[go: up one dir, main page]

KR100283541B1 - 신규 사이토킨 - Google Patents

신규 사이토킨 Download PDF

Info

Publication number
KR100283541B1
KR100283541B1 KR1019940701285A KR19940701285A KR100283541B1 KR 100283541 B1 KR100283541 B1 KR 100283541B1 KR 1019940701285 A KR1019940701285 A KR 1019940701285A KR 19940701285 A KR19940701285 A KR 19940701285A KR 100283541 B1 KR100283541 B1 KR 100283541B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cd4o
cells
sequence
seq
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
KR1019940701285A
Other languages
English (en)
Inventor
리챠드 제이 아미테이지
윌리암 씨 판슬로우
멜라니 케이 스프리그스
스리니바산 서브하쉬니
Original Assignee
크리스토퍼 엘. 와이트, 스코트 지. 홀퀴스트, 스티븐 엘. 말라스카
임뮤넥스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27120174&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR100283541(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 크리스토퍼 엘. 와이트, 스코트 지. 홀퀴스트, 스티븐 엘. 말라스카, 임뮤넥스 코포레이션 filed Critical 크리스토퍼 엘. 와이트, 스코트 지. 홀퀴스트, 스티븐 엘. 말라스카
Application granted granted Critical
Publication of KR100283541B1 publication Critical patent/KR100283541B1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 폴리펩티드(CD40-L) 및 CD40-L 폴리펩티드를 제공하는데 유용한 DNA 서열, 벡터 및 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 더 구체적으로 말하자면, 본 발명은 CD40 수용체의 세포외 결합 영역과 결합하는 단리된 인체 및 쥐 CD40-L 폴리펩티드를 제공한다.

Description

[발명의 명칭]
신규 사이토킨
[본 발명의 기술분야]
본 발명은 신규 사이토킨(cytokine)에 관한 것이다. 더 구체적으로 말하자면, 본 발명은 가용성 및 막 결합 형태의 아고니스트 및 길항질 활성 모두를 갖는 인체 CD4O에 결합하는 쥐 및 인체 사이토킨 클로닝에 관한 것이다.
[발명의 배경]
"인터루킨(Interleukin)"으로 표시되는 사이토킨은 면역 주효기 세포에 영향을 미치는 단백질 인자이다. 인터루킨-1 내지 인터루킨-12로 표시되는 사이토킨이 보고되어 있으며, 인터루킨이라고도 불린다. 다른 공지의 사이토킨으로는 종양 괴사 인자(TNF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 마스트 세포 성장 인자(MGF), 표피 성장 인자(EGF), 혈소판 유도 성장 인자(PDGF), 신경 성장 인자(NGF), 에리쓰로포이에틴(EPO), γ-인터페론(γ-IFN) 등이 있다.
두개의 상이한 TNF 수용체(유형 I 및 유형 II)를 위한 DNA가 클로닝되어 있다[스미스(Smith) 등의 "Science" 248:1019(1990) 및 쉬올(Schall) 등의 "Cell" 61:361(1990) 참조]. TNF 수용체의 두 형태는 서로 관련이 있고, 신경 성장 인자 수용체(존슨(Johnson) 등의 "Cell" 47:545(1986)), B 세포 항원 CD 40(스타멘코빅 (Stamenkovic) 등의 "EMBO J." 8:1403 (1989)), T 세포 항원 OX4O (말레트 (Mallett) 등의 "EMBO J." 9:1063(1990), 인체 파스(Fas) 항원(이토(Itoh) 등의 "Cell" 66:233(1991)) 및 쥐 4-1BB 수용체(권(Kwon) 등의 "Cell. Immunol." 121:414(1989) [권 등의 I] 및 권 등의 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 86:1963(1989) [권 등의 II] 참조)로 이루어진 수용체 군에 속하는 것이다.
인체 CD4O 단백질(CD4O)은 분자량이 30,600인, 277개의 아미노산으로 이루어진 펩티드로서 주로 소수성 아미노산인 19개의 아미노산으로 이루어진 분비 신호 펩티드를 갖는다(스타멘코빅 등의 문헌). 성숙 인체 CD4O 단백질의 분자량(글리코실화는 제외)은 28,300이다. 인체 CD4O을 코딩하는 cDNA를 버키트(Burkitt) 임파종 세포주 라지(Raji)로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 단리시켰다. CD4O cDNA에 의해 코딩된 추정 단백질은 추정 리더 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 및 막 결합 수용체 단백질들이 공통적으로 갖는 기타 다른 다수의 특성을 함유한다. CD40은 B 임파구, 상피 세포 및 일부의 암세포주 상에서 발현된다는 것이 발견되었다.
CD4O에 대한 단일클론 항체(mAb)는 인체 B세포의 여러가지 기능 효과를 중개하는 것으로 나타났다. 이들 효과에는 (a) 동형 접착(고돈(Gordon) 등의 "J. Immunol." 140:1425(1988) [고돈 등의 I]); (b) 증가된 세포 크기(고돈 등의 I 및 발레(Valle) 등의 "Eur. J. Immunol." 19 1463(1989)); (c) 항-IgM, 항-CD2O mAb, 포르볼 에스테르(클라크(Clark) 등의 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 83:4494(1986) 및 파울리(Paulie) 등의 "J. Immunol." 142:590(1989)) 또는 인터루킨-4와 결합된 포르볼 에스테르 (고돈 등의 "Eur. J. Immunol. " 17:1535(1987) [고돈 등의 II])에 의해 활성화된 B 세포 증식, 및(d) 인터루킨-4(IL-4)에 의해 자극된 T-고갈 배양물로부터 IgE(자바라(Jabara) 등의 "J. Exp. Med." 172:1861(1990); 장(Zhang) 등의 "J. Immunol." 146:1836(1991)) 및 IgM (가스칸 (Gascan) 등의 "J. Immunol." 147:8(1991))의 생산이 있다.
이러한 항체 중의 하나인 mAb89(반체로(Banchereau) 등의 "Clin. Immunol. Spectrum" 3:8(1991) [반체로 등의 I])라고 불리는 항체는 비교적 낮은 항체 농도 (30 ng/ml 또는 약 10-10M)에서 인체 B세포 증식을 유도하는 것으로 발견되었다. 증식은 2 내지 3주 동안 지속되고, 인체 B 세포 수를 10배 증가시켰다. CD4O 표면 분자가 IgM과 가교결합되었을 때, B 세포가 최적 상태로 자극되었다. 다른 항-CD4O mAb의 Fab 단편은 불과 1주일 동안만 증식 반응을 유도하였다. 또한, 반체로 등의 문헌("Science" 251:70(1991)[반체로 등의 II]에 따르면, 정지 인체 B 세포가 인체 Fc 수용체, 및 인체 CD4O에 대해 특이적인 모노크로날 항체로 감염된 쥐의 섬유아세포 Ltk- 세포주와 함께 배양될 때, 정지 인체 B 세포는 지속적인 증식 상태에 돌입한다고 보고하고 있다. 반체로 등의 II에 의하면, 가교 결합 CD4O 이 B 세포의 클론 팽창을 위해 필요하다는 것이 발견되었다.
CD23은 T 세포 상에서 발현되는 것이 아니라, 대부분의 IgM-/IgD-성숙 B 세포 상에서 발현되는 것으로 발견된 저친화성 IgE 수용체이다. CD23은 서열화되어 있고, 그의 서열은 키쿠타니(Kikutani) 등의 문헌["Cell" 47:657(1986)]에 기재되어 있다. 가용성 CD23(sCD23)은 토끼에서 피로겐 반응을 유도하는 것으로 발견되었으며, 이 반응은 인체 IgE의 투여에 의해 중단되었다(가데리(Ghaderi) 등의 "Immunology" 75:510(1991) 참조). 따라서, CD23은 가용성 CD4O 또는 CD4O-L 효과를 위한 적당한 마커(marker)일 수 있다.
본 발명 이전에는 CD4O을 위한 리간드가 알려져 있지 않았었다. 따라서, 당 업계에서는 CD4O 리간드(CD4O-L)를 동정 및 특성화하는 것이 요구되고 있다.
[발명의 요약]
신규 사이토킨(이하, "CD4O-L"이라 표기함)을 단리시켜서 특성화하였다. 대표적인 쥐 CD4O-L cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 추정 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1 및 제1도에 기재되어 있으며, 또한 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2에 기재되어 있다. 대표적인 인체 CD4O-L cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 추정 아미노산 서열은 SEQ ID NO:11 및 제2도에 기재되어 있고, 또한 아미노산 서열은 SEQ ID NO:12에 기재되어 있다. 또한, 본 발명은 보통 엄격한 또는 심하게 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:11 (인체 CD4O-L의 코딩 영역)로 정의되는 프로브, SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 46에서부터 뉴클레오티드 828까지 연장되는 서열의 단편, 또는 제2도 (SEQ ID NO:11)에 대해 상보적인 DNA 또는 RNA 서열 또는 그의 단편과 혼성화되는, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 다른 CD4O-L 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 본 발명은 유전 암호의 축퇴로 인해, 상기 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드와 실질적으로 동일 또는 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 이에 대해 상보적인 서열을 포함한다.
CD4O-L은 C-말단으로서의 세포외 영역, 트랜스멤브레인 영역 및 N-말단으로서의 세포내 영역을 갖는 유형 II 막 폴리펩티드이다. 쥐 CD4O-L의 가용성 형태는 EL-4 세포의 상징액에서 발견되었으며, EL-4 세포는 본 명세서에 기재된 비오티닐화된 CD40/Fc 융합 단백질을 기초로 하여 분류하였다. 가용성 CD4O-L은 CD4O-L의 세포외 영역 또는 그의 단편으로 이루어진다. 쥐 CD40-L(ATCC에 1991년 12월 6일자로 수탁되어 수탁번호 ATCC 68872가 부여됨)의 단백질 서열은 제1도 및 SEQ ID NO:2에 기재되어 있으며, 인체 CD4O-L(ATCC에 1991년 12월 6일자로 수탁되어 수탁번호 ATCC 68873이 부염됨)의 단백질 서열은 제2도 및 SEQ ID NO:12에 기재되어 있다. 쥐 CD4O-L의 세포외 영역은 제1도 및 SEQ ID NO;2에서 아미노산 47에서부터 아미노산 260까지 연장되고, 인체 CD4O-L의 세포외 영역은 제2도 및 SEQ ID NO:12에서 아미노산 47에서부터 아미노산 261까지 연장된다. CD4O-L의 생물학적 활성은 이 사이토킨이 CD4O과 결합함으로써 중개되는데, 이러한 활성은 B 세포 증식, 및 IgE 분비를 포함하여 항체 분비와 유도를 포함한다.
또한, 본 발명은 CD4O-L의 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:11 및 제1도 및 제2도에 기재된 바와 같은 CD40-L의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 DNA 또는 RNA 서열로부터 선택된 적어도 약 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열에 대응하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드 (데옥시뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)를 제공한다. 이러한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 CD4O-L mRNA 또는 폴리펩티드의 전사 또는 번역을 방해한다.
또한, 본 발명은 CD4O-L 면역원에 대해 특이적인 항체를 생성하기 위해 면역원으로서 작용할 수 있는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO;11에 의해 코팅된 아미노산 서열로부터 선택된 적어도 10개의 아미노산으로 이루어진 단백질 서열에 대응하는 CD4O-L 펩티드 단편을 제공한다. 이 CD4O-L 면역원 단편은 CD4O-L에 대해 특이적인 모노크로날 항체를 제공함에 있어서 항원 결정기로서 작용할 수 있다.
또한, 본 발명은 인체 CD40/Fc 융합 단백질, 및 인체 CD4O의 세포외 영역으로 이루어지는 가용성 CD4O 단백질(sCD40)을 제공한다. sCD40 및 CD40/Fc 융합 단백질은 모두 CD4O-L 또는 항-CD4O mAb에 의해 유도되는 B 세포 자극, IL-4에 의해 유도되는 IgE 자극 및 IL-4에 의해 유도되는 B 세포에서의 CD23 유도를 억제할 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 쥐 CD4O-L에 대응하는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다. 이 단백질은 폴리펩티드의 N-말단으로서의 세포내 도메인, 트랜스멤브레인 영역, 및 폴리펩티드의 C-말단으로서의 세포외 도메인을 갖는 유형 II 폴리펩티드이다. 세포내 도메인이나 또는 트랜스멤브레인 영역보다 길이가 더 긴 세포외 도메인은, 4개의 시스테인(Cys) 잔기에 비추어 볼 때, 하나의 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위 및 두개의 잠재적인 디술피드 결합을 함유한다.
제2도는 인체 CD4O-L에 대응하는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다. 이 단백질은 폴리펩티드의 N-말단으로서의 세포내 도메인, 트랜스멤브레인 영역, 및 폴리펩티드의 C-말단으로서의 세포외 도메인을 갖는 유형 II 폴리펩티드이다. 세포내 도메인 또는 트랜스멤브레인 영역보다 길이가 더 긴 세포외 도메인은, 5개의 시스테인(Cys) 잔기에 비추어 볼 때, 1개의 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위 및 2개의 잠재적인 디술피드 결합을 함유한다.
제3도는 아미노산 수준에서 77.7%의 상동성을 나타내는 인체 및 쥐 CD4O-L의 단백질 서열을 비교한 것이다.
제4도는 완전 길이의 쥐 CD4O-L cDNA(SEQ ID NO:1)로 형질 감염되어 결합 CD40-L을 발현하는 CV1 세포 (CD40-L + CV1 세포)와 함께 배양함으로써 일어나는 T 세포 고갈 인체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 증식을 중공 벡터(HAVEO)로 형질감염되어 결합 쥐 CD4O-L을 발현하지 않는 CV1 세포와 함께 배양할 때 일어나는 것과 비교해서 나타낸다. 제7일째의 증식 결과는 CD4O-L + CV1 세포가 인터루킨-4(IL-4) 부재 또는 존재 하에서 T-세포 고갈 PBMC의 증식을 상당히 증가시킨다는 것을 나타낸다.
제5도는 결합 쥐 CD4O-L 및 10 ng/ml의 IL-4를 첨가했을 때의 T 세포 고갈 PBMC의 증식을 나타낸다. 이 데이타는 IL-4의 동시 유사분열유발 효과를 나타내지는 않지만, 결합 CD4O-L의 지속적인 강한 유사분열 유발 효과를 나타낸다.
제6도는 결합 CD4O-L이 IgE 분비를 증가시킨다는 것을 나타낸다.
제7도는 막-결합 CD4O-L이 IL-4 존재하에서 CD23 유도를 자극한다는 것을 나타낸다.
제8도는 헬퍼 T 세포 클론인 막 결합 쥐 CD40-L 또는 7A1 세포에 의해 일어나는 쥐 비장 B 세포의 증식을 나타낸다.
제9도는 항-양 적혈구 세포(SRBC)에 의한 플라크 형성 세포(PFC)로 나타낸 항원 특이성 반응 유도에 대해서 쥐 CD40-L 및 T 세포 7A1의 발현을 기초하여 분류된 세포주인 쥐 EL4O.9 세포들을 비교하여 나타낸다.
제10도는 상이한 cDNA로 형질 감염된 막 결합 CD40-L 및 기타 다른 유형의 세포의 B 세포 증식 활성을 비교하여 나타낸다. 막 결합 CD4O-L은 헬퍼 T 세포클론 또는 기타 다른 대조 세포에 비해 상당히 높은 B 세포 증식 활성을 나타낸다.
제11도는 쥐 CD4O-L cDNA로 형질 감염된 7C2 세포(헬퍼 T 세포 클론) 및 CV1 세포가 항 SRBC 플라크 형성 세포를 유발한다는 것을 나타낸다.
제12도는 쥐 B 세포 증식 유도에 대해서 두개의 헬퍼 T 세포 클론과 막 결합 CD4O-L을 발현하는 세포를 비교하여 나타낸다.
제13도는 인터루킨-2(IL-2) 존재 또는 부재하에서 막 결합 CD4O-L 및 헬퍼 T 세포 클론에 의한 항원 특이성 플라크 형성 세포 유도를 나타낸다.
제14도는 막 결합 CD4O-L의 B 세포 증식 및 IgE 분비 자극 효과를 나타낸다. 막 결합 CD4O-L의 효과는 TNF 수용체가 아니라 CD4O 수용체에 의해 억제되었다.
[발명의 상세한 설명]
쥐 및 인체 CD4O을 위한 리간드로서 작용할 수 있는 신규 폴리펩티드를 단리해서 서열화하였다. 더 구체적으로 말하자면, 이 리간드를 코딩하는 cDNA를 클로닝하고 서열화하였다. 또한, 본 발명은 재조합 CD4O-L 폴리펩티드를 발현시키는 방법을 제공한다. CD4O-L 폴리펩티드는 인체 또는 쥐 CD4O-L의 유도체 또는 유사체와 같은 다른 형태의 포유 동물 CD4O-L을 포함한다. 쥐 및 인체 CD4O-L은 완전 길이의 막 결합 폴리펩티드의 C-말단에 각각 아미노산 214 및 215개의 세포외 영역을 포함한다. 세포외 영역은 CD4O에 결합하는 도메인을 포함한다. 또한, 쥐 및 인체 CD4O-L은 양측에 대전된 아미노산으로 경계지워지는 동종의 소수성 아미노산 24개로 이루어진 트랜스멤브레인 영역, 및 N 말단으로서 아미노산 22개의 세포내 영역을 포함한다. 또한, 본 발명은 막 결합 단백질로서 쥐 또는 인체 CD4O-L을 코딩하여 인체 또는 쥐 CD4O-L을 발현하는 cDNA로 형질 감염된 포유 동물 세포의 세포외 영역 전부 또는 일부 또는 세포외 영역의 유도체로 이루어지는 완전 길이의 CD4O-L 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함한다.
본 발명은 CD4O-L 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA 서열 및 이 단리된 DNA 서열에 대해 상보적인 DNA 또는 RNA 서열을 포함한다. 이 단리된 DNA 서열 및 그의 상보 서열은 (a) 제2도(SEQ ID NO:11)에 나타낸 DNA 서열의 뉴클레오티드 184 내지 828, 뉴클레오티드 193 내지 828 또는 뉴클레오티드 193 내지 762, 및 그의 상보 서열, (b) 보통 엄격한 조건 하에서 (a)의 DNA 서열 또는 그의 상보 서열과 혼성화되어 CD4O-L 폴리펩티드, 그의 유사체 또는 유도체를 DNA 서열, 및 (c) 유전 암호의 축퇴로 인해, 상기 DNA 서열 및 그의 상보 서열 중 어느 하나에 의해 코딩된 CD4O-L 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이밖에, 본 발명은 CD4O-L 폴리펩티드 및 유사체를 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 벡터, 및 이 벡터로 감염된 숙주 세포를 포함한다.
본 명세서에 기재된 신규 사이토킨은 TNF 수용체 슈퍼(super) 군에 속하는 수용체인 CD4O을 위한 리간드이다. 따라서, CD4O-L은 예를 들면 B 임파구에 의해 발현되는 것으로 알려진 CD4O에 의해 신호를 형질 도입할 수 있는 원인일 것이다. 완전 길이의 CD4O-L은 막 결합 폴리펩티드이며, 이는 C 말단으로서의 세포외 영역, 트랜스멤브레인 영역 및 N-말단으로서의 세포내 영역으로 이루어진다. CD40-L의 가용성 형태는 세포외 영역 또는 그의 단편으로부터 제조될 수 있으며, 가용성 CD4O-L은 CD4O-L의 막 결합 형태를 발현하는 세포의 배양 상징액에서 발견된다. 쥐 CD4O-L의 세포외 영역의 단백질 서열은 제1도 및 SEQ ID NO:2에서 아미노산 47에서부터 아미노산 260까지 연장된다. 인체 CD4O-L의 세포외 영역의 단백질 서열은 제2도 및 SEQ ID NO:12에서 아미노산 47에서부터 아미노산 261까지 연장된다. CD4O-L의 생물학적 활성은 CD4O 또는 그의 종 특이성 동족체에 결합시킴으로써 중개되고, 이러한 활성은 B 세포의 증식, 및 활성 B 세포로부터의 면역글로블린 분비 유도를 포함한다. CD4O-L (가용성 모노머 및 올리고머 형태 뿐만아니라 막 결합 형태)은, 활성을 중개하는데 IL-4 및 가교 결합을 필요로하는 항-CD4O 항체와는 대조적으로, IL-4 부재하에서 B 세포 증식 및 면역글로블린 분비(IgE 분비는 제외)를 수행할 수 있다.
CD4O-L은 CD4O 또는 CD4O의 포유 동물 동족체에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "CD4O-L"이라는 용어는 트랜스멤브레인 및 세포내 영역이 결여된 가용성 CD4O-L 폴리펩티드, 인체 CD4O-L의 포유동물 동족체, 인체 또는 쥐 CD4O-L의 유사체 또는 인체 또는 쥐 CD4O-L의 유도체를 포함한다.
또한, CD4O-L은 CD4O-L 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 얻을 수 있다. 본 명세서에서 CD4O-L 유사체는 인체 또는 쥐 CD4O-L의 서열과 실질적으로 상동이지만, 하나 또는 다수의 결실, 삽입 또는 치환으로 인해 천연 서열 CD4O-L (인체 또는 쥐) 폴리펩티드와는 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. CD4O-L의 유사체는 올리고뉴클레오티드 합성 및 결찰에 의해 또는 부위 특이성 돌연변이 유발 기술에 의해 제조된 DNA 구조체로부터 합성될 수 있다.
인체 또는 쥐 CD4O-L의 일차 아미노산 구조는 글리코실기, 지질, 포스페이트, 아세틸기 등과 같은 기타 다른 화학적 잔기와 공유 결합성 또는 응집성 접합체(conjugate)를 형성함으로써 또는 아미노산 서열에 돌연변이를 유발함으로써 변경시켜서 CD4O-L 유도체를 생성할 수 있다. CD4O-L의 공유 결합성 유도체는 특정 관능기를 CD4O-L 아미노산 측쇄에 연결시키거나 또는 CD40-L 폴리펩티드 또는 그의 세포외 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 결합시킴으로써 제조된다. 본 발명의 범위에서 CD4O-L의 다른 유도체는 재조합 배양물에서 N-말단 또는 C-말단 융합체로서 합성하는 것과 같이 CD4O-L 또는 그의 단편과 기타 다른 단백질 또는 폴리펩티드와의 공유 결합성 또는 응집성 접합체를 포함한다. 예를 들면, 접합체는 접합체의 접합 전달을 합성 부위로부터 세포막 또는 세포벽의 내부 또는 외부로 동시 번역 또는 후번역적으로 인도하는 CD4O-L 폴리펩티드의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역에 신호 또는 리더 폴리펩티드 서열을 함유할 수 있다(예: 사카로마이세스 (Saccharomyces)의 α-인자 리더). CD4O-L 폴리펩티드 융합체는 CD4O-L의 정제 및 동정을 용이하게 하기 위해 첨가된 폴리펩티드(예 : 폴리-히스(poly-His), 또는 신규 다관능성체를 제공하는 다른 사이토킨과의 융합체를 포함할 수 있다. 다른 사이토킨은 예를 들면 인터루킨 1 내지 13, TNF(종양 괴사 인자), GM-CSF(과립구 대식세포 콜로니 자극 인자), G-CSF(과립구-콜로니 자극 인자), MGF(마스트 세포 성장 인자), EGF(표피 성장 인자), PDGF(혈소판 유도 성장 인자), NGF(신경 성장 인자), EPO (에리쓰로포이에틴), γ-IFN(감마 인터페론), 4-1BBL (4-1BB 리간드), 및 면역 세포 성장, 분화 또는 기능에 영향을 미치는 기타 다른 사이토킨이 있다.
본 발명의 핵산 서열은 보통 엄격한 또는 심하게 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 서열 또는 상보적인 스트랜드와 혼성화되는 DNA 및(또는) RNA 서열을 포함한다. 보통 엄격한 혼성화 조건은 예를 들면 삼브루크(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, 1:1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재된 조건을 의미한다. 삼브루크 등의 문헌에 정의된 바와 같은 보통 엄격한 조건은 예비 세척 용액[5 ×SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)] 및 혼성화 조건(50℃, 5 ×SSC, 철야)의 이용을 포함한다. 심하게 엄격한 조건은 고온의 혼성화 및 세척을 포함한다.
CD4O-L의 생물학적 활성은 예를 들면 CD4O의 리간드 결합 도메인에 결합하기 위한 경쟁을 측정함으로써 결정할 수 있다(즉, 경쟁 결합 분석). 쥐 CD4O-L 및 인체 CD4O-L은 모두 인체 CD4O에 결합한다. 인체 CD4O에 대한 쥐 CD4O-L(분류된 쥐 EL-40.9 세포에서 발현됨)의 결합 친화성은 약 1.74 ×109M-1이었다. 마찬가지로, 인체 CD4O에 대한 쥐 CD4O-L(비분류된 쥐 EL-46.1 세포에서 발현됨)의 결합 친화성은 약 2.3 ×109M-1이었다. 이들 결합 친화성 측정치는 모두 사이토킨/사이토킨 수용체 결합을 대표하는 범위내에 포함된다.
CD4O-L 폴리펩티드에 대한 경쟁 결합 분석의 한 방법은 방사성 표지화된 가용성의 제1도(SEQ ID NO:1)의 쥐 CD4O-L 또는 제2도(SEQ ID NO:11)의 인체 CD4O-L, 및 CD4O을 발현하는 무상(intact) 세포(예 : 인체 B 세포)를 사용한다. 무상 세포 대신에, 융합 단백질의 Fc 영역과 단백질 A 또는 단백질 B와의 상호 작용을 통해 고체 상에 결합된 가용성 CD4O(예 : CD40/Fc 융합 단백질)로 대체할 수 있다. 경쟁 결합 분석의 또다른 방법은 CD40/Fc 융합 단백질과 같은 방사성 표지화된 가용성 CD4O, 및 CD4O-L을 발현하는 무상 세포를 활용한다. 별법으로, 가용성 CD4O-L은 고체 상에 결합될 수 있다.
경쟁 결합 분석은 표준 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 방사성 표지화된 CD4O-L은 표면 결합된 CD4O에 대한 결합 활성을 분석하기 위해 추정 CD4O-L 동족체와 경쟁시키는데 사용될 수 있다. 정량적인 결과는 경쟁형 오토라디오그래프 플레이트 결합 분석에 의해 얻을 수 있거나, 또는 정량적인 결과를 얻기 위해서는 스캐챠드 플롯(Scatchard plot)을 활용할 수 있다.
CD4O을 발현하는 무상 세포와의 경쟁 결합 분석은 두가지 방법에 의해 수행될 수 있다. 첫번째 방법에서는, B 세포를 현탁시켜서 성장시키거나 또는 조직 배양 플레이트에 부착시켜서 성장시킨다. 부착 세포는 37℃에서 10분 동안 5mM EDTA로 처리해서 제거할 수 있다. 두번째 방법에서는, 막 결합 CD4O을 발현하는 형질 감염된 COS 세포를 사용할 수 있다. COS 세포 또는 또다른 포유 동물 세포는 세포 외부에 세포외 영역을 갖는 완전 길이의 CD4O을 발현하기 위해 적당한 벡터에서 인체 CD4O cDNA로 형질 감염시킬 수 있다.
별법으로,가용성 CD4O은 칼럼 크로마토그래피 매트릭스와 같은 고체 상에 결합시키거나, 또는125I와 같은 검정 가능한 부분의 존재 여부를 분석하기 위한 적당한 튜브 또는 유사한 기판에 결합시킬 수 있다. 고체 상과의 결합은 예를 들면 CD40/Fc 융합 단백질을 얻어서 이것을 단백질 A 또는 단백질 G 표면에 결합시킴으로써 달성할 수 있다.
CD4O-L 및 그의 동족체의 생물학적 활성을 측정하기 위한 또다른 방법은 상기와 유사한 경쟁 분석에 접합된 가용성 CD4O(예 :125I-CD40/Fc)을 이용하는 것이다. 그러나, 이 경우 CD4O-L, 또는 고체 기판에 결합된 가용성 CD4O-L을 발현하는 무상 세포는 추정 CD4O 동족체를 함유하는 시료를 이용하여 CD4O-L에 대한 접합된 가용성 CD4O의 결합 경쟁을 측정하는데 사용된다.
또한, CD4O-L은 B 세포 증식 평가에서 생물학적 활성을 측정함으로써 분석할 수 있다. 인체 B 세포는 데프란스(Defrance 등의 문헌[J. Immunol. 139:1135 (1987)]에 기재된 바와 같이 네가티브 선택 및 퍼콜(Percoll) 밀도 침강에 의한 정제에 의해 인체 편도선으로부터 얻을 수 있다. 버키트 임파종 세포주는 CD4O-L 에 대한 반응으로 일어나는 세포 증식을 측정하는데 사용될 수 있다. 버키트 임파종 세포주의 예로는 예를 들면 라지(ATCC CCL 86), 다우디(Daudi; ATCC CCL 213) 및 나말와(Namalwa; ATCC CRL 1432)가 있다. 막 결합 CD40-L은 B 세포 증식을 자극한다. 올리고머, 바람직하게는 다이머 CD4O-L은 B 세포 증식을 자극할 수 있다. CD4O(수용체)는 B 세포의 CD4O-L 증식을 억제한다.
CD4O-L의 생물학적 활성을 결정하기 위한 또다른 분석은 CD4O-L 또는 그의 유도체 또는 유사체의 활성화에 대한 반응으로 B 세포에 의해 생산되는 면역 글로블린을 측정하는 것이다. 다클론 면역 글로블린 분비는 예를 들면 배양액에서 5 ×105B 세포/ml를 적어도 7일 동안 배양함으로써 측정할 수 있다. 면역 글로블린(Ig) 생산은 맬리스제우스키(Maliszewski) 등의 문헌[J. Immunol. 144: 3028(1990) (맬리스제우스키 등의 I) 또는 Eur. J. Immunol. 20:1735(1990) (맬리스제우스키 등의 II)]에 기재된 바와 같은 엘리사(ELISA) 분석에 의해 측정할 수 있다. 쥐 B 세포는 예를 들면 마우스로부터 얻어서, 그래브스테인(Grabstein) 등의 문헌[J. Exp. Med. 163:1405(1986) (그래브스테인 등의 I)], 맬리스제우스키 등의 I 및 맬리스제우스키 등의 II에 기재된 방법에 따라서 배양할 수 있다.
CD4O-L은 CD4O을 발현하는 세포를 검정하기 위한 결합 분석에 사용할 수 있다. 예를 들면, 제1도 (SEQ ID NO:1)의 쥐 CD4O-L 또는 제2도(SEQ ID NO:1)의 인체 CD4O-L 또는 그의 세포외 도메인 또는 단편은125I와 같은 검정 가능한 부분에 접합시킬 수 있다.125I에 의한 방사성 표지화는 높은 특이 활성으로 표지화된 관능성125I-CD4O-L 분자를 생산하는 몇가지 표준 방법 중 어느 하나에 의해 수행할 수 있다. 별법으로, 색 정량 또는 형광 정량 반응에 측매적으로 작용할 수 있는 효소, 비오틴 또는 아비딘과 같은 기타 다른 검정 가능한 부분이 사용될 수 있다. CD4O 발현 세포는 접합 CD4O-L과 접촉시킬 수 있다. 배양 후, 비결합 접합 CD4O-L을 제거하고, 검정 가능한 부분을 이용하여 결합을 측정한다.
CD4O-L 폴리펩티드는 다이머 또는 트리머와 같은 올린고머로서 존재할 수 있다. 올리고머는 상이한 CD4O-L 폴리펩티드 상의 시스테인 잔기 사이에 형성된 디술피드 결합에 의해 연결된다. 별법으로, 두개의 가용성 CD40-L 도메인을 Gly4 SerGly5Ser 링커 서열, 또는 미합중국 특허 제5,073,627호 (본 명세서에서 참고 인용함)에 기재된 다른 링커 서열과 연결시킬 수 있다. 또한, CD4O-L 폴리펩티드는 CD40/Fc 융합 단백질에 대해 기재한 바와 같이 가용성 CD4O-L의 C 말단(세포외 도메인)과 IgG1의 Fc 영역 (예 : SEQ ID NO:3)을 융합시킴으로써 형성할 수 있다. CD40-L/Fc 융합 단백질은 2가 CD4O-L을 형성하는 항체 분자의 중쇄와 훨씬 유사하다. 항체의 중쇄 및 경쇄 모두를 가진 융합 단백질이 제조되는 경우, 4개의 CD4O-L 세포외 영역을 갖는 CD4O-L 올리고머를 형성할 수 있다.
융합 단백질은 목적 서열로부터의 단편을 효소 절단 및 결찰시키는 통상의 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR 기술은 목적 단편을 제조 및(또는) 증폭시키는데 사용될 수 있다. 목적 서열을 나타내는 합성-올리고뉴클레오티드의 중첩(overlapping)을 이용하여 융합 단백질의 코딩하는 DNA 구조체를 제조할 수 있다. 또한, 융합 단백질은 CD40-L, 및 추가로 리더(또는 신호 펩티드) 서열, Fc 영역, 링커 서열, 및 융합 단백질의 용이한 정제 또는 신속한 검정을 위한 수단을 제공하는 고도의 항원 부분을 코딩하는 서열을 포함하여 2 이상의 서열로 이루어질 수 있다.
신호 펩티드는 세포로부터 단백질 분비를 촉진시킨다. 일례의 신호 펩티드는 인체 인터루킨-7(II-7; 굿윈(Goodwin) 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 302(1989): 제2b도)의 리더 서열의 아미노 말단의 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또한, 다른 신호 펩티드도 사용될 수 있다. 예를 들면, IL-7 리더 서열에서 일부 뉴클레오티드는 아미노산 서열을 변경시키지 않고도 변경될 수 있다. 또한, 리더 서열로서 작용하는 IL-7 서열의 능력에 영향을 주지 않고도 아미노산을 변화시킬 수 있다.
플라그(Flag) 옥타펩티드(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)는 융합 단백질의 생물학적 활성을 변경시키지 않으며, 고도의 항원이고, 특이성 모노크로날 항체에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하며, 발현된 융합 단백질의 신속한 검정 및 용이한 정제를 가능하게 한다. 플라그 서열은 또한 Asp-Lys 바로 다음에 위치한 잔기에서 소 점막 엔테로키나제에 의해 특이적으로 절단되고, 이 펩티드에 의해 캡핑(capping)된 융합 단백질은 이 콜라이(E. Coli)에서의 세포내 분해에 대해 내성을 가질 수도 있다. 플라그서열에 결합하는 쥐 모노크로날 항체는 ATCC에 기탁 번호 HB9259로 기탁되었으며; 플라그 서열로 이루어지는 융합 단백질의 정제에 항체를 사용하는 방법은 미합중국 특허 제5,011,912호에 기재되어 있으며, 본 명세서에서는 이 문헌을 참고 인용한다.
적당한 Fc 영역은 단백질 A 또는 단백질 G에 결합할 수 있는 Fc 영역으로 정의되거나, 또는 별법으로서, Fc 영역으로 이루어지는 융합 단백질의 정제 또는 검정에 사용될 수 있는 항체로서 인식된다. 바람직한 Fc 영역은 인체 IgG1또는 쥐 IgG1의 Fc 영역을 포함한다. 일례는 SEQ ID NO:3에 나타낸 인체 IgG1Fc 영역이고; 또다른 예는 주형으로서 인체 cDNA를 사용하여 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10의 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 PCR에 의해 얻어지는 cDNA에 의해 코딩되는 Fc 영역이다. 또한, 적당한 Fc 영역의 부분, 예를들면 단백질 A와의 결합의 원인이 되는 아미노산 서열이 결실된 인체 IgG1의 Fc 영역은 결과적인 Fc 영역이 단백질 A가 아니라 단백질 G에 결합하도록 하기 위해 사용될 수도 있다.
[Gly4Ser]3반복 서열은 CD4O-L이 적절하게 이차 및 삼차 구조 내로 겹쳐지게 하기에 충분한 간격으로 CD4O-L의 세포외 영역과 융합 단백질의 Fc 영역을 이격시키는 링커 서열을 제공한다. 적당한 링커 서열은 (1) 가요성의 연장된 배열을 채택하고, (2) 융합 단백질의 관능성 도메인과 상호 작용할 수 있는 정렬된 이차 구조를 발달시키는 경향을 나타내지 않고, (3) 관능성 단백질 도메인과의 상호작용을 촉진시킬 수 있는 소수성 또는 대전 특성을 최소한으로 가진다. 가요성 단백질 영역의 대표적인 표면 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser을 포함한다. 사실상, Gly, Asn 및 Ser을 함유하는 아미노산 서열의 모든 변화는 링커 서열에 대한 상기 척도를 만족시킬 것으로 예상된다. Thr 및 Ala와 같은 기타 다른 중성에 가까운 아미노산이 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커 서열의 길이는 융합 단백질의 생물학적 활성에 중요한 영향을 미치지 않게 하면서 변화시킬 수 있다. 링커 서열은 융합 단백질이 관능성 도메인을 분리시키고 입체 구조적 간섭을 방지하는데 사용될 수 있는 불필수 N- 또는 C-말단 아미노산 영역을 갖는 경우에 불필요하다.
CD4O-L 폴리펩티드는 제1도(SEQ ID NO:1) 및 제2도(SEQ ID NO:1)에 나타낸 CD4O-L의 세포외 도메인으로 이루어지는 가용성 폴리펩티드로서, 또는 쥐 및 인체 서열의 제1도(SEQ ID NO:1) 및 제2도(SEQ ID NO:11)에 나타낸 바와 같이 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 영역 및 짧은 세포내 도메인으로 이루어지는 막 결합 폴리펩티드로서 존재할 수 있다. 게다가, 본 발명은 디술피드 상호 작용에 의해 연결되거나 또는 스페이서 아미노산 링킹(linking) 기 존재 또는 부재하에 융합 중합체로서 나타내어지는 CD4O-L 세포외 도메인 또는 그의 단편의 올리고머를 포함한다. 예를 들면, 다이머 CD4O-L 분자는 IgG Fc 영역 링킹 기에 의해 연결될 수 있다.
이론적으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 막 결합 CD4O-L 및 올리고머 CD4O-L은, 종래에는 IL-4 존재하에서 가교 결합된 항-CD4O 항체에 의해서만 달성할 수 있었던, B 세포의 Ig 생성 및 증식을 자극하는 활성을 달성할 수 있다. 또한, CD4O-L의 세포외 도메인으로만 이루어지며 CD40 수용체에 결합할 수 있는 가용성 모노머 CD4O-L은 막 결합 올리고머 CD4O-L 및(또는) 가교 결합 CD4O 항체의 활성을 억제하는데 기여하는 것으로 여겨진다. 또한, 막 결합 CD4O-L과 CD4O의 상호 작용은 B 세포 성장 및 분화의 항원 특이성 항체 생산 및 다클론 Ig 분비의 T세포 접촉 의존성 유도의 원인이 되는 주요한 분자 상호 작용이다. 이와 관련하여, 완전 길이 CD4O-L을 코딩하는 cDNA로 형질 감염된 포유 동물 세포(즉, 세포내 도메인, 트랜스멤브레인 영역 및 세포외 도메인 또는 그의 단편을 가지며 막 결합됨)는 B 세포 성장, 분화, 및 항원 특이성 항체 생산 자극을 유도할 수 있는 능력에 있어서 T 세포를 모방할 수 있는 것으로 여겨진다. 가용성 올리고머 CD4O-L, 바람직하게는 세포외 영역의 다이머의 활성은 막 결합 CD4O-L의 생물학적 활성을 모방할 수 있는 것으로 여겨진다. 게다가, 가용성 모노머 CD4O-L(세포외 도메인 또는 그의 단편으로 이루어짐)은 CD4O 수용체에 결합하여 T 세포와 B 세포의 상호 작용을 방지할 수 있으며, 따라서 그 자체로서 모노머 또는 올리고머 형태로 존재할 수 있는 CD4O(수용체) 세포외 도메인과 유사한 활성을 갖는다. 별법으로, CD4O-L은 B 세포 성장, 분화, 및 항원 특이성 항체 생산 자극을 유도할 수 있는 가용성 인자로서 작용하기 위해 올리고머(바람직하게는 다이머)일 수 있다. 따라서, 막 결합 CD4O-L 및 올리고머 CD4O-L은 CD4O 아고니스트로서 작용하는 반면, 가용성(모노머) CD4O-L 및 가용성 CD4O은 신호를 중요하게 형질도입하지 않고 CD4O 수용체 부위를 차단시킴으로써 또는 B 세포 및 다른 표적 세포에서 CD40 부위에 CD4O-L이 결합하는 것을 방해함으로써 CD4O 길항질로서 작용하는 것으로 여겨진다.
CD4O 아고니스트 및 CD4O 길항질은 모두 유용한 치료 활성을 가질 것이다. 예를 들면, CD4O 아고니스트(즉, 막 결합 CD4O-L 및 올리고머 CD4O-L)은 백신 보조제로서 유용하고 하이브리도마 세포로부터 mAb 생산을 자극하는데 유용하다. CD4O 길항질(즉, CD4O 수용체, CD40/Fc 및, 가능하면, 가용성 모노머 CD4O-L)은 알레르기, 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 등과 같은 고수준의 항원-항체 복합체 존재를 특징으로 하는 자기 면역 질환 치료에 유용하다.
인체 B 세포로부터 IgE 분비는 T 세포 존재하에 IL-4에 의해 유도될 수 있다(버셀리(Vercelli) 등의 "J. Exp. Med." 169;1295(1989) 참조). 또한, IgE 생산은 항-CD4O mAb를 첨가함으로써 T 세포 고갈 PBM(말초 혈액 단핵 세포)로부터 유도될 수 있다(자바라 등의 "J. Exp. Med." 172:1861(1990); 및 장(Zhang) 등의 "J. Immunol." 146:1836(1991)). 또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 CD40/Fc 융합 단백질, 또는 SEQ ID NO. 3에 기재된 cDNA 서열에 의해 코딩된 가용성 CD4O의 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는, T 세포 존재하의 IL-4에 의해 또는 CD4O-L (바람직하게는 막 결합 CD4O-L)에 의해 활성화되는 활성화 B 세포로부터의 IgE 생산을 억제하기 위한 방법을 포함한다. 마찬가지로, CD4O 수용체 및 가능하면 가용성 CD4O-L(모노머에 한함)은 또한 다른 항체 이소타입의 분비를 차단할 수도 있다.
또한, 본 발명은 연합된 천연-패턴 글리코실화 존재 또는 부재하의 CD40-L 폴리펩티드를 포함한다. 효모 또는 포유 동물 발현계(예 COS-7 세포에서 발현되는 CD4O-L은 발현계 선택에 따라 분자량 및 글리코실화 패턴에 있어서 천연 CD4O-L 폴리펩티드와 유사하거나 또는 상당히 다를 수 있다. 이. 콜라이와 같은 박테리아 발현계에서 CD4O-L 폴리펩티드 발현은 글리코실화되지 않은 분자를 제공한다.
아미노산 잔기 또는 서열의 여러가지 삽입 또는 치환, 또는 생물학적 활성 또는 결합에 필요하지 않는 말단 또는 내부 잔기 또는 서열의 결실을 코딩하는 DNA 구조체가 제조될 수 있다. 예를 들면, 세포외 CD4O-L N-글리코실화 부위를 변경시켜서 글리코실화를 방지할 수 있으며, 효모 발현계를 사용하여 균질한 환원 탄수화물 유사체를 발현할 수 있다. 진핵 폴리펩티드의 N-글리코실화 부위는 3개의 아미노산으로 이루어진 군 Asn-X-Y(여기서, X는 Pro를 제외한 모든 아미노산이고, Y는 Ser 또는 Thr임)으로 특징지워진다. 이 3개의 아미노산으로 이루어진 군을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 적당히 변경시키면, Asn 측쇄에 탄수화물 잔기의 부착을 방지하는 치환, 삽입 또는 결실이 일어난다. 또다른 예에서, Cys 잔기를 코딩하는 서열을 Cys 잔기가 결실되거나 또는 다른 아미노산으로 치환되도록 변경시킬 수 있으며, 이에 따라서 복원시 부적합한 분자내 디술피드 다리 형성을 방지할 수 있다. 인체 CD4O-L은 그의 세포외 도메인에 5개의 Cys 잔기를 포함한다. 따라서, 5개의 Cys 잔기 중 적어도 하나는 다른 아미노산으로 치환시키거나 또는 단백질 삼차 구조 또는 디술피드 결합 형성에 영향을 주지 않게 하면서 결실시킬 수 있다.
돌연변이를 유발시키는 다른 방법으로는 KEX2 프로테아제 활성이 존재하는 효모계에서의 발현을 증진시키기 위해서 이염기 아미노산 잔기를 코딩하는 서열을 변경시키는 것이 있다. CD4O-L 폴리펩티드의 서브 유닛은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 코딩하는 서열을 결실시킴으로써 작제될 수 있다.
CD40-L 폴리펩티드는 멀티-엑손(multi-exon) 유전자에 의해 코딩된다. 또한, 본 발명은 전사 후에 뒤따르는 상이한 mRNA 스플라이싱에 기인할 수 있으며, 본 명세서에 기재된 cDNA와 동일 또는 유사 영역을 공유하는 또다른 mRNA 구조체를 포함한다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 표적 CD4O-L mRNA(센스) 또는 CD4O-L DNA(안티센스)서열에 결합할 수 있는 단일 스트랜드 핵산 서열(RNA 또는 DNA)로 이루어진다. 본 발명에 따르면, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:11의 단편, 또는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:11 의 DNA 또는 RNA 상보 서열로 이루어진다. 이 단편은 적어도 약 14개의 뉴클레오티드로 이루어진다. 바람직하게는, 이 단편은 약 14개 내지 약 30개의 뉴클레오티드로 이루어진다. CD4O-L을 위한 cDNA 서열에 기초하여 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 생성하는 능력은 예를 들면 스테인(Stein) 및 코헨(Cohen)의 문헌[Cancer Res. 48:2659(1988)] 및 반 데르 크롤(van der Krol) 등의 문헌 [BioTechniques, 6:958(1988)]에 기재되어 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 서열이 결합함으로써, 이중선체의 분해 증가 및 전사 또는 번역의 미종결을 포함하는 몇가지 수단 중의 하나에 의해 또는 기타 다른 수단에 의해 번역(RNA) 또는 전사(DNA)를 차단하는 이중선체가 형성된다. 적당한 폴리머라제 프로머터는 모든 RNA 폴리머라제를 위한 프로머터 또는 모든 DNA 폴리머라제를 위한 프로모터를 포함한다. 또한, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 변경된 당-포스포디에스테르 골격(또는 다른 당 결합, 예를 들면 국제 공개 제91/06629호에 기재된 것)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 당 결합은 내인성 뉴클레아제에 대해 내성을 갖는다. 내성을 갖는 당 결합을 함유하는 이러한 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 안정하지만(즉, 효소적 분해에 대해 내성을 가질 수 있지만), 표적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 서열 특이성을 유지한다. 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예는 국제 공개 제90/10448호에 기재된 바와 같은 유기 부분, 및 폴리-(L-리신)과 같은 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 다른 부분과 공유 결합하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변경시키기 위하여 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 엘립티신과 같은 삽입제 및 알킬화제 또는 금속 착물을 부착시킬 수 있다. 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 CaP04에 의해 중개되는 DNA 형질 감염, 전기 염동, 또는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 비루스와 같은 기타 다른 유전자 전달 벡터를 포함하는 모든 유전자 전달 방법에 의해 표적 핵산 서열을 함유하는 세포에 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 도입시킬 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 적당한 레트로비루스 벡터내에 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 삽입시킴으로써 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내에 도입시킨 후, 이 세포를 생체내 또는 생체외에서 삽입 서열을 함유하는 레트로비루스 벡터와접촉시키는 것이 좋다. 적당한 레트로비루스 벡터로는 쥐 레트로비루스 M-MuLV, N2(M-MuLV로부터 유래된 레트로비루스), 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C로 표시되는 이중 카피(copy) 벡터 (제PCT/US90/02656호 참조)가 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 별법으로, 다른 프로모터 서열을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다.
또한, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 국제 공개 제91/04753호에 기재된 바와 같이 리간드 결합 분자와의 접합체를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포내에 도입시킬 수 있다. 적당한 리간드 결합 분자로는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 다른 사이토킨, 또는 세포 표면 수용체와 결합하는 다른 리간드가 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 접합은 리간 결합 분자가 그의 대응 분자 또는 수용체에 결합하는 능력, 또는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합 형태의 세포내 도입을 차단하는 능력을 실질적으로 방해하지 않는다.
별법으로, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 국제 공개 제90/10448 호에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드-지질 복합체를 형성함으로써 표적 핵산 서열을 함유하는 세포내에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 착물은 내인성 리파제에 의해 세포내에서 해리되는 것이 좋다.
쥐 CD4O-L cDNA의 서열은 직접 발현 기술에 의해 얻어진다. 인체 CD4O-L의 서열은 프로브로서 쥐 CD4O-L cDNA를 사용하여 종-교차 혼성화 기술에 의해 얻어졌다.
본 발명자들은 먼저 스타멘코빅 등의 문헌에 기재된 서열(SEQ ID NO:4)을 기초로 하여, 프라이머를 사용하는 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 기술에 의해 인체 CD4O(수용체)의 세포외 영역의 클론을 얻음으로써 쥐 CD4O-L을 클로닝하였다. 상부 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3'(SEQ ID NO: 5)는 CD4O의 개시 메티오닌의 상부에 Sal I 부위를 도입하고, 하부 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-CCGTCGACGTCTAGAGCCGATCCTGGGG-3'(SEQ ID NO:6)은 CD4O의 192번 아미노산 다음에 종료 코돈을 삽입하며, 이어서 Xba 1 및 Sal I 부위를 삽입한다. 증폭 cDNA를 Sal I로 소화시기고, pDC406 (맥마한(McMahan) 등의 "EMBO J." 10:2821 (1991) 내로 클로닝해서 pDC406/sCD40을 작제하였다.
또다른 CD4O 수용체 단편(SEQ ID NO:4)는 인체 IgG1의 Fc 도메인(SEQ ID NO:3)에 융합시키기 위해 PCR 기술을 이용한다. 간단히 말해서, 상부 올리고뉴클레오티드 프라이머(SEQ ID NO:5) 및 융합 주형(SEQ ID NO:4)는 상기한 바와 동일하다. 하부 올리고뉴클레오티드 프라이머는 CD40의 193번 아미노산 다음에 아미노산 Tyr Va1Glu Pro Arg (SEQ ID NO:8)을 삽입시킨 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3'(SEQ ID NO:7)이다. Glu 및 Pro는 인체 IgG1의 힌지(hinge) 영역의 처음 두개의 아미노산이며, 그 뒤에 Bg1 II 제한 부위가 존재한다. Bg1 II 제한 부위는 CD4O의 세포외 도메인을 인체 IgG1 Fc 영역의 잔여 부분에 융합시키는데 사용된다.
다른 수용체로부터의 리간드 결합 도메인을 포함하는 다른 융합 단백질은 수용체의 리간드 결합 도메인을 위한 DNA 서열을 얻고, 이 서열을 단백질 A 또는 단백질 G, 또는 예를 들면 아비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 친화성 정제 능력이 있는 다른 폴리펩티드에 결합하는 항체 분자의 Fc 영역을 코딩하는 DNA 서열과 융합시킴으로써 얻어진다. 이 결과 얻은 유전자 구조체를 포유 동물 세포 내로 도입시켜 융합 단백질을 일시적으로 발현시킬 수 있다. 수용체/Fc 융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 정제에 의해 정제될 수 있다. 수용체/아비딘 융합 단백질은 비오틴 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 이어서, 융합 단백질은 고농도의 염 용액 또는 다른 적당한 완충액으로 용출시킴으로써 칼럼으로부터 제거될 수 있다.
본 발명자들은 인체 세포로부터 얻은 cDNA(주형) 및 상부 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-TATTAATCATTCAGTAGGGCCCAGATCTTGTGACAAAACTCAC-3'(SEQ ID NO: 9) 및 하부 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-GCCAGCTTAACTAGTTCATTTACCCGGAGACAGGGGAGA-3'(SEQ ID NO:10)을 사용하여 PCR 증폭에 의해 인체 IgG1 Fc 영역을 코딩하는 cDNA를 얻었다. PCR에 의해 증폭된 cDNA는 힌지 영역의 처음 부분 근처에 Bg1 II 부위를 도입하고, 이를 CD40/Fc융합 DNA를 작제하기 위해 CD4O 세포외 도메인을 결찰하는데 사용하고, 이를 pDC406 내에 결찰시켜서 pDC406/CD40/Fc를 작제하였다. 다른 적당한 Fc 영역은 단백질 A 또는 단백질 G와 높은 친화성으로 결합할 수 있으며 인체 IgG1 또는 쥐 IgG1의 Fc 영역을 포함하는 모든 영역으로 정의된다. 일례는 SEQ ID NO:3에 나타낸 인체 IgG1 Fc 영역, 또는 주형으로서 인체 cDNA를 사용하여 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10으로부터 얻은 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 PCR에 의해 얻은 cDNA이다.
수용체/Fc 융합 분자는 원핵 발현 방법에 의해 합성하기에는 일반적으로 너무 크고 복잡하기 때문에 재조합 포유 동물 세포 배양물에서 합성하는 것이 바람직하다. 수용체/Fc 융합 단백질을 발현하기 위한 적당한 포유 동물 세포의 예는 CV-1 세포(ATCC CCL 70) 및 COS-7 세포(ATCC CRL 1651)이며, 이들은 모두 원숭이 신장에서 유래한다.
DNA 구조체 pDC406/CD40/Fc를 원숭이 신장 세포주 CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478) 내에 형질 감염시킨다. pDC406 플라스미드는 SV4O, 인체 면역 결핍 비루스(HIV) 및 엡스타인-바르 비루스(EBV)로부터 유래하는 조절 서열을 포함한다. CV-1/EBNA 세포주는 엡스타인-바르 비루스 핵 항원-1(EBNA-1)을 코딩하는 유전자로 CV-1 세포주를 형질감염시킴으로써 유도하고, 인체 CMV 즉각-초기 인핸서(enhancer)/프로모터로부터 유도된 EBNA-1을 본질적으로 발현한다. EBNA-1 유전자는 EBV 복제원을 함유하는 pDC406과 같은 발현 벡터의 에피좀성 복제를 허용한다.
CD40/Fc 융합 단백질을 발현하는 형질 감염체는 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯을 이용하여 초기에 동정된다. 이어서, 상징액에 대해 도트 블롯 또는 겔 전기 영동을 수행한 후 G28-5mAb(인체 CD4O 수용체에 결합하는 항체)에 결합시키기 위해 전기 영동된 단백질을 전달한다. 이어서, 블롯팅된 단백질은125I-단백질 A로 방사성 표지화시켜서 배양시키고, 세척해서 비결합 라벨을 제거하고, Fc 발현에 대해 검사한다. 모노크로날 항체 G28-5는 상기 클라크(Clark) 등의 문헌에 따라 생산한다.
일단 융합 구조체를 발현하는 세포가 동정되면, 형질 감염된 세포의 대규모 배양물을 성장시켜서 CD40/Fc를 발현하는 세포로부터 상징액을 축적시킨다. 상징액 중의 CD40/Fc 융합 단백질은 친화성 정제에 정제한다. 간단히 말해서, CD40/Fc 융합 단백질을 함유하는 배양 상징액 1ℓ는 포유 동물 세포 상징액을 여과시키고 (예 : 0.45 μ여과지), 여액을 단백질 A/G 항체 친화성 칼럼(뉴햄프셔주킨 소재 Schleicher and Schull 제품)에 적용함으로써 정제한다. 칼럼을 유리 단백질이 세척 완충액에서 검출되지 않을 때까지 PBS 중의 0.5 M NaCl로 세척한다. 결합된 융합 단백질은 칼럼으로부터 25 mM 시트레이트 완충액(pH 2.8)으로 용출시키고, 500 mM 헤페스(Hepes) 완충액 (pH 9.1)을 첨가하여 pH 7이 되도록 조정한다. 용출된 CD40/Fc 융합 단백질의 은-염색 SDS 겔은 그것의 순도가 98%를 초과한다는 것을 나타냈다.
가용성 CD4O(sCD40) 및 CD40/Fc 융합 단백질을 본 명세서에 기재한 바와 같이 제조한다. 상징액을 G28-5(항-CD4O mAb) 친화성 칼럼을 통해 정제시켜서 형질감염된 CV-1/EBNA 세포에 의해 발현되는 sCD40을 친화성 정제한다. 단백질 함유 분획을 한데 모으고, G28-5 결합 분석 및 환원제로서 1mM 디티오트레이톨 존재하에 SDS-PAGE(소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동)에 의한 분석을 위해 분취액을 회수한다. 분자량 28,100 달톤에서 하나의 밴드가 관찰되었다. 환원제 부재하에서, sCD40의 SDS-PAGE 분석은 두개의 밴드를 나타내며, 주요 밴드는 분자량 56,000에서 나타나고, 나머지 한 밴드는 분자량 28,000에서 나타난다. 이러한 양상으로 밴드가 형성되는 것은 sCD40의 대부분이 용액 중의 디술피드 결합 호모다이머로서 존재하는 것을 나타낸다. 분자량 28,000의 밴드는 유리 모노머이다.
CD4O 단백질은 은 염색법에 의해 가시화한다. 시료의 단백질 농도는 표준 물질로서 초순수 소 혈청 알부민을 사용하는 마이크로-BCA 분석(Pierce 제품)을 이용하여 결정한다. 가용성 CD4O의 순도 및 단백질 농도는 아미노산 분석에 의해 확인한다. 정제된 가용성 CD4O은 PVDF지에 흡착시키고, 이 PVDF지에 대해 N-말단 단백질 서열화를 위해 제조자가 제공하는 지시에 따라서 어플라이드(Applied) 바이오시스템즈(Biosystems) 모델 477A 단백질 서열화 장치 상에서 자동 에드만 (Edman) 분해를 수행한다. 이 방법은 sCD40의 단백질 서열을 검색한다.
가용성 CD4O 및 CD40/Fc 융합 단백질은 항-CD4O mAb(G28-5) 부재하에서 인체 B 세포 반응을 조정할 수 있다. 정제된 편도선 B 세포를 항-IgM 및 인체 IL-4와 함께 배양하고, sCD40 또는 CD40/Fc 융합 단백질을 첨가한다. CD40의 어떠한 형태도 B 세포 증식에 대해 억제 효과를 갖지 않았다(트리티에이티드(tritiated) 티미딘 혼입에 의해 측정됨). 이와 대조적으로, IL-4 수용체는 IL-4에 의해 유도되는 B 세포 증식을 농도 의존 방식으로 억제한다.
가용성 CD4O 및 CD40/Fc가 2-도너 MLC(혼합 임파구 배양물)계에서 IL-4에 의해 유도되는 IgE 분비를 억제할 수 있는 능력을 시험하였다. 세 실험에서, IgE 생산 수준은 CD4O의 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 10 μg/ml의 농도로 첨가된 가용성 CD4O은 이러한 알레르기 모델에서 IgE 분비를 완전 억제할 수 있었다. 또한, CD40/Fc는 가용성 대응체(counterpart)로서 유사한 효과를 가졌다. 그러나, IL-7 수용체-Fc 융합 단백질(공개된 IL-7 수용체 서열을 이용하여 유사한 방법으로 제조됨)의 첨가는 이 모델에서 IgE 분비에 영향을 미치지 않았다.
또한, CD23의 수준은 sCD40 또는 CD40/Fc 융합 단백질에 대한 반응으로 동일 MLC에서 측정한다. 가용성 CD4O은 IL-4만으로 자극된 배양물에 비해 제6일에서 SCD23 수준을 작지만 재현가능하게 감소시키지만, 동일 배양물에서 더 강력한 억제 효과가 제12일에서 나타난다. IL-4-자극 T-고갈 PBM(말초 혈액 대식 세포) E-세포에 의한 가용성 CD23 유도는 sCD40의 첨가에 의해 유사하게 영향을 받아서, 제6일에서 sCD23 수준을 소량 감소시키고 제12일에서 보다 더 현저한 억제 효과를 나타낸다. 각 배양계에서, CD40/Fc 융합 단백질을 이용하였을 때 얻어지는 결과는 sCD40을 이용하였을 때 얻어지는 결과와 실질적으로 동일하다.
CD4O-L을 위한 cDNA를 단리시키기 위해, 정제된 CD40/Fc 융합 단백질을 시판 고체 상 시약(요도-겐(IODO-GEN), Pierce 제품)을 이용하여125I로 방사성 표지화시킨다. 이 방법에서는, 요도-겐 5 μg을 10 × 75 mm 유리관의 바닥에 평평하게 가하고, 0.1 M 인산나트륨(pH 7.4) 75 μl 및 Na125I 20 μl (2m Ci)와 함께 20분 동안 배양한다. 이어서, 용액을 PBS(인산염으로 완충시킨 염수) 45 μl 중의 CD40/Fc 5 μg을 함유하는 제2 유리관에 옮기고, 이 반응 혼합물을 4 ℃에서 2분동안 배양시킨다. 반응 혼합물을 2 ml 층 부피의 세파덱스(Sephadex) G-25(Sigma 제품) 상에서 겔 여과하여 분류시킨 후, RPMI 1640 배지 (2.5% (v/v) 소 혈청 알부민(BSA), 0.2%(v/v) 아지드화나트륨 및 20 mM 헤페스 함유, pH 7.4의 결합 배지)에서 평형화시킨다. 최종적으로 얻어진125I CD40/Fc 푸울(pool)을 결합 배지 중의 1 × 10-7M의 원액이 되도록 희석시키고, 4℃에서 1개월 이하 동안 저장하는데, 이때 수용체 결합 활성에 있어서 검출 가능한 손실이 발견되지 않았다.
cDNA 라이브러리는 비오티닐화 CD40/Fc 융합 단백질의 결합을 기초로 하여 FACS(형광 활성화 세포 분류)에 의해 분류된 EL4 세포주로부터 제조한다. 세포는 분류된 EL-4 세포에 의한 CD4O을 위한 리간드 발현을 기초로 하여 형광 강도에 있어서 중요한 이동이 일어날 때까지 5회 분류하였다. 5회 분류된 세포를 EL-40.5 세포라고 명명하고, 이 세포를 EL-40.5 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 형성할 목적으로 배양하였다. 간단히 말해서, cDNA를 합성하고, 중공 pDC406 벡터 내에 삽입시키고, 이. 콜라이 내로 형질 전환시킨다. 형질전환체를 한데 모아서, 이로부터 DNA를 단리시키고, CV1-EBNA 세포내로 형질감염시켜서 발현 클로닝 라이브러리를 형성한다. 형질 감염된 CV1-EBNA 세포를 슬라이드 상에서 3일 동안 배양하며 CD4O-L을 일시적으로 발현시킨다. 이어서, 형질 감염된 세포를 함유하는 슬라이드를 방사성 요오드화된 CD40/Fc와 함께 배양시키고, 세척해서 비결합 CD40/Fc를 제거하고, 글루테르알데히드로 고정시킨다. 고정된 슬라이드를 액상 사진 에멀젼중에 침지시키고, 암실에 노출시킨다. 슬라이드를 현상시킨 후, 현미경을 사용하여 슬라이드들을 각각 개별적으로 검사하고, CD4O-L을 발현하는 세포를 밝은 배경하에서 오토라디오그래프 은 그레인 존재에 의해 동정한다.
EL-40.5 세포로부터 얻어진 발현 클로닝 라이브러리를 스크리닝하고, 약 2000개의 독립 클론을 함유하는 하나의 푸울이125I 표지화 CD40/Fc 융합 단백질 결합에 대해 양성으로 확인되었다. 이 푸울을 약 200개의 콜로니를 갖는 더 작은 푸울로 나눈다. 작은 푸울들을 상기한 바와 같이 스크리닝한다. 작은 푸울 중의 하나는 CD4O-L에 대해 양성이었다.
하나의 클론을 단리하고, 표준 기술에 의해 서열화하여, 제1도 및 SEQ ID NO:1에 나타낸 바와 같은 쥐 CD4O-L의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 제공하였다.
인체 동족체 CD4O-L cDNA는 종-교차 혼성화 기술에 의해 발견되었다. 간단히 말하자면, 인체 말초 혈액 임파구(PBL) cDNA 라이브러리는 6일 동안 CD3(10ng/ml) 및 인터루킨-2(IL-2, 10 ng/ml)에 결합하는 OKT3 항체(ATCC, 메릴랜드주 록빌 소재)로 처리한 말초 혈액 임파구로부터 제조한다. PBL 세포를 세척하고, 이어서 10 ng/ml PMA (포르볼 미리스테이트 아세테이트, Sigma 제품(세인트 루이스 소재)) 및 500 ng/ml 이오노마이신(Calbiochem제품)으로 4시간 동안 자극한다. 메신저 RNA를 자극된 PBL 세포로부터 단리시키고, cDNA를 형성하고, cDNA를 Eco R1 링커 내에 결찰시킨다. 결찰된 cDNA를 제조자의 지시에 따라서 λgt10 파지 클로닝 비히클 기가팩(Gigapak캘리포니아주 산디애고 소재 Stratagene 제품)내에 삽입시킨다. 파지를 증폭시키고, 15 cm 플레이트 당 파지 약 20000개의 밀도로 플레이트에 넣고, 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌["Molecular Biology: A Laboratory Manual", 316-328(1982); 미합중국 뉴욕주 소재 Cold Spring Harbor Laboratory]에 기재된 바에 따라서 파지 리프트(lift)를 수행한다. 쥐 프로브는 SEQ ID NO:1 및 제1도의 뉴클레오티드 13 내지 뉴클레오티드 793의 쥐 CD4O-L의 코딩 영역에 따라서 작제한다. 이 프로브는 보통 엄격한 또는 심하게 엄격한 조건하에서 PBL 라이브러리 파지 리프트와 혼성화시킨다. 간단히 말해서, 혼성화 조건은 6 x SSC, 1 x 덴하르트(Denhardt's) 용액, 2mM EDTA, 0.5% Np4O (노니데트(Nonidet) P-40) 세정제, 63 ℃ 및 철야이다. 이어서, 55℃에서 3시간 동안 3 x SSC, 0.1% SDS에서 세척한 후, X선 필름에 철야 노출시킨다. 양성 플라크는 1000개의 플라크 당 약 1개의 비율로 동정되었다. 양성 플라크를 2회 정제하고, cDNA를 증폭 배양물로부터 제조한다.
당업자는 종-교차 혼성화 기술에 의해 쥐 또는 인체 CD4O-L의 다른 포유 동물 동족체를 코딩하는 cDNA를 얻기 위하여 본 명세서에 기재된 쥐 또는 인체 CD4O-L cDNA 서열을 이용할 수 있다. 간단히 말해서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 제1도(SEQ ID NO:1)에 기재된 쥐 CD4O-L 또는 제2도(SEQ ID NO:11)에 기재된 인체 CD4O-L의 세포외 영역의 뉴클레오티드 서열로부터 형성된다. 이 프로브는 상기 마니아티스 등의 문헌에 기재된 바와 같은 표준 기술에 의해 제조할 수 있다. 쥐 또는 인체 프로브는 보통 엄격한 조건하에서 포유 동물 cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된다. 포유 동물 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 예는 cDNA의 경우 포유 동물의 말초 혈액 임파구로부터 제조된 라이브러리를 포함한다. 별법으로, 여러 종류의 세포주로부터 단리된 다양한 cDNA 라이브러리 또는 mRNA는 포유 동물 CD4O-L DNA 또는 mRNA의 적당한 원천을 결정하기 위해 노던(Northern) 혼성화에 의해 스크리닝할 수 있다.
재조합 DNA 기술에 의해 CD4O-L을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 비루스 또는 곤충 유전자로부터 유도되는 것과 같은, 적당한 전사 또는 번역 조절 뉴클레오티드 서열에 조작가능하게 연결된, CD4O-L 폴리펩티드를 코딩하는 합성 또는 cDNA-유도 DNA 단편으로 이루어지는 CD40-L DNA 서열을 포함한다. 조절 서열의 예는 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 서열(예 : 전사 프로모터 또는 인핸서), 임의로 전사를 조절하는 오퍼레이터 서열, mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역 개시 및 종료를 조절하는 적당한 서열이다. 뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 기능적으로 CD4O-L DNA 서열과 관련이 있을 때 조작가능하게 연결된다. 따라서, 프로모터 뉴클레오티드 서열이 CD40-L DNA 서열의 전사를 조절하는 경우 CD4O-L DNA 서열에 조작가능하게 연결된다. 또한, 리보좀 결합 부위가 번역을 촉진하기 위해 벡터내에 위치하는 경우 CD4O-L 폴리펩티드를 위한 서열에 조작가능하게 연결될 수 있다. 이밖에, 신호 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 예를 들면, 신호 펠티드(분비리더)를 위한 DNA 서열은 CD4O-L DNA에 조작가능하게 연결될 수 있다. 신호 펩티드는 효모 숙주 세포에 의해 번역된 융합 폴리펩티드의 개선된 세포외 분비를 가능하게 하는 전구 아미노산 서열로 나타내어진다.
CD4O-L 폴리펩티드의 발현을 위한 적당한 숙주 세포는 원핵 생물, 효모 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵 생물은 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들면 이. 콜라이 또는 바실러스를 포함한다. 형질 전환을 위해 적당한 원핵 숙주 세포는 예를 들면 이. 콜라이, 고초균(Bacillus subtillis), 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 및 슈도모나스속, 스트렙토마이세스속 및 포도상구균속에 속하는 것들이다. 고등 진핵 세포로는 포유 동물원의 확립된 세포주가 있다. 본 명세서에 기재된 DNA 구조체로부터 유도된 RNA를 이용하여 CD4O-L 폴리펩티드를 생산하기 위해 세포 미함유 번역계도 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유 동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적당한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들면 포우웰즈(Pouwels) 등의 문헌 ["Cloning Vectors : A Laboratory Manual"; 뉴욕주 소재 Elsevier (1985)]에 기재되어 있다.
이. 콜라이와 같은 원핵 숙주 세포에서, CD40-L 폴리펩티드 또는 유사체는 원핵 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드 발현을 촉진시키기 위해 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. N-말단 Met는 발현된 재조합 CD4O-L 폴리펩티드로부터 절단될 수 있다. 원핵 숙주 세포는 연장성 단백질 분해 또는 디술피드 처리를 필요로 하지 않는 CD4O-L 폴리펩티드를 발현시키는데 이용될 수 있다.
재조합 CD4O-L DNA 서열을 함유하는 발현 벡터는 적당한 숙주 미생물 또는 포유 동물 세포주의 실질적으로 균질한 배양물 내에서 형질 감염 또는 형질 전환된다. 형질전환된 숙주 세포는 CD40-L 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질 전환 또는 형질 감염되어 CD4O-L 폴리펩티드를 발현하는 세포이다. 발현된 CD4O-L 폴리펩티드는 숙주 세포의 특성 및 숙주 세포내에 삽입된 유전자 구조에 따라 좌우되어 숙주 세포내에 위치하고(또는) 배양 상징액 내로 분비된다.
원핵 숙주 세포내로 형질 감염된 발현 벡터는 일반적으로 1 이상의 형질 선택성 마커를 포함한다. 형질 선택성 마커는 예를 들면 항생 물질 내성을 제공하거나 또는 무기 영양 요구성을 공급하는 단백질을 코딩하는 유전자, 및 숙주내에서 중폭시키기 위해 숙주에 의해 인식되는 복제원이다. 원핵 숙주 세포를 위한 다른 유용한 발현 벡터는 시판 플라스미드로부터 유도되는 박테리아원의 선택성 마커이다. 이 선택성 마커는 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37013)의 유전 성분으로 이루어질 수 있다. pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성을 위한 유전자를 함유하므로, 형질 전환된 세포를 동정하기 위한 간단한 수단을 제공한다. pBR322 "골격" 부분은 적당한 프로모터 및 CD4O-L DNA 서열과 결합한다. 다른 시판 벡터는 예를 들면 pkk223-3(스웨덴 웁살라 소재 Pharmacia Fine Chemicals 제품) 및 pGEM1(위스콘신주 매디슨 소재 Promega Biotec. 제품)이다.
프로모터 서열은 재조합 원핵 숙주 세포 발현 벡터를 위해 흔히 사용된다. 흔히 사용되는 프로모터 서열은 β-락타마제(페니실리나제), 락토스 프로모터계 (장(Chang) 등의 "Nature" 275:615(1978); 및 고델(Goeddel) 등의 "Nature" 281:544(1979)), 트립토판(trp) 프로모터계(고델 등의 "Nucl. Acids Res." 8:4057(1980); 및 유럽 특허 공개 제136776호) 및 tac 프로모터(마니아티스의 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 412(1982), Cold Spring Harbor Laboratory)이다. 특히 유용한 원핵 숙주 세포 발현계는 파지 λPL프로모터 및 cI857ts 이열성(易熱性) 리프레서(repressor) 서열을 이용한다. λPL프로모터의 유도체를 혼입하는 ATCC로부터 입수가능한 플라스미드 벡터는 플라스미드 pHUB2(이. 콜라이 균주 JM89(ATCC 37092)에 존재) 및 pPLc28(이. 콜라이 균주 RR1(ATCC 53082))를 포함한다.
CD4O-L은 바람직하게는 효모균속(예: 맥주 효모균(S. cerevisiae))으로부터 선택되는 효모 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 피치아(Pichia) 또는 클루이베로 마이세스(Kluyveromyces)와 같은 기타 다른 효모를 사용할 수도 있다. 효모 벡터는 2μ효모 플라스미드로부터 유래하는 복제 서열 원, 독자적 복제 서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열 및 전사 종료를 위한 서열을 종종 포함한다. 바람직하게는, 효모 벡터는 복제 서열원 및 선택성 마커를 포함한다. 효모 벡터를 위해 적당한 프로모터 서열은 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제(히츠만(Hitzeman)등의 "J. Biol. Chem. " 255:2073(1980)), 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제와 같은 다른 글리콜 분해 효소(헤스(Hess) 등의 "J. Adv. Enzyme Reg 7:149(1968); 홀란드(Holland) 등의 "Biochem" 17:4900(1978)이다. 효모 발현에 사용하기 위한 다른 적당한 벡터 및 프로모터는 히츠만의 유럽 특허 공개 제73,657호에 기재되어 있다.
효모 벡터는 예를 들면 이. 콜라이에서 선택 및 복제를 위한 pBR322로부터 얻어지는 DNA 서열(Ampr유전자 및 복제원)을 이용하여 조립할 수 있다. 효모 발현 구조체에 포함될 수 있는 다른 효모 DNA 서열은 글루코스-억제성 ADH2 프로모터 및 α-인자 분비 리더를 포함한다. ADH2 프로모터는 루셀(Russell) 등의 문헌 ["J. Biol. Chem." 258: 2674(1982)] 및 베이어(Beier) 등의 문헌["Nature" 300: 724(1982)]에 기재되어 있다. 효모 α-인자 리더 서열은 이종 폴리펩티드 분비를 인도한다. α-인자 리더 서열은 프로모터 서열과 구조 유전자 서열 사이에 삽입되는 경우가 종종 있다[쿠리안(Kurjan) 등의 문헌("Cell" 30:933(1982)) 및 비터 (Bitter) 등의 문헌("Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 81:5330(1984))참조]. 효모 숙주로부터 재조합 폴리펩티드의 분비를 촉진시키기 위해 적당한 다른 리더 서열은 당업계에 알려져 있다. 리더 서열은 1 이상의 제한 부위를 함유하기 위해서 3' 말단 근처에서 변경될 수 있다. 이것은 리더 서열과 구조 유전자의 융합을 촉진시킨다.
효모의 형질 전환에 관한 프로토콜은 당업계에 알려전 있다. 이러한 프로토콜의 하나는 힌넨(Hinnen) 등의 문헌["Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 75:1929(1978)]에 기재되어 있다. 힌넨 등의 프로토콜은 0.67% 효모 질소 염기, 0.5% 카스아미노산, 2% 글루코스, 10 μg/ml 아데닌 및 20 μg/ml 우라실을 함유하는 선택 배지에서 Trp+형질전환체를 선택한다.
ADH2 프로모터 서열을 함유하는 벡터에 의해 형질 전환된 효모 숙주 세포는 "부유" 배지에서 발현을 유도하기 위해 성장시킬 수 있다. 부유 배지의 예는 1% 효모 추출물, 2 % 펩톤 및 1% 글루코스로 이루어지며 80 μg/ml 아데닌 및 80 μg/ml우라실이 보충된 것이다. 글루코스가 배지로부터 고갈될 때 ADH2 프로모터의 억제 해제가 일어난다.
포유 동물 또는 곤충 숙주 세포 배양계는 또한 재조합 CD4O-L 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 적당한 포유 동물 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장 세포의 COS-7 (ATCC CRL 1651)(Gluzman등의 "Cell" 23:175(1981)), L 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL 163), 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포 및 BHK(ATCC CRL 10) 세포주이다. 적당한 포유 동물 발현 벡터는 복제원, 프로모터 서열, 구조 유전자에 연결된 인핸서와 같은 비전사 성분, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 어셉터 부위와 같은 기타 다른 5' 또는 3' 플랭킹 비전사 서열, 및 전사 말단 서열을 포함한다.
포유 동물 숙주 세포 발현 벡터를 위한 전사 및 전사 조절 서열은 비루스 게놈으로부터 절단될 수 있다. 예를 들면, 흔히 사용되는 포유동물 세포 프로모터 서열 및 인핸서 서열을 폴리오마(Polyoma) 비루스, 아데노비루스(Adenovirus) 2, 시미안(Simian) 비루스 40(SV4O) 및 인체 사이토메갈로비루스로부터 유도된다. SV4O 비루스 게놈, 예를 들면 SV4O원, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도되는 DNA 서열을 사용하여, 포유 동물 숙주 세포에서 구조 유전자 서열을 발현하는데 필요한 다른 유전 성분을 제공할 수 있다. 비루스의 초기 및 후기 프로모터는 비루스 복제원을 함유할 수 있는 단편으로서 비루스 게놈으로부터 쉽게 얻어지기 때문에 특히 유용하다[Fiers 등의 "Nature" 273:113(1978) 참조]. 또한, SV4O 비루스 복제원에 위치한 Bg1 I 부위를 향하여 Hind III 부위로부터 연장하는 약 250 bp의 서열이 포함된다는 전제 하에서, 좀 더 작거나 또는 큰 SV4O 단편이 사용될 수 있다.
예시적인 포유 동물 발현 벡터는 오까야마(Okayama) 및 베르그(Berg)의 문헌 (Mol. Cell. Biol. 3:280(1983))에 기재된 바에 따라서 작제할 수 있다. 코즈만 (Cosman) 등의 문헌["Nature" 312:768(1984)]에 기재된 유용한 고등 발현 벡터 PMLSV MIN4는 ATCC 39890으로 기탁되어 있다. 또다른 유용한 포유동물 발현 벡터는 유럽 특허 공개 제0367566호 및 미합중국 특허 출원 제07/701,415호(1991년 5월 6일 출원)에 기재되어 있으며, 본 명세서에서는 이 문헌을 참고 인용한다. CD4O-L과 같은 유형 II 단백질 세포외 영역을 발현하기 위해서, 미합중국 특허 제4,956,195호에 기재된 인터루킨-7(IL-7)을 위한 신호 서열 또는 미합중국 특허 출원 제06/626,667호(1984년 7월 2일 출원)에 기재된 인터루킨-2 수용체를 위한 신호 서열과 같은 이종 신호 서열이 삽입되어야 한다.
인체 또는 쥐 CD4O-L은 세포내 및 트랜스멤브레인 영역이 포함되는 경우에는 막 결합 형태로 또는 세포외 도메인만이 포함되는 경우에는 가용성 형태로 제조될 수 있다. 본 발명자들은 포유 동물 세포에서 완전 길이의 쥐 CD4O-L을 발현시켜서 막 결합 쥐 CD4O-L을 발현하는 세포를 얻었다. CV1 세포는 HAVEO 벡터에서 제1도(SEQ ID NO:1)의 cDNA로 형질 감염시키거나, 또는 CV1 세포는 본 명세서의 실시예 6에 기재된 기술을 이용하여 HAVEO 중공 벡터로 형질 감염시킨다. 이로써, 막 결합 쥐 CD4O-L을 발현하는 형질 감염된 CV1 세포를 얻었다. 이 세포들을 하기 실시예 10 내지 13에 기재된 일련의 실험을 위한 막 결합 쥐 CD4O-L 원으로서 사용한다.
[재조합 CD40-L 폴리펩티드의 정제]
CD4O-L 폴리펩티드는 CD4O-L 폴리펩티드를 발현하는데 필요한 배양 조건 하에서 형질 전환된 숙주 세포를 배양해서 제조할 수 있다. 이어서, 이 결과 얻어진 발현된 폴리펩티드는 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제할 수 있다. 필요한 경우, CD4O-L 폴리펩티드는 시판 단백질 농축 필터, 예를 들면 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 이용하여 농축시킬 수 있다. 농축 단계 후에, 농축액을 겔 여과 배지와 같은 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 별법으로, 음이온 교환 수지, 예를 들면 돌출(pending)된 디에틸 아미노에틸(DEAE)기를 갖는 매트릭스 또는 기질이 사용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 단백질 정제에 흔히 이용되는 기타 다른 종류일 수 있다. 별법으로서, 양이온 교환제를 사용할 수 있다. 적당한 양이온 교환제는 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 갖는 여러 종류의 불용성 매트릭스이다. 술포프로필기가 바람직하다.
마지막으로, CD4O-L을 추가로 더 정제하기 위해서, 소수성 RP-HPLC 매질(예: 돌출된 메틸 또는 기타 다른 지방족기를 갖는 실리카겔)을 사용하는 1종 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 장치가 사용될 수 있다. 상기 정제 장치의 일부 또는 전부를 다양하게 조합하여, 실질적으로 균질한 재조합 단백질을 제공하는 데 사용될 수 있다.
또한, CD4O-L 폴리펩티드를 친화성 정제하기 위해 CD4O 리간드 결합 도메인을 포함하는 친화성 칼럼을 이용할 수 있다. CD40-L 폴리펩티드는 고농도 염 용출 완충제 중에서 친화성 칼럼으로부터 제거하고, 이어서 사용하기 위해 저농도염 완충액내로 투석시킬 수 있다.
박테리아 배양물에서 생산된 재조합 단백질은 통상적으로 숙주 세포의 초기 파열, 원심 분리, 세포 펠릿으로부터의 추출(불용성 폴리펩티드의 경우), 또는 상징액으로부터의 추출 (가용성 폴리펩티드의 경우), 이어서 1회 이상의 농축, 탈염, 이온 교환, 친화성 정제 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리시킨다. 마지막으로, RP-HPLC는 최종 정제 단계를 위하여 사용될 수 있다. 미생물 세포는 냉동-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파열 또는 세포 용해제 이용을 포함하는 모든 통상의 방법에 의해 파열될 수 있다.
형질 전환된 효모 숙주 세포는 분비된 폴리펩티드로서 CD40-L을 발현하는데 이용되는 것이 바람직하다. 효모 숙주 세포 발효로부터 분비된 재조합 폴리펩티드는 우르달(Urdal) 등의 문헌(J. Chromatog. 296:171(1984))에 기재된 바와 유사한 방법으로 정제시킬 수 있다. 우르달 등은 예비 HPLC 칼럼 상에서 재조합 인체 IL-2를 정제하기 위한 두개의 연속적인 역상 HPLC 단계를 기재한다.
[CD4O-L 조성물의 투여]
본 발명은 적당한 희석제 또는 담체 중에 유효량의 CD40-L을 함유하는 치료 조성물, 및 이 조성물을 이용한 포유 동물의 치료 방법을 제공한다. 치료 용도를 위해서, 정제된 CD4O-L 또는 그의 생물학적 활성 유사체를 증상에 적합한 방식으로 치료를 위한 환자, 바람직하게는 사람에게 투여한다. 따라서, 예를 들면, 목적 치료 효과를 달성하기 위해 투여하는 CD40-L 제약 조성물(예 : 가용성 세포외 도메인 또는 그의 단편의 형태)은 거환 주입, 연속 주입, 이식제로부터의 지속 방출 또는 기타 다른 방법에 의해 투여될 수 있다. 대표적으로, CD4O-L 치료제는 정제된 CD40-L 폴리펩티드와 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 혼합한 제약 조성물 형태로 투여된다. 이러한 담체는 사용된 투여량 및 농도에서 환자에게 무독성이다. 보편적으로, 이러한 조성물의 제조에는 CD4O-L 폴리펩티드를 완충제, 아스코르브산과 같은 산화 방지제, 저분자량(약 10개 미만의 잔기를 가짐) 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 탄수화물(글루코스, 수크로스 또는 덱스트란 포함), EDTA와 같은 킬레이트제, 글루타티온 및 다른 안정화제 및 부형제와 혼합하는 것이 수반된다. 중성의 완충 염수 또는 동종 혈청 알부민과 혼합한 염수는 적당한 희석제의 예이다. CD4O-L 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유효한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터 유효량을 투여함으로써 생체내 투여할 수 있다. 별법으로 CD40-L 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 개체로부터 CD4O-L DNA 또는 mRNA를 함유하는 세포를 제거하고, 유전자 전달 기술을 이용하여 세포내에 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 혼입하고, 이 세포를 개체내로 재침출함으로써 생체외 투여할 수 있다.
다음 실시예들은 본 발명의 특정 태양들을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[실시예1]
이 실시예는 CD4O 리간드를 코딩하는 cDNA 클론을 감지하는데 사용되는 가용성 CD40/Fc 융합 단백질을 발현시키기 위한 CD40/Fc DNA구조체의 구성에 대해 설명한다. 완전한 CD4O 인체 수용체 서열의 세포외 영역 또는 리간드 결합 도메인의 cDNA 서열을 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 기술을 사용하여 얻고, 이 서열은 상기한 스타멘코빅 등의 문헌에 공개된 서열을 기초로 한다. CD4O 플라스미드(CDM8)는 PCR증폭용 주형으로 사용하였다. CDM8은 스타멘코빅 등의 문헌에 기재되어 있고, 저자로부터 입수할 수 있다. PCR 기술[사키(Sarki) 외 공저, Science 239:487, 1988]은 CD4O 세포외 리간드 결합 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 증폭시키기 위하여 5'(상부) 및 3'(하부) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 행하였다. 상부 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-(CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (SEQ ID NO:5)는 CD4O의 이니시에이터(initiator) 메티오닌 상부의 Sal 1 부위와 CD4O의 아미노산 193뒤의 아미노산 Tyr Val Glu Pro Arg(SEQ ID NO:8)을 삽입시킨 하부 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-ACAAGATCT GGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3'(SEQ ID NO:7) 사이에 도입시킨다. Glu 및 Pro는 인체 IgG1의 접번 영역의 최초 2개의 아미노산이고, 이 뒤에는 CD4O의 세포외 도메인을 인체 IgG1 Fc 영역의 잔여부에 융합시키는 데 사용되는 Bg1 II 제한 부위가 위치한다.
상기 DNA 구조체 pDC406/CD40/Fc를 원숭이 신장 세포주 CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478) 내로 형질감염시켰다. pDC406 플라스미드는 SV4O, 인체 면역 결핍 비루스(HIV), 및 엡스테인-바르 비루스(EBV)로부터 유도되는 규칙적인 서열을 포함하고 있다. CV-1/EBNA 세포주는 인체 CMV 초중기 인핸서/프로모터로부터 유도된 EBNA-1을 구성적으로 발현시키는 EB 비루스 핵 항원-1(EBNA-1)을 코딩하는 유전자로CV-1 세포주를 형질감염시켜 유도한다. EBNA-1 유전자는 EBV 복제원을 함유하는 pDC406과 같은 발현 벡터의 에피좀 복제를 가능하게 한다.
먼저 융합 구조체를 발현시키는 세포들을 동정하고, 형질감염된 세포들의 대량 배양물을 성장시켜 CD40/Fc를 발현시키는 세포로부터 상징액을 모았다. 이 상징액 중의 CD40/Fc 융합 단백질을 친화성 정제에 의해 정제하였다. 이를 요약하면, 포유동물 세포 상징액을 예컨대 0.45 μ필터를 통해 여과시키고, 이 여액을 4 ℃, 80 ml/시간의 유속에서 1.5 cm x 12.0 cm 크기의 단백질 A/G 항체 친화성 칼럼(Schleicher 및 Schuell, 뉴햄프셔주 킨 소재)에 가하여 CD40/Fc 융합 단백질을 함유하는 배양물 상징액 1리터를 정제하였다. 이 칼럼을 유리 단백질이 세척 완충액중에서 검출되지 않을 때까지 PBS(인산염 완충 염수) 중의 0.5 M NaCl로 세척하였다. 마지막으로, 칼럼을 PBS로 세척하였다. 결합된 융합 단백질을 칼럼으로부터 pH 2.8의 25 mM 시트르산염 완충액으로 용출시킨 후에, pH 9.1의 50 mM 헤페스 완충액으로 pH 7로 만들었다. 용출시킨 CD40/Fc 융합 단백질의 은 염색된 SDS 겔은 98% 이상의 순도를 갖는 것으로 나타났다. 정제한 CD40/Fc 융합 단백질은 시판되는 고체 상 시약 요도-겐(IODO-GEN, 피어스사 (Pierce) 제품)을 사용하여125I로 요오드화시켰다. 이 과정에서, 요도-겐 5 μg을 10 × 75mm 유리 튜브의 저부에 평평하게 놓고 4℃에서 pH 7.4의 0.1M 인산나트륨 75 μl 및 Na125I 20 μl(2mCi)로 20분간 배양시켰다. 이어서, 이 용액을 PBS 45 μl 중의 CD40/Fc 5 μg을 함유하는 제2 유리 튜브로 이동시키고, 이 반응 혼합물을 4 ℃에서 20분간 배양시켰다. 반응 혼합물을 2 ml 베드 용적의 세파덱스G-25 (시그마사(Sigma) 제품) 상에서 겔 여과에 의해 분류하고, 이어서 이를 2.5%(v/v) 소 혈청 알부민(BSA), 0.2%(v/v) 아지드화나트륨 및 20mM 헤페스를 함유하는 RPMI 1640 배지(pH 7.4, 결합 배지)에서 평형화시켰다.125ICD40/Fc의 최종 푸울을 결합 배지 중의 1 × 10-7M 원액으로 희석시키고 수용체 결합 활성의 검출 가능한 손실없이 4 ℃에서 최대 1시간 동안 보관하였다.
이로부터 약 50-60%의 표지 혼입이 관찰되었다. 방사성 요오드화는 1 x 105내지 5 x 1015cpm/nmole(단백질 1몰 당 방사성 요오드 0.42-2.0 원자)의 특이 활성을 일으킨다. 이를 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)한 결과, 단일 표지된 폴리펩티드가 예상 수치와 부합한다는 것이 드러났다. 표지된 융합 단백질은 침전성 98% 트리클로로아세트산(TCA)보다 더 크기가 컸으며, 이것은125I가 단백질에 공유 결합되었음을 나타낸다.
[실시예 2]
이 실시예는 CD40-L을 추정적으로 발현시키는 세포주의 선택에 대해 설명한다. 몇가지의 세포주를 실시예 1에 기재된 방사성 요오드화 CD40/Fc 융합 단백질을 사용하여 스크리닝하였다. 이를 요약하면, 표준 방법론에 의거하여 정량적 결합 연구를 행하였고, 각종 세포주로부터 스캐챠드 플롯을 얻었다. 클론성 세포주(EL4, ATCC TiP39)인 쥐 흉선종 세포주를 동정 및 분류하였다. 분류하기 전에, EL-4 세포는 1 세포 당 약 40개 분자의 CD4O-L을 발현시키는 것으로 밝혀졌다. 제7 분류 세포를 EL-40.7이라 명명하고 성장시킨 결과 1 세포 당 약 10,000 분자의 CD4O-L을 발현시키는 것으로 밝혀졌다. 최종적으로, 제9 분류 세포를 EL-40.9라 명명하고 성장시킨 결과 1 세포 당 약 15,000 분자의 CD40-L을 발현시키는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 3]
이 실시예는 쥐 CD4O-L의 발현 클로닝을 위한 cDNA 라이브러리의 제조에 대해 설명한다. 라이브러리는 EL-40.5로 지칭된 쥐 흉선종 세포주 EL-4(ATCC TIB 39)의 제5 분류 클론으로부터 제조하였다. EL-40.5 세포는 FACS(형광 활성화 세포 분류 장치)중에서 비오티닐화 CD40/Fc 융합 단백질로 5회 분류한 EL4 세포이었다. cDNA 라이브러리는 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된 미합중국 특허 제4,968,607호에 기재되어 있는 EL-40.5 세포로 부터 얻은 RNA로 제조하였다. 이를 요약하면, cDNA 라이브러리는 EL-40.5 세포주로부터 추출한 전체 RNA로부터 단리시킨 폴리(A)+mRNA를 역전사시켜 작제하였다. 이러한 라이브러리 작제 기술은 오수벨(Ausubel) 등의 문헌[Current Protocol In Molecular Biology, 제1권 (1987)]에 기재된 것과 실질적으로 유사하다. 폴리(A)+mRNA는 올리고 dT 셀룰로오스 크로마토그래피에 의해 단리시키고, 이중 스트랜드 cDNA는 구블러(Gubler) 등의 문헌[Gene 25:263, 1983]에 기재된 것과 실질적으로 동일한 방법으로 제조하였다. 폴리(A)+mRNA 프래그먼트를 프라이머로서 랜덤 헥사뉴클레오티드를 사용하여 역전사제에 의해 RNA-cDNA 하이브리드로 전환시켰다. 이어서, 이 RNA-cDNA 하이브리드를 RNA아제 H와 DNA 폴리머라제 I를 함께 사용하여 이중 스트랜드 cDNA 프래그먼트로 전환시켰다. Sa1 I 어댑터 5'-TCG ACT GGA ACG AGA CGA CCT GCT-3' GA CCT TGC TCT GCT GGA CGA-5'를 헤이메를(Haymerle) 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 14:8615, 1986]에 기재된 바와 같이, 평활 말단 cDNA의 5' 말단에 연결시켰다. 연결되지 않은 어댑터는 68℃에서 겔 여과 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 이로부터 cDNA 상의 뉴클레오티드 24개의 비자가 상보성 오우버행(overhang)이 남았다. 이와 동일한 과정을 사용하여 포유 동물 발현 벡터 pDC406의 5' Sa1 I 말단을 cDNA에 첨가된 것과 상보적인 뉴클레오티드 24개의 오우버행으로 전환시켰다. 적정 비율의 어댑팅된 벡터와 cDNA를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제의 존재하에 연결시켰다. 투석시킨 연결혼합물을 암피실린 플레이트 상에서 선택한 E. coli 균주 DH5 α 및 형질전환체내로 전기 영동시켰다.
플라스미드 DNA를 푸울 당 약 2,000 클론의 형질전환된 E. Coli로 이루어지는 푸울로부터 단리시켰다. 이렇게 단리시킨 DNA를 DEAE-덱스트란에 이어 실질적으로 문헌[ 루드만(Luthman) 외 공저, Nucl. Acids Res. 11:1295, 1983 및 맥컷챤 (McCutchan) 외 공저, J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1985]에 기재된 방법에 따라 클로로퀸(chloroquin) 처리에 의해 CV1-EBNA 세포의 융합 하부층 내로 형질감염시켰다.
CV1-EBNA 세포를 완전 배지(10%(v/v) 송아지 태반 혈청, 50 U/ml 페니실린, 50 U/ml 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 둘베코(Dulbecco)의 변형 이글 배지)중에 유지시키고, 단일 웰 체임버로 된 슬라이드(Lab-Tek)에약 2 x 105세포/웰의 밀도로 평평하게 넣었다. 이 슬라이드를 인체 피브로네틴(10μg/ml PBS) 1 ml로 30분간 예비 처리한 후 PBS로 일회 세척하였다. 층속에서 성장하는 고착 세포로부터 배지를 제거하고, 66.6 μM 클로로퀸 술페이트를 함유하는 완전 배지 1.5 ml로 교체하였다. 세포에 DNA 용액(2 μg DNA, 클로로퀸을 함유하는 완전 배지 중의 0.5 mg/ml DEAE-덱스트란) 약 0.2 mml를 첨가하고, 이 혼합물을 37℃에서 약 5시간 동안 배양시켰다. 배양시킨 후에, 배지를 제거하고 세포를 10% DMSO(디메틸술폭시드)를 함유하는 완전 배지를 2.5-20분간 첨가하여 쇽(shock)을 가하였다. 이렇게 쇽을 가한 후에 용액을 신선한 완전 배지로 교체하였다. 이 세포를 2-3일간 배양하여 성장시켜 삽입한 DNA 서열을 과도적으로 발현시켰다. 이러한 상태는 생존하는 CV1-EBNA 세포에서 30% 내지 80%의 형질감염 빈도를 유발시켰다.
[실시예 4]
이 실시예는 실시예 1에서 제조한 표지된 CD40/Fc 융합 단백질로 실시예 3에서 제조한 발현 클로닝 라이브러리를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 48-72 시간 후에, 실시예 3에서 제조한 CV1-EBNA 세포의 형질감염된 단일층을 실시예 1에서 제조한 방사성 요오드화 CD40/Fc 융합 단백질을 사용한 CD4O-L의 발현을 위하여 슬라이드 오토라디오그래피법에 의해 분석하였다. 형질감염된 CV1-EBNA 세포를 결합 배지(소 혈청 알부민(BSA) 25 mg/ml, 아지드화나트륨 2 mg/ml, 20mM 헤페스(pH 7.2), 및 50 mg/ml 무지방 분유를 함유하는 RPMI 1640)로 일회 세척하고, 1 × 10-9M125ICD40/Fc 융합 단백질을 함유하는 결합 배지 중에서 4 ℃에서 2시간 배양시켰다. 배양시킨 후에, 체임버로된 슬라이드중의 세포를 결합 완충액으로 3회, 그리고 PBS(pH 7.3)로 2회 세척하여 비결합성 방사성 표지된 융합 단백질을 제거하였다.
이 세포를 PBS 중의 10% 글루테르알데히드 중에서 실온에서 30분간 배양하여 고정시키고, PBS 중에서 2회 세척후 공기 건조시켰다. 이 슬라이드를 코닥 (Kodak) GTNB-2 사진 에멀젼(물로 6배 희석시킴)에 침지시키고, 실온에서 광차단 상자 속에서 2 내지 4일간 암실에 노출시켰다 이 슬라이드를 코닥 D19 현상제중에서 현상하고, 물로 헹구고 아그파(Agfa) G433c 정착제로 정착시켰다. 이 슬라이드를 각각 25-40배 배율의 현미경으로 조사하였다. CD4O-L을 발현시키는 세포를 나타내는 양성 슬라이드를 광 배경에 대해 오토라디오그래피에 의한 은 그레인(grain)이 존재하는 것으로 동정하였다.
약 2000개의 개별 클론을 함유하는 한 푸울은 CD40/Fc 융합 단백질을 결합시키기 위한 잠재적인 양성인 것으로 동정되었다. 이 푸울을 적정하고, 각각 약 200개의 클론을 함유하는 플레이트를 제공하도록 평평하게 놓았다. 각 플레이트를 파내어 상기한 바와 동일한 과정에 의해 CV1-EBNA 세포내로 형질감염시키기 위한 플라스미드 DNA 푸울을 제공하였다. 상기한 바와 같이 슬라이드 오토라디오그래피법에 의해 보다 더 소형의 푸울을 스크리닝하였다. 이러한 소형 푸울중의 하나는 CD40/Fc 융합 단백질에 결합할 수 있는 발현된 유전자 생성물의 존재로서 표시되는 것과 같이 CD4O-L에 대해 양성인 클론을 함유하고 있었다.
양성 소형 푸울을 적정 및 평평하게 놓아서 개별 콜로니를 얻었다. 대략 400개의 개별 콜로니를 취하여 96웰 플레이트로된 개별 웰 중의 배양 배지내로 접종시켰다. 여러 열과 행의 웰을 한데 모아서 배양물을 혼합하고, 혼합한 배양물을 사용하여 최종 형질감염 및 스크리닝을 위한 DNA를 제조하였다. 양성 열과 양성 행의 교차는 잠재적인 양성 콜로니를 나타내었다. 10개의 잠재적 양성 콜로니(즉, 후보 클론)을 동정하였다. 각 후보 클론으로부터 DNA를 단리시키고, 다시 형질감염시키고, 스크리닝하였다. 5개의 후보 클론은 CD40/Fc에 결합하여 양성이었다. 이 5개의 후보 클론을 모두 디데옥시 뉴클레오티드 서열화에 의해 측정된 바와 같이, 1468 뉴클레오티드의 cDNA 삽입물을 함유하고 있었다. CD4O-L 클론의 cDNA코딩 영역은 제1도 및 SEQ ID NO:1의 서열에 해당한다.
pDC406-mCD40-L로 명명된 쥐 CD4O-L 서열을 함유하는 클로닝 벡터는 1991년 12월 6일자로 미합중국 매릴랜드주 록빌 소재 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection : ATCC)에 기탁 번호 68872로서 기탁하였다. 이 클론의 뉴클레오티드 서열 및 예상 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1 및 제1도에 예시되어 있다.
[실시예 5]
이 실시예는 쥐 CD4O-L의 서열로부터 명명된 프로브를 사용하여 인체 CD4O-L 동족체를 단리시키는데 사용되는 종-교차 혼성화 기술을 예시한다. 쥐 CD4O-L 프로브는 쥐 CD4O-L 클론 pDC406-CD4O-L (뉴클레오티드 13 내지 793)로부터 코딩 영역을 절단하고 랜덤 프라이머(뵈링거-만하임(Boehringer-Mannheim)사)를 사용하여 프래그먼트를32P로 표지화하여 제작하였다.
인체 말초 혈액 임파구(PBL) cDNA 라이브러리를 λgt10 아암(arm)을 사용하하여 λ파지 벡터를 구성하고, 제조업자의 지시에 따라 시판되는 키트(Gigapak: 미합증국 캘리포니아주 산디에고 소재 Stratagene)를 사용하여 시험관내로 포장하였다. PBL 세포를 정상적인 자원자로부터 채취하여 10 ng/ml OKT3 (항 CD3 항체) 및 10 ng/ml 인체 IL-2(미합중국 워싱턴주 시애틀 소재 임뮤넥스사(Immunex) 제품)로 6일간 처리하였다. 이 PBL 세포를 세척하고, 500 ng/ml 이오노마이신(칼바이오켐(Calbiochem)사 제품) 및 10 ng/ml PMA(시그마사 제품)로 4일간 자극하였다. 이렇게 자극한 PBL 세포로부터 운반 RNA 및 cDNA를 채취하고, 제조업자의 지시에 따라 λgt 10 파지 벡터(Gigapak; Stratagen제품) 내로 포장하였다.
쥐 프로브를 6 x SSC (15mM 시트르산삼나트륨 및 65 mM 염화나트륨), 1 x 덴하르트 용액, 2 mM EDTA, 및 0.5% Np4O 중의 파지 cDNA에 63 ℃에서 철야 혼성화시켰다. 이렇게 혼성화시킨 후에, 55℃에서 3시간 동안 3 x SSC 및 0.1% SDS로 광역 세척하였다. 이를 오토라디오그래피한 결과 특이 밴드가 육안으로 관찰되었다.
hCD40-L로 명명된 인체 CD4O-L 서열을 함유하는 클로닝 벡터를 1991년 12월 6일자로 미합중국 매릴랜드주 록빌 소재 ATCC에 수탁 번호 68873으로 기탁하였다. 이 클론의 뉴클레오티드 서열 및 예상 아미노산 서열은 SEQ ID NO:11 및 제2도 예시되어 있다.
[실시예 6]
이 실시예는 CV1-EBNA 세포에서 막 결합 쥐 CD40-L의 발현에 대해 예시한다. HAVEO 벡터 또는 중공 HAVEO 벡터 중의 쥐 CD40-L cDNA를 맥마한(Mcmahan) 등의 문헌[EMBO J. 10:2821, 1991] 및 본 명세서의 실시예 3에 기술된 것과 같은 표준 기술을 사용하여 CV1 EBNA 세포 내로 형질 감염시켰다. 이를 요약하면, CV1 EBNA 세포를 10% 송아지 태반 혈청(배지) 보충한 둘베코 최소 필수 배지 10 ml 중에 10 cm 디쉬 당 2 ×106세포의 밀도로 플레이팅하였다. 이 세포를 37 ℃에서 철야 부착시켰다. 이 배지를 66.7 μM 클로로퀸 및 mCD40-L을 코딩하는 cDNA 5 μg을 함유하는 DNA 혼합물을 함유하는 배지 1.5 ml로 교체하였다. 또한, 이 세포에 175 μl 및 25 μl의 DEAE-덱스트란(PBS중의 4 mg/ml)을 함유하는 배지를 첨가하였다. 세포와 cDNA를 37℃에서 5시간 동안 배양시켰다. cDNA 혼합물을 제거하고, 세포에 10% DMSO를 함유하는 신선한 배지 1 ml로 2.5 분간 쇽을 가하였다. 이 배지를 신선한 배지로 교체하고 세포를 3일 이상 성장시켰다.
[실시예 7]
이 실시예는 CD4O-L에 대한 모노크로날 항체의 제조 방법에 대해 예시한다. COS 세포를 발현시켜 정제된 쥐 CD4O-L 또는 인체 CD4O-L 제제를 제조하였다. 정제된 CD4O-L은 미합중국 특허 제4,411,993호에 기재된 기술과 같은 통상의 기술을 사용하여 CD4O-L에 대한 모노크로날 항체를 생성할 수 있다. 이를 요약하면, 생쥐를 완전 프레운트(Freund) 부형제에 유화시킨 면역원으로서 CD40-L로 면역시키고, 피하 또는 복강내로 10-100 μg의 양을 주사하였다. 10-12일이 경과한 후에, 면역된 동물을 불완전 프레운트 부형제중에 유화시킨 추가량의 CD4O-L을 추가 투여하였다. 생쥐에 1주 내지 2주의 면역화 스케줄에 따라 이후에 주기적으로 추가투여하였다. 이로부터 도트 블롯 분석법(dot blot assay) 또는 효소 결합 면역 흡착 검사법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA)으로 시험하기 위하여 CD4O-L 항체에 대한 혈청 시료를 레트로-오비탈 채혈법(retro-orbital bleeding) 또는 테일-팁 절단법(Tail-tip-excision)에 의하여 주기적으로 채취하였다.
적절한 항체 적정량을 검출한 후에, 양성 동물에 CD4O-L 염수 총액을 최종적으로 1회 정맥내 주사하였다. 3-4일이 경과한 후에 이 동물을 희생시키고, 비장세포를 취하고, 이 비장 세포를 쥐 골수종 세포주(예컨대, NS1 또는 Ag 8.653)에 융합시켰다. 이러한 융합으로부터 하이브리도마 세포가 생성되며, 이를 HAT(하이폭산틴, 아미놉테린 및 티미딘) 선택성 배지 중의 다수의 미세적정 플레이트에 플레이팅시켜 비융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하였다.
하이브리도마 세포를 엥그발(Engvall) 등의 문헌[Immunochem. 8:871, 1971] 및 미합중국 특허 제4,703,004호에 기재된 기술을 적용시켜 정제된 CD40-L에 대한 반응성을 조사하기 위해서 ELISA법에 의하여 스크리닝하였다. 양성 하이브리도마 세포는 유전자 조성이 동일한 BALB/c 생쥐에게 복강내 주사하여 고농도의 항 CD4O-L 모노크로날 항체를 함유하는 복수를 생성할 수 있다. 별법으로, 이 하이브리도마 세포는 각종 기술을 사용하여 플라스크 또는 로울러 병 속에서 시험관내 성장시킬 수 있다. 생쥐 복수에서 생성된 모노크로날 항체는 황산암모늄으로 침전시킨 후에 겔 배제 크로마토그래피하여 정제할 수 있다. 별법으로, CD4O-L에 대한 결합에 기초하여 친화성 크로마토그래피할 수 있는 것과 마찬가지로, 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 항체의 결합에 기초한 친화성 크로마토그래피를 사용할 수도 있다.
[실시예 8]
이 실시예는 sCD40 및 CD40/Fc 융합 단백질의 항알레르기 치료 효과를 예시한다. 가용성 CD4O 및 CD40/Fc를 2 도너 MCL 시스템에서 IL-4(5ng/ml) 유도 IgE 분비를 억제시키는 능력에 대해 시험하였다. 이 3회의 실험으로부터 얻어진 데이타를 하기 표1에 나타낸다.
IgE 농도는 ELISA 과정에 의한 배양물에서 12일후에 측정하였다. 이를 요약하면, 평바닥을 갖는 96웰 미세적정 플레이트(코닝사(Corning) 제품)를 PBS(인산염 완충 염수)중에서 1:500의 희석 비율로 생쥐 mAb 항 인체 IgE(지메드사(Zymed)제품)로 코팅시켰다. 이를 3회 세척한 후에, 5% 무지방 분유를 사용하여 차단 단계를 행하고, 계속하여 인체 IgE 표준물 또는 시험용 상징액으로 적정하였다. 이를 3회 세척한 후에, 비오티닐화 염소 항 인체 IgE(키르케가드 앤드 페리사(Kirkegaard and Perry)제품)를 1:500의 희석 비율로 첨가하였다. 이어서, 이를 추가로 세척한 후 스트렙트아비딘-HRP(지메드사 제품)를 1:500의 희석 비율로 첨가하였다. 이를 더 세척한 후, TMB 기질(키르케가드 앤드 페리사 제품)을 사용하여 반응을 진행시키고, 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 세척 단계는 PBS 와 0.05% 트윈(Tween)의 혼합물 중에서 행하였다. 모든 배양 단계는 실온에서 1 시간 동안 100 μl/웰의 용적에서 행하였다. 이 분석의 감지도는 100 pg/ml이다.
[실시예 9]
위 실시예는 IL-4(5 ng/ml) 자극된 B 세포로부터 가용성 CD23 유도를 억제시키는 sCD40 및 CD40/Fc 융합 단백질의 효과를 예시한다. 가용성 CD4O 및 CD40/Fc를 2 도너 MLC 시스템에서 IL-4 유도된 sCD23 유도를 억제시키는 능력에 대해 시험하였다. 이 3회의 실험으로부터 얻어진 데이타를 하기 표2에 나타낸다.
가용성 CD23 농도는 시판되는 sCD23 ELISA 검출 키트(미합중국 산디애고 소재 바인딩 사이트사(Binding Site) 제품)를 사용한 배양물에서 6일 및 12일후에 측정하였다. 감지도 한계는 500 pg/ml 이었다. 약 1 × 105세포/웰을 표2에 나타낸 첨가제들의 존재하에 또는 첨가제 부재하에 소정 시간 동안 둥근 바닥을 갖는 96웰 미세적정 플레이트(미합중국 유타주 바운티풀 소재 인터마운틴 사이언티픽사(Intermountain Scientific) 제품)에서 3개 1조로 배양하였다. 이 결과는 sCD40의 항알레르기 효과를 나타낸다. sCD40 대신에 CD40/Fc로 유사한 연구를 행하였고(데이타는 기재되어 있지 않음), 유사한 결과를 얻었다. 따라서, 실시예 8 과 9에 있는 데이타들은 CD4O에 대한 항알레르기성을 예증한다.
[실시예 10]
이 실시예는 인체 B 세포에 대한 막 결합 쥐 CD4O-L의 B세포 증식 활성을 예시한다. 인체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 정상인 자원자의 말초 혈액으로부터 히스토파크(Histopaque: 미합중국 미조리주 세인트 루이스 소재 시그마사 제품)상에서 밀도 구배 원심분리에 의해 단리시켰다. 세포(E-)의 T 세포 제거 제제는 2-아미노에틸이소티오우로늄으로 로젯팀 (rosetting)하여 T세포를 제거하여 얻은 후, 추가로 히스토파크상에서 밀도 구배 원심분리하였다. 37 ℃, 10% CO2분위기 하에서 열에 의해 불활성화된 10% 송아지 태반 혈청(FBS)를 첨가한 RPMI 배지 중에서 E-제제로 B 세포 증식 분석을 행하였다. 약 1 × 105E-세포/웰을 형질 감염시킨 CV1 EBNA 세포 (실시예 6에서 설명)의 존재하에서 7일간 둥근 바닥을 갖는 96 웰 미세적정 플레이트(코닝사 제품)에서 3개 1조로 배양하였다. CV1 EBNA 세포를 쥐 CD4O-L cDNA 또는 중공 벡터로 형질감염시켰다. 이 세포에 최종 8시간의 배양 시간 동안 1 μ Ci/웰의 삼중수소화 티미딘(25 Ci/nmole, 미합중국 일리노이주 알링톤 하이트 소재의 아머샴사(Amersham) 제품)을 첨가하였다. 자동 세포 수확기로 유리 섬유 디스크상으로 세포를 수확하고, 액체 신틸레이션 분광법으로 혼입된 cpm을 측정하였다.
제4a도는 중공 벡터(HAVEO) 또는 HAVEO 중의 쥐 CD4O-L cDNA로 형질 감염시킨 CV1 EBNA 세포의 인체 B 세포 증식을 대비하여 도시한 도면이다. 이들 데이타는 막 결합 CD4O-L이 조 마이토젠(co-mitogen)의 부재하에서도 인체 B 세포 증식을 자극한다는 것을 나타낸다. 제4b도는 위와 유사한 실험을 나타낸 것이나, 단 배양물에 10 ng/ml의 인체 IL-4를 첨가하였다. 이 실험에서, IL-4는 막 결합 쥐 CD4O-L의 B 세포 마이토젠 활성을 약간 증강시킨다. 제5도는 제4b도에 나타낸 실험을 반복한 것이다. 그러나, 실험을 반복하였을 때 IL-4의 조마이토젠 활성은 입증되지 않았다. CD4O-L 마이토젠 활성은 반복하여 입증되었다. 따라서, 막 결합 CD4O-L은 인체 B 세포의 증식을 자극한다.
[실시예 11]
이 실시예는 실시예 10에서 단리된 E-세포로부터 IgE 생성과 CD23 유도를 자극하는 막 결합 쥐 CD4O-L의 효과를 예시한다. 약 1 × 105세포/웰을 10% CO2의 습윤 분위기중에서 이소코베(Iscove)의 변형 둘베코 배지(IMDM)과 10% FCS의 혼합물 중의 둥근 바닥을 갖는 96웰 눈크(Nunc) 미세적정 플레이트(미합중국 유타주 바운티풀 소재 인터마운틴 사이언티픽사 제품)에서 3개 1조로 배양시켰다. 이 배지에 50 μg/ml 인체 트랜스페린(시그마사 제품), 0.5% 소 혈청 알부민(시그마사 제품) 및 1 μg/ml 올레산, 리놀레산 및 팔미트산(시그마사 제품)을 각각을 보충하였다. E-세포를 5ng/ml 인체 IL-4의 존재하에서 10일간 배양하였다. 쥐 CD4O-L 또는 중공 벡터로 형질 감염시킨 CV1 EBNA 세포 적정액을 첨가하였다. 10일이 경과한 후에, 실시예 8에 기재된 ELISA 과정에 의하여 IgE에 대하여 또는 실시예 9에 기재된 과정에 의하여 CD23 유도에 대해 배양물 상징액을 분석하였다.
제6도는 중공 벡터(HAVEO) 또는 CD40-L로 형질 감염시킨 E-세포 및 CV1 EBNA 세포의 배양물에 대하여 상징액 중의 IgE 생성(ng/ml)을 대비하여 도시한 도면이다. 최대 3,000 CV1 EBNA 세포에 대해서는 아무 차이도 없었으나, 10,000 또는 30,000 CD4O-L을 첨가하여 형질 감염시킨 CV1 EBNA 세포의 경우 IgE가 현저하게 생성되었다. 대조용으로서, E-세포를 단독 배지, 5 ng/ml IL-4 또는 5 ng/ml IL-4와 500 ng/ml G28-5 항체를 첨가한 배지에서 배양시켰을 때, IgE 생성은 각각 4.7, 2.9 및 〉 600 ng/ml이었다. 제7도에서 CD23 유도를 측정하였을 때, CD4O-L로 형질 감염된 10,000 및 30,000 CV1 EBNA 세포는 대조 중공 벡터 CV1 EBNA 세포와 비교하여 증가된 CD23 유도를 나타냈다. 대조용으로서, E-세포를 단독 배지, 5 ng/ml IL-4 또는 5 ng/ml IL-4와 500 ng/ml G28-5 항체를 첨가한 배지에서 배양시켰을 때, CD23 유도는 각각 〈 0.1, 2.4 및 11.2 ng/ml 이었다. 이들 데이타는 IgE 생성 및 CD23 유도 모두가 막 결합 CD4O-L과 관련된 생물학적 활성임을 나타낸다.
[실시예 12]
이 실시에는 B 세포 증식 활성, 다클론 면역글로블린(Ig) 생성, 항원 특이성 항체 형성 및 임상용으로서 막 결합 가용성 CD4O-L을 사용하는 각종 방법을 예시한다.
본 발명자들은 상기한 그렙스테인 등의 문헌 I, 맬리스제우스키 등의 문헌 I 및 II에 기술된 방법에 따라 쥐 비장 B 세포를 얻었다. 이를 요약하면, 세포 항혈청과 보체를 사용하여 T 세포를 제거하고 세파덱스G10 컬럼을 통과시켜 부착 세포를 제거하고 염소 항 쥐 IgM으로 코팅된 페트리 접시 위에서 패닝(panning)하여 B 세포 양성 선택을 행하여 세포의 혼합 배양물을 정제하였다. 정제된 B 세포를 RPMI, 송아지 태반 혈청(B 세포 증식 분석용에 대해서는 5%, 그리고 플라그(plaque) 형성 세포 분석 또는 다클론 항체 분석에 대해서는 20%), 2-메르캅토에탄올, 항생 물질, 아미노산 및 피루베이트 중에서 배양하였다. B 세포 증식은 실시예 10 및 상기한 그렙스테인 등의 문헌 I, 맬리스제우스키 등의 문헌 I 및 II에 기술된 분석법에 따라 측정하였다. 항원 특이적 항체 형성은 그렙스테인 등의 문헌[J. Mol. Cell. Immunol. 2:199, 1986(그렙스테인 등의 문헌 II)]에 기술되어 있는 방법으로 측정하였다. 이를 요약하면, 항원 특이성 항체 형성 측정시에는 배양물 당 1 × 106의 쥐 B 세포를 함유하는 배양물 2.0 ml 중에서 항원(0.03 % v/v)으로서 양 적혈구 세포(SRBC)를 사용하였다. B 세포 배양물을 5일간 배양시키고, 상기한 그래브스테인 등의 문헌 II에 기재된 젼(Jerne)의 용혈성 플라크 분석법(hemolytic Plaque Assay)에 의하여 플라크 형성 세포를 측정하였다. 세포의 수는 코울터(Coulter) 계수기로 측정하였다. 다클론 Ig 분비는 상기한 맬리스제우스키 등의 문헌 I 및 II에 기재된 바와 같이 배양물 2.0 ml 당 1 × 106의 B 세포를 함유하는 배양물을 7일 동안에 동형 특이적 ELISA 분석법에 의하여 측정하였다.
CD4O-L 또는 중공 벡터 또는 7A1 세포(T 세포 헬퍼 클론)으로 형질 감염된 CV1 EBNA 세포에 의한 세포 증식의 결과는 제8도, 10도 및 12도에 도시되어 있다. 이들 데이타는 CD4O-L이 B 세포를 가장 크게 증식시킨다는 것을 나타낸다. T 세포 헬퍼 세포 7A1 및 7C2는 B 세포 증식에 대해 최소로 효과를 갖는다.
항원 특이성 항체 형성에 대한 각종 세포들의 효과는 제9도 및 11도에 도시되어 있다. 제9도는 가용성 CD4O-L을 분비하는 세포 헬퍼 클론 7A1 및 쥐 EL 40.9 세포를 플라크 형성 세포에 대해 대비하여 도시한 도면이다. EL4O.9 세포는 항원 특이성 항체 형성에 대한 억제 효과를 갖는 것으로 보인다. 제11도는 중공 벡터 또는 CD4O-L로 형질감염시킨 T 세포 헬퍼 세포 7C2 및 CV1 EBNA 세포에 대한 PFC (플라크 형성 세포)를 도시한다. 7C2 세포 및 막 결합 CD4O-L은 모두 항원 특이성 항체 형성(PFC)을 자극시킨다. 제13도는 10 ng/ml 인터루킨-2(IL-2)의 존재 또는 부재하에서 CD4O-L과 7A1 세포의 항원 특이성 항체 형성을 대비하여 도시하고 있다. IL-2는 7A1 세포에 대해서는 PFC를 증가시키지만, 막 결합 CD4O-L에 의해 유발되는 PFC는 증가시키지 않는다.
사이토키네스 IL-4(10 ng/ml) 및 IL-5(COS 세포 상징액의 1:40 희석물)의 존재하에서 또는 첨가된 사이토키네스 없이 막 결합된 CD4O-L, 대조용 CV1 EBNA 세포 및 헬퍼 T 세포 7A1의 쥐 B 세포에 의한 다클론 Ig 생성의 자극 또는 억제에 대해 비교하였다. IgA, IgG3, IgE, IgG2b, IgM 및 IgG1의 양을 표3 내지 8에 각각 나타낸다.
위 데이타들은 CD40과 그의 리간드간의 상호작용이 항원 특이성 항체 생성 및 다클론 Ig 분비에 대한 B 세포 성장 및 분화의 T 세포 접촉성 유도를 초래하는 주요 분자내 작용이라는 것을 나타낸다. 이와 같이, 이들 데이타는 가용성 CD4O, CD40/Fc 융합 단백질 및 가용성일 수 있는 CD4O-L(모노머)에 의한 이러한 상호작용의 길항질이 항체 반응의 진행을 현저하게 방해할 것임을 제안하고 있다. 따라서, CD4O, CD40/Fc 융합 단백질 및 가용성 CD4O-L이 알레르기, 낭창, 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병 및 기타 질환을 포함하는 임상적 상황인 경우에, 자동면역 항체 또는 항원/항체 복합체가 이 질환들의 임상적 병리에 관여하다. 또한, 막 결합 CD4O-L 또는 올리고머 가용성 CD40-L은 B 세포 증식과 항체 생성을 자극시키는데 유용할 것이다. 이와 같이, 이러한 형태의 CD4O-L은 백신 보조제 및 하이브리도마 세포로부터의 mAb분비 자극제로서 매우 유용하다.
[실시예 13]
이 실시예는 말초 혈액 단핵 세포(E-)로부터 IgE 분비 및 E-세포의 증식에 미치는 막 결합 CD4O-L의 효과를 예시하다. E-세포는 실시예 10의 과정에 따라 얻은 후 중공 벡터 또는 mCD40-L cDNA로 형질 감염시킨 CV1 EBNA 세포의 존재하에 7 또는 10일간 배양시켰다. 또한, 제14도에 나타낸 바와 같은 제제 일부에 CD40/Fc 융합 단백질(실시예 1에 기재되어 있음) 또는 TNF 수용체/Fc 융합 단백질(국제 공개 제91/03553호에 기재되어 있음)을 첨가하였다. IgE 분비를 실시예 8의 과정에 따라 측정하고, B 세포 증식을 실시예 10의 과정에 따라 측정하였다.
5가지의 상이한 농도로 형질감염된 CV1 EBNA 세포에 대한 B 세포 증식 및 IgE 분비의 결과를 제14도에 도시하였다. B 세포 증식 및 IgE 분비는 모두 막 결합 CD4O-L의 존재하에서 증가되었다. CD40/Fc 융합 단백질을 첨가하였을 때 B 세포 증식 및 IgE 분비는 중단되었다. TNF 수용체/Fc 융합 단백질은 아무런 효과가 없었다. IgE 분비에 대한 비교용으로, 대조용 제제(형질 감염된 CV1 EBNA 세포가 없음)로서 IL-4를 첨가한 경우 이 분석에서 IgE를 전혀 생성하지 않았으며 IL-4와 G28-5항 CD4O mAb를 첨가한 경우 이 분석에서 29.7 ng/ml를 생성하였다.
[실시예 14]
이 실시예는 CD4O-L/FC2 구조체로 지칭되는 가용성 CD4O-L/Fc 융합 단백질을 발현시키는 CD4O-L/Fc DNA구조체의 구성에 대해 설명한다. CD4O-L/FC2를 코딩하는 DNA는 리더(또는 시그널) 펩티드, 호프(Hopp) 등의 문헌[Bio/Technology 6:1204, 1988;Flag로 지칭됨]에 기재되어 있는 8개의 아미노산으로 이루어진 친수성 서열, 면역글로블린의 적당한 Fc 영역, [Gly4Ser]3반복 서열(본 명세서에 참고로 인용된 미합중국 특허 제5,073,627호) 또는 기타 적합한 링커 서열, 및 아미노산 50 내지 아미노산 261의 인체 CD4O-L의 세포외 영역(SEQ ID NO:11)을 코딩하는 서열로 구성된다. 리더 서열 Flag및 인 체 IgG1Fc를 함유하는 pDC406 발현 벡터는 통상적인 효소 절단 기술 및 리더 서열 Flag및 인체 IgG1Fc를 코딩하는 프래그먼트의 연결 기술을 사용하여 제조하고 Nsi 1 및 Not 1로 제한시킨다.
5'(상부) 및 3'(하부) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 기법[사키(Sarki) 외 공저, Science 239:487, 1988 참조]을 행함으로써 인체 CD40-L (ATCC 68873; SEQ ID NO:11)을 함유하는 클로닝 벡터로부터 CD4O 세포외 리간드 결합 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 증폭시켜 PCR 프래그먼트를 형성하였다. 상부 올리고뉴클레오티드 프라이머(SEQ ID NO:13)를 링커 서열([Gly4Ser]3SerSer) 상부의 Nsi 1 부위에 도입하였으며, 이 부위 뒤에는 CD4O-L의 세포외 도메인의 2개의 뉴클레오티드(SEQ ID NO:11의 아미노산 51 내지 57)가 위치한다. 하부 올리고뉴클레오티드 프라이머(SEQ ID NO:13)를 CD4O-L의 종지 코돈의 바로 다음 하부에 위치하는 Not 1 부위에 도입하였다. 이어서, PCR 프래그먼트를 리더 서열 Flag및 인체 IgG1Fc를 함유하는 pDC406 발현 벡터 내로 연결시켰다. CD4O-L/FC2의 뉴클레오티드 및 예상 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16에 제시되어 있다. 얻어진 DNA 구조체(CD4O-L/FC2)를 원숭이 신장 세포주 CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478)내로 형질감염시켰다. 이 구조체는 CD4O을 발현시키는 세포를 사용하는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석에서 관찰된 결합에 의해 입증된 바와 같이 CD4O을 결합시킬 수 있는 가용성 CD4O-L을 코딩한다.
CD4O-L/FC2를 코딩하는 구조체로 형질감염시킨 인체 배 신장 293 세포 (ATCC CRL 1573)의 대량 배양물을 성장시켜 CD4O-L/FC2를 함유하는 상징액을 모았다. 인체 아데노비루스 5 DNA에 의해 형질전환된 제1 인체 배 신장의 영구주(permanent line)인 293 세포주는 pCD406 벡터에 연결된 재조합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 상징액 중의 CD4O-L/FC2 융합 단백질을 친화성 정제에 의해 정제하였다. 이를 요약하면, 포유동물 세포 상징액을 예컨대 0.45 μ필터를 통해 여과시키고 이 여액을 4 ℃, 약 60 내지 80 ml/시간의 유속에서 1.5 cm x 12.0 cm 크기의 스트렙트아비딘-아가로스(미합중국 일리노이주 록크포드 소재 피어스 케미칼사 제품)에 커플링된 비오티닐화 염소 항 인체 IgG(미합중국 일리노이주 웨스트 그로브 소재 잭슨 임뮤노리서취 레버러토리즈, 인크(Jack son Immunoresearch Laboratories, Inc.)사 제품)를 함유하는 항체 친화성 칼럼에 가하여 CD40-L/FC2 융합 단백질을 함유하는 배양물 상징액을 친화성 정제에 의해 정제하였다. 이 칼럼을 유리 단백질이 세척 완충액 중에서 검출되지 않을 때까지 약 20 칼럼 용적의 PBS(인산염 완충 염수)로 세척하였다. 결합된 융합 단백질을 12.5 mM 시트르산염 완충액, pH 2.8의 75 mM NaCl을 사용해 칼럼으로부터 용출시키고, pH 9.1의 500 mM 헤페스 완충액으로 pH 7로 만들었다. 정제된 올리고머 CD4O-L/FC2 펩티드는 임의의 보조 자극물이 없어도 인체 B 세포의 증식을 유발시켰으며, 막 결합 CD4O-L에 대해 실시예 12에서 설명한 바와 같이 적절한 사이토킨과 함께 IgG, IgE, IgA 및 IgM을 생성시켰다.
[실시예 15]
이 실시예는 트라이머 CD40-L로 지칭되는 가용성 CD40-L 융합 단백질을 발현시키는 CD4O-L DNA 구조체의 구성에 대해 설명한다. 이 트라이머 CD4O-L은 "로이신 지퍼(Leucine Zipper)"로 지칭되는 33개의 아미노산으로 이루어진 서열인 리더 서열(SEQ ID NO:17) 및 호프 등의 문헌[Bio/Technology 6:1204, 1988:Flag로 로 지칭됨]에 기술된 8개의 아미노산으로 이루어진 친수성 서열을 함유하고, 이 친수성 서열 뒤에는 아미노산 50 내지 아미노산 261(SEQ ID NO:11)의 인체 CD4O-L의 세포외 영역이 존재한다. 리더 및 Flag서열의 효용성은 발명의 상세한 설명에 설명되어 있다. SEQ ID NO:17에 존재하는 33개의 아미노산으로 이루어진 서열은 용액중에서 자발적으로 트라이머를 형성한다. 따라서, 이러한 33개의 아미노산으로 이루어진 서열로 이루어지는 융합 단백질은 자발적으로 트라이머 또는 멀티머를 형 성한다.
상기 구조체는 리더 서열, 상기한 33개의 아미노산으로 이루어진 서열 및 Flag서열을 제공하는 올리고뉴클레오티드를 형성한 후, 최종 생성물을 실시예 14에 기재된 방법으로 제조한 SEQ ID NO:11의 아미노산 51 내지 261을 코딩하는 DNA 프래그먼트에 연결시켜 제조한다.
발현 벡터 pDC406 중의 생성된 연결 생성물을 원숭이 신장 세포주 CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478) 내로 형질 감염시켰다. pDC406 플라스미드는 SV40, 인체 면역 결핍 비루스(HIV) 및 EB 비루스(EBV)로 부터 유도된 규칙적인 서열을 포함한다. CV-1/EBNA 세vh주는 인체 CMV 초중기 인핸서/프로모터로부터 유도된 EBNA-1을 구성적으로 발현시키는 EB 비루스 핵 항원-1(EBNA-1)을 코딩하는 유전자로 CV-1 세포주를 형질감염시켜 유도하였다. EBNA-1 유전자는 EBA 복제원을 함유하는 pDC406과 같은 발현 벡터의 에피좀 복제를 가능하게 한다.
먼저 융합 구조체를 발현시키는 세포들을 동정하고, 형질감염된 세포들의 대량 배양물을 성장시켜 트라이머 CD40-L을 발현시키는 세포로부터 상징액을 모았다. 이 상징액 중의 트라이머 CD40-L 융합 단백질을 미합중국 특허 제5,011,912호에 기재된 바와 실질적으로 동일한 방법으로 친화성 정제에 의해 정제하였다. 용출시킨 CD4O-L 융합 단백질의 은 염색 SDS 겔을 제조하여 순도를 측정하였다.
서열 목록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 : 아미테이지, 리챠드(ARMITAGE, RICHARD)
판슬로우, 윌리암(FANSLOW, WILLIAM)
스프리그스, 멜라니(SPRIGGS, MELANIE)
(ii) 발명의명칭 : 신규 사이토킨
(iii) 서열 수 : 17
(iv) 주소 :
(A) 수취인 : 임뮤넥스 코포레이션(IMMUNEX CORPORATI0N)
(B) 거리명 : 유니버시티 스트리트 51
(C) 도시명 ; 시애틀
(D) 주 : 워싱톤
(E) 국적 : 미합중국
(F) ZIP : 98101
(v) 컴퓨터 판독형 :
(A) 미디어 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) 현 출원 데이타 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(viii) 변리사/대리인 정보 :
(A) 성명 : 오스터, 제프리 비.
(B) 등록 번호 : 32585
(C) 참고/처리 번호 : 2802
(ix) 통신 정보 :
(A) 전화번호 : 2065870430
(B) 팩스 번호 : 2065870606
(2) SEQ ID NO:1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 783 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일 스트랜드
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 가정 서열 : 없음
(iv) 안티센스 : 없음
(vi) 원래 기원 :
(A) 생물 : 생쥐
(vii) 직접 기원 :
(B) 클론 : CD4O-L
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재 위치 : 1..783
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:1
(2) SEQ ID NO:2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 260 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:2
(2) SEQ ID NO:3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 740 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정 서열: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원래 기원:
(A) 생물: 사람
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: IgG1 Fc
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:3
(2) SEQ ID NO:4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 519 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정 서열: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원래 기원:
(A) 생물: 사람
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: CD4O 세포외 영역
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:4
(2) SEQ ID NO:5에 대한 정보 :
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정 서열: 없음
(iv) 안티 센스: 없음
(vi) 원래 기원:
(A) 생물: PCR 프라이머
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: CD4O 5' 프라이머
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:5
CCGTCGACCA CCATGGTTCG TCTGCC
26
(2) SEQ ID NO:6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토플로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정 서열: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원래 기원:
(A) 생물: PCR 프라이머
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: CD4O 3' 프라이머
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:6
CCGTCGACGT CTAGAGCCGA TCCTGGGG
28
(2) SEQ ID NO:7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 40 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정 서열: 없음
(vi) 원래 기원:
(A) 생물: PCR 프라이머
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: CD4O 3' 하부 프라이머
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:7
ACAAGATCTG GGCTCTACGT ACTCAGCCGA TCCTGGGGAC
40
(2) SEQ ID NO:8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩티드
(iii) 가정 서열: 없음
(v) 프래그먼트 유형: 내부 프래그먼트
(vi) 원래 기원:
(A) 생물: 펜타펩티드
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:8
Tyr val Gly Pro Arg
1 5
(2) SEQ ID NO:9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 43 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정 서열: 없음
(vi) 원래 기원:
(A) 생물: PCR 프라이머
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: 인체 IGG1/FC 5' 프라이머
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:9
TATTAATCAT TCAGTAGGGC CCAGATCTTG TGACAAAACT CAC
43
(2) SEQ ID NO:10에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 38 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정 서열: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원래 기원:
(A) 생물: PCR 프라이머
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: 인체 IGG1/FC 3' 하부 프라이머
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:10
GCCAGCTTAA CTAGTTCATT TACCCGGAGA CAGGGAGA
39
(2) SEQ ID NO:11에 대한 정보 :
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 840 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정 서열: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원래 기원:
(A) 생물: 사람
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: CD4O-L
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재 위치: 46..831
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:11
(2) SEQ ID NO:12에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 261 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:12
(2) SEQ ID NO:13에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 73 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가정 서열: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:13
(2) SEQ ID NO:14에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가정 서열: 없음
(iv) 안티 센스: 없음
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:14
GGCCGCTCAG AGTTTGAGTA A
21
(2) SEQ ID NO:15에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1425 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA 내지 mRNA
(iii) 가정 서열: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: 인체 CD4O-L/FC2 (가용성 CD4O-L)
(ix) 특징:
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재 위치: 4..1422
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 매트 펩티드
(B) 존재 위치: 79..1422
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 시그 펩티드
(B) 존재 위치: 4..78
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:15
(2) SEQ ID NO:16에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 473 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:16
(2) SEQ ID NO:17에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 33 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 펩티드
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:17

Claims (17)

  1. (a) SEQ ID NO:11의 뉴클레오티드 46 내지 828, 184 내지 828, 또는 193 내지 762:
    (b) 엄격한 조건 (63℃, 6 X SSC에서 밤새 혼성화; 55℃, 3 X SSC에서 세척)하에서 (a)의 서열 또는 그의 상보 스트랜드 중의 하나와 검정 가능하게 혼성화되는 DNA 서열; 및
    (c) 유전 암호의 축퇴로 인해 상기 DNA 서열 중의 어느 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, CD4O에 결합하는 CD4O-L 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA 서열.
  2. 제1항에 있어서, 가용성 CD4O-L 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA 서열.
  3. 제1항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  4. 제2항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  5. 제3항의 발현 벡터로 형질 전환 또는 형질 감염된 숙주 세포.
  6. 제4항의 발현 벡터로 형질 전환 또는 형질 감염된 숙주 세포.
  7. 제5항의 숙주 세포를 발현 촉진 조건 하에서 배양하고, 이 배양물로부터 CD4O-L 폴리펩티드를 회수하는 것으로 이루어진 CD4O-L 폴리펩티드의 생산 방법.
  8. 제6항의 숙주 세포를 발현 촉진 조건 하에서 배양하고, 이 배양물로부터 CD4O-L 폴리펩티드를 회수하는 것으로 이루어진 CD4O-L 폴리펩티드의 생산 방법.
  9. 제1항의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 함유하는 정제된 생물학적 활성 CD4O-L 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 인체 CD4O-L로 주로 이루어진 정제된 생물학적 활성CD4O-L 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO:11에 나타낸 서열의 아미노산 1 내지 261로 정의된 폴리펩티드;
    (b) SEQ ID NO:11에 나타낸 서열의 아미노산 47 내지 261로 정의된 폴리펩티드; 및
    (c) SEQ ID NO:11에 나타낸 서열의 아미노산 47 내지 아미노산 51 사이의 서열 중의 하나의 아미노산부터 시작하여 SEQ ID NO:11에 나타낸 서열의 아미노산 239 내지 아미노산 261 사이의 서열 중의 하나의 아미노산을 포함하는 서열로 정의된 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 정제된 생물학적 활성 CD4O-L 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, CD4O-L이 가용성 CD4O-L인 정제된 생물학적 활성 CD4O-L 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, SEQ ID NO:11의 아미노산 51 내지 261로 이루어지는 가용성 CD4O-L 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 2개 이상의 CD4O-L 세포외 영역으로 이루어진 올리고머인 가용성 CD4O-L 폴리펩티드.
  15. 가용성 CD4O 단백질, CD4O 융합 단백질, 가용성 모노머 CD4O-L 폴리펩티드 및 그의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 CD4O 길항질 유효량을 포함하는, 알레르기, 알레르기성 반응, 낭창, 류머티스성 관절염 또는 이식편 대 숙주 질환을 치료하기 위한 제약학적 조성물.
  16. 막 결합 CD4O-L 폴리펩티드, 가용성 올리고머 CD4O-L 폴리펩티드 및 그의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 보조제를 포함하는, 백신 반응을 증가시키기 위한 제약학적 조성물.
  17. CD4O-L, 막 결합 CD4O-L 및 올리고머 CD4O-L로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4O 아고니스트 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는, 모노크로날 항체 분비를 증가시키기 위한 하이브리도마 세포의 자극 방법.
KR1019940701285A 1991-10-25 1992-10-23 신규 사이토킨 Expired - Fee Related KR100283541B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78370791A 1991-10-25 1991-10-25
US783.707 1991-10-25
US80572391A 1991-12-05 1991-12-05
US805.723 1991-12-05
PCT/US1992/008990 WO1993008207A1 (en) 1991-10-25 1992-10-23 Novel cytokine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100283541B1 true KR100283541B1 (ko) 2001-03-02

Family

ID=27120174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019940701285A Expired - Fee Related KR100283541B1 (ko) 1991-10-25 1992-10-23 신규 사이토킨

Country Status (12)

Country Link
EP (2) EP0667901B2 (ko)
JP (2) JP3308534B2 (ko)
KR (1) KR100283541B1 (ko)
AT (2) ATE274055T1 (ko)
AU (1) AU661360B2 (ko)
CA (2) CA2121798C (ko)
DE (2) DE69233051T2 (ko)
DK (3) DK0897983T3 (ko)
ES (2) ES2227513T5 (ko)
FI (2) FI116850B (ko)
NO (2) NO317625B1 (ko)
WO (1) WO1993008207A1 (ko)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5981724A (en) * 1991-10-25 1999-11-09 Immunex Corporation DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40
US7405270B2 (en) 1991-10-25 2008-07-29 Immunex Corporation CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation
US5962406A (en) * 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
US5716805A (en) * 1991-10-25 1998-02-10 Immunex Corporation Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
US7070777B1 (en) * 1991-11-15 2006-07-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting inflammation with an antibody that binds the 5C8 protein
US5474771A (en) 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
US6472510B1 (en) 1992-02-14 2002-10-29 Bristol-Myers Squibb Company CD40 receptor ligands
US5874082A (en) * 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
AU5098493A (en) * 1992-08-21 1994-03-15 Schering Corporation Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40
US5540926A (en) * 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation
EP0679191B1 (en) * 1993-01-22 2003-12-10 Immunex Corporation Detection and treatment of mutations in a cd40 ligand gene
US5560908A (en) * 1993-01-22 1996-10-01 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for NIDDM
WO1995006666A1 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Trustees Of Dartmouth College Anti-gp39 antibodies and uses therefor
US5869049A (en) * 1993-09-02 1999-02-09 Trustees Of Dartmouth College Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists
ZA946765B (en) 1993-09-02 1996-02-15 Dartmouth College Methods of prolonged suppression of humoral immunity
ATE179616T1 (de) * 1993-09-02 1999-05-15 Dartmouth College Verfahren zur verlaengerter unterdrueckung der humoralen immunitaet
WO1995014487A1 (en) * 1993-11-24 1995-06-01 The Australian National University Treatment of viral disease with cd40l peptide
CA2179196A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Richard J. Armitage Method of preventing or treating disease characterized by neoplastic cells expressing cd40
US5683693A (en) * 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
DK0763057T3 (da) 1994-04-28 2006-03-27 Boehringer Ingelheim Pharma Fremgangsmåde til proliferering og differentiering af B celler og anvendelse deraf
AU699291B2 (en) * 1995-03-01 1998-11-26 Immunex Corporation Method for stimulating an immune response
AU2556195A (en) 1995-03-13 1996-10-02 Regents Of The University Of Michigan, The CD40 binding compositions and methods of using same
AU693713B2 (en) * 1995-06-07 1998-07-02 Immunex Corporation CD40L mutein
PT833847E (pt) * 1995-06-22 2004-02-27 Biogen Inc Cristais de fragmentos de ligando cd40 e sua utilizacao
US6440418B1 (en) 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6340459B1 (en) 1995-12-01 2002-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients
AU3570797A (en) * 1996-06-14 1998-01-07 University Of Washington Absorption-enhanced differential extraction device
NZ333607A (en) * 1996-07-10 2000-08-25 Immunex Corp Method of stimulating the immune system by transfecting dendritic cells
US6017527A (en) * 1996-07-10 2000-01-25 Immunex Corporation Activated dendritic cells and methods for their activation
US7070771B1 (en) * 1996-12-09 2006-07-04 Regents Of The University Of California Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells
JP4138013B2 (ja) 1996-12-23 2008-08-20 イミュネックス・コーポレーション Ｔｎｆスーパーファミリーのメンバーであるｎｆ−ｋａｐｐａ ｂの受容体アクティベーターに対するリガンド
US6271349B1 (en) 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
EP1076699B1 (en) 1998-05-14 2008-10-29 Immunex Corporation Method of inhibiting osteoclast activity
DE122009000039I1 (de) 1998-10-23 2009-11-05 Kirin Amgen Inc Thrombopoietin substitute
US7300774B1 (en) 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
JP2003508016A (ja) * 1999-04-16 2003-03-04 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー Ｃｄ４０／ｃｄ４０ｌキメラポリペプチドをコードする核酸、それらの生成方法及びそれらの使用
EP1067194A1 (en) * 1999-04-16 2001-01-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Vectors containing a gene coding for CD40 and/or CD40L under the control of a cytokine-inducible promoter which is a human acute phase amyloid A gene promoter. Methods for their production and uses thereof
AU6934600A (en) 1999-08-27 2001-03-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd40 ligand and cd40 agonist compositions and methods of use
GB9927757D0 (en) * 1999-11-25 2000-01-26 Kennedy Rheumatology Inst Treatment of autoimmune diseases
AU2001251612A1 (en) 2000-04-14 2001-10-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Roles of jak/stat family members in tolerance induction
AU6158501A (en) 2000-05-12 2001-11-26 Beth Israel Hospital Compositions and methods for achieving immune suppression
CA2424749A1 (en) 2000-10-02 2002-04-11 Chiron Corporation Methods of therapy for b-cell malignancies using antagonist anti-cd40 antibodies
AU2002221780A1 (en) * 2000-10-31 2002-05-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof
DK2087908T3 (en) 2001-06-26 2018-07-23 Amgen Inc ANTIBODIES AGAINST OPGL
US6586245B2 (en) 2001-07-18 2003-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of CD40 ligand expression
EP1414483A1 (en) * 2001-07-31 2004-05-06 Serono Genetics Institute S.A. Agonists and antagonists of moxifin for the treatment of metabolic disorders
EP3187592B1 (en) 2001-09-20 2018-12-12 Immunex Corporation Selection of cells expressing heteromeric polypeptides
US7786282B2 (en) 2001-12-06 2010-08-31 The Regents Of The University Of California Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain
US7495090B2 (en) 2002-05-23 2009-02-24 The Regents Of The University Of California Nucleic acids encoding chimeric CD154 polypeptides
BRPI0407487A (pt) 2003-02-14 2006-02-14 Biogen Idec Inc cassete e um vetor de expressão para a expressão transitória ou estável de moléculas exógenas
JP5102028B2 (ja) 2004-07-26 2012-12-19 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ１５４抗体
JP5269412B2 (ja) 2004-10-07 2013-08-21 アルゴス セラピューティクス，インコーポレイティド 成熟樹状細胞組成物およびその培養方法
US8513008B2 (en) 2004-10-07 2013-08-20 Argos Therapeutics, Inc. Mature dendritic cell compositions and methods for culturing same
SG156672A1 (en) 2004-10-22 2009-11-26 Amgen Inc Methods for refolding of recombinant antibodies
RU2518289C2 (ru) 2006-09-13 2014-06-10 Эббви Инк, Способ получения антитела или его фрагмента с подпиткой (варианты)
EP2500415A1 (en) 2006-09-13 2012-09-19 Abbott Laboratories Cell culture improvements
MY188753A (en) 2006-09-18 2021-12-29 Univ Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses
EP4512422A3 (en) 2007-09-14 2025-05-21 Amgen Inc. Homogenous antibody populations
AU2008318615A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Texas A&M University System Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium
ES2761693T3 (es) 2007-11-01 2020-05-20 Univ Arkansas Composiciones y métodos para mejorar las respuestas inmunitarias a Eimeria
EP2784089A1 (en) 2008-01-15 2014-10-01 AbbVie Inc. Improved mammalian expression vectors and uses thereof
PL2501822T3 (pl) 2009-11-17 2017-12-29 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Sposoby zwiększenia produkcji białek
JP6242050B2 (ja) 2010-01-21 2017-12-06 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー 免疫応答を増強するワクチンベクターおよび方法
CN102971008B (zh) 2010-06-09 2015-11-25 阿肯色大学评议会 降低弯曲菌属感染的疫苗和方法
NZ711019A (en) 2013-02-14 2019-07-26 Univ Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria or limiting eimeria infection
US10023608B1 (en) 2013-03-13 2018-07-17 Amgen Inc. Protein purification methods to remove impurities
WO2014152508A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to enteric pathogens
CN115887671A (zh) 2015-07-16 2023-04-04 百欧肯治疗有限公司 治疗癌症的组合物及方法
BR112018002319A2 (pt) 2015-08-05 2018-12-11 Janssen Biotech, Inc. anticorpos anti-cd154 e métodos de uso dos mesmos
WO2017083604A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Amgen Inc. Triazine mediated pharmacokinetic enhancement of therapeutics
JP7467027B2 (ja) 2016-05-03 2024-04-15 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー 免疫刺激性ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドを含む酵母ワクチンベクター並びにそれを使用する方法
IL300591A (en) 2016-05-11 2023-04-01 Amgen Inc Direct selection of cells expressing high levels of heteromeric proteins using intergenic glutamine synthetase complementation vectors
JP7121029B2 (ja) * 2017-02-27 2022-08-17 シャタック ラボ，インコーポレイテッド Ｃｓｆ１ｒベースのキメラタンパク質
SG11201906465YA (en) 2017-02-27 2019-08-27 Shattuck Labs Inc Tigit- and light-based chimeric proteins

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2089229C (en) * 1992-02-14 2010-04-13 Alejandro A. Aruffo Cd40cr receptor and ligands therefor
US5540926A (en) * 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBO J. 11(12), pp 4313-4321 (1992.12.11) *
Molecular Immunology 25(9), pp 829-841 (1988) *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1993008207A1 (en) 1993-04-29
FI981765A0 (fi) 1998-08-17
FI981765L (fi) 1998-08-17
EP0897983B1 (en) 2003-05-07
EP0897983A2 (en) 1999-02-24
JP3308534B2 (ja) 2002-07-29
ATE274055T1 (de) 2004-09-15
ES2227513T5 (es) 2009-04-01
DK0667901T3 (da) 2004-12-27
CA2121798A1 (en) 1993-04-29
HK1019343A1 (en) 2000-02-03
CA2121798C (en) 2007-07-24
ES2227513T3 (es) 2005-04-01
NO317625B1 (no) 2004-11-29
FI116850B (fi) 2006-03-15
CA2312667A1 (en) 1993-04-29
EP0667901B2 (en) 2008-10-15
FI941837A0 (fi) 1994-04-20
EP0897983A3 (en) 1999-03-17
NO980030L (no) 1998-01-05
FI116828B (fi) 2006-03-15
NO980030D0 (no) 1998-01-05
AU3122693A (en) 1993-05-21
DK0822199T3 (da) 2004-12-27
EP0667901A1 (en) 1995-08-23
DE69233051D1 (de) 2003-06-12
DK0897983T3 (da) 2003-08-11
JP2877788B2 (ja) 1999-03-31
DE69233402D1 (de) 2004-09-23
FI941837L (fi) 1994-05-30
NO941422D0 (no) 1994-04-19
EP0667901A4 (en) 1995-06-22
EP0667901B1 (en) 2004-08-18
DE69233051T2 (de) 2004-03-11
DE69233402T3 (de) 2009-06-25
CA2312667C (en) 2002-11-19
JPH10150994A (ja) 1998-06-09
DE69233402T2 (de) 2005-09-15
JPH07504083A (ja) 1995-05-11
DK0667901T4 (da) 2008-11-10
ATE239790T1 (de) 2003-05-15
ES2198025T3 (es) 2004-01-16
NO320073B1 (no) 2005-10-17
AU661360B2 (en) 1995-07-20
NO941422L (ko) 1994-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100283541B1 (ko) 신규 사이토킨
US7309489B1 (en) Mouse CD40 ligand-specific antibodies and hybridomas
US6410711B1 (en) DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40
US6355779B1 (en) Cytokine designated 4-1BB ligand antibodies and human receptor that binds thereto
US7138500B1 (en) Antibodies to human 4-1BB
US5674704A (en) Cytokine designated 4-IBB ligand
KR100467998B1 (ko) Il-17수용체
AU694232B2 (en) Receptor for oncostatin M
US5962406A (en) Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
CA2124085C (en) Receptor for oncostatin m and leukemia inhibitory factor
US5783665A (en) Cytokine which is a ligand for OX40
EP0615451B1 (en) Novel cytokine that binds cd30
JP3559281B2 (ja) Ｃｄ２７リガンド
CA2222914C (en) Novel cd40l mutein
EP0739350B1 (en) Ligand that binds fas antigen
US7405270B2 (en) CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation
AU2255397A (en) Receptor protein designated 2f1
KR19990087793A (ko) 러크-8로 표시된 싸이토킨
ES et al. NEUE CYTOKINE NOUVELLE CYTOKINE
HK1019343B (en) Antibody against cd40-l

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 19940419

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 19971023

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 19990830

Patent event code: PE09021S01D

A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 19991130

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20000628

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 19990830

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
PJ0201 Trial against decision of rejection

Patent event date: 20000729

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event code: PJ02012R01D

Patent event date: 20000628

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PJ02011S01I

Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

Decision date: 20001023

Appeal identifier: 2000101001748

Request date: 20000729

PB0901 Examination by re-examination before a trial

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20000729

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event date: 20000729

Patent event code: PB09011R01I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 19991130

Patent event code: PB09011R02I

B701 Decision to grant
PB0701 Decision of registration after re-examination before a trial

Patent event date: 20001023

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PB07012S01D

Patent event date: 20001002

Comment text: Transfer of Trial File for Re-examination before a Trial

Patent event code: PB07011S01I

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20001209

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20001211

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20031120

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20041124

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20051123

Start annual number: 6

End annual number: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20061124

Start annual number: 7

End annual number: 7

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20071123

Start annual number: 8

End annual number: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20081201

Year of fee payment: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20081201

Start annual number: 9

End annual number: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee
PC1903 Unpaid annual fee

Termination category: Default of registration fee

Termination date: 20101110