ES2677245T3

ES2677245T3 - Anticuerpos Antagonistas de IL-17

Info

Publication number: ES2677245T3
Application number: ES15156029.9T
Authority: ES
Inventors: Franco E Di Padova; Hermann Gram; Hans Hofstetter; Margit Jeschke; Jean-Michel Rondeau; Wim Van Den Berg
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2005-08-04
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2025-08-04
Also published as: US20150152178A1; US9765140B2; ATE517924T1; JP2008507988A; PL2902039T3; HK1207559A1; NO20151787L; CY2015030I1; CY1120723T1; CY2015030I2; EP3409288A1; EP2902039B1; HUS1500037I1; NO336279B1; EP1776142B9; CY1115444T1; HUE038187T2; US20250122277A1; EP2364729B1; US7807155B2

Abstract

Un anticuerpo de unión a IL-17 o fragmento del mismo que comprende dominios variables tanto de cadena pesada (VH) como de cadena ligera (VL) para uso en el tratamiento de una artritis inflamatoria, en donde dicho anticuerpo de unión a IL-17 o fragmento del mismo comprende al menos un sitio de unión a antígeno que comprende: (a) un VH que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3, teniendo dicha CDR1 la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, teniendo dicha CDR2 la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, y teniendo dicha CDR3 la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, en donde las regiones hipervariables están de acuerdo con la definición de Kabat; o (b) un VH que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1-x, CDR2-x y CDR3-x, teniendo dicha CDR1-x la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11, teniendo dicha CDR2-x la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:12, y teniendo dicha CDR3-x la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:13, en donde las regiones hipervariables están de acuerdo con la definición de Chothia; y (c) un VL que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1', CDR2' y CDR3', teniendo dicha CDR1' la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:4, teniendo dicha CDR2' la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:5, y teniendo dicha CDR3' la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:6 en donde las regiones hipervariables están de acuerdo con la definición de Kabat.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos Antagonistas de IL-17

Esta invencion se relaciona con una molecula de union a IL-17, en particular un anticuerpo para la IL-17 humana, mas preferiblemente un anticuerpo humano para la IL-17 humana (tambien llamado IL-17A) y con el uso de tales anticuerpos en el tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por la IL-17.

IL-17, una citoquina derivada de celula T presente por ejemplo en artritis reumatoide (RA), actua como una citoquina pro-inflamatoria, particularmente en conjunto con IL-1 y TNF-a (Chabaud M & Miossec P (1999) Arthritis Rheum 42, 963-970; Awane M et al (1999) J. Immunol 162, 5337-5344). La IL-17 induce la produccion de MMP y regula por disminucion el TIMP (Jovanovic DV et al (2001) J. Rheumatol. 28, 712-718), y el bloqueo de IL-1 e IL-17 tiene un efecto sinergico en la inflamacion y la destruccion osea in vivo (Chabaud M & Miossec (2001) Artrhitis Rheum 44, 1293-1303). La produccion excesiva o inapropiada de IL-17 se asocia con la patologia de varias enfermedades y trastornos, tal como artritis reumatoide (Witowski et al., 2004 Cell Mol Life Sci 61:567-579), osteoartritis, aflojamiento de los implantes oseos, rechazo agudo de trasplante (Antonysamy et al., 1999, J Immunol 162, 577-584; van Kooten et al., 1998, J Am Soc Nephrol 9, 1526-1534), septicemia, choque endotoxico o septico, alergias, asma (Molet et al., 2001, J Allergy Clin Immunol 108, 430-438), perdida osea, soriasis (Teunissen et al., 1998, J Invest Dermatol 111, 645-649), isquemia, esclerosis sistemica (Kurasawa et al., 2000, Artritis Rheum 43, 2455-2463), apoplejia, y otros trastornos inflamatorios. Se han propuesto anticuerpos para la IL-17 para uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por la IL-17; vease por ejemplo, WO 95/18826 y la discusion en la introduccion de los mismos.

Ahora se preparan anticuerpos mejorados a la IL-17 humana aptos para uso en el tratamiento de artritis inflamatoria mediada por la IL-17. La invencion tambien proporciona una molecula de union a IL-17 para su uso en el tratamiento de la artritis inflamatoria que comprende los dominios variables de cadena ligera (Vl) y de cadena pesada (Vh); dicha molecula de union de IL-17 comprende por lo menos un sitio de union a antigeno que comprende:

a) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (Vh) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3, dicho CDR1 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:1, dicho CDR2 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 2, y dicho CDR3 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 3 o equivalentes CDR directos de los mismos; y

b) un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1’, CDR2’ y CDR3’, dicho CDR1’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 4, dicho CDR2’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 5, y dicho CDR3’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 6 o los equivalentes CDR directos de los mismos.

La invencion tambien proporciona una molecula de union de IL-17 para uso en el tratamiento de artritis inflamatoria que comprende los dominios variables de cadena ligera (Vl) y de cadena pesada (Vh); dicha molecula de union de IL-17 comprende por lo menos un sitio de union a antigeno que comprende:

a) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (Vh) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1- x, CDR2-x y CDR3-x, dicho CDR1-x que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 11, dicho CDR2-x tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 12, y dicho CDR3-x tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 13 o los equivalentes CDR-x directos de los mismos; y

b) un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1’, CDR2’ y CDR3’, dicho CDR1’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 4, dicho CDR2’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 5, y dicho CDR3’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 6 o los equivalentes CDR’ directos de los mismos.

A menos que se indique otra cosa, se describe aqui cualquier cadena de polipeptidos que tiene una secuencia de aminoacidos que parte en la extremidad del terminal N y que finaliza en la extremidad del terminal C. Cuando el sitio de union a antigeno comprende los dominios VH y VL, estos se pueden ubicar en la misma molecula de polipeptidos, preferiblemente, cada dominio puede estar en una cadena diferente, el dominio VH es parte de una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma y el VL es parte de una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma.

"Molecula de union de IL-17" significa cualquier molecula capaz de unirse al antigeno IL-17 sola o asociada con otras moleculas. La reaccion de union se puede mostrar mediante metodos estandar (ensayos cualitativos) que incluyen, por ejemplo, un ensayo de union, ensayo de competicion o un bioensayo para determinar la inhibicion de la union de IL-17 a su receptor o cualquier clase de ensayo de union, con referencia a una prueba de control negativa en la que se utiliza un anticuerpo de especificidad no relacionada pero del mismo isotipo, por ejemplo un anticuerpo anti-CD25 (vease tambien Ejemplo 1).

Ejemplos de moleculas de union a antigeno incluyen anticuerpos producidos por celulas B o hibridomas y anticuerpos humanos, de CDR injertados o quimericos o cualquier fragmento de los mismos, por ejemplo fragmentos F(ab’)2 y Fab, asi como tambien anticuerpos de dominio unico o de cadena sencilla.

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Un anticuerpo de cadena sencilla consiste de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo unido covalentemente mediante un ligador de peptido que consiste usualmente de 10 a 30 aminoacidos, preferiblemente de 15 a 25 aminoacidos. Por lo tanto, tal una estructura no incluye la parte constante de las cadenas pesada y ligera y se considera que el separador pequeno de peptidos debe ser menos antigenico que una parte constante completa. "Anticuerpo quimerico" significa un anticuerpo en el que las regiones constantes de cadenas pesada y ligera o ambas son de origen humano mientras que los dominios variables de las cadenas pesada y ligera son de origen no humano (por ejemplo de murino) o de origen humano pero derivado de un anticuerpo humano diferente. "Anticuerpo injertado en CDR" significa un anticuerpo en el que las regiones hipervariables (CDR) se derivan de un anticuerpo donante, tal como un anticuerpo no humano (por ejemplo de murino) o un anticuerpo humano diferente, mientras que todas o sustancialmente todas las otras partes de la inmunoglobulina por ejemplo las regiones constantes y las partes altamente conservadas de los dominios variables, es decir las regiones estructurales, se derivan de un anticuerpo receptor, por ejemplo un anticuerpo de origen humano. Sin embargo un anticuerpo injertado a CDR puede contener unos pocos aminoacidos de la secuencia donante en las regiones estructurales, por ejemplo en las partes de las regiones estructurales adyacentes a las regiones hipervariables. "Anticuerpo humano" significa un anticuerpo en el que las regiones constantes y variables de las cadenas pesada y ligera son todas de origen humano, o sustancialmente identicas a las secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo e incluye los anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de la parte constante y variable de inmunoglobulina de murino se han reemplazado por sus contrapartes humanas, por ejemplo como se describe en terminos generales en la EP 0546073 B1, USP 5545806, USP 5569825, USP 5625126, USP 5633425, USP 5661016, USP 5770429, EP 0 438474 B1 y EP 0 463151 B1.

Las moleculas de union de IL-17 particularmente preferidas de la invencion son anticuerpos humanos, especialmente el anticuerpo AIN457 como se describe aqui adelante en los Ejemplos 1 y 2.

Asi en los anticuerpos quimericos preferidos los dominios variables de las cadenas pesada y ligera son de origen humano, por ejemplo aquellos del anticuerpo AIN457 que se muestran en la SEQ ID NO: 10 (= dominio variable de cadena ligera, es decir el aminoacido 1 a 109 de la SEQ ID NO: 10) y SEQ ID NO: 8 (= dominio variable de cadena pesada, es decir el aminoacido 1 a 127 de la SEQ ID NO: 8). Los dominios de region constante tambien comprenden preferiblemente dominios de region constante humana adecuados, por ejemplo como se describe en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E.A. et al, US Department of Health y Human Services, Public Health Service, National Institute of Health.

Las regiones hipervariables se pueden asociar con cualquier clase de regiones estructurales, aunque preferiblemente son de origen humano. Las regiones estructurales adecuadas se describen en Kabat E.A. et al, ibid. La estructura de cadena pesada preferida es una estructura de cadena pesada humana, por ejemplo aquel del anticuerpo AIN457. Este consiste de la secuencia por ejemplo de las regiones FR1 (aminoacido 1 a 30 de la SEQ ID NO: 8), FR2 (aminoacido 36 a 49 de la SEQ ID NO: 8), FR3 (aminoacido 67 a 98 de la SEQ ID NO: 8) y FR4 (aminoacido 117 a 127 de la SEQ ID NO: 8). Tomando en consideracion las regiones hipervariables determinadas de AIN457 mediante analisis de rayos X, otra estructura de cadena pesada preferido consiste en la secuencia de las regiones FR1-x (aminoacido 1 a 25 de la SEQ ID NO: 8), FR2-x (aminoacido 36 a 49 de la SEQ ID NO: 8), FR3-x (aminoacido 61 a 95 de la SEQ ID NO: 8) y FR4 (aminoacido 119 a 127 de la SEQ ID NO: 8). En una forma similar, la estructura de cadena ligera consiste, en la secuencia, de las regiones FR1 ’ (aminoacido 1 a 23 de la SEQ ID NO: 10), FR2’ (aminoacido 36 a 50 de la SEQ ID NO: 10), FR3’ (aminoacido 58 a 89 de la SEQ ID NO: 10) y FR4’ (aminoacido 99 a 109 de la SEQ ID NO: 10).

De acuerdo con lo anterior, la invencion tambien proporciona una molecula de union de IL-17 para uso en el tratamiento de artritir inflamatoria que comprende por lo menos un sitio de union a antigeno que comprende un primer dominio que tiene una secuencia de aminoacidos sustancialmente identica a aquella mostrada en SEQ ID NO: 8 que inicia con el aminoacido en la posicion 1 y termina con el aminoacido en la posicion 127 o un primer dominio como se describio anteriormente y un segundo dominio que tiene una secuencia de aminoacidos sustancialmente identica a aquella mostrada en SEQ ID NO: 10, que inicia con el aminoacido en la posicion 1 y termina con el aminoacido en la posicion 109.

Los anticuerpos monoclonales que surgen contra una proteina encontrada en forma natural en todos los humanos se desarrollan tipicamente en un sistema no humano por ejemplo en ratones, y como tales son proteinas tipicamente no humanas. Como una consecuencia directa de esto, un anticuerpo xenogenico producido por un hibridoma, cuando se administra a los humanos, provoca una respuesta inmune indeseable que esta mediada predominantemente por la parte constante de la inmunoglobulina xenogenica. Esto claramente limita el uso de tales anticuerpos ya que ellos no se pueden administrar durante un periodo prolongado. Por lo tanto se prefiere utilizar particularmente anticuerpos humanos de cadena sencilla, de dominio unico, quimericos, o injertados en CDR, o especialmente anticuerpos humanos que probablemente no provocan una respuesta alogenica sustancial cuando se administran a los humanos.

En vista de lo anterior, se selecciona una molecula de union de IL-17 mas preferida para uso en el tratamiento de artritir inflamatoria a partir de un anticuerpo anti IL-17 humano que comprende por lo menos

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a) una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3 o equivalentes CDR directos de las mismas y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena pesada humana; dicho CDR1 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1, dicho CDR2 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 2, y dicho CDR3 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 3; y

b) una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables y opcionalmente tambien las regiones hipervariables CDR1’, CDR2’, y CDR3’ o los equivalentes CDR directos de las mismas y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana, dicho CDR1’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 4, dicho CDR2’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 5, y dicho CDR3’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 6.

Alternativamente, una molecula de union de IL-17 para uso en el tratamiento de artritir inflamatoria se puede seleccionar de una molecula de union de cadena sencilla que comprende un sitio de union a antigeno que comprende

a) un primer dominio que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3 o equivalentes CDR directos de las mismas, dicho CDR1 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1, dicho CDR2 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 2, y dicho CDR3 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 3; y

b) un segundo dominio que comprende las regiones hipervariables CDR1’, CDR2’ y CDR3’ o los equivalentes CDR directos de las mismas, dicho CDR1’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 4, dicho CDR2’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 5, y dicho CDR3’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 6; y

c) un ligador de peptido que se une a la extremidad de terminal N del primer dominio y a la extremidad de terminal C del segundo dominio o a la extremidad de terminal C del primer dominio y a la extremidad de terminal N del segundo dominio.

Como es bien sabido, los cambios menores en una secuencia de aminoacido tal como eliminacion, adicion o sustitucion de uno, unos pocos o aun varios aminoacidos puede conducir a una forma alelica de la proteina original que tiene propiedades sustancialmente identicas.

Asi, el termino "equivalentes CDR directos de los mismos" significa moleculas de union de IL-17 que comprenden en secuencia las regiones hipervariables CDR1 i, CDR2i, y CDR3i, (en lugar de CDR1, CDR2, y CDR3), en donde

(i) la region hipervariable CDR1i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable CDR1 como se muestra en la SEQ ID NO: 1; y

(ii) la region hipervariable CDR2i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable CDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 2; y

(iii) la region hipervariable CDR3i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable CDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 3; y

(iv) tal una molecula que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1i, CDR2i, y CDR3i es capaz de inhibir la actividad de la IL-7 humana 1 nM (= 30 ng/ml) en una concentracion de 50 nM, preferiblemente 20 nM, mas preferiblemente 10 nM, mas preferiblemente 5 nM de dicha molecula al 50%, dicha actividad de inhibicion se mide en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana.

De forma similar, el termino "equivalentes CDR-x directos de los mismos" significa moleculas de union de IL-17 que comprenden en secuencia las regiones hipervariables CDR1i-x, CDR2i-x, y CDR3i-x, (en lugar de CDR1-x, CDR2-x, y cDr3-x), en donde

(v) la region hipervariable CDR1i-x difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable CDR1 -x como se muestra en la SEQ ID NO: 11; y

(vi) la region hipervariable CDR2i-x difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable CDR2-x como se muestra en la SEQ ID NO: 12; y

(vii) la region hipervariable CDR3i-x difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable CDR3-x como se muestra en la SEQ ID NO: 13; y

(viii) tal una molecula que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1i-x, CDR2i-x, y CDR3i-x es capaz de inhibir la actividad de IL-17 humana 1nM (= 30 ng/ml) en una concentracion de 50 nM, preferiblemente 20 nM, mas preferiblemente 10 nM, mas preferiblemente 5 nM de dicha molecula al 50%, dicha actividad de inhibicion se mide en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana.

De forma similar, el termino "equivalentes CDR’ directos de los mismos" significa un dominio que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1’i, CDR2’i, y CDR3’i, en donde

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(i) la region hipervariable CDRI’i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable CDR1 ’ como se muestra en la SEQ ID NO: 4; y

(ii) la region hipervariable CDR2’i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable CDR2’ como se muestra en la SEQ ID NO: 5; y

5 (iii) la region hipervariable CDR3’i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable CDR3’ como se muestra en la SEQ ID NO: 6; y

(iv) tal una molecula que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1’i, CDR2’i, y CDR3’i es capaz de inhibir la actividad de IL-17 humana 1nM (= 30 ng/ml) en una concentracion de 50 nM, preferiblemente 20nM, mas preferiblemente 10 nM, mas preferiblemente 5 nM de dicha molecula al 50%, dicha actividad de inhibicion se mide 10 en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana.

Alternativamente, una molecula de union de IL-17 puede ser una molecula de union de IL-17 que comprende por lo menos un sitio de union a antigeno que comprende por lo menos un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (Vh) que comprende en la secuencia

a) regiones hipervariables CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2) y CDR3 (SEQ ID NO: 3); o

15 b) regiones hipervariables CDR1i, CDR2i, CDR3i, dicha region hipervariable CDR1i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR1 como se muestra en la SEQ ID NO: 1, dicha region hipervariable CDR2i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 2; y dicha region hipervariable CDR3i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR3 como se muestra en la 20 SEQ ID NO: 3; y

dicha molecula de union de IL-17 que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1x, CDR2x, y CDR3x es capaz de inhibir la actividad de IL-17 humana 1nM (= 30 ng/ml) en una concentracion de 50 nM, preferiblemente 20nM, mas preferiblemente 10 nM, mas preferiblemente 5 nM de dicha molecula al 50%, dicha actividad de inhibicion se mide en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana.

25 De forma similar, una molecula de union de IL-17 para uso en el tratamiento de artritir inflamatoria puede ser una molecula de union de IL-17 que comprende por lo menos un sitio de union a antigeno que comprende por lo menos un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (Vh) que comprende en secuencia

a) regiones hipervariables CDR1 -x (SEQ ID NO: 11), CDR2-x (SEQ ID NO: 12) y CDR3-x (SEQ ID NO: 13); o

b) regiones hipervariables CDR1i-x, CDR2i-x, CDR3i-x, dicha region hipervariable CDR1i-x difiere por 3, 30 preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR1-x como se muestra en la

SEQ ID NO: 11, dicha region hipervariable CDR2i-x difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR2-x como se muestra en la SEQ ID NO: 12; y dicha region hipervariable CDR3i-x difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR3-x como se muestra en la SEQ ID NO: 13; y dicha molecula de union de IL-17 que comprende en secuencia 35 las regiones hipervariables CDR1 i-x, CDR2i-x, y CDR3i-x es capaz de inhibir la actividad de IL-17 humana 1nM (= 30 ng/ml) en una concentracion de 50 nM, preferiblemente 20 nM, mas preferiblemente 10 nM, mas preferiblemente 5 nM de dicha molecula al 50%, dicha actividad de inhibicion se mide en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana.

De forma similar, una molecula de union de IL-17 para uso en el tratamiento de artritir inflamatoria puede ser una 40 molecula de union de IL-17 que comprende por lo menos un sitio de union a antigeno que comprende por lo menos un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl) que comprende en secuencia

a) regiones hipervariables CDR’1 (SEQ ID NO: 4), CDR’2 (SEQ ID NO: 5) y CDR’3 (SEQ ID NO: 6); o

b) regiones hipervariables CDR1’i, CDR2’i, CDR3’i, dicha region hipervariable CDR’1i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR’1 como se muestra en la SEQ ID NO: 4,

45 dicha region hipervariable CDR’2i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR’2 como se muestra en la SEQ ID NO: 5; y dicha region hipervariable CDR’3i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR’3 como se muestra en la SEQ ID NO: 6; y dicha molecula de union de IL-17 comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR’1i, CDR’2i, y CDR’3i es capaz de inhibir la actividad de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/ml) en una concentracion de 50 nM, 50 preferiblemente 20nM, mas preferiblemente 10 nM, mas preferiblemente 5 nM de dicha molecula al 50%, dicha actividad de inhibicion se mide en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana.

Alternativamente, una molecula de union de IL-17 para uso en el tratamiento de artritir inflamatoria puede ser una molecula de union de IL-17 que comprende los dominios variables de cadena ligera (Vl) y de cadena pesada (Vh) y dicha molecula de union de IL-17 comprende por lo menos un sitio de union a antigeno que comprende:

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a) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (Vh) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2) y CdR3 (SEQ iD NO: 3); y un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1’ (SEQ ID NO: 4), CDR2’ (SEQ ID NO: 5) y CDR3’ (SEQ ID NO: 6); o

b) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (Vh) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1i, CDR2i, y CDR3i, dicha region hipervariable de las regiones hipervariables CDR1i, CDR2i, CDR3i, dicha region hipervariable CDR1i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR1 como se muestra en la SEQ ID NO: 1, dicha region hipervariable CDR2i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido (s) de la region hipervariable de CDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 2; y dicha region hipervariable CDR3i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 3; y

un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1’i, CDR2’i, CDR3’i, dicha region hipervariable CDR’1i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR’1 como se muestra en la SEQ ID NO: 4, dicha region hipervariable CDR’2i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR’2 como se muestra en la SEQ ID NO: 5; y dicha region hipervariable CDR’3i difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR’3 como se muestra en la SEQ ID NO: 6; y

dicha molecula de union de IL-17 definida en b) comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1i, CDR2i, CDR3i, CDR’1i, CDR’2i, y CDR’3i es capaz de inhibir la actividad de IL-17 humana 1nM (= 30 ng/ml) en una concentracion de 50 nM, preferiblemente 20nM, mas preferiblemente 10 nM, mas preferiblemente 5 nM de dicha molecula al 50%, dicha actividad de inhibicion se mide en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana.

Alternativamente, una molecula de union de IL-17 para uso en el tratamiento de artritir inflamatoria puede ser una molecula de union de IL-17 que comprende los dominios variables de cadena ligera (Vl) y de cadena pesada (Vh) y dicha molecula de union de lL-17 comprende por lo menos un sitio de union a antigeno que comprende:

a) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (Vh) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1- x (SEQ ID nO: 11), CDR2-x (SEQ ID NO: 12) y CDR3-x (SEQ ID NO: 13); y un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1’ (SEQ ID NO: 4), CDR2’ (SEQ ID NO: 5) y CDR3’ (SEQ ID NO: 6); o

b) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (Vh) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1i-x, CDR2i-x, y CDR3i-x, dicha region hipervariable de las regiones hipervariables CDR1i-x, CDR2i-x, CDR3i-x, dicha region hipervariable CDR1i-x difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR1-x como se muestra en la SEQ ID NO: 11, dicha region hipervariable CDR2i-x difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR2-x como se muestra en la SEQ ID NO: 12; y dicha region hipervariable CDR3i-x difiere por 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente 1 aminoacido de la region hipervariable de CDR3-x como se muestra en la SEQ ID NO: 13; y

El anticuerpo de union de IL-17 o fragmento del mismo para uso en el tratamiento de la artritis inflamatoria es un anticuerpo IgG1/K humano que comprende:

(a) una cadena ligera que consiste en los residuos de aminoacidos que comienzan en el residuo +1 de la Tabla 10

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EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSS

YLAWY QQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRF

SGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSS

PCTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK

SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS

GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYF

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC;

y

(b) una cadena pesada que comprende los residuos de aminoacidos que comienzan en el residuo +1 en la Tabla 11

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSN YWMNWVRQAPGKGLEWVAATNQDGSEKYYV GSVKGRFT1SRDNAKNSLY LQMNSLRVEDTA VYY CVRDYYDILTDYYIHYWYFDLWGRGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP.

La inhibicion de la union de IL-17 a su receptor se puede probar de forma conveniente en varios ensayos que incluyen tales ensayos que se describen aqui adelante en el texto. El termino "al mismo grado" significa aquella referencia y las moleculas equivalentes exhiben, sobre una base estadistica, actividad de inhibicion IL-17 esencialmente identica en uno de los ensayos referidos aqui (vease Ejemplo 1). Por ejemplo, las moleculas de union de IL-17 de la invencion tienen tipicamente IC50 para la inhibicion de la IL-17 humana en la produccion de IL-6 inducida por la IL-17 humana en fibroblastos de dermis humana que estan dentro de +/- x5, es decir por debajo de 10 nM, mas preferiblemente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 nM de aquellos de, preferiblemente sustancialmente los mismos que, el IC50 de la molecula de referencia correspondiente cuando se ensayan como se describe en el Ejemplo 1.

Alternativamente, el ensayo utilizado puede ser un ensayo de inhibicion competitiva de la union de IL-17 mediante receptores IL-17 solubles (por ejemplo las construcciones R/Fc de la IL-17 humana del Ejemplo 1) y la molecula de union de IL-17 de la invencion.

Mas preferiblemente, el anticuerpo IL-17 humana comprende por lo menos

a) una cadena pesada que comprende un dominio variable que tiene una secuencia de aminoacidos sustancialmente identica a aquella mostrada en SEQ ID NO: 8 que inicia con el aminoacido en la posicion 1 y termina con el aminoacido en la posicion 127 y la parte constante de una cadena pesada humana; y

b) una cadena ligera que comprende un dominio variable que tiene una secuencia de aminoacidos sustancialmente identica a aquella mostrada en SEQ ID NO: 10 que inicia con el aminoacido en la posicion 1 y termina con el aminoacido en la posicion 109 y la parte constante de una cadena ligera humana.

La parte constante de una cadena pesada humana puede ser del tipo y1 , Y2, y3, y4, M, a1, a2, 5 o £, preferiblemente del tipo y, mas preferiblemente del tipo y1, mientras que la parte constante de una cadena ligera humana puede ser del tipo k o A (que incluye los subtipos A1, A2 y A3) pero es preferiblemente del tipo k. Las secuencias de aminoacidos de todas estas partes constantes se dan en Kabat et al (supra).

Los conjugados de las moleculas de union de la invencion, por ejemplo conjugados de enzima o toxina o radioisotopo, tambien se incluyen dentro del alcance de la invencion.

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"Polipeptido", si no se especifica aqui de otra forma, incluye cualquier peptido o proteina que comprende los aminoacidos unidos uno al otro mediante enlaces de peptidos, que tienen una secuencia de aminoacidos que inician de la extremidad del terminal N y terminan en la extremidad del terminal C. Preferiblemente el polipeptido de la presente invencion es un anticuerpo monoclonal, se prefiere mas un anticuerpo monoclonal quimerico (tambien llamado injertado en V) o humanizado (tambien llamado injertado en CDR), mas preferido un anticuerpo completamente humano que se puede obtener por ejemplo mediante la tecnologia ilustrada en el Ejemplo 1. El anticuerpo monoclonal completamente humano o humanizado (injertado en CDR) puede o no puede incluir las mutaciones adicionales introducidas en las secuencias estructurales (FR) del anticuerpo receptor.

Un derivado funcional de un polipeptido como se utiliza aqui incluye una molecula que tiene una actividad biologica cualitativa en comun con un polipeptido para la presente invencion, es decir que tiene la capacidad de unirse a la IL- 17 humana. Un derivado funcional incluye fragmentos y analogos de peptidos de un polipeptido de acuerdo con la presente invencion. Los fragmentos comprenden regiones dentro de la secuencia de un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especifica. El termino "derivado" se utiliza para definir las variantes de la secuencia de aminoacido, y las modificaciones covalentes de un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especifica. Los derivados funcionales de un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especifica, por ejemplo de la region hipervariable de la cadena ligera y pesada, tienen preferiblemente por lo menos aproximadamente 65%, mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 75%, aun mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 85%, mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 95, 96, 97, 98, 99% de homologia de secuencia general con la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especifica, y retiene sustancialmente la capacidad de unirse a la IL-17 humana o por ejemplo neutraliza la produccion de IL-6 de los fibroblastos de dermis humana inducidos por IL-17.

El termino "modificacion covalente" incluye modificaciones de un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especifica; o un fragmento de la misma con un agente de derivacion proteinaceo o no proteinaceo organico, fusiones a las secuencias de polipeptido heterologo, y modificaciones post-traduccionales. Los polipeptidos modificados covalentemente, por ejemplo de una secuencia especifica, aun tienen la capacidad de unirse a la IL-17 humana o por ejemplo neutraliza la produccion de IL-6 de los fibroblastos de dermis humana inducidos por IL- 17 mediante entrecruzamiento. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente al hacer reaccionar los residuos de aminoacido dirigidos con un agente de derivacion organico que es capaz de hacer reaccionar con los lados seleccionados o los residuos terminales, o mediante mecanismos de aprovechamiento de las modificaciones post-traduccionales que funcionan en las celulas anfitrionas recombinantes seleccionadas. Ciertas modificaciones post-traduccionales son el resultado de la accion de las celulas anfitrionas recombinantes en el polipeptido expresado. Los residuos glutaminilo y asparaginilo son frecuentemente desamidados post- traduccionalmente en los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desaminan bajo condiciones ligeramente acidas. Otras modificaciones post-traduccionales incluyen hidroxilacion de prolina y lisina, fosforilacion de grupos hidroxilo de los residuos serilo, tirosina o treonilo, metilacion de los grupos a- amino de las cadenas laterales lisina, arginina, e histidina, vease por ejemplo T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983). Las modificaciones covalentes incluyen por ejemplo proteinas de fusion que comprenden un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especifica y sus variantes de secuencia de aminoacido, tal como inmunoadhesinas, y fusiones del terminal N para las secuencias de senal heterologas.

"Homologia" con respecto a un polipeptido nativo y su derivado funcional se define aqui como el porcentaje de residuos de aminoacido en la secuencia candidata que son identicos a los residuos de un polipeptido nativo correspondiente, despues de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para alcanzar el porcentaje de homologia maximo, y no considerar cualesquier sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Ni las extensiones de terminal N- o C ni las inserciones se deben interpretar como reduccion en la homologia o identidad. Son bien conocidos metodos y programas de ordenador para alineacion.

"Aminoacidos", se refiere a todos los aminoacidos L-a que se presentan en forma natural, por ejemplo y que incluyen los aminoacidos D. Los aminoacidos se identifican por sus designaciones bien conocidas de una letra o tres letras.

El termino "variante de secuencia de aminoacido" se refiere a moleculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoacidos cuando se compara con un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especifica. Las variantes de la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especifica, aun tienen la capacidad de unirse a la IL-17 humana o por ejemplo neutraliza la produccion de IL-6 de los fibroblastos de dermis humana inducidos por IL-17. Las variantes de sustitucion son aquellas que tienen por lo menos un residuo de aminoacido eliminado y un aminoacido diferente insertado en su lugar en la misma posicion en el polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especifica. Estas sustituciones pueden ser unicas, en donde solo ha sido sustituido un aminoacido en la molecula, o ellos pueden ser multiples, en donde se han sustituido dos o mas aminoacidos en la misma molecula. Las variantes de insercion son aquellas con uno o mas aminoacidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoacido en una posicion particular en un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especifica. Inmediatamente adyacente a un aminoacido significa conectado al grupo funcional a-carboxi o

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a-amino del aminoacido. Las variantes de eliminacion son aquellas con uno o mas aminoacidos en un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una secuencia especffica, retirada. De forma comun, las variantes de eliminacion tendran uno o dos aminoacidos eliminados en una region particular de la molecula.

Una molecula de union de IL-17 para uso en el tratamiento de artritis se puede producir mediante tecnicas de ADN recombinante. En vista de esto, se pueden construir una o mas moleculas de ADN que codifican las moleculas de union, colocadas bajo secuencias de control apropiadas y transferidas en un organismo anfitrion adecuado para expresion.

En una forma muy general, de acuerdo con lo anterior se proporcionan

(i) moleculas de ADN que codifican una molecula de union de IL-17 de dominio sencillo de la divulgacion, una molecula de union de IL-17 de cadena sencilla de la invencion, una molecula de union de IL-17 que comprende una cadena ligera y pesada como se define aquf, o fragmentos de una molecula de union de IL-17 de la invencion; y

(ii) el uso de las moleculas de ADN de la invencion para la produccion de una molecula de union de IL-17 de la invencion mediante medios recombinantes.

De acuerdo con lo anterior, la divulgacion proporciona una molecula de ADN que codifica una molecula de union de IL-17 como se describio anteriormente.

Adicionalmente, la invencion proporciona una construccion de ADN que comprende una molecula de ADN que es sustancialmente homologa a la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9.

Adicionalmente, la diculgacion proporciona una construccion de ADN que comprende dos moleculas de ADN de las cuales una es sustancialmente homologa a la SEQ ID NO: 7 o es un equivalente directo ADNH del mismo y la otra es sustancialmente homologa a la SEQ ID NO: 9, o es un equivalente ADNL directo del mismo.

El estado actual de la tecnica es tal que el trabajador experto es capaz de sintetizar las moleculas de ADN de la invencion dada la informacion proporcionada aquf es decir las secuencias de aminoacidos de las regiones hipervariables y las secuencias de ADN que las codifican. Un metodo para construir un gen de dominio variable se describe por ejemplo en la EPA 239 400 y se puede resumir brevemente como sigue: se clona un gen que codifica un dominio variable de un MAb de cualquier especificidad. Se determinan los segmentos de ADN que codifican la estructura y las regiones hipervariables y se retiran los segmentos de ADN que codifican las regiones hipervariables de tal manera que se fusionan los segmentos de ADN que codifican las regiones estructurales junto con los sitios de restriccion adecuados en las uniones. Los sitios de restriccion se pueden generar en las posiciones apropiadas mediante mutagenia de la molecula de ADN mediante procedimientos estandar. Los casetes de CDR sinteticos de doble hebra se preparan mediante sfntesis de ADN de acuerdo con las secuencias que codifican la SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2), SEQ ID NO: 3 (CDR3), SEQ ID NO: 4 (CDR1'), SEQ ID NO: 5 (CDR2'), SEQ ID NO: 6 (CDR6'), SEQ ID NO: 11 (CDR1-x), SEQ ID NO: 12 (CDR2-x), SEQ ID NO: 13 (CDR3-x). Estos casetes se proporcionan con extremos pegajosos ya que ellos se pueden ligar en las uniones del soporte.

Adicionalmente, no es necesario tener acceso al mARN de una produccion de estirpes de celulas de hibridoma con el fin de obtener una construccion de ADN que codifica las moleculas de union de IL-17 de la invencion. Asf la solicitud PCT WO 90/07861 da instrucciones completas para la produccion de un anticuerpo mediante tecnicas de ADN recombinantes dada solo la informacion escrita como la secuencia de nucleotido del gen. El metodo comprende la sfntesis de un numero de los oligonucleotidos, su amplificacion mediante el metodo PCR, y su empalme para dar la secuencia de ADN deseada.

Los vectores de expresion que comprenden un promotor adecuado o genes que codifican partes constantes de cadena ligera y pesada estan publicamente disponibles. Asf, una vez se prepara una molecula de ADN de la invencion esta se puede transferir de manera conveniente a un vector de expresion apropiado. Las moleculas de ADN que codifican los anticuerpos de cadena sencilla tambien se pueden preparar mediante metodos estandar, por ejemplo, como se describe en la WO 88/1649.

En analogfa al caso de los equivalentes CDR, el termino "equivalentes ADNh directos de los mismos" significa que representa una primera construccion de ADN que codifica una cadena pesada o fragmento de la misma de una molecula de union de IL-17 de la invencion y comprende:

a) una primera parte que codifica un dominio variable que comprende alternativamente la estructura y las regiones hipervariables, dichas regiones hipervariables estan en la secuencia CDR1i, CDR2i y CDR3i, dicho CDR1i es por lo menos 50% homologa, preferiblemente por lo menos 60, 70, 80, 85, o 90% homologa, mas preferiblemente por lo menos 95% homologa a la region hipervariable CDR1 como se muestra en la SEQ ID NO: 1, dicho CDR2i es por lo menos 50% homologa, preferiblemente por lo menos 60, 70, 80, 85, o 90% homologa, mas preferiblemente por lo menos 95% homologa a la region hipervariable CDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 2, y CDR3i es por lo menos 50% homologa, preferiblemente por lo menos 60, 70, 80, 85, o 90% homologa, mas preferiblemente por lo menos 95% homologa a la region hipervariable CDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 3; esta primera parte

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empieza en un codon que codifica el primer aminoacido del dominio variable y termina con un codon que codifica el ultimo aminoacido del dominio variable; y

b) una segunda parte que codifica una parte constante de cadena pesada o fragmento de la misma que inicia con un codon que codifica el primer aminoacido de la parte constante de la cadena pesada y finaliza con un codon que codifica el ultimo aminoacido de la parte constante o fragmento de la misma, seguido por un codon de parada; y

c) dicha construccion de ADN que codifica un polipeptido que es capaz solo o en combinacion con otro polipeptido de inhibir la actividad de la IL-7 humana 1 nM (= 30 ng/ml) en una concentracion de 50 nM, preferiblemente 20 nM, mas preferiblemente 10 nM, mas preferiblemente 5 nM de dicha molecula al 50%, dicha actividad de inhibicion se mide en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana.

De forma similar, el termino "equivalentes ADNh-x directos de los mismos" significa que representa en una primera construccion de ADN alternativa que codifica una cadena pesada o fragmento de la misma de una molecula de union de IL-17 de la invencion y comprende:

a) una primera parte que codifica un dominio variable comprende alternativamente la estructura y las regiones hipervariables, dichas regiones hipervariables estan en la secuencia CDR1i-x, CDR2i-x y CDR3i-x, dicho CDR1i-x es por lo menos 50% homologa, preferiblemente por lo menos 60, 70, 80, 85, o 90% homologa, mas preferiblemente por lo menos 95% homologa a la region hipervariable CDR1 como se muestra en la SEQ ID NO: 11, dicho CDR2i-x es por lo menos 50% homologa, preferiblemente por lo menos 60, 70, 80, 85, o 90% homologa, mas preferiblemente por lo menos 95% homologa a la region hipervariable CDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 12, y CDR3i-x es por lo menos 50% homologa, preferiblemente por lo menos 60, 70, 80, 85, o 90% homologa, mas preferiblemente por lo menos 95% homologa a la region hipervariable CDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 13; esta primera parte empieza en un codon que codifica el primer aminoacido del dominio variable y termina con un codon que codifica el ultimo aminoacido del dominio variable; y

b) una segunda parte que codifica una parte constante de cadena pesada o fragmento de la misma que inicia con un codon que codifica el primer aminoacido de la parte constante de la cadena pesada y finaliza con un codon que codifica el ultimo aminoacido de la parte constante o fragmento del mismo, seguido por un codon de parada; y

Preferiblemente, estas construcciones de ADN codifican un dominio variable que comprende alternativamente la estructura y las regiones hipervariables, dichas regiones hipervariables estan en la secuencia CDR1, CDR2 y CDR3, dicho CDR1 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1, dicho CDR2 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 2, y dicho CDR3 tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 3. Mas preferiblemente, estas construcciones de ADN codifican un dominio variable que comprende alternativamente la estructura y las regiones hipervariables, dichas regiones hipervariables estan en la secuencia CDR1 -x, CDR2-x y CDR3-X, dicho CDR1 -x que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 11, dicho CDR2-X tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 12, y dicho CDR3-X tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 13. Mas preferiblemente, esta primera parte codifica un dominio variable que tiene una secuencia de aminoacidos sustancialmente identica a la secuencia de aminoacidos como se muestra en la SEQ ID NO: 8 que inicia con el aminoacido en la posicion 1 y termina con el aminoacido en la posicion 127. Mas preferiblemente la primera parte tiene la secuencia de nucleotido como se muestra en la SEQ ID NO: 7 partiendo con el nucleotido en la posicion 1 y finalizando con el nucleotido en la posicion 381. Tambien preferiblemente, la segunda parte codifica la parte constante de una cadena pesada humana, mas preferiblemente la parte constante de la cadena humana y1 . Esta segunda parte puede ser un fragmento de ADN de origen genomico (que comprende intrones) o un fragmento de cADN (sin intrones).

De forma similar, el termino "equivalentes directos de ADNl de los mismos’ significa que representa para una segunda construccion de ADN que codifica una cadena ligera o fragmento de la misma de una molecula de union de IL-17 de la invencion y comprende:

a) una primera parte que codifica un dominio variable que comprende alternativamente la estructura y regiones hipervariables; dichas regiones hipervariables son CDR3i’ y opcionalmente CDR1i’ y CDR2i’, dicho CDR1i’ es por lo menos 50% homologa, preferiblemente por lo menos 60, 70, 80, 85, o 90% homologa, mas preferiblemente por lo menos 95% homologa a la region hipervariable CDR1’ como se muestra en la SEQ ID NO: 4, dicho CDR2i’ es por lo menos 50% homologa, preferiblemente por lo menos 60, 70, 80, 85, o 90% homologa, mas preferiblemente por lo menos 95% homologa a la region hipervariable CDR2’ como se muestra en la SEQ ID NO: 5, y dicho CDR3i’ es por lo menos 50% homologa, preferiblemente por lo menos 60, 70, 80, 85, o 90% homologa, mas preferiblemente por lo menos 95% homologa a la region hipervariable CDR3’ como se muestra en la SEQ ID NO: 6; esta primera parte empieza en un codon que codifica el primer aminoacido del dominio variable y termina con un codon que codifica el ultimo aminoacido del dominio variable; y

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b) una segunda parte que codifica la parte constante de la cadena ligera o fragmento del mismo que inicia con un codon que codifica el primer aminoacido de la parte constante de la cadena ligera y finaliza con un codon que codifica el ultimo aminoacido de la parte constante o fragmento del mismo seguido por un codon de parada; y

c) dicha construccion de ADN que codifica un polipeptido que es capaz solo o en combinacion con otro polipeptido de inhibir la actividad de la IL-7 humana 1 nM (= 30 ng/ml) en una concentracion de 50 nM, preferiblemente 20nM, mas preferiblemente 10 nM, mas preferiblemente 5 nM de dicha molecula al 50%, dicha actividad de inhibicion se mide en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana.

Preferiblemente, esta segunda construccion de ADN codifica un dominio variable que comprende alternativamente la estructura y regiones hipervariables, dichas regiones hipervariables estan en la secuencia CDR1’, CDR2’ y CDR3’, dicho CDR1 ’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 4, dicho CDR2’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 5, y dicho CDR3’ tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 6. Mas preferiblemente, esta primera parte de la segunda construccion de ADN codifica un dominio variable que tiene una secuencia de aminoacidos sustancialmente identica a la secuencia de aminoacidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10 que inicia con el aminoacido en la posicion 1 y termina con el aminoacido en la posicion 109. Mas preferiblemente, la primera parte tiene la secuencia de nucleotido como se muestra en la SEQ ID NO: 9 partiendo con el nucleotido en la posicion 1 y finalizando con el nucleotido en la posicion 327. Tambien preferiblemente la segunda parte codifica la parte constante de una cadena ligera humana, mas preferiblemente la parte constante de la k humana.

Preferiblemente, se utilizaran la primera y segunda construccion de ADN, pero tambien se pueden utilizar por separado.

La invencion tambien incluye las moleculas de union de IL-17 en las que uno o mas de los residuos de aminoacido de CDR1, CDR2, CDR3, CDR1-x, CDR2-x, CDR3-x, CDR1’, CDR2’ o CDR3’ o los soportes, tipicamente solo unos pocos (por ejemplo 1-4), se cambian; por ejemplo mediante mutacion por ejemplo mutagenia dirigida a sitio de las secuencias de ADN correspondientes. La invencion incluye las secuencias de ADN que codifican tales moleculas de union de IL-17 cambiadas. En particular la invencion incluye las moleculas de union a IL- 17 en las que uno o mas residuos de CDR1 ’ o CDR2’ se han cambiado de los residuos mostrados en la SEQ ID NO: 4 (para CDR1 ’) y SEQ ID NO: 5 (para CDR2’).

En la primera y segunda construcciones de ADN, la primera y segunda partes se pueden separar mediante un intron, y, un mejorador se puede ubicar de forma conveniente en el intron entre la primera y segunda partes. La presencia de tal un mejorador que se transcribe pero no se traduce, puede ayudar a la transcripcion eficiente. En realizaciones particulares la primera y la segunda construcciones de ADN comprenden el mejorador de un gen de cadena pesada ventajosamente de origen humano.

Cada una de las construcciones de ADN se pone bajo el control de las secuencias de control adecuadas, en particular bajo el control de un promotor adecuado. Se puede utilizar cualquier clase de promotor, dado que este se adapta al organismo anfitrion en el que se transferiran las construcciones de ADN para expresion.

El anticuerpo deseado se puede producir en un cultivo celular o en un animal transgenico. Se puede obtener un animal transgenico adecuado de acuerdo con metodos estandar que incluyen microinyectar en los huevos la primera y la segunda construcciones de ADN puestas bajo las secuencias de control adecuadas que transfieren los huevos asi preparados en las hembras seudoprenadas y seleccionar un descendiente que expresa el anticuerpo deseado.

Cuando se producen cadenas de anticuerpo en un cultivo celular, las construcciones de ADN primero se pueden insertar en un unico vector de expresion o en dos vectores de expresion separados pero compatibles, el ultimo siendo posiblemente preferido.

De acuerdo con lo anterior, la invencion tambien proporciona un vector de expresion capaz de replicacion en una estirpe celular procariotica o eucariotica que comprende por lo menos una de las construcciones de ADN descritas anteriormente.

Cada vector de expresion que contiene una construccion de ADN luego se transfiere a un organismo anfitrion adecuado. Cuando las construcciones de ADN se insertan de forma separada en dos vectores de expresion, se pueden transferir de forma separada, es decir un tipo de vector por celula, o se co-transfieren, se prefiere esta ultima posibilidad. Un organismo anfitrion adecuado puede ser una bacteria, una levadura o una estirpe celular de mamifero, se prefiere esta ultima. Mas preferiblemente, la estirpe celular de mamifero es de origen linfoide, por ejemplo un mieloma, hibridoma o una celula B inmortalizada normal, que no expresa de manera conveniente ningun anticuerpo endogeno de cadena ligera o pesada.

Para la expresion en celulas de mamifero se prefiere que la secuencia codificante de la molecula de union de IL-17 se integre en el ADN de la celula anfitriona dentro de un locus que permite o favorece un alto nivel de expresion de la molecula de union de IL-17. Las celulas en las que la molecula de union de IL-17 codifica las secuencias que se integran en tal locus favorable se pueden identificar y seleccionar sobre la base de los niveles de la molecula de union de IL-17 que ellos expresan. Se puede utilizar cualquier marcador seleccionable adecuado para la preparacion

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de las celulas anfitrionas que contienen la secuencia que codifica la molecula de union de IL-17; por ejemplo, un gen dhfr /metotrexato o se puede utilizar el sistema de seleccion equivalente. Los sistemas alternativos para la expresion de las moleculas de union de IL-17 de la invencion incluyen sistemas de amplificacion/seleccion basados en GS, tal como aquellos descritos en la EP 0256055 B, EP 0323997 B y la solicitud de patente Europea 89303964.4.

En un aspecto adicional de la invencion se proporciona un proceso para la produccion de una molecula de union de IL-17 que comprende (i) cultivar un organismo que se transforma con un vector de expresion como se definio anteriormente y (ii) recuperar la molecula de union de IL-17 del cultivo.

Para los propositos de la presente descripcion un anticuerpo es "capaz de inhibir la union de IL-17 como AIN457" si el anticuerpo es capaz de inhibir la union de IL-17 a su receptor sustancialmente al mismo grado que el anticuerpo AIN457, en donde "al mismo grado" tiene el significado como se definio anteriormente.

El anticuerpo AIN457 tiene afinidad de union al IL-17 que es mayor que las afinidades previamente reportadas para los anticuerpos anti- IL-17, en particular a cualesquier anticuerpos anti IL-17 humanas. Asi el AIN457 tiene una constante de equilibrio de disociacion KD para la union a IL-17 de aproximadamente 0.188 ± 0.036 nM (determinado por BIAcore, por ejemplo como se muestra en el Ejemplo 2). Esta alta afinidad de union hace el anticuerpo AIN457 particularmente adecuado para aplicaciones terapeuticas.

En la presente descripcion la frase "enfermedad mediada por Il-17" abarca todas las enfermedades y afecciones medicas en las que el IL-17 cumple una funcion, directamente o indirectamente, en la enfermedad o afeccion medica, que incluye el origen, desarrollo, progreso, persistencia o patologia de la enfermedad o afeccion.

En la presente descripcion los terminos "tratamiento" o "tratar" se refieren a tratamiento profilactico o preventivo asi como tambien tratamiento que modifica la enfermedad o tratamiento curativo, que incluye el tratamiento del paciente en riesgo de contraer la enfermedad o se sospecha de haber contraido la enfermedad asi como tambien pacientes que estan enfermos o que se han diagnosticado que sufren de una enfermedad o afeccion medica, e incluye supresion de la recaida clinica.

Las moleculas de union de IL-17 como se definio anteriormente tienen especificidad de union para la IL-17 humana, en particular anticuerpos que son capaces de inhibir la union de IL-17 a su receptor; y anticuerpos para IL-17 que son capaces de inhibir la actividad de la IL-7 humana 1 nM (= 30 ng/ml) en una concentracion de 50 nM, preferiblemente 20nM, mas preferiblemente 10 nM, mas preferiblemente 5 nM de dicha molecula al 50%, dicha actividad de inhibicion se mide en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana, se denominan aqui como los anticuerpos de la invencion.

Preferiblemente los anticuerpos de la divulgacion son anticuerpos humanos, mas preferiblemente el anticuerpo AIN457 o los equivalentes directos de los mismos.

Los anticuerpos de la divulgacion bloquean los efectos de IL-17 en sus celulas objetivo y de esta manera son indicados para uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por IL-17. Estas y otras actividades farmacologicas de los anticuerpos de la invencion se pueden demostrar en metodos de prueba estandar por ejemplo como se describe adelante:

Neutralizacion de la produccion dependiente de IL-17 de interleuquina-6 mediante fibroblastos humanos primarios: La produccion de IL-6 en fibroblastos primarios humanos (dermicos) es dependiente de IL-17 (Hwang SY et al., (2004) Artritis Res Ther; 6:R120-128.

En resumen, se estimulan fibroblastos de dermis humana con el IL-17 recombinante en la presencia de varias concentraciones del Anticuerpo de la invencion o el receptor de la IL-17 humana con la parte Fc. El anticuerpo anti- CD25 quimerico Simulect® (basiliximab) se utiliza como un control negativo. El sobrenadante se toma despues de 16 h de estimulacion y se evalua para IL-6 mediante ELISA. Los anticuerpos de la invencion tienen tipicamente IC50 para la inhibicion de la produccion de IL-6 (en la presencia de la IL-17 humana 1nM) de aproximadamente 50 nM o menos (por ejemplo de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50 nM) cuando se prueba como se hizo anteriormente, es decir dicha actividad de inhibicion se mide en la produccion de IL-6 inducida por hu-IL-17 en fibroblastos de dermis humana. Preferiblemente, los Anticuerpos de la invencion tienen un IC50 para la inhibicion de la produccion de IL-6 como se definio anteriormente de aproximadamente 20 nM o menos, mas preferiblemente de aproximadamente 10 nM o menos, mas preferiblemente de aproximadamente 5 nM o menos, mas preferiblemente de aproximadamente 2 nM o menos, mas preferiblemente de aproximadamente 1 nM o menos.

Como se indico en el ensayo anterior los Anticuerpos de la invencion bloquean potencialmente los efectos de IL-17. De acuerdo con lo anterior, los Anticuerpos de la invencion tienen utilidad farmaceutica como sigue:

Los anticuerpos de la divulgacion son utiles en la profilaxis y el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-17 o afecciones medicas, por ejemplo afecciones inflamatorias, alergias y afecciones alergicas, reacciones de hipersensibilidad, enfermedades autoinmunes, infecciones severas, y rechazo de trasplante de tejido u organo.

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Por ejemplo, los Anticuerpos de la divulgacion se pueden utilizar para el tratamiento de receptores de trasplantes de corazon, pulmon, trasplantes combinados de corazon-pulmon, higado, rinon, trasplantes pancreaticos, trasplantes de piel o cornea, que incluyen rechazo de aloinjerto o rechazo de xenoinjerto, y para la prevencion de enfermedad de injerto-versus-anfitrion, tal como luego de trasplante de medula osea, y trasplante de organo asociado a arteriosclerosis.

Los anticuerpos de la divulgacion son particularmente utiles para el tratamiento, prevencion, o alivio de enfermedad autoinmune y de afecciones inflamatorias, en particular afecciones inflamatorias con una etiologia que incluye un componente autoinmune tal como artritis (por ejemplo artritis reumatoide, artritis cronica progrediente y artritis deformante) y enfermedades reumaticas, que incluyen afecciones inflamatorias y enfermedades reumaticas que involucran perdida osea, dolor inflamatorio, espondiloartropatias que incluyen espondiilitis anquilosante, sindrome de Reiter, artritis reactiva, artritis soriatica, y artritis enteropatica, hipersensibilidad (que incluye hipersensibilidad de las vias respiratorias e hipersensibilidad dermica) y alergias. Las enfermedades auto-inmunes especificas para las que se pueden emplear los Anticuerpos de la invencion incluyen trastornos hematologicos autoinmunes (que incluyen por ejemplo anemia hemolitica, anemia aplasica, anemia de globulo rojo puro y trombocitopenia idiopatica), lupus sistemico eritematoso, trastornos inflamatorios del musculo, policondritis, escleroderma, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis cronica activa, miastenia gravis, soriasis, sindrome de Steven-Johnson, sprue idiopatico, enfermedad autoinmune inflamatoria del intestino (que incluye por ejemplo colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn y Sindrome de Intestino Irritable), oftalmopatia endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis multiple, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus tipo I), uveitis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis primaveral, fibrosis de pulmon intersticial, artritis soriatica y glomerulonefritis (con y sin sindrome nefrotico, por ejemplo que incluye sindrome nefrotico idiopatico o nefropatia de cambio minimo), tumores, esclerosis multiple, enfermedad inflamatoria de la piel y cornea, miositis, aflojamiento de implantes oseos, trastornos metabolicos, tal como aterosclerosis, diabetes, y dislipidemia.

Los Anticuerpos de la divulgacion tambien son utiles para el tratamiento, prevencion, o alivio de asma, bronquitis, neumoconiosis, enfisema pulmonar, y otras enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vias respiratorias.

Los Anticuerpos de la divulgacion son utiles para tratar reacciones inflamatorias hiperagudas y agudas indeseables que estan mediadas por IL-17 o implican la produccion de IL-17, o la promocion de TNF liberado por IL-17, por ejemplo infecciones agudas, por ejemplo choque septicemico (por ejemplo, choque endotoxico y sindrome de dificultad respiratoria de adultos), meningitis, neumonia; y quemaduras severas; y para el tratamiento de caquexia o sindrome consuntivo asociado con liberacion TNF morbida, a consecuencia de infeccion, cancer, o disfuncion de organo, especialmente caquexia relacionada con el SIDA, por ejemplo, asociada con o a consecuencia de infeccion por VIH.

Los Anticuerpos de la divulgacion son particularmente utiles para tratar enfermedades de metabolismo oseo que incluyen osteoartritis, osteoporosis y otras artritis inflamatorias, y perdida osea en general, que incluyen perdida osea relacionada con la edad, y en particular enfermedad periodontica.

Para estas indicaciones, la dosificacion apropiada, por supuesto, variara dependiendo de, por ejemplo, el Anticuerpo particular de la invencion que se va a emplear, el anfitrion, el modo de administracion y la naturaleza y severidad de la afeccion que se va a tratar. Sin embargo, en el uso profilactico, se indican de manera general los resultados satisfactorios que van a obtener en dosificaciones de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal, mas usualmente de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 5 mg por kilogramo de peso corporal. La frecuencia de dosificacion para usos profilacticos estara normalmente en el rango de aproximadamente una vez por semana hasta aproximadamente una vez cada 3 meses, mas usualmente en el rango de aproximadamente una vez cada 2 semanas hasta aproximadamente una vez cada 10 semanas, por ejemplo una vez cada 4 a 8 semanas. El anticuerpo de la invencion se administra de forma conveniente parenteralmente, intravenosamente, por ejemplo en la vena antecubital u otra vena periferica, intramuscularmente, o subcutaneamente. Un tratamiento profilactico comprende tipicamente administrar el Anticuerpo de la invencion una vez por mes a una vez cada 2 a 3 meses, o menos frecuentemente.

Los Anticuerpos de la divulgacion se pueden administrar como un unico ingrediente activo o en conjunto con, por ejemplo como un adyuvante para o en combinacion con, otros farmacos por ejemplo agentes inmunosupresores o agentes inmunomoduladores u otros agentes antiinflamatorios, por ejemplo para el tratamiento o prevencion de las enfermedades mencionadas anteriormente. Por ejemplo, los Anticuerpos de la invencion se pueden utilizar en combinacion con DMARD, por ejemplo sales de Gold, sulfasalazina, antimalarias, metotrexato, Dpenicilamina, azatioprina, acido micofenolico, ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, minociclina, leflunomida, glucocorticoides; un inhibidor de calcineurina, por ejemplo ciclosporina A o FK 506; un modulador de recirculacion de linfocitos, por ejemplo FTY720 y analogos FTY720; un inhibidor mTOR, por ejemplo rapamicina, 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, CCI779, ABT578, AP23573 o TAFA-93; una ascomicina que tiene propiedades inmuno-supresoras, por ejemplo ABT-281, ASM981, etc.; corticosteroides; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida; mizoribina; acido micofenolico; mico-feno-lato mofetilo; 15- desoxiespergualina o un homologo inmunosupresor, analogo o derivado de los mismos; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales para los receptores de leucocito, por ejemplo, MHC, CD2, cD3, CD4, CD7, CD8, cD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 o sus ligandos; otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo una molecula de union recombinante que

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tiene por lo menos una porcion del dominio extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma, por ejemplo por lo menos una porcion extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma unida a una secuencia de proteina diferente a CTLA4, por ejemplo CTLA4Ig (por ejemplo la designada por ATCC 68629) o un mutante de la misma, por ejemplo LEA29Y; inhibidores de molecula de adhesion, por ejemplo antagonistas LFA-1, antagonistas ICAM-1 o -3, antagonistas VCAM-4 o antagonistas VLA-4; o un agente quimioterapeutico, por ejemplo paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, doxorubicina o 5-fluorouracilo; agentes anti TNF, por ejemplo anticuerpos monoclonales para TNF, por ejemplo infliximab, adalimumab, CDP870, o construcciones del receptor para TNF-RI o TNF-RII, por ejemplo Etanercept, PEG-TNF-RI; bloqueadores de las citoquinas proinflamatorias, bloqueadores de IL- 1, por ejemplo Anakinra o IL-1 trap, AAL160, ACZ 885, bloqueadores de IL-6; bloqueadores de quimioquinas, por ejemplo inhibidores o activadores de proteasas, por ejemplo metaloproteasas, anticuerpos anti-lL-15, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-CD20, NSAID, tal como aspirina o un agente anti-infeccioso (la lista no se limita a los agentes mencionados).

De acuerdo con lo anterior la presente divulgacion proporciona en un aspecto aun adicional:

Un metodo como se definio anteriormente que comprende co-administracion, por ejemplo concomitantemente o en secuencia, de una cantidad terapeuticamente afectiva de una molecula de union de IL-17, por ejemplo un anticuerpo de la invencion, y por lo menos una segunda sustancia de farmaco, dicha segunda sustancia de farmaco es un inmuno-supresor / inmunomodulador, quimioterapeutico anti-inflamatorio o farmaco anti-infeccioso, por ejemplo como se indico anteriormente.

O, una combinacion terapeutica, por ejemplo un equipo, que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de a) una molecula de union de IL-17, por ejemplo un anticuerpo de la invencion, y b) por lo menos una segunda sustancia seleccionada de un inmuno-supresor / inmunomodulador, quimioterapeutico anti-inflamatorio o farmaco anti-infeccioso, por ejemplo como se indico anteriormente. El equipo puede comprender instrucciones para su administracion.

Cuando los Anticuerpos de la divulgacion se administran en conjunto con otros inmuno-supresores / inmunomoduladores, quimioterapeuticos anti-inflamatorios o terapia anti-infecciosa, las dosificaciones del compuesto de combinacion co-administrado variaran por supuesto dependiendo del tipo de co-farmaco empleado, por ejemplo si se trata de un DMARD, anti-TNF, bloqueador de IL-1 u otros, sobre el farmaco especifico empleado, sobre la afeccion que trata, etc.

Las composiciones farmaceuticas de la divulgacion se pueden fabricar de manera convencional. Una composicion de acuerdo con la divulgacion se proporciona preferiblemente en forma liofilizada. Para la administracion inmediata esta se disuelve en un portador acuoso adecuado, por ejemplo agua esteril para inyeccion o solucion salina fisiologica regulada esteril. Si se considera deseable hacer una solucion de mayor volumen para la administracion mediante infusion como una inyeccion de bolo, es ventajoso incorporar albumina de suero humano o la propia sangre heparinizada del paciente en la solucion salina al momento de la formulacion. Alternativamente, la formulacion se aplica subcutaneamente. La presencia de un exceso de tal proteina fisiologicamente inerte evita la perdida de anticuerpo mediante adsorcion en las pareces del contenedor y la tuberia utilizada con la solucion de infusion. Si se utiliza albumina, una concentracion adecuada es de 0.5 a 4.5% en peso de la solucion salina. Otras formulaciones comprenden formulacion liquida o liofilizada.

La invencion se describe adicionalmente por via de ilustracion en los siguientes Ejemplos.

Ejemplos

Se utilizan ratones transgenicos hechos mediante ingenieria para expresar el repertorio IgG/K humano en lugar del repertorio de inmunoglobulina de murino (Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol., 14, 845-851) para generar los anticuerpos en la IL-17 humana. Las celulas B de estos ratones se inmortalizan mediante tecnologia de hibridoma estandar y se obtienen celulas de hibridoma de murino que secretan el anticuerpo AIN457 IgG1/K humano.

Ejemplo 1: Generacion de hibridoma, purificacion de los anticuerpos, seleccion del anticuerpo AIN457

Produccion de la IL-17 humana recombinante (huIL-17): La huIL-17 recombinante se produce en E. coli en cuerpos de inclusion y se repliega mediante tecnicas convencionales (produccion propia libre de portador (E. coli; Novartis Pharma, lote BME3141/ 98) o compradas (libre de portador, E. coli; R&D Systems #317-IL/CF)) o cuando se secreta y glucosila parcialmente la proteina en HEK.EBNA (huIL-17 recombinante, libre de portador (IL-17 APP-C6 de celulas HEK/EBNA transfectadas; Novartis Pharma, lote En.E-3382/82; 0.28 mg/ml; huIL-17 recombinante, libre de portador (IL-17 APP-C4 de celulas HEK/EBNA transfectadas; Novartis Pharma, lote En.E-3382/83; 0.29 mg/ml)). Esta ultima forma tiene una extension de 4 aminoacidos en el terminal C para la purificacion rapida de los sobrenadantes del cultivo mediante cromatografia de inmunoafinidad. En este caso, se cargan sobrenadantes de cultivo en una columna de tamano apropiado de un anticuerpo anti-tag inmovilizado especifico acoplado a Sefarosa 4B activada CNBr en una densidad de 10 mg/ml de resina siguiendo las instrucciones del fabricante (Pharmacia). Despues de lavado inicial con PBS, se eluye la huIL-17 unida con glicina a 100 mM, pH 2.7 y se neutraliza inmediatamente con NaOH diluido.

Acoplamiento de huIL-17 a Hemocianina de Lapa Ojo de Cerradura (KLH): la HuIL-17 producida en E. coli o HEK.EBNA se acopla al KLH pre-activado con un exceso del entrecruzador homobifuncional de Suberato de disuccinimidilo (DSS). En resumen, se reconstituyen 20 mg de Imject® Mariculture KLH liofilizado (Pierce # 77600) con 2 ml de H2O para dar una solucion de 10 mg/ml que contiene Solucion Salina Regulada con Fosfato (PBS), pH 5 7.2. A esta solucion de 400 pl se agregan 250 mM de DSS en Sulfoxido de Dimetilo (DMSO) y la mezcla se agita

durante aproximadamente 1 hr a temperatura ambiente (no todo el reactivo se disuelve y se forma algun precipitado). Despues de una breve centrifugacion y filtracion (0.45 pm) la solucion se desaliniza luego en Sephadex G25 fino (Pharmacia) en PBS (indice de flujo 2 ml/min) produciendo aproximadamente 11 mg de KLH activado en 1.5 mg/ml (Bradford). Se mezcla 1 ml del KLH activado (1.5 mg) con 1 ml de una solucion de 9 mg/ml en agua de

10 huIL-17 derivado de E. coli liofilizado (lote BM-E3141/98). La solucion permanece clara y se incuba durante 2 hrs a temperatura ambiente. La concentracion del complejo resultante es 1.4 mg/ml (medida por Bradford). Se mezcla 1 ml del KLH activado (1.5 mg) con 1 ml de huIL-17 HEK.EBNA (aproximadamente 3 mg en agua; lote En.E-3382/83). La solucion permanece clara y se incuba durante 2 hrs a temperatura ambiente. La concentracion (Bradford) es 2.9 mg/ml.

15 Inmunizacion: Ratones modificados con ingenieria genetica 27340 (hembras; MEDAREX Inc, Annandale, NJ) en los que los genes de parte variable y constante de inmunoglobulina de murino se reemplazan funcionalmente por sus contrapartes humanas (codigo Genotype Tg 221100-TgH (CMD)++;TgN(Hco7)11952+; TgH(JKD)++;

TgN(KCO5)9272+ (vease tambien Sherie L. Morrison, 1994, Nature, Vol. 368, p. 812-813; Nils Lonberg et al., 1994, Nature, Vol. 368, p. 856-859) se inmunizan siguiendo el esquema reportado en la tabla 1.

20 Tabla 1. Calendario de Inmunizacion

Dia: Fecha Inmunogeno Dosis y ruta de inmunizacion

0: 07.06.01 HuIL-17 (BM-E3141/98) acoplado a KLH mezclado 1:1 con huIL-17 (BM-E3141/98) en adyuvante Gerbu 25 pg de cada inyeccion s.c. en dos puntos; volumen total/raton con adyuvante 100 pl

14: 21.06.01 (1er refuerzo) HuIL-17 (BM-E3141/98) acoplado a KLH mezclado 1:1 con huIL-17 (En.E-3382/83) acoplado a KLH en adyuvante Gerbu 25 pg de cada inyeccion s.c. en dos puntos; volumen total/raton con adyuvante 100 pl

28: 05.07.01 (2do refuerzo) HuIL-17 (BM-E3141/98) mezclado 1:1 con huIL-17 (En.E-3382/83) en adyuvante Gerbu 10 pg de cada inyeccion s.c. en dos puntos; volumen total/raton con adyuvante 100 pl

35: 12.07.01 Suero recolectado para ELISA

42: 19.07.01 (3er refuerzo) HuIL-17 (BM-E3141/98) mezclado 1:1 con huIL-17 (En.E-3382/83) acoplado a KLH en adyuvante Gerbu 20 pg de cada inyeccion s.c. en dos puntos; volumen total/raton con adyuvante 100 pl

63: 09.08.01 (4to refuerzo) HuIL-17 (BM-E3141/98) acoplado a KLH mezclado 1:1 con huIL-17 (En.E-3382/83) acoplado a KLH en adyuvante Gerbu 20 pg de cada inyeccion s.c. en dos puntos; volumen total/raton con adyuvante 100 pl

91: 06.09.01 (5to refuerzo) HuIL-17 (BM-E3141/98) mezclado 1:1 con huIL-17 (En.E-3382/83) en adyuvante Gerbu 20 pg de cada inyeccion s.c. en dos puntos; volumen total/raton con adyuvante 100 pl

99: 14.09.01 Suero recolectado para ELISA

117: 02.10.01 HuIL-17 (En.E-3382/83) HuIL-17 (En.E- 3382/83) acoplado a kLh 10 pg/raton i.v. 10 pg/raton i.p.

118: 03.10.01 HuIL-17 (En.E-3382/83) acoplado a KLH 10 pg/raton i.p.

119: 04.10.01 HuIL-17 (En.E-3382/83) acoplado a KLH 10 pg/raton i.p.

120: 05.10.01 Fusion

Se obtienen muestras de suero 35 y 99 dias despues del inicio del protocolo de inmunizacion, para medir niveles de anticuerpo anti-huIL17 mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).

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Generacion de hibridomas: En el dia 120, se sacrifican ratones 27340 mediante inhalacion de CO2. Se fusionan celulas de bazo totales (1 x 108) con celulas PAI-0 (5 x 107 celulas) utilizando PEG 4000. Las celulas fusionadas se colocan en placas en 720 pozos (1 ml/pozo), que contiene una capa de alimentacion de celulas peritoneales de raton (ratones Balb/c), en medio HAT (RPMI 1640 que contiene 2 g/l de Bicarbonato de sodio, 5 x 10-5 M de p- Mercaptoetanol, 10-4 M de Hipoxantina, 1.6 x 10-5 M de Timidina, 4 x 10-7 M de Aminopterina, 10% de FCS inactivado por calor y 50 pg/ml de Gentamicina). En el dia 14, el medio HAT se intercambia con medio HT es decir medio HAT sin Aminopterina. La deteccion inicia en el dia 10, y dura dos semanas. De las placas de 720 pozos iniciales, 684 pozos (95%) son positivos para el crecimiento de hibridoma. Se recolectan los sobrenadantes y se seleccionan para MAb reactivo huIL-17 en ELISA utilizando el E. coli y huIL-17 derivado de HEK/EBNA. Cincuenta y dos pozos principales tienen resultados positivos para la presencia de anticuerpos anti-huIL-17. Se clonan veintiocho hibridomas y se congelan los restantes. Se hace la clonacion, en placas de microtitulo de 4 x 96 pozos, en medio HT y una capa de alimentacion de celulas peritoneales de raton. Se colocan en placas los hibridomas a 0.5 celula/100 pl por pozo. Los pozos se seleccionan microscopicamente para crecimiento, y los positivos se cargan en 100 pl de medio HT. Al siguiente dia, los sobrenadantes se prueban para la produccion de anticuerpo en un ELISA especifico huIL-17. Luego de clonacion, la mayor parte de los hibridomas clonados retienen la capacidad de secretar el Anticuerpo Monoclonal especifico anti-huIL-17 (MAb).

Produccion y purificacion de anticuerpo: Se transfieren los clones seleccionados en medio libre de suero (5 ml) en matraces de 25 cm2 de TC (TC: cultivo de tejido). Los hibridomas se expanden progresivamente en medio libre de suero en matraces de 75 cm2 de TC y matraces “roller”. Todos los MAb anti-hu-IL-17 diferentes que incluyen NVP- AIN457-NX (340-110-28 es decir numero de raton-numero de hibridoma-numero de clon) se purifican mediante cromatografia de afinidad de Proteina A. Los sobrenadantes de cultivo se ajustan a pH 7.3 y se cargan en una columna de tamano apropiado de Proteina A Sefarosa 4 de flujo rapido (Pharmacia). Despues de lavado inicial con 100 mM de regulador de fosfato, pH 7.3 los anticuerpos unidos se eluyen con 50 mM de citrato, pH 2.7, 140 mM de NaCl. La fraccion eluida se neutraliza inmediatamente (pH 7.0) y se filtra esteril. La concentracion de proteina se determina mediante absorcion a 280 nm utilizando un factor de Unidad de Absorcion 1.35 (AU)/mg.

Actividad de inhibicion de MAb anti-huIL-17 sobre la produccion de IL-6 inducida por huIL-17 en fibroblastos de dermis humana: Se cultivan fibroblastos de dermis humana en FBM complementado con 2% de FCS, insulina (5 pg/ml) huFGF-basico (0.1 pg/ml) y Gentamicina (50 pg/ml). Los fibroblastos se separan del plastico utilizando una solucion de Tripsina/EDTA. Los fibroblastos se distribuyen en placas de microtitulo de 96 pozos en una densidad de 1x104 celulas/pozo en FBM complementado con 1% de FCS. Se dejan adherir los fibroblastos a las placas durante la noche. A la siguiente manana el medio se remueve y el FBM fresco complementado con 1% de FCS, huIL-17 (diferentes concentraciones que varian de 30 a 500 ng/ml) y sobrenadantes de hibridoma (dilucion final 1/5) o los anticuerpos purificados se agregan a un volumen final de 200 pl. Se recolectan los sobrenadantes de cultivo despues de la incubacion a 24 h y se mide la produccion de huIL-6 mediante ELISA.

ELISA para la deteccion de anticuerpos anti-huIL-17: Se cubren placas de microtitulo ELISA con huIL-17 recombinante (100 pl/pozo a 3 pg/ml; lote BM-E3141/98 o En.E-3382/82) en PBS 0.02% de NaN3 y se incuban durante la noche a temperatura ambiente. Al siguiente dia, se bloquean las placas de microtitulo con 300 pl de PBS/2% de BSA/ 0.02% de NaN3 durante 2 h a 37°C. Las placas luego se lavan 4 veces con PBS/ 0.05% de Tween 20/ 0.02% de NaN3. Se agregan las diluciones de suero de raton 27340 (rango de dilucion final en el dia 35: 1/100 a 1/3200; rango de dilucion final en el dia 99: 1/200 a 1/12800; 100 pl/pozo) o los sobrenadantes de cultivo de hibridomas (dilucion final 1:3; 100 pl/pozo). Despues de incubacion durante la noche a temperatura ambiente, las placas se lavan 4 veces con PBS/ 0.05% de Tween 20/ 0.02% de NaN3. Se agrega un anticuerpo especifico de fragmento Fc, anti-hu-IgG de raton conjugado con biotina, en una dilucion final de 1/20000 (100 pl/pozo). Las muestras se dejan reaccionar durante 4 h a temperatura ambiente. Despues de lavar (4 veces), se agrega estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina en una dilucion final de 1/8000 (100 pl/pozo). Despues de 40 minutos a temperatura ambiente, las placas se lavan de nuevo 4 veces y se agrega el sustrato (p-nitrofenilfosfato en regulador dietilamino pH 9.8; 150 pl/pozo). Las placas se leen despues de 30 o 45 min dependiendo del desarrollo de la reaccion en el lector de microtitulo (Bio-Rad) utilizando filtros de 405 y 490 nm.

ELISA para deteccion del isotipo de anticuerpo: Para revelar el isotipo MAb, los sobrenadantes de cultivo (100 pl; dilucion final 1/5) se agregan a los pozos de placas de microtitulo recubiertas con huIL-17 (vease lo anterior), y se incuban durante la noche a temperatura ambiente. Despues de lavado (4 veces), 100 pl/pozo de IgG1 anti-humano MAb de raton conjugado con biotina (dilucion final 1/1000), IgG2 (dilucion final 1/1000), IgG3 (dilucion final 1/1000) IgG4 (dilucion final 1/2000) o cadena ligera k Anti-Humana (dilucion final 1/1000) se agregan durante 4 h a temperatura ambiente. Como un control se utiliza MAb especifico de cadena ligera A1 y A2 anti-raton de rata conjugado con biotina (dilucion final 1/1000). Esto esta seguido, como se describio previamente, mediante lavado y adicion de estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (100 pl; dilucion final 1/8000). Despues de lavar (4 veces) se agrega el sustrato (p-nitrofenilfosfato en regulador dietilamino; 100 pl). Las placas se leen despues de 30 o 45 min dependiendo del desarrollo de la reaccion, en un lector de microtitulo (Bio-Rad) utilizando filtros de 405 y 490 nm.

ELISA para la deteccion de la produccion de huIL-6: Se cubren placas de microtitulo ELISA con un MAb de raton anti-huIL-6 (MAB206 de R&D system; 100 pl/pozo a 4 pg/ml) en PBS 0.02% de NaN3 y se incuban durante la noche

a temperatura ambiente. Al siguiente dia, las placas de microtitulo se bloquean con 300 pi de PBS/2% de BSA/ 0.02% de NaN3 durante 2 h a 37°C. Las placas luego se lavan 4 veces con PBS/ 0.05% de Tween 20/0.02% de NaN3. Se agregan los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos de dermis humana (dilucion final 1:3; 100 pl/pozo). Para establecer una curva de titulacion huIL-6 (100 pl/pozo) se titula de 400 pg/ml a 3.1 pg/ml en etapas de 5 dilucion 1:2. Despues de incubacion durante la noche a temperatura ambiente, las placas se lavan 4 veces con PBS/ 0.05% de Tween 20/0.02% de NaN3. Se agrega un anticuerpo anti-huIL-6 de cabra conjugado con biotina (BAP206; R&D Systems) (25 ng/ml; 100 pl/pozo). Las muestras se dejan reaccionar durante 4 h a temperatura ambiente. Despues de lavar (4 veces), se agrega estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina en una dilucion final de 1/8000 (100 pl/pozo). Despues de 40 minutos a temperatura ambiente, las placas se lavan de nuevo 4 veces y se

10 agrega el sustrato (p-nitrofenilfosfato en regulador dietilamino pH 9.8; 150 pl/pozo). Las placas se leen despues de 30 min en un lector de microtitulo (Bio-Rad) utilizando filtros de 405 y 490 nm. Calculos: Los valores se reportan como valores O.D. originales o como el % de inhibicion calculado sobre la media de valores duplicados. Se reportan datos adicionales como Media ± EEM. Se utiliza una curva estandar huIL-6 para medir la concentracion de huIL-6 en los sobrenadantes de cultivo utilizando un ajuste cubico de curva.

15 Resultados

Titulos de suero de raton 27340:

Tabla 2. Titulos de suero Anti-huIL-17 (raton 27340)

Dilucion en suero

Valores O.D. (Media ± EEM)

Dia: Lote HuIL- 17* 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800

: E. coli 1.795 ± 0.022 1.524 ± 0.006 1.167 ± 0.015 0.854 ± 0.013 0.615 0.005 ± 0.378 0.032 ±

35: HEK/ EBNA 2.180 ± 0.041 1.875 ± 0.005 1.577 ± 0.047 1.313 ± 0.016 1.031 0.011 ± 0.728 0.003 ±

99: E. coli 2.130 ± 0.078 1.913 ± 0.075 1.635 ± 0.041 1.494 0.066 ± 1.125 0.001 ± 0.810 ± 0.070 0.559 ± 0.021

: HEK/ EBNA 2.029 ± 0.005 1.925 ± 0.030 1.716 ± 0.012 1.524 0.004 ± 1.259 0.018 ± 0.970 ± 0.036 0.706 ± 0.002

* Se recubren las placas de microtitulo con huIL-17 (3 pg/ml) de E. coli (BM-E3141/98) o celulas HEK/EBNA (En.E-3382/82).

20

El suero de raton 27340 se analiza en ELISA para la presencia de anticuerpos anti-huIL-17 en los dias 35 y 99 en dos preparaciones diferentes de huIL-17 (Tabla 2). Los resultados muestran que los titulos de suero de raton 27340 se incrementan aproximadamente cuatro veces entre el dia 35 y el dia 99 y que se reconocen las preparaciones huIL-17.

25 Union en ELISA de los sobrenadantes de hibridoma: Se prueban 684 sobrenadantes en ELISA para la presencia de anticuerpos anti- huIL-17, utilizando dos preparaciones de huIL-17 recombinante, el primero de E coli (BM-E3141/98) el ultimo de celulas HEK/EBNA (En.E-3382/82). Se clasifican cincuenta y dos sobrenadantes positivos para la presencia de anticuerpos anti-huIL-17 (Tabla 3). La union preferencial a una o a la otra preparacion de huIL-17 se observa en unos pocos casos. Se subrayan los 28 hibridomas que se clonan posteriormente.

30 Tabla 3. Reactividad de ELISA de los sobrenadantes de cultivo

Hibridoma (No)

1

3

Lote HuIL-17 *

Valores O.D. de E. coli

1.935/1.830

1.928/1.928

HEK/ EBNA valores O.D.

ND

2.026/1.956

Hibridoma (No)

386

435

Lote HuIL-17

Valores O.D. de E. coli

1.780/1.812

2.194/2.139

HEK/ EBNA valores O.D.

2.002/1.905

2.221/2.169

5: 1.386/1.471 2.099/2.042 439 1.180/1.236 1.442/1.470

59: 1.917/2.078 2.342/2.384 444 1.034/1.066 1.166/1.138

66: 1.629/1.619 ND 450 2.060/2.209 2.079/2.237

104: 2.650/2.716 2.439/2.366 477 1.392/1.348 1.515/1.524

106: 1.329/1.371 1.362/1.465 496 2.131/2.078 2.569/2.798

110: 2.355/2.363 2.425/2.497 504 1.755/1.559 ND

112: 0.789/0.857 1.154/1.208 543 2.332/2.455 2.370/2.381

116: 1.656/1.652 ND 544 1.145/1.196 1.187/1.201

128: 1.244/1.669 0.714/0.695 548 0.728/0.750 0.891/0.909

142: 1.192/1.322 0.847/0.810 552 0.824/0.811 0.969/0.943

173: 1.899/2.108 1.966/2.023 557 2.241/2.326 2.347/2.483

182: 0.948/0.903 0.874/0.866 564 0.628/0.675 0.808/0.820

190: 2.249/2.084 2.150/2.139 566 1.092/1.068 1.239/1.152

196: 1.406/1.305 1.797/1.752 577 1.018/0.928 1.226/1.206

216: 1.120/1.146 1.114/1.128 597 0.781/0.821 1.117/1.121

234: 1.890/1.990 ND 612 1.935/1.777 2.033/1.989

277: 1.674/1.640 ND 622 2.121/2.230 2.592/2.277

285: 0.678/0.789 0.735/0.784 627 1.000/1.077 1.203/1.209

298: 2.475/2.677 2.340/2.358 649 1.335/1.389 1.311/1.337

305: 1.721/1.789 0.602/0.634 658 1.218/1.297 1.415/1.437

319: 1.111/1.073 1.223/1.202 674 1.112/1.087 1.134/1.127

328: 1.738/1.762 1.869/1.835 686 1.447/1.549 1.730/1.646

343: 2.478/2.702 2.302/2.448 705 1.899/1.803 1.870/1.872

373: 1.200/1.194 1.212/1.233 720 2.249/2.420 2.383/2.385

*Se recubren placas con huIL-17 recombinante (3 pg/ml) de E. coli (BM-E3141/98) o celulas HEK/EBNA (En.E-3382/82). Los sobrenadantes se prueban en la dilucion final de 1/3.

Union en ELISA de los sobrenadantes de cultivo de los clones de hibridoma: En la Tabla 4 se muestra la reactividad en ELISA de los sobrenadantes de los clones de los 11 hibridomas, que retienen la mejor produccion de MAb anti- huIL-17. Los clones, se resaltan en negrilla, se seleccionan para producir ~1 litro de sobrenadante en botellas “roller” 5 para la purificacion y analisis de los anticuerpos. Con la excepcion de los clones derivados del hibridoma No 5, que producen anticuerpo huIgG3K, todos los otros clones producen MAb huIgG1K, cuando se evalua por los anticuerpos monoclonales especificos de isotipo.

Tabla 4. Reactividad de ELISA de los sobrenadantes de cultivo para hu-IL-17.

Clon (No): Sobrenadantes* Valores O.D. Clon (No) Sobrenadantes* Valores O.D. Clon (No) Sobrenadantes Valores O.D.

3-2: 2.198/1.940 106-1 1.244/1.306 543-4 1.003/0.913

3-20: 1.909/1.939 106.2 1.203/1.138 543-16 0.795/0.717

3-21: 1.873/1.812 106-3 1.176/1.166 557-6 0.879/0.940

5

10

5-18: 1.240/1.168 110-7 1.535/1.393 557-36 0.980/0.925

5-22: 1.340/1.396 110-28 1.376/1.370 557-37 1.104/1.109

5.29: 1.316/1.354 305-21 1.484/1.518 622-2 0.923/0.894

5.31: 1.227/1.302 305-38 1.669/1.858 622-5 1.070/1.032

5-40: 1.364/1.543 343-1 1.351/1.375 622-6 0.980/0.953

104-2: 1.385/1.299 439-80 2.506/2.543 658-2 0.744/0.744

104-4: 1.085/1.044 450-13 1.568/1.610 658-6 0.769/0.772

104-9: 1.488/1.304 450-23 1.658/1.667 658-16 0.741/0.758

104-11: 1.670/1.380 543-1 1.074/0.991

Se recubren placas de microtitulo con huIL-17 recombinante (3 pg/ml) de celulas HEK/EBNA (En.E-3382/82).

Actividad neutralizante de los sobrenadantes de cultivo: Los sobrenadantes de cultivo se prueban para la inhibicion de la produccion de huIL-6 mediante fibroblastos de dermis humana estimulados con huIL-17 recombinante. Como se muestra en la Tabla 5, la mayor parte de los sobrenadantes de cultivo muestran actividad de inhibicion.

Tabla 5. Inhibicion de sobrenadantes: la produccion de IL-6 inducido por huIL-17 en fibroblastos de dermis humana al cultivar

Inhibicion de la produccion de IL-6 (%)

Clon: Cantidad de huIL-17 utilizado como estimulo (ng/ ml)

(No): 62.5 125 250 500

3-20: 86.3 75.0 33.1 23.2

5 -40: 23.3 41.4 20.3 19.0

104-11: 47.7 48.5 22.2 16.3

106.1: 61.6 19.8 5.7 9.8

110-28: 99.8 92.5 88.6 61.3

305-38: 47.2 47.1 36.6 23.7

343-1: 96.8 102.4 90.5 66.4

450-23: 51.7 48.5 47.5 26.6

543.4: -6.0 -12.0 -6.5 -7.1

622-2: 34.0 23.2 20.3 18.4

658-16: 34.4 27.7 12.7 18.8

Actividad neutralizante de AIN45: Seleccion del clon 110-28 para la produccion del candidato AIN457 desarrollado (realizacion preferida de la invencion) se basa en la actividad neutralizante y la medicion de afinidad en BIACORE 2000 de los anticuerpos purificados (vease Ejemplo 2 adelante).

Ejemplo 2: El AIN457 se une con muy alta afinidad a la IL-17 humana recombinante (huIL-17); el KD es 122 ± 22 pM (BIAcore) y neutraliza la produccion de IL-6 humana inducida por huIL-17 en fibroblasto dermico humano; el IC50 tiene 2.1 ±0.1 nM en una concentracion de 1.87 nM huIL-17

a) Metodos

Reactivos: Se compran reactivos de laboratorio generales de Merck o Sigma y estan disponibles en el grado de la mas alta pureza; las fuentes de reactivos especiales se detallan adelante.

Proteinas: Se generan anticuerpos monoclonales al inmunizar ratones transgenicos MEDAREX con la IL-17 humana recombinante, y luego se sigue el procedimiento estandar para producir las estirpes celulares, de las que el material secretado se puede purificar mediante cromatografia de Sefarosa de Proteina A [esencialmente como se describe en el Ejemplo 1). El AIN457 se almacena como una solucion filtrada esteril en 50 mM de Na-citrato, pH 7.0, 140 mM 5 de NaCl a 4°C. El AIN457 humano recombinante (lote KB03303A) se obtiene en solucion madre esteril de 20 mM de Na-citrato/40 mM de regulador de fosfato, pH 7, 150 mM de NaCl o 20 mM de acido acetico pH 5.5 ajustado con Tris-base 1M. Las concentraciones estan usualmente en el rango de 2 mg/ml y se diluyen en una concentracion final de 5 pg/ml en el regulador BIA (20 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,05% v/v de Tween-20) para los experimentos Biacore.

10 La IL-17 humana recombinante es de produccion propia; lote En/E 3882/83; 0.29 mg/ml.

Mediciones BIAcore

La determinacion de los parametros de union cinetica y los niveles de reactividad cruzada se hacen mediante mediciones de resonancia de plasmon de superficie utilizando el biosensor optico BIAcore 2000 (BIAcore AB, Upsalla, Suecia, vease Lit. HS 1,2 para detalles). Esta tecnologia permite la determinacion libre de etiqueta de 15 constantes de indice microscopico para union (kon) y disociacion (koff) de un ligando a un receptor. Por lo tanto, es especialmente adecuado para caracterizar las interacciones de anticuerpo-antigeno. Esta tecnologia complementa y es en muchos aspectos superior a las mediciones ELISA (Van Regenmortel, Dev Biol (Basel). 2003; 112:141-51.). Los estudios de union del IL-17 recombinante al anticuerpo AIN457 IL-17 se desarrollan en dos formas. En el protocolo estandar, se captura el AIN457 mediante un anticuerpo Fcy anti-humano (Jackson Immunochemicals; Cat. 20 No. 109-005-098) que se inmoviliza previamente en un chip sensor CM-5 BIAcore (Research grade). La union covalente del anticuerpo de captura Fcy se hace con el ’Equipo de acoplamiento de Amina’ proporcionado por BIAcore (BIAcore, Cat. No. bR-1000-50). Tipicamente, 3000 RU del anticuerpo de captura se adhieren a la superficie de dextrano activada con una solucion de anticuerpo anti Fcy de 30 pg/ml en 10 mM de regulador Ac, pH 4.5 en un indice de flujo de 5 pl/min que conduce a aproximadamente 250 RU de inmovilizacion AIN457. Como una 25 directriz, 1000 RU corresponden a una transferencia de masa de 1 ng/mm2. Alternativamente, IL-17 (Seccion 3.2; Tabla 4), anticuerpo AIN457 se acopla directamente a la superficie del chip sin capturar el anticuerpo. Los resultados se comparan con el protocolo descrito en la Tabla 9 (vease adelante).

b) Resultados

Cineticas de union del complejo AIN457 IL-17/

30 La constante de disociacion de equilibrio Kd permite algun juicio acerca de la estabilidad de los complejos, una vez formados in vivo. Por lo tanto, hemos determinado las constantes cineticas para la union de la IL-17 humana al anticuerpo AIN457 inmovilizado, y hemos derivado el Kd para el proceso a partir de estos datos. La Tabla 3 muestra el resumen de los datos obtenidos cuando las curvas de 2 experimentos se ajustan al modelo Langmuir utilizando el software BIA 3.0 evaluation. Aunque el anticuerpo es, por supuesto, bivalente, la union se puede tratar como un 35 evento 1:1, con los sitios de union a anticuerpo individuales exhibidos en la superficie que llega a estar ocupada por las moleculas In-17 monomericas.

Este experimento muestra, la asociacion extremadamente rapida asi como tambien las cineticas de disociacion muy lentas del complejo de anticuerpo-quimioquina. Se obtienen mejores datos de ajuste cuando los sensogramas se tratan individualmente (a diferencia de globalmente, como se sugiere en la BIA evaluation.) Asi, despues de 40 combinar las series de titulacion obtenemos valores promedio de 12 sensogramas de kon= (4.1 ± 0.1) x105 1/M s; koff= (3.8 ± 0.5) x10-4 l/s; y para KD=122 ± 22 pM.

Tabla 3. Constantes cineticas para la union 1:1 de la IL-17 humana rec a NVP-AIN457

Conc [nM]: kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Exp. IL-314

2: 3.31E+05 3.36E-05 1.02E-10 Serie 1

4: 1.28E+05 3.78E-05 2.95E-10

8: 3.79E+05 1.86E-05 4.90E-11

12: 3.60E+05 3.00E-05 8.33E-11

16: 3.52E+05 5.70E-05 1.62E-10

20: 3.52E+05 4.15E-05 1.18E-10

2: 1.23E+06 1.97E-05 1.60E-11 Serie 2

4: 4.11E+05 1.20E-05 2.92E-11

5

10

15

8: 3.78E+05 4.54E-05 1.20E-10

12: 3.46E+05 5.13E-05 1.48E-10

16: 3.17E+05 5.95E-05 1.88E-10

20: 3.34E+05 5.01E-05 1.50E-10

Media: 4.10E+05 3.80E-05 1.22E-10 n=12

EEM: 7.73E+04 4.51E-06 2.21E-11

Media Kd calculada de entradas individuales (verticalmente), a diferencia de aplicar la ecuacion KD=koff/kon

Para el AIN457 producido en celulas recombinantes (KB03303A) se realizan mediciones de afinidad para las citoquinas IL-17 de hombre, titi, macaco de la india y macaco de java, respectivamente. Los detalles experimentales de las mediciones Biacore son iguales como se describio anteriormente para el anticuerpo MAB110-28. Se realizan dos pruebas de series independientes de 6 concentraciones de IL-17 en cada serie. Las concentraciones para la IL- 17 humana son 2, 4, 8, 12, 16, 20 nM y 10, 20, 30, 40, 50, 60 nM para todas las otras especies. El analisis de los datos completos produce n=12 mediciones individuales para cada especie IL-17. Se reporta el Kd asi como tambien EEM.

Tabla 4. Resumen: Constantes cineticas para la union 1:1 de rec humano, titi, macaco de la india y macaco de java IL-17 a NVP-AIN457 (KB03303A)

Especies: KD [M] Media Serie 1+2 SEM

Humano: 0.227 nM +/- 0.03 nM

Titi: 1.2 nM +/- 0.1 nM

Macaco de la india: 9 nM +/-1 nM

Macado de java: 6 nM +/- 0.7 nM

Un conjunto completo de datos del analisis BIAcore para respectivas IL-17 se dan adelante en las tablas 5 a 8.: el anticuerpo KB03303A con kon, koff y Kd y las especies

Tabla 5. Constantes cineticas para la union 1:1 de la IL-17: humana rec a AIN457 (KB03303A)

Conc [nM]: kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Exp. IL-366/ IL-365

2: 3.37E+05 6.43E-05 1.91E-10 Serie 1

4: 2.59E+05 7.76E-05 2.99E-10

8: 2.12E+05 5.21E-05 2.46E-10

12: 2.18E+05 7.38E-05 3.38E-10

16: 2.02E+05 7.15E-05 3.54E-10

20: 1.92E+05 8.04E-05 4.20E-10

2: 5.50E+05 7.01E-05 1.27E-10 Serie 2

4: 3.22E+05 3.30E-05 1.02E-10

8: 2.85E+05 4.73E-05 1.66E-10

12: 2.86E+05 4.84E-05 1.69E-10

16: 2.61E+05 3.09E-05 1.18E-10

20: 2.58E+05 4.90E-05 1.90E-10

Media EEM: 2.82E+05 2.77E+04 5.82E-05 4.91E-06 2.27E-10 3.00E-11 n=12

Tabla 6. Constantes cineticas para la union 1:1 de IL-17 de titi rec a AIN457 (KB03303A)

Conc [nM]: kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Exp. IL-366/ IL-365

10nM: 8.89E+04 7.96E-05 8.95E-10 Serie 1

20nM: 1.11E+05 8.69E-05 7.82E-10

30nM: 9.82E+04 1.15E-04 1.17E-09

40nM: 9.92E+04 1.16E-04 1.17E-09

50nM: 9.81E+04 1.19E-04 1.21E-09

10nM: 8.83E+04 9.98E-05 1.13E-09 Serie 2

20nM: 1.10E+05 1.28E-04 1.17E-09

30nM: 9.70E+04 1.52E-04 1.57E-09

40nM,: 9.66E+04 1.31E-04 1.36E-09

50nM: 9.52E+04 1.59E-04 1.67E-09

Media: 9.83E+04 1.19E-04 1.21E-09 n=10

EEM: 2.36E+03 8.09E-06 ±0.1

Tabla 7. Constantes cineticas para la union 1:1 de IL-17 de macaco de la india rec a AIN457 (KB03303A)

Conc [nM]: kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Exp. IL-366/ IL-365

10: 1.70E+05 3.89E-04 2.28E-09 Serie 1

20: 6.73E+04 4.94E-04 7.34E-09

30: 5.86E+04 3.54E-04 6.04E-09

40: 3.27E+04 4.05E-04 1.24E-08

50: 4.05E+04 4.55E-04 1.12E-08

60: 3.50E+04 4.60E-04 1.31E-08

10: 5.47E+04 3.85E-04 7.04E-09 Serie 2

20: 4.62E+04 2.74E-04 5.93E-09

30: 4.30E+04 3.51E-04 8.16E-09

40: 3.76E+04 3.66E-04 9.74E-09

50: 3.60E+04 4.32E-04 1.20E-08

60: 3.44E+04 4.24E-04 1.23E-08

Media: 5.47E+04 3.99E-04 8.96E-09 n=12

EEM: 1.09E+04 1.72E-05 9.70E-10

Tabla 8. Constantes cineticas para la union 1:1 de IL-17 de macaco de java rec a AIN457 (KB03303A)

Conc [nM]: kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] Exp. IL-366/ IL-365

5nM: 3.27E+05 3.60E-04 1.10E-09 Serie 1

10nM: 1.79E+05 4.02E-04 2.24E-09

15nM: 1.03E+05 5.67E-04 5.50E-09

20nM: 1.10E+05 5.23E-04 4.75E-09

25nM: 9.23E+04 5.78E-04 6.26E-09

30nM: 9.05E+04 7.14E-04 7.89E-09

5nM: 7.18E+04 5.08E-04 7.08E-09 Serie 2

10nM: 9.70E+04 6.69E-04 6.90E-09

15nM: 1.03E+05 7.66E-04 7.41E-09

20nM: 1.02E+05 7.32E-04 7.17E-09

25nM: 1.02E+05 7.47E-04 7.34E-09

30nM: 1.00E+05 8.34E-04 8.32E-09

Media: 1.23E+05 6.17E-04 6.00E-09 n=10

EEM: 1.99E+04 4.34E-05 6.52E-10

Posteriormente se evalua la actividad de inhibicion del AIN457 purificado (Lote En/E-10333/53; 0.54 mg/ml) en huIL- 17. Los valores IC50 se muestran en la Tabla 6. En estos experimentos, huIL-17R/Fc y un MAb de raton anti-huIL-17 se incluyen como controles positivos y Simulect como control negativo.

5 Tabla 9. Neutralizacion de hu-IL-17 mediante el MAb AIN457 anti-huIL-17 humano o en comparacion con IL-17R/Fc, y un MAb de raton anti-huIL-17 (R&D System).

AIN457 IL-17 R/Fc MAB 317

IC50 ± EEM IC50 ± EEM IC50 ± EEM

(n=3*) (n=3) (n=3)

Recombinante huIL-17 2.071 ± 0.116 1.713 ± 0.305 nM 12.226 ± 2.050 nM

nM

@ 1.87 nM (30 ng/ml)

*Se calculan la Media y EEM de tres experimentos diferentes e independientes.

En conclusion, el AIN457 abroga la secrecion dependiente de IL-17 de huIL-6 mediante fibroblastos de dermis humana. La potencia es comparable con aquella de huIL-17R/Fc y superior a aquella de un MAb anti-huIL-17 de 10 raton comercialmente disponible. Es interesante notar que se observa una inhibicion mas completa con AIN457 que con IL-17R/Fc.

Ejemplo 3: Pureza y secuencias de aminoacidos parciales del secuenciamiento de aminoacido de cadena ligera y pesada

Secuencias de aminoacidos de terminal amino de las regiones Vl y Vh: Los primeros 48 residuos de aminoacido de 15 la cadena ligera y pesada para dos anticuerpos anti-IL-17A, clon 110-7 (vease tabla 4) y 110-28 (vease tabla 4), se determinan mediante degradacion de Edman. La secuencia de aminoacidos es identica para ambos clones. Se busca el GeneBank mediante analisis de rafaga y se utiliza la secuencia de ADN mas homologa encontrada para designar los cebadores de clonacion.

Clonacion molecular de las regiones Vl y Vh: Se prepara ARN total de 2x107 celulas de hibridoma (clon 110-7, clon 20 110-28) con el Equipo RNeasy Midi de acuerdo con el protocolo del vendedor (Quiagen Hilden Alemania). Se eluye

5

10

15

20

25

30

35

40

45

ARN total en 200gl de RNasa libre de agua y se almacena a -80°C. La sintesis de cADN de la primera hebra se lleva a cabo con transcriptasa inversa M-MLV (Promega, Madison, WI), cebador oligo-dT, mezcla de nucleotido PCR (dNTP) e inhibidor ARNsin (Roche, Mannheim). Se mezcla cinco gg de ARN total con 1 gl de cebador oligo-dT (0.5 gg/gl), y se agrega RNasa libre de agua en un volumen final de 36 gl. La mezcla se incuba a 70°C durante 10 minutos y luego se almacena en hielo. Mientras esta en hielo, se agregan los siguientes reactivos: 10gl 5x RT de regulador, 2gl de dNTP (10mM cada uno), 2 gl de RNasin y 1 gl de transcriptasa inversa M-MLV. La reaccion se lleva a cabo a 42°C durante 1 hora.

La reaccion PCR se ensambla utilizando 4 gl de plantilla de cADN 2gl de cada cebador en 10 gM cada uno (vease adelante y Tablas 10 y 11 para revision) 20gl de 2xQiamix (que contiene Regulador, dNTP, TAQPolimerasa) y 1 gl de polimerasa de ADN Pwo en un volumen total de 40 gl. Las condiciones PCR se fijan para 35 ciclos de 94°C durante 15 segundos, 55°C para 20 segundos y 72°C para 30 segundos. El producto PCR se subclona en el vector de clonacion pCR4-TOPO-Zero (Stragagene, La Jolla, Ca.). Varios clones se anaden a cada reaccion y la secuencia de nucleotido se determina por Solvias AG (Basilea), utilizando los cebadores MV432 (SEQ ID NO: 21), MV433 (SEQ ID NO: 22), MV434 (SEQ ID NO: 23), MV435 (SeQ ID NO: 14), y los cebadores estandar en el ADN de vector.

El cADN que codifica la cadena pesada se amplifica utilizando los pares de cebador MV416 (SEQ ID NO: 15)/#265 (SEQ ID NO: 16) y MV418 (SEQ ID NO: 17) /#265 (SEQ ID NO: 16). Los cebadores cubren las secuencias de nucleotido que corresponden a las siguientes posiciones de aminoacido de la cadena pesada: posicion MV416 -19/- 13 (peptido de senal); posicion MV418 +1/+7; posicion #265 n +253/+259. La posicion +1 es el primer aminoacido de la proteina madura.

El cADN que codifica la cadena ligera se amplifica utilizando los pares de cebador MV417 (SEQ ID NO: 18)/#223 (SEQ ID NO: 19) y MV419 (SEQ ID NO: 20)/#223 (SEQ ID NO: 19). Los cebadores cubren las secuencias de nucleotido que corresponden a las siguientes posiciones de aminoacido de la cadena ligera: posicion MV417 -20/-14 (peptido de senal); posicion MV419 +1/+7; posicion #223 +210/+215. Este metodo permite hacer dos amplificaciones independientes de PCR para cada cadena de inmunoglobulina, que resulta en dos secuencias de ADN independientemente establecidas.

Resultados y Discusion

Los productos PCR clonados que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de dos hibridomas (110-7 y 110-28, vease tabla 4 anterior) se caracterizan por el secuenciamiento de ADN. Se utilizan cinco o seis secuencias independientes para ensamblar las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera. Los cADN de cadena ligera son todos identicos y cubren la secuencia codificante completa (posicion de aminoacido -20 a +215). Los cADN de cadena pesada tienen 2 emparejamientos incorrectos diferentes en un cADN cada uno. Estos se excluyen de la secuencia final, que se extiende desde el codon de inicio al final de la region de bisagra despues del dominio constante 1 (posicion de aminoacido -19 a +238). Las secuencias para ambos hibridomas son identicas. El cADN obtenido del hibridoma 110-28 se selecciona y se utiliza para todo el trabajo de expresion adicional. La SEQ ID NO: 7 (cADN de cadena pesada de AIN457), SEQ ID NO: 8 (secuencia de aminoacidos de cadena pesada de AIN457), sEq ID NO: 9 (cADN de cadena ligera AIN457) y SEQ iD NO: 10 (secuencia de aminoacidos de AIN457) muestran la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera y la cadena pesada de AIN457, junto con la secuencia de proteina y la posicion de los cebadores utilizados para la amplificacion PCR y el secuenciamiento de ADN. Las secuencias de ADN se han registrado en PlasNova, numero de acceso NPL003689 para la cadena pesada, y numero de acceso NPL003690 para la cadena ligera.

La secuencia de aminoacidos encontrada mediante la clonacion de cADN es identica a aquella obtenida previamente por la degradacion de Edman de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina purificadas, que indican que se ha clonado el cADN correcto.

Tabla 10: Secuencia de nucleotidos y de aminoacidos de la cadena ligera

La secuencia de aminoacidos que codifica el dominio variable se coloca en negrilla y se subraya. Se indican los cebadores de oligonucleotido utilizados para clonacion (subrayado).

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo de union a IL-17 o fragmento del mismo que comprende dominios variables tanto de cadena pesada (Vh) como de cadena ligera (Vl) para uso en el tratamiento de una artritis inflamatoria, en donde dicho anticuerpo de union a IL-17 o fragmento del mismo comprende al menos un sitio de union a antfgeno que comprende:

(a) un Vh que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3, teniendo dicha CDR1 la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1, teniendo dicha CDR2 la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 2, y teniendo dicha CDR3 la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 3, en donde las regiones hipervariables estan de acuerdo con la definition de Kabat; o

(b) un Vh que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1-x, CDR2-x y CDR3-x, teniendo dicha CDR1-x la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 11, teniendo dicha CDR2-x la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:12, y teniendo dicha CDR3-x la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:13, en donde las regiones hipervariables estan de acuerdo con la definicion de Chothia; y

(c) un Vl que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1', CDR2' y CDR3', teniendo dicha CDR1' la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:4, teniendo dicha CDR2' la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:5, y teniendo dicha CDR3' la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:6 en donde las regiones hipervariables estan de acuerdo con la definicion de Kabat.
2. El anticuerpo de union a IL-17 o fragmento del mismo para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, que es un anticuerpo humano.
3. El anticuerpo de union a IL-17 o fragmento del mismo para uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que comprende al menos un sitio de union a antfgeno que comprende:

a. un primer dominio que tiene una secuencia de aminoacidos como la mostrada en la SEQ ID NO:8 comenzando con el aminoacido en la position 1 y terminando con el aminoacido en la position 127; o

b. un primer dominio que tiene una secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO:8 comenzando con aminoacido en la posicion 1 y terminando con aminoacido en la posicion 127 y un segundo dominio que tiene una secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO:0, comenzando con aminoacido en la posicion 1 y terminando con aminoacido en la posicion 109.
4. El anticuerpo de union a IL-17 o fragmento del mismo para uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, que es un anticuerpo IgG1/K humano que comprende:

(a) una cadena ligera que consiste en los residuos de aminoacidos que comienzan en el residuo +1 en la Tabla 10 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSS SYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY GSSPCTFGQGTRFEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQFKSGTASVVCFFNNFYPREAKVQWKVD NAFQSGNSQESVTEQDSKDSTYSFSSTFTFS KADYEKHKVYACEVTHQGESSPVTKSFNRG

E C ;

y

(b) una cadena pesada que comprende los residuos de aminoacidos que comienzan en el residuo +1 en la Tabla 11

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

NYWMNWVRQAPGKGLEWVAAINQDGSEKY

YYGSYKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRYE

DTAVYYCVRDYYDILTDYYIHYWYFDLWG

RGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC

NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP.
5. Uso de un anticuerpo de union a IL-17 o fragmento del mismo que comprende tanto dominios variables de cadena pesada (Vh) como de cadena ligera (Vl), para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de espondilitis anquilosante, en donde dicho anticuerpo o fragmento de union a IL-17 comprende al menos un sitio de union a

5 antfgeno que comprende:

(a) un Vh que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3, teniendo dicha CDR1 la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1, teniendo dicha CDR2 la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:2, y teniendo dicha CDR3 la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:3, en donde las regiones hipervariables estan de acuerdo con la definicion de Kabat; o

10 (b) un Vh que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1-x, CDR2-x y CDR3-x, teniendo dicha

CDR1 -x la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:11, teniendo dicha CDR2-x la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:12, y teniendo dicha CDR3-x la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:13, en donde las regiones hipervariables estan de acuerdo con la definicion de Chothia; y

(c) un Vl que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1', CDR2' y CDR3', teniendo dicha CDR1' la 15 secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:4, teniendo dicha CDR2' la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:5, y teniendo dicha CDR3' la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:6 en donde las regiones hipervariables estan de acuerdo con la definicion de Kabat.
6. Uso de un anticuerpo de union a IL-17 o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo IgG1/K humano que comprende:

20 (a) una cadena ligera que consiste en los residuos de aminoacidos que comienzan en el residuo +1 de la Tabla 10

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS

SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI

PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY

CQQYGSSPCTFGQGTRLEIKRTVAAPSVF

IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK

VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY

SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS

SPVTKSFNRGEC;

y

(b) una cadena pesada que comprende los residuos de aminoacidos que comienzan en el residuo +1 en la Tabla 11 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF SNYWMNWVRQAPGKGLEWVAAINQDGSE KYYVGSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS

LRVEDT AVYY CVRDYYDILTDYYIHYWY

FDLWGRGTLYTY SSASTKGPSYFPLAPSS

KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG

ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS

SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS

CDKTHTCPPCP.

H-CDR3

imagen1

Figura 1. Estructura de rayos X de Fab AIN457

Vista de cerca de los dominios variables del Fab AIN457 (traza C) con las regiones de determinacion de complementariedad resaltadas. Se muestran todas las cadenas laterales de tirosina contribuidas por los bucles de CDR, para ilustrar el hecho de que el sitio de combinacion con antigeno de AIN457 es excepcionalmente rico en residuos de tirosina. Tambien se muestran (flecha) las cadenas laterales de Cys L97, en la interfaz Vl-Vh

imagen2

Figura 2. Estructura de rayos X de Fab AIN457, vista general

Representacion de superficie de Van der Waals de Fab AIN457. La cadena ligera y pesada tienen color gris claro y oscuro, respectivamente. Los bucles de CDR se resaltan en diferentes colores. Observe la presencia del bucle H-CDR3 que sobresale del sitio de combinacion de antigeno del anticuerpo.