ES2709103T3

ES2709103T3 - Métodos para conservar órganos y tejidos

Info

Publication number: ES2709103T3
Application number: ES10191739T
Authority: ES
Inventors: Marco Cicardi; Luigi Bergamaschini
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 2002-08-28
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2019-04-15
Anticipated expiration: 2023-06-06
Also published as: WO2004019968A1; EP1542710B1; ES2395014T3; US8748368B2; US20110008762A1; EP2386310A3; US7718617B2; JP5465648B2; US20040053206A1; US7166576B2; EP2386310B1; JP2011078417A; CA2496789C; EP1542710A4; AU2003243413B2; EP2386310A2; CA2496789A1; CY1121194T1; HK1076039A1; AU2003243413A1

Abstract

Composición para conservar y/o almacenar un órgano, comprendiendo la composición una disolución de conservación de órganos ex vivo fisiológicamente aceptable y un polipéptido de unión a calicreína de 53 - 60 aminoácidos, en la que el polipéptido de unión a calicreína comprende los aminoácidos 3-60 de SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCION

Metodos para conservar organos y tejidos

Solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 60/407.004, presentada el 28 de agosto de 2002.

Antecedentes de la invencion

La conservacion de la viabilidad de los organos de donantes es un objetivo importante para el trasplante de organos. Normalmente el organo que va a trasplantarse debe almacenarse y enviarse al posible receptor. La capacidad de prolongar la viabilidad celular del organo durante el almacenamiento y transporte es muy importante para tener exito en la operacion de trasplante. Las disoluciones de conservante desempenan un papel importante en la longevidad del organo. Las disoluciones para la conservacion de organos incluyen las descritas por Berdyaev et al., patente estadounidense n.° 5.432.053; Belzer et al., patentes estadounidenses n.° 4.798.824, 4.879.283 y 4.873.230; Taylor, patente estadounidense n.° 5.405.742; Dohi et al., patente estadounidense n.° 5.565.317; Stem et al., patentes estadounidenses n.° 5.370.989 y 5.552.267. Sin embargo, existe la necesidad de metodos y disoluciones mejorados para la conservacion de organos.

Las proteasas estan implicadas en una amplia gama de rutas biologicas. En particular, serina proteasas tales como calicrema, plasmina, elastasa, activador de plasminogeno de urocinasa, trombina, inhibidor de la coagulacion asociado a lipoprotema humana y factores de coagulacion tales como los factores Vila, IXa, Xa, XIa y XIIa se han implicado en rutas que afectan al flujo sangumeo, por ejemplo, isquemia general y focal, invasion tumoral, fibrinolisis, perdida de sangre perioperatoria e inflamacion. Los inhibidores de serina proteasas espedficas, por tanto, han recibido atencion como posibles dianas farmacologicas para diversas enfermedades isquemicas.

Un inhibidor de este tipo, la aprotinina (tambien denominado inhibidor de tripsina pancreatica bovina o BPTI), obtenido del pulmon bovino, se ha aprobado en los Estados Unidos para uso profilactico en la reduccion de la perdida de sangre periooperativa y la necesidad de transfusion en pacientes que se someten a CPB, por ejemplo, en el transcurso de un procedimiento de injerto de derivacion de arterias coronarias. La aprotinina esta disponible comercialmente con el nombre comercial TRASILOL® (Bayer Corporation Pharmaceutical Division, West Haven, Connecticut) y se aprobo previamente para su uso para tratar pancreatitis. La eficacia de la aprotinina esta asociada con sus capacidades relativamente no espedficas para inhibir una variedad de serina proteasas, incluyendo calicrema plasmatica y plasmina. Estas proteasas son importantes en varias rutas del sistema de activacion por contacto (Ca S).

El CAS se activa inicialmente cuando la sangre completa entra en contacto con la superficie de sustratos foraneos (por ejemplo, caolm, vidrio, sulfato de dextrano o superficies oseas danadas). La calicrema, una serina proteasa, es una enzima plasmatica que inicia la cascada de CAS conduciendo a la activacion de neutrofilos, plasmina, coagulacion y diversas cininas. La calicrema se secreta como un zimogeno (precalicrema) que circula como molecula inactiva hasta que se activa por un acontecimiento proteolftico de manera temprana en la cascada de activacion por contacto.

Sin embargo, el uso de inhibidores de calicrema espedficos para la conservacion de organos no se habfa demostrado satisfactoriamente.

Sumario de la invencion

Esta invencion se basa en el descubrimiento de peptidos que inhiben serina proteasas, tales como, por ejemplo, calicrema, que pueden emplearse satisfactoriamente para conservar un organo pendiente de trasplante. Mas espedficamente, la invencion proporciona metodos de uso de inhibidores de calicrema en un metodo para conservar un organo o tejido y composiciones para tal uso. La invencion tambien se refiere a metodos para reducir, inhibir o prevenir el dano o la lesion por reperfusion en un organo o tejido que se ha extirpado de su huesped y a composiciones para tal uso. Los peptidos de calicrema preferidos incluyen los descritos en las patentes estadounidenses n.os 6.333.402 y 6.057.287 concedidas a Markland et al.

La presente memoria descriptiva describe composiciones que comprenden un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID NO: 1),

en la que Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno un aminoacido o estan ausentes; Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41, Xaa42, Xaa44, Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52, Xaa53 y Xaa54 pueden ser cualquier aminoacido; Xaa10 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asp y Glu; Xaa11 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala y Thr, Xaa13 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys y Gln; Xaa15 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln; Xaa16 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Gly, Ser, Asp y Asn; Xaa17 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln y Thr; Xaal8 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: His, Leu, Gln y Ala; Xaa19 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Pro, Gln, Leu, Asn e Ile; Xaa21 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Trp, Phe, Tyr, His e Ile; Xaa22 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe; Xaa23 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe; Xaa3l es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile y Thr; Xaa32 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Gln, Asp Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly y Val; Xaa34 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Thr, Ile, Ser, Val, Ala, Asn, Gly y Leu; Xaa35 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr, Trp y Phe; Xaa39 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Gly, Ala, Ser y Asp; Xaa40 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Gly y Ala; Xaa43 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asn y Gly; Xaa45 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Phe y Tyr; y en la que dicho polipeptido inhibe calicrema, y metodos de uso de tales composiciones; la invencion se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto de referencia, posiciones de aminoacido espedficas pueden ser las siguientes: Xaa6 puede ser Ala, Xaa7 puede ser Phe, Xaa8 puede ser Lys, Xaa9 puede ser Ala, Xaalo puede ser Asp, Xaa11 puede ser Asp, Xaa13 puede ser Pro, Xaa15 puede ser Arg, Xaa16 puede ser Ala, Xaa17 puede ser Ala, Xaa18 puede ser His, Xaa19 puede ser Pro, Xaa20 puede ser Arg, Xaa24 puede ser Asn, Xaa25 puede ser Ile, Xaa26 puede ser Phe, Xaa27 puede ser Thr, Xaa28 puede ser Arg, Xaa29 puede ser Gln, Xaa31 puede ser Glu, Xaa32 puede ser Glu, Xaa34 puede ser Ile, Xaa35 puede ser Tyr, Xaa39 puede ser Glu, Xaa41 puede ser Asn, Xaa42 puede ser Arg, Xaa44 puede ser Arg, Xaa46 puede ser Glu, Xaa47 puede ser Ser, Xaa48 puede ser Leu, Xaa49 puede ser Glu y/o Xaa50 puede ser Glu; cualquiera de estos aminoacidos espedficos en estas posiciones puede aparecer individualmente o en combinacion con uno o mas de los aminoacidos en una o mas posiciones descritas de otra forma.

En un aspecto de referencia, la presente memoria descriptiva describe una composicion que comprende un polipeptido tal como se describe en SEQ ID NO: 1, de manera que dos o mas de las siguientes posiciones de aminoacido se definen tal como sigue: Xaa10 puede ser Asp; Xaa11 puede ser Asp; Xaa13 puede ser Pro; Xaa15 puede ser Arg; Xaa16 puede ser Ala; Xaa17 puede ser Ala; Xaa18 puede ser His; Xaa19 puede ser Pro; Xaa21 puede ser Trp; Xaa22 puede ser Phe; Xaa23 puede ser Phe; Xaa31 puede ser Glu; Xaa32 puede ser Glu; Xaa34 puede ser Ile; Xaa35 puede ser Tyr; Xaa39 puede ser Glu; Xaa40 puede ser Gly; Xaa43 puede ser Asn; y Xaa45 puede ser Phe, y metodos de uso de tales composiciones. En otro aspecto de referencia, cinco o mas de las siguientes posiciones de aminoacido se definen tal como sigue: Xaa10 puede ser Asp; Xaa11 puede ser Asp; Xaa13 puede ser Pro; Xaa15 puede ser Arg; Xaa16 puede ser Ala; Xaa17 puede ser Ala; Xaa18 puede ser His; Xaa19 puede ser Pro; Xaa21 puede ser Trp; Xaa22 puede ser Phe; Xaa23 puede ser Phe; Xaa31 puede ser Glu; Xaa32 puede ser Glu; Xaa34 puede ser Ile; Xaa35 puede ser Tyr; Xaa39 puede ser Glu; Xaa40 puede ser Gly; Xaa43 puede ser Asn; y Xaa45 puede ser Phe. En un aspecto de referencia, 10 o mas de los aminoacidos se definen tal como sigue: Xaa10 puede ser Asp; Xaa11 puede ser Asp; Xaa13 puede ser Pro; Xaa15 puede ser Arg; Xaa16 puede ser Ala; Xaa17 puede ser Ala; Xaal8 puede ser His; Xaa19 puede ser Pro; Xaa21 puede ser Trp; Xaa22 puede ser Phe; Xaa23 puede ser Phe; Xaa31 puede ser Glu; Xaa32 puede ser Glu; Xaa34 puede ser Ile; Xaa35 puede ser Tyr; Xaa39 puede ser Glu; Xaa40 puede ser Gly; Xaa43 puede ser Asn; y Xaa45 puede ser Phe. En aun otra realizacion, 15 o mas de los aminoacidos se definen tal como sigue: Xaa10 puede ser Asp; Xaa11 puede ser Asp; Xaa13 puede ser Pro; Xaa15 puede ser Arg; Xaa16 puede ser Ala; Xaa17 puede ser Ala; Xaa18 puede ser His; Xaa19 puede ser Pro; Xaa21 puede ser Trp; Xaa22 puede ser Phe; Xaa23 puede ser Phe; Xaa31 puede ser Glu; Xaa32 puede ser Glu; Xaa34 puede ser Ile; Xaa35 puede ser Tyr; Xaa39 puede ser Glu; Xaa40 puede ser Gly; Xaa43 puede ser Asn; y Xaa45 puede ser Phe.

En un aspecto de referencia, la memoria descriptiva describe una composicion que comprende un polipeptido tal como se define mediante SEQ ID NO: 1, de manera que, si esta presente, Xaa3 es Ser, Xaa2 es His, Xaa1 es Met, Xaa56 es Thr, Xaa57 es Arg y/o Xaa58 es Asp, y metodos de uso de tales composiciones.

En otra realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos, con aa 3-60 de: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 2), y a metodos de uso de tales composiciones, en particular una composicion que comprende un polipeptido de union a calicrema de 53-60 aminoacidos que comprende un dominio Kunitz, en el que el dominio Kunitz comprende el potencial de enlaces disulfuro entre cistemas en las posiciones 5 y 55; 14 y 38; y 30 y 51 (segun posiciones de aminoacido correspondientes a inhibidor de tripsina pancreatica bovina (BPTI)), y que comprende ademas:

numero de aminoacido 13 seleccionado de His y Pro;

numero de aminoacido 16 seleccionado de Ala y Gly;

numero de aminoacido 17 seleccionado de Ala, Asn y Ser;

numero de aminoacido 18 seleccionado de His y Leu; y

numero de aminoacido 19 seleccionado de Gln, Leu y Pro (SEQ ID NO: 23).

En una realizacion particular, la presente invencion se dirige a una composicion que comprende un polipeptido de union a calicrema de 53-60 aminoacidos que comprende un dominio Kunitz, en el que el dominio Kunitz comprende el potencial de enlaces disulfuro entre cistemas en las posiciones 5 y 55; 14 y 38; y 30 y 51 (segun posiciones de aminoacido correspondientes a inhibidor de tripsina pancreatica bovina (BPTI)), y que comprende ademas: numero de aminoacido 13 seleccionado de His y Pro;

numero de aminoacido 15 seleccionado de Lys y Arg;

numero de aminoacido 16 seleccionado de Ala y Gly;

numero de aminoacido 17 seleccionado de Ala, Asn y Ser;

numero de aminoacido 18 seleccionado de His y Leu; y

numero de aminoacido 19 seleccionado de Gln, Leu y Pro,

numero de aminoacido 31 es Glu;

numero de aminoacido 32 seleccionado de Glu y Gln;

numero de aminoacido 34 seleccionado de Ser, Thr e Ile; y

numero de aminoacido 39 seleccionado de Gly, Glu y Ala (SEQ ID NO: 24).

En una realizacion particular, la presente invencion se dirige a una composicion que comprende un polipeptido de union a calicrema de 53-60 aminoacidos que comprende un dominio Kunitz, en el que el dominio Kunitz comprende una cistema en cada una de las posiciones 5 y 55; 14 y 38; y 30 y 51 (segun posiciones de aminoacido correspondientes a inhibidor de tripsina pancreatica bovina (BPTI)), y que comprende ademas:

numero de aminoacido 13 seleccionado de His y Pro;

numero de aminoacido 15 seleccionado de Lys y Arg;

numero de aminoacido 16 seleccionado de Ala y Gly;

numero de aminoacido 17 seleccionado de Ala, Asn y Ser;

numero de aminoacido 18 seleccionado de His y Leu; y

numero de aminoacido 19 seleccionado de Gln, Leu y Pro,

numero de aminoacido 31 es Glu;

numero de aminoacido 32 seleccionado de Glu y Gln;

numero de aminoacido 34 seleccionado de Ser, Thr e Ile; y

numero de aminoacido 39 seleccionado de Gly, Glu y Ala (SEQ ID NO: 24).

En una realizacion particular, el dominio Kunitz se selecciona del grupo que consiste en:

KKII/3 n.° 1 (SEQ ID NO: 24)

KKII/3 n.° 2 (SEQ ID NO: 25)

KKII/3 n.° 3 (SEQ ID NO: 26)

KKII/3 n.° 4 (SEQ ID NO: 27)

KKII/3 n.° 5 (SEQ ID NO: 28)

KKII/3 n.° 6 (SEQ ID NO: 29)

KKII/3 n.° 7 (SEQ ID NO: 30)

KKII/3 n.° 8 (SEQ ID NO: 31)

KKII/3 n.° 9 (SEQ ID NO: 32) y

KKII/3 n.° 10 (SEQ ID NO: 33)

tal como se describe en la tabla 1.

Cada una de las composiciones descritas en el presente documento puede usarse en los metodos de la invencion. Ademas, los compuestos descritos en el presente documento pueden usarse en la fabricacion de un medicamento o una composicion para las indicaciones o los metodos descritos en el presente documento.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 es un diagrama simplificado de multiples rutas importantes y acontecimientos relacionados implicados en el sistema de activacion por contacto y la respuesta inflamatoria sistemica (SIR) que pueden surgir en un paciente que experimenta traumatismo de tejidos oseos y blandos tal como el asociado con un procedimiento de injerto de derivacion de arterias coronarias (CABG), especialmente cuando el procedimiento de CABG implica circulacion sangumea extracorporea, tal como derivacion cardiopulmonar (CPB; aparato de derivacion). Las flechas indican la activacion de un componente o acontecimiento a otro componente o acontecimiento en la cascada. Las flechas en ambas direcciones indican efectos de activacion de componentes o acontecimientos en ambas direcciones. Las flechas discontinuas indican la probable participacion de un componente o acontecimiento en la activacion de otro componente o acontecimiento. Las abreviaturas son las siguientes: “tPA” = activador de plasminogeno tisular; “C5a” = un componente proteico del sistema del complemento; “fXIIa” = protema activadora de pre-calicrema para formar calicrema activa; “Extrmseco” = sistema de coagulacion extrmseco; “Intrmseco” = sistema de coagulacion intrmseco. La figura 2 muestra una porcion de un ADN y los aminoacidos deducidos correspondientes para un polipeptido inhibidor de calicrema (“KI”) de la invencion en el plasmido pPIC-K503. El ADN insertado codifica el peptido senal prepro mata de Saccharomyces cerevisiae (subrayado) fusionado en marco con el extremo amino-terminal del polipeptido PEP-1 de KI que tiene la secuencia de aminoacidos circundada por el area en el recuadro. La secuencia de aminoacidos del polipeptido PEP-1 de KI mostrada en la region en el recuadro es SEQ ID NO: 2, y la secuencia codificante de nucleotidos correspondiente del polipeptido de KI es SEQ ID NO: 3. Las flechas discontinuas indican la ubicacion y direccion de dos secuencias de cebador de PCR en regiones AOX que se usaron para producir moldes de secuenciacion. La secuencia de ADN para toda la secuencia de nucleotidos de la figura comprende la secuencia codificante estructural para la protema de fusion y se designa SEQ ID NO: 35. La porcion doblemente subrayada de la secuencia indica una secuencia de sonda de diagnostico. BstBI y EcoRI indican las ubicaciones de sus respectivos sitios de endonucleasas de restriccion palindromicos, hexamericos en la secuencia. Los asteriscos indican codones de terminacion de la traduccion.

La figura 3 muestra una alineacion de secuencias de aminoacidos de las realizaciones preferidas de la invencion. Descripcion detallada de la invencion

Lo siguiente es una descripcion de realizaciones preferidas de la invencion.

La invencion se basa en el descubrimiento de polipeptidos de inhibidores de calicrema (KI) que inhiben calicrema plasmatica con una especificidad que permite su uso en metodos mejorados de conservacion de organos y tejidos, tales como pendientes de un trasplante, y metodos correspondientes, tal como se define en las reivindicaciones. La invencion tambien se refiere a la reduccion, inhibicion o prevencion del dano o la lesion por reperfusion en un organo o tejido que se ha extirpado de su huesped y a composiciones para lo mismo.

Polipeptidos utiles en la invencion

Los polipeptidos de KI utiles en la invencion comprenden polipeptidos de dominio Kunitz. En una realizacion estos dominios Kunitz son formas variantes que comprenden la estructura en bucle de dominio Kunitz 1 de la protema de inhibidor de la coagulacion asociado a lipoprotema humana (LACI). LACI contiene tres estructuras de bucle peptidicas internas bien definidas que son dominios Kunitz modelo (Girard, T. et al., 1989. Nature, 338:518-520). Los tres dominios Kunitz de LACI confieren la capacidad de unirse a e inhibir calicrema, aunque no con una afinidad excepcional. Las variantes de dominio Kunitz 1 de LACI descritas en el presente documento se han examinado, aislado y se unen a calicrema con afinidad y especificidad potenciadas (veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.795.865 y 6.057.287). El polipeptido util en la invencion tiene la secuencia de aminoacidos definida por los aminoacidos 3-60 de SEQ ID NO: 2.

Los polipeptidos de union a calicrema pueden usarse para dirigir moleculas terapeuticas o de diagnostico a calicrema en, por ejemplo, tejido de organos, celulas u organismos completes. Tales metodos de administracion dirigida para propositos terapeuticos o de diagnostico los conocena un experto en la tecnica. Por ejemplo, un experto en la tecnica podna usar polipeptidos de union a calicrema dirigidos para identificar un organo que se ha danado por los efectos de la calicrema, o podna seleccionarse como diana calicrema para determinar los efectos de un agente terapeutico particular usando polipeptidos de union a calicrema de la invencion.

Cada polipeptido util en la invencion se une a calicrema. En realizaciones preferidas, los polipeptidos son inhibidores de calicrema (KI) tal como se determina usando ensayos de inhibicion y union a calicrema conocidos en la tecnica. La afinidad y especificidad potenciadas por calicrema de los polipeptidos de dominio Kunitz variantes descritos en el presente documento proporcionan la base para su uso en procedimientos quirurgicos de CPB y especialmente de CABG para prevenir o reducir la perdida de sangre perioperatoria y/o SIR en pacientes que se someten a tales procedimientos. Los polipeptidos de KI usados en la invencion pueden tener o comprender la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de dominio Kunitz variante aislado originalmente mediante el examen de colecciones de presentacion en fago para determinar la capacidad de unirse a calicrema.

Los polipeptidos de KI descritos en el presente documento comprenden un polipeptido de dominio Kunitz que comprende la secuencia de aminoacidos:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID NO: 1).

“Xaa” se refiere a una posicion en una cadena peptfdica que puede ser cualquiera de varios aminoacidos diferentes. Por ejemplo, para los peptidos de KI descritos en el presente documento, Xaa10 puede ser Asp o Glu; Xaa11 puede ser Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala o Thr; Xaa13 puede ser Pro, Arg, His, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys o Gln; Xaa15 puede ser Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn o Gln; Xaa16 puede ser Ala, Gly, Ser, Asp o Asn; Xaa17 puede ser Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln o Thr; Xaa18 puede ser His, Leu, Gln o Ala; Xaa19 puede ser Pro, Gln, Leu, Asn o Ile; Xaa21 puede ser Trp, Phe, Tyr, His o Ile; Xaa31 puede ser Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile o Thr; Xaa32 puede ser Glu, Gln, Asp Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly o Val; Xaa34 puede ser Ile, Thr, Ser, Val, Ala, Asn, Gly o Leu; Xaa35 puede ser Tyr, Trp o Phe; Xaa39 puede ser Glu, Gly, Ala, Ser o Asp. Los aminoacidos Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41, Xaa42, Xaa44, Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52, Xaa53 y Xaa54 pueden ser cualquier aminoacido. Adicionalmente, cada uno de los primeros cuatro y los ultimos tres aminoacidos de SEQ ID NO: 1 pueden estar opcionalmente presentes o ausentes y pueden ser cualquier aminoacido, si estan presentes.

Los peptidos definidos segun SEQ ID NO: 1 forman un conjunto de polipeptidos que se unen a e inhiben calicrema. La diversidad de los KI aumenta a medida que aumenta el numero de posiciones variables en la secuencia peptfdica o a medida que aumenta el numero de aminoacidos posibles en una posicion variable. Por ejemplo, en un aspecto de la memoria descriptiva, un polipeptido de KI util en los presentes metodos y composiciones tiene las siguientes posiciones variables: Xaa11 puede ser Asp, Gly, Ser o Val; Xaa13 puede ser Pro, Arg, His o Asn; Xaa15 puede ser Arg o Lys; Xaa16 puede ser Ala o Gly; Xaa17 puede ser Ala, Asn, Ser o Ile; Xaa18 puede ser His, Leu o Gln; Xaa19 puede ser Pro, Gln o Leu; Xaa21 puede ser Trp o Phe; Xaa31 es Glu; Xaa32 puede ser Glu o Gln; Xaa34 puede ser Ile, Thr o Ser; Xaa35 es Tyr; y Xaa39 puede ser Glu, Gly o Ala.

Un aspecto mas espedfico de la memoria descriptiva se define mediante los siguientes aminoacidos en posiciones variables: Xaa10 es Asp; Xaa11 es Asp; Xaa13 puede ser Pro o Arg; Xaa15 es Arg; Xaa16 puede ser Ala o Gly; Xaa17 es Ala; Xaa18 es His; Xaa19 es Pro; Xaa21 es Trp; Xaa31 es Glu; Xaa32 es Glu; Xaa34 puede ser Ile o Ser; Xaa35 es Tyr; y Xaa39 es Gly.

Los polipeptidos de KI utiles en los metodos y composiciones descritos en el presente documento comprenden un dominio Kunitz. Un subconjunto de las secuencias abarcadas por SEQ ID NO: 1 se describe mediante lo siguiente (cuando no se indica, “Xaa” se refiere al mismo conjunto de aminoacidos que se permiten para SEQ ID NO: 1): Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Arg Xaa21 Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 36).

Son ejemplos espedficos y particulares de peptidos de KI descritos en el presente documento tal como sigue, en donde el primer peptido de KI mencionado es de la invencion:

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoacidos 3-60 de ^{S e Q} ID NO: 2),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala Asn His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 4),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 5),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Gln Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Ala Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 6),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Ser Leu Pro Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 7),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 8),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Gly Ala His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 9),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Arg Cys Lys Gly Ala His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 10),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Gly Gly Arg Cys Arg Gly Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 11),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 12),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Val Gly Arg Cys Arg Gly Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 13),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Val Gly Arg Cys Arg Gly Ala Gln Pro Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 14),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Ser Cys Arg Ala Ala His Leu Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 15),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Glu Gly Gly Ser Cys Arg Ala Ala His Gln Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO. 16),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Gly Ala His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 17),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Arg Gly Ala Leu Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 18),

Met His Ser Phe Phe Lys Ala Asp Ser Gly Asn Cys Arg Gly Asn Leu Pro Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 19),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Ser Gly Arg Cys Arg Gly Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 20),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Gly Gly Arg Cys Arg Ala Ile Gln Pro Arg Trp> Phe Phe Asn Ile Phe■ Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 21),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Arg Cys Arg Gly Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 22).

La figura 3 proporciona una alineacion de secuencias de aminoacidos de estas secuencias.

Otros polipeptidos de KI utiles en la presente invencion incluyen:

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala (SEQ ID NO: 23),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Ser Leu Pro Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 24),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala Asn His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 25),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 26),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Gln Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Ala Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 27),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Ser Leu Pro Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 28),

Met His Ser Phe Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 29),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 30),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 31),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Ala Asn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 32),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys Gly Ala His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe le Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leui Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 33),

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 34).

Estas secuencias se resumen en la siguiente tabla 1.

TABLA 1: Secuencias de aminoacidos de variantes de LACI(K1) seleccionadas por unirse a calicrema plasmatica humana.

(a) Numero de aminoacidos de residuos variados. LACI(K1) (residuos de LACI 50-107 (SEQ ID NO: 32)) tiene 58 aminoacidos de longitud siendo la posicion P1 el numero de residuo 15 y estando fijado como lisina en este caso.

Los polipeptidos utiles en los metodos y composiciones descritos en el presente documento pueden prepararse de manera sintetica usando cualquier equipo y protocolo de smtesis de peptidos convencional. Por ejemplo, la smtesis por etapas de un polipeptido de KI descrito en el presente documento puede llevarse a cabo mediante la eliminacion de un grupo protector amino (N) terminal de un aminoacido inicial (es decir, carboxi-terminal), y el acoplamiento al mismo del extremo carboxilo del siguiente aminoacido en la secuencia del polipeptido. Este aminoacido esta tambien adecuadamente protegido. El grupo carboxilo del aminoacido entrante puede activarse para que reaccione con el extremo N-terminal del aminoacido unido mediante la formacion para dar un grupo reactivo tal como formacion para dar una carbodiimida, un antudrido de acido simetrico o un grupo “ester activo” tal como hidroxibenzotriazol o esteres pentafluorofemlicos. Los metodos de smtesis de peptidos en fase solida preferidos incluyen el metodo de BOC, que utiliza terc-butiloxicarbonilo como grupo protector de a-amino, y el metodo de FMO^c, que utiliza 9-fluorenilmetiloxicarbonilo para proteger el a-amino de los residuos de aminoacido. Ambos metodos los conocen bien los expertos en la tecnica (Stewart, J. y Young, J., Solid-Phase Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co., San Francisco 1989); Merrifield, J., 1963. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154; Bodanszky, M. y Bodanszky, A., The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Nueva York 1984). Si se desea, pueden disenarse aminoacidos amino y/o carboxi-terminales para dar la secuencia de aminoacidos y anadirse durante la smtesis de polipeptidos.

Alternativamente, pueden producirse polipeptidos de dominio Kunitz y polipeptidos de KI utiles en las composiciones y los metodos de la invencion mediante metodos recombinantes usando cualquiera de varias celulas y vectores de expresion correspondientes, incluyendo pero sin limitarse a vectores de expresion bacterianos, vectores de expresion de levaduras, vectores de expresion de baculovirus, vectores de expresion de virus de mamfferos, y similares. Tambien pueden producirse polipeptidos de dominio Kunitz y polipeptidos de KI utiles en las composiciones y los metodos de la invencion de manera transgenica usando moleculas de acido nucleico que comprenden una secuencia codificante deun polipeptido de dominio Kunitz o de KI descrito en el presente documento, en el que la molecula de acido nucleico puede integrarse en y expresarse a partir del genoma de un animal huesped usando metodos transgenicos disponibles en la tecnica. En algunos casos, puede ser necesario o ventajoso fusionar la secuencia codificante de un polipeptido de dominio Kunitz o un polipeptido de KI que comprende el dominio Kunitz con otra secuencia codificante en un vector de expresion para formar un polipeptido de fusion que se expresa facilmente en una celula huesped. Preferiblemente, la celula huesped que expresa un polipeptido de fusion de este tipo tambien procesa el polipeptido de fusion para producir un polipeptido de dominio Kunitz o de KI util en la invencion que contiene solo la secuencia de aminoacidos deseada. Obviamente, si cualquier otro aminoacido permanece unido al polipeptido de dominio Kunitz o de KI expresado, tal(es) aminoacido(s) adicional(s) no debe(n) disminuir la actividad de union a calicrema y/o inhibidora de calicrema del polipeptido de dominio Kunitz o de KI de modo que impida el uso del polipeptido en los metodos o las composiciones de la invencion.

Un sistema de expresion recombinante preferido para producir polipeptidos de KI utiles en los metodos y composiciones descritos en el presente documento es un vector de expresion de levaduras, que permite que una secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de KI o polipeptido de dominio Kunitz se una en el mismo marco de lectura con una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de peptido lfder prepro mata de Saccharomyces cerevisiae, que a su vez esta bajo el control de un promotor de levadura operable. El plasmido de expresion de levaduras recombinante resultante puede transformarse entonces mediante metodos convencionales en las celulas de un huesped de levaduras apropiado, compatible, cuyas celulas son capaces de expresar la protema recombinante a partir del vector de expresion de levaduras recombinante. Preferiblemente, una celula huesped de levadura transformada con un vector de expresion recombinante de este tipo tambien es capaz de procesar la protema de fusion para proporcionar un polipeptido de KI util en los metodos y composiciones de la invencion. Un huesped de levadura preferido para producir polipeptidos de dominio KunitZ recombinantes y polipeptidos de KI que comprenden tales dominios Kunitz es Pichia pastoris.

Tal como se indico anteriormente, los polipeptidos de KI que son utiles en los metodos y composiciones descritos en el presente documento pueden comprender un polipeptido de dominio Kunitz descrito en el presente documento. Algunos polipeptidos de KI pueden tener una secuencia flanqueante adicional, preferiblemente de uno a seis aminoacidos de longitud, en el extremo amino y/o carboxi-terminal, siempre que tales aminoacidos adicionales no disminuyan significativamente la afinidad de union a calicrema o la actividad de inhibicion de calicrema como para impedir su uso en los metodos y composiciones descritos en el presente documento. Tales aminoacidos adicionales pueden anadirse deliberadamente para expresar un polipeptido de KI en una celula huesped recombinante particular o pueden anadirse para proporcionar una funcion adicional, por ejemplo, para proporcionar un peptido para unir el polipeptido de KI a otra molecula o para proporcionar un resto de afinidad que facilite la purificacion del polipeptido. Preferiblemente, el/los aminoacido(s) adicional(es) no incluye(n) cistema, que podna interferir con los enlaces disulfuro del dominio Kunitz. Los ejemplos nativos de dominios Kunitz presentan enlaces disulfuro, por ejemplo, BPTI contiene enlaces bisulfuro entre residuos de cistema en las posiciones de aminoacido 5 y 55; 14 y 38; y 30 y 51.

El polipeptido de dominio Kunitz util en los metodos y composiciones de la invencion tiene la secuencia de aminoacidos de los residuos 3-60 de SEQ ID NO: 2. Cuando se expresa y se procesa en un sistema de expresion de protemas de fusion de levaduras (por ejemplo, basado en el plasmido de expresion de integracion pHIL-D2), un polipeptido de dominio Kunitz de este tipo conserva un dipeptido de Glu-Ala amino terminal adicional de la fusion con la secuencia de peptido lfder prepro mata de S. cerevisiae. Cuando se secreta de la celula huesped de levadura, la mayor parte del peptido lfder se procesa a partir de la protema de fusion para producir un polipeptido funcional de KI (tambien denominado “PEP-1” o “DX88”) que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 (vease la region en el recuadro en la figura 2 ).

Los polipeptidos de KI particularmente preferidos utiles en los metodos y composiciones descritos en el presente documento tienen una afinidad de union por calicrema que es del orden de 1000 veces mayor que la de la aprotinina, que esta aprobada actualmente para su uso en procedimientos de CABG para reducir la perdida de sangre. Las afinidades de union sorprendentemente altas de tales polipeptidos de KI descritos en el presente documento indican que tales polipeptidos de KI presentan un alto grado de especificidad por calicrema para la exclusion de otras dianas moleculares (vease la tabla 1, a continuacion). Por tanto, el uso de tales polipeptidos segun la invencion reduce mucha de la especulacion acerca de las posibles dianas terapeuticas. El menor grado de especificidad presentado por, por ejemplo, la aprotinina, conduce a posibles efectos secundarios pleiotropicos y a ambiguedad acerca de su mecanismo terapeutico.

Los polipeptidos definidos por, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 contienen posiciones invariantes, por ejemplo, las posiciones 5, 14, 30, 51 y 55 pueden ser Cys solo. Otras posiciones tales como, por ejemplo, las posiciones 6, 7, 8, 9, 20, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 41, 42, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53 y 54 pueden ser cualquier aminoacido (incluyendo aminoacidos que no se producen de manera natural). En una realizacion particularmente preferida, uno o mas aminoacidos corresponden al de una secuencia nativa (por ejemplo, LACI (SEQ ID NO: 32-34)). En una realizacion preferida, al menos una posicion variable es diferente de la de la secuencia nativa. En aun otra realizacion preferida, los aminoacidos pueden sustituirse cada uno individual o colectivamente mediante una sustitucion de aminoacidos conservativa o no conservativa. Las sustituciones de aminoacidos conservativas reemplazan un aminoacido por otro aminoacido de estructura qmmica similar y pueden no tener efecto sobre la funcion de la protema. Las sustituciones de aminoacidos no conservativas reemplazan un aminoacido por otro aminoacido de estructura qmmica distinta. Los ejemplos de sustituciones de aminoacidos conservados incluyen, por ejemplo, Asn->Asp, Arg->Lys y Ser->Thr. En una realizacion preferida, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y/o 21 de estos aminoacidos pueden seleccionarse independiente o colectivamente, en cualquier combinacion, para que se correspondan con la posicion correspondiente de SEQ ID NO: 2.

Otras posiciones, por ejemplo, las posiciones 10, 11,13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 31, 32, 34, 35, 39, 40, 43 y 45, pueden ser cualquiera de un conjunto seleccionado de aminoacidos. Por tanto SEQ ID NO: 1 define un conjunto de posibles secuencias. Cada miembro de este conjunto contiene, por ejemplo, una cistema en las posiciones 5, 14, 30, 51 y 55, y uno cualquiera de un conjunto espedfico de aminoacidos en las posiciones 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 221, 22, 23, 31, 32, 34, 35, 39, 40, 43 y 45. En una realizacion preferida, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18 y/o 19 de estos aminoacidos pueden seleccionarse independiente o colectivamente, en cualquier combinacion, para que se correspondan con la posicion correspondiente de SEQ ID NO: 2. El peptido tiene preferiblemente al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de identidad con SEQ ID NO: 2.

Metodos y composiciones

La presente invencion se dirige a metodos para conservar organos y tejidos que comprenden poner en contacto el organo o tejido con una disolucion de conservante que comprende un inhibidor de calicrema, tal como se describe en las reivindicaciones. La invencion tambien se refiere a reducir, inhibir o prevenir el dano o la lesion por reperfusion en un organo o tejido que se ha extirpado de su huesped que comprende poner en contacto el organo o tejido con dicho inhibidor de calicrema. Las disoluciones de conservante de la invencion pueden usarse para conservar y/o proteger tejido de organos, u organos completos, cuando dichos organos o tejido se ponen en contacto con la disolucion. Una realizacion espedfica de la invencion es para la conservacion de un corazon humano, o tejido miocardico humano. Otra realizacion de la invencion es para la conservacion de un pulmon humano o tejido pulmonar humano. Otros organos, o partes de los mismos, que pueden conservarse segun la invencion incluyen rinon, fngado, tejido endotelial, tejido intestinal, tejido vascular (por ejemplo, un injerto de aorta), piel y pancreas. La invencion contempla el uso de las disoluciones para conservar tejido de marnffero, organos o una porcion de los mismos. Ademas, las disoluciones pueden usarse para facilitar el trasplante de organos, por ejemplo, mediante perfusion del organo o tejido durante el procedimiento de trasplante. La disolucion puede usarse tambien como disolucion de cardioplejfa en cirugfa cardiaca. Preferiblemente, el organo o porcion del mismo se mantiene en la disolucion apropiada en todo momento, particularmente, antes del procedimiento de trasplante.

Las disoluciones de la invencion pueden usarse para mantener la viabilidad del organo o tejido durante el almancenamiento, el trasplante u otra cirugfa. La invencion incluye un metodo de almacenamiento de tejido u organos que comprende poner en contacto dicho tejido, organo o parte del mismo, con la disolucion de la invencion, de manera que se prolongue la viabilidad in vivo y/o in vitro. Las disoluciones permiten el mantenimiento de la viabilidad del tejido de corazon o pulmon durante hasta 24 horas o mas. El uso de las disoluciones de la invencion da como resultado una viabilidad mejorada de los organos.

Alternativamente o ademas, una vez extirpado del donante, el organo o tejido vivo puede colocarse en una disolucion de conservacion que contiene el inhibidor. Ademas, el inhibidor de calicrema se administra tambien preferiblemente al receptor del trasplante justo antes de, o simultaneamente con, el trasplante. En todos los casos, el inhibidor tambien puede administrarse directamente al tejido en riesgo, como mediante inyeccion al tejido, o puede proporcionarse de manera sistemica, o bien mediante administracion oral o bien parenteral, usando cualquiera de los metodos y formulaciones descritos en el presente documento y/o conocidos en la tecnica.

En una realizacion, puede usarse cualquier disolucion de conservacion disponible comercialmente para sacar provecho. Los ejemplos de tales disoluciones incluyen la disolucion de Belzer UW comercializada con la marca comercial VIASPAN, descrita en las patentes estadounidenses n.os 4.798.824, 4.873.230, 4.879.283.

La disolucion de conservacion y la composicion del perfundido descritas en las patentes mencionadas anteriormente incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente:

TABLA 2

La disolucion se lleva a pH 7,4 a temperature ambiente con NaOH. Las concentraciones finales son Na=30,+0,5 mM, K+ = 120 5 mM, mOsm/litro=320 5. Bactrim = trimetoprima (16 mg/ml) y sulfametoxazol (80 mg/ml). El hidroxietilalmidon puede estar presente en el intervalo de desde aproximadamente el 3 hasta aproximadamente el 8 %.

Esta disolucion proporciona normalmente una conservacion de 72 horas del pancreas, una conservacion de 48 horas del rinon y una conservacion de al menos 24 horas del hngado. La patente estadounidense 5.145.771 describio la disolucion de conservacion de organos conocida como “disolucion Carolina”, que es tambien util en la presente invencion. La disolucion de conservacion o enjuague descrita en la patente mencionada anteriormente incluye, pero no se limita a, los componentes en aproximadamente los intervalos de concentracion expuestos en la tabla 3 a continuacion.

TABLA 3

Una realizacion espedfica se prepara con los componentes en las cantidades expuestas en la tabla 4 a continuacion segun las instrucciones expuestas a continuacion.

TABLA 4: Componentes de 1 litro de disolucion de enjuague

En una realizacion, esta disolucion puede prepararse tal como sigue: usando un matraz volumetrico de 500 ml, medir 500 ml de disolucion de hidroxietilalmidon al 10 % (peso/volumen) y verterla en un vaso de precipitados de 1 l. Anadir 400 ml de agua doblemente destilada y agitar vigorosamente usando una barra agitadora magnetica. Anadir el resto de los componentes de uno en uno. Tras anadirse todos los componentes, ajustar el pH a 6,5 con 1-2 ml de NaOH 5 N. La disolucion debe agitarse durante al menos treinta minutos. Transferir la disolucion a un matraz volumetrico de 1 l y llevar hasta un volumen final de 1 l. Filtrar para eliminar cualquier partfcula no disuelta.

Todavfa otra realizacion se ejemplifica mediante la tabla 5 a continuacion.

TABLA 5: Intervalos de concentracion en 1 litro

Una composicion segun la tabla 5 anterior puede incluir opcionalmente uno, varios o todos los componentes adicionales especificados en la tabla 3 anterior. Preferiblemente, la composicion incluye al menos un antioxidante. Por tanto, una realizacion espedfica de una composicion se expone en la tabla 6 a continuacion:

TABLA 6: Componentes de 1 litro de disolucion de enjuague

Las composiciones preferidas pueden comprender ademas uno o mas tampones, portadores, antioxidantes, inhibidores de proteasa u otros agentes antiisquemicos farmaceuticamente aceptables.

Las composiciones utiles en los metodos de la invencion comprenden polipeptidos de KI que comprenden un polipeptido de dominio Kunitz que tiene una secuencia de 58 aminoacidos de los aminoacidos 3-60 de SEQ ID NO: 2. Un ejemplo de un polipeptido de KI particularmente preferido de este tipo util en los metodos y composiciones de la invencion es el polipeptido PEP-1 de KI que tiene la secuencia de 60 aminoacidos de SEQ ID NO: 2. En SEQ ID NO: 3 se proporciona una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 (veanse, por ejemplo, los nucleotidos 309-488 en la figura 2). Se entiende que, basandose en el codigo genetico conocido, la invencion tambien proporciona formas degeneradas de la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 3 simplemente sustituyendo cada aminoacido codificado por la secuencia de nucleotidos por uno o mas de los codones degenerados conocidos. Los nucleotidos 7-180 de SEQ ID NO: 3, y formas degeneradas de la misma, codifican el polipeptido de dominio Kunitz que no se produce de manera natural que tiene la secuencia de 58 aminoacidos de los aminoacidos 3-60 de SEQ ID NO: 2.

Consideraciones de concentracion para polipeptidos de KI

Varias consideraciones con respecto a la dosificacion con un polipeptido de KI en los metodos de la invencion pueden ilustrarse a modo de ejemplo con el polipeptido PEP-1 de KI representativo de la invencion que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ Id NO: 2 (peso molecular de 7.054 Daltons).

La tabla 7, a continuacion, proporciona una comparacion de la afinidad (Ki.app) del polipeptido PEP-1 de KI por calicrema y otras once proteasas plasmaticas conocidas.

TABLA 7

ND = no determinado

Claramente, el polipeptido PEP-1 de KI es altamente espedfico para calicrema plasmatica humana. Ademas, la afinidad (Ki.app) de PEP-1 por calicrema es 1000 veces mayor que la afinidad de aprotinina por calicrema: la Ki.app de PEP-1 por calicrema es de aproximadamente 44 pM (tabla 1), mientras que la Ki.app de aprotinina por calicrema es de 30.000 pM. Por tanto, una dosis de PEP-1 podna ser aproximadamente 1000 veces menor que la usada para aprotinina en una base molar. Sin embargo, la consideracion de varios otros factores puede proporcionar una estimacion mas precisa de la dosis de PEP-1 requerida en la practica. Tales factores incluyen la cantidad de calicrema activada tras la extirpacion de un organo de un paciente particular, y los reconocera el experto en la tecnica.

La invencion se describira adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Un polipeptido de KI representativo.

Se identifico un polipeptido de KI (PEP-1) util en las composiciones y metodos de la invencion como polipeptido de union a calicrema presentado en un fago recombinante a partir de una coleccion de presentacion en fago. PEP-1 tiene la siguiente secuencia de aminoacidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 2). El peso molecular de PEP-1 es de 7.054 Daltons.

La secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 3) del ADN de fago recombinante que codifica la secuencia de aminoacidos de PEP-1 (aminoacidos 3-60 de SEQ ID NO: 2) se aislo y se secuencio mediante metodos convencionales determinados a partir del ADN de fago recombinante. Se produjo PEP-1 en cantidades utiles para su caracterizacion adicional como protema recombinante en celulas huesped con fenotipo His4' de la cepa de levadura Pichia pastoris.

Ejemplo 2: Construccion de un plasmido recombinante para expresar polipeptidos de KI.

El plasmido inicial, pHIL-D2, es resistente a ampicilina y contiene un alelo de tipo natural de His4 de P. pastoris. En la figura 2 se muestra la secuencia de ADN final que comprende la secuencia codificante de la protema de fusion prepro mata-PEP-1 en el plasmido de expresion recombinante pPIC-K503. Se modifico la secuencia de ADN de pHIL-D2 para producir pPlC-K503, tal como sigue:

1. Se elimino el sitio SstBI en la region de AOX1 en 3' de pHIL-D2, ubicada en el sentido de 3' del gen His4, mediante digestion por restriccion parcial, relleno y ligacion, alterando la secuencia de TTCGAA (SEQ ID NO: 23) a TTCGCGAA (SEQ ID NO: 24). Se realizo esta modificacion para facilitar y dirigir la clonacion del casete de expresion en el plasmido.

2. Se elimino el sitio AatII que lleva el gen bla ubicado en el sentido de 3' de His4 mediante digestion por restriccion, relleno y ligacion modificando la secuencia de GACGTC (SEQ ID NO: 25) a GACGTACGTC (SEQ ID NO: 26). Se realizo esta modificacion para facilitar la clonacion de casetes de expresion que tienen sitios AatII en el plasmido. Se sintetizo el ADN que codifica PEP-1 basandose en la secuencia de nucleotidos del fago de presentacion que se une a calicrema original y consistfa en 450 pares de bases (pb). La secuencia de ADN final del inserto en el plasmido pHIL-D2 esta flanqueada por una secuencia de AOX1 en 5' y una secuencia de AOX1 en 3' (porciones de las cuales se muestran en la figura 2) y codifican una protema de fusion que comprende el peptido senal prepro mata de S. cerevisiae fusionado a la secuencia codificante estructural para el polipeptido PEP-1 de KI. Se anadio el peptido senal para facilitar la secrecion de PEP-1 de las celulas huesped de levadura. Los oligonucleotidos para formar el inserto se sintetizaron y se obtuvieron comercialmente (Genesis Labs, The Woodlands, TX), y el inserto se genero mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Entonces se incorporo el ADN sintetico unido que codifica la protema de fusion prepro mata/PEP-1 mediante ligacion en el plasmido pHIL-D2 modificado entre los sitios SstBI y EcoRI.

Se usaron los productos de ligacion para transformar la cepa de Escherichia coli XL1 Blue. Se uso un ensayo de PCR para examinar transformantes de E. coli para detectar el constructo de plasmido deseado. Se amplifico ^aDⁿde extractos celulares mediante PCR usando cebadores que conteman las secuencias de AOX1 en 5' y AOX1 en 3' (vease anteriormente y la figura 2). Se secuenciaron los productos de PCR del numero de pares de bases correcto. Ademas, se secuenciaron aproximadamente 20-50 pb en cualquier lado de los sitios de clonacion, y se obtuvo la secuencia predicha. La secuencia de ADN final del inserto en el plasmido pHIL-D2 (para producir el plasmido pPICK503) se muestra en la figura 2 junto con porciones de secuencias de AOX1 en 5' y 3' flanqueantes y secuencias de aminoacidos correspondientes de la protema de fusion que comprenden el peptido senal prepro mata de S. cerevisiae fusionado a la secuencia codificante estructural para el polipeptido de PEP-1 de KI. Se selecciono un transformante con el constructo de plasmido de expresion deseado, el plasmido pPICK503, para preparar lmeas celulares de levadura para la produccion rutinaria de PEP-1.

Ejemplo 3: Fabricacion de PEP-1 a partir de la lmea celular de levadura recombinante.

Se transformaron esferoplastos de P. pastoris GS115 que teman el fenotipo His4' con el plasmido de expresion pPIC-K503 (anteriormente) tras la linearizacion del plasmido en el sitio SacI y la recombinacion homologa del ADN de plasmido en el locus de AOX1 en 5'. El fenotipo de la cepa de produccion es His4+. Se inserto todo el plasmido en la secuencia genomica de AOX1 en 5' de la levadura.

Se examinaron aislamientos de la transformacion para detectar crecimiento en ausencia de histidina exogena con metanol como unica fuente de carbono. Mas del 95 % de los transformantes conservaban la capacidad de tipo natural para crecer con metanol como unica fuente de carbono, demostrando de ese modo que el plasmido se habfa insertado en el genoma del huesped mediante recombinacion homologa en lugar de transposicion. Estos transformantes no requenan histidina exogena para el crecimiento, demostrando de ese modo que el plasmido se habfa integrado en el genoma del huesped. Se clonaron colonias seleccionadas. Se realizaron estudios de expresion de cultivo pequeno para identificar clones que secretaban los mayores niveles de PEP-1 activo al medio de cultivo. Se cuantificaron los niveles de secrecion de PEP-1 en disoluciones de sobrenadante de cultivo clarificadas para determinar los niveles de PEP-1 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se evaluaron para determinar la inhibicion de calicrema. Se selecciono un clon de levadura para la produccion de PEP-1 basandose en su alto nivel de expresion de PEP-1 entre los cultivos muestreados.

Se prepararon comercialmente bancos de celulas maestras y de trabajo de P. pastoris que producen PEP-1 (MDS Pharma Services, Bothell, Washington). Una produccion convencional de PEP-1 en levadura comprendfa tres etapas tal como sigue: (1) preparacion del cultivo simiente, (2) fermentacion y (3) recuperacion del cultivo.

La etapa de cultivo simiente consistfa en la inoculacion de seis frascos (300 ml cada uno) que conteman caldo de inoculo (base de nitrogeno de levadura, fosfato de potasio y glicerol, pH = 5) con el contenido de un unico vial de un banco de celulas de trabajo de P. pastoris que producen PEP-1. Se inocularon los frascos en un agitador orbital (300 rpm) durante aproximadamente 13 horas a 30°C 2°C.

Se realizaron las fermentaciones en un fermentador Braun de 100 litros cerrado con caldo esteril. Se inicio cada fermentacion con la transferencia del contenido de los seis frascos de cultivo simiente al fermentador. Tras aproximadamente 24 horas, se agoto el glicerol en el fermentador y se anadio glicerol adicional durante aproximadamente 8 horas adicionales.

Entonces se inicio una fase de alimentacion mixta, que duro aproximadamente 83 horas, mediante la adicion de una alimentacion de glicerol y metanol. Al final de este tiempo, se termino la fermentacion, y se diluyo el contenido del fermentador con agua purificada. La purificacion y el procesamiento de PEP-1 consisffan en cinco etapas tal como sigue: (1) cromatograffa en lecho expandido, (2) cromatograffa de intercambio cationico, (3) cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC), (4) ultrafiltracion y diafiltracion y (5) filtracion final y envasado.

La etapa de purificacion inicial consisffa en cromatograffa en lecho expandido. Se aplico el cultivo de fermentador diluido a la columna equilibrada empaquetada con resina Streamline SP (columna de cromatograffa Streamline 200 de Amersham Pharmacia, Amersham Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey). Entonces se lavo la columna (acido acetico 50 mM, pH = 3,0 - 3,5) en un modo de flujo ascendente para purgar las celulas de celulas del lecho expandido. Se elevo el adaptador superior por encima del lecho expandido para potenciar el lavado. Se detuvo el flujo y se permitio que el lecho se asentara. Se movio hacia abajo el adaptador de modo que estuviera ligeramente por encima del lecho asentado. Se revirtio la direccion del flujo. Se recogio el efluente. Se continuo lavando en un modo descendente usando acetato de sodio 50 mM, pH 4,0. Se recogio el efluente. Se eluyo PEP-1 de la columna usando acetato de sodio 50 mM, pH 6,0. Se recogio el eluato en un recipiente de 50 litros. Entonces se filtro el eluato a traves de un filtro de 0,22 m dentro de un recipiente limpio ubicado en el sitio de purificacion. Se recogieron muestras adicionales para la determinacion de la concentracion de PEP-1. Entonces se realizo una etapa de cromatograffa de intercambio cationico usando el eluato filtrado de la columna de lecho expandido. Se eluyo PEP-1 de la columna usando citrato de trisodio 15 mM, pH 6,2.

Se eliminaron protemas adicionales de la preparacion de PEP-1 mediante cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC). Antes de la HIC, se diluyo el eluato de la columna de intercambio cationico con sulfato de amonio. Se aplico el eluato a la columna, y se eluyo el PEP-1 usando sulfato de amonio (0,572 M) en fosfato de potasio (100 mM), pH 7.0. Se recogio el eluato en fracciones basandose en los valores de A280. Se recogieron todas las fracciones en botellas de PETG esteriles, pesadas previamente.

Se agruparon fracciones seleccionadas en un recipiente limpio. Se concentro el conjunto mediante ultrafiltracion. La preparacion de PEP-1 concentrada se sometio a diafiltracion inmediatamente frente a diez volumenes de PBS, pH 7.0.

Se realizo una etapa de filtracion final antes del envasado con el fin de minimizar la carga biologica en el PEP-1 en bruto. Se filtro la disolucion en bruto a traves de un filtro de 0,22 m y se recogio en una botella de PETG esteril, pesada previamente. Se retiro una muestra para las pruebas de liberacion del lote. El resto del volumen se dispenso de manera aseptica en botellas de PETG esteriles y se almaceno a -20°C.

Ejemplo 4: Ensayo de inhibicion de calicrema.

Se uso una prueba cinetica para medir la actividad inhibidora de polipeptidos de KI, tales como PEP-1. El ensayo cinetico mide la fluorescencia tras la escision mediada por calicrema de un sustrato, prolilfenilalanilarginilaminometilcumarina. Se incubo una cantidad conocida de calicrema con un patron de referencia de polipeptido de KI diluido en serie o muestras de prueba de polipeptido de KI diluidas en serie, en un tampon de reaccion adecuado en una placa de microtitulacion. Se ejecuto cada muestra por triplicado. Se anadio la disolucion de sustrato, y se leyo la placa inmediatamente usando una longitud de onda de excitacion de 360 nm y una longitud de onda de emision de 460 nm. Se requeffa que al menos dos de cada una de las curvas de muestra y de patron de referencia tuvieran un valor de R-cuadrado de 0,95 para que se considerase valida.

Ejemplo 5: Conservacion de organos

Se lavaron HUVEC en confluencia en PBS y se incubaron adicionalmente a 4 grados durante 24-48 horas en un medio libre de suero (SFM). Tras almacenamiento en fffo, se lavaron las celulas varias veces con PBS, y se anadieron calicrema (0,125 U) y el sustrato de calicrema espedfico S2302 a las celulas. Se registraron los cambios en la densidad optica. Para la evaluacion por microscopfa optica de PEP-1 unido a celulas, tras almacenamiento en fffo, se trataron HUVEC con PEP-1, se fijaron con formalina y se trataron con anticuerpo de conejo anti-PEP-1 y anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa. Tambien se evaluo la capacidad de HUVEC para producir calicrema sobre la superficie celular y en los sobrenadantes de celulas mantenidas a 37 °C. La actividad de calicrema era de 380 19 U.A. en sobrenadantes de HUVEC mantenidos a 37 °C; no pudo medirse actividad en la superficie de las mismas celulas. En la evaluacion por microscopfa optica habfa una union significativa de PEP-1 a la superficie de HUVEC tratadas en fiio durante 24 horas. Se obtuvo el maximo de la union incubando celulas en presencia de PEP-1 (5 mg/ml). PEP-1 unido a celulas conservaba la capacidad para inhibir calicrema exogena. Estos resultados indican que PEP-1 se une a celulas endoteliales, manteniendo su actividad inhibidora de calicrema. Por tanto, puede usarse para detectar y modular el dano mediado por cininas en la superficie vascular.

Aunque esta invencion se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a realizaciones preferidas de la misma, los expertos en la tecnica entenderan que pueden hacerse diversos cambios en la forma y los detalles en la misma sin apartarse del alcance de la invencion abarcado por las reivindicaciones adjuntas.

A continuacion se describen aspectos adicionales de esta divulgacion y se denominan realizaciones E1 a E91; mediante lo cual debe indicarse que la presente invencion se define mediante las reivindicaciones.

E1. Un metodo para conservar un organo o tejido que comprende poner en contacto el organo o tejido con una cantidad eficaz de un inhibidor de calicrema.

E2. El metodo de E1, en el que el polipeptido comprende un dominio Kunitz.

E3. El metodo segun E2, en el que el inhibidor de calicrema es un polipeptido que comprende SEQ ID NO: 2.

E4. El metodo segun E2, en el que el inhibidor de calicrema es un polipeptido que comprende los aminoacidos 3-60 de SEQ ID NO: 2.

E5. El metodo de E1, en el que el organo o tejido es corazon, pulmon, rinon, pancreas, Imgado, intestino, tejido endotelial, tejido vascular o piel.

E6. Un metodo para conservar un organo o tejido que comprende poner en contacto el organo o tejido con una cantidad eficaz de un inhibidor de calicrema que comprende un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaalo Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID NO: 1), en la que

Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno un aminoacido o estan ausentes;

Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41, Xaa42, Xaa44, Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52, Xaa53 y Xaa54 pueden ser cualquier aminoacido;

Xaa10 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asp y Glu;

Xaa11 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala y Thr;

Xaa13 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys y Gln; Xaa15 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln;

Xaa16 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Gly, Ser, Asp y Asn;

Xaa17 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln y Thr;

Xaa18 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: His, Leu, Gln y Ala;

Xaa19 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Pro, Gln, Leu, Asn e Ile;

Xaa21 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Trp, Phe, Tyr, His e Ile;

Xaa22 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe;

Xaa23 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe;

Xaa31 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile y Thr; Xaa32 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Gln, Asp Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly y Val;

Xaa34 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Thr, Ile, Ser, Val, Ala, Asn, Gly y Leu;

Xaa35 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr, Trp y Phe;

Xaa39 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Gly, Ala, Ser y Asp;

Xaa40 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Gly y Ala;

Xaa43 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asn y Gly;

Xaa45 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Phe y Tyr; y

en el que dicho polipeptido inhibe calicrema.

E7. El metodo de E6, en el que Xaa6 es Ala.

E8. El metodo de E6, en el que Xaa7 es Phe.

E9. El metodo de E6, en el que Xaa8 es Lys.

E10. El metodo de E6, en e que Xaa9 es Ala.

E11. El metodo de E6, en e que Xaa10 es Asp.

E12. El metodo de E6, en e que Xaa11 es Asp.

E13. El metodo de E6, en el que Xaa13 es Pro, Xaa15 es Arg, Xaa16 es Ala, Xaa17 es Ala, Xaa18 es His y Xaa19 es Pro.

que Xaa20 es Arg.

E15. El metodo de E6, en el que Xaa24 es Asn.

E16. El metodo de E6, en el que Xaa25 es Ile.

metodo de E6, en el que Xaa26 es Phe

metodo de E6, en el que Xaa27 es Thr.

E19. El metodo de E6, en el que Xaa28 es Arg.

metodo de E6, en el que Xaa29 es Gln.

E21. El metodo de E6, en el que Xaa31 es Glu.

E22. El metodo de E6, en el que Xaa32 es Glu.

metodo de E6, en el que Xaa34 es Ile.

metodo de E6, en el que Xaa35 es Tyr.

metodo de E6, en el que Xaa39 es Glu.

metodo de E6, en el que Xaa41 es Asn.

metodo de E6, en el que Xaa42 es Arg.

metodo de E6, en el que Xaa44 es Arg.

metodo de E6, en el que Xaa46 es Glu.

metodo de E6, en el que Xaa47 es Ser.

E31. El metodo de E6, en el que Xaa48 es Leu.

metodo de E6, en el que Xaa49 es Glu.

metodo de E6, en el que Xaa50 es Glu.

E34. El metodo de E6, en el que el polipeptido comprende dos o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en: Asp en Xaa10; Asp en Xaa11; Pro en Xaa13; Arg en Xaa15; Ala en Xaa16; Ala en Xaa17; His en Xaa18; Pro en Xaa19; Trp en Xaa21; Phe en Xaa22; Phe en Xaa23; Glu en Xaa31; Glu en Xaa32; Ile en Xaa34; Tyr en Xaa35; Glu en Xaa39; Gly en Xaa40; Asn en Xaa43; y Phe en Xaa45.

E35. El metodo de E6, en el que el polipeptido comprende cinco o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en: Asp en Xaa10; Asp en Xaa11; Pro en Xaa13; Arg en Xaa15; Ala en Xaa16; Ala en Xaa17; His en Xaa18; Pro en Xaa19; Trp en Xaa21; Phe en Xaa22; Phe en Xaa23; Glu en Xaa31; Glu en Xaa32; Ile en Xaa34; Tyr en Xaa35; Glu en Xaa39; Gly en Xaa40; Asn en Xaa43; y Phe en Xaa45.

E36. El metodo de E6, en el que el polipeptido comprende diez o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en: Asp en Xaa10; Asp en X aa ll; Pro en Xaa13; Arg en Xaa15; Ala en Xaa16; Ala en Xaa17; His en Xaa18; Pro en Xaa19; Trp en Xaa21; Phe en Xaa22; Phe en Xaa23; Glu en Xaa31; Glu en Xaa32; Ile en Xaa34; Tyr en Xaa35; Glu en Xaa39; Gly en Xaa40; Asn en Xaa43; y Phe en Xaa45.

E37. El metodo de E6, en el que el polipeptido comprende quince o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en: Asp en Xaa10; Asp en Xaa11; Pro en Xaa13; Arg en Xaa15; Ala en Xaa16; Ala en Xaa17; His en Xaa18; Pro en Xaa19; Trp en Xaa21; Phe en Xaa22; Phe en Xaa23; Glu en Xaa31; Glu en Xaa32; Ile en Xaa34; Tyr en Xaa35; Glu en Xaa39; Gly en Xaa40; Asn en Xaa43; y Phe en Xaa45.

E38. El metodo de E6, en el que Xaa3 es Ser.

E39. El metodo de E6, en el que Xaa2 es His.

E40. El metodo de E6, en el que Xaa1 es Met.

E41. El metodo de E6, en el que Xaa56 es Thr.

E42. El metodo de E6, en el que Xaa57 es Arg.

E43. El metodo de E6, en el que Xaa58 es Asp.

E44. El metodo segun E6, en el que el inhibidor de calicrema es un polipeptido que comprende los aminoacidos 3-60 de SEQ ID NO: 2.

E45. El metodo segun E6, en el que el inhibidor de calicrema es un polipeptido que comprende SEQ ID NO: 2.

E46. El metodo de E6, en el que el organo o tejido es corazon, pulmon, rinon, pancreas, Imgado, intestino, tejido endotelial, tejido vascular o piel.

E47. Un metodo para reducir la lesion por reperfusion de un organo durante la cirugfa y/o tras la extirpacion del organo de un sujeto, que comprende colocar el organo en una disolucion de conservacion y almacenamiento de organos, en el que la disolucion comprende un inhibidor de calicrema.

E48. El metodo segun E47, en el que el inhibidor de calicrema es un polipeptido que comprende SEQ ID NO: 1, en la que Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno un aminoacido o estan ausentes;

Xaa10 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asp y Glu;

Xaa13 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys y Gln;

Xaa15 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln;

Xaa22 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe;

Xaa23 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe;

Xaa35 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr, Trp y Phe;

Xaa40 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Gly y Ala;

Xaa43 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asn y Gly;

Xaa45 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Phe y Tyr.

E49. El metodo segun E47, en el que el inhibidor de calicrema es un polipeptido que comprende los aminoacidos 3 60 de SEQ ID NO: 2.

E50. El metodo segun E47, en el que el inhibidor de calicrema es un polipeptido que comprende SEQ ID NO: 2. E51. El metodo de E47, en el que el organo o tejido es corazon, pulmon, rinon, pancreas, Imgado, intestino, tejido endotelial, tejido vascular o piel.

E52. Una composicion para conservar y/o almacenar un organo que comprende una disolucion de conservacion de organos ex vivo fisiologicamente aceptable que contiene un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID NO: 1), en la que

Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 oXaa58 son cada uno individualmente un aminoacido o estan ausentes; Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41, Xaa42, Xaa44, Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52, Xaa53 y Xaa54 pueden ser cualquier aminoacido;

Xaa10 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asp y Glu;

Xaa11 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala y Thr; Xaa13 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys y Gln; Xaa15 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln;

Xaa22 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe;

Xaa23 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe;

Xaa35 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr, Trp y Phe;

Xaa40 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Gly y Ala;

Xaa43 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Asn y Gly;

Xaa45 es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: Phe y Tyr; y

en la que dicho polipeptido inhibe calicrema.

E53. La composicion de E52, en a que Xaa6 es Ala.

E54. La composicion de E52, en a que Xaa7 es Phe.

E55. La composicion de E52, en a que Xaa8 es Lys.

E56. La composicion de E52, en a que Xaa9 es Ala.

E57. La composicion de E52, en a que Xaa10 es Asp.

E58. La composicion de E52, en a que Xaa11 es Asp.

E59. La composicion de E52, en la que Xaa13 es Pro, Xaa15 es Arg, Xaa16 es Ala, Xaa17 es Ala, Xaa18 es His y Xaa19 es Pro.

E60. La composicion de E52, en la que Xaa20 es Arg.

E61. La composicion de E52, en la que Xaa24 es Asn.

E62. La composicion de E52, en la que Xaa25 es Ile.

E63. La composicion de E52, en la que Xaa26 es Phe

E64. La composicion de E52, en la que Xaa27 es Thr.

E65. La composicion de E52, en la que Xaa28 es Arg.

E66. La composicion de E52, en la que Xaa29 es Gln.

E67. La composicion de E52, en la que Xaa31 es Glu.

E68. La composicion de E52, en la que Xaa32 es Glu.

E69. La composicion de E52, en la que Xaa34 es Ile.

E70. La composicion de E52, en la que Xaa35 es Tyr.

E71. La composicion de E52, en la que Xaa39 es Glu.

E72. La composicion de E52, en la que Xaa41 es Asn.

E73. La composicion de E52, en la que Xaa42 es Arg.

E74. La composicion de E52, en la que Xaa44 es Arg.

E75. La composicion de E52, en la que Xaa46 es Glu.

E76. La composicion de E52, en la que Xaa47 es Ser.

E77. La composicion de E52, en la que Xaa48 es Leu.

E78. La composicion de E52, en la que Xaa49 es Glu.

E79. La composicion de E52, en la que Xaa50 es Glu.

E80. La composicion de E52, en la que el polipeptido comprende dos o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en: Asp en Xaa10; Asp en Xaa11; Pro en Xaa13; Arg en Xaa15; Ala en Xaa16; Ala en Xaa17; His en Xaa18; Pro en Xaa19; Trp en Xaa21; Phe en Xaa22; Phe en Xaa23; Glu en Xaa31; Glu en Xaa32; Ile en Xaa34; Tyr en Xaa35; Glu en Xaa39; Gly en Xaa40; Asn en Xaa43; y Phe en Xaa45.

E81. La composicion de E52, en la que el polipeptido comprende cinco o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en: Asp en Xaa10; Asp en Xaa11; Pro en Xaa13; Arg en Xaa15; Ala en Xaa16; Ala en Xaa17; His en Xaa18; Pro en Xaa19; Trp en Xaa21; Phe en Xaa22; Phe en Xaa23; Glu en Xaa31; Glu en Xaa32; Ile en Xaa34; Tyr en Xaa35; Glu en Xaa39; Gly en Xaa40; Asn en Xaa43; y Phe en Xaa45.

E82. La composicion de E52, en la que el polipeptido comprende diez o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en: Asp en Xaa10; Asp en X aa ll; Pro en Xaa13; Arg en Xaa15; Ala en Xaa16; Ala en Xaa17; His en Xaa18; Pro en Xaa19; Trp en Xaa21; Phe en Xaa22; Phe en Xaa23; Glu en Xaa31; Glu en Xaa32; Ile en Xaa34; Tyr en Xaa35; Glu en Xaa39; Gly en Xaa40; Asn en Xaa43; y Phe en Xaa45.

E83. La composicion de E52, en la que el polipeptido comprende quince o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en: Asp en Xaa10; Asp en Xaa11; Pro en Xaa13; Arg en Xaa15; Ala en Xaa16; Ala en Xaa17; His en Xaa18; Pro en Xaa19; Trp en Xaa21; Phe en Xaa22; Phe en Xaa23; Glu en Xaa31; Glu en Xaa32; Ile en Xaa34; Tyr en Xaa35; Glu en Xaa39; Gly en Xaa40; Asn en Xaa43; y Phe en Xaa45.

E84. La composicion de E52, en la que Xaa3 es Ser.

E85. La composicion de E52, en la que Xaa2 es His.

E86. La composicion de E52, en la que Xaa1 es Met.

E87. La composicion de E52, en la que Xaa56 es Thr.

E88. La composicion de E52, en la que Xaa57 es Arg.

E89. La composicion de E52, en la que Xaa58 es Asp.

E90. La composicion segun E52, en la que el polipeptido comprende SEQ ID NO: 2.

E91. Un metodo para conservar un organo o tejido que comprende poner en contacto el organo o tejido con una disolucion de conservacion de organos ex vivo fisiologicamente aceptable que contiene un polipeptido de union a calicrema.

E92. El metodo segun E91, en el que el polipeptido de union a calicrema comprende SEQ ID NO: 2.

E93. El metodo de E91, en el que el organo o tejido es corazon, pulmon, rinon, pancreas, Imgado, intestino, tejido endotelial, tejido vascular o piel.

E94. El metodo de E91, en el que el polipeptido de union a calicrema comprende un dominio Kunitz.

E95. El metodo de E94, en el que el dominio Kunitz comprende una cistema en cada una de posiciones 5 y 55; 14 y 38; y 30 y 51, y comprende ademas:

numero de aminoacido 13 seleccionado de His y Pro;

numero de aminoacido 16 seleccionado de Ala y Gly;

numero de aminoacido 17 seleccionado de Ala, Asn y Ser;

numero de aminoacido 18 seleccionado de His y Leu; y

numero de aminoacido 19 seleccionado de Gln, Leu y Pro (SEQ ID NO: 23),

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composicion para conservar y/o almacenar un organo, comprendiendo la composicion una disolucion de conservacion de organos ex vivo fisiologicamente aceptable y un polipeptido de union a calicrema de 53 -60 aminoacidos, en la que el polipeptido de union a calicrema comprende los aminoacidos 3-60 de SEQ ID NO: 2.

2. La composicion de la reivindicacion 1, en la que la disolucion de conservacion de organos ex vivo comprende en 1 litro de la disolucion:

(i) 100 mmol de lactobionato de K+, 25 mmol de KH2PO4, 5 mmol de MgSO4, 30 mmol de rafinosa, 5 mmol de adenosina, 3 mmol de glutation, 100 U de insulina, 0,5 ml de Bactrim (16 mg/ml), 8 mg de dexametasona, alopurinol 1 mM, y 50 g de hidroxietilalmidon que tiene un peso molecular de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 300.000 y un grado de sustitucion de desde aproximadamente 0,4 hasta 0,7;

(ii) hidroxietilalmidon modificado al 10% 30-100 g/l, NaCl 85-145 mM, KCI 3-6 mM, CaCl2 1,0-1,6 mM, KH2PO40,7-1,3 mM, MgSO40,9-1,5 mM, alopurinol 0,05-5,0 mM, desferrioxamina 0,02-2,0 mM, glutation 0,5-10,0 mM, nicardipino 0,1-5,0 |iM, adenosina 0,1-5,0 mM, fructosa 1,0-50,0 mM, glucosa 1,0-50,0 mM, insulina 5-250 U/l y Mops 2-40 mM;

(iii) hidroxietilalmidon modificado al 10% 50 g/l, NaCl 115 mM, KCI 5 mM, CaCl2 1,30 mM, KH2PO4 1 mM, MgSO4 1,2 mM, alopurinol 1 mM, desferrioxamina 1 mM, glutation 3 mM, nicardipino 2 |iM, adenosina 1 mM, fructosa 10 mM, glucosa 10 mM, insulina 100 U/l y Mops 20 mM;

(iv) NaCl 85-145 mM, KCI 3-6 mM, CaCl2 1,0-1,6 mM, KH2PO4 0,7-1,3 mM, MgSO4 0,9-1,5 mM y adenosina 0,12-1,2 mM; o

(v) NaCl 115 mM, KCI 5 mM, CaCl2 1,30 mM, KH2PO4 1 mM, MgSO4 1,2 mM, alopurinol 1 mM, desferrioxamina 1 mM, glutation 3 mM y adenosina 0,12 mM.

3. La composicion de la reivindicacion 1 o 2, en la que la composicion comprende ademas un antioxidante.

4. Metodo ex vivo para conservar un organo o tejido, comprendiendo el metodo poner en contacto el organo o tejido con la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Metodo ex vivo para reducir la lesion por reperfusion de un organo durante la cirugfa y/o tras la extirpacion del organo de un sujeto, comprendiendo el metodo poner en contacto el organo con la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. El metodo de la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, en el que el organo o tejido es corazon, pulmon, rinon, pancreas, hngado, intestino, tejido endotelial, tejido vascular o piel.