ES2395014T3

ES2395014T3 - Métodos para conservar órganos y tejidos

Info

Publication number: ES2395014T3
Application number: ES03791557T
Authority: ES
Inventors: Marco Cicardi; Luigi Bergamaschini
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 2002-08-28
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2013-02-07
Anticipated expiration: 2023-06-06
Also published as: WO2004019968A1; EP1542710B1; US8748368B2; US20110008762A1; EP2386310A3; US7718617B2; JP5465648B2; US20040053206A1; US7166576B2; EP2386310B1; JP2011078417A; CA2496789C; EP1542710A4; AU2003243413B2; EP2386310A2; ES2709103T3; CA2496789A1; CY1121194T1; HK1076039A1; AU2003243413A1

Abstract

Un método ex vivo para conservar un órgano o tejido que comprende poner en contacto el órgano o tejido con unacantidad eficaz de un inhibidor de calicreina, en el que el inhibidor de calicreína es un polipéptido que consiste en losaminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2 o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2.

Description

Métodos para conservar órganos y tejidos.

Solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional U.S. No. 60/407.004, presentada el 28 de agosto, 2002.

Las enseñanzas completas de la solicitud anterior se incorporan en la presente memoria por referencia.

Antecedentes de la invención

La conservación de la viabilidad de los órganos donantes es un objetivo importante para el trasplante de órganos. Típicamente, el órgano que se va a trasplantar debe almacenarse y transportarse al receptor posible. La capacidad para prolongar la viabilidad celular del órgano durante el almacenamiento y transporte es muy importante para el éxito de la operación de trasplante. Las disoluciones de conservación juegan un papel importante en la longevidad del órgano. Las disoluciones para la conservación de órganos incluyen las descritas por Berdyaev et al., Pat. U.S. No. 5.432.053; Belzer et al., Pat. U.S. Nos. 4.798.824, 4.879.283 Y4.873.230; Taylor, Pat. U.S. No. 5.405.742; Dohi et al., Pat. U.S. No. 5.565.317; Stern el al., Pat. U.S. Nos. 5.370.989 Y5.552.267, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad. Sin embargo, existe una necesidad de métodos y disoluciones mejoradas para la conservación de órganos.

Las proteasas están implicadas en un amplio rango de rutas biológicas. En particular, las serina proteasas tales como calicreína, plasmina, elastasa, activador del plasminógeno uroquinasa, trombina, inhibidor de la coagulación asociado con la lipoproteína humana y los factores de coagulación tales como los factores Vlla, IXa, Xa, Xla y Xlla se han implicado en rutas que influyen en el flujo sanguíneo, por ejemplo, isquemia general y focal, invasión tumoral, fibrinolisis, pérdida de sangre perioperatoria e inflamación. Los inhibidores de serina proteasas específicas, por lo tanto, han recibido atención como dianas potenciales de fármacos para varias enfermedades isquémicas.

Uno de dichos inhibidores, aprotinina (también denominada inhibidor de la tripsina pancreática bovina o BPTI), obtenida de pulmón bovino, se ha aprobado en los Estados Unidos para uso profiláctico en la reducción de pérdida de sangre perioperatoria y la necesidad de transfusión en pacientes sometidos a CPB, por ejemplo, en el curso de un procedimiento de injerto de bypass arterial coronario. La aprotinina está disponible comercialmente con el nombre registrado TRASYLOL® (Bayer Gorporation Pharmaceutical Division, West Haven, Gonnecticut) y fue aprobada previamente para uso para tratar pancreatitis. La eficacia de la aprotinina está asociada con sus capacidades relativamente no específicas para inhibir una variedad de serina proteasas, incluyendo la calicreína plasmática y plasmina. Estas proteasas son importantes en varias rutas del sistema de activación por contacto (GAS).

GAS se activa inicialmente cuando la sangre completa se pone en contacto con la superficie de sustratos extraños (por ejemplo, caolín, vidrio, sulfato de dextrano o superficie óseas dañadas). La calicreína, una serina proteasa, es una enzima plasmática que inicia la cascada GAS dando lugar a la activación de neutrófilos, plasmina, coagulación y varias quininas. La calicreína se secreta como un zimógeno (pre-calicreína) que circula como una molécula inactiva hasta que es activada por un evento proteolítico pronto en la cascada de activación por contacto.

Sin embargo, el uso de inhibidores específicos de calicreína para la conservación de órganos no se ha demostrado con éxito.

U.S. 3.682.776 describe la conservación de órganos, tejidos y productos alimenticios por contacto con inhibidores de proteasas biológicos. WO 93/14122 describe una variante del dominio I del inhibidor de proteasa de tipo Kunitz humano del inhibidor de la ruta del factor tisular. WO 00/14235 describe inhibidores de proteasa que comprenden un dominio Kunitz. WO 95/21601 describe dominios Kunitz homólogos a BPTI que inhiben una o más calicreínas plasmáticas y/o tisulares. WO 03/103475 describe métodos para prevenir o reducir la isquemia y/o una respuesta inflamatoria sistémica en un paciente usando péptidos que inhiben serina proteasas.

Sumario de la invención

Esta descripción se basa en el descubrimiento de péptidos que inhiben las serina proteasas, tales como, por ejemplo, calicreína, que pueden emplearse con éxito para conservar un órgano pendiente de trasplante. Más específicamente, la descripción proporciona métodos para usar inhibidores de calicreína en un método para conservar un órgano o tejido y composiciones para dicho uso. La descripción también se refiere a métodos para reducir, inhibir o prevenir la lesión o daño por reperfusión en un órgano o tejido que se ha extraído de su huésped y a composiciones para dicho uso. Los péptidos de calicreína preferidos incluyen aquellos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nos. 6.333.402 y 6.057.287 de Markland el al., cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad.

En un caso particularmente preferido, la descripción está dirigida a composiciones que comprenden un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos:

Xaal Xaa2 Xaal Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 XaaS Xaa9 XaalO Xaall G)y Xaa13 Cys

XaalS Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26

Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa3S 01y 01y Cys Xaa39

Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa4S Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 xaaSo Cys

XaaS2 XaaS3 Xaa54 Cys XaaS6 XaaS7 XaaS8 (SEQ ID NO: 1),

en la que Xaa1 , Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno individualmente un aminoácido o están ausentes; Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41 , Xaa42, Xaa44 , Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52, Xaa53 y Xaa54 pueden ser cualquier aminoácido; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Asp y Glu; Xaa11 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Asp, Gly, Ser, Val, Asn, lIe, Ala y Thr; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys y Gln; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Gly, Ser, Asp y Asn; Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Asn, Ser, lIe, Gly, Val, Gln y Thr; Xaa18 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: His, Leu, Gln y Ala; Xaa19 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Pro, Gln, Leu, Asn elle; Xaa21 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Trp, Phe, Tyr, His elle; Xaa22 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe; Xaa23 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe; Xaa31 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, lIe y Thr; Xaa32 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Gln, Asp, Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly y Val; Xaa34 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Thr, lIe, Ser, Val, Ala, Asn, Gly y Leu; Xaa35 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr, Trp y Phe; Xaa39 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Gly, Ala, Ser y Asp; Xaa40 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Gly y Ala; Xaa43 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Asn y Gly; Xaa45 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Phe y Tyr; y en el que dicho polipéptido inhibe la calicreína y a métodos para usar dichas composiciones.

En un caso particular, las posiciones de aminoácidos específicos pueden ser las siguientes: Xaa6 puede ser Ala, Xaa7 puede ser Phe, Xaa8 puede ser Lys, Xaa9 puede ser Ala, Xaa10 puede ser Asp, Xaa11 puede ser Asp, Xaa13 puede ser Pro, Xaa15 puede ser Arg, Xaa16 puede ser Ala, Xaa17 puede ser Ala, Xaa18 puede ser His, Xaa19 puede ser Pro, Xaa20 puede ser Arg, Xaa24 puede ser Asn, Xaa25 puede ser lIe, Xaa26 puede ser Phe, Xaa27 puede ser Thr, Xaa28 puede ser Arg, Xaa29 puede ser Gln, Xaa31 puede ser Glu, Xaa32 puede ser Glu, Xaa34 puede ser lIe, Xaa35 puede ser Tyr, Xaa39 puede ser Glu, Xaa41 puede ser Asn, Xaa42 puede ser Arg, Xaa44 puede ser Arg, Xaa46 puede ser Glu, Xaa47 puede ser Ser, Xaa48 puede ser Leu, Xaa49 puede ser Glu y/o Xaa50 puede ser Glu; cualquiera de estos aminoácidos específicos en estas posiciones puede ocurrir individualmente o en combinación con uno o más de los aminoácidos en una o más posiciones descritas de otra manera.

En un caso particular, la presente descripción está dirigida a una composición que comprende un polipéptido como se ha descrito en la SEQ ID NO: 1, de manera que dos o más de las posiciones de aminoácidos siguientes se definen como sigue: Xaa10 puede ser Asp; Xaa11 puede ser Asp; Xaa13 puede ser Pro; Xaa15 puede ser Arg; Xaa16 puede ser Ala; Xaa17 puede ser Ala; Xaa18 puede ser His; Xaa19 puede ser Pro; Xaa21 puede ser Trp; Xaa22 puede ser Phe; Xaa23 puede ser Phe; Xaa31 puede ser Glu; Xaa32 puede ser Glu; Xaa34 puede ser lIe; Xaa35 puede ser Tyr; Xaa39 puede ser Glu; Xaa40 puede ser Gly; Xaa43 puede ser Asn; y Xaa45 puede ser Phe y a métodos para usar dichas composiciones. En otro caso, cinco o más de las posiciones de aminoácido siguientes se definen como sigue: Xaa10 puede ser Asp; Xaa11 puede ser Asp; Xaa13 puede ser Pro; Xaa15 puede ser Arg; Xaa16 puede ser Ala; Xaa17 puede ser Ala; Xaa18 puede ser His; Xaa19 puede ser Pro; Xaa21 puede ser Trp; Xaa22 puede ser Phe; Xaa23 puede ser Phe; Xaa31 puede ser Glu; Xaa32 puede ser Glu; Xaa34 puede ser lIe; Xaa35 puede ser Tyr; Xaa39 puede ser Glu; Xaa40 puede ser Gly; Xaa43 puede ser Asn; y Xaa45 puede ser Phe. En otro caso, 10 o más de los aminoácidos se definen como sigue: Xaa 1 O puede ser Asp; Xaa 11 puede ser Asp; Xaa13 puede ser Pro; Xaa15 puede ser Arg; Xaa16 puede ser Ala; Xaa17 puede ser Ala; Xaa18 puede ser His; Xaa19 puede ser Pro; Xaa21 puede ser Trp; Xaa22 puede ser Phe; Xaa23 puede ser Phe; Xaa31 puede ser Glu; Xaa32 puede ser Glu; Xaa34 puede ser lIe; Xaa35 puede ser Tyr; Xaa39 puede ser Glu; Xaa40 puede ser Gly; Xaa43 puede ser Asn; y Xaa45 puede ser Phe. En otro caso más, 15 o más de los aminoácidos se definen como sigue: Xaa10 puede ser Asp; Xaa11 puede ser Asp; Xaa13 puede ser Pro; Xaa15 puede ser Arg; Xaa16 puede ser Ala; Xaa17 puede ser Ala; Xaa18 puede ser His; Xaa19 puede ser Pro; Xaa21 puede ser Trp; Xaa22 puede ser Phe; Xaa23 puede ser Phe; Xaa31 puede ser Glu; Xaa32 puede ser Glu; Xaa34 puede ser lIe; Xaa35 puede ser Tyr; Xaa39 puede ser Glu; Xaa40 puede ser Gly; Xaa43 puede ser Asn; y Xaa45 puede ser Phe.

En un caso particular, la descripción está dirigida a una composición que comprende un polipéptido como se ha definido por SEO ID NO: 1, de manera que, si está presente, Xaa3 es Ser, Xaa2 es His, Xaa1 es Met, Xaa56 es Thr, Xaa57 es Arg y/o Xaa58 es Asp y a métodos para usar dichas composiciones.

En otro caso, la descripción está dirigida a una composición que comprende un polipéptido que comprende la 5

secuencia de aminoácidos:

~~~~~~~~~~.~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~k~~~~~~~~~_~

(SEQ ID NO;2). y métodos para usar dichas composiciones _.

En un caso particular, la presente descripción está dirigida a una composición que comprende un polipéptido de unión a calicreína de 53-60 aminoácidos que comprende un dominio Kunitz, en el que el dominio Kunitz comprende el potencial para enlaces disulfuro entre las cisteínas en las posiciones 5 y 55; 14 Y 38; Y 30 Y 51 (según las

10 posiciones de aminoácidos correspondientes al inhibidor de tri psi na pancreática bovina (BPTI», y que comprende además: aminoácido número 13 seleccionado de His y Pro; aminoácido número 16 seleccionado de Ala y Gly; aminoácido número 17 seleccionado de Ala, Asn y Ser; 15 aminoácido número 18 seleccionado de His y Leu; y

aminoácido número 19 seleccionado de Gln, Leu y Pro (SEO ID NO: 23). En un caso particular, la presente descripción está dirigida a una composición que comprende un polipéptido de unión a calicreina de 53-60 aminoácidos que comprende un dominio Kunitz, en el que el dominio Kunitz comprende el potencial para enlaces disulfuro entre las cisteínas en las posiciones 5 y 55; 14 Y 38; Y 30 Y 51 (según las

20 posiciones de aminoácidos correspondientes al inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI», y que comprende además: aminoácido número 13 seleccionado de His y Pro; aminoácido número 15 seleccionado de Lys y Arg; aminoácido número 16 seleccionado de Ala y Gly; 25 aminoácido número 17 seleccionado de Ala, Asn y Ser;

aminoácido número 18 seleccionado de His y Leu; y aminoácido número 19 seleccionado de Gln, Leu y Pro, aminoácido número 31 es Glu; aminoácido número 32 seleccionado de Glu y Gln;

30 aminoácido número 34 seleccionado de Ser, Thr e lIe; y aminoácido número 39 seleccionado de Gly, Glu y Ala (SEO ID NO: 24).

En un caso particular, la presente descripción está dirigida a una composición que comprende un polipéptido de unión a calicreína de 53-60 aminoácidos que comprende un dominio Kunitz, en el que el dominio Kunitz comprende una cisteína en cada una de las posiciones 5 y 55; 14 Y 38; Y 30 Y 51 (según las posiciones de aminoácidos

35 correspondientes al inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI» , y que comprende además: aminoácido número 13 seleccionado de His y Pro; aminoácido número 15 seleccionado de Lys y Arg; aminoácido número 16 seleccionado de Ala y Gly; aminoácido número 17 seleccionado de Ala, Asn y Ser;

5 aminoácido número 34 seleccionado de Ser, Thr e lIe; y aminoácido número 39 seleccionado de Gly, Glu y Ala (SEO ID NO: 24). En un caso particular, el dominio Kunitz se selecciona del grupo que consiste en:

~#l.(SBQ ID NO:24) KKDlJW2 (SBQ ID 00:2'>

KKlJI3#~(SEQ.lDNO:26) KI<iíl3N4(S~QIPN():21)

KlOIfJfl5(SBQm Nd:28)

Kl(DI;J#6{$~QlDNO:29)

JOOII3 .t[1.(SBQ.JI) NQ:lO)

lCKIII3 #8 (sBQm NO:!1)

KKI(I3#9(SEQID NO:~2) y

KKDJ3#lO.($BQ]P NO::!3)

como se describe en la Tabla 1.

10 Cada una de las composiciones descritas en la presente memoria puede usarse en los métodos de la descripción. Además, los compuestos descritos en la presente memoria pueden usarse en la fabricación de un medicamento o composición para las indicaciones o métodos descritos en la presente memoria.

Ahora, tomando como base la descripción que está contenida en la presente memoria, la presente invención proporciona lo siguiente:

15 Un método ex vivo para conservar un órgano o tejido que comprende poner en contacto el órgano o tejido con una cantidad eficaz de un inhibidor de calicreína, en el que el inhibidor de calicreína es un polipéptido que consiste en los aminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2 o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2.

Un método ex vivo para reducir el daño por reperfusión de un órgano durante cirugía y/o después de la extracción del órgano de un sujeto, que comprende poner el órgano en una disolución de almacenamiento y conservación de

20 órganos, en el que la disolución comprende un inhibidor de calicreina, en el que el inhibidor de calicreína es un polipéptido que consiste en los aminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2 o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2.

Una composición para conservar y/o almacenar un órgano que comprende una disolución de conservación de órganos ex vivo fisiológicamente aceptable y un polipéptido que consiste en los aminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2

o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2,

25 en el que la disolución de conservación de órganos ex vivo se selecciona del grupo que consiste en:

una disolución de conservación de órganos que comprende 3% a 8% de hidroxietil almidón, Na+ a 30±5 mM, K+ a 120±5 mM, mOsmllitro de 320±5 y trimetoprim a 16 mg/mL y sulfametoxazol a 80 mg/mL, pH 7,4;

una disolución de conservación de órganos que comprende, por litro, 50 g hidroxietil almidón, 100 mmoles K+lactobionato, 25 mmoles KH2P04, 5 mmoles MgS04, 30 mmoles rafinosa, 5 mmoles adenosina, 3 mmoles glutatión,

30 100 U de insulina, 0,5 mL Bactrim, 8 mg dexametasona y 1 mM alopurinol;

una disolución de conservación de órganos que comprende 85 mM a 145 mM NaCI, 3 mM a 6 mM KCI, 1,0 mM a 1,6 mM CaCb, 0,7 mM a 1,3 mM KH2P04, 0,9 mM a 1,5 mM MgS04, 0,05 mM a 5,0 mM alopurinol, 0,02 mM a 2,0 mM desferrioxamina, 0,5 mM a 10,0 mM glutatión, 0,1 ¡..1M a 5,0 ¡..1M nicardipeno, 0,1 mM a 5,0 mM adenosina, 1,0 mM a 50,0 mM fructosa, 1,0 mM a 50,0 mM glucosa, 5 U/L a 250 U/L insulina, 2 mM a 40 mM MOPS y 30 gIL a 100 gIL de un hidroxietil almidón modificado al 10%;

una disolución de conservación de órganos que comprende 50g/L de hidroxietil almidón modificado al 10%, 115 mM NaCI, 5 mM KCI, 1,30 mM CaCI2, 1 mM KH2P04, 1,2 mM MgS04, 1 mM alopurinol, 1 mM desferrioxamina, 3 mM glutatión, 2 ¡..1M nicardipeno, 1 mM adenosina, 10 mM fructosa, 10 mM glucosa, 100 U/L insulina y 20 mM MOPS, pH 6,5;

una disolución de conservación de órganos que comprende 85 mM a 145 mM NaCI, 3 mM a 6 mM KCI, 1,0 mM a 1,6 mM CaCI2, 0,7 mM a 1,3 mM KH2P04, 0,9 mM a 1,5 mM MgS04, y 0,12 mM a 1,2 mM adenosina; y

una disolución de conservación de órganos que comprende 115 mM NaCI, 5 mM KCI, 1,30 mM CaCI2, 1 mM KH2P04, 1,2 mM MgS04, 1 mM alopurinol, 1 mM desferrioxamina, 3 mM glutatión y 0,12 mM adenosina.

En las reivindicaciones adjuntas se muestran aspectos y realizaciones adicionales de la invención

Descripción breve de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama simplificado de rutas múltiples principales y eventos relacionados implicados en el sistema de activación por contacto y respuesta infamatoria sistémica (SIR) que pueden surgir en un paciente sometido a trauma de tejido blando y óseo tal como el asociado con un procedimiento de injerto de bypass arterial coronario (CABG), especialmente cuando el procedimiento CABG implica circulación sanguínea extra-corpórea" tal como bypass cardiopulmonar (CPB; Aparato de Bypass) . Las flechas indican la activación desde un componente o evento a otro componente o evento en la cascada. Las fechas en ambas direcciones indican los efectos activadores de los componentes o eventos en ambas direcciones. Las flechas rotas indican la participación probable de un componente

o evento en la activación de otro componente o evento. Las abreviaturas son como sigue: "tPA" = activador de plasminógeno tisular; "C5a" = un componente proteico del sistema de complemento; "fXlla" = proteína activadora de pre-calicreína para formar calicreína activa; "Extrínseco" =sistema de coagulación extrínseco; "Intrínseco" =sistema de coagulación intrínseco.

La FIG. 2 muestra una parte de un ADN y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente para un polipéptido inhibidor de calicreína ("KI") de la descripción en el plásmido pPIC-K503. El ADN insertado codifica el péptido señal de prepro mata de Saccharomyces cerevisiae (subrayado) fusionado en marco con el extremo amino del polipéptido KI PEP-1 que tiene la secuencia de aminoácidos contenida en el área enmarada. La secuencia de aminoácidos del polipéptido KI PEP-1 mostrada en la región enmarcada es SEQ ID NO: 2 y la secuencia de nucleótidos codificadora correspondiente del polipéptido KI es SEQ ID NO: 3. Las flechas discontinuas indican la localización y dirección de dos secuencias cebadoras de PCR en regiones AOX que se usaron para producir los moldes de secuenciación. La secuencia de ADN para la secuencia de nucleótidos completa de la figura comprende la secuencia codificadora estructural para la proteína de fusión y se designa SEQ ID NO: 35. La parte doblemente subrayada de la secuencia indica una secuencia de sonda de diagnóstico. BstBl y EcoRI indican las localizaciones de sus sitios de endonucleasa de restricción palindrómicos, hexaméricos, respectivos, en la secuencia. Los asteriscos indican codones de parada de la traducción.

La FIG. 3 muestra el alineamiento de secuencias de aminoácidos de los casos preferidos de la descripción.

Descripción detallada de la invención

Una descripción de los casos preferidos de la descripción se muestra a continuación.

La descripción se basa en el descubrimiento de polipéptidos inhibidores de calicreína (KI) que inhiben la calicreína plasmática con una especificidad que permite su uso en métodos mejorados para conservar órganos y tejidos, tales como pendientes de un trasplante, y en los métodos correspondientes. La descripción también se refiere a reducir, inhibir o prevenir la lesión o daño por reperfusión en un órgano o tejido que se ha extraído de su huésped y a las composiciones de éste.

Polipéptidos Útiles en la Práctica de la Descripción

Los polipéptidos KI útiles en la práctica de la descripción comprenden polipéptidos con dominio Kunitz. En un caso, estos dominios Kunitz son formas variantes que comprenden la estructura en bucle del dominio Kunitz 1 de la proteína inhibidora de la coagulación asociada con la lipoproteína humana (LACI). LACI contiene tres estructuras peptídicas en bucle internas, bien definidas que son dominios Kunitz paradigma (Girard, T. et .al., 1989. Nature, 338: 518-520). Los tres dominios Kunitz de LACI confieren la capacidad de unir e inhibir calicreína, aunque no con una afinidad excepcional. Las variantes del dominio Kunitz 1 de LACI descritas en la presente memoria se han cribado, aislado y unen calicreína con afinidad y especificidad aumentadas (véase, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos.

5.795.865 y 6.057.287, incorporadas en la presente memoria por referencia). Un ejemplo de un polipéptido preferido útil en la práctica de la descripción, incluyendo la invención, tiene la secuencia de aminoácidos definida por los aminoácidos 3-60 de SEQ ID NO: 2.

Los polipéptidos que unen calicreina pueden usarse para dirigir moléculas terapéuticas o de diagnóstico a la calicreína, por ejemplo, en órganos, tejidos, células u organismos completos. Dichos métodos de administración dirigida para propósitos terapéuticos o de diagnóstico serán conocidos para el experto en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos que unen calicreina dirigidos podrian usarse por un experto en la técnica para identificar un órgano que

5 ha sido dañado por los efectos de la calicreina o la calicreína puede ser tomada como diana para los efectos de un agente terapéutico particular usando polipéptidos que unen calicreina de la descripción.

Cada polipéptido útil en la práctica de la descripción se une a calicreína. En casos preferidos, los polipéptidos son inhibidores de calicreína (KI) según se determina usando ensayos de unión e inhibición de calicreína conocidos en la técnica. La afinidad y especificidad aumentadas para la calicreína de los polipéptidos con dominio Kunitz variantes

10 descritos en la presente memoria proporciona la base para su uso en CPB y especialmente procedimientos quirúrgicos CABG para prevenir o reducir la pérdida sanguínea perioperatoria y/o SIR en pacientes sometidos a dichos procedimientos. Los polipéptidos KI usados en la práctica de la descripción pueden tener o comprender la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con dominio Kunitz variante aislado originariamente cribando bibliotecas de exposición en fagos para la capacidad de unir calicreína.

15 Los polipéptidos KI útiles en los métodos y composiciones de la descripción comprenden un polipéptido con dominio Kunitz que comprende la secuencia de aminoácidos:

X4al Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 XaalO Xaall GIy Xaa13 Cys

Xaal S Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xlal9 XaalO Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa2S Kaa26

Xaa27 Xaa28 Xaa29 C)'I Xaall Xaa32 Phe Xaa34 Xaa3S Oly Gly C)'s Xaa39

Xaa40 Xaa41 Xea42 Xaa43 Xaa44 Xaa4S Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 xaaso Cys

XaaS2 XaaS3 XaaS4 Cys XaaS6 XaaS7 XaaS8 (SEQ ID NO:1)

"Xaa" se refiere a una posición en una cadena peptidica que puede ser cualquiera de varios aminoácidos diferentes. Por ejemplo, para los péptidos KI descritos en la presente memoria, Xaa10 puede ser Asp o Glu; Xaa11 puede ser 20 Asp, Gly, Ser, Val, Asn, lIe, Ala o Thr; Xaa13 puede ser Pro, Arg, His, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys o Gln; Xaa15 puede ser Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn o Gln; Xaa16 puede ser Ala, Gly, Ser, Asp o Asn; Xaa17 puede ser Ala, Asn, Ser, lIe, Gly, Val, Gln o Thr; Xaa18 puede ser His, Leu, Gln o Ala; Xaa19 puede ser Pro, Gln, Leu, Asn o lIe; Xaa21 puede ser Trp, Phe, Tyr, His o lIe; Xaa31 puede ser Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, lIe o Thr; Xaa32 puede ser Glu, Gln, Asp, Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly o Val; Xaa34 puede ser lIe, Thr, Ser, Val, Ala, Asn, Gly o

25 Leu; Xaa35 puede ser Tyr, Trp o Phe; Xaa39 puede ser Glu, Gly, Ala, Ser o Asp. Los aminoácidos Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41 , Xaa42, Xaa44, Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52, Xaa53 y Xaa54 pueden ser cualquier aminoácido. Además, cada uno de los cuatro primeros y al menos tres aminoácidos de SEQ ID NO: 1 pueden estar opcionalmente presentes o ausentes y pueden ser cualquier aminoácido, si están presentes.

30 Los péptidos definidos según la SEQ ID NO: 1 forman un conjunto de polipéptidos que se unen a e inhiben la calicreína. La diversidad de los KI se incrementa al incrementarse el número de posiciones variables en la secuencia peptidica o al incrementarse el número de aminoácidos posible en una posición variable. Por ejemplo, en un caso preferido de la descripción, un polipéptido KI útil en los métodos y composiciones de la descripción tiene las posiciones variables siguientes: Xaa11 puede ser Asp, Gly, Ser o Val; Xaa13 puede ser Pro, Arg, His o Asn; Xaa15

35 puede ser Arg o Lys; Xaa16 puede ser Ala o Gly; Xaa17 puede ser Ala, Asn, Ser o lIe; Xaa18 puede ser His, Leu o Gln; Xaa19 puede ser Pro, Gln o Leu; Xaa21 puede ser Trp o Phe; Xaa31 es Glu; Xaa32 puede ser Glu o Gln; Xaa34 puede ser lIe, Thr o Ser; Xaa35 es Tyr; y Xaa39 puede ser Glu, Gly o Ala.

Un caso más específico de la descripción se define por los aminoácidos siguientes en las posiciones variables: Xaa10 es Asp; Xaa11 es Asp; Xaa13 puede ser Pro o Arg; Xaa15 es Arg; Xaa16 puede ser Ala o Gly; Xaa17 es Ala;

40 Xaa18 es His; Xaa19 es Pro; Xaa21 es Trp; Xaa31 es Glu; Xaa32 es Glu; Xaa34 puede ser lIe o Ser; Xaa35 es Tyr; y Xaa39 es Gly.

En el alcance de la descripción también están englobados péptidos que comprenden partes de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, los polipéptidos podrían comprender dominios de unión para epítopos de calicreína especificos. Dichos fragmentos de los polipéptidos descritos en la presente memoria también

45 estarían englobados.

Los polipéptidos KI útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria comprenden un dominio Kunitz. Un subconjunto de las secuencias englobadas por SEQ ID NO: 1 se describe por lo siguiente (cuando no se indica, "Xaa" se refiere al mismo conjunto de aminoácidos que se permiten para SEQ I NO: 1):

Met His Ser Pbe Cys Ala Phe Lys Ala XaalO Xaall GIy Xaa13 Cys Xaal S Xea16 Xaa17 X8a18 Xaa19 Al¡ Xaa21 Phe Phe Aan DePbe Thr Ara GIn Cys Xaa3t Xaa32 Pbe Xaa34 Xaa3S GIy 01y Cya Xaa39 GJy Aso GJn Asn Axg Pbe GIu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Ara Asp (SBQ ID NO:36).

Los ejemplos específicos y particulares de los péptidos KI útiles en la práctica de la descripción son como sigue:

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

~~~~~&~~~~~~~~~~~~~~

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

(aminoácidos 3-60 de SEQ ID NO: 2),

Met His Ser Phe Cys Ala Pbe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala Asn His Leu

~~~~~.~~~~~~~~k~~~~ ~~~~~~~~k~~~~~~~~~~

Asp (SEQ ID NO:4),

~~h~~~~~~~~~~~~~~~~

Arg Phe Phe Phe Asn DePhe Thr Arg GIn Cys Glu Glu Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Gtu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO;S),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gln

~~~~~.~~~~~~~~.~~~~

AJa Oly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Sor Len G1u Olu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:6),

Met Mis Ser Phe Cys Ala Phe Lys AJa Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Ser Leu Pro Arg Phe Phe Phe Asn De Phe Thr Arg GIn Cys Glu Glu Phe lle Tyr Gly Gly Cys Gly GJy Asn Gln Asn Arg Pbe Glu Ser Leu GJu Glu Cys Lys Lys Me1 Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO;7)J Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Aja Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn De Phe Thr Arg GIn Cys OJu GJu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys G1y Oly Asn Gln Aso Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys 1hr Arg Asp (SEQ ID NO:8), Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys GJy Ala His Leu Arg Phe Pbe Phe Asn Ile Phe Thr Arg GIn Cys Glu Glu Phe De Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO;9),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Aja Asp Asp Gly Arg Cys Lys Gly Ala His Leu Arg Phe Phe Phe Asn lle Phe Thr Arg Gln Cys Otu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Olu Ser Leu GJu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 10).

Met liis Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Gly Gly Arg Cys Arg Gly Ala His Pro

Arg Trp Phe Phe Asn lIe Phe Thr Arg Gln Cys Olu Olu Phe Ser Tyr Gly GJy Cys

Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Olu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg

Asp (SEQ ID NO: 11).

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ata Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Pbe Phe Asn De Phe Thr Arg Gln Cys OJu Glu Phe Ser Tyr GJy Gly Cys Gly Gly Asn GIn Asn Arg Phe OJu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: (2),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Val Gly Arg Cys Arg Gly AlaHis Pro Arg Trp Phe Phe Asn ne Phe Thr Arg GIn Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly 01y Asn GEn Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:l3),

~~k~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~ ~~~~~~~~~~~~

..

~~~~~~~~k~~~~~~~~~~

Asp(SEQ ID NO:1 4),

Met Jiis Ser Phe Cys AlaPhe Lys Aja Asp Asp Gly Ser Cys Arg Aja Aja His Leu

Arg Trp Phe Phe Asn De Phe Thr Arg GJn Cys GJu Glu Phe Ser Tyr Oly Gly Cys

-: " .

Gl)' Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ 10 NO: 1S),

Met Bis Ser Pbe Cys Ala Phe Lys Ala Glu GJy GI)' Ser Cys Arg Ala Ala His Gln Arg Trp Phe Phe Asn He Phe Thr Arg GIn Cys GJu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu-Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 16),

Met His Ser Phe Cys AlaPhe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Gly Ala His Leu

~~~~~.~Th~~~~~~~~~~~

Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Alg Asp (SEQ ID NO: 17)"

Mel His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Arg Gly AJa Leu Pro Arg Trp Phe Phe Asn De .Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly GJy Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Len Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:18).

~~~~~~~~~~k~~~~~~~~

Arg Phe Phe Pbe Asn De Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys GIy Gly Asn (Un Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu. Glu Cys Lys Lys Met C)'S Tbr Arg Asp(SBQID NO:19).

~~k~~~~~~~~~~~_~~~~

~~~~~&~~~~~~~~~~~~~

~~~~~~~~k~~~~~~~~~~

Asp (SBQ ID NO:20),

~~k~~~~~~~~~_~~~~~~

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

Asp (SBQ mNO:21),

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~k~~~~ ~~~~~~~~k~~~~~~~~~~

Asp (SEQ ID NO:22).

La FIG. 3 proporciona un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de estas secuencias. Otros polipéptidos KI útiles en la práctica de la presente descripción incluyen:

~~~~~~~~~~.~~~~~~&.~ ~~~~~~~~~~~.~~~~~~~ ~~~~~~~k~~_~~~~~~~~

(SBQ ID NO:23),

~~~~~~~~~~~~~~~~k~~ ~~~~~~~~~~~~~~&~~~~~ ~~~~-~~~~~~~~~~~~~

(SEQ mN0:24),

Met His Ser Pbe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Aja Asn Hís Leu Arg Phe Phe Phe Asn fle Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn GIn Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:25),

Met His Ser Phe Cys Aja Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His GIn

Arg Phe Phe Phe Asn De Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Thr Tyr Gly Gly Cys

Gly Gly Asn Gln Asn A.rg Phe Glu Ser Leu GJu Glu Cys Lys LysMet Cys Thr ArJ

Asp (SEQ ID NO:26),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp GlyHis Cys Lys Ala Asn His Gln

~~~~~b~~~~~~~~~~~~~

Ala Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:27),

Met Bis Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Mis Cys Lys Ala Ser Leu Pro ~ . Arg Pbe Phe Phe Aso De Phe Thr Arg Gln Cys OJu GJu Phe De Tyr Gly Gly Cys Gly Oly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys LysLys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:28),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala .Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn Bis GJn

~~~~~~~~~~~~~~k~~~~

Gly Oly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:29») Met Bis Ser Pbe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn Bis Gln

~~~~~~~~~~~~~~k~~~~ ~~~~~~~~k~~~~~~~~~~

Asp (SBQ ID NO:30)J Met His Ser Pbe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Mis Cys Lys AJa Asn His OJn

~~~~~.~~~~~~~~S~~rny~~

Gly Gly Asn. Gln Asn Arg Phe GJu Ser Leu GJu Glu Cys Lys Lys Met Cys 1ñr Arg Asp (SEQ ID NO:31») Met His Ser Phe Cys AlaPheLys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Aso His Otn

~~~~~&~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~k~~~~~~~~~~

Asp (SEQ ID NO:32),

5 Met His Ser Phe Cys Ata Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Gly Ala His Leu Arg Phe Phe Phe Asn De Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe De Tyr Gly Gly Cys Gla;

-: .

Gly Asn Gln Asn Arg Phe OJu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp

(SEQ ID NO:33); Met His Ser Phe Cys AJa Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala De Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn De Phe Thr Arg Gln Cys GJu Glu Phe De Tyr Gly Gly Cys Glt Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO:34).

Estas secuencias se resumen en la Tabla 1 siguiente.

TABLA 1: Secuencias de aminoácidos de las variantes LACI(KI) seleccionadas para unión a calicreina plasmática humana.

13 16 17 18 19 31 32 34 39(a)

KlJY3#1 H s L p E E 1 E (SEQ ID NO:24)

KKlJI3#2 P A N H L E E s G (SEQ]l) NO;25)

KKII13#3 H A N H Q E E T G (SEQlDNO:26)

KK.DI3#4 H A N H E Q T A (SEQ IIlNO:27)

p 1 G

KKI1I3#S H A s L E E (SEQ ID NO:28)

KK.W3#16 H A N H Q E E s G (SEQlDNO;29)

KKll/31f7 H A N H Q E s (j (SEQ ID NO:30)

KlJY3#8 H A N H Q E E S G (Sf!Q 10 NO:.3J)

KXlII3t#9 H A N H Q E E S G (SEQ ID NO:32)

KKI113#IO H G A H L E E 1 E (SEQ DlNQ:33)

Consenso H A N H Q E SIT G

5 (a) Números de aminoácidos de residuos variegados. LACI(KI) (residuos de LACI 50-107 (SEO ID NO: 32» tiene una longitud de 58 aminoácidos siendo la posición P1 el número de residuo 15 y fijado como lisina en este caso.

Los polipéptidos útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria pueden hacerse sintéticamente usando cualquier protocolo y equipo de síntesis de polipéptidos estándar. Por ejemplo, la síntesis por etapas de un polipéptido KI descrito en la presente memoria puede realizarse por la eliminación de un grupo 10 protector amino terminal (N) de un aminoácido inicial (es decir, carboxi-terminal) y acoplándolo al extremo carboxilo del siguiente aminoácido en la secuencia del polipéptido. Este aminoácido también está protegido adecuadamente. El grupo carboxilo del aminoácido entrante puede activarse para reaccionar con el N-terminal del aminoácido únido por formación en un grupo reactivo tal como la formación en una carbodiimida, un anhídrido ácido simétrico, o un grupo "éster activo" tal como ésteres hidroxibenzotriazol o pentafluorofenilo. Los métodos de síntesis de péptidos en 15 fase sólida preferidos incluyen el método BOC, que utiliza ferc-butiloxicarbonilo como el grupo protector de a-amino y el método FMOC, que utiliza 9-fluorenilmetoxicarbonilo para proteger el a-amino de los residuos de aminoácidos. Ambos métodos son muy conocidos para los expertos en la técnica (Stewart, J y Young, J., Solid-Phase Peptide Synthesis 0N. H. Freeman Co., San Francisco 1989); Merrifield, J., 1963. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154; Bodanszky, M. y Bodanszky, A., The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Nueva York 1984), las 20 enseñanzas completas de estas referencias se incorporan en la presente memoria por referencia). Si se desea,

pueden designarse aminoácidos amino y/o carboxi terminales adicionales en la secuencia de aminoácidos y añadirse durante la sintesis del polipéptido.

Alternativamente, los polipéptidos con dominio Kunitz y los polipéptidos KI útiles en las composiciones y métodos de esta descripción, incluyendo los polipéptidos KI útiles en las composiciones y métodos de la invención, pueden producirse por métodos recombinantes usando cualquiera de varias células y vectores de expresión correspondientes, incluyendo pero no limitado a vectores de expresión bacterianos, vectores de expresión de levaduras, vectores de expresión de baculovirus, vectores de expresión virales de mamíferos, y semejantes. Los polipéptidos con dominio Kunitz y los polipéptidos KI útiles en las composiciones y métodos de la descripción también pueden producirse transgénicamente usando moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia codificadora para un dominio Kunitz o polipéptido KI descrito en la presente memoria, en el que la molécula de ácido nucleico puede integrarse en y expresarse a partir del genoma de un animal huésped usando métodos transgénicos disponibles en el técnica. En algunos casos, puede ser necesario o ventajoso fusionar la secuencia codificadora para un polipéptido con dominio Kunitz o un polipéptido KI que comprende el dominio Kunitz con otra secuencia codificadora en un vector de expresión para formar un polipéptido de fusión que se expresa fácilmente en una célula huésped. Preferiblemente, la célula huésped que expresa dicho polipéptido de fusión también procesa el polipéptido de fusión para rendir un dominio Kunitz o polipéptido KI útil en la práctica de la descripción que contiene sólo la secuencia de aminoácidos deseada. Obviamente, si cualquier otro aminoácido(s) permanece unido al dominio Kunitz expresado o polipéptido KI, dichos aminoácido(s) adicionales no deberían disminuir la actividad de unión a calicreína y/o inhibidora de calicreína del dominio Kunitz o polipéptido KI para descartar el uso del polipéptido en los métodos o composiciones de la descripción.

Un sistema de expresión recombinante preferido para producir polipéptidos KI útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria es un vector de expresión de levaduras, que permite unir una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para un polipéptido KI o polipéptido con dominio Kunitz en el mismo marco de lectura con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia del prepro péptido líder mata de Saccharomyces cerevisiae, que a su vez está bajo el control de un promotor de levadura operable. El plásmido de expresión de levaduras recombinante resultante puede transformarse por métodos estándar en las células de un huésped de levadura apropiado, compatible, siendo estas células capaces de expresar la proteína recombinante a partir del vector de expresión de levaduras recombinante. Preferiblemente, una célula de levadura huésped transformada con dicho vector de expresión recombinante también es capaz de procesar la proteína de fusión para proporcionar un polipéptido KI activo útil en los métodos y composiciones de la descripción. Un huésped de levadura preferido para producir polipéptidos con dominio Kunitz recombinantes y polipéptidos KI que comprenden dichos dominios Kunitz es Pichia pastoris.

Como se ha indicado anteriormente, los polipéptidos KI que son útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria pueden comprender un polipéptido con dominio Kunitz descrito en la presente memoria. Dichos polipéptidos KI pueden tener una secuencia flanqueante adicional, preferiblemente con una longitud de uno a seis aminoácidos, en el extremo amino y/o carboxi terminal, siempre que dichos aminoácidos adicionales no disminuyan significativamente la afinidad de unión a calicreína o actividad inhibidora de la calicreína de manera que descarten el uso en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria. Dichos aminoácidos adicionales pueden añadirse deliberadamente para expresar un polipéptido KI en una célula huésped recombinante particular o pueden añadirse para proporcionar una función adicional, por ejemplo, para proporcionar un péptido para unir el polipéptido KI a otra molécula o para proporcionar un resto de afinidad que facilite la purificación del polipéptido. Preferiblemente, el o los aminoácidos adicionales no incluyen cisteína, que podría interferir con los enlaces disulfuro del dominio Kunitz. Los ejemplos nativos de los dominios Kunitz presentan enlaces disulfuro, por ejemplo, BPTI contiene enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína en las posiciones de aminoácidos 5 y 55; 14 Y 38; Y 30 Y 51.

Un ejemplo de un polipéptido con dominio Kunitz preferido útil en los métodos y composiciones de la presente descripción, incluyendo los métodos y composiciones de la presente invención, tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 3-60 de SEQ ID NO: 2. Cuando se expresa y procesa en un sistema de expresión de proteína de fusión de levadura (por ejemplo, basado en el plásmido de expresión de integración pHIL-02), dicho polipéptido con dominio Kunitz retiene un dipéptido Glu-Ala amino terminal adicional de la fusión con la secuencia del péptido líder prepro mata de S. cerevisiae. Cuando se secreta de la célula huésped de levadura, la mayor parte del péptido líder se procesa a partir de la proteína de fusión para rendir un polipéptido KI funcional (también referido como "PEP-1" o "OX88") que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (véase la región enmarcada en FIG. 2).

Los polipéptidos KI particularmente preferidos útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria tienen una afinidad de unión para calicreína que es del orden de 1.000 veces mayor que la de la aprotinina, que está aprobada actualmente para uso en procedimientos CABG para reducir la pérdida sanguínea. Las afinidades de unión sorprendentemente altas de dichos polipéptidos KI descritos en la presente memoria indican que dichos polipéptidos KI presentan un alto grado de especificidad para calicreína para la exclusión de otras moléculas diana (véase la Tabla 1, más adelante). Así, el uso de dichos polipéptidos según la descripción reduce gran parte de la especulación de los agentes terapéuticos posibles. El menor grado de especificidad que presenta, por ejemplO, la aprotinina, da lugar a posibles efectos secundarios pleyotrópicos y ambigüedad respecto a su mecanismo terapéutico.

Los polipéptidos definidos, por ejemplo, por SEO ID NO: 1 contienen posIciones invariables, por ejemplo, las posiciones 5, 14, 30,51 Y 55 sólo pueden ser Cys. Otras posiciones tales como, por ejemplo, las posiciones 6, 7, 8, 9,20,24,25,26,27,28,29,41,42, 44,46,47,48,49, 50,52,53 Y 54 pueden ser cualquier aminoácido (incluyendo aminoácidos no naturales). En un caso particularmente preferido, uno o más aminoácidos corresponden a la de una secuencia nativa (por ejemplo, LACI (SEO ID NOS: 32-34». En un caso preferido, al menos una posición variable es diferente de la de la secuencia nativa. En otro caso preferido más, los aminoácidos pueden estar cada uno sustituidos individualmente o colectivamente con una sustitución de aminoácido conservativa o no conservativa. Las sustituciones de aminoácidos conservativas reemplazan un aminoácido con otro aminoácido de estructura química similar y puede no afectar la función de la proteína. Las sustituciones de aminoácidos no conservativas reemplazan un aminoácido con otro aminoácido de estructura química diferente. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadas incluyen, por ejemplo, Asn>Asp, Arg>Lys y Ser> Thr. En un caso preferido, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20 y/o 21 de estos aminoácidos pueden seleccionarse independientemente o colectivamente, en cualquier combinación, para corresponder con la posición correspondiente de SEO ID NO: 2.

Otras posiciones, por ejemplo, las posiciones 10,11, 13,15,16,17,18,19,21,22,23, 31,32,34,35,39,40, 43 Y 45, pueden ser cualquiera de un conjunto seleccionado de aminoácidos. Así, la SEO ID NO: 1 define un conjunto de posibles secuencias. Cada miembro de este conjunto contiene, por ejemplo, una cisteína en las posiciones 5, 14,30, 51 Y 55 Y uno cualquiera de un conjunto específico de aminoácidos en las posiciones 10, 11, 13,15, 16,17, 18, 19, 21,22, 23,31,32,34,35,39,40,43 Y 45. En un caso preferido, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y/o 19 de estos aminoácidos pueden seleccionarse independientemente o colectivamente, en cualquier combinación, para corresponder a la posición correspondiente de SEO ID NO: 2. El péptido tiene preferiblemente al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de identidad con SEO ID NO: 2.

Métodos y Composiciones

La presente descripción está dirigida a métodos para conservar órganos y tejidos que comprenden poner en contacto el órgano o tejido con una disolución de conservación que comprende un inhibidor de calicreína, tal como los descritos en la presente memoria. La descripción también se refiere a reducir, inhibir o prevenir la lesión o daño por reperfusión en un órgano o tejido que se ha extraído de su huésped que comprende poner en contacto el órgano

o tejido con un inhibidor de calicreína. Las disoluciones de conservación de la descripción, incluyendo las de la invención, pueden usarse para conservar y/o proteger tejido de órganos, u órganos completos, cuando dichos órganos o tejido se ponen en contacto con la disolución. Un caso especifico de la descripción, y una realización específica de la invención, es para la conservación de un corazón humano, o tejido miocárdico humano. Otro caso de la descripción, y otra realización de la invención, es para la conservación de un pulmón humano o tejido pulmonar humano. Otros órganos, o partes de éstos, que pueden conservarse según la descripción, incluyendo la invención, incluyen riñón, hígado, tejido endotelial, tejido intestinal, tejido vascular (por ejemplo, un injerto de aorta), piel y páncreas. Se contempla el uso de las disoluciones para conservar tejido, órganos de mamíferos o partes de éstos. Además, las disoluciones pueden usarse para facilitar el trasplante de órganos, por ejemplo, por perfusión del órgano o tejido durante el procedimiento de trasplante. La disolución también puede usarse como una disolución de cardioplegia en cirugía cardiaca. Preferiblemente, el órgano o parte de éste, se mantiene en la disolución apropiada en todo momento, particularmente antes del procedimiento de trasplante.

Las disoluciones de la presente descripción, incluyendo las de la invención, pueden usarse para mantener la viabilidad del órgano o tejido durante el almacenamiento, trasplante u otra cirugía. La invención incluye un método para almacenar tejido u órganos que comprende poner en contacto dicho tejido, órgano o parte de éste, con la disolución de la invención, de manera que se prolonga la viabilidad in vivo y/o in vitro. Las disoluciones permiten el mantenimiento de la viabilidad del tejido cardiaco o pulmonar durante hasta 24 horas o más. El uso de las disoluciones de la descripción, incluyendo las de la invención, resulta en una viabilidad mejorada de los órganos.

Alternativamente o además, una vez extraído del donante, el órgano o tejido vivo puede ponerse en una disolución de conservación que contiene el inhibidor. Además, el inhibidor de calicreína también se administra preferiblemente al receptor del trasplante justo antes de, o simultáneamente con, el trasplante. En todos los casos, el inhibidor también puede administrarse directamente al tejido en riesgo, como por inyección en el tejido, o puede proporcionarse sistémicamente, bien por administración oral o parenteral, usando cualquiera de los métodos y formulaciones descritas en la presente memoria y/o conocidas en la técnica.

En un caso, puede usarse ventajosamente cualquier disolución de conservación disponible comercialmente. Los ejemplos de dichas disoluciones incluyen la disolución Belzer UW vendida con la marca registrada VIASPAN, descrita en las Patentes U.S. Nos. 4.798.824, 4.873.230, 4.879.283, que se incorporan por la presente memoria por referencia.

La disolución de conservación y composición del perfundido descrita en las patentes mencionadas anteriormente incluye, pero no está limitada a, lo siguiente:

TABLA 2

Sustancia: Cantidad en 1 Litro

K+-Iactobionato: 100 mmoles

KH2P04: 25 mmoles

MgS04: 5 mmoles

Rafinosa: 30 mmoles

Adenosina: 5mmoles

Glutatión: 3 mmoles

Insulina: 100 U

Bactrim: 0,5 mL

Dexametasona: 8 mg

Alopurinol: 1 mM

Hidroxietil almidón que tiene un peso molecular de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 300.000 daltons y un grado de sustitución de aproximadamente 0,4 a 0,7: 50 9

La disolución se lleva a pH 7,4 a temperatura ambiente con NaOH. Las concentraciones finales son Na= 30±5 mM, K+= 120±5 mM, mOsm/litro= 320±5. Bactrim= trimetoprim (16 mg/mL) y sulfametoxazol (80 mg/mL). El hidroxietil almidón puede estar presente en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 8%.

5 Esta disolución proporciona típicamente una conservación de 72 horas del páncreas, conservación de 48 horas para

el rinón y al menos conservadón de 24 horas para el hígado. La Patente U.S. 5.145.771 t incorporada en la presente

memoria por referencia, describió la disolución de conservación de órganos conocida como la "Disolución Carolina", que también es útil en la práctica de la presente descripción, incluyendo la presente invención. La composición de la disolución de lavado o conservación descrita en la patente mencionada anteriormente incluye, pero no está limitada

10 a, los componentes en aproximadamente los intervalos de concentración mostrados en la Tabla 3 más adelante.

TABLA 3

Intervalos de Concentración en 1 Litro 10% hidroxietil almidón modificado 30 gIL a 100 gIL

NaCI: 85mM a 145mM

KCI: 3mM a 6mM

CaCI2: 1,0 mM a 1,6mM

KH2P04: 0,7 mM a 1,3mM

MgS04: O,9mM a 1,5 mM

Alopurinol: 0,05 mM a 5,0 mM

Desferrioxamina: 0,02 mM a 2,0 mM

Glutatión: 0,5 mM a 10,0 mM

Nicardipeno: 0,1 mu M a 5,0 mu M

Adenosina: 0,1 mM a 5,0 mM

Fructosa: 1,OmM a 50,0 mM

Glucosa: 1,OmM a 50,0 mM

Insulina: 5 U/L a 250 U/L

Mops: 2mM 40 mM

Una disolución específica se prepara con los componentes en las cantidades mostradas en la Tabla 4 más adelante según las instrucciones mostradas más adelante.

TABLA 4: Componentes de 1 Litro de Disolución de Lavado

500mL: Agua Destilada Desionizada

50 gIL: 10% hidroxietil almidón modificado

115 mM: NaCI 6,7 g

5mM: KCI 0,37g

1,30 mM: CaCI2 0,19 9

1 mM: KH2P04 0,14 9

1,2 mM: MgS04 0,15 9

1 mM: Alopurinol 0,14 9

1 mM: Desferrioxamina 0,65g

3mM: Glutatión 0,92 9

2muM: Nicardipeno 0,80 mg

1 mM: Adenosina 0,32 9

10mM: Fructosa 1,8 9

10mM: Glucosa 1,8 9

100 U/L: Insulina 100 unidades

20mM: Mops 4,2 9

Esta disolución puede prepararse como sigue: usando un matraz volumétrico de 500 mL, medir 500 mL de

5 disolución al 10% (peso/volumen) de hidroxietil almidón y verterlo en un vaso de precipitados de 1 L. Añadir 400 mL de agua doble destilada y agitar vigorosamente usando una barra magnética de agitación. Añadir el resto de los componentes uno a uno. Después de añadir todos los componentes, ajustar el pH a 6,5 con 1-2 mL 5N NaOH. La disolución debería agitarse durante al menos treinta minutos. Transferir la disolución a un matraz volumétrico de 1 L Yllevarlo a un volumen final de 1 L. Filtrar para eliminar cualesquiera partículas no disueltas.

10 Otra disolución más se ejemplifica por la Tabla 5 más adelante.

TABLA 5: Intervalos de Concentración en 1 Litro

NaCI: 85mM a 145 mM

KCI: 3mM a 6mM

CaCI2: 1,OmM a 1,6 mM

KH2P04: 0,7mM a 1,3mM

MgS04: 0,9 mM a 1,5 mM

Adenosina: 0,12 mM a 1,2mM

Una composlclon según la Tabla 5 anterior puede incluir opcionalmente uno, varios, o todos los ingredientes adicionales especificados en la Tabla 3 anterior. Preferiblemente, la composición incluye al menos un antioxidante. Así, un caso específico de una composición se muestra en la Tabla 6 más adelante:

TABLA 6: Componentes de 1 Litro de Disolución de Lavado

500 mL: Agua Destilada Desionizada

115 mM: NaCI 6,7 g

5mM: KCI 0,37 9

1,30 mM: CaCh 0,19 g

1 mM: KH2P04 0,14 g

1,2mM: M9S04 0, 15 9

1 mM: Alopurinol 0,14 g

1 mM: Desferrioxamina 0,65 9

3mM: Glutatión 0,92 g

,12 mM: Adenosina 0,038 g

5 Las composIciones preferidas pueden comprender además uno o más tampones, vehículos, antioxidantes, inhibidores de proteasas farmacéuticamente aceptables u otros agentes anti-isquémicos.

Las composiciones útiles en los métodos de la descripción comprenden cualquiera de los polipéptidos con dominio Kunitz o polipéptidos KI que comprenden dichos polipéptidos con dominio Kunitz descritos en la presente memoria. Se prefieren particularmente los polipéptidos KI que comprenden un polipéptido con dominio Kunitz que tiene una 10 secuencia de 58 aminoácidos de los aminoácidos 3-60 de SEQ ID NO: 2. Un ejemplo de dicho polipéptido KI particularmente preferido útil en los métodos y composiciones de la presente descripción, incluyendo los métodos y composiciones de la presente invención, es el polipéptido KI PEP-1 que tiene la secuencia de 60 aminoácidos de

SEO ID NO: 2. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO: 2 se

proporciona en SEQ ID NO: 3 (véanse, por ejemplo, los nucleótidos 309-488 en la FIG. 2). Se entiende que tomando

15 como base el código genético conocido, la descripción también proporciona formas degeneradas de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 sustituyendo simplemente uno o más de los codones degenerados conocidos por cada aminoácido codificado por la secuencia de nuc!eótidos. Los nuc!eótidos 7-180 de SEQ ID NO: 3, y las formas degeneradas de ésta, codifican el polipéptido con dominio Kunitz no natural que tiene la secuencia de 58 aminoácidos de los aminoácidos 3-60 de SEQ ID NO: 2.

20 Consideraciones de Concentración para los polipéptidos KI

Varias consideraciones respecto a la dosificación con un polipéptido KI en métodos de la descripción pueden ilustrarse como ejemplo con el polipéptido KI PEP-1 representativo de la descripción que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (peso molecular de 7.054 Daltons).

La Tabla 7, más adelante, proporciona una comparación de la afinidad (Ki.app) del polipéptido KI PEP-1 para 25 calicreína y otras once proteasas plasmáticas conocidas.

TABLA 7

Sustrato de la Proteasa: PEP-1 K¡,app (pM) Aprotinina K¡,app (pM)

plasmina humana: 1,4 x 105 894

tripsina pancreática humana: >2 x 107 NO

quimiotripsina pancreática humana: >2,0 x 107 7,3 X 105

elastasa de neutrófilos humana: >2,0 x 107 1,7 X 106

trombina plasmática humana: >2,0 x 107 >1,Ox108

NO = no determmado

Claramente, el polipéptido KI PEP-1 es altamente específico para la calicreína plasmática humana. Además, la afinidad (K¡.app) de PEP-1 para calicreína es 1.000 veces mayor que la afinidad de aprotinina para la calicreína: la K¡. app de PEP-1 para calicreína es aproximadamente 44 pM (Tabla 1), mientras que la K¡.app de aprotinina para la

5 calicreína es 30.000 pM. Así, una dosis de PEP-1 podría ser aproximadamente 1.000 veces menor que la usada para aprotinina en una base molar. Sin embargo, la consideración de varios factores adicionales puede proporcionar una estimación más exacta de la dosis de PEP-1 requerida en la práctica. Dichos factores incluyen la cantidad de calicreína activada después de la extracción de un órgano de un paciente particular y serán reconocidos por el experto en la técnica.

10 La presente descripción, incluyendo la presente invención, se describirá adicionalmente con referencia a los ejemplos no limitativos siguientes. Las enseñanzas de todas las patentes, solicitudes de patente y todas las demás publicaciones y sitios de internet citados en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad.

Ejemplos

Ejemplo 1: Un polipéptido KI representativo.

15 Se identificó un polipéptido KI (PEP-1) útil en las composiciones y métodos de la presente descripción, incluyendo la presente invención, como un polipéptido que une calicreína expuesto en un fago recombinante de una biblioteca de exposición en fago. PEP-1 tiene la secuencia de aminoácidos siguiente:

Glu Ala Met His Ser Pbe Cys AJa Phe L)'I Ala Asp Asp Gly Pro Cys

~~~~~-~~~~~~~-~~~~~~

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

Met Cys Thr Arg Asp (SBQ ID NO:2). El peso molecular de PEP-1 es 7.054 Oaltons_

La secuencia de nucleótidos (SEO ID NO: 3) del AON de fago recombinante que codifica la secuencia de

20 aminoácidos de PEP-1 (aminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2) se aisló y secuenció por métodos estándar determinada a partir del AON de fago recombinante. PEP-1 se produjo en cantidades útiles para una caracterización adicional como una proteína recombinante en células huésped de fenotipo His4-de la cepa de levadura Pichia pastoris.

Ejemplo 2: Construcción de un plásmido recombinante para expresar polipéptidos KI.

25 El plásmido inicial, pHIL-02, es resistente a ampicilina y contiene un alelo de tipo salvaje de His4 de P. pastoris. La secuencia de AON final que comprende la secuencia codificadora para la proteína de fusión Prepro mata-PEP-1 en el plásmido de expresión recombinante pPIC-K503 se muestra en la Fig. 2. La secuencia de AON de pHIL-02 se modificó para producir pPIC-K503, como sigue:

1. El sitio BstSI en la región 3' AOX1 de pHIL-02, localizado aguas abajo del gen His4, se eliminó por digestión de

30 restricción parcial, relleno y ligación, alterando la secuencia de TTCGAA (SEQ ID NO: 23) a TTCGCGAA (SEQ ID NO: 24). Esta modificación se hizo para facilitar y dirigir la clonación del casete de expresión en el plásmido.

2. El sitio Aatll que presenta el gen bla localizado aguas abajo de His4 se eliminó por digestión de restricción, relleno y ligación modificando la secuencia de GACGTC (SEO ID NO: 25) a GACGTACGTC (SEO ID NO: 26). Esta modificación se hizo para facilitar la clonación de los casetes de expresión que tienen sitios Aatll en el plásmido. El

35 AON que codifica PEP-1 se sintetizó tomando como base la secuencia de nucleótidos del fago de exposición de unión a calicreína original y consistió en 450 pares de bases (pb). La secuencia de AON final del inserto en el plásmido pHIL-02 está flanqueada por una secuencia 5' AOX1 y una secuencia 3' AOX1 (partes de la cual se muestran en la FIG. 2) Y codifica una proteína de fusión que comprende el péptido señal de prepro mata de S.

cerevisiae fusionado con la secuencia codificadora estructural para el polipéptido KI PEP-1. El péptido señal se añadió para facilitar la secreción de PEP-1 de las células huésped de levadura. Los oligonucleótidos para formar el inserto se sintetizaron y obtuvieron comercialmente (Genesis Labs, The Woodlands, TX) y el inserto se generó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN sintético unido que codifica la proteína de fusión prepro mata/PEP-1 se incorporó por ligación en el plásmido pHIL-D2 modificado entre los sitios BstBl y EcoRI.

Los productos de ligación se usaron para transformar la cepa de Escherichia coli XL 1 Azul. Se usó un ensayo de PCR para cribar los transformantes de E. coli para la construcción de plásmido deseada. El ADN de los extractos celulares se amplificó por PCR usando cebadores que contienen las secuencias 5' AOX1 y 3' AOX1 (véase anteriormente y la FIG. 2). Los productos de PCR con el número correcto de pares de bases se secuenciaron. Además, aproximadamente 20-50 pb en cada lado de los sitios de clonación se secuenciaron y se obtuvo la secuencia predicha. La secuencia de ADN final del inserto en el plásmido pHIL-D2 (para rendir el plásmido pPICK503) se muestra en la FIG. 2 junto con partes de las secuencias flanqueantes 5' y 3' AOX1 y la secuencia de aminoácidos correspondiente de la proteína de fusión que comprende el péptido señal de prepro mata de S. cerevisiae fusionado con la secuencia codificadora estructural para el polipéptido KI PEP-1. Un transormante con la construcción de plásmido de expresión deseada, el plásmido pPIC-K503, se seleccionó para preparar líneas celulares de levadura para la producción rutinaria de PEP-1 .

Ejemplo 3: Fabricación de PEP-1 a partir de línea celular de levaduras recombinante.

Los esferoplastos de P. pastoris GS115 que tienen el fenotipo His4-se transformaron con el plásmido de expresión pPIC-K503 (anterior) después de linealización del plásmido en el sitio Sacl y recombinación homóloga del ADN plasmídico en ellocus 5' AOX1 del huésped. El fenotipo de la cepa de producción es His4+. El plásmido completo se insertó en la secuencia genómica 5' AOX1 de la levadura.

Los aislados de la transformación se cribaron para crecimiento en ausencia de histidina exógena con metanol como la única fuente de carbono. Más del 95% de los transformantes retuvieron la capacidad de tipo salvaje de crecer con metanol como la única fuente de carbono, demostrando de esta manera que el plásmido se había insertado en el genoma del huésped por recombinación homóloga en lugar de transposición. Estos transformantes no requerían histidina exógena para crecer, demostrando de esta manera que el plásmido se había integrado en el genoma del huésped. Se clonaron las colonias seleccionadas. Se realizaron estudios de expresión en cultivos pequeños para identificar los clones que secretan los niveles más altos de PEP-1 activo en el medio de cultivo. Los niveles de secreción de PEP-1 en las disoluciones de sobrenadante del cultivo clarificadas se cuantificaron para niveles de PEP-1 por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y se evaluaron para inhibición de calicreina. Se seleccionó un clon de levadura para producción de PEP-1 tomando como base su alto nivel de expresión de PEP-1 entre los cultivos muestreados.

Se prepararon comercialmente bancos de células madre y de trabajo de P. pastoris que producen PEP-1 (MDS Pharma Services, Bothell, Washington). Una producción estándar de PEP-1 en levaduras comprendió tres etapas como sigue: (1) preparación del cultivo de siembra, (2) fermentación, y (3) recuperación del cultivo.

La etapa del cultivo de siembra consistió en la inoculación de seis matraces (300 mL cada uno) que contienen caldo de inóculo estéril (base nitrogenada de levadura, fosfato de potasio y glicerol, pH = 5) con los contenidos de un único vial de un banco celular de trabajo de P. pastoris que produce PEP-1 . Los matraces se inocularon en un agitador orbital (300 rpm) durante aproximadamente 13 horas a 30°C ± 2°C.

Las fermentaciones se realizaron en un fermentador Braun de 100 litros cerrado lleno con caldo estéril. Cada fermentación se inició con la transferencia de los contenidos de los seis matraces de cultivo de siembra al fermentador. Después de aproximadamente 24 horas, el glicerol del fermentador se agotó y se añadió glicerol adicional durante aproximadamente 8 horas adicionales.

Una fase de alimentación mixta, que duró aproximadamente 83 horas, se inició por la adición de una alimentación de glicerol y metanol. Al final de este tiempo, la fermentación se finalizó y los contenidos del fermentador se diluyeron con agua purificada. La purificación y procesamiento de PEP-1 consistieron en cinco etapas como sigue: (1) cromatografía en lecho expandido, (2) cromatografía de intercambio catiónico, (3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), (4) ultrafiltración y diafiltración, y (5) filtración final y envasado.

La etapa de purificación final consistió en cromatografía en lecho expandido. El cultivo del fermentador diluido se aplicó a una columna equilibrada empaquetada con resina Streamline SP (columna de cromatografía Amersham Pharmacia Streamline 200, Amersham Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey). La columna de lavó (50 mM ácido acético, pH =3,0-3,5) en un modo de flujo ascendente para eluir con lavado las células de levadura del lecho expandido. El adaptador de la parte superior se elevó por encima del lecho expandido aumentando el lavado. El flujo se paró y se dejó que el lecho se asentara. El adaptador se movió hacia abajo de manera que estaba ligeramente por encima del lecho asentado. La dirección del flujo se invirtió. El efluente se recogió. El lavado continuó en un modo descendente usando 50 mM acetato de sodio, pH 4,0. El efluente se recogió_ PEP-1 se eluyó de la columna usando 50 mM acetato de sodio, pH 6,0. El eluato se recogió en un contenedor de 50 litros. El eluato se filtró a través de un filtro de 0,22 m en un contenedor limpio localizado en el sito de purificación. Se recogieron muestras adicionales para la determinación de la concentración de PEP-1. Se realizó una etapa de cromatografia de intercambio catiónico usando el eluato filtrado de la columna de lecho expandido. PEP-1 se eluyó de la columna usando 15 mM citrato de trisodio, pH 6,2.

Se eliminaron proteínas adicionales de la preparación de PEP-1 por cromatografía de interacción hidrofóbica (HIG). Antes de HIC, el eluato de la columna de intercambio catiónico se diluyó con sulfato de amonio. El eluato se aplicó a la columna y el PEP-1 se eluyó usando sulfato de amonio (0,572 M) en fosfato de potasio (100 mM), pH 7,0. El eluato se recogió en fracciones tomando como base los valores de A280. Todas las fracciones se recogieron en botellas de PETG estériles, pre-pesadas.

Las fracciones seleccionadas se juntaron en un contendor limpio. El conjunto se concentró por ultrafiltración. La preparación de PEP-1 concentrada se diafiltró inmediatamente frente a diez volúmenes de PBS, pH 7,0.

Se realizó una etapa de filtración final antes del envasado con el fin de minimizar la biocarga en la mayor parte de PEP-1. La mayor parte de la disolución se filtró a través de un filtro de 0,22 m y se recogió en una botella de PETG estéril, pre-pesada. Una muestra se extrajo para ensayo de liberación de lote. El resto de la mayor parte se dispensó asépticamente en botellas de PETG estériles y se almacenó a -20°C.

Ejemplo 4: Ensayo de Inhibición de Calicreína.

Se usó un ensayo cinético para medir la actividad inhibidora de los polipéptidos KI, tales como PEP-1. El ensayo cinético mide la fluorescencia después de la escisión mediada por calicreína de un sustrato, prolilfenilalanilarginíl amino metil cumarina. Una cantidad conocida de calicreina se incubó con un polipéptido KI estándar de referencia diluido de manera seriada o muestras de ensayo de polipéptido KI diluidas de manera seriada, en un tampón de reacción adecuado en una placa de microtitulación. Cada muestra se ensayó en triplicado. La disolución del sustrato se añadió y la placa se leyó inmediatamente usando una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. Al menos dos de cada una de las curvas de estándar de referencia y de muestra se requirieron para considerar válido un valor R-cuadrado de 0,95.

Ejemplo 5: Conservación de Órganos

Se lavaron HUVEC en confluencia en PBS y se incubaron adicionalmente a 4 grados durante 24-48 horas en medio sin suero (SFM). Después de almacenamiento en frío, las células se lavaron varias veces con PBS, y se añadieron calicreína (0,125 U) Y el sustrato específico de calicreina S2302 a las células. Los cambios en la densidad óptica se registraron. Para la evaluación por microscopía óptica del PEP-1 unido a las células, después del almacenamiento en frío, se trataron las HUVEC con PEP-1, se fijaron con formalina y se trataron con anti-PEP-1 de conejo e IgG anticonejo conjugada con peroxidasa. La capacidad de HUVEC para producir calicreína también se evaluó en la superficie de las células y en el sobrenadante de las células mantenidas a 37°C. La actividad calicreína fue 380 ± 19

A.U. en los sobrenadantes de HUVEC mantenidas a 37°C; no hubo actividad mensurable en la superficie de las mismas células. En la evaluación por microscopía óptica hubo una unión significativa de PEP-1 a la superficie de HUVEC tratadas con frió durante 24 horas. La unión máxima se obtuvo incubando las células en presencia de PEP1 (5 mg/ml). El PEP-1 unido a las células retuvo la capacidad de inhibir calicreína exógena. Estos resultados indican que PEP-1 se une a las células endoteliales, manteniendo su actividad inhibidora de calicreína. Por lo tanto, puede usarse para detectar y modular el daño mediado por quininas en la superficie vascular.

Aunque esta invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a las realizaciones preferidas de

ésta, los expertos en la técnica entenderán que pueden hacerse varios cambios en forma y detalles a ésta sin apartarse del alcance de la invención englobado por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un método ex vivo para conservar un órgano o tejido que comprende poner en contacto el órgano o tejido con una cantidad eficaz de un inhibidor de calicreina, en el que el inhibidor de calicreína es un polipéptido que consiste en los aminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2 o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2.
2.

Un método ex vivo para reducir el daño por reperfusión de un órgano durante cirugía y/o después de la extracción del órgano de un sujeto, que comprende poner el órgano en una disolución de almacenamiento y conservación de órganos, en el que la disolución comprende un inhibidor de calicreína, en el que el inhibidor de calicreína es un polipéptido que consiste en los aminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2 o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2.
3.

El método de la Reivindicación 1 o Reivindicación 2, en el que el órgano o tejido es corazón, pulmón, riñón, páncreas, hígado, intestino, tejido endotelial, tejido vascular o piel.
4.

Una composición para conservar y/o almacenar un órgano que comprende una disolución de conservación de órganos ex vivo fisiológicamente aceptable y un polipéptido que consiste en los aminoácidos 3-60 de SEO ID NO: 2

o un polipéptido que consiste en SEO ID NO: 2,

en el que la disolución de conservación de órganos ex vivo se selecciona del grupo que consiste en:

una disolución de conservación de órganos que comprende 3% a 8% hidroxietil almidón, Na+ a 30±5 mM, K+ a 120±5 mM, mOsmllitro de 320±5 y trimetoprim a 16 mg/mL y sulfametoxazol a 80 mg/mL, pH 7,4;

una disolución de conservación de órganos que comprende, por litro, 50 g hidroxietil almidón, 100 mmoles K+lactobionato, 25 mmoles KH2P04, 5 mmoles MgS04, 30 mmoles rafinosa, 5 mmoles adenosina, 3 mmoles glutatión, 100 U insulina, 0,5 mL Bactrim, 8 mg dexametasona y 1 mM alopurinol;

una disolución de conservación de órganos que comprende 85 mM a 145 mM NaCI, 3 mM a 6 mM KCI, 1,0 mM a 1,6 mM CaCh, 0,7 mM a 1,3 mM KH2P04, 0,9 mM a 1,5 mM MgS04; 0,05 mM a 5,0 mM alopurinol, 0,02 mM a 2,0 mM desferrioxamina, 0,5 mM a 10,0 mM glutatión, O, 1 ~M a 5,0 ~M nicardipeno, 0,1 mM a 5,0 mM adenosina, 1,0 mM a 50,0 mM fructosa, 1,0 mM a 50,0 mM glucosa, 5 U/L a 250 U/L insulina, 2 mM a 40 mM MOPS y 30 gIL a 100 gIL de un hidroxietil almidón modificado al 10%;

una disolución de conservación de órganos que comprende 50g/L de 10% hidroxietil almidón modificado, 115 mM NaCI, 5 mM KCI, 1,30 mM CaCI2, 1 mM KH2P04, 1,2 mM MgS04, 1 mM alopurinol, 1 mM desferrioxamina, 3 mM glutatión, 2 ~M nicardipeno, 1 mM adenosina, 10 mM fructosa, 10 mM glucosa, 100 U/L insulina y 20 mM MOPS, pH

6,5;

una disolución de conservación de órganos que comprende 85 mM a 145 mM NaCI, 3 mM a 6 mM KCI, 1,0 mM a 1,6 mM CaCI2, 0,7 mM a 1,3 mM KH2P04, 0,9 mM a 1,5 mM MgS04, y 0,12 mM a 1,2 mM adenosina; y

una disolución de conservación de órganos que comprende 115 mM NaCI, 5 mM KCI, 1,30 mM CaCh, 1 mM KH2P04, 1,2 mM MgS04, 1 mM alopurinol, 1 mM desferrioxamina, 3 mM glutatión y 0,12 mM adenosina.
5. La composición de la Reivindicación 4, en la que la composición comprende además al menos un antioxidante.

Figura 1

/~~

A.parato de Bypass Extrínsec.a >lntrínseca ... ..

1

coagulación ReperfusIOn

u¡n¡na !'LAS..... ' ", . . ....... ... ,...... ! Le.cocitos

A.ctivación de

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Figura 2

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ACG A'l'G AGA TTC CCA !'CT A'l'C 2'TC ACT GC'T Gn' TTG nc GC2' Gel' H R F PSI r T A V L F A A

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GAC TTC GAC G?C GeT GTT Tl'G ~T:l'C TCT Me TCt' ACT Me Me GGT D F D V A V lo P F. S N S l' N N G

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SEO ID 2: (con't.) SEO ID 4: (con'L) SEO ID 5: (con'L) SEO ID 6: (con'L) SEO tD 1: (con't.) SEQ ID 8: (con't) SEQ ID 9: (coo't.) sEfO ID 10 : (con't.) SEQ ID 11 : (con·t.) SEQ ID 12:(con't.) SEQ ID 13 : (eoD't) SEO ID 14: (con't.) SEO ID 15 : (con't) SEO ID 16 : (COD't) • SEQ ID 17 :(c::on't.) SEQ ID 18:(con't.) SEQ ID 19: (con'l) SEO ID 20:{con't.) SEQ ID 21 : (con'L) SEQ ID 22 : (con'L)

FIGURA 3

----MHSFCAFKA-DOGPCRAAHPRWFFNIFTRQCEEFIYGG ----MHSFCAFKA-DDGPCKANHLRFFFNIFTRQCEEFSYGG

----

MHS~-DDGBCKANHORFFFNIFTROCEEFTYGG

----

MHS~FKA-OOGHCKANHQRFFFNIFTROCEOFTYGG

----MHSFCAFKA-DDGHCKASLPRFFFNIFTRQCEEFIYGG ----MHSFCAFKA-ODGHCKANHQRFFFNIFTRQCEEFSYGG ----MHSFCAFKA-DOGHCKGAHLRFFFNIFTRQCEEFIYGG ----MHSFCAFKA-ODGRCKGARLRFFFNIFTRQCEEFIYGG ----MHSFCAFKA-DGGRCRGAHPRWFFNIFTRQCEEFSYGG ----MHSFCAFKA-DDGPCRAAHPRWFFNIFTRQCEEF5YGG ----MHSFCAFKA-DVGRCRGAHPRWFFNIFTRQCEEFSYGG ----MHSFCAFKA-DVGRCRGAOPRFFFNI FTRQCEEFSYGG

---

~MHSFCAFKA-DDGSCRAAHLRWrFNIFTRQCEEFSYGG

----MHSFCAFKA-EGGSCRAABQRWFFNIFTRQCEEFSYGG ----MHSFCAFKA-DOGPCRGAHLRFFFNIFTRQCEEFSYGG ----MHSFCAFKA-DOGHCRGALPRWFFNIFTRQCEEFSYGG

----MHSFCAFKA-DSGNCRGNLPRFFFNIFT~QCEEFSYGG

----HHSFCAFKA-OSGRCRGNHQRFFFNIFTRQCEEFSYGG

----

MHS~-DGGRCRAIOPRWFFNIFTRQCEEFSYGG

----MHSfCAFKA-DDGRCRGAHPRHFFNIFTRQCEEFSYGG

CEGNQ--NRFESLEECKKHCTRO CGGNQ--NRFESLEECKI<MCTRD CGGNQ--NRFESLEECKKMCTRD CAGNO--NRFESLEECKKHCTRD CGGNQ--NRFESLEECKKMCTRD CGGNQ--NRFESLEECKKMCTRD CEGNQ--NRFESLE.ECKKMCTRD CEGNQ--NRFESLEECKl<MCTRD CGGNO--NRFESLEECKKMCTRD CGGNQ--NRFESLEECKKHCTRD CGGNQ--NRFESLEECKKMCTRD CGGNQ--NRFESLEECKKMCTRD CGGNQ--NRFESLEECKKMCTRD CGGNO--NRE'ESLEECkKMCTRD CGGNQ--NRFESLEECKKMCTRo CGGNQ--NRFESLEECKKHCTRD CGGNQ--NRFESLEECKKMCTRD

CGGNQ--NRFESLEEC~TRD

CGGNQ--NRFESLEECKKMCTRD CGGNQ--NRFESLEECKKMCTRD