ES2227513T3

ES2227513T3 - Nuevas citoquinas.

Info

Publication number: ES2227513T3
Application number: ES92925017T
Authority: ES
Inventors: Richard J. Armitage; William C. Fanslow; Melanie K. Spriggs; Srinivasan Subhashini
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1991-10-25
Filing date: 1992-10-23
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2012-10-23
Also published as: NO941422L; FI981765A0; ES2198025T3; EP0667901A4; NO317625B1; DK0897983T3; CA2312667C; AU3122693A; DK0667901T3; WO1993008207A1; FI941837A0; JP2877788B2; FI941837L; CA2121798A1; DE69233402T2; EP0667901A1; EP0667901B2; JPH10150994A; ATE274055T1; DE69233051T2

Abstract

SE DESCRIBE UN POLIPEPTIDO (CD40-L) Y SECUENCIAS DNA, VECTORES Y CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS UTILES EN LA PRODUCCION DE CD40-L. CON MAS PARTICULARIDAD, ESTA INVENCION PROPORCIONA POLIPEPTIDOS CD40-L HUMANOS Y MURINE AISLADOS QUE SE UNEN A LA REGION DE UNION EXTRACELULAR DE UN RECEPTOR CD40.

Description

Nuevas citoquinas.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a una citoquina nueva. Más específicamente, la presente invención se refiere a la clonación de una citoquina murina y humana que se une a un CD40 humano que tiene actividad agonista y antagonista en formas solubles y unidas a la membrana.

Antecedentes de la invención

Las citoquinas que tienen una denominación de "interleuquina" son los factores proteicos que influyen sobre las células inmunitarias efectoras. Las citoquinas designadas desde interleuquina-1 a interleuquina-12 se han publicado y denominado interleuquinas. Entre otras citoquinas conocidas se incluyen el factor de necrosis tumoral (TNF), el factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF), el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor de crecimiento de mastocitos (MGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento nervioso (NGF), la eritropoyetina (EPO), el \gamma-interferón (\gamma-IFN) y otros.

Se han clonado los ADN de dos receptores de TNF diferentes (tipo I y tipo II) (Smith y col., Science 248: 1019, 1990; y Schall y col., Cell 61: 361, 1990). Ambas formas del receptor de TNF están relacionadas entre sí y pertenecen a una familia de receptores cuyos miembros incluyen el receptor del factor de crecimiento nervioso (Johnson y col., Cell 47: 545, 1986), el antígeno CD40 de las células B (Stamenkovic y col., EMBO J. 8: 1403, 1989), el antígeno de la célula T OX40 (Mallett y col. EMBO J.9:1063, 1990), el antígeno humano Fas (Itoh y col., Cell 66: 233, 1991) y el receptor 4-IBB murino (Kwon y col., Cell. Immunol. 121: 414, 1989 [Kwon y col. I] y Kwon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1963, 1989 [Kwon y col. II]).

La proteína CD40 humana (CD40) es un péptido de 277 aminoácidos que tiene un peso molecular de 30.600 y un péptido de señalización secretor de 19 aminoácidos que comprende, principalmente, aminoácidos hidrófobos (Stamenkovic y col.). El peso molecular (exclusivo de glucosilación) de la proteína CD40 humana madura es 28.300. De una genoteca de ADNc preparada para la línea celular de linfoma de Burkitt, Raji, se aisló un ADNc que codificaba la CD40 humana. La proteína putativa codificada por el ADNc deCD40 contiene una secuencia líder putativa, un dominio transmembrana y una serie de otras características comunes a las proteínas receptoras unidas a la membrana. Se ha descubierto que CD40 se expresa en la superficie de los linfocitos B, las células epiteliales y algunas líneas de células de carcinoma.

Se ha mostrado que un anticuerpo monoclonal (AcMo) dirigido contra CD40 media varios efectos funcionales de las células B humanas. Entre estos efectos se incluyen: (a) adherencias homotípicas (Gordon y col., J. Immunol. 140: 1425, 1988 [Gordon y col., I]; (b) aumento del tamaño celular (Gordon y col. I y Valle y col., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989); (c) proliferación de células B activadas con AcMo anti-IgM, anti-CD20, ésteres de forbol solos (Clark y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; y Paulie y col., J. Immunol. 142: 590, 1989) o ésteres de forbol combinados con interleuquina-4 (Gordon y col., Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987 [Gordon y col. II]; y (d) producción de IgE (Jabara y col., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; Zhang y col., J. immunol. 146: 1836, 1991) e IgM (Gascan y col., J. Immunol. 147: 8, 1991) en cultivos con depleción de células T estimulados con interleuquina-4 (IL-4).

Se descubrió que uno de tales anticuerpos, denominado AcMo 89 por Banchereau y col., Clin. Immunol. Spectrum 3: 8, 1991 [Banchereau y col. I], inducía la proliferación de células B humanas a una concentración del anticuerpo relativamente baja (30 ng/ml o aproximadamente 10^{-10}M). La proliferación duró de dos a tres semanas y tuvo como resultado una expansión de diez veces la población de células B humanas. La estimulación óptima de las células B se produjo cuando la molécula de superficie CD40 se entrecruzó con la IgM. Los fragmentos Fab de otro AcMo anti-CD40 indujeron sólo una débil respuesta proliferativa. Además, Banchereau y col., Science 251: 70, 1991 [Banchereau y col. II] comunicaron que las células B humanas en reposo entraban en un estado de proliferación mantenida cuando se incubaban con una línea celular Ltk fibroblástica murina que se había sometido a transfección con el receptor Fc humano y con un anticuerpo monoclonal específico del CD40 humano. Banchereau y col. II descubrieron que el entrecruzamiento con CD40 es necesario para la expansión clonal de las células B.

El CD23 es un receptor de IgE de baja afinidad que se ha descubierto que se expresa en la mayoría de las células B maduras IgM^{-}/IgD^{-}, pero no en las células T. Se ha secuenciado el CD23 y su secuencia la describieron Kikutani y col., Cell 47: 657, 1986. Se descubrió que el CD23 soluble (sCD23) inducía una reacción pirogénica en conejos, y esta reacción se anuló con la administración de IgE humana (Ghaderi y col., Immunology 73: 510, 1991). Por tanto, el CD23 puede ser un marcador adecuado de los efectos del CD40 soluble o CD40-L.

Clark, Tissue Antigens 35: 33-36, 1990, es un artículo de revisión que describe el CD40 y el hecho de que no se ha identificado el ligando de CD40.

Yellin y col., Immunol. 147 (10): 3389-3395, 1991 describen que un subclon de CD4^{-} de la línea de células T leucémicas Jurkat, conocido como D1.1, induce la activación de células B. Esto sugiere que las estructuras de superficie en D1.1 median este efecto.

La solicitud de patente europea nº 0614374 es parte del estado de la técnica según el Artículo 54(3) de CPE y describe un anticuerpo que reconoce una molécula de la superficie de células T en D1.1 conocida como T-BAM, así como un inmunoprecipitado del anticuerpo y T-BAM.

Antes de la presente invención no se conocía un ligando para C40. En consecuencia, en la técnica existe una necesidad de identificar un ligando de CD40 (CD40-L).

Resumen de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ADN aislado que codifica un polipéptido CD40-L que se une a CD40, seleccionado entre: (a) ADN que comprende los nucleótidos 46 a 828, 196 a 828, 193 a 762 de la ID SEC nº 11 y sus hebras complementarias; (b) ADN que codifica los aminoácidos 1-261 de la ID SEC Nº 12; (c) ADN que codifica los aminoácidos 47-261 de la ID SEC Nº 12; (d) ADN que codifica los aminoácidos 51-261 de la ID SEC Nº 12; (e) ADN que codifica un fragmento de (c) o (d); y (f) ADN que es complementario al ADN que hibrida con el ADN de (a) en condiciones moderadamente rigurosas (solución de prelavado de 5 x SSC, 0,5% SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, 5 x SSC durante la noche).

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un ADN aislado que codifica un polipéptido CD40-L que se une a CD40, seleccionado entre: (a) ADN que comprende los nucleótidos 1 a 783 de la ID SEC Nº 1 y su hebra complementaria; (b) ADN que codifica los aminoácidos 1 a 260 de la ID SEC Nº 2; (c) ADN que codifica los aminoácidos 47 a 260 de la ID SEC Nº 2; (d) ADN que codifica un fragmento de (b) o de (c); y (e) ADN que es complementario del ADN que hibrida con el ADN de (a) en condiciones moderadamente rigurosas (solución de prelavado de 5 x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, 5 x SSC durante la noche).

Se ha aislado y se ha caracterizado una nueva citoquina, en lo sucesivo denominada "CD40-L". La secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos deducida del ADNc del CD40-L murino representativo se describen en la ID SEC Nº 1 y en la figura 1 y la secuencia de aminoácidos también se enumera en la ID SEC Nº 2. La secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos deducida del ADNc de CD40-L humano representativo se describen en la ID SEC Nº 11 y en la figura 2, y la secuencia de aminoácidos se enumera en la ID SEC Nº 12. La presente invención además comprende otros polipéptidos CD40-L codificados por las secuencias nucleotídicas que hibridan, en condiciones moderada o intensamente rigurosas, con sondas definidas por la ID SEC Nº 11 (la región codificadora del CD40-L humano), fragmentos de la secuencia que se extienden desde el nucleótido 46 al nucleótido 828 de la ID SEC Nº 11, o a las secuencias de ADN o de ARN complementarias a la figura 2 (ID SEC Nº 11) o fragmentos de los mismos. La invención además comprende secuencias de ácido nucleico que, debido a la degeneración del código genético, codifican polipéptidos sustancialmente idénticos o sustancialmente similares a los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente y las secuencias complementarias a ellas.

El CD40-L es un polipéptido de membrana de tipo II que tiene una región extracelular en su extremo C, una región transmembrana y una región intracelular en su extremo N. Se ha descubierto una versión soluble del CD40-L murino en sobrenadantes de células EL-4 y de células EL-4 clasificadas según una proteína de fusión CD40/Fc biotinilada descrita en la presente memoria descriptiva. El CD40-L soluble comprende una región extracelular de CD40-L o un fragmento del mismo. La secuencia proteica del CD40-L murino se describe en la figura 1 y la ID SEC Nº 2, y el CD40-L humano en la figura 2 y la ID SEC Nº 12. La región extracelular del CD40-L murino se extiende desde el aminoácido 47 al aminoácido 260 en la figura 1 y la ID SEC Nº 2, y la del CD40-L humano desde el aminoácido 47 al aminoácido 261 en la figura 2 y la ID SEC Nº 12. La actividad biológica del CD40-L está mediada por la unión de esta citoquina al CD40 e incluye la proliferación de células B y la inducción de la secreción de anticuerpos, incluyendo la secreción de IgE.

Los oligonucleótidos sentido y antisentido (desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos) que corresponden a una secuencia de al menos aproximadamente 12 nucleótidos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de CD40-L o de las secuencias de ADN o de ARN complementarias a la secuencia nucleotídica del CD40-L como se describen en las ID SEC Nº1 y ID SEC Nº11 y en las figuras 1 2 impiden la transcripción o la traducción del ARNm de CD40-L o de polipéptidos.

Los fragmentos peptídicos de CD40-L que corresponden a una secuencia proteica de al menos 10 aminoácidos seleccionados de la secuencia de aminoácidos codificada por la ID SEC Nº 1 o la ID SEC Nº 11, que pueden actuar como inmunógenos para generar anticuerpos específicos de inmunógenos CD40-L pueden servir como determinantes antigénicos que proporcionen anticuerpos monoclonales específicos del CD40-L.

La invención también proporciona una proteína de fusión CD40/Fc humana y una proteína CD40 soluble (sCD40) que comprende la región extracelular del CD40 humano. Ambas proteínas de fusión, sCD40 y CD40/Fc, pueden inhibir el CD40-L o la estimulación de células B inducidas por AcMo antiCD40, la estimulación de IgE inducida por IL-4 y la inducción de CD23 inducida por IL-4 en células B.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos correspondientes al CD40-L murino. Esta proteína es un polipéptido de tipo II que tiene su extremo N como su dominio intracelular, seguido por una región transmembrana y un dominio extracelular en el extremo C del polipéptido. El dominio extracelular, que es más largo que el dominio intracelular o que la región transmembrana, contiene un sitio de posible glucosilación unido a N y dos posibles enlaces disulfuro en vista de los cuatro residuos de cisteína (Cys).

La figura 2 ilustra las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos correspondientes al CD40-L humano. Esta proteína es un polipéptido de tipo II que tiene su extremo N como su dominio intracelular, seguido por una región transmembrana y un dominio extracelular en el extremo C del polipéptido. El dominio extracelular, que es más largo que el dominio intracelular o que la región transmembrana, contiene un sitio de posible glucosilación unido a N y dos posibles enlaces disulfuro en vista de los 5 residuos de cisteína (Cys).

La figura 3 ilustra una comparación de las secuencias proteicas de los CD40-L humano y murino, que muestra una homología del 77,7% en los aminoácidos.

La figura 4 ilustra la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana con depleción de células T causada por la incubación con células CV1 resultantes de la transfección con ADNc del CD40-L murino de longitud completa (ID SEC Nº1) y que expresan la unión CD40-L (células CD40-L ^{+}CV1) cuando se compararon con células CV1 resultantes de la transfección con un vector vacío (HA VEO) y que no expresan la unión CD40-L murino. Los resultados de proliferación al 7º día muestran que las células CD40-L ^{+}CV1 aumentan de forma significativa la proliferación de PBMC con depleción de células T en presencia o ausencia de interleuquina-4 (IL-4).

La figura 5 ilustra una segunda determinación de la proliferación de PBMC con depleción de células T con la adición de CD40-L murino unido y 10 ng/ml de IL-4. Estos datos muestran la ausencia de efectos comitogénico de la IL-4 pero el fuerte efecto mitogénico del CD40-L unido continuó.

La figura 6 ilustra que el CD40-L unido aumenta la secreción de IgE.

La figura 7 ilustra que el CD40-L unido a membrana estimula la eliminación de CD23 en presencia de IL-4.

La figura 8 ilustra la proliferación de células B esplénicas murinas causada por CD40-L unido murino o de células 7A1, que es un clon de células T cooperadoras.

La figura 9 ilustra una comparación entre células EL40.9 murinas, una línea celular seleccionada según la expresión de CD40-L murino, y células T 7A1 para la inducción de una respuesta específica de antígeno indicada por células formadoras de placas (PFC) mediante eritrocitos antioveja (SCBC).

La figura 10 ilustra una comparación de la actividad proliferativa de células B de CD40L unido a membrana y otros tipos de células sometidos a transfección con ADNc diferentes. El CD40-L unido a membrana mostró una actividad proliferativa de células significativamente mayor que un clon de células colaboradoras u otras células control.

La figura 11 ilustra que las células 7C2 (un clon de células T colaboradoras) y células CV1 sometidas a transfección con ADNc de CD40-L murino inducen células formadoras de placa antiEC.

La figura 12 ilustra una comparación de dos clones de células T colaboradoras con células que expresan CD40-L unido a membrana para inducir la proliferación de células B murinas.

La figura 13 ilustra la inducción de células formadoras de placa específicas de antígeno por CD-40-L unido a membrana y un clon de células T colaboradoras en presencia o ausencia de interleuquina-2 (IL-2) añadida.

La figura 14 muestra los efectos del CD40-L unido a la membrana en la estimulación de la proliferación de células B y la secreción de IgE. Los efectos del CD40-L unido a la membrana se inhibieron con el receptor CD40 pero no por el receptor de TNF.

Descripción detallada de la invención

Se han aislado y secuenciado nuevos polipéptidos que pueden actuar como ligandos del CD40 murino y humano. Más particularmente, se han clonado y secuenciado los ADNc que codifican estos ligandos. Además se proporcionan procedimientos para la expresión de polipéptidos CD40-L recombinantes. Los polipéptidos CD40-L incluyen otras formas de CD40-L de mamíferos, tales como derivados o análogos del CD40-L humano o ,murino. Los CD40-L murino y humano comprenden una región extracelular de, respectivamente, 214 y 215 aminoácidos en el extremo C del polipéptido unido a la membrana de longitud completa. La región extracelular contiene el dominio que se une al CD40. Los CD40-L murino y humano además comprenden una región transmembrana hidrófoba homóloga de 24 aminoácidos delineada por aminoácidos cargados en ambos lados y una región intracelular de 22 aminoácidos en su extremo N. La presente invención además comprende polipéptidos de CD40-L de longitud completa o sus fragmentos, que comprenden toda o parte de la región extracelular o derivados de la región extracelular y células de mamífero sometidas a transfección con un ADNc que codifica el CD40-L murino o humano y que expresan CD40-L humano o murino como una proteína unida a la membrana.

La presente invención comprende secuencias de ADN aisladas que codifican polipéptidos de CD40-L y secuencias de ADN o de ARN complementarias a tales secuencias de ADN aisladas. Las secuencias de ADN aisladas y sus complementarias se seleccionan del grupo formado por (a) los nucleótidos 184 a 828, los nucleótidos 193 a 828 o los nucleótidos 193 a 762 de la secuencia de ADN que se expone en la figura 2 (ID SEC Nº 11) y sus complementarias, (b) secuencias de ADN que hibridan con las secuencias de ADN de (a) o sus complementarias en condiciones moderadamente rigurosas y que codifican un polipéptido de CD40-L, análogos o derivados del mismo, y (c) secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, codifican polipéptidos de CD40-L codificados por cualquiera de las secuencias de ADN anteriores y sus complementarias. Además, la presente invención incluye vectores que comprenden secuencias de ADN que codifican polipéptidos de CD40-L y análogos, células huésped sometidas a transfección con tales vectores, y un procedimiento para preparar un polipéptido, que comprende cultivar tal célula huésped en condiciones que estimulan la expresión del polipéptido. La invención también proporciona un ADN como se muestra en las ID SEC Nº 5, 6, 7, 9 ó 10, o su ARN equivalente, o su complementaria.

También se proporciona un polipéptido de CD40-L purificado que se une al CD40-L, que proporciona un polipéptido codificado por el ADN de los aspectos primero y segundo.

La nueva citoquina descrita en la presente memoria descriptiva es un ligando de CD40, un receptor que es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF. Por tanto, es muy probable que el CD40-L sea el responsable de la transducción de la señal a través del CD40, del que se conoce que se expresa en, por ejemplo, los linfocitos B. El CD40-L de longitud completa es un polipéptido unido a la membrana con una región extracelular en su extremo C, una región transmembrana y una región intracelular en su extremo N. A partir de la región extracelular o de un fragmento de la misma se puede preparar una versión soluble del CD40-L y se ha descubierto un CD40-L soluble en sobrenadantes de cultivos de células que expresan una versión unida a la membrana del CD40-L. La secuencia proteica de la región extracelular del CD40-L murino se extiende desde el aminoácido 47 al aminoácido 260 de la figura 1 y la ID SEC Nº 2. La secuencia proteica de la región extracelular del CD40-L humano se extiende desde el aminoácido 47 hasta el aminoácido 261 de la figura 2 y la ID SEC Nº 12. La actividad biológica del CD40-L está mediada por la unión al CD40 o a su homólogo específico de especie, y comprende la proliferación de células B y la inducción de la secreción de inmunoglobulinas por parte de las células B activadas. El CD40-L (incluidas las formas solubles monomérica y oligomérica, así como las formas unidas a la membrana) pueden efectuar la proliferación de células B y la secreción de inmunoglobulinas (a excepción de la secreción de IgE) sin la presencia de IL-4 añadida, al contrario que los anticuerpos antiCD40, que requieren IL-4 y entrecruzamiento para mediar la actividad.

El CD40-L se refiere a un género de polipéptidos que son capaces de unirse a CD40 o a homólogos en mamíferos del CD40. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "CD40-L" incluye polipéptidos de CD40-L solubles que no tienen regiones transmembrana ni intracelular, homólogos en mamíferos del CD40-L humano, análogos del CD40-L humano o murino o derivados del CD40-L humano o murino.

El CD40-L también se puede obtener mediante mutaciones de secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido de CD40-L. Un análogo de CD40-L, según se denomina en la presente memoria descriptiva, es un polipéptido sustancialmente homólogo a una secuencia de CD40-L humano o murino pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la secuencia nativa del polipéptido de CD40-L (de las especies humana o murina) a causa de una o una pluralidad de deleciones, inserciones o sustituciones. Se pueden sintetizar análogos de CD40-L a partir de constructos de ADN preparados mediante síntesis y unión de oligonucleótidos o mediante técnicas de mutagénesis específica de sitio.

La estructura aminoacídica primaria del CD40-L humano o murino puede modificarse para crear derivados de CD40-L formando conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos, tales como grupos glucosilo, lípidos, fosfatos, grupos acetilo y similares, o creando secuencias aminoacídicas mutantes. Los derivados covalentes del CD40-L se preparan mediante unión de grupos funcionales concretos a las cadenas laterales aminoacídicas del CD40-L o al extremo N o al extremo C de un polipéptido de CD40-L o del dominio extracelular del mismo. Entre otros derivados de CD40-L que entran dentro del alcance de esta invención se incluyen conjugados covalentes o agregados de CD40-L o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante la síntesis en cultivos recombinantes como fusiones en el extremo N o el extremo C. por ejemplo, el conjugado puede comprender una señal o secuencia polipeptídica líder en la región del extremo N o la región del extremo C de un polipéptido de CD40L que, durante o después de la traducción, dirige la transferencia del conjugado de su lugar de síntesis a un lugar dentro o fuera de la membrana de la célula o de la pared celular (por ejemplo, el \alpha-factor líder de Saccharomyces). Las fusiones de polipéptidos de CD40-L pueden comprender polipéptidos añadidos para facilitar la purificación y la identificación de CD40-L (por ejemplo, poli-His) o fusiones con otras citoquinas para proporcionar nuevas entidades polifuncionales. Entre otras citoquinas se incluyen, por ejemplo, cualquiera de las interleuquinas 1 a 13, el TNF (factor de necrosis tumoral), el GM.CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos), G-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos), el factor de crecimiento de mastocitos (MGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento nerviosos (NGF), la eritropoyetina (EPO), el \gamma-interferón (\gamma-IFN), el 4-IBB-L (ligando de 4-IBB) y otras citoquinas que afectan al crecimiento, la diferenciación o la función de las células inmunitarias.

Las secuencias de ácido nucleico que entran dentro del alcance de la presente invención incluyen secuencias de ADN yo de ARN que hibridan con la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 1 o de la ID SEC Nº 11 o sus hebras complementarias, en condiciones moderada o intensamente rigurosas. Condiciones de hibridación moderadamente rigurosas se refiere a condiciones descritas en, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª ed. Vol. 1, pág. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Las condiciones moderadamente rigurosas, según han definido Sambrook y col., incluye el uso de una solución de prelavado de 5 x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, 5 x SSC durante la noche. Las condicione intensamente rigurosas incluyen temperaturas más elevadas de hibridación y lavado.

La actividad biológica de CD40-L puede determinarse, por ejemplo, mediante competición para unirse al dominio de unión al ligando de CD40 (es decir, ensayos de unión competitiva). Tanto el CD40-L murino como el CD40-L humano se unen al CD40 humano. La afinidad de unión del CD40-L murino (expresado en células seleccionadas EL-40.9 murinas) por el CD40 humano fue de aproximadamente 1,74 x 10^{9} M^{-1}. De igual forma, la afinidad de unión del CD40-L murino (expresado en células no seleccionadas EL-46-1 murinas) por el CD40 humano fue de aproximadamente 2,3 x 10^{9} M^{-1}. Las mediciones de la afinidad de unión se encuentran en un intervalo típico de unión a receptor de citoquina/citoquina.

Una configuración de un ensayo de unión competitiva para el polipéptido CD40-L usa un CD40-L murino soluble marcado radioactivamente, según la figura 1 (ID SEC Nº 1) o CD40-L humano según la figura 2 (ID SEC Nº 11) y células intactas que expresan CD40 (por ejemplo, células B humanas). En lugar de células intactas, se podría sustituir el CD40 soluble (tal como una proteína de fusión CD40/Fc) unido a una fase sólida mediante una interacción de la Proteína A o la Proteína G con la región Fc de la proteína se fusión. Una segunda configuración de un ensayo de unión competitiva usa CD40 soluble marcado radioactivamente tal como una proteína de fusión CD40/Fc, y células intactas que expresan CD40-L. Como alternativa, el CD40-L podría unirse a una fase sólida.

Los ensayos de unión competitiva se pueden llevar a cabo usando metodología estándar. por ejemplo, se puede usar un CD40-L murino marcado radioactivamente para competir con un homólogo de CD40-L para el estudio de la actividad de unión frente al CD40 de superficie. Mediante ensayos de unión competitiva en placas autorradiográficas se pueden obtener resultados cualitativos o para generar resultados cuantitativos se pueden usar gráficas de Scatchard.

Los ensayos de unión competitiva con células intactas que expresan CD40 se pueden llevar a cabo mediante dos procedimientos. En un primer procedimiento, se induce el crecimiento de las células B en suspensión o mediante adherencia a las placas de cultivo tisular. Las células adheridas se pueden extraer mediante tratamiento con EDTA 5 mM durante diez minutos a 37ºC. En un segundo procedimiento, se pueden usar células COS sometidas a transfección que expresan CD40 unido a membrana. Las células COS u otras células de mamíferos se pueden someter a transfección con ADNc de CD40 humano en un vector adecuado, para que expresen CD40 de longitud completa con una región extracelular por fuera de la célula.

Como alternativa, el CD40 soluble se puede unir a una fase sólida tal como una matriz de columna de cromatografía o un tubo o sustrato similar para analizar la presencia de un resto detectable tal como ^{125}I. La unión a una fase sólida se puede conseguir, por ejemplo, obteniendo una proteína de fusión CD40/Fc y uniéndola a una proteína A o a una proteína G de superficie.

Otro medio para medir la actividad biológica del CD40-L y sus homólogos es usar CD40 soluble conjugado (por ejemplo, ^{125}I-CD40/Fc) en ensayos de competición similares a los descritos anteriormente. Sin embargo, en este caso, células intactas que expresan CD40-L o CD40-l soluble unido a un sustrato sólido, se usan para medir la competición por la unión de CD40 soluble, conjugado a CD40-L mediante una muestra que contiene un homólogo putativo de CD40.

CD40-L también puede estudiarse midiendo la actividad biológica en un ensayo de proliferación de células B. Las células B humanas se pueden obtener de amígdalas humanas mediante purificación por selección negativa y sedimentación por densidad en Percoll, según se describe en Defrance y col., J. Immunol. 139: 1135, 1987. Pueden usarse líneas de células del linfoma de Burkitt para medir la proliferación celular en respuesta a CD40-L. ejemplos de líneas de células de linfoma de Burkitt incluyen, por ejemplo, Raji (ATCC CCL 86), Daudi (ATCC CL 213) y Namalwa (ATCC CRL 1432). El CD40-L unido a la membrana estimuló la proliferación de células B. El CD40-L oligomérico, preferentemente dimérico, puede estimular la proliferación de células B. El CD40 (receptor) antagoniza la proliferación de células B estimulada por el CD40-L.

Otro ensayo más para determinar la actividad biológica de CD40-L es medir la inmunoglobulina producida por las células B en respuesta a la activación por parte del CD40-L o un derivado o análogo del mismo. La secreción de inmunoglobulinas policlonales se puede medir, por ejemplo, mediante la incubación con 5 x 10^{5} células B/ml en cultivo durante al menos siete días. La producción de inmunoglobulinas (Ig) se puede medir mediante un ensayo ELISA tal como el descrito en Maliszewski y col., J. Immunol. 144: 3028, 1990 [Maliszewski y col. I] o Maliszewski y col., Eur. J. Immunol. 20: 1735, 1990 [Maliszewski y col. II]. Las células B murinas se pueden obtener, por ejemplo, de ratones y cultivar según los procedimientos descritos en Grabstein y col., J. Exp. Med. 163: 1405, 1986 [Grabstein y col. I], Maliszewski y col. I, y Maliszewski y col. II.

Se puede usar CD40-L en un ensayo de unión para detectar las células que expresan CD40. Por ejemplo, el CD40-L murino según la figura 1 (ID SEC Nº 1) o el CD40-L humano según la figura 2 (ID SEC Nº 11), o un dominio extracelular o un fragmento del mismo, se pueden conjugar a un resto detectable tal como ^{125}I. El Marcaje radioactivo con ^{125}I se puede realizar con una cualquiera de las varias metodologías que proporcionan una molécula CD40-L-^{125}I funcional marcada para detectar actividad específica elevada. Como alternativa se puede usar otro resto detectable tal como una enzima que pueda catalizar una reacción clorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las células que expresan CD40 se pueden poner en contacto con CD40-L conjugado. Tras la incubación se elimina el CD40-L conjugado que no se ha unido y se mide la unión usando el resto detectable.

Los polipéptidos de CD40-L pueden existir en forma de un monómero soluble o como oligómeros, como dímeros o trímeros. Los oligómeros pueden estar unidos por puentes disulfuro formados entre residuos de cisteína de los diferentes polipéptidos CD40-L. Pueden formarse usando una cremallera de leucina, tal como la cremallera de leucina de la ID SEC Nº 17. Como alternativa, se pueden unir dos dominios de CD40-L solubles con una secuencia de unión tal como una secuencia de unión Gly_{4}SerGly_{5}Ser, u otras secuencias de unión descritas en EE.UU. en la patente 5.073.627, que se incorpora en la presente memoria descriptiva como referencia. Los polipéptidos de CD40-L también pueden crearse mediante fusión del extremo C del CD40-L soluble (dominio extracelular) con la región Fc de la IgG1 (por ejemplo, la ID SEC Nº 3) como se ha descrito para la proteína de fusión CD40/Fc. Se deja que las proteínas de fusión CD40-L/Fc se asemejen mucho a las cadenas pesadas de una molécula de anticuerpo para formar CD40-L divalente. Si las proteínas de fusión están formadas por cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero CD40-L con tantas como cuatro regiones extracelulares CD40-L.

Las proteínas de fusión se pueden preparar usando técnicas convencionales de corte y empalme enzimático de fragmentos de las secuencias deseadas. Se pueden usar técnicas de PCR usando oligonucleótidos sintéticos para preparar y/o amplificar los fragmentos deseados. También se puede usar la superposición de oligonucleótidos sintéticos que representen las secuencias deseadas para preparar constructos de ADN que codifiquen las proteínas de fusión. Las proteínas de fusión también pueden comprender CD40-L y dos o más secuencias adicionales, incluidas una secuencia líder (o péptido señalizador), región Fc, una secuencia de unión y secuencias codificadoras de restos altamente antigénicos que proporcionan un medio para la purificación superficial o la detección rápida de una proteína de fusión.

Los péptidos señalizadores facilitan la secreción de proteínas por parte de las células. Un ejemplo de péptido señalizador es los 25 aminoácidos del extremo amino de la secuencia líder de la interleuquina-7 humana (IL-7; Goodwin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86: 302, 1989; figura 2B). También se pueden usar otros péptidos señalizadores. Por ejemplo, se pueden alterar ciertos nucleótidos en la secuencia líder de la IL-7 sin alterar la secuencia de aminoácidos. Además, se pueden hacer cambios en los aminoácidos que no afecten a la capacidad de la secuencia de IL-7 para actuar como secuencia líder.

El octapéptido Flag® (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) no altera la actividad biológica de las proteínas de fusión, es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido de forma reversible por un anticuerpo monoclonal, lo que permite la detección rápida y la purificación superficial de la proteína de fusión expresada. La secuencia Flag® también se escinde específicamente por la acción de la enteroquinasa mucosa bovinaenel residuo inmediatamente posterior al par Asp-Lys, las proteínas de fusión protegidas con este péptido también pueden ser resistentes a la degradación intracelular en E. coli. Se ha depositado un anticuerpo monoclonal murino que se une a la secuencia Flag® con el número de registro ATCC HB 9259; en la patente de EE.UU. 5.011.912, que se incorpora en la presente memoria descriptiva como referencia, se describen procedimientos para usar el anticuerpo en la purificación de proteínas de fusión que comprenden la secuencia Flag®.

Se definen regiones Fc adecuadas como regiones Fc que se unen a la proteína A o a la proteína G, o como alternativa, se reconocen por un anticuerpo que se puede usar en la purificación o la detección de una proteína de fusión que comprende la región Fc. Entre las regiones Fc preferibles se incluyen la región Fc de la IgG1 humana o la IgG1 murina. Un ejemplo es la región Fc de IgG1 que se muestra en la ID SEC Nº 3; otro ejemplo es una región Fc codificada por el ADNc obtenido mediante PCR a partir de cebadores oligonucleotídicos de la ID SEC N1 9 y la ID SEC Nº 10, cono ADNc humano como molde. También se pueden usar porciones de una región FC adecuada, por ejemplo, una región Fc de IgG1 humana de la que se ha delecionado una secuencia de aminoácidos responsable de la unión a la proteína A, de forma que la región Fc resultante se une a la proteína G pero no a la proteína A.

La secuencia repetida [Gly_{4}Ser]_{3} proporciona una secuencia de unión que separa la región extracelular del CD40-L de la porción Fc de la proteína de fusión por una distancia suficiente para garantizar que el CD40-L se pliega de forma adecuada en sus estructuras secundaria y terciaria. Las secuencias de unión adecuadas (1) adoptarán una conformación flexible extendida, (2) no exhibirán propensión a desarrollar una estructura secundaria ordenada que podría interaccionar con los dominios funcionales de las proteínas de fusión y (3) tendrán un mínimo carácter hidrófobo o cargado que podría interaccionar con los dominios funcionales de la proteína. Entre los aminoácidos de la superficie típicos en las regiones proteicas flexibles se incluyen Gly, Asn y Ser. Virtualmente se esperaría que cualquier permutación de las secuencias de aminoácidos que contienen Gly, Asn y Ser cumpliera los criterios anteriores para una secuencia de unión. En la secuencia de unión también se pueden usar otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala. La longitud de la secuencia de unión puede variar sin que afecte de forma significativa a la actividad biológica de la proteína de fusión. Las secuencias de unión son innecesarias cuando las proteínas que se están condensando tienen regiones aminoacídicas no esenciales en los extremos N o C, que se pueden usar para separar los dominios funcionales e impedir la interferencia estérica.

Los polipéptidos de CD40-L pueden existir como polipéptidos solubles que comprenden el dominio extracelular de CD40-L como se muestra en la figura 1 (ID SEC Nº 11) y la figura 2 (ID SEC Nº 11) o como polipéptidos unidos a la membrana que comprenden el dominio extracelular, una región transmembrana y un dominio corto intracelular, como se muestra en la figura 1 (ID SEC Nº 1) y la figura 2 (ID SEC Nº 11) para las secuencias murina y humana, respectivamente. Además, la presente invención comprende oligómeros de dominios extracelulares de CD40-L o fragmentos de los mismos, unidos por interacciones disulfuro, o expresados como polímeros de fusión con o sin grupos de enlace de aminoácidos espaciadores. Por ejemplo, una molécula dimérica de CD40-L puede estar unida por un grupo de unión a la región Fc de la IgG.

Sin limitarse a una teoría, el CD40-L unido a la membrana y el CD40-L oligomérico pueden conseguir actividad estimulando la formación de Ig y la proliferación de células B, que anteriormente sólo se conseguía mediante anticuerpo antiCD40 con sobrecruzamiento en presencia de IL-4. Además parece muy probable que el CD40-L monomérico soluble, que comprende sólo el dominio extracelular de CD40-L y es capaz de unirse al receptor CD40, servirá para antagonizar la actividad del CD40-L unido a la membrana y oligomérico y/o de los anticuerpos antiCD40. Además parece probable que la interacción del CD40-L unido a la membrana con CD40 es la principal interacción molecular responsable de la inducción del crecimiento y diferenciación de las células B hacia la producción de anticuerpos específicos de antígenos y hacia la secreción de Ig policlonales dependientes del contacto con células T. A este respecto, una célula de mamífero en la que se ha producido la transfección con un ADNc que codifica CD40-L de longitud completa (es decir, que está unido a la membrana y tiene un dominio intracelular, una región transmembrana y un dominio extracelular o un fragmento del mismo) puede ser similar a las células T en cuanto a su capacidad para inducir el crecimiento de las células B, la diferenciación y la estimulación de la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Parece que las actividades del CD40-L oligomérico soluble, preferentemente un dímero de regiones extracelulares, pueden ser similares a las actividades biológicas del CD40-L unido a la membrana. Es más, el CD40-L monomérico soluble (que comprende el dominio extracelular o un fragmento del mismo) se puede unir al receptor de CD40 para impedir la interacción de las células T con las células B y, por tanto, tiene una actividad similar al dominio extracelular de CD40 (receptor), que él mismo puede estar en forma monomérica u oligomérica. Como alternativa, el CD40-L puede ser oligomérico (preferentemente un dímero) para actuar como un factor soluble capaz de inducir el crecimiento de las células B, su diferenciación y la estimulación de la producción de anticuerpos específicos de antígeno. En consecuencia, parece que el CD40-L unido a la membrana y el CD40-L oligomérico actúan como agonistas del CD40, mientras que el CD40-L soluble (monomérico) y el CD40 soluble actúan como antagonistas de CD40 mediante el bloqueo de los sitios en el receptor CD40 sin transducir la señal de forma significativa o impidiendo la unión de CD40-L a los sitios de CD40 en las células B y en otras células diana.

Tanto los agonistas de CD40 como las antagonistas de CD40 tendrán una actividad terapéutica útil. Por ejemplo, los agonistas de CD40 (es decir, el CD40L unido a la membrana y el CD40-L oligomérico) son útiles como adyuvantes de vacunas y para estimular la producción de AcMo por parte de las células de hibridoma. Los antagonistas de CD40 (es decir, el receptor de CD40, CD40/Fc y posiblemente el CD40-L monomérico, soluble) son útiles para tratar enfermedades autoinmunitarias que se caracterizan por la presencia de niveles elevados de complejos anticuerpo-antígeno, tales como alergia, lupus, artritis reumatoide, diabetes mellitus insulinodependiente (DMID), enfermedad injerto contra huésped (GVHD) y otras. Por tanto, en otros aspectos, la invención proporciona: el uso de un polipéptido de CD40-L monomérico soluble de la invención en la preparación de un medicamento para tratar alergias, una reacción alérgica, lupus, artritis reumatoide o enfermedad injerto contra huésped; una vacuna que comprende un oligómero del polipéptido de CD40-L de la invención como adyuvante; una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o un oligómero de la invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable; y un procedimiento para estimular células de hibridoma para incrementar la secreción de anticuerpos monoclonales, que comprende administrar a dichas células de hibridoma una cantidad eficaz de un oligómero del polipéptido de CD40-L de la invención.

La secreción de IgE por parte de las células B humanas se puede inducir en presencia de células T (Vercelli y col., J. Exp. Med. 169: 1295, 1989). Además, la producción de IgE se puede inducir a partir de PBM (células mononucleares de sangre periférica) con depleción de células T mediante la adición de un AcMo antiCD40 (Jabara y col., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990 y Zhang y col., J. Immunol. 146: 1836, 1991). Un procedimiento para inhibir la producción de IgE por parte de células B activadas, activada por IL-4 en presencia de células T o por CD40-L (preferentemente, CD40-L unido a la membrana), comprende la administración de una cantidad eficaz de una proteína de fusión CD40/Fc, como se describe en la presente memoria descriptiva, o un CD40 soluble codificado por la secuencia de ADNc descrita en la ID SEC Nº 3. De igual forma, los receptores de CD40 y posiblemente el CD40-L soluble (sólo el monómero) también pueden bloquear la secreción de otros isotipos de anticuerpos.

La presente invención además incluye polipéptidos de CD40-L con o sin una glucosilación de patrón nativo asociada. El CD40-L expresado en sistemas de expresión de levadura o de mamífero (por ejemplo, células COS-7) puede ser similar a significativamente diferente de un polipéptido de CD40-L nativo en cuanto al peso molecular y al patrón de glucosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos de CD40-L en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glucosiladas.

Se pueden preparar constructos de ADN que codifican varias adiciones o sustituciones de residuos o secuencias de aminoácidos, o deleciones de residuos o secuencias terminales o internos que no se necesitan para la actividad biológica o para la unión. Por ejemplo, el sitio de N-glucosilación en el dominio extracelular de CD40-L se puede modificar para impedir la glucosilación mientras se permite la expresión de un análogo hidrato de carbono reducido y homogéneo usando sistemas de expresión en levaduras. Los sitios de N-glucosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro, e Y es Ser o Thr. Las modificaciones adecuadas en la secuencia de nucleótidos que codifica este triplete darán como resultado sustituciones, adiciones o deleciones que impidan la unión de residuos de hidratos de carbono en la cadena latera de la Asn. En otro ejemplo, se pueden alterar secuencias que codifican residuos de Cys para provocar la deleción de los residuos de Cys o su sustitución con otros aminoácidos, lo que impide la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos tras la renaturalización. El CD40-L humano comprende cinco residuos de Cys en su dominio extracelular. Por tanto, al menos uno de los cinco residuos de Cys se puede sustituir con otro aminoácido o delecionar sin que afecte a la estructura terciaria de la proteína o a la formación de puentes disulfuro.

Otros enfoques de la mutagénesis implican la modificación de secuencias que codifican residuos de aminoácidos dibásicos para aumentar la expresión en sistemas en levaduras en los que existe actividad de KEX2 proteasa. Pueden construirse subunidades de un polipéptido de CD40-L mediante la deleción de secuencias que codifican residuos o secuencias terminales o internas.

Los polipéptidos CD40-L son codificados por genes multiexones. La presente invención también incluye constructos de ARNm alternativos que se pueden atribuir a distintos eventos de separación de ARN tras la transcripción y que comparten regiones de identidad o similitud con los ADNc descritos en el presente documento.

Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden una secuencia de ácido nucleico (ARN o ADN) monocatenario capaz de unirse a las secuencias de ARNm (sentido) del CD40-L diana o de ADN (antisentido)del CD40-L. Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden comprender un fragmento de la ID SEC Nº 1 o de la ID SEC Nº 11 o un ADN o un ARN complementario de la ID SEC Nº 1 o de la ID SEC Nº 11. Tal fragmento comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos. Preferentemente, tal fragmento comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para crear un oligonucleótido antisentido o sentido, basado en una secuencia de ADNc para el CD40-L, se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1988 y van der Krol y col., BioTechniques 6: 958, 1988.

La unión de oligonucleótidos antisentido o sentido a secuencias de ácido nucleico diana tiene como resultado la formación de dúplex que bloquean la traducción (ARN) o la transcripción (ADN) a través de uno de varios medios, incluido el aumento de la degradación de los dúplex, la terminación prematura de la transcripción o de la traducción, o por otros medios. Entre los promotores de la polimerasa adecuados se incluyen los promotores para cualquier ARN polimerasa o promotores para cualquier ADN polimerasa. Los oligonucleótidos antisentido o sentido además comprenden oligonucleótidos que tienen estructuras de fosfodiéster-azúcar modificada (u otros enlaces entre azúcares, tales como los descritos en el documento WO91/06629) y en los que tales enlaces entre azúcares son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales nucleótidos con enlaces entre azúcares resistentes son estables in vivo (Es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de la secuencia para poder unirse a las secuencias nucleotídicas diana. Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido incluyen los oligonucleótidos que están unidos covalentemente a restos orgánicos, tales como los descritos en el documento WO 90/10448, y otros restos que aumentan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico diana, tal como poli(L-lisina). Todavía más, a los oligonucleótidos sentido o antisentido pueden unirse agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos, para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o sentido por la secuencia nucleotídica diana. Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante cualquier procedimiento de transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, electroporación u otros vectores de transferencia génica como el virus de Epstein-Barr. Los oligonucleótidos antisentido o sentido se introducen preferentemente en una células que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante inserción del oligonucleótido antisentido o sentido en un vector retroviral adecuado, después la célula se pone en contacto con el vector retrovirus que contiene la secuencia insertada, ya sea in vivo o ex vivo. Entre los vectores retrovirales adecuados se incluyen, pero no se limita a ellos, los retrovirus murinos M-MuLV, N2 (un DCT5B y DCT5C (véase la solicitud PCT US 90/02656). Como alternativa, se pueden usar otras secuencias promotoras para expresar el oligonucleótido.

Los oligonucleótidos sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia nucleotídica diana mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión al ligando, según se describe en el documento WO 91/04753. Entre las moléculas de unión al ligando se incluyen, pero no se limita a ellas, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas u otros ligandos que se unen a los receptores de superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de unión al ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión al ligando para unirse a su correspondiente molécula o receptor o bloquea la entrada de un oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula.

Como alternativa, un oligonucleótido sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, según se describe en el documento WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o antisentido-lípido preferentemente se disocia en el interior de la células por acción de una lipasa endógena.

La secuencia del ADNc del CD40-L murino se obtuvo mediante técnicas de expresión directa. La secuencia del CD40-L humano se obtuvo mediante técnicas de hibridación de especies cruzadas usando el ADNc del CD40-L murino como sonda.

Nosotros hemos clonado el CD40-L murino mediante la obtención en primer lugar de un clon de la región extracelular del CD40 humano (el receptor) por técnicas de la reacción en cadena la de polimerasa (PCR) usando cebadores basados en una secuencia publicada en Stamenkovic y col. (ID SEC Nº 4). Un cebador oligonucleotídico en 5',5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (ID SEC Nº 5) introduce un sitio Sal I en dirección 5' de un iniciador metionina de CD40 y un cebador oligonucleotídico en 3' CCGTCGACGTCTAGAGCCGATCCTGGGG-3' (ID SEC Nº 6) inserta un codón de terminación tras el aminoácido 192 de CD40, seguido por sitios Xba 1 y Sal 1. El ADNc amplificado se digirió con Sal I y se clonó en pDC406 (McMahan y col., EMBO J. 10: 2821, 1991) para construir pDC406/s CD40.

Un segundo fragmento del receptor CD40 (ID SEC Nº 4) se obtuvo mediante técnicas de PCR para la fusión con el dominio Fc de IgG1 humana (ID SEC Nº 3). Brevemente, el cebador oligonucleotídico en 5' (ID SEC Nº 5) y el molde de fusión (ID SEC Nº 4) fueron los mismos que anteriormente. El cebador oligonucleotídico en 3' fue 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (ID SEC Nº 7) que inserta los aminoácidos Tyr Val Glu Pro Arg (ID SEC Nº 8) tras el aminoácido 193 del CD40. Glu y Pro son los primeros dos aminoácidos de una región bisagra de la IgG1 humana y están seguidos por un sitio de restricción Bgl II. El sitio de restricción Bgl II se usó para fusionar el dominio extracelular del CD40 al resto de la región Fc de la IgG1.

Otras proteínas de fusión que comprenden dominios de unión al ligando de otros receptores se pueden preparar mediante la obtención de una secuencia de ADN para el dominio de unión al ligando de un receptor y fusionar esta secuencia a una secuencia de ADN que codifica una región Fc de una molécula anticuerpo que se une a la proteína A o a la proteína G, u otro polipéptido que es capaz de purificación por afinidad, por ejemplo, avidina o estreptavidina. El constructo génico resultante se puede introducir en células de mamífero para expresar transitoriamente una proteína de fusión. Las proteínas de fusión receptor/Fc se pueden purificar mediante purificación por afinidad de la proteína A o la proteína G. Las proteínas de fusión receptor/avidina se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad por biotina. Después se puede eliminar se la columna la proteína de fusión mediante la elución con una solución rica en sales u otro tampón adecuado.

Nosotros obtuvimos un ADNc que codificaba la región Fc de la IgG1 humana mediante amplificación por PCR usando ADNc de células humanas como molde y un cebador oligonucleotídico en 5' 5'-TATTAATCATTCAGAGGGC
CCAGATCTTGTGACAAAACTCAC-3' (ID SEC Nº 9) y un cebador oligonucleotídico en 3' 5'-GCCAGCTTAAC
TAGTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA-3'' (ID SEC Nº 10). El ADNc amplificado por PCR introdujo un sitio Bgl II cerca del inicio de la región HINGE, que se usó para ligar el dominio extracelular de CD40 para construir un ADNc de fusión CD40/Fc, que se ligó en pDC406 para construir pDC406/CD40/Fc. Otras regiones Fc adecuadas se definen como cualquier región que se pueda unir con una afinidad elevada a la proteína A o a la proteína G e incluye la región Fc de la IgG1 humana o la IgG1 murina. Un ejemplo es la región Fc de la IgG1 humana que se muestra en la ID SEC Nº 3 o el ADNc obtenido mediante PCR de los cebadores oligonucleotídicos de la ID SEC Nº 9 y la ID SEC Nº 10 con ADNc humano como molde.

Preferentemente, las moléculas de fusión receptor/Fc se sintetizan en cultivos de células de mamífero recombinantes porque generalmente son demasiado grandes y complejas para sintetizarse a través de procedimientos de expresión procarióticos. Ejemplos de células de mamífero adecuadas para expresar una proteína de fusión receptor/Fc incluyen células CV-1 (ATCC CCL 70) y células COS-7 (ATCC CRL 1651), ambas derivadas de riñón de
mono.

El constructo de ADN pDC406/CD40/Fc se sometió a transfección en la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). El plásmido pDC406 incluye secuencias reguladoras derivadas de SV40, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus de Epstein-Barr (EBV). La línea celular CV-1/EBNA se derivó de la transfección de la línea células CV-1 con un gen que codifica el antígeno 1 nuclear del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) y que expresa de forma constitutiva EBNA-1 impulsado por el promotor/intensificador inmediato-temprano de CMV humano. Un gen EBNA-1 permite la replicación episomal de los vectores de expresión tales como pDC406, que contienen el origen de replicación del EBV.

Los transfectantes que expresan la proteína de fusión CD40/Fc se identifican, inicialmente, usando transferencia de puntos/gotas o transferencias de tipo Western. Después, los sobrenadantes se someten a transferencia de puntos o a electroforesis en gel seguido por transferencia de las proteínas sometidas a la electroforesis para la unión al AcMo G-28-5 (un anticuerpo que se une al receptor de CD40 humano). Las proteínas transferidas se incubaron a continuación con la proteína A marcada radioactivamente con ^{125}I, se lavaron para eliminar el marcador sin unir y se analizaron para detectar la expresión de Fc. El anticuerpo monoclonal G28-5 se produjo según Clark y col., supra.

Una vez que se hubieron identificado las células que expresaban el constructo de fusión, se indujo el crecimiento a gran escala de cultivos de células que se habían sometido a transfección, para acumular sobrenadante de las células que expresaban CD40/Fc. La proteína de fusión CD40/Fc en el líquido sobrenadante se purificó mediante purificación por afinidad. Brevemente, se purificó un litro de sobrenadante del cultivo que contenía la proteína de fusión CD40/Fc mediante filtración de los sobrenadantes de células de mamífero (por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y la aplicación del filtrado a una columna de afinidad por anticuerpo frente a las proteínas A/G (Schleicher y Schuell, Keene, NH) a 4ºC a un caudal de 80 ml/h para una columna de 1,5 cm x 12,0 cm. La columna se lavó con NaCl 0,5M en PBS hasta que no se pudo detectar proteína libre en el tampón de lavado. Por último, la columna se lavó con PBS. La proteína de fusión unida se eluyó de la columna con tampón citrato 25 mM, pH 2,8, y se llevó hasta un pH 7 con tampón Hepes 500 mM, pH 9,1. Los geles SDS marcados con plata de la proteína de fusión CD40/Fc mostraron que tenía una pureza > 98%.

El CD40 soluble (sCD40) y las proteínas de fusión CD40/Fc se prepararon como se describe en la presente memoria descriptiva. Los sobrenadantes se purificaron con una columna de afinidad por G28-5 (AcMo antiCD40) para purificar por afinidad el sCD40 expresado por las células sometidas a transfección CV-1/EBNA. Se agruparon las fracciones que contenían la proteína y se extrajeron alícuotas para realizar ensayos y análisis de unión a G28-5 mediante SDS-PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida dodecilsulfato sódico) en presencia de ditiotreitol 1 mM como agente reductor. Se observó una única banda de un peso molecular de 28.100 daltons. En ausencia de agente reductor, el análisis por SDS-Page del sCD40 reveló dos bandas, una banda principal de peso molecular 56.000 y una banda menor de peso molecular 28.000. El patrón de bandas indica que la mayoría del sCD40 existe en forma de homodímero en solución unido por puentes disulfuro. La banda de 28.000 es monómero libre.

Las proteínas CD40 se visualizaron mediante tinción de plata. Las concentraciones de proteína en la muestra se determinaron usando un ensayo micro-BCA (Pierce) con seroalbúmina bovina ultrapura como referencia. La pureza del CD40 soluble y la concentración proteica se confirmaron mediante análisis de aminoácidos. El CD40 soluble purificado se absorbió a papel de PVDF y el papel se sometió a degradación de Edman automática en un secuenciador de proteínas modelo 477A de Applied Biosystems siguiendo las instrucciones del fabricante para secuenciar el extremo N de la proteína. Este procedimiento comprobó la secuencia proteica del sCD40.

El CD40 soluble y la proteína de fusión CD40/Fc pudieron modular las respuestas de las células B humanas en ausencia de AcMo antiCD40 (G28-5). Las células B purificadas procedentes de amígdalas se cultivaron con antiIgM e IL-4 humana y se añadió sCD40 o proteína de fusión CD40/Fc. Ninguna de las formas de CD40 tuvo un efecto inhibidor sobre la proliferación de células B (medido mediante la incorporación de timidina tritiada). Por el contrario, el receptor de IL-4 inhibió la proliferación de células B inducida por IL-4 de forma dependiente de concentra-
ción.

El CD40 soluble y la CD40/Fc se probaron para determinar su capacidad para inhibir la secreción de IgE inducida por IL-4 en un sistema CML (cultivo mixto de linfocitos) de 2-donantes. En tres experimentos, el nivel de producción de IgE se redujo a medida que se aumentó la concentración de CD40. El CD40 soluble, añadido a una concentración de 10 \mug/ml, fue capaz de inhibir por completo la secreción de IgE en este modelo de alergia. Además, la CD40/Fc tuvo efectos similares que su homónimo soluble. Sin embargo, la adición de una proteína de fusión receptor de IL-7-Fc (preparada mediante procedimientos similares con una secuencia de receptor de IL-7 publicada) no afectó a la secreción de IgE en este modelo.

Los niveles de CD23 también se midieron en el mismo CML en respuesta a sCD40 o a las proteínas de fusión CD40/Fc. El CD40 soluble produjo una pequeña, pero reproducible disminución del nivel de sCD23 al sexto día en comparación con los cultivos estimulados con IL-4 sola, sin embargo, en los mismos cultivos se produjo un efecto inhibidor más fuerte el día 12. La inducción de CD23 soluble por células E^{-}PBM (macrófagos de sangre periférica) con depleción de células T estimuladas por IL-4 se vio afectada de forma similar por la adición de sCD40, lo que causó una pequeña disminución de los niveles de sCD23 el sexto día y una inhibición más pronunciada el día 12. En cada sistema de cultivo, los resultados con la proteína de fusión CD40/Fc fueron sustancialmente los mismos que los observados con sCD40.

En un esfuerzo por aislar un ADNc para un CD40-L, la proteína CD40/Fc purificada se marcó radiactivamente con ^{125}I usando un agente de fase sólida comercialmente disponible (IODO-GEN, Pierce). En este procedimiento, se sembraron 5 \mug de IODO-GEN en el fondo de un tubo de vidrio de 10 x 75 mm y se incubaron durante veinte minutos a 4ºC con 75 \mul de fosfato sódico 0,1M, pH 7,4 y 20 \mul (2 mCi) de Na^{125}I. A continuación se transfirió la solución a un segundo tubo de vidrio que contenía 5\mug de CD40/Fc en 45 \mul de PBS (suero salino tamponado con fosfato) y esta mezcla de reacción se incubó durante veinte minutos a 4ºC. LA mezcla de reacción se fraccionó mediante filtración en gel en un volumen de lecho de Sephadex® G-25 (Sigma) de 2 ml y después se equilibró en medio RPMI 1640 que contenía 2,5% (v/v) de seroalbúmina bovina (BSA), 0,2% (v/v) de azida sódica y HEPES 20 mM, medio de unión a pH 7,4. La acumulación final de CD40^{125}I/Fc se diluyó hasta obtener una solución SOTCK de trabajo de 1 x 10^{-7}M en medio de unión y se almacenó durante hasta un mes a 4ºC sin que se observara ninguna pérdida detectable de la actividad de unión del receptor.

Se preparó una genoteca de ADNc a partir de la línea celular EL4 seleccionada mediante FACS (separación de células activada por fluorescencia) sobre la base de la unión de una proteína de fusión CD40/Fc biotinilada. Las células se separaron cinco veces hasta que se produjo un desplazamiento significativo de la intensidad de la fluorescencia basado en la expresión de un ligando para CD40 por las células EL-4 seleccionadas Las células separadas cinco veces se denominaron células EL-40.5 y estas células se cultivaron con los propósitos de crear una genoteca de ADNc a partir del ARNm de EL-40.5 Brevemente, el ADNc se sintetizó, se insertó en un vector pCD406 vacío y se transformó en E. coli. Los transformantes se agruparon y el ADN de las acumulaciones se aisló y se transfirió mediante transfección a células CV1-EBNA para crear una biblioteca de clonación de expresión. Las células CV-1-EBNA transfeccionadas se cultivaron en placas durante tres días para permitir la expresión transitoria del CD40-L. Las placas que contenían las células transfeccionadas se incubaron a continuación con CD40/Fc radioyodinada, se lavaron para eliminar la CD40/Fc sin unir y se fijaron con glutaraldehído. Las placas fijadas se sumergieron en una emulsión fotográfica líquida y se expusieron en oscuridad. Después de revelar las placas, se analizaron de forma individual con un microscopio y las células que expresaban CD40-L se identificaron por la presencia en la autorradiografía de granos de plata contra un entorno claro.

La biblioteca de clonación de expresión de células EL-40.5 se sometieron a detección selectiva y un grupo, que contenía aproximadamente 2000 clones individuales, se identificó como positivo para la unión de la proteína de fusión CD40/Fc marcada con ^{125}I. Este grupo de dividió en grupos más pequeños de aproximadamente 200 colonias. Los grupos más pequeños se sometieron a detección selectiva como se ha descrito anteriormente. Uno de los grupos pequeños fue positivo para el CD40-L.

Un único clon se aisló y se secuenció mediante técnicas estándar, para proporcionar la secuencia de ADNc y se dedujo la secuencia de aminoácidos del CD40-L murino como se muestra en la figura 1 y la ID SEC Nº 1.

El ADNc del CD40-L homólogo humano se descubrió mediante técnicas de hibridación con especies cruzadas. Brevemente, se preparó una genoteca de ADNc de linfocitos de sangre periférica (PBL) humanos a partir de linfocitos de sangre periférica tratados con el anticuerpo OKT3 (ATCC, Rockville MD), que se une al CD3 (10 ng/ml) y a la interleuquina-2 (IL.2, 10 ng/ml), durante seis días. Se lavaron las células PBL y después se estimularon durante 4horas con 10 ng/ml de PMA (acetato de miristato de forbol, Sigma St Louis) y 500 ng/ml de ionomicina (Calbiochem). El ARN mensajero se aisló a partir de células PBL, se formó ADNc y el ADNc se ligó en ligadores de Eco R1. El ADNc ligado de insertó en el sitio Eco R1 del vehículo de clonación fago \lambdagt10 (Gigapak® Stratagen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. El fago se amplificó, se sembró a densidades de aproximadamente 20.000 fagos por 15 cm de placa y se realizaron los ensayos del fago, como se describe en Maniatis y col., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, páginas 316-328. Se construyó una sonda murina correspondiente a la región codificadora del CD40-L murino desde el nucleótido 13 al nucleótido 793 de la ID SEC Nº 1 y la figura 1. Esta sonda hibridó con los ensayos del fago de la biblioteca de PBL en condiciones de moderada a intensamente rigurosas. Brevemente, las condiciones de hibridación fueron 6 x SSC, 1 x solución de Denhardt, EDTA 2 mM, 0,5% de Np40 (detergente Nonidet P-40) a 63ºC durante la noche. Este se siguió de lavado en 3 x SSC, 0,1% de SDS durante tres horas a 55ºC, seguido por exposición durante la noche a película de rayos X. Las placas positivas se identificaron con una frecuencia de aproximadamente 1 por 1000 placas. Las placas positivas se purificaron dos veces y se preparó ADNc a partir de cultivos amplificados.

Se pueden usar las secuencias del ADNc del CD40-L murino o humano descritas en la presente memoria descriptiva para obtener ADNc que codifican otros homólogos mamíferos de CD40-L murino o humano mediante técnicas de hibridación con especies cruzadas. Brevemente, a partir de la secuencia de nucleótidos de la región extracelular del CD40-L murino según se describe el la figura 1 (ID SEC Nº 1) o del CD40-L humano según se describe en la figura 2 (ID SEC Nº 11) se crea una sonda oligonucleotídica. Esta sonda se puede preparar mediante técnicas estándar, tales como las descritas en Maniatis y col., supra. La sonda murina o humana se usa para seleccionar una genoteca de ADNc de mamíferos o una biblioteca genómica en condiciones de rigurosidad moderada. Entre los ejemplos de ADNc de mamífero o de bibliotecas genómicas se incluyen, para ADNc, una biblioteca formada por linfocitos de sangre periférica de mamífero. Como alternativa, varias genotecas de ADNc o de ARNm aislados de varias líneas celulares se pueden seleccionar mediante hibridación Northern para determinar una fuente adecuada de ADN o ARNm de CD40-L de mamífero.

Los vectores de expresión recombinante para la expresión de CD40-L mediante técnicas de ADN recombinante incluyen una secuencia de ADN de CD40-L que comprende un fragmento de ADN sintético o derivado de ADNc que codifica un polipéptido de CD40-L, operablemente unido a una secuencia nucleotídica adecuada reguladora de la transcripción o de la traducción, tal como una derivada de un gen de mamífero, de bacteria, de virus o de insecto. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen secuencias que tienen un papel regulador en la expresión génica (por ejemplo, un promotor o un intensificador de la transcripción), opcionalmente una secuencia operador para controlar la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión al ARNm ribosómico y secuencias adecuadas que controlan la iniciación y la terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias nucleotídicas se unen operablemente cuando la secuencia reguladora está funcionalmente relacionada con la secuencia de ADN del CD40-L. Por tanto, una secuencia nucleotídica promotor se une operablemente a la secuencia de ADN del CD40-L si la secuencia nucleotídica promotor controla la transcripción de la secuencia de ADN del CD40-L. Todavía más, un sitio de unión al ribosoma puede estar operablemente unido a una secuencia para un polipéptido de CD40-L si el sitio de unión al ribosoma está colocado en el interior del vector para estimular la traducción. Además, las secuencias que codifican los péptidos señalizadores se pueden incorporar en vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de ADN para un péptido señalizador (líder secretor) puede estar operablemente unida a una secuencia de ADN del CD40-L. El péptido señalizador se expresa como una secuencia de aminoácidos precursora, que permite mejorar la secreción extracelular del polipéptido de fusión traducido por una célula huésped de levadura.

Entre las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos de CD40-L se incluyen células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Entre las procariotas se incluyen microorganismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células huésped procarióticas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias otras especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Las células eucarióticas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero. También se podrían usar sistemas de traducción acelulares para producir polipéptidos de CD40-L usando ARN derivados de constructos de ADN descritos en la presente memoria descriptiva. Los vectores de clonación y expresión adecuados para usar con huésped de células bacterianas, fúngicas, de levaduras y de mamífero se describen, por ejemplo, en Pouwels y col. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985).

En una célula huésped procariota, tal como E. coli, un polipéptido de CD40-L o un análogo puede incluir un residuo de metionina en el extremo N para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la células huésped procariota. LA Met del extremo N puede escindirse del polipéptido de CD40-L recombinante expresado. Las células huésped procariotas pueden usarse para la expresión de polipéptidos de CD40-L que no requieren un procesamiento extenso proteolítico o por disulfuro.

Los vectores de expresión que portan la secuencia de ADN de CD40-L se traspasan mediante transfección o se transforman en un cultivo sustancialmente homogéneo de un microorganismo huésped adecuado o de una línea de células de mamífero. Las células huésped transformadas son células que se han transformado o transfeccionado con secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos de CD40-L y que expresan polipéptidos de CD40-L. Los polipéptidos de CD40-L expresados se localizarán en la célula huésped y/o se secretarán al fluido sobrenadante del cultivo, dependiendo de la naturaleza de la célula huésped y del constructo génico insertado en la célula huésped.

Los vectores de expresión que se han transfeccionado en células huésped procariotas generalmente comprenden uno o más marcadores fenotípicos seleccionables. Un marcador fenotípico seleccionable es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a un antibiótico o que suministra un requerimiento autótrofo, y un origen de replicación reconocido por el huésped para garantizar la amplificación en el huésped. Otros vectores de expresión útiles para las células huésped procariotas incluyen un marcador seleccionable de origen bacteriano derivado de plásmidos comercialmente disponibles. Este marcador seleccionable puede comprender elementos genéticos del vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). ElpBR322 contiene genes de resistencia a ampicilina y a tetraciclina y, por tanto, proporciona medios simples para identificar las células transformadas. Las secciones "estructurales" del pBR322 se combinan con un promotor adecuado y una secuencia de ADN del CD40-L. Entre otros vectores comerciales se incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.).

Las secuencias promotor se usan habitualmente para los vectores de expresión recombinante de la célula huésped procariota. Entre las secuencias promotorhabituales se incluyen la \beta-lactamasa (penicilinasa), el sistema del promotor lactosa (Chang y col., Nature 275: 615, 1978; y Goeddel y col., Nature 281: 544, 1979), el sistema del promotor triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 19080 y el documento EP-A-36776) y el sistema del promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión de células huésped procariotas particularmente útil usa un promotor P_{L}del fago \gamma y una secuencia represora termolábil cI857ts. Entre los vectores plasmídicos disponibles en la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor P_{L} \gamma se incluyen el plásmido pHUB2 (residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092) y el pPLc28 (residente en E. coli RR1 (ATCC 53082)).

El CD40L se puede expresar en las células huésped de levadura, preferentemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También se pueden usar otros géneros de levadura, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levadura a menudo contendrán una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura de 2 \mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotor, secuencias para la poliadenilación y secuencias para la terminación del la transcripción. Preferentemente, los vectores de levadura incluyen una secuencia de un origen de replicación y un marcador seleccionable. Entre las secuencias promotor adecuados para los vectores de levadura se incluyen promotores de metalotioneína, la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255: 1073, 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland y col., Biochem. 17: 4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para usar en la expresión en levaduras se describen en Hitzeman , EPA-73.657.

Se pueden simular vectores de levaduras usando, por ejemplo secuencias de ADN de pBR322 para su selección y replicación en E. coli (gen Amp y origen de replicación). Otras secuencias de ADN de levadura que se pueden incluir en un constructo de expresión en levaduras incluyen un promotor ADH2 reprimible con glucosa y un líder de secreción de factor \alpha. Russell y col. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier y col. (Nature 300: 724, 1982) han descrito el promotor ADH2. La secuencia líder del factor \alpha de levadura dirige la secreción de polipéptidos heterólogos. A menudo, la secuencia líder del factor \alpha se inserta entre la secuencia promotor y la secuencia de genes estructurales. Véase, por ejemplo, Kurjan y col., Cell 30: 933, 1982 y Bitter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de huéspedes levadura son conocidas para aquellos expertos en la técnica. Una secuencia líder se puede modificar cerca de su extremo 3' para que contenga uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder con el gen estructural.

Los expertos en la técnica conocen los protocolos de transformación en levaduras. Uno de estos protocolos lo describen Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978. El protocolo de Hinnen y col. selecciona transformantes Trp+ en un medio selectivo, en el que el medio selectivo consiste en 0,67% de base nitrogenada de levadura, 0,5% de ácidos de casamino, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Se puede estimular el crecimiento de las células huésped de levadura transformadas con vectores que contienen la secuencia promotor ADH2 para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno compuesto por un 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa complementada con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. Cuando se agota la glucosa del medio se produce la depresión del promotor ADH2.

Los sistemas de cultivo de células huésped de mamífero o de insecto también podrían usarse para expresar polipéptidos de CD40-L recombinantes. Entre los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas se incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y col., Cell 23: 175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10). Entre los vectores de expresión de mamíferos adecuados se incluyen elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, una secuencia promotor, un intensificador unido al gen estructural, otras secuencias no transcritas adyacentes a 5' o a 3', tales como sitios de unión al ribosoma, un sitio de poliadenilación, sitios receptores o aceptores de empalme y secuencias de terminación de la transcripción.

Las secuencias de control de la transcripción y de la traducción para los vectores de expresión de células huésped de mamífero se pueden escindir de genomas virales. Por ejemplo, las secuencias promotor e intensificadoras de células de mamífero usadas de forma habitual derivan del virus del polioma, del adenovirus 2, del virus 40 de simio (SV40) y del citomegalovirus humano. Se pueden usar secuencias de ADN derivadas del genoma del virus SV40, por ejemplo, el origen SV40, los promotores temprano y tardío, los intensificadores, SPLICE y los sitios de poliadenilación, para proporcionar los otros elementos genéticos requeridos para la expresión de una secuencia de genes estructurales en una célula huésped de mamífero. Los promotores virales tempranos y tardíos son particularmente útiles porque ambos se pueden obtener con facilidad de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen de replicación viral (Fiers y col., Nature 273: 113, 1978). También se pueden usar fragmentos del SV40 más pequeños o más grandes, siempre que esté incluida la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizados en el origen del virus SV40 del sitio de replicación.

Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos se pueden construir como describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983). Un vector de expresión superior útil, el PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y col., Nature 312: 768, 1984, se ha depositado como ATCC 39890. En el documento EP-A-0367566 y en la solicitud de patente de EE.UU. con nº de serie 07/701.415 presentada el 16 de mayo de 1991, incorporada en la presente memoria descriptiva, se describen otros vectores de expresión de mamíferos útiles. Para la expresión de una región extracelular proteica de tipo II, tal como CD40-L, debería añadirse una secuencia señalizadora heteróloga como la secuencia señalizadora para la interleuquina-7 (IL-7) descrita en la patente de EE.UU. 4.965.195, o la secuencia señalizadora para el receptor de la interleuquina-2 descrita en la solicitud de patente de EE.UU. 06/6262.667 presentada el 2 de julio de 1984.

El CD40-L humano o murino se puede preparar en forma unida a la membrana cuando se incluyen las regiones intracelular y transmembrana o en forma soluble con sólo el dominio extracelular. Nosotros hemos inducido la expresión del CD40-L murino de longitud completa en células de mamífero, para proporcionar células que expresen el CD40-L murino unido a la membrana. Células CV1 se sometieron a transfección con el vector HAVEO vacío usando técnicas descritas en el Ejemplo 6 de la presente memoria descriptiva. Estas células se usaron como fuente de CD40-L murino unido a la membrana para la serie de experimentos comunicados en los Ejemplos 10-13 que se comentan más adelante.

Purificación de polipéptidos de CD40-L recombinantes

Se pueden preparar polipéptidos de CD40-L mediante el cultivo de células huésped transformadas en condiciones de cultivo necesarias para expresar polipéptidos de CD40-L. Los polipéptidos resultantes expresados pueden, a continuación, purificarse de los medios de cultivo o de los extractos celulares. Si se desea, se puede concentrar un polipéptido de CD40-L usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Como alternativa se puede usar una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato con grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos habitualmente usados en la purificación de proteínas. Entre los intercambiadores catiónicos adecuados se incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo.

Por último se pueden usar una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) empleando medios RP-HPLC hidrófobos (por ejemplo, gel de sílice con grupos metilo u otros alifáticos pendientes), para purificar el CD40-L. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones, también se pueden usar para proporcionar una proteína recombinante sustancialmente homogénea.

También es posible usar una columna de afinidad que comprenda un dominio de unión al ligando de CD40 para purificar por afinidad los polipéptidos de CD40-L expresados. Los polipéptidos de CD40-L se pueden extraer de una columna de afinidad en tampón de elución rico en sal y después se pueden dializar en un tampón bajo en sal para su uso.

Normalmente, la proteína recombinante producida en un cultivo bacteriano se aísla mediante la rotura de las células huésped, centrifugación, extracción de los sedimentos/precipitados celulares si el polipéptido es insoluble, o del fluido sobrenadante si el polipéptido es soluble, seguido por más etapas de concentración, desalación, intercambio iónico, purificación por afinidad o exclusión por amaño. Finalmente, se puede usar una RP-HPLC para las etapas finales de purificación. Las células microbianas se pueden romper mediante cualquier procedimiento conveniente, incluidos ciclos de congelación-descongelación, exposición a ultrasonidos, rotura mecánica o uso de agentes de lisis
celular.

Preferentemente, las células huésped de levadura transformadas se usan para expresar CD40-L como un polipéptido secretado. Esto simplifica la purificación. El polipéptido recombinante secretado procedente de la fermentación de una célula huésped de levadura se puede purificar mediante procedimientos análogos a los descritos por Urdal y col. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Urdal y col. describen dos etapas secuenciales de RP-HPLC para la purificación de IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC preparativa.

Administración de composiciones de CD40-L

La presente invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad eficaz de CD40-L en un vehículo o diluyente adecuado. Para uso terapéutico, el CD40-L purificado o un análogo del mismo biológicamente activo se administra a un paciente, preferentemente un ser humano, para el tratamiento de forma adecuada para la indicación. Por tanto, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas e CD40-L (por ejemplo, en forma de un dominio extracelular soluble o de un fragmento del mismo), que se administran para conseguir un efecto terapéutico deseado, se pueden administrar mediante inyección en bolo, infusión continua, liberación mantenida a partir de implantes u otra técnica adecuada. Típicamente, un agente terapéutico de CD40-L se administrará en forma de una composición farmacéutica que comprenda polipéptido de CD40-L purificado junto con vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Tales vehículos serán inocuos para los pacientes a las dosis y concentraciones usadas. Por lo general, la preparación de tales composiciones conlleva combinar un polipéptido de CD40-L con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono incluidas glucosa, sacarosa o dextranos, agentes quelantes tales como EDTA, glutation y otros estabilizantes y excipientes. Ejemplos de diluyentes adecuados son suero salino tamponado neutro o suero salino mezclado con seroalbúmina coespecífica. Los oligonucleótidos de CD40-L sentido o antisentido pueden administrase in vivo mediante la administración de una cantidad eficaz de un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un oligonucleótido eficaz antisentido o sentido. Además, los oligonucleótidos de CD40-L sentido o antisentido pueden administrarse ex vivo extrayendo de un individuo las células que contienen ADN o ARNm de CD40-L, incorporando en las células un oligonucleótido antisentido o sentido usando técnicas de transferencia génica y reinfundiendo las células en el individuo.

Con los siguientes ejemplos se pretende ilustrar formas de realización particulares y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplo I

Este ejemplo describe la construcción de un constructo de ADN de CD40/Fc para expresar una proteína de fusión CD40 soluble/Fc para usar en la detección de clones de ADNc que codifican un ligando de CD40. La secuencia de ADNc de la región extracelular o el dominio de unión al ligando de la secuencia del receptor humano CD40 completo se obtuvo usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se basa en la secuencia publicada en Stamenkovic y col., supra. Como molde para la amplificación por PCR se usó un plásmido de CD40 (CDM8). El CDM8 se describe en Stamenkovic y col. y se obtuvo de los autores. Se empleó una técnica de PCR (Sarki y col., Science 239: 487, 1988) usando cebadores oligonucleotídicos en 5' y en 3' para amplificar las secuencias de ADN que codifican el dominio extracelular de unión al ligando de CD40. El cebador oligonucleotídico en 5', 5'-CCGTC
GACCACCATGGTTCGTCTCGCC-3' (ID SEC Nº 5) introduce un sitio Sal I en 5' de un iniciador de metionina de CD40 y un cebador oligonucleotídico en 3', 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (ID SEC Nº 7) que inserta aminoácidos Tyr Val Glu Pro Arg (ID SEC Nº 8) tras el aminoácido 193 de CD40. Glu y Pro son los primeros aminoácidos de una región bisagra de la IgG1 humana y están seguidos por un sitio de restricción Bgl II que se usó para fusionar el dominio extracelular de CD40 al resto de la región Fc de la IgG1 humana.

El constructo de ADN pDC406/CD40/Fc se transfirió mediante transfección a la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). El plásmido pDC406 incluye secuencias reguladoras derivadas del SV40, del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y del virus de Epstein-Barr (EBV). La línea celular CV-1/EBNA se derivó mediante transfección de la línea celular CV-1 con un gen que codifica el antígeno-1 nuclear del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) que expresa de forma constitutiva EBNA-1 impulsado por el promotor/intensificador intermedio-precoz de CMV humano. El gen EBNA-1 permite la replicación episomal de los vectores de expresión, tales como pDC406, que contienen el origen de replicación del EBV.

Una vez que se identificaron las células que expresaban el constructo de fusión, se indujo el crecimiento en cultivos a gran escala de células sometidas a transfección para producir la acumulación de sobrenadantes de las células que expresan CD40/Fc. La proteína de fusión CD40/Fc en el fluido sobrenadante se purificó mediante purificación por afinidad. Brevemente, un litro de sobrenadante del cultivo que contenía la proteína de fusión CD40/Fc se purificó mediante filtración de los sobrenadantes de las células de mamífero (por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y aplicando el filtrado a una columna de afinidad por anticuerpo de la proteína A/G (Schleicher y Schuell, Keene, NH) a 4ºC a un caudal de 80 ml/h para una columna de 1,5 cm x 12,0 cm. La columna se lavó con NaCl 0,5M en PBS (suero salina tamponado con fosfato) hasta que no se pudo detectar proteína en el tampón de lavado. Por último, la columna se lavó con PBS. La proteína de fusión unida eluyó de la columna con tampón citrato 25 mM, pH 2,8 y se llevó a un pH 7 con tampón Hepes 500 mM, pH 9,1. Los geles SDS marcados con plata de la proteína de fusión CD40/Fc eluida mostraron que era de una pureza >98%.

La proteína de fusión CD40/Fc purificada se trató con yodo ^{125}I usando un agente de fase sólida comercialmente disponible (YODO-GEN, Pierce). En este procedimiento, se sembraron 5 \mug de YODO-GEN en el fondo de un tubo de vidrio de 10 x 75 mm y se incubó durante veinte minutos a 4ºC con 75 \mul de fosfato sódico 0,1M, pH 7,4 y
20 \mul (2 mCi) de Na^{125}I. Después, la solución se transfirió a un segundo tubo de vidrio que contenía 5 \mug de CD40/Fc en 45 \mul de PBS y esta mezcla de reacción se incubó durante veinte minutos a 4ºC. La mezcla de reacción se repartió mediante filtración en gel en un lecho de 2 ml de volumen de Sephadex® G-25 (Sigma) y después se equilibró en medio RPMI 1640 que contenía 2,5% (v/v) de seroalbúmina bovina (BSA), 0,2% (v/v) de azida sódica y Hepes 20 mM, medio de unión a pH 7,4. El grupo final de CD40/Fc ^{125}I se diluyó hasta obtener una solución madre de trabajo de 1 x 10^{-7}M en medio de unión y se almacenó durante hasta un mes a 4ºC sin que se produjera pérdida detectable de la actividad de unión al receptor.

Se observó una incorporación del marcador de aproximadamente el 50%-60%. El marcaje radioactivo con yodo proporcionó actividades específicas en el intervalo de 1 x 10^{15} a 5 x 10^{15} cpm/nmol (0,42-2,0 átomos de yodo radioactivo por molécula de proteína). La electroforesis en geles de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) reveló un único polipéptido marcado consistente con los valores esperados. Más de un 98% de la proteína de fusión marcada era precipitable en ácido tricloroacético (TCA), lo que indica que el ^{125}I estaba unido covalentemente a la proteína.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la selección de una línea celular que expresa de forma putativa CD40-L. Se seleccionaron varias líneas celulares usando la proteína de fusión CD40/Fc marcada con yodo radioactivo descrita en el Ejemplo 1. Brevemente, se llevaron a cabo estudios de unión cuantitativa según la metodología estándar y se derivaron gráficos de Scatchard para las diversas líneas celulares. Se identificó y se seleccionó una línea celular clonal (EL4, ATCC Catálogo TIP 39), una línea celular de timoma murino. Antes de la selección, se descubrió que las células EL-4 expresaban aproximadamente 450 moléculas de CD40-L por célula. Las séptimas células seleccionadas se denominaron EL-40.7 y se indujo su crecimiento, y se descubrió que expresaban aproximadamente 10.000 moléculas de CD40-L por célula. Por último, las novenas células seleccionadas se denominaron EL-40.9 y se indujo su crecimiento, y se descubrió que expresaban aproximadamente 15.000 moléculas de CD40-L por célula.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe la preparación de una genoteca de ADNc para la clonación por expresión de CD40-L murino. La genoteca se preparó a partir de un quinto clon seleccionado de una línea celular EL-4 de timoma de ratón (ATCC TIB 39), denominado EL-40.5. Las células EL-40.5 eran células EL-4 separadas cinco veces con proteína de fusión CD40/Fc biotinilada en un FACS (separador de células activado por fluorescencia). Se preparó una genoteca de ADNc a partir de ARN obtenido de células EL-40.5, esencialmente como se describe en la patente de EE.UU. 4,968.607, cuya descripción se incorpora en la presente memoria descriptiva como referencia. Brevemente, se construyó una genoteca de ADNc mediante transcripción inversa de ARNm poli(A)^{+} aislado del ARN total extraído de la línea celular EL-40.5. La técnica de construcción de genotecas fue sustancialmente similar a la descrita por Ausuble y col., eds. Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1 (1987). El ARNm poli(A)^{+} se aisló mediante cromatografía en oligodT celulosa y se preparó ADNC bicatenario sustancialmente como describen Gubler y col. Gene 25: 263, 1983. Los fragmentos de ARNm poli(A)^{+} se convirtieron en híbridos ARN-ADNc mediante la transcriptasa inversa usando hexanucleótidos aleatorios como cebadores. Después, los híbridos ARN-ADNc se convirtieron en fragmentos de ADNc bicatenario usando ARNasa H combinada con la ADN polimerasa I. Los extremos del ADNc bicatenario resultante se convirtieron en romos con la ADN polimerasa T4.

Los adaptadores Sal I

5'-TCG ACT GGA ACG AGA CGA CCT GCT-3' {}\hskip1.2cm GA CCT TGC TCT GCT GGA CGA- 5'

se ligaron a los extremos 5' del ADNc con extremos romos resultante, como se describe en Haymerle y col., Nucleic Acids Res. 14: 8615, 1986. Los adaptadores no ligados se eliminaron mediante cromatografía de filtración en gel a 68ºC. Esto dejó prolongaciones no autocomplementarios de 24 nucleótidos en el ADNc. El mismo procedimiento se usó para convertir los extremos Sal I en 5' del vector de expresión de mamífero pDC406 en prolongaciones de 24 nucleótidos complementarios de los añadidos al ADNc. Proporciones óptimas del vector adaptado y del ADNc se ligaron en presencia de polinucleótido quinasa T4. Las mezclas de ligamiento dializadas se sometieron a electroforesis en la cepa DH5\alpha de E. coli y los transformantes se seleccionaron en placas con ampicilina.

El ADN plasmídico se aisló de los grupos formados por aproximadamente 2.000 clones de E. coli transformada por grupo. El ADN aislado se transfirió mediante transfección en una capa subconfluyente de células CV1-EBNA usando DEAE-dextrano, seguido por tratamiento con cloroquina sustancialmente según los procedimientos descritos en Luthman y col., Nucl. Acids. Res. 11: 1295, 1983 y McCutchan y col., J. Natl. Cancer Inst. 41: 351, 1986.

Las células CV1-EBNA se mantuvieron en medio completo (medio Eagles modificado con Dulbecco, que contiene 10% (v/v) de suero bovino fetal, 50 U/ml de penicilina, 50 U/ml de estreptomicina y L-glutamina 2mM) y se sembraron en placas hasta una densidad de aproximadamente 2 x 10^{5} células/pocillo en placas divididas en cámaras de un único pocillo (Lab-Tek). Las PLACAS se trataron previamente con 1 ml de fibronectina humana (10 \mug/ml de PBS) durante 30 minutos, seguido de un único lavado con PBS. Se eliminó el medio de las células adherentes en crecimiento en una capa y se sustituyó con 1,5 ml de medio completo que contenía sulfato de cloroquina 66,6 \muM. A las células se añadieron aproximadamente 0,2 ml de una solución de ADN (2 \mug de ADN, o,5 mg/ml de DEAE-dextrano en medio completo con cloroquina) y la mezcla se incubó a 37ºC durante aproximadamente cinco horas. Tras la incubación, se eliminó el medio y las células se agitaron mediante la adición de medio completo con 10% de DMSO (Dimetilsulfóxido) durante 2,5-20 minutos. La agitación se siguió de la sustitución de la solución con medio completo fresco. Se indujo el crecimiento en cultivo de las células durante de dos a tres días para permitir la expresión transitoria de las secuencias insertadas de ADN. Estas condiciones condujeron a una frecuencia de transfección del 30% al 80% en las células CV1-BNA supervivientes.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe la detección selectiva de la genoteca de clonación de expresión preparada en el Ejemplo 3 con una proteína de fusión CD40/Fc marcada preparada en el Ejemplo 1. Después de 48-72 horas, las monocapas transfeccionadas de células CV1-EBNA preparadas en el Ejemplo 3 se analizaron mediante autorradiografía de la SLIDE para la expresión del CD40-L usando la proteína de fusión CD40/Fc marcada con yodo radiactivo según se preparó en el Ejemplo 1. Las células CV1-EBNA transfeccionadas se lavaron una vez con medio de unión (RPMI 1640 que contenía 25 mg/ml de seroalbúmina bovina 8BSA), 2 mg/ml de azida sódica, Hepes 20 mM a pH 7,2 y 50 mg/ml de leche seca desgrasada) y se incubaron durante 2 horas a 4ºC en medio de unión con proteína de fusión CD40/Fc ^{125}I 1 x 10^{-9}M. Después de la incubación, las células en las placas divididas en cámaras se lavaron tres veces con tampón de unión, seguido de dos lavados con PBS, (pH 7,3) para eliminar la proteína de fusión marcada radioactivamente sin unir.

Las células se fijaron mediante incubación en 10% de gluteraldehído en PBS (30 minutos a temperatura ambiente), se lavaron dos veces en PBS y se secaron al aire. Las placas se sumergieron en emulsión fotográfica Kodak GTNB-2 (dilución 6 x en agua) y se expusieron en oscuridad durante de dos a cuatro días a temperatura ambiente en una caja opaca. Las placas se revelaron en un revelador Kodak D19, se enjuagaron con agua y se fijaron en fijador Agfa G433. Las placas se analizaron individualmente al microscopio con un aumento de 25-40x. Las placas positivas que mostraban las células que expresan CD40-L se identificaron mediante la presencia en la autorradiografía de granos de plata frente a un entorno claro.

Se identificó un grupo con aproximadamente 2000 clones individuales como potencialmente positivo para unirse a la proteína de fusión CD40/Fc. El grupo se tituló y se sembró para proporcionar placas que contenían, cada una de ellas, 200 colonias. Cada placa se raspó para proporcionar ADN plasmídico acumulado para la transfección en células CV1-EBNA según el mismo procedimiento descrito anteriormente. La detección selectiva de los grupos más pequeños se realizó mediante autorradiografía de la placa como se ha descrito previamente. Uno de los grupos más pequeños contenía clones que eran positivos para el CD40-L, como indica la presencia de un producto génico expresado capaz de unirse a la proteína de fusión CD40/Fc.

El grupo positivo más pequeño se tituló y se sembró en placas para obtener colonias individuales. Se escogieron aproximadamente 400 colonias individuales y se inocularon al medio de cultivo en pocillos individuales de placas de 96 pocillos. Los cultivos se mezclaron mediante la agrupación de las filas y las columnas y los cultivos mezclados se usaron para preparar ADN para un ciclo final de transfección y detección selectiva. Una intersección de una fila positiva y una columna positiva indicó una posible colonia positiva. Se identificaron diez posibles colonias positivas (es decir, los clones candidatos). Se aisló ADN de cada clon candidato, se volvió a someter a transfección y se volvió a someter a detección selectiva. Cinco clones candidatos fueron positivos al unirse a CD40/Fc. Todos los cinco clones candidatos positivos contenían un inserto de ADNc de 1468 nucleótidos, según se determina mediante secuenciación de didesoxinucleótidos. La región codificadora del ADNc del clon de CD40-L corresponde a la secuencia de la Figura 1 y de la ID SEC Nº 1.

Un vector de clonación que contenía una secuencia de CD40-L murino, designado pDC406-mCD40-L, se depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) el 6 de diciembre de 1991 con el número de registro 688872. La secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica predicha de este clon se ilustran en la ID SEC Nº 1 y la figura 1.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra una técnica de hibridación con especies cruzadas que se usó para aislar un homólogo de CD40-L humano usando una sonda diseñada a partir de la secuencia del CD40-L murino. Una sonda de CD40-L murino se produjo mediante la excisión de la región de codificación del clon de CD40-L murino, pDC406-CD40-L (nucleótido 13 a 793) y el marcaje con ^{32}P del fragmento usando cebadores aleatorios (Boehringer-Mannheim).

En un vector fago \lambda se construyó una genoteca de ADNc de linfocitos de sangre periférica (PBL) humana usando ramas \lambdagt10 y se empaquetó in vitro usando un kit disponible en el mercado (Gigapak® Stratagene, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Las células PBL se obtuvieron de voluntariosa humanos normales y se trataron con 10 ng/ml de OKT3 (un anticuerpo antiCD3) y 10 ng/ml de Il-2 humana (Immunex, Seattle, WA) durante seis días. Las células PBL se lavaron y estimularon con 500 ng/ml de ionomicina (Calbiochem) y 10 ng/ml de PMA (Sigma) durante cuatro horas. El ARN mensajero y el ADNc se obtuvieron de células PBL estimuladas y se empaquetó en vectores fagos \lambdagt10 (Gigapak® Stratagene) según las instrucciones del fabricante.

La sonda murina se hibridó con el ADNc del fago en 6 x SSC (citrato sódico 15 mM y cloruro sódico 165 mM), 1 X solución de Denhardt, EDTA 2 mM, 0,5% de Np40 a 63ºC durante la noche. La hibridación se siguió de lavado extenso en 3 x SSC, 0,1% de SDS a aproximadamente 55ºC durante tres horas. Las bandas específicas se visualizaron mediante autorradiografía.

Un vector de clonación que contenía la secuencia de CD40-L, designado hCD40-L, e depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) el 6 de diciembre de 1991, con el número de registro 68873. La secuencia nucleotídica la secuencia aminoacídica predicha de este clon se ilustran en la ID SEC Nº 11 y en la figura 2.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la expresión de CD40-L murino unido a la membrana en células CV1-EBNA. El ADNc de CD40-L murino en el vector HAVEO o en el vector HAVEO vacío se transfirió por transfección a células CV1-EBNA usando técnicas estándar, tales como las descritas por McMahan y col., EMBO J. 10: 28221, 1991 y en el Ejemplo 3 en la presente memoria descriptiva. Brevemente, las células CV1 EBNA se sembraron en placas a una densidad de 2 x 10^{6} células por 10 cm de placa en 10 ml de Medio Esencial Mínimo Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal (Medio). Las células se dejaron adherir durante la noche a 37ºC. El Medio se reemplazó con 1,5 ml de Medico que contenía 66,7 \muM de cloroquina y una mezcla de ADN que contenía 5 \mug de ADNc que codificador de mCD40-L. También se añadió a las células Medio con 175 \mul y 25 \mul de dextrano DEAE (4 mg/ml en PBS). Las células y el ADNc se incubaron a 37ºC durante 5 horas. Se extrajo la mezcla de ADNc y las células se sacudieron con 1 ml de Medio fresco que contenía 10% de DMSO durante 2,5 minutos. El Medio se reemplazó con Medio fresco y se dejó crecer a las células durante al menos 3 días.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales frente a CD40-L. Las preparaciones de CD40-L murino o de CD40-L humano purificados se preparan mediante expresión en células COS y purificación por afinidad de CD40/Fc como se ha descrito en la presente memoria descriptiva. EL CD40-L purificado puede generar anticuerpos monoclonales frente a CD40-L usando técnicas convencionales, por ejemplo, las técnicas descritas en la patente de EE.UU. 4.411.993. Brevemente, se inmunizan ratones con CD40-L como inmunógeno emulsionado en adyuvante completo de Freund y se inyectó en cantidades que varían de 10-100 \mug por vía subcutánea o intraperitoneal. De diez a doce días después, los animales inmunizados recibieron un inóculo de refuerzo con CD40-L adicional emulsionado en adyuvante de Freund completo. A partir de entonces, periódicamente, los ratones reciben inóculos de refuerzo según un programa de inmunización de una o dos veces a la semana. Periódicamente se extraen muestras de suero mediante extracción de sangre retroorbitaria o escisión en la punta de la cola para realizar pruebas mediante ensayo de transferencia de puntos o ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) para los anticuerpos frente a CD40-L.

Tras la detección de un título adecuado de anticuerpos, se proporciona a los animales con resultados positivos una última inyección intravenosa de CD40-L en suero salino. Se sacrifica a los animales de tres a cuatros días después, se recogen las células del bazo y las células del bazo se fusionan con una línea celular murina de mieloma (por ejemplo, NS1 o Ag 8.653). Las fusiones generan células de hibridoma, que se siembran en placa en placas de microtitulación múltiple en un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) selectivo para inhibir la proliferación de las células que no se han fusionado, los híbridos de mieloma y los híbridos de células de bazo.

La detección selectiva de las células de hibridoma se lleva a cabo mediante ELISA para detectar la reactividad frente a CD40-L purificado mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall y col., Immunochem. 8: 871, 1971 y en la patente de EE.UU. 4.703.004. Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar por vía intraperitoneal en ratones BALB/c singénicos para producir ascitis con concentraciones elevadas de anticuerpos monoclonales antiCD40-L. Como alternativa, las células de hibridoma se pueden dejar crecer in vitro en matraces o en frascos rotatorios mediante varias técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en las ascitis de ratón se pueden purificar por precipitación con sulfato amónico seguida por cromatografía por exclusión en gel. Como alternativa, también se puede usar cromatografía por afinidad basada en la unión de anticuerpos frente a la proteína A o la proteína G o cromatografía por afinidad basada en la unión a CD40-L.

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra los efectos terapéuticos antialérgicos del sCD40 y de la proteína de fusión CD40/Fc. Se realizaron pruebas con el CD40 soluble y la CD40/Fc para determinar su capacidad para inhibir la secreción de IgE inducida por IL-4 (5 ng/ml) en un sistema CML de dos donantes. Los datos procedentes de tres experimentos se presentan en la Tabla I.

TABLAI

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1

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Los niveles de IgE se midieron 12 días después en el cultivo mediante un procedimiento de ELISA. Brevemente, placas de microtitulación de 96 pocillos y fondo plano (Corning) se revistieron con AcMo de ratón antiIgE humana (Zymed) a una dilución de 1:500 en PBS (suero salino tamponado con fosfato). Después de lavar 3 veces se llevó a cabo una etapa de bloqueo con 5% de leche seca desgrasada, seguida de la titulación de los estándar de IgE humana o de los sobrenadantes de prueba. Después de lavar 3 veces se añadió IgE antihumana de cabra biotinilada (Kirkegard y Perry) a una dilución de 1:500. Esto se siguió de más lavados y después de la adición de estreptavidina-HRP (Zymed) a una dilución de 1:500. Después de más lavados, se desarrolló la reacción usando sustrato TMB (Kirkegaard y Perry) y se midió la absorbancia a 520 nm. Todas las etapas de lavado se llevaron a cabo en PBS más 0,05% de Tween. Todas la etapas de incubación se realizaron a volúmenes de 100 \mul/pocillo durante una hora a temperatura ambiente. La sensibilidad de este ensayo es de 100 pg/ml.

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra los efectos del sCD40 y de la proteína de fusión CD40/Fc para inhibir la liberación de CD23 por parte de las células B estimuladas con IL-4 (5 ng/ml). Se realizaron pruebas con CD40 soluble y CD40/Fc para determinar su capacidad para inhibir la liberación de sCD23 inducida por IL-4 en un sistema de CML de dos donantes. Los datos procedentes de tres experimentos se presentan en la tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

2

Los niveles de CD23 se midieron después de 6 y 12 días en cultivo mediante un kit ELISA de detección de sCD23 (Binding Site, San Diego, CA). El límite de sensibilidad fue de 500 pg/ml. Se cultivaron aproximadamente 1 x 10^{5} células por pocillo por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo (Intermountain Scientific, Bountiful UT) durante el tiempo indicado en presencia o ausencia de aditivos, como se indica en la tabla 2. Los resultados muestran efectos antialérgicos del sCD40. Se llevaron a cabo estudios similares con CD40/Fc (datos no mostrados) en lugar de sCD40 y se obtuvieron resultados similares. En consecuencia, estos datos del los Ejemplos 8 y 9 ilustran una propiedad antialérgica del CD40.

Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra la actividad proliferativa de células B del CD40-L murino unido a la membrana para células B humana. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de sangre periférica de voluntarios normales mediante centrifugación por gradiente de densidad con Histopaque® (Sigma, St. Louis, MO). Las preparaciones con depleción de células T (E^{-}) se obtuvieron mediante la eliminación de células T por roseteo con eritrocitos de carnero(EC) tratados con bromuro de 2-aminoetilisotiouranio y posterior centrifugación por gradiente de densidad con Histopaque®. Los ensayos de proliferación de células B se llevaron a cabo con preparaciones E^{-} en medio RPMI con 10% de suero bovino fetal (SBF) inactivado por calor a 37ºC en una atmósfera de 10% de CO_{2}. Aproximadamente 1 x 10^{5} células E^{-} por pocillo se cultivaron por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (Corning) durante 7 días en presencia de células CV1 EBNA transfeccionadas (descritas en el ejemplo 6). Se sometió a transfección las células CV1 EBNA con ADNc de CD40-L murino o con un vector vacío. Las células recibieron pulsos con 1 \muCi/pocillo de timidina tritiada (25 Ci/nmol, Amersham, Arlingtom Heightd, IL) durante las últimas ocho horas de cultivo. Las células se recogieron en discos de fibra de vidrio con un cosechador celular automático y las cpm incorporadas se midieron mediante espectrometría de centelleo líquido.

La figura 4a muestra una comparación de la proliferación de células B de células CV1 EBNA sometidas a transfección con vector vacío (HAVEO) o con ADNc de CD40-L murino en vector HAVEO. Estos datos muestran que la el CD40-L unido a la membrana estimula la proliferación de células B humanas en ausencia de un comitógeno. La figura 4b muestra un experimento similar, a excepción de que se añadieron 10 ng/ml de IL-4 humana a los cultivos. En este experimento, la IL-4 intensifica ligeramente la actividad mitogénica de células B del CD40-L unido a la membrana murino. La figura 5 es una repetición del experimento que se muestra en la figura 4b. Sin embargo, cuando se repitió el experimento, no se observaron signos de actividad comitogénica de la IL-4. Sí existieron pruebas de la actividad mitogénica del CD40-L. En consecuencia, el CD40-L unido a la membrana estimula la proliferación de células B humanas.

Ejemplo 11

Este ejemplo ilustra el efecto del CD40-L unido a la membrana murino sobre la estimulación de la producción de IgE y la eliminación de CD23 de las células E^{-} aisladas en el Ejemplo 10. Aproximadamente 1 x 10^{5} células/pocillo se cultivaron por triplicado en placas de microtitulación Nunc de 96 pocillos de fondo redondo (Intermountain Scientific, Bountiful UT) en Medio Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) más 10% de FCS en atmósfera húmeda de 10% de CO_{2}. El medio estaba complementado con 50 \mug/ml de transferrina humana (Sigma), 0,5% de seroalbúmina bovina (Sigma) y 1 \mug/ml de cada uno de los ácidos oleico, linoleico y palmítico (Sigma). Las células E^{-} se cultivaron durante 10 días en presencia de 5 ng/ml de IL-4 humana. Se añadió una titulación de células CV1 EBNA sometidas a transfección con CD40-L murino o con vector vacío. Después de diez días, se analizaron los sobrenadantes del cultivo para detectar IgE mediante el procedimiento ELISA que se describe en el Ejemplo 8 o para determinar la eliminación de CD23 mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 9.

La figura 6 muestra una comparación de la producción de IgE en los sobrenadantes (en ng/ml) de los cultivos de las células E^{-} y de las células CV1 EBNA sometidas a transfección con vector vacío (HAVEO) o con CD40-L. No se observaron diferencias con hasta 3000 células CV1 EBNA, sin embargo la adición de 10000 ó 30000 de células CV1 EBNA sometidas a transfección con CD40-L tuvo como resultado una producción de IgE significativa. Como comparación, cuando las células E^{-} se incubaron con medio solo, 5 ng/ml de Il-4 o 5 ng/ml de IL-4 más 500 ng/ml de anticuerpo G28-5, la producción de IgE fue 4,7, 2,9 y > 600 ng/ml, respectivamente. Cuando se midió la eliminación de CD23 en la figura 7, se mostró un aumento de la eliminación de CD23 en las 10000 y 30000 células CV1 EBNA sometidas a transfección con CD40-L en comparación con las células CV1 EBNA control con vector vacío. Como comparación, cuando las células E^{-} se incubaron con medio solo, 5 ng/ml de IL-4 o 5 ng/ml de IL-4 más 500 ng/ml de anticuerpo G28-5, la eliminación de CD23 fue < 0,1, 2,4 y 11,2 ng/ml, respectivamente. Estos datos muestran que la producción de IgE y la eliminación de CD23 son, ambos, actividades biológicas asociadas con el CD40-L unido a la membrana.

Ejemplo 12

Este ejemplo ilustra la actividad de proliferación de células B, la producción de inmunoglobulina (Ig) policlonal, la formación de anticuerpos específicos de antígeno y varios procedimientos para usar el CD40-L soluble y unido a la membrana en aplicaciones clínicas. Los inventores obtuvieron células B de bazo según los procedimientos descritos en Grabstein y col., I supra, Maliszewski y col., I supra y Maliszewski y col., II supra. Brevemente, el cultivo mixto de células se purificó mediante depleción de células T usando antisuero de células T y complemento, y depleción de células adherentes mediante paso por columnas de Sephadex® G10 y mediante selección positiva de células B apelmazadas en placas petri revestidas con IgM de cabra antiratón. Las células B purificadas se cultivaron en medio RPMI, suero bovino fetal (5% para los ensayos de proliferación de células B y 205 para los ensayos de células formadoras de placas o para los ensayos de anticuerpos monoclonales), 2-mercaptoetanol, antibióticos, aminoácidos y piruvato. La proliferación de células B se midió según el ensayo descrito en el Ejemplo 10 y en Grabstein y col., I supra, Maliszewski y col., I supra y Maliszewski y col., II supra. La formación de anticuerpos específicos de antígeno se midió mediante el procedimiento descrito en Grabstein y col., J. Mol. Cell. Immunol. 2: 199, 1986 [Grabstein y col. II]. Brevemente, para la formación de anticuerpos específicos de antígeno se usaron eritrocitos de carnero (EC) como antígeno (0,03% v/v) en cultivos de 2,0 ml de 1 x 10^{6} células B murinas por cultivo. Los cultivos de células B se incubaron durante 5 días y las células formadoras de placas se determinaron mediante el ensayo de la placa hemolítica de Jerne, según se describe en Grabstein y col. II supra. La cifra de células se determinó en un contador coulter. La secreción de Ig policlonales se determinó mediante ensayos de ELISA específicos de isotipo en cultivos de siete días de 1 x 10^{6} células por 2,0 ml de cultivo, según se describe en Maliszewski y col., I supra y Maliszewski y col., II supra.

Los resultados de la proliferación de células B por las células CV1 EBNA sometidas a transfección con CD40-L o con vector vacío o células 7A1 (un clon de células T colaboradoras) se muestran en las figuras 8, 10 y 12. Estos datos muestran que el CD40-L produjo la mayor proliferación de células B. Las células T colaboradoras 7A1 y 7C2 ejercieron un efecto mínimo sobre la proliferación de células B.

Los efectos de varias células en la formación de anticuerpos específicos de antígeno se muestran en las figuras 9 y 11. La figura 9 muestra una comparación de las células formadoras de placa que compara el clon de células T colaboradoras 7A1 y las células El40.9 murinas que secretan un CD40-L soluble. Parece que las células EL40,9 ejercen un efecto inhibidor sobre la formación de anticuerpos específicos de antígeno. La figura 11 muestra PFC (células formadoras de placa) para las células T colaboradoras 7C2 y las células CV1 EBNA sometidas a transfección con vector vacío o con CD40-L. Tanto las células 7C2 como el CD40-L unido a la membrana estimulaba la formación de anticuerpos específicos de antígeno (PFC).

La figura 13 compara la formación de anticuerpos específicos de antígeno de CD40-L y de células 7A1 en presencia o ausencia de 10 ng/ml de interleuquina 2 (IL-2). La IL-2 aumentó las PFC para las células 7A1 pero no incrementó las PFC causadas por el CD40-L unido a la membrana.

La producción de Ig policlonales por parte de las células B murinas se comparó para la estimulación o la inhibición con CD40-L unido a la membrana, las células CV1 EBNA control y las células T colaboradoras 7A1 en presencia de las citoquinas IL-4 (10 ng/ml) e IL-5 (dilución 1:40 de sobrenadantes de células COS) o sin la adición de citoquinas. Las cantidades de IgA, igG3, IgE, IgG2b, IgM e IgG1 se muestran en las tablas 3-8, respectivamente.

TABLA 3

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3

TABLA 4

4

TABLA 5

35

TABLA 6

5

TABLA 7

34

TABLA 8

6

Estos datos indican que la interacción de CD40 con su ligando es la interacción molecular principal responsable de la inducción del crecimiento y la diferenciación hacia la producción de anticuerpos específicos de antígeno y secreción de Ig policlonales dependiente del contacto con células T. Como tal, estos datos sugieren que los antagonistas de interacción, por CD40, la proteína de fusión CD40/Fc y posiblemente el CD40-L soluble (monomérico), interferirán de forma significativa con el desarrollo de las respuestas de anticuerpos. Por tanto, las situaciones clínicas en las que CD40, las proteínas de fusión CD40/Fc y el CD40-L incluyen alergia, lupus, artritis reumatoide, diabetes mellitus insulinodependiente y cualquier otra enfermedad en la que los anticuerpos autoinmunitarios o los complejos antígeno/anticuerpo son responsables de las alteraciones clínicas de la enfermedad. Es más, el CD40-L unido a la membrana o el CD40-L soluble oligomérico será útil para estimular la proliferación de células B y la producción de anticuerpos. Como tal, estas formas de CD40-L son más útiles como adyuvantes de vacunas y como agente estimulante para la secreción de AcMo a partir de las células de hibridoma.

Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra el efecto del CD40-L unido a la membrana en la proliferación de y la secreción de IgE por las células mononucleares de sangre periférica (E^{-}). Las células E^{-}se obtuvieron según el procedimiento descrito en el Ejemplo 10 y se incubaron durante 7 ó 10 días en presencia de células CV1 EBNA sometidas a transfección con vector vacío o con ADNc de mCD40-L. Además, a algunas de las preparaciones se añadió proteína de fusión CD40/Fc (descrita en el Ejemplo 1) o proteína de fusión Receptor de TNF/Fc (descrita en el documento WO91/03553)como se indica en la figura 14. La secreción de IgE se midió según el procedimiento descrito en el Ejemplo 8 y la proliferación de células B se midió según el procedimiento descrito en el Ejemplo 10.

Los resultados en cuanto a la proliferación de células B y la secreción de IgE se muestran en la figura 14 para cinco concentraciones diferentes de células CV1 EBNA sometidas a transfección. Tanto la proliferación de células B como la secreción de IgE aumentaron en presencia de CD40-L unido a la membrana. La adición de proteína de fusión CD40/Fc anuló la proliferación celular y la secreción de IgE. La proteína de fusión Receptor de TNF/Fc no ejerció ningún efecto. Como comparación para la secreción de IgE, la adición de IL-4 como agente control (sin células CV1 EBNA sometidas a transfección) no produjo IgE en este ensayo y la adición de IL-4 más AcMo antiCD40 G28-5 tuvo como resultado 29,7 ng/ml de IgE en este ensayo.

Ejemplo 14

Este ejemplo describe la construcción de un constructo de ADN de CD40-L/Fc para expresar una proteína de fusión CD40 soluble/Fc denominado constructo CD40-L/FC2. El ADN que codifica CD40-L/FC2 comprende secuencias que codifican un péptido líder (o señal, una secuencia hidrófila de ocho aminoácidos descrita por Hopp y col. (Hopp y col., Biotechnology 6: 1204, 1988; denominado Flag®), una región Fc adecuada de una inmunoglobulina, una secuencia repetida de [Gly_{4}Ser]_{3} (descrita en la patente de EE.UU. 5.073.627, que se incorpora la presente memoria descriptiva como referencia) u otra secuencia de unión adecuada, y la región extracelular del CD40-L humano desde el aminoácido 50 al aminoácido 261 (ID SEC Nº11). Se prepara un vector de expresión pDC406 que contiene una secuencia líder, Flag®, y la Fc de la IgG1 humana usando técnicas convencionales de corte y empalme enzimático de fragmentos que codifican una secuencia líder, Flag®, y la Fc de IgG1 humana y restricción con Nsi 1 y Not 1.

Se usó una técnica de PCR (Sarki y col., Science 239: 487, 1988) usando cebadores oligonucleotídicos en 5' y en 3' para amplificar las secuencias de ADN que codifican el dominio extracelular de unión al ligando de CD40 de un vector de clonación que contiene CD40-L humano (ATCC 68873; ID SEC Nº 11), para formar un fragmento de PCR. El cebador oligonucleotídico en 5' (ID SEC Nº 13) introdujo en 5' un sitio Nsi de una secuencia de unión ([Gly_{4}Ser]_{3}
SerSer), seguida por 21 nucleótidos del dominio extracelular de CD40-L (desde el aminoácido 51 hasta el 57 de la ID SEC Nº 11). Un cebador oligonucleotídico en 3' (ID SEC Nº 14) introdujo un sitio Not 1 justo en 3' del codón de terminación del CD40-L. EL fragmento de PCR se ligó en el vector de expresión pDC406 que contenía la secuencia líder, Flag®, y la Fc de IgG1. El nucleótido y la secuencia aminoacídica predicha de CD40-L/FC2 se presentan en la ID SEC Nº 15 y la ID SEC Nº 16. El constructo de ADN resultante (CD40-L/FC2) se transfirió por transfección en la línea de células de riñón de mono CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). EL constructo codificaba un CD40-L soluble capaz de unirse a CD40, como se pone de manifiesto con la unión observada en los análisis de selección de células activado por fluorescencia (FACS) usando células que expresan CD40.

Se indujo el crecimiento de cultivos a gran escala de células 293 de riñón de embrión humano (TACC CDRL 1573) sometidas a transfección con el constructo que codifica CD40/FC2, para acumular el sobrenadante que contiene CD40-L/FC2. La línea celular 293, una línea permanente de riñón primario embrionario humano transformada con ADN del adenovirus humano 5, permite la expresión de proteínas recombinantes ligadas en el vector pCD406. La proteína de fusión CD40-L/FC2 en el fluido sobrenadante se purificó mediante purificación por afinidad. Brevemente, el sobrenadante del cultivo que contiene la proteína de fusión CD40-L/FC2 se purificó mediante filtración de los sobrenadantes de células de mamífero (por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y la aplicación del filtrado a una columna de afinidad de anticuerpos que comprende IgG antihumana de cabra biotinilada (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Westgrove, OA, EE.UU.) acoplada a agarosa-estreptavidina (Pierce Chemical, Rockford, IL, EE.UU.) a 4ºC a un caudal de aproximadamente 60 a 80 ml/h para una columna de 1,5 cm x 12,0 cm. La columna se lavó con aproximadamente 20 volúmenes de columna de PBS (suero salino tamponado con fosfato), hasta que no se pudo detectar proteína libre en el tampón de lavado. La proteína de fusión unida se eluyó de la columna con tampón citrato 12,5 mM, NaCl 75 mM, pH 2,8, se llevó hasta un pH 7 con tampón Hepes 500 mM a pH 9,1. El péptido CD40-L/FC2 oligomérico purificado indujo proliferación de células B humanas en ausencia de ningún coestímulo y (junto con la citoquina adecuada) tuvo como resultado la producción de IgG, IgE, IgA e IgM, como se describe en el Ejemplo 12 para el CD40-L unido a la membrana.

Ejemplo 15

Este ejemplo describe la construcción de un constructo de ADN de CD40-L que exprese una proteína de fusión CD40-L soluble denominada CD40-L trimérico. El CD40-L trimérico contiene una secuencia líder, una secuencia de 33 aminoácidos denominada "cremallera de leucina" (ID SEC Nº 17) y una secuencia hidrófila de ocho aminoácidos descrita por Hopp y col. (Hopp y col., BioTechnology 6: 1204, 1988; denominado Flag®), seguida por loa región extracelular del CD40-L humano desde al aminoácido 50 hasta el aminoácido 261 (ID SEC Nº 11). La utilidad de las secuencias líder y Flag® se ha descrito en la sección de la Descripción Detallada. La secuencia de 33 aminoácidos presentada en la ID SEC Nº 17 trimeriza de forma espontánea en solución. Por tanto, se espera que las proteínas de fusión que comprende esta secuencia de 33 aminoácidos formen espontáneamente trímeros o multí-
meros.

El constructo se prepara mediante la síntesis de oligonucleótidos que representan una secuencia líder, la secuencia de 33 aminoácidos descrita anteriormente y la secuencia Flag®, después se liga el producto final a un fragmento de ADN que codifica desde el aminoácido 51 hasta el 261 de la ID SEC Nº 11, preparada como se ha descrito en el Ejemplo 14.

El producto resultante de la unión en el vector de expresión pDC406 se transfirió mediante transfección a la línea de células de riñón de mono CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). El plásmido pDC406 incluye secuencias reguladoras derivadas del SV40, del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del virus de Epstein-Barr (EBV). La línea celular CV-1/EBNA se derivó mediante transfección de la línea de células CV-1 con un gen que codifica el antígeno-1 nuclear del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) que expresa constitutivamente EBNA-1 impulsado por promotor/intensificador intermedio-precoz de CMV humano. El gen EBNA-1 permite la replicación episomal de los vectores de expresión, tales como pDC406, que contienen el origen de replicación del EBV.

Una vez que se identifican las células que expresan el constructo de fusión, se induce el crecimiento de cultivos a gran escala de células sometidas a transfección para acumular el sobrenadante de las células que expresan el CD40-L trimérico. La proteína de fusión trimérica CD40-L en el fluido sobrenadante se purifica mediante purificación por afinidad sustancialmente como se describe en la patente de EE.UU. 5.011.912. Para determinar la pureza se pueden preparar geles de SDS marcados con plata de la proteína de fusión CD40-L eluida.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: ARMITAGE, RICHARD

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: IMMUNEX CORPORATION

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: IMMUNEX CORPORATION

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 51 UNIVERSITY STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: SEATTLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: WASHINGTON

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL: 98101

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVA CITOQUINA

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 17

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(v): FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM compatible con PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0. Versión 1.25

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(iv): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US92/08990

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 de octubre de 1992

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 783 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: RATÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: CD40-L

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: COS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:I..783

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 1:

7

8

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(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 260 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 2:

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\vskip1.000000\baselineskip

9

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(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 740 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: SER HUMANO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: Fc IgG1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

10

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 519 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: SER HUMANO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: REGIÓN EXTRACELULAR DE CD40

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: CEBADOR DE PCR

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: CEBADOR en 5' DE CD40

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTCGACCA CATGGTTCG TCTGCC

\hfill

26

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(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: CEBADOR de PCR

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: CEBADOR EN 3' DE CD40

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCGACGT CTAGAGCCGA TCCTGGGG

\hfill

28

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(2) iNFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 7:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: CEBADOR DE PCR

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: CEBADOR EN 3' DE CD40

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAAGATCTG GGCTCTACGT ACTCCCAGCCGA TCCTGGGGAC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: PENTAPÉPTIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Val Gly Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: CEBADOR DE PCR

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: IGG1 HUMANA/FC CEBADOR EN 5'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATTAATCAT TCAGTAGGGC CCAGATCTTG TGACAAAACT CAC

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO:CEBADOR DE PCR

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: IGG1 HUMANA/FC CEBADOR EN 3'

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCC GCTTAA CTAGTTCATT TACCCGGAGA CAGGGAGA

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 840 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLON: CD40-L

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 46..831

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

130

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 261 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTGGCGGA GGGTCAGGCG GAGGTGGGTC CGAGGCGGG GGTTCAAGTT CTAGACAAGAT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAAGATGAA AGG

\hfill

73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCGCTCAG AGTTTGAGTA A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1425 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: CD40-L humano/FC2-(CD40-L soluble)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(C): LOCALIZACIÓN:4..1422

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:79..1422

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sig_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:4..78

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 473 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

19

Claims

1. Una secuencia de ADN aislado que codifica un polipéptido de CD40-L que se une a CD40, seleccionado
entre:

(a): ADN que comprende los nucleótidos 46 a 828, 196 a 828, 193 a 762 de la ID SEC Nº 11 y sus hebras complementarias;

(b): ADN que codifica los aminoácidos 1-261 de la ID SEC Nº 12;

(c): ADN que codifica los aminoácidos 47-261 de la ID SEC Nº 12;

(d): ADN que codifica los aminoácidos 51-261 de la ID SEC Nº 12;

(e): ADN que codifica un fragmento de (c) o (d); y

(f): ADN que es complementario del ADN que hibrida con el ADN de (a) en condiciones de rigurosidad moderada (solución de prelavado de 5 x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, 5 x SSC durante la noche).

2. Un ADN aislado que codifica un polipéptido de CD40-L que se une a CD40, seleccionado entre:

(a): ADN que comprende los nucleótidos 1 a 783 de la ID SEC Nº 1 y su hebra complementaria;

(b): ADN que codifica los aminoácidos 1 a 260 de la ID SEC Nº 2;

(c): ADN que codifica los aminoácidos 47 a 260 de la ID SEC Nº 2;

(d): ADN que codifica un fragmento de (b) o (c); y

(e): ADN que es complementario del ADN que hibrida con el ADN de (a) en condiciones de rigurosidad moderada (solución de prelavado de 5 x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, 5 x SSC durante la noche).

3. El ADN aislado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que además comprende un ADN que codifica un péptido cremallera de leucina.

4. El ADN aislado según la reivindicación 3, en el que el péptido cremallera de leucina es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la ID SEC Nº 17.

5. El ADN aislado según la reivindicación 1 ó 2, que además comprende un ADN que codifica una región Fc de inmunoglobulina.

6. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Una célula huésped transformada o sometida a transfección con un vector de expresión según la reivindicación 6.

8. Un procedimiento para preparar un polipéptido, que comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 7 en condiciones que estimulan la expresión del polipéptido.

9. Un polipéptido CD40-L purificado que se une a CD40, que comprende un polipéptido codificado por el ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Un polipéptido según la reivindicación 9, que es un monómero soluble.

11. Un oligómero que comprende dos o más polipéptidos de la reivindicación 9 o la reivindicación 10.

12. El oligómero de la reivindicación 11, que además comprende una cremallera de leucina.

13. El oligómero de la reivindicación 12, en el que la cremallera de leucina comprende la ID SEC Nº 17.

14. El oligómero de la reivindicación 11, 12 ó 13, que además comprende una región Fc.

15. El oligómero de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que además comprende una secuencia de unión.

16. El uso de un polipéptido monomérico soluble según la reivindicación 10 en la preparación de un medicamento para tratar alergias, reacciones alérgicas, lupus, artritis reumatoide u la enfermedad del injerto contra el huésped.

17. Una composición para vacuna que comprende un oligómero según cualquiera de las reivindicaciones 11-15, como adyuvante.

18. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o un oligómero según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15 junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

19. Un procedimiento para estimular células de hibridoma para aumentar la secreción de anticuerpo monoclonal, que comprende la administración a dichas células de hibridoma una cantidad eficaz de un oligómero según una cualquiera de las reivindicaciones 11-15.

20. Un ADN como se muestra en la ID SEC Nº 5, 6, 7, 9 ó 10, o su ARN equivalente o su complementario.