NL8803186A - Perfusaat voor het conserveren van organen. - Google Patents

Description

it Λ - Perfusaat voor het conserveren van organen -

Het conserveren van nieren, het ex vivo bewaren van nieren uit lijken is een betrekkelijk nieuw gebied.

Het conserveren van nieren uit lijken voor transplantatie is algemene praktijk in ziekenhuizen; de vooruitgang op dit terrein 5 is echter beperkt tot proefondervindelijke methoden. Hoewel deze benadering vanuit klinisch oogpunt gedeeltelijk succesvol is geweest, worden de feitelijke principes achter deze successen niet goed begrepen.

Aangezien niertransplantatie zich heeft 10 ontwikkeld van een strikte onderzoeksmethode tot een erkende klinische therapie voor nierziekten in het eindstadium,is het conserveren van nieren van een laboratorium-onderzoeksmethode een erkende klinische methode geworden . Tegenwoordig zijn de twee meest algemeen gebruikte methoden voor het conserveren 15 van nieren eenvoudig hypotherm bewaren en continue perfusie.

Bij hypotherm bewaren worden bij de meest gebruikte methode de organen uit het donorlijk verwijderd en snel afgekoeld .Dit wordt gewoonlijk bereikt door een combinatie van uitwendig koelen en een korte perfusieperiode om de kerntemperatuur zo 20 snel mogelijk te laten dalen. De nieren worden vervolgens bewaard, ondergedompeld in een doorspoeloplossing in een eenvoudig kunststof vat,en bij een temperatuur van 0 tot 4°C gehouden door het vat in ijs te dompelen . De voordelen van deze methode zijn de 25 eenvoud, de lage kosten en het gemak van vervoer van de organen .

De samenstelling van de doorspoeloplossing ter verkrijging van optimale conservering is uitgebreid bestudeerd.

De tweede methode voer-het conserveren van nieren die uitgebreid laboratoriumonderzoek en klinisch 30 onderzoek heeft ondergaan, is continue pulserende perfusie.

De basisingrediënten van de continue perfusie zijn in het algemeen (1) pulserende stroom, (2) hypothermie , (3) membraanoxygenering en (4) een perfusaat dat zowel albumine als lipiden bevat .

Er zijn verschillende voordelen verbonden aan continue perfusie.

35 In de eerste plaats verschaft perfusie genoeg tijd om van trans plantatie van organen uit lijken een methode te maken waarbij tot op zekere hoogte kan worden gekozen . In de tweede plaats 8803186? η - 2.- maakt perfusie het mogelijk dat , voorafgaand aan de implantatie, de levensvatbaarheid wordt onderzocht. Een belangrijke verbetering van de resultaten van het transplanteren van nieren uit lijken kan worden verwacht als de conserveringstijd zou kunnen worden 5 verlengd tot de 5-7 dagen welke nodig zijn voor de huidige methoden voor het onderzoeken van een gemengde lymfocytcultuur.

Door de mogelijkheid om met succes nieren van mensen gedurende 2 tot 3 dagen te conserveren door hetzij eenvoudig koud bewaren na eerst doorspoelen met een intracellulaire 10 elektrolytoplossing hetzij pulserende perfusie met een elektrolyt- proteineoplossing, is er voldoende tijd verkregen voor het onderzoeken van histocompatibiliteit van de donor en recipient, het uitwisselen van nieren tussen transplantatiecentra , het zorgvuldig pre-operatief voorbereiden van de recipient , het verkrijgen van 15 voorlopige resultaten van de donorcultuur en het herstellen van vaten van het niertransplantaat voor de implantatie. Het conserveren van nieren gedurende 72 uur onder toepassing van hypotherme pulserende perfusie met gecryoprecipiteerd plasma bleek een belangrijke stap vooruit te zijn voor het conserveren 20 van menselijke nieren en was de bij voorkeur toegepaste conserveringsmethode. Het conserveren van nieren met ijskoude intracellulaire elektrolyt bevattende doorspoeloplossing gevolgd door eenvoudig koud bewaren is met succes toegepast voor het conserveren van menselijke nieren gedurende maximaal 61 25 uur.

Serumalbumine in verschillende vormen wordt uitsluitend gebruikt voor klinische orgaanconservering ter verkrijging van de noodzakelijke oncotfsche druk. Tot deze vormen behoren gecryoprecipiteerd plasma, plasmaproteinefractie, 30 humaan serumalbumine en met silicagel behandeld plasma.

Omdat deze perfusaten uit natuurlijke materialen worcfen bereid is variatie echter onvermijdelijk. Het zou bijzonder voordelig zijn als een perfusaat beschikbaar was dat een synthetisch colloide bevatte .

35 In het verleden is een groot aantal synthe tische colloidale materialen experimenteel onderzocht op doeltreffendheid bij het conserveren van nieren. Tot deze colloïden behoren 88031867 I» - 3 - dextranen, polyvinylpyrrolidine , Pluronics, hydroxyethylzetmeel (HES) , Picoll, Arabische gom en polyethyleenglycol . Geen van deze colloïden was even doeltreffend als serumalbumine.

HES was echter 24 uur en in sommige gevallen 72 uur doeltreffend 5 als conserveermiddel. Deze colloidale materialen werden alle onderzocht in perfusaten op zoutbasis. Kortgeleden werd een uitstekende conservering van nieren van honden gedurende 72 uur waargenomen met een perfusaat dat gluconaatanionen in plaats van chloride bevatte met humaan serumalbumine ( HSA) voor colloid-10 osmotische druk .

Aan het eind van de jaren *60 toonden twee belangrijke studies aan dat nieren veilig gedurende 30 uur konden worden geconserveerd door koud bewaren (1) en gedurende wel 72 uur door continue perfusie (2). Deze twee 15 studies veranderden de klinische transplantatie van nieren uit lijken van een spoedmethode tot een methode waarbij tot op zekere hoogte kan worden gekozen . Collins', oplossing of de gemodificeerde Eurocollins' oplossing heeft de voorkeur van de meeste transplantatiecentra die nieren door koud bewaren 20 conserveren.

De introductie van cyclosporine voor immunosuppressie gedurende de jaren feo heeft opnieuw de belangstelling gewekt voor het transplanteren van andere organen, met name lever, pancreas, hart, long en hart-long.

25 Maar conserveringsmethoden die succesvol zijn voor nieren zijn niet succesvol gebleken voor deze andere organen. Dientengevolge wordt: de klinische conservering van hart, lever en pancreas tot een minimum beperkt , niet langer dan 6 tot 10 uren.

Het is veel ingewikkelder om deze organen te transplanteren 30 dan nieren, en onveranderlijk worden de operaties gedurende de nacht uitgevoerd wanneer operatiekamers in de donorziekenhuizen beschikbaar zijn. Korte conserveringstijden voor hart en lever maken ook twee chirurgische teams nodig , één voor de donor en één voor de recipient . Het verlengen van de conserverings -35 tijd voor deze organen tot 30 uur zou dezelfde gevolgen hebben voor hun transplantatie als de gevolgen die dit had op de niertransplantatie, namelijk grotere beschikbaarheid van organen, minder 8803186: * - 4 - verspilling van organen, grotere uitwisseling van organen en lagere kosten.

Een conserverings^oplossing die gebruikt kan worden voor alle donororganen, zowel voor het in situ afkoe-5 len van een orgaan in de donor als ook voor het koud bewaren nadat het orgaan is weggehaald zou gewenst zijn.

Volgens de onderhavige uitvinding wordt voorzien in een samenstelling die geschikt is voor het conserveren en bewaren van een orgaan dat bestemd is voor implantatie in 10 een patient , welke samenstelling bestaat uit een lactobionaat en een hydroxyethylzetmeel dat geen of nagenoeg geen ethyleen-glycol, ethyleenchloorhydrine, natriumchloride en aceton bevat en dat een moleculairgewicht van 150.000 tot 350.000 dalton heeft. Voorts voorziet de uitvinding in een werkwijze voor het 15 conserveren van een orgaan dat bestemd is voor implantatie in een patient, bij welke werkwijze men het orgaan in een dergelijke bovengenoemde samenstelling brengt. Een dergelijke samenstelling of perfusaat verschaft een conservering van 72 uur voor de pancreas, 48 uur voor de nier en tenminste 24 uur voor de lever.

20 Hoewel perfusaten op serumalbumine (HSA)-basis de levensvatbaar heid van nieren gedurende maximaal 3 dagen in stand houden , worden de nieren beschadigd zoals blijkt uit de verhoogde serum-creatinine-spiegels na transplantatie en de tijd welke nodig is voordat die verhoogde spiegels weer normaal zijn .

25 Tot nu toe zijn aanvaardbare methoden voor het conserveren van nieren niet beschikbaar. De methoden die klinisch effectief zijn gebleken , zijn beperkt tot een korte bewaartijd ( 3 dagen) en geven een aanzienlijk verminderde levensvatbaarheid. De uitvinding beschrijft de biochemische 30 samenstelling van de pearfusaat- en bewaaroplossing die het meest geschikt is voor de hypotherm geconserveerde organen , en een nieuw , synthetisch colloid-osmotisch middel dat een aanzienlijk betere conservering voor langere duur geeft.

Bevriezing en continue aerobe perfusie 35 zijn theoretisch de enige manieren voor het verkrijgen van een werkelijke conservering voor langere tijd ( van een maand tot' jaren). Eenvoudig koud bewaren heeft een specifieke tijdslimiet 88031867 - 5 - waarna het orgaan niet langer levensvatbaar is . Hypothermie verlaagt de snelheid waarmee intracellulaire enzymen essentiele celcomponenten afbreken welke nodig zijn voor de levensvatbaarheid van het orgaan.

5 Aangetoond is dat door de eenvoudige koeling van ischemische nieren met koud bloed de functie daarvan gedurende 12 uur werd in stand gehouden. Collins (Lancet 1969; 2:1219-1222) toonde aan dat door toepassing van een geschikte doorspoeloplossing de bewaartijd voor nieren nog met 10 een factor 3 ( tot 30 uur) werd verhoogd. Met deze oplossing konden andere organen zoals pancreas, lever en hart, niet worden geconserveerd, wat naar men aanneemt te wijten is aan orgaanspeci-fieke metabolische verschillen .

De doorspoeloplossing moet - om geschikt 15 en effectief te zijn - een samenstelling hebben die de door hypothermie veroorzaakte opzwelling van cellen tot een minimum beperkt, de uitzetting van extracellulaire ruimte tijdens de doorspoelperiode voorkomt , beschadiging door zuurstaf-vrije radicalen voorkomt, met name tijdens de hernieuwde perfusie , 20 en substraten verschaft voor het opnieuw vormen van hoog-energe- tische fosfaatverbindingen tijdens de hernieuwde perfusie.

De dar hypothermie veroorzaakte opzwelling van cellen is te wijten aan de ophoping van water . Deze neiging tot opzwellen kan worden tegengegaan door toevoeging van 110 25 tot 140 mmol (110 tot 140 mOsm/kg osmotische kracht ) stoffen waarvoor de cel impermeabel is ( impermeanten). Deze concentratie impermeanten is bij benadering gelijk aan de concentratie glucose in Collins' oplossing voor bewaren in de koude (120 mM) en van impermeanten in andere oplossingen voor bewaren in 30 de kou. Een sleutelcomponent van succesvolle oplossingen voor bewaren in de kou is derhalve de juiste concentratie van een doeltreffend impermeant.

Een doeltreffende koude doorspoeloplossing moet de uitzetting van de extracellulaire ruimte voorkomen, 35 welke uitzetting kan optreden tijdens het in situ doorspoelen van donororganen en na het weghalen van de organen . Een dergelijke Uitzetting kan het vaatsysteem samendrukken en er voor zorgen 8803186: - 6 - dat de doorspoeloplossing slecht over het weefsel wordtverdeeld.

De meeste oplossingen voor bewaren in de kou bevatten geen stoffen die oncotische druk uitoefenen (albumine of andere colloïden).

De componenten van de doorspoeloplossing diffunderen dan ook 5 snel in extracellulaire ruimten en veroorzaken weefseloedeem .

De ideale in situ doorspoeloplossing moet derhalve stoffen bevatten die colloid-osmotische druk veroorzaken en de vrije uitwisseling van essentiele bestanddelen van de doorspoeloplossing mogelijk maken zonder de extracellulaire ruimte 10 te doen uitzetten.

Er zijn belangrijke verschillen in het metabolisme van de nier, lever en pancreas, en deze verschillen kunnen van invloed zijn op de mate waarin deze organen worden geconserveerd. De onderdrukking van de opzwelling van de cellen 15 maakt het gebruik van een doeltreffende impermeant nodig . Glucose, de belangrijkste impermeant in Collins' oplossing is niet doeltreffend voor de lever of pancreas en komt gemakkelijk in cellen, Southard et al., Cryobiology 1986; 23:477-482 .

Mannitol, een andere algemeen gebruikte impermeant, is ongeveer 20 even permeabel als glucose in de lever. Een reden waarom oplos singen voor bewaren in de kou,die afhangen van glucose of mannitol , niet effectief zijn voor de lever en pancreas is derhalve dat deze oplossingen geen effectieve impermeanten bevatten.

Volgens de uitvinding bevat de oplossing 25 voor het conserveren van organen het anion lactobionaat en bij voorkeur raffinose als impermeanten voor de cel; bij voorkeur heeft de oplossing een osmolaliteit van ongeveer 320 Mosm/1, + + K -concentratie van 120 mM en Na -concentratie van 30 mM.

Het bij voorkeur toegepaste colloide is een gemodificeerd hydroxy- 30 ethylzetmeel met een gewichtsgemiddeld moleculairgewicht van 150.000 tot 350.000 en in het bijzonder 200.000 tot 300.000 dalton en een substitutiegraad van 0,4 tot 0,7. Het bij voorkeur toegepaste colloide bevat geen of nagenoeg geen hydroxyethylzetmeel met een moleculairgewicht van minder dan 50.000 dalton.

35 Volgens de uitvinding wordt hydroxyethyl- zetmeel gedialyseerd tegen gedestilleerd-gedeioniseerd water of op andere wijze behandeld ter verwijdering van verscheidene 88031867 - 7- verontreinigingen waarvan voorheen onbekend was dat ze een nadelig effect hebben op de doeltreffendheid van hydroxyethylzet-meel-preparaten . De door de dialyse verwijderde materialen zijn de zeer kleine hydroxyethylzetmeelcomponenten, met inbegrip 5 van ethyleenglycol en ethyleenchloorhydrine welke als nevenprodukten van de hydroxyethylering zijn verkregen alsmede het overgebleven aceton en natriumchloride. Van ethyleenglycol en ethyleenchloorhydrine is bekend dat ze toxisch zijn . Hun verwijdering is derhalve, zelfs indien ze in een kleine hoeveelheid aanwezig 10 zijn , gewenst.

Een verdere belangrijke overweging voor succesvol bewaren in de kou is het voorkómen van intracellulaire acidose.Ischemie stimuleert glycolyse en glycogenolyse (Pasteur-effect), zelfs in de kou; ischemie doet ook de vorming 15 van melkzuur en de concentratie van waterstofionen toenemen.

Weefselacidose is fataal voor cellen en kan lysosomale instabiliteit veroorzaken, lysosomale enzymen activeren en de eigenschappen van mitochondriën veranderen. Het voorkomen van intracellulaire acidose is dan ook een belangrijk vereiste voor een goede conser-20 vering. Sommige studies hebben aangetoond dat doeltreffend bufferen van oplossingen voor bewaren in de kou of het toepassen van doorspoeloplossingen met een alkalische pH het bewaren van lever (Lie, TS et al.. Transplant Proc. 1984 , 16:134-137) en pancreas (Abstract, Am. Soc. of Transplant Surgeons 13th 25 Annual Meeting , mei 28-29 , 1987) verbetert. De bij voorkeur toegepaste samenstelling volgens de uitvinding heeft een pH van ongeveer 7,4.

Een andere belangrijke overweging voor doeltreffend bewaren in de kou is beschadiging door zuursfef—vrije 30 radicalen tijdens hernieuwde perfusie, maar de precieze rol van deze middelen is nog niet duidelijk . Aangenomen wordt , dat zuurstaf-vrije radicalen van weinig belang zijn in levers en nieren van mensen omdat endogeen xanthineoxydase een betrekkelijk geringe activiteit heeft vergeleken met de grote endogene 35 activiteit van superoxydedismutase, dat superoxydeanionen verwijdert.

Door zuurstcf^vrije radicalen veroorzaakte beschadiging kan daarentegen uiterst belangrijk zijn in longen en ingewanden, 88031867 f - 8 - * die gevoelig zijn voor een dergelijke beschadiging. De samenstelling bevat dan ook bij voorkeur glutathion.

Een andere belangrijke overweging is het energiemetabolsime. Adenosinetrifosfaat (ATP) ontleedt snel 5 tijdens hypotherm bewaren en deze afbraak leidt tot de vorming van eindprodukten (adenosine, inosine en hypoxanthine) waarvoor het plasmamembraan vrij permeabel is . Voor hernieuwde perfusie van een orgaan is het nodig dat de Na-pompactiviteit snel wordt hersteld, waarvoor ATP nodig is. De beschikbaarheid van ATP-10 voorlopers kan dan ook belangrijk zijn voor een succesvolle .

conservering van organen. De bij voorkeur toegepaste samenstelling bevat derhalve adenosine.

Het hydroxyethylzetmeel is kenmerkend aanwezig in een hoeveelheid van 3 tot 8 gew.%.

15 Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de conserverings^oplossing en perfusaatsamenstelling -zonder daartoe beperkt te zijn - de volgende stoffen, bij voorkeur in ongeveer de aangegeven hoeveelheden :

Tabel A

20

Stof Hoeveelheid in 1 liter K+-lactobionaat 100 mmol 25 KH2P04 25 ™“°1

MgSO^ 5 mmol

Raffinose 30 mmol

Adenosine 5 mmol

Glutathion 3 mmol

30 Insuline 100 U

Bactrim 0,5 ml

Dexamethason 8 mg

Allopurinol 1 mM

Hydroxyethylzetmeel met een moleculairgewicht van 200.000 tot 300.000 dalton en een substi- tutiegraad van 0,4 tot 0,7 50 g 88 03 186 .

De oplossing wordt bij kamertemperatuur - 9 - met NaOH op een pH van 7,4 gebracht. De eindconcentraties zijn + +

Na =30+5 mM, K = 120 + 5 mM, mOsm/liter = 320 + 5.Batrxm= trimethoprim (16 mg/ml ) en sulfamethoxazool (80 mg/ml).

5 Een andere bij voorkeur toegepaste samenstelling is de volgende:

Stof Hoeveelheid per liter

Lactobionzuur 35,83 g Eénbasisch kaliumfosfaat 3,40 g 10 Raffinosepentahydraat* 17,83 g

Magnesiumsulfaatheptahydraat* 1,23 g

Adenosine 1,34 g

Allopurinol 0,136 g 61utathion(gereduceerd) 0,922 g 15 Pentafractie** 50,00 g

Kaliumhydroxyde ( 10 N) 10,0 ml

Natriumhydroxyde of zoutzuur- pH instellen tot 7,4

Water voer injectiedoeleinden - volume aanvullen tot 1,0 1 20 * Andere hydraten kunnen uiteraard worden gebruikt onder verkrijging van een equivalente hoeveelheid ** Het in Voorbeeld I verkregen hydroxyethylzetmeel 25

De uitvinding verschaft derhalve een langere , klinische orgaanconserveringstijd , en de toepassing van een synthetisch colloïde vermindert de variatie welke optreedt bij perfusaten die bereid zijn uit natuurlijke materialen.

De volgende voorbeelden lichten 30 de uitvinding verder toe.

Voorbeeld I

Bereiding van hydroxyethylzetmeel _ 100 g Hydroxyethylzetmeel 35 werd opgelost in gedestilleerd - gedeioniseerd water ter bereiding van een 10 gew.S-ige oplossing. De HES-oplossing werd gebracht in dialysezakjes (34 mm x 46 cm) met een moleculair-gewichts-grens van 50.000 dalton, welke in een vat van 10-15 1 met 8803186: % - 10 - gedestilleerd-gedeioniseerd water werden gebracht en 72 uur geroerd . Het water werd dagelijks ververst, en het HES werd verzameld en bij -20°C bevroren tot het werd gebruikt; het 5 had een moleculairgewicht van 200.000 tot 300.000 dalton en een subsitutiegraad van ongeveer 0,4-0,5.

Voorbeeld II

Conservering gedurende 72 uur 10 van pancreas van honden

Vrouwelijke bastaardhonden met een gewicht van 15-25 kg werden voer het exepriment gebruikt.

Operatiemethode . Anesthesie werd geïnduceerd met pentathol en gehandhaafd met halothan. Door 15 een incisie in het midden werd het linkergedeelte (staart) van de pancreas weggehaald zoals eerder is beschreven . Het trans-plantaat met de milt daaraan vast werd getransplanteerd aan de fascia iliaca hetzij onmiddellijk na doorspoelen (controle) hetzij na bewaren in de kou gedurende 48 of 72 uur. De ductus 20 pancreaticus werd opengelaten waardoor het pancreassecreet vrij in de buikholte kon lopen. Er werden geen anti-coagulantia gebruikt . Het rechtergedeelte van de pancreas werd ten tijde van de transplantatie verwijderd.

25 Experimenteel protocol. Alle honden

Ontvingen intraveneus 0,5 g Mandol voor hst weghalen en tijdens de eerste drie dagen na de transplantatie. De honden werden gevoerd met een standaard hondenvoer met Viokase. De dieren werden in drie groepen verdeeld. Groep 1 (controle ): na weghalen 30 en uitwassen werden de transplantaten onmiddellijk getransplanteerd; groep 2 (bewaren in de kou gedurende 48 uur); groep 3 (be waren in de kou gedurende 72 uur). De bloedglucoseconcentratie werd gedurende de eerste week na de transplantatie dagelijks bepaald en daarna 2 maal in de week. Een intraveneuze glucose-35 tolerantieproef ( IVGTT) werd 24 uur , 2 weken en 4 weken na de transplantatie uitgevoerd. De transplantaten werden na 4 weken verwijderd en 2-3 dagen later werd een IVGTT uitgevoerd.

Voor de IVGTT werd glucose (0,5 g/kg lichaamsgewicht ) geïnjecteerd, waarna bloedglucose na 1, 5 10, 20, 30, 60, 90 en 120 min werd bepaald. De K-waarde werd berekend uit de bloedglucoseconcentratie 88031867 * - 11 - welke werd verkregen uit de bepalingen na 5-60 min. (9) .

Glucosewaarden groter dan 150 mg % gedurende meer dan 2 dagen en een K-waarde kleiner dan 1,0 werden beschouwd als tekenen van diabetes.

5 Conservering. De samenstelling van de conserveringsoplossing wordt weergegeven in Tabel A.

De pancreas werd na verwijdering doorgespoeld met ongeveer 250-300 ml doorspoeloplossing vanaf een hoogte van 60 cm . Het transplantaat werd in een dubbele kusntstof zak geplaatst, bedekt 10 met conserveringsoplossing en in een ijswaterbad geplaatst.

Statistiek. Statistische beoordeling werd uitgevoerd onder toepassing van de T-proef van Student.

De gegeven waarden zijn gemiddelden + SEM.

15 Resultaten

Alle transplantaten werden goed geperfundeerd onmiddellijk na de transplantatie. In de geconserveerde transplantaten ontwikkelden zich intralobulaire oedemen in verschillende mate na 5-10 min hernieuwde perfusie. De milt 20 werd in alle gevallen goed geperfundeerd. Zoals is vermeld in

Tabel B gingen 5 honden dood? 3 in de controlegroep en 2 in groep 3 ( 72 uur geconserveerd). De doodsoorzaken stonden niet in verband met de transplantatie en alle honden gingen met functionerende transplantaten dood.

25 Ten tijde van de pancreatectomie vertoonden alle transplantaten (zelfs in de controlegroep) verschillende tekenen van fibrose , evenals de milt. Arteriele en veneuze thrombose was in geen enkel transplantaat zichtbaar.

De bloedglucosewaarden na transplanta-30 tie en de IVGTT-resultaten zijn voor elk dier in Tabel B vermeld.

De gemiddelde waardm( + SEM ) voor elke bestudeerde grogp zijn eveneens in tabel B vermeld. De gemiddelde bloedglucosewaarde tijdens de eerste week na transplantatie was het grootst in 35 groep 3 (124+ 6 mg%) en deze waarde verschilde significant (P< 0,05) vergeleken met de waarden voor groep 1 (94+ 7 mg%) en groep 2 (107 + 7 mg %). De gemiddelde K-waarde op dag 1 was eveneens significant lager ( P< 0,05 ) in groep 3 (185 + 0,15%) vergeleken met groep 1 ( 2,44 + 0,14 %) en groep 2 ( 2,53 + 0,22%).

8803186 ,T

- 12 - %

In groep 3 bleven de K-waarden op de dagen 14 (1,7+0,1%) en 28 (1,61 + 0,19 %) gelijk aaide K-waarde op dag 1 (P= NS) . In de groepen 1 en 2 daalden de K-waarden en 2 weken na transplantatie waren er geen significante verschillen tussen 5 de drie groepen. Vier weken na transplantatie was de K-waarde voor groep 3 beter dan voor groep 2, maar wat lager vergeleken met de controlegroep (statistische significantie kon niet worden vermeld wegens het kleine aantal in groep 1).

10 8803186; * - 13 - φ β ι a S3 φ ο Ü £ Λ c - « η. its ·Η Ό Ό 't 0 0 C * C 5 5 r< m β η Φ Ό Ό § ο> φ ιβ εη φ £, Οι ιβ θ' <β Φ Ö* 01 C Ό ιβ C Ό ^ .3 Ό ·Η Ö β .¾ η- Ε Ό « ® ΐ cm ιηο<ΝΦ θ' 21 οι Ό Ή Φ Φ g ιβΦ ιβ .Q Φ -β 'ΟΌ Οι β ·Η fi Φ 3ft ο «1 Ιβ Φ 'i* ^ u TSS Ό Μ Όϋ Η Η Ο <η Ο -Ρ Ο 2 η, Μ ο m Ο fi 00 φ φ ig φ Ό ·Η Ό Μ fi » ^ ^ 2 «8 8 μ « 0" 3 3 ο SÜJ ! Η : <ί ! *J ! ι Η Η +|

ϊ g * ο S

S ΚΗ“ Η

S-I

Φ > β Φ Λ οι ιή β * Λ η ο - - vq ο § f Λ S R , SJ 5' t * 3 8

CM* ιΗ 1 r-1 »—I 00 ^^CMHOO

. +> I > <N * ι—I

Φ 5 * H _ -° c

g-S

7ί Μ* N

O Jj CM

03 HP «.

o ο o U'S— t" oo m vo oo , io in ιο ω Ümo> οί io r- m +1 i- « in I> +1 « S Ü >S ^ οί cm cm“ cm" MJ N CM CM H n c s o \

1 > 1-1 CM CM

Φ « w — ^

•H

-P

o

§OT cm m oo η o °0 «η <33 o VO

V ο φ cof^iDWior^ a ο Φ h >-i Φ Oi * +J +! +1 +1 +[ +1 +1 -H +1 +l +l ο ·ό r~ r-ι ·<? σι m in cn ή <n ^ in ζ a E ΐ. (v rr) ^ fnOO CO ΙΟ ι—i CO o vo S SÏ? s rt o 5 ” S σ.Φ2;33 (Q φ w- r—t r-1 I 3 _ hi Φ O fi C fi 21 Ο&ΑίΦΟΦ'Ο

.5 r-tm H3I-I U_^rH

£ <υ.θΦΐβοΦ3Φ3Φ Φ Φ φ φ ΦΦ ·ο 2 φ ΦΛίΦ^'α & Ο O O OO -Η β Λβ Λ Λ. ^

Λ1 ι, ι, o Li U Ê -Η *ΰ (!) (!) K

S £ Ü £ ί Ü I -C -C ΛΌΛ-ΟΦ o o o o oo co®cofioofioofi

5 g g g o Ο -Μ· Μ Μ* -Η M- -rt- Μ* -H

* O ·· " B 01 Ό ft 91 c φ 2

00 S

® Uj—jCMlO-tfin C3 10 I> 00 03 88 03 186.

' Φ I

•Η Φ - ΙΑ - m Ό 3 ·Η m 3 Ή Ό φ 3 φ Φ Η Φ ιβ &ι 3 - 3 Φ 3 Η tn ft Ό 3 f Φ J in τι Β Φ υ g » !Ρ * 3 Ο -η φ Ο ·Η 3 τι Η Ό Ο Ο Ό σι Η ο οο οο η m m * η η φ ο η η ο Ν I Η I ·* W * CNJ I »—ί I—I I <Ν I—f ι—I +|

CM

10 Η 00 Η *» Ο

CQ

CM ΟΓ*- Γ'"- ΙΟ t*'* +1 η ιη η η σ> οο r* (1) * | { ·» * *» Η ,Ρ Η I Η CM I Η Η Η P"* fO * -Ρ Η & η <ϋ ο m > Η Μ Q) Ο > ι^ηιηιηο) iocni^ +| 'ΦΓ'Ηΐηο η σι r->

w ^ · κ »> ^ s ·· IP

iH«HrHCMCM CM Η Η 00 ν Η

fO

00 00 ΙΟ Η CO OHO σ* η σ> ο σ> ιη ^ οο η m Η Η Η +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 σ' m γ-· σι ο οο cm ο σ> m ιϋ

^ h. W Κ h. h. ta. »» W CM

m oo cm m oo room m

HomoH'a,mi-icv sh r—( i—[ i—I i—I rH i—I f—i rH rH Φ (Ö H 3 ft Eh Φ Eh

O O

3 3 >

φ Ό O' H

3 H

(S3 Φ · έ o Ό mm φ a τ} > > Λ Ή Φ £ ~ ~ ,τ! ό Φ mm ο ο ο C0 3 - - ·· [^ ·Η Ο Ο ft ft ft φ - “ 0 3 ο η cm m ιη ιο η» ÜHHHHH ΗΗι—( IÖ J0 8803186.

♦ - 15 -

Alle honden werden hyperglycemisch (bloedglucose groter dan 200 mg %) na verwijdering van de pancreas, wat erop wijst dat het getransplanteerde orgaan alleen verantwoordelijk was voor de glucosehomeostase.Vier dieren uit groep 3 werden 5 bekeken op overleven gedurende langere tijd. Een hond ging 7 weken na transplantatie dood aan pneumonie, maar bleef normoglyce-misch. Twee dieren werden na 3 en 4 maanden gedood , en een hond werd gedurende 6 maanden gehouden . Alle honden vertoonden geen tekenen van diabetes en waren normoglycemisch.

10

Voorbeeld III

Conservering van de lever gedurende 24 uur

De klinische conservering van de lever 25 is beperkt tot ongeveer 6-10 uur en het verlengen van deze periode tot 24 uur of meer zou belangrijke gevolgen kunnen hebben op levertransplantaties. De geïsoleerde, geperfundeerde konijnelever werd gebruikt ter beoordeling van de kwaliteit van de conservering na koud bewaren in Collins' oplossing , 20 Cambridge plasmaprotelne-fractie (PPF) , Marshalls' oplossing , en de oplossing volgens de uitvinding (Tabel A). De galproduktie tijdens normothermische perfusie van in de kou bewaarde levers was de meest bruikbare parameter voor de levensvatbaarheid en de snelheid van de galproduktie (ml/100 g/h + SD) in de 25 controlegroep versus 24 uur in de kou bewaarde konijnelevers wordt in onderstaande tabel vermeld.

Controle Cambridge Eurocollins Marshalls Conserverings- oplossing PPF volgens de uit- 30 vinding 5,4+1,7 1,8+0,9 1,9+1,3 3,1+0,5 4,4+ 0,5

De beschreven conserverings^plossing volgens de uitvinding was superieur ten opzichte van andere oplossingen 35 voor koud bewaren op basis van de galproduktie na 24 uur koud bewaren (2,4 °C) en normothermische hernieuwde perfusie.

De uiteindelijke proef voor succesvolle leverconservering is het transplantatiemodel . De 8803186 Γ - 16 - * conserveringsoplossing werd dan ook onderzocht in het orthotope levertransplantatiemodel bij honden . Na eenvoudige perfusie met de oplossing werden 3 hondelevers 24 tot 26 uur bewaard .

De transplantatie werd uitgevoerd onder toepassing van een 5 gecombineerde " cuff" en hechtingstechniek. Alle levers zagen er onmiddellijk bevredigend uit en alle drie honden werden prompt wakker en waren binnen 4 uur na de procedure weer op de been .

De bloedplaatjestellingen waren 6 uur 10 na de operatie normaal. Bilirubine- en enzymwaarden na 6 uur en gedurende de daarop volgende 7 dagen zijn in de tabel vermeld (gemiddelde + SD) en wijzen op een snelle terugkeer van de normale leverfunctie. Een hond ging 5 dagen na de operatie dood ten gevolge van intussusceptie.

15 6 uur Dag 1 Dag 3 Dag 5 Dag 7

Bilirubine mg% 0,6+0,3 0,7+0,6 0,9+0,7 0,5+0,4 0,4+0,2 SGOT 2148+983 1835+1145 61+ 16 55+ 40 45+ 21

Alk. fos. 186+ 14 217+ 47 273+126 311+ 64 315+ 48 20

Voorbeeld IV

Nierconservering

De beschreven oplossing voor koud bewaren 25 (CS) werd onderzocht op nierconservering, en het effect op de nierfunctie na hernieuwde perfusie werd onderzocht 1) in het geïsoleerde, geperfundeerde niermodel bij honden (IPK) en 2) in het autotransplantatie-model bij honden.

1) Hondenieren werden 48 uur in de 3Q kou bewaard hetzij in Eurocollins (EC) oplossing hetzij in de beschreven oplossing voor koud bewaren (CS). De nierfunctie werd bepaald tijdens de hernieuwde perfusie met het IPK-model onder toepassing van een geoxygeneerd, gemodificeerd albumine bevattende Krebs-Henseleit-

O

oplossing bij 37 C gedurende 90 min. Urinemonsters werden elke 35 10 min verzameld en geanalyseerd. GFR (creatinineklaring ), urine/plasma- proteïne (U/P) en fractionele natrium-herabsorptie (% Na) werden berekend. De resultaten zijn in Tabel C vermeld als gemiddelde met 8803186Γ * - 17 - tussen haakjes de standaarddeviatie.

Beide groepen in de kou bewaarde nieren hadden een verminderde nierfunctie ten tijde van de hernieuwde perfusie (vergeleken met controlenieren). In tegenstelling tot in 5 EC bewaarde nieren verbeterden van in CS bewaarde nieren de GFR en natrium-herabsorptie significant tijdens IPK . Deze verbetering in functie doet vermoeden dat nieren die in CS worden geconserveerd koude ischemische beschadiging sneller kunnen herstellen dan nieren die in EC zijn bewaard.

10 2) 8 Hondenieren die 48 uur in CS

waren geconserveerd zijn onderworpen aan autotransplantatie. Drie dieren gingen dood door technische complicaties ( arteriele thrombose, intussusceptie) . De serumcreatinines ( gemiddelde + SD) na transplantatie van de vijf overlevenden zijn in Tabel D vermeld.

15 De studie wijst op een goede conser vering van de nierfunctie gedurende 48 uur koud bewaren met de CS-oplossing. Deze oplossing kan dan ook de nier, pancreas en lever conserveren en kan worden gebruikt voor eenvoudig koud bewaren of 20 continue perfusie.

88 03 186: --,---j- - ! - 18 - 1 1 ! 1 1

1 1 I

- ΰ ιη ! Γ οο ο ! cm ^ ~ ι — ο) οο (Λ 00 «Μ 2 CO CM Ο CO 00 I 00 ΙΟ ΓΜ έΤ - - ~ - - - Η CM I ^ - -

-σΐΜ, _7ΗΓ' 0*·-Ι «· Ο CM

Η j CM CM j OOI Ο ΟΙ Η 00 Η 00 ! m Ο Ο ! Ο Η O' I Η^Ρ·· | Ο Ο 00 ιΟ MS οο ΙΟ Ο οο ιο I 00 ΙΟ 00 Ο - - - ! 'Ο - - j - - - I ^ '__ ΙΜ Ο Ο ! ,„ Γ"- r-l | Ο Ο Ο I οοογ«- η Ο Η ι Ο ΙΟ ι ΐσΐ'ίΟΟ I Η I ! 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 I

—.lOOlCoOr-tllO-'-'l OOM

^«^^. ‘lOr^ Ot^CMI — — ι—I >-00 ] 1 -- j > Ο οι I ^ .-Η CO Η - -Η'3, ~*·0000 0·.-Ι TfHr' ο, «a* η Mr η «μ ooi > - * +1 o — ^ — — I — — — | O O 10 ___ ID I — — —

O Η O Ι m CM CO CM ΙΟ Μ* I IOCMO

O^VO jSoOO HOOCOl OIOCM M1 - - - w - - - - - ι - - - σι -oo ίοΜ'νο Μ-ί'ΟΟΟΟ ΟΟΟΙ <Jl CO CD H - fl cm ~ oo cm ισιιοοο o, ! S ! { +1 | | --

1 1 I

! ' I ^ I 00 * 00 I H - 1 °, Λ Λ ^ Λ ι +1 — — — _ o ιο cm — -^1 — — — oo'ioMrcor^ ocricoi r^ooco ---- or>-'t I'-- kOHi'a'or^ a

_ --- — 00 00 O--I --- CO

“ on 00 M S Η Η OOI OOOlO hi O' - m “-- M2 -- ---1 Η H - ι mo, I0000 m 000 0oo00l IO Ifl H fiC +1 Η Μ1 N Ϊ CO CM H ΙΟ I .H 00 Γ" EH-- ---1^ - -[ - --1 ---

IOI^Co MCCT'I^ OOOI OCOIO COLO

HH pL CM CM ι lOlOOO CD --

ü - ! H ?I

hi 1 —-- « i iC 1 ° -

Eh I co - O

1 00 , I +1 ? d M 2 oiojcMOOMI H n > (^oocoio - τι* ! oho ι οοσ>* οι οι -,. Μγ, 00 - ---1 -- Η - - _ w Γ1 ΓΜ $ ΙΟ ο ο ο ι ο ^ cm cm ο, ο — |S2 --1---1 +1 οο ,* ~Μ, m σι 00 ! σι οο οο I Η ^ 01 m3 Μ 2 οο οιο^ι σι οο ο - οο ιο σι - - ---ι --- <a< ο 0Μ * ' Μί οο CD Ο Ο Ο I 00¾^ 00 - -

Η 10 W Μν I Olcfcc CM ι—I

I I'j I t 4-1 I OM I T| ! ! ι h

III ιοί CM - H

ι CM , I +1 I w _ ι m 1 ΗΓ- * U CQ I * u CO I * j O Η„ o U-HOlUWOjU^yi^um ο O0+) I u w u--

III CM

I C oo - Öi I Φ ‘O, w e I 1 « ! *! ° H +i Ö s j j 5 ! ® —i M Cn ι I 3 j C Φ ^ c -p.1 c" ι λ So, 41 w Pi I Jim Ο υε ti g t ! ! & ! ° ö e - 5 5-5 αί-ξ. tt, ι +> (1) 9 0) .5 M <e π u n β

« ηβ o3 q-I ¢3 0 rt <B -H

. s_p 3 1_p 1 p ι_<*o u I q| m -p_ 8803 186.'

Claims (13)

1. Samenstelling die geschikt is voor het conserveren en bewaren van een orgaan dat bestemd is voor implantatie in een patient, net bet kenmerk, dat de samenstelling bestaat uit een lactobionaat en een hydroxyethylzetmeel dat 5 geen of nagenoeg geen ethyleenglycol, ethyleenchloorhydrine, natriumchloride en aceton bevat en dat een moleculairgewicht van 150.000 tot 350.000 dalton heeft.

2. Samenstelling volgens conclusie 1, net het kennerk, dat het zetmeel geen of nagenoeg geen hydroxy- 10 ethylzetmeel met een moleculairgewicht van minder dan 50.000 dalton bevat.

3. Samenstelling volgens conclusie 1 of 2, net het kennerk, dat de osmolaliteit van de oplossing ongeveer 320 mOSm/1 is .

4. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het zetmeel een moleculairgewicht van 200.000 tot 300.000 dalton en een substitutie-graad van 0,4 tot 0,7 heeft.

5. Samenstelling volgens één van de 20 voorgaande conclusies, net het kennerk, dat de samenstelling eveneens omvat een elektrolyt welke geschikt is voor het handhaven van de levensvatbaarheid van de cel en een geneesmiddel dat geschikt is voor het verminderen van infectie.

6. Samenstelling volgens conclusie 5, 25 set het kennerk , dat deze kaliumdiwaterstoffosfaat, calcium- chloride, dexamethason en/of penicilline omvat.

7. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies, net het kennerk, dat deze raffinose omvat.

8. Samenstelling volgens één van de 30 voorgaande conclusies, net het kennerk, dat deze glutathion omvat.

9. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies, net het kennerk,dat deze een gluconaat omvat.

10. Samenstelling volgens één van de 98 03 186. i τ - 20 - voorgaande conclusies, met het kenmerk , dat deze adenosine, glucose , insuline, allopurinol en/of dexamethason omvat.

11. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het zetmeel in een 5 hoeveelheid van 3 tot 8 gew.% aanwezig is.

12. Werkwijze voor het conserveren van een orgaan dat bestemd is voor implantatie in een patient, met het kenmerk, dat men het orgaan in een samenstelling zoals gedefinieerd in één van de voorgaande conclusies brengt.

13. Toepassing van een samenstelling zoals gedefinieerd in conclusie 1 bij het conserveren en bewaren van een orgaan dat bestemd is voor implantatie in een patient. -o-o-o-o- 8803186.