ES2198025T3

ES2198025T3 - Anticuerpos contra cd40-l.

Info

Publication number: ES2198025T3
Application number: ES98113461T
Authority: ES
Inventors: Richard J. Armitage; William C. Fanslow; Melanie K. Spriggs
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1991-10-25
Filing date: 1992-10-23
Publication date: 2004-01-16
Anticipated expiration: 2012-10-23
Also published as: NO941422L; FI981765A0; EP0667901A4; NO317625B1; DK0897983T3; CA2312667C; AU3122693A; DK0667901T3; WO1993008207A1; FI941837A0; JP2877788B2; FI941837L; CA2121798A1; DE69233402T2; EP0667901A1; EP0667901B2; JPH10150994A; ATE274055T1; DE69233051T2; FI116828B

Abstract

SE EXPONE UN ANTICUERPO AISLADO INMUNORREACTIVO CON EL CD40 - L O UN INMUNOGENO DEL CD40 - L.

Description

Anticuerpos contra CD40-L.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos contra la CD40-L.

Antecedentes de la invención

Las citoquinas que tienen una designación "interleuquina" son los factores proteicos que influyen en las células efectoras inmunes. Las citoquinas denominadas interleuquina-1 a interleuquina 12 se han descrito y llamado interleuquinas. Otras citoquinas conocidas incluyen el factor de necrosis tumoral (abreviadamente TNF), el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (abreviadamente GM-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos (abreviadamente G-CSF), el factor de crecimiento de mastocitos (abreviadamente MGF), factor de crecimiento epidérmico (abreviadamente EGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (abreviadamente PDGF), el factor de crecimiento neural (abreviadamente NGF), la eritropoyetina (abreviadamente EPO), el interferón \Box (abreviadamente \Box-IFN) y otros.

Se han clonado DNA para dos diferentes receptores de TNF (tipo I y tipo II) (Smith y col., Science 248: 1019, 1990); y Schall y col., Cell 61: 361, 1990). Ambas formas del receptor del TNF se relacionan mutuamente y pertenecen a una familia de receptores cuyos miembros incluyen el receptor del factor de crecimiento neural (Jonhson y col., Cell 47: 545, 1986), el antígeno CD40 de células B (Stamenkovic y col., EMBO J. 8: 1403, 1989), el antígeno OX40 de células T (Mallett y col., 9: 1063, 1990), el antígeno Fas humano (Itoh y col., Cell 66: 233, 1991) y el receptor 4-1BB de tipo murino (Kwon 1 col., Cell. Immunol. 121: 414, 1989 [Kwon y col. I] y Kwon 1 col., Proc. Natl. Acad Sci USA 86: 1963, 1989 [Kwon y col. II]).

La proteína CD40 humana (abreviadamente CD40) es un péptido de 227 aminoácidos que tiene un peso molecular de 30.600 y un péptido señal secretor de 19 aminoácidos que comprende aminoácidos hidrófobos predominantemente (Stamenkovic y col.). El peso molecular (exclusivo de glicosilación) de la proteína CD40 humana madura es 28.300. Se aisló un cDNA que codificaba la CD40 humana a partir de una biblioteca de cDNA preparada a partir de la línea celular Raji del linfoma de Burkitt. La proteína putativa codificada por el cDNA de CD40 contiene una secuencia líder putativa, un dominio transmembrana y otras numerosas características comunes a las proteínas re receptores unidos a membranas. Se ha encontrado que la CD40 se expresa en linfocitos B, células epiteliales y algunas líneas celulares de carcinomas.

Se ha mostrado que un anticuerpo monoclonal (mAb) dirigido contra CD40 media diversos efectos funcionales de células B humanas. Estos efectos incluyen: (a) adhesiones homotípicas (Gordon y col., J. Immunol. 140: 1425, 1988 [Gordon y col. I]); (b) aumento de tamaño celular (Gordon y col., I y Valle y col., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989); (c) proliferación de células B activadas con anti-IgM, anti-CD20 mAb, éster de forbol solo (Clark y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 83: 4494, 1986; y Paulie y col., J. Immunol. 142: 590, 1989), o éster de forbol combinado con interleuquina-4 (Gordon y col., Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987 [Gordon y col. II]); y (d) producción de IgE (Jabara y col., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; Zhang y col., J. Immunol. 146: 1836, 1991) e IgM (Gascan y col., J. Immunol. 147: 8, 1991) de cultivos agotados con T estimulados con interleuquina-4 (abreviadamente IL-4).

Dicho anticuerpo, llamado mAb 89 por Banchereau y col., Clin. Immunol. Spectrum 3: 8, 1991 [Banchereau y col. I] se encontró que inducía la proliferación de células B humanas a una concentración de anticuerpos relativamente baja (30 ng/ml o aproximadamente 10^{-10} M). La proliferación continuaba dos o tres semanas y daba como resultado una expansión de diez veces la población de células B humanas. La estimulación óptima de las células B ocurría cuando la molécula superficial de CD40 se reticula mediante la IgM. Los fragmentos Fab y otros fragmentos anti-CD40 mAb inducía solamente una respuesta proliferativa débil. Además, Banchereau y col., Science 251: 70, 1991 [Banchereau y col. II] describieron que las células B humanas restantes registraban un estado de proliferación sostenida cuando se incubaron tanto con una línea celular Ltk fibroblástica de tipo murino que se transfectaba con el receptor Fc humano como con un anticuerpo específico monoclonal para CD40 humano. Banchereau y col., II encontraron que la CD40 reticulada es necesaria para la expansión clónica de las células B.

CD23 es un receptor de IgE de baja afinidad que se ha encontrado que se expresa en la mayoría de las células B maduras de IgM^{-}/IgG^{-}, pro no células T. CD23 se ha secuenciado y su secuencia se ha descrito en Kikutani y col., Cell 47: 657, 1986. Se encontró que el CD23 soluble (abreviadamente sCD23) induce una reacción pirogénica en conejos y esta reacción se invalidó mediante la administración de una IgE humana (Ghaderi y col., Immunology 73: 510, 1991). Por consiguiente, CD23 puede ser un marcador adecuado para los efectos de CD40 o CD40-L solubles.

Antes de la presente invención, se desconocía un ligando para CD40. Consecuentemente existe una necesidad en la técnica de identificar y caracterizar un ligando de CD40 (CD40-L).

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales aislados como se indica en la reivindicación 1 y reivindicación 2. Una citoquina denominada en lo sucesivo en esta memoria descriptiva "CD40-L" se ha aislado y caracterizado. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de cDNA de CD40-L representativa de tipo murino se describen en la SEC ID Nº 1 y la figura 1 y la secuencia de aminoácidos también se enumera en la SEC ID Nº 2. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de nucleótidos deducida de cDNA de CD40-L representativa de tipo murino se describen en la SEC ID Nº 11 y la figura 2 y la secuencia de aminoácidos también se enumera en la SEC ID Nº 12. Otros polipéptidos de CD40-L se pueden codificar mediante secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones de rigurosidad moderada o intensa a sondas definidas por la SEC ID Nº 11 (la región que codifica CD40-L de tipo humano), los fragmentos de la secuencia que se extiende desde el nucleótido 46 al nucleótido 828 de la SEC ID Nº 11, o a las secuencias de DNA o RNA complementarias a la figura 2 (SEC ID Nº 11) o fragmentos de los mismos.

CD40-L es un polipéptido de membrana de tipo II que tiene una región extracelular en su extremo C, una región transmembrana y una región intracelular en su extremo N. Se ha encontrado una versión soluble de CD40-L de tipo murino en sobrenadantes de células EL-4 y células EL-4 separadas en función de una proteína de fusión CD40/Fc biotinilada descrita en esta memoria descriptiva. La CD40-L soluble comprende una región extracelular de CD40-L o un fragmento de la misma. La secuencia de proteínas de CD40-L de tipo murino se describe en la figura 1 y la SEC ID Nº 2, y la CD40-L de tipo humano en la figura 2 y SEC ID Nº 12. La región extracelular de CD40-L de tipo murino se extiende desde el aminoácido 47 al aminoácido 260 en la figura 1 y SEC ID Nº 2, y la CD40-L de tipo humano desde el aminoácido 47 al aminoácido 261 en la figura 2 y SEC ID Nº 12. La actividad biológica de CD40-L está mediada mediante la unión de esta citoquina con CD40 e incluye la proliferación de células B y la inducción de secreción de anticuerpos, incluyendo la secreción de IgE.

Los fragmentos de péptidos de CD40-L que corresponden a una secuencia de proteínas de al menos 10 aminoácidos seleccionados de la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 11 que pueden actuar como inmunógenos para generar anticuerpos específicos a los inmunógenos CD40-L. Dichos fragmentos inmunógenos de CD40-L pueden servir como determinantes antigénicos para proporcionar anticuerpos monoclonales específicos para CD40-L.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes a CD40-L de tipo murino. Esta proteína es un polipéptido de tipo II que tiene su extremo N como su dominio intracelular, seguido de una región transmembrana y un dominio extracelular en el extremo C del polipéptido. El dominio extracelular, que es más largo que bien el dominio intracelular o la región transmembrana, contiene un sitio potencial de glicosilación unido a N y dos enlaces potenciales disulfuro a la vista de cuatro residuos de cisteína (Cys).

La figura 2 ilustra secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes a la CD40-L de tipo humano. Esta proteína es un polipéptido de tipo II que tiene su extremo N como su dominio intracelular, seguido de una región transmembrana y un dominio extracelular en el extremo C del polipéptido. El dominio extracelular que es más largo que bien el dominio intracelular o la región transmembrana, contiene un sitio potencial de glicosilación unido a N y dos enlaces potenciales disulfuro a la vista de 5 residuos de cisteína (Cys).

La figura 3 ilustra una comparación de secuencias de proteínas de CD40-L de tipo humano y murino que muestran una homología del 77,7% a nivel de aminoácidos.

La figura 4 ilustra una proliferación de células mononucleares de sangre periférica (abreviadamente PBMC) humana agotadas con células T ocasionadas por la incubación con células CV1 transfectadas con cDNA de CD40-L de tipo murino de longitud completa (SEC ID Nº 1) y que expresa CD40-L unida (CD40-L + células CV1) cuando se compraran con células CV1 transfectadas con el vector vacío (HAVEO) y que no expresa CD40-L unida de tipo murino. Los resultados de la proliferación el día 7 muestran que la CD40-L + células CV1 incrementan significativamente la proliferación de PBMC agotadas con células T en presencia o ausencia de la interleuquina-4 (IL-4).

La figura 5 ilustra una segunda determinación de la proliferación de PBMC agotadas con células T con adición de CD40-L unida de tipo murino y 10 ng/ml de IL-4. Estos datos no muestran ningún efecto comitogénico de IL-4 sino un fuerte efecto mitogénico continuado de CD40-L unida.

La figura 6 ilustra que la CD40-L unida aumenta la secreción de IgE.

La figura 7 ilustra que la CD40-L unida a membrana estimula la separación de CD23 en presencia de IL-4.

La figura 8 ilustra la proliferación de células B esplénicas de tipo murino originadas por CD40-L de tipo murino unida a membrana o células 7A1 que es un clon de células auxiliares T.

La figura 9 ilustra una comparación de células El40.9 de tipo murino, una línea celular separadas que se separaron en función de la expresión de CD40-L de tipo murino y 7A1 de células T para la inducción de una respuesta de un antígeno específico indicada por las células formadoras de placas (abreviadamente PFC) mediante anti - glóbulos rojos de oveja (abreviadamente SRBC).

La figura 10 ilustra una comparación de la actividad proliferativa de células B de CD40-L unida a membrana y otros tipos de células transfectadas con diferentes cDNA. La CD40-L unida a la membrana mostraba significativamente una mayor actividad proliferativa de células B que un clon de células auxiliares u otras células de control.

La figura 11 ilustra que las células 7C2 (un clon de células auxiliares T) y las células CV1 transfectadas con cDNA de CD40-L de tipo murino inducen células formadoras de placas anti SRBC.

La figura 12 ilustra una comparación de dos clones de células auxiliares T con células que expresan CD40-L unida a membranas para inducir la proliferación de células B.

La figura 13 ilustra la inducción de células formadoras de placas de antígeno específico mediante CD40-L unida a membrana y un clon de células T auxiliares en presencia o ausencia de la interleuquina 2 (IL-2) añadida.

La figura 14 muestra los efectos de CD40-L unida a membrana que estimulan la proliferación de células B y la secreción de IgE. Los efectos de CD40-L unida a membrana se inhibieron mediante el receptor de CD40 pero no por el receptor del TNF.

Descripción detallada de la invención

Se han aislado y secuenciado los polipéptidos que pueden actuar como un ligando para CD40 de tipo murino y humano. Más particularmente, se han aislado y secuenciado los cDNA que codifican estos ligandos. Se proporcionan además los procedimientos para expresión de los polipéptidos de CD40-L recombinantes. Los polipéptidos

\hbox{CD40-L}

incluyen otras formas de CD40-L de mamíferos tales como los derivados o análogos de CD40-L de tipo humano o. murino Las CD40-L de tipo murino y humano comprenden una región extracelular de 214 y 215 aminoácidos respectivamente en el extremo C del polipéptido unido a membrana de longitud completa. La región extracelular contiene el dominio que se une a CD40. La CD40-L de tipo murino y humano comprende una región transmembrana de 24 aminoácidos homólogos de tipo hidrófobo diseñada mediante aminoácidos cargados sobre cualquier lateral y una región intracelular de 22 aminoácidos en sus extremos N. En esta memoria descriptiva se describen los polipéptidos de CD40-L de longitud completa o fragmentos de los mismos que comprenden toda o parte de la región extracelular o derivados de la región extracelular y células de mamíferos transfectadas con un cDNA que codifica CD40-L de tipo murino o humano y que expresan CD40-L de tipo humano o murino como una proteína unida a membrana.

La citoquina descrita en esta memoria descriptiva es un ligando para CD40, un receptor que es un miembro de la superfamilia del receptor de TNF. Por consiguiente, la CD40-L es probablemente responsable de la señal de transducción mediante CD40, que se sabe que se expresa, por ejemplo, mediante linfocitos B. La CD40-L de longitud completa es un polipéptido unido a membrana con una región extracelular en su extremo C, una región transmembrana y una región intracelular en su extremo N. Se puede elaborar una versión soluble de CD40-L a partir de la región extracelular o un fragmento de la misma y se ha encontrado una CD40-L soluble en los sobrenadantes de los cultivos de las células que expresan una versión unida a membrana de CD40-L. La secuencia proteica de la región extracelular de CD40-L de tipo murino se extiende desde el aminoácido 47 hasta el aminoácido 260 en la figura 1 y la SEC ID Nº 2. La secuencia proteica de la región extracelular de CD40-L de tipo humano se extiende desde el aminoácido 47 hasta el aminoácido 261 en la figura 2 y la SEC ID Nº 12. La actividad biológica de CD40-L está mediada por la unión a CD40 o a un homólogo de especie específica del mismo y comprende la proliferación de células B y la inducción de la secreción de inmunoglobulinas a partir de las células B activadas. La CD40-L (que incluye formas monoméricas y oligoméricas solubles, así como las formas unidas a membranas) pueden efectuar la proliferación de células B y la secreción de inmunoglobulinas (excepto la secreción de IgE) sin la presencia de IL-4 añadida, en contraste a los anticuerpos anti-CD40 que requieren IL-4 y reticulación para mediar la actividad.

La CD40-L se refiere a un género de polipéptidos que son capaces de unirse a CD40, u homólogos de mamíferos de CD40. Como se utiliza en esta memoria descriptiva el término "CD40-L" incluye los polipéptidos de CD40-L solubles carentes de regiones transmembrana e intracelulares, los homólogos de mamíferos de CD40-L de tipo humano, los análogos de CD40-L de tipo humano o murino o derivados de CD40-L de tipo humano o murino.

La CD40-L también se puede obtener mediante mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de CD40-L. Un análogo de CD-40L, como se refiere en esta memoria descriptiva, es un polipéptido sustancialmente homólogo a una secuencia de CD40-L de tipo humano o murino pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente del polipéptido de CD40-L (especie humana o murina) de la secuencia nativa debido a una o una pluralidad de supresiones, inserciones o sustituciones. Los análogos de CD40-L se pueden sintetizar a partir de las construcciones de DNA preparadas mediante la síntesis y ligación de oligonucleótidos o mediante técnicas de mutación en un sitio específico.

La estructura primaria de aminoácidos de CD40-L de tipo humano o murino se puede modificar para crear derivados de CD40-L mediante la formación de conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos, tales como los grupos glicosilo, lipídicos, fosfato, grupos acetilo y similares, o mediante la creación de mutantes de la secuencia de aminoácidos. Los derivados covalentes de CD40-L se preparan mediante la unión de grupos funcionales particulares a las cadenas laterales de los aminoácidos de CD40-L o en el extremo N o el extremo C de un polipéptido de

\hbox{CD40-L}

o el dominio extracelular de los mismos. Otros derivados de CD40-L dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregados de CD40-L o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante síntesis en cultivo recombinante como fusiones del extremo N o extremo C. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia señal o líder de polipéptidos en la región terminal N o la región terminal C de un polipéptido de CD40-L que dirige cotraduccionalmente o post-traduccionalmente la transferencia del conjugado desde su sitio de síntesis a un sitio en el interior o exterior de la membrana celular o pared celular (por ejemplo, el líder del factor \alpha de Saccharomyces). Las fusiones de los polipéptidos de CD40-L pueden comprender los polipéptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de CD40-L (por ejemplo poli-His), o fusiones con otras citoquinas para proporcionar entidades polifucionales nuevas. Otras citoquinas incluyen, por ejemplo, cualquiera de las interleuquinas 1 a 13, el TNF (factor de necrosis tumoral), el GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos), el G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos), el MGF (factor de crecimiento de mastocitos), el EGF (factor de crecimiento epidérmico), el PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas), el NGF (factor de crecimiento neural), la EPO (eritropoyetina), el \gamma-IFN (interferón gamma), el 4-1BB-L (ligando 4-1BB) y otras citoquinas que afectan al crecimiento diferenciación o función celular inmune.

Por ejemplo, la actividad biológica de CD40-L se puede determinar mediante competición de unión al dominio de unión al ligando de CD40 (es decir, ensayos de unión competitiva). Tanto la CD40-L de tipo murino como la CD40-L de tipo humano se unen a CD40 de tipo humano. La afinidad de unión de CD40-L de tipo murino (expresada en células de EL-40.9 de tipo murino separadas) para CD40 de tipo humano era aproximadamente 1,74 x 10^{9} M^{-1}. De manera similar, la afinidad de unión de CD40-L (expresada en células EL-46.1 de tipo murino no separadas) para CD40 de tipo humano era aproximadamente 2,3 x 10^{9} M^{-1}. Ambas mediciones de afinidad de unión se encuentran dentro de un intervalo típico de la unión citoquina/receptor de citoquina.

Una configuración de un ensayo de unión competitiva para los polipéptidos de CD40-L utiliza una CD40-L soluble de tipo murino marcado radiactivamente según la figura 1 (SEC ID Nº 1) o CD40-L de tipo murino según la figura 2 (SEC ID Nº 11) y células intactas que expresan CD40 (por ejemplo células B humanas). En lugar de células intactas, se puede sustituir la CD40 soluble (tal como una proteína de fusión CD40/Fc) unida a una fase sólida mediante una interacción de una proteína A o proteína G con la región Fc de la proteína de fusión. Una segunda configuración de un ensayo de unión competitiva utiliza CD40 soluble marcada radiactivamente tal como una proteína de fusión CD40/Fc y células intactas que expresan CD40-L. Alternativamente, la CD40-L soluble se podría unir a una fase sólida.

Los ensayos de unión competitiva se pueden realizar usando metodología estándar. Por ejemplo, CD40-L de tipo murino marcada radiactivamente se puede usar para competir con un homólogo de CD40-L putativo para ensayar la actividad de unión contra CD40 unida superficialmente. Los resultados cualitativos se pueden obtener mediante ensayos de unión competitiva de placas autorradiográficas, o se pueden utilizar los gráficos Scatchard para generar resultados cuantitativos.

Los ensayos de unión competitiva con células intactas que expresan CD40 se pueden realizar mediante dos procedimientos. En un primer procedimiento, las células se hacen crecer bien en suspensión o mediante adherencia a placas de cultivo de tejidos. Las células adherentes se pueden separar mediante tratamiento con EDTA 5 mM durante diez minutos a 37ºC. En un segundo procedimiento se pueden usar las células COS transfectadas que expresan CD40 unida a membrana. Las células COS u otra célula de mamífero se puede transferir con cDNA de CD40 de tipo humano en un vector apropiado para expresar CD40 de longitud completa con una región extracelular exterior a la célula.

Alternativamente, la CD40 soluble se puede unir a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna, o un tubo o sustrato similar adecuado para el análisis con el fin de detectar la presencia de un resto tal como ^{125}I. Por ejemplo, la unión a una fase sólida se puede llevar a cabo obteniendo una proteína de fusión CD40/Fc y uniéndola a una superficie de la proteína A o proteína G.

Otros medios para medir la actividad biológica de CD40-L y sus homólogos de la misma es utilizar CD40 conjugada soluble (por ejemplo, ^{125}I-CD40/Fc) en ensayos de competición similares a los descritos anteriormente. Sin embargo, en este caso las células intactas que expresan CD40-L o CD40-L soluble unidas a un sustrato sólido se utilizan para medir la competición de la unión de CD40 a CD40-L soluble mediante una muestra que contenía un homólogo de CD40 putativo.

CD40-L se puede también ensayar midiendo la actividad biológica en un ensayo de proliferación de células B. Las células B humanas se pueden obtener a partir de tonsilas humanas mediante la purificación por selección negativa y sedimentación de densidad Percoll, como describen Defrance y col., J. Immunol. 139: 1135, 1987. Las líneas celulares del linfoma de Burkitt se pueden usar para medir la proliferación celular en respuesta a CD40-L. Los ejemplos de las líneas celulares del linfoma de Burkitt incluyen, por ejemplo, Raji (ATCC CCL 86), Daudi (ATCC CCL 213) y Namalwa (ATCC CRL 1432). La CD40-L unida a membrana estimulaba la proliferación de células B. La CD40-L oligomérica, preferiblemente dimérica puede estimular la proliferación de células B. El CD40 (receptor) antagoniza la proliferación de CD40-L de células B.

Todavía otro ensayo para determinar la actividad biológica de CD40-L es medir la inmunoglobulina producida por células B en respuesta a la activación mediante CD40-L o un derivado o análogo de la misma. La secreción de inmunoglobulinas policlonales se puede medir, por ejemplo, mediante la incubación con 5 x 10^{5} células B/ml en cultivo durante al menos 7 días. La producción de inmunoglobulinas (Ig) se puede medir mediante un ensayo ELISA tal como el descrito en Maliszewski y col., J. Immunol. 144: 3028, 1990 [Maliszewski y col. I] o Maliszewski y col., Eur J. Immunol. 20: 1735, 1990 [Maliszewski y col. II]. Por ejemplo, las células B de tipo murino se pueden obtener a partir de ratones y cultivarse según los procedimientos descritos en Grabstein y col., J. Exp. Med. 163: 1405, 1986 [Grabstein y col. I], Maliszewski y col., I, y Maliszewski y col. II.

La CD40-L se puede usar en un ensayo de unión para detectar células que expresan CD40. Por ejemplo, la

\hbox{CD40-L}

de tipo murino según la figura 1 (SEC ID Nº 1) o la CD40-L de tipo humano según la figura 2 (SEC ID Nº 11), o un dominio extracelular o un fragmento de la misma se puede conjugar a un resto detectable tal como ^{125}I. El marcaje con radiactividad con ^{125}I se puede realizar con cualquiera de las varias metodologías estándar que producen una molécula ^{125}I - CD40-L funcional marcada con una actividad específica alta. Alternativamente, se puede usar otro resto detectable tal como una enzima que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las células que expresan CD40 se pueden poner en contacto con CD40-L conjugado. Después de la incubación, la

\hbox{CD40-L}

conjugada unida se separa y se mide la unión utilizando el resto detectable.

Los polipéptidos de CD40-L pueden existir en forma de oligómeros, tales como dímeros o trímeros. Los oligómeros se unen mediante enlaces disulfuros formados entre residuos de cisteína en diferentes polipéptidos de

\hbox{CD40-L}

. Alternativamente, se pueden unir dos dominios de CD40-L solubles con una secuencia de engarce Gly_{4}SerGly_{5}Ser, u otra secuencia de engarce descrita en la patente de Estados Unidos 5.073.627 que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Los polipéptidos de CD40-L también se pueden crear mediante la fusión del terminal G de CD40-L soluble (dominio extracelular) a la región Fc de IgG1 (por ejemplo, la SEC ID Nº 3) como se describe para la proteína de fusión CD40/Fc. Las proteínas de fusión CD40-L/Fc se deja que se ensamblen con cadenas pesadas muy similares de una molécula de anticuerpos para formar CD40-L divalente. Si las proteínas de fusión están hechas tanto con cadenas pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible que formen un oligómero de CD40-L con tantas como cuatro regiones extracelulares de CD40-L.

Las proteínas de fusión se pueden preparar usando técnicas convencionales de corte y ligadura de fragmentos de las secuencias deseadas. Las técnicas de PCR que emplean oligonucleótidos sintéticos se pueden usar para preparar y/o ampliar los fragmentos deseados. Los oligonucleótidos sintéticos de solapamiento que representan las secuencias deseadas también se pueden utilizar para preparar construcciones de DNA que codifican proteínas de fusión. Las proteínas de fusión también pueden comprender CD40-L y dos o más secuencias adicionales, incluyendo una secuencia líder (o péptido señal), la región Fc, la secuencia de engarce y las secuencias que codifican los restos altamente antigénicos que proporcionan un medio de purificación fácil o detección rápida de una proteína de fusión.

Los péptidos señal facilitan la secreción de proteínas de las células. Un péptido señal ejemplar es el terminal amino de 25 aminoácidos de la secuencia líder de una interleuquina-7 humana (IL-7; Goodwin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86: 302, 1989; figura 2 B). Se pueden emplear otros péptidos señal. Por ejemplo, ciertos nucleótidos en la secuencia líder de IL-7 se pueden modificar sin alterar la secuencia de aminoácidos. Adicionalmente, se pueden hacer los cambios de aminoácidos que no afecten a la capacidad de la secuencia de IL-7 para actuar como secuencia líder.

El octapéptido Flag® (Asp – Tyr – Lys – Asp - Asp - Asp - Asp - Lys) no altera la actividad biológica de las proteínas de fusión, es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente mediante un anticuerpo monoclonal específico, que permite la rápida detección y la fácil purificación de la proteína de fusión expresada. La secuencia Flag® se escinde también específicamente mediante la enteroquinasa de la mucosa bovina en el residuo inmediatamente siguiente al apareamiento Asp - Lys, las proteínas de fusión tapadas con este péptido también pueden ser resistentes a la degradación intracelular en E. coli. Un anticuerpo monoclonal de tipo murino que se une a la secuencia Flag® se ha depositado con el número de acceso HB 9259 en la ATCC; los procedimientos de uso del anticuerpo en la purificación de las proteínas de fusión que comprende la secuencia Flag® se describen en la patente de Estados Unidos 5.011.912 que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia.

Las regiones Fc adecuadas se definen como las regiones Fc que se pueden unir a la proteína A o a la proteína G, o alternativamente se reconocen por un anticuerpo que se pueden usar en la purificación o detección de una proteína de fusión que comprende la región Fc. Preferiblemente las regiones Fc incluyen la región Fc de IgG_{1} de tipo humano o IgG_{1} de tipo murino. Un ejemplo es la región Fc de IgG_{1} de tipo humano mostrada en la SEC ID Nº 3; otro ejemplo es una región Fc codificada por cDNA obtenido por PCR de cebadores de oligonucleótidos de la SEC ID Nº 9 y la SEC ID Nº 10 con cDNA humano como molde. También se pueden usar las porciones de una región Fc adecuadas, por ejemplo, una región Fc de IgG_{1} de tipo humano que ha suprimido una secuencia de aminoácidos responsable de la unión a la proteína A, tal como la región Fc resultante se une a la proteína G pero no a la proteína A.

La secuencia repetida [Gly_{4}Ser]_{3} proporciona una secuencia de engarce que separa la región extracelular de la CD40-L de la porción Fc de la proteína de fusión mediante una distancia suficiente para asegurar que la CD40-L se pliega adecuadamente en sus estructuras secundarias y terciarias. Las secuencias de engarce adecuadas (1) adoptarán una conformación extendida flexible, (2) no exhibirán una propensión para desarrollar una estructura secundaria ordenada que podría interactuar con los dominios funcionales de las proteínas de fusión, y (3) tendrá un carácter mínimo hidrófobo o cargado que podría promover la interacción con los dominios funcionales proteicos. Los aminoácidos superficiales típicos en las regiones proteicas flexibles incluyen Gly, Asn y Ser. Virtualmente cualquier permutación de las secuencias de aminoácidos que contienen Gly, Asn y Ser se esperaría que satisfaga el criterio anterior para una secuencia de engarce. También se pueden utilizar otros aminoácidos neutros, tales como Thr y Ala en la secuencia del engarce. La longitud de la secuencia de engarce puede variar sin afectar significativamente a la actividad biológica de la proteína de fusión. Las secuencias de engarce son innecesarias si las proteínas que se fusionan tienen regiones de aminoácidos no esenciales con terminal N- o C- que se pueden usar para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia sérica.

Los polipéptidos de CD40-L pueden existir en forma de polipéptidos solubles que comprenden el dominio extracelular de CD40-L como se muestra en la figura 1 (SEC ID Nº 1) y la figura 2 (SEC ID Nº 11) o en forma de polipéptidos unidos a membranas que comprenden el dominio extracelular, una región transmembrana y un dominio extracelular corto, como se muestra en la figura 1 (SEC ID Nº 1) y la figura 2 (SEC ID Nº 11) para las secuencias de tipo murino y humano respectivamente. Además, la presente invención comprende los oligómeros de los dominios extracelulares de CD40-L o sus fragmentos unidos mediante interacciones disulfuro o expresados como polímeros de fusión con o sin grupos de unión a aminoácidos espaciadores. Por ejemplo, una molécula dimérica de CD40-L se puede unir mediante un grupo de unión de la región IgGFc.

Sin reducirse a la teoría, CD40-L unido a membrana y CD40-L oligomérica pueden lograr la formación de Ig estimuladora de actividad y proliferación de células B previamente solamente conseguida mediante la reticulación del anticuerpo anti-CD40 en presencia de IL-4. Además parece probable que la CD40-L soluble monomérica que comprende solamente el dominio extracelular de CD40-L y es capaz de unirse al receptor de CD40 servirá para antagonizar la actividad de CD40-L unida a membrana y oligomérica y/o anticuerpos anti-CD40 reticulados. Además parece probable que la interacción de CD40-L unida a membrana con CD40 es la principal interacción molecular responsable de la inducción dependiente del contacto de células T del crecimiento de células B y diferenciación tanto para la producción de anticuerpos de antígenos específicos como la secreción de Ig policlonal. En este aspecto, una célula de mamíferos transfectada con un cDNA que codifica la CD40-L de longitud completa (es decir, estando unida a membrana y teniendo un dominio intracelular, una región transmembrana y un dominio extracelular o un fragmento del mismo) pueden imitar a las células T en su capacidad para inducir el crecimiento de las células B, diferenciación y estimulación de la producción del anticuerpo de antígeno específico. Parece que las actividades de la CD40-L soluble oligomérica, preferiblemente un dímero de las regiones extracelulares puede imitar las actividades biológicas de la CD40-L unida a membrana. Además, la CD40-L soluble monomérica (que comprende el dominio extracelular o un fragmento del mismo) se puede unir al receptor CD40 para evitar la interacción de células T con las células B y por esto tienen una actividad similar al dominio extracelular de CD40 (receptor) que puede estar él mismo en forma monomérica u oligomérica. Alternativamente, la CD40-L puede ser oligómerica (preferiblemente dímera) para actuar como un factor soluble capaz de inducir el crecimiento de células B, la diferenciación y la estimulación de producción de anticuerpos de antígenos específicos. Consecuentemente, parece que la CD40-L unida a membrana y la CD40-L oligomérica actúan como agonistas de CD40, mientras la CD40-L (monomérico) soluble y la CD40 soluble actúan como antagonistas de CD40 mediante el bloqueo de los sitios de los receptores de CD40 sin transducir significativamente la señal o evitando la unión de CD40-L a los sitios CD40 en las células B y otras células diana.

Tanto los agonistas CD40 como los antagonistas CD40 tendrán una actividad terapéutica útil. Por ejemplo, los agonistas CD40 (es decir, la CD40-L unida a membrana y la CD40-L oligomérica) son útiles como adyuvantes de vacunas y para estimular la producción de mAb a partir de las células de hibridoma. Los antagonistas de CD40 (es decir, el receptor de CD40, CD40/Fc y posiblemente la CD40-L soluble monomérica) son útiles para tratar enfermedades autoinmunes caracterizadas por la presencia de altos niveles de complejos antígeno - anticuerpo, tales como alergia, lupus, artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina (abreviadamente IDDM) enfermedad injerto contra huésped (abreviadamente GVHD) y otras.

La secreción de IgE desde las células B humanas se pueden inducir mediante IL-4 en presencia de células T (Vercelli y col., J. Exp. Med. 169: 1295, 1989). Además, la producción de IgE se puede inducir a partir de PBM (células mononucleares de sangre periférica) agotadas con células T mediante la adición de un anti-CD40 mAb (Jabara y col., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990 y Zhang y col., J Immunol. 146: 1836, 1991). Además la presente invención incluye un procedimiento para inhibir la producción de IgE de las células B activadas, activada mediante IL-4 en presencia de células T o mediante CD40-L (preferiblemente, CD40-L unida a membrana), que comprende la administración de una cantidad eficaz de una proteína de fusión CD40/Fc, como se describe en esta memoria descriptiva o una CD40 soluble codificada por la secuencia de cDNA descrita en la SEC ID Nº 3. De manera similar, los receptores de CD40 y posiblemente CD40-L soluble (solamente monómero) pueden también bloquear la secreción de otros isotipos de anticuerpos.

Además la presente invención incluye los polipéptidos de CD40-L con o sin glicosilación asociada al modelo nativo. La CD40-L expresada en sistemas de expresión de levaduras o de mamíferos (por ejemplo, células COS-7) pueden ser similares o significativamente diferentes del polipéptido de CD40-L nativo en peso molecular y modelo de glicosilación dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de los polipéptidos de CD40-L en los sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas.

Se pueden preparar construcciones de DNA que codifican diversas adiciones o sustituciones de residuos o secuencias de aminoácidos, o supresiones de residuos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica o unión. Por ejemplo, el sitio de glicosilación N de CD40-L extracelular se puede modificar para imposibilitar la glicosilación mientras que permite la expresión de un análogo de carbohidratos homogéneos reducidos usando sistemas de expresión de levaduras. Los sitios de glicosilación N en polipéptidos de eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn - X - Y, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Las modificaciones adecuadas a la secuencia de nucleótidos que codifican este triplete darán como resultados sustituciones, adiciones o supresiones que evitan la unión de residuos de carbohidratos en la cadena lateral de Asn. En otro ejemplo, las secuencias que codifican los residuos Cys se pueden alterar para provocar que los residuos Cys se supriman o se sustituyan con otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos en la renaturalización. La CD40-L de tipo humano comprende cinco residuos Cys en su dominio extracelular. De este modo, al menos uno de los cinco residuos Cys se puede reemplazar con otro aminoácido o suprimirse sin que afecte a la estructura terciaria de las proteínas o formación de enlaces disulfuro.

Otros planteamientos a la mutagénesis implican la modificación de secuencias que codifican los residuos aminoácidos dibásicos para potenciar la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad de la KEX2 proteasa. Las subunidades de un polipéptido de CD40-L se puede construir mediante la supresión de secuencias que codifican los residuos o secuencias terminales o internas.

Los polipéptidos de CD40-L se codifican mediante genes multiexón. Además la presente invención incluye construcciones de mRNA alternativas que se pueden atribuir a diferentes sucesos de corte y ensamblaje de mRNA que siguen a la transcripción y que comparten regiones de identidad o similitud con los cDNA descritos en esta memoria descriptiva.

La secuencia de cDNA de CD40-L de tipo murino se obtuvo mediante técnicas de expresión directa. La secuencia de CD40-L se obtuvo mediante técnicas de hibridación cruzada entre especies que usan el cDNA de CD40-L de tipo murino como sonda.

Los autores clonaron CD40-L de tipo murino primero mediante la obtención de un clon de la región extracelular de CD40 (el receptor) de tipo humano mediante las técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (abreviadamente PCR) usando cebadores a base de una secuencia publicada en Stamenkovic y col (SEC UD Nº 4). Un cebador de oligonucleótidos hacia arriba 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (SEC ID Nº 5) introduce un sitio Sal 1 hacia arriba de un iniciador metionina de CD40 y un cebador de oligonucleótidos hacia abajo 5' -CCGTCGACGTCTAGAGCCGATCCTGGGG-3' (SEC ID Nº 6) inserta un codón de terminación después del aminoácido 192 de CD40, seguido de sitios Xba 1 y Sal 1. El cDNA amplificado se digiere con Sal 1 y se clona en pDC406 (McMahan y col., EMBO J. 10: 2821, 1991) para construir pDc406/s CD40.

Un segundo fragmento de receptor de CD40 (SEC ID Nº 4) se obtuvo mediante técnicas de PCR para la fusión al dominio Fc de IgG1 humana (SEC ID Nº 3). Brevemente, el cebador de oligonucleótidos hacia arriba (SEC ID Nº 5) y molde de fusión (SEC ID Nº 4) eran los mismos que los descritos anteriormente. El cebador de oligonucleótidos hacia abajo era 5' -ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC -3' (SEC ID Nº 7) que inserta los aminoácidos Tyr Val Glu Pro Arg (SEC ID Nº 8) después del aminoácido 193 de CD40. Glu y Pro son los dos primeros aminoácidos de una región articulada de IgG1 humana y están seguidos de un sitio de restricción Bgl II. El sitio de restricción Bgl II se usó para fusionar el dominio extracelular de CD40 al residuo de la región Fc de IgG1 humana.

Otras proteínas de fusión que comprenden los dominios de unión a ligandos desde otros receptores se pueden preparar mediante la obtención de una secuencia de DNA para el dominio de unión al ligando de un receptor y fusionando esta secuencia a una secuencia de DNA que codifica una región Fc de una molécula de anticuerpo que se una a la proteína A o a la proteína G u otro polipéptido que es capaz de la purificación por afinidad, por ejemplo, avidina o estreptavidina. La construcción génica resultante se puede introducir en células de mamíferos para expresar transitoriamente una proteína de fusión.

Las proteínas de fusión receptor/Fc se pueden purificar mediante purificación por afinidad de la proteína A o la proteína G. Las proteínas de fusión receptor/avidina se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad de biotina. Posteriormente se puede retirar la proteína de fusión de la columna eluyendo con una solución de alta concentración de sal u otro tampón adecuado.

Los autores obtuvieron un cDNA que codifica la región Fc de IgG1 humana mediante amplificación por PCR usando cDNA de células humanas como molde y un cebador de oligonucleótidos hacia arriba 5'-TATTAATCATTCAGTA-GGGCCCAGATCTTGTGACAAAACTCAC-3' (SEC ID Nº 9) y un cebador de oligonucleótidos hacia abajo 5'-GCCAGCTTAACTAGTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA-3' (SEC ID Nº 10). El cDNA amplificado por PCR introdujo un sitio Bgl II cerca del comienzo de la unión articulada que se utilizó para ligar el dominio extracelular de CD40 a la construcción cDNA de fusión de sCD40/Fc, que se ligó en pDC406 para construir pD406/CD40/Fc. Otras regiones adecuadas Fc se definen como cualquier región que se puede unir con alta afinidad a la proteína A o a la proteína G e incluye la región Fc de IgG1 de tipo humano o IgG1 de tipo murino. Un ejemplo es la región Fc de IgG1 de tipo humano mostrada en la SEC ID Nº 3 o el cDNA obtenido mediante PCR de cebadores de oligonucleótidos de la SEC ID Nº 9 y la SEC ID Nº 10 con cDNA humano como molde.

Preferiblemente las moléculas de fusión Receptor/Fc se sintetizan en cultivo de células de mamíferos recombinantes debido a que en general son demasiado grandes y complejas para sintetizarse mediante procedimientos de expresión en procarióticos. Los ejemplos de células de mamíferos adecuados para expresar una proteína de fusión de receptor/Fc incluyen células CV - 1 (ATCC CCL 70) y células COS 7 (ATCC CRL 1651) ambos derivados de riñón de mono.

La construcción pDC406/CD40/Fc de DNA se transfectó en la línea celular de riñón de mono CV - 1/EBNA (ATCC CRL 10478). El plásmido pDC406 incluye secuencias reguladoras derivadas de SV40, virus de inmunodeficiencia humana (abreviadamente VIH) y virus de Epstein - Barr (abreviadamente VEB). La línea celular CV - 1/EBNA se derivó mediante transfección de la línea celular CV – 1 con un gen que codifica el antígeno-1 nuclear del virus Epstein - Barr (abreviadamente EBNA-1) y expresa constitutivamente EBNA-1 conducido desde el potenciador/promotor inmediato/temprano de CMV humano. Un gen EBNA-1 permite la replicación episomal de vectores de expresión tales como pDC406 que contienen el origen EBV de la replicación.

Los transfectantes que expresan la proteína de fusión CD40/Fc se identifican inicialmente usando transferencia de puntos o transferencia de Western. Después los sobrenadantes se someten a transferencia de puntos o electroforesis en gel seguido de la transferencia de las proteínas de electroforesis para la unión a G28-5 mAb (un anticuerpo que se une al receptor CD40 humano). Después las proteínas manchadas se incuban con la proteína A marcada radiactivamente con ^{125}I, se lavaron para retirar el marcador no unido y se examinaron para la expresión de Fc. Se produjo el anticuerpo monoclonal G28-5 según Clark y col., anteriormente.

Una vez que se identificaron las células que expresan la construcción de fusión, se desarrollaron cultivos a gran escala de células transfectadas para acumular el sobrenadante de las células que expresan CD40/Fc. La proteína de fusión CD40/Fc en fluido sobrenadante se purificó mediante purificación por afinidad. Brevemente, se purificó un litro de sobrenadante del cultivo que contenía proteína de fusión CD40/Fc mediante la filtración de sobrenadantes de células de mamíferos (por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y aplicando el filtrado a una columna de afinidad del anticuerpo de la proteínas A/G (Schleicher y Schuell, Keene, NH) a 4ºC a un caudal de 80 ml/hora para una columna de 1,5 cm x 12,0 cm. Se lavó la columna con NaCl 0,5 M en PBS hasta que no se pudiera detectar proteína libre en el tampón de lavado. Finalmente, se lavó la columna con PBS. La proteína de fusión unida se eluyó de la columna con tampón citrato 25 mM, pH 2,8 y se llevó hasta pH 7 con tampón Hepes 500 mM, pH 9,1. Los geles SDS teñidos con plata de la proteína de fusión CD40/Fc eluida mostraron que tenía una pureza >98%.

La CD40 soluble (sCD40) y la proteínas de fusión CD40/Fc se prepararon como se ha descrito en esta memoria descriptiva. Se purificaron los sobrenadantes mediante una columna de afinidad G28 (anti-CD40 mAb) para purificar por afinidad la sCD40 expresada por las células CV - 1/EBNA transfectadas. Las fracciones que contenían proteínas se reunieron y se retiraron alícuotas para ensayos de unión a G28-5 y análisis mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) en presencia de ditiotreitol 1 mM como agente reductor. Se vio una banda única de peso molecular 28.100 daltons. En ausencia de un agente reductor el análisis SDS - PAGE de sCD40 revelaron dos bandas, una banda principal de peso molecular 56.000 y una banda menor de peso molecular 28.000. La configuración de las bandas indica que la mayoría de sCD40 existe en forma de homodímero unido a disulfuros en solución. La banda de 28.000 está ausente de monómero.

Las proteínas CD40 se visualizaron mediante tinción con plata. Las concentraciones de las proteínas de la muestra se determinaron usando un microensayo BCA (Pierce) con albúmina sérica bovina ultrapura como estándar. Se confirmaron la pureza de CD40 soluble y la concentración de proteínas mediante el análisis de aminoácidos. Se absorbió la CD40 soluble purificada en papel de PVDF y se sometió el papel a degradación automática de Edman y un secuenciador de proteínas modelo 477 A de Applied Biosystems según las instrucciones de los fabricantes para secuenciar las proteínas del terminal N. Este procedimiento comprobaba la secuencia de proteínas de sCD40.

El CD40 soluble y la proteína de fusión CD40/Fc eran capaces de modular las respuestas de células B humanas en ausencia de anti-CD40 mAb (G28-5). Las células B tonsilares modificadas se cultivaron con anti-IgM e IL-4 de tipo humano y se añadió bien la sCD40 o la proteína de fusión CD40/Fc. Ninguna forma de CD40 tenía un efecto inhibitorio en la proliferación de células B (medido mediante la incorporación de timidina tritiada) En contraposición, el receptor de IL-4 inhibía la proliferación de células B inducidas por IL-4 de una manera dependiente de la concentración.

El CD40 soluble y la CD40/Fc se ensayaron para su capacidad de inhibir la secreción de IgE inducida por IL-4 en un sistema MLC (cultivo de mezclas de linfocitos) de 2 donantes. En tres experimentos, el nivel de producción de IgE se redujo a medida que la concentración de CD40 se aumentaba. La CD40 soluble, añadida a una concentración de 10 \mug/ml, era capaz de inhibir completamente la secreción de IgE en este modelo de alergia. Además, la CD40/Fc tenía efectos similares a su homólogo soluble. Sin embargo, la adición de una proteína de fusión receptor de IL-7 - Fc (preparada mediante procedimientos similares con una secuencia publicada del receptor de IL-7) no afectó a la secreción de IgE en este modelo.

También se midieron los niveles de CD23 en el mismo MLC en respuesta a sCD40 o proteínas de fusión CD40/Fc. La CD40 soluble producía un pequeño descenso pero reproducible descenso en el nivel sCD23 el día 6 comparado con los cultivos estimulados con IL-4 sola, sin embargo se declaró un efecto inhibitorio más fuerte el día 12 en los mismos cultivos. La inducción de CD23 mediante células E^{-} de PBM (macrófagos de sangre periférica) agotados con células T estimulada por IL-4 se afectada de manera similar mediante la adición de sCD40 que ocasionaba un pequeño descenso en los niveles de sCD23 el día 6 y una inhibición más pronunciada en día 12. En cada sistema de cultivos, los resultados con la proteína de fusión CD40/Fc eran sustancialmente los mismos que con sCD40.

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En un esfuerzo para aislar un cDNA para una CD40-L, la proteína de fusión CD40/Fc purificada se marcó radiactivamente con yodo mediante ^{125}I usando un agente de fase sólida disponible comercialmente (IODO-GEN, Pierce). En este procedimiento, se sembraron 5 \mug de IODO-GEN en el fondo de un tubo de vidrio de 10 x 75 mm y se incubaron durante veinte minutos a 4ºC con 75 \mul de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,4 y 20 \mul de Na^{125}I (2 mCi). Después la solución se transfirió a un segundo tubo de vidrio que contenía 5 \mug de CD40/Fc en 45 \mul de PBS (solución salina tamponada con fosfato) y esta mezcla de reacción se incubó durante 20 minutos a 4ºC. Se fraccionó la mezcla de reacción mediante filtración en gel en un volumen de 2 ml de lecho de Sephadex® G-25 (Sigma) y después se equilibró en medio RPMI 1640 que contenía 2,5% (v/v) de albúmina sérica bovina (abreviadamente BSA), 0,2% (v/v) de azida sódica y Hepes 20 mM, pH 7,4 de medio de unión. La combinación final de ^{125}I CD40/Fc se diluyó hasta una solución madre de trabajo de 1 x 10^{-7} M en medio de unión y se almacenó hasta durante un mes a 4ºC sin pérdida detectable de actividad de unión al receptor.

Se preparó una biblioteca de cDNA a partir de una línea celular EL4 separada mediante FACS (separación celular activada por fluorescencia) a base de la unión de una proteína de fusión CD40/Fc biotinilada. Se separaron las células durante cinco minutos hasta que hubo un cambio significativo en la intensidad de la fluorescencia basándose en la expresión de un ligando para CD40 mediante las células separadas EL-4. Las células separadas cinco veces se llamaron células EL-40.5 y estas células se cultivaron con el propósito de crear una biblioteca de cDNA de mRNA de EL-40.5. Brevemente, se sintetizó cDNA, se insertó en el vector de pDC406 vacío y se transformó en E. coli. Se reunieron los transformantes y el DNA de las combinaciones se aisló y se transfectó en células CV1-EBNA para crear una biblioteca de clonación de expresión. Las células CV1-EBNA transfectadas se cultivaron en portaobjetos durante tres días para permitir la expresión transitoria de CD40-L. Después los portaobjetos que contenían las células transfectadas se incubaron con CD40/Fc marcada con yodo radiactivo, se lavaron para retirar la CD40/Fc no unida y se fijaron con glutaraldehído. Los portaobjetos fijados se sumergieron en emulsión líquida fotográfica y se expusieron en la oscuridad. Después de desarrollar los portaobjetos se examinaron individualmente con un microscopio y se identificaron las células que expresaban CD40-L mediante la presencia de granos de plata autorradiográficos frente un fondo luminoso.

La biblioteca de clonación de expresión de las células EL-40.5 se analizó y se identificó una combinación que contenía aproximadamente 2000 clones individuales como positiva para unirse a la proteína de fusión CD40/Fc marcada con ^{125}I. Esta combinación se descompuso en conjuntos más pequeños de aproximadamente 200 colonias. Se analizaron las combinaciones más pequeñas como se ha descrito anteriormente. Uno de las combinaciones más pequeñas era positiva para CD40-L.

Se aisló un clon único y se secuenció mediante técnicas estándar para proporcionar la secuencia de cDNA y se dedujo la secuencia de aminoácidos de CD40-L de tipo murino como se muestra en la figura 1 SEC ID Nº 1.

Se encontró el cDNA de CD40-L homólogo de tipo humano mediante técnicas de hibridación de especies cruzadas. Brevemente, se preparó una biblioteca de cDNA de linfocitos de sangre periférica humana (abreviadamente PBL) a partir de linfocitos de sangre periférica tratados con anticuerpo OKT3 (ATCC, Rockville MD) que se une a CD3 (10 ng/ml) e interleuquina - 2 (IL-2, 10 ng/ml) durante seis días. Las células de PBL se lavaron y después se estimularon durante 4 horas con 10 ng/ml de PMA (acetato de forbol miristato, Sigma San Luis) y 500 ng/ml de ionomicina (Calbiochem). Se aisló RNA mensajero de células PBL estimuladas, se ligaron el cDNA formado y el cDNA en engarces Eco R1. El cDNA ligado se insertó en el sitio Eco R1 del vehículo de clonación del fago \lambdagt10 (Gigapak® Stratagene, san Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Se amplificó el fago, se sembró a densidades de aproximadamente 20.000 fagos por placa de 15 cm y se realizaron los anillos de los fagos como se ha descrito en el documento de Maniatis y col., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, páginas 316 - 328. Se construyó una sonda de tipo murino correspondiente a la región de codificación de

\hbox{CD40-L}

de tipo murino del nucleótido 13 al nucleótido 793 de la SEC ID Nº 1 y la figura 1. Se hibridó esta sonda a los anillos de los fagos de la biblioteca de los PBL en condiciones de rigurosidad moderada a intensa. Brevemente, las condiciones de hibridación eran 6 X de SSC, 1 X de solución de Denhardt, EDTA de 2 mM, 0,5% de Np40 (detergente Nonidet

\hbox{P-40}

) a 63ºC durante una noche. A esto siguió un lavado en 3 X de SSC, 0,1% de SDS durante tres horas a 55ºC, seguido de una exposición a película de Rayos X durante una noche. Se identificaron las placas positivas a una frecuencia de aproximadamente 1 por 1000 placas. Se purificaron dos veces las placas positivas y se preparó cDNA de cultivos amplificados.

Se pueden utilizar las secuencias de cDNA de CD40-L de tipo murino o humano descritas en esta memoria descriptiva para obtener los cDNA que codifican otros homólogos de mamíferos de CD40-L de tipo murino o humano mediante técnicas de hibridación de especies cruzadas. Brevemente, se crea una sonda de oligonucleótidos a partir de la secuencia de nucleótidos de la región extracelular de CD40-L de tipo murino como se describe en la figura 1 (SEC ID Nº 1) o CD40-L como se describe en la (SEC ID Nº 11). Esta sonda se puede preparar mediante técnicas estándar tales como las descritas anteriormente en Maniatis y col. La sonda de tipo murino o humano se usa para analizar una biblioteca de cDNA de mamíferos o biblioteca genómica en condiciones de rigurosidad moderada. Los ejemplos de cDNA de mamíferos o bibliotecas genómicas incluyen, para cDNA, una biblioteca preparada a partir de los linfocitos de sangre periférica de mamíferos. Alternativamente, se pueden analizar diversas bibliotecas de cDNA o mRNA aislados de diversas líneas celulares mediante la hibridación Northern para determinar una fuente adecuada de DNA de CD40-L o mRNA de mamíferos.

Los vectores de expresión recombinantes para la expresión de CD40-L mediante técnicas de DNA recombinante incluyen una secuencia de DNA de CD40-L que comprende un fragmento de DNA sintético o derivado de cDNA que codifica un polipéptido de CD40-L unido operativamente a una secuencia de nucleótidos reguladores de transcripción o traducción tal como la derivada de un gen de mamíferos, microbiano, viral o de insectos. Los ejemplos de las secuencias reguladoras incluyen las secuencias que tienen un papel regulador en la expresión génica (por ejemplo, un promotor o potenciador de transcripción) opcionalmente una secuencia de operadores para controlar la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión ribosomal de mRNA y las secuencias apropiadas que controlan la transcripción e iniciación y terminación de la traducción. Las secuencias de nucleótidos se unen operativamente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de DNA de CD40-L. De esta manera una secuencia promotora de nucleótidos se une operativamente a una secuencia de DNA de CD40-L si la secuencia promotora de nucleótidos controla la transcripción de la secuencia de DNA de CD40-L. Además, un sitio de unión a ribosomas se puede unir operativamente a una secuencia para un polipéptido de CD40-L si el sitio de unión a ribosomas se posiciona en el vector para estimular la traducción. Además, las secuencias que codifican los péptidos señal se pueden incorporar en vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de DNA para un péptido señal (líder de secreción) se puede unir operativamente a una secuencia de DNA de CD40-L. El péptido señal se expresa como una secuencia precursora de aminoácidos que es capaz de mejorar la secreción extracelular del polipéptido de fusión traducido mediante una célula hospedadora de levaduras.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos de CD40-L incluyen células procarióticas, levaduras o eucarióticas superiores. Las procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo E. coli o Bacillus. Las células hospedaoras procarióticas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas otras especies del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Las células eucarióticas superiores incluyen líneas celulares estabilizadas de origen mamífero. Los sistemas de traducción exentos de células se podrían también emplear para producir polipéptidos de CD40-L usando RNA derivados de construcciones de DNA descritos en esta memoria descriptiva. Los vectores de clonación y expresión para uso con hospedadores bacterianos, fúngicos, de levaduras y de células de mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels y col., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985).

En una célula hospedadora procariótica, tal como E. coli, un polipéptido CD40-L o análogo puede incluir un resto metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula hospedadora procariótica La Met N-terminal se puede escindir del polipéptido CD40-L recombinante expresado. Las células hospedadoras procarióticas se pueden usar para la expresión de los polipéptidos CD40-L que no requieren procesamiento proteolítico o disulfuro extensivo.

Los vectores de expresión que llevan la secuencia de DNA de CD40-L recombinante se transfectan o se transforman en un cultivo sustancialmente homogéneo de un microorganismo hospedador o línea celular mamífera adecuado. Las células hospedadoras transformadas son células que se han transformado o transfectado con secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos CD40-L y expresan los polipéptidos de CD40-L. Los polipéptidos de

\hbox{CD40-L}

expresados se localizarán dentro de la célula hospedadora y/o se secretarán en el fluido sobrenadante del cultivo, dependiendo de la naturaleza de la célula hospedadora y de la construcción génica insertada en la célula hospedadora.

Los vectores de expresión transfectados en células hospedadoras procarióticas comprenden en general uno o más marcadores seleccionables fenotípicamente. Por ejemplo, un marcador seleccionable fenotípicamente es un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que suministra un requerimiento autotrófico y un origen de replicación reconocido por el hospedador para asegurar la amplificación dentro del hospedador. Otros vectores de expresión útiles para las células hospedadoras procarióticas incluyen un marcador seleccionable de origen bacteriano derivado de plásmidos comercialmente disponibles. Este marcador seleccionable puede comprender elementos genéticos del vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). El pBR322 contiene genes de resistencia a la ampicilina y tetraciclina y de esta manera proporciona medios sencillos para identificar células transformadas. Las secciones del "eje central" de pBR322 se combinan con un promotor adecuado y una secuencia de DNA de CD40-L. Otros vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEMI (Promega Biotec, Madison, WI, Estados Unidos).

Las secuencias de promotores se usan comúnmente para los vectores de expresión de células hospedadoras procarióticas. Las secuencias promotoras comunes incluyen la lactamasa \beta (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang y col., Nature 275: 615, 1978; y Goeddel y col., Nature 281:544, 1979), sistema promotor de triptófano (abreviadamente trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; y EP-A-36776) y promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión de células hospedadoras procarióticas útil emplea un promotor del fago \lambda P_{L} y una secuencia del represor termolábil cI857ts. Los vectores de plásmidos disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo que incorpora derivados del promotor \lambda P_{L} incluyen el plásmido pHUB2 (residente en E. coli cepa JMB9 (ATCC 37092)) y pPLc28 (residente en E. coli RR1 (ATCC 53082)).

CD40-L se puede expresar en células hospedadoras de levaduras, preferiblemente del genero Saccharomyces (por ejemplo, S. Cerevisiae). También se puede usar otro género de levaduras, tales como Pichia o Kluiveromyces. Los vectores de levaduras a menudo contendrán un origen de la secuencia de replicación de un plásmido de levadura de 2\mu, una secuencia de replicación autónoma (abreviadamente ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación y secuencias para la terminación de la transcripción. Preferiblemente, los vectores de levaduras incluyen un origen de la secuencia de replicación y un marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para los vectores de levaduras incluyen promotores para metalotioneina, 3-fosfogliceratoquinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland y col., Biochem. 17: 4900, 1978), tal como enolasa, gliceraldehído -3-fosfatodeshidrogenasa, hexoquinasa, piruvatodescarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfatoisomerasa, 3-fosfogliceratomutasa, piruvatoquinasa, triosafosfatoisomerasa, fosfoglucosaisomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levaduras se describen posteriormente en Hitzeman, documento EPA-73.657.

Por ejemplo, los vectores de levaduras se pueden ensamblar usando secuencias de DNA de pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación). Otras secuencias de DNA de levaduras que se pueden incluir en una construcción de expresión de levaduras incluyen un promotor ADH2 reprimible con glucosa y un líder de secreción del factor \alpha. El promotor ADH2 lo han descrito Russell y col., (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier y col., (Nature 300: 724, 1982). La secuencia líder del factor \alpha de levaduras dirige la secreción de polipéptidos heterólogos. La secuencia líder del factor \alpha se inserta a menudo entre la secuencia del promotor y la secuencia génica estructural. Véase, por ejemplo, Kurjan y col., Cell 30: 933, 1982 y Bitter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 81: 5330, 1984. Los expertos en la técnica conocen otras secuencias líderes adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de hospedadores de levaduras. Una secuencia líder se puede modificar cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gen estructural.

Los expertos en la técnica conocen los protocolos de transformación de levaduras. Un protocolo de este tipo lo describe Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75: 1929, 1978. El protocolo de Hinnen y col., selecciona los transformante de Trp^{+} en un medio selectivo, en el que el medio selectivo consta de 0,67% de base de nitrógeno de levaduras, 0, 5% de ácidos casamino, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Las células hospedadoras de levaduras transformadas por vectores que contienen la secuencia del promotor ADH2 se pueden desarrollar para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consta de 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementada con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La des-represión del promotor ADH2 se produce cuando se agota la glucosa del medio.

Los sistemas de cultivo de células hospedadoras de insectos o de mamíferos se podrían también emplear para expresar los polipéptidos CD40-L recombinantes. Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y col., Cell 23: 175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (abreviadamente CHO), células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10). Los vectores de expresión de mamíferos adecuados incluyen elementos no transcritos tales como un origen de replicación, una secuencia promotora, un potenciador unido al gen estructural, otras secuencias no transcritas flanqueantes en 5' ó 3', tales como sitios de unión a ribosomas, un sitio de poliadenilación, sitios de aceptores y donantes de corte y ensamblaje y secuencias de terminación de transcripción.

Las secuencias de control de transcripción y de traducción para los vectores de expresión de células hospedadoras de mamíferos se pueden eliminar de los genomas virales. Por ejemplo, las secuencias de promotores de células de mamíferos comúnmente usadas y las secuencias de potenciadores se derivan del virus Polyoma, adenovirus 2, virus Simiano 40 (SV 40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de DNA derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, los sitios origen SV40, promotor temprano y tardío, potenciador, corte y ensamblaje y poliadeniilación se pueden usar para proporcionar los otros elementos genéticos requeridos para la expresión de una secuencia génica estructural en una célula hospedadora de mamíferos. Los promotores tempranos y tardíos virales son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen viral de replicación (Fiers y col., Nature 273: 113, 1978). También se pueden usar fragmentos más cortos o más largos de SV40 con tal de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pares de bases (abreviadamente bp) que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl localizado en el origen viral de SV40 del sitio de replicación.

Los vectores de expresión de mamíferos ejemplares se pueden describir como describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983). Un vector de expresión altamente útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y col., Nature 312: 768, 1984 se ha depositado como ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamíferos útiles adicionales se describen en el documento EP-A0367566 y en la solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 07/701.415, presentada el 16 de mayo de 1991, incorporado en esta memoria descriptiva como referencia. Para la expresión de una región extracelular proteica de tipo II, tal como CD40-L, se debe añadir una secuencia señal heteróloga tal como la secuencia señal para interleuquina IL-7 (abreviadamente IL-7) descrita en la patente de Estados Unidos 4.965.195 o la secuencia señal para el receptor de interleuquina-2 descrita en la solicitud de patente de Estados Unidos 06/626.667 presentada el 7 de julio de 1984.

La CD40-L de tipo murino o humano se puede preparar en una forma unida a membrana cuando se incluyen una región intracelular y transmembrana o en forma soluble con el dominio extracelular solamente. Los autores expresaron la CD40-L de tipo murino de longitud completa en células de mamíferos para producir células que expresan la

\hbox{CD40-L}

de tipo murino unido a membrana. Las células de CV1 se transfectaron con un cDNA mostrado en la figura 1 (SEC ID Nº 1) en el vector HAVEO o células CV1 se transfectaron con un vector vacío HAVEO usando técnicas descritas en el ejemplo 6 de esta memoria descriptiva. Esto produjo células CV1 transfectadas que expresan CD40-L de tipo murino unido a membrana. Estas células se usaron como una fuente de CD40-L de tipo murino unido a membrana para las series de experimentos descritos en los ejemplos 10 - 13 descritos más adelante. Purificación de polipéptidos de CD40-L recombinante

Los polipéptidos CD40-L se pueden preparar mediante el cultivo de células hospedadoras transformadas en las condiciones de cultivo necesarias para expresar los polipéptidos de CD40-L. Después los polipéptidos expresados resultantes se pueden purificar a partir de medios de cultivo o extractos de células. Si se desea, un polipéptido CD40-L se puede concentrar usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de filtración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Alternativamente, se puede emplear una resina de cambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos de dietilaminoetilo (abreviadamente DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores de catión adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo.

Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (abreviadamente RP-HPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrófobos (por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo u otros alifáticos pendientes) para purificar adicionalmente la CD40-L. Alguna o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, se pueden también emplear para proporcionar sustancialmente una proteína recombinante homogénea.

También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende el dominio de unión a ligando CD40-L para purificar por afinidad los polipéptidos CD40-L expresados. Para uso los polipéptidos CD40-L se pueden eliminar de una columna de afinidad en un tampón de elución con alta concentración de sal y después dializar en un tampón de baja concentración de sal.

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se aísla usualmente mediante la ruptura de las células hospedadoras, centrifugación, extracción de sedimentos celulares si se trata de un polipéptido insoluble, o a partir del fluido sobrenadante si se trata de un polipéptido soluble, seguido de una o más etapas de concentración, precipitación por sales, intercambio iónico, purificación de afinidad o cromatografía por exclusión de tamaño. Finalmente, se puede emplear RP-HPLC para las etapas de purificación final. Las células microbianas se pueden romper mediante cualquier procedimiento conveniente, que incluye el ciclo congelación - descongelación, sonicación, rompimiento mecánico o uso de agentes de lisado de células.

Las células hospedadoras de levaduras transformadas se emplean preferiblemente para expresar CD40-L como un polipéptido secretado. Esto simplifica la purificación. El polipéptido recombinante secretado de una fermentación de células hospedadoras de levaduras se pueden purificar mediante procedimientos análogos a los descritos por Urdal y col., (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Urdal y col., describen dos etapas secuenciales de HPLC de fase inversa para la purificación de IL-2 humana en una columna de HPLC preparativa.

Los siguientes ejemplos intentan ilustrar las realizaciones particulares y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe el montaje de una construcción de DNA de CD40/Fc para expresar una proteína de fusión CD40/Fc soluble para uso en la detección de clones de cDNA que codifican un ligando CD40. La secuencia de cDNA de la región extracelular o dominio de unión a ligando de la secuencia del receptor humano de CD40 se obtuvo usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (abreviadamente PCR) y se basa en la secuencia publicada en Stamenkovic y col., más arriba. Se usó un plásmido de CD40 (CDM8) como molde para la amplificación por PCR. El CDM8 se describe en Stamenkovic y col., y se obtuvo de los autores. Una técnica de PCR (Sarki y col., Science 239: 487, 1988) se empleó usando cebadores de oligonucleótidos en 5' (hacia arriba) y 3' (hacia abajo) para amplificar las secuencias de DNA que codifican el dominio de unión a ligando extracelular de CD40. El cebador de oligonucleótidos hacia arriba 5'- CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (SEC ID Nº 5) introduce un sitio Sal 1 hacia arriba de un iniciador metionina de CD40 y un cebador de oligonucleótidos hacia abajo 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (SEC ID Nº 7) que inserta los aminoácidos Tyr Val Glu Pro Arg (SEC ID Nº 8) después del aminoácido 193 de CD40. Glu y Pro son los dos primeros aminoácidos de una región articulada de IgG1 humana y están seguidos de un sitio de restricción Bgl II que se usó para fusionar el dominio extracelular de CD40 al residuo de la región Fc de IgG1.

La construcción pDC406/CD40/Fc de DNA se transfectó en la línea celular de riñón de mono CV - 1/EBNA (ATCC CRL 10478). El plásmido pDC406 incluye secuencias reguladoras derivadas de SV40, virus de inmunodeficiencia humana (abreviadamente (VIH)) y virus de Epstein - Barr (abreviadamente VEB). La línea celular CV - 1/EBNA se derivó mediante transfección de la línea celular CV - 1 con un gen que codifica el antígeno-1 nuclear del virus Epstein - Barr abreviadamente EBNA-1) que expresa constitutivamente EBNA-1 conducido desde el potenciador/promotor intermedio/temprano de CMV humano. El gen EBNA permite la replicación episomal de vectores de expresión tales como pDC406 que contienen el origen de VEB de la replicación.

Una vez que se identificaron las células que expresan la construcción de fusión, se desarrollaron cultivos a gran escala de células transfectadas para acumular el sobrenadante de las células que expresan CD40/Fc. La proteína de fusión CD40/Fc en fluido sobrenadante se purificó mediante purificación por afinidad. Brevemente, se purificó un litro de sobrenadante del cultivo que contenía la proteína de fusión CD40/Fc mediante la filtración de sobrenadantes de células de mamíferos (por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y aplicando el filtrado a una columna de afinidad del anticuerpo de las proteínas A/G (Schleicher y Schuell, Keene, NH) a 4ºC a un caudal de 80 ml/hora para una columna de 1,5 cm x 12,0 cm. Se lavó la columna con NaCl 0,5 M en PBS (solución salina tamponada con fosfato) hasta que no se pudiera detectar proteína libre en el tampón de lavado. Finalmente, se lavó la columna PBS. Se eluyó la proteína de fusión unida de la columna con tampón citrato 25 mM, pH 2,8 y se llevó hasta pH 7 con tampón Hepes 500 mM, pH 9,1. Los geles SDS teñidos con plata de la proteína de fusión CD40/Fc eluida mostraron que tenía una pureza >98%.

La proteína de fusión CD40/Fc se marcó radiactivamente con yodo mediante ^{125}I usando un agente de fase sólida disponible comercialmente (IODO-GEN, Pierce). En este procedimiento, se sembraron 5 \mug de IODO-GEN en el fondo de un tubo de vidrio de 10 x 75 mm y se incubaron durante veinte minutos a 4ºC con 75 \mul de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,4 y 20 \mul de Na^{125}I (2 mCi). Después la solución se transfirió a un segundo tubo de vidrio que contenía 5 \mug de CD40/Fc en 45 \mul de PBS (solución salina tamponada con fosfato) y esta mezcla de reacción se incubó durante 20 minutos a 4ºC. Se fraccionó la mezcla de reacción mediante filtración en gel en un volumen de 2 ml de lecho de Sephadex® G-25 (Sigma) y después se equilibró en medio RPMI 1640 que contenía 2,55 (v/v) de albúmina sérica bovina (abreviadamente BSA), 0,2% (v/v) de azida sódica y Hepes 20 mM, pH 7,4 de medio de unión. La combinación final de ^{125}I CD40/Fc se diluyó hasta una solución madre de trabajo de 1 x 10^{-7} M en medio de unión y se almacenó hasta durante un mes a 4ºC sin pérdida detectable de actividad de unión al receptor.

Se observó aproximadamente un 50%-60% de incorporación del marcador. La yodación radiactiva produjo actividades específicas en el intervalo entre 1 x 10^{15} y 5 x 10^{15} cpm/nmol (0,42 - 2,0 átomos de yodo radiactivo por molécula de proteína). La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (abreviadamente SDS - PAGE) reveló un único péptido marcado consistente con los valores esperados. La proteína de fusión marcada era mayor que el ácido tricloroacético (abreviadamente TCA) al 98% que puede precipitar, lo que indicaba que el ^{125}I estaba unido covalentemente a la proteína.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la selección de una línea celular que expresa putativamente CD40-L. Se seleccionaron varias líneas celulares usando la proteína de fusión CD40/Fc marcada radiactivamente con yodo como se ha descrito en el ejemplo 1. Brevemente, los estudios cuantitativos de unión se realizaron según la metodología estándar y se derivaron los gráficos de Scatchard para las diversas líneas celulares. Una línea celular clonal (EL4, TIP 39 del catálogo de ATCC) una línea celular de timoma de tipo murino se identificó y se separó. Antes de la separación, se encontró que las células EL-4 expresaban aproximadamente 450 moléculas de CD40-L por célula. Las células de la clase séptima se llamaron EL-40.7 y se desarrollaron y se encontró que expresan aproximadamente 10.000 moléculas de CD40-L por célula. Por último, las células de la clase novena se llamaron EL-40.9 y se desarrollaron y se encontró que expresan aproximadamente 15.000 moléculas de CD40-L por célula.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe la preparación de una biblioteca de cDNA para la clonación y expresión de CD40-L de tipo murino. La biblioteca se preparó de un quinto clon separado de la línea celular EL-4 (ATCC TIB 39) de timoma de ratón, llamado EL-40.5. Las células EL40.5 eran células EL4 separadas cinco veces con la proteína de fusión CD40/Fc biotinilada en un FACS (separador de células activado por fluorescencia). Se preparó una biblioteca de cDNA de RNA obtenido de células EL-40.5 esencialmente como se ha descrito en la patente de Estados Unidos 4.968.607, la descripción de la cual se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Brevemente, se construyó una biblioteca de cDNA mediante transcripción inversa de poli(A)^{+} mRNA aislado del RNA total extraído de la línea celular EL-40.5. La técnica de construcción de la biblioteca era sustancialmente similar a la descrita por Ausubel y col., eds., Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 1, (1987). El Poly (A)^{+} mRNA se aisló mediante cromatografía en columna de oligo dT celulosa y el cDNA de doble cadena se preparó sustancialmente como describen Gubler y col., Gene 25: 263, 1983. Los fragmentos de Poli (A)^{+} mRNA se convirtieron a híbridos RNA - cDNA mediante transcriptasa inversa usando hexanucleótidos aleatorios amo cebadores. Después los híbridos RNA - cDNA se convirtieron en fragmentos de cDNA de doble cadena usando RNAasa H en combinación con DNA polimerasa I. El cDNA de doble cadena resultante se despuntaron con T4 DNA polimerasa.

Adaptadores Sal I

5' - TCG AC \hskip-6mm\hbox{}	T GGA ACG AGA CGA CCT GCT - 3'
	GA CCT TGC TCT GCT GGA CGA - 5'

los autores ligaron a los extremos 5' del cDNA despuntado resultante como se describe en Haymerle y col., Nucleic Acids Res. 14: 8615, 1986. Los adaptadores no ligados se retiraron mediante cromatografía por filtración en gel a 68ºC. Esto dejó protuberancias de 24 nucleótidos no autocomplementarias en el cDNA. Se usó el mismo procedimiento para convertir los extremos 5' Sal I del vector de expresión pDC406 de mamíferos a protuberancias de 24 nucleótidos complementarias a los añadidos a cDNA. Se ligaron proporciones óptimas de vector adaptado y cDNA en presencia de T4 polinucleótidoquinasa. La mezclas de ligación dializadas se sometieron a electroporación en la cepa DH5\alpha de E. coli y se seleccionaron transformantes en placas de ampicilina.

El DNA de plásmidos se aisló a partir de combinaciones que consistían en aproximadamente 2.000 clones de E. coli transformado por combinación. El DNA asilado se transfectó en una capa subconfluente de células CV1-EBNA usando DEAE - dextrano seguido de tratamiento con cloroquina sustancialmente según los procedimientos descritos por Luthman y col., Nucl. Acids Res. 11: 1295, 1983 y MaCutchan y col., J. Natl. Cancer Inst. 41: 351, 1986.

Las células CV1-EBNa se mantuvieron en medio completo (Medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía 10% de (suero de ternera fetal v/v, 50 U/ml de penicilina, 50 U/ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM) y se sembraron a una densidad aproximadamente de 2 x 10^{5} células/pocillo en portaobjetos compartimentados de pocillos únicos (Lab-Tek). Se pretrataron los portaobjetos con 1 ml de fibronectina humana (10 \mug/ml de PBS) durante 30 minutos seguido de un único lavado con PBS. Se retiraron los medios de las células adherentes que se desarrollaron en una capa y se sustituyeron con 1,5 ml de medio completo que contenía sulfato de cloroquina 66,6 \muM. Se añadieron aproximadamente 0,2 ml de una solución de DNA (2 \mug de DNA, 0,5 mg/ml de DEAE - dextrano en medio completo que contenía cloroquina) a las células y se incubó la mezcla a 37ºC durante aproximadamente cinco horas. Después de la incubación, se retiró el medio y se sometieron las células a un choque mediante la adición de medio completo que contenía 10% de DMSO (sulfóxido de dimetilo) durante 2,5 - 20 minutos. Después del choque se reemplazó la solución con medio completo reciente. Se desarrollaron las células en cultivo durante dos a tres días para permitir la expresión transitoria de las secuencias de DNA insertadas. Estas condiciones condujeron a una frecuencia de transfección de 30 a 80% en las células sobrevivientes de CB1-EBNA.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe la selección de la biblioteca de clonación de expresión preparada en el ejemplo 3 con una proteína de fusión CD40/Fc preparada en el ejemplo 1. Después de 48 - 72 horas, las monocapas de células CV1 - EBNA transfectadas preparadas en el ejemplo 3 se ensayaron mediante autorradiografía del portaobjeto para la expresión de CD40-L usando la proteína de fusión CD40/Fc marcada radiactivamente con yodo como se preparó en el ejemplo 1. Las células CV1 - EMNA transfectadas se lavaron una vez con medio de unión (RPMI 1640 que contenía 25 mg/ml de albúmina sérica bovina (abreviadamente BSA), 2 mg/ml de azida sódica, Hepes 20 mM pH 7,2 y 50 mg/ml de leche seca no grasa) y se incubaron durante 2 horas a 4ºC en medio de unión que contenía 1 x 10^{-9} M de proteína de fusión ^{125}I-CD40/Fc. Después de la incubación, las células en los portaobjetos compartimentados se lavaron tres veces con tampón de unión, seguido de dos lavados con PBS, (pH 7,3) para retirar la proteína de fusión unida no marcada radiactivamente.

Se fijaron las células mediante incubación en 10% de gluteraldehído en PBS (30 minutos a temperatura ambiente), se lavaron dos veces en PBS y se secaron al aire. Se sumergieron los portaobjetos en emulsión fotográfica Kodak GTNB-2 (6x de dilución en agua) y se expusieron en la oscuridad durante dos a cuatro días a temperatura ambiente en una caja a prueba de luz. Los portaobjetos se revelaron en revelador Kodak D19, se aclararon en agua y se fijaron en fijador Agfa G433C. Se examinaron individualmente los portaobjetos individualmente en un microscopio a una ampliación 25 - 40 x. Los portaobjetos positivos que mostraban las células que expresaban CD40-L se identificaron por la presencia de granos de plata autorradiográficos contra un fondo luminoso.

Una combinación que contenía aproximadamente 2000 clones individuales se identificaron como potencialmente positivas para unión a la proteína de fusión CD40/Fc. Se tituló la combinación y se sembró para proporcionar placas que contenían aproximadamente 200 colonias cada una. Cada placa se raspó para proporcionar DNA de plásmidos reunidos para la transfección en células CV1 - EBNA según el mismo procedimiento descrito anteriormente. Se seleccionaron las combinaciones más pequeñas mediante autorradiografía como se ha descrito anteriormente de los portaobjetos como se ha descrito anteriormente. Una de las combinaciones más pequeñas contenía clones que eran positivos para CD40-L como se indicaba por la presencia de un producto génico expresado capaz de unirse a la proteína de fusión CD40/Fc.

La combinación positiva más pequeña se tituló y se sembró para obtener colonias individuales. Se escogieron aproximadamente 400 colonias individuales y se inocularon en medio de cultivo en pocillos individuales de placas de 96 pocillos. Los cultivos se mezclaron mediante la reunión de filas y columnas y se usaron los cultivos mezclados para preparar DNA para una ronda final de transfección y selección. Una intersección de una fila positiva y una columna positiva indicaban una colonia positiva potencial. Se identificaron diez colonias potenciales positivas (es decir, clones candidatos). Se aisló DNA de cada clon candidato, se volvió a transfectar y se volvió a seleccionar. Cinco clones candidatos fueron positivos mediante la unión a CD40/Fc. Los cinco clones candidatos positivos contenían una inserción de cDNA de 1468 nucleótidos, según se determinó mediante la secuenciación de dideoxinucleótidos. La región de codificación de cDNA del clon CD40-L corresponde a la secuencia de la figura 1 y SEC ID Nº 1.

Un vector de clonación que contenía la secuencia de CD40-L de tipo murino, designada pDC406-mCD40-L se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD (abreviadamente ATCC) el 6 de diciembre de 1991, número de acceso 68872. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos prevista de este clon se ilustran en la SEC ID Nº 1 y en la figura 1.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra una técnica de hibridación de especies cruzadas que se utilizó para aislar un homólogo

\hbox{CD40-L}

humano que usa una sonda diseñada a partir de la secuencia de CD40-L de tipo murino. Una sonda de CD40-L de tipo murino se produjo mediante la eliminación de la región que codifica el clon pDC406-CD40-L de CD40-L de tipo murino (nucleótido 13 hasta 793) y marcando con ^{32}P el fragmento que usa cebadores aleatorios (Boehringer-Mannheim).

Se construyó una biblioteca de cDNA de linfocitos de sangre periférica (abreviadamente PBL) humana en un vector del fago \lambda usando brazos \lambdagt10 y se empaquetaron in vitro usando un kit disponible comercialmente (Gigapak® Stratagene, San Diego, CA) según las instrucciones de los fabricantes. Las células de PBL se obtuvieron a partir de voluntarios humanos normales y se trataron con 10 ng/ml de OKT3 (un anticuerpo anti-CD3) y 10 ng/ml de IL-2 humana (Immunex, Seattle, WA) durante seis días. Las células de PBL se lavaron y se estimularon con 500 ng/ml de ionomicina (Calbiochem) y 10 ng/ml de PMA (Sigma) durante cuatro horas. Se obtuvieron RNA mensajero y cDNA a partir de las células PBL estimuladas y se empaquetaron en vectores del fago \lambdagt10 (Gigapak® Stratagene) según las instrucciones de los fabricantes. Se hibridó la sonda de tipo murino al cDNA del fago en 6X de SSC (citrato trisódico 15 mM y cloruro sódico 165 mM), 1 X de solución Denhardt, EDTA 2 mM, 0,5% de Np40 a 63ºC durante una noche. A la hibridación siguió un lavado abundante en 3X de SSC, 0,1% de SDS a aproximadamente 55ºC durante tres horas. Se visualizaron las bandas específicas mediante autorradiografía.

Se depositó un vector de clonación que contenía la secuencia de CD40-L humano, designado como hCD40-L en la Colección Americana de Cultivos Tipo (abreviadamente ATCC), Rockville, MD el 6 de diciembre de 1991 con número de acceso 68873. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos prevista de este clon se ilustran en la SEC ID Nº 11 y en la figura 2.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la expresión de CD40-L de tipo murino unido a membrana en células CV1-EBNA. El cDNA de CD40-L de tipo murino en el vector HAVEO o vector HAVEO vacío se transfectaron en células CV1 EBNA usando técnicas estándar, tales como las descritas en McMahan y col. EMBO J. 10: 2821, 1991 y en el ejemplo 3 de esta memoria descriptiva. Brevemente, se sembraron células CV1 EBNA a una densidad de 2 x 10^{6} células por placa de 10 cm en 10 ml de medio esencial mínimo de Dulbecco suplementado con 10% de suero de ternera fetal (Medio). Se dejaron que las células se adhirieran durante una noche a 37ºC. Se reemplazó el medio con 1,5 ml de medio que contenía cloroquina 66,7 \muM y una mezcla de DNA que contenía 5 \mug de cDNA que codifica mCD40-L. También se añadió a las células medio que contenía 175 \mul y 25 \mul de DEAE dextrano (4 mg/ml en PBS). Se incubaron las células y cDNA a 37ºC durante 5 horas. La mezcla de cDNA se retiró y las células se sometieron a choque con un ml de medio reciente que contenía 10% de DMSO durante 2,5 minutos. Se reemplazó el medio con medio reciente y se desarrollaron las células durante al menos 3 días.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales para la CD40-L. Las preparaciones de CD40-L de tipo murino purificado o CD40-L de tipo humano se prepararon mediante la expresión de células COS y purificación por afinidad de CD40/Fc como se ha descrito en esta memoria descriptiva. La CD40-L purificada puede generar anticuerpos monoclonales contra CD40-L usando técnicas convencionales, por ejemplo, las técnicas descritas en la patente de Estados Unidos 4.411.993. Brevemente, se inmunizan los ratones con CD40-L como un inmunógeno emulsionado en adyuvante completo de Freund y se inyecta en cantidades que varían entre 10 - 100 \mug subcutáneamente o intraperitonealmente. Entre diez y doce días más tarde, los animales inmunizados se estimularon con CD40-L adicional emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. A continuación los ratones se estimulan periódicamente en un programa de inmunización semanal o bisemanal. Las muestras de suero se toman periódicamente mediante sangrado retroorbital o escisión en el extremo de la cola para análisis mediante el ensayo transferencia de puntos o ELISA (ensayo enzimático de inmunosorbencia) para anticuerpos CD40-L.

Después de la detección de un título adecuado del anticuerpo, se suministra a los animales una última inyección intravenosa de CD40-L en solución salina. Tres o cuatro días más tarde se sacrificaron los animales, se recogieron las células del bazo y se fusionaron las células esplénicas a una línea celular de mieloma de tipo murino (por ejemplo, NS1 o Ag 8.653). Las fusiones de las células generadas que se siembran en placas múltiples de microtitulación en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.

Se analizaron las células de hibridoma mediante ELISA para reactividad frente a CD40-L purificada mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall y col., Immunochem. 8: 871, 1971 y en la patente de Estados Unidos 4.703.004. Las células positivas de hibridoma se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones BALB/c singénicos para producir ascites que contenían concentraciones altas de anticuerpos monoclonales anti-CD40-L. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vitro en matraces o frascos rotativos mediante diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascites de ratones se pueden purificar mediante precipitación con sulfato amónico, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también se puede usar la cromatografía de afinidad basada en la unión de un anticuerpo a la proteína A o a la proteína G, como la cromatografía de afinidad basada en la unión a CD40-L.

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra los efectos terapéuticos antialérgicos de sCD40 y la proteína de fusión CD40/Fc. Se analizaron CD40 y CD40/Fc para su capacidad de inhibir la secreción de IgE inducida por IL-4 (5 ng/ml) en un sistema MLC de dos donantes. Los datos de tres experimentos se presentan en la tabla 1.

TABLA 1

	IgE (ng/ml)
Adición	Exp. 1	Exp. 2	Exp. 3
Medio	< 0,1	< 0,1	< 0,1
IL-4	24	47	54
IL-4 + sCD40 (0,1 \mug/ml)	19	sd	38
IL-4 + sCD40 (0,3 \mug/ml)	14	29	24
IL-4 + sCD40 (1 \mug/ml)	10	24	8
IL-4 + sCD40 (3 \mug/ml)	7	19	2
IL-4 + IL-7R/Fc (10 \mug/ml)	21	sd	58

Los niveles de IgE se midieron después de 12 días en cultivo mediante el procedimiento ELISA. Brevemente, placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (Corning) se cubrieron con anti- IgE humano mAb de ratón (Zymed) en una dilución 1:500 en PBS (solución salina tamponada con fosfato). Después de lavar 3 veces se realizó una etapa de bloqueo usando 5% de leche seca no grasa, seguido de la titulación de patrones de IgE de tipo humano o sobrenadantes de los ensayos. Después de lavar 3 veces se añadió anti - IgE humano de cabra biotinilado (Kirkegaard y Perry) en una dilución 1:500. A esto siguió un lavado adicional y después la adición de estreptavidina - HPR (Zymed) en una dilución 1:500. Después de un lavado adicional, se desarrolló la reacción usando sustrato TMB (Kirkegaard y Perry) y se midió la absorbancia a 520 nm. Todas las etapas de lavado se llevaron a cabo en PBS más 0,05% de Tween. Todas las etapas de incubación se realizaron a volúmenes de 100 \mul/pocillo durante una hora a temperatura ambiente. La sensibilidad de este ensayo es 100 pg/ml.

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra los efectos de sCD40 y proteína de fusión CD40/Fc para inhibir la separación de CD23 soluble de las células B estimuladas por IL-4 (5 ng/ml). Se ensayaron CD40 soluble y CD40/Fc para su capacidad de inhibir la separación de sCD23 inducida por IL-4 en un sistema MLC de dos donantes. Los datos de estos tres experimentos se presentan en la tabla 2.

TABLA 2

	sCD23 (ng/ml)
Adición	Exp. 1	Exp. 2	Exp. 3
	día 6	día 12	día 6	día 12	día 6	día 12
E^{-} + medio	55	< 0,5	24	10	10	5
+ IL-4	115	55	96	62	44	27
+ IL-4 + sCD40 (1 \mug/ml)	sd	sd	88	36	38	9
+ IL-4 + sCD40 (3 \mug/ml)	97	4	82	31	40	4
+ IL-4 + sCD40 (10 \mug/ml)	sd	sd	72	28	sd	sd

TABLA 2 (continuación)

	sCD23 (ng/ml)
Adición	Exp. 1	Exp. 2	Exp. 3
	día 6	día 12	día 6	día 12	día 6	día 12
+ IL-4 + IL-7R/Fc (3 \mug/ml)	111	48	103	67	40	22

PBM^{-} + medio	12	< 0,5	15	5	3	10
+ IL-4	39	255	47	22	48	26
+ IL-4 + sCD40 (1 \mug/ml)	sd	sd	44	18	46	18
+ IL-4 + sCD40 (3 \mug/ml)	24	6	37	11	45	12
+ IL-4 + sCD40 (10 \mug/ml)	sd	sd	28	5	sd	sd
+ IL-4 + IL-7R/Fc (3 \mug/ml)	35	26	43	20	50	23

Los niveles de CD23 soluble se midieron después de 6 y 12 días en cultivo mediante un kit comercial de detección ELISA de sCD23 (Binding Site, Dan Diego, CA). El límite de sensibilidad era 500 pg/ml. Aproximadamente 1 x 10^{5} células por pocillo se cultivaron por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo (Intermountain Scientific, Bountiful UT) durante el tiempo indicado en presencia o ausencia de aditivos como se indica en la tabla 2. Los resultados muestran los efectos antialérgicos de sCD40. Se realizaron estudios similares con CD40/Fc (datos no mostrados) en lugar de sCD40 y se obtuvieron resultados similares. Consecuentemente, los datos en los ejemplos 8 y 9 ilustran una propiedad antialérgica para CD40.

Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra la actividad la actividad proliferativa de las células B de CD40-L de tipo murino unida a membrana para las células B humanas. Las células mononucleares de sangre periférica (abreviadamente PBMC) humana se aislaron de sangre periférica de voluntarios normales mediante centrifugación en gradiente de densidad en Histopaque® (Sigma, San Luis, MO) las preparaciones agotadas con células T de células (E^{-}) se obtuvieron mediante la separación de células T por rosetting con SRBC (glóbulos rojos de oveja) tratadas con 2-aminoetilisotiouronio y posterior centrifugación en gradiente de densidad en Histopaque®. Los ensayos de proliferación de células B se llevaron a cabo con preparaciones de E^{-} en medio RPMI con la adición de 10% de suero bovino fetal (abreviadamente FBS) inactivado por calor a 371C en 10% de atmósfera de CO_{2}. Se cultivaron por triplicado aproximadamente 1 x 10^{5} células E^{-} por pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (Corning) durante 7 días en presencia de células CV1 EMNA (como se ha descrito en el ejemplo 6). Las células CV1 EBNA se transfectaron con cDNA de CD40-L de tipo murino o un vector vacío. Se pulsaron las células con 1 \muCi/pocillo de timidita tritiada (25 Ci/nmol Amersham, Arlington Heights, IL) durante las ocho horas finales de cultivo. Se recogieron las células en discos de fibra de vidrio con un colector automático de células y se incorporaron, las cpm se midieron mediante espectrometría de centelleo líquido.

La figura 4a muestra una comparación de proliferación de células B humanas de células de CV1 EBNA transfectadas con un vector vacío (HAVEO) o con cDNA de CD40-L de tipo murino en vector HAVEO. Estos datos muestran que CD40-L de tipo murino estimula la proliferación de células B humanas en ausencia de un co-mitógeno. La figura 4b muestra un experimento similar excepto que se añade 10 ng/ml de IL-4 humana a los cultivos. En este experimento la IL-4 potencia la actividad mitogénica de las células B de CD40-L de tipo murino unida a membrana. La figura 5 es una repetición del experimento mostrado en la figura 4b. Sin embargo, cuando se repitió el experimento no hubo evidencia de actividad mitogénica de IL-4. Hubo evidencia repetida de actividad mitogénica de CD40-. Consecuentemente, la CD40-L unida a membrana estimula la proliferación de células B.

Ejemplo 11

Este ejemplo ilustra el efecto de CD40-L de tipo murino unido a membrana para estimular la producción de IgE y la separación de CD23 de las células E^{-} aisladas en el ejemplo 10. Aproximadamente 1 x 10^{5} células /por pocillo se cultivaron por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo Nunc (Intermountain Scientific, Bountiful UT) en Medio de Dulbecco modificado por Iscove (abreviadamente IMDM) más 10% de FCS en una atmósfera humidificada de 10% de CO_{2}. El medio se suplementó con 50 \mug/ml de transferrina humana (Sigma), 0,5% de albúmina sérica bovina (Sigma) y 1 \mug/ml de cada uno de los ácidos oleico, linoleico y palmítico (Sigma). Se cultivaron las células E^{-} durante 10 días en presencia de 5 ng/ml de IL-4 humana. Se añadió una titulación de células CV1 EBNA transfectadas con CD40-L de tipo murino o vector vacío. Después de diez días los sobrenadantes del cultivo se ensayaron para IgE mediante el procedimiento ELISA descrito en el ejemplo 8 ó para la separación de CD23 mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 9.

La figura 6 muestra una comparación de la producción de IgE en los sobrenadantes (en ng/ml) para los cultivos de células E^{-} y células CV1 EBNA transfectadas con vector vacío (HAVEO) o con CD40-L. No se detectó ninguna diferencia con hasta 3000 células de CV1 EBNA, sin embargo la producción significativa de IgE se produjo con la adición de 10000 ó 30000 células de CV1 EBNA transfectadas con CD40-L. Como comparación, cuando las células E^{-} se incubaron con medio solamente, 5 ng/ml de IL-4 ó 5 ng/ml de IL-4 más 500 ng/ml de anticuerpo G28 - 5, la producción de IgE era 4,7, 2,9 y >600 ng/ml respectivamente. Cuando la separación de CD23 se midió en la figura 7, 10000 y 30000 células de CV1 EBNA transfectadas con CD40-L mostraron un incremento de la separación de CD23 cuando se comparaba con las células CV1 EBNA de control de vector vacío. Como comparación, cuando las células E^{-} se incubaron con medio solamente, 5 ng/ml de IL-4 ó 5 ng/ml de IL-4 más 500 ng/ml de anticuerpo G28 - 5, la separación de CD23 era < 0,1, 2,4 y 11,2 ng/ml respectivamente. Estos datos muestran que la producción de IgE y la separación de CD23 son ambas actividades biológicas asociadas con CD40-L unida a membrana.

Ejemplo 12

Este ejemplo ilustra la actividad proliferativa de las células B, producción de inmunoglobulina (Ig) policlonal, formación de anticuerpo de antígeno específico y diversos procedimientos para uso de CD40-L unido a membrana y soluble en aplicaciones clínicas. Los autores obtuvieron células B esplénicas de tipo murino según los procedimientos descritos por Grabstein y col, más arriba, Maliszewski y col., I más arriba y Maliszewski y col., II más arriba. Brevemente, el cultivo mezclado de las células se purificó mediante la depleción de las células T usando un antisuero de células T y complemento, y la depleción de células adherentes mediante el paso por columnas de Sephadex® G10 y mediante la selección positiva de células B por extensión en placas Petri cubiertas con anti-ratón IgM de cabra. Las células B purificadas se cultivaron en RPMI, suero de ternera fetal, (5% para ensayos de proliferación de células B y 20% para los ensayos de células formadoras de placas o ensayos de anticuerpos policlonales), 2-mercaptoetanol, antibióticos aminoácidos y piruvatos. La proliferación de las células B se midió según el ensayo descrito en el ejemplo 10 y en Grabstein y col., más arriba, Maliszewski y col., I, más arriba y Maliszewski y col., II, más arriba. La formación de anticuerpos de antígeno específico se midió mediante el procedimiento descrito por Grabstein y col., J. Mol. Cell. Immunol. 2: 199, 1986 [Grabstein y col II]. Brevemente, la formación de anticuerpos de antígeno específico usaba glóbulos rojos de oveja (abreviadamente SRBC) como antígeno (0,03% v/v) en cultivos de 2 ml de 1 x 10^{6} células B de tipo murino. Los cultivos de células B se incubaron durante 5 días y las células formadoras de placas se determinaron mediante el ensayo de placas hemolíticas de Jerne como describen Grabstein y col., II más arriba. Los recuentos de células se determinaron en un contador Coulter. La secreción de Ig policlonal se determinó mediante ensayos ELISA de isotipo específico en cultivos de siete días de 1 x 10^{6} células B por 2,0 ml de cultivo como describen Maliszewski y col., I más arriba y Maliszewski y col., II más arriba.

Los resultados de la proliferación de células B mediante células CV1 EBNA trasfectadas con CD40-L o vector vacío o células 7A1 (un clon auxiliar de células T) se muestran en las figuras 8, 10 y 12. Los datos muestran que la CD40-L ocasionaba la mayor proliferación de células B. Las células 7A1 y 7C2 auxiliares de las células T tenían un mínimo efecto en la proliferación de células B.

Los efectos de diversas células en la formación de anticuerpos de antígenos específicos se muestran en las figuras 9 y 11. La figura 9 muestra una comparación de células formadoras de placas que comparan el clon 7A1 auxiliar de células T y las células EL40.9 de tipo murino que secretan un CD40-L soluble. Las células EL40.9 parecen tener un efecto inhibitorio en la formación de anticuerpos de antígenos específicos. La figura 11 muestra PFC (células formadoras de placas) para las células 7C2 auxiliares de las células T y las células CV1 EBNA transfectadas con, bien un vector vacío o con CD40-L. Tanto las células 7C2 como el CD-L unida a membrana estimulan la formación de anticuerpos de antígenos específicos (abreviadamente PFC). La figura 13 compara la formación de anticuerpos de antígenos específicos de CD40-L y células 7A1 en presencia o ausencia de 10 ng/ml de interleuquina - 2 (abreviadamente IL - 2). La IL - 2 aumentaba la PFC para las células 7A1 pero no incrementaron la PFC ocasionada por CD40-L unida a membrana.

La producción de Ig policlonal mediante las células B de tipo murino se comparó para estimulación o inhibición con CD40-L unida a membrana, células CV1 EBNA de control y células 7A1 de T auxiliares en presencia de citoquinas IL-4 (10 ng/ml) e IL.5 (dilución de 1:40 de sobrenadantes de células COS) o sin citoquinas añadidas. La cantidad de IgA, IgG3, IgE, IgG2b, IgM e IgG1 se muestra en las tablas 3 - 8 respectivamente.

TABLA 3

	IgA, ng/ml
	Células	Medio	+ IL-4 + IL-5
CD40-L	2 X 10(5)	666,275 \pm 174,444	64,639 \pm 51,870
	1 X 10(5)	288,085 \pm 20,773	291,831 \pm 10,673
	1 X 10(4)	53,750 \pm 36,531	910,072 \pm 62,713

HAVEO	2 X 10(5)	0	628,190 \pm 42,907
	1 X 10(5)	0	477,755 \pm 57,478
	1 X 10(4)	0	295,640 \pm 12,736

7A1 (2C11)	1 X 10(6)	0	2177,549 \pm 377,052
	2 X 10(5)	0	646,898 \pm 86,325
	1 X 10(5)	0	480,671 \pm 40,011

Medio		0	458,152 \pm 77,258
LPS		88,531 \pm 31,248	132,336 \pm 51,356

TABLA 4

	IgG3, ng/ml
	Células	Medio	+ IL-4 + IL-5
CD40-L	2 X 10(5)	108,427 \pm 14,359	0
	1 X 10(5)	118,079 \pm 8,021	46,535 \pm 9,899
	1 X 10(4)	127,591 \pm 6,268	467,023 \pm 78,276

HAVEO	2 X 10(5)	0	29,773 \pm 5,224
	1 X 10(5)	0	66,323 \pm 8,673
	1 X 10(4)	0	34,671 \pm 12,975

7A1 (2C11)	1 X 10(6)	33,420 \pm 9,972	820,856 \pm 39,442
	2 X 10(5)	0	436,074 \pm 59,332
	1 X 10(5)	0	239,760 \pm 45,978

TABLA 4 (continuación)

	IgG3, ng/ml
	Células	Medio	+ IL-4 + IL-5
Medio		21,808 \pm 7,107	64,773 \pm 13,924
LPS		816,697 \pm 43,553	103,720 \pm 11,883

TABLA 5

	IgE, ng/ml
	Células	Medio	+ IL-4 + IL-5
CD40-L	2 X 10(5)	0	64,144 \pm 4,979
	1 X 10(5)	0	83,493 \pm 9,093
	1 X 10(4)	0	461,155 \pm 60,514

HAVEO	2 X 10(5)	0	0
	1 X 10(5)	0	4,208 \pm 0,527
	1 X 10(4)	0	0

7A1 (2C11)	1 X 10(6)	0	208,091 \pm 8,090
	2 X 10(5)	0	32,530 \pm 0,723
	1 X 10(5)	0	15,889 \pm 2,947

Medio		0	12,602 \pm 1,460
LPS		0	408,355 \pm 9,764

TABLA 6

	IgG2b, ng/ml
	Células	Medio	+ IL-4 + IL-5
CD40-L	2 X 10(5)	0	0
	1 X 10(5)	0	6,230 \pm 0,285
	1 X 10(4)	0	47,414 \pm 0,241

TABLA 6 (continuación)

	IgG2b, ng/ml
	Células	Medio	+ IL-4 + IL-5
HAVEO	2 X 10(5)	0	7,001 \pm 2,358
	1 X 10(5)	0	6,230 \pm 2,285
	1 X 10(4)	0	9,620 \pm 2,650

7A1 (2C11)	1 X 10(6)	0	189,343 \pm 2,837
	2 X 10(5)	0	22,431 \pm 6,835
	1 X 10(5)	0	7,207 \pm 1,580

Medio		0	7,422 \pm 1,620
LPS		0	33,291 \pm 3,183

TABLA 7

	IgM, ng/ml
	Células	Medio	+ IL-4 + IL-5
CD40-L	2 X 10(5)	1,805 \pm 0,639	0,439 \pm 0,184
	1 X 10(5)	2,237 \pm 0,583	5,878 \pm 0,858
	1 X 10(4)	2,293 \pm 0,595	96,730 \pm 13,009

HAVEO	2 X 10(5)	0	10,890 \pm 2,126
	1 X 10(5)	0	13,303 \pm 0,993
	1 X 10(4)	0,624 \pm 0,178	22,538 \pm 2,304

7A1 (2C11)	1 X 10(6)	0,769 \pm 0,124	104,857 \pm 17,463
	2 X 10(5)	0,142 \pm 0,052	27,016 \pm 1,706
	1 X 10(5)	0,126 \pm 0,048	13,070 \pm 0,600

Medio		0,231 \pm 0,057	36,809 \pm 2,860
LPS		53,302 \pm 9,668	41,974 \pm 6,158

TABLA 8

	IgGl, ng/ml
	Células	Medio	+ IL-4 + IL-5
CD40-L	2 X 10(5)	0	130,185 \pm 24,547
	1 X 10(5)	0	310,588 \pm 1,261
	1 X 10(4)	0	270,727 \pm 17,511

HAVEO	2 X 10(5)	0	187,668 \pm 57,730
	1 X 10(5)	0	43,320 \pm 49,770
	1 X 10(4)	0	1363,464 \pm 45,841

7A1 (2C11)	1 X 10(6)	0	145,652 \pm 136,070
	2 X 10(5)	0	365,563 \pm 24,276
	1 X 10(5)	0	449,475 \pm 101,012

Medio		0	133,660 \pm 386,231
LPS		0	246,231 \pm 21,526

Estos datos indican que la interacción de CD40 con su ligando es la principal interacción responsable de la inducción dependiente del contacto con las células T del desarrollo de las células B y diferenciación para la producción de anticuerpos de antígenos específicos y la secreción de Ig policlonal. Como tal, estos datos sugieren que los antagonistas de esta interacción, mediante CD40 soluble, la proteína de fusión CD40/Fc y posiblemente CD40-L soluble (monomérica) interferirán significativamente con el desarrollo de respuestas de anticuerpo. Por lo tanto, las situaciones clínicas donde CD40, las proteínas de fusión CD40/Fc y CD40-L soluble incluyen alergia, lupus, artritis reumatoide, diabetes dependiente de insulina y cualquier otra enfermedad en la que el anticuerpo antiinmune o complejos antígeno/anticuerpo son responsable de la patología clínica de la enfermedad. Además, la CD40-L unida a membrana o CD40-L oligomérica soluble serán útiles para estimular la proliferación de las células B y la producción de anticuerpos. Como tal, estas formas, de CD40-L son más útiles para adyuvantes de vacunas y como agente estimulante para la secreción de mAb de las células de hibridoma.

Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra el efecto de CD40-L unida a membrana en la proliferación de la secreción de IgE de las células mononucleares de sangre periférica (E^{-}). Las células E^{-} se obtuvieron según el procedimiento descrito en el ejemplo 10 y se incubaron durante 7 ó 10 días en presencia de células CV1 EBNA transfectadas con el vector vacío o cDNA de mCD40-L. Adicionalmente, la proteína de fusión CD40/Fc (descrita en el ejemplo 1) o la proteína de fusión receptor de TNF/Fc (descrita en el documento WO 91/03553) se añadieron a alguna de las preparaciones como se indica en la figura 14. La secreción de IgE se midió según el procedimiento descrito en el ejemplo 8 y la proliferación de células B se midió según el procedimiento descrito en el ejemplo 10.

Los resultados para la proliferación de células B y la secreción de IgE se muestran en la figura 14 para cinco concentraciones diferentes de células CV1 EBNA transfectadas. Tanto la proliferación de células B como la secreción de IgE se incrementaron en presencia de CD40-L unida a membrana. La adición de la proteína de fusión CD40/Fc eliminaba tanto la proliferación de las células B como la secreción de IgE. La proteína de fusión receptor de TNF/Fc no tenía ningún efecto. Como comparación para la secreción de IgE, la adición de IL-4 como agente de control (sin células CV1 EBNA transfectadas) no produjo IgE en este ensayo y la adición de IL-4 más G28 anti-CD40 mAb dio como resultado 29,7 ng/ml de IgE en este ensayo.

\newpage

Ejemplo 14

Este ejemplo describe el montaje de una construcción de DNA de CD40-L/Fc para expresar una proteína de fusión CD40-L/Fc soluble denominada construcción CD40- L/FC2. El DNA que codifica CD40-L/FC2 comprende las secuencias que codifican un péptido líder (o señal), una secuencia hidrófila de ocho aminoácidos descrita por Hopp y col., BioTechnology 6: 1204, 1988; denominada Flag®, una región Fc adecuada de una inmunoglobulina, una secuencia repetida [Gly_{4}Ser]_{3} (descrita en la patente de Estados Unidos 5.073.627, que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia) u otra secuencia de engarce adecuada y la región extracelular de CD40-L de tipo humano desde el aminoácido 50 hasta el aminoácido 261 (SEC ID Nº 11). Un vector de expresión pDC406 que contenía una secuencia líder, Flag®, y la Fc de IgG1 humana se preparó utilizando técnicas convencionales de corte y ligación enzimática de fragmentos que codifican una secuencia líder Flag®, y una Fc de IgG_{1} humana y restringida con Nsi 1 y Not 1.

Una técnica de PCR (Sarki y col., Science 239: 487, 1988) se empleó usando cebadores de oligonucleótidos en 5' (hacia arriba) y 3' (hacia abajo) para amplificar las secuencias de DNA que codifican el dominio de unión a ligando extracelular de CD40 a partir de un vector de clonación que contiene CD40-L (ATCC 68873; SEC ID Nº 11) para formar un fragmento por PCR. El cebador de oligonucleótidos hacia arriba (SEC ID Nº 13) introdujo un sitio Nsi hacia arriba de una secuencia de engarce ([Gly_{4}Ser]_{3} SerSer), a la que siguieron 21 nucleótidos del dominio extracelular de CD40-L (aminoácidos 51 hasta 57 de la SEC ID Nº 11). Un cebador de oligonucleótidos hacia abajo (SEC ID Nº 14) introdujo un sitio Not 1 hacia abajo del codón de terminación de la CD40-L. Después el fragmento PCR se ligó en el vector de expresión pDC406 que contenía una secuencia líder Flag®, y una Fc de IgG_{1} humana. El nucleótido y la secuencia de aminoácidos prevista de CD40-L/FC2 se presentan en las SEC ID Nº 15 y la SEC ID Nº 16. La construcción de DNA resultante (CD40-L/FC2) se transfectó en la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). La construcción codificaba un CD40-L soluble capaz de unirse a CD40, como se evidencia por la unión observada en los análisis de separación celular activada por fluorescencia (abreviadamente FACS) usando células que expresan CD40.

Los cultivos a gran escala de células 293 de riñón embrionario humano (ATCC CRL 1573) transfectadas con la construcción que codifica CD40-L/FC2 se desarrollaron para acumular sobrenadante que contenía CD40-L/FC2. La línea celular 293, una línea permanente de riñón embrionario humano primario transformado mediante DNA de adenovirus 5 humano, permite la expresión de proteínas recombinantes ligadas en el vector pCD406. La proteína de fusión CD40-L/PC2 en fluido sobrenadante se purificó mediante purificación por afinidad. Brevemente, el sobrenadante del cultivo que contenía la proteína de fusión CD40-L/PC2 se purificó mediante la filtración de sobrenadantes de células de mamíferos (por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y aplicando el filtrado a una columna de afinidad de anticuerpos que comprendía anti- IgG humano de cabra biotinidado (Jackson Immunoreserach Laboratories, Inc., Westgrove, PA, Estados Unidos) acoplado a estreptavidina - agarosa (Pierce Chemical, Rockford, IL, Estados Unidos) a 4ºC, a un caudal de aproximadamente 60 a 80 ml/hora para una columna de 1,5 cm x 12,0 cm. Se lavó la columna con aproximadamente 20 volúmenes de columna de PBS (solución salina tamponada con fosfato) hasta que no se pudiera detectar proteína libre en el tampón de lavado. La proteína de fusión unida se eluyó de la columna con tampón citrato 12,5 mM, NaCl 75 mM, pH 2,8 y se llevó hasta pH 7 con tampón Hepes 500 mM, pH 9,1. El péptido CD40-L/FC2 oligomérico purificado inducía la proliferación de células B humanas en ausencia de cualquier coestímulo y (en unión con la citoquina apropiada) dio como resultado la producción de IgG, IgE, IgA e IgM como se describe en el ejemplo 12 para la

\hbox{CD40-L}

unida a membrana. Ejemplo 15

Este ejemplo describe el montaje de una construcción de DNA de CD40-L para expresar una proteína de fusión de CD40-L soluble denominada CD40-L trimérica soluble. La CD40-L trimérica contiene una secuencia líder, una secuencia de 33 aminoácidos denominada "cremallera de leucina" (SEC ID Nº 17) y una secuencia hidrófila de ocho aminoácidos descrita por Hopp y col., (Hopp y col., BioTechnology 6: 1204, 1988; denominada Flag®, seguido de la región extracelular de CD40-L humana desde al aminoácido 50 hasta el aminoácido 261 (SEC ID Nº 11). La utilidad de las secuencias líder y Flag® se han descrito en la descripción detallada. La secuencia de 33 aminoácidos presentada en la SEC ID Nº 17 se trimeriza espontáneamente en solución. Las proteínas de fusión comprendiendo esta secuencia de 33 aminoácidos se esperan de esta forma que formen trímeros y multímeros espontáneamente.

La construcción se prepara mediante la síntesis de oligonucleótidos que representan una secuencia líder, la secuencia de 33 aminoácidos descrita anteriormente y la secuencia Flag®, que liga después el producto final a un fragmento de DNA que codifica desde el aminoácido 51 hasta el 261 de la SEC ID Nº 11, preparado como se describe en el ejemplo 14.

El producto de ligación resultante en el vector de expresión pDC406 se transfectó en la línea celular CV - 1/EBNA de riñón de mono (ATCC CRL 10478). El plásmido pDC406 incluye las secuencias reguladoras derivadas de SV40, virus de la inmunodeficiencia humana (abreviadamente VIH) y virus de Epstein - Barr (abreviadamente VEB). La línea celular CV - 1/EBNA se derivó mediante transfección de la línea celular CV - 1 con un gen que codifica el antígeno-1 nuclear del virus Epstein - Barr (abreviadamente EBNA-1) que expresa constitutivamente EBNA-1 conducido desde el potenciador/promotor intermedio/temprano de CMV humano. El gen EBNA - 1 permite la replicación episomal de los vectores de expresión tales como pDC406 que contienen el origen EBV de la replicación.

Una vez que se identificaron las células que expresan la construcción de fusión, se desarrollaron cultivos a gran escala de células transfectadas para acumular el sobrenadante de las células que expresan CD40-L trimérica. La proteína de fusión CD40-L trimérica en fluido sobrenadante se purificó mediante purificación por afinidad como se describe sustancialmente en la patente de Estados Unidos 5.011.912. Para determinar la pureza se pueden preparar geles de SDS teñidos con plata de la proteína de fusión eluida CD40-L.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Armitage, Richard.

: Fanslow, William

: Spriggs, Melanie

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Citoquinas nuevas

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 17

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DIRECCIÓN: Immunex Corporation

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 51 University Street

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: Seattle

\vskip0.333000\baselineskip

(D): ESTADO: Washington

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO: 98101

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE LECTURA DE ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC IBM Compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Patent In Release #1.0 Versión #1.25

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Oster, Jeffrey B.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE AFILIACIÓN: 32585

\vskip0.333000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE SUMARIO: 2802

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 206 587 0430

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FAX: 206 587 0606

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 783 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Ratón

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: CD40-L

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..783

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia:

\hskip2cm

SEC ID Nº 1:

15

16

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 260 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 2:

17

170

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(E): LONGITUD: 740 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(F): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(G): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(H): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Ser humano

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: Fc de IgG1

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 3:

18

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 519 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Ser humano

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: Región extracelular de CD40

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 4:

20

200

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Cebador de PCR

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: Cebador en 5' de CD40

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 5:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCGTCGACCA CCATGGTTCG TCTGCC

\hfill

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Cebador de PCR

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: Cebador en 3' de CD40

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 6:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCGTCGACGT CTAGAGCCGA TCCTGGGG

\hfill

28

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Cebador de PCR

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: Cebador hacia abajo en 3' de CD40

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 7:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ACAAGATCTG GGCTCTACGT ACTCAGCCGA TCCTGGGGAC

\hfill

40

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: no

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: pentapéptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 8:

Tyr	Val	Gly	Pro	Arg
1				5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Cebador de PCR

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: Cebador en 5' de IGG1/Fc de tipo humano

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 9:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TATTAATCAT TCAGTAGGGC CCAGATCTTG TGACAAAACT CAC

\hfill

43

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Cebador de PCR

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: Cebador hacia abajo en 3' de IGG1/Fc de tipo humano

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 10:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCCAGCTTAA CTAGTTCATT TACCCGGAGA CAGGGAGA

\hfill

38

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 840 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: CD40-L

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 46..831

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 11:

21

210

22

220

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 261 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 12:

23

230

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 73 pares de bases***(B) TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 13:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGGTGGCGGA GGGTCAGGCG GAGGTGGGTC CGGAGGCGGG GGTTCAAGTT CTGACAAGAT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGAAGATGAA AGG

\hfill

73

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 14:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGCCGCTCAG AGTTTGAGTA A

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1425 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: CD40-L/FC2 de tipo humano (CD40-L soluble)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4..1422

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 79..1422

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sig_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4..78

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 15:

24

240

25

250

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 473 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 16:

27

28

280

29

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\hskip2cm

SEC ID Nº 17:

30

Claims

1. Un anticuerpo monoclonal aislado inmunoreactivo con CD40-L seleccionado de:

(a): el polipéptido definido por los aminoácidos 1 a 261, inclusive, de la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 11;

(b): el polipéptido definido por los aminoácidos 47 a 261, inclusive, de la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 11; y

(c): un polipéptido definido por una secuencia que comienza con un aminoácido en la secuencia entre el aminoácido 47 y el aminoácido 51, inclusive, para e incluir un aminoácido en la secuencia entre el aminoácido 239 y el aminoácido 261, inclusive, de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 11.

2. Un anticuerpo monoclonal aislado inmunoreactivo con CD40-L de tipo murino seleccionado de:

(a): el polipéptido definido por los aminoácidos 1 a 260, inclusive, de la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 1;

(b): el polipéptido definido por los aminoácidos 47 a 260, inclusive, de la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 1.