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MX2012014366A - Metodos y medios para modificar un genoma vegetal en una secuencia de nucleotidos usada comunmente en la ingenieria genetica de genomas vegetales. - Google Patents

Metodos y medios para modificar un genoma vegetal en una secuencia de nucleotidos usada comunmente en la ingenieria genetica de genomas vegetales.

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MX2012014366A
MX2012014366A MX2012014366A MX2012014366A MX2012014366A MX 2012014366 A MX2012014366 A MX 2012014366A MX 2012014366 A MX2012014366 A MX 2012014366A MX 2012014366 A MX2012014366 A MX 2012014366A MX 2012014366 A MX2012014366 A MX 2012014366A
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foreign dna
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MX2012014366A
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Halluin Kathleen D
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Bayer Cropscience Nv
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Publication date
Application filed by Bayer Cropscience Nv filed Critical Bayer Cropscience Nv
Publication of MX2012014366A publication Critical patent/MX2012014366A/es
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Abstract

Métodos y medios para modificar de manera dirigida el genoma vegetal de plantas transgénicas que comprenden genes quiméricos, en donde los genes quiméricos tienen un elemento de ADN utilizado comúnmente en la biología molecular de plantas; se proveen meganucleasas rediseñadas para cortar dicho elemento usado comúnmente en la biología molecular de plantas.

Description

MÉTODOS Y MEDIOS PARA MODIFICAR UN GENOMA VEGETAL EN UNA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS USADA COMÚNMENTE EN LA INGENIERIA GENÉTICA DE GENOMAS VEGETALES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el campo de la agronomía. Más particularmente, la invención provee métodos y medios para introducir una modificación deseada, incluyendo una inserción, una supresión o una sustitución, en una secuencia de nucleótidos localizada de manera precisa en el genoma de una planta trangénica, en donde la secuencia de nucleótidos está comprendida dentro de un elemento o fragmento ADN que es de uso frecuente en la transgénesis de plantas, tal como un gen marcador seleccionable utilizado habitualmente. Las modificaciones son desencadenadas en un primer paso por inducción de una ruptura de cadena doble en la secuencia de nucleótidos de reconocimiento usando meganucleasas derivadas de meganucleasas naturales que fueron rediseñadas para reconocer el sitio de reconocimiento y luego cortarlo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La necesidad de introducir modificaciones deseadas en genomas vegetales, incluyendo el control sobre la ubicación de la integración del ADN extraño en plantas se ha vuelto cada vez más importante, y se han desarrollado métodos en un esfuerzo por atender esta necesidad (por una revisión, véase Kumar y Fladung, 2001 , Trends in Plant Science, 6, páginas 155-159). Estos métodos se basan mayormente en la introducción inicial de una ruptura de ADN de cadena doble en la ubicación deseada.
Se ha demostrado que la activación del locus blanco y/o del ADN de reparación o donante por inducción de rupturas del ADN de cadena doble realizada por endonucleasas de corte raro, tal como l-Scel, incrementa la frecuencia de recombinación homologa en varios órdenes de magnitud. (Puchta et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 93, páginas 5055-5060; Chilton y Que, Plant Physiol., 2003; D'Halluin et al., 2008 Plant Biotechnol. J. 6, 93-102).
En WO96/14408 se describe un ADN aislado que codifica la enzima l-Scel. Esta secuencia de ADN se puede incorporar en vectores de clonación y expresión, líneas de células transformadas y animales transgénicos. Los vectores son de utilidad en el mapeo de genes y la inserción de genes dirigida al sitio.
En WO00/46386 se describen métodos para modificar, reparar, atenuar e inactivar un gen u otro ADN cromosómico en una célula por medio de una ruptura de cadena doble inducida por l-Scel. También se divulgan métodos de tratamiento o profilaxis de una enfermedad genética en un individuo que lo necesita. Además se divulgan endonucleasas de restricción quiméricas.
Además, se han descrito métodos que permiten diseñar endonucleasas de corte raro para alterar la especificidad de sustrato o de secuencia de las enzimas, permitiendo así inducir una ruptura de cadena doble en un locus de interés sin depender de la presencia de un sitio de reconocimiento de ninguna de las endonucleasas de corte raro naturales. Brevemente, se pueden preparar enzimas de restricción quiméricas usando híbridos entre un dominio de dedo de zinc diseñado para reconocer una secuencia de nucleótidos específica y el dominio de corte de ADN no específico de una enzima de restricción natural, tal como Fokl. Dichos métodos fueron descritos, por ejemplo en WO 03/080809, en W094/18313 o en WO95/09233 y en Isalan et al., 2001 , Nature Biotechnology 19, 656- 660; Liu et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530). Otra manera de producir meganucleasas personalizadas, por selección en una biblioteca de variantes, se describe en WO2004/067736. Las meganucleasas personalizadas o las meganucleasas rediseñadas con una especificidad de secuencia y una afinidad de unión a ADN alteradas también se pueden obtener por medio de un diseño racional como se describe en WO2007/047859.
En WO2007/049095 se describen variantes de endonucleasas homing "LADGLIDADG" con mutaciones en dos subdominios separados, donde cada uno de ellos une una parte distinta de medio sitio del ADN blanco modificado, de manera tal que la variante de endonucleasa puede cortar una secuencia del ADN blanco quimérico que comprende los nucleótidos unidos por cada subdominio.
En WO2007/049156 y en WO2007/093836 se describen variantes de la endonucleasa homing l-Crel con una nueva especificidad de corte y sus usos.
En WO2007/047859 se describen meganucleasas diseñadas racionalmente con una especificidad de secuencia y una afinidad de unión a ADN alteradas.
En WO2006/105946 se describe un método para realizar un intercambio exacto, en células vegetales y en plantas, de una secuencia de ADN blanco por una secuencia de ADN de interés por medio de recombinación homologa, con lo cual el marcador seleccionare o rastreable usado durante la fase de recombinación homologa para una selección temporal de los efectos de reemplazo de genes pueda eliminarse posteriormente si dejar ninguna huella y sin recurrir al cultivo in vitro durante el paso de eliminación, empleando el método descrito allí para eliminar un ADN seleccionado por expresión específica de microsporas de una endonucleasa de corte raro inductor de una ruptura de cadena doble.
En la Solicitud de Patente Provisional de los EE.UU. N°: 60/828.042 y en la Solicitud de Patente Europea 06020370.0, y en WO2008/037436 se describen variantes de los métodos y medios de WO2006/105946, en donde el paso de eliminación de un fragmento de ADN seleccionado inducido por una endonucleasa de corte raro inductora de una ruptura de cadena doble se encuentra bajo el control de un promotor específico de la línea germinal. Otras formas de realización del método, se basaban en la unión de extremos no homólogos en un extremo del ADN de reparación y en la recombinación homologa en el otro extremo.
Gao et al., 2009, The Plant Journal, páginas 1-11 , describen una mutagénesis dirigida hereditaria en maíz usando una endonucleasa rediseñada.
Dado que las meganucleasas rediseñadas derivan de endo-nucleasas naturales, los potenciales sitios de reconocimiento disponibles no son completamente aleatorios sino que parecen mostrar algún grado de semejanza con la secuencia de nucleótidos reconocida originalmente por la endonucleasa natural sobre la cual se basa la meganucleasa rediseñada. Según se establece en Gao et al, 2009 {supra) el método de diseño de proteínas basado en la estructura para modificar las características de unión de ADN de l-Crel se basan en la inspección visual de la estructura co-cristalina de l-Crel-ADN que conduce a la predicción de un gran número de sustituciones de aminoácidos que cambia la preferencia de bases de l-Crel en posiciones particulares en su sitio de reconocimiento. Las sustituciones de aminoácido individuales fueron evaluadas experimentalmente, y aquellas que conferían el cambio deseado en la preferencia de bases se incorporaron en una base de datos de mutaciones que se pueden "mezclar y aparear" para generar derivados de l-Crel que reconocen sitios de ADN altamente divergentes. En teoría, la diversidad combinatoria disponible usando la base de datos de mutaciones actual es suficiente para dirigir una endonucleasa manipulada aproximadamente cada 1000 bp en una secuencia de ADN aleatoria.
Por consiguiente, aún persiste la necesidad de megaun-cleasas rediseñadas funcionales que puedan reconocer un sitio de reconocimiento en un elemento o región de ADN introducido previamente en una planta trangénica como una parte usada comúnmente de un transgen, e inducir una ruptura de ADN de cadena doble en dicha región con una eficiencia suficiente, desencadenando de esa manera los eventos requeridos, p.ej., para la inserción del ADN extraño, la supresión o sustitución por recombinación homologa o unión de extremos no homólogos en el sitio de ruptura de cadena doble. La identificación de dicho par compuesto por el sitio de reconocimiento y la meganucleasa rediseñada, mejora las herramientas disponibles para modificar un genoma vegetal de una manera dirigida, al permitir la inserción, supresión o sustitución del ADN en la proximidad de la ruptura de ADN de cadena doble inducida en la ubicación de un transgen introducido previamente, sin necesidad de recurrir a la presencia de los sitios de reconocimiento para endonucleasas de corte raro introducidos históricamente tal como, p.ej., I-Scel (lo cual no se produce naturalmente en las células vegetales).
Estos y otros problemas se resuelven como se describirá de aquí en adelante en las diferentes formas de realización de la invención, así como en las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una forma de realización de la invención, se provee un método para introducir una molécula de ADN extraño en un sitio predefinido en un genoma de una célula vegetal trangénica, que comprende los pasos de a. inducir una ruptura de ADN de cadena doble en el sitio predefinido; b. introducir la molécula de ADN extraño en la célula vegetal; c. seleccionar una célula vegetal en donde el ADN extraño se introduce en el sitio predefinido; y d. opcionalmente regenerar la célula vegetal en una planta caracterizado porque entonces el sitio predefinido es una secuencia de nucleótidos diferente de un sitio de reconocimiento para una meganucleasa natural y entonces el sitio predefinido es una secuencia de nucleótidos introducida comúnmente como parte de un transgen en una planta trangénica y en donde la ruptura de ADN de cadena doble es inducida por introducción de una meganucleasa de cadena simple no natural o un par de meganucleasas no naturales que reconoce o reconocen conjuntamente el sitio predefinido e induce o inducen la ruptura de cadena doble.
En otra forma de realización, la invención provee un método para introducir una molécula de ADN extraño en un sitio predefinido del genoma de una célula vegetal, que comprende los pasos de a. inducir una ruptura de ADN de cadena doble en el sitio predefinido; b. introducir la molécula de ADN extraño en la célula vegetal; c. seleccionar una célula vegetal en donde el ADN extraño se introduce en el sitio predefinido; y d. opcionalmente regenerar la célula vegetal en una planta caracterizado porque entonces el sitio predefinido está comprendido dentro de una región de codificación de fosfinotricinacetiltransferasa de S. hygroscopicus (región de codificación de bar), que puede tener la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N° 3 y porque la ruptura de ADN de cadena doble es inducida por introducción de una meganucleasa de cadena simple o un par de meganucleasas que reconoce o reconocen conjuntamente el sitio predefinido e induce o inducen la ruptura de cadena doble. El sitio predefinido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N° 1 o la SEQ ID N° 2.
En aún otra forma de realización, se provee un método para introducir una molécula de ADN extraño en un sitio predefinido del genoma de una célula vegetal, que comprende los pasos de a. inducir una ruptura de ADN de cadena doble en el sitio predefinido; b. introducir la molécula de ADN extraño en la célula vegetal; c. seleccionar una célula vegetal en donde el ADN extraño se introduce en el sitio predefinido; y d. opcionalmente regenerar la célula vegetal en una planta caracterizado porque entonces el sitio predefinido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N° 1 o de la SEQ ID N° 2 y porque la ruptura de ADN de cadena doble es inducida por introducción de una meganucleasa de cadena simple o un par de meganucleasas que reconoce o reconocen conjuntamente el sitio predefinido y induce o inducen la ruptura de cadena doble, tal como una meganucleasa o el par de meganucleasas derivan de l-Crel (representado por la SEQ ID N° 16) y en donde los siguientes aminoácidos están presentes en una de las subunidades: - S en la posición 32; Y o R en la posición 33; E en la posición 38; R en la posición 40; K en la posición 66; Q en la posición 80; T en la posición 42; R en la posición 77; R en la posición 68; R en la posición 70; Q en la posición 44; I en la posición 24; S en la posición 26; S en la posición 28 y R en la posición 30 o R en la posición 70; T en la posición 44; I en la posición 24; S en la posición 26; S en la posición 28; N en la posición 30; S en la posición 32; R en la posición 33; Q en la posición 38; Q en la posición 80; R en la posición 40; K en la posición 66; T en la posición 42; R en la posición 77 y R en la posición 68 (posiciones correspondientes a la secuencia de aminoácidos de l-Cre-l). Los ejemplos de dicha meganucleasa son proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 5 y la SEQ ID 6, respectivamente, codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 4 desde la posición de nucleótido 2004 hasta la posición de nucleótido 2525 ó 2522, o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 4 desde la posición de nucleótido 4885 hasta la posición de nucleótido 5405 ó 5403. Una meganucleasa de cadena simples de acuerdo con la invención puede ser una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 18, codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 17 desde la posición de nucleótido 1267 hasta 1605 y 1795 hasta 2541 , o una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 18 desde la posición de aminoácido 1 hasta 167 y 208 a 362, codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N° 17 desde la posición de nucleótido 1267 hasta 1605, 1795 hasta 1956 y 2071 hasta 2541.
En cualquiera de las formas de realización, el ADN extraño puede estar comprendido dentro de un ADN de reparación, donde dicho ADN de reparación comprende al menos una secuencia de nucleótidos flanqueadora homologa de la secuencia 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 1 o la SEQ ID N° 2. El ADN extraño puede comprender un gen marcador seleccionable y/o un gen de interés de expresión en plantas, tal como de un gen de tolerancia a herbicidas, un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un gen de resistencia a un estrés abiótico, una enzima relacionada con la biosíntesis de aceite, la biosíntesis de carbohidratos, una enzima relacionada con la fuerza de las fibras o la longitud de fibras, una enzima relacionada con la biosíntesis de metabolitos secundarios. El ADN extraño también se puede integrar como tal, es decir sin secuencias flanqueadoras con homología con la región que rodea al sitio blanco predefinido (sin ningún ADN adicional), para su integración por unión de extremos no homólogos.
La meganucleasa o el par de meganucleasas pueden expresarse a partir de un gen quimérico o un par de genes quiméricos, cada uno de los cuales comprende un promotor de expresión en plantas ligado operativamente a una región de codificación que codifica la meganucleasa o uno de los miembros del par de meganucleasas, y además está ligado operativamente a una región de ADN relacionada con la terminación de la transcripción y la poliadenilación funcional en una célula vegetal.
La invención provee además células vegetales y plantas y semillas o partes de propagación, en donde el ADN extraño fue introducido en el sitio predefinido, que se obtuvo mediante los métodos provistos en la presente.
La invención también provee un método para cultivar( una planta en donde el ADN extraño fue introducido en el sitio predefinido, que se obtuvo mediante los métodos provistos en la presente, que comprende el paso de aplicar una sustancia química a la planta o al sustrato donde crece la planta.
Aún otra forma de realización de la invención está dirigida a un proceso para producir una planta que comprende un ADN extraño integrado en la región de codificación de bar que comprende el paso de cruzar una planta que consiste esencialmente de las células vegetales obtenidas mediante los métodos de la invención con otra planta o consigo misma y opcionalmente cosechar semillas.
La invención también se refiere a un proceso que comprende el paso de aplicar un compuesto químico sobre una planta o una semilla de una planta en el cual se ha introducido el ADN extraño en el sitio predefinido, que se obtuvo mediante los métodos provistos en la presente.
Otra forma de realización de la invención se relaciona con el uso de una meganucleasa o un par de meganucleasas descritos en la presente para introducir un ADN extraño en la región de codificación de bar en una célula vegetal.
Aún otra forma de realización de la invención se relaciona con el uso de una meganucleasa personalizada para introducir un ADN extraño de interés en un sitio predefinido en una célula vegetal.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS Figura 1 : Representación esquemática del sitio de reconocimiento y de las interacciones con los aminoácidos de las diferentes unidades monoméricas de meganucleasas, BAY 39 y BAY40.
Figura 2: Secuencia de aminoácidos de la unidad monomérica 2 ("40") de BAY 39/40 (obsérvese que la secuencia de aminoácidos comprende una señal de localización nuclear SV40 (aminoácidos 1 a 10)).
Figura 3: Secuencia de aminoácidos de la unidad monomérica 1 ("39") de BAY 39/40 (obsérvese que la secuencia de aminoácidos comprende una señal de localización nuclear SV40 (aminoácidos 1 a 10)).
Figura 4: Secuencia de aminoácidos de la meganucleasa BAY 39/40 de cadena simple (obsérvese que la secuencia de aminoácidos comprende una señal de localización nuclear SV40 (aminoácidos 1-12) y una región conectora (aminoácidos 168 a 205)).
Figura 5: Alineación de la secuencia de nucleótidos de los amplicones de PCR alrededor del sitio de reconocimiento de las regiones de codificación bar, en líneas sensibles a fosfinotricina derivadas de una planta trangénica que comprende un gen bar de expresión en plantas y genes de expresión en plantas para las unidades monoméricas de BAY39/40. 1 : secuencia de nucleótidos de una muestra control; 2: secuencia de nucleótidos de una línea tolerante a fosfinotricina; 3-9: secuencias de nucleótidos de líneas sensibles a fosfinotricina.
DESCRIPCIÓN DE LAS DIFERENTES FORMAS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en la observación que se pueden obtener meganucleasas rediseñadas funcionales que reconocen específicamente y cortan una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N°: 1 y SEQ ID N°: 2 - Figura 1 ), que está presente en la secuencia de nucleótidos de la región de codificación del gen de la fosfinotricinacetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus (gen bar) (Thompson, C, Mowa, R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J., Lauwereys, M. y Botterman, J. (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus, The EMBO Journal 6: 2519-2523 (Acceso X05822), cuya secuencia de nucleótidos está presente en un gen marcador seleccionable usado comúnmente en la transgénesis de plantas.
La SEQ ID N°: 3 representa la secuencia de nucleótidos del gen bar. El complemento del sitio de reconocimiento de la SEQ ID N°: 1 (SEQ ID N°: 2) corresponde a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 3 del nucleótido 132 al 153. Las meganucleasas descritas en la presente tienen entonces la capacidad de reconocer y cortar una secuencia de nucleótidos en plantas transgénicas que comprende un gen de expresión en plantas, que tiene un promotor de expresión en plantas ligado operativamente a una región de ADN que codifica al gen de la fosfinotricinacetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus (bar) y que está seguido por una región de terminación de la transcripción 3' y de poliadenilación funcional en plantas, donde la región de codificación de bar comprende la secuencia de nucleótidos que es el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 1 , tal como la SEQ ID N°: 3.
Se ha incorporado la región de codificación de bar en numerosas plantas transgénicas que fueron, son o serán comercializadas, incluyendo plantas que comprenden los siguientes eventos: Achicoria (Cichorium intvbus): Eventos RM3-3, RM3-4, RM3-6 descritos en el expediente del ente regulador de los Estados Unidos 97-148-01 p Colza oleaginosa (Brassica napus) Evento MS1 descrito en los expedientes DD95-04 (CA) o 98-278-01 p (US) Evento MS8 descrito en los expedientes DD96-17 (CA) o 98-278-01 p (US) o en WO 2001/041558 Evento RF1 descrito en los expedientes DD95-04 (CA) o 98-278-01 p (US) Evento RF2 descrito en los expedientes DD95-04 (CA) o 98-278-01 p (US) Evento RF3 descrito en los expedientes DD96-17 (CA) o 98-278-01p (US) o en WO 2001/041558 Eventos PHY14, PHY35, PHY36 descrito en los expedientes del ente regulador de Japón Algodón (Gossypium hirsutum) Evento LLcotton 25 descrito en los expedientes 02-042-01 p (US) o en WO 2003/013224 Evento T303-40 descrito en WO2008/ 22406 Evento GHB119 descrito en el expediente del ente regulador 08-340-01 p (US) o en WO2008/151780 Maíz (Zea mavs) Evento TC-6275 (=DAS-06275-8) descrito en expediente del ente regulador 03-181 -01 p (US) Evento Bt176 descrito en expediente del ente regulador 94-319-01 p (US) Evento B16 (=DLL25) descrito en el expediente del ente regulador de los Estados Unidos 95-145-01 p o en WO9506128 Evento DBT418 descrito en el expediente del ente regulador 96-291 -01 p (US) - Evento ZMA101 Evento CBH351 descrito en el expediente del ente regulador 97-265-01 p (US) Evento MS3 descrito en el expediente del ente regulador 95-228-01 p (US) - Evento MS6 descrito en el expediente del ente regulador 98-349-01 p (US) Arroz (Orvza sativa) Evento LLRice62 descrito en el expediente del ente regulador de los Estados Unidos 98-329-01 p o en WO 2001/083818 Evento LLRICE601 descrito en el expediente del ente regulador de los Estados Unidos 06-234-01 p o en la Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 2008289060 Soja (Glycine max) Eventos W62 y W98 descritos en expediente del ente regulador 96-068-01 p(US) Las plantas transgénicas que contienen estos eventos contienen entonces una secuencia de reconocimiento para las meganucleasas descritas en la presente y son objetos adecuados para los métodos de la invención. Aún más, el gen bar de expresión en plantas generalmente se usa como un marcador seleccionable y se han generado numerosas plantas transgénicas que también son objetos adecuados para los métodos de la invención.
Por consiguiente, en una forma de realización, la invención se relaciona con un método para introducir una molécula de ADN extraño en un sitio predefinido o preseleccionado en un genoma (nuclear) de una célula vegetal trangénica que comprende los pasos de a. inducir una ruptura de ADN de cadena doble en el sitio predefinido; b. introducir la molécula de ADN extraño en dicha célula vegetal; y c. seleccionar una célula vegetal en donde el ADN extraño se introduce en el sitio predefinido; y en donde el sitio predefinido es una secuencia de nucleótidos diferente de un sitio de reconocimiento para una meganucleasa natural y es una secuencia de nucleótidos introducida comúnmente como parte de un transgen en una planta trangénica y en donde la ruptura de ADN de cadena doble es inducida por introducción de una meganucleasa de cadena simple no natural o un par de unidades monoméricas de meganucleasas no naturales que reconoce o reconocen conjuntamente el sitio predefinido e induce o inducen la ruptura de cadena doble.
Según se usa en la presente, "una secuencia de nucleótidos introducida comúnmente como parte de un transgen en plantas" se refiere a una secuencia de nucleótidos de una región de ADN que se ha usado previamente como un elemento de un gen quimérico introducido en plantas, con lo cual las plantas transgénicas se encuentran fácilmente disponibles, particularmente cuando las plantas transgénicas fueron, son o serán comercializados y para las cuales se ha solicitado la concesión de regulaciones y están disponibles al público. Hay distintas bases de datos que resumen y proveen información acerca de las solicitudes de aprobación reguladora incluyendo la base de datos de cultivos GM del Centro de Evaluación de riesgo que se puede consultar en línea (http://www.cera-gmc.org/?action=gm_crop_datbase&) o el listado resumido de las Solicitudes de desregulación concedidas o en trámite de APHIS, disponible en línea en http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html.
Las regiones de ADN introducidas comúnmente como parte de un transgen en plantas incluyen regiones promotoras, tal como el promotor 35S del transcripto CaMV 35S (Odell et al., (1985), Nature 313: 810-812); el promotor 35S del FMV (Richins R.D., Scholthof H.B., Shepherd R.J. (1987) Sequence of the figwort mosaic virus (caulimovirus group), Nucleic Acids Research 15: 8451-8466); el promotor de la subunidad pequeña del gen Rubisco de Arabidopsis thaliana (Krebbers E., Seurinck J., Herdies L, Cashmore A. R., Timko M. P. (1988), Four genes in two diverged subfamilies encode the ribulose-1 ,5-bisphosphate carboxylase small subunit polypeptides of Arabidopsis thaliana, Plant Molecular Biology, 11 , 745-759); el promotor del virus en mosaico de la vena de Casava (Verdaguer et al (1996) Plant Mol. Biol. 31 : 1 29 o Verdaguer et al (1998) Plant Mol. Biol. 37: 1055); el promotor Actina2 de Arabidopsis (An Y.Q., McDowell J.M., Huang S., McKinney E.C., Chambliss S., Meagher R.B. (1996) Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues, The Plant Journal 10:107-121) o de arroz (McEIroy D., Zhang W., Cao J., Wu R. (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transfomation, The Plant Cell 2: 163-171); el promotor de histona H3 o el promotor de histona H4 (Chabouté M, Chaubet N, Philipps G, Ehling M y Gigot C (1987) Genomic organization and nucleotide sequences of two histone H3 and two histone H4 genes of Arabidopsis thaliana, Plant Mol. Biol. 8: 179-191 ); el promotor del gen de ubiquitina-1 de maíz (Zea mays) (Christensen et al (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675); secuencias directrices de la UTR 5' tal como la directriz cab22L (Harpster M, Townsend J, Jones J, Bedbrook J y Dunsmuir P.(1988) Relative strengths of the 35S cauliflower mosaic virus, V, 2' and nopaline synthase promoters in transformed tobáceo, sugarbeet and oilseed rape callus tissue, Mol Gen Genet, 212: 182-190); o 5' tev (Carrington J y Freed D (1990) Cap-independent enhancement of translation by a plant potyvirus 5' nontranslated región, J Virol 64(4): 1590-1597); un extremo 3' del gen de la nopalina sintasa (Depicker A., Stachel S., Dhaese P., Zambryski P., Goodman H.M. (1982), Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence, Journal of Molecular and Applied Genetics 1 , 561 -573); un extremo 3' del gen de la octopina sintasa (De Greve H., Dhaese P., Seurinck J., Lemmers M., Van Montagu M., Schell J. (1982), Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacteríum tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene, Journal of Molecular and Applied Genetics, 1 , 499-51 1 ); el terminador CaMV35S (Sanfagon et al (1991) Genes Dev, 5: 141) la región de terminación de la transcripción y poliadenilación del gen 7 del vector de ADN-T de tipo octopina (D'Haese et al, 1983, The EMBO Journal, 2, 419-426) y marcadores seleccionares tales como bar (Thompson, C, Movva, R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J., Lauwereys, M. y Botterman, J. (1987) Characterízation of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus, The EMBO Journal 6: 2519-2523 (Acceso X05822)); pat (Wohlleben, W., Arnold, W., Broer, I., Hillemann, D., Strauch, E. y Puhler, A. Nucleotide sequence of the phosphinothrícin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tu494 and its expression in Nicotiana tabacum, Gene 70 (1), 25-37 (1988)); 2mepsps (secuencia 4 de la Patente US6566587 o N° EMBL AR337832); CP4 (Padgette S.R., Re D., Barry G., Eichholtz D., Delannay X., Fuchs R.L., Kishore G.M., Fraley R.T. (1996), New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready gene, en Herbicide-Resistant Crops: Agricultura!, Environmental, Econ...., neo, Acceso V006 8; Beck et al (1982) Gene 19(3) p327-336); o hpt (Kaster et al., (1983), NAR 1 1 , 6895-691 1).
Una región de ADN preferida en el contexto de esta invención es la secuencia de nucleótidos de la región de codificación del gen bar mencionado previamente.
Las meganucleasas rediseñadas descritas en la presente se basan en la meganucleasa natural l-Crel para su uso como andamiaje. I-Crel es una endonucleasa homing presente en los cloroplastos de Chlamydomonas rheinhardti (Thompson et al., 1992, Gene 1 19, 247-251). Esta endonucleasa es un homodímero que reconoce un sitio de ADN pseudo-palindrómico de 22 bp en el gen 23SrRNA y crea una ruptura de ADN de cadena doble que se usa para la introducción de un intrón. I-Crel es un miembro de un grupo de endonucleasas que contienen un solo motivo LAGLIDADG. Las enzimas LAGLIDADG contienen una o dos copias del motivo consenso. Las enzimas de un solo motivo, tal como l-Crel, funcionan como homodímeros, en tanto las enzimas de motivo doble son monómeros con dos dominios separados. Por consiguiente, cuando se rediseñan meganucleasas derivadas de un andamiaje l-Crel para reconocer una secuencia de nucleótidos de 22 bp de interés, se diseñan dos unidades monoméricas, cada una de las cuales reconoce una parte del sitio de reconocimiento de 22 bp, que son necesarios conjuntamente para inducir una ruptura de cadena doble en el sitio de reconocimiento de 22 bp (WO2007/047859). La acción conjunta se puede lograr ligando las dos unidades monoméricas en una meganucleasa de cadena simple o también se puede lograr promoviendo la formación de heterodímeros, como se describe, por ejemplo, en WO2007/047859.
La secuencia de aminoácidos de un monómero l-Crel natural se provee como la SEQ ID N°: 16. Para rediseñar las unidades monoméricas I-Crel de manera tal que los heterodímeros de las mismas reconozcan la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 1 y/o 2, los siguientes aminoácidos están presente en las posiciones indicadas: 1. en la unidad 1 de la meganucleasa: a. S en la posición 32; b. Y en la posición 33; c. E en la posición 38; d. R en la posición 40; e. K en la posición 66; f. Q en la posición 80; g- T en la posición 42; h. R en la posición 77; i. R en la posición 68; j- R en la posición 70; k. Q en la posición 44; I. I en la posición 24; m. S en la posición 26; n. S en la posición 28; o. R en la posición 30. 2. en la unidad 2 de la meqanucleasa: P- R en la posición 70; q- T en la posición 44; r. I en la posición 24; s. S en la posición 26; t. S en la posición 28; u. N en la posición 30; V. S en la posición 32; w. R en la posición 33; X. Q en la posición 38; y- Q en la posición 80; z. R en la posición 40; aa. K en la posición 66; bb. T en la posición 42; ce. R en la posición 77; dd. R en la posición 68.
En la Figura 1 se provee una representación esquemática de la misma.
La enzima inductora de ruptura de cadena doble rediseñada puede comprender, aunque no necesariamente, una señal de localización nuclear (NLS), tal como la NLS del antígeno T grande SV40 [Raikhel, Plant Physiol., 100: 1627-1632 (1992) y las referencias allí citadas] [Kalderon ef al., Cell 39: 499-509 (1984)]. La señal de localización nuclear se puede localizar en cualquier parte en la proteína, pero convenientemente se ubica por el extremo N-terminal de la proteína. La señal de localización nuclear puede reemplazar uno o más de los aminoácidos de la enzima inductora de ruptura de cadena doble. Se debe considerar que si la meganucleasa rediseñada se proporcionó con una NLS por el extremo N-terminal de la proteína, tal como una NLS de 10 ó 12 aminoácidos de SV40, las posiciones de aminoácido se desplazarán (incrementadas) en consecuencia. Asimismo, en el caso que las dos unidades monoméricas están ligadas a una meganucleasa de cadena simple, también se desplazará la posición de la segunda unidad. Las correspondientes posiciones de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos l-Crel también se puede identificar determinando la alineación óptima como se describirá más adelante. Resultará claro que en la meganucleasa rediseñada de cadena simple, es irrelevante el orden de las unidades, es decir, si las unidades 1 y 2 descritos previamente aparecen en ese orden en la cadena de aminoácidos simple o si la unidad 2 precede a la unidad uno en la cadena de aminoácidos simple no constituye una diferencia a considerar para que las dos unidades combinadas puedan reconocer la secuencia blanco.
Las meganucleasas rediseñadas adecuadas para la invención pueden comprender una secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID N°: 5 y 6 (unidades monoméricas que pueden cortar el sitio de reconocimiento como un heterodímero) o puede comprender una secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID N°: 18 (meganucleasa de cadena simple que comprende dos unidades representadas por los aminoácidos 1 a 167 y 208 a 362, respectivamente, unidas por una secuencia conectora representada por los aminoácidos 168 a 205) o puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 18 entre 1 y 167 y entre 206 y 362 (respectivamente, la unidad 1 y 2 de la meganucleasa de cadena simple sin el conector).
Convenientemente, la o las meganucleasas rediseñadas se pueden proveer por expresión de uno o más genes recombinantes de expresión en plantas que codifican dichas meganucleasas. Para tal fin, se puede ligar operativamente una región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una meganucleasa rediseñada o una unidad monomérica de una meganucleasa a un promotor de expresión en plantas y una región de ADN relacionada con la terminación de la transcripción y poliadenilación y luego introducirla en una planta o en células vegetales. El o los genes recombinantes que codifican meganucleasas rediseñadas se pueden introducir de manera transitoria o estable.
A los efectos de la invención, el término "promotor funcional en plantas" y "promotor de expresión en plantas" significa un promotor que tiene la capacidad de dirigir la transcripción en una planta, un tejido vegetal, un órgano vegetal, una parte de planta o una célula vegetal. Incluye cualquier promotor de origen vegetal, pero también cualquier promotor de origen no vegetal con capacidad para dirigir la transcripción en una célula vegetal.
Los promotores que se pueden usar en este sentido son promotores constitutivos, tal como el promotor del transcripto 35S del virus en mosaico de la coliflor (CaMV) (Hapster et al., 1988, Mol. Gen. Genet. 212: 182-190), el promotor CaMV 19S (Patente de los EE.UU. N°: 5.352.605; WO 84/02913; Benfey et al., 1989, EMBO J. 8: 2195-2202), el promotor del virus del trébol subterráneo N° 4 o N° 7 (WO 96/06932), el promotor de la subunidad pequeña de Rubisco (Patente de los EE.UU. N°: 4.962.028), el promotor de ubiquitina (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-649), promotores de genes de ADN-T, tales como los promotores de la octopina sintasa (OCS) y de la nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium, y otros promotores de genes cuya expresión constitutiva en plantas es conocida por el especialista en el arte.
Otros promotores que se pueden usar en este sentido son promotores específicos de tejidos o de órganos, preferentemente son promotores específicos de semillas, tal como el promotor de albúmina 2S (Joseffson et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 12196-12201 ), el promotor de faseolina (Patente de los EE.UU. N° 5.504.200; Bustos et al., 1989, Plant Cell 1 (9): 839-53), el promotor de legumina (Shirsat et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 215(2): 326-331), el promotor de la "proteína de semillas desconocida" (USP) (Baumlein et al., 1991 , Mol. Gen. Genet. 225(3): 459-67), el promotor de napina (Patente de los EE.UU. N° 5.608.152; Stalberg et al., 1996, Planta 199: 515-519), el promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980) y otros promotores de genes cuya expresión específica de semillas en plantas es conocida por el especialista en el arte.
Otros promotores que se pueden usar son promotores específicos de tejidos o específicos de órganos tales como los promotores específicos de primordios de órganos (An et al., 1996, Plant Cell 8: 15-30), los promotores específicos de tallos (Keller et al., 1988, EMBO J. 7(12): 3625-3633), los promotores específicos de hojas (Hudspeth et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 579-589), los promotores específicos de mesófilo (tales como los promotores de Rubisco inducibles por luz), los promotores específicos de raíces (Keller et al., 1989, Genes Dev., 3: 1639-1646), los promotores específicos de tubérculos (Keil et al., 1989, EMBO J. 8(5): 1323-1330), los promotores específicos de tejidos vasculares (Peleman et al., 1989, Gene 84: 359-369), los promotores selectivos de estambres (WO 89/10396, WO 92/13956), los promotores específicos de la zona de dehiscencia (WO 97/13865) y semejantes.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las meganucleasas rediseñadas adecuadas para la invención pueden comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 4 desde la posición de nucleótido 2004 hasta la posición de nucleótido 2525 o 2522 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 4 desde la posición de nucleótido 4885 hasta la posición de nucleótido 5405 o 5403. Para facilitar la clonación y otras técnicas de ADN recombinante, puede ser ventajoso incluir un intrón funcional en plantas en la región que codifica una meganucleasa, particularmente una meganucleasa de cadena simple. Dicho intrón puede comprender, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 17 entre las posiciones de nt 1606 y 1794.
La región de ADN que codifica la meganucleasa rediseñada se puede optimizar para su expresión en plantas adaptando el contenido de GC, la utilización de codones, la eliminación de secuencias de nucleótidos indeseadas. La región de codificación se pueden optimizar aún más para su expresión en plantas y la región de codificación sintética puede tener una secuencia de nucleótidos diseñada para cumplir con los siguientes criterios: a) la secuencia de nucleótidos codifica una endonucleasa homing rediseñada funcional descrita en la presente; b) la secuencia de nucleótidos tiene un contenido de GC de entre aproximadamente un 50% y aproximadamente un 60%; c) la secuencia de nucleótidos no comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA y CATAAA; d) el nucleótido no comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de CCAAT, ATTGG, GCAAT y ATTGC; e) la secuencia de nucleótidos no comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de ATTTA, AAGGT, AGGTA, GGTA o GCAGG; f) la secuencia de nucleótidos no comprende una extensión de GC que consiste de 7 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de G o C; g) la secuencia de nucleótidos no comprende una extensión de AT que consiste de 5 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de A o T; h) la secuencia de nucleótidos no comprende codones que codifican Leu, Me, Val, Ser, Pro, Thr, Ala que comprenden dupletes de TA o CG en las posiciones 2 y 3 (es decir, la secuencia de nucleótidos no comprenden los codones TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG y GCG).
Un ejemplo de dicha secuencia optimizada está representada por la SEQ ID N°: 17 entre las posiciones de nt 1267 y 1605 y entre las posiciones de nt 1795 y 2541 (en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el conector presente entre las dos unidades de meganucleasas está representada por los nt 1957 a 2070).
También resultará claro que los términos usados para describir el método, tal como "introducción de un fragmento de ADN" así como "regeneración de una planta a partir de la célula" no implican que dicho fragmento de ADN necesariamente deba introducirse mediante técnicas de transformación. Aún más, resultará claro inmediatamente para el especialista en el arte que la molécula de ADN de interés también puede introducirse mediante técnicas de cría o cruzamiento de una planta a otra.
Sin embargo, resultará claro que la molécula de ADN de interés puede introducirse en las células vegetales mediante cualquier método conocido en el arte, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, pero también mediante métodos de transferencia directa de ADN. La molécula de ADN transformante se puede transferir a las células vegetales usando cualquier método convencional, incluyendo, pero en un sentido no limitativo, un método de transferencia directa de ADN. Según se usa en la presente, "transferencia directa de ADN" es cualquier método de introducción de ADN en células vegetales que no comprende el uso de Agrobacterium spp. natural y que tiene la capacidad de introducir ADN en las células vegetales. Esto incluye métodos bien conocidos en el arte, tales como la introducción de ADN por electroporacion en protoplastos, la introducción de ADN por electroporacion en células vegetales intactas o en tejidos parcialmente degradadas o en células vegetales, la introducción de ADN por la acción de agentes tales como PEG y semejantes, en protoplastos, el use de fibras de siliconas y el bombardeo con microproyectiles recubiertas con ADN.
La capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en un sitio preseleccionado da lugar a diversas aplicaciones potenciales. El ADN extraño de interés se puede introducir en el sitio preseleccionado ya sea por recombinación homologa o en el proceso de unión de extremos no homólogos. La ruptura de cadena doble también se puede usar para inducir la formación de pequeñas supresiones o inserciones en el sitio preseleccionado, ¡nactivando así potencialmente al gen quimérico que comprende la secuencia de nucleótidos del sitio preseleccionado. La ruptura de cadena doble en el sitio preseleccionado también facilitará el reemplazo de una región de ADN en la cercanía de dicho sitio para una región de ADN de interés, por ejemplo como se describe en WO 06/105946, WO08/037436 o en WO08/1 8559.
Para insertar el ADN extraño por recombinación homologa en el sitio preseleccionado, el ADN extraño puede estar comprendido dentro de un ADN de reparación, en donde el ADN extraño está flanqueado por al menos una región de ADN flanqueadora cuya secuencia de nucleótidos es similar a la secuencia de nucleótidos de la región de ADN 5' o 3' con respecto al sitio preseleccionado. El ADN de reparación puede comprender al ADN extraño a insertar flanqueado por dos regiones de ADN flanqueadoras, 5' y 3' con respecto al ADN extraño y que son similares a la secuencia de nucleótidos de la región de ADN 5' o 3' con respecto a los sitios preseleccionados. Como alternativa, el ADN extraño se puede integrar como tal, es decir sin secuencias flanqueadoras con homología con la región que rodea al sitio blanco predefinido (sin ningún ADN adicional), para su integración por unión de extremos no homólogos.
Según se usa en la presente, "una región de ADN flanqueadora" es un ADN con una secuencia de nucleótidos que presenta homología con las regiones de ADN, respectivamente 5' o 3' con respecto a la secuencia de ADN blanco o al sitio preseleccionado. Esto permite un mejor control de la inserción del ADN extraño o de la molécula de ADN de interés. Aún más, la integración por recombinación homologa permitirá una unión precisa del fragmento de ADN extraño al genoma nuclear de la planta hasta el nivel de nucleótidos.
Las regiones de ADN flanqueadoras pueden variar en longitud, y deberían ser de al menos 10 nucleótidos de longitud aproximadamente. Sin embargo, la región flanqueadora puede ser tan largo como prácticamente sea posible (p.ej., hasta aproximadamente 100-150 kb, tal como de los cromosomas artificiales bacterianos completos (BAC)). Preferentemente, la región flanqueadora será de entre aproximadamente 50 bp y aproximadamente 2000 bp. Aún más, no es necesario que las regiones que flanquean al ADN extraño de interés sean idénticas a las regiones de ADN que flanquean al sitio preseleccionado y puede tener entre aproximadamente 80% y aproximadamente 100% de identidad de secuencia, preferentemente entre aproximadamente 95% y aproximadamente 100% de identidad de secuencia con las regiones de ADN que flanquean al sitio preseleccionado. Cuanto más larga es la región flanqueadora, menos severo es el requisito de homología. Aún más, se prefiere que la identidad de secuencia sea tan grande como sea prácticamente posible en la cercanía de la ubicación de inserción exacta del ADN extraño. Aún más, para poder intercambiar la secuencia de ADN blanco sin cambiar la secuencia de ADN de las secuencias de ADN adyacentes, las secuencias de ADN flanqueadoras preferentemente deberían ser idénticas a las regiones de ADN que flanquean el sitio preseleccionado.
Aún más, no es necesario que las regiones que flanquean al ADN extraño de interés presenten homología con las regiones inmediatamente flanqueadoras del sitio preseleccionado, sino que pueden presentar homología con una región de ADN del genoma nuclear más alejado de dicho sitio preseleccionado. La inserción del ADN extraño dará como resultado entonces la eliminación del ADN blanco entre el sitio de inserción preseleccionado y la región de ADN de homología. En otras palabras, el ADN blanco ubicado entre las regiones de homología será sustituido por el ADN extraño de interés. Entonces, al elegir la configuración apropiada del ADN extraño para reparar la ruptura de ADN de cadena doble, al introducir una molécula de ADN extraño de acuerdo con los métodos de la invención, además de las inserciones, también se pueden efectuar reemplazos dirigidos o supresiones dirigidas de la región genómica ubicada entre las regiones de homología.
El ADN extraño a insertar también puede comprender un marcador seleccionable o rastreable, que puede eliminarse, o no, después de la inserción.
Los "marcadores seleccionares o rastreables", según se usa en la presente, tienen el significado habitual conocido en el arte e incluyen, pero en un sentido no limitativo, una fosfinotricinacetiltransferasa, una neomicina fosfotransferasa, una glifosato oxidasa, una enzima EPSP tolerante a glifosato, un gen de nitrilasa, un gen mutante de una acetolactato sintasa o de una acetohidroxiácido sintasa, ß-glucoronidasa (GUS), genes del locus R, proteína fluorescente verde y semejantes que se puedan expresar en plantas.
La selección de la célula vegetal o planta en donde se ha introducido al marcador seleccionable o rastreable y el resto de la molécula de ADN extraño por recombinación homologa a través de las regiones de ADN flanqueadoras se puede efectuar, por ejemplo, examinando y seleccionando la ausencia de las secuencias presentes en el ADN transformante pero localizado fuera de las regiones de ADN flanqueadoras. Aún más, la presencia de las secuencias del ADN transformante fuera de las regiones de ADN flanqueadoras indicaría que el origen de las células vegetales transformadas es por inserción de ADN aleatoria. Para tal fin, se pueden incluir marcadores seleccionables o rastreables en la molécula de ADN transformante fuera de las regiones de ADN flanqueadoras, que luego se pueden usar para identificar aquellas células vegetales que no contienen a los marcadores seleccionables o rastreables localizados fuera del ADN transformante y que pueden haber surgido por recombinación homologa a través de las regiones de ADN flanqueadoras. Como alternativa, la molécula de ADN transformante puede contener marcadores seleccionables fuera de las regiones de ADN flanqueadoras que permiten la selección de la ausencia de dichos genes (genes marcadores seleccionables negativos).
Resultará claro que los métodos de acuerdo con la invención permiten la inserción de cualquier ADN de interés, incluyendo el ADN que comprende una secuencia de nucleótidos con una secuencia de nucleótidos signatura particular, por ejemplo para una subsiguiente identificación. El ADN de interés también puede ser uno o más genes de expresión en plantas incluyendo, pero en un sentido no limitativo, un gen de tolerancia a herbicidas, un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un gen de resistencia a un estrés abiótico, una enzima relacionada con la biosíntesis de aceite o la biosíntesis de carbohidratos, una enzima relacionada con la fuerza y/o la longitud de fibras, una enzima relacionada con la biosíntesis de metabolitos secundarios.
Los genes de tolerancia a herbicidas incluyen un gen que codifica la enzima 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). Los ejemplos de dichos genes EPSPS comprenden el gen AroA (CT7 mutante) de la bacteria Salmonella typhimurium (Comai et al., 1983, Science 221 , 370-371 ), el gen CP4 de la bacteria Agrobacteríum sp., (Barry et al., 1992, Curr. Topics Plant Physiol., 7, 139-145), los genes que codifican una EPSPS de Petunia (Shah et al., 1986, Science 233, 478-481 ), un EPSPS de tomate (Gasser et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 4280-4289) o un EPSPS de Eleusine (WO 01/66704). También puede ser un EPSPS mutado descrito, por ejemplo, en EP 0837944, WO 00/66746, WO 00/66747 o WO 02/26995. Las plantas tolerantes a glifosato también se pueden obtener por expresión de un gen que codifica una enzima glifosato óxido-red uctasa descrita en las Patentes de los EE.UU. N°: 5.776.760 y 5.463.175. Las plantas tolerantes a glifosato también se pueden obtener por expresión de un gen que codifica una enzima glifosato acetiltransferasa descrita, por ejemplo, en WO 02/36782, WO 03/092360, WO 05/012515 y WO 07/024782. Las plantas tolerantes a glifosato también se pueden obtener por selección de plantas que contienen mutaciones naturales de los genes mencionados previamente, como se describe, por ejemplo, en WO 01/024615 o WO 03/013226. Los genes EPSPS que confieren tolerancia a glifosato se describen, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente de los EE.UU. N°: 11/517.991 , 10/739.610, 12/139.408, 12/352.532, 1 1/312.866, 1 1/315.678, 12/421.292, 11/400.598, 11/651.752, 11/681.285, 1 1/605.824, 12/468.205, 11/760.570, 11/762.526, 1 1/769.327, 1 1/769.255, 1 1/943.801 ó 12/362.774. Otros genes que confieren tolerancia a glifosato, tales como los genes decarboxilasa, se describen, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente de los EE.UU. N°: 11/588.811 , 11/185.342, 12/364.724, 11/185.560 ó 12/423.926.
Otros genes de tolerancia a herbicidas pueden codificar una enzima detoxificante del herbicida o una enzima glutamina sintasa muíante que es resistente a la inhibición, por ejemplo como se describe en la Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 11/760.602. Una de tales enzimas detoxificantes eficientes es una enzima que codifica una fosfinotricinacetiltransferasa (tal como la proteína bar o pat de especies de Streptomyces). Las fosfinotricinacetiltransferasas se describen, por ejemplo, en las Patentes de los EE.UU. N°: 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 5.273.894; 5.637.489; 5.276.268; 5.739.082; 5.908.810 y 7.112.665.
Los genes de tolerancia a herbicidas también pueden conferir tolerancia a los herbicidas que inhiben la enzima hidroxifenilpiruvatodioxigenasa (HPPD). Las hidroxifenilpiruvatodioxigenasas son enzimas que catalizan la reacción en la que el para-hidroxifenilpiruvato (HPP) se transforma en homogentisato. Las plantas tolerantes a los inhibidores de HPPD se pueden transformar con un gen que codifica una enzima HPPD resistente natural o con un gen que codifica una enzima HPPD mutada o quimérica descrito en WO 96/38567, WO 99/24585 y WO 99/24586, WO 2009/144079, WO 2002/046387 o US 6.768.044. La tolerancia a los inhibidores de HPPD también se pueden obtener por transformación de plantas con genes que codifican determinadas enzimas permitiendo la formación de homogentisato a pesar de la inhibición de la enzima HPPD nativa por el inhibidor de HPPD. Dichas plantas y genes se describen en WO 99/34008 y WO 02/36787. La tolerancia de la plantas a los inhibidores de HPPD también se puede mejorar por transformación de las plantas con un gen que codifica una enzima que tiene actividad prefenato deshidrogenasa (PDH) además de un gen que codifica una enzima tolerante a HPPD, descrita en WO 2004/024928. Además, las plantas se pueden hacer más tolerantes a los herbicidas inhibidores de HPPD por adición en su genoma de un gen que codifica una enzima capaz de metabolizar o degradar los inhibidores de HPPD, tales como las enzimas CYP450 que se muestran en WO 2007/103567 y WO 2008/150473.
Aún otros genes de tolerancia a herbicidas que codifican variantes de enzimas ALS (también conocida como acetohidroxiácido sintasa, AHAS) se describen por ejemplo en Tranel y Wright (2002, Weed Science 50: 700-712), pero también en las Patentes de los EE.UU. N°: 5.605.01 1 , 5.378.824, 5.141.870 y 5.013.659. La producción de plantas tolerantes a sulfonilurea y plantas tolerantes a imidazolinona se describe en las Patentes de los EE.UU. N°: 5.605.011 ; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361 ; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937; y 5.378.824; y en la Publicación Internacional WO 96/33270. Otros genes de tolerancia a imidazolinona también se describen, por ejemplo, en WO 2004/040012, WO 2004/106529, WO 2005/020673, WO 2005/093093, WO 2006/007373, WO 2006/015376, WO 2006/024351 y WO 2006/060634. Además, se describen genes de tolerancia a sulfonilurea e imidazolinona, por ejemplo, en WO 07/024782 y en la Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 61/288958.
Un gen de resistencia a insectos puede comprender una secuencia de codificación que codifica: 1) una proteína cristalina insecticida de Bacillus thuringiensis o una porción insecticida de la misma, tales como las proteínas cristalinas insecticidas enumeradas por Crickmore et al., (1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 807-813), actualizado por Crickmore et al., (2005) en la nomenclatura de toxinas de Bacillus thuringiensis, en línea en http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil__Crickmore/Bt/), o porciones insecticidas de las mismas, por ejemplo, las proteínas de las clases de proteínas Cry, CryIAb, CryIAc, CryI B, CryI C, CryI D, CryI F, Cry2Ab, Cry3Aa o Cry3Bb o porciones insecticidas de las mismas (por ejemplo, en EP 1999141 y WO 2007/107302), o dichas proteínas codificadas por genes sintéticos como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de los EE.UU. ? 2/249.016 ; ? 2) una proteína cristalina de Bacillus thuringiensis o una porción de la misma que es insecticida en la presencia de una segunda proteína cristalina adicional de Bacillus thuringiensis o una porción de la misma, tal como la toxina binaria conformada por las proteínas cristalinas Cry34 y Cry35 (Moellenbeck et al., 2001 , Nat. Biotechnol. 19: 668-72; Schnepf et al., 2006, Applied Environm. Microbio!. 71 , 1765-1774) o la toxina binaria compuesta por las proteínas CryIA o CryI F y las proteínas Cry2Aa o Cry2Ab o Cry2Ae (Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 12/214,022 y EP 08010791.5); o 3) una proteína insecticida híbrida que comprende partes de diferentes proteínas cristalinas insecticidas de Bacillus thuringiensis, tal como un híbrido de las proteínas de 1) anterior o un híbrido de las proteínas de 2) anterior, por ejemplo, la proteína Cry1A.105 producida por el evento de maíz MON89034 (WO 2007/027777); o 4) una proteína de cualquiera de 1) a 3) anteriores, en donde algunos, particularmente 1 a 10, aminoácidos han sido reemplazados por otro aminoácido para obtener una mayor actividad insecticida contra una especie de insecto blanco, y/o para ampliar el rango de especies de insectos blanco afectado, y/o debido a los cambios introducidos en el ADN codificante durante la clonación o transformación, tal como la proteína Cry3Bb1 en los eventos de maíz MON863 o MON88017, o la proteína Cry3A en el evento de maíz MIR604; o 5) una proteína secretada insecticida de Bacillus thuringiensis o de Bacillus cereus, o una porción insecticida de la misma, tales como las proteínas insecticidas vegetativas (VIP) enumeradas en: http://wwwJifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, por ejemplo, las proteínas de la clase de proteínas VIP3Aa; o 6) una proteína secretada de Bacillus thuringiensis o de Bacillus cereus que es insecticida en la presencia de una segunda proteína secretada de Bacillus thuringiensis o de B. cereus, tal como la toxina binara constituida por las proteínas VIP1A y VIP2A (WO 94/21795); o 7) una proteína insecticida híbrida que comprende partes de diferentes proteínas secretadas de Bacillus thuringiensis o de Bacillus cereus, tal como un híbrido de las proteínas en 1) anterior o un híbrido de las proteínas en 2) anterior; o 8) una proteína de cualquiera de 5) a 7) anteriores en donde algunos, particularmente 1 a 10, aminoácidos han sido reemplazados por otro aminoácido para obtener una mayor actividad insecticida contra una especie de insecto blanco y/o para ampliar el rango de especies de insectos blanco afectas y/o debido a los cambios introducidos en el ADN codificante durante la clonación o transformación (en tanto aún codifica una proteína insecticida), tal como la proteína VIP3Aa en el evento de algodón COT102; o 9) una proteína secretada de Bacillus thuringiensis o Bacillus cereus que es insecticida en la presencia de una proteína cristalina de Bacillus thuringiensis, tal como la toxina binaria conformada por VIP3 y Cry1 A o Cry1 F (Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 61/126083 y 61/195019) o la toxina binaria constituida por la proteína VIP3 y las proteínas Cry2Aa o Cry2Ab o Cry2Ae (Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 12/214,022 y EP 08010791.5); 10) una proteína de 9) anterior en donde algunos, particularmente 1 a 10, aminoácidos han sido reemplazados por otro aminoácido para obtener una mayor actividad insecticida contra una especie de insecto blanco y/o para ampliar el rango de especies de insectos blanco afectado y/o debido a los cambios introducidos en el ADN codificante durante la clonación o transformación (en tanto aún codifica una proteína insecticida).
Un "gen resistente a insectos", según se usa en la presente, incluye además transgenes que comprenden una secuencia que produce luego de su expresión un ARN de cadena doble, que luego de su ingestión por una plaga de insectos de plantas, inhibe el crecimiento de esta plaga de insectos, como se describe, p.ej., en WO 2007/080126, WO 2006/129204, WO 2007/074405, WO 2007/080127 y WO 2007/035650.
Los genes de tolerancia al estrés abiótico incluyen: 1) un transgen capaz de reducir la expresión y/o la actividad del gen de poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) en las células vegetales o plantas como se describe en WO 00/04173, WO/2006/045633, EP 04077984.5 o EP 06009836.5. 2) un transgen capaz de reducir la expresión y/o la actividad de los genes que codifican PARG de las plantas o células vegetales, como se describe, por ejemplo, en WO 2004/090140. 3) un transgen que codifica una enzima funcional en plantas de la vía de síntesis salvaje de la nicotinamida adenina dinucleótido incluyendo nicotinamidasa, nicotinato fosforibosiltransferasa, ácido nicotínico mononucleótido adeniltransferasa, nicotinamida adeninadinucleótido sintetasa o nicotinamida fosforibosiltransferasa, como se describe, por ejemplo, en EP 04077624.7, WO 2006/133827, PCT/EP07/002433, EP 1999263 o WO 2007/107326.
Las enzimas relacionadas con la biosíntesis de carbohidratos incluyen las que se describen, p.ej., en EP 0571427, WO 95/04826, EP 0719338, WO 96/15248, WO 96/19581 , WO 96/27674, WO 97/1 1 188, WO 97/26362, WO 97/32985, WO 97/42328, WO 97/44472, WO 97/45545, WO 98/27212, WO 98/40503, WO99/58688, WO 99/58690, WO 99/58654, WO 00/08184, WO 00/08185, WO 00/08175, WO 00/28052, WO 00/77229, WO 01/12782, WO 01/12826, WO 02/101059, WO 03/071860, WO 2004/056999, WO 2005/030942, WO 2005/030941 , WO 2005/095632, WO 2005/095617, WO 2005/095619, WO 2005/095618, WO 2005/123927, WO 2006/018319, WO 2006/103107, WO 2006/108702, WO 2007/009823, WO 00/22140, WO 2006/063862, WO 2006/072603, WO 02/034923, EP 06090134.5, EP 06090228.5, EP 06090227.7, EP 07090007.1 , EP 07090009.7, WO 01/14569, WO 02/79410, WO 03/33540, WO 2004/078983, WO 01/19975, WO 95/26407, WO 96/34968, WO 98/20145, WO 99/12950, WO 99/66050, WO 99/53072, US 6,734,341 , WO 00/11192, WO 98/22604, WO 98/32326, WO 01/98509, WO 01/98509, WO 2005/002359, US 5,824,790, US 6,013,861 , WO 94/04693, WO 94/09144, WO 94/11520, WO 95/35026 o WO 97/20936 o las enzimas relacionadas con la producción de polifructosa, en especial del tipo inulina y levano, como se divulga en EP 0663956, WO 96/01904, WO 96/21023, WO 98/39460 y WO 99/24593, la producción de alfa-1 ,4-glucanos como se divulga en WO 95/31553, US 2002031826, US 6.284.479, US 5.712.107, WO 97/47806, WO 97/47807, WO 97/47808 y WO 00/14249, la producción de alfa-1 ,4-glucanos con ramificaciones alfa-1 ,6, como se divulga en WO 00/73422, la producción de alternano, como se divulga, p. ej., en WO 00/47727, WO 00/73422, EP 06077301.7, US 5.908.975 y EP 0728213, la producción de hialuronano, como se divulga, p.ej., en WO 2006/032538, WO 2007/039314, WO 2007/039315, WO 2007/039316, JP 2006304779 y WO 2005/012529.
La invención también provee un método para introducir una supresión en un sitio predefinido o preseleccionado en un genoma (nuclear) de una célula vegetal trangénica que comprende los pasos de a. inducir una ruptura de ADN de cadena doble en el sitio predefinido; y b. seleccionar una célula vegetal que tiene una supresión en dicho sitio predefinido; en donde el sitio predefinido es una secuencia de nucleótidos diferente de un sitio de reconocimiento para una meganucleasa natural y es una secuencia de nucleótidos introducida comúnmente como parte de un transgen en una planta trangénica y en donde la ruptura de ADN de cadena doble es inducida por introducción de una meganucleasa de cadena simple no natural o un par de unidades monoméricas de meganucleasas no naturales que reconoce o reconocen conjuntamente el sitio predefinido e induce o inducen la ruptura de cadena doble.
Una forma de realización de la invención también comprende proveer genes quiméricos que codifican meganucleasas rediseñadas descritas en la presente, en donde el gen quimérico comprende un promotor de expresión en plantas ligado operativamente a una región de ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de l-Crel como un andamiaje que comprende una S en la posición 32; Y en la posición 33; E en la posición 38; R en la posición 40; K en la posición 66; Q en la posición 80; T en la posición 42; R en la posición 77; R en la posición 68; R en la posición 70; Q en la posición 44; I en la posición 24; S en la posición 26; S en la posición 28 y R en la posición 30 o R en la posición 70; T en la posición 44; I en la posición 24; S en la posición 26; S en la posición 28; N en la posición 30; S en la posición 32; R en la posición 33; Q en la posición 38; Q en la posición 80; R en la posición 40; K en la posición 66; T en la posición 42; R en la posición 77 y R en la posición 68 (las posiciones son con respecto a la secuencia de aminoácidos de l-Crel, las correspondientes posiciones de aminoácidos en las meganucleasas rediseñadas se pueden determinar por alineación), tal como una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 5 o la SEQ ID 6 o una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 18 o una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°18 entre las posiciones 1 y 167 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°18 entre las posiciones 206 y 362.
Se podrá apreciar que los medios y métodos de la invención se pueden usar en cualquier planta incluyendo plantas de maíz, tabaco, cereales incluyendo plantas de trigo, avena, cebada, centeno, arroz, césped, sorgo, mijo o caña de azúcar. Los métodos de la invención también se pueden aplicar a cualquier planta (Angiospermae o Gymnospermae) incluyendo, pero en un sentido no limitativo, algodón, cañóla, colza oleaginosa, soja, verduras, papas, Lemna spp., Nicotiana spp., Arabidopsis, alfalfa, cebada, haba, maíz, algodón, lino, arveja, colza, arroz, centeno, alazor, sorgo, soja, girasol, tabaco, trigo, espárrago, remolacha y remolacha azucarera, brócoli, col, zanahorias, coliflor, apio, pepino, berenjena, lechuga, cebolla, colza oleaginosa, pimiento, papa, zapallo, rábano, espinaca, calabacín, tomate, zapallito, almendra, manzana, damasco, banana, mora, arándano azul, cacao, cereza, coco, arándano rojo, dátiles, uvas, pomelo, guayaba, kiwi, limón, lima, mango, melón, nectarina, naranja, papaya, fruto de la pasión, durazno, maní, pera, ananá, pistacho, ciruela, frambuesa, frutilla, mandarina, nuez y sandía.
Es también un objeto de la invención proveer células vegetales y plantas generadas de acuerdo con los métodos de la invención. El alcance de la presente invención también incluye gametas, semillas, embriones, ya sea cigóticos o somáticos, la progenie o híbridos de plantas que comprenden eventos de inserción de ADN, producidos por medio de métodos de cría tradicionales. Dichas plantas pueden contener una secuencia de ADN heterólogo o extraño insertada o en lugar de una secuencia blanco, y solamente será diferente de sus plantas progenitores por la presencia de esta secuencia de ADN heterólogo o de ADN de post intercambio.
Las plantas obtenidas mediante los métodos descritos en la presente además se pueden cruzar utilizando técnicas de cría tradicionales con otras plantas para obtener plantas de progenie que comprenden los eventos de inserción de ADN buscados que se obtuvieron de acuerdo con la presente invención.
Las plantas y semillas de acuerdo con la invención se pueden tratar además con un compuesto químico, tal como un compuesto químico seleccionado del siguiente listado: • Herbicidas para frutas/verduras: atrazina, bromadlo, diurón, glifosato, linurón, metribuzina, simazina, trifluralina, fluazifop, glufosinato, halosulfurón Gowan, paraquat, propizamida, setoxidim, butafenacilo, halosulfurón, indaziflam · Insecticidas para frutas/verduras: aldicarb, Badil us thuriengiensis, carbarilo, carbofurano, clorpirifos, cipermetrina, deltametrina, abamectina, ciflutrina/beta-ciflutrina, esfenvalerato, lambda-cihalotrina, acequinocilo, bifenazato, metoxifenozida, novalurón, cromafenozida, tiacloprid, dinotefurano, fluacripirim, espirodiclofeno, gamma-cihalotrina, espiromesifeno, espinosad, rinaxipir, ciazipir, triflumurón, espirotetramat, imidacloprid, flubendiamida, tiodicarb, metaflumizona, sulfoxaflor, ciflumetofeno, cianopirafeno, clotianidina, tiametoxam, espinotoram, tiodicarb, flonicamid, metiocarb, emamectina-benzoato, indoxacarb, fenamifos, piriproxifeno, fenbutatina-óxido • Fungicidas para frutas/verduras: ametoctradina, azoxistrobina, bentiavalicarb, boscalida, captan, carbendazim, clorotalonilo, cobre, ciazofamid, ciflufenamid, cimoxanilo, ciproconazol, ciprodinilo, difenoconazol, dimetomorf, ditianón, fenamidona, fenhexamida, fluazinam, fludioxonilo, fluopicolida, fluopiram, fluoxastrobina, fluxapiroxad, folpet, fosetilo, iprodiona, iprovalicarb, isopirazam, kresoxim-metilo, mancozeb, mandipropamid, metalaxil/mefenoxam, metiram, metrafenona, miclobutanilo, penconazol, pentiopirad, picoxistrobina, propamocarb, propiconazol, propineb, proquinazid, protioconazol, piraclostrobina, pirimetanilo, quinoxifeno, espiroxamina, azufre, tebuconazol, tiofanato-metilo, trifloxistrobin • Herbicidas para cereales: 2.4-D, amidosulfurón, bromoxinilo, carfentrazona-e, clorotolurón, clorsulfurón, clodinafop-p, clopiralid, dicamba, diclofop-m, diflufenicán, fenoxaprop, florasulam, flucarbazona-Na, flufenacet, flupirsulfurón-M, fluroxipir, flurtamona, glifosato, iodosulfurón, ioxinilo, isoproturón, MCPA, mesosulfurón, metsulfurón, pendimetalina, pinoxadeno, propoxicarbazona, prosulfocarb, piroxsulam, sulfosulfurón, tifensulfurón, tralkoxidim, triasulfurón, tribenurón, trifluralina, tritosulfurón · Fungicidas para cereales: azoxistrobina, bixafeno, boscalida, carbendazim, clorotalonilo, ciflufenamida, ciproconazol, ciprodinilo, dimoxistrobina, epoxiconazol, fenpropidina, fenpropimorf, fluopiram, fluoxastrobina, fluquinconazol, fluxapiroxad, isopirazam, kresoxim-metilo, metconazol, metrafenona, pentiopirad, picoxistrobina, procloraz, propiconazol, proquinazid, protioconazol, piraclostrobina, quinoxifeno, espiroxamina, tebuconazol, tiofanato-metilo, trifloxistrobina • Insecticidas para cereales: dimetoato, lambda-cihaltrina, deltametrina, alfa-cipermetrina, ß-ciflutrina, bifentrina, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, clorpirifos, pirimicarb, metiocarb, sulfoxaflor • Herbicidas para maíz: atrazina, alaclor, bromoxinilo, acetoclor, dicamba, clopiralid, (s-)dimetenamida, glufosinato, glifosato, isoxaflutol, (s-)metolaclor, mesotriona, nicosulfurón, primisulfurón, rimsulfurón, sulcothona, foramsulfurón, topramezona, tembotriona, saflufenacilo, tiencarbazona, flufenacet, piroxasulfón • Insecticidas para maíz: carbofurano, clorpirifos, bifentrina, fipronilo, imidacloprid, lambda-cihalotrina, teflutrina, terbufos, tiametoxam, clotianidina, espiromesifeno, flubendiamida, triflumurón, rinaxipir, deltametrina, tiodicarb, ß-ciflutrina, cipermetrina, bifentrina, lufenurón, tebupirimfos, etiprol, ciazipir, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, avermectina • Fungicidas para maíz: azoxistrobina, bixafeno, boscalida, ciproconazol, dimoxistrobina, epoxiconazol, fenitropán, fluopiram, fluoxastrobina, fluxapiroxad, isopirazam, metconazol, pentiopirad, picoxistrobina, propiconazol, protioconazol, piraclostrobina, tebuconazol, trifloxistrobina • Herbicidas para arroz: butaclor, propanilo, azimsulfurón, bensulfurón, cihalofop, daimurón, fentrazamida, imazosulfurón, mefenacet, oxaziclomefona, pirazosulfurón, piributicarb, quinclorac, tiobencarb, indanofán, flufenacet, fentrazamida, halosulfurón, oxaziclomefona, benzobiciclón, piriftalida, penoxsulam, bispiribac, oxadiargilo, etoxisulfurón, pretilaclor, mesotriona, tefuriltriona, oxadiazona, fenoxaprop, pirimisulfán • Insecticidas para arroz: diazinón, fenobucarb, benfuracarb, buprofezina, dinotefurano, fipronilo, imidacloprid, isoprocarb, tiacloprid, cromafenozida, clotianidina, etiprol, flubendiamida, rinaxipir, deltametrina, acetamiprid, tiametoxam, ciazipir, espinosad, espinotoram, emamectina-benzoato, cipermetrina, clorpirifos, etofenprox, carbofurano, benfuracarb, sulfoxaflor • Fungicidas para arroz: azoxistrobina, carbendazim, carpropamida, diclocimet, difenoconazol, edifenfos, ferimzona, gentamicina, hexaconazol, himexazol, iprobenfos (IBP), isoprotiolano, isotianilo, kasugamicina, mancozeb, metominostrobina, orisastrobina, pencicurón, probenazol, propiconazol, propineb, piroquilón, tebuconazol, tiofanato-metilo, tiadinilo, triciclazol, trifloxistrobina, validamicina • Herbicidas para algodón: diurón, fluometurón, MSMA, oxifluorfeno, prometrina, trifluralina, carfentrazona, cletodim, fluazifop-butilo, glifosato, norflurazón, pendimetalina, piritiobac-sodio, trifloxisulfurón, tepraloxidim, glufosinato, flumioxazina, tidiazurón • Insecticidas para algodón: acefato, aldicarb, clorpirifos, cipermetrina, deltametrina, abamectina, acetamiprid, benzoato de emamectina, imidacloprid, indoxacarb, lambda-cihalotrina, espinosad, tiodicarb, gamma-cihalotrina, espiromesifeno, piridalilo, flonicamid flubendiamida, triflumurón, rinaxipir, beta-ciflutrina, espirotetramat • clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, dinetofurano, flubendiamida, ciazipir, espinosad, espinotoram, gamma-cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, tiodicarb, avermectina, flonicamid, piridalilo, espiromesifeno, sulfoxaflor • Fungicidas para algodón: azoxistrobina, bixafeno, boscalida, carbendazim, clorotalonilo, cobre, ciproconazol, difenoconazol, dimoxistrobina, epoxiconazol, fenamidona, fluazinam, fluopiram, fluoxastrobina, fluxapiroxad, iprodiona, isopirazam, isotianilo, mancozeb, maneb, metominostrobina, pentiopirad, picoxistrobina, propineb, protioconazol, piraclostrobina, quintozeno, tebuconazol, tetraconazol, tiofanato-metilo, trifloxistrobina · Herbicidas para soja: alaclor, bentazona, trifluralina, clorimurón-etilo, cloransulam-metilo, fenoxaprop, fomesafeno, fluazifop, glifosato, imazamox, imazaquina, imazetapir, (s-)metolaclor, metribuzina, pendimetalina, tepraloxidim, glufosinato.
• Insecticidas para soja: lambda-cihalotrina, metomilo, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dimetofurano, flubendiamida, rinaxipir, ciazipir, espinosad, espinotoram, emamectina-benzoato, fipronilo, etiprol, deltametrina, ß-ciflutrina, gamma y lambda cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5h)-ona, espirotetramat, espinodiclofeno, triflumurón, flonicamida, tiodicarb, beta-ciflutrina • Fungicidas para soja: azoxistrobina, bixafeno, boscalid, carbendazim, clorotalonilo, cobre, ciproconazol, difenoconazol, dimoxistrobina, epoxiconazol, fluazinam, fluopiram, fluoxastrobina, flutriafol, fluxapiroxad, isopirazam, iprodiona, isotianilo, mancozeb, maneb, metconazol, metominostrobina, miclobutanilo, pentiopirad, picoxistrobina, propiconazol, propineb, protioconazol, piraclostrobina, te-buconazol, tetraconazol, tiofanato-metilo, trifloxistrobina · Herbicidas para remolacha azucarera: cloridazón, desmedifam, etofumesato, fenmedifam, triallato, clopiralida, fluazifop, lenacilo, metamitrón, quinmerac, cicloxidim, triflusulfurón, tepraloxidim, quizalofop • Insecticidas para remolacha azucarera: imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, deltametrina, (¡>-ciflutrina, gamma/lambda cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, teflutrina, rinaxipir, ciaxipir, fipronilo, carbofurano • Herbicidas para cañóla: clopiralida, diclofop, fluazifop, glufosinato, glifosato, metazaclor, trifluralina etametsulfurón, quinmerac, quizalofop, cletodim, tepraloxidim • Fungicidas para cañóla: azoxistrobina, bixafeno, boscalida, carbendazim, ciproconazol, difenoconazol, dimoxistrobina, epoxiconazol, fluazinam, fluopiram, fluoxastrobina, flusilazol, fluxapiroxad, ¡prodiona, isopirazam, mepiquat-cloruro, metconazol, metominostrobina, paclobutrazol, pentiopirad., picoxistrobina, procloraz, protioconazol, piraclostrobina, tebuconazol, tiofanato-metilo, trifloxistrobina, vinclozolina • Insecticidas para cañóla: carbofurano, tiacloprid, deltametrina, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, acetamiprid, dinetofurano, ß-ciflutrina, gamma y lambda cihalotrina, tau-fluvaleriato, etiprol, espinosad, espinotoram, flubendiamida, rinaxipir, ciazipir, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.
Según se utiliza en la presente, "que comprende" debe interpretarse como un término que especifica la presencia de las características establecidas, los enteros, los pasos o los componentes mencionados, pero que no excluye la presencia o la adición de una o más características, números enteros, pasos o componentes, o grupos de los mismos. Así, por ejemplo, un ácido nucleico o una proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los citados de hecho, es decir, puede estar embebido en un ácido nucleico o una proteína más grande. Un gen quimérico que comprende una región de ADN, definida desde el punto de vista funcional o estructural, puede comprender regiones de ADN adicionales, etc.. Según se utiliza en la presente, el término "parte de planta" incluye cualquier órgano o tejido vegetal, incluyendo, pero en un sentido no limitativo, frutos, semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callos, hojas, raíces, brotes, flores, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas.
A los efectos de esta invención, la "identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos relacionados, expresada como un porcentaje, hace referencia a la cantidad de posiciones en las dos secuencias alineadas de forma óptima que tienen residuos idénticos (x100), dividida por la cantidad de posiciones comparadas. Una falta de coincidencia o hueco, es decir, una posición en la alineación en la que hay un residuo en una secuencia, pero no en la otra, se considera como una posición con residuos no idénticos. La alineación de las dos secuencias se efectúa con el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch 1970). La anterior alineación de secuencias asistida por computadora, se puede efectuar convenientemente usando un programa de software estándar tal como GAP que forma parte de Wisconsin Package Versión 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EE.UU.) usando la matriz de calificación predeterminada con una penalidad por creación de falta de coincidencia de 50 y una penalidad por extensión de falta de coincidencia de 3.
Resultará claro que siempre que las secuencias de nucleótidos de moléculas de ARN se definan con referencia a una secuencia de nucleótidos de las correspondientes moléculas de ADN, la timina (T) en la secuencia de nucleótidos deberá reemplazarse por uracilo (U). La referencia a moléculas de ARN o ADN resultará evidente a partir del contexto de la aplicación.
Los siguientes ejemplos no limitantes describen el uso de una meganucleasa rediseñada para modificar plantas en el sitio de una región de codificación de bar que ya está presente en el genoma vegetal.
A menos que se indique lo contrario en los ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos estándar que se describen en Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al., (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE.UU.. Los materiales y métodos estándar utilizados para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicada conjuntamente por BIOS Scientific Publicaciones Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Otras referencias acerca de técnicas estándar de biología molecular incluyen Sambrook y Russell (2001 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda edición, Academic Press (RU). Los materiales y métodos estándar utilizados para las reacciones en cadena de la polimerasa se pueden consultar en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson at al., (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primera Edición, Springer Verlag, Alemania.
Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones mencionadas aquí se incorporan por completo en la presente a modo de referencia para todo fin.
En la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias: SEQ ID N°: 1: secuencia de nucleótidos del sitio de reconocimiento de las meganucleasas rediseñadas BAY 39/BAY40 SEQ ID N°: 2: secuencia de nucleótidos del complemento del sitio de reconocimiento de las meganucleasas rediseñadas BAY 39/BAY40 SEQ ID N°: 3: secuencia de nucleótidos de la región de codificación del gen bar SEQ ID N°: 4: secuencia de nucleótidos del vector pCV177 que expresa un par de meganucleasas heterodiméricas BAY 39 y BAY40 SEQ ID N°: 5: secuencia de aminoácidos de la unidad monomérica 2 de la meganucleasa BAY39/40 ("40") SEQ ID N°: 6: secuencia de aminoácidos de la unidad monomérica 1 de la meganucleasa BAY39/40 ("39") SEQ ID N°: 7: secuencia de nucleótidos del amplicón de PCR de la región de codificación de bar alrededor del sitio de reconocimiento BAY39/40 (control) SEQ ID N°: 8: secuencia de nucleótidos del amplicón de PCR de la región de codificación de bar alrededor del sitio de reconocimiento BAY39/40 (línea tolerante a PPT) SEQ ID N°: 9: secuencia de nucleótidos del amplicón de PCR de la región de codificación de bar alrededor del sitio de reconocimiento BAY39/40 (línea sensible a PPT) SEQ ID N°: 10: secuencia de nucleótidos del amplicón de PCR de la región de codificación de bar alrededor del sitio de reconocimiento BAY39/40 (línea sensible a PPT 2) SEQ ID N°: 11 : secuencia de nucleótidos del amplicón de PCR de la región de codificación de bar alrededor del sitio de reconocimiento BAY39/40 (línea sensible a PPT 3) SEQ ID N°: 12: secuencia de nucleótidos del amplicón de PCR de la región de codificación de bar alrededor del sitio de reconocimiento BAY39/40 (línea sensible a PPT 4) SEQ ID N°: 13: secuencia de nucleótidos del amplicón de PCR de la región de codificación de bar alrededor del sitio de reconocimiento BAY39/40 (línea sensible a PPT 5) SEQ ID N°: 14: secuencia de nucleótidos del amplicón de PCR de la región de codificación de bar alrededor del sitio de reconocimiento BAY39/40 (línea sensible a PPT 6) SEQ ID N°: 15: secuencia de nucleótidos del amplicón de PCR de la región de codificación de bar alrededor del sitio de reconocimiento BAY39/40 (línea sensible a PPT 7) SEQ ID N°: 16: secuencia de aminoácidos de una variante natural de l-Crel (monómero) SEQ ID N°: 17: secuencia de nucleótidos del vector pCV170 que expresa una meganucleasa BAY39/BAY40 de cadena simple SEQ ID N°: 18: secuencia de aminoácidos de la meganucleasa BAY39/40 de cadena simple EJEMPLOS Todas las meganucleasas rediseñadas que se describen en la presente fueron diseñadas por Precisión BioSciences Inc., 104 T.W. Alexander Drive, Research Triangle Park, NC27713.
EJEMPLO 1 Descripción de los vectores de ADN-T que codifican las meganucleasas rediseñadas de acuerdo con la invención.
Se construyó un gen quimérico que codifica un par de monómeros de meganucleasas rediseñadas que como un heterodimero reconoce la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 1 ó 2 (hd BAY39/40), usando técnicas convencionales de ADN recombinante, que comprende, los siguientes fragmentos de ADN ligados operativamente: • una región de ADN que codifica el promotor 35S de CaMV (SEQ ID N°: 6 desde la posición de nt 1516 hasta la posición de nt 1933, tal como la SEQ ID N°: 4 desde la posición de nt 1516 hasta la posición de nt 1997) · una región de ADN que comprende la región que codifica la unidad monomérica 2 de BAY 39/40, ligada operativamente a una NLS SV40 en el extremo N-terminal (SEQ ID N°: 4 entre las posiciones de nt 2004 y 2525, incluyendo el codón de terminación, o hasta 2522 excluyendo el codón de terminación) • una región de ADN relacionada con la terminación de la transcripción y poliadenilación 3' del gen de la nopalina sintasa gene (SEQ ID N°: 4 entre las posiciones de nt 2530 y 2783) · una región de ADN que codifica el promotor 35S de CaMV (SEQ ID N°: 4 desde la posición de nt 4397 hasta la posición de nt 4814, tal como la SEQ ID N°: 4 desde la posición de nt 4397 hasta la posición de nt 4878) • una región de ADN que comprende la unidad monomérica 1 de BAY 39/40, ligada operativamente a una NLS SV40 en el extremo N-terminal (SEQ ID N°: 4 entre las posiciones de nt 4885 y 5405, incluyendo el codón de terminación, o hasta 5403, excluyendo el codón de terminación) • una región de ADN relacionada con la terminación de la transcripción y poliadenilación 3' del gen de la nopalina sintasa (SEQ ID N°: 4 entre las posiciones de nt 5411 y 5664) La secuencia de nucleótidos del plásmido resultante se muestra en la SEQ ID N°: 4.
Se construyó un gen quimérico que codifica una meganucleasa rediseñada de cadena simple que reconoce la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 1 ó 2 (se BAY39/40), usando técnicas convencionales de ADN recombinante, que comprende los siguientes fragmentos de ADN ligados operativamente: • una región de ADN que codifica el promotor 35S de CaMV (SEQ ID N°: 17 desde la posición de nt 691 hasta la posición de nt 1223) • la secuencia directriz del gen rbcS ATS1A de Arabidopsis thaliana; SEQ ID N°: 17 desde la posición de nt 1224 hasta la posición de nt 1266; Krebbers et al., 1988 Plant Molecular Biology 1 1 : 745-759) · una región de ADN que codifica la región N-terminal de la meganucleasa BAY 39/40 de cadena simple, ligada operativamente a una NLS SV40 en el extremo N-terminal, optimizada para su expresión en tabaco (SEQ ID N°: 17 entre las posiciones de nt 1267 y 1605) • una región de ADN que codifica al segundo intrón del gen ST-LS1 específico de tejidos inducible por luz de papa (SEQ ID N°: 17 entre las posiciones de nt 1606 y 1794; X04753; Eckes et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 205, 14-22) • una región de ADN que codifica la región C-terminal de la meganucleasa BAY 39/40 de cadena simple (SEQ ID N°: 17 entre las posiciones de nt 1795 y 1798, incluyendo el codón de terminación, o hasta 2541 , excluyendo el codón de terminación), incluyendo la región de ADN que codifica una secuencia conectora (SEQ ID N°: 17 entre las posiciones de nt 1757 y 2070), optimizada para su expresión en tabaco. • una región de ADN relacionada con la terminación de la transcripción y poliadenilación 3' del gen 35S (SEQ ID N°: 17 entre las posiciones de nt 2545 y 2678) La secuencia de nucleótidos del plásmido resultante se muestra en la SEQ ID N°: 17.
EJEMPLO 2 Descripción de la línea de tabaco blanco y del ensayo Con el fin de desarrollar un ensayo para inducir la ruptura de ADN de cadena doble, se seleccionó una línea de plantas transgénicas de tabaco tolerante a fosfinotricina (PPT) que contenía una región de codificación de bar bajo el control de un promotor de expresión en plantas.
Esta línea transgénica se usó como material de partida en una transformación en donde los genes quiméricos que codifican las meganucleasas hd BAY39/40 se introducían de manera estable o transitoria conjuntamente con un gen quimérico de expresión en plantas que comprende una higromicinafosfotransferasa que confiere resistencia a higromicina.
Después de inducir la ruptura de ADN de cadena doble en el sitio de reconocimiento en la región de codificación de bar por medio de expresión de los genes quiméricos de expresión en plantas que codifica al heterodímero BAY39/40, la ruptura se puede reparar por unión de extremos no homólogos en la ausencia de ADN de reparación, dando como resultado la supresión o inserción de uno o más pares de bases, interrumpiendo de esta manera la región de codificación de bar, lo que resulta en sensibilidad a fosfinotricina.
Se seleccionaron diversas líneas de plantas que exhiben sensibilidad a fosfinotricina y resistencia a higromicina. Se amplificó un fragmento de ADN a partir de estas líneas de plantas por medio de PCR usando cebadores ubicados a cada lado del sitio de reconocimiento (SEQ ID N°: 1 ó 2) en la región de codificación de bar, y se determinó la secuencia de nucleótidos de los amplicones. En la Figura 5 se muestra la alineación de las diferentes secuencias de nucleótidos.
Resulta claro que en las líneas de plantas sensibles a PPT (3 a 9), se había alterado el sitio de reconocimiento de BAY39/40 por supresión (3 a 8) o inserción (9), en tanto no se observó ninguna alteración en las líneas de plantas resistentes a PPT (2).
Se puede concluir entonces a partir de estos experimentos que hdBAY39/40 presenta actividad de corte en el sitio preseleccionado.
EJEMPLO 3 Inserción dirigida por unión de extremos no homólogos La co-distribución del pCV177, que comprende a los genes quiméricos que codifican meganucleasas hd BAY39/40, o del pCV 70, que comprende al gen quimérico que codifica la se BAY39/40, conjuntamente con ADN de reparación que comprende un marcador seleccionable, tal como un gen quimérico de expresión en plantas, que comprende una región de codificación 2mepsp (sin homología adicional con la región blanco) en células vegetales que contiene un gen bar quimérico de expresión en plantas integrado en su genoma y la selección de plantas sensibles a fosfinotricina pero tolerante al compuesto de selección, tal como glifosato, permite identificar células vegetales en donde las secuencias de ADN de reparación están integradas en la región de codificación de bar.
EJEMPLO 4 Inserción dirigida por unión de extremos homólogos La co-distribución del pCV177, que comprende los genes quiméricos que codifican meganucleasas hd BAY39/40, o del pCV170, que comprende al gen quimérico que codifica la se BAY39/40, con ADN de reparación que comprende un marcador seleccionable, tal como un gen quimérico de expresión en plantas que comprende una región de codificación de 2mepsp flanqueada en posición 5' por secuencias flanqueadoras que comprenden una secuencia de nucleótidos que presenta similitud de secuencia con la región de codificación de bar de la SEQ ID N°: 3 entre el nucleótido 1 y el nucleótido 132, y flanqueada en posición 3' por secuencias flanqueadoras que comprenden una secuencia de nucleótidos con similitud de secuencia con la región de codificación de bar de la SEQ ID N°: 3 entre el nucleótido 154 y el nucleótido 552, en células vegetales que comprenden un gen bar quimérico de expresión en plantas integrado en su genoma y la selección de plantas sensibles a fosfinotricina tolerantes al compuesto de selección, tal como glifosato, permite identificar células vegetales en donde el ADN de reparación se ha integrado en la región de codificación de bar.
EJEMPLO 5 Inducción dirigida de la ruptura de ADN de cadena doble usando la meganucleasa BAY39/40 de cadena simple y heterodimérica en algodón Se cultivaron callos embriogénicos de plantas de algodón resistentes a PPT que contienen un gen quimérico que comprende al gen bar bajo el control del promotor CSVMV sobre el sustrato M100 (sales MS, vitaminas B5, MES 0,5 g/l, MgCI2.6H20 0,94 g/l, Gelrite 2 g/l, glucosa 30 g/l, pH 5,8) con 2 g/l de carbono activado. Estos callos fueron sometidos a bombardeo con micropartículas, usando un sistema de distribución de partículas biolísticas PPS_1000/He de BioRAD esencialmente como se describe en Sanford et al., 1992, donde las partículas estaban recubiertas con el vector pCV177 que codifica la meganucleasa heterodimérica BAY39/40 o con el vector pCV170 que codifica la meganucleasa de cadena simple BAY39/40. La co-distribución del vector de la meganucleasa se realizó con un vector que contiene al gen 2mEPSPS bajo el control de un promotor de expresión en plantas que confiere tolerancia a glifosato como un gen marcador seleccionable. Después del bombardeo, los callos fueron transferidos a un medio que contiene glifosato 1 mM, dando como resultado aproximadamente 3000 callos embriogénicos resistentes a glifosato. Entre ellos, 85 eventos eran sensibles a PPT, de los cuales 79 eventos fueron analizados además a nivel molecular. Estos 79 eventos fueron caracterizados por su genotipo mediante PCR usando cebadores que flanquean al sitio blanco y subsiguiente secuenciación del producto de la PCR. La ausencia de un producto de PCR es indicativa de una gran supresión alrededor del sitio blanco (tabla 1).
TABLA 1 Caracterización de eventos de transformación resistentes a lifosato sensibles a PPT. pCV170 (se) producto obtenido cambio en el sitio por PCR N° eventos blanco N° eventos no 11 gran supresión 11 sí 8 sin mutación 6 reemplazo/inserción 1 supresión 1 pCV177 (hd) producto obtenido cambio en el sitio por PCR N° eventos blanco N° eventos no 33 gran supresión 33 sí 27 sin mutación 19 inserción 4 supresión 4 Por consiguiente, estos resultados demuestran que ambas meganucleasas BAY39/40 de cadena simple así como heterodimérica tienen la capacidad de inducir una ruptura dirigida de ADN de cadena doble en la posición deseada y que se pueden obtener los eventos de supresión, reemplazo e inserción buscados usando estas meganucleasas en algodón.

Claims (30)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1.- Un método para introducir una molécula de ADN extraño en un sitio predefinido en un genoma de una célula vegetal, que comprende los pasos de: a. inducir una ruptura de ADN de cadena doble en dicho sitio predefinido; b. introducir dicha molécula de ADN extraño en dicha célula vegetal; y c. seleccionar una célula vegetal en donde dicho ADN extraño se introduce en dicho sitio predefinido; en donde dicho sitio predefinido está comprendido dentro una región de ADN que codifica una fosfinotricinacetiltransferasa codificada por Streptomyces hygroscopicus (región de codificación de bar) y que dicha ruptura de ADN de cadena doble es inducida por introducción de una meganucleasa de cadena simple o por un par de meganucleasas que reconoce o reconocen conjuntamente dicho sitio predefinido e induce o inducen dicha ruptura de cadena doble.
2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho sitio predefinido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 1 o la SEQ ID N°: 2.
3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha región de codificación de bar comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 3.
4.- Un método para introducir una molécula de ADN extraño en un sitio predefinido en un genoma de una célula vegetal, que comprende los pasos de: a. inducir una ruptura de ADN de cadena doble en dicho sitio predefinido; b. introducir dicha molécula de ADN extraño en dicha célula vegetal; y c. seleccionar una célula vegetal en donde dicho ADN extraño se introduce en dicho sitio predefinido; en donde dicho sitio predefinido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 1 o la SEQ ID N°: 2 y que dicha ruptura de ADN de cadena doble es inducida por introducción de una meganucleasa de cadena simple o por un par de meganucleasas que reconoce o reconocen conjuntamente dicho sitio predefinido e induce o inducen dicha ruptura de cadena doble.
5.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque dicha meganucleasa o dicho par de meganucleasas deriva de l-Crel y en donde los siguientes aminoácidos están presentes en la unidad 1 de la meganucleasa: a. S en la posición 32; b. Y en la posición 33; c. E en la posición 38; d. R en la posición 40; e. K en la posición 66; f. Q en la posición 80; g. T en la posición 42; h. R en la posición 77; i. R en la posición 68; j. R en la posición 70; k. Q en la posición 44; I. I en la posición 24; m. S en la posición 26; n. S en la posición 28; o. R en la posición 30; y en donde los siguientes aminoácidos están presentes en la unidad 2 de la meganucleasa: p. R en la posición 70; q. T en la posición 44; r. I en la posición 24; s. S en la posición 26; t. S en la posición 28; u. N en la posición 30; v. S en la posición 32; w. R en la posición 33; x. Q en la posición 38; y Q en la posición 80; z. R en la posición 40; aa. K en la posición 66; bb. T en la posición 42; ce. R en la posición 77; dd. R en la posición 68.
6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque dicho par de meganucleasas forma obligadamente heterodímeros o en donde dicha meganucleasa es una meganucleasa de cadena simple que comprende dos dominios derivados de l-Crel unidos covalentemente por medio de un conector.
7. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque dicho par de meganucleasas comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 5 y de la SEQ ID N°: 6, respectivamente, o dicha meganucleasa de cadena simple comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 18 entre las posiciones 1 y 167 y entre las posiciones 206 y 362.
8.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque dicho par de meganucleasas está codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 4 desde la posición de nucleótido 2004 hasta la posición de nucleótido 2525 ó 2522 y la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 4 desde la posición de nucleótido 4885 hasta la posición de nucleótido 5405 ó 5403, o dicha meganucleasa de cadena simple está codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 17 entre las posiciones de nucleótidos 1267 y 1605 y entre 1795 y 1956 y entre 2071 y 2541 , o dicha meganucleasa de cadena simple está codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 17 entre las posiciones de nucleótidos 1267 y 1605 y entre 1795 y 2541.
9.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque dicha meganucleasa o dicho par de meganucleasas está codificado por un ácido nucleico cuyos codones han sido optimizados para su expresión en dicha célula de dicha planta.
10.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque dicho ADN extraño se introduce por transferencia directa de ADN.
11. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque dicho ADN extraño se introduce sin ningún ADN adicional.
12. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado además porque dicho ADN extraño está comprendido dentro de un ADN de reparación, donde dicho ADN de reparación comprende al menos una secuencia de nucleótidos flanqueadora homologa de la secuencia 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 1.
13. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque dicha meganucleasa o dicho par de meganucleasas se expresa a partir de un gen quimérico o un par de genes quiméricos, cada uno de los cuales comprende un promotor de expresión en plantas ligado operativamente a una región de codificación que codifica dicha meganucleasa o a uno de los miembros de dicho par de meganucleasas, y además está ligado operativamente a una región de ADN relacionada con la terminación de la transcripción y poliadenilación funcional en una célula vegetal.
14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho gen quimérico se introduce transitoriamente en dicha célula vegetal.
15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho gen quimérico se introduce de manera estable en dicha célula vegetal.
16. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado además porque dicho ADN extraño comprende un gen marcador seleccionable.
17. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado además porque dicho ADN extraño comprende un gen de interés de expresión en plantas.
18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho gen de interés de expresión en plantas se selecciona del grupo de un gen de tolerancia a herbicidas, un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un gen de resistencia a un estrés abiótico, una enzima relacionada con la biosíntesis de aceite, la biosíntesis de carbohidratos, una enzima relacionada con la fuerza de las fibras o la longitud de las fibras, una enzima relacionada con la biosíntesis de metabolitos secundarios.
19.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dicha célula vegetal además se regenera en una planta.
20. - Una célula vegetal, en donde dicho ADN extraño se introdujo en dicho sitio predefinido, obtenido mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. - Una planta, en donde dicho ADN extraño se introdujo en dicho sitio predefinido, obtenido mediante el método de conformidad con la reivindicación 19.
22. - Una semilla o una parte de propagación de una planta, que comprende dicho ADN extraño integrado en dicho sitio predefinido, de la planta de la reivindicación 21.
23. - Un método para cultivar una planta de conformidad con la reivindicación 21 , que comprende el paso de aplicar un compuesto químico a dicha planta o sustrato en donde se cultiva dicha planta.
24.- Un proceso para producir una planta que comprende ADN extraño integrado en la región de codificación de bar, que comprende el paso de cruzar una planta que consiste esencialmente de las células vegetales de la reivindicación 20 con otra planta o consigo misma y opcionalmente cosechar las semillas.
25.- Un proceso para cultivar una planta en el campo, CARACTERIZADO porque comprende el paso de aplicar un compuesto químico sobre una planta de la reivindicación 21.
26.- Un proceso para producir semilla tratadas, que comprende el paso de aplicar un compuesto químico sobre una semilla de una planta de conformidad con la reivindicación 22.
27. - El uso de una meganucleasa o de un par de meganucleasas descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para introducir un ADN extraño en la región de codificación de bar.
28. - El uso de una meganucleasa personalizada para introducir un ADN extraño de interés en un sitio predefinido en una célula vegetal.
29. - Un método para introducir una molécula de ADN extraño en un sitio predefinido en un genoma de una célula vegetal, que comprende los pasos de: a. inducir una ruptura de ADN de cadena doble en dicho sitio predefinido; b. introducir dicha molécula de ADN extraño en dicha célula vegetal; y c. seleccionar una célula vegetal en donde dicho ADN extraño se introduce en dicho sitio predefinido; en donde dicha ruptura de ADN de cadena doble es inducida por introducción de una meganucleasa de cadena simple no natural o un par de meganucleasas no naturales, que reconoce o reconocen conjuntamente dicho sitio predefinido e induce o inducen dicha ruptura de cadena doble.
30. - Un método para introducir una molécula de ADN extraño en un sitio predefinido en un genoma de una célula vegetal transgénica, que comprende los pasos de: a. inducir una ruptura de ADN de cadena doble en dicho sitio predefinido; b. introducir dicha molécula de ADN extraño en dicha célula vegetal; y c. seleccionar una célula vegetal en donde dicho ADN extraño se introduce en dicho sitio predefinido; en donde dicho sitio predefinido es una secuencia de nucleótidos diferente de un sitio de reconocimiento de una meganucleasa natural, donde dicho sitio predefinido es una secuencia de nucleótidos introducida comúnmente como parte de un transgen en una planta transgénica y en donde la ruptura de ADN de cadena doble es inducida por introducción de una meganucleasa de cadena simple no natural o un par de meganucleasas no naturales, que reconoce o reconocen conjuntamente dicho sitio predefinido e induce o inducen dicha ruptura de cadena doble.
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