DE69233402T2

DE69233402T2 - Neue cytokine

Info

Publication number: DE69233402T2
Application number: DE69233402T
Authority: DE
Inventors: Richard J. Armitage; William C. Fanslow; Melanie K. Spriggs; Srinivasan Subhashini
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1991-10-25
Filing date: 1992-10-23
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2012-10-24
Also published as: WO1993008207A1; FI981765A0; FI981765L; EP0897983B1; EP0897983A2; JP3308534B2; ATE274055T1; ES2227513T5; DK0667901T3; CA2121798A1; HK1019343A1; CA2121798C; ES2227513T3; NO317625B1; FI116850B; CA2312667A1; EP0667901B2; FI941837A0; EP0897983A3; NO980030L

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Zytokin. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das Klonen eines murinen und eines humanen Zytokines, welches an ein humanes CD40 bindet und welches in löslicher und membrangebundener Form sowohl Agonisten- als auch Antagonistenaktivität aufweist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zytokine, welche eine „Interleukin"-Bezeichnung tragen, sind diejenigen Proteinfaktoren, welche Immuneffektorzellen beeinflussen. Mit Interleukin-1 bis einschließlich Interleukin-12 bezeichnete Zytokine sind beschrieben und als ein Interleukin benannt worden. Zu weiteren bekannten Zytokinen gehören der Tumornekrosefaktor (TNF), Granulozyt-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Granulozyt-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Mastzellen-Wachstumsfaktor (MGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Erythropoietin (EPO), γ-Interferon (γ-IFN) und andere.
DNAs für zwei verschiedene TNF-Rezeptoren (Typ I und Typ II) wurden geklont (Smith et al., Science, 248: 1019, 1990 und Schall et al., Cell, 61: 361, 1990). Beide Formen des TNF-Rezeptors sind miteinander verwandt und gehören zu einer Familie von Rezeptoren, zu deren Mitgliedern der Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor (Johnson et al., Cell, 47: 545, 1986), das B-Zellen-Antigen CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J., 8: 403, 1989), das T-Zellen-Antigen OX40 (Mallett et al., EMBO J., 9: 1063, 1990), humanes Fas-Antigen (Itoh et al., Cell, 66: 233, 1991) und der murine 4-1BB-Rezeptor (Kwon et al., Cell. Immunol., 121: 414, 1989 [Kwon et al. I] und Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1963, 1989 [Kwon et al. II]) gehören.
Humanes CD40-Protein (CD40) ist ein Peptid aus 277 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 30.600 und einem 19-Aminosäuren-Sekretionssignalpeptid, welches überwiegend hydrophobe Aminosäuren (Stamenkovic et al.) aufweist. Das Molekulargewicht (ausgenommen der Glykosylierung) des vollständig entwickelten humanen CD40-Proteins ist 28.300. Ein cDNA-codierendes humanes CD40 wurde aus einer cDNA-Bibliothek hergestellt aus der Burkitt-Lymphomzelllinie Raji isoliert. Das von der CD40-cDNA codierte putative Protein enthält eine putative Leadersequenz, eine transmembrane Domäne und eine Reihe weiterer Merkmale, die es mit den gewöhnlichen membrangebundenen Rezeptorproteinen gemeinsam hat. CD40 wird nachweislich auf B-Lymphozyten, Epithelzellen und einigen Karzinomzelllinien exprimiert.
Ein gegen CD40 gerichteter monoklonaler Antikörper (mAb) vermittelt nachweislich verschiedene funktionale Auswirkungen auf humane B-Zellen. Zu diesen Auswirkungen gehören: (a) homotypische Adhäsionen (Gordon et al., J. Immunol., 140: 1425, 1988 [Gordon et al. I]); (b) gesteigerte Zellgröße (Gordon et al. I und Valle et al., Eur. J. Immunol., 19: 1463, 1989); (c) Proliferation von B-Zellen aktiviert mit Anti-IgM, Anti-CD20-mAb, Phorbolester allein (Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4494, 1986; und Paulie et al., J. Immunol., 142: 590, 1989), oder Phorbolester in Kombination mit Interleukin-4 (Gordon et al., Eur. J. Immunol., 17: 1535, 1987 [Gordon et al. II]); und (d) Erzeugung von IgE (Jabara et al., J. Exp. Med., 172: 1861, 1990; Zhang et al., J. Immunol., 146: 1836, 1991) und IgM (Gascan et al., J. Immunol., 147: 8, 1991) aus Interleukin-4 (IL-4) stimulierten T-verminderten Kulturen.
Ein solcher Antikörper, von Banchereau et al., Clin. Immunol. Spectrum, 3: 8, 1991 [Banchereau et al. I] mAb 89 genannt, induziert nachweislich die humane B-Zellen-Proliferation bei einer relativ niedrigen Antikörperkonzentration (30 ng/ml oder etwa 10^–10 M). Die Proliferation dauerte zwei bis drei Wochen und resultierte in einer zehnfachen Expansion der humanen B-Zellen-Population. Die optimale Stimulierung der B-Zellen fand statt, wenn das CD40-Oberflächenmolekül durch IgM quervernetzt wurde. Fab-Fragmente eines anderen Anti-CD40-mAb induzierten lediglich eine schwache proliferative Reaktion. Ferner berichten Banchereau et al., Science, 251: 70, 1991 [Banchereau et al. II], dass ruhende humane B-Zellen in ein Stadium anhaltender Proliferation übergingen, wenn sie sowohl mit einer murinen Fibroblasten-Ltk-Zelllinie, welche mit humanem Fc-Rezeptor transfiziert war, als auch mit einem monoklonalen Antikörper spezifisch für humanes CD40 inkubiert wurden. Banchereau et al. II fanden heraus, dass das Quervernetzen von CD40 für die klonale Expansion von B-Zellen notwendig ist.
CD23 ist ein Niedrigaffinitäts-IgE-Rezeptor, der nachweislich auf den meisten vollständig entwickelten IgM^–/IgD^–B-Zellen exprimiert wird, jedoch nicht auf T-Zellen. CD23 wurde sequenziert und seine Sequenz wurde in Kikutani et al., Cell, 47: 657, 1986 beschrieben. Lösliches CD23 (sCD23) induziert nachweislich eine pyrogene Reaktion bei Kaninchen, und diese Reaktion wurde durch die Verabreichung von humanem IgE aufgehoben (Ghaderi et al., Immunology, 73: 510, 1991). Daher kann CD23 ein geeigneter Marker für die Auswirkungen von löslichem CD40 oder CD40-L sein.
Clark, Tissue Antigens, 35: 33–36, 1990, ist ein Review-Artikel, welcher CD40 und die Tatsache, dass der CD40-Ligand nicht identifiziert wurde, offenbart.
Yellin et al., J. Immunol., 147(10): 3389–3395, 1991 offenbart, dass ein CD4^–-Subklon der leukämischen Jurkat-T-Zelllinie, bekannt als D1.1, die B-Zellen-Aktivierung induziert. Daraus lässt sich schließen, dass Oberflächenstrukturen auf D1.1 diese Wirkung mediieren.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0614374 ist Teil des Standes der Technik gemäß Artikel 54(3) EPC und offenbart einen Antikörper, welcher ein T-Zellen-Oberflächenmolekül auf D1.1, bekannt als T-BAM, sowie ein Immunpräzipitat des Antikörpers und T-BAM erkennt.
Vor der vorliegenden Erfindung war kein Ligand für CD40 bekannt. Dementsprechend besteht Bedarf in der Technik, einen CD40-Liganden (CD40-L) zu identifizieren und zu charakterisieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt bietet die vorliegende Erfindung eine isolierte DNA-Sequenz, welche ein CD40-L-Polypeptid codiert, das an CD40 bindet, ausgewählt aus: (a) DNA, welche die Nukleotide 46 bis einschließlich 828, 196 bis einschließlich 828, 193 bis einschließlich 762 der SEQ. ID. NR. 11 und deren komplementäre Stränge aufweist; (b) DNA, welche die Aminosäuren 1–261 der SEQ. ID. NR. 12 codiert; (c) DNA, welche die Aminosäuren 47–261 der SEQ. ID. NR. 12 codiert; (d) DNA, welche die Aminosäuren 51–261 der SEQ. ID. NR. 12 codiert; (e) DNA, welche ein Fragment von (c) oder (d) codiert, und (f) DNA, welche ein Komplement einer DNA ist, welche unter mäßig stringenten Bedingungen (Vorwaschlösung aus 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von 50°C, 5 × SSC über Nacht) zu der DNA aus (a) hybridisiert.
In einem zweiten Aspekt bietet die vorliegende Erfindung eine isolierte DNA, welche ein CD40-L-Polypeptid codiert, welches an CD40 bindet, ausgewählt aus: (a) DNA, welche die Nukleotide 1 bis einschließlich 783 der SEQ. ID. NR. 1 und ihren komplementären Strang aufweist; (b) DNA, welche die Aminosäuren 1 bis 260 der SEQ. ID. NR. 2 codiert; (c) DNA, welche die Aminosäuren 47 bis 260 der SEQ. ID. NR. 2 codiert; (d) DNA, welche ein Fragment von (b) oder (c) codiert, und (e) DNA, welche ein Komplement einer DNA ist, welche unter mäßig stringenten Bedingungen (Vorwaschlösung aus 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von 50°C, 5 × SSC über Nacht) zu der DNA aus (a) hybridisiert.
Ein neuartiges Zytokin, im Folgenden als „CD40-L" bezeichnet, wurde isoliert und charakterisiert. Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der repräsentativen murinen CD40-L-cDNA ist in SEQ. ID. NR. 1 und 1 offenbart, und die Aminosäuresequenz ist außerdem in SEQ. ID. NR. 2 aufgelistet. Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der repräsentativen humanen CD40-L-cDNA ist in SEQ. ID. NR. 11 und 2 offenbart, und die Aminosäuresequenz ist außerdem in SEQ. ID. NR. 12 aufgelistet. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner weitere CD40-L-Polypeptide, welche von Nukleotidsequenzen codiert werden, welche unter mäßig stringenten oder streng stringenten Bedingungen mit den durch SEQ. ID. NR. 11 (die Codierregion von humanem CD40-L) definierten Sonden, Fragmenten der Sequenz, welche sich von Nukleotid 46 bis Nukleotid 828 von SEQ. ID. NR. 11 erstreckt, oder zu DNA- oder RNA-Sequenzen komplementär zu 2 (SEQ. ID. NR. 11) oder Fragmenten davon hybridisieren. Die Erfindung umfasst ferner Nukleinsäuresequenzen, welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes Polypeptide codieren, welche im Wesentlichen identisch mit den oder im Wesentlichen ähnlich der Polypeptide/n sind, welche von den oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen und zu ihnen komplementären Sequenzen codiert werden.
CD40-L ist ein Membranpolypeptid vom Typ II mit einer extrazellulären Region an seinem C-Terminus, einer transmembranen Region und einer intrazellulären Region an seinem N-Terminus. Eine lösliche Version von murinem CD40-L wurde in Überständen aus EL-4-Zellen gefunden, und die EL-4-Zellen wurden auf Grundlage eines hierin beschriebenen biotinylierten CD40/Fc-Fusionsproteins sortiert. Lösliches CD40-L umfasst eine extrazelluläre Region von CD40-L oder ein Fragment davon. Die Proteinsequenz des murinen CD40-L ist in 1 und SEQ. ID. NR. 2 beschrieben, und humanes CD40-L in 2 und SEQ. ID. NR. 12. Die extrazelluläre Region des murinen CD40-L erstreckt sich von Aminosäure 47 bis Aminosäure 260 in 1 und SEQ. ID. NR. 2, und die des humanen CD40-L von Aminosäure 47 bis Aminosäure 261 in 2 und SEQ. ID. NR. 12. Die biologische Aktivität von CD40 wird durch die Bindung dieses Zytokines mit CD40 vermittelt und beinhaltet die B-Zellen-Proliferation und Induktion der Antikörpersekretion, einschließlich der IgE-Sekretion.
Antisense- oder Sense-Oligonukleotide (Deoxyribonukleotide oder Ribonukleotide), welche einer Sequenz von mindestens etwa 12 Nukleotiden ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von CD40-L oder DNA- oder RNA-Sequenzen komplementär zur Nukleotidsequenz von CD40-L, wie in SEQ. ID. NR. 1 und SEQ. ID. NR. 11 und den 1 und 2 beschrieben, entsprechen, verhindern die Transkription oder Translation von CD40-L-mRNA oder -polypeptiden.
CD40-L-Peptidfragmente, welche einer Proteinsequenz von mindestens 10 Aminosäuren ausgewählt aus der von SEQ. ID. NR. 1 oder SEQ. ID. NR. 11 codierten Aminosäuresequenz entsprechen, welche als Immunogene agieren können, um Antikörper zu erzeugen, welche für das CD40-L-Immunogen spezifisch sind, können als Antigendeterminanten dienen, indem sie für CD40-L spezifische monoklonale Antikörper bereitstellen.
Die Erfindung sieht ferner ein humanes CD40/Fc-Fusionsprotein und ein lösliches CD40-Protein (sCD40) vor, welche die extrazelluläre Region von humanem CD40 aufweisen. Sowohl sCD40 als auch das CD40/Fc-Fusionsprotein können CD40-L oder Anti-CD40-mAb-induzierte B-Zellen-Stimulation, IL-4-induzierte IgE-Stimulation und IL-4-induzierte CD23-Induktion in B-Zellen verhindern.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, welche murinem CD40-L entsprechen. Dieses Protein ist ein Polypeptid vom Typ II, das dessen N-Terminus als seine intrazelluläre Domäne enthält, gefolgt von einer transmembranen Region und einer extrazellulären Domäne am C-Terminus des Polypeptides. Die extrazelluläre Domäne, welche länger als sowohl die intrazelluläre Domäne als auch die transmembrane Region ist, enthält eine potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstelle und zwei potentielle Disulfidbrücken im Hinblick auf vier Cystein (Cys)-Reste.
2 veranschaulicht Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, welche humanem CD40-L entsprechen. Dieses Protein ist ein Polypeptid vom Typ II, das dessen N-Terminus als seine intrazelluläre Domäne enthält, gefolgt von einer transmembranen Region und einer extrazellulären Domäne am C-Terminus des Polypeptides. Die extrazelluläre Domäne, welche länger als sowohl die intrazelluläre Domäne als auch die transmembrane Region ist, enthält eine potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstelle und zwei potentielle Disulfidbrücken im Hinblick auf 5 Cystein (Cys) -Reste.
3 veranschaulicht einen Vergleich der Proteinsequenzen von humanem und murinem CD40-L, welcher 77,7% Homologie auf der Aminosäureebene zeigt.
4 veranschaulicht die Proliferation von T-Zellen-verminderten mononukleären humanen peripheren Blutzellen (PBMC) verursacht durch die Inkubation mit CV1-Zellen transfiziert mit der kompletten Länge muriner CD40-L-cDNA (SEQ. ID. NR. 1), welche gebundenes CD40-L (CD40-L⁺CV1-Zellen) exprimieren, im Vergleich mit CV1-Zellen transfiziert mit einem leeren Vektor (HAVEO), welche kein gebundenes murines CD40-L exprimieren. Die Proliferationsergebnisse an Tag 7 zeigen, dass CD40-L⁺CV1-Zellen die Proliferation von T-Zellen-verminderten PBMC in Gegenwart oder Abwesenheit von Interleukin-4 (IL-4) wesentlich erhöhen.
5 veranschaulicht eine zweite Bestimmung der T-Zellen-depletierten PBMC-Proliferation unter Zugabe von gebundenem murinem CD40-L und 10 ng/ml IL-4. Diese Daten zeigen keine co-mitogene Wirkung von IL-4, aber eine andauernde starke mitogene Wirkung von gebundenem CD40-L.
6 veranschaulicht, dass gebundenes CD40-L die IgE-Sekretion erhöht.
7 veranschaulicht, dass membrangebundenes CD40-L die CD23-Abscheidung in Gegenwart von IL-4 stimuliert.
8 veranschaulicht die Proliferation von murinen Milz-B-Zellen durch membrangebundenes murines CD40-L oder 7A1-Zellen, welches ein Helfer-T-Zellenklon ist.
9 veranschaulicht einen Vergleich von murinen EL40.9-Zellen, einer sortierten Zelllinie, welche auf Grundlage der Expression von murinem CD40-L und T-Zellen 7A1 zum Auslösen einer Antigen-spezifischen Reaktion angezeigt durch Plaque-bildende Zellen (PFC) durch Anti-Schaf rote Blutkörperchen (SCBC) sortiert wurde.
10 veranschaulicht einen Vergleich der B-Zellen-Proliferationsaktivität von membrangebundenem CD40-L und anderen Zelltypen transfiziert mit unterschiedlichen cDNAs. Membrangebundenes CD40-L zeigte wesentlich mehr B-Zellen-Proliferationsaktivität als ein Helferzellenklon oder andere Kontrollzellen.
11 veranschaulicht, dass 7C2-Zellen (ein Helfer-T-Zellenklon) und CV 1-Zellen transfiziert mit muriner CD40-L-cDNA Anti-SRBC-Plaque-bildende Zellen induzieren.
12 veranschaulicht einen Vergleich von zwei Helfer-T-Zellenklonen mit Zellen, welche membrangebundenes CD40-L exprimieren, auf das Induzieren muriner B-Zellen-Proliferation.
13 veranschaulicht die Induktion von Antigen-spezifischen Plaque-bildenden Zellen durch membrangebundenes CD40-L und einen Helfer-T-Zellenklon in Gegenwart oder Abwesenheit von zugefügtem Interleukin-2 (IL-2).
14 zeigt Auswirkungen von membrangebundenem CD40-L beim Stimulieren der B-Zellen-Proliferation und IgE-Sekretion. Die Auswirkungen von membrangebundenem CD40-L wurden vom CD40-Rezeptor, nicht jedoch vom TNF-Rezeptor verhindert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Neuartige Polypeptide, welche als Ligand für murines und humanes CD40 agieren können, wurden isoliert und sequenziert. Insbesondere wurden cDNAs, welche diese Liganden codieren, geklont und sequenziert. Ferner werden Verfahren zur Exprimierung von rekombinanten CD40-L-Polypeptiden bereitgestellt. Zu CD40-L-Polypeptiden gehören weitere Formen von Säugetier-CD40-L, wie Derivate oder Analoga von humanem oder murinem CD40-L. Murines und humanes CD40-L umfassen eine extrazelluläre 214- bzw. 215-Aminosäurenregion am C-Ende des membrangebundenen Polypeptides mit kompletter Länge.
Die extrazelluläre Region enthält die Domäne, welche an CD40 bindet. Murines und humanes CD40-L enthalten ferner eine homologe, hydrophobe, transmembrane 24-Aminosäurenregion, abgegrenzt durch geladene Aminosäuren auf jeder Seite und eine intrazelluläre 22-Aminosäurenregion an ihren N-Termini. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner CD40-L-Polypeptide mit kompletter Länge oder Fragmente davon, welche die gesamte oder einen Teil der extrazellulären Region oder Derivate der extrazellulären Region und Säugetierzellen transfiziert mit einer cDNA, welche murines oder humanes CD40-L codiert, aufweist und humanes oder murines CD40-L als ein membrangebundenes Protein exprimieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst isolierte DNA-Sequenzen, welche CD40-L-Polypeptide codieren sowie DNA- oder RNA-Sequenzen, die komplementär zu solchen isolierten DNA-Sequenzen sind. Die isolierten DNA-Sequenzen und deren Komplemente sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) den Nukleotiden 184 bis einschließlich 828, den Nukleotiden 193 bis einschließlich 828 oder den Nukleotiden 193 bis einschließlich 762 der in 2 (SEQ. ID. NR. 11) dargestellten DNA-Sequenz und deren Komplementen, (b) den DNA-Sequenzen, welche unter mäßig stringenten Bedingungen mit den DNA-Sequenzen aus (a) hybridisieren, und welche ein CD40-L-Polypeptid, Analoga oder Derivate davon codieren, und (c) den DNA-Sequenzen, welche, aufgrund der Degeneration des genetischen Codes CD40-L-Polypeptide codiert, die durch eine der vorgenannten DNA-Sequenzen und deren Komplemente codieren sind. Außerdem beinhaltet die vorliegende Erfindung Vektoren, welche DNA-Sequenzen, die CD40-L-Polypeptide und Analoga codieren, Wirtszellen transfiziert mit solchen Vektoren sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides umfassen, welches das Kultivieren einer solchen Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des Polypeptides fördern, beinhaltet. Die Erfindung bietet außerdem eine DNA wie in SEQ. ID. NR. 5, 6, 7, 9 oder 10 gezeigt, oder ihr RNA-Äquivalent oder ihr Komplement.
Außerdem wird ein gereinigtes CD40-L-Polypeptid bereitgestellt, welches sich an CD40-L bindet, welches ein von der DNA des ersten und zweiten Aspektes codiertes Polypeptid aufweist.
Ein neuartiges, hierin offenbartes Zytokin ist ein Ligand für CD40, ein Rezeptor, welcher ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Superfamilie ist. Daher ist CD40-L sehr wahrscheinlich verantwortlich für das Transduzieren von Signalen via CD40, welches bekanntermaßen zum Beispiel durch B-Lymphozyten exprimiert wird. CD40-L mit der kompletten Länge ist ein membrangebundenes Polypeptid mit einer extrazellulären Region an seinem C-Terminus, einer transmembranen Region und einer intrazellulären Region an ihrem N-Terminus. Eine lösliche Version von CD40-L kann aus der extrazellulären Region oder einem Fragment davon hergestellt werden, und ein lösliches CD40-L wurde in Kulturüberständen von Zellen gefunden, welche eine membrangebundene Version von CD40-L exprimieren. Die Proteinsequenz der extrazellulären Region des murinen CD40-L reicht von Aminosäure 47 bis Aminosäure 260 in 1 und SEQ. ID. NR. 2. Die Proteinsequenz der extrazellulären Region des humanen CD40-L reicht von Aminosäure 47 bis Aminosäure 261 in 2 und SEQ. ID. NR. 12. Die biologische Aktivität von CD40-L wird durch die Bindung an CD40 oder ein Spezies-spezifisches Homolog davon vermittelt und umfasst die Proliferation von B-Zellen und die Induktion der Immunglobulinsekretion aktivierter B-Zellen. CD40-L (einschließlich löslicher monomerer und oligomerer Formen, sowie membrangebundener Formen) können die B-Zellen-Proliferation und Immunglobulinsekretion (außer der IgE-Sekretion) ohne die Gegenwart von hinzugefügtem IL-4 bewirken, im Gegensatz zu Anti-CD40-Antikörpern, welche zum Vermitteln von Aktivität IL-4 und Quervernetzung erfordern.
CD40-L bezieht sich auf eine Gattung von Polypeptiden, welche in der Lage sind, CD40 oder Säugetierhomologe von CD40 zu binden. Wie hierin verwendet beinhaltet der Begriff „CD40-L" lösliche CD40-L-Polypeptide, welchen transmembrane und intrazelluläre Regionen fehlen, Säugetierhomologe von humanem CD40-L, Analoga von humanem oder murinem CD40-L oder Derivate von humanem oder murinem CD40-L.
CD40-L erhält man auch durch Mutationen von Nukleotidsequenzen, welche für ein CD40-L-Polypeptid codieren. Ein CD40-L-Analogon, auf das sich hierin bezogen wird, ist ein Polypeptid, welches im Wesentlichen homolog mit einer Sequenz von humanem oder murinem CD40-L ist, welches allerdings eine Aminosäuresequenz aufweist, welche sich aufgrund einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von der ursprünglichen Sequenz des CD40-L (humane oder murine Spezies) -Polypeptides unterscheidet. Analoga von CD40-L können aus DNA-Konstrukten hergestellt durch Oligonukleotidsynthese und Ligation oder durch Stellen-spezifische Mutageneseverfahren synthetisiert werden.
Die primäre Aminosäurenstruktur von humanem oder murinem CD40-L kann modifiziert werden, um CD40-L-Derivate herzustellen, indem kovalente oder aggregative Konjugate mit anderen chemischen Komponenten wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetylgruppen und ähnlichen gebildet werden, oder indem Aminosäuresequenzmutanten erzeugt werden. Kovalente Derivate von CD40-L werden durch das Verknüpfen bestimmter Funktionsgruppen an CD40-L-Aminosäureseitenketten oder am N-Ende oder C-Ende eines CD40-L-Polypeptides oder der extrazellulären Domäne davon hergestellt. Zu weiteren Derivaten von CD40-L innerhalb des Umfangs dieser Erfindung gehören kovalente oder aggregative Konjugate von CD40-L oder seine Fragmente mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie z. B. durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminalen oder C-Enden-Fusionen. Zum Beispiel kann das Konjugat eine Signal- oder Leader-Polypeptidsequenz an der N-terminalen-Region oder der C-terminalen-Region eines CD40-L-Polypeptides aufweisen, welches co-translational oder post-translational den Transfer des Konjugates von seiner Synthesestelle an eine Stelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand (z. B. den α-Faktor-Leader von Saccharomyces) dirigiert. CD40-L-Polypeptidfusionen können Polypeptide umfassen, welche zur Vereinfachung von Reinigung und Identifikation des CD40-L zugefügt wurden (z. B. Poly-His), oder Fusionen mit anderen Zytokinen, um neuartige polyfunktionale Einheiten bereitzustellen. Zu weiteren Zytokinen gehören zum Beispiel sämtliche Interleukine-1 bis -13, TNF (Tumornekrosefaktor), GM-CSF (Granulozyt-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor), G-CSF (Granulozyt-Kolonie-stimulierender Faktor), MGF (Mastzellen-Wachstumsfaktor), EGF (Epidermalwachstumsfaktor), PDGF (Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor), NGF (Nervenwachstumsfaktor), EPO (Erythropoietin), γ-IFN (Gamma-Interferon), 4-1BB-L (4-1BB-Ligand) und weitere Zytokine, welche Immunzellenwachstum, -differenzierung oder -funktion beeinträchtigen.
Zu Nukleinsäuresequenzen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung gehören DNA- und/oder RNA-Sequenzen, welche unter mäßig stringenten oder streng stringenten Bedingungen mit der Nukleinsequenz aus SEQ. ID. NR. 1 oder SEQ. ID. NR. 11 oder den komplementären Strängen hybridisieren. Mäßig stringente Hybridisierungsbedingungen beziehen sich auf die zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, S. 1.101–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschriebenen Bedingungen. Zu mäßig stringenten Bedingungen, wie in Sambrook et al. definiert, gehören die Verwendung einer Vorwaschlösung von 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von 50°C, 5 × SSC, über Nacht. Streng stringente Bedingungen beinhalten höhere Temperaturen bei Hybridisierung und Waschung.
Die biologische Aktivität von CD40-L kann zum Beispiel durch Kompetition um die Bindung an die Ligandenbindungsdomäne von CD40 bestimmt werden (d. h. kompetitive Bindungsassays). Sowohl murines CD40-L als auch humanes CD40-L binden an humanes CD40. Die Bindungsaffinität von murinem CD40-L (exprimiert auf sortierten murinen EL40.9-Zellen) für humanes CD40 lag bei etwa 1,74 × 10⁹ M^–1. Ähnlich lag die Bindungsaffinität von murinem CD40-L (exprimiert auf unsortierten murinen EL46,1-Zellen) für humanes CD40 bei etwa 2,3 × 10⁹ M^–1. Beide Bindungsaffinitätsmessungen liegen innerhalb eines Bereiches, der typisch für die Zytokin-/Zytokinrezeptor-Bindung ist.
Eine Konfiguration eines kompetitiven Bindungsassays für das CD40-L-Polypeptid verwendet ein radioaktiv markiertes, lösliches murines CD40-L gemäß 1 (SEQ. ID. NR. 1) oder humanes CD40-L gemäß 2 (SEQ. ID. NR. 11) sowie die intakten Zellen, welche CD40 exprimieren (z. B. humane B-Zellen). Anstelle intakter Zellen könnte lösliches CD40 (wie ein CD40/Fc-Fusionsprotein), das an eine feste Phase über eine Protein-A- oder Protein-G-Interaktion gebunden ist, mit der Fc-Region des Fusionsproteins ersetzt werden. Eine zweite Konfiguration eines kompetitiven Bindungsassays verwendet radioaktiv markiertes lösliches CD40 wie ein CD40/Fc-Fusionsprotein und intakte Zellen, welche CD40-L exprimieren. Alternativ kann lösliches CD40-L an eine feste Phase gebunden sein.
Kompetitive Bindungsassays können mit Hilfe von Standardverfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann radioaktiv markiertes murines CD40-L verwendet werden, um mit einem putativen CD40-L-Homolog zu konkurrieren, um so eine Untersuchung auf die Bindungsaktivität gegen oberflächengebundenes CD40 durchzuführen.
Qualitative Ergebnisse erhält man durch kompetitive autoradiographische Plattenbindungsassays, oder es können Scatchard-Plots verwendet werden, um quantitative Ergebnisse zu erzeugen.
Kompetitive Bindungsassays mit intakten Zellen, welche CD40 exprimieren, können mit Hilfe zweier Verfahren durchgeführt werden. In einem ersten Verfahren werden B-Zellen entweder in einer Suspension oder durch Adhäsion an Gewebekulturplatten gezüchtet. Adhärente Zellen können durch Behandlung mit 5 mM EDTA zehn Minuten bei 37°C entfernt werden. In einem zweiten Verfahren können transfizierte COS-Zellen, welche membrangebundenes CD40 exprimieren, verwendet werden. COS-Zellen oder eine andere Säugetierzelle kann mit humaner CD40-cDNA in einem geeigneten Vektor transfiziert werden, um CD40 mit der kompletten Länge mit einer extrazellulären Region außerhalb der Zelle zu exprimieren.
Alternativ kann lösliches CD40 an eine feste Phase wie eine Säulenchromatographiematrix gebunden werden, oder ein Röhrchen oder ein ähnliches Substrat, welches für die Analyse auf die Gegenwart einer nachweisbaren Komponente wie ¹²⁵I geeignet ist. Die Bindung an eine feste Phase kann zum Beispiel erreicht werden, indem ein CD40/Fc-Fusionsprotein erzeugt und dieses an eine Protein-A- oder Protein-G-Oberfläche gebunden wird.
Ein weiteres Mittel zum Messen der biologischen Aktivität von CD40-L und Homologen davon ist der Einsatz von konjugiertem, löslichem CD40 (zum Beispiel ¹²⁵I-CD40/Fc) in Kompetitionsassays ähnlich der oben beschriebenen. In diesem Fall jedoch werden intakte Zellen, welche CD40-L exprimieren, oder lösliches CD40-L gebunden an ein festes Substrat verwendet, um die Kompetition um die Bindung von konjugiertem, löslichem CD40 an CD40-L mit einer Probe zu messen, welche ein putatives CD40-Homolog enthält.
CD40-L kann auch durch das Messen der biologischen Aktivität in einem B-Zellen-Proliferationsassay untersucht werden. Humane B-Zellen erhält man aus humanen Tonsillen durch Reinigung über negative Selektion und Percoll-Dichten-Sedimentation, wie von Defrance et al., J. Immunol., 139: 1135, 1987 beschrieben. Burkitt-Lymphomzelllinien können verwendet werden, um die Zellproliferation als Reaktion auf CD40-L zu messen. Burkitt-Lymphomzelllinien beinhalten zum Beispiel Raji (ATCC CCL 86), Daudi (ATCC CCL 213) und Namalwa (ATCC CRL 1432). Membrangebundenes CD40-L stimulierte die B-Zellen-Proliferation. Oligomeres, vorzugsweise dimeres CD40-L kann die B-Zellen-Proliferation stimulieren. CD40 (Rezeptor) antagonisiert die CD40-L-Proliferation von B-Zellen.
Ein weiteres Assay zur Bestimmung der biologischen Aktivität von CD40-L ist die Messung des von B-Zellen als Reaktion auf die Aktivierung durch CD40-L oder ein Derivat oder Analogon davon produzierten Immunglobulins. Die polyklonale Immunglobulinsekretion kann zum Beispiel durch Inkubation mit 5 × 10⁵ B-Zellen/ml in Kultur für mindestens sieben Tage gemessen werden. Die Immunglobulin- (Ig-) Produktion kann mit einem ELISA-Assay gemessen werden, wie eines beschrieben in Maliszewski et al., J. Immunol., 144: 3028, 1990 [Maliszewski et al. I] oder Maliszewski et al., Eur. J. Immunol., 20: 1735, 1990 [Maliszewski et al. II]. Murine B-Zellen erhält man zum Beispiel aus Mäusen und kultiviert sie gemäß der in Grabstein et al., J. Exp. Med., 163: 1405, 1986 [Grabstein et al. I], Maliszewski et al. I und Maliszewski et al. II beschriebenen Verfahren.
CD40-L kann in einem Bindungsassay verwendet werden, um Zellen nachzuweisen, die CD40 exprimieren. Zum Beispiel können murines CD40-L gemäß 1 (SEQ. ID. NR. 1) oder humanes CD40-L gemäß 2 (SEQ. ID. NR. 11) oder eine extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon an eine nachweisbare Komponente wie ¹²⁵I konjugiert werden. Die radioaktive Markierung mit ¹²⁵I kann mittels einer der Standardmethoden durchgeführt werden, welche ein funktionales ¹²⁵I-CD40-L-Molekül markiert für hohe spezifische Aktivität ergeben. Alternativ kann eine andere nachweisbare Komponente wie ein Enzym, welches eine kolorimetrische oder fluorimetrische Reaktion katalysieren kann, Biotin oder Avidin verwendet werden. Zellen, welche CD40 exprimieren, können mit konjugiertem CD40-L kontaktiert werden. Nach der Inkubation wird ungebundenes konjugiertes CD40-L entfernt und die Bindung wird mittels der nachweisbaren Komponente gemessen.
CD40-L-Polypeptide können als ein lösliches Monomer oder als Oligomere, wie Dimere oder Trimere vorkommen. Oligomere können durch Disulfidbrücken gebunden werden, welche sich zwischen Cysteinresten auf unterschiedlichen CD40-L-Polypeptiden bilden. Sie können mit Hilfe eines Leucinzippers, wie dem Leucinzipper aus SEQ. ID. NR. 17, gebildet werden. Alternativ kann man zwei lösliche CD40-L-Domänen mit einer Linkersequenz wie einer Gly4SerGly5Ser-Linkersequenz oder einer anderen Linkersequenz beschrieben in US-Patentschrift Nr. 5,073,627, durch Bezugnahme hierin eingefügt, verknüpfen. CD40-L-Polypeptide können außerdem durch Fusion des C-Terminus des löslichen CD40-L (extrazelluläre Domäne) an die Fc-Region von IgG1 (zum Beispiel SEQ. ID. NR. 3) hergestellt werden, wie dies für das CD40/Fc-Fusionsprotein beschrieben wurde. Man lässt CD40-L/Fc-Fusionsproteine sich in etwa so anordnen wie schwere Ketten eines Antikörpermoleküls, um divalentes CD40-L zu bilden. Werden Fusionsproteine sowohl mit schweren als auch leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt ist es möglich, ein CD40-L-Oligomer mit bis zu vier extrazellulären CD40-L-Regionen zu bilden.
Fusionsproteine können mit Hilfe konventioneller Verfahren für Enzymschneiden und Ligation von Fragmenten aus gewünschten Sequenzen hergestellt werden. PCR-Verfahren, bei denen synthetische Oligonukleotide zum Einsatz kommen, können verwendet werden, um die gewünschten Fragmente herzustellen und/oder zu amplifizieren. Überlappende synthetische Oligonukleotide welche die gewünschte Sequenz darstellen, können auch verwendet werden, um DNA-Konstrukte herzustellen, welche Fusionsproteine codieren. Fusionsproteine können außerdem CD40-L und zwei oder mehr zusätzliche Sequenzen aufweisen, einschließlich einer Leader- (oder Signalpeptid-) Sequenz, Fc-Region, Linkersequenz oder Sequenzen, welche hochantigene Komponenten codieren, welche ein Mittel zur einfachen Reinigung oder zum schnellen Nachweis eines Fusionsproteins bereitstellen.
Signalpeptide vereinfachen die Sekretion von Proteinen aus Zellen. Ein exemplarisches Signalpeptid sind die aminoterminalen 25-Aminosäuren der Leadersequenz von humanem Interleukin-7 (IL-7; Goodwin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 302, 1989; 2B). Es können auch andere Signalpeptide zum Einsatz kommen. Zum Beispiel können bestimmte Nukleotide in der IL-7-Leadersequenz verändert werden, ohne die Aminosäuresequenz an sich zu verändern. Außerdem können Veränderungen an den Aminosäuren vorgenommen werden, welche die Fähigkeit der IL-7-Sequenz, als eine Leadersequenz zu agieren, nicht beeinträchtigen.
Das Flag^®-Oktapeptid (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) verändert die biologische Aktivität des Fusionsproteins nicht, ist hochantigen und bietet ein Epitop, welches durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper reversibel gebunden ist, wodurch ein schneller Nachweis und einfache Reinigung des exprimierten Fusionsproteins ermöglicht werden. Die Flag^®-Sequenz wird außerdem spezifisch durch Rinderschleimhaut-Enterokinase an dem Rest aufgespaltet, der unmittelbar auf die Asp-Lys-Paarung folgt; Fusionsproteine bedeckt mit diesem Peptid können auch gegen die intrazelluläre Degradation in E. coli resistent sein. Ein muriner monoklonaler Antikörper, welcher die Flag^®-Sequenz bindet, wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer HB 9259 hinterlegt; Verfahren der Verwendung des Antikörpers bei der Reinigung von Fusionsproteinen, welche die Flag^®-Sequenz umfassen, sind in US-Patentschrift Nr. 5,011,912, durch Bezugnahme hierin eingefügt, beschrieben.
Geeignete Fc-Regionen sind als Fc-Regionen definiert, welche an Protein A oder Protein G binden können, oder werden alternativ von einem Antikörper erkannt, der bei der Reinigung oder dem Nachweis eines Fusionsproteins, welches die FC-Region aufweist, verwendet werden kann. Zu bevorzugten Fc-Regionen gehören die Fc-Region von humanem IgG₁ oder murinem IgG₁. Ein Beispiel ist die in SEQ. ID. NR. 3 gezeigte humane IgG₁-Fc-Region; ein weiteres Beispiel ist eine Fc-Region codiert durch cDNA, welche durch PCR aus Oligonukleotidprimeren aus SEQ. ID. NR. 9 und SEQ. ID. NR. 10 mit humaner cDNA als Schablone gewonnen wurde. Es können auch Teile einer geeigneten Fc-Region verwendet werden, zum Beispiel eine Fc-Region von humanem IgG₁, aus der eine Sequenz von Aminosäuren gelöscht wurde, welche für die Bindung an Protein A verantwortlich ist, so dass die daraus resultierende Fc-Region an Protein G, jedoch nicht an Protein A bindet.
Die [Gly₄Ser]₃-Repeat-Sequenz bietet eine Linkersequenz, welche die extrazelluläre Region des CD40-L vom Fc-Teil des Fusionsproteins mit einer Distanz trennt, welche ausreichend ist, um sicherzustellen, dass sich das CD40-L richtig in seine sekundären und tertiären Strukturen faltet. Geeignete Linkersequenzen (1) nehmen eine flexible ausgestreckte Konformation an, (2) zeigen keine Neigung für die Entwicklung einer geordneten sekundären Struktur, welche mit den Funktionsdomänen von Fusionsproteinen interagieren könnte, und (3) haben minimale hydrophobe oder geladene Eigenschaften, welche eine Interaktion mit den funktionalen Proteindomänen fördern könnten. Zu typischen Oberflächenaminosäuren in flexiblen Proteinregionen gehören Gly, Asn und Ser. Von praktisch jeder Permutation von Aminosäuresequenzen, welche Gly, Asn und Ser enthält, würde man erwarten, dass sie die obengenannten Kriterien für eine Linkersequenz erfüllt. Andere nahezu neutrale Aminosäuren, wie Thr und Ala, können auch in der Linkersequenz verwendet werden. Die Länge der Linkersequenz kann ohne eine erhebliche Beeinflussung der biologischen Aktivität des Fusionsproteins variieren. Linkersequenzen sind unnötig, wenn die Proteine die verschmolzen werden nicht-wesentliche N- oder C-Terminale-Aminosäureregionen aufweisen, welche verwendet werden können, um die funktionalen Domänen zu trennen und sterische Interferenz zu verhindern.
CD40-L-Polypeptide können als lösliche Polypeptide vorkommen, welche die extrazelluläre Domäne von CD40-L wie in 1 (SEQ. ID. NR. 1) und 2 (SEQ. ID. NR. 11) gezeigt aufweisen, oder als membrangebundene Polypeptide, welche die extrazelluläre Domäne, eine transmembrane Region und eine kurze intrazelluläre Domäne, wie in 1 (SEQ. ID. NR. 1) und 2 (SEQ. ID. NR. 11) für die murinen bzw. humanen Sequenzen gezeigt, aufweisen. Weiters umfasst die vorliegende Erfindung Oligomere von extrazellulären CD40-L-Domänen oder Fragmente davon, verknüpft durch Disulfidinteraktionen oder exprimiert als Fusionspolymere mit oder ohne Spacer-Aminosäure-Verbindungsgruppen. Zum Beispiel kann ein dimeres CD40-L-Molekül durch eine IgG-Fc-Region-Verbindungsgruppe verbunden sein.
Ohne durch die Theorie gebunden zu sein, können membrangebundenes CD40-L und oligomeres CD40-L Aktivität erreichen, welche die Ig-Bildung und Proliferation von B-Zellen stimuliert, welche bisher nur durch den quervernetzten Anti-CD40-Antikörper in Gegenwart von IL-4 erreicht wurde. Es erscheint weiters wahrscheinlich, dass monomeres lösliches CD40-L, welches nur die extrazelluläre Domäne von CD40-L aufweist und in der Lage ist, an der CD40-Rezeptor zu binden, zum Antagonisieren der Aktivität von membrangebundenem und oligomerem CD40-L und/oder quervernetzten Anti-CD40-Antikörpern dienen wird. Es erscheint ferner wahrscheinlich, dass die Interaktion von membrangebundenem CD40-L mit CD40 die prinzipielle molekulare Interaktion ist, welche für die T-Zellen-Kontakt-abhängige Induktion von B-Zellen-Wachstum und Differenzierung sowohl in die Antigen-spezifische Antikörperproduktion als auch die polyklonale Ig-Sekretion verantwortlich ist. Bezüglich dessen kann eine Säugetierzelle transfiziert mit einer cDNA, welche CD40-L mit kompletter Länge codiert (d. h. sie ist membrangebunden und weist eine intrazelluläre Domäne, eine transmembrane Region und eine extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon auf), T-Zellen in ihrer Fähigkeit zum Induzieren des B-Zellen-Wachstums, Differenzieren und Stimulieren der Antigen-spezifischen Antikörperproduktion nachahmen. Es scheint, dass Aktivitäten von oligomerem löslichem CD40-L, vorzugsweise ein Dimer extrazellulärer Regionen, die biologische Aktivität von membrangebundenem CD40-L nachahmen kann. Weiters kann lösliches monomeres CD40-L (welches die extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon aufweist) an den CD40-Rezeptor binden, um die T-Zellen-Interaktion mit B-Zellen zu verhindern, und besitzt daher eine Aktivität ähnlich der extrazellulären CD40- (Rezeptor) Domäne, welche selbst in monomerer oder in oligomerer Form vorliegen kann. Alternativ kann CD40-L oligomer (bevorzugt ein Dimer) sein, um als ein löslicher Faktor zu agieren, welcher in der Lage ist, B-Zellen-Wachstum, Differenzierung und Stimulation der Antigen-spezifischen Antikörperproduktion zu induzieren. Dementsprechend scheint es, dass membrangebundenes CD40-L und oligomeres CD40-L als CD40-Agonisten agieren, während lösliches (monomeres) CD40-L und lösliches CD40 als CD40-Antagonisten agieren, indem sie CD40-Rezeptorstellen ohne eine signifikante Wandlung des Signals blockieren, oder indem sie die CD40-L-Bindung an CD40-Stellen auf B-Zellen und anderen Zielzellen verhindern.
Sowohl CD40-Agonisten als auch CD40-Antagonisten werden nützliche therapeutische Aktivität zeigen. Zum Beispiel sind CD40-Agonisten (d. h. membrangebundenes CD40-L und oligomeres CD40-L) nützlich als Impfstoffadjuvanzien sowie zum Stimulieren der mAb-Produktion aus Hybridomzellen. CD40-Antagonisten (d. h. CD40-Rezeptor, CD40/Fc und möglicherweise lösliches, monomeres CD40-L) sind nützlich für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, die durch die Gegenwart hoher Niveaus von Anitigen-Antikörper-Komplexen gekennzeichnet sind, wie Allergie, Lupus, Rheumatoidarthritis, Insulin-abhängige Diabetes Mellitus (IDDM), Graft-versus-host-Krankheit (GVHD) und andere. So bietet die Erfindung in weiteren Aspekten: die Verwendung eines löslichen monomeren CD40-L-Polypeptides der Erfindung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Allergie, einer allergischen Reaktion, Lupus, Rheumatoidarthritis oder der Graft-versus-host-Krankheit; ein Impfstoff, welcher ein Oligomer des CD40-L-Polypeptides der Erfindung als ein Adjuvans aufweist; eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Polypeptid oder ein Oligomer der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff aufweist; sowie ein Verfahren zum Stimulieren von Hybridomzellen zur Steigerung der Sekretion monoklonaler Antikörper, welches die Verabreichung einer effektiven Menge eines Oligomers des CD40-L-Polypeptides der Erfindung an die Hybridomzellen beinhaltet.
Die IgE-Sekretion aus humanen B-Zellen kann durch IL-4 in Gegenwart von T-Zellen induziert werden (Vercelli et al., J. Exp. Med., 169: 1295, 1989). Ferner kann die IgE-Produktion aus T-Zellen-verminderten PBM (mononukleären peripheren Blutzellen) durch Zugabe eines Anti-CD40-mAb induziert werden (Jabara et al., J. Exp. Med., 172: 1861, 1990 und Zhang et al., J. Immunol., 146: 1836, 1991). Ein Verfahren zur Verhinderung der IgE-Produktion aus aktivierten B-Zellen, aktiviert durch IL-4 in der Gegenwart von T-Zellen oder durch CD40-L (bevorzugt membrangebundenes CD40-L), umfasst die Verabreichung einer effektiven Menge eines CD40/Fc-Fusionsproteins, wie hierin beschrieben, oder eines löslichen CD40 codiert durch die cDNA-Sequenz beschrieben in SEQ. ID. NR. 3. Ähnlich können CD40-Rezeptoren und möglicherweise auch lösliches CD40-L (nur Monomer) auch die Sekretion anderer Antikörperisotypen blockieren.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet ferner CD40-L-Polypeptide mit oder ohne zugehörige Nativ-Pattern-Glykosylierung. CD40-L exprimiert in Hefe- oder Säugetierexpressionssystemen (z. B. COS-7-Zellen) kann einem nativen CD40-L-Polypeptid im Molekulargewicht und dem Glykosylierungsmuster je nach Auswahl der Expressionssystems ähnlich sein oder sich signifikant davon unterscheiden. Die Expression von CD40-L-Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen wie E. coli bietet nichtglykosylierte Moleküle.
Es können DNA-Konstrukte, welche verschiedene Zusätze oder Substitutionen von Aminosäureresten oder -sequenzen, oder Deletionen von Endresten oder internen Resten oder Sequenzen, welche für die biologische Aktivität oder Bindung nicht notwendig sind, codieren hergestellt werden. Zum Beispiel kann die extrazelluläre CD40-L-N-Glykosylierungsstelle modifiziert werden, um die Glykosylierung auszuschließen, während die Expression eines homogenen Analogons mit reduzierten Kohlenhydraten mit Hilfe von Hefeexpressionssystemen zugelassen wird. N-Glykosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind gekennzeichnet durch ein Aminosäurentriplet Asn-X-Y, wobei X jede Aminosäure außer Pro und Y Ser oder Thr ist. Geeignete Modifikationen in die Nukleotidsequenz, welche dieses Triplet codiert, führen zu Substitutionen, Additionen oder Deletionen, welche die Anlagerung von Kohlehydratresten an der Asn-Seitenkette verhindern. In einem weiteren Beispiel können Sequenzen, welche Cys-Reste codieren, so verändert werden, dass die Cys-Reste entfernt oder mit anderen Aminosäuren ersetzt werden, was die Bildung von inkorrekten intramolekularen Disulfidbrücken bei der Renaturierung verhindert. Humanes CD40-L umfasst fünf Cys-Reste in seiner extrazellulären Domäne. So kann zumindest einer der fünf Cys-Reste gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht oder entfernt werden, ohne die Protein-Tertiärstruktur oder Disulfidbrückenbildung zu beeinflussen.
Weitere Ansätze zur Mutagenese beinhalten die Modifikation von Sequenzen, welche zweibasige Aminosäurereste codieren, zur Verbesserung der Expression in Hefesystemen, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorliegt. Durch das Entfernen von Sequenzen, welche Endreste oder interne Reste oder Sequenzen codieren, können Untereinheiten eines CD40-L-Polypeptides hergestellt werden.
CD40-L-Polypeptide werden durch Mehrfach-Exon-Gene codiert. Die vorliegende Erfindung beinhaltet ferner alternative mRNA-Konstrukte, welche verschiedenen mRNA-Splicing Ereignissen nach der Transkription zugeschrieben werden können, und welche sich identische oder ähnliche Regionen mit den hierin offenbarten cDNAs teilen.
Antisense- oder Sense-Oligonukleotide umfassen eine Einzelstrang-Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA), welche in der Lage ist, sich an Ziel-CD40-L-mRNA- (Sense) oder CD40-L-DNA- (Antisense) Sequenzen zu binden. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide können ein Fragment aus SEQ. ID. NR. 1 oder SEQ. ID. NR. 11 umfassen oder ein DNA- oder RNA-Komplement aus SEQ. ID. NR. 1 oder SEQ. ID. NR. 11. Ein solches Fragment umfasst mindestens etwa 14 Nukleotide. Bevorzugt umfasst ein solches Fragment von etwa 14 bis etwa 30 Nukleotide. Die Fähigkeit, ein Antisense- oder ein Sense-Oligonukleotid auf Grundlage einer cDNA-Sequenz für CD40-L zu erzeugen, ist zum Beispiel in Stein and Cohen, Cancer Res., 48: 2659, 1988 und van der Krol et al., BioTechniques, 6: 958, 1988 beschrieben.
Die Bindung von Antisense- oder Sense-Oligonukleotiden an Ziel-Nukleinsäuresequenzen führt zu einer Bildung von Duplexen, welche die Translation (RNA) oder Transkription (DNA) durch eines von mehreren Mitteln, einschließlich der gesteigerten Degradation der Duplexe, der vorzeitigen Beendung von Transkription oder Translation, oder durch andere Mittel blockieren. Zu geeigneten Polymerasepromotoren gehören Promotoren für jede RNA-Polymerase oder Promotoren für jede DNA-Polymerase. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide umfassen ferner Oligonukleotide, welche modifizierte Zucker-Phosphodiester-Hauptketten (oder andere Zucker-Verknüpfungen, wie die in WO 91/06629 beschriebenen) aufweisen, und wobei solche Zuckerverknüpfungen resistent gegen endogene Nukleasen sind. Solche Oligonukleotide mit resistenten Zucker-Verknüpfungen sind in vivo stabil (d. h. in der Lage sich der enzymatischen Degradation zu widersetzen, behalten aber ihre Sequenzspezifität bei, damit sie in der Lage sind, sich an Zielnukleotidsequenzen zu binden. Zu weiteren Beispielen von Sense- oder Antisense-Oligonukleotiden gehören die Oligonukleotide, welche kovalent mit organischen Komponenten wie den in WO 90/10448 beschriebenen verknüpft sind, oder anderen Komponenten, welche die Affinität des Oligonukleotides für eine Zielnukleotidsequenz wie Poly- (L-Lysin) erhöhen. Weiters können interkalierende Agenzien wie Ellipticin und alkylierende Agenzien oder Metallkomplexe an Sense- oder Antisense-Oligonukleotiden angelagert werden, um die Bindungsspezifitäten des Antisense- oder Sense-Oligonukleotides für die Zielnukleotidsequenz zu modifizieren. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide können mittels jedes Gentransferverfahrens, einschließlich zum Beispiel CaPO₄-mediierte DNA-Transfektion, Elektroporation oder andere Gentransfervektoren wie das Epstein-Barr-Virus in eine Zelle, welche die Zielnukleinsäuresequenz enthält, eingefügt werden. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide werden bevorzugt durch Insertion des Antisense- oder Sense-Oligonukleotides in einen geeigneten retroviralen Vektor und anschließendes Kontaktieren der Zelle mit dem Retrovirusvektor, welcher die eingefügte Sequenz enthält, entweder in vivo oder ex vivo in eine Zelle eingefügt, welche die Zielnukleinsäuresequenz enthält. Zu geeigneten retroviralen Vektoren gehören, jedoch nicht darauf beschränkt, das murine Retrovirus M-MuLV, N2 (ein Retrovirus abgeleitet aus M-MuLV), oder die Doppelkopievektoren mit der Bezeichnung DCT5A, DCT5B und DCT5C (siehe PCT-Anmeldung US 90/02656). Alternativ können andere Promotorsequenzen verwendet werden, um das Oligonukleotid zu exprimieren.
Sense- oder Antisense-Oligonukleotide können auch durch die Bildung eines Konjugates mit einem Ligandenbindungsmolekül wie in WO 91/04753 beschrieben in eine Zelle, welche die Zielnukleotidsequenz enthält, eingebracht werden. Zu geeigneten Ligandenbindungsmolekülen gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Zytokine oder andere Liganden, welche an Zelloberflächenrezeptoren binden. Bevorzugt beeinträchtigt die Konjugation des Ligandenbindungsmoleküls die Fähigkeit des Ligandenbindungsmoleküls nicht wesentlich, an sein/en entsprechendes/n Molekül oder Rezeptor zu binden oder den Eintritt des Sense- oder Antisense-Oligonukleotides oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren.
Alternativ kann ein Sense- oder Antisense-Oligonukleotid durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipid-Komplexes, wie in WO 90/10448 beschrieben, in eine Zelle, welche die Zielnukleotidsequenz aufweist, eingebracht werden. Der Sense- oder Antisense-Oligonukleotid-Lipid-Komplex wird bevorzugt innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Die Sequenz muriner CD40-L-cDNA erhielt man durch direkte Expressionsverfahren. Die Sequenz von humanem CD40-L erhielt man durch speziesübergreifende Hybridisierungsverfahren unter Verwendung der murinen CD40-L-cDNA als Sonde.
Es wurde murines CD40-L geklont, indem zuerst ein Klon der extrazellulären Region von humanem CD40 (der Rezeptor) durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -Verfahren gewonnen wurde, bei denen Primer auf Grundlage einer von Stamenkovic et al. veröffentlichten Sequenz (SEQ. ID. NR. 4) verwendet wurden. Ein stromaufwärtiger Oligonukleotidprimer 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (SEQ. ID. NR. 5) fügt eine Sal-1-Stelle stromaufwärts von einem Initiator-Methionin von CD40 ein und ein stromabwärtiger Oligonukleotidprimer 5'-CCGTCGACGTCTAGAGCCGATCCTGGGG-3' (SEQ. ID. NR. 6) fügt ein Terminationscodon nach Aminosäure 192 von CD40 ein, gefolgt von Xba-1- und Sal-1-Stellen. Die amplifizierte cDNA wurde mit Sal-1 digeriert und in pDC406 geklont (McMahan et al., EMBO J., 10: 2821, 1991), um pDC406/s-CD40 herzustellen.
Ein zweites CD40-Rezeptorfragment (SEQ. ID. NR. 4) erhielt man durch PCR-Verfahren für die Fusion an die Fc-Domäne von humanem IgG1 (SEQ. ID. NR. 3). Kurz, der stromaufwärtige Oligonukleotidprimer (SEQ. ID. NR. 5) und die Fusionsschablone (SEQ. ID. NR. 4) waren die gleichen wie zuvor. Der stromabwärtige Oligonukleotidprimer war 5'- ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (SEQ. ID. NR. 7), welcher die Aminosäuren Tyr Val Glu Pro Arg (SEQ. ID. NR. 8) nach Aminosäure 193 von CD40 einfügt. Glu und Pro sind die ersten beiden Aminosäuren einer Hingeregion von humanem IgG1 und ihnen folgt eine Bgl-II-Restriktionsstelle. Die Bgl-II-Restriktionsstelle wurde verwendet, um die extrazelluläre Domäne des CD40 mit dem Rest der humanen IgG1-Fc-Region zu verschmelzen.
Weitere Fusionsproteine, welche Ligandenbindungsdomänen aus anderen Rezeptoren aufweisen, können durch die Erzeugung einer DNA-Sequenz für die Ligandenbindungsdomäne eines Rezeptors und das Verschmelzen dieser Sequenz an eine DNA-Sequenz hergestellt werden, welche eine Fc-Region eines Antikörpermoleküls codiert, welches an Protein A oder Protein G bindet, oder ein anderes Polypeptid, welches zu Affinitätsreinigung in der Lage ist, zum Beispiel Avidin oder Streptavidin. Das daraus resultierende Genkonstrukt kann in Säugetierzellen eingefügt werden, um dort transient ein Fusionsprotein zu exprimieren. Rezeptor/Fc-Fusionsproteine können durch Protein-A- oder Protein-G-Affinitätsreinigung gereinigt werden. Rezeptor/Avidin-Fusionsproteine können durch Biotinaffinitätschromatographie gereinigt werden. Das Fusionsprotein kann später durch Eluieren mit hochprozentiger Salzlösung oder einem anderen geeigneten Puffer aus der Säule entfernt werden.
Wir erhielten eine cDNA, welche eine humane IgG1-Fc-Region codiert, durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von cDNA aus humanen Zellen als Matrize und eines stromaufwärtigen Oligonukleotidprimers 5'-TATTAATCATTCAGTAGGGCCCAGATCTTGTGACAAAACTCAC-3' (SEQ. ID. NR. 9) und eines stromabwärtigen Oligonukleotidprimers 5'-GCCAGCTTAACTAGTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA-3' (SEQ. ID. NR. 10). Die PCR-amplifizierte cDNA fügte eine Bgl-II-Stelle in der Nähe des Beginns der Hingeregion ein, welche verwendet wurde, um die extrazelluläre CD40-Domäne zu ligieren und eine sCD40/Fc-Fusions-cDNA herzustellen, welche in pDC406 ligiert wurde, um pDC406/CD40/Fc herzustellen. Weitere geeignete Fc-Regionen sind definiert als jede Region, welche mit hoher Affinität an Protein A oder Protein G binden kann, und beinhaltet die Fc-Region von humanem IgG1 oder murinem IgG1.
Ein Beispiel ist die in SEQ. ID. NR. 3 gezeigte humane IgG1-Fc-Region oder die durch PCR aus den Oligonukleotidprimeren aus SEQ. ID. NR. 9 und SEQ. ID. NR. 10 mit humaner cDNA als Matrize gewonnene cDNA.
Rezeptor/Fc-Fusionsmoleküle werden bevorzugt in rekombinanten Säugetierzellkulturen synthetisiert, weil sie im Allgemeinen zu groß und zu komplex sind, um durch prokaryotische Expressionsverfahren synthetisiert zu werden. Zu Beispielen geeigneter Säugetierzellen für die Expression eines Rezeptor/Fc-Fusionsproteins gehören CV-1-Zellen (ATCC CCL 70) und COS-7-Zellen (ATCC CRL 1651), beide abgeleitet aus Affennieren.
Das DNA-Konstrukt pDC406/CD40/Fc wurde in die Affennierenzelllinie CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) transfiziert. Das pDC406-Plasmid beinhaltet regulatorische Sequenzen, welche aus SV40, dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) und dem Epstein-Barr-Virus (EBV) abgeleitet sind. Die CV-1/EBNA-Zelllinie wurde durch Transfektion der CV-1-Zelllinie mit einem Gen, welches das Epstein-Barr-Virus-Kernantigen-1 (EBNA-1) codiert, abgeleitet und exprimiert konstitutiv EBNA-1 stimuliert vom humanen CMV-Immediate-Early-Enhancer/Promotor. Ein EBNA-1-Gen ermöglicht die episomale Replikation von Expressionsvektoren wie pDC406, welche den EBV-Replikationsursprung enthalten.
Transfektanten, welche das CD40/Fc-Fusionsprotein exprimieren, werden zunächst mit Hilfe von Dot-Blots oder Western-Blots identifiziert. Die Überstände werden dann einem Dot-Blot oder einer Gel-Elektrophorese unterzogen, gefolgt vom Transfer des elektrophoresierten Proteins zur Bindung an G28-5-mAb (ein Antikörper, welcher an den humanen CD40-Rezeptor bindet). Die geblotteten Proteine wurden dann mit radioaktiv markiertem ¹²⁵I-Protein-A inkubiert, gewaschen, um ungebundenen Marker zu entfernen, und auf die Expression von Fc untersucht. Der monoklonale Antikörper G28-5 wurde gemäß Clark et al., oben erzeugt.
Sobald Zellen, welche das Fusionskonstrukt exprimieren, identifiziert worden waren, wurden in großem Maßstab Kulturen transfizierter Zellen gezüchtet, um Überstand aus Zellen, welche CD40/Fc exprimieren, zu sammeln. Das CD40/Fc-Fusionsprotein in Überstandsfluid wurde mittels Affinitätsreinigung gereinigt. Kurz, ein Liter Kulturüberstand, welcher CD40/Fc-Fusionsprotein enthält, wurde durch das Filtern von Säugetierzellüberständen (z. B. in einem 0,45 μ-Filter) und das Aufbringen des Filtrates auf eine Protein-A/G-Antikörper-Affinitätssäule (Schleicher and Schuell, Keene, NH) bei 4°C bei einer Fließgeschwindigkeit von 80 ml/h für eine 1,5 cm × 12,0 cm Säule gereinigt. Die Säule wurde mit 0,5 M NaCl in PBS gewaschen, bis im Waschpuffer kein freies Protein mehr nachweisbar war. Abschließend wurde die Säule mit PBS gewaschen. Gebundenes Fusionsprotein wurde mit 25 mM Citratpuffer, pH 2,8 aus der Säule eluiert und mit 500 mM Hepespuffer, pH 9,1 auf pH 7 gebracht. Silbergefärbte SDS-Gele des eluierten CD40/Fc-Fusionsproteins zeigten es zu > 98% rein.
Lösliches CD40 (sCD40) und CD40/Fc-Fusionsproteine wurden wie hierin beschrieben hergestellt. Die Überstände wurden durch eine G28-5- (Anti-CD40-mAb) Affinitätssäule gereinigt, um mittels der Affinität sCD40, welches von den transfizierten CV-1/EBNA-Zellen exprimiert wird zu reinigen. Proteinenthaltende Fraktionen wurden gepooled und Aliquots für G28-5-Bindungsassays und Analyse durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese) in Gegenwart von 1 mM Dithiothreitol als Reduktionsmittel entfernt. Eine einzelne Bande wurde festgestellt mit einem Molekulargewicht von 28.100 Dalton. In Abwesenheit eines Reduktionsmittels zeigte die SDS-PAGE-Analyse von sCD40 zwei Banden, eine größere Bande mit einem Molekulargewicht von 56.000 und eine kleinere Bande mit einem Molekulargewicht von 28.000. Das Bandenmuster zeigt, dass der Hauptteil des sCD40 als ein Disulfid-verbrücktes Homodimer in Lösung vorkommt. Die 28.000 Bande ist ein freies Monomer.
CD40-Proteine wurden durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Die Proteinkonzentrationen in den Proben wurden mittels eines Mikro-BCA-Assays (Pierce) mit ultrareinem Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Reinheit von löslichem CD40 und die Proteinkonzentration wurden durch Aminosäureanalyse bestätigt. Gereinigtes lösliches CD40 wurde auf PVDF-Papier absorbiert und das Papier für die N-terminale-Proteinsequenzierung gemäß der Anleitung des Herstellers der automatisierten Edman-Degradation auf einem Applied Biosystems Proteinsequenzer vom Model 477A unterzogen. Dieses Verfahren überprüfte die Proteinsequenz von sCD40.
Lösliches CD40 und CD40/Fc-Fusionsprotein waren in der Lage, humane B-Zellen-Reaktionen in Abwesenheit von Anti-CD40-mAb (G28-5) zu modulieren. Gereinigte Tonsillen-B-Zellen wurden mit Anti-IgM und humanem IL-4 kultiviert, und es wurde entweder sCD40 oder CD40/Fc-Fusionsprotein zugefügt. Keine der Formen von CD40 hatte eine inhibitorische Wirkung auf die B-Zellen-Proliferation (gemessen durch tritiierte Thymidininkorporation). Der IL-4-Rezeptor verhinderte im Gegensatz dazu die IL-4-induzierte B-Zellen-Proliferation in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise.
Lösliches CD40 und CD40/Fc wurden auf ihre Fähigkeit getestet, IL-4-induzierte IgE-Sekretion in einem 2-Donor-MLC (gemischte Lymphozytenkultur) -System zu verhindern. Bei drei Experimenten reduzierte sich das Niveau der IgE-Produktion, wenn die Konzentration von CD40 erhöht wurde. Lösliches CD40, zugefügt mit einer Konzentration von 10 μg/ml, war in der Lage, die IgE-Sekretion in diesem Allergiemodell komplett zu verhindern. Ferner hatte CD40/Fc ähnliche Auswirkungen wie sein lösliches Gegenstück. Die Zugabe eines IL-7-Rezeptor-Fc-Fusionsproteins (hergestellt durch ähnliche Verfahren mit einer veröffentlichten IL-7-Rezeptorsequenz) allerdings beeinträchtigte die Sekretion von IgE in diesem Modell nicht.
Außerdem wurden in der gleichen MLC die Niveaus von CD23 als Reaktion auf sCD40 oder CD40/Fc-Fusionsproteine gemessen. Lösliches CD40 erzeugte am Tag 6 eine kleine, aber reproduzierbare Verringerung beim sCD23-Level im Vergleich zu Kulturen, die nur mit IL-4 allein stimuliert wurden, jedoch wurde in den gleichen Kulturen am Tag 12 eine stärkere inhibitorische Wirkung deutlich. Die Induktion von löslichem CD23 durch IL-4-stimulierte, T-verminderte PBM (periphere Blutmakrophagen) E^–-Zellen wurde durch die Zugabe von sCD40 ähnlich beeinträchtigt, indem eine kleine Verringerung bei den sCD23-Levels am Tag 6 und eine deutlichere Hemmung am Tag 12 verursacht wurde. In jedem Kultursystem waren die Ergebnisse mit dem CD40/Fc-Fusionsprotein im Wesentlichen die gleichen wie mit sCD40.
Bei einem Versuch eine cDNA für ein CD40-L zu isolieren wurde gereinigtes CD40/Fc-Fusionsprotein mit ¹²⁵I unter Verwendung eines handelsüblichen Festphasenagens (IODO-GEN, Pierce) radiojodiert. Bei diesem Verfahren wurden 5 μg IODO-GEN auf dem Boden eines 10 × 75 mm Glaskolbens plattiert und für zwanzig Minuten bei 4°C mit 75 μl 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4 und 20 μl (2 mCi) Na ¹²⁵I inkubiert. Die Lösung wurde dann in einen zweiten Glaskolben übertragen, welcher 5 μg CD40/Fc in 45 μl PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) enthielt und diese Reaktionsmischung wurde für zwanzig Minuten bei 4 °C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde durch Gelfiltration auf einem 2 ml Austauschervolumen Sephadex^® G-25 (Sigma) fraktioniert und dann in RPMI 1640 Medium, welches 2,5% (v/v) Rinderserumalbumin (BSA), 0,2% (v/v) Natriumazid und 20 mM Hepes, pH 7,4 Bindungsmedium enthielt, äquilibriert. Der abschließende Pool von ¹²⁵I-CD40/Fc wurde auf eine Arbeitsstammlösung von 1 × 10^–7 in Bindungsmedium verdünnt und bei 4°C für bis zu einem Monat ohne einen nachweisbaren Verlust der Rezeptorbindungsaktivität gelagert.
Eine cDNA-Bibliothek wurde aus einer EL4-Zelllinie sortiert durch FACS (Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung) auf der Grundlage der Bindung eines biotinylierten CD40/Fc-Fusionsproteins hergestellt. Die Zellen wurden fünfmal sortiert bis sich bei der Fluoreszenzintensität durch die sortierten EL-4-Zellen aufgrund der Expression eines Liganden für CD40 eine signifikante Verschiebung zeigte. Die fünffach sortierten Zellen wurden EL-40.5-Zellen genannt und diese Zellen wurden zum Zweck der Erzeugung einer cDNA-Bibliothek aus EL-40.5-mRNA kultiviert. Kurz, cDNA wurde synthetisiert, in einen leeren pDC406-Vektor eingefügt und in E. coli transformiert. Die Transformanten wurden gepooled und die DNA aus den Pools wurde isoliert und in CV1-EBNA-Zellen transfiziert, um eine Expressionsklonbibliothek zu erzeugen. Transfizierte CV1-EBNA-Zellen wurden drei Tage auf Objektträgern kultiviert, um die transiente Expression von CD40-L zuzulassen. Die Objektträger, welche die transfizierten Zellen enthielten, wurden dann mit radiojodiertem CD40/Fc inkubiert, gewaschen, um ungebundenes CD40/Fc zu entfernen, und mit Gluteraldehyd fixiert. Die fixierten Objektträger wurden in flüssige fotografische Emulsion getaucht und der Dunkelheit ausgesetzt. Nach der Entwicklung wurden die Objektträger einzeln mit einem Mikroskop überprüft und durch die Gegenwart von autoradiographischen Silberkörnchen gegen einen hellen Hintergrund wurden Zellen, welche CD40-L exprimieren, identifiziert.
Die Expressionsklonbibliothek aus EL-40.5-Zellen wurde untersucht und ein Pool, welcher etwa 2000 einzelne Klone enthielt, wurde als positiv für die Bindung von ¹²⁵I-markiertem CD40/Fc-Fusionsprotein identifiziert. Dieser Pool wurde in kleinere Pools von etwa 200 Kolonien aufgeteilt. Die kleineren Pools wurden wie oben beschrieben untersucht. Einer der kleineren Pools war positiv für CD40-L.
Es wurde ein einzelner Klon isoliert und durch Standardverfahren sequenziert, um eine cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von murinem CD40-L wie in 1 und SEQ. ID. NR. 1 gezeigt bereitzustellen.
Die humane homologe CD40-L-cDNA fand man durch speziesübergreifende Hybridisierungsverfahren. Kurz, eine humane periphere Blutlymphozyten- (PBL) cDNA-Bibliothek wurde aus peripheren Blutlymphozyten hergestellt, die sechs Tage mit OKT3-Antikörper (ATCC, Rockville MD), welcher an CD3 (10 ng/ml) und Interleukin-2 (IL-2, 10 ng/ml) bindet, behandelt ist. Die PBL-Zellen wurden gewaschen und dann 4 Stunden mit 10 ng/ml PMA (Phorbolmyristatacetat, Sigma St. Louis) und 500 ng/ml Ionomycin (Calbiochem) stimuliert. Boten-RNA wurde aus stimulierten PBL-Zellen isoliert, cDNA gebildet, und cDNA wurde in Eco-R1-Linker ligiert. Ligierte cDNA wurde gemäß der Herstelleranleitung in die Eco-R1-Stelle des λgt10-Phagen-Klonvehikels (Gigapak^® Stratagene, San Diego, CA) eingefügt. Phage wurde amplifiziert, mit Dichten von etwa 20.000 Phagen pro 15 cm Platte plattiert, und es wurden Phagen-Lifts durchgeführt, wie in Maniatis et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, Seiten 316–328 beschrieben. Eine murine Probe wurde hergestellt, welche der Codierregion von murinem CD40-L von Nukleotid 13 bis Nukleotid 793 der SEQ. ID. NR. 1 und 1 entspricht. Diese Sonde wurde unter mäßig stringenten und streng stringenten Bedingungen mit den PBL-Bibliotheks-Phagen-Lifts hybridisiert. Kurz, die Hybridisierungsbedingungen waren 6 × SSC, 1 × Denhardt's Lösung, 2 mM EDTA, 0,5% Np40 (Nonidet P-40-Detergent) bei 63°C über Nacht. Dem folgte eine Waschung in 3 × SSC, 0,1% SDS drei Stunden bei 55°C, gefolgt von einer Röntgenfilmaussetzung über Nacht. Positive Plaques wurden mit einer Häufigkeit von etwa 1 pro 1000 Plaques identifiziert. Positive Plaques wurden zweifach gereinigt und aus amplifizierten Kulturen wurde cDNA hergestellt.
Die hierin offenbarten murinen oder humanen CD40-L-cDNA-Sequenzen können verwendet werden, um durch speziesübergreifende Hybridisierungsverfahren cDNAs zu erhalten, welche andere Säugetierhomologe von murinem oder humanem CD40-L codieren. Kurz, eine Oligonukleotidsonde wird aus der Nukleotidsequenz der extrazellulären Region von murinem CD40-L, wie in 1 (SEQ. ID. NR. 1) beschrieben, oder humanem CD40-L, wie in 2 (SEQ. ID. NR. 11) beschrieben, erzeugt. Diese Sonde kann durch Standardverfahren wie die in Maniatis et al. oben beschriebenen hergestellt werden. Die murine oder humane Sonde wird verwendet, um eine Säugetier-cDNA-Bibliothek oder Genombibliothek unter mäßig stringenten Bedingungen zu untersuchen. Zu Beispielen von Säugetier-cDNA- oder Genombibliotheken gehören, für cDNA, eine Bibliothek hergestellt aus den peripheren Blutzellen des Säugetiers. Alternativ können verschiedene cDNA-Bibliotheken oder mRNAs isoliert aus verschiedenen Zelllinien durch Northern Hybridisierung untersucht werden, um eine geeignete Quelle von Säugetier-CD40-L-DNA oder -mRNA zu bestimmen.
Zu rekombinanten Expressionsvektoren für die Expression von CD40-L durch rekombinante DNA-Verfahren gehören eine CD40-L-DNA-Sequenz, welche ein synthetisches oder cDNA-abgeleitetes DNA-Fragment umfasst, welches ein CD40-L-Polypeptid codiert, welches wirkungsmäßig mit einer geeigneten Transkriptions- oder Translations-Regulationsnukleotidsequenz, wie einer aus einem Säugetier-, Mikroben-, Viren- oder Insektengen abgeleiteten, verbunden ist. Zu Beispielen von Regulationssequenzen gehören Sequenzen, welche eine regulatorische Rolle bei der Genexpression spielen (z. B. ein Transkriptionspromotor oder Enhancer), gegebenenfalls eine Operatorsequenz zur Steuerung der Transkription, eine Sequenz, welche eine mRNA-Ribosomenbindungsstelle codiert, sowie geeignete Sequenzen, welche Transkriptions- und Translationsstart und -beendigung steuern. Nukleotidsequenzen sind wirkungsmäßig verbunden, wenn die Regulationssequenz funktional mit der CD40-L-DNA-Sequenz verwandt ist. So ist eine Promotornukleotidsequenz wirkungsmäßig mit einer CD40-L-DNA-Sequenz verbunden, wenn die Promotornukleotidsequenz die Transkription der CD40-L-DNA-Sequenz steuert. Weiters kann eine Ribosomenbindungsstelle wirkungsmäßig mit einer Sequenz für ein CD40-L-Polypeptid verbunden sein, wenn die Ribosomenbindungsstelle innerhalb des Vektors positioniert ist, um die Translation zu unterstützen. Außerdem können Sequenzen, welche Signalpeptide codieren, in Expressionsvektoren eingelagert werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) wirkungsmäßig mit einer CD40-L-DNA-Sequenz verbunden sein. Das Signalpeptid wird als eine Vorläufer-Aminosäuresequenz exprimiert, welche verbesserte extrazelluläre Sekretion von translatiertem Fusionspolypeptid durch eine Hefe-Wirtszelle ermöglicht.
Zu geeigneten Wirtszellen für die Expression von CD40-L-Polypeptiden gehören Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen. Prokaryoten beinhalten Gram-negative oder Gram-positive Organismen, zum Beispiel E. coli oder Bacilli. Zu geeigneten prokaryotischen Wirtszellen für die Transformation gehören zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, salmonella typhimurium und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus. Zu höheren eukaryotischen Zellen gehören etablierte Zelllinien mit Säugetierursprung. Zellfreie Translationssysteme können auch eingesetzt werden, um CD40-L-Polypeptide mit Hilfe von RNAs herzustellen, welche von hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind. Geeignete Klon- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit Bakterien-, Pilz-, Hefe- oder Säugetierzellwirten sind zum Beispiel in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New. York, (1985) beschrieben.
In einer prokaryotischen Wirtszelle wie E. coli kann ein CD40-L-Polypeptid oder ein Analogon einen N-terminalen-Methioninrest beinhalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptides in der prokaryotischen Wirtszelle zu vereinfachen. Das N-terminale-Met kann von dem exprimierten rekombinanten CD40-L-Polypeptid abgespalten werden. Prokaryotische Wirtszellen können für die Expression von CD40-L-Polypeptiden verwendet werden, welche keine extensive proteolytische oder Disulfidbehandlung erfordern.
Die Expressionsvektoren, welche die rekombinante CD40-L-DNA-Sequenz tragen, werden in eine im Wesentlichen homogene Kultur eines/r geeigneten Wirtsmikroorganismus oder Säugetierzelllinie transfiziert oder transformiert. Transformierte Wirtszellen sind Zellen, welche mit Nukleotidsequenzen, welche CD40-L-Polypeptide codieren und CD40-L-Polypeptide exprimieren, transformiert oder transfiziert wurden. Exprimierte CD40-L-Polypeptide befinden sich innerhalb der Wirtszelle und/oder werden in Kulturüberstandsfluid sekretiert, je nach der Art der Wirtszelle und dem in die Wirtszelle eingefügten Genkonstrukt.
In prokaryotische Wirtszellen transfizierte Expressionsvektoren umfassen im Allgemeinen einen oder mehrere phänotypische wählbare Marker. Ein phänotypischer wählbarer Marker ist zum Beispiel ein Gen, welches ein Protein codiert, welches Antibiotikaresistenz überträgt oder eine autotrophe Anforderung liefert, sowie ein vom Wirt erkannter Replikationsursprung, um die Amplifikation innerhalb des Wirtes sicherzustellen. Zu weiteren nützlichen Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen gehören ein wählbarer Marker mit Bakterienursprung abgeleitet aus handelsüblichen Plasmiden. Dieser wählbare Marker kann genetische Elemente des Klonvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und bietet so einfache Mittel zum Identifizieren transformierter Zellen. Die pBR322-„Hauptketten"-Abschnitte sind mit einem geeigneten Promotor und einer CD40-L-DNA-Sequenz kombiniert. Zu weiteren handelsüblichen Vektoren gehören zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Promotorsequenzen werden normalerweise für rekombinante prokaryotische Wirtszellenexpressionsvektoren verwendet. Gebräuchliche Promotorsequenzen beinhalten (3-Lactamase (Penicillinase), das Laktosepromotorsystem (Chang et al., Nature, 275: 615, 1978; und Goeddel et al., Nature, 281: 544, 1979), das Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8: 4057, 1980; und EP-A-36776) und den tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 412, 1982). Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtszellenexpressionssystem verwendet einen Phagen-λ-P_L-Promotor und eine thermolabile cI857ts-Repressorsequenz. Zu von der American Type Culture Collection erhältlichen Plasmidvektoren, welche Derivate des λ-P_L-Promotors beinhalten, gehören das Plasmid pHUB2 (befindlich im E. coli-Stamm JMB9 (ATCC 37092)) und pPLc28 (befindlich in E. coli RR1 (ATCC 53082)).
CD40-L kann in Hefewirtszellen, bevorzugt aus der Gattung Saccharomyces (z. B. S. cerevisiae) exprimiert werden. Es können auch andere Hefegattungen wie Pichia oder Kluyveromyces eingesetzt werden. Hefevektoren enthalten oft eine Replikationsursprungssequenz aus einem 2 μ-Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für die Polyadenylierung sowie Sequenzen für den Transkriptionsabschluss. Bevorzugt enthalten Hefevektoren eine Replikationsursprungssequenz und eine wählbaren Marker. Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren beinhalten Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073, 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem., 17: 4900, 1978) wie Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-Phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Weitere geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind ferner beschrieben in Hitzeman, EPA-73,657. Hefevektoren können zum Beispiel mit Hilfe von DNA-Sequenzen aus pBR322 zur Auswahl und Replikation in E. coli (Amp^I-Gen und Replikationsursprung) zusammengestellt werden.
Weitere Hefe-DNA-Sequenzen, welche in ein Hefeexpressionskonstrukt eingefügt werden können, beinhalten einen Glukose-unterdrückbaren ADH2-Promotor und α-Faktor- Sekretionsleader. Der ADH2-Promotor wurde von Russell et al. (J. Biol. Chem., 258: 2674, 1982) und Beier et al. (Nature, 300: 724, 1982) beschrieben. Die Hefe-α-Faktor-Leadersequenz steuert die Sekretion heterologer Polypeptide. Die α-Faktor-Leadersequenz wird oft zwischen die Promotorsequenz und die Strukturgensequenz eingefügt. Siehe z. B. Kurjan et al., Cell, 30: 933, 1982 und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5330, 1984. Weitere Leadersequenzen, welche für die Vereinfachung der Sekretion rekombinanter Polypeptide aus Hefewirten geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt. Eine Leadersequenz kann nahe ihres 3'-Endes modifiziert werden, damit sie eine oder mehrere Restriktionsstellen beinhaltet. Dies vereinfacht die Fusion der Leadersequenz an das Strukturgen.
Hefetransformationsprotokolle sind dem Fachmann bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929, 1978 beschrieben. Das Protokoll aus Hinnen et al. wählt für Trp⁺ Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefe-Stickstoff-Basis, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glukose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen transformiert durch Vektoren, welche eine ADH2-Promotorsequenz enthalten, können gezüchtet werden, um die Expression in einem „reichen" Medium zu induzieren. Ein Beispiel eines reichen Mediums besteht aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glukose, ergänzt mit 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil. Zur Derepression des ADH2-Promotors kommt es, wenn die Glukose aus dem Medium aufgebraucht ist.
Säugetier- oder Insektenwirtszellenkultursysteme können auch eingesetzt werden, um rekombinante CD40-L-Polypeptide zu exprimieren. Zu Beispielen geeigneter Säugetierwirtszelllinien gehören die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) Gluzman et al., Cell, 23: 175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Eierstockzellen von Chinesischen Hamster (CHO), HeLa-Zellen und BHK (ATCC CRL 10) -Zelllinien. Geeignete Säugetierexpressionsvektoren beinhalten nichttranskribierte Elemente wie einen Replikationsursprung, eine Promotorsequenz, einen Enhancer verknüpft mit dem Strukturgen, andere nichttranskribierte 5'- oder 3'-Flanking-Sequenzen, wie Ribosomenbindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Splice-Donor- und -Acceptor-Stellen und Transkriptionsterminationssequenzen.
Transkriptions- und Translationssteuersequenzen für Säugetierwirtszellenexpressionsvektoren können aus viralen Genomen entfernt werden. Zum Beispiel werden gebräuchlich verwendete Säugetierzellenpromotorsequenzen und Enhancer-Sequenzen aus dem Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Simian-Virus-40 (SV40) und humanem Zytomegalovirus abgeleitet. Aus dem SV40-Virengenom abgeleitete DNA-Sequenzen, zum Beispiel der SV40-Ursprung, früher und später Promotor, Enhancer, Splice- und Polyadenylierungsstellen, können verwendet werden, um die anderen genetischen Elemente bereitzustellen, welche für die Expression einer Strukturgensequenz in einer Säugetierwirtszelle erforderlich sind. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, weil beide leicht als ein Fragment aus dem viralen Genom gewonnen werden können, welches auch einen viralen Replikationsursprung enthalten kann (Fiers et al., Nature, 273: 113, 1978). Es können auch kleinere oder größere SV40-Fragmente verwendet werden, vorausgesetzt, dass die etwa 250 bp Sequenz, welche sich von der Hind-III-Stelle aus in Richtung der Bgl-1-Stelle erstreckt, die sich in der viralen SV40-Replikationsursprungsstelle befindet, enthalten ist.
Exemplarische Säugetierexpressionsvektoren können wie von Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol., 3: 280, 1983) offenbart hergestellt werden. Ein nützlicher Vektor mit hoher Expression, PMLSV.N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature, 312: 768, 1984, ist als ATCC 39890 hinterlegt worden. Zusätzliche nützliche Säugetierexpressionsvektoren sind in EP-A-0367566 und in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/701,415, eingereicht am 16. Mai 1991, hierin durch Bezugnahme eingefügt, beschrieben. Für die Expression der extrazellulären Region eines Proteins vom Typ II, wie CD40-L, sollte eine heterologe Signalsequenz zugefügt werden wie die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7) beschrieben in US-Patentschrift 4,965,195 oder die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor beschrieben in der US-Patentanmeldung 06/626,667, eingereicht am 2. Juli 1984.
Humanes oder murines CD40-L kann in membrangebundener Form hergestellt werden, wenn intrazelluläre und transmembrane Regionen enthalten sind, oder in löslicher Form mit lediglich der extrazellulären Domäne. Es wurde murines CD40-L mit der kompletten Länge in Säugetierzellen exprimiert, um Zellen zu erzeugen, welche membrangebundenes murines CD40-L exprimieren. CV 1-Zellen wurden mit einer cDNA, gezeigt in 1 (SEQ. ID. NR. 1), in HAVEO-Vektor transfiziert, oder CV1-Zellen wurden mit Hilfe von in Beispiel 6 hierin beschriebenen Verfahren mit leerem HAVEO-Vektor transfiziert. So entstanden transfizierte CV 1-Zellen, welche membrangebundenes murines CD40-L exprimieren. Diese Zellen wurden als eine Quelle für membrangebundenes murines CD40-L für die Experimentreihe verwendet, über die in den Beispielen 10–13 berichtet wird.
Reinigung rekombinanter CD40-L-Polypeptide
CD40-L-Polypeptide können durch Kultivierung transformierter Wirtszellen unter den Kulturbedingungen hergestellt werden, welche für das Exprimieren von CD40-L-Polypeptiden notwendig sind. Die daraus resultierenden exprimierten Polypeptide können dann von Kulturmedium oder Zellextrakten gereinigt werden. Ein CD40-L-Polypeptid kann, falls gewünscht, mit Hilfe eines handelsüblichen Proteinkonzentrationsfilters, zum Beispiel einer Amicon oder Minipore Pellicon Ultrafiltrationseinheit konzentriert werden. Im Anschluss an den Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix wie ein Gelfiltrationsmedium aufgetragen werden. Alternativ kann Anionenaustauschharz eingesetzt werden, zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit Diethylaminoethyl- (DEAE) Seitengruppen. Die Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere bei der Proteinreinigung gebräuchlich eingesetzte Arten sein. Alternativ kann ein Kationenaustauschschritt angewandt werden. Geeignete Kationenaustauscher beinhalten verschiedene unlösliche Matrizen, welche Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen aufweisen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt.
Abschließend können ein oder mehrere Schritte der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC), bei denen hydrophobes RP-HPLC-Medium eingesetzt wird (z. B. Kieselgel mit Methyl oder anderen aliphatischen Seitengruppen), angewandt werden, um das CD40-L weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorangegangenen Reinigungsschritte können in verschiedenen Kombinationen auch eingesetzt werden, um ein im Wesentlichen homogenes rekombinantes Protein bereitzustellen.
Es ist außerdem möglich eine Affinitätssäule zu verwenden, welche eine CD40-Liganden-Bindungsdomäne aufweist, um die exprimierten CD40-L-Polypeptide mittels der Affinität zu reinigen. Die CD40-L-Polypeptide können in einem hochsalzhaltigen Elutionspuffer von einer Affinitätssäule entfernt und dann zur Verwendung in einen geringer salzhaltigen Puffer dialysiert werden.
In Bakterienkultur hergestelltes rekombinantes Protein wird normalerweise durch anfängliches Aufbrechen der Wirtszellen, Zentrifugierung, Extraktion aus Zellpellets, wenn es sich um ein unlösliches Polypeptid handelt, oder aus dem Überstandsfluid, wenn es sich um ein lösliches Polypeptid handelt, isoliert, gefolgt von einem oder mehreren Konzentations-, Aussalzungs-, Ionenaustausch-, Affinitätsreinigungs- oder Größenausschlusschromatographieschritten. Schließlich kann RP-HPLC für abschließende Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobenzellen können mit jedem angemessenen Verfahren, einschließlich Gefrier-Tau-Zyklen, Beschallung, mechanische Aufbrechen oder die Verwendung von Zellauflösungsagenzien aufgebrochen werden.
Transformierte Hefewirtszellen werden bevorzugt eingesetzt, um CD40-L als ein sekretiertes Polypeptid zu exprimieren. Dies vereinfacht die Reinigung. Sekretierte rekombinante Polypeptide aus einer Hefewirtszellenfermentation können mit Hilfe von Verfahren gereinigt werden, die analog zu den von Urdal et al. (J. Chromatog., 296: 171, 1984) offenbarten sind.
Urdal et al. beschreiben zwei sequentielle Umkehrphasen-HPLC-Schritte zur Reinigung von rekombinantem humanem IL-2 auf einer präparativen HPLC-Säule.
Verabreichung von CD40-L-Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung bietet therapeutische Zusammensetzungen, welche eine effektive Menge CD40-L in einem/r geeigneten Verdünnungsmittel oder Trägersubstanz enthalten. Zur therapeutischen Verwendung wird einem Patienten, bevorzugt einem Menschen, zur Behandlung in einer der Indikation angemessenen Weise gereinigtes CD40-L oder ein biologisch aktives Analogon davon verabreicht. So können zum Beispiel pharmazeutische CD40-L-Zusammensetzungen (zum Beispiel in Form einer löslichen extrazellulären Domäne oder eines Fragmentes davon), welche verabreicht werden, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, durch Bolus-Injektion, kontinuierliche Infusion, verzögerte Freisetzung aus Implantaten oder andere geeignete Verfahren gegeben werden. Normalerweise wird ein therapeutisches CD40-L-Agens in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, welche gereinigtes CD40-L-Polypeptid in Verbindung mit physiologisch akzeptablen Trägersubstanzen, Bindemitteln oder Verdünnungsmitteln aufweist. Solche Trägersubstanzen sind bei den verabreichten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch für Patienten. Für gewöhnlich erfordert die Herstellung solcher Zusammensetzungen die Kombination eines CD40-L-Polypeptides mit Puffern, Antioxidanzien wie Ascorbinsäure, Polypeptiden mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten, einschließlich Glukose, Saccharose oder Dextranen, Chelatbildnern wie EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Bindemitteln. Neutrale gepufferte Salzlösung oder Salzlösung gemischt mit conspezifischem Serumalbumin sind beispielhafte geeignete Verdünnungsmittel. CD40-L-Sense- oder -Antisense-Oligonukleotide können durch Verabreichung einer effektiven Menge eines Vektors, welcher eine Nukleinsäuresequenz enthält, welche ein effektives Antisense- oder Sense-Oligonukleotid codiert, in vivo verabreicht werden. Zusätzlich können CD40-L-Sense- oder -Antisense-Oligonukleotide durch die Entfernung von CD40-L-DNA oder -mRNA aus einem Individuum enthaltenden Zellen, das Einbringung eines Antisense- oder Sense-Oligonukleotides in die Zellen mit Hilfe von Gentransferverfahren und der Rückinfusion der Zellen in das Individuum ex vivo verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung bestimmter Ausführungsformen und nicht der Einschränkung des Umfanges der Erfindung.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines CD40/Fc-DNA-Konstruktes zum Exprimieren eines löslichen CD40/Fc-Fusionsproteins zur Verwendung beim Nachweis von cDNA-Klonen, welche einen CD40-Liganden codieren. Die cDNA-Sequenz der extrazellulären Region oder Ligandenbindungsdomäne der kompletten humanen CD40-Rezeptorsequenz erhielt man mit Hilfe von Polymerasekettenreaktions- (PCR) Verfahren und basiert auf der Sequenz veröffentlicht in Stamenkovic et al., siehe oben. Ein CD40-Plasmid (CDM8) wurde als Matrize für die PCR-Amplifikation verwendet. CDM8 wird in Stamenkovic et al. beschrieben und wurde von den Autoren erhalten. Ein PCR-Verfahren (Sarki et al., Science, 239: 487, 1988) wurde unter Verwendung der 5'-(stromaufwärts) und 3'-(stromabwärts) Oligonukleotidprimer eingesetzt, um die DNA-Sequenzen zu amplifizieren, welche die extrazelluläre CD40-Ligandenbindungsdomäne codieren. Der stromaufwärtige Oligonukleotidprimer 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (SEQ. ID. NR. 5) fügt eine Sal-1-Stelle stromaufwärts von einem Initiator-Methionin von CD40 ein, und der stromabwärtige Oligonukleotidprimer 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (SEQ. ID. NR. 7), fügt die Aminosäuren Tyr Val Glu Pro Arg (SEQ. ID. NR. 8) nach Aminosäure 193 von CD40 ein. Glu und Pro sind die ersten beiden Aminosäuren einer Hingeregion von humanem IgG1, und ihnen folgt eine Bgl-II-Restriktionsstelle, welche verwendet wurde, um die extrazelluläre Domäne von CD40 mit dem Rest der humanen IgG1-Fc-Region zu verschmelzen.
Das DNA-Konstrukt pDC406/CD40/Fc wurde in die Affennierenzelllinie CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) transfiziert. Das pDC406-Plasmid beinhaltet Regulationssequenzen abgeleitet von SV40, dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) und dem Epstein-Barr-Virus (EBV). Die CV-1/EBNA-Zelllinie wurde durch Transfektion der CV-1-Zelllinie mit einem Gen abgeleitet, welches das Epstein-Barr-Virus-Kernantigen-1 (EBNA-1) codiert, welches stimuliert vom humanen CMV-Intermediate-Early-Enhancer/Promotor konstitutiv EBNA-1 exprimiert. Das EBNA-1-Gen ermöglicht die episomale Replikation von Expressionsvektoren wie pDC406, welche den EBV-Replikationsursprung enthalten.
Nach der Identifizierung von Zellen, welche das Fusionskonstrukt exprimieren, wurden großangelegte Kulturen transfizierter Zellen gezüchtet, um Überstand aus Zellen anzusammeln, welche CD40/Fc exprimieren. Das CD40/Fc-Fusionsprotein in Überstandsfluid wurde durch Affinitätsreinigung gereinigt. Kurz, ein Liter Kulturüberstand, welcher CD40/Fc-Fusionsprotein enthält, wurde durch das Filtern von Säugetierzellenüberständen (z. B. in einem 0,45-μ-Filter) und das Auftragen des Filtrates auf eine Protein-A/G-Antikörper-Affinitätssäule (Schleicher and Schuell, Keene, NH) bei 4°C bei einer Fließrate von 80 ml/h für eine 1,5 cm × 12,0 cm Säule gereinigt. Die Säule wurde mit 0,5 M NaCl in PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) gewaschen, bis kein freies Protein mehr im Waschpuffer nachgewiesen werden konnte. Abschließend wurde die Säule mit PBS gewaschen. Gebundenes Fusionsprotein wurde mit 25 mM Citratpuffer, pH 2,8 aus der Säule eluiert und mit 500 mM Hepespuffer, pH 9,1, auf pH 7 gebracht. Silbergefärbte SDS-Gele des eluierten CD40/Fc-Fusionsproteins zeigten dieses als > 98% rein.
Gereinigtes CD40/Fc-Fusionsprotein wurde unter Verwendung eines handelsüblichen Festphasenagens (IODO-GEN, Pierce) mit ¹²⁵I jodiert. Bei diesem Verfahren wurden 5 μg IODO-GEN auf den Boden eines 10 × 75 mm Glaskolbens plattiert und zwanzig Minuten bei 4°C mit 75 μl 1,1 M Natriumphosphat, pH 7,4 und 20 μl (2 mCi) Na¹²⁵I inkubiert. Die Lösung wurde dann in ein zweites Glasröhrchen übertragen, welches 5 μg CD40/Fc in 45 μl PBS enthielt und diese Reaktionsmischung wurde bei 4°C zwanzig Minuten inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde durch Gelfiltration auf einem 2 ml Austauschervolumen Sephadex^® G-25 (Sigma) fraktioniert und dann in RPMI 1640 Medium, welches 2,5% (v/v) Rinderserumalbumin (BSA), 0,2% (v/v) Natriumazid und 20 mM Hepes, pH 7,4 Bindungsmedium enthielt, äquilibriert. Der abschließende Pool von ¹²⁵I-CD40/Fc wurde auf eine Arbeitsstammlösung von 1 × 10^–7 in Bindungsmedium verdünnt und bei 4°C für bis zu einem Monat ohne einen nachweisbaren Verlust der Rezeptorbindungsaktivität gelagert.
Etwa 50%–60% Markierungsinkorporation wurden beobachtet. Radiojodierung erreichte spezifische Aktivitäten im Bereich von 1 × 10¹⁵ bis 5 × 10¹⁵ cpm/nMol (0,42–2,0 Atome radioaktives Jod pro Proteinmolekül). SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) enthüllte eine einziges markiertes Polypeptid, welches den erwarteten Werten entsprach. Das markierte Fusionsprotein war zu mehr als 98% durch Trichloressigsäure (TCA) fällbar, was zeigte, dass das ¹²⁵I kovalent an das Protein gebunden war.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel beschreibt die Auswahl einer Zelllinie, welche CD40-L putativ exprimiert. Es wurden mehrere Zelllinien mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen radiojodierten CD40/FC-Fusionsproteins untersucht. Kurz, es wurden quantitative Bindungsstudien gemäß der Standardmethodik durchgeführt, und Scatchard-Plots wurden für die verschiedenen Zelllinien abgeleitet. Eine klonale Zelllinie (EL4, ATCC-Katalog TIP 39), eine murine Thymomzelllinie, wurde identifiziert und sortiert. Vor dem Sortieren fand man heraus, das EL-4-Zellen etwa 450 Moleküle CD40-L pro Zelle exprimieren. Die Zellen der siebenten Sortierung wurden EL-40.7 genannt und gezüchtet, wobei sich herausstellte, dass sie etwa 10.000 Moleküle CD40-L pro Zelle exprimieren. Schließlich wurden die Zellen der neunten Sortierung EL-40.9 genannt und gezüchtet, wobei sich herausstellte, dass sie etwa 15.000 Moleküle CD40-L pro Zelle exprimieren.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer cDNA-Bibliothek für das Expressionsklonieren von murinem CD40-L. Die Bibliothek wurde aus dem fünften sortierten Klon einer murinen Thymomzelllinie EL-4 (ATCC TIB 39), genannt EL-40.5, hergestellt. EL-40.5-Zellen waren EL4-Zellen fünffach sortiert mit biotinyliertem CD40/Fc-Fusionsprotein in einem FACS (fluoreszenzaktivierter Zellsortierer). Eine cDNA-Bibliothek wurde aus RNA hergestellt, welche aus EL-40,5-Zellen, im Wesentlichen beschrieben in US-Patentschrift 4,968,607, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin eingefügt wird, gewonnen wurde. Kurz, eine cDNA-Bibliothek wurde durch umgekehrte Transkription von Poly-(A)⁺-mRNA, isoliert aus der gesamten RNA extrahiert aus der EL-40.5-Zelllinie, hergestellt. Die Bibliothekenerzeugungsverfahren waren im Wesentlichen ähnlich den von Ausubel et al., eds., Current Protocols In Molecular Biology, Vol. I, (1987) beschriebenen. Poly-(A)⁺-mRNA wurde durch Oligo-dT-Zellulosechromatographie isoliert und Doppelstrang-cDNA wurde im Wesentlichen wie von Gubler et al., Gene, 25: 263, 1983 beschrieben hergestellt. Poly-(A)⁺-mRNA-Fragmente wurden durch umgekehrte Transkriptase unter Verwendung von beliebigen Hexanukleotiden als Primere in RNA-cDNA-Hybriden umgewandelt. Die RNA-cDNA-Hybriden wurden dann mit Hilfe von RNAase-H in Verbindung mit DNA-Polymerase-I in Doppelstrang-cDNA-Fragmente umgewandelt. Die daraus resultierende Doppelstrang-cDNA wurde mit T4-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen. Sal-I-Adaptoren
wurden an 5'-Enden der resultierenden stumpf endenden cDNA ligiert, wie in Haymerle et al., Nucleic Acids Res., 14: 8615, 1986 beschrieben. Nichtligierte Adaptoren wurden durch Gelfiltrationschromatographie bei 68°C entfernt. So verblieben 24 nicht selbst-komplementäre Nukleotidenüberhänge auf der cDNA. Das gleiche Verfahren wurde verwendet, um 5'-Sal-I-Enden des Säugetierexpressionsvektors pDC406 in 24 Nukleotidenüberhänge komplementär zu den der cDNA hinzugefügten umzuwandeln. Optimale Anteile von adaptiertem Vektor und cDNA wurden in Gegenwart von T4-Polynukleotidkinase ligiert. Dialysierte Ligationsmischungen wurden in den E. coli-Stamm DH5α elektroporiert und Transformanten auf Ampicillin-Platten selektiert.
Plasmid-DNA wurde aus Pools bestehend aus etwa 2.000 Klonen von transformiertem E. coli pro Pool isoliert. Die isolierte DNA wurde mittels DEAE-Dextran in eine sub-konfluierende Schicht von CV1-EBNA-Zellen transfiziert, gefolgt von einer Chloroquin-Behandlung, welche im Wesentlichen gemäß der in Luthman et al., Nucl. Acids Res., 11: 1295, 1983 und McCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst., 41: 351, 1986 beschriebenen Verfahren stattfand.
CV1-EBNA-Zellen wurden in komplettem Medium (Dulbecco's Modified Eagles' Medium, welches 10% v/v fötales Kälberserum, 50 U/ml Penicillin, 50 U/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin enthielt) aufrechterhalten und wurden auf eine Dichte von etwa 2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in Einzel-Vertiefungs-Trägern mit einer Kammer (Lab-Tek) plattiert. Die Träger wurden mit 1 ml humanem Fibronectin (10 μg/ml PBS) 30 Minuten vorbehandelt, gefolgt von einer einmaligen Waschung mit PBS. Das Medium wurde von adhärenten, in einer Schicht wachsenden Zellen entfernt und mit 1,5 ml komplettem Medium ersetzt, welches 66,6 μm Chloroquinsulfat enthielt. Etwa 0,2 ml einer DNA-Lösung (2 μg DNA, 0,5 mg/ml DEAE-Dextran in komplettem Medium, welches Chloroquin aufwies) wurden den Zellen zugefügt und die Mischung wurde bei 37°C etwa fünf Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden durch Zugabe von komplettem Medium, welches 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) enthielt, 2,5–20 Minuten geschockt. Dem Schocken folgte der Austausch der Lösung mit frischem komplettem Medium. Die Zellen wurden in Kultur zwei bis drei Tage gezüchtet, um die transiente Expression der eingefügten DNA-Sequenzen zu ermöglichen. Diese Bedingungen führten zu einer 30% bis 80% Transfektionshäufigkeit bei den überlebenden CV1-EBNA-Zellen.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel beschreibt das Screening der in Beispiel 3 hergestellten Expressionsklonierungsbibliothek mit einem in Beispiel 1 hergestellten markierten CD40/Fc-Fusionsprotein. Nach 48–72 Stunden wurden in Beispiel 3 hergestellte transfizierte monomolekulare Schichten von CV1-EBNA-Zellen mit Hilfe von Objektträger-Autoradiographie unter Verwendung von radiojodiertem CD40/Fc-Fusionsprotein, wie in Beispiel 1 hergestellt, auf die Expression von CD40-L untersucht. Transfizierte CV1-EBNA-Zellen wurden einmal mit Bindungsmedium (RPMI 1640 mit 25 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes, pH 7,2 und 50 mg/ml fettfreiem Milchpulver) gewaschen und 2 Stunden bei 4°C in Bindungsmedium mit 1 × 10^–9 M ¹²⁵I-CD40/Fc-Fusionsprotein inkubiert. Nach der Inkubation wurden Zellen in den Kammerträgern dreimal mit Bindungspuffer gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen mit PBS (pH 7,3), um ungebundenes radioaktiv markiertes Fusionsprotein zu entfernen.
Die Zellen wurden durch Inkubation in 10% Gluteraldehyd in PBS (30 Minuten bei Raumtemperatur) fixiert, zweifach in PBS gewaschen und luftgetrocknet. Die Träger wurden in photographische Emulsion Kodak GTNB-2 (6 × Verdünnung mit Wasser) getaucht und im Dunkeln zwei bis vier Tage bei Raumtemperatur in einer lichtundurchlässigen Box stehen gelassen. Die Träger wurden in Kodak-D19-Entwickler entwickelt, in Wasser gespült und mit Agfa G433C-Fixierungsmittel fixiert. Die Träger wurden einzeln unter einem Mikroskop bei 25–40-facher Vergrößerung untersucht. Positive Träger mit CD40-L-exprimierenden Zellen wurden durch die Gegenwart autoradiographischer Silberkörnchen gegen einen hellen Hintergrund identifiziert.
Ein Pool, welcher etwa 2000 einzelne Klone enthielt, wurde als potentiell positiv für die Bindung des CD40/Fc-Fusionsproteins identifiziert. Der Pool wurde titriert und plattiert, um Platten bereitzustellen, welche jeweils etwa 200 Kolonien enthielten. Jede Platte wurde abgeschabt, um gemäß dem oben beschriebenen gleichen Verfahren gepoolte Plasmid-DNA für die Transfektion in CV1-EBNA-Zellen bereitzustellen. Die kleineren Pools wurden wie zuvor beschrieben mittels Träger-Autoradiographie untersucht. Einer der kleineren Pools enthielt Klone, die positiv für CD40-L waren, wie dies durch die Gegenwart eines exprimierten Genproduktes angezeigt wurde, welches in der Lage war, sich an das CD40/Fc-Fusionsprotein zu binden.
Der positive kleinere Pool wurde titriert und plattiert, um einzelne Kolonien zu erhalten. Etwa 400 einzelne Kolonien wurden ausgewählt und in einzelnen Vertiefungen von 69-Vertiefungen-Platten in Kulturmedium inokuliert. Die Kulturen wurden durch Pooling-Reihen und -Säulen gemischt und die gemischten Kulturen wurden verwendet, um DNA für einen abschließenden Transfektions- und Screeningzyklus herzustellen. Eine Intersektion einer positiven Reihe und eine positive Säule zeigten eine potentiell positive Kolonie. Zehn potentiell positive Kolonien (d. h. in Frage kommende Klone) wurden identifiziert. Aus jedem in Frage kommenden Klon wurde DNA isoliert, erneut transfiziert und erneut untersucht. Fünf in Frage kommende Klone waren positiv durch die Bindung an CD40/Fc. Alle fünf positiven in Frage kommenden Klone enthielten einen cDNA-Einschub von 1468 Nukleotiden, was durch Dideoxy-Nukleotidsequenzierung bestimmt wurde. Die cDNA-Codierregion des CD40-L-Klones entspricht der Sequenz von 1 und SEQ. ID. NR. 1.
Ein Klonvektor mit einer murinen CD40-L-Sequenz, bezeichnet mit pDC406-mCD40-L, wurde am 6. Dezember 1991 unter der Zugangsnummer 68872 bei der American Type Culture Collection in Rockville, MD (ATCC) hinterlegt. Die Nukleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz dieses Klons sind in SEQ. ID. NR. 1 und in 1 veranschaulicht.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel veranschaulicht das speziesübergreifende Hybridisierungsverfahren, welches eingesetzt wurde, um mit Hilfe einer aus der Sequenz von murinem CD40-L hergestellten Sonde ein humanes CD40-L-Homolog zu isolieren. Eine murine CD40-L-Sonde wurde durch das Entfernen der Codierregion aus einem murinen CD40-L-Klon pDC406-CD40-L (Nukleotid 13 bis einschließlich 793) und ³²P-Markierung des Fragmentes mit Hilfe von beliebigen Primern (Boehringer-Mannheim) hergestellt.
Eine humane periphere Blutlymphozyten- (PBL) cDNA-Bibliothek wurde mit Hilfe von λgt10-Armen in einem λ-Phagenvektor hergestellt und in vitro mittels einer handelsüblichen Ausrüstung (Gigapak^® Stratagene, San Diego, CA) gemäß der Herstelleranleitung verpackt. Die PBL-Zellen erhielt man aus normalen humanen Freiwilligen und sie wurden sechs Tage mit 10 ng/ml OKT3 (ein Anti-CD3-Antikörper) und 10 ng/ml humanem IL-2 (Immunex, Seattle, WA) behandelt. Die PBL-Zellen wurden gewaschen und vier Stunden mit 500 ng/ml Ionomycin (Calbiochem) und 10 ng/ml PMA (Sigma) stimuliert. Boten-RNA und -cDNA wurden den stimulierten PBL-Zellen entnommen und gemäß der Herstelleranleitung in λgt10-Phagenvektoren (Gigapak^® Stratagene) verpackt.
Die murine Probe wurde bei 63°C über Nacht in 6 × SSC (15 mM Trinatriumcitrat und 165 mM Natriumchlorid), 1 × Denhardt's Lösung, 2 mM EDTA, 0,5% Np40 zu Phagen-cDNA hybridisiert. Der Hybridisierung folgte eine extensive Waschung in 3 × SSC, 0,1% SDS bei etwa 55°C für drei Stunden. Spezifische Bänder wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Ein Klonierungsvektor, welcher eine humane CD40-L-Sequenz enthält, bezeichnet mit hCD40-L, wurde am 6. Dezember 1991 unter der Zugangsnummer 68873 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) hinterlegt. Die Nukleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz dieses Klons sind in SEQ. ID. NR. 11 und in 2 veranschaulicht.
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel veranschaulicht die Expression von membrangebundenem murinem CD40-L in CV1-EBNA-Zellen. Murine CD40-L-cDNA in HAVEO-Vektor oder leerem HAVEO-Vektor wurde mit Hilfe von Standardverfahren, wie den in McMahan et al., EMBO J., 10: 2821, 1991 und im Beispiel 3 hierin beschriebenen, in CV1-EBNA-Zellen transfiziert. Kurz, CV1-EBNA-Zellen wurden mit einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro 10 cm Schale in 10 ml Dulbecco's Minimal Essential Medium ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (Medium) plattiert. Das Anhaften der Zellen wurde über Nacht bei 37°C zugelassen. Das Medium wurde mit 1,5 ml Medium, welches 66,7 μM Chloroquin und eine DNA-Mischung mit 5 μg cDNA, welche mCD40-L codiert, enthält ersetzt. Außerdem wurde den Zellen Medium mit 175 μl und 25 μl DEAE-Dextran (4 mg/ml in PBS) zugefügt. Die Zellen und cDNA wurden 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die cDNA-Mischung wurde entfernt und die Zellen wurden mit 1 ml frischem Medium mit 10% DMSO für 2,5 Minuten geschockt. Das Medium wurde mit frischem Medium ausgetauscht und die Zellen wurden für mindestens 3 Tage gezüchtet.
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper zu CD40-L. Präparate aus gereinigtem murinem CD40-L oder humanem CD40-L werden wie hierin beschrieben durch COS-Zellexpression und CD40/Fc-Affinitätsreinigung hergestellt. Gereinigtes CD40-L kann mit Hilfe konventioneller Verfahren, zum Beispiel den in US-Patentschrift 4,411,993 beschriebenen Verfahren, monoklonale Antikörper gegen CD40-L erzeugen. Kurz, Mäuse werden mit CD40-L als ein in komplettem Freund's Adjuvans emulgiertes Immunogen immunisiert und in Mengen zwischen 10–100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem CD40-L, emulgiert in inkomplettem Freund's Adjuvans, geboostet. Danach werden die Mäuse in regelmäßigen Abständen nach einem wöchentlich bis zweiwöchentlich Immunisierungsplan geboostet. Durch retroorbitale Blutungen oder Schwanzspitzen-Exzision werden in regelmäßigen Abständen zum Testen auf CD40-L-Antikörper mittels des Dot-Blot-Assays oder ELISA (Enzymverbundenes Immunosorbens Assay) Serumproben genommen.
Nach dem Nachweis eines geeigneten Antikörper-Titers wird positiven Tieren eine letzte intravenöse Injektion CD40-L in Salzlösung verabreicht. Drei bis vier Tage später werden die Tiere getötet, Milzzellen entnommen und die Milzzellen mit einer murinen Myelomzelllinie (z. B. NS 1 oder Ag 8.653) verschmolzen. Fusionen erzeugen Hybridomzellen, welche in multiple Mikrotiterplatten in ein selektives HAT- (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium plattiert werden, um die Proliferation von nicht verschmolzenen Zellen, Myelomhybriden und Milzzellenhybriden zu verhindern.
Die Hybridomzellen werden mit ELISA auf Reaktivität gegen gereinigtes CD40-L durch Anpassungen der in Engvall et al., Immunochem., 8: 871, 1971 und in US-Patentschrift 4,703,004 offenbarten Verfahren untersucht. Positive Hybridomzelllinien können intraperitoneal in syngenetische BALB/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites mit hohen Konzentrationen monoklonaler Anti-CD40-L-Antikörper zu erzeugen. Alternativ können Hybridomzellen in vitro mittels verschiedener Verfahren in Kolben oder Rollerflaschen gezüchtet werden. In Mausaszites hergestellte monoklonale Antikörper können mit Hilfe von Ammoniumsulfat-Präzipitation gefolgt von Gelausschluss-Chromatographie gereinigt werden. Alternativ kann auch die Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung des Antikörpers an Protein A oder Protein G verwendet werden, wie auch die Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung an CD40-L.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel veranschaulicht therapeutische Anti-Allergie-Wirkungen von sCD40 und CD40/Fc-Fusionsprotein. Lösliches CD40 und CD40/Fc wurden auf ihre Fähigkeit, IL-4- (5 ng/ml) induzierte IgE-Sekretion in einem Zwei-Donor-MLC-System zu verhindern, getestet. Die Daten aus drei Experimenten sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 IgE (ng/ml)
Die IgE-Levels wurden nach 12 Tagen in der Kultur mit einem ELISA-Verfahren gemessen. Kurz, Flachboden-96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten (Corning) wurden mit Maus-mAb Anti-Human-IgE (Zymed) bei einer Verdünnung von 1 : 500 in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) beschichtet. Nach 3-maligem Waschen wurde mit Hilfe von 5% fettfreiem Milchpulver ein Blockierungsschritt durchgeführt, gefolgt von der Titration des humanen IgE- Standards oder Testüberständen. Nach 3-maligem Waschen wurde biotinyliertes Ziegen-Anti-Human-IgE (Kirkegaard and Perry) mit einer Verdünnung von 1 : 500 zugefügt. Dem folgten weitere Waschungen und danach die Zufügung von Streptavidin-HRP (Zymed) in einer Verdünnung von 1 : 500. Nach weiteren Waschungen wurde die Reaktion mit Hilfe von TMB-Substrat (Kirkegaard and Perry) entwickelt und die Absorbanz bei 520 nm gemessen. Alle Waschungsschritte wurden in PBS plus 0,05% Tween ausgeführt. Alle Inkubationsschritte wurden mit einem Volumen von 100 μl/Vertiefung eine Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Empfindlichkeit dieses Assays ist 100 pg/ml.
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel veranschaulicht die Auswirkungen von sCD40 und CD40/Fc-Fusionsprotein, die Ausscheidung von löslichem CD23 aus IL-4- (5 ng/ml) stimulierten B-Zellen zu verhindern. Lösliches CD40 und CD40/Fc wurden auf ihre Fähigkeit getestet, IL-4-induzierte sCD23-Ausscheidung in einem Zwei-Donor-MLC-System zu verhindern. Die Daten aus drei Experimenten sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2 sCD23 (ng/ml)
Die Niveaus von löslichem CD23 wurden nach 6 und 12 Tagen in der Kultur mit einer handelsüblichen sCD23-ELISA-Nachweisausrüstung (Binding Site, San Diego, CA) gemessen. Die Empfindlichkeitsgrenze lag bei 500 pg/ml. Etwa 1 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung wurden für die angegebene Zeit in Gegenwart oder Abwesenheit von Zusatzstoffen wie in Tabelle 2 angegeben dreifach in Rundboden-96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten (Intermountain Scientific, Bountiful UT) kultiviert. Die Ergebnisse zeigen Anti-Allergie-Wirkungen von sCD40. Ähnliche Studien wurden mit CD40/Fc (Daten nicht gezeigt) anstelle von sCD40 durchgeführt und man erhielt ähnliche Resultate. Dementsprechend veranschaulichen diese Daten in Beispiel 8 und 9 eine Anti-Allergie-Eigenschaft für CD40.
BEISPIEL 10
Dieses Beispiel veranschaulicht die proliferative B-Zellen-Aktivität von membrangebundenem murinem CD40-L für humane B-Zellen. Humane mononukleäre periphere Blutzellen (PBMC) wurden durch Dichtegradienten-Zentrifugierung über Histopaque^® (Sigma, St. Louis, MO) aus peripherem Blut von normalen Freiwilligen isoliert. T-Zellen-verminderte Präparate von Zellen (E^–) erhielt man durch die Entfernung von T-Zellen durch Rosetting mit 2-Aminoethylisothioronium-Bromid-behandelten SRBC (rote Blutkörperchen von Schafen) und weiter durch die Dichtegradienten-Zentrifugierung über Histopaque^®. Es wurden B-Zellen-Proliferations-Assays mit E^–-Präparaten in RPMI-Medium mit zugefügten 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) bei 37°C in einer 10% CO₂-Atmosphäre durchgeführt. Etwa 1 × 10⁵ E^–-Zellen pro Vertiefung wurden für 7 Tage in Gegenwart von transfizierten CV1-EBNA-Zellen (beschrieben in Beispiel 6) dreifach in Flachboden-96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten (Corning) kultiviert. Die CV1-EBNA-Zellen wurden mit muriner CD40-L-cDNA oder leerem Vektor transfiziert. Die Zellen wurden für die letzten acht Stunden der Kultur mit 1 μCi/Well titriertem Thymidin (25 Ci/nMol Amersham, Arlington Heights, IL) gepulst. Die Zellen wurden mit einem automatisierten Zell-Harvester auf Glasfaserscheiben entnommen und eingelagertes cpm wurde durch Flüssigkeitsszintillationsspektrometrie gemessen.
4a zeigt einen Vergleich humaner B-Zellen-Proliferation von CV1-EBNA-Zellen transfiziert mit leerem Vektor (HAVEO) oder mit muriner CD40-L-cDNA in HAVEO-Vektor. Diese Daten zeigen, dass das membrangebundene CD40-L humane B-Zellen-Proliferation in Abwesenheit eines Co-Mitogens stimuliert. 4b zeigt ein ähnliches Experiment, außer dass der Kultur 10 ng/ml humanes IL-4 zugefügt wurden. Bei diesem Experiment verbessert IL-4 die mitogene B-Zellen-Aktivität von membrangebundenem murinem CD40-L leicht. 5 ist eine Wiederholung des in 4b gezeigten Experimentes. Als das Experiment jedoch wiederholt wurde, gab es keinen Nachweis für komitogene IL-4-Aktivität. Es gab den wiederholten Nachweis mitogener CD40-L-Aktivität. Demzufolge stimuliert membrangebundenes CD40-L die Proliferation humaner B-Zellen.
BEISPIEL 11
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung von membrangebundenem murinem CD40-L, die IgE-Produktion und CD23-Abscheidung aus den in Beispiel 10 isolierten E^–-Zellen zu stimulieren. Etwa 1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung wurden in dreifachen Rundboden-96-Vertiefungen-Nunc-Mikrotiterplatten (Intermountain Scientific, Bountiful UT) in Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) plus 10% FCS in einer Feuchtatmosphäre von 10% CO₂ kultiviert. Das Medium wurde ergänzt mit 50 μg/ml humanem Transferrin (Sigma), 0,5% Rinderserumalbumin (Sigma) und je 1 μg/ml Öl-, Linol- und Palmitinsäure (Sigma). Die E^–-Zellen wurden für 10 Tage in Gegenwart von 5 ng/ml humanem IL-4 kultiviert. Eine Titration von CV1-EBNA-Zellen transfiziert mit murinem CD40-L oder leerem Vektor wurde hinzugefügt. Nach zehn Tagen wurden die Kulturüberstände mit Hilfe des in Beispiel 8 beschriebenen ELISA-Verfahrens auf IgE untersucht, oder mit dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren auf die CD23-Abscheidung.
6 zeigt einen Vergleich der IgE-Produktion in den Überständen (in ng/ml) der Kulturen von E^–-Zellen und CV1-EBNA-Zellen transfiziert mit leerem Vektor (HAVEO) oder mit CD40-L. Bei bis zu 3000 CV1-EBNA-Zellen wurden keine Unterschiede festgestellt, jedoch ergab sich ein signifikante IgE-Produktion bei Zugabe von 10000 oder 30000 CD40-L-transfizierten CV1-EBNA-Zellen. Zum Vergleich, wenn E^–-Zellen mit Medium allein, 5 ng/ml IL-4 oder 5 ng/ml IL-4 plus 500 ng/ml G28-5-Antikörper inkubiert wurden, lag die IgE-Produktion bei 4,7, 2,9 bzw. > 600 ng/ml. Als die CD23-Abscheidung in 7 gemessen wurde, zeigten 10000 und 30000 CV1-EBNA-Zellen transfiziert mit CD40-L erhöhte CD23-Abscheidung beim Vergleich mit CV1-EBNA-Kontrollzellen mit leerem Vektor. Zum Vergleich, wenn E^–-Zellen mit Medium allein, 5 ng/ml IL-4 oder 5 ng/ml IL-4 plus 500 ng/ml G28-5-Antikörper inkubiert wurden, lag die CD23-Abscheidung bei < 0,1, 2,4 bzw. 11,2 ng/ml. Diese Daten zeigen, dass sowohl die IgE-Produktion als auch die CD23-Abscheidung biologische Aktivitäten in Zusammenhang mit membrangebundenem CD40-L sind.
BEISPIEL 12
Dieses Beispiel veranschaulicht die B-Zellen-Proliferationsaktivität, die polyklonale Immunglobulin-(Ig) Produktion, antigenspezifische Antikörperbildung und verschiedene Verfahren der Verwendung von membrangebundenem und löslichem CD40-L in klinischen Anwendungen. Murine Milz-B-Zellen erhielt man gemäß der in Grabstein et al. I oben, Maliszewski et al. I oben und Maliszewski et al. II oben beschriebenen Verfahren. Kurz, die Mischkultur von Zellen wurde durch T-Zellen-Verminderung mittels T-Zellen-Antiserum und Komplement sowie durch adhärente Zellverminderung mittels Durchlauf von Sephadex^® G10-Säulen und durch B-Zellen-positive Selektion mittels Aufbringung auf mit Ziegen-Antimaus-IgM beschichteten Petrischalen gereinigt. Gereinigte B-Zellen wurden in RPMI, fötalem Kälberserum (5% für B-Zellen-Proliferations-Assays und 20% für Plaquebildungszellassays oder polyklonale Antikörper-Assays), 2-Mercaptoethanol, Antibiotika, Aminosäuren und Pyruvat kultiviert. Die B-Zellen-Proliferation wurde gemäß dem in Beispiel 10 und in Grabstein et al. I oben, Maliszewski et al. I oben und Maliszewski et al II oben beschriebenen Assay gemessen. Die antigenspezifische Antikörperbildung wurde durch das in Grabstein et al., J. Mol. Cell. Immunol., 2: 199, 1986 [Grabstein et al. II] beschriebene Verfahren gemessen. Kurz, die antigenspezifische Antikörperbildung verwendete rote Blutkörperchen von Schafen (SRBC) als Antigen (0,03% v/v) in 2,0 ml Kulturen von 1 × 10⁶ murinen B-Zellen pro Kultur. Die B-Zellen-Kulturen wurden 5 Tage inkubiert und die Plaquebildungszellen wurden mit Hilfe des hämolytischen Jerne-Plaque-Assays wie in Grabstein et al. II oben beschrieben bestimmt. Die Zellzahlen wurden in einem Coulter-Counter bestimmt. Die polyklonale Ig-Sekretion wurde durch Isotypen-spezifische ELISA-Assays in Sieben-Tages-Kulturen von 1 × 10⁶ B-Zellen pro 2,0 ml Kultur wie in Maliszewski et al. I oben und Maliszewski et al. II oben beschrieben bestimmt.
Die Ergebnisse der B-Zellen-Proliferation durch CV1-EBNA-Zellen transfiziert mit CD40-L oder leerem Vektor oder 7A1-Zellen (ein T-Zellen-Helferklon) sind in 8, 10 und 12 gezeigt. Diese Daten zeigen, dass die höchste B-Zellen-Proliferation durch CD40-L verursacht wurde. Die T-Zellen-Helferzellen 7A1 und 7C2 hatten minimale Wirkung auf die B-Zellen-Proliferation.
Die Auswirkungen verschiedener Zellen auf die antigenspezifische Antikörperbildung sind in 9 und 11 gezeigt. 9 zeigt einen Vergleich von Plaque-bildenden Zellen mit dem T-Zellen-Helferklon 7A1 und murinen EL40.9-Zellen, welche ein lösliches CD40-L absondern. Die EL40.9-Zellen scheinen eine inhibitorische Wirkung auf die antigenspezifische Antikörperbildung zu haben. 11 zeigt PFC (Plaque-bildende Zellen) für die T-Zellen-Helferzellen 7C2 und CV 1-EBNA-Zellen entweder mit leerem Vektor oder CD40-L transfiziert. Sowohl 7C2-Zellen als auch membrangebundenes CD40-L stimulierten die antigenspezifische Antikörperbildung (PFC). 13 vergleicht die antigenspezifische Antikörperbildung von CD40-L und 7A1-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ng/ml Interleukin-2 (IL-2). IL-2 erhöhte die PFC für 7A1-Zellen, jedoch nicht die durch membrangebundenes CD40-L verursachte PFC.
Die polyklonale Ig-Produktion durch murine B-Zellen wurde auf die Stimulation oder Hemmung mit membrangebundenem CD40-L, Kontroll-CV1-EBNA-Zellen und den Helfer-T-Zellen 7A1 in Gegenwart der Zytokine IL-4 (10 ng/ml) und IL-5 (1 : 40-Verdünnung von COS-Zellüberständen) oder ohne hinzugefügte Zytokine verglichen. Die Menge an IgA, IgG3, IgE, IgG2b, IgM und IgG1 sind jeweils in den Tabellen 3 – 8 gezeigt.
TABELLE 3 IgA, ng/ml
TABELLE 4 IgG3, ng/ml
TABELLE 5 IgE, ng/ml
TABELLE 6 IgG2b, ng/ml
TABELLE 7 IgM, μg/ml
TABELLE 8 IgG1, ng/ml
Diese Daten zeigen, dass die Interaktion von CD40 mit seinem Liganden die wichtigste intermolekulare Wechselwirkung ist, welche für die T-Zellen-Kontakt-abhängige Induktion von B-Zellen-Wachstum und Differenzierung bei der antigenspezifischen Antikörperproduktion wie auch der polyklonalen Ig-Sekretion verantwortlich ist. Daher lassen diese Daten darauf schließen, dass die Antagonisten dieser Wechselwirkung durch lösliches CD40, CD40/Fc-Fusionsprotein und möglicherweise lösliches CD40-L (monomer) signifikant in die Entwicklung von Antikörperreaktionen eingreifen werden. Daher gehören zu klinischen Situationen, bei denen CD40, CD40/Fc-Fusionsproteine und lösliches CD40-L eingesetzt werden können, Allergie, Lupus, Rheumatoidarthritis, Insulin-abhängige Diabetes Mellitus und alle anderen Erkrankungen, bei denen Autoimmunantikörper oder Antigen/Antikörperkomplexe für die klinische Pathologie der Krankheit verantwortlich sind. Weiters sind membrangebundenes CD40-L oder oligomeres lösliches CD40-L von Nutzen, um die B-Zellen-Proliferation und Antikörperproduktion zu stimulieren. Daher sind diese Formen von CD40-L am nützlichsten für Impfstoff-Adjuvanzien und als ein Stimulationsagens für die mAb-Sekretion aus Hybridomzellen.
BEISPIEL 13
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung von membrangebundenem CD40-L auf die Proliferation von und IgE-Sekretion aus mononukleären peripheren Blutzellen (E^–). E-Zellen erhält man gemäß dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahrens, und sie wurden für 7 bis 10 Tage in Gegenwart von CV1-EBNA-Zellen transfiziert mit leerem Vektor oder mCD40-L-cDNA inkubiert. Zusätzlich wurde CD40/FC-Fusionsprotein (beschrieben in Beispiel 1) oder TNF-Rezeptor/Fc-Fusionsprotein (beschrieben in WO 91/03553) wie in 14 gezeigt zu einigen der Präparate hinzugefügt. Die IgE-Sekretion wurde gemäß dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren gemessen und die B-Zellen-Proliferation wurde gemäß dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren gemessen.
Die Ergebnisse für die B-Zellen-Proliferation und IgE-Sekretion werden in 14 für fünf unterschiedliche Konzentrationen transfizierter CV1-EBNA-Zellen gezeigt. Sowohl die B-Zellen-Proliferation als auch die IgE-Sekretion wurde in Gegenwart von membrangebundenem CD40-L erhöht. Die Zugabe von CD40/Fc-Fusionsprotein ablatierte sowohl die B-Zellen-Proliferation als auch die IgE-Sekretion. Das TNF-Rezeptor/Fc-Fusionsprotein zeigte keine Wirkung. Als Vergleich für die IgE-Sekretion erzeugte bei diesem Assay die Zugabe von IL-4 als Kontrollagens (ohne transfizierte CV1-EBNA-Zellen) kein IgE und die Zugabe von IL-4 plus G28-5 Anti-CD40-mAb resultierte bei diesem Assay in 29,7 ng/ml IgE.
BEISPIEL 14
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines CD40-L/Fc-DNA-Konstruktes zum Exprimieren eines löslichen CD40-L/Fc-Fusionsproteins bezeichnet als CD40-L/FC2-Konstrukt. DNA, welche CD40-L/FC2 codiert, umfasst Sequenzen, welche ein Leader- (oder Signal-) Peptid, eine hydrophile Acht-Aminosäuren-Sequenz beschrieben von Hopp et al. (Hopp et al., Bio/Technology, 6: 1204, 1988; bezeichnet als Flag^®), eine geeignete Fc-Region eines Immunglobulins, eine [Gly₄Ser]₃-Repeatsequenz (beschrieben in US-Patentschrift Nr. 5,073,627, durch Bezugnahme hierin eingefügt) oder andere geeignete Linkersequenzen sowie die extrazelluläre Region von humanem CD40-L von Aminosäure 50 bis Aminosäure 261 (SEQ. ID. NR. 11) codieren. Ein pDC406-Expressionsvektor, welcher eine Leadersequenz, Flag^® und humanes IgG₁-Fc aufweist, wird mit Hilfe konventioneller Verfahren des Enzymschneidens und der Ligation von Fragmenten, welche eine Leadersequenz, Flag^® und humanes IgG₁-Fc codieren, hergestellt und mit Nsi1 und Not1 beschnitten.
Ein PCR-Verfahren (Sarki et al., Science, 239: 487, 1988) wurde unter Verwendung der 5'-(stromaufwärts) und 3'-(stromabwärts) Oligonukleotidprimere eingesetzt, um die DNA-Sequenzen, welche die extrazelluläre CD40-Liganden-Bindungsdomäne codieren, aus einem Klonvektor zu amplifizieren, welcher humanes CD40-L (ATCC 68873; SEQ. ID. NR. 11) aufweist, um ein PCR-Fragment zu bilden. Der stromaufwärtige Oligonukleotidprimer (SEQ. ID.
NR. 13) fügte eine Nsi-1-Stelle stromaufwärts einer Linkersequenz [Gly₄Ser]₃SerSer ein, welcher 21 Nukleotide der extrazellulären Domäne von CD40-L (die Aminosäuren 51 bis einschließlich 57 von SEQ. ID. NR. 11) folgten. Ein stromabwärtiger Oligonukleotidprimer (SEQ. ID. NR. 14) fügte eine Not-1-Stelle genau stromabwärts des Terminationscodons des CD40-L ein. Das PCR-Fragment wurde dann in den pDC406-Expressionsvektor ligiert, welcher eine Leadersequenz, Flag^® und humanes IgG₁-Fc aufweist. Die Nukleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz von CD40-L/FC2 sind in SEQ. ID. NR. 15 und SEQ. ID. NR. 16 wiedergegeben. Das daraus resultierende DNA-Konstrukt (CD40-L/FC2) wurde in die Affennierenzelllinie CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) transfiziert. Das Konstrukt codierte ein lösliches CD40-L, welches zur Bindung von CD40 in der Lage war, wie dies durch die bei der Fluoreszenzaktivierten Zellsortierungs- (FACS) Analyse mit Hilfe von CD40-exprimierenden Zellen beobachtete Bindung nachgewiesen wurde.
In großem Maßstab angelegte Kulturen humaner embryonaler Nierenzellen (293) (ATCC CRL 1573) transfiziert mit dem Konstrukt, welches CD40-L/FC2 codiert, wurden gezüchtet, um Überstand anzusammeln, welcher CD40-L/FC2 aufweist. Die 293-Zelllinie, eine permanente Linie der primären humanen embryonalen Niere, transformiert durch die humane Adenovirus-5-DNA, erlaubt die Expression rekombinanter Proteine ligiert in den pDC406-Vektor. Das CD40-L/FC2-Fusionsprotein in Überstandsfluid wurde durch Affinitätsreinigung gereinigt. Kurz, Kulturüberstand, welcher das CD40-L/FC2-Fusionsprotein enthält, wurde durch das Filtern von Säugetierzellenüberständen (z. B. in einem 0,45-μ-Filter) und das Auftragen des Filtrates auf eine Antikörperaffinitätssäule, welche biotinyliertes Ziegen-Antihuman-IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Westgrove, PA, USA) gekoppelt mit Streptavidin-Agarose (Pierce Chemical, Rockford, IL, USA) enthält, bei 4°C mit einer Fließrate von etwa 60 bis 80 ml/h für eine 1,5 cm × 12 cm Säule gereinigt. Die Säule wurde mit etwa 20 Säulenvolumen PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) gewaschen, bis im Waschpuffer kein freies Protein mehr nachweisbar war. Gebundenes Fusionsprotein wurde mit 12,5 mM Citratpuffer, 75 mM NaCl, pH 2,8 aus der Säule eluiert und mit 500 mM Hepespuffer, pH 9,1 auf pH 7 gebracht. Das gereinigte oligomere CD40-L/FC2-Peptid induzierte die humane B-Zellen-Proliferation in Abwesenheit anderer Co-Stimuli und führte (in Verbindung mit dem geeigneten Zytokin) zur Erzeugung von IgG, IgE, IgA und IgM, wie in Beispiel 12 für membrangebundenes CD40-L beschrieben.
BEISPIEL 15
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines CD40-L-DNA-Konstruktes für die Expression eines löslichen CD40-L-Fusionsproteins bezeichnet als trimeres CD40-L. Trimeres CD40-L enthält eine Leadersequenz, eine 33-Aminosäurensequenz bezeichnet als ein „Leucin-Zipper" (SEQ. ID. NR. 17) und eine hydrophile Acht-Aminosäurensequenz beschrieben von Hopp et al. (Hopp et al., Bio/Technology, 6: 1204, 1988; bezeichnet als Flag^®), gefolgt von der extrazellulären Region von humanem CD40-L von Aminosäure 50 bis Aminosäure 261 (SEQ. ID. NR. 11). Die Nützlichkeit der Leader- und der Flag^®-Sequenzen wurden im Abschnitt Detaillierte Beschreibung beschrieben. Die in SEQ. ID. NR. 17 dargestellte 33-Aminosäurensequenz trimerisiert spontan in Lösung. Von Fusionsproteinen, welche diese 33-Aminosäurensequenz enthalten, wird daher erwartet, dass sie spontan Trimere oder Multimere bilden.
Das Konstrukt wird durch Synthetisierung von Oligonukleotiden, welche eine Leadersequenz, die oben beschriebene 33-Aminosäurensequenz und die Flag^®-Sequenz darstellen, und die anschließende Ligation des Endproduktes an ein DNA-Fragment, welches die Aminosäuren 51 bis einschließlich 261 von SEQ. ID. NR. 11, wie in Beispiel 14 erzeugt, codiert hergestellt.
Das daraus resultierende Ligationsprodukt im Expressionsvektor pDC406 wurde in die Affennierenzelllinie CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) transfiziert. Das pDC406-Plasmid beinhaltet regulatorische Sequenzen abgeleitet von SV40, humanem Immundefizienzvirus (HIV) und dem Epstein-Barr-Virus (EBV). Die CV-1/EBNA-Zelllinie wurde durch Transfektion der CV-1-Zelllinie mit einem Gen abgeleitet, welches das Epstein-Barr-Virus-Kernantigen-1 (EBNA-1) codiert, welches stimuliert vom humanen CMV-Intermediate-Early-Enhancer/Promotor konstitutiv EBNA-1 exprimiert. Das EBNA-1-Gen erlaubt die episomale Replikation von Expressionsvektoren wie pDC406, welche den EBV-Replikationsursprung enthalten.
Nach der Identifikation von Zellen, welche das Fusionskonstrukt exprimieren, werden großangelegte Kulturen transfizierter Zellen gezüchtet, um Überstände aus Zellen anzusammeln, welche trimeres CD40-L exprimieren. Das trimere CD40-L-Fusionsprotein in Überstandsfluid wird durch Affinitätsreinigung im Wesentlichen wie in US-Patentschrift Nr. 5,011,912 beschrieben gereinigt. Silbergefärbte SDS-Gele des eluierten CD40-L-Fusionsproteins können zur Bestimmung der Reinheit hergestellt werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Isolierte, CD40-L-Polypeptid-codierende DNA-Sequenz, welche an CD40 bindet und ausgewählt ist aus: (a) DNA, welche die Nukleotide 46 bis einschließlich 828, 196 bis einschließlich 828, 193 bis einschließlich 762 von SEQ. ID. NR: 11 und deren komplementäre Stränge aufweist; (b) DNA, welche die Aminosäuren 1–261 von SEQ. ID. NR: 12 codiert; (c) DNA, welche die Aminosäuren 47–261 von SEQ. ID. NR: 12 codiert; (d) DNA, welche die Aminosäuren 51–261 von SEQ. ID. NR: 12 codiert; (e) DNA, welche ein Fragment von (c) oder (d) codiert; und (f) DNA, welche ein Komplement einer DNA ist, welche unter moderat stringenten Bedingungen (Vorwaschlösung aus 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von 50°C, 5 × SSC über Nacht) an die DNA aus (a) hybridisiert.
Isolierte, CD40-L-Polypeptid-codierende DNA, welche an CD40 bindet und ausgewählt ist aus: (a) DNA, welche die Nukleotide 1 bis einschließlich 783 von SEQ. ID. NR: 1 und ihren komplementären Strang aufweist; (b) DNA, welche die Aminosäuren 1 bis 260 von SEQ. ID. NR: 2 codiert; (c) DNA, welche die Aminosäuren 47 bis 260 von SEQ. ID. NR: 2 codiert; (d) DNA, welche ein Fragment von (b) oder (c) codiert; und (e) DNA, welche ein Komplement einer DNA ist, welche unter moderat stringenten Bedingungen (Vorwaschlösung aus 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von 50°C, 5 × SSC über Nacht) an die DNA aus (a) hybridisiert.
Isolierte DNA nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welche ferner eine DNA aufweist, welche ein Leucin-Zipper-Peptid codiert.
Isolierte DNA nach Anspruch 3, wobei das Leucin-Zipper-Peptid ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ist, die durch SEQ. ID. NR: 17 repräsentiert wird.
Isolierte DNA nach Anspruch 1 oder 2, welche ferner eine DNA aufweist, welche eine Immunglobulin-Fc-Region codiert.
Rekombinanter Expressionsvektor, welcher eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1–5 aufweist.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert oder transfiziert ist.
Verfahren zum Herstellen eines Polypeptides, welches das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 7 unter Bedingungen beinhaltet, welche die Expression des Polypeptides fördern.
Gereinigtes CD40-L-Polypeptid, welches an CD40 bindet und ein durch die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiertes Polypeptid aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 9, welches ein lösliches Monomer ist.
Oligomer, welches zwei oder mehr Polypeptide nach Anspruch 9 oder Anspruch 10 aufweist.
Oligomer nach Anspruch 11, welches ferner einen Leucin-Zipper aufweist.
Oligomer nach Anspruch 12, wobei der Leucin-Zipper SEQ. ID. NR: 17 enthält.
Oligomer nach Anspruch 11, 12 oder 13, welches ferner eine Fc-Region enthält.
Oligomer nach einem der Ansprüche 11 bis 14, welches ferner eine Linkersequenz enthält.
Verwendung eines löslichen monomeren Polypeptides nach Anspruch 10 beim Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung einer Allergie, einer allergischen Reaktion, Lupus, Rheumatoidarthritis oder einer Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion.
Impfstoffzusammensetzung, welche ein Oligomer nach einem der Ansprüche 11–15 als Adjuvans enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Polypeptid oder ein Oligomer nach einem der Ansprüche 9 bis 15 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Bindemittel enthält.
Verfahren zum Stimulieren von Hybridomzellen zum Erhöhen der monoklonalen Antikörpersekretion, wobei den Hybridomzellen eine wirksame Menge eines Oligomers nach einem der Ansprüche 11–15 verabreicht wird.
DNA, wie sie in SEQ. ID. NRn: 5, 6, 7, 9 oder 10 gezeigt ist, oder ihr RNA-Äquivalent oder ihr Komplement.