 값을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 IL17 유도된 IL8 사이토카인 자극
을 억제하는, 이중특이적 2가 항체.
3. 제 1 실시양태에 있어서,
이중특이적 항체가 2가인, 이중특이적 2가 항체.
4. 제 1 실시양태 내지 제 3 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
(i) 제 1 항원 결합 부위가,
(a) 서열번호 17의 CDR1H, 서열번호 18의 CDR2H, 서열번호 19의 CDR3H, 및 서열번호 20의 CDR1L, 서열번호 21의 CDR2L, 서열번호 22의 CDR3L;
(b) 서열번호 1의 CDR1H, 서열번호 2의 CDR2H, 서열번호 3의 CDR3H, 및 서열번호 4의 CDR1L, 서열번호 5의 CDR2L, 서열번호 6의 CDR3L ; 또는
(c) 서열번호 9의 CDR1H, 서열번호 10의 CDR2H, 서열번호 11의 CDR3H, 및 서열번호 12의 CDR1L, 서열번호 13의 CDR2L, 서열번호 14의 CDR3L을 포함하고;
(ii) 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 47의 CDR1H, 서열번호 48의 CDR2H, 서열번호 49의 CDR3H, 및 서열번호 50의 CDR1L, 서열번호 51의 CDR2L, 서열번호 52의 CDR3L을 포함하는, 이중특이적 항체.
5. 제 4 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 키메라 또는 인간화된 변이체.
6. 제 1 실시양태 내지 제 3 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
(i) 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 35의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 26, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 또는 서열번호 46의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
(ii) 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 55 또는 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 57 또는 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
7. 제 1 실시양태 내지 제 3 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
(i) 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
(ii) 제 2 항원 결합 부위가, (a) 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인, 또는 (b) 서열번호 55의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 57의 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
8. 제 1 실시양태 내지 제 3 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
(i) 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
(ii) 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
9. 제 1 실시양태 내지 제 3 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
(i) 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
(ii) 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 55의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 57의 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
10. 제 1 실시양태 내지 제 9 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
IgG1 또는 IgG4 아형인, 이중특이적 항체.
11. 제 1 실시양태 내지 제 10 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
돌연변이 L234A 및 L235A(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 IgG1 아형인, 이중특이적 항체.
12. 제 1 실시양태 내지 제 11 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 IgG1 아형인, 이중특이적 항체.
13. 제 1 실시양태 내지 제 12 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
돌연변이 S228P 및 L235E(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 IgG4 아형인, 이중특이적 항체.
14. 제 1 실시양태 내지 제 13 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
돌연변이 S228P, L235E 및 P329G(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 IgG4 아형인 이중특이적 항체.
15. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물.
16. 약학 조성물의 제조를 위한 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체의 용도.
17. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,
암, 또는 염증 질환, 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상의 치료에 사용하기 위한 항체.
18. 암, 또는 염증 질환, 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상의 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체의 용도.
19. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 암호화하는 핵산.
20. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 발현을 위한 제 19 실시양태에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
21. 제 20 실시양태에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
22. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제 19 실시양태에 따른 핵산을 발현하고 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 재조합 항체를 회수하는, 상기 항체의 제조 방법.
23. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 환자에게 투여함을 포함하는, 암, 또는 염증 질환, 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상을 앓고 있는 환자의 치료 방법.
하기의 실시예, 도면 및 서열 목록은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부한 특허청구범위에 나타나 있다. 본 발명의 진의로부터 벗어나지 않고 나타낸 절차에 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
재료 및 일반적인 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열들에 대한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제공되어 있다. 항체 불변 쇄의 아미노산은 카밧의 EU 지수에 따라 넘버링되고 지칭된다(문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)]).
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기재된 표준 방법을 이용하여 DNA를 조작하였다. 제조자의 지시에 따라 분자생물학적 약제들을 사용하였다.
유전자 합성
화학적 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 원하는 유전자 분절을 제조할 수 있다. 단일 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단 부위에 의해 배치된 상기 유전자 분절을, PCR 증폭을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션으로 조립한 후 표시된 제한 부위, 예를 들면, KpnI/SacI 또는 AscI/PacI을 통해 pPCRScript(Stratagene(스트라타진)) 계열의 pGA4 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
유전자 합성 단편들은 진아트(Geneart, 독일 레겐스부르그 소재)에서 주어진 요건에 따라 순서대로 정돈되었다. Tweak/IL-17 이중특이적 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 모든 유전자 분절들은 진핵세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 코딩하는 5' 말단 DNA 서열을 갖고 합성된 유전자의 5' 말단 및 3' 말단에서 유일한 제한 부위를 갖도록 합성되었다. 이황화 안정화된 "크놉스-대-홀스" 변형된 중쇄를 보유하는 DNA 서열은 "크놉스" 중쇄 내에 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖고 "홀" 중쇄 내에 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖도록 디자인되었다.
DNA 서열 결정
DNA 서열은 메디게노믹스 게엠베하(MediGenomix GmbH, 독일 마르틴스리에드 소재) 또는 시퀴서브 게엠베하(Sequiserve GmbH, 독일 바터스테텐 소재)에서 수행된 이중 가닥 서열에 의해 결정되었다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
GCG(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 소프트웨어 팩키지 버전 10.2 및 인포맥스(Infomax) 벡터 NT1 어드밴스 스위트 버전 11.5를 서열 생성, 맵핑, 분석, 해석 및 예시에 사용하였다.
발현 벡터
전술된 항체의 발현을 위해, CMV-인트론 A 프로모터를 갖는 cDNA 구성 또는 CMV 프로모터를 갖는 게놈 구성에 의거한 (예를 들면, HEK293 EBNA 또는 HEK293-F 세포에서의) 일시적 발현 또는 (예를 들면, CHO 세포에서의) 안정한 발현을 위한 발현 플라스미드의 변이체들을 적용하였다.
IgG4_SPLE의 경우에, CH1 도메인과 힌지 도메인 사이의 인트론은 제거되고, 유전자 조직에서 항체 유전자의 나머지를 유지한다. IgG4_SPLE의 인트론-결실된 버전은 더이상 총 유전자 조직에서 암호화된 IgG4_SPLE에서 통상적으로 보이는 스플라이싱 인공물의 결과로서 힌지없는 항체를 나타내지 않는다.
항체 발현 카세트 이외에, 벡터는
- 에스케리키아 콜라이 내에서 이 플라스미드의 복제를 허용하는 복제기점; 및
- 에스케리키아 콜라이 내에서 엠피실린 내성을 부여하는 β-락타마제(lactamase) 유전자
를 함유하였다.
항체 유전자의 전사 유닛(unit)은 하기 요소들로 구성된다:
- 5' 말단에 존재하는 유일한 제한 부위;
- 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터;
- cDNA 조직화의 경우 인트론 A 서열;
- 인간 항체 유전자의 5'-비번역 영역;
- 면역글로불린 중쇄 신호 서열;
- 면역글로불린 엑손-인트론 구성을 갖는 cDNA 또는 게놈 구성으로서의 인간 항체 쇄(중쇄, 변형된 중쇄 또는 경쇄);
- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3'-비번역 영역; 및
- 3' 말단에 존재하는 유일한 제한 부위.
일시적 형질감염 및 안정한 형질감염을 위해, 형질전환된 에스케리키아 콜라이 배양물로부터의 플라스미드 제제(뉴클레오본드 에이엑스(Nucleobond AX), 마슈리-나겔(Macherey-Nagel))를 사용하여 보다 많은 양의 플라스미드를 제조하였다.
세포 배양 기법
문헌[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.]에 기재된 바와 같이 표준 세포 배양 기법을 이용하였다.
HEK293 -F 시스템에서의 일시적 형질감염
제조자의 지시(인비트로겐(Invitrogen), 미국 소재)에 따라 프리스타일(FreeStyle: 상표) 293 발현 시스템을 사용하여 인간 배아 신장 293-F 세포를 일시적으로 형질감염시킴으로써 재조합 면역글로불린 변이체를 발현시켰다. 요약하건대, 현탁액 프리스타일(상표) 293-F 세포를 37℃/8% CO2에서 프리스타일(상표) 293 발현 배지 중에서 배양하고, 상기 세포를 형질감염 당일 1 x 106 내지 2 x 106개 생존 세포/㎖의 밀도로 새로운 배지 내에 시딩하였다. 단일특이적 모 항체에 대한 250 ㎖ 최종 형질감염 부피를 위해 325 ㎕의 293펙틴(fectin: 상표)(인비트로겐, 독일 소재) 및 250 ㎍의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA를 1:1 몰비로 사용하여 옵티(Opti)-MEM(등록상표) I 배지(인비트로겐, 미국 소재) 중에서 DNA-296펙틴(상표) 착체를 제조하였다. 250 ㎖ 최종 형질감염 부피를 위해 325 ㎕의 293펙틴(상표)(인비트로겐, 독일 소재) 및 250 ㎍의 "크놉스-대-홀스" 중쇄 1, 2 및 경쇄 플라스미드 DNA를 일반적으로 1:1:1 몰비로 사용하여 옵티-MEM(등록상표) I 배지(인비트로겐, 미국 소재) 중에서 2개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 갖는 "크놉스-대-홀스" DNA-293펙틴 착체를 제조하였다. 이에 대한 포맷은 국제특허출원공개 제 2011/117330 호("이중특이적 한암 scFab 항체")에 기재되어 있다. 발현 수율 및 생성 질의 최적화를 위해, 상기 비를 변경시킬 수 있다. 250 ㎖ 최종 형질감염 부피를 위해 325 ㎕의 293펙틴(상표)(인비트로겐, 독일 소재) 및 250 ㎍의 "크놉스-대-홀스" 중쇄 1, 2 및 경쇄 1, 2 플라스미드 DNA를 1:1:1:1 몰비로 사용하여 옵티-MEM(등록상표) I 배지(인비트로겐, 미국 소재) 중에서 DNA-293펙틴 착체를 제조하였다(이에 대한 포맷은 국제특허출원공개 제 2009/080253 호("크로스맵" 또는 "CH1-CL 도메인 교환된 항체)에 기재되어 있다). 발현 수율 및 생성 질의 최적화를 위해, 상기 비를 변경시킬 수 있다. 항체 함유 세포 배양물 상청액을 14000 g에서 30분 동안 원심분리하여 형질감염으로부터 7일 후 회수하고 멸균 필터(0.22 ㎛)를 통해 여과하였다. 상청액을 정제할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
단백질 측정
문헌[Pace, C.N., et. al., Protein Science 4 (1995) 2411-1423]에 따라 아미노산 서열에 의거하여 계산된 몰 흡광계수를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 측정하였다.
상청액 중의 항체 농도 측정
단백질 A 아가로스 비드(로슈(Roche))를 사용하는 면역침전을 이용하여 세포 배양물 상청액 중의 항체 및 유도체의 농도를 평가하였다. 60 ㎕의 단백질 A 아가로스 비드를 TBS-NP40(50 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% 노니데트(Nonidet)-P40)으로 3회 세척하였다. 그 후, 1 내지 15 ㎖의 세포 배양물 상청액을 TBS-NP40에 의해 미리 평형화된 단백질 A 아가로스 비드에 인가하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 상기 비드를 울트라프리-MC-필터 컬럼(아미콘(Amicon)) 상에서 0.5 ㎖ TBS-NP40으로 1회 세척하고, 0.5 ㎖ 2x 포스페이트 완충 식염수(2x PBS, 로슈)로 2회 세척하고, 0.5 ㎖ 100 mM Na-시트레이트(pH 5.0)로 짧게 4회 세척하였다. 35 ㎕의 누페이지(NuPAGE: 등록상표) LDS 샘플 완충제(인비트로겐)를 첨가하여 결합된 항체를 용출하였다. 샘플의 절반을 누페이지(등록상표) 샘플 환원제와 조합하거나 미환원된 상태로 놓아두고, 70℃에서 10분 동안 가열하였다. 그 후, 20 ㎕를 (비환원된 SDS-PAGE의 경우 MOPS 완충제를 사용하고, 환원된 SDS-PAGE의 경우 누페이지(등록상표) 항산화제 런닝 완충제 첨가제(인비트로겐)를 갖는 MES 완충제를 사용하는) 4 내지 12% 누페이지(등록상표) 비스-트리스 SDS-PAGE(인비트로겐)에 인가하고, 코마시 블루(Coomassie Blue)로 염색하였다.
세포 배양물 상청액 중의 항체 및 유도체의 농도를 단백질 A-HPLC 크로마토그래피로 측정하였다. 요약하건대, 단백질 A에 결합하는 항체 및 유도체를 함유하는 세포 배양물 상청액을 완충제(50 mM K2HPO4 및 300 mM NaCl, pH 7.3) 중에서 하이트랩(HiTrap) 단백질 A 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))에 인가하고, 다이오넥스(Dionex) HPLC 시스템 상에서 550 mM 아세트산(pH 2.5)을 사용하여 매트릭스로부터 용출하였다. 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 대역의 적분으로 정량하였다. 정제된 표준 IgG1 항체를 표준물로서 사용하였다.
대안적으로, 세포 배양물 상청액 중의 항체 및 유도체의 농도를 샌드위치-IgG-ELISA로 측정하였다. 요약하건대, 스트렙타웰 하이 바인드(StreptaWell High Bind) 스트렙타비딘 A-96 웰 마이크로타이터 플레이트(로슈)를 실온에서 1시간 동안, 또는 대안적으로 4℃에서 밤새 동안 0.1 ㎍/㎖의 농도로 100 ㎕/웰의 바이오티닐화된 항-인간 IgG 포획 분자 F(ab')2<h-Fcγ>BI(다이아노바(Dianova))로 코팅한 후, 200 ㎕/웰의 0.05% 트윈 함유 PBS(PBST, 시그마)로 3회 세척하였다. 각각의 항체 함유 세포 배양물 상청액의 일련의 PBS(시그마) 희석물을 웰 당 100 ㎕씩 웰에 첨가하고, 실온에서 마이크로타이터플레이트 진탕기 상에서 1 내지 2시간 동안 항온처리하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 PBST로 3회 세척하고, 실온에서 마이크로타이터플레이트 진탕기 상에서 1 내지 2 시간 동안 0.1 ㎍/㎖의 농도로 100 ㎕의 F(ab')2<hFcγ>POD(다이아노바)를 검출 항체로서 사용하여 결합된 항체를 검출하였다. 비결합된 검출 항체를 200 ㎕/웰의 PBST로 3회 세척하고, 100 ㎕/웰의 ABTS를 첨가하여 결합된 검출 항체를 검출하였다. 405 nm(기준 파장 492 nm)의 측정 파장에서 테칸 플루오르(Tecan Fluor) 분광계 상에서 흡광도의 측정을 수행하였다.
이중특이적 항체의 정제
단백질 A-세파로스(상표)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)를 사용하는 친화성 크로마토그래피 및 수퍼덱스200 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 세포 배양물 상청액으로부터 이중특이적 항체를 정제하였다. 요약하건대, 멸균 여과된 세포 배양물 상청액을 PBS 완충제(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)에 의해 평형화된 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(5 ㎖)에 인가하였다. 비결합된 단백질을 평형화 완충제로 세척하였다. 항체 및 항체 변이체를 0.1 M 시트레이트 완충제(pH 2.8)로 용출하고, 단백질 함유 분획을 0.1 ㎖의 1 M 트리스(pH 8.5)로 중화시켰다. 그 다음, 용출된 단백질 분획을 모으고 아미콘 울트라 원심분리 필터 장치(MWCO: 30 K, 밀리포어)로 3 ㎖의 부피까지 농축하고, 완충제(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0)에 의해 평형화된 수퍼덱스200 하이로드(HiLoad) 120 ㎖ 16/60 겔 여과 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 상에 적재하였다. 정제된 이중특이적 항체를 5% 고분자량 응집체 미만으로 함유하는 분획을 모으고 -80℃에서 1.0 mg/㎖ 분취액으로서 저장하였다.
SDS - PAGE
제조자의 지시에 따라 누페이지(등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐)을 이용하였다. 구체적으로, 4 내지 20% 누페이지(등록상표) 노벡스(Novex)(등록상표) 트리스-글리신 프리-캐스트 겔 및 노벡스(등록상표) 트리스-글리신 SDS 런닝 완충제를 사용하였다. 상기 겔을 런닝하기 전에 누페이지(등록상표) 샘플 환원제를 첨가하여 샘플의 환원을 달성하였다.
분석적인 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머 상태의 확인을 위한 크기 배제 크로마토그래피를 HPLC 크로마토그래피로 수행하였다. 요약하건대, 단백질 A 정제된 항체를 아질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템 상에서 완충제(300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5) 중의 토소(Tosoh) TSK겔 G3000SW 컬럼에 인가하거나, 다이오넥스 HPLC 시스템 상에서 2x PBS 중의 수퍼덱스200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 인가하였다. 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 영역의 적분으로 정량하였다. 바이오라드 겔 여과 표준 151-1901을 표준물로서 사용하였다.
질량 분광법
이중특이적 항체의 총 탈글리코실화된 질량을 전기분무 이온화 질량 분광법(ESI-MS)을 통해 측정하고 확인하였다. 더욱이 잠재적인 부산물, 예컨대, LC 및 HC 짝짓기오류를 검출하고 상대적으로 정량하였다. 요약하건대, 3 mg/ml 이하의 단백질 농도에서 100 ㎍의 정제된 항체를 37 또는 45℃에서 16 또는 2시간 동안 100 mM NaH2PO4/NA2HPO4(pH 7) 중 14 또는 28 U의 N-글리코시다제 F(로슈)로 탈글리코실화시킨 후 수퍼덱스 G25 컬럼(지이 헬쓰케어) 상의 HPLC를 통해 탈염시켰다. 각각의 중쇄 및 경쇄의 질량을 탈글리코실화 및 환원 후 ESI-MS로 측정하였다. 요약하건대, 115 ㎕ 중 50 ㎍의 항체를 4 M 구아니딘-하이드로클로라이드 및 50 ㎕의 8 M 구아니딘-하이드로클로라이드 중 60 ㎕의 0.5 M TCEP로 37℃에서 30 분 동안 항온처리한 후 탈염시켰다. 환원된 중쇄 및 경쇄의 총 질량 및 질량을 트라이베르사 나노메이트(TriVersa NanoMate)(아비디온(Avidion)) 공급원이 장착된 maXis UHR-TOF(브루커(Bruker)) MS 시스템 상에서 ESI-MS를 통해 측정하였다.
실시예 1
면역화를 통한 TWEAK 항원 결합 부위의 생성( TWEAK / IL17 이중특이적 항체에 대한 TWEAK 항원 결합 부위가 유도될 수 있는 것으로부터의 모 TWEAK 항체의 생성)
인간/ 뮤린 TWEAK 를 사용한 토끼의 면역화
뉴질랜드 화이트(New Zealand White) 토끼(오릭토라구스 쿠니쿨러스(Oryctolagus cuniculus))를 제 0 일에 완전 프로인트(Freund) 보조제와 함께 400 ㎍의 재조합 인간 TWEAK로, 제 21, 43 및 65일에 불완전 프로인트 보조제와 함께 200 ㎍의 인간 TWEAK로, 및 제 85일에 불완전 프로인트 보조제와 함께 200 ㎍의 뮤린 TWEAK로 면역시켰다. 모든 면역화는 피하의 여러 영역에서 수행하였다. 역가 측정을 위해 제 77 및 98일에 혈청을 준비하였다. 최종 추가접종(boost)은 200 ㎍의 인간 및 200 ㎍의 뮤린 가용성 TWEAK의 정맥내 주사에 의해 수행하였으며, 인간 및 마우스 TWEAK에 결합하고(실시예 2), 인간 및 마우스 TWEAK-Fn14 상호작용을 중화시키고(실시예 4 및 5), IL-8 분비를 억제하는(실시예 6) 그의 능력을 기준으로 항체를 선택하였다. 또한, 항체-TWEAK 착체의 반감기를 조사하였다(실시예 3). 항체의 항-종양 효능을 B16BL6(뮤린 흑색종; B16의 전이성 폐 아세포주(subline)), SJSA(골육종, ATCC CRL-2098) 및 HCT-116(결장, ATCC CCL-247) 이종이식 모델에서 시험하였다.
실시예 2
인간 및 마우스 TWEAK 에 대한 결합( ELISA )
인간 및 마우스 TWEAK에 대한 모 항-TWEAK 항체의 결합을 ELISA로 측정하였다. 인간 또는 마우스 재조합 TWEAK를 2 내지 8℃에서 밤새 배양하여, 0.5 M 카보네이트 코팅 완충액(pH 9.5) 중에서, 1 ㎍/ml, 25 ㎕/웰로 384-웰 눈크 맥시소프(Nunc Maxisorp) 플레이트 상에 고정화시켰다. 실온에서 PBS/1% BSA로 1 시간 동안 플레이트를 차단한 다음 2회 세척 단계(PBS중 0.1% 트윈(Tween, 등록상표)) 및 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액 중 상이한 농도의 항-TWEAK 항체 또는 상기 항체의 하이브리도마 상등액과 함께 배양하였다. 4회 더 세척한 후, 차단 완충액 중에 1:5000으로 희석시킨 항-토끼-HRP 항체를 사용하여 실온에서 1 시간 동안 항체를 검출하였다. 추가로 4회 세척 단계 후에 10 내지 30 분 동안 ABTS(등록상표, 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH))를 첨가하여 신호를 발생시켰다. 흡광도를 405 nm에서 판독하였다.
실시예 3
비아코어를 사용한 항체- TWEAK 착체의 반감기 측정
비아코어 2000 기기를 시스템내에 탑재된 비아코어 스트렙타비딘 코팅된 센서와 함께 사용하였다. 시스템 완충액 HBS-ET(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% 트윈(등록상표) 20)를 100 ㎕/분의 유량으로 사용하였다. 샘플 완충액은 시스템 완충액이었다. 비오틴화된 인간 가용성 TWEAK(서열번호 68의 아미노산 99 내지 249) 및 비오틴화된 뮤린 가용성 TWEAK(서열번호 69의 아미노산 81 내지 225)를 각각 150 RU에서 SA 센서 상에서 상이한 유동 셀 상에 고정화시켰다. 유동 셀 FC1을 블랭크 기준 셀로 사용하였다. 각각의 항체를 2 분의 결합 시간 동안 100 nM에서 100 ㎕/분으로 분석물로서 시스템 내에 주입하였다. 면역착체의 해리를 5 분간 모니터링하였다. 센서 표면을 HBS-ET로 10 초동안 세척하고, 10 mM 글라이신(pH 2.25)으로 2 x 2 분 주입을 이용하여 재생시켰다. 상기 절차를 25℃에서 수행하였다. 그 사이[240 내지 300 초]에 착체 해리 상의 동역학적 속도 제한 단계를 취하여 해리 속도 kd[1/s]를 산출하였다(비아코어 평가 소프트웨어 4.0). 식 t1/2 해리 = ln(2)/(60 x kd)에 따라서, 면역착체의 반감기(분)를 계산하였다. 결과를 하기 표 1a 및 1b, 및 표 2b에 나타내었다.
[표 1a]
Figure 112014105932313-pct00003
또 다른 실험에서, 키메라 <TWEAK> 305chi 및 국제특허출원공개 제 2006/130374 호의 P2D10의 키메라 버전의 항체-TWEAK 착체의 반감기(25℃에서 t/2 해리[분])를 측정하였다(두 키메라 항체 모두 인간 불변 영역으로 서열번호 59의 인간 카파 경쇄 불변 영역 및 서열번호 61의 인간 IgG1 불변 영역을 갖는다).
[표 1b]
Figure 112014105932313-pct00004
본 발명에 따른 항체는 25℃에서 비아코어에 의해 측정하여, 100 분 이상, 바람직하게는 110 분 이상의, 가용성 인간 TWEAK(서열번호 68의 아미노산 99 내지 249)와 항체 사이 착체의 반감기와 같은 유용한 성질을 나타낸다. 상기 반감기를 나타내는 항-TWEAK 항체는 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 예를 들면, 근이영양증, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 예를 들면, 다발성 골수종에서의 골 변성, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 및 혈관 손상의 치료에 사용하기에 특히 바람직하다.
실시예 4
TWEAK - Fn14 상호작용의 중화(인간)
인간 TWEAK/인간 Fn14 상호작용의 차단을 수용체 상호작용 ELISA에 의해 확인하였다. 96-웰 맥시소프(MaxiSorp: 등록상표) 플레이트(눈크(NUNC))를, 실온에서 1.5 시간 동안, 웰 당 PBS 중 1 ㎍/ml 인간 Fn14:Fc(인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된 인간 Fn14의 세포외 도메인(서열번호 98의 아미노산 1 내지 75)) 100 ㎕로 코팅하고 실온에서 교반하에 30 분 동안 PBS 중 5% FBS의 용액으로 차단하였다. 그 사이에, 차단액 중 2.5 ng/ml의 인간 Flag-표지된 가용성 TWEAK(아미노산 106 내지 249)를 교반하에 실온에서 2 시간 동안 상이한 농도의 항-TWEAK 항체 또는 하이브리도마 상등액과 함께 배양하였다. Fn14-코팅된 플레이트를 세척 완충액(PBS 중 0.1% 트윈(등록상표) 20)으로 1회 세척한 후, 100 ㎕의 TWEKA-항체 용액을 각 웰로 옮기고 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양한 다음 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 차단 완충액에 1:5000으로 희석시킨 항-FLAG-HRP 검출 항체 100 ㎕를 웰에 채우고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 4회 추가 세척 단계 후에, 약 10 분 동안 100 ㎕의 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 첨가하여 신호를 발생시켰다. 100 ㎕의 1 N HCl을 가하여 반응을 중단시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(기준 파장 620 nm). 결과를 표 2a 및 2b에 나타내었다.
실시예 5
TWEAK - Fn14 상호작용의 중화(마우스)
마우스 가용성 TWEAK를 표지화하지 않았기 때문에 상이한 검출 시스템을 사용하는 것을 제외하고 인간 단백질에 대해 기재한 바와 유사한 원리에 따라 마우스 TWEAK/마우스 Fn14 상호작용 ELISA를 행하였다. 간략하게, 맥시소프 플레이트를 인간 Fn14:Fc에 대해 전술한 바와 같이 마우스 Fn14:Fc(인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된 마우스 Fn14의 세포외 도메인(서열번호 98의 아미노산 1 내지 75))로 코팅한 다음, 차단 및 세척하였다. 4 ng/ml의 마우스 가용성 TWEAK를 차단 완충액 중에서 항-TWEAK-항체 또는 하이브리도마 상등액과 함께 예비-배양한 후, 웰 당 100 ㎕의 혼합물을 Fn14-코팅된 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 배양하고 4회 세척한 후에, 차단 완충액중 125 ng/ml의 비오틴화된 항-마우스 TWEAK 항체를 실온에서 1 시간 동안 첨가한 다음 추가 4회 세척 단계를 수행하였다. TWEAK 항체를 차단 완충액에 1:5000으로 희석시킨 스트렙타비딘-HRP와 함께 실온에서 30 분간 배양하여 검출하였다. 전술한 바와 같이 신호를 발생시키고 흡광도를 측정하였다. 결과는 하기 표 2a 및 2b에 나타내었다.
실시예 6
IL -8 분비 ELISA
세포 시스템 내에서 항-TWEAK 항체에 의한 TWEAK 활성의 차단을 A375 흑색종 세포를 사용한 IL-8 분비 분석에서 확인하였다. 10,000개의 A375 세포(ATCC #CRL1619)를 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 100 ㎕의 성장 배지(4.5 g/L 글루코스 함유 DMEM, 피루베이트 및 글루타맥스(GlutaMAX(등록상표)/10% FBS 함유)에 접종하고 37℃/5% CO2에서 48 시간 동안 배양하였다. 인간 재조합 가용성 TWEAK를 300 ng/ml에서 성장 배지 중 상이한 농도의 항-TWEAK 항체와 함께 실온에서 30 분간 배양하였다. 이어서, 50 ㎕의 혼합물을 세포 플레이트의 각 웰에 첨가한 다음, 48 시간 동안 더 배양하여 IL-8을 분비시켰다. 플레이트를 200 x g에서 5 분간 원심분리한 후 20 ㎕의 세포 상등액을 취하고 "CXCL8 콴티킨(Quantikine) ELISA" 키트(알앤디 시스템즈(R&D Systems)로부터의 RD5P 캘리브레이터 딜루언트(Calibrator Diluent) 980 ㎕와 혼합하였다. 제조사의 지시에 따라 ELISA에 의해 IL-8을 검출하였다. 결과는 하기 표 2a 및 2b에 나타내었다.
[표 2a]
Figure 112014105932313-pct00005
[표 2b]
Figure 112014105932313-pct00006
실시예 7
< TWEAK >301, < TWEAK >304, < TWEAK >305( TW -301, TW -304, TW -305로서 약칭됨)의 에피토프 영역의 결정
비아코어 2000 기기를 비아코어 평가 소프트웨어 4.0과 함께 사용하였다. 샘플 및 시스템 완충액은 HBS-ET(pH 7.4)이었다. 센서 표면에 대한 TWEAK 분석물의 강한 비특이적 결합으로 인해, 개개 항체들의 에피토프 지도작성은 문헌[Johne, B. et al., J. Immun. Meth. 160, 191-198 (1993)]에 기재된 바와 같은 비아코어 교차-경쟁 실험에 의해 통상적으로 수행할 수 없었다.
TWEAK 단백질의 개별적 생화학적 성질로 인해, 리간드로서 TWEAK를 사용하는 또 다른 방법을 개발해야 했다. 비오틴화된 TWEAK를 스트렙타비딘-코팅된 칩 표면 상에 고정화시키고, 연속 주입된 항체(항체 1)의 에피토프 커버리지(coverage)를 측정하였다. 목적은 이미 결합된 1차 항체의 존재하에 2차 항체(항체 2)의 상대적 결합 수준을 검출하는 것이었다. 상기 상대 결합 수준으로부터 비율을 산출하였다(Ab2/Ab1, %로 나타낸 몰비, 하기 표 3).
5 nM의 비오틴화된 TWEAK를 20 ㎕/분에서 1 분 동안 스트렙타비딘 코팅된 센서 유동 셀 상에 고정화시켰다. 각각의 TWEAK 에피토프의 포화가 달성될 때까지, 1차 및 2차 mAb를 4 분 동안 100 nM에서 10 ㎕/분으로 시스템내에 연속 주입하였다. 기준으로 SA 코팅된 유동 셀을 사용하였다.
시스템을 30 ㎕/분에서 HBS-ET로 20 초동안 세척한 다음, 30 ㎕/분에서 6 M GuadHCl 및 100 mM HCl로 1 분 동안 2회 재생시켰다. 상기 재생 단계에 의해 센서 표면으로부터 결합된 mAb가 분리되었으며, 고정화된 비오틴화된 TWEAK는 비가역적으로 변성되었다. 스트렙타비딘 센서 표면이 비오틴화된 TWEAK로 완전히 포화될 때까지, 상기 과정을 동일 유동 셀 상에 천연 비오틴화된 TWEAK 단백질을 고정화시켜 반복하였다(피드 배치 방식).
[표 3]
Figure 112014105932313-pct00007
교차차단 실험은 10% 미만의 각 항체의 접근성 값을 나타내며, 상기 값은 상기 분석의 노이즈 내에 든다. TW-301chi, TW-304chi 및 TW-305chi가 동일 에피토프 영역에 결합함이 명백하게 확인된다.
실시예 8
콜라겐-유도성 관절염( 류마티스성 관절염의 뮤린 모델)의 생체내 억제 - 항체 < TWEAK >305-( 키메라 ; TW305 )는 류마티스성 관절염의 뮤린 모델인 콜라겐-유도성 관절염을 억제한다.
6 내지 8 주령의 수컷 DBA1/J 마우스(잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory), 미국 메인주 발 하버 소재)를 완전 프로인트 보조제 중의 유형 II 소 콜라겐으로 면역화시키고, 3 주 후에 불완전 프로인트 보조제 중에서 다시 면역화시켰다(추가접종, 제 0 일). 마우스에게 추가접종 전날 시작하여 격일로 키메라 항체 <TWEAK>305-(=TW305)(10 mg/kg, n=12), 엔브렐(Enbrel)(10 mg/kg, n=12) 또는 비히클(포스페이트 완충 식염수, n=12)을 투여하였다. 마우스를 추가접종 후 제 0, 2, 5, 7, 9, 12 및 14일에 관절염에 대해 검사하였다. 관절염의 중증도를 다음의 기준에 근거하여 점수를 매겼다: 1 = 1개 손가락의 종창 및/또는 발적; 2 = 2 개 이상의 관절에서 종창; 3 = 2개 초과의 관절이 수반된 상태에서 발의 전체적 종창; 4 = 발 전체 및 손가락들의 심한 관절염. 비히클과 비교하여, TW-305는 임상 점수(p<0.05, 제 14 일)를 TNF 차단제 엔브렐과 유사한 정도로 상당히 감소시켰다.
실시예 9
면역화를 통한 IL17 항원 결합 부위의 생성( TWEAK / IL17 이중특이적 항체에 대한 IL17 항원 결합 부위가 유도될 수 있는 것으로부터 모 IL17 항체의 생성)
마우스 당 펩로테크(Peprotech)(http://www.peprotech.com; 카탈로그 번호: 200-17, 1% 알부민과 함께 1% PBS 중)로부터의 250(1x) 및 100 μg(3x) 재조합 인간 IL17을 사용하여 5마리 암컷 Balb/c 마우스를 사용하여 20 주 내에 면역화를 수행하였다. 하이브리도마 생성. 마우스 림프구를 단리하고 하이드리도마를 생성하기 위해 PEG계 표준 프로토콜을 사용하여 마우스 골수종 세포주와 융합하였다. 이어서, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생성을 위해 스크리닝하였다. 생성된 하이브리도마로부터 ELISA 및 (IL-17A 유도된 hIL-6 및 hIL-8 방출의 억제를 통한) 사이토카인 방출 분석에 의해 측정된 IL-17 하위유형에 결합을 사용하여 마우스 클론 <IL17> 9C6-2B6을 선택하였다. 마우스 클론 <IL17> 9C6-2B6의 인간화는 (서열번호 55 및 57의 VH의 인간화된 변이체, <IL17> 9C6-2B6-HC134 및 VL의 인간화된 변이체, <IL17> 9C6-2B6-LC134와 함께) 인간화된 변이체 <IL17> 9C6-2B6-134 및 (서열번호 56 및 58의 VH의 인간화된 변이체, <IL17> 9C6-2B6-HC136 및 VL의 인간화된 변이체, <IL17> 9C6-2B6-LC136과 함께) <IL17> 9C6-2B6을 야기하였다.
실시예 10
ELISA 에 의해 측정된 IL -17에 대한 결합 및 IL17 하위유형을 갖는 교차반응성
눈크(등록상표) 맥시소프 플레이트(96-웰)를 PBS(100 ml/웰) 중 0.5 μg/ml 농도에서 재조합 인간 IL-17(펩로테크 카탈로그 번호 200-17, www.peprotech.com)로 코팅하였다. 플레이트를 오비탈 쉐이커(orbital shaker)로 37℃에서 2 시간 동안 교반하면서 항온처리하였다. 이후 코팅 용액을 제거하고 100 μl/웰 PBSTC(포스페이트 완충된 염수, 0, 0.5% 트윈(Tween: 등록상표)20, 2% 닭 혈청)를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 차단 용액을 제거하고 샘플[블랭크: PBSTC, 샘플(PBS 중 10μg/ml): 항-인간 IL-17 항체 <IL17> 9C6-2B6, <IL17> 9C6-2B6-134, <IL17> 9C6-2B6-136, 이바이오사이언스(eBioscience)(www.ebioscience.com)의 Mab 16-7178-85; 알앤디 시스템즈www.rndsystems.com)의 MAB 317, NVP-AIN-497(국제특허출원공개 제 2006/013107 호)]을 플레이트(100 μl/웰)에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 교반하면서 항온처리하였다. 샘플을 제거하고, 플레이트를 200 μl/웰 PBST(포스페이트 완충된 염수, 0.05% 트윈(등록상표)20)로 3회 세척하고, 마우스 항체의 검출을 위하여 제 2 항체(염소 항-마우스 IgG, Fc 감마, HRP 접합; 케미콘(Chemicon) AP127P, www.millipore.com) 또는 인간화된 항체의 검출을 위하여 염소 항-인간 IgG, Fc 감마, HRP 접합물(케미콘 AP113P)을 첨가하였다. 제 2 항체를 PBSTC에 1:10000 희석하고, 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 교반하면서 항온처리하였다. 제 2 항체를 제거하고, 플레이트를 200 μl/웰 PBST(포스페이트 완충된 염수, 0.05% 트윈(등록상표)20)로 3회 세척하고, 100μl/웰 ABTS(등록상표)(로슈 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH))를 첨가하였다. 광학 밀도를 405/492 nm에서 IL-17A 결합(100 %로 설정됨)에 관하여 측정하였다. 다른 인간 IL-17 하위유형(IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F)에 대한 결합을 동일한 분석 포맷으로 수행하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 결과는 상이한 IL17 하위유형에 대하여 가장 유사한 결합 행동을 갖는 항체가 알앤디 시스템즈의 MAB 317임을 나타낸다(www.rndsystems.com).
[표 4]
Figure 112014105932313-pct00008
실시예 11
사이토카인 방출 분석, CCD -25 SK 세포에서 IL -17A 유도된 hIL -6 및 hIL -8 방출의 억제
항-IL-17 항체의 전항온처리와 함께 IL-17A 및 TNF-α로 자극 후 CCD-25SK 세포(피부 섬유아세포, ATCC 번호: CRL-1474)의 hIL-8 생성을 검출하여 분석을 수행하였다. CCD-25SK 세포는 IL-17 수용체를 갖는다. 가용성 IL-17A는 이러한 IL-17 수용체에 결합한다. IL17A에 대한 항체는 IL-17A에 결합한다. 상기 기작은 TNFα의 존재에서만 작동한다. IL-17 수용체에 대한 IL-17A의 결합을 통해, 세포는 판독으로서 ELISA에 의해 검출될 수 있는 hIL-6 및 hIL-8을 생성한다. 측정된 hIL6 및 hIL-8은 IL-17에 의해 CCD-25SK 세포의 자극을 억제하는 항-IL-17 항체 농도에 관한 정보를 갖는다.
CCD-25SK 세포를 48-웰 플레이트에 2.5 x 104 세포/웰의 세포 밀도(부피 0.45 ml/웰)로 시딩하고 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 항온처리하였다. 밤새 항온처리 후, 세포를 항-IL-17 항체로 30 분 동안 9000, 3000, 1000, 333.3, 111.1, 37.03, 12.34 및 4.11 ng/ml의 종말 농도로 처리하였다. 각 항체의 희석 시리즈를 배지 50 μl/웰(10x 농축됨)로 제조하였다. 30 분 후, 세포를 10 ng/ml IL-17A 및 50 pg/ml TNF-α의 혼합물로 자극하였다. 50 μl/웰(10x 농축됨) 및 24 시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 항온처리하였다. 밤새 항온처리 후 상청액을 96-웰 플레이트에 옮기고 hIL-8 ELISA를 위한 중간체로서 -20℃에서 냉동시켰다.
hIL-6 및 hIL-8 ELISA를 다음과 같이 수행하였다. 100 μl 희석된 포획 항체를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 코팅 완충액을 사용하여 희석액을 제조하였다. 플레이트를 흡입하고, 200 μl/웰로 3회 세척하고, 200 μl/웰 분석 희석물로 차단하고, 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 흡입하고 200 μl/웰로 3회 세척하였다. 100 μl 표준물 및 샘플을 첨가하고 2 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 표준 희석 시리즈: 400 pg/ml, 200 pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12.5 pg/ml, 6.3 pg/ml 및 음성 대조군으로서 분석 희석물. 샘플 희석은 1:200이었다. 플레이트를 흡입하고 250 μl/웰로 4회 세척하였다. 100 μl 접합물을 각 웰에 첨가하였다. 접합물을 검출 항체 및 분석 희석물 중 1:250 희석된 효소 시약으로 제조하였다. 플레이트를 흡입하고 250 μl/웰로 6회 세척하였다. 100 μl 기질을 각 웰에 첨가하고 12 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후 반응을 50 μl/웰 1 M H2SO4로 정지시켰다. 판독을 450 nm에서 30 분 내에 570 nm에서 λ 보정으로 수행하였다. 결과를 하기 표 5에 나타내었다(80%의 최대 억제에 관하여 측정된 IC50 값).
[표 5]
Figure 112014105932313-pct00009
실시예 12
시아노몰구스 IL -17A를 사용한 교차 반응성(결합 분석)
인간 및 시아노몰구스 IL17A에 대한 상대적 결합을 측정하였다. 실시예 2에 따라 결합 분석을 수행하였다. 2개의 개별 실험(한 실험에서는 마우스 IL17항체를 비교하였고, 다른 실험에서는 인간 및 인간화된 IL17 항체를 비교함)에 대한 결과를 하기 표6a 및 6b에 나타내었다.
[표 6a]
Figure 112014105932313-pct00010
[표 6b]
Figure 112014105932313-pct00011
실시예 13
시아노몰구스 원숭이( 마카카 파시쿨라리스 ) 사이토카인 방출 분석, 시아노몰구스 IL -17A 유도된 IL -6 및 IL -8 생성의 억제
시아노몰구스 표피 섬유아세포(CDF)는 인간 또는 시아노몰구스 IL-17A 자극에 반응하여 시아노몰구스 IL-6 및 IL-8을 생성한다. 자극 전 인간 IL-17에 대하여 높아진 항-IL-17 항체를 갖는 세포의 전항온처리에 따라 CDF 세포에 의한 이 시아노몰구스 IL-17A 자극된 IL-6 및 IL-8 생성의 억제를 측정하기 위해 분석을 수행하였다.
CDF 세포를 48-웰 플레이트에 0.5 ml의 부피 중 2 x 105 세포/ml의 세포 밀도로 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 항온처리하여 부착하였다. 밤새 항온처리 후, 매질을 400 μl 신선한 매질로 교체하고 세포를 항-IL-17 항체로 30 분 동안 항체 농도의 범위(10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 0 ng/ml)에서 처리하였다. 각 항체 희석 시리즈를 50 μl/웰(10x 농축됨)을 사용하여 매질로 제조하였다. 30 분 후, 세포를 100 ng/ml IL-17A(50 μl의 1000 ng/ml 10x 농축)로 자극하고 밤새 18 시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 항온처리하였다. 항온처리 기간 후, 상청액을 신선한 튜브에 옮기고 즉시 분석하거나 ELISA에 의한 분석 때까지 -80℃에서 저장하였다. hIL-6 및 hIL-8 ELISA는 이의 각각의 시아노몰구스 사이토카인과 교차 반응성을 나타내었고 사이토카인 수준을 정량하기 위해 사용하였다. ELISA를 위해 100 μl 희석된 포획 항체를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 코팅 완충액을 사용하여 희석액을 제조하였다. 플레이트를 흡입하고, 200 μl/웰로 3회 세척하고, 200 μl/웰 분석 희석물로 차단하고, 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 흡입하고 200 μl/웰로 3회 세척하였다. 100 μl 표준물 및 샘플을 첨가하고 제조자의 지시에 따라 2 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 흡입하고 250 μl/웰로 3회 이상 세척하였다. 100 μl 접합물을 각 웰에 첨가하였다. 접합물을 검출 항체 및 분석 희석물 중 1:250 희석된 효소 시약으로 제조하였다. 플레이트를 흡입하고 250 μl/웰로 3회 이상 세척하였다. 100 μl 기질을 각 웰에 첨가하고 판독하기 위하여 충분한 색이 현상될 때까지 항온처리하였다. 항온처리 후, 반응을 50 μl/웰 1 M H2SO4로 중지시키고 플레이트 판도기 상에서 450 nm의 파장에서 30 분 내에 판독하였다.
실시예 14
이중특이적 < TWEAK - IL -17> 항체 분자 < Tweak - IL -17> #2, < Tweak - IL -17> #4, <Tweak-IL-17> #20, < Tweak - IL -17> #21, < Tweak - IL -17> #23, < Tweak - IL -17> #24, < Tweak - IL -17> #5의 발현 및 정제
하기 이중특이적 항체 <Tweak-IL-17> #2, <Tweak-IL-17> #4, <Tweak-IL-17> #20, <Tweak-IL-17> #21, <Tweak-IL-17> #23, <Tweak-IL-17> #5의 경쇄 및 중쇄(하기 표 7에 기재된 바와 같은 항원 결합 부위(VH/VL)에 기초함)를 기재된 바와 같은 유전체적, 부분적으로 유전체적 또는 cDNA 유도된 발현 벡터에 구축하였다. 이중특이적 2가 항체 <Tweak-IL-17> #2, <Tweak-IL-17> #24에 대하여, 국제특허출원공개 제 2009/080253 호("크로스맵" 또는 "CH1-CL 도메인 교환 항체")에 기재된 포맷을 사용하였다. 이중특이적 2가 <Tweak-IL-17> #4, <Tweak-IL-17> #20, <Tweak-IL-17> #21, <Tweak-IL-17> #23에 대하여, 국제특허출원공개 제 2011/117330 호("이중특이적 한암 scFab 항체")에 기재된 포맷을 사용하고, <Tweak-IL-17> #5(이때, scFab는 중쇄의 N-말단에서 융합됨)에 대하여 국제특허출원공개 제 2010/112193 호에 기재된 이중특이적 4가 포맷을 사용하였다. 국제특허출원공개 제 2009/080253 호, 국제특허출원공개 제 2011/117330 호 및 국제특허출원공개 제 2010/112193 호는 참고로서 본원에 혼입된다.
플라스미드를 에스케리키아 콜라이 내에 증폭시키고, 정제한 후, HEK293 세포를 재조합 단백질의 일과성 발현을 위해 형질감염시켰다. 배양 7일 후, HEK293 세포의 상청액을 수확하고, 여과하고 이중특이적 2가 항체를 정제하였다.
[표 7]
상응하는 TWEAK 및 IL17 VH 및 VL 도메인에 기초한 상이한 <Tweak/IL-17> 이중특이적 항체의 구축물, 및 각각의 IgG 불변 영역(돌연변이 함유, 존재하는 경우; 카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)
Figure 112014105932313-pct00012
맵셀렉트(MabSelect) SuRe(상표)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 이중특이적 항체를 정제하였다. 이후 크로마토그래픽 단계(크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex)200 하이로드 120 ml 16/60 겔 여과 컬럼, 지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 또는 이온 교환 크로마토그래피(매크로프렙(MacroPrep) CHT(상표) 유형 II 10 ml, 바이오래드(Bio-Rad) 플러스 크기 배제 크로마토그래피)를 맵셀렉트 SuRe(상표) 크로마토그래피 후 이중특이적 항체의 개별적인 생성물 연관된 부산물에 대하여 선택하였다.
간단히 말해서, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 PBS 완충액(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl, pH 7.4)으로 평형시킨 맵셀렉트 SuRe 수지상에 포획하고, 평형 완충액으로 세척하고 pH 3.0에서 25 mM 나트륨 시트레이트로 용리하였다. 용리된 단백질 분획을 모으고 2 M 트리스(pH 9.0)로 중성화하였다. 항체 풀을 10 mM NaH2PO4, 20 mM MES, 50 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2(pH 7.5)에 재완충하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 대하여 제조하였다. 평형 완충액(10 mM NaH2PO4, 20 mM MES, 50 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.5)으로 CHT 컬럼의 평형 후, 항체를 CHT 컬럼에 적용하고, 평형 완충액으로 세척하고 10 mM NaH2PO4, 20 mM MES, 500 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2(pH 7.5)에 선형 구배로 용리하였다. (이온 교환 크로마토그래피 또는 맵셀렉트 SuRe 친화성 크로마토그래피로부터의) 분획을 함유하는 이중특이적 항체를 모으고 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)으로 평형시킨 슈퍼덱스 200 26/60 GL(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하였다. 분획을 함유하는 이중특이적 항체를 모으고, 비바스핀(Vivaspin) 한외여과 장치(사르토리우스 스테딤 바이오테크 에스에이(Sartorius Stedim Biotech S.A.), 프랑스 소재)를 사용하여 요구된 농도로 농축하고 -80℃에서 저장하였다
실시예 15
이중특이적 분자의 SDS - CE 및 분석적 SEC
SDS - CE
이중특이적 및 대조군 항체의 순도, 항체 무결성 및 분자량을 마이크로유체 랩칩(Labchip) 기법(칼리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Science), 미국 소재)을 사용하여 CE-SDS로 분석하였다. 5 μl의 단백질 용액을 제조자의 지시에 따라 HT 단백질 발현 시약 키트를 사용하여 CE-SDS 분석을 위해 제조하고 HT 단백질 발현 칩을 사용하여 랩칩 GXII 시스템으로 분석하였다. 데이타를 랩칩 GX 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
분석적 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머 상태의 측정을 위한 크기 배제 크로마토그래피를 HPLC 크로마토그래피로 수행하였다. 간단히 말해서, 다양한 수준의 정제 과정에서 정제된 항체를 아질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템 상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4(pH 7.5) 중 토소(Tosoh) TSKgel G3000SW 컬럼 또는 다이오넥스(Dionex) HPLC-시스템 상에서 2x PBS 중 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 용리된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적의 통합으로 정량화하였다. 바이오라드 겔 여과 표준 151-1901을 표준으로서 제공하였다.
[표 8]
수율, 순도 프로필 및 응집 경향(응집물 경향은 단백질 A 후 단량체 %로 반영됨)
Figure 112014105932313-pct00013
실시예 16
인간 윤활 섬유아세포의 IL -17 유도된 사이토카인 자극의 억제
RA 환자로부터 수득된 인간 성인 섬유아세포-유사 활막세포(HFLS-RA)에 의해 전-염증성 사이토카인(예를 들면, 인간 IL-6, 인간 IL-8)의 IL-17-유도된 생성의 억제를 위해 상이한 <Tweak-IL-17> 이중특이적 항체의 항-IL-17 성분을 시험하였다. 상이한 RA-FLS 공여체의 약물 반응의 수립 후, 여러 리드 후보자의 효력을 추정하였다.
HFLS-RA(카탈로그 번호 408RA-05a)를 셀 어플리케이션 인코포레이티드(Cell Applications Inc.)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재; 독일 유통업체: 테부-바이오(tebu-bio), 독일 오펜바흐 소재)로부터 구입하였다. 세포를 녹이고, 윤활막세포 성장 배지(셀 어플리케이션 인코포레이티드; 카탈로그 번호 415-500)에서 확대시키고, 악큐타아제(Accutase)(피에이에이 라보라토리즈 게엠베하(PAA Laboratories GmbH), 오스트리아 파슁 소재; 카탈로그 번호 L11-007)로 첨출한 후 약 2 x 104 HFLS-RA 세포/웰를 96-웰 세포 배양 플레이트(코스타/코닝 라이프 사이언시즈(Costar/Corning Life Sciences), 네덜란드 암스테르담 소재; 카탈로그 번호 3596) 중 200 μl/웰 배지로 시딩하였다.
세포를 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 미리 배양한 후 사이토카인(및 임의적으로 항체)을 첨가하였다. 사이토카인의 첨가 전에, 배지를 제거하고 150 μl/w의 상응하는 사이토카인(임의적: 항체) 희석액을 첨가하고: 0 내지 10 μg/ml 재조합 인간 IL-17A(펩로테크(PeproTech), 독일 함부르크 소재; 카탈로그 번호 200-17); 0 내지 25 μg/ml 재조합 인간 TWEAK(알앤디 시스템즈, 독일 비스바덴 소재; 카탈로그 번호 1090-TW/CF), 또는 0 내지 10 μg/ml 재조합 인간 TNFα(알앤디 시스템즈; 카탈로그 번호 210-TA/CF)를 10번의 1:10 희석 단계로 적정하여 표시된 사이토카인에 대한 ED50 값을 수득하였다. TWEAK를 음성 대조군으로서 사용하고 TNF를 양성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 6 시간, 24 시간 및 72 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하면서, 72 시간을 (단백질 수준에 대한) 가장 양호한 사이토카인 반응을 제공하는 이 항온처리 시간으로서 하기 실험을 위해 사용하였다. 세포를 상이한 농도(cfin = 0 내지 150/500 nM)에서 30 분 동안 37℃, 5% CO2에서 여러 항체로 전항온처리한 후 추가 72 시간 동안 100 ng/ml 내지 10 μg/ml TWEAK로 자극을 적용하였다.
[표 9]
윤활 섬유아세포의 IL-17, Tweak 및 TNFα에 의한 사이토카인 유도의 효과적인 투여(ED50) 값(단위: ng/ml)
Figure 112014105932313-pct00014
[표 10]
원자가 당(= IL17 결합 암 당) 억제제 농도 IC50으로서 계산된 윤활섬유아세포의 IL-17에 의한 사이토카인 유도 후 <IL-17> 모 항체 및 <Tweak-IL-17> 이중특이적 항체의 억제 농도(IC50)(단위: nM)
Figure 112014105932313-pct00015
흥미롭게도 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 모 IL17 항체에 비해 결합 원자가 당 개선된 IC50을 나타낸다.
CBA 를 통한 사이토카인 측정
이 후, 약 120 μl/w 상청액을 96-웰 RB 플레이트에 옮기고 사이토카인 분석이 수행될 때까지 -20℃에서 저장하였다. 이를 위해 혈구계산 비드 분석(CBA) 플랫폼을 사용하고 특히 IL-6 및 IL-8의 생성(또는 이의 억제)을 분석하였다. 상기 분석을 인간 IL-6(비디 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 558276) 및 IL-8(비디 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 558277) 플렉스 세트를 사용하여 인간 가용성 단백질 마스터 완충 키트(비디 바이오사이언시즈, 독일 하이델베르그 소재, 카탈로그 번호 558265)의 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 플레이트를 FACS 분석으로 측정하고 FCAP 소프트웨어(모두 비디 바이오사이언시즈로부터 사용가능)를 사용하여 분석하였다.
실시예 17
인간 윤활 섬유아세포의 Tweak 유도된 증식의 억제
RA 환자로부터 수득된 인간 성인 섬유아세포-유사 활막세포(HFLS-RA; 카탈로그 번호 408RA-05a)를 셀 어플리케이션 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재; 독일 유통업체: 테부-바이오, 독일 오펜바흐 소재)로부터 구입하였다. 세포를 녹이고, 아쿠타아제(피에이에이 래보라토리즈 게엠베하, 오스트리아 파슁 소재; 카탈로그 번호 L11-007)로 박리 후 확장하고, 2 x 104 HFLS-RA 세포/웰을 이후 세포역가 글로 증식/생존력 분석을 위해 96-웰 백색 침니 플레이트(그레이너 바이오-원(Greiner Bio-one), 독일 프랑켄하우센 소재; 카탈로그 번호 655098) 중 100 μl/웰 배지에 시딩하였다. 예비 실험에서, 증식을 제조자의 지시에 따라 클릭-잇(Click-iT) 에듀(EdU) 키트를 사용하여 추정하였다(하기 참조).
재조합 인간 TWEAK(알앤디 시스템즈, 독일 비스바덴 소재; 카탈로그 번호 1090-TW/CF)를 100 μl/w를 갖는 1:3 희석 단계 중 0 내지 6,000 ng/ml로 3회 적정하여 용량-반응-곡선의 EC50 값을 수득하였다. 웰당 총 부피는 200 μl이었다. 이어서, 플레이트를 증식을 측정할 때까지 72 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다.
최종 실험에서, 세포를 상이한 농도(cfin = 0 내지 150 nM)로 30 분 동안 37℃, 5% CO2에서 표시된 항체로 전항온처리하였다. 이 후, 세포를, 10 내지 20 ng/ml 재조합 인간 TWEAK를 각 웰(50 μl/w)에 첨가하고 추가 72 시간 동안 배양하여 자극하였다. 재조합 IL-17 또는 TNFα를 사용한 자극은 HFLS 증식의 측정가능한 유도를 야기하지 않았다.
증식 분석
세포역가 글로 키트(프로메가 게엠베하(Promega GmbH), 독일 만하임 소재; 카탈로그 번호 G7571)를 사용하여 일반적인 세포 생존력/활성에 의해 측정된 바와 같은 증식을 추정하였다. 간단히 말해서, 기질 및 완충액을 녹이고 기질을 10 ml 완충액에 용해하였다. 평형을 위해 플레이트를 30 분 동안 실온에서 항온처리하고, 원심분리하고, 100 μl 세포 상청액을 100 μl의 세포역가 글로 시약에 첨가하였다(웰 당). 플레이트를 10 분 동안 신호 평형 후 2 분 진탕하고, 발광을 96-웰 F 그레이너 침니 백색/발광/0 내지 1000 ms로 설정된 테칸 인피니트(Tecan Infinite) 2000 판독기(테칸(Tecan), 독일 크라일스하임 소재)를 사용하여 측정하였다.
예비 실험에서, 증식을 제조자의 지시에 따라 클릭-잇 에듀 A647 키트를 사용하여 추정하였다(인비트로겐, 카탈로그 번호 A10208).
[표 11]
HFLS 및 HFSL-RA를 자극하고 72 시간 후 증식을 분석하였다.
Figure 112014105932313-pct00016
[표 12]
원자가 당(= Tweak 결합 암 당) 억제제 농도 IC50으로서 계산된 <Tweak-IL-17> 이중특이적 항체에 의한 Tweak 유도된 HFLS 증식의 억제
Figure 112014105932313-pct00017
실시예 18
< TWEAK - IL -17> 항체 분자의 점도 측정에 기초한 소규모 동적 광 산란( DLS )
점도 측정을 문헌[He, F., et al., Analytical Biochemistry 399(1) (2009), 141-3]에 기재된 바와 같이 본질적으로 수행하였다. 간단히 말해서, 샘플을 200 mM 아르기닌 숙시네이트(pH 5.5) 중 다양한 단백질 농도에 농축한 후, 폴리스티렌 라텍스 비드(300 nm 지름) 및 폴리소르베이트 20(0.02% v/v)을 첨가하였다. 샘플을 0.4 μm 필터 플레이트를 통해 원심분리하여 광학 384-웰 플레이트로 옮기고 파라핀 오일로 덮었다. 라텍스 비드의 겉보기 지름을 동적 광 산란에 의해 25℃에서 측정하였다. 용액의 점도를 하기 수학식 1로서 계산할 수 있다:
Figure 112014105932313-pct00018
상기 식에서,
η은 점도이고; η 0는 물의 점도이고; r h는 라텍스 비드의 겉보기 유체역학적 반경이고; r h , 0는 물 중 라텍스 비드의 유체역학적 반경이다.
동일한 농도에서 다양한 샘플을 비교하기 위해, 점도-농도 데이타를 무니(Mooney) 식(수학식 2)(문헌[Mooney, Colloid Sci, 1951; Monkos, Biochem. Biophys. Acta 1997])에 맞췄고 데이타를 이에 맞게 덧붙였다.
Figure 112014105932313-pct00019
상기 식에서,
S는 단백질의 유체 상호간섭 인자이고; K는 자가-군집 인자이고; Φ는 용해된 단백질의 부피 분획이다.
또한, 국제특허출원공개 제 2010/102251 호에 기재된 이중특이적 항체 D2E7-B6-17.8 DVD-Ig(이는 2차 특이성으로서 TNF α에 결합함)에 기초한 IL17 데이타의 비교를 위해 측정하였다.
[표 13]
이중특이적 항체의 점도를 다양한 농도에서 측정하였다.
Figure 112014105932313-pct00020
이중특이적 항체의 안정성
샘플을 200 mM 아르기닌 숙시네이트(pH 5.5) 중 150 mg/mL의 최종 농도로 농축하고, 멸균 여과하고 40℃에서 4일 동안 잠잠하게 저장하였다. 저장 전 및 저장 후, 고 분자량(HMW) 종의 함량을 크기-배제 크로마토그래피로 측정하였다. 저장된 샘플과 제조 후 즉시 측정된 샘플 사이의 HMW 함량의 차이를 "HMW 증가"로서 기록하였다. 또한, 국제특허출원공개 제 2010/102251 호에 기재된 이중특이적 항체 D2E7-B6-17.8 DVD-Ig(이는 2차 특이성으로서 TNF α에 결합함)에 기초한 IL17의 데이타를 비교하기 위해 측정하였다.
[표 14]
이중특이적 항체의 안정성을 DLS 및 SE-HPLC로 측정하였다.
Figure 112014105932313-pct00021
실시예 19
본 발명에 따른 이중특이적 < TWEAK / IL17 > 항체의 결합
이중특이적 항체 및 모 항체의 <IL17> 및 <TWEAK> 결합 친화성을 비아코어(등록상표) T100 기기 (GE Healthcare)를 사용하여 25℃에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 비아코어(등록상표) 시스템은 분자 상호작용 연구에 널리 수립되어 있다. SPR-기법은 금 코팅된 바이오센서 칩의 표면에 가까운 굴절률의 측정에 기초한다. 굴절률에서 변화는 고정된 리간드와 용액에 주입된 분해물질의 상호작용에 의해 야기된 표면 상 질량 변화를 나타낸다. 분자가 표면 상 고정된 리간드에 결합하는 경우 및 반대의 경우 질량은 증가하고, 고정된 리간드로부터 분해물질의 해리의 경우(반사 착체 해리) 질량은 감소한다. SPR은 리간드/분해물질 결합의 지속적 실시간 모니터링을 허용하고 따라서 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 평형 상수(KD)의 측정을 허용한다.
IL17 결합 친화성
포획 시스템(10 μg/ml 염소 항-인간 F(ab')2; 주문 코드: 28958325; 지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 에이비(GE Healthcare Bio-Sciences AB), 스웨덴 소재)의 약 12000 공명 단위(RU)를 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 커플링하였다. 샘플 및 시스템 완충액은 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충된 염수, pH 7.4)이었다. 이중특이적 항체를 10 μl/분의 유속에서 1 분 동안 50 nM 용액을 주입하여 포획하였다. 결합을 1:1 희석 중 50 nM로 시작하는 30 μl/분의 유속에서 3 분 동안 용액 중 다양한 농도로 인간 IL17을 주입하여 측정하였다. 해리 단계를 5 분 이하 동안 모니터링하고 샘플 용액으로부터 런닝 완충액으로의 스위칭을 유도하였다. 표면을 30 μl/분의 유속에서 글리신(pH 2.1) 용액으로 세척하면서 60초 동안 2회 재생성하였다. 팽창 굴절률 차이를 염소 항-인간 F(ab')2 표면으로부터 수득된 반응을 가감함으로써 정정하였다. 또한 블랭크 주입을 가감하였다(= 이중 참조). 겉보기 KD 및 다른 동력학 파라미터를 계산하기 위해, 랭뮤어(Langmuir) 1:1 모델을 사용하였다. 결과를 하기 표 15에 나타내었다.
[표 15]
인간 IL17에 대한 결합 친화성
Figure 112014105932313-pct00022
TWEAK 결합 친화성
센서 표면에 대한 TWEAK 분해물질의 강력한 비특이적 결합으로 인해, 리간드로서 TWEAK를 사용하는 역 구성을 선택하였다. TWEAK의 약 100 공명 단위(RU)를 지이 헬스케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 C1 칩 표면에 고정하였다. 샘플 및 시스템 완충액은 PBS-T (0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충된 염수, pH 7.4)이었다. 결합을 1:1 희석 중 50 nM로 시작하는 30 μl/분의 유속에서 3 분 동안 용액 중 다양한 농도로 이중특이적 항체를 주입하여 측정하였다. 해리 단계를 10 분 이하 동안 모니터링하고 샘플 용액으로부터 런닝 완충액으로의 스위칭을 유도하였다. 표면을 30 μl/분의 유속에서 3 M MgCl2 용액으로 세척하면서 30 초 동안 3회 재생성하였다. 팽창 굴절률 차이를 블랭크 커플링된 표면으로부터 수득된 반응을 가감함으로써 정정하였다. 또한, 블랭크 주입을 가감하였다(= 이중 참조). 겉보기 KD 및 다른 동력학 파라미터를 계산하기 위해, 랭뮤어 1:1 모델을 사용하였다. 결과를 하기 표 16에 나타내었다.
[표 16]
인간 TWEAK에 대한 결합 친화성
Figure 112014105932313-pct00023
인간 TWEAK 및 인간 IL17 둘다를 표적하기 위한 < TWEAK / IL17 > 항체의 동시 결합
포획 시스템(10 μg/ml 염소 항-인간 F(ab')2; 주문 코드: 28958325; 지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 에이비, 스웨덴 소재)의 약 12000 공명 단위(RU)를 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30)에 커플링하였다. 샘플 및 시스템 완충액은 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충된 염수, pH 7.4)이었다. 유량 세포의 온도를 25℃로 설정하고 샘플의 온도를 12℃로 차단하였다. 포획하기 전, 유량 세포를 런닝 완충액으로 2회 준비시켰다. 이중특이적 항체를 10 μl/분의 유속에서 60 초 동안 50 nM 용액을 주입하여 포획하였다. 이중특이적 항체에 대한 각 리간드의 독립적 결합을 연속적으로 또는 동시에 첨가하여(30 μl/분의 유속), 각 리간드에 대한 활성 결합능을 측정하여 분석하였다:
1) 120 초 동안 50 nM의 농도로 인간 Tweak-Fc의 주입(은 항원의 단일 결합을 확인한다).
2) 120 초 동안 50 nM의 농도로 인간 IL17A/A의 주입(은 항원의 단일 결합을 확인한다).
3) 120 초 동안 50 nM의 농도로 인간 Tweak-Fc의 주입 후 50 nM의 농도로 인간 IL17A/A의 추가 주입(은 Tweak의 존재하에 IL17A/A의 결합을 확인한다).
4) 120 초 동안 50 nM의 농도로 인간 IL17A/A의 주입 후 50 nM의 농도로 인간 Tweak-Fc의 추가 주입(은 IL17A/A의 존재하에 Tweak의 결합을 확인한다).
5) 120 초 동안 50 nM의 농도로 인간 IL17A/A 및 50 nM의 농도로 인간 Tweak-Fc의 공-주입(은 동시에 Tweak의 결합 및 IL17A/A의 결합을 확인한다).
표면을 30 μl/분의 유속에서 글리신(pH 2.1) 용액으로 세척하면서 60 초 동안 2회 재생성하였다. 팽창 굴절률 차이를 염소 항-인간 IgG 표면으로부터 수득된 반응을 가감함으로써 정정하였다. 이중특이적 항체는 접근법 3, 4 및 5의 생성된 최종 신호가 접근법 1 및 2의 개별적인 최종 신호의 합과 동일한 경우 상호 독립적으로 항원 모두에 결합할 수 있다.
[표 17]
<TWEAK> 및 <IL17> 둘다 표적하기 위한 <TWEAK/IL17> 항체의 동시 결합
Figure 112014105932313-pct00024
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Bispecific antibodies against human TWEAK and human IL17 and uses thereof <130> 30945 WO <140> PCT/EP2013/056970 <141> 2013-04-03 <150> EP12163396.0 <151> 2012-04-05 <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 1 Phe Thr Phe Asn Ala Asn Tyr 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 2 Tyr Gly Gly Gly Asn Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 3 Gly Pro Ile Ser Arg Asp Leu 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 4 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 5 Asp Ala Phe Asp Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 6 Gln Ser Thr Asp Tyr Gly Asn Ser Trp Asp Gly Asn Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 7 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Gly Gly Gly Asn Ser Gly Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Ile Ser Arg Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Leu 115 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 8 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Phe Asp Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Asp Tyr Gly Asn Ser 85 90 95 Trp Asp Gly Asn Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Thr 100 105 110 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 9 Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 10 Tyr Val Gly Ser Ser Gly 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 11 Ser Val His Phe Gly Asp Leu 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 12 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asp Leu Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 13 Ser Val Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 14 Gln Cys Ile Asp Tyr Gly Asn Asn Tyr Val Gly Asn Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 116 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 15 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser Ser Gly Ala Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Ala 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Val Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Val His Phe Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 16 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Val Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Ile Asp Tyr Gly Asn Asn 85 90 95 Tyr Val Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 17 Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 18 Tyr Val Arg Gln Gly 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Asp Ala Phe Val Ile Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Phe 115 120 <210> 24 <211> 111 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 24 Ala Ile Glu Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Arg Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg 85 90 95 Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VH, <TWEAK>305-HC1 <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr 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27 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VH, <TWEAK>305-HC3 <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Val Tyr Val Arg Gln Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VH, <TWEAK>305-HC4 <400> 28 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Val Tyr Val Arg Gln Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu 50 55 60 Asn Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VH, <TWEAK>305-HC5 <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Val Tyr Val Arg Gln Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VH, <TWEAK> 305-HC6 <400> 30 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Val Tyr Val Arg Gln Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VH, <TWEAK>305-HC7 <400> 31 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Val Tyr 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<211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VH, <TWEAK> 305-HC9 <400> 33 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Val Tyr Val Arg Gln Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Lys Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VH, <TWEAK>305-HC10 <400> 34 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Val Tyr Val Arg Gln Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VH, <TWEAK>305-HC11 <400> 35 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Val Tyr Val Arg Gln Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VL, <TWEAK> 305-LC1 <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg 85 90 95 Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VL, <TWEAK> 305-LC2 <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg 85 90 95 Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 38 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VL, <TWEAK> 305-LC3 <400> 38 Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg 85 90 95 Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 39 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VL, <TWEAK> 305-LC4 <400> 39 Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg 85 90 95 Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 40 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VL, <TWEAK> 305-LC5 <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Ala 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<213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VL, <TWEAK> 305-LC9 <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg 85 90 95 Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 45 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized variant of VL, <TWEAK> 05-LC10 <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser 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Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 180 185 190 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 195 200 205 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 210 215 220 Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu 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130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205 Leu Arg Gln Met 210 <210> 100 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Ile Ser 1 5 10 15 Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu 20 25 30 Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe 35 40 45 Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr 50 55 60 Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro 65 70 75 80 Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala 85 90 95 Glu Asn Ser

Claims (23)

  1. 인간 TWEAK에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 인간 IL17에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체로서, (i) 제 1 항원 결합 부위가,
    (a) 서열번호 17의 CDR1H, 서열번호 18의 CDR2H, 서열번호 19의 CDR3H, 및 서열번호 20의 CDR1L, 서열번호 21의 CDR2L, 서열번호 22의 CDR3L;
    (b) 서열번호 1의 CDR1H, 서열번호 2의 CDR2H, 서열번호 3의 CDR3H, 및 서열번호 4의 CDR1L, 서열번호 5의 CDR2L, 서열번호 6의 CDR3L; 또는
    (c) 서열번호 9의 CDR1H, 서열번호 10의 CDR2H, 서열번호 11의 CDR3H, 및 서열번호 12의 CDR1L, 서열번호 13의 CDR2L, 서열번호 14의 CDR3L을 포함하고;
    (ii) 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 47의 CDR1H, 서열번호 48의 CDR2H, 서열번호 49의 CDR3H, 및 서열번호 50의 CDR1L, 서열번호 51의 CDR2L, 서열번호 52의 CDR3L을 포함하는, 이중특이적 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    이중특이적 항체가,
    (a) 0.2 nM 이하의 IC50 값을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 TWEAK 유도된 증식;
    (b) 3.0 nM 이하의 IC50 값을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 IL17 유도된 IL6 사이토카인 자극; 및
    (c) 2.0 nM 이하의 IC50 값을 갖는 인간 섬유아세포-유사 활막세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 IL17 유도된 IL8 사이토카인 자극
    을 억제하는, 이중특이적 항체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    이중특이적 항체가 2가인, 이중특이적 항체.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 따른 이중특이적 항체의 키메라 또는 인간화된 변이체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    (i) 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 35의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 또는 서열번호 46의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
    (ii) 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 55 또는 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 57 또는 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    (i) 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
    (ii) 제 2 항원 결합 부위가, (a) 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인, 또는 (b) 서열번호 55의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 57의 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
  8. 제 1 항에 있어서,
    (i) 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
    (ii) 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 56의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 58의 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
  9. 제 1 항에 있어서,
    (i) 제 1 항원 결합 부위가, 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 37의 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
    (ii) 제 2 항원 결합 부위가, 서열번호 55의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 57의 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
  10. 제 1 항에 있어서,
    IgG1 또는 IgG4 아형인, 이중특이적 항체.
  11. 제 1 항에 있어서,
    돌연변이 L234A 및 L235A(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64의 IgG1 아형인, 이중특이적 항체.
  12. 제 1 항에 있어서,
    돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64의 IgG1 아형인, 이중특이적 항체.
  13. 제 1 항에 있어서,
    돌연변이 S228P 및 L235E(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 서열번호 65, 서열번호 66 또는 서열번호 67의 IgG4 아형인, 이중특이적 항체.
  14. 제 1 항에 있어서,
    돌연변이 S228P, L235E 및 P329G(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 서열번호 65, 서열번호 66 또는 서열번호 67의 IgG4 아형인, 이중특이적 항체.
  15. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 암, 염증 질환, 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 근육 질환, 다발성 경화증, 만성 신장 질환, 골 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염 또는 혈관 손상을 치료하기 위한 약학 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 15 항에 있어서,
    근육 질환이 근이영양증이고, 골 질환이 다발성 골수종에서의 골 변성인, 약학 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 핵산.
  20. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 발현을 위한 제 19 항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  21. 제 20 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  22. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제 19 항에 따른 핵산을 발현하고 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체를 회수하는 상기 항체의 제조 방법.
  23. 삭제
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