ES2326347T3 - Metodo para regular la produccion de oxido nitrico. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UNOS PROCEDIMIENTOS PARA REGULAR NIVELES DE MONOXIDO DE NITROGENO. ESTOS PROCEDIMIENTOS UTILIZAN RECEPTORES IL - 17, QUE SE PUEDEN UTILIZAR CONJUNTAMENTE CON INHIBIDORES DE IL - 1 Y/O TNF.

Description

Método para regular la producción de óxido nítrico.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere de forma general a la modulación de niveles de óxido nítrico, particularmente en la osteoartritis.

Antecedentes de la invención

Las citocinas son moléculas similares a las hormonas que regulan varios aspectos de una respuesta inmune o inflamatoria; ejercen sus efectos enlazándose específicamente a receptores presentes en las células y transduciendo una señal a las células. Además de tener efectos beneficiosos (es decir, desarrollo de una respuesta inmune eficaz y control de la enfermedad infecciosa), las citocinas también han sido implicadas en varios estados autoinmunes e inflamatorios.

Varias células asociadas con el cartílago (es decir, condrocitos, células del recubrimiento sinovial, células endoteliales, fibrobastos sinoviales y células mononucleares que están presentes en una articulación) pueden liberar óxido nítrico (NO). Este radical libre sirve como un agente antimicrobiano de primera línea y también tiene efectos antitumorales. Sin embargo, el NO también ha sido implicado en varios estados perjudiciales, incluyendo enfermedades autoinmunes e inflamatorias y en la destrucción del hueso que se produce en la osteoartritis, que no se considera típicamente como un estado inflamatorio.

Rouvier et al. (J. Inmunol. 150: 5445, 1993) informaron de un nuevo ADNc al que denominaron CTLA-8 y que desde entonces se ha conocido como interleucina-17 (IL-17). La IL-17 es 57% homóloga con la secuencia de aminoácidos predicha de un marco de lectura abierto (ORF) presente en el herpesvirus saimiri (HVS) denominado HVS13 (Nicholas et al., Virol. 179: 1 89, 1990; Albrecht et al., J. Virol. 66: 5047, 1992).

Se ha clonado un nuevo receptor que se enlaza a la IL-17 y a su homólogo vírico HVS13 y han sido descritos en el documento USSN 08/620.694, presentado el 21 de marzo de 1996. El receptor es una proteína transmembranal de tipo I; el receptor de ratón tiene 864 restos aminoácidos, el receptor humano tiene 866 restos aminoácidos. Se ha encontrado que una forma soluble del receptor inhibe varias actividades mediadas por la IL-17.

Resumen de la invención

El óxido nítrico (NO) es un radical libre que está implicado en muchos fenómenos, incluyendo los estados patofisiológicos de la artritis reumatoide (RA) y la osteoartritis (OA). La IL-17 estimula la producción de NO por el cartílago en individuos que padecen OA. Se ha encontrado que una forma soluble del IL-17R inhibe varias actividades mediadas por la IL-17. Consecuentemente, el IL-17R será útil para regular los niveles de NO en un entorno clínico.

La presente invención proporciona el uso del receptor de la IL-17 soluble en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la osteoartritis. Los modos de realización preferidos de la invención se definen en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada de la invención

El óxido nítrico es una molécula de señalización intracelular que está implicada en muchos fenómenos fisiológicos, incluyendo la relajación dependiente del endotelio, las respuestas inmunes mediadas por neurotransmisión y por las células. Como agente antimicrobiano, el NO es eficaz frente a bacterias, virus, helmintos y parásitos; también es útil para matar las células tumorales. En las enfermedades inflamatorias (es decir, artritis, colitis ulcerativa, diabetes, enfermedad de Crohn) se producen niveles aumentados de NO y se han usado inhibidores de la NO sintetasa (NOS) en modelos experimentales de la enfermedad inflamatoria con efectos variados (revisados por A. O. Vladutiu en Clinical Immunology and Immunopathology 76: 1-11; 1995).

La osteoartritis (OA) se ha considerado típicamente como una enfermedad no inflamatoria, sin embargo Amin et al. (J. Exp. Med. 182: 2097, 1995) han informado recientemente de que los niveles de NOS están aumentados en el cartílago de los pacientes con OA. La incubación del cartílago afectado por OA en medio sin suero produjo una liberación espontánea de cantidades sustanciales de NO. La interleucina-1\beta (IL-1\beta), el factor a de necrosis tumoral (TNF-\alpha) y el lipopolisacárido (LPS) aumentaron la liberación de nitrito en el cartílago afectado por OA. Resultados similares fueron observados por Sakurai et al. (J. Clin. Invest. 96: 2357, 1995) en pacientes con artritis reumatoide.

La IL-17 también aumenta la liberación en el cartílago afectado por OA. Además, los inhibidores de la IL-1\beta y el TNF-\alpha no inhiben la liberación de NO aumentada por la IL-17. Consecuentemente, los inhibidores de la IL-17 serán útiles para regular los niveles de NO. Dichos inhibidores encontrarán aplicaciones terapéuticas en la mejora de los efectos del NO en la OA, así como en otros estados de enfermedad en los que este radical libre tenga un papel (es decir, enfermedad autoinmune e inflamatoria).

Una forma particularmente preferida de inhibidor de la IL-17 es el IL-17R soluble que se describe en detalle en la patente estadounidense Nº 5.869.286. Los inhibidores de la IL-17 pueden usarse en conjunción (es decir, de forma simultánea, separada o secuencial) con inhibidores de la IL-1 y el TNF. Ejemplos de inhibidores de la IL-1 incluyen los receptores de la IL-1 solubles, tales como los descritos en las patentes estadounidenses 5.319.071, 5.180.812 y 5.350.683 así como una proteína conocida como antagonista del receptor de la IL-1 (IL-1RA; Eisenberg et al., Nature 343: 341, 1990) e inhibidores de una enzima que escinde la IL-1 en su forma biológicamente activa, como se describe en la patente estadounidense 5.416.013.

Los ejemplos de inhibidores del TNF incluyen las formas solubles de los receptores del TNF, como se describen por ejemplo en la patente estadounidense 5.395.760 y las proteínas de fusión al receptor del TNF, tales como las descritas en la patente estadounidense 6.541.610. Además, se sabe que algunas proteínas codificadas por virus se enlazan al TNF y actúan como antagonistas del TNF, como se describe en las patentes estadounidenses 5.359.039 o 5.464.938; y también se conocen inhibidores de una enzima que escinde el TNF en su forma biológicamente activa (véanse las patentes estadounidenses 5.629.285 y 5.230.742).

IL-17, HVS13 y proteínas homólogas

La CTLA-8 se refiere a un ADNc clonado a partir de un clon de hibridoma de células T activadas (Rouvier et al. J. Inmunol. 150: 5445, 1993). Los análisis por transferencia de Northern indicaron que la transcripción de la CTLA-8 fue muy específica del tejido. Se encontró que el gen de la CTLA-8 mapea en un sitio cromosómico 1a en ratones y en uno 2q31 en humanos. Aunque Rouvier et al. nunca identificaron una proteína codificada por el gen de la CTLA-8, se encontró que la secuencia de aminoácidos predicha para la CTLA-8 era homóloga al 57% con la secuencia de aminoácidos predicha para un ORF presente en el herpesvirus saimiri HVS13. La proteína CTLA-8 se denomina en la presente memoria interleucina-17 (IL-17).

Se ha publicado la secuencia nucleotídica completa del genoma del HVS (Albrecht et al., J. Virol. 66: 5047, 1992). Se han descrito estudios adicionales sobre uno de los marcos de lectura abiertos (ORF) del HVS, HVS13, en Nicholas et al., Virol., 179: 189, 1990. El HVS13 es un gen tardío que está presente en el fragmento HindIII-G del HVS. Se cree que los antisueros desarrollados contra los péptidos derivados del HVS13 reaccionan con la proteína tardía (Nicholas et al., supra).

La proteína CTLA-8 murina de longitud completa y una proteína de fusión CTLA-8/Fc han sido expresadas y analizadas y se ha encontrado que actúan como un co-estímulo para la proliferación de las células T. La IL-17 humana (CTLA-8) se identificó analizando una biblioteca de células T humanas usando un fragmento de ADN obtenido por PCR de secuencias degeneradas; se espera que también existan homólogos de la IL-17 (CTLA-8) en otras especies. También se ha expresado una proteína HVS13 de longitud completa, así como una proteína de fusión HVS13/Fc, y se encontró que actúa de forma similar a la proteína IL-17 (CTLA-8). Además, también es probable que otras especies de virus del herpes codifiquen proteínas homólogas a las codificadas por el HVS13.

Proteínas y análogos

La patente estadounidense 5.869.286 describe el IL-17R y sus homólogos aislados que presentan una actividad inmunorreguladora. Dichas proteínas están esencialmente libres de materiales endógenos contaminantes y, opcionalmente, sin glicosilación asociada de patrón natural. Los derivados del IL-17R dentro del alcance de la invención también incluyen varias formas estructurales de la proteína primaria que conservan su actividad biológica. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una proteína IL-17 puede estar en forma de sales ácidas o básicas o puede estar en forma neutra. Los restos aminoácidos individuales también se pueden modificar por oxidación o reducción.

La estructura primaria de aminoácidos puede modificarse formando conjugados covalentes o agregativos con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares, o creando mutantes de secuencia de aminoácidos. Los derivados covalentes se preparan uniendo grupos funcionales particulares con cadenas de aminoácidos laterales o en los extremos N- o C-terminales.

Las formas solubles del IL-17R están dentro del alcance de la invención. El nucleótido y la secuencia de aminoácidos predicha del IL-17R murino se muestra en las SEQ. ID. Nº 1 y 2. Los análisis por ordenador indicaron que la proteína tiene un péptido señal N-terminal con un sitio de escisión entre los aminoácidos 31 y 32. Los expertos en la técnica reconocerán que el sitio de escisión real puede ser diferente del predicho por el análisis por ordenador. Así, se espera que el aminoácido N-terminal del péptido escindido esté entre aproximadamente cinco aminoácidos a cada lado del sitio de escisión predicho. El péptido señal es seguido por un domino extracelular de 291 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y una cola citoplasmática de 521 aminoácidos. El IL-17R soluble comprende el péptido señal y el dominio extracelular (restos 1 a 322 de la SEQ. ID. Nº 1) o uno de sus fragmentos. Alternativamente, un péptido señal diferente puede estar sustituido por los restos 1 a 31 de la SEQ. ID. Nº 1.

El nucleótido y la secuencia de aminoácidos predicha del IL-17R humanos se muestran en las SEQ. ID. Nº 3 y 4. Comparte muchas características con el IL-17R murino. El análisis por ordenador indicó que la proteína tiene un péptido señal N-terminal con un sitio de escisión entre los aminoácidos 27 y 28. Los expertos en la técnica reconocerán que el sitio de escisión real puede ser diferente que el predicho por el análisis por ordenador. Así, se espera que el aminoácido N-terminal del péptido escindido esté entre aproximadamente cinco aminoácidos a cada lado del sitio de escisión predicho. El péptido señal es seguido por un domino extracelular de 293 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y una cola citoplasmática de 525 aminoácidos. El IL-17R soluble comprende el péptido señal y el dominio extracelular (restos 1 a 320 de la SEQ. ID. Nº 1) o uno de sus fragmentos. Alternativamente, un péptido señal diferente puede estar sustituido por el péptido señal natural.

Otros derivados de la proteína IL-17R y sus homólogos dentro del alcance de la invención incluyen los conjugados covalentes o agregativos de la proteína o de sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tal como por síntesis en cultivos recombinantes como fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia polipeptídica señal (o líder) en la región N-terminal de la proteína que, de forma simultánea o posterior a la traducción, dirige la transferencia de la proteína de su sitio de síntesis a su sitio de función dentro o fuera de la membrana o de la pared celular (por ejemplo el líder del factor \alpha en levaduras).

Las fusiones de proteínas pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de las proteínas IL-17R y sus homólogos (por ejemplo, poli-His). La secuencia de aminoácidos de las proteínas de la invención también puede unirse a un péptido de identificación tal como el descrito por Hopp et al., BioTechnology 6: 1204 (1988). Dicho péptido altamente antigénico proporciona un epítope enlazado reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo un ensayo rápido y una fácil purificación de la proteína recombinante expresada. La secuencia de Hopp et al. también es escindida específicamente por una enterocinasa de mucosa bovina permitiendo la eliminación del péptido de la proteína purificada. Las proteínas de fusión con dichos péptidos en los extremos también pueden ser resistentes a la degradación intracelular en E. coli.

Las formas solubles de algunas proteínas transmembranales han sido expresadas como proteínas de fusión en las que un dominio extracelular de una proteína de membrana (región de enlace cognado) se une a un dominio de inmunoglobulina constante de cadena pesada (Fc). Dichas proteínas de fusión son útiles como reactivos para detectar sus proteínas cognadas. También son útiles como agentes terapéuticos en el tratamiento de la enfermedad. Sin embargo, los receptores de los dominios Fc están presentes en muchos tipos de células. Así, cuando se forma una proteína de fusión a partir de un dominio Fc y una región de enlace cognada, el enlace a una célula puede ocurrir bien mediante el enlace de la región de enlace cognada con su proteína cognada o bien mediante el enlace del dominio Fc a un receptor del Fc (FcR). Dicho enlace del dominio Fc a los receptores del Fc puede evitar cualquier enlace de la región de enlace cognada a su cognado. Además, el enlace de los dominios Fc a los receptores del Fc induce la secreción de varias citocinas que están implicadas en el aumento de varios aspectos de una respuesta inmune o inflamatoria; dicho aumento ha sido implicado en algunos de los efectos adversos de la administración terapéutica de algunos anticuerpos (Krutman et al., J. Immunol. 145: 1337, 1990; Thislewaite et al., Am. J. Kidney Dis. 11: 112, 1988).

Jefferis et al. (Mol. Immunol. 27: 1237, 1990) han informado de que una región de un anticuerpo denominada región bisagra (y específicamente los restos 234-237 en esta región) determina el reconocimiento del anticuerpo por los receptores del Fc humanos Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. Leu_{(234)} y Leu_{(235)} fueron críticos en el enlace de alta afinidad de la IgG_{3} al Fc\gammaRI presente en las células U937 (Canfield y Morrison, J. Exp. Med. 173: 1483, 1991). Resultados similares fueron obtenidos por Lund et al. (J. Immunol. 147: 2657, 1991; Molecular Immunol. 29: 53, 1991). Estos autores observaron una disminución de 10-100 veces en la afinidad de la IgG por el FcR cuando se sustituyó un único aminoácido en un resto crítico.

Se encontró que la sustitución de un único aminoácido en el dominio Fc de un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (leucina por ácido glutámico en la posición 235) producía una activación de las células T significativamente menor que con el anticuerpo no mutado, manteniendo a la vez las propiedades inmunosupresoras (Alegre et al., J. Immunol. 148: 3461, 1992). Wawrzynczak et al. encontraron que los anticuerpos monoclonales murinos que contenían una sustitución de un único aminoácido en el resto 235 tenían la misma semivida en suero que los anticuerpos naturales (Mol. Immunol. 29: 221, 1992). Los dominios Fc con afinidad reducida por los receptores del Fc son útiles en la preparación de proteínas de fusión del Fc.

Los cierres de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de enlace de ADN (Landschulz et al. Science 240: 1759, 1988). El dominio de cierre de leucina es un término utilizado para denominar un dominio peptídico conservado presente en estas (y otras) proteínas que es el responsable de la dimerización de las proteínas. El dominio de cierre de leucina (también denominado en la presente memoria como dominio de oligomerización o formador de oligómeros) comprende una repetición de grupos de siete unidades repetitivos, con cuatro o cinco restos leucina dispersos con otros aminoácidos. Ejemplos de dominios de cierre de leucina son los encontrados en el factor de transcripción GCN4 de levaduras y una proteína de enlace de ADN térmicamente estable encontrada en el hígado de rata (C/EBP, Landschulz et al., Science 243: 1681, 1989). Dos proteínas de transformación nuclear, fos y jun, también presentan dominios de cierre de leucina, al igual que el producto génico del proto-oncogén murino c-myc (Landschulz et al. Science 240: 1759, 1988). Los productos de los oncogenes nucleares fos y jun que comprenden dominios de cierre de leucina forman preferentemente un heterodímero (O'Shea et al. Science 245: 646, 1989; Turner y Tjian, Science 243: 1689, 1989). El dominio de cierre de leucina es necesario para la actividad biológica (unión al ADN) de estas proteínas.

Las proteínas fusogénicas de varios virus diferentes, incluyendo paramixovirus, virus corona, virus del sarampión y muchos retrovirus, también presentan dominios de cierre de leucina (Auckland y Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses 6: 703, 1990). Los dominios de cierre de leucina en estas proteínas fusogénicas víricas están cerca de la región transmembranal de las proteínas; se ha sugerido que los dominios de cierre de leucina podrían contribuir a la estructura oligomérica de las proteínas fusogénicas. La oligomerización de las proteínas fusogénicas víricas está implicada en la formación del poro de fusión (Spruce et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3523, 1991). Recientemente se ha publicado que los dominios de cierre de leucina tienen un papel en la oligomerización de los factores de transcripción del choque térmico (Rabindran et al. Science 259: 230, 1993).

Los dominios de cierre de leucina se pliegan en dobles hélices cortas, paralelas (O'Shea et al. Science 254: 539, 1991). La arquitectura general de la doble hélice paralela ha sido bien caracterizado con un empaquetamiento del tipo "knobs-into-holes" ("protuberancias en agujeros") como propuso Crick en 1953 (Acta Crystallogr. 6: 689). El dímero formado por un dominio de cierre de leucina está estabilizado por la repetición del grupo de siete restos denominado (abcdefg)_{n} según la notación de McLachlan y Stewart (J. Mol. Biol. 98: 293, 1975), donde los restos a y d son generalmente restos hidrófobos, siendo d una leucina, que se alinea en la misma cara de una hélice. En las posiciones g y e generalmente se encuentran restos con carga opuesta. Por lo tanto, en una doble hélice paralela formada por dos dominios de cierre de leucina, las "protuberancias" (knobs) formados por las cadenas laterales hidrófobas de la primera hélice están empaquetados en los "agujeros" (holes) formados entre las cadenas laterales de la segunda hélice.

Los restos leucina en la posición d aportan energías de estabilización hidrófóbica grandes y son importantes para la formación del dímero (Krystek et al. Int. J. Peptide Res. 38: 229, 1991). Lovejoy et al. publicaron recientemente la síntesis de un paquete de hélice \alpha de tripe cadena en el que las hélices van arriba-arriba-abajo (Science 259: 1288, 1993). Sus estudios confirmaron que la energía de estabilización hidrofóbica proporciona la principal fuerza impulsora para la formación de las dobles hélices a partir de monómeros helicoidales. Estos estudios también indicaron que las interacciones electrostáticas contribuyen a la estequiometría y la geometría de las dobles hélices.

Varios estudios han indicado que los aminoácidos conservativos pueden ser sustituidos por restos leucina individuales con una disminución mínima de la capacidad de dimerización; sin embargo, múltiples cambios producirán generalmente una pérdida de esta capacidad (Landschulz et al. Science, 243: 1681, 1989; Turner y Tijan, Science 243: 1689, 1989; Hu et al. Science 250: 1400, 1990). van Heekeren et al. han publicado que se pueden sustituir varios restos amino diferentes por restos leucina en el dominio de cierre de leucina de la GCN4 y además han descubierto que algunas proteínas GCN4 que contiene dos sustituciones de leucina eran débilmente activas (Nucl. Acids Res. 20: 3721, 1992). La mutación de la primera y segunda leucinas del grupo de siete restos del dominio de cierre de leucina de la proteína de fusión del virus del sarampión (MVF) no afectó a la formación del sincitio (una medida de la fusión celular inducida por virus); sin embargo, la mutación de los cuatro restos leucina evitó completamente la fusión (Buckland et al., J. Gen. Virol. 73: 1703, 1992). Ninguna de las mutaciones afectó a la capacidad de la MVF para formar un tetrámero.

Recientemente, se ha encontrado que las sustituciones de aminoácidos en los restos a y d de un péptido sintético que representa el dominio de cierre de leucina de la GCN4 cambian las propiedades de oligomerización del dominio de cierre de leucina (Alber, Sixth Symposium of the Protein Society, San Diego, CA). Cuando todos los restos en la posición a se cambian por isoleucina, el cierre de leucina todavía forma un dímero paralelo. Cuando, además de este cambio, todos los restos leucina en la posición d también se cambian por isoleucina, el péptido resultante forma espontáneamente una doble hélice trimérica paralela en disolución. Sustituyendo todos los aminoácidos en la posición d con isoleucina y en la posición a con leucina se obtiene un péptido que tetrameriza. Los péptidos que contienen estas sustituciones todavía se denominan dominio de cierre de leucina ya que se cree que el mecanismo de formación del oligómero es el mismo que en los dominios de cierre de leucina tradicionales tales como los descritos
anteriormente.

Los derivados del IL-17R también pueden ser utilizados como inmunógenos, reactivos en ensayos in vitro o como agentes de enlace en procedimientos de purificación por afinidad. Dichos derivados también se pueden obtener mediante agentes de entrecruzamiento, tales como el éster M-maleimidobenzoilsuccinimida y la N-hidroxisuccinimida, en los restos cisteina y lisina. Las proteínas de la invención también pueden enlazarse covalentemente mediante grupos laterales reactivos con varios sustratos insolubles, tales como en estructuras de agarosa activadas con bromuro de cianógeno, activadas con bisoxirano, activadas con carbonildiimidazol o activadas con tosilo, o adsorbiéndose en superficies poliolefínicas (con o sin entrecruzamiento con glutaraldehído). Una vez enlazado a un sustrato, las proteínas se pueden usar para enlazarse selectivamente (con el propósito de ensayo o purificación) con anticuerpos cultivados frente al IL-17R o frente a otras proteínas que son similares al IL-17R, así como con otras proteínas que se enlazan al IL-17R o sus proteínas homólogas.

La presente invención también se refiere al IL-17R con o sin glicosilación asociada de patrón natural. Las proteínas expresadas en levaduras o sistemas de expresión de mamíferos, por ejemplo células COS-7, pueden ser similares o ligeramente diferentes en peso molecular y patrón de glicosilación que las moléculas naturales, dependiendo del sistema de expresión. La expresión de los ADN que codifican las proteínas de la invención en bacterias tal como la E. coli proporcionan moléculas no glicosiladas. Los análogos mutantes funcionales de la proteína del IL-17R o sus homólogos que tienen sitios de N-glicosilación desactivados se pueden producir por síntesis del oligonucleótido y ligadura o mediante técnicas de mutagénesis de sitio específico. Estas proteínas análogas se pueden producir en forma homogénea de carbohidrato reducido con un buen rendimiento usando sistemas de expresión en levaduras. Los sitios de N-glicosilación en las proteínas eucarióticas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A_{1}-Z en el que A_{1} es cualquier aminoácido excepto Pro y Z es Ser o Thr. En esta secuencia la aspargina proporciona un grupo amino de cadena lateral para la unión covalente de hidrocarburo. Dicho sitio se puede eliminar sustituyendo otro aminoácido por el Asn o por el resto Z, por deleción de Asn o Z o insertando un aminoácido distinto de Z entre A_{1} y Z o un aminoácido distinto de Asn entre Asn y A_{1}.

Los derivados de la proteína IL-17R también se pueden obtener por mutaciones del IL-17R natural o sus subunidades. Una proteína IL-17R mutada, como se denomina en la presente memoria, es un polipéptido homólogo de una proteína IL-17R pero que tienen una secuencia de aminoácidos diferente del IL-17R nativo por una o varias deleciones, inserciones o sustituciones. El efecto de cualquier mutación hecha en un ADN que codifica el péptido IL-17R se puede determinar fácilmente analizando la capacidad del péptido IL-17R mutado para inhibir la coestimulación de las células T o B por el IL-17R (CTLA-8) o sus proteínas homólogas, o para enlazarse a proteínas que se enlazan específicamente al IL-17R (por ejemplo, anticuerpos o proteínas codificadas por el ADNc de la CTLA-8 o el ORF del HVS13). Además, la actividad de los análogos, muteinas o derivados del IL-17R se puede determinar por cualquiera de los métodos de ensayo descritos en la presente memoria. Se pueden realizar mutaciones similares en los homólogos del IL-17R y se pueden analizar de una forma similar.

Se pueden construir análogos bioequivalentes de las proteínas de la invención, por ejemplo, haciendo varias sustituciones de restos o secuencias o deleciones de restos o secuencias terminales internas no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, los restos cisteina pueden sufrir una deleción o ser reemplazados por otros aminoácidos para evitar la formación de enlaces de disulfuro intramoleculares incorrectos durante la renaturalización. Otras aproximaciones a la mutagénesis implican la modificación de restos aminoácidos dibásicos adyacentes para aumentar la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad proteasa KEX2.

De forma general, las sustituciones se deben realizar de forma conservativa, es decir, los aminoácidos sustitutos más preferidos son aquellos que no afectan la capacidad de las proteínas de la invención para enlazar sus ligandos de una forma esencialmente equivalente a la de la mIL-17R o hIL-17R naturales. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de aminoácidos fuera del (de los) dominio(s) de enlace y la sustitución de aminoácidos que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria del IL-17R y sus homólogos. Ejemplos adicionales incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Al por otro, o sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg, Glu y Asp o Gln y Asn. Otras de estas sustituciones conservativas, por ejemplo sustituciones de regiones completas que tienen características de hidrofobicidad similares son bien conocidas.

De forma similar, cuando se adopta una estrategia de deleción o inserción, se debe considerar el efecto potencial de la deleción o la inserción sobre la actividad biológica. Las subunidades de las proteínas de la invención se pueden construir mediante la deleción de restos o secuencias terminales o internos. Los fragmentos del IL-17R que se enlazan a la IL-17 se pueden preparar fácilmente (por ejemplo, usando enzimas de restricción para la deleción de porciones de ADN) y se puede analizar su capacidad para enlazarse a la IL-17. Una guía adicional para los tipos de mutaciones que se pueden hacer es proporcionada por una comparación de la secuencia del IL-17R con las proteínas que tienen estructuras similares, así como por la realización de análisis estructurales de las proteínas de la invención.

Las mutaciones en las secuencias de nucleótidos construidas por la expresión de análogos del IL-17R deben, por supuesto, preservar la fase del marco de lectura de las secuencias codificantes y preferiblemente no crearán regiones complementarias que puedan hibridarse para producir estructuras secundarias de ARNm tales como bucles o estructuras en horquilla que puedan afectar adversamente a la traducción de ARNm receptor. Aunque se pueda predeterminar un sitio de mutación, no es necesario que se determine la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, con el fin de elegir las características óptimas de los mutantes en un sitio dado, se puede realizar mutagénesis aleatoria en el codón diana y analizar la actividad deseada en las proteínas víricas mutadas.

No todas la mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína IL-17R o sus homólogos se expresarán en el producto final, por ejemplo se pueden hacer sustituciones de nucleótidos para aumentar la expresión, fundamentalmente para evitar bucles de estructura secundaria en el ARNm transcrito (véase el documento EPA 75.444A, incorporando en la presente memoria como referencia) o para proporcionar codones que sean traducidos más fácilmente por el huésped elegido, por ejemplo la bien conocida preferencia de los codones de la E. coli por la expresión de la E. coli.

Se pueden introducir mutaciones en un sitio particular sintetizando los oligonucleótidos que contengan una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permitan la ligadura de fragmentos de la secuencia natural. Después de la ligadura, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada.

Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis de sitio específico dirigida a un oligonucleótido para proporcionar un gen modificado que tenga codones particulares modificados según la sustitución, deleción o inserción necesaria. Los ejemplos de métodos para realizar las alteraciones detalladas anteriormente se describen en Walter et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y las patentes estadounidenses Nº 4.518.584 y 4.737.462 describen técnicas adecuadas y se incorporan como referencia en la presente memoria.

Debido a la degeneración del código, puede haber una considerable variación en las secuencias de nucleótidos que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Otros modos de realización incluyen las secuencias capaces de hibridarse en condiciones moderadamente severas (disolución de prelavado de 5 x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, 5 x SSC, durante la noche) las secuencias de ADN que codifican el IL-17R y otras secuencias que están degeneradas con las que codifican el IL-17R. En un modo de realización preferido, los análogos del IL-17R tienen una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos aproximadamente 70% a la secuencia de aminoácidos de las proteínas IL-17R como se detallan en las SEQ. ID. Nº 1 o SEQ. ID. Nº 3. De forma similar, los análogos de los homólogos del IL-17R tienen una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 70% a la secuencia de aminoácidos de las proteínas homólogas naturales. En un modo de realización más preferido, los análogos del IL-17R o sus homólogos tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos aproximadamente 80% a la forma natural de las proteínas de la invención; en el modo de realización más preferido, los análogos del IL-17R o sus homólogos tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos aproximadamente 90% a la forma natural de las proteínas de la invención

El porcentaje de identidad se puede determinar usando un programa de ordenador, por ejemplo el programa de ordenador GAP descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) y disponible en el Grupo de Genética Computacional de la Universidad de Wisconsin (UWGCG por sus iniciales en inglés: University of Wisconsin Genetics Computer Group). Para los fragmentos derivados de la proteína IL-17R, la identidad se calcula en función de la porción de proteína IL-17R que está presente en el fragmento. Se pueden usar métodos similares para analizar los homólogos del IL-17R.

La capacidad de los análogos del IL-17R para enlazarse a la CTLA-8 se puede determinar analizando la capacidad de los análogos para inhibir la proliferación de células T inducida por la IL-17 (CTLA-8). Alternativamente, se pueden usar ensayos adecuados, por ejemplo un inmunoensayo enzimático o un ensayo de transferencia puntual (dot blot), empleando CTLA-8 o HSV13 (o uno de sus homólogos que se enlaza con el IL-17R natural) para evaluar la capacidad de los análogos del IL-17R para enlazarse con la CTLA-8. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica.

Expresión de los receptores recombinantes de la IL-17

Las proteínas de la presente invención se producen preferiblemente por métodos de ADN recombinante insertando una secuencia de ADN que codifica la proteína IL-17R o uno de sus homólogos en un vector de expresión recombinante y expresando la secuencia de ADN en un sistema de expresión recombinante microbiano en condiciones que favorecen la expresión. Las secuencias de ADN que codifican las proteínas proporcionadas por esta invención se pueden ensamblar a partir de fragmentos de ADNc y conectores cortos de oligonucleótidos, o a partir de series de oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético que sea capaz de insertarse en un vector de expresión recombinante y expresarse en una unidad de transcripción recombinante.

Los vectores de expresión recombinante incluyen fragmentos de ADN sintéticos o derivados del ADNc que codifican al IL-17R, homólogos o análogos bioequivalentes, unidos de forma operativa con elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados obtenidos a partir de genes de mamíferos, microbianos, víricos o de insectos. Dichos elementos reguladores incluyen un promotor de transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica los sitios de enlace del ARNm ribosómico adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción, como se describe con detalle a continuación. Adicionalmente se pueden incorporar la capacidad para replicarse en un huésped, generalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.

Las regiones del ADN están unidas de forma operativa cuando están relacionadas funcionalmente unas con otras. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder de secreción) está unido de forma operativa con el ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está unido de forma operativa para una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace ribosómico está unido de forma operativa con una secuencia codificante si está colocado de forma que permite la traducción. Generalmente, unido de forma operativa significa contiguo y, en el caso de los líderes de secreción, contiguo y en el marco de lectura. Las secuencias de ADN que codifican al IL-17R o sus homólogos que deben ser expresados en un microorganismo preferiblemente no contendrá intrones que puedan terminar prematuramente la transcripción del ADN en ARNm.

Los vectores de expresión útiles para su uso bacteriano pueden comprender un marcador elegible y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, el pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Bostec, Madison, WI, USA). Estas secciones "vertebrales" del pBR322 se combinan con un promotor adecuado y la secuencia estructural que se debe expresar. La E. Coli se transforma típicamente usando derivados del pBR322, un plásmido obtenido a partir de una especie de E. Coli (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). El pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y por lo tanto proporciona un medio sencillo para identificar las células transformadas.

Los promotores usados generalmente en los vectores de expresión recombinantes microbianos incluyen la \beta-lactamasa (penicilinasa) y el sistema promotor de la lactosa (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; y EPA 36.776) y un promotor del tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión particularmente útil emplea el promotor de fago \lambda P_{L} y el represor termolábil cI857ts. Los vectores del plásmido disponibles en la colección de la American Type Culture Collection que incorpora derivados del promotor del \lambda P_{L} incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa de E. Coli JMB9 (ATCC 37092) y el pPLc28 residente en la E. Coli RR1 (ATCC 53082).

Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levaduras incluyen los promotores para la metalotioneina, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en R. Hitzeman et al., EPA 73.657.

Los vectores preferidos en levaduras se pueden ensamblar usando secuencias de ADN del pBR322 para la selección y replicación en E. Coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) y secuencias de ADN de levaduras incluyendo un promotor ADH2 reprimible con glucosa y un líder de secreción del factor \alpha. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). El líder del factor \alpha en levaduras, que dirige la secreción de proteínas heterólogas, se puede insertar entre el promotor y el gen estructural que debe ser expresado. Véase, por ejemplo, Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; y Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. La secuencia líder se puede modificar para que contenga, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia líder con los genes extraños.

Las secuencias de control de la transcripción y la traducción en los vectores de expresión que se deben usar para transformar las células de vertebrados pueden ser proporcionadas por fuentes víricas. Por ejemplo, los promotores y potenciadores comúnmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, virus 40 de simios (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma vírico del SV40 por ejemplo el origen, promotor temprano y tardío, potenciador, sitio de empalme y sitio de poliadenilación del SV40 se pueden usar para proporcionar los otros elementos genéticos necesarios para la expresión de una secuencia de ADN heteróloga. Los promotores temprano y tardío son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir del virus como un fragmento que también contiene el origen de replicación vírico del SV40 (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). También se pueden usar fragmentos de SV40 mayores o menores, con la condición de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio HindIII hasta el sitio BglI situados en el origen de replicación vírico. Además, se pueden usar el promotor genómico vírico, secuencias de control y/o señal, con la condición de que dichas secuencias de control sean compatibles con la célula huésped elegida. Los vectores ejemplo se pueden construir como ha sido descrito por Okayama y Berg (Mol. Cell Biol. 3: 280, 1983).

Un sistema útil para la expresión estable de alto nivel de los ADNc receptores de mamíferos en células epiteliales mamarias C127 murinas se puede construir esencialmente como ha sido descrito por Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Un vector eucariótico preferido para la expresión del ADN del IL-17R se denomina pDC406 (McMaham et al., EMBO J. 10: 2821, 1991) e incluye secuencias de regulación obtenidas a partir del SV40, virus de inmunodeficiencia humano (VIH) y virus de Epstein-Barr (EBV). Otros vectores preferidos incluyen el pDC409 y pDC410 que se obtienen a partir del pDC406. El pDC410 se obtuvo a partir del pDC406 sustituyendo del origen de replicación del EBV con secuencias que codifican el antígeno T grande del SV40. El pDC409 se diferencia del pDC406 en que se ha realizado la deleción de un sitio de restricción BglII fuera del sitio de clonación múltiple, haciendo único el sitio Bgl II en el sitio de clonación múltiple.

Células huésped

Las células huésped transformadas son células que han sido transformadas o transfectadas con vectores de expresión construidos usando técnicas de ADN recombinante y que contienen secuencias que codifican las proteínas de la presente invención. Las células huésped transformadas pueden expresar la proteína deseada (IL-17R o sus homólogos), pero las células huésped transformadas con el objetivo de clonar o amplificar el ADN de la invención no necesitan expresar la proteína. Las proteínas expresadas serán secretadas preferiblemente en el sobrenadante del cultivo, dependiendo del ADN elegido, pero se pueden depositar en la membrana celular.

Las células huésped adecuadas para la expresión de las proteínas víricas incluyen las células procariotas, de levaduras o eucarióticas superiores bajo el control de los promotores adecuados. Las procariotas incluyen los organismos gram positivo o gram negativo, por ejemplo E. Coli o Bacillus spp. Las células eucarióticas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero como se describen a continuación. También se pueden emplear sistemas de traducción sin células para producir proteínas víricas usando los ARN obtenidos a partir de los constructos de ADN descritos en la presente memoria. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y de mamíferos han sido descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985), cuya descripción pertinente se incorpora como referencia en la presente memoria.

Los huéspedes de expresión procarióticos se pueden usar para la expresión del IL-17R u homólogos que no requieren procedimientos proteolíticos ni con bisulfito extensos. Los vectores de expresión procarióticos comprenden generalmente uno o más marcadores fenotípicos elegibles, por ejemplo un gen que codifica las proteínas que confieren resistencia a los antibióticos o que proporcionan un requisito autotrófico, y un origen de replicación reconocido por el huésped para asegurar la amplificación en el huésped. Los huéspedes procarióticos adecuados para la transformación incluyen E. Coli, Bacillus subtilis, Salmonella Typhimurium y varias especies de los géneros Pseudomonas, Streptomices y Staphylococcus, aunque también se pueden emplear otros como material de elección.

El IL-17R recombinante también puede ser expresado en una levadura huésped, preferiblemente de la especie Saccharomyces, tal como la S. Cerevisiae. También se pueden emplear levaduras de otros géneros, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levaduras generalmente contendrán un origen de replicación del plásmido 2\mu de levadura o una secuencia de replicación autónoma (ARS), promotor, ADN que codifica la proteína vírica, secuencias para la poliadenilación y terminación de la transcripción y un gen de selección. Preferiblemente, los vectores de levaduras incluirán un origen de replicación y un marcador elegible que permitan la transformación tanto de la levadura como de la E. Coli, por ejemplo el gen de la resistencia a la ampicilina de la E. Coli y el gen trp 1 de la S. cerevisae, que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura a la que le falta la capacidad para crecer en triptófano, y un promotor obtenido a partir de un gen de levadura altamente expresado para inducir la transcripción de una secuencia estructural en la dirección 3'. La presencia de la lesión trp 1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un medio eficaz para detectar la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano.

Los protocolos de transformación de levaduras adecuados son conocidos por los expertos en la técnica; un ejemplo de técnica ha sido descrito por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978, eligiendo los transformantes Trp+ en un medio de selección que consiste en 0,67% de base nitrogenada de levadura, 0,5% de ácidos casamino, 2% de glucosa, 10 \mug/mL de adenina y 20 \mug/mL de uracilo. Las cepas huésped transformadas por vectores que comprenden el promotor ADH2 se pueden hacer crecer por expresión en un medio rico que consiste en 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementada con 80 mg/mL de adenina y 80 mg/mL de uracilo. La desrepresión de promotor ADH2 se produce por agotamiento de la glucosa del medio. Los sobrenadantes de levadura brutos se cultivan por filtración y se mantienen a 4ºC antes de purificación adicional.

Varios sistemas de cultivos celulares de insectos o mamíferos se pueden emplear para expresar la proteína recombinante. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos se revisan en Luckow y Summers, Bio/Technology 6: 47 (1998). Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981) y otras líneas celulares capaces de expresar un vector apropiado, incluyendo por ejemplo las líneas celulares CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los vectores de expresión en mamíferos pueden comprender elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador unido al gen que debe ser expresado y otras secuencias no transcritas en los extremos 5' o 3', y secuencias no traducidas en 5' o 3', tales como los sitios de enlace ribosómicos necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de empalme y secuencias de terminación de la transcripción.

Purificación de los receptores de la IL-17

Los homólogos o análogos del IL-17R purificados se preparan cultivando sistemas huésped/vector adecuados para expresar los productos de traducción recombinante de los ADN de la presente invención, que entonces se purifican del medio de cultivo o de los extractos celulares. Por ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas que segregan la proteína recombinante en el medio de cultivo pueden concentrarse primero usando un filtro de concentración de la proteína disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.

Después de la etapa de concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una proteína de estructura homóloga o lectina o una molécula de anticuerpo enlazada a un soporte adecuado. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo una matriz o sustancia que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) laterales. Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede usar una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. La cromatografía por filtración en gel también proporciona un medio para purificar las proteínas de la invención.

La cromatografía de afinidad es un método particularmente preferido para purificar el IL-17R y sus homólogos. Por ejemplo, un IL-17R expresado como una proteína de fusión que comprende una región de inmunoglobulina Fc puede purificarse usando cromatografía de afinidad de Proteína A o Proteína G. Además, una proteína IL-17R que comprende un dominio de cierre de oligomerización puede purificarse sobre una resina que comprende un anticuerpo específico del dominio de cierre de oligomerización. Los anticuerpos monoclonales frente a la proteína IL-17R también pueden ser útiles en la purificación por cromatografía de afinidad usando métodos que son bien conocidos en la técnica. También se puede usar un ligando (es decir, IL-17R o HVS-13) para preparar una matriz de afinidad para la purificación por afinidad del IL-17R.

Finalmente, se pueden usar una o más etapas de cromatografía líquida de altas prestaciones en fase inversa (RP-HPLC) empleando un medio hidrófobo de RP-HPLC, por ejemplo gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos laterales para proporcionar una proteína recombinante homogénea.

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La proteína recombinante producida en un cultivo bacteriano se aísla generalmente por extracción inicial a partir de precipitados celulares, seguido por una o más etapas de concentración, salificación, intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión de tamaño. Finalmente, se puede usar cromatografía líquida de altas prestaciones (HPLC) para las etapas de purificación finales. Las células microbianas empleadas en la expresión de la proteína vírica recombinante pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, ultrasonidos, ruptura mecánica o la utilización de agentes de lisis celular.

La fermentación de las levaduras que expresan la proteína de la invención como una proteína secretada simplifica de forma importante la purificación. La proteína recombinante secretada que resulta de la fermentación a gran escala se puede purificar por métodos análogos a los descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Esta referencia describe dos etapas secuenciales de HPLC en fase inversa para la purificación del GM-CSF recombinante humano en una columna de HPLC preparativa.

La proteína sintetizada en un cultivo recombinante se caracteriza por la presencia de componentes celulares, incluyendo proteínas, en cantidades y de un carácter que dependen de las etapas de purificación realizadas para recuperar la proteína de la invención del cultivo. Estos componentes serán generalmente de origen de levaduras, procariotas o eucariotas superiores no humanas y preferiblemente están presentes en cantidades contaminantes inocuas, del orden de menos de aproximadamente 1 por ciento en peso. Además, el cultivo celular recombinante permite la producción de las proteínas de la invención sin otras proteínas que normalmente pueden estar asociadas con las proteínas como se encuentran en la naturaleza en la especie de origen.

Administración de las composiciones de IL-17R

La presente invención proporciona el uso de composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad eficaz de una proteína y un diluyente y vehículo adecuados en el tratamiento de la osteoartritis. También está previsto el uso del IL-17R o sus homólogos junto con receptores solubles de la citocina o citocinas u otras moléculas inmunorreguladoras. Dichas moléculas se pueden administrar separadamente, secuencialmente o simultáneamente con las composiciones de IL-17R. Particularmente, las moléculas inmunorreguladoras preferidas son receptores solubles de la IL-1, receptores solubles del TNF y sus proteínas de fusión.

Para uso terapéutico, la proteína purificada se administra a un paciente, preferiblemente un humano, para el tratamiento de forma apropiada para la indicación. Así, por ejemplo, las composiciones de proteína IL-17R se pueden dar mediante inyección de un bolo, infusión continua, liberación prolongada para implantes u otra técnica adecuada. Típicamente, se administrará un agente terapéutico en forma de una composición que comprende IL-17R purificado junto con vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Dichos vehículos serán no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas.

Generalmente, la preparación de dichas composiciones de proteína supone combinar la proteína de la invención con disoluciones amortiguadoras de pH, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. La disolución salina tamponada neutra o disolución salina mezclada con albúmina de suero coespecífico son diluyentes apropiados que sirven de ejemplo. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado usando disoluciones de excipientes apropiados (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Las dosis apropiadas se pueden determinar en ensayos. La cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y la severidad del trastorno que se va a tratar, la respuesta deseada, la condición del paciente, etc.

Los receptores del IL-17R (CTLA-8) se pueden administrar con el objetivo de regular los niveles de NO. Es probable por lo tanto que el IL-17R sea útil para el tratamiento de la osteoartritis.

Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración y no como limitación. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden hacer variaciones de los modos de realización de la invención presentados en los ejemplos, especialmente a la luz de las enseñanzas de las distintas referencias citadas en la presente memoria, cuyas descripciones se incorporan como referencia.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la capacidad del IL-17R para inhibir la respuesta proliferativa de las células T a los mitógenos. Los órganos linfoides se cultivaron asépticamente y se obtuvo una suspensión celular. Las células T esplénicas y de los nodos linfáticos se aislaron de la suspensión celular. La pureza de las preparaciones de células T esplénicas resultantes fueron generalmente >95% CD3^{+} y <1% sIgM^{+}. Se cultivaron células T esplénicas murinas purificadas (2 x 10^{5}/pozo) bien con 1% de PHA o bien con 1 mg/mL de Con A, y se valoró en el ensayo un IL-17R soluble (una forma soluble del IL-17R que comprende la región extracelular del IL-17R fundida con la región Fc de la IgG1). La proliferación se determinó después de 3 días con la adición de 1 \muCi [3H]timidina. La secreción de las citocinas (interleucina-2) se determinó para células T murinas cultivadas durante 24 horas con 1 \mug/mL de Con A en presencia o ausencia de 10 \mug/mL de IL-17R.Fc o en presencia de una proteína Fc de control. La producción de IL-2 se midió por ELISA y los resultados se expresaron como ng/mL de IL-2 producidos.

La IL-7R/Fc inhibió de forma significativa la proliferación inducida por el mitógeno de las células T esplénicas murinas purificadas de forma dependiente de la dosis, mientras que el Fc de control no tuvo ningún efecto sobre la proliferación de células T murinas. Se observó una inhibición completa de la proliferación inducida por el mitógeno para una concentración de IL-17R.Fc soluble de 10 \mug/mL. Los análisis de producción de IL-2 por las células T esplénicas activadas con Con A en presencia o en ausencia de IL-17R-Fc en el cultivo mostró que la adición de IL-17R.Fc al cultivo de células T inhibió la producción de IL-2 a niveles 8-9 veces inferiores a los observados en cultivos que contienen el medio solo o el medio más una proteína Fc de control. Se observaron resultados similares cuando se usaron células T humanas.

Ejemplo 2

Este ejemplo muestra la capacidad del IL-17R para inhibir la producción de NO por las células asociadas al cartílago. El cartílago articular se obtiene de pacientes afectados por OA o controles normales esencialmente como ha sido descrito por Amin et al. supra. El cartílago se corta en discos pequeños (aproximadamente 3 mm) que se colocan en un cultivo de órganos en presencia o en ausencia de IL-17R.Fc o en presencia de una proteína Fc de control. La producción de óxido nítrico se analiza determinando el nivel de nitrito en el medio a diferentes intervalos de tiempo, por ejemplo usando una reacción de Griess modificada (Anal. Biochem. 12b: 12299; 1982). Ding et al. (J. Immunol. 141: 2407, 1988) también describen un método útil para medir el NO en cultivos de órganos ex vivo de células asociadas a la sinovia y al cartílago. El IL-17R.Fc se valora para determinar una concentración eficaz para inhibir la producción de NO. También se usan otras formas solubles del IL-17R para regular los niveles de NO de esta forma.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Immunex Corporation

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN:

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv)

DOMICILIO DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Immunex Corporation

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(B)

CALLE: 51 University Street

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(C)

CIUDAD: Seattle

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(D)

ESTADO: Washington

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(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 98101

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(v)

FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

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(B)

COMPUTADORA: Apple PowerMacintosh

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: Systema Operativo Apple 7,5,5

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(D)

PROGRAMA: Microsoft Word para PowerMacintosh, Versión 6,0,1

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:-pendiente de asignar-

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 60/052.525

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 27 NOVIEMBRE 1996

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE LEGAL:

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(A)

NOMBRE: Perkins, Patricia Anne

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34,693

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2623-WO

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN::

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(A)

TELÉFONO: (206)587-0430

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(B)

TELEFAX: (206)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 3288 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A)

ORGANISMO: Ratón

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(B)

CLON: receptor de IL-17

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 121..2712

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

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1

2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 864 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3223 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Humano

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: IL-17R

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 93..2690

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 866 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

18

Claims (3)

1. El uso de un receptor soluble de la IL-17 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la osteoartritis.

2. El uso según la reivindicación 1 en el que el receptor soluble de la IL-17 se elige entre el grupo que consiste en:

(a)

una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 322 de la SEQ. ID. Nº 2;

(b)

una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 320 de la SEQ. ID. Nº 4;

(c)

una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente 70% a las secuencias de aminoácidos de las proteína (a) o (b) y que se enlaza al IL-17R; y

(d)

fragmentos de las proteínas (a), (b) o (c) que se enlazan a la IL-17.

3. El uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que el medicamento se administra simultánea, secuencial o separadamente con una molécula inmunorreguladora elegida entre el grupo que consiste en una receptor soluble de la IL-1 de tipo I, un receptor soluble de la IL-1 de tipo II, un antagonista de un receptor de la IL-1, un receptor soluble del TNF, una proteína de fusión que comprende una receptor de la IL-1 y un receptor del TNF y sus combinaciones.